BR112014007469B1

BR112014007469B1 - Método de fabricação de uma biblioteca de domínios de módulo de fibronectina tipo iii (fn3), biblioteca e método para obter um arcabouço de proteína

Info

Publication number: BR112014007469B1
Application number: BR112014007469-0A
Authority: BR
Inventors: Michael Diem; Steven Jacobs
Original assignee: Janssen Biotech, Inc
Priority date: 2011-09-27
Filing date: 2012-09-27
Publication date: 2022-06-14
Also published as: EP3540100B8; JP6440496B2; KR102142385B1; WO2013049275A1; AU2012316080A1; CN110725009B; IL231585A0; US9897612B2; EP2761066A1; JP6722263B2; IL269470A; JP2017121238A; AU2012316080A8; CN103827361A; EA201490703A1; CA2849774A1; US10571472B2; ES2928578T3; IL277891B1; KR20140069226A

Abstract

ARCABOUÇOS DE PROTