JP2024511281A - 抗ｃｌｄｎ１８．２抗体コンジュゲート - Google Patents

抗ｃｌｄｎ１８．２抗体コンジュゲート Download PDF

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Abstract

本開示は、本明細書において、放射性核種との抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片のコンジュゲート、それを含有する医薬組成物、ならびにイメージング、患者スクリーニング、処置プロセスモニタリングおよび有効性評価におけるその使用を提供する。【選択図】なし

Description

[0001]本発明は、核医学、特に放射標識ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートの調製および適用に関する。
[0002]世界では、胃がんの発生率および死亡数はそれぞれ第５位および第３位にランクされた。胃がんの発生率は中国では第２位にランクされる。現在、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）を標的とするモノクローナル抗体であるトラスツズマブが、進行性胃がんの第一選択の処置において延命効果を有する唯一の薬物である。近年では、ＨＥＲ２を標的とする新薬（抗体薬物コンジュゲート、二重特異性抗体、低分子阻害剤等）に関する好材料がしばしば報告されてきたが、ＨＥＲ２陽性胃がん患者の割合は低く（１０～１２％のみ）、彼らのほとんどが１年以内に薬物抵抗性を発生し、薬物抵抗性後の的確で効果的な標的に向けられた薬物の不足、という厄介な状況を依然として払拭することができない。したがって、胃がん処置の新たな標的を探索することは、進行性胃がん処置のボトルネックを突破するキーである。
[0003]２０１６年のＦＡＳＴ研究は、ＣＬＤＮ１８．２（ｃｌａｕｄｉｎ１８スプライスバリアント２、ＣＬＤＮ１８．２）を標的とするモノクローナル抗体であるＩＭＡＢ３６２に関する一連の実験による、胃がんの「新星」標的であるＣｌａｕｄｉｎ１８．２を検証した。しかし、現在まで、抗ＣＬＤＮ１８．２核種プローブに関する報告は発表されていなかった。
[0004]最新の分子イメージング技術の包括的、非侵襲的、リアルタイムかつ動的な各特徴を使用することによって、ＣＬＤＮ１８．２の診断のための高度の特異性を備える分子プローブを開発することは意義が大きい。したがって、新規な抗ＣＬＤＮ１８．２核種プローブおよび療法に対する大きなニーズが存在する。
[0005]本開示全体を通して、冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、当該冠詞の文法的対象の１つをまたは２つ以上を（すなわち、少なくとも１つを）指して本明細書で使用される。例として、「抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、１つの抗体または２つ以上の抗体を意味する。
[0006]一態様では、本開示は、治療用放射性核種または診断用放射性核種を含む放射性核種にコンジュゲートされた抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片を含む、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートを提供する。
[0007]一部の実施形態では、治療用放射性核種は、１１１Ｉｎ、１１１ｍＩｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１９９Ａｕおよび２１１Ｐｂからなる群から選択される。
[0008]一部の実施形態では、診断用放射性核種は、１８Ｆ、３２Ｐ、３３Ｐ、４５Ｔｉ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７５Ｓｃ、７７Ａｓ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、９９Ｍｏ、１０５Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１ｌｎ、１２３ｌ、１２４ｌ、１２５ｌ、１３１ｌ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５４’’１５８１Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７５Ｌｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４ｌｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃからなる群から選択される。
[0009]一部の実施形態では、診断用放射性核種は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）または単一光子放出コンピュータ化断層撮影（ＳＰＥＣＴ）によって検出可能である。
[0010]一部の実施形態では、放射性核種は、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、８６Ｙ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１２３／１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１１Ｃ、１４Ｃ、４１Ｃａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１３Ｎ、１５Ｏ、４４Ｓｃ、１８Ｆ、９９ｍＴｃ、および９０ｍＴｃからなる群から選択される。
[0011]一部の実施形態では、放射性核種は１２４Ｉまたは１２３Ｉまたは１３１Ｉである。
[0012]一部の実施形態では、放射性核種は６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、または８９Ｚｒである。
[0013]一部の実施形態では、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、または８９Ｚｒは、キレート剤を介して抗体またはその抗原結合断片に標識されている。
[0014]一部の実施形態では、キレート剤はキレート化のための３個以上の原子を含み、各原子が窒素、硫黄、酸素、およびリンからなる群から選択される。
[0015]一部の実施形態では、キレート剤は、ＤＦＯ（デルフェロキサミン）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸）、ＤＴＰＡ（ＮＲ－ジエチレントリアミン五酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－酢酸）、１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸（本明細書ではＴＲＩＴＡと略記）；１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸（本明細書ではＴＥＴＡと略記）；および１，５，９，１３－テトラアザシクロヘキサデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸（本明細書ではＨＥＴＡと略記）、エチレンジアミン四酢酸（本明細書ではＥＤＴＡと略記）、またはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を含む。
[0016]一部の実施形態では、放射性核種は６４Ｃｕもしくは６７Ｃｕであり、キレート剤はＴＥＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＯＤＡ、もしくはＮＯＤＧＡを含むか、または放射性核種は８９Ｚｒであり、キレート剤はＤＦＯを含む。
[0017]一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片は、重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに／または軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の配列を含み、ここで：
ＨＣＤＲ１配列は、ＧＹＮＭＮ（配列番号１）、もしくはＴＹＦＩＧＶＧ（配列番号１３）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
ＨＣＤＲ２配列は、Ｘ１ＩＤＰＹＹＸ２Ｘ３ＴＸ４ＹＮＱＫＦＸ５Ｇ（配列番号３２）、もしくはＨＩＷＷＮＤＮＫＹＹＮＴＡＬＫＳ（配列番号１５）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
ＨＣＤＲ３配列は、Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＧＮＡＦＤＹ（配列番号３３）、もしくはＭＧＳＧＡＷＦＴＹ（配列番号１７）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
ＬＣＤＲ１配列は、ＫＳＳＱＸ９ＬＸ１０ＮＸ１１ＧＮＸ１２ＫＮＹＬＴ（配列番号３４）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
ＬＣＤＲ２配列は、ＷＡＳＴＲＸ１３Ｓ（配列番号３５）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
ＬＣＤＲ３配列は、ＱＮＤＹＸ１４Ｘ１５ＰＸ１６Ｔ（配列番号３６）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
ここで、Ｘ１はＮまたはＹまたはＨであり、Ｘ２はＧまたはＶであり、Ｘ３はＡまたはＧまたはＴであり、Ｘ４はＲまたはＴまたはＳであり、Ｘ５はＫまたはＲであり、Ｘ６はＳまたはＭであり、Ｘ７はＹまたはＦであり、Ｘ８はＹまたはＨであり、Ｘ９はＳまたはＮであり、Ｘ１０はＬまたはＦであり、Ｘ１１はＳまたはＮであり、Ｘ１２はＱまたはＬであり、Ｘ１３はＥまたはＫであり、Ｘ１４はＳまたはＹであり、Ｘ１５はＦまたはＹであり、かつＸ１６はＦまたはＬである。
[0018]一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片は：
配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号５の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号５の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号８の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号９の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１１の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号１０の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１３の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１５の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１７の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１２の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１９の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号２１の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号１４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１８の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または
配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２２の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号５の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２０の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む。
[0019]一部の実施形態では、重鎖可変領域は、重鎖ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４のうちの１つもしくは複数をさらに含み、かつ／または軽鎖可変領域は、軽鎖ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３、およびＬＦＲ４のうちの１つもしくは複数をさらに含み、ここで：
ＨＦＲ１は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＸ１７ＦＴ（配列番号５４）またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
ＨＦＲ２は、ＷＶＸ１８ＱＡＰＧＱＧＬＥＷＸ１９Ｇ（配列番号５５）またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
ＨＦＲ３配列は、ＲＶＴＸ２０ＴＩＤＫＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号５６）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
ＨＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号５７）またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
ＬＦＲ１は、ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＸ２１ＮＣ（配列番号５８）またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
ＬＦＲ２は、ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号５９）またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
ＬＦＲ３は、ＧＶＰＤＲＦＸ２２ＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣ（配列番号６０）またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
ＬＦＲ４は、ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６１）またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
ここで、Ｘ１７はＴまたはＳであり、Ｘ１８はＲまたはＫであり、Ｘ１９はＭまたはＩであり、Ｘ２０はＭまたはＬであり、Ｘ２１はＩまたはＭであり、かつＸ２２はＳまたはＴである。
[0020]一部の実施形態では、
ＨＦＲ１は配列番号６２および６３からなる群から選択される配列を含み、
ＨＦＲ２は、配列番号６４および６５からなる群から選択される配列を含み、
ＨＦＲ３は、配列番号６６および６７からなる群から選択される配列を含み、
ＨＦＲ４は配列番号５７の配列を含み、
ＬＦＲ１は配列番号６８および６９からなる群からの配列を含み、
ＬＦＲ２は配列番号５９の配列を含み、
ＬＦＲ３は、配列番号７０および７１からなる群から選択される配列を含み、
ＬＦＲ４は配列番号６１の配列を含む。
[0021]一部の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、および配列番号４７、ならびにＣＬＤＮ１８．２への特異的な結合親和性を依然として保持しつつ少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む。
[0022]一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、およびＣＬＤＮ１８．２への特異的な結合親和性を依然として保持しつつ少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む。
[0023]一部の実施形態では、
重鎖可変領域は配列番号２３の配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号２４の配列を含む；
重鎖可変領域は配列番号２５の配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号２６の配列を含む；
重鎖可変領域は配列番号２７の配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号２８の配列を含む；
重鎖可変領域は配列番号２９の配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号２６もしくは２８の配列を含む；
重鎖可変領域は配列番号３７の配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号３８の配列を含む；
重鎖可変領域は配列番号３９の配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号４０の配列を含む；
重鎖可変領域は配列番号４１の配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号４２の配列を含む；
重鎖可変領域は配列番号４３の配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号４４の配列を含む；
重鎖可変領域は配列番号４５の配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号４６の配列を含む；または
重鎖可変領域は配列番号４７の配列を含み、かつ軽鎖可変領域は配列番号４８の配列を含む。
[0024]一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＣＬＤＮ１８．２への特異的な結合親和性を依然として保持する１つまたは複数のアミノ酸残基の置換または改変をさらに含む。
[0025]一部の実施形態では、置換または改変のうちの少なくとも１つは、１つもしくは複数のＣＤＲ配列中および／またはＶＨもしくはＶＬ配列の１つもしくは複数の非ＣＤＲ領域中にある。
[0026]一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片は、免疫グロブリン定常領域、任意選択でヒトＩｇの定常領域、または任意選択でヒトＩｇＧの定常領域をさらに含む。
[0027]一部の実施形態では、定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の定常領域を含む。
[0028]一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ１の定常領域は、配列番号４９、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同性配列を含む。
[0029]一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片はヒト化されている。
[0030]一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片は、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、および二価ドメイン抗体である。
[0031]別の態様では、本開示は、本明細書で提供される抗体コンジュゲート、および１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。
[0032]一部の実施形態では、放射化学的純度が少なくとも９５％（例えば、９７％、９８％、９９％）である。
[0033]別の態様では、本開示は、対象において目的の部位の画像を取得する方法であって、
ａ）本明細書で提供される抗体コンジュゲートおよび／または本明細書で提供される医薬組成物の有効量を対象に投与するステップと；
ｂ）対象の目的の部位を陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）またはＳＰＥＣＴに供するステップと；
ｃ）対象において放射性核種からの検出可能なシグナルを特定するステップと；
ｄ）検出可能なシグナルの画像を作成し、それによって対象において目的の部位の画像を取得するステップと、
を含む、方法を提供する。
[0034]一部の実施形態では、目的の部位は、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を発現しているまたはｃｌａｕｄｉｎ１８．２を発現していると疑われる部位である。
[0035]一部の実施形態では、目的の部位は、腫瘍を有するまたは腫瘍を有すると疑われている。
[0036]別の態様では、本開示は、対象において非侵襲的な様式でｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現を検出または視覚化する方法であって、
ａ）本明細書で提供される抗体コンジュゲートおよび／または本明細書で提供される医薬組成物の有効量を対象に投与するステップと；
ｂ）対象を陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）またはＳＰＥＣＴに供するステップと；
ｃ）対象の目的の部位において放射性核種からの検出可能なシグナルを特定するステップと；
ｄ）特定された検出可能なシグナルに基づいて、対象の目的の部位におけるｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現を決定または視覚化するステップと、
を含む、方法を提供する。
[0037]一部の実施形態では、方法は、目的の部位においてｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現を有すると特定された対象に、抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２療法の治療有効量を投与するステップをさらに含む。
[0038]一部の実施形態では、方法は、特定された検出可能なシグナルに基づいて、対象の目的の部位におけるｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現の分布を決定するステップをさらに含む。
[0039]一部の実施形態では、方法は、対象の目的の部位におけるｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現の不均一性を決定するステップをさらに含む。
[0040]一部の実施形態では、目的の部位は腫瘍である。
[0041]別の態様では、本開示は、治療期間の間処置を受けていた対象において、非侵襲的な様式で、治療有効性、処置への応答性、または抵抗性もしくは再発の発生、または転移を、モニタリングする方法であって、
ａ）本明細書で提供される抗体コンジュゲートおよび／または本明細書で提供される医薬組成物の有効量を対象に投与するステップと；
ｂ）対象を陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）またはＳＰＥＣＴに供するステップと；
ｃ）対象の目的の部位において放射性核種からの検出可能なシグナルを特定するステップと；
ｄ）特定された検出可能なシグナルに基づいて、対象の目的の部位における処置後のｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現を決定するステップと；
ｅ）処置後のｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現のレベルまたは分布をそれぞれ、治療期間前に対象から得られたベースラインのｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現のレベルまたは分布と比較して、対象においてｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現のレベルまたは分布の処置後の変化を決定するステップと；
ｆ）ステップ（ｅ）で決定された変化に基づいて、治療有効性、処置への応答性、または抵抗性もしくは再発の発生、または転移を決定するステップと
を含む、方法を提供する。
[0042]一部の実施形態では、ベースラインのｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現レベルまたは分布は、同様の方法を使用して決定される。
[0043]一部の実施形態では、ベースラインのｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現レベルまたは分布は、本明細書で提供される抗体コンジュゲートおよび／または本明細書で提供される医薬組成物の有効量を対象に投与するステップと、対象を陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）またはＳＰＥＣＴに供するステップと、対象の目的の部位において放射性核種からの検出可能なシグナルを特定するステップと、特定された検出可能なシグナルに基づいて、対象の目的の部位におけるベースラインのｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現を決定するステップとによって、治療期間の前（すなわち処置前）に決定される。一部の実施形態では、ベースラインのｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現の決定のための目的の部位は、処置後のｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現の決定のための目的の部位と同じであるか、またはそれと少なくとも同等である。
[0044]一部の実施形態では、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現のレベル上昇または広がりが、低減した治療有効性、処置への低減した応答性、または抵抗性の存在もしくは再発の存在を示す。
[0045]一部の実施形態では、対象はがんを有する。
[0046]別の態様では、本開示は、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートおよび／または本明細書で提供される医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む、ＣＬＤＮ１８．２関連疾患または状態の処置を必要とする対象においてＣＬＤＮ１８．２関連疾患または状態を処置する方法を提供する。
[0047]一部の実施形態では、疾患または状態はがんであり、任意選択でＣＬＤＮ１８．２発現がんである。
[0048]一部の実施形態では、対象はＣＬＤＮ１８．２発現がんを有すると特定されている。
[0049]別の態様では、本開示は、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート、または本明細書で提供される組成物を含むキットを提供する。
[0050]別の態様では、本開示は、本明細書で提供される第１の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートと、本明細書で提供される第２の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートとを含むキットであって、第１の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは診断用放射性核種を含み、第２の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは治療用放射性核種を含む、キットを提供する。
[0051]一部の実施形態では、キットは本明細書で提供される方法で使用するためのものである。
[0052]別の態様では、本開示は、本明細書で提供される対象の目的の部位の画像を取得する方法で使用するための、または本明細書で提供される、対象において非侵襲的な様式でｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現を検出もしくは視覚化する方法で使用するための、または本明細書で提供される、対象において、非侵襲的な様式で、治療有効性、処置への応答性、または抵抗性もしくは再発の発生、または転移をモニタリングする方法で使用するための、医薬の製造における、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートまたは本明細書で提供される組成物の使用であって、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは診断用放射線核種を含む、使用を提供する。
[0053]別の態様では、本開示は、本明細書で提供される、ＣＬＤＮ１８．２関連疾患または状態の処置を必要とする対象においてＣＬＤＮ１８．２関連疾患または状態を処置する方法で使用するための医薬の製造における、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートまたは本明細書で提供される組成物の使用であって、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは治療用放射線核種を含む、使用を提供する。
[0054]別の態様では、本開示は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片を、１２４Ｉ、１２３Ｉまたは１３１Ｉで標識されたヨウ化物化合物と酵素的または化学的酸化剤の存在下で反応させるステップを含む、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートを調製する方法を提供する。
[0055]一部の実施形態では、化学的酸化剤は、Ｎ－ブロモスクシンイミド、ヨードゲン、またはクロラミン－Ｔである。
[0056]別の態様では、本開示は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片を、キレート剤とコンジュゲートさせてキレート剤－抗体コンジュゲートを取得するステップと、キレート剤－抗体コンジュゲートを６４Ｃｕまたは８９Ｚｒと反応させるステップとを含む、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートを調製する方法を提供する。
[0057]一部の実施形態では、キレート剤は、ＤＦＯ（デルフェロキサミン）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸）、ＤＴＰＡ（ＮＲ－ジエチレントリアミン五酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－酢酸）、ＴＲＩＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸）；ＴＥＴＡ（１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸）；およびＨＥＴＡ（１，５，９，１３－テトラアザシクロヘキサデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＮＥＴＡ（｛４－［２－（ビス－カルボキシメチルアミノ）－エチル］］－７－カルボキシメチル－［１，４，７］トリアゾナン－１－イル｝－酢酸）、ＴＡＣＮ－ＴＭ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，トリス（２－メルカプトエチル）１，４，７－トリアザシクロノナン）、ＴＲＡＰ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－トリス［メチル（２－カルボキシエチル）ホスフィン酸］）、ＣＰ２５６、ＰＣＴＡ（３，６，９，１５－テトラアザビシクロ［９．３．１］ペンタデカ－１（１５），１１，１３－トリエン－３，６，９,－三酢酸）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシム、ならびにそれらの誘導体を含む。
[0058]図１は、１２４Ｉ－１８Ｂ１０プローブの放射標識率および放射化学的純度を示す：Ａ）精製後の放射化学的純度；Ｂ）精製後の放射化学的純度；Ｃ）ＰＢＳ中で１時間後の放射化学的純度；Ｄ）ＰＢＳ中で４８時間後の放射化学的純度。 [0059]図２は、ＭＫＮ４５－ＣＬＮＤ１８．２ ｈｉｇｈ／ＭＫＮ４５細胞における１２４Ｉ－１８Ｂ１０およびその対照群の取込みを示す。 [0060]図３は、正常なＫｕｎｍｉｎｇマウスにおける１２４Ｉ－１８Ｂ１０の体内分布を示す。 [0061]図４は、本発明の実施例５のＣＬＤＮ１８．２陽性／陰性ＰＤＸモデルにおける１２４Ｉ－１８Ｂ１０およびその対照群ならびに１８Ｆ－ＦＤＧのＭｉｃｒｏ－ＰＥＴイメージング比較を示す。 [0062]図５Ａ～Ｂは、エピトープマッピングを使用した、突然変異ｈＣＬＤＮ１８．２バリアントへのキメラ抗体の結合シグナルを示す棒グラフである。Ｅ５６がＱへと突然変異された場合、１８Ｂ１０－Ｃの結合は完全に失われた。この変化は、ＩＭＡＢ３６２および５９Ａ９－Ｃを除く他のキメラ抗体にも当てはまった。Ａ４２、Ｎ４５などの他のアミノ酸もＩＭＡＢ３６２および他の抗体の結合にある程度寄与したが、１８Ｂ１０－Ｃについてはそうではなかった。 [0062]図５Ａ～Ｂは、エピトープマッピングを使用した、突然変異ｈＣＬＤＮ１８．２バリアントへのキメラ抗体の結合シグナルを示す棒グラフである。 [0063]図６は、ＰＤＸマウスにおける１２４Ｉ－１８Ｂ１０の体内分布を示す。 [0064]図７は、最初の５人の患者の画像から導出された、患者の１２４Ｉ－１８Ｂ１０の体内分布を示す。 [0065]図８は、患者の卵巣病変における１２４Ｉ－１８Ｂ１０の蓄積を示す。
[0066]本開示の以下の説明は、単に、本開示の種々の実施形態を例示することを意図するものである。そのようなものとして、論じられる特定の改変は、本開示の範囲に対する制限と解釈されるべきではない。本開示の範囲から逸脱することなく、種々の等価物、変法および改変が為され得ることは当業者であれば明らかであり、また、このような等価の実施形態は、本明細書に含まれるべきであるということが理解される。刊行物、特許および特許出願を含めて、本明細書において引用された全ての参考文献は、参照によりその全文で本明細書に組み込まれる。
定義
[0067]本明細書で使用される場合、本発明に照らして（特に請求項に照らして）使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という各用語および類似の用語は、本明細書で別段に示さない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方をカバーすると解釈されたい。
[0068]本明細書で使用される用語「抗体」とは、特定の抗原に結合する任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、二価抗体、一価抗体、多重特異性抗体、または二重特異性抗体を含む。天然のインタクトな抗体は２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。哺乳動物の重鎖はアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューに分類され、それぞれの重鎖は可変領域（ＶＨ）ならびに第１、第２、第３の定常領域（それぞれＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）から構成される；哺乳動物の軽鎖はλまたはκと分類され、それぞれの軽鎖は可変領域（ＶＬ）および定常領域から構成される。抗体は「Ｙ」の形状を有し、Ｙの本幹はジスルフィド結合を介して互いに結合した２つの重鎖の第２および第３の定常領域から構成される。Ｙのそれぞれのアームは、単一の軽鎖の可変領域および定常領域に結合した単一の重鎖の可変領域および第１の定常領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は抗原結合を担う。両方の鎖の可変領域は一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度に可変性のループを含有する。本明細書で開示される抗体および抗原結合ドメインのＣＤＲの境界は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉの慣習（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７３（４）、９２７頁（１９９７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１２月５日；１８６（３）：６５１～６３頁（１９８５）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６，９０１頁（１９８７）；Ｎ．Ｒ．Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１３巻（１２）、８１９～８２４頁（２０００）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．１２月２１日～２８日；３４２（６２５２）：８７７～８３頁（１９８９）；Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２７：５５～７７頁（２００３）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１（３）、（２００５）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ（第２版）、第２６章、４８１～５１４頁、（２０１５））によって定義または特定され得る。３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる隣接するストレッチの間に挿入され、これは、ＣＤＲよりも高度に保存的であり、超可変ループを支えるスキャフォールドを形成する。重鎖および軽鎖の定常領域は抗原結合には関与しないが、種々のエフェクター機能を呈する。抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてクラスに割り付けられる。抗体の主な５つのクラスまたはアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、これらはそれぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューの重鎖の存在によって特徴付けられる。主な抗体のクラスのいくつかは、ＩｇＧ１（ガンマ１重鎖）、ＩｇＧ２（ガンマ２重鎖）、ＩｇＧ３（ガンマ３重鎖）、ＩｇＧ４（ガンマ４重鎖）、ＩｇＡ１（アルファ１重鎖）、またはＩｇＡ２（アルファ２重鎖）などのサブクラスに分割される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体はその任意の抗原結合断片を包含する。
[0069]本明細書で使用される場合、用語「抗原結合断片」とは、１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体の断片から形成される抗体断片、または抗原に結合するがインタクトな天然の抗体構造を含まない任意の他の抗体部分を指す。抗原結合断片の例としては、限定されないが、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、多重特異性抗体、ラクダ化単鎖ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、および二価ドメイン抗体が挙げられる。抗原結合断片は、親抗体が結合する同じ抗原に結合することができる。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、特定のヒト抗体由来の１つまたは複数のＣＤＲを含むことができる。
[0070]抗体に関する「Ｆａｂ」とは、ジスルフィド結合によって単一の重鎖の可変領域および第１の定常領域に結合した単一の軽鎖（可変領域と定常領域の両方）から構成される抗体の一価抗原結合断片を指す。Ｆａｂは、ヒンジ領域の、重鎖の間のジスルフィド結合のＮ末端に近位の残基での抗体のパパイン消化によって取得され得る。
[0071]「Ｆａｂ’」とは、ヒンジ領域の一部を含むＦａｂ断片を指し、これは、ヒンジ領域の、重鎖間におけるジスルフィド結合のＣ末端に近位の残基での抗体のペプシン消化によって取得され得るものであり、したがってこれは、ヒンジ領域中の少数の残基（１個または複数のシステインを含む）においてＦａｂと異なる。
[0072]「Ｆ（ａｂ’）２」とは、２つの軽鎖と２つの重鎖の一部とを含むＦａｂ’の二量体を指す。
[0073]抗体に関する「Ｆｃ」とは、ジスルフィド結合を介して、第２の重鎖の第２および第３の定常領域に結合した、第１の重鎖の第２および第３の定常領域からなる抗体の部分を指す。ＩｇＧおよびＩｇＭのＦｃ領域は、３つの重鎖定常領域（各鎖中の第２、第３および第４の重鎖定常領域）を含有する。これは抗体のパパイン消化によって取得され得る。抗体のＦｃ部分は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣなどの種々のエフェクター機能の要因であるが、抗原結合においては機能しない。
[0074]抗体に関する「Ｆｖ」とは、完全な抗原結合部位を保有する抗体の最小断片を指す。Ｆｖ断片は、単一の重鎖の可変領域に結合した単一の軽鎖の可変領域から構成される。「ｄｓＦｖ」とは、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片を指し、単一の軽鎖の可変領域と単一の重鎖の可変領域の間の連結がジスルフィド結合である。
[0075]「単鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」とは、互いに直接的に、またはペプチドリンカー配列を介して接続された軽鎖可変領域と重鎖可変領域とから構成される操作された抗体を指す（Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳら．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８５：５８７９頁（１９８８））。「ｓｃＦｖ二量体」とは、２つの重鎖可変領域と２つの軽鎖可変領域とをリンカーとともに含む単一の鎖を指す。ある特定の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」とは、二価ダイアボディまたは二価ＳｃＦｖ（ＢｓＦｖ）であり、これは、ＶＨの一部分がＶＬの他の部分と協調するようにかつ同じ抗原（もしくはエピトープ）または異なる抗原（もしくはエピトープ）を標的化することができる２つの結合部位を形成するように、別のＶＨ－ＶＬ部分と二量体化されたＶＨ－ＶＬ（ペプチドリンカーによって連結された）を含む。他の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」とは、二重特異性ダイアボディであり、これは、ＶＨ１とＶＬ１が協調するとともにＶＨ２とＶＬ２が協調するようにかつそれぞれの協調した対が異なる抗原特異性を有するように、ＶＬ１－ＶＨ２（ペプチドリンカーによって連結された）と会合したＶＨ１－ＶＬ２（またペプチドリンカーによって連結された）を含む。
[0076]「単鎖Ｆｖ－Ｆｃ抗体」または「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」とは、抗体のＦｃ領域に接続されたｓｃＦｖから構成される操作された抗体を指す。
[0077]「ラクダ化単一ドメイン抗体」、「重鎖抗体」、「ナノボディ」または「ＨＣＡｂ」とは、２つのＶＨドメインを含有し、軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１２月１０日；２３１（１－２）：２５～３８頁（１９９９）；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６月；７４（４）：２７７～３０２頁（２００１）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。重鎖抗体は、元々、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）（ラクダ、ヒトコブラクダおよびラマ）から取得された。軽鎖を欠くが、ラクダ化抗体は、確実な抗原結合レパートリーを有する（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．６月３日；３６３（６４２８）：４４６～８頁（１９９３）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ら「Ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃａｍｅｌｉｄａｅ；ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ」、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．４月；５４（１）：３９～４７頁（２００２）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．らＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．５月；１０９（１）：９３～１０１頁（２００３））。重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）は、適応免疫応答によって生成される既知の最小抗原結合ユニットとなる（Ｋｏｃｈ－Ｎｏｌｔｅ Ｆ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．１１月；２１（１３）：３４９０～８頁．Ｅｐｕｂ ２００７年６月１５日（２００７））。「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を含み、この場合、この断片は、単一のポリペプチド鎖中でＶＬドメインに接続されたＶＨドメイン（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）を含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．７月１５日；９０（１４）：６４４４～８頁（１９９３）；ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１を参照のこと）。同一鎖上の２つのドメインは、リンカーが短すぎるので対合できず、したがってこれらのドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対合せざるを得ず、それにより２つの抗原結合部位を作り出す。この２つの抗原結合部位は、同一または異なる抗原（またはエピトープ）を標的化することができる。
[0078]「ドメイン抗体」とは、重鎖の可変領域のみまたは軽鎖の可変領域のみを含有する抗体断片を指す。ある特定の実施形態では、２つ以上のＶＨドメインが、ペプチドリンカーと共有結合で合体して、二価または多価のドメイン抗体を形成する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨドメインは、同一または異なる抗原を標的化することができる。
[0079]ある特定の実施形態では、「（ｄｓＦｖ）２」は、３つのペプチド鎖：ペプチドリンカーによって連結され、ジスルフィド架橋によって２つのＶＬ部分に結合された２つのＶＨ部分を含む。
[0080]ある特定の実施形態では、「二重特異性ｄｓダイアボディ」は、ＶＨ１とＶＬ１との間のジスルフィド架橋を介して、ＶＬ１－ＶＨ２（ペプチドリンカーによって連結された）に結合されたＶＨ１－ＶＬ２（またペプチドリンカーによって連結された）
を含む。
[0081]ある特定の実施形態では、「二重特異性ｄｓＦｖ」または「ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’」は、３つのペプチド鎖：ＶＨ１－ＶＨ２部分であって、この２つの重鎖は、ペプチドリンカー（例えば長いフレキシブルなリンカー）によって結合されているとともにジスルフィド架橋を介してそれぞれＶＬ１部分およびＶＬ２部分へと対合されている、ＶＨ１－ＶＨ２部分を含む。それぞれのジスルフィドで対合した重鎖および軽鎖は、異なる抗原特異性を有する。
[0082]本明細書で使用される用語「ヒト化」とは、抗体または抗原結合断片が、非ヒト動物に由来するＣＤＲ、ヒトに由来するＦＲ領域、および適用可能な場合、ヒトに由来する定常領域を含むことを、意味する。ある特定の実施形態では、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２抗体の可変領域フレームワークのアミノ酸残基は、配列最適化のために置換される。ある特定の実施形態では、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２抗体鎖の可変領域フレームワーク配列は、対応するヒト可変領域フレームワーク配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である。
[0083]本明細書で使用される用語「キメラ」とは、１つの種に由来する重鎖および／または軽鎖の部分、ならびに異なる種に由来する重鎖および／または軽鎖の残りの部分を有する抗体または抗原結合断片を指す。例示的な例では、キメラ抗体は、ヒトに由来する定常領域、および非ヒト種、例えばマウスに由来する可変領域を含むことができる。
[0084]用語「生殖系列配列」とは、生殖系列免疫グロブリン可変領域配列によってコードされる全ての他の既知の可変領域アミノ酸配列との比較において、参照可変領域アミノ酸配列または部分配列との最も高い決定されたアミノ酸配列同一性を共有する可変領域アミノ酸配列または部分配列をコードする核酸配列を指す。生殖系列配列とはまた、全ての他の評価された可変領域アミノ酸配列との比較において、参照可変領域アミノ酸配列または部分配列との最も高いアミノ酸配列同一性を有する可変領域アミノ酸配列または部分配列を指すこともできる。生殖系列配列は、フレームワーク領域のみであっても、相補性決定領域のみであっても、フレームワークおよび相補性決定領域であっても、可変セグメント（上で定義される）であっても、可変領域を含む配列もしくは部分配列の他の組合せであってもよい。配列同一性は、本明細書に記載される方法を使用して、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、または当技術分野で既知の別のアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列のアラインメントを取って、決定され得る。生殖系列の核酸配列またはアミノ酸配列は、参照可変領域の核酸配列またはアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有することができる。生殖系列配列は、例えば、公開され入手可能な国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）およびＶ－ｂａｓｅを通して決定され得る。
[0085]本明細書で使用される「抗ＣＬＤＮ１８．２抗体」または「ＣＬＤＮ１８．２に対する抗体」とは、例えば診断用途および／または治療用途に提供するために十分な親和性をもってＣＬＤＮ１８．２（例えば、ヒトまたは非ヒトＣＬＤＮ１８．２）に特異的に結合することができる抗体を指す。
[0086]本明細書で使用される用語「親和性」とは、免疫グロブリン分子（すなわち抗体）またはその断片と抗原との間の非共有結合の相互作用の強度を指す。
[0087]本明細書で使用される「特異的結合」または「特異的に結合する」という各用語は、例えば抗体と抗原との間などの２つの分子間のノンランダムの結合反応を指す。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合断片は、≦１０－６Ｍ（例えば、≦５×１０－７Ｍ、≦２×１０－７Ｍ、≦１０－７Ｍ、≦５×１０－８Ｍ、≦２×１０－８Ｍ、≦１０－８Ｍ、≦５×１０－９Ｍ、≦４×１０－９Ｍ、≦３×１０－９Ｍ，≦２×１０－９Ｍ、または≦１０－９Ｍ）の結合親和性（ＫＤ）をもって、ヒトおよび／または非ヒトのＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する。本明細書で使用されるＫＤとは、解離速度と会合速度との比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を指し、この比は、それらに限定されないが、表面プラズモン共鳴法、マイクロスケール熱泳動法、ＨＰＬＣ－ＭＳ法、およびフローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ）法を含めて、当技術分野で既知の従来の任意の方法を使用することによって決定され得る。ある特定の実施形態では、ＫＤ値はフローサイトメトリー法を使用することによって適当に決定され得る。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、様々なイムノアッセイフォーマットが使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、あるタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するためにルーチンで使用される（特異的免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイフォーマットおよび条件の記載に関しては、例えばＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９８）を参照のこと）。通常には、特異的または選択的結合反応は、背景シグナルと比べて少なくとも２倍、より通常にはバックグラウンドと比べて少なくとも１０～１００倍のシグナルを生じることになる。
[0088]アミノ酸配列（または核酸配列）に関して「配列同一性パーセント（％）」とは、配列をアラインさせ、必要に応じて、ギャップを導入して、最大一致を得た後に、参照配列中のアミノ酸（または核酸）残基と同一である、候補配列中のアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸（または核酸）配列同一性のパーセントを決定する目的のアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで入手可能、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３～４１０頁（１９９０）；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９～３４０２頁（１９９７）も参照のこと）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトで入手可能、Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６：３８３～４０２頁（１９９６）；Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、２３（２１）：２９４７～８頁（２００７）も参照のこと）、およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なツールを使用して、行われ得る。当業者は、ツールによって提供されるデフォルトパラメータを使用してもよく、またはアラインメント向けに必要に応じて、例えば、適切なアルゴリズムを選択することによるなど、パラメータをカスタマイズしてもよい。ある特定の実施形態では、非同一性の残基の位置が保存的アミノ酸置換によって異なってもよい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基が類似した化学特性（例えば電荷または疎水性）を備える側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換はタンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、類似性のパーセントまたは程度は、置換の保存的性質を補正するように上方調整され得る。この調整を為すための手段は当業者によく知られる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７～３３１頁を参照のこと。
[0089]本明細書で使用される場合、「相同体配列」および「相同性配列」とは互換性で使用され、任意選択でアラインさせた場合に、別の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列（もしくはその相補鎖）またはアミノ酸配列を指す。
[0090]「単離された」物質は、人の手によって天然状態から改変されたものである。「単離された」組成物または物質は、天然に存在する場合、その元の環境から変化されたかまたは取り出されたか、またはその両方である。例えば、生きている動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、同一ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、実質的に純粋な状態で存在するようにその天然状態の共存する物質から十分に分離された場合には「単離されて」いる。単離された「核酸」または「ポリヌクレオチド」は互換的に使用され、単離された核酸分子の配列を指す。ある特定の実施形態では、「単離された抗体またはその抗原結合断片」とは、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換クロマトグラフィーもしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定されて、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の純度を有する抗体または抗原結合断片を指す。
[0091]本明細書で使用される「結合を遮断する」または「同じエピトープに関して競合する」能力とは、２つの分子（例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２と抗ＣＬＤＮ１８．２抗体）間の結合相互作用を検出可能な任意の程度に阻害する抗体または抗原結合断片の能力を指す。ある特定の実施形態では、２つの分子間の結合を遮断する抗体または抗原結合断片は、２つの分子間の結合相互作用を少なくとも５０％だけ阻害する。ある特定の実施形態では、この阻害は、６０％より大きくてもよく、７０％より大きくてもよく、８０％より大きくてもよく、または９０％より大きくてもよい。
[0092]本明細書で使用される用語「抗体コンジュゲート」とは、放射性核種などの別の薬剤との抗体またはその抗原結合断片の連結を指す。
[0093]用語「対象」とは、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ネコ、ウサギ、ヒツジ、イヌ、雌ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類を含む。注記した場合を除いて、「患者」または「対象」という各用語は、本明細書では互換的に使用される。
[0094]用語「抗腫瘍活性」とは、腫瘍細胞の増殖、生存率、または転移活性の低減を意味する。例えば、抗腫瘍活性は、療法無しの対照と比較して、療法に起因する、療法過程で生じる異常細胞の増殖率の低下もしくは腫瘍サイズの安定もしくは縮小、またはより長期の生存によって示され得る。そのような活性は、それらに限定されないが、異種移植モデル、同種移植モデル、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）モデル、および抗腫瘍活性を調査するための当技術分野で既知の他のモデルを含めて、許容されるインビトロまたはインビボの腫瘍モデルを使用して評価され得る。
[0095]本明細書で使用される、状態の「処置する」または「処置」とは、状態を防止または軽減すること、状態の発症または発生の速度を遅くすること、状態を発生させるリスクを減少させること、状態に関連する症状の発生を防止することまたは遅延させること、状態に関連する症状を減少または終止させること、状態の完全または部分退縮を生み出すこと、状態を治癒すること、またはそれらの一部の組合せを含む。
[0096]用語「ＣＬＤＮ１８．２」とは、霊長類（例えば、ヒト、サル）およびげっ歯類（例えばマウス）などの哺乳動物に由来するＣｌａｕｄｉｎ－１８スプライスバリアント２を指す。ある特定の実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２はヒトＣＬＤＮ１８．２である。ヒトＣＬＤＮ１８．２の例示的な配列としては、ヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１００２０２６．１、または配列番号３０）が挙げられる。ＣＬＤＮ１８．２の例示的な配列としては、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（マウス）ＣＬＤＮ１８．２タンパク質（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１１８１８５２．１）カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（クラブイーティングモンキー）ＣＬＤＮ１８．２タンパク質（ＮＣＢＩ参照配列番号ＸＰ＿０１５３００６１５．１）が挙げられる。ＣＬＤＮ１８．２はがん細胞で発現する。一実施形態では、前記ＣＬＤＮ１８．２はがん細胞の表面で発現する。
[0097]用語「ＣＬＤＮ１８．１」とは、霊長類（例えば、ヒト、サル）およびげっ歯類（例えばマウス）などの哺乳動物に由来するＣｌａｕｄｉｎ－１８スプライスバリアント１を指す。ある特定の実施形態では、ＣＬＤＮ１８．１はヒトＣＬＤＮ１８．１である。ヒトＣＬＤＮ１８．１の例示的な配列としては、ヒトＣＬＤＮ１８．１タンパク質（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０５７４５３．１、または配列番号３１）、ハツカネズミ（マウス）ＣＬＤＮ１８．２タンパク質（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１１８１８５１．１）、カニクイザル（クラブイーティングモンキー）ＣＬＤＮ１８．２タンパク質（ＮＣＢＩ参照配列番号ＸＰ＿００５５４５９２０．１）が挙げられる。
[0098]本明細書で使用される「ＣＬＤＮ１８．２関連」疾患または状態とは、ＣＬＤＮ１８．２の発現または活性の増大または低下によって引き起こされる、それらによって悪化される、そうでなければそれらに関係する任意の疾患または状態を指す。一部の実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２関連状態は、例えば、がんである。
[0099]本明細書で使用される「がん」とは、悪性細胞増殖または新生物、異常な増殖、浸潤または転移によって特徴付けられるあらゆる医学的状態を指し、固形腫瘍および白血病などの非固形がん（例えば血液悪性腫瘍）の両方を含む。本明細書において使用される場合、「固形腫瘍」とは、新生物および／または悪性細胞の固形塊を指す。
[00100]用語「薬学的に許容される」とは、指定された担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または塩が、一般に、製剤を含むその他の成分と化学的におよび／または物理的に適合しており、そのレシピエントと生理学的に適合していることを示す。
[00101]本明細書の「約」の値またはパラメータへの言及は、当該値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつこれら記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。数的範囲は、その範囲を規定する数字を含む。一般に言って、用語「約」とは、変数の表示された値、および表示された値の実験誤差以内（例えば、平均値についての９５％信頼区間内）または表示された値の１０パーセント以内のいずれかより大きい方の、変数の全ての値を指す。用語「約」が、期間（年、月、週、日等）の文脈内で使用される場合、用語「約」とは、当該期間±次の下位期間の一定量（例えば、約１年とは、１１～１３か月を意味し；約６か月とは、６か月±１週間を意味し；約１週間とは、６～８日間を意味する；等）、または表示された値の１０パーセント以内、いずれか長い方を意味する。
[00102]抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート
[00103]本開示は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の放射性核種コンジュゲートを提供する。
[00104]Ｃｌａｕｄｉｎ－１８（ＣＬＤＮ１８）分子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：スプライスバリアント１（ＣＬＤＮ１８Ａ１またはＣＬＤＮ１８．１）：ＮＰ＿０５７４５３、ＮＭ＿０１６３６９、およびスプライスバリアント２（ＣＬＤＮ１８Ａ２またはＣＬＤＮ１８．２）：ＮＭ＿００１００２０２６、ＮＰ＿００１００２０２６）は、約２７．９／２７．７２ｋＤの分子量を有する内在性膜貫通タンパク質である。ＣＬＤＮ１８タンパク質は、隣接細胞間における膜内粒子の相互接続ストランドのネットワークを組織化する、上皮および内皮の密着結合内に位置する。ＣＬＤＮ１８およびオクルディンは密着結合において最も顕著な膜貫通タンパク質成分である。それらの強力な細胞間接着特性に起因して、これらの密着結合タンパク質は、一次障壁を造りだして溶質の傍細胞輸送を防止および制御するとともにまた膜の脂質およびタンパク質の側方拡散も制限し、その結果、細胞の極性を維持する。
[00105]ＣＬＤＮ１８は、抗体によって選択的に処理され得る異なるいくつかの立体構造を呈する（Ｓａｈｉｎ Ｕ、Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ Ｍ、Ｄｈａｅｎｅ Ｋ、ら Ｃｌａｕｄｉｎ－１８ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ ２ ｉｓ ａ ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８、１４（２３）：７６２４～７６３４頁を参照のこと）。ＣＬＤＮ１８立体構造１は、大多数のＣＬＤＮファミリーメンバーに関して記載されるように、膜貫通ドメイン（ＴＭ）として役立つ４つの疎水性領域を全て有し、２つの細胞外ループ（疎水性領域１および疎水性領域２によって包含されるループ１；疎水性領域３および４によって包含されるループ２）が形成される。第２の立体構造（ＣＬＤＮ１８立体構造２）は、ＰＭＰ２２に関して記載されるように、第２および第３の疎水性ドメインが形質膜を完全には横断しないため、第１の膜貫通ドメインと第４の膜貫通ドメインとの間の部分（ループＤ３）が細胞外であることを必然的に伴う。第３の立体構造（ＣＬＤＮ１８立体構造３）は、２つの内部疎水性領域が第１および第４の疎水性領域によって包含される状態で大きな細胞外ドメインを示す。ループＤ３における古典的Ｎグリコシル化部位のために、ＣＬＤＮ－１８トポロジーバリアントであるＣＬＤＮ１８トポロジー２およびＣＬＤＮ１８トポロジー３はさらなる細胞外Ｎグリコシル化部位を内部に持つ。
[00106]ＣＬＤＮ１８はマウスとヒトの両方に存在する異なる２種類のスプライスバリアントを有する。スプライスバリアントであるＣＬＤＮ１８．１とＣＬＤＮ１８．２は、第１のＴＭとループ１とを含むＮ末端にての最初の２１個のアミノ酸が異なるが、一方、Ｃ末端のタンパク質配列は同一である（Ｎｉｉｍｉ Ｔ、Ｎａｇａｓｈｉｍａ Ｋ、Ｗａｒｄ Ｊ Ｍ、ら Ｃｌａｕｄｉｎ－１８，ａ ｎｏｖｅｌ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔ／ＥＢＰ／ＮＫＸ２．１ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ，ｅｎｃｏｄｅｓ ｌｕｎｇ－ａｎｄ ｓｔｏｍａｃｈ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、２００１、２１（２１）：７３８０～７３９０頁．を参照のこと）。
[00107]ＣＬＤＮ１８．１は正常な肺および胃の上皮で選択的に発現し、一方、ＣＬＤＮ１８．２は胃細胞でのみ発現する。最も重要なことに、ＣＬＤＮ１８．２発現は、胃上皮の分化した寿命の短い細胞に制限されるが、胃幹細胞領域からは無い。高感度ＲＴ－ＰＣＲを使用する場合であっても、両バリアントは他の正常ヒト臓器においてまったく検出不能である。しかし、両バリアントは、胃、食道、膵臓および肺の各腫瘍を始めとするいくつかのがんタイプ、ならびにヒトがん細胞株で高度に発現する（Ｍａｔｓｕｄａ Ｙ、Ｓｅｍｂａ Ｓ、Ｕｅｄａ Ｊ、ら Ｇａｓｔｒｉｃ ａｎｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｌａｕｄｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｒｏｎｔ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７、９８（７）：１０１４～１０１９頁．を参照のこと）。
[00108]いかなる理論にも束縛されることを望むわけではないが、ＣＬＤＮ１８．２の分子的および機能的特徴が、ＣＬＤＮ１８．２を抗体ベースのがん診断および療法のための高度に興味深い標的とすると考えられる。その特徴としては、（ｉ）毒性関連正常組織の大部分からＣＬＤＮ１８の非存在、（ｉｉ）胃の標的陰性幹細胞によって補充され得る分化した胃細胞のような不必要な細胞集団に対するＣＬＤＮ１８．２バリアント発現の制限、（ｉｉｉ）正常細胞と新生物の細胞との間の起こり得る差次的グリコシル化、および（ｉｖ）様々な立体配座トポロジーの存在、が挙げられる。
[00109]ＣＬＤＮ１８タンパク質の分子量が、腫瘍と隣接する正常組織との間で異なることがわかってきた。より高い分子量のＣＬＤＮ１８タンパク質が健全な組織において観察され、それは、脱グリコシル化合物ＰＮＧａｓｅ Ｆによる正常組織溶解物の処理によって、腫瘍において観察されるのと同じ分子量まで低下され得る。このことは、ＣＬＤＮ１８は、その正常組織のカウンターパートと比較して腫瘍においてはほとんどグリコシル化されないことを示唆する。古典的なＮ－グリコシル化モチーフは、ＣＬＤＮ１８分子のループＤ３ドメイン内のアミノ酸残基１１６においてある。分子量の差異および推測される構造的差異は、抗体結合のための変更されたエピトープを表すことができる。
[00110]加えて、密着結合タンパク質としてのＣＬＤＮ１８は、診断のための良好な特異性にも、処置のための良好な治療域にも寄与することができる。腫瘍細胞はＣＬＤＮを発現するが、正常な上皮組織において見出されるようなＣＬＤＮのホモタイプおよびヘテロタイプの会合によって古典的な密着結合を形成しないことが多いので、腫瘍細胞は、細胞外抗体結合および免疫療法に順応する遊離ＣＬＤＮのかなりのプールを有する可能性が高い。健全な上皮におけるＣＬＤＮのエピトープ結合が、密着結合内において、抗体結合へとアクセスされることから遮られる可能性がある。
[00111]本開示は、放射性核種にコンジュゲートされた抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片を含む、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートを提供する。
[00112]ｉ．放射性核種
[00113]放射性核種とは、放射性崩壊をたどることができる不安定な原子核によって特徴付けられる作用剤である。本開示内で有用な放射性核種には、ガンマ線エミッター、陽電子エミッター、オージェ電子エミッター、Ｘ線エミッターおよび蛍光エミッターが含まれる。放射性核種は治療用または診断用のいずれでもよい。
[00114]ある特定の実施形態では、放射性核種は治療用である。ベータ、アルファおよびオージェ電子などの短距離高ＬＥＴ放出によって崩壊する放射性核種は高度に細胞傷害性であり、したがって、放射線療法目的で設計された物質を標識するのに有用である。治療用放射性核種は、２０～６，０００ｋｅＶの範囲の、例えば、オージェエミッターの場合は６０～２００ｋｅＶ、ベータエミッターの場合は１００～２，５００ｋｅＶ、アルファエミッターの場合は４，０００～６，０００ｋｅＶの範囲の、崩壊エネルギーを有することができる。当業者であれば、要因に基づいて、本明細書で提供される抗体コンジュゲートにおいて使用される適切な治療用核種を選択することができるが、その要因には、放射性核種の半減期、放出された粒子のエネルギー、放出された粒子が移動することができる最大範囲、中でも、がん細胞による放射性核種の十分な濃度と長期間の残留が含まれる。
[00115]治療用放射性核種の例としては、それらに限定されないが、１１１Ｉｎ、１１１ｍＩｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１９９Ａｕおよび２１１Ｐｂが挙げられる。
[00116]オージェ放出粒子で実質的に崩壊する追加の治療用放射性核種の例としては、Ｃｏ－５８、Ｇａ－６７、Ｂｒ－８０ｍ、Ｔｃ－９９ｍ、Ｒｈ－１０３ｍ、Ｐｔ－１０９、Ｉｎ－１１１、Ｓｂ－１１９、Ｉ－１２５、Ｈｏ－１６１、Ｏｓ－１８９ｍおよびＩｒ－１９２が挙げられる。
[00117]アルファ粒子の生成で実質的に崩壊するさらなる追加の放射性核種の例としては、それらに限定されないが：Ｄｙ－１５２、Ａｔ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｒａ－２２３、Ｒｎ－２１９、Ｐｏ－２１５、Ｂｉ－２１１、Ａｃ－２２５、Ｆｒ－２２１、Ａｔ－２１７、Ｂｉ－２１３およびＦｍ－２５５が挙げられる。
[00118]追加の可能性のある治療用放射性核種には、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、１６９Ｙｂ等が含まれる。
[00119]ある特定の実施形態では、放射性核種は診断用である。
[00120]診断用放射性核種は造影剤として使用され得る。造影剤は、動物対象もしくはヒト対象の細胞もしくは組織、またはインビトロ条件下の細胞もしくは組織において、放射性核種およびそれへの被着物質の位置を示すことができる。ある特定の実施形態では、放射性核種とは、インビボでの投与の後に非侵襲的な様式で外側に検出され得るものである。造影剤などの診断用途向けの放射性核種は、比較的低い細胞傷害性を伴うこと、しかし、イメージングに適した放出で崩壊することが好ましい。診断用途を有する放射性核種には、例えば、１８Ｆ、３２Ｐ、３３Ｐ、４５Ｔｉ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７５Ｓｃ、７７Ａｓ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、９９Ｍｏ、１０５Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１ｌｎ、１２３ｌ、１２４ｌ、１２５ｌ、１３１ｌ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５４’’１５８１Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７５Ｌｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４ｌｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃが含まれ得る。本開示の実施形態に従って診断剤として使用され得る常磁性イオンには、それらに限定されないが、遷移金属およびランタニド金属（例えば６～９、２１～２９、４２、４３、４４、または５７～７１の原子番号を有する金属）のイオンが含まれる。これらの金属には、Ｃｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、ＹｂおよびＬｕのイオンが含まれる。
[00121]ある特定の実施形態では、放射性核種は、放射性金属イオン、ガンマ線放出放射性ハロゲンおよび陽電子放出放射性非金属である。ある特定の実施形態では、放射性核種は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）または単一光子放出コンピュータ化断層撮影（ＳＰＥＣＴ）によって検出可能である。例えば、ガンマ線放出で崩壊する放射性核種は、平面イメージングおよび単一光子放出コンピュータ化断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージングに適切であり、一方、陽電子（ベータ）放出および消滅光子で崩壊する放射性核種は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）に適切である。ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴイメージング技術などによって検出可能な診断用放射性核種標識には、例えば、限定されないが、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、８６Ｙ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１２３／１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１１Ｃ、１４Ｃ、４１Ｃａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１３Ｎ、１５Ｏ、４４Ｓｃ、１８Ｆ、９９ｍＴｃ、および９０ｍＴｃ等が含まれる。
[00122]本明細書で使用される用語「陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）」とは、標的の組織若しくは臓器または活性を視覚化するために医療分野で使用される核イメージング技法を指す。ＰＥＴは、生化学レベルで体内の特定の機能をマークするために選択される放射性核種コンジュゲートトレーサー分子からの陽電子放出の後に、立て続けに生成される２つの消滅光子を測定する。ＰＥＴは、解剖所見の代わりに生物学的機能の分子イメージングを提供する。ＰＥＴは、他のイメージング技法により入手不可能な人体の多くの機能の像を作成することにより、患者の検査を可能とする。短寿命の陽電子放出放射性トレーサーは対象に注入された後、安定な対応物に関連する生理学的経路に従って体内に分布することができる。トレーサーが対象の標的に特異的に向けられたターゲティング分子である場合、トレーサーは、そのような標的を発現する組織または臓器の視覚化を可能とする。
[00123]本明細書で使用される用語「ＳＰＥＣＴ」とは「単一光子放出コンピュータ断層撮影」を指し、これはガンマ線を使用する核医学断層撮影イメージング技法である。それは、ガンマカメラを使用する従来の核医学平面型イメージングに類似し、真の３Ｄ情報を提供することができる。この情報は、患者を通る横断面として通常には表示されるが、必要に応じて、自由に再フォーマットまたは操作され得る。ガンマ放出放射性核種またはそのコンジュゲートの対象への注入が、イメージングにとって必要とされる。
[00124]放射性核種コンジュゲートの抗体および抗原結合断片を作製する方法は、当技術分野で既知である。一般に、方法は、金属放射性核種の場合と非金属放射性核種の場合では異なる。金属放射性核種のコンジュゲーションは、コンジュゲーションのためのキレート剤を通常には必要とするが、このキレート剤は非金属放射性核種の場合では必要ない場合がある。
[00125]抗体への金属放射性核種のコンジュゲーション方法は、例えば、適切なキレート剤を介して当技術分野で既知である（例えば、ＷＯ９４／１１０２６；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１巻および２巻、Ｃｏｌｉｇｅｎら、編 Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）を参照のこと）。
[00126]本明細書で使用される用語「キレート剤」とは、２つ以上の結合で金属を結合することができる化学構造を指す。キレート剤は、金属イオンに結合することができる１個または複数のキレート基を有することができる。例えば、キレート剤は、金属イオンへの配位に適した少なくとも１個のヘテロ原子を含み、水溶液から金属イオンを封鎖することができる。
[00127]一部の実施形態では、キレート剤はキレート化のための３個以上の原子を含み、各原子が窒素、硫黄、酸素、およびリンからなる群から選択される。
[00128]本開示に従って使用され得るキレート剤の例としては、それらに限定されないが、ＤＦＯ（デルフェロキサミン）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸）、ＤＴＰＡ（ＮＲ－ジエチレントリアミン五酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－酢酸）、ＴＲＩＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸）；ＴＥＴＡ（１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸）；およびＨＥＴＡ（１，５，９，１３－テトラアザシクロヘキサデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＮＥＴＡ（｛４－［２－（ビス－カルボキシメチルアミノ）－エチル］－７－カルボキシメチル－［１，４，７］トリアゾナン－１－イル｝－酢酸）、ＴＡＣＮ－ＴＭ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，トリス（２－メルカプトエチル）１，４，７－トリアザシクロノナン）、ＴＲＡＰ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－トリス［メチル（２－カルボキシエチル）ホスフィン酸］）、ＣＰ２５６、ＰＣＴＡ（３，６，９，１５－テトラアザビシクロ［９．３．１］ペンタデカ－１（１５），１１，１３－トリエン－３，６，９,－三酢酸）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシム、ならびにそれらの誘導体、が挙げられる。
[00129]一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体コンジュゲートは、キレート剤を介して本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片にコンジュゲートされた金属放射性核種を含む。当業者であれば、例えば、Ｐｒｉｃｅ Ｅ． Ｗら， Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ．， ２０１４， ４３， ２６０－２９０により記載のような、当技術分野で既知の知識に基づいて、放射性核種に適したキレート剤を選択することができる。
[00130]一部の実施形態では、金属放射性核種は、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｚｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、６７Ｇａ、４４Ｓｃ、または９９ｍＴｃであり得る。一部の実施形態では、放射性核種は６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、または８９Ｚｒである。一部の実施形態では、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、または８９Ｚｒは、キレート剤を介して抗体またはその抗原結合断片に標識されている。
[00131]一部の実施形態では、キレート剤は、抗体へのコンジュゲーションのために反応性官能基をさらに含む。キレートは、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，８２４，６５９号に開示されるように、抗体またはペプチドに直接連結され得る。このような反応性基は、キレート剤が、抗体の１個または複数のアミノ酸残基、例えば遊離のシステイン、リジン等の官能基と反応することを可能とする。反応性基の例としては、マレイミド、アミノベンジル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル等が挙げられる。
[00132]ある特定の実施形態では、キレート剤は、二機能性リンカー試薬によって、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合断片にコンジュゲートされる。そのような二機能性リンカーの例としては、限定されないが：Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えばビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えばビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６－ジイソシアネート）、ビス－活性フッ素化合物（例えば１，５－ジフルオロ（ｄｉｆｌｕｏｍ）－２，４－ジニトロベンゼン）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＲＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、およびスルホ－ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＧ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）が挙げられる。これらのリンカー試薬は市販である（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．、Ｕ．Ｓ．Ａ製、４６７～４９８頁、２００３－２００４ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ａｎｄ Ｃａｔａｌｏｇを参照のこと）。
[00133]一部の実施形態では、放射性核種は６４Ｃｕまたは６７Ｃｕであり、キレート剤はＴＥＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＯＤＡ、またはＮＯＤＧＡを含む。一部の実施形態では、放射性核種は８９Ｚｒであり、キレート剤はＤＦＯを含む。
[00134]一部の実施形態では、放射性核種は非金属である。一部の実施形態では、放射性核種は放射性ハロゲンを含む。一部の実施形態では、放射性核種は１２４Ｉまたは１２３Ｉまたは１３１Ｉである。放射性ヨウ素化抗体を調製する方法は当技術分野で既知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒａｓｓｉ，Ｊ．ら（１９８７）．Ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、９１～１４１頁、Ｅｃｌｅｌｍａｎ，Ｗ．Ｃ．ら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４０、３０３６～３０４２頁、１９９８を参照のこと。
[00135]一部の実施形態では、１２４Ｉまたは１２３Ｉまたは１３１Ｉは、抗体またはその抗原結合断片の少なくとも１つのフェニルヒドロキシル基に標識されている。
[00136]ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、Ｎａ１２４Ｉなどの放射性ヨウ素の存在下でチロシン残基への求電子置換によって直接ヨウ素化される。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、前標識の化合物または連結後標識することができる化合物の共有結合連結によって、例えば、ペプチド用のボルトンハンター試薬によって、間接的にヨウ素化される。
[00137]一部の実施形態では、１２４Ｉまたは１２３Ｉまたは１３１Ｉは、酸化剤の存在下で抗体またはその抗原結合断片に標識される。化学的酸化剤および酵素的酸化剤を含めて、適切な任意の酸化剤が使用され得る。例示的な酸化剤としては、限定されないが、Ｎ－ブロモスクシンイミド、クロラミンＴ、塩素ガス、またはラクトペルオキシダーゼが挙げられる。
[00138]一部の実施形態では、１２４Ｉまたは１２３Ｉまたは１３１Ｉは、Ｎ－ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）反応によって、抗体またはその抗原結合断片に標識される。
[00139]一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体コンジュゲートは、ナノ粒子にさらにコンジュゲートされ得る。例えば、ナノ粒子は薬物担体として治療用途で使用され得るが、この薬物担体は、本発明のＣＬＤＮ１８．２特異的抗体または断片にコンジュゲートされた場合に、化学療法剤、放射線療法剤、毒素、または当技術分野で既知の他の任意の細胞傷害性剤もしくは抗がん剤を、細胞表面上でＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するがん性細胞に送達する。
[00140]一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体コンジュゲートは薬物にさらにコンジュゲートされ得るが（例えば、リジン残基のイプシロンアミノ基にて）、担体は追加の治療剤または診断薬を取り込むことができる。
[00141]ｉ．抗体配列
[00142]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体コンジュゲートは、重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに／または軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の配列を含む抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片を含み、ここで、
ＨＣＤＲ１配列は、ＧＹＮＭＮ（配列番号１）、もしくはＴＹＦＩＧＶＧ（配列番号１３）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
ＨＣＤＲ２配列は、Ｘ１ＩＤＰＹＹＸ２Ｘ３ＴＸ４ＹＮＱＫＦＸ５Ｇ（配列番号３２）、もしくはＨＩＷＷＮＤＮＫＹＹＮＴＡＬＫＳ（配列番号１５）、またはその少なくとも８０％（もしくは少なくとも８５％、９０％、９５％）の配列同一性の相同体配列を含み；
ＨＣＤＲ３配列は、Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＧＮＡＦＤＹ（配列番号３３）、もしくはＭＧＳＧＡＷＦＴＹ（配列番号１７）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
ＬＣＤＲ１配列は、ＫＳＳＱＸ９ＬＸ１０ＮＸ１１ＧＮＸ１２ＫＮＹＬＴ（配列番号３４）、またはその少なくとも８０％（もしくは少なくとも８５％、９０％、９５％）の配列同一性の相同体配列を含み；
ＬＣＤＲ２配列は、ＷＡＳＴＲＸ１３Ｓ（配列番号３５）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
ＬＣＤＲ３配列は、ＱＮＤＹＸ１４Ｘ１５ＰＸ１６Ｔ（配列番号３６）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
ここで、Ｘ１はＮまたはＹまたはＨであり、Ｘ２はＧまたはＶであり、Ｘ３はＡまたはＧまたはＴであり、Ｘ４はＲまたはＴまたはＳであり、Ｘ５はＫまたはＲであり、Ｘ６はＳまたはＭであり、Ｘ７はＹまたはＦであり、Ｘ８はＹまたはＨであり、Ｘ９はＳまたはＮであり、Ｘ１０はＬまたはＦであり、Ｘ１１はＳまたはＮであり、Ｘ１２はＱまたはＬであり、Ｘ１３はＥまたはＫであり、Ｘ１４はＳまたはＹであり、Ｘ１５はＦまたはＹであり、かつＸ１６はＦまたはＬである。
[00143]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体コンジュゲートは、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片を含み、ここで、重鎖可変領域は：
ａ）配列番号１および配列番号１３から選択される配列を含むＨＣＤＲ１、
ｂ）配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号１５、配列番号１９、および配列番号２２から選択される配列を含むＨＣＤＲ２、ならびに
ｃ）配列番号５、配列番号１１、配列番号１７、および配列番号２１から選択される配列を含むＨＣＤＲ３、
を含み、かつ／または
軽鎖可変領域は：
ｄ）配列番号２、配列番号１０、配列番号１４、および配列番号２０のうちの配列を含むＬＣＤＲ１、
ｅ）配列番号４および配列番号１６のうちの配列を含むＬＣＤＲ２、ならびに
ｆ）配列番号６、配列番号８、配列番号１２、および配列番号１８から選択される配列を含むＬＣＤＲ３
を含む。
[00144]ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、以下からなる群から選択される：
ａ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号５の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｂ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号５の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｃ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号９の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１１の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｄ）配列番号１３の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１５の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１７の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｅ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１９の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号２１の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに
ｆ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２２の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号５の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域。
[00145]ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、以下からなる群から選択される：
ａ）配列番号２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｂ）配列番号２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号８の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｃ）配列番号１０の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｄ）配列番号２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１２の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｅ）配列番号１４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１８の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに
ｆ）配列番号２０の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
[00146]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体コンジュゲートでは：
ａ）重鎖可変領域は、配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号５の配列を含むＨＣＤＲ３を含み；軽鎖可変領域は、配列番号２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含むか；
ｂ）重鎖可変領域は、配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号５の配列を含むＨＣＤＲ３を含み；軽鎖可変領域は、配列番号２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号８の配列を含むＬＣＤＲ３を含むか；
ｃ）重鎖可変領域は、配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号９の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１１の配列を含むＨＣＤＲ３を含み；軽鎖可変領域は、配列番号１０の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含むか；
ｄ）重鎖可変領域は、配列番号１３の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１５の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１７の配列を含むＨＣＤＲ３を含み；軽鎖可変領域は、配列番号２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１２の配列を含むＬＣＤＲ３を含むか；
ｅ）重鎖可変領域は、配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１９の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号２１の配列を含むＨＣＤＲ３を含み；軽鎖可変領域は、配列番号１４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１８の配列を含むＬＣＤＲ３を含むか；または
ｆ）重鎖可変領域は、配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２２の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号５の配列を含むＨＣＤＲ３を含み；軽鎖可変領域は、配列番号２０の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
[00147]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体コンジュゲートは、ＣＬＤＮ１８．２抗体７Ｃ１２、１１Ｆ１２、２６Ｇ６、５９Ａ９、１８Ｂ１０および１２Ｅ９の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、または６）のＣＤＲ配列を含む。
[00148]本明細書で使用される「７Ｃ１２」とは、配列番号３７の重鎖可変領域および配列番号３８の軽鎖可変領域を有するマウス抗体を指す。
[00149]本明細書で使用される「１１Ｆ１２」とは、配列番号３９の重鎖可変領域および配列番号４０の軽鎖可変領域を有するマウス抗体を指す。
[00150]本明細書で使用される「２６Ｇ６」とは、配列番号４１の重鎖可変領域および配列番号４２の軽鎖可変領域を有するマウス抗体を指す。
[00151]本明細書で使用される「５９Ａ９」とは、配列番号４３の重鎖可変領域および配列番号４４の軽鎖可変領域を有するマウス抗体を指す。
[00152]本明細書で使用される「１８Ｂ１０」とは、配列番号４５の重鎖可変領域および配列番号４６の軽鎖可変領域を有するマウス抗体を指す。
[00153]本明細書で使用される「１２Ｅ９」とは、配列番号４７の重鎖可変領域および配列番号４８の軽鎖可変領域を有するマウス抗体を指す。
[00154]表１は、これらのＣＬＤＮ１８．２抗体のＣＤＲ配列を示す。重鎖および軽鎖の可変領域配列はまた表２に下でも提供される。
[00155]
[00156]
[00157]本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、標識化抗体、二価抗体、または抗イディオタイプ抗体であり得る。組換え抗体とは、動物内ではなく組換え法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製される抗体である。
[00158]ＣＤＲは、抗原結合を担うことが知られるが、しかし、６つＣＤＲの全てが必ずしも不可欠であるわけでも不変であるわけでもないことが見出されてきた。換言すると、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体７Ｃ１２、１１Ｆ１２、２６Ｇ６、５９Ａ９、１８Ｂ１０、または１２Ｅ９（配列番号１～２２のいずれか１つに対応する）において１、２、または３つのＣＤＲを交換または変更または改変し、ＣＬＤＮ１８．２への特異的結合親和性を依然として実質的に保持することが可能である。
[00159]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体７Ｃ１２、１１Ｆ１２、２６Ｇ６、５９Ａ９、１８Ｂ１０、または１２Ｅ９のうちの１つの重鎖ＣＤＲ３配列を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体コンジュゲートは、配列番号５、１１、１７、および２１の重鎖ＣＤＲ３配列を含む。重鎖ＣＤＲ３領域は、抗原結合部位の中心に位置し、したがって、抗原と最も接触し、抗原への抗体の親和性に最も多くの自由エネルギーを供給する、と考えられる。また、重鎖ＣＤＲ３は、多重の多様化メカニズムにより、長さ、アミノ酸組成および立体構造の点で、抗原結合部位に関して群を抜いて最も多様なＣＤＲであるとも考えられる（Ｔｏｎｅｇａｗａ Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ．３０２：５７５～８１頁）。重鎖ＣＤＲ３の多様性は、大半の抗体特異性（Ｘｕ ＪＬ、Ｄａｖｉｓ ＭＭ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１３：３７～４５頁）ならびに望ましい抗原結合親和性（Ｓｃｈｉｅｒ Ｒ、等 Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２６３：５５１～６７頁）を生じるのに十分である。
[00160]一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、重鎖可変ドメインの全てもしくは一部および／または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体および抗原結合断片は、本明細書で提供される重鎖可変ドメインの全部または一部からなる単一ドメイン抗体である。そのような単一ドメイン抗体に関するさらなる情報は当技術分野で入手可能である（例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照のこと）。
[00161]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、抗体およびその抗原結合断片がＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合することができる限り、適切なフレームワーク領域（ＦＲ）配列を含む。表１に提供されるＣＤＲ配列は、マウス抗体から取得されるが、組換え技法などの当技術分野で既知の適切な方法を使用して、なかでもマウス、ヒト、ラット、ウサギなどの適切な任意の種の適切な任意のＦＲ配列に移植され得る。
[00162]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートはヒト化される。ヒト化抗体または抗原結合断片は、ヒトにおけるその低減した免疫原性という点で望ましい。ヒト化抗体は、非ヒトＣＤＲ配列がヒトまたは実質的にヒトのＦＲ配列に移植されるので、その可変領域においてキメラである。抗体または抗原結合断片のヒト化は、ヒト免疫グロブリン遺伝子内の対応するヒトＣＤＲ遺伝子を非ヒト（例えばマウス）ＣＤＲ遺伝子で置換することによって本質的に実施され得る（例えば、Ｊｏｎｅｓら（１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２～５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３～３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４～１５３６頁を参照のこと）。
[00163]適切なヒトの重鎖および軽鎖可変ドメインが、この目的を達成するために、当技術分野で既知の方法を使用して選択され得る。例示的な例では、「ベストフィット」アプローチが使用され得るが、この場合、非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体可変ドメイン配列が、既知のヒト可変ドメイン生殖系列配列のデータベースに対してスクリーニングされるかまたはＢＬＡＳＴ処理され（ＢＬＡＳＴｅｄ）、そして、非ヒトクエリー配列に最も近いヒト配列が特定され、非ヒトＣＤＲ配列を移植するためのヒト足場として使用される（例えば、Ｓｉｍｓら、（１９９３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６頁；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７） Ｊ．Ｍｏｔ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１頁を参照のこと）。代替的に、全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワークが、非ヒトＣＤＲの移植のために使用され得る（例えば、Ｃａｒｔｅｒら（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５頁；Ｐｒｅｓｔａら（１９９３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３頁を参照のこと）。
[00164]ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗体コンジュゲートは、非ヒトであるＣＤＲ配列を除いて実質的に全てヒト配列から構成される。一部の実施形態では、可変領域ＦＲ、および存在する場合には定常領域は、完全にまたは実質的にヒト免疫グロブリン配列由来である。ヒトＦＲ配列とヒト定常領域配列が異なるヒト免疫グロブリン遺伝子に由来する場合があり、例えば、ＦＲ配列があるヒト抗体に由来し、定常領域が別のヒト抗体に由来する場合がある。一部の実施形態では、ヒト化抗体または抗原結合断片は、ヒト重鎖／軽鎖ＦＲ１～４を含む。
[00165]一部の実施形態では、ヒトに由来するＦＲ領域は、それが由来するヒト免疫グロブリンと同じアミノ酸配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ヒトＦＲの１つまたは複数のアミノ酸残基が、親の非ヒト抗体由来の相当する残基で置換される。これは、ヒト化抗体またはその断片を非ヒト親抗体構造により近似させて、免疫原性を減少させるもしくは回避するために、および／または結合活性もしくは結合親和性を改善もしくは保持するために、ある特定の実施形態では望ましいことがある。
[00166]ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗体コンジュゲートは、各ヒトＦＲ配列中に１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を含む、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインの全てのＦＲ中に、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１つ以下のアミノ酸残基置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸残基におけるこのような変化は、重鎖ＦＲ領域のみに、軽鎖ＦＲ領域のみに、または両方の鎖に、存在する可能性がある。ある特定の実施形態では、１個または複数のアミノ酸残基が突然変異される、例えば、ＣＤＲ配列が由来する非ヒト親抗体中に（例えば、マウスフレームワーク領域中）に見出される対応する残基に復帰突然変異される。突然変異に適した位置は、当技術分野で既知の原理に従って、当業者であれば選択され得る。例えば、突然変異の位置は、以下の場所に選択され得る：１）ヒトグレムリン配列のフレームワークにおける残基がほとんど存在しない（例えば、ヒト可変領域配列の２０％未満もしくは１０％未満で）場所；２）当該位置が、ヒト生殖系列鎖の一次配列中の３つのＣＤＲのうちの１つもしくは複数に直接隣接している場所、これは、ＣＤＲ中の残基と相互作用する可能性が高いからである；または３）当該位置が３次元モデルのＣＤＲに近く、したがって、ＣＤＲ中のアミノ酸との相互作用に関して十分可能性を有することができる場所。選択された位置での残基は、親抗体の対応する残基に、またはヒト生殖系列配列の対応する残基でも親抗体の対応する残基でもない残基に、しかし、ヒト配列に通常の残基であって、すなわち、ヒト生殖系列配列と同じサブグループに属する既知のヒト配列中の当該位置でより高頻度で存在する、ヒト配列に通常の残基に、復帰突然変異され得る（米国特許第５，６９３，７６２号を参照のこと）。
[00167]ある特定の実施形態では、本開示のヒト化軽鎖およびヒト化重鎖は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、ＣＬＤＮ１８．２への、親抗体と実質的に同じ親和性、またはそれよりもなお高い親和性を保持する。
[00168]ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるそのヒト化抗体コンジュゲートは、復帰突然変異の有無にかかわらず、ヒト生殖系列フレームワーク配列ＶＫ／４－１の１つもしくは複数の軽鎖ＦＲ配列、および／またはヒト生殖系列フレームワーク配列ＶＨ／１－４６の１つもしくは複数の重鎖ＦＲ配列を含む。必要に応じて、復帰突然変異がヒト生殖系列フレームワーク配列に導入されてもよい。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体１８Ｂ１０は、重鎖フレームワーク配列ＶＨ／１－４６において、全てＫａｂａｔ付番に基づいて、Ｒ７１Ｉ、Ｔ７３Ｋ、Ｔ２８Ｓ、Ｍ６９Ｌ、Ｒ３８Ｋ、およびＭ４８Ｉからなる群から選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含有することができる。ヒト化抗体１８Ｂ１０は、軽鎖フレームワーク配列ＶＫ／４－１において、全てＫａｂａｔ付番に基づいて、Ｓ６３ＴおよびＩ２１Ｍからなる群から選択される１つまたは複数の復帰突然変異を含有することができる。
[00169]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートにおいて、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、および配列番号４７、ならびにＣＬＤＮ１８．２、特にヒトＣＬＤＮ１８．２への特異的な結合親和性を依然として保持しつつ少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む、重鎖可変領域を含む。
[00170]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートにおいて、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、およびＣＬＤＮ１８．２、特にヒトＣＬＤＮ１８．２への特異的な結合親和性を依然として保持しつつ少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む、軽鎖可変領域を含む。
[00171]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、以下を含む：
配列番号２５の配列を含む重鎖可変領域および配列番号２６の配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号２７の配列を含む重鎖可変領域および配列番号２８の配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号２９の配列を含む重鎖可変領域および配列番号２６もしくは２８の配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号３７の配列を含む重鎖可変領域および配列番号３８の配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号３９の配列を含む重鎖可変領域および配列番号４０の配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号４１の配列を含む重鎖可変領域および配列番号４２の配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号４３の配列を含む重鎖可変領域および配列番号４４の配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号４５の配列を含む重鎖可変領域および配列番号４６の配列を含む軽鎖可変領域；または
配列番号４７の配列を含む重鎖可変領域および配列番号４８の配列を含む軽鎖可変領域。
[00172]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、重鎖ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４のうちの１つもしくは複数、ならびに／または軽鎖ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４のうちの１つもしくは複数をさらに含み、ここで：
ＨＦＲ１は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＸ１７ＦＴ（配列番号５４）またはその少なくとも８０％（もしくは少なくとも８５％、９０％、９５％）の配列同一性の相同性配列を含み、
ＨＦＲ２は、ＷＶＸ１８ＱＡＰＧＱＧＬＥＷＸ１９Ｇ（配列番号５５）またはその少なくとも８０％（もしくは少なくとも９０％）の配列同一性の相同性配列を含み、
ＨＦＲ３配列は、ＲＶＴＸ２０ＴＩＤＫＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号５６）、またはその少なくとも８０％（もしくは少なくとも８５％、９０％、９５％）の配列同一性の相同性配列を含み、
ＨＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号５７）またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
ＬＦＲ１は、ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＸ２１ＮＣ（配列番号５８）またはその少なくとも８０％（もしくは少なくとも８５％、９０％、９５％）の配列同一性の相同性配列を含み、
ＬＦＲ２は、ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号５９）またはその少なくとも８０％（もしくは少なくとも８５％、９０％）の配列同一性の相同性配列を含み、
ＬＦＲ３は、ＧＶＰＤＲＦＸ２２ＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣ（配列番号６０）またはその少なくとも８０％（もしくは少なくとも８５％、９０％、９５％）の配列同一性の相同性配列を含み、
ＬＦＲ４は、ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６１）またはその少なくとも８０％（もしくは少なくとも９０％）の配列同一性の相同性配列を含み、
ここで、Ｘ１７はＴまたはＳであり、Ｘ１８はＲまたはＫであり、Ｘ１９はＭまたはＩであり、Ｘ２０はＭまたはＬであり、Ｘ２１はＩまたはＭであり、かつＸ２２はＳまたはＴである。
[00173]ある特定の実施形態では、ＨＦＲ１は配列番号６２および６３からなる群から選択される配列を含み、ＨＦＲ２は、配列番号６４および６５からなる群から選択される配列を含み、ＨＦＲ３は、配列番号６６および６７からなる群から選択される配列を含み、ＨＦＲ４は配列番号５７の配列を含み、ＬＦＲ１は配列番号６８および６９からなる群からの配列を含み、ＬＦＲ２は配列番号５９の配列を含み、ＬＦＲ３は、配列番号７０および７１からなる群から選択される配列を含み、ＬＦＲ４は配列番号６１の配列を含む。
[00174]
[00175]表３－２は、ヒト化１８Ｂ１０抗体の可変領域の配列を例示する。
[00176]
[00177]ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの定常領域に融合された重鎖可変領域、およびヒトカッパ鎖の定常領域に融合された軽鎖可変領域を含むことができる。
[00178]本明細書で提供されるヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、ＣＬＤＮ１８．２発現細胞への特異的な結合親和性を保持していたが、こういった面で、親抗体に少なくとも匹敵するかまたはそれよりもなお良好である。本明細書で提供されるヒト化抗体全てが、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび腫瘍細胞表面にての標的の架橋結合によって誘導されるアポトーシスの誘導による細胞殺滅ならびに増殖の直接阻害を媒介することができるという点で、本明細書で提供されるヒト化抗体は、ＮＵＧＣ４細胞、ＳＮＵ－６２０細胞、ＳＮＵ－６０１細胞、またはＫＡＴＯＩＩＩ細胞などのＣＬＤＮ１８．２発現細胞とのそれらの機能的相互作用を保持することもできる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体およびその抗原結合断片は、免疫グロブリン定常領域、任意選択でヒトＩｇの定常領域、または任意選択でヒトＩｇＧの定常領域をさらに含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、重鎖および／または軽鎖の定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、および／またはＣＨ２－ＣＨ３領域を含む。ある特定の実施形態では、重鎖定常領域はＦｃ領域を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖定常領域はＣκまたはＣλを含む。
[00179]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体およびその断片は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の定常領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体およびその抗原結合断片は、ＩｇＧ１アイソタイプの定常領域を含む。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１の定常領域は、配列番号４９、またはその少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％）の配列同一性を有する相同性配列を含む。
[00180]ＩｇＧ１アイソタイプの定常領域は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣなどのエフェクター機能を誘導することができる。本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体およびその抗原結合断片のエフェクター機能は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞に対する細胞傷害性をもたらすことができる。エフェクター機能は、種々のアッセイ、例えば、Ｆｃ受容体結合アッセイ、Ｃ１ｑ結合アッセイ、および細胞溶解アッセイ、ならびにＡＤＣＣまたはＣＤＣを決定するための上記のアッセイのいずれかを使用して評価され得る。
[00181]驚くべきことに、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体およびその断片は、ヒトＣＬＤＮ１８．２を中発現する細胞株（例えばＮＵＧＣ４細胞）、ヒトＣＬＤＮ１８．２を低発現する細胞株（例えば、ＳＮＵ－６２０、ＳＮＵ－６０１、およびＫＡＴＯＩＩＩ細胞）に高い親和性を有することが、本発明者らによって見出された。このことは、ヒトＣＬＤＮ１８．２を低発現する細胞への特異的結合または匹敵する結合を示さないＩＭＡＢ３６２などの既存の抗体とは区別された。キメラＩｇＧ１抗体ＩＭＡＢ３６２は、米国特許出願第２００９１６９５４７号Ａ１に開示のアミノ酸配列（ＩＭＢ３６２の重鎖および軽鎖の可変領域配列は配列番号７２および配列番号７３として本明細書に含まれる）ならびにＣＡＳ番号１４９６５５３－００－４を有する、Ｇａｎｙｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡＧによって開発された抗ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体である。ＩＭＡＢ３６２は、ＣＬＤＮ１８．２の第１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ１）を認識し、Ｃｌａｕｄｉｎ １８の密接に関連するスプライスバリアント１（ＣＬＤＮ１８．１）を始めとする他のｃｌａｕｄｉｎファミリーメンバーにまったく結合しない。
[00182]ＮＵＧＣ４細胞は、がん患者由来の傍胃リンパ節から樹立された細胞株である（Ａｋｉｙａｍａ Ｓら、Ｊｐｎ Ｊ Ｓｕｒｇ．１９８８年７月；１８（４）：４３８～４６頁を参照のこと）。ＮＵＧＣ４細胞株は、ＪＣＲＢ細胞バンクから受託番号ＪＣＲＢ０８３４で入手可能である。
[00183]ＳＮＵ－６０１細胞もＳＮＵ－６２０細胞も両方とも、Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＳＮＵ）によってがん患者の腹水から樹立されたヒト胃癌細胞株である（ＫＵ ＪＬら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．２００５年２月；３７（１）：１～１９頁；Ｐａｒｋら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１９９７年２月７日；７０（４）：４４３～４４９頁）。ＳＮＵ－６０１細胞およびＳＮＵ－６２０細胞は、Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋからそれぞれ００６０１および００６２０の受託番号で入手可能である。
[00184]ＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞は、胃がん患者の転移部に由来する細胞株である（Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ Ｍ、ら Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．４８：６１～６８頁、１９７８．を参照のこと）。ＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞株は、ＡＴＣＣから受託番号ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１０３で入手可能である。
[00185]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、ＫｉｎＥｘＡアッセイによって測定した場合、２．５ｎＭ以下（または２．４、２．３、２．２、２．１、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４ｎＭ以下）のＫＤ値でヒトＣＬＤＮ１８．２発現細胞（例えばＮＵＧＣ４細胞株またはＫＡＴＯＩＩＩ細胞株）に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、ＫｉｎＥｘＡアッセイによって測定した場合、ＩＭＡＢ３６２のＫｄ値の８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％以下のＫｄ値でヒトＣＬＤＮ１８．２発現細胞に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、ＫＤ値は、ＮＵＧＣ４細胞、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞、ＳＮＵ－６０１細胞、ＳＮＵ－６２０細胞を用いて、または、これらの同等である細胞であって、ＮＵＧＣ４細胞、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞、ＳＮＵ－６０１細胞、もしくはＳＮＵ－６２０細胞のレベルに匹敵するかもしくはそれ以下のヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質発現レベルを有する同等である細胞を用いて、決定される。ある特定の実施形態では、ＫＤ値は、ヒトＣＬＤＮ１８．２を高発現する細胞株またはヒトＣＬＤＮ１８．２を中発現する細胞株を用いて決定される。
[00186]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、ヒトＣＬＤＮ１８．２（またはマウスＣＬＤＮ１８．２）発現細胞への結合に関して、フローサイトメトリーアッセイによって測定した場合、７０μｇ／ｍｌ以下（または６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、もしくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１μｇ／ｍｌ以下）であるＥＣ５０値を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、フローサイトメトリーアッセイによって測定した場合、ＩＭＡＢ３６２のＥＣ５０値の８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、１％、または０．１％以下のＥＣ５０値で、ヒトＣＬＤＮ１８．２発現細胞に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、ＥＣ５０値は、ＮＵＧＣ４細胞株、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞株、ＳＮＵ－６０１細胞株、ＳＮＵ－６２０細胞株を用いて、または、これらの同等である細胞であって、ＮＵＧＣ４細胞株、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞株、ＳＮＵ－６０１細胞株、もしくはＳＮＵ－６２０細胞株のレベルに匹敵するかもしくはそれ以下のヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質発現レベルを有する同等である細胞を用いて、例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２を低発現する細胞株、もしくはヒトＣＬＤＮ１８．２を中発現する細胞株を用いて、決定される。ある特定の実施形態では、ＥＣ５０は、ヒトＣＬＤＮ１８．２を高発現する細胞株を用いて決定される。
[00187]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、ヒトＣＬＤＮ１８．２を高発現する細胞株またはヒトＣＬＤＮ１８．２を中発現する細胞株への結合について、５、４、３または２μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値を有する。
[00188]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、フローサイトメトリーアッセイによって測定した場合、７０μｇ／ｍｌ以下（または６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、もしくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１μｇ／ｍｌ以下）のＮＵＧＣ４細胞への結合に関してのＥＣ５０値を有する。
[00189]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、ＣＬＤＮ１８．１（例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．１またはマウスＣＬＤＮ１８．１）に結合しない。
[00190]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、フローサイトメトリーによって測定した場合、１．５μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値で、マウスＣＬＤＮ１８．２（例えばマウスＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞）に特異的に結合することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、フローサイトメトリーによって測定した場合、０．１μｇ／ｍｌ～１．５μｇ／ｍｌ（例えば、０．１μｇ／ｍｌ～１．２μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ～０．８μｇ／ｍｌ、または０．６７μｇ／ｍｌ）のＥＣ５０でマウスＣＬＤＮ１８．２に結合する。
[00191]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体および本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、様々なレベルのヒトＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞において抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性および／またはＣＤＣ活性を誘導することができる。
[00192]本明細書で使用される場合、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」とは、細胞媒介性反応であって、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。標的細胞の溶解は細胞外であり、細胞間の直接接触を必要とし、補体を伴わない。ＡＤＣＣは、抗原提示と腫瘍特異的Ｔ細胞応答の誘導とをもたらす、様々な程度の即時腫瘍破壊を直接誘導するメカニズムと捉えられ得る。ＡＤＣＣのインビボ誘導は、腫瘍特異的Ｔ細胞応答および宿主由来抗体応答をもたらすと考えられる。
[00193]ＡＤＣＣを行う方法は当技術分野で既知である。全般に、ＣＬＤＮ１８．２発現細胞などの標的細胞が、ある範囲の濃度の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体とともにインキュベートされ、洗浄後、Ｆｃ受容体発現細胞などのエフェクター細胞が添加されてＡＤＣＣが起こることを可能とする。細胞傷害性または細胞生存率が、エフェクター細胞と標的細胞を混合して数時間後の一時点で決定され、その結果、ＡＤＣＣのレベルを定量化する。細胞傷害性は、溶解した標的細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光色素または乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）などの天然細胞内タンパク質）の放出によって検出され得る。別の実施形態では、細胞生存率は、培養物中の生細胞の数に比例する発光シグナルを生成するルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用して（すなわちＡＤＣＣレポーターアッセイ）、代謝的に活性な細胞の指標（例えばＡＴＰ）によって決定される（例えば、Ｃｒｏｕｃｈ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６０、８１～８頁を参照のこと）。エフェクター細胞の例は、ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ、またはＦｃγＲＩＩＩ発現細胞である。
[00194]「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下での標的の溶解による、抗体によって誘導され得る別の細胞殺滅の方法である。ＩｇＭは補体活性化に最も効果的なアイソタイプである。ＩｇＧ１とＩｇＧ３はどちらもまた、古典的補体活性化経路を介するＣＤＣ誘導時に極めて効果的である。このカスケードでは、抗原－抗体複合体の形成は、同種抗原と複合体を形成したＩｇＧ分子などの関与する抗体分子の、ＣＨ２ドメイン上で極めて近接した多重のＣｌｑ結合部位の曝露をもたらす（Ｃｌｑは補体Ｃ１の３つの副成分のうちの１つである）。こういった曝露されたＣｌｑ結合部位は、それまで低親和性であったＣｌｑ－ＩｇＧ相互作用を高アビディティの相互作用に転換し、このことが、一連の他の補体タンパク質を伴う事象のカスケードを作動させ、エフェクター細胞走化性／活性化剤Ｃ３ａおよびＣ５ａのタンパク質分解性の放出をもたらす。補体カスケードは、水および溶質が細胞内および細胞外への自由な通過を容易にする孔を細胞膜に造り出す膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成で終了する。
[00195]ＣＤＣ活性は、上で論じられたＡＤＣＣ活性の方法と同様の方法によって決定され得るが、エフェクター細胞が使用されないことを除いて、ヒト血清に由来する補体の存在が必要とされる。簡潔に述べると、抗体試料をアッセイ培地で連続的に希釈し、ヒト血清補体の存在下でＣＬＤＮ１８．２を発現する標的細胞とともにインキュベートした。インキュベーション後、細胞傷害性または細胞生存率は、溶解した標的細胞からの標識の放出によって、または代謝的に活性な細胞の指標（例えばＡＴＰ）によって決定される。代謝的に活性な細胞のＡＴＰをアッセイするＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬が使用され得、細胞溶解の程度は適当なリーダーを用いて発光の強度を測定することによって定量化され得る。
[00196]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートを介したＡＤＣＣまたはＣＤＣ誘導性細胞死は、未処理細胞と比べて評価され得るヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Ｍｏｏｒｅら Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１～１１頁（１９９５）を参照のこと）または７ＡＡＤの取込みによって評価されるような、膜統合性の喪失によって決定され得る。
[00197]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、細胞傷害性アッセイによって測定した場合、１μｇ／ｍｌ以下（または０．９、０．８、０．７、０．６、０．５μｇ／ｍｌ以下）のＥＣ５０値で、ヒトＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞上で補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を誘導することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体およびその断片は、細胞傷害性アッセイによって測定した場合、ＩＭＡＢ３６２のＥＣ５０値の８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％以下のＥＣ５０値で、ヒトＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞上でＣＤＣを誘導することができる。ある特定の実施形態では、ＣＤＣは、ヒトＣＬＤＮ１８．２を中発現する細胞株またはヒトＣＬＤＮ１８．２を高発現する細胞株を用いて決定される。
[00198]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、ＡＤＣＣレポーターアッセイによって測定した場合、２μｇ／ｍｌ以下（または１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、もしくは０．１μｇ／ｍｌ以下）のＥＣ５０値で、ヒトＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞上で抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、ＡＤＣＣレポーターアッセイによって測定した場合、ＩＭＡＢ３６２のＥＣ５０値の８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、もしくは１％以下のＥＣ５０値で、またはＩＭＡＢ３６２の総ＡＤＣＣ能（例えば、抗体濃度対ＡＤＣＣ活性レベルのプロットにおいて観察される最大レベルのＡＤＣＣ活性によって示されるような）の少なくとも１２０％、１５０％、１８０％、もしくは２００％の総ＡＤＣＣ能で、ヒトＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞上でＡＤＣＣを誘導する。ある特定の実施形態では、ＡＤＣＣは、ＮＵＧＣ４細胞株、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞株、ＳＮＵ－６０１細胞株、ＳＮＵ－６２０細胞株を用いて、または、これらの同等である細胞であって、ＮＵＧＣ４細胞株、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞株、ＳＮＵ－６０１細胞株、もしくはＳＮＵ－６２０細胞株のレベルに匹敵するかもしくはそれ以下のヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質発現レベルを有する同等である細胞を用いて、例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２を中発現する細胞株、もしくはヒトＣＬＤＮ１８．２を低発現する細胞株を用いて、決定される。
[00199]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、ＡＤＣＣレポーターアッセイによって測定した場合、２μｇ／ｍｌ以下（または１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、もしくは０．１μｇ／ｍｌ以下）のＥＣ５０値で、ＮＵＧＣ４細胞上でＡＤＣＣを誘導することができる。
[00200]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、配列番号３０のアミノ酸配列を有するヒトＣＬＤＮ１８．２の位置Ｄ２８、Ｗ３０、Ｖ４３、Ｎ４５、Ｙ４６、Ｌ４９、Ｗ５０、Ｒ５１、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｆ６０、Ｅ６２、Ｙ６６、Ｌ７２、Ｌ７６、Ｖ７９およびＲ８０にてのアミノ酸残基のうちの少なくとも１個または複数（例えば、１個、２個、３個またはそれ超）を含むエピトープに結合する。
[00201]本明細書で使用される用語「エピトープ」とは、抗体が結合する抗原の原子またはアミノ酸の特定の群を指す。エピトープは、抗体と直接接触する特定のアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基を含むことができる。当業者であれば、過度の実験を行わずに、ある抗体と本開示の抗体の２種の抗体がＣＬＤＮ１８．２抗原ポリペプチドへの結合について競合するかどうかを確かめることによって、当該抗体が、本開示の抗体（例えば、本明細書で提供されるハイブリドーマ／キメラまたはヒト化の各抗体７Ｃ１２、１１Ｆ１２、２６Ｇ６、５９Ａ９、１８Ｂ１０ならびにこれらのキメラバリアントおよびヒト化バリアントのいずれか）と同じエピトープもしくは重複エピトープまたは隣接するエピトープに結合するかどうかを、決定することが可能であることを理解するであろう。
[00202]２種の抗原結合タンパク質（例えば抗体）に関して本明細書で使用される、用語「結合について競合する」とは、競合結合アッセイによって決定される場合、一方の抗原結合タンパク質が、抗原（例えば、ヒト／マウスＣＬＤＮ１８．２）への他方の抗原結合タンパク質の結合を遮断するまたは減少させることを意味する。競合結合アッセイは、当技術分野でよく知られており、例えば、直接または間接のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、直接または間接の酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、およびサンドイッチ競合アッセイを含む（例えば、Ｓｔａｈｌｉら、１９８３、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２～２５３頁を参照のこと）。通常には、そのようなアッセイは、固体表面に結合した精製抗原または抗原担持細胞、未標識試験抗体および標識参照抗体の使用を伴う。競合阻害は、試験抗体の存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通例、試験抗体は過剰に存在する。２種の抗体がＣＬＤＮ１８．２への結合について競合する場合、当該２種の抗体は、同じエピトープもしくは重複エピトープ、または他の抗体によって結合されるエピトープと立体障害が生じるのに十分に近い隣接エピトープに結合する。通例、競合する抗体は、過剰に存在する場合、共通の抗原への試験抗体の特異的結合を少なくとも５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％またはそれ超だけ、阻害する（例えば減少させる）ことになる。
[00203]ある特定の実施形態では、抗体によって結合されるエピトープまたはエピトープのアミノ酸残基は、抗原、すなわちＣＬＤＮ１８．２の特定の残基を突然変異させることによって決定され得る。抗体が、野生型ＣＬＤＮ１８．２へのそれの結合と比べて有意に減少したレベルにて、例えばアラニンに突然変異されたアミノ酸残基を有する突然変異型ＣＬＤＮ１８．２に結合する場合、このことは、突然変異された残基がＣＬＤＮ１８．２抗原への抗体の結合に直接関与するか、または、抗体が抗原に結合されている場合、突然変異された残基は抗体に極めて近接していることを示す。そのような突然変異された残基はエピトープ内にあると考えられ、抗体はその残基を含むエピトープに特異的に結合すると考えられる。本明細書で使用される結合における有意に減少したレベルとは、抗体と突然変異型ＣＬＤＮ１８．２との間の結合親和性（例えば、ＥＣ５０、Ｋｄ、または結合能）が、抗体と野生型ＣＬＤＮ１８．２との間の結合と比べて、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ超より大きく減少することを意味する。そのような結合測定は、当技術分野で既知でかつ本明細書で開示される適切な任意の方法、例えば、限定されないが、ＫｉｎＥｘＡアッセイおよびフローサイトメトリーを使用して実行され得る。
[00204]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、野生型ＣＬＤＮ１８．２の残基がアラニンで置換された突然変異型ＣＬＤＮ１８．２に対して有意により低い結合を呈し、残基は、ヒトＣＬＤＮ１８．２のＤ２８、Ｗ３０、Ｖ４３、Ｎ４５、Ｙ４６、Ｌ４９、Ｗ５０、Ｒ５１、Ｒ５５、Ｅ５６、Ｆ６０、Ｅ６２、Ｙ６６、Ｌ７２、Ｌ７６、Ｖ７９およびＲ８０からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、残基はＥ５６である。ある特定の実施形態では、残基は、Ｗ３０、Ｌ４９、Ｗ５０、Ｒ５５、およびＥ５６からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、残基は、Ｔ４１、Ｎ４５、Ｙ４６、Ｒ５１、Ｆ６０、Ｅ６２、およびＲ８０からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、残基は、Ｄ２８、Ｖ４３、Ｎ４５、Ｙ４６、Ｙ６６、Ｌ７２、Ｌ７６、およびＶ７９からなる群から選択される。
[00205]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、ヒトＣＬＤＮ１８．２のＥ５６Ａを含む突然変異型ＣＬＤＮ１８．２への結合において、抗体と野生型ＣＬＤＮ１８．２との間の結合と比べて、少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９９％またはそれ超の減少を呈する。
[00206]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートはヒトＣＬＤＮ１８．２のＷ３０Ａ、Ｌ４９Ａ、Ｗ５０Ａ、Ｒ５５Ａ、およびＥ５６Ａからなる群から選択される１つまたは複数の突然変異された残基を含む突然変異型ＣＬＤＮ１８．２への結合において、抗体と野生型ＣＬＤＮ１８．２との間の結合と比べて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の減少を呈する。
[00207]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、ヒトＣＬＤＮ１８．２のＤ２８、Ｖ４３、Ｎ４５、Ｙ４６、Ｙ６６、Ｌ７２、Ｌ７６、およびＶ７９からなる群から選択される１つまたは複数の突然変異された残基を含む突然変異型ＣＬＤＮ１８．２への結合において、抗体と野生型ＣＬＤＮ１８．２との間の結合と比べて、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％の減少を呈する。
[00208]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、ヒトＣＬＤＮ１８．２のＴ４１Ａ、Ｎ４５Ａ、Ｙ４６Ａ、Ｒ５１Ａ、Ｆ６０Ａ、Ｅ６２Ａ、およびＲ８０Ａからなる群から選択される１つまたは複数の突然変異された残基を含む突然変異型ＣＬＤＮ１８．２への結合において、抗体と野生型ＣＬＤＮ１８．２との間の結合と比べて、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％の減少を呈する。
[00209]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、Ａ４２および／またはＮ４５に結合しない。
[00210]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、その抗原結合断片、および抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、本明細書で提供されるエピトープに結合することができ、ヒトＣＬＤＮ１８．２を中発現する細胞株またはヒトＣＬＤＮ１８．２を低発現する細胞株においてＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を誘導することができる。
[00211]ｉｉ．抗体バリアント
[00212]本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート中の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体およびその抗原結合断片はまた、本明細書で提供される抗体配列の種々のタイプのバリアントも包含する。
[00213]ある特定の実施形態では、バリアントは、表１に提供される１、２、もしくは３つのＣＤＲ配列中に、１つもしくは複数のＦＲ配列中に、本明細書で提供される重鎖もしくは軽鎖の可変領域配列中に、および／または定常領域（例えばＦｃ領域）中に、１つもしくは複数の改変または置換を含む。そのような抗体バリアントは、その親抗体のＣＬＤＮ１８．２への特異的結合親和性を保持するが、改変または置換によって付与される１つまたは複数の望ましい特性を有する。例えば、抗体バリアントは、２、３例を挙げると、改善した抗原結合親和性、改善したグリコシル化パターン、グリコシル化の減少したリスク、減少した脱アミノ化、減少または向上したエフェクター機能、改善したＦｃＲｎ受容体結合、延長した薬物動態半減期、ｐＨ感受性、および／またはコンジュゲーションに対する適合性（例えば、１つもしくは複数の導入されたシステイン残基）を有する場合がある。
[00214]親抗体配列はスクリーニングされて、当技術分野で既知の方法、例えば「アラニンスキャニング変異導入」（例えば、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１～１０８５頁を参照のこと）を使用して、改変または置換されるのに適切であるかまたは好ましい残基を特定することができる。簡潔に言えば、標的残基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕなどの荷電残基）が特定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えばアラニンまたはポリアラニン）と置き換えられ得、そして改変抗体が作製され、目的の特性についてスクリーニングされる。特定のアミノ酸位置での置換が目的の機能変化を明示する場合、当該位置は改変または置換向けに可能性のある残基として特定され得る。可能性のある残基は、異なるタイプの残基（例えば、システイン残基、正に荷電した残基等）と置換することによってさらに評価され得る。
ａ）親和性バリアント
[00215]親和性バリアントは、親抗体のＣＬＤＮ１８．２への特異的結合親和性を保持するか、または親抗体に勝って改善されたＣＬＤＮ１８．２特異的結合親和性さえも有する。当技術分野で既知の種々の方法がこの目的を達成するために使用され得る。例えば、抗体バリアント（例えばＦａｂバリアントまたはｓｃＦｖバリアント）のライブラリがファージディスプレイ技術を用いて生成および発現され、次いで、ヒトＣＬＤＮ１８．２への結合親和性についてスクリーニングされ得る。別の例の場合、コンピュータソフトウェアが使用されて、ヒトＣＬＤＮ１８．２への抗体の結合を仮想的にシミュレートし、結合界面を形成する抗体上のアミノ酸残基を特定することができる。そのような残基は、結合親和性の減少を防止するように置換において回避されてもよく、より強力な結合をもたらす置換に向けて標的とされてもよい。
[00216]ある特定の実施形態では、ＣＤＲ配列、ＦＲ配列、または可変領域配列中の置換のうちの少なくとも１つ（または全て）は保存的置換を含む。アミノ酸配列に関して「保存的置換」とは、アミノ酸残基を、同様の生理化学的特性を備える側鎖を有する異なるアミノ酸残基と交換することを指す。例えば、保存的置換は、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ）の間で、中性親水性側鎖を有する残基（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎ）の間で、酸性側鎖を有する残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の間で、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇ）の間で、または芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）の間で行われ得る。当技術分野で既知であるように、保存的置換は、通常、タンパク質のコンホメーション構造において重大な変化を引き起こさず、したがって、タンパク質の生物活性を保持する可能性がある。
[00217]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体または抗原結合断片は、１つもしくは複数のＣＤＲ配列および／または１つもしくは複数のＦＲ配列中に、１つまたは複数のアミノ酸残基置換を含む。ある特定の実施形態では、親和性バリアントは、１つもしくは複数のＣＤＲ配列および／またはＦＲ配列中に、合計で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つ以下の置換を含む。
[00218]ある特定の実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体およびその抗原結合断片は、表１に列挙されるＣＤＲ配列（単数または複数）と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する１、２、または３つのＣＤＲ配列を含み、それと同時に、その親抗体と同様かまたはそれよりも一層高いレベルでのＣＬＤＮ１８．２への結合親和性を保持する。
[00219]ある特定の実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体およびその抗原結合断片は、配列番号２３～２９および３７～４８の可変領域配列（単数または複数）と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する１つまたは複数の可変領域配列を含み、それと同時に、その親抗体と同様かまたはそれよりも一層高いレベルでのＣＬＤＮ１８．２への結合親和性を保持する。一部の実施形態では、合計１～１０個のアミノ酸が、配列番号２５～２９および３７～４８から選択される配列において、置換、挿入、または欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲの外側の領域において（すなわち、ＦＲにおいて）起こる。
ｂ）グリコシル化バリアント
[00220]本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート中の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体および抗原結合断片はまた、グリコシル化バリアントも包含し、これは、抗体または抗原結合断片のグリコシル化の程度を増減するように取得され得る。本明細書で使用される用語「グリコシル化」とは、グリカン、例えば、フコース、キシロース、マンノース、またはＧｌｃＮＡｃホスホセリングリカンをタンパク質、脂質、またはその他の有機分子に付着させる酵素プロセスを指す。グリカンに連結される炭素に応じて、グリコシル化は、Ｎ結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化、リン酸グリコシル化、Ｃ結合型グリコシル化、およびグリピエーションを含めて５つのクラスに分けられ得る。
[00221]抗体のグリコシル化は通常はＮ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基、例えばアスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－スレオニンなどのトリペプチド配列におけるアスパラギン残基の側鎖への、炭水化物部分の付着を指し、この場合、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である。Ｏ結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も普通にはセリンまたはスレオニンへの、糖であるＮ－アセチルガラクトサミン（ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、付着を指す。
[00222]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体および抗原結合断片は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣなどの改善されたエフェクター機能を有するグリコシル化バリアントを包含する。
[00223]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合断片はアフコシル化される。「アフコシル化」または「アフコシル化される」という各用語は、抗体に付着したＮ－グリカン上でのコアフコースの減少または除去を指す。ヒトＩｇＧ抗体の大多数のグリカンは、コアフコース残基が０個、１個、または２個の末端ガラクトースを有する複合二分岐分子であるＧ０、Ｇ１、およびＧ２として知られる。
[00224]アフコシル化抗体バリアントは、例えば、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉら Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９～１２４９頁（２００４）；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉら Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４頁（２００４）に記載されているように、当技術分野で既知の方法を使用して作製され得る。
[00225]ある特定の実施形態では、抗体グリコシル化バリアントは、抗体のＦｃにおけるＣＨ２領域のＡｓｎ２９７部位でアフコシル化される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における約２９７位に位置するアスパラギン残基（Ｆｃ領域残基のＥＵ付番）を指す；しかし、抗体におけるわずかな配列変動に起因して、Ａｓｎ２９７はまた、２９７位の約±３個のアミノ酸の上流または下流、すなわち２９４位と３００位の間に位置する場合もある。
[00226]ある特定の実施形態では、抗体グリコシル化バリアントは、例えば、Ｎ結合型グリコシル化部位のトリペプチド配列、またはＯ結合型グリコシル化部位のセリン残基もしくはスレオニン残基、が抗体にもＦｃ配列にももはや存在しないように、天然のグリコシル化部位の除去（例えば、Ｎ２９７Ａ置換による）によって、取得され得る。代替的に、ある特定の実施形態では、抗体グリコシル化バリアントは、選択した糖基を抗体の成熟コア炭水化物構造に付加することができない宿主細胞株において抗体を産生させることによって、取得される場合がある。
ｃ）システイン操作型バリアント
[00227]本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート中の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体および抗原結合断片はまた、システイン操作型バリアントを包含し、これは、１個または複数の導入された遊離システインアミノ酸残基を含む。
[00228]遊離システイン残基とは、ジスルフィド架橋の一部ではないシステイン残基である。システイン操作型バリアントは、操作型システインの部位での、例えばマレイミドまたはハロアセチルを通した、例えば、なかでも細胞傷害性化合物および／もしくはイメージング化合物、標識、または放射性同位体（ｒａｄｉｏｉｓｏｐｔｙｐｅ）とのコンジュゲーションに有用である。抗体または抗原結合断片を操作して遊離システイン残基を導入する方法は当技術分野で既知であり、例えばＷＯ２００６／０３４４８８を参照のこと。
ｄ）Ｆｃバリアント
[00229]本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート中の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体および抗原結合断片は、これのＦｃ領域および／またはヒンジ領域に１つもしくは複数のアミノ酸残基の改変または置換を含むＦｃバリアントも包含する。
[00230]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、野生型定常領域と比べてＣＤＣまたはＡＤＣＣの向上を付与する、１つもしくは複数のアミノ酸残基の置換または改変を含む定常領域を含む。Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインにてのある特定のアミノ酸残基は、例えばＦｃγＲＩＩＩＡへのＦｃドメインの親和性を増強することによって増強されたＡＤＣＣ活性をもたらすために置換され得る。抗体操作によってＡＤＣＣ活性を変更する方法は、当技術分野で記載されており、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１．２７６（９）：６５９１～６０４頁；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００．１６４（８）：４１７８～８４頁；Ｓｔｅｕｒｅｒ Ｗら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５、１５５（３）：１１６５～７４頁；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１、１６６（４）：２５７１～５頁；Ｌａｚａｒ ＧＡら、ＰＮＡＳ、２００６、１０３（１１）：４００５～４０１０頁；Ｒｙａｎ ＭＣら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．、２００７、６：３００９～３０１８頁；Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＯ，ら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００８、７（８）：２５１７～２７頁；Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２００２、２７７：２６７３３～２６７４０頁；Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２００３、２７８：３４６６～３４７３頁を参照のこと。
[00231]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、例えばＣ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を改善または低減することによって補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を変更する１つまたは複数のアミノ酸の置換を含む（例えば、ＷＯ９９／５１６４２；Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８～４０頁（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＦｃ領域バリアントの他の例に関するＷＯ９４／２９３５１を参照のこと）。
[00232]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合断片の定常領域は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｐ３９６Ｌ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、配列番号４９（すなわち野生型配列）と比べて１つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含む。ある特定の実施形態では、定常領域は配列番号５１の配列を含む。
[00233]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのｐＨ依存性結合を改善する１つまたは複数のアミノ酸の置換を含む。そのようなバリアントは、バリアントがリソソームでの分解から逃れ、次いで細胞外へ移動および放出されることを可能とする酸性ｐＨでＦｃＲｎに結合する場合、延長した薬物動態半減期を有することができる。抗体およびその抗原結合断片を操作してＦｃＲｎとの結合親和性を改善する方法は当技術分野でよく知られており、例えば、Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、６（１）：６３～７３頁、１９９８；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．ら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１巻、２７章：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＫ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒにより出版、２０１０；Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７０：３２６９～３２７７頁（２０１０）；およびＨｉｎｔｏｎ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７６：３４６～３５６頁（２００６）を参照のこと。
[00234]ｉｉｉ．抗原結合断片
[00235]本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートはまた、抗ＣＬＤＮ１８．２抗原結合断片も含むことができる。種々のタイプの抗原結合断片は、当技術分野で既知であり、例えば、そのＣＤＲ配列が表１に示される例示的な抗体およびそれらの様々なバリアント（例えば、親和性バリアント、グリコシル化バリアント、Ｆｃバリアント、システイン操作型バリアント等）を含めて、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体に基づいて開発され得る。
[00236]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗原結合断片は、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、または二価ドメイン抗体である。
[00237]種々の技法がそのような抗原結合断片の作製のために使用され得る。例示的な方法としては、インタクトな抗体の酵素消化（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７～１１７頁（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１頁（１９８５）を参照のこと）、大腸菌などの宿主細胞による組換え発現（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＳｃＦｖ抗体断片の場合）、上で論じられたファージディスプレイライブラリからのスクリーニング（例えば、ＳｃＦｖの場合）、ならびにＦ（ａｂ’）２断片を形成する２つのＦａｂ’－ＳＨ断片の化学カップリング（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３～１６７頁（１９９２））が挙げられる。抗体断片の作製のための他の技法は当業者であれば明らかであろう。
[00238]ある特定の実施形態では、抗原結合断片はｓｃＦｖである。ｓｃＦｖの生成は、例えば、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および同第５，５８７，４５８号に記載される。ｓｃＦｖは、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかでエフェクタータンパク質に融合されて、融合タンパク質をもたらすことができる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編を参照のこと）。
[00239]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート中の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体およびその抗原結合断片は、二価、四価、六価、または多価である。本明細書で使用される用語「価」とは、所与の分子における明記された数の抗原結合部位の存在を指す。したがって、「二価」、「四価」、および「六価」という各用語は、抗原結合分子における、それぞれ、２つの結合部位、４つの結合部位、および６つの結合部位の存在を表す。二価よりも多いあらゆる分子は多価とされ、例えば、三価、四価、六価等を包含する。
[00240]二価分子は、２つの結合部位がどちらも同じ抗原または同じエピトープへの結合にとって特異的である場合、単一特異性であり得る。これは、ある特定の実施形態では、一価の対応物よりも抗原またはエピトープへの強力な結合を可能にする。同様に、多価分子もまた単一特異性であり得る。ある特定の実施形態では、二価または多価の抗原結合部分において、結合部位の第１の価と結合部位の第２の価とは、構造的に同一である（すなわち、同じ配列を有する）か、または構造的に異なる（すなわち、同じ特異性を有するにもかかわらず、異なる配列を有する）。
[00241]二価はまた、２つの結合部位が異なる抗原またはエピトープに対して特異的である場合、二重特異性であり得る。これもまた多価分子に当てはまる。例えば、三価分子は、２つの結合部位が第１の抗原（またはエピトープ）にとって単一特異性であり、第３の結合部位が第２の抗原（またはエピトープ）にとって特異的である場合、二重特異性であり得る。
[00242]二重特異性抗体
[00243]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは二重特異性である。本明細書で使用される用語「二重特異性」とは、３以上の特異性を有する分子、および３以上の特異性を有する、すなわち多重特異性の分子を包含する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性抗体およびその抗原結合断片は、ＣＬＤＮ１８．２の第１および第２のエピトープに特異的に結合することができるか、またはＣＬＤＮ１８．２および第２の抗原に特異的に結合することができる。ある特定の実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２の第１のエピトープと第２のエピトープは、互いに全く異なるか、または重複しない。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体およびその抗原結合断片は、第１のエピトープと第２のエピトープの両方に同時に結合することができる。ある特定の実施形態では、第２の抗原は、ＣＬＤＮ１８．２とは異なる。
[00244]ある特定の実施形態では、第２の抗原は、腫瘍抗原を含む。本明細書で使用される「腫瘍抗原」とは、腫瘍特異的抗原（例えば、腫瘍細胞にユニークであり、非腫瘍細胞には普通見出されない抗原）、腫瘍関連抗原（例えば、腫瘍細胞と非腫瘍細胞の両方に見出されるが、腫瘍細胞では異なって発現される）、および腫瘍ネオ抗原（例えば、体細胞変異がタンパク質配列を変化させるかまたは２種の関連しない配列の間で融合タンパク質を作り出すことから、がん細胞において発現される）を指す。
[00245]調製方法
[00246]別の態様では、本開示は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片を、１２４Ｉ、１２３Ｉまたは１３１Ｉで標識されたヨウ化物化合物と酵素的または化学的酸化剤の存在下で反応させるステップを含む、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートを調製する方法を提供する。
[00247]一部の実施形態では、化学的酸化剤は、Ｎ－ブロモスクシンイミド、ヨードゲン、またはクロラミン－Ｔである。
[00248]別の態様では、本開示は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片を、キレート剤とコンジュゲートさせてキレート剤－抗体コンジュゲートを取得するステップと、キレート剤－抗体コンジュゲートを金属放射性核種と、例えば、６４Ｃｕまたは８９Ｚｒと反応させるステップとを含む、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートを調製する方法を提供する。
[00249]一部の実施形態では、キレート剤は、ＤＦＯ（デルフェロキサミン）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸）、ＤＴＰＡ（ＮＲ－ジエチレントリアミン五酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－酢酸）、ＴＲＩＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸）；ＴＥＴＡ（１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸）；およびＨＥＴＡ（１，５，９，１３－テトラアザシクロヘキサデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＮＥＴＡ（｛４－［２－（ビス－カルボキシメチルアミノ）－エチル］－７－カルボキシメチル－［１，４，７］トリアゾナン－１－イル｝－酢酸）、ＴＡＣＮ－ＴＭ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，トリス（２－メルカプトエチル）１，４，７－トリアザシクロノナン）、ＴＲＡＰ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－トリス［メチル（２－カルボキシエチル）ホスフィン酸］）、ＣＰ２５６、ＰＣＴＡ（３，６，９，１５－テトラアザビシクロ［９．３．１］ペンタデカ－１（１５），１１，１３－トリエン－３，６，９,－三酢酸）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシム、ならびにそれらの誘導体を含む。
[00250]医薬組成物
[00251]本開示は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートおよび１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、非経口投与に適しており、例えば、ボーラス注入、静脈内注射、または腫瘍内注射に適している。ある特定の実施形態では、医薬組成物は単位用量の注射用形態にある。
[00252]本明細書で開示される医薬組成物で使用するための薬学的に許容される担体は、例えば、薬学的に許容される液体、ゲル、または固体担体、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗微生物剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、麻酔薬、懸濁化剤／分配剤（ｄｉｓｐｅｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、封鎖剤またはキレート化剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または非毒性補助剤、当技術分野で既知の他の成分、またはそれらの種々の組合せを含むことができる。
[00253]適切な成分は、例えば、抗酸化剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、防腐剤、潤滑剤、風味剤、増粘剤、着色剤、乳化剤、または糖およびシクロデキストリンなどの安定化剤を含むことができる。適切な抗酸化剤は、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、および／または没食子酸プロピルを含むことができる。本明細書で開示されるように、本明細書で提供される抗体もしくは抗原結合断片およびコンジュゲートを含む組成物中にメチオニンなどの１つまたは複数の抗酸化剤を包含することは、抗体または抗原結合断片の酸化を低下させる。酸化のこういった減少は、結合親和性の喪失を妨げるかまたは減少させ、それによって、抗体安定性を改善し、有効期間を最長化する。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で開示される１つもしくは複数の抗体コンジュゲートおよびメチオニンなどの１つまたは複数の抗酸化剤とを含む、組成物が提供される。
[00254]さらに例示するため、薬学的に許容される担体は、例えば、水性ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー液、等張デキストロース注射液、滅菌水注射液、またはデキストロースおよび乳酸加リンガー液、非水性ビヒクル、例えば、野菜起源の不揮発性油、綿実油、トウモロコシ油、胡麻油、または落花生油、静菌性または静真菌性濃度での抗微生物剤、等張剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース、緩衝剤、例えば、リン酸またはクエン酸緩衝剤、抗酸化剤、例えば、重硫酸ナトリウム、局部麻酔薬、例えば、塩酸プロカイン、懸濁化剤および分散剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドン、乳化剤、例えば、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０）、封鎖剤またはキレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）もしくはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸を含むことができる。担体として利用される抗微生物剤は、フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムを含む、複数回投与用容器中の医薬組成物に添加され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールを含むことができる。適切な非毒性補助物質は、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解度向上剤、または酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートもしくはシクロデキストリンなどの薬剤を含むことができる。
[00255]ある特定の実施形態では、医薬組成物は注射用組成物に製剤化される。注射用医薬組成物は、例えば液体溶液、懸濁液、乳濁液、または液体溶液、懸濁液もしくは乳濁液を生成するのに適した固体形態などの、従来の任意の形態で調製され得る。注射用の調製物は、注射への準備ができた滅菌および／または非発熱性の溶液、皮下錠剤を含めて使用の直前に溶媒と組み合わせる準備ができた凍結乾燥された粉末などの無菌の乾燥した可溶物、注射への準備ができた無菌懸濁液、使用の直前にビヒクルと組み合わせる準備ができた無菌の乾燥した不溶物、ならびに、無菌および／または非発熱性乳濁液を含むことができる。溶液は、水性であっても非水性であってもいずれでもよい。
[00256]ある特定の実施形態では、単位用量の非経口調製物は、アンプル、バイアル、または針付き注射器にパッケージされる。当技術分野で既知であり実施されるように、非経口投与向けの全ての調製物は、無菌であることおよび発熱性ではないことが求められる。
[00257]ある特定の実施形態では、滅菌の凍結の乾燥粉末は、本明細書で開示される抗体または抗原結合断片を適切な溶媒に溶解することによって調製される。溶媒は、安定性を改善する賦形剤、または粉末もしくは粉末から調製される再構成溶液の他の薬理学的成分を含有することができる。使用され得る賦形剤は、それらに限定されないが、水、デキストロース、ソルビタール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたはその他の適切な薬剤を含む。溶媒は、緩衝液、例えば、クエン酸塩、リン酸ナトリウムもしくはカリウム、または当業者に既知の他のそのような緩衝液を、一実施形態においては、中性ｐＨ付近で、含有することができる。その後の溶液の無菌濾過と、これに続く当業者に既知の標準条件下での凍結乾燥は、望ましい製剤を供給する。一実施形態では、生成する溶液は、凍結乾燥向けにバイアルに配分されることになる。各バイアルは、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートまたはその組成物の単回投薬量または複数回投薬量を含有することができる。用量または一連の用量に必要とされる量を少量上回って（例えば、約１０％）バイアルを過剰充填することは、正確な試料採取および正確な投薬を容易にするために、許容される。凍結乾燥粉末は、約４℃～室温などで、適当な条件下で保存され得る。
[00258]注射のために水を用いる凍結乾燥粉末の再構成は、非経口投与で使用するための製剤を提供する。一実施形態では、再構成の場合、滅菌水および／もしくは非発熱水、またはその他の液体の適切な担体が凍結乾燥粉末に添加される。正確な量は、与えられている選択された療法に依存するが、経験的に決定されてもよい。
[00259]ＣＬＤＮ１８．２関連状態を処置および診断する方法
[00260]本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、ＣＬＤＮ１８．２関連状態を診断または治療するための方法で有用であり得る。ある特定の実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２関連状態はがんである。ある特定の実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２関連状態は、ＣＬＤＮ１８．２発現がんである。
[00261]ある特定の実施形態では、がんは、胃がん、肺がん、気管支がん、骨がん、肝臓および胆管がん、膵臓がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、精巣がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、脊椎がん、脳がん、子宮頚がん、子宮がん、子宮内膜がん、大腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、肛門がん、食道がん、消化器がん、皮膚がん、前立腺がん、下垂体がん、胃がん、膣がん、甲状腺がん、神経膠芽腫、星状細胞腫、黒色腫、骨髄異形成症候群、肉腫、奇形腫、および腺癌から選択される。
[00262]がんの例としては、それらに限定されないが、以下が挙げられる：非小細胞肺がん（扁平上皮／非扁平上皮）、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、大腸がん、卵巣がん、乳がん（例えば、基底乳癌（ｂａｓａｌ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺管癌（ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、および小葉乳癌（ｌｏｂｕｌａｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ））、膵臓がん、胃癌、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、胸腺癌、黒色腫、骨髄腫、菌状息肉腫、メルケル細胞がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、リンパ性悪性腫瘍、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌種、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原生癌、肝細胞癌、胆汁腺管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫、古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球リッチなＢ細胞性リンパ腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄球性（顆粒球）白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、真正赤血球増加症、肥満細胞由来腫瘍、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤ、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、結節外ＮＫ／Ｔ細胞性リンパ腫、上咽頭癌、ＨＨＶ８関連原発性滲出液リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および骨髄形成異常、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、稀突起神経膠腫、メナンジオマ、黒色腫、神経芽細胞腫ならびに網膜胚種細胞腫。
[00263]本明細書で使用される「ＣＬＤＮ１８．２発現がん」とは、ＣＬＤＮ１８．２を発現するがん細胞を伴う任意のがんまたは腫瘍を指す。ＣＬＤＮ１８．２を発現するがんの例としては、胃がん、食道がん、膵臓がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）などの肺がん、卵巣がん、大腸がん、結腸直腸がん、消化管間葉系腫瘍（ＧＩＳＴ）、消化管カルチノイド腫瘍、直腸がん、肛門がん、胆管がん、小腸がん、虫垂がん；前立腺がん、腎がん（例えば、腎細胞癌）、肝がん、頭頸部がん、ならびに胆嚢のがんおよびその転移、例えば、クルッケンベルク腫、腹膜播種性転移およびリンパ節転移などの胃がん転移が挙げられる。
[00264]ある特定の実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２発現がんは、腺癌、例えば、進行性腺癌であり得る。ある特定の実施形態において、がんは、胃、食道、膵管、胆管、肺および卵巣の腺癌から選択される。ある特定の実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２発現がんは、胃のがん、食道のがん、特に下部食道のがん、食道－胃接合部のがん、および胃食道がんを含む。
[00265]ＣＬＤＮ１８．２関連状態を検出、視覚化、診断、ステージングおよびモニタリングする方法
[00266]本明細書で提供される抗体コンジュゲートは、ＣＬＤＮ１８．２発現を検出する上で、特に非侵襲的な様式でインビボで検出する上で有用である。
[00267]本明細書で提供される抗体コンジュゲートはまた、ＣＬＤＮ１８．２関連状態を視覚化、診断、ステージングおよびモニタリングする上でも有用である。ある特定の実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２関連状態はがんである。ある特定の実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２関連状態は、ＣＬＤＮ１８．２発現がんである。
[00268]本明細書で提供される抗体の放射性核種コンジュゲートは、（ｉ）ＣＬＤＮ１８．２の発現、（ｉｉ）ＣＬＤＮ１８．２の分布、および（ｉｉｉ）ＣＬＤＮ１８．２の発現または分布の変化について情報を提供するために、インビボで使用され得る。免疫組織化学（ＩＨＣ）などのＣＬＤＮ１８．２の目下利用可能な診断方法と比較して、本明細書で提供される抗体の放射性核種コンジュゲートは、非侵襲的処置、定量化可能、全身評価、および多重の時点にての反復投薬および評価において有利である。
[00269]本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、対象の身体のトポグラフィー内の標的細胞を視覚化するために、インビボ核イメージングモダリティとともに使用され得る。ＣＬＤＮ１８．２発現に関連するがんを診断することに加えて、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の放射性核種コンジュゲートはまた、本明細書で提供される方法に従ってがんの進行をステージングし、モニタリングするためにも使用され得る。
[00270]本明細書で記載される方法に従って使用され得るインビボ核イメージングの適切な方法としては、それらに限定されないが、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、ＰＥＴ／ＣＴ複合撮像装置、および単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）が挙げられる。
[00271]一態様では、本開示は、対象において目的の部位の画像を取得する方法であって、
ａ）本明細書で提供される抗体コンジュゲートおよび／または本明細書で提供される医薬組成物の有効量を対象に投与するステップと；
ｂ）対象の目的の部位を陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）またはＳＰＥＣＴに供するステップと；
ｃ）対象において放射性核種からの検出可能なシグナルを特定するステップと；
ｄ）検出可能なシグナルの画像を作成し、それによって対象において目的の部位の画像を取得するステップと、
を含む、方法を提供する。
[00272]一部の実施形態では、目的の部位は、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を発現しているまたはｃｌａｕｄｉｎ１８．２を発現していると疑われる部位である。
[00273]一部の実施形態では、目的の部位は、腫瘍を有するまたは腫瘍を有すると疑われている。一部の実施形態では、目的の部位は、全身、胴体、頭、または四肢であり得る。
[00274]別の態様では、本開示は、対象において非侵襲的な様式でｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現を検出または視覚化する方法であって、
ａ）本明細書で提供される抗体コンジュゲートおよび／または本明細書で提供される医薬組成物の有効量を対象に投与するステップと；
ｂ）対象を陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）またはＳＰＥＣＴに供するステップと；
ｃ）対象の目的の部位において放射性核種からの検出可能なシグナルを特定するステップと；
ｄ）特定された検出可能なシグナルに基づいて、対象の目的の部位におけるｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現を決定または視覚化するステップと、
を含む、方法を提供する。
[00275]一部の実施形態では、本明細書で提供されるＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、対象に静脈内注射されてもよい。対象は、注射後の一定時間後にＰＥＴによってスキャンされ得る。
[00276]ある特定の実施形態では、方法は、対象をＸ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ）に供して、調査中の身体の部位の断面の画像を取得するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＣＴおよびＰＥＴの統合画像が取得されて、身体の基準座標系の上にＣＬＤＮ１８．２の発現および分布を示すことができる。
[00277]一部の実施形態では、方法は、目的の部位においてｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現を有すると特定された対象に、抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２療法の治療有効量を投与するステップをさらに含む。
[00278]抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２療法は、限定されないが、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体薬物コンジュゲート、ＣＬＤＮ１８．２を標的とする小分子化合物、ＣＬＤＮ１８．２を標的とする核酸、またはＣＬＤＮ１８．２を標的とする細胞療法を含めて、ＣＬＤＮ１８．２を標的とする任意の治療剤でよい。
[00279]一部の実施形態では、方法は、特定された検出可能なシグナルに基づいて、対象の目的の部位におけるｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現の分布を決定するステップをさらに含む。
[00280]一部の実施形態では、方法は、対象の目的の部位におけるｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現の不均一性を決定するステップをさらに含む。
[00281]一部の実施形態では、目的の部位は腫瘍である。
[00282]別の態様では、本開示は、治療期間の間処置を受けていた対象において、非侵襲的な様式で、治療有効性、処置への応答性、または抵抗性もしくは再発の発生、または転移をモニタリングする方法であって、
ａ）本明細書で提供される抗体コンジュゲートおよび／または本明細書で提供される医薬組成物の有効量を対象に投与するステップと；
ｂ）対象を陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）またはＳＰＥＣＴに供するステップと；
ｃ）対象の目的の部位において放射性核種からの検出可能なシグナルを特定するステップと；
ｄ）特定された検出可能なシグナルに基づいて、対象の目的の部位における処置後のｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現を決定するステップと；
ｅ）処置後のｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現のレベルまたは分布を、治療期間前に対象から得られた、それぞれ、ベースラインのｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現のレベルまたは分布と比較して、対象においてｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現のレベルまたは分布の処置後の変化を決定するステップと；
ｆ）ステップ（ｅ）で決定された変化に基づいて、治療有効性、処置への応答性、または抵抗性もしくは再発の発生、または転移を決定するステップと
を含む、方法を提供する。
[00283]一部の実施形態では、ベースラインのｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現レベルまたは分布は、同様の方法を使用して決定される。
[00284]一部の実施形態では、ベースラインのｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現レベルまたは分布は、本明細書で提供される抗体コンジュゲートおよび／または本明細書で提供される医薬組成物の有効量を対象に投与するステップと、対象を陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）またはＳＰＥＣＴに供するステップと、対象の目的の部位において放射性核種からの検出可能なシグナルを特定するステップと、特定された検出可能なシグナルに基づいて、対象の目的の部位におけるベースラインのｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現を決定するステップによって、治療期間の前（すなわち処置前）に決定される。
[00285]一部の実施形態では、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現のレベル上昇または広がりが、低減した治療有効性、処置への低減した応答性、または抵抗性の存在もしくは再発の存在を示す。一部の実施形態では、転移は、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現が以前は検出不能であった部位へのｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現の広がりによって示され得る。
[00286]一部の実施形態では、対象はがんを有する。
[00287]一部の実施形態では、ベースラインのｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現の決定のための目的の部位は、処置後のｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現の決定のための目的の部位と同じであるか、またはそれと少なくとも同等である。目的の部位は、両方とも同じタイプの組織のものであるかまたは同じ病変内に位置する場合、目的の別の部位と同等である。
[00288]一部の実施形態では、ベースラインのｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現の決定のための目的の部位はまた、処置後のｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現の決定のための目的の部位と異なってもよい。
[00289]処置の方法
[00290]別の態様では、本明細書で提供されるＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートおよび／または医薬組成物の治療有効量をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、ＣＬＤＮ１８．２活性のモジュレーションから利益を受けると思われる対象において疾患または症状を処置する方法が提供される。
[00291]ある特定の実施形態では、疾患または状態は、ＣＬＤＮ１８．２関連の疾患または状態である。一部の実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２関連疾患または状態はがんである。一部の実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２関連疾患または状態は、ＣＬＤＮ１８．２発現がんである。
[00292]ある特定の実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは治療用放射性核種を含む。
[00293]ある特定の実施形態では、治療用放射性核種は、１１１Ｉｎ、１１１ｍＩｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１９９Ａｕおよび２１１Ｐｂからなる群から選択される。
[00294]ある特定の実施形態では、治療用放射性核種は、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１５３Ｓｍ、２２３Ｒａ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、１６６Ｈｏからなる群から選択される。
[00295]本明細書で提供されるＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートの治療有効量は、例えば、体重、年齢、過去の病歴、現在の処方薬、対象の健康状態および交差反応の可能性、アレルギー、感受性および有害な副作用、ならびに投与経路および疾患発達の程度などの、当技術分野で既知の種々の因子に依存することになる。用量は、これらのおよびその他の状況または要件によって示されるように、当業者（例えば医師または獣医師）によって比例的に増減されてもよい。本明細書で開示されるＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、当技術分野で既知の任意の経路、例えば、非経口（例えば、皮下、腹腔内、静脈内注入を含めて静脈内、筋肉内、または皮内の各注射）によって投与され得る。
[00296]一部の実施形態では、方法は、本明細書で提供されるＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートの治療有効量を対象に投与するステップをさらに含む。
[00297]ある特定の実施形態では、対象は、ＣＬＤＮ１８．２発現がん細胞を有すると特定される。がん細胞上のＣＬＤＮ１８．２の存在および／または発現レベルは、定量的蛍光サイトメトリー、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ｑＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、マイクロアレイ、ＳＡＧＥ、ＦＩＳＨ等などの、当技術分野で既知の種々の方法によって決定され得る。対象におけるＣＬＤＮ１８．２の存在および／または発現レベルはまた、本明細書で提供される方法に基づいても決定され得る。
[00298]ある特定の実施形態では、対象は、本明細書で提供される方法を使用して、ＣＬＤＮ１８．２発現がんを有すると診断されている。
[00299]ある特定の実施形態では、対象は、本明細書で提供される診断用放射性核種を含む本明細書で提供される抗体コンジュゲートを使用して、ＣＬＤＮ１８．２発現がんを有すると診断されている。
[00300]一部の実施形態では、本明細書で開示されるＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、単独で、または１つもしくは複数の追加の治療手段もしくは薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本明細書で開示されるＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、第２の治療剤と、例えば、化学療法剤、抗がん薬、放射線療法、免疫療法、抗血管新生剤、標的療法、細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、緩和ケア、がんの処置のための手術（例えば、腫瘍摘出術）、または１つもしくは複数の制吐薬もしくは化学療法から生じる合併症のその他処置と組み合わせて投与され得る。
[00301]これらの実施形態のうちのある特定のものでは、１種または複数の追加の治療剤と組み合わせて投与される本明細書で開示されるＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート、これらの実施形態のうちある特定のものでは、ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートおよび追加の治療剤は、同一医薬組成物の一部として投与され得る。しかし、別の治療剤と「組み合わせて」投与されるＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、当該薬剤と同時に投与されなくても、または当該薬剤と同一組成物中で投与されなくてもよい。別の薬剤の前または後に投与されるＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートおよび第２の薬剤が、異なる経路を介して投与される場合でも、語句「組み合わせて」が本明細書において使用される場合、当該薬剤と「組み合わせて」投与されると見なされる。可能であれば、本明細書で開示される抗体または抗原結合断片と組み合わせて投与される追加の治療剤は、追加の治療剤の製品情報シートに挙げられているスケジュールに従うか、またはＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第５７編；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；ＩＳＢＮ：１５６３６３４４５７；第５７編（２００２年１１月））に従うか、または当技術分野でよく知られるプロトコルに従って投与される。
[00302]キット
[00303]別の態様では、本開示は、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートまたは本明細書で提供される組成物を含むキットを提供する。
[00304]一部の実施形態では、キットは、対象においてＣＬＤＮ１８．２の存在または量または分布の検出において有用であり得、または本明細書で提供される診断方法において有用であり得る。
[00305]一部の実施形態では、キットは、対象においてＣＬＤＮ１８．２発現がんの処置において有用であり得、または本明細書で提供される処置方法において有用であり得る。
[00306]一部の実施形態では、キットは、本明細書で開示される治療用放射性核種を含む本明細書で提供される第１の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートを含む第１の組成物と、本明細書で開示される診断用放射性核種を含む本明細書で提供される第２の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートを含む第２の組成物とを含む。一部の実施形態では、治療用放射性核種は、１１１Ｉｎ、１１１ｍＩｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１９９Ａｕおよび２１１Ｐｂからなる群から選択され、ならびに／または、診断用放射性核種は、１８Ｆ、３２Ｐ、３３Ｐ、４５Ｔｉ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７５Ｓｃ、７７Ａｓ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、９９Ｍｏ、１０５Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１ｌｎ、１２３ｌ、１２４ｌ、１２５ｌ、１３１ｌ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５４’’１５８１Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７５Ｌｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４ｌｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と第２の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は同一かまたは異なる。一部の実施形態では、第１および第２の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は両方とも、配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１９の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号２１の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１８の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
[00307]一部の実施形態では、キットは、本明細書で提供される方法で使用するためのものである。
[00308]一部の実施形態では、本開示は、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合断片および第２の治療剤を含むキットを提供する。キットは、ＣＬＤＮ１８．２関連疾患の処置、予防、および／または改善において有用であり得る。
[00309]別の態様では、本開示は、本明細書で提供される方法で使用するための医薬または診断用製品の製造における、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートまたは本明細書で提供される組成物の使用を提供する。
[00310]ある特定の実施形態では、キットは、他の何らかの経路を通してキット成分を送達することができるデバイスをさらに含む場合がある、例えば、非経口送達などの用途のための注射器は、対象の体内への組成物の注入のための注射器である。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは、抗体の滅菌液体製剤または凍結乾燥調製物を含有するあらかじめ充填された注射器または自動注入ペンの形態で提供される場合がある（例えば、Ｋｉｖｉｔｚら、Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２００６、２８：１６１９～２９頁）。
[00311]キット成分は、一緒に包装されてもよく、２つ以上の容器内へと分けられてもよい。一部の実施形態では、容器は、再構成に適切である組成物の無菌凍結乾燥製剤を含有するバイアルであってもよい。キットはまた、他の試薬の再構成および／または希釈に適する１種または複数の緩衝剤を含有してもよい。使用され得るその他の容器には、それらに限定されないが、パウチ、トレイ、箱、管等が含まれる。キット成分は、容器内に滅菌状態で包装および維持され得る。含まれ得る別の成分は、キットの使用に関する取扱説明書である。
[00312]具体的な実施形態（そのうちいくつかは好ましい実施形態である）を参照して、本開示を特に示し、記載してきたが、本明細書において開示されるような本開示の精神および範囲から逸脱することなく形態および詳細において種々の変法が為され得ることを、当業者であれば理解されたい。
[00313]実施例１ 緒言
[00314]一連の研究は、胃がんの標的療法向けの新規な標的としてＣＬＤＮ１８．２は幅広い適用の見通しを有することを示した。目標として精密な処置によって、潜在的受益者を最大化する方法、およびＣＬＤＮ１８．２陽性胃がん患者の分子病理学的特徴を迅速かつ包括的に評価する方法は、解決すべき喫緊の課題である。
[00315]この問題を解決することとは、ＣＬＤＮ１８．２の検出技術に対するより高い要件を提唱することを意味する。しかし、ＣＬＤＮ１８．２の検出には依然として多くの制限がある。
[00316]（１）単一の検出方法。現在のところ、市販の抗体は、組織パラフィン切片、凍結組織切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）検出にのみ使用される。不十分な識別能力および低感度という状況で、ＣＬＤＮ１８．２またはＣＬＤＮ１８．１（Ｃｌａｕｄｉｎ１８の別のスプライスバリアント）を区別することができなかったが、なぜなら、ＣＬＤＮ１８．２とＣＬＤＮ１８．１のアミノ酸配列が高度に相同性であるからである（アミノ酸配列のうちの９１％が同一である）。
[00317]（２）検出方法が侵襲的である。単一の検出方法は、ＣＬＤＮ１８．２検出試料が組織切片のみに限定されることおよび試料採取が侵襲的かつ面倒であることをもたらし、このようなことは、患者にとってより高い要件を有する。
[00318]（３）検出標本の不均一性：進行性胃がんの不均一性は顕著である。本発明者らは、ＣＬＤＮ１８．２の組織発現空間および強度に不均一性があり得ること、ならびにＣＬＤＮ１８．２の組織およびリキッド生検標本に不均一性があり得ることを見出した。進行期の患者のルーチンな病理学的分子診断標本は主に内視鏡生検標本であり、この場合、組織含量が少なく試料採取部位が限定される；したがって、単一の内視鏡組織標本検査は、ＣＬＤＮ１８．２発現の不均一性に起因して、潜在的な一部の受益者を見逃すおそれがある。
[00319]（４）静的試験の結果：研究は、薬物処置の前後で、標的発現の強度および空間分布、腫瘍組織の免疫微小環境状態に顕著な差異があり、このことがフォローアップ処置の有効性に影響を与えることを示した。試料採取および検出の方法に制限があることから、ＣＬＤＮ１８．２について、動的モニタリングの探索を支持することは困難である。したがって、これらの問題については、ＣＬＤＮ１８．２の非侵襲的で包括的、リアルタイム、動的な検出技術を探索および統合して、全病変の包括的な評価を行うこと、および治療効果と組み合わせた潜在的な受益者の特徴を要約すること、ならびに診断および治療を先導することが最善の解決策である。
[00320]したがって、最新の分子イメージング技術の包括的、非侵襲的、リアルタイムかつ動的な特徴を使用することによって、ＣＬＤＮ１８．２の診断およびその後の免疫チェックポイント抗体応答の評価に向けた高度の特異性を備える分子プローブを開発することが大いに重要である。ＨＥＲ２陽性胃がんに焦点を合わせた多数の核種分子プローブがあり、技術は比較的成熟しているが、ＣＬＤＮ１８．２核種プローブに関する報告は国内外でいまだに白紙である。本発明は、ＣＬＤＮ１８．２標的化モノクローナル抗体１８Ｂ１０を一例として取り上げ、１８Ｂ１０抗体を標識するために次世代核種１２４Ｉ／６４Ｃｕ／８９Ｚｒを使用したが、インビボ研究は、上記抗体がＣＬＤＮ１８．２高発現腫瘍において有意に高い取込みを有したことを示し、このことは、上記核種標識の１８Ｂ１０抗体は、ＣＬＤＮ１８．２を標的とする特異的プローブとして、腫瘍免疫療法スクリーニング、処置プロセスのモニタリングおよび有効性評価向けの可能性のある造影剤であることを示唆した。
[00321]本発明は、少なくとも部分的には、ＣＬＤＮ１８．２標的化モノクローナル抗体（１８Ｂ１０を一例として取り上げる）を標識する次世代核種１２４Ｉ／６４Ｃｕ／８９Ｚｒ、ならびにその調製方法および適用を提供する。
[00322]本発明の概念は以下の通りである：１２４Ｉ（Ｔ１／２＝４．２ｄ）、６４Ｃｕ（Ｔ１／２＝１２．７ｈ）、８９Ｚｒ（Ｔ１／２＝７８．４ｈ）は新規な固形標的ＰＥＴ核種であり、これらは、幅広い臨床適用の見通しを有する。１８Ｆ（Ｔ１／２＝１１０分）および１１Ｃ（Ｔ１／２＝２０．４分）と比較して、１２４Ｉ／６４Ｃｕ／８９Ｚｒは比較的長い半減期を有し、このことは長期のイメージング調査および放射性核種の輸送に資するが、肝臓取込みが低く、このことは肝臓病変の検出に資する。抗原分子上の１つのエピトープ（抗原決定基）のみに結合するモノクローナル抗体は、抗原の構造および機能を研究し、そのメカニズムを解明するための分子プローブとして使用され得る。核種標識のモノクローナル抗体を使用して、インビボでの生体高分子（タンパク質、核酸、酵素等）の位置および分布を決定することは容易である。
[00323]本発明の目的を達成するために、第１の態様では、本発明は、次世代核種標識のＣＬＤＮ１８．２標的化モノクローナル抗体を提供するが、これは、放射性核種１２４Ｉ／６４Ｃｕ／８９Ｚｒ標識のＣＬＤＮ１８．２標的化モノクローナル抗体である。
[00324]第２の態様では、本発明は、１２４Ｉ／６４Ｃｕ／８９Ｚｒ－ＣＬＤＮ１８．２標的化モノクローナル抗体（１８Ｂ１０を一例として取り上げる）の調製方法を提供する。ＮＢＳ法により、１２４Ｉを、モノクローナル抗体の分子構造中のフェニルヒドロキシル基のオルトパラ位に標識したが、方法は以下を含む：ｐＨ７．２の０．１Ｍ ＰＢ緩衝剤０．５～１．５ｍＬ、１８Ｂ１０ ０．５～１０ｍｇおよびＮ－ブロモスクシンイミド６～１２０μｇを、２５～９０ＫＢｑ／μＬのＮａ１２４Ｉ溶液０．５～１．０ｍＬに添加し、３７℃で６０秒間培養し、次いで、１０％ヒト血清アルブミン０．０５～０．２ｍＬを添加して反応を停止させた；最終反応溶液をＰＤ－１０カラムによって精製して、目標生成物を得た。
[00325]６４Ｃｕ／８９Ｚｒ標識のＣＬＤＮ１８．２標的化モノクローナル抗体を、二官能性キレート剤を使用することによって得た（１８Ｂ１０を一例として取り上げる）：モノクローナル抗体６モルに当量のＤＦＯを濃度２～５ｍｇ／ｍＬの１８Ｂ１０溶液に添加し、反応系のｐＨ値を脱イオン０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液で８．５に調整した；４～３７℃で４～２４時間反応させることによりＤＦＯ－１８Ｂ１０を得た。標識前駆体１５μｇ～２ｍｇをｐＨ５．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．１～１．０ｍＬに添加し、次いで、２５～１００ＭＢｑのフレッシュ６４Ｃｕ／８９Ｚｒ溶液を添加し、ｐＨ値を７．０に調整した；温度を４０℃に３０分間制御した；最終反応溶液をＰＤ－１０カラムによって精製して、目標生成物を得た。
[00326]標識率が９５％超であり、ＰＤ－１０カラムによって精製された場合、目標生成物の放射化学的純度は９８．７６％であった。
[00327]使用前に、ＰＤ－１０カラムをｐＨ７．４の０．０１Ｍ ＰＢＳ溶液でまず平衡化し、ＰＢＳ ５ｍＬを毎回添加し、カラムを重力流速で乾燥し、これを５回繰り返した；次いで、目標生成物をｐＨ７．４の０．０１Ｍ ＰＢＳ溶液によって精製した。
[00328]１２４Ｉ－１８Ｂ１０のインビトロ安定性解析は、１２４Ｉ－１８Ｂ１０はｐＨ７．４の０．０１Ｍ ＰＢＳ溶液中で２５℃で４８時間良好な安定性を維持することができたこと、および放射化学的純度は９７．８９±０．０５％であったことを示した。
[00329]第３の態様では、本発明は、ＣＬＤＮ１８．２を標的とする腫瘍造影剤および治療薬の調製における１２４Ｉ／６４Ｃｕ／８９Ｚｒ－ＣＬＤＮ１８．２標的化モノクローナル抗体（１８Ｂ１０を一例として取り上げる）の適用を提供する。
[00330]第４の態様では、本発明は、ＰＥＴ／ＣＴ分子イメージングプローブの調製における１２４Ｉ／６４Ｃｕ／８９Ｚｒ－ＣＬＤＮ１８．２標的化モノクローナル抗体（１８Ｂ１０を一例として取り上げる）の適用を提供する。
[00331]第５の態様では、本発明は、核種標識されたＣＬＤＮ１８．２標的化モノクローナル抗体を含む、ＣＬＤＮ１８．２を標的とする腫瘍造影剤を提供する。
[00332]新世代の核種標識のモノクローナル抗体（１２４Ｉ－１８Ｂ１０）は、腫瘍細胞表面のＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合することができる；正常なマウスでは、血液を除いて臓器および組織の特定の分布はなかった；ＰＤＸ担持マウスのＰＥＴイメージング研究では、図４に示すように、ＣＬＤＮ１８．２陽性担腫瘍モデルとＣＬＤＮ１８．２陰性担腫瘍モデルの両方で１８Ｆ－ＦＤＧの取込みが極めて低かった。ＣＬＤＮ１８．２陽性ＰＤＸ担持マウスにおける１２４Ｉ－１８Ｂ１０の分布は時間とともに動的に変化した：腫瘍部位の取込みシグナルは２時間と比較して６０時間で有意に上昇した：１２０時間では、心血液プール内の取込みシグナルは消失し、腫瘍内のシグナルのみを観察することができた。ＣＬＤＮ１８．２陰性ＰＤＸ担持マウスの腫瘍部位において１２４Ｉ－１８Ｂ１０のおよびＣＬＤＮ１８．２陽性ＰＤＸ担持マウスにおいて１２４Ｉ－ＩｇＧの、特異的蓄積はなかった。これらの結果は、１２４Ｉ－１８Ｂ１０プローブはＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍に特異的に蓄積され、高感度および高特異性の特徴を有することを示す。１２４Ｉ－１８Ｂ１０プローブは、将来にわたっては、患者の腫瘍におけるＣＬＤＮ１８．２の発現を非侵襲的な様式で検出するための造影剤として使用され得る。
[00333]要約すると、本発明は少なくとも以下の利点および有益な効果を有する：本発明により提供される新規なＰＥＴ分子プローブ１２４Ｉ／６４Ｃｕ／８９Ｚｒ－ＣＬＤＮ１８．２標的化モノクローナル抗体は、安定した特性、良好なイメージング効果、ＣＬＤＮ１８．２への高親和性および高機能活性を有しており、以下のことが期待される：全身性病変におけるＣＬＤＮ１８．２の発現をリアルタイムでかつ非侵襲的にモニタリングするため、同じ病変および異なる病変におけるＣＬＤＮ１８．２発現の不均一性をモニタリングするため、ならびに処置過程のＣＬＤＮ１８．２発現の変化を観察するために使用され、その結果、患者をスクリーニングすること、治療効果をモニタリングすること、薬物抵抗性および／もしくは再発または転移を早期に警告すること、ならびに標的化腫瘍薬の個別化されたかつ精密な処置を実現することが期待される。
[00334]本発明では、次世代ＰＥＴ核種１２４Ｉ／６４Ｃｕ／８９Ｚｒが使用され、これは、モノクローナル抗体の標識を実現することができるとともにモノクローナル抗体の活性にほとんど影響を及ぼさない；加えて、肝臓の非特異的取込みが低く、このことは肝臓病変の検出に資する；さらに、全身のバックグラウンドが低く、このことは腫瘍と非腫瘍との良好な比を有し、腫瘍病変の観察に資する。
[00335]実施例２ ＣＬＤＮ１８．２を標的とする次世代核種標識のモノクローナル抗体の調製（１２４Ｉ－１８Ｂ１０を一例として取り上げる）
[00336]本研究で使用されたＣＬＤＮ１８．２標的化モノクローナル抗体１８Ｂ１０は、ＭａｂＳｐａｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓｕｚｈｏｕ）Ｃｏ．，Ｌｔｄによって供給されたもので、ヒトおよびマウスのＣＬＤＮ１８．２の両方と交差反応性であり、前臨床研究のためにマウスで試験され得る。ＰＤ－１０プレロードゲルカラムはＧＥ（米国）から購入した。
[00337]１２４Ｉ－１８Ｂ１０をＮＢＳ反応により調製した：ｐＨ７．２の０．１Ｍ ＰＢ緩衝剤０．８ｍＬ、１８Ｂ１０モノクローナル抗体溶液（Ｈ２Ｏで調製）０．１ｍＬ（２９．２ｍｇ／ｍＬ）およびＮＢＳ ３６μｇを、５９．２ＫＢｑ／μＬのＮａ１２４Ｉ溶液１．０ｍＬに順番に添加し、３７℃で６０秒間培養し、次いで、１０％ヒト血清アルブミン０．１ｍＬを添加して反応を停止させた；最終反応溶液をＰＤ－１０カラムによって精製して、目標生成物を得た。
[00338]使用前に、ＰＤ－１０カラムをｐＨ７．４の０．０１Ｍ ＰＢＳ溶液でまず平衡化し、ＰＢＳ ５ｍＬを毎回添加し、カラムを重力流速で乾燥し、これを５回繰り返した；次いで、目標生成物をｐＨ７．４の０．０１Ｍ ＰＢＳ溶液によって精製した。
[00339]Ｒａｄｉｏ－ＴＬＣおよびＲａｄｉｏ－ＨＰＬＣを使用して、放射標識率および放射化学的純度を決定した。Ｒａｄｉｏ－ＴＬＣ検出：３７～７４ｋＢｑ（１～２μＣｉ）の放射能を有する遊離Ｎａ１２４Ｉ ２μＬおよび精製１２４Ｉ－１８Ｂ１０を飽和ＥＤＴＡ ２０μＬに添加した。上の溶液２μＬをＸｉｎｈｕａ Ｎｏ．１濾紙の底から１ｃｍで滴下し、生理食塩水展開システムに置いた。展開の完了の後、濾紙を取り出し、Ｒａｄｉｏ－ＴＬＣ検出用に乾燥させた。Ｒａｄｉｏ－ＨＰＬＣ検出：３７～７４ｋＢｑ（１～２μＣｉ）の放射能を有する遊離Ｎａ１２４Ｉ ２μＬおよび精製１２４Ｉ－１８Ｂ１０をＲａｄｉｏ－ＨＰＬＣ分析用にｐＨ７．４の０．０１Ｍ ＰＢＳ ５０μＬに希釈した。分析条件：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏ ＳＥＣ－３ゲルろ過／体積排除クロマトグラフィーカラム、流速１ｍＬ／分、移動相ｐＨ７．４の０．０１Ｍ ＰＢＳ。
[00340]目標生成物１２４Ｉ－１８Ｂ１０の放射標識率および放射化学的純度は、それぞれ、９７．９４％および９８．７６％であった。目標生成物１２４Ｉ－１８Ｂ１０の放射化学的純度は、ＰＢＳ中で４８時間後も約９８％を保持した（図１）。
[00341]実施例３ ＣＬＤＮ１８．２を標的とする次世代核種標識のモノクローナル抗体の取込み（１２４Ｉ－１８Ｂ１０を一例として取り上げる）
[00342]ＭＫＮ４５細胞へのＣＬＤＮ１８．２のトランスフェクションおよびスクリーニングを通して、ＣＬＤＮ１８．２の高発現を有するＭＫＮ４５－ＣＬＤＮ１８．２高細胞株を取得した。ＭＫＮ４５細胞を陰性対照細胞として使用した。播種した細胞を２４ウェルプレートで一晩均一に培養して、壁に細胞を十分に接着させた。第２日目に、１ｍＣｉの１２４Ｉ－１８Ｂ１０または１２４Ｉ－ｈＩｇＧを添加し、それぞれ、１０分間、３０分間、６０分間および１２０分間培養した。遮断群では、コールド前駆体１８Ｂ１０ ０．５ｍｇ／ウェルを添加して取込みシグナルを遮断した。培養後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、溶解物を回収した。取込みシグナルをγカウンターで検出し、解析した。
[00343]結果（図２）は、ＭＫＮ４５－ＣＬＤＮ１８．２高細胞は１０分にての１２４Ｉ－１８Ｂ１０の取込み率が高いことを示し、これは時間とともに上昇したことを示した。遮断のためにコールド前駆体を添加した場合、取込み率が有意に低下し、このことは、取込みシグナルはＣＬＤＮ１８．２特異的であったことを示す。ＭＫＮ４５－ＣＬＤＮ１８．２高細胞による１２４Ｉ－ｈＩｇＧの取込みも、ＭＫＮ４５細胞による１２４Ｉ－１８Ｂ１０の取込みも両方とも低かった。
[00344]実施例４ ＣＬＤＮ１８．２を標的とする次世代核種標識のモノクローナル抗体（１２４Ｉ－１８Ｂ１０を一例として取り上げる）の正常マウスにおける体内分布
[00345]１２４Ｉ－１８Ｂ１０（０．７４ＭＢｑ、２００μＬ）を正常なＫｕｎｍｉｎｇマウスに尾静脈を介して注射した。マウスの心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、胃、骨、筋肉、大腸、小腸、脳、血液、ならびにその他の臓器および組織を、注射の２時間後、２４時間後、６０時間後および１２０時間後に分離した。磨砕後、取込みシグナルをγカウンターにより検出および解析し、１２４Ｉ－１８Ｂ１０プローブのＩＤ％／ｇを得た。
[00346]正常なマウス（図３）では、血液取込みは全ての時点で最も高かった。血液に加えて、２時間目にての肝臓、腎臓、肺および脾臓での取込みは他の臓器および組織における取込みよりも高かった。全ての臓器の取込みは時間とともに低下した。血液と比較して、他の臓器の取込みはより低い傾向にある。
[00347]実施例５ ＰＤＸ担腫瘍マウスにおけるＣＬＤＮ１８．２を標的とする次世代核種標識のモノクローナル抗体（１２４Ｉ－１８Ｂ１０を一例として取り上げる）のＰＥＴイメージング
[00348]免疫組織化学（ＩＨＣ）法により、ＣＬＤＮ１８．２陽性ＰＤＸ（陽性強度３＋）およびＣＬＤＮ１８．２陰性ＰＤＸを接種用に選択した。全腫瘍組織をヌードマウスの右下肢に皮下注射した。ＰＤＸ腫瘍の直径が０．８ｃｍであった場合、担腫瘍マウスを複数の群に分けた。ＣＬＤＮ１８．２陽性ＰＤＸ担持マウスを３群：１８Ｆ－ＦＤＧ群、１２４Ｉ－１８Ｂ１０群および１２４Ｉ－ｈＩｇＧ群に分けた。これら３群に尾静脈を介して、それぞれ、１８Ｆ－ＦＤＧ、１８．５ＭＢｑの１２４Ｉ－１８Ｂ１０、および１８．５ＭＢｑの１２４Ｉ－ｈＩｇＧを注射した。ＣＬＤＮ１８．２陰性ＰＤＸ担腫瘍マウスも同じ３群に分けた。注射の２時間後、６０時間後および１２０時間後に、動物をイソフルラン（２％イソフルラン－３０％酸素／空気）で麻酔し、イメージングをマイクロＰＥＴ／ＣＴで行った。
[00349]図４に示すように、１８Ｆ－ＦＤＧの取込みは、ＣＬＤＮ１８．２陽性担腫瘍モデルとＣＬＤＮ１８．２陰性担腫瘍モデルの両方で極めて低かった。ＣＬＤＮ１８．２陽性ＰＤＸ担持マウスにおける１２４Ｉ－１８Ｂ１０の分布は時間とともに動的に変化した：２時間目、取込みシグナルは、心血液プールおよびＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍部位で検出された；６０時間目、心血液プール内の取込みシグナルは、著しく減少したが、一方、腫瘍内では増加した；１２０時間目、心血液プール内の取込みシグナルは消失し、腫瘍内のシグナルのみが観察され得た。ＣＬＤＮ１８．２陰性ＰＤＸ担持マウスにおいて全ての組織および腫瘍内の１２４Ｉ－１８Ｂ１０の取込みシグナルは、異なる時点でまったく類似しており、このことは、ＣＬＤＮ１８．２陰性腫瘍では特異的な蓄積がなかったことを示す。陰性対照のように、ＣＬＤＮ１８．２陽性ＰＤＸ担持マウスにおける１２４Ｉ－ＩｇＧの取込みシグナルは、各時点で腫瘍内よりもむしろ心血液プール内で高いことが見出された。これらの結果は、１２４Ｉ－１８Ｂ１０プローブはＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍内に特異的に蓄積され、長時間（１２０時間）のイメージング後に有意なシグナルが依然としてあったことを示す。本プローブは、高感度および高特異性の特徴を有するとともに、将来にわたって患者の腫瘍におけるＣＬＤＮ１８．２の発現を非侵襲的に検出するための造影剤として使用され得る。
[00350]本発明により提供される次世代核種１２４Ｉ／６４Ｃｕ／８９Ｚｒ標識のＣＬＤＮ１８．２標的化モノクローナル抗体は、安定した特性、良好なイメージング効果、ＣＬＤＮ１８．２に対する高親和性および高機能活性を有し、ＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍病変の診断および正確なステージングに資する。本発明のモノクローナル抗体が良好な適用の見通しをもって標的とするＣＬＤＮ１８．２の造影剤となる可能性を有することが、前臨床動物研究により確認される。
実施例６：ＣＬＤＮ１８．１と異なるＣＬＤＮ１８．２のアミノ酸での部位特異的突然変異誘発を介する選択された抗体のエピトープマッピング
[00351]１．ヒトＣＬＤＮ１８．２－ｍＲＦＰ構築物およびヒトＣＬＤＮ１８．１－ｍＲＦＰ構築物の生成
[00352]ヒトＣＬＤＮ１８．１（アミノ酸１～２６１、配列番号３１）－ｍＲＦＰ１（アミノ酸１～２２５）およびヒトＣＬＤＮ１８．２（アミノ酸１～２６１、配列番号３０）－ｍＲＦＰ１（アミノ酸１～２２５）をコードするｃＤＮＡをインビトロで合成した（配列番号５２および配列番号５３はそれぞれそれらのアミノ酸配列である）。次いで、ＰＣＲ産物を、製造業者の取扱説明書に従ってＳｙｎｏアセンブリミックス試薬（Ｓｙｎｂｉｏ）を使用する相同組換えの方法によって、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローニングした。プラスミドはＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用することによって精製した。
[00353]ヒトのＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：スプライスバリアント１（ＣＬＤＮ１８．１）：ＮＰ＿０５７４５３、ＮＭ＿０１６３６９、およびスプライスバリアント２（ＣＬＤＮ１８．２）：ＮＭ＿００１００２０２６、ＮＰ＿００１００２０２６）によれば、異なる８個のアミノ酸が２８～７０の間に位置しており、これらがＣＬＤＮ１８．１へではなくヒトＣＬＤＮ１８．２への特異的結合の決定因子である可能性がある。上で生成した野生型ヒトＣＬＤＮ１８．２－ｍＲＦＰプラスミドをテンプレートとして使用して、統合配列の２つのセグメントをプライマーを用いて生成した。指定位置で単一アミノ酸がヒトＣＬＤＮ１８．１のアミノ酸に変更された状態のヒトＣＬＤＮ１８．２－ｍＲＦＰのバリアントを、プライマーを使用してオーバーラップＰＣＲによって増幅した。具体的な突然変異は、Ｑ２９Ｍ、Ｎ３７Ｄ、Ａ４２Ｓ、Ｎ４５Ｑ、Ｑ４７Ｅ、Ｅ５６Ｑ、Ｇ６５Ｐ、およびＬ６９Ｉ上にある。指定位置で単一アミノ酸が変更された状態のヒトＣＬＤＮ１８．１－ｍＲＦＰのバリアントを、プライマーを使用したオーバーラップＰＣＲによって増幅した。具体的な突然変異は、Ｍ２９Ｑ、Ｄ３７Ｎ、Ｓ４２Ａ、Ｑ４５Ｎ、Ｅ４７Ｑ、Ｑ５６Ｅ、Ｐ６５Ｇ、Ｉ６９Ｌ上にある。次いで、ＰＣＲ産物を相同組換えの方法によって、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローニングした。ヒトＣＬＤＮ１８．２－ｍＲＦＰバリアントを、個々の陽性クローンを配列決定することによって特定および確認した。
[00354]続いて、突然変異型および野生型ヒトＣＬＤＮ１８．２－ｍＲＦＰまたはヒトＣＬＤＮ１８．１－ｍＲＦＰのこれらのプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞株にトランスフェクトした。まず、５×１０６個のＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクション用に６０ｍｍディッシュに６０％～８０％の割合で播種した。ＤＮＡ１０μｇの１×ＨＢＳ ４００μｌおよび２５ｋＤａの線形ＰＥＩトランスフェクション試薬１０μｌ（１×ＨＢＳに溶解、１ｍｇ／ｍｌのストック溶液）を混合して、ＤＮＡ／ＰＥＩ比 １：２．５に達した。次に、混合物をＨＥＫ２９３細胞培養物に一滴ずつ添加した。６～８時間後、トランスフェクト細胞をｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＭＥＭで一晩置き換えた。トランスフェクションの２４時間後、キメラ抗体を使用するＦＡＣＳ解析用に細胞を収集した。
[00355]ヒトＣＬＤＮ１８．１のアミノ酸配列（配列番号３１）
ＭＳＴＴＴＣＱＶＶＡＦＬＬＳＩＬＧＬＡＧＣＩＡＡＴＧＭＤＭＷＳＴＱＤＬＹＤＮＰＶＴＳＶＦＱＹＥＧＬＷＲＳＣＶＲＱＳＳＧＦＴＥＣＲＰＹＦＴＩＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲＡＬＭＩＶＧＩＶＬＧＡＩＧＬＬＶＳＩＦＡＬＫＣＩＲＩＧＳＭＥＤＳＡＫＡＮＭＴＬＴＳＧＩＭＦＩＶＳＧＬＣＡＩＡＧＶＳＶＦＡＮＭＬＶＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＴＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦＧＡＡＬＦＶＧＷＶＡＧＧＬＴＬＩＧＧＶＭＭＣＩＡＣＲＧＬＡＰＥＥＴＮＹＫＡＶＳＹＨＡＳＧＨＳＶＡＹＫＰＧＧＦＫＡＳＴＧＦＧＳＮＴＫＮＫＫＩＹＤＧＧＡＲＴＥＤＥＶＱＳＹＰＳＫＨＤＹＶ
[00356]ヒトＣＬＤＮ１８．１－ｍＲＦＰ１のアミノ酸配列（配列番号５２）：
ＭＳＴＴＴＣＱＶＶＡＦＬＬＳＩＬＧＬＡＧＣＩＡＡＴＧＭＤＭＷＳＴＱＤＬＹＤＮＰＶＴＳＶＦＱＹＥＧＬＷＲＳＣＶＲＱＳＳＧＦＴＥＣＲＰＹＦＴＩＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲＡＬＭＩＶＧＩＶＬＧＡＩＧＬＬＶＳＩＦＡＬＫＣＩＲＩＧＳＭＥＤＳＡＫＡＮＭＴＬＴＳＧＩＭＦＩＶＳＧＬＣＡＩＡＧＶＳＶＦＡＮＭＬＶＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＴＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦＧＡＡＬＦＶＧＷＶＡＧＧＬＴＬＩＧＧＶＭＭＣＩＡＣＲＧＬＡＰＥＥＴＮＹＫＡＶＳＹＨＡＳＧＨＳＶＡＹＫＰＧＧＦＫＡＳＴＧＦＧＳＮＴＫＮＫＫＩＹＤＧＧＡＲＴＥＤＥＶＱＳＹＰＳＫＨＤＹＶＭＡＳＳＥＤＶＩＫＥＦＭＲＦＫＶＲＭＥＧＳＶＮＧＨＥＦＥＩＥＧＥＧＥＧＲＰＹＥＧＴＱＴＡＫＬＫＶＴＫＧＧＰＬＰＦＡＷＤＩＬＳＰＱＦＱＹＧＳＫＡＹＶＫＨＰＡＤＩＰＤＹＬＫＬＳＦＰＥＧＦＫＷＥＲＶＭＮＦＥＤＧＧＶＶＴＶＴＱＤＳＳＬＱＤＧＥＦＩＹＫＶＫＬＲＧＴＮＦＰＳＤＧＰＶＭＱＫＫＴＭＧＷＥＡＳＴＥＲＭＹＰＥＤＧＡＬＫＧＥＩＫＭＲＬＫＬＫＤＧＧＨＹＤＡＥＶＫＴＴＹＭＡＫＫＰＶＱＬＰＧＡＹＫＴＤＩＫＬＤＩＴＳＨＮＥＤＹＴＩＶＥＱＹＥＲＡＥＧＲＨＳＴＧＡ
[00357]ヒトＣＬＤＮ１８．２のアミノ酸配列（配列番号３０）
ＭＡＶＴＡＣＱＧＬＧＦＶＶＳＬＩＧＩＡＧＩＩＡＡＴＣＭＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＧＹＦＴＬＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲＡＬＭＩＶＧＩＶＬＧＡＩＧＬＬＶＳＩＦＡＬＫＣＩＲＩＧＳＭＥＤＳＡＫＡＮＭＴＬＴＳＧＩＭＦＩＶＳＧＬＣＡＩＡＧＶＳＶＦＡＮＭＬＶＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＴＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦＧＡＡＬＦＶＧＷＶＡＧＧＬＴＬＩＧＧＶＭＭＣＩＡＣＲＧＬＡＰＥＥＴＮＹＫＡＶＳＹＨＡＳＧＨＳＶＡＹＫＰＧＧＦＫＡＳＴＧＦＧＳＮＴＫＮＫＫＩＹＤＧＧＡＲＴＥＤＥＶＱＳＹＰＳＫＨＤＹＶ
[00358]ヒトＣＬＤＮ１８．２－ｍＲＦＰ１のアミノ酸配列（配列番号５３）：
ＭＡＶＴＡＣＱＧＬＧＦＶＶＳＬＩＧＩＡＧＩＩＡＡＴＣＭＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＧＹＦＴＬＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲＡＬＭＩＶＧＩＶＬＧＡＩＧＬＬＶＳＩＦＡＬＫＣＩＲＩＧＳＭＥＤＳＡＫＡＮＭＴＬＴＳＧＩＭＦＩＶＳＧＬＣＡＩＡＧＶＳＶＦＡＮＭＬＶＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＴＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦＧＡＡＬＦＶＧＷＶＡＧＧＬＴＬＩＧＧＶＭＭＣＩＡＣＲＧＬＡＰＥＥＴＮＹＫＡＶＳＹＨＡＳＧＨＳＶＡＹＫＰＧＧＦＫＡＳＴＧＦＧＳＮＴＫＮＫＫＩＹＤＧＧＡＲＴＥＤＥＶＱＳＹＰＳＫＨＤＹＶＭＡＳＳＥＤＶＩＫＥＦＭＲＦＫＶＲＭＥＧＳＶＮＧＨＥＦＥＩＥＧＥＧＥＧＲＰＹＥＧＴＱＴＡＫＬＫＶＴＫＧＧＰＬＰＦＡＷＤＩＬＳＰＱＦＱＹＧＳＫＡＹＶＫＨＰＡＤＩＰＤＹＬＫＬＳＦＰＥＧＦＫＷＥＲＶＭＮＦＥＤＧＧＶＶＴＶＴＱＤＳＳＬＱＤＧＥＦＩＹＫＶＫＬＲＧＴＮＦＰＳＤＧＰＶＭＱＫＫＴＭＧＷＥＡＳＴＥＲＭＹＰＥＤＧＡＬＫＧＥＩＫＭＲＬＫＬＫＤＧＧＨＹＤＡＥＶＫＴＴＹＭＡＫＫＰＶＱＬＰＧＡＹＫＴＤＩＫＬＤＩＴＳＨＮＥＤＹＴＩＶＥＱＹＥＲＡＥＧＲＨＳＴＧＡ
[00359]２．部位突然変異のＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２細胞またはＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．１細胞へのＣＬＤＮ１８．２キメラ抗体の結合
[00360]トランスフェクトしたＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２細胞またはＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．１細胞を、２％ＢＳＡを含むＰＢＳに１０＾５個／ウェル、１００μｌ／ウェルの密度で再懸濁した。細胞をＦＡＣＳ洗浄緩衝剤（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で３回洗浄し、各ウェルのキメラ抗体１０μｇ／ｍｌおよびＩＭＡＢ３６２の１００μｌ／ウェルとともに４℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳ洗浄緩衝剤で３回洗浄し、ヤギ抗ｈＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＦＩＴＣ（１：２００希釈）１００μｌ／ウェルとともに４℃でさらに３０分間インキュベートした。最後に、細胞をＦＡＣＳ洗浄緩衝剤で３回洗浄し、フローサイトメトリーによって解析した。ＣＬＤＮ１８．２トランスフェクト細胞への結合を解析するために、ＲＦＰ陽性細胞を対照ゲーティングに使用した。
[00361]ＩＭＡＢ３６２を、ＵＳ２００９１６９５４７Ａ１に開示された配列に従って発現させた。最も高いシグナルを持つ単一細胞クローンを選別し、細胞バンク用に増幅した。
[00362]ＩＭＡＢ３６２の重鎖可変領域（配列番号７２）
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＰＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＴＲＳＷＲＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
[00363]ＩＭＡＢ３６２の軽鎖可変領域（配列番号７３）
[00364]
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
[00365]野生型の結合シグナルのパーセンテージと比べた突然変異型ＣＬＤＮ１８．２バリアントへのこれらのキメラ抗体の結合シグナルのパーセンテージを算出し、表４に要約した。図５Ａ～５Ｂに示すように、１８Ｂ１０－Ｃ（すなわち、ヒトＩｇＧ１定常領域に融合させた１８Ｂ１０融合体のキメラ抗体）の結合は、Ｅ５６がＱに突然変異された場合、完全に失われた。この変更はまた、ＩＭＡＢ３６２および５９Ａ９－Ｃを除く他のキメラ抗体にも当てはまった。加えて、本発明者らは、Ａ４２、Ｎ４５などの他のアミノ酸もＩＭＡＢ３６２および他の抗体の結合にある程度寄与したが、１８Ｂ１０－Ｃではそうではなかったことを見出した。
[00366]
実施例７：ヒト化抗体の生成および特性評価
[00367]１．ヒト化抗体の生成、発現および精製
[00368]１８Ｂ１０
[00369]軽鎖についてはヒト生殖系列フレームワーク配列ＶＫ／４－１をおよび重鎖についてはＶＨ／１－４６を、それぞれＣＤＲ移植に使用した。
[00370]重鎖（ＨＣ）バリアント１、２および３を、それぞれ、ＨＣバリアント１については生殖系列配列（１８Ｂ１０ ＨＣ生殖系列、配列番号２３）およびＲ７１Ｉ、Ｔ７３Ｋの復帰突然変異（Ｈｕ１８Ｂ１０＿Ｈａ、配列番号２５）に、ＨＣバリアント２については上記生殖系列配列およびＲ７１Ｉ、Ｔ７３Ｋ、Ｔ２８Ｓ、Ｍ６９Ｌの復帰突然変異（Ｈｕ１８Ｂ１０＿Ｈｂ、配列番号２７）に、ＨＣバリアント３については上記生殖系列配列およびＲ７１Ｉ、Ｔ７３Ｋ、Ｔ２８Ｓ、Ｍ６９Ｌ、Ｒ３８Ｋ、Ｍ４８Ｉの復帰突然変異（Ｈｕ１８Ｂ１０＿Ｈｃ、配列番号２９）に、３つのＣＤＲを直接移植することによって取得した。
[00371]（１）１８Ｂ１０ ＨＣの生殖系列配列：
[00372]ＶＨ／１－４６（１８Ｂ１０－生殖系列、配列番号２３）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
[00373]ＶＨ／１－４６バリアント１（Ｈｕ１８Ｂ１０＿Ｈａ、配列番号２５）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＩＤＫＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＹＨＧＮＡＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
[00374]ＶＨ／１－４６バリアント２（Ｈｕ１８Ｂ１０＿Ｈｂ、配列番号２７）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＩＤＫＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＹＨＧＮＡＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
[00375]ＶＨ／１－４６バリアント３（Ｈｕ１８Ｂ１０＿Ｈｃ、配列番号２９）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＩＤＫＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＹＨＧＮＡＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
[00376]軽鎖（ＬＣ）バリアント１および２を、生殖系列配列（１８Ｂ１０ ＬＣ生殖系列、配列番号２４）に３つのＣＤＲを直接移植し、それぞれバリアント１（Ｈｕ１８Ｂ１０＿Ｌａ、配列番号２６）については復帰突然変異なし、ＬＣバリアント２（Ｈｕ１８Ｂ１０＿Ｌｂ、配列番号２８）についてはＳ６３Ｔ、Ｉ２１Ｍにより、取得した。
[00377]（２）１８Ｂ１０ ＬＣの生殖系列配列：
[00378]ＶＫ／４－１（１８Ｂ１０ ＬＣ生殖系列、配列番号２４）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰ
[00379]ＶＫ／４－１バリアント１（Ｈｕ１８Ｂ１０＿Ｌａ、配列番号２６）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＬＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＫＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
[00380]ＶＫ／４－１バリアント２（Ｈｕ１８Ｂ１０＿Ｌｂ、配列番号２８）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＬＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＫＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
[00381]上記の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組合せは、以下のヒト化１８Ｂ１０抗体を生成する：１８Ｂ１０－ＨａＬａ（配列番号２５のＶＨおよび配列番号２６のＶＬを有する）、１８Ｂ１０－ＨｂＬａ（配列番号２７のＶＨおよび配列番号２６のＶＬ）、１８Ｂ１０－ＨｃＬａ（配列番号２９のＶＨおよび配列番号２６のＶＬを有する）、１８Ｂ１０－ＨａＬｂ（配列番号２５のＶＨおよび配列番号２８のＶＬを有する）、１８Ｂ１０－ＨｂＬｂ（配列番号２７のＶＨおよび配列番号２８のＶＬを有する）、１８Ｂ１０－ＨｃＬｂ（配列番号２９のＶＨおよび配列番号２８のＶＬを有する）。
[00382]１８Ｂ１０の重鎖および軽鎖のヒト化バリアントは、下に示すようにヒトＩｇＧ１重鎖定常領域およびカッパ軽鎖定常領域に連結される：
[00383]ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号４９）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
[00384]ヒトカッパ軽鎖定常領域（配列番号５０）：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
[00385]上記の重鎖および軽鎖のｃＤＮＡの可変領域を合成し、ヒトＩｇＧ１およびヒトカッパの定常領域と融合させた。選択した抗体遺伝子の重鎖および軽鎖を発現ベクターにクローニングし、大規模ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ製のＰｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを使用して調製した。製造業者のプロトコルに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、トランスフェクションを実施した。細胞生存率がおよそ６０％であった場合に上清を採取した。細胞培養上清を０．２２μｍ濾過カプセルを通して濾過して、細胞デブリを除去した。上清をあらかじめ平衡化したプロテインＡアフィニティーカラム上へとローディングする。次いで、カラム内部のプロテインＡ樹脂を平衡化緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、２５ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．５）を使用して抗体を溶出した。ｐＨを、１Ｍトリス塩基（ｐＨ９．０）を用いて約６．０～７．０に調整した。エンドトキシンを１ＥＵ／ｍｇ未満に制御した。次いで、精製した抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣによって特徴付けした。
[00386]２．ヒトおよびマウスのＣＬＤＮ１８．２への結合
[00387]対数期のＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２細胞とＮＵＧＣ４細胞をＰＢＳに再懸濁した。ＦＡＣＳ洗浄緩衝剤（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）を使用することによる３×の細胞洗浄の後、４００ｎＭから０．００２ｎＭまでの範囲の希釈ヒト化抗体１００μｌ／ウェルを、４℃で３０分間のインキュベーションにあたり、各ウェルに添加した。再び、ＦＡＣＳ洗浄緩衝剤を使用することによって細胞を３回洗浄し、次いでヤギ抗ｍＩｇＧ－ＦＩＴＣ（１：４００希釈）１００μｌ／ウェルとともに４℃でさらに３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ洗浄緩衝剤を使用した最終の３×洗浄の後、フローサイトメトリーによって細胞を解析した。
[00388]最善のものをスクリーニングするために、全てのヒト化抗体バリアントをキメラ抗体と直接比較して試験した。全てのバリアントがその結合を完全に保持していた。次に、復帰突然変異を１つのみ有した１８Ｂ１０－ＨａＬａを、ＨＥＫ２９３マウスＣＬＤＮ１８．２細胞へのその結合について試験した。１８Ｂ１０－ＨａＬａは、ＩＭＡＢ３６２よりも良好な効力および高いＭＦＩでマウスＣＬＤＮ１８．２に十分に結合することができたが、このことは、１８Ｂ１０－ＨａＬａはマウスへの良好な交差反応性を有したことを示す。
[00389]３．ＫｉｎＥｘＡによるヒト化ＣＬＤＮ１８．２抗体の親和性解析
[00390]１８Ｂ１０－ＨａＬａおよびＩＭＡＢ３６２を、ＣＬＤＮ１８．２発現細胞へのその親和性結合についてＫｉｎＥｘＡによって直接比較で評価した。ＫｉｎＥｘＡ ４０００（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）の取扱説明書に従い、ＰＭＭＡハードビーズ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ、＃４４０１７６）２００ｍｇをヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体３０μｇで２時間コーティングし、次いでＢＳＡ １０ｍｇ／ｍｌで１時間遮断した。２種の胃細胞株、ＮＵＧＣ４およびＫＡＴＯＩＩＩ（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＨＴＢ－１０３）を対数期で収集し、０．２ｎＭ １８Ｂ１０－ＨａＬａまたはＩＭＡＢ３６２と混合した。細胞－抗体混合物を、０．２ｎＭの１８Ｂ１０－ＨａＬａまたはＩＭＡＢ３６２を使用して２倍に希釈し、室温で３時間インキュベートした。遊離抗体の量は、希釈とともに増加していた。この遊離抗体をヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃコーティングビーズによって捕捉し、続いて、読み出し用にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ヒトＩｇＧ １μｇ／ｍｌによって標識した。
[00391]各抗体の結合親和性を表５に要約した。ＮＵＧＣ４細胞およびＫＡＴＯＩＩＩへの１８Ｂ１０－ＨａＬａ結合のＫｄは約０．３ｎＭであり、これはＩＭＡＢ３６２のＫｄより８倍超で高かった。このことは、上記のＦＡＣＳ結合結果と一致した。
[00392]
[00393]４．ＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２細胞でのＣＤＣアッセイ
[00394]１８Ｂ１０－ＨａＬａを、ＣＤＣ活性アッセイにおいてＩＭＡＢ３６２と直接比較で試験した。１８Ｂ１０－ＨａＬａは、ＩＭＡＢ３６２よりも２０倍超で高いＣＤＣ活性を有した。１８Ｂ１０－ＨａＬａ依存性の特異的細胞殺滅のパーセンテージは、０．３μｇ／ｍｌの濃度で８６％に達したが、一方、ＩＭＡＢ３６２は同じ濃度で細胞殺滅を有さなかった。
[00395]５．ＭＫＮ４５－ＣＬＤＮ１８．２細胞に対する結合および細胞傷害性効果
[00396]細胞結合アッセイは上記と同じとした。１８Ｂ１０のヒト化バリアント全てが、キメラ１８Ｂ１０と同等の親和性で細胞に結合した。復帰突然変異を１つだけ備える１８Ｂ１０－ＨａＬａを、さらなるＡＤＣＣ活性研究向けに選択した。
[00397]Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ｌｕｃ－ＦｃγＲＩＩＩＡ－Ｖ１７６細胞をエフェクター細胞としておよびＭＫＮ４５－ＣＬＤＮ１８．２細胞を標的細胞として使用して、ＡＤＣＣ活性を試験した。１８Ｂ１０－ＨａＬａは、ＩＭＡＢ３６２よりもはるかに低いＥＣ５０（０．０５μｇ／ｍｌ）を有し、キメラ１８Ｂ１０のＥＣ５０と一致した。
[00398]６．ＮＵＧＣ４細胞に対する結合および細胞傷害性効果
[00399]細胞結合およびＡＤＣＣアッセイは上と同じとした。１８Ｂ１０－ＨａＬａは、ＩＭＡＢ３６２と比較して、はるかに良好なＡＤＣＣ効力（ＥＣ５０ およそ０．５９μｇ／ｍｌ）を示した。
[00400]７．ＮＵＧＣ４を標的細胞としておよびＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用するＡＤＣＣアッセイ
[00401]対数期のＮＵＧＣ４細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。細胞を、９６ウェルＵ底プレートに１ウェルあたり１×１０＾４個の細胞で事前播種した。抗ＣＬＤＮ１８．２抗体およびＩＭＡＢ３６２を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で勾配希釈し、最終濃度２００から０．２μｇ／ｍｌまでで上のプレートに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。Ｍｉａｏ Ｓｈｕｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ製の凍結ＰＢＭＣを液体窒素から取り出し、直ちに３７℃のウオーターバスに入れた。遠心分離後、細胞をＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳに再懸濁し、次いで、上述の９６ウェルＵ底プレートにウェルあたり４０×１０＾４個の細胞で播種した。次いで、プレートをインキュベーター中に３７℃で５時間置いた。
[00402]インキュベーションの後、プレートを２２℃に平衡化した。Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｇ７８９２）またはＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｇ１７８０）を使用することによって、ＬＤＨを検出した。製造業者の取扱説明書に従ってＬｙｓｉｓ、Ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓを添加した後、励起波長５６０ｎｍおよび発光波長５９０ｎｍ（Ｇ７８９２）で蛍光を測定するか、または４９０ｎｍもしくは４９２ｎｍ（Ｇ１７８０）にての吸光度を測定した。
[00403]１８Ｂ１０－ＨａＬａは、ＩＭＡＢ３６２よりもはるかに良好なＡＤＣＣ効力を示した。回帰曲線にフィットしないので、ＥＣ５０が正確に算出されない可能性がある。
[00404]８．ヒトＣＬＤＮ１８．２での部位特異的突然変異誘発を使用する、選択した抗体のエピトープマッピング
[00405]同一方法およびヒトＣＬＤＮ１８．２－ｍＲＦＰプラスミドを使用して、下に列挙のヒトＣＬＤＮ１８．２の２８～８０の間の４２個のアミノ酸を一度に１個ずつアラニンで置き換えた。これらのバリアントを、プライマーを使用するオーバーラップＰＣＲによって増幅した。具体的な突然変異は、Ｑ２８Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｗ３０Ａ、Ｓ３１Ａ、Ｔ３２Ａ、Ｑ３３Ａ、Ｄ３４Ａ、Ｌ３５Ａ、Ｙ３６Ａ、Ｎ３７Ａ、Ｎ３８Ａ、Ｖ４０Ａ、Ｔ４１Ａ、Ｖ４３Ａ、Ｆ４４Ａ、Ｎ４５Ａ、Ｙ４６Ａ、Ｑ４７Ａ、Ｌ４９Ａ、Ｗ５０Ａ、Ｒ５１Ａ、Ｓ５２Ａ、Ｖ５４Ａ、Ｒ５５Ａ、Ｅ５６Ａ、Ｅ５６Ａ、Ｓ５７Ａ、Ｓ５８Ａ、Ｆ６０Ａ、Ｔ６１Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｒ６４Ａ、Ｙ６６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｔ６８Ａ、Ｌ６９Ａ、Ｌ７０Ａ、Ｌ７２Ａ、Ｍ７５Ａ、Ｌ７６Ａ、Ｑ７７Ａ、Ｖ７９Ａ、Ｒ８０Ａである。次いで、ＰＣＲ産物を、製造業者の取扱説明書に従ってＳｙｎｏアセンブリミックス試薬（Ｓｙｎｂｉｏ）を使用する相同組換えの方法によって、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローニングした。プラスミドはＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用することによって精製した。
[00406]続いて、突然変異型および野生型ＣＬＤＮ１８．２－ｍＲＦＰのこれらのプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に細胞をフローサイトメトリーによって解析した。
[00407]Ｗ３０、Ｌ４９、Ｗ５０、Ｅ５６がＡに突然変異された場合、１８Ｂ１０－ＨａＬａの結合は完全に失われたが（結合パーセンテージ＜１０％）、このことは、これら４個のアミノ酸がヒトＣＬＤＮ１８．２へのその結合にとって極めて重要であることを示す。とりわけ、Ｅ５６は結合エピトープを構成する最も重要なものである。これら４個の極めて重要なアミノ酸の他に、Ｒ５１、Ｆ６０、Ｅ６２、Ｒ８０などの他のいくつかのアミノ酸も、アラニンで置き換えられると、結合に影響を及ぼす（１０％と２５％の間の結合パーセンテージ）。部位突然変異ＣＬＤＮ１８．２への５９Ａ９－Ｃの結合は、部分的にのみＥ５６に依存性であった（結合パーセンテージ約２２％）。野生型と比較した抗体への突然変異ＣＬＤＮ１８．２の結合パーセンテージを表６に要約した。
[00408]
[00409]実施例８ ＣＬＤＮ１８．２を標的とする次世代核種標識のモノクローナル抗体（１２４Ｉ－１８Ｂ１０を一例として取り上げる）のＰＤＸマウスにおける体内分布
[00410]１２４Ｉ－１８Ｂ１０（０．７４ＭＢｑ、各群当たり２００μＬ）を、胃がん患者の腫瘍からの腫瘍組織を重症免疫不全マウス（ＮＳＧ）のマウスへと移植することにより形成した患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）モデル（ｃｌａｕｄｉｎ１８．２過剰発現で確認、Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃａｎｃｅｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌの消化器腫瘍科より提供）に、尾部静脈を介して注射した。体内分布実験を、試験群についてはＰＤＸマウスの１２４Ｉ－１８Ｂ１０ならびに、遮断群については１２４Ｉ－１８Ｂ１０および非標識１８Ｂ１０（２００ｍｇ／マウス）で共添加されたことを含めて、２つの群に分けた。マウスの心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、胃、骨、筋肉、大腸、小腸、脳、および腫瘍を注射の２４０時間後に分離した。磨砕後、取込みシグナルをγカウンターにより検出および解析し、１２４Ｉ－１８Ｂ１０プローブのＩＤ％／ｇを得た。
[00411]ＰＤＸマウス（図６）では、腫瘍において１２４Ｉ－１８Ｂ１０の取込みが他の群と比較して最も高かった。非標識１８Ｂ１０との競合に起因して、遮断群は正常組織と腫瘍組織の両方で取込みの有意な減少を示した。本結果が示すところは、１２４Ｉ－１８Ｂ１０が腫瘍細胞に濃縮されたことであり、このことは疾患診断における１２４Ｉ－１８Ｂ１０の用途を裏付ける。
[00412]実施例９ 患者におけるＣＬＤＮ１８．２を標的とする次世代核種標識のモノクローナル抗体（１２４Ｉ－１８Ｂ１０を一例として取り上げる）のマッピング
[00413]探索的臨床研究では、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現がんと診断された患者を、１２４Ｉ－１８Ｂ１０ ＰＥＴ／ＣＴイメージングの前後１週間以内に１２４Ｉ－１８Ｂ１０ ＰＥＴ／ＣＴスキャンおよび１８Ｆ－ＦＤＧ ＰＥＴ／ＣＴの対象とした（各患者当たり１１．１～１８．５ＭＢｑ、静脈内注射による）。１２４Ｉ－１８Ｂ１０ ＰＥＴイメージングの場合、１２４Ｉ－１８Ｂ１０の投与の３日前および７日後にルゴールヨウ化カリウム（毎回１０滴、１日３回）を取ることにより患者の甲状腺を遮断した。１２４Ｉ－１８Ｂ１０ ＰＥＴ／ＣＴスキャンを、１２４Ｉ－１８Ｂ１０の投与に続いて２時間、２４時間、７２時間、９６時間後にＳｉｅｍｅｎｓ Ｂｉｏｇｒａｐｈ ｍＣＴ Ｆｌｏｗ ６４スキャナー（Ｅｒｌａｎｇｅｎ、ドイツ）を用いて取得した。ＰＥＴ画像は、頭から足または大腿上部まで、０．８ｍｍ／秒、０．５ｍｍ／秒、０．４ｍｍ／秒、０．３ｍｍ／秒および０．２ｍｍ／秒のスキャン速度で、それぞれ、２時間、２４時間、４８時間、７２時間で取得し、順序付きサブセット化による期待値最大化法を使用して再構成した。
[00414]患者における１２４Ｉ－１８Ｂ１０の体内分布を、最初の５人の患者の画像から導出した（図７）。甲状腺は患者において十分に遮断された。トレーサーは注射後血液中で濃縮され、経時的に低下し、脾臓および肝臓の濃度は経時的に上昇した。脾臓は、２４時間、４８時間、および７２時間で最も高い活性を有する臓器となった。腎臓でもトレーサーの取込みがあり、脳、肺および骨での取込みは低かった。明瞭なトレーサーの取込みは、正常な胃壁では見られなかった。加えて、図８は、１２４Ｉ－１８Ｂ１０が患者の卵巣病変に蓄積したが、これは卵巣に転移したｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現がんであったことを示した。１８Ｆ－ＦＤＧ ＰＥＴ／ＣＴの結果と比較して、１２４Ｉ－１８Ｂ１０ ＰＥＴ／ＣＴ ２４時間および１２４Ｉ－１８Ｂ１０ ＰＥＴ／ＣＴ ４８時間の結果は、１２４Ｉ－１８Ｂ１０が、卵巣病変中のｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現がん組織においてより高い取込みを有したこと（１８Ｆ－ＦＤＧ ＰＥＴ／ＣＴ ＳＵＶｍａｘ：３（左）、２．９（右）；１２４Ｉ－１８Ｂ１０ ＰＥＴ／ＣＴ ２４時間ＳＵＶｍａｘ：２５．１（左）、２２．２（右）；１２４Ｉ－１８Ｂ１０ ＰＥＴ／ＣＴ ４８時間ＳＵＶｍａｘ：１２．５（左）、１７．６（右））を示した。

Claims (50)

  1. 治療用放射性核種または診断用放射性核種を含む放射性核種にコンジュゲートされた抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片を含む、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート。
  2. 前記治療用放射性核種が、１１１Ｉｎ、１１１ｍＩｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１９９Ａｕおよび２１１Ｐｂからなる群から選択される、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート。
  3. 前記診断用放射性核種が、１８Ｆ、３２Ｐ、３３Ｐ、４５Ｔｉ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７５Ｓｃ、７７Ａｓ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、９９Ｍｏ、１０５Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１ｌｎ、１２３ｌ、１２４ｌ、１２５ｌ、１３１ｌ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５４’’１５８１Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７５Ｌｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４ｌｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃからなる群から選択される、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート。
  4. 前記診断用放射性核種が、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）または単一光子放出コンピュータ化断層撮影（ＳＰＥＣＴ）によって検出可能である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート。
  5. 前記放射性核種が、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、８６Ｙ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１２３／１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１１Ｃ、１４Ｃ、４１Ｃａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１３Ｎ、１５Ｏ、４４Ｓｃ、１８Ｆ、９９ｍＴｃ、および９０ｍＴｃからなる群から選択される、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート。
  6. 前記放射性核種が１２４Ｉまたは１２３Ｉまたは１３１Ｉである、請求項２に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート。
  7. 前記放射性核種が６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、または８９Ｚｒである、請求項２に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート。
  8. 前記６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、または８９Ｚｒが、キレート剤を介して前記抗体またはその抗原結合断片に標識されている、請求項６に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート。
  9. 前記キレート剤がキレート化のための３個以上の原子を含み、各原子が窒素、硫黄、酸素、およびリンからなる群から選択される、請求項７に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート。
  10. 前記キレート剤が、ＤＦＯ（デルフェロキサミン）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸）、ＤＴＰＡ（ＮＲ－ジエチレントリアミン五酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－酢酸）、１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸（本明細書ではＴＲＩＴＡと略記）；１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸（本明細書ではＴＥＴＡと略記）；および１，５，９，１３－テトラアザシクロヘキサデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸（本明細書ではＨＥＴＡと略記）、エチレンジアミン四酢酸（本明細書ではＥＤＴＡと略記）、またはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を含む、請求項９に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート。
  11. 前記放射性核種が６４Ｃｕもしくは６７Ｃｕであり、かつ前記キレート剤がＴＥＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＯＤＡ、もしくはＮＯＤＧＡを含むか、または前記放射性核種が８９Ｚｒであり、かつ前記キレート剤がＤＦＯを含む、請求項１０に記載の抗体コンジュゲート。
  12. 前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片が、重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに／または軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の配列を含み、ここで：
    前記ＨＣＤＲ１配列は、ＧＹＮＭＮ（配列番号１）、もしくはＴＹＦＩＧＶＧ（配列番号１３）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
    前記ＨＣＤＲ２配列は、Ｘ１ＩＤＰＹＹＸ２Ｘ３ＴＸ４ＹＮＱＫＦＸ５Ｇ（配列番号３２）、もしくはＨＩＷＷＮＤＮＫＹＹＮＴＡＬＫＳ（配列番号１５）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
    前記ＨＣＤＲ３配列は、Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＧＮＡＦＤＹ（配列番号３３）、もしくはＭＧＳＧＡＷＦＴＹ（配列番号１７）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
    前記ＬＣＤＲ１配列は、ＫＳＳＱＸ９ＬＸ１０ＮＸ１１ＧＮＸ１２ＫＮＹＬＴ（配列番号３４）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
    前記ＬＣＤＲ２配列は、ＷＡＳＴＲＸ１３Ｓ（配列番号３５）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
    前記ＬＣＤＲ３配列は、ＱＮＤＹＸ１４Ｘ１５ＰＸ１６Ｔ（配列番号３６）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同体配列を含み；
    ここで、Ｘ１はＮまたはＹまたはＨであり、Ｘ２はＧまたはＶであり、Ｘ３はＡまたはＧまたはＴであり、Ｘ４はＲまたはＴまたはＳであり、Ｘ５はＫまたはＲであり、Ｘ６はＳまたはＭであり、Ｘ７はＹまたはＦであり、Ｘ８はＹまたはＨであり、Ｘ９はＳまたはＮであり、Ｘ１０はＬまたはＦであり、Ｘ１１はＳまたはＮであり、Ｘ１２はＱまたはＬであり、Ｘ１３はＥまたはＫであり、Ｘ１４はＳまたはＹであり、Ｘ１５はＦまたはＹであり、かつＸ１６はＦまたはＬである、請求項１～１１のいずれかに記載の抗体コンジュゲート。
  13. 前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片が：
    配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号５の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
    配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号５の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号８の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
    配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号９の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１１の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号１０の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
    配列番号１３の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１５の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１７の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１２の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
    配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１９の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号２１の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号１４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１８の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または
    配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２２の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号５の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２０の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
  14. 前記重鎖可変領域が、重鎖ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４のうちの１つもしくは複数をさらに含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、軽鎖ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３、およびＬＦＲ４のうちの１つもしくは複数をさらに含み、ここで：
    前記ＨＦＲ１は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＸ１７ＦＴ（配列番号５４）またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
    前記ＨＦＲ２は、ＷＶＸ１８ＱＡＰＧＱＧＬＥＷＸ１９Ｇ（配列番号５５）またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
    前記ＨＦＲ３配列は、ＲＶＴＸ２０ＴＩＤＫＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号５６）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
    前記ＨＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号５７）またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
    前記ＬＦＲ１は、ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＸ２１ＮＣ（配列番号５８）またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
    前記ＬＦＲ２は、ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（配列番号５９）またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
    前記ＬＦＲ３は、ＧＶＰＤＲＦＸ２２ＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣ（配列番号６０）またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
    前記ＬＦＲ４は、ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６１）またはその少なくとも８０％の配列同一性の相同性配列を含み、
    ここで、Ｘ１７はＴまたはＳであり、Ｘ１８はＲまたはＫであり、Ｘ１９はＭまたはＩであり、Ｘ２０はＭまたはＬであり、Ｘ２１はＩまたはＭであり、かつＸ２２はＳまたはＴである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
  15. 前記ＨＦＲ１が、配列番号６２および６３からなる群から選択される配列を含み、
    前記ＨＦＲ２が、配列番号６４および６５からなる群から選択される配列を含み、
    前記ＨＦＲ３が、配列番号６６および６７からなる群から選択される配列を含み、
    前記ＨＦＲ４が、配列番号５７の配列を含み、
    前記ＬＦＲ１が、配列番号６８および６９からなる群からの配列を含み、
    前記ＬＦＲ２が、配列番号５９の配列を含み、
    前記ＬＦＲ３が、配列番号７０および７１からなる群から選択される配列を含み、
    前記ＬＦＲ４が、配列番号６１の配列を含む、請求項１４に記載の抗体コンジュゲート。
  16. 前記重鎖可変領域が、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、および配列番号４７、ならびにＣＬＤＮ１８．２への特異的な結合親和性を依然として保持しつつ少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
  17. 前記軽鎖可変領域が、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、およびＣＬＤＮ１８．２への特異的な結合親和性を依然として保持しつつ少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
  18. 前記重鎖可変領域が配列番号２３の配列を含み、かつ軽鎖可変領域が配列番号２４の配列を含む；
    前記重鎖可変領域が配列番号２５の配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号２６の配列を含む；
    前記重鎖可変領域が配列番号２７の配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号２８の配列を含む；
    前記重鎖可変領域が配列番号２９の配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号２６もしくは２８の配列を含む；
    前記重鎖可変領域が配列番号３７の配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号３８の配列を含む；
    前記重鎖可変領域が配列番号３９の配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号４０の配列を含む；
    前記重鎖可変領域が配列番号４１の配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号４２の配列を含む；
    前記重鎖可変領域が配列番号４３の配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号４４の配列を含む；
    前記重鎖可変領域が配列番号４５の配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号４６の配列を含む；または
    前記重鎖可変領域が配列番号４７の配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が配列番号４８の配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
  19. 前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＣＬＤＮ１８．２への特異的な結合親和性を依然として保持する１つまたは複数のアミノ酸残基の置換または改変をさらに含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
  20. 前記置換または改変のうちの少なくとも１つが、前記ＶＨもしくはＶＬ配列の、１つもしくは複数のＣＤＲ配列中および／または１つもしくは複数の非ＣＤＲ領域中にある、請求項１９に記載の抗体コンジュゲート。
  21. 前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片が、免疫グロブリン定常領域、任意選択でヒトＩｇの定常領域、または任意選択でヒトＩｇＧの定常領域をさらに含む、請求項１２～２０のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
  22. 前記定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の定常領域を含む、請求項２１に記載の抗体コンジュゲート。
  23. ヒトＩｇＧ１の前記定常領域が、配列番号４９、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有する相同性配列を含む、請求項２２に記載の抗体コンジュゲート。
  24. 前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片がヒト化されている、請求項１～２３のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
  25. 前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片が、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、および二価ドメイン抗体である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
  26. 請求項１～２５のいずれかに記載の前記抗体コンジュゲート、および１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  27. 放射化学的純度が少なくとも９５％（例えば、９７％、９８％、９９％）である、請求項２６に記載の医薬組成物。
  28. 対象において目的の部位の画像を取得する方法であって、
    ａ）請求項１～２５のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲートおよび／または請求項２６～２７のいずれか一項に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与するステップと；
    ｂ）前記対象の目的の部位を陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）またはＳＰＥＣＴに供するステップと；
    ｃ）前記対象において放射性核種からの検出可能なシグナルを特定するステップと；
    ｄ）前記検出可能なシグナルの画像を作成し、それによって前記対象において前記目的の部位の画像を取得するステップと、
    を含む、方法。
  29. 前記目的の部位が、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を発現しているかまたはｃｌａｕｄｉｎ１８．２を発現していると疑われる部位である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記目的の部位が、腫瘍を有するかまたは腫瘍を有すると疑われている、請求項２８～２９のいずれかに記載の方法。
  31. 対象において非侵襲的な様式でｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現を検出または視覚化する方法であって、
    ａ）請求項１～２５のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲートおよび／または請求項２６～２７のいずれか一項に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与するステップと；
    ｂ）前記対象を陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）またはＳＰＥＣＴに供するステップと；
    ｃ）前記対象の目的の部位において放射性核種からの検出可能なシグナルを特定するステップと；
    ｄ）特定された検出可能なシグナルに基づいて、前記対象の前記目的の部位におけるｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現を決定または視覚化するステップと、
    を含む、方法。
  32. 前記目的の部位においてｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現を有すると特定された対象に、抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２療法の治療有効量を投与するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記特定された検出可能なシグナルに基づいて、前記対象の前記目的の部位におけるｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現の分布を決定するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記対象の前記目的の部位におけるｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現の不均一性を決定するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記目的の部位が腫瘍である、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 治療期間の間処置を受けていた対象において、非侵襲的な様式で、治療有効性、処置への応答性、または抵抗性もしくは再発の発生、または転移をモニタリングする方法であって、
    ａ）請求項１～２５のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲートおよび／または請求項２６～２７のいずれか一項に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与するステップと；
    ｂ）前記対象を陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）またはＳＰＥＣＴに供するステップと；
    ｃ）前記対象の目的の部位において放射性核種からの検出可能なシグナルを特定するステップと；
    ｄ）特定された検出可能なシグナルに基づいて、前記対象の目的の部位における処置後のｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現を決定するステップと；
    ｅ）処置後のｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現のレベルまたは分布をそれぞれ、治療期間前に前記対象から得られたベースラインのｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現のレベルまたは分布と比較して、前記対象において前記ｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現のレベルまたは分布の処置後の変化を決定するステップと；
    ｆ）ステップ（ｅ）で決定された前記変化に基づいて、治療有効性、処置への応答性、または抵抗性もしくは再発の発生、または転移を決定するステップと
    を含む、方法。
  37. ｃｌａｕｄｉｎ１８．２発現のレベル上昇または広がりが、低減した治療有効性、処置への低減した応答性、または抵抗性の存在もしくは再発の存在を示す、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記対象ががんを有する、請求項３７に記載の方法。
  39. 請求項１～２５のいずれかに記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートおよび／または請求項２６～２７に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む、ＣＬＤＮ１８．２関連疾患または状態の処置を必要とする前記対象においてＣＬＤＮ１８．２関連疾患または状態を処置する方法。
  40. 前記疾患または状態ががんであり、任意選択でＣＬＤＮ１８．２発現がんである、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記対象はＣＬＤＮ１８．２発現がんを有すると特定されている、請求項４０に記載の方法。
  42. 請求項１～２５のいずれかに記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲート、または請求項２６～２７のいずれかに記載の組成物を含むキット。
  43. 請求項１～２５のいずれかに記載の第１の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートと、請求項１～２５のいずれかに記載の第２の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートとを含むキットであって、前記第１の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは診断用放射性核種を含み、前記第２の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは治療用放射性核種を含む、キット。
  44. 請求項２８～４１のいずれか一項に記載の方法で使用するためのものである、請求項４２または４３に記載のキット。
  45. 請求項２８～３８のいずれか一項に記載の方法で使用するための医薬の製造における、請求項１～２５のいずれかに記載の前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートまたは請求項２６～２７のいずれかに記載の組成物の使用であって、前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは診断用放射線核種を含む、使用。
  46. 請求項３９～４１のいずれか一項に記載の方法で使用するための医薬の製造における、請求項１～２５のいずれかに記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートまたは請求項２６～２７のいずれかに記載の組成物の使用であって、前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートは治療用放射線核種を含む、使用。
  47. 抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片を、１２４Ｉ、１２３Ｉまたは１３１Ｉで標識されたヨウ化物化合物と酵素的または化学的酸化剤の存在下で反応させるステップを含む、請求項６に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートを調製する方法。
  48. 前記化学的酸化剤が、Ｎ－ブロモスクシンイミド、ヨードゲン、またはクロラミン－Ｔである、請求項４７に記載の方法。
  49. 抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合断片を、キレート剤とコンジュゲートさせてキレート剤－抗体コンジュゲートを取得するステップと、前記キレート剤－抗体コンジュゲートを６４Ｃｕまたは８９Ｚｒと反応させるステップとを含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体コンジュゲートを調製する方法。
  50. 前記キレート剤が、ＤＦＯ（デルフェロキサミン）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸）、ＤＴＰＡ（ＮＲ－ジエチレントリアミン五酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－酢酸）、ＴＲＩＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸）；ＴＥＴＡ（１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸）；およびＨＥＴＡ（１，５，９，１３－テトラアザシクロヘキサデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”－四酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＮＥＴＡ（｛４－［２－（ビス－カルボキシメチルアミノ）－エチル］］－７－カルボキシメチル－［１，４，７］トリアゾナン－１－イル｝－酢酸）、ＴＡＣＮ－ＴＭ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，トリス（２－メルカプトエチル）１，４，７－トリアザシクロノナン）、ＴＲＡＰ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－トリス［メチル（２－カルボキシエチル）ホスフィン酸］）、ＣＰ２５６、ＰＣＴＡ（３，６，９，１５－テトラアザビシクロ［９．３．１］ペンタデカ－１（１５），１１，１３－トリエン－３，６，９,－三酢酸）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシム、ならびにそれらの誘導体を含む、請求項４９に記載の方法。
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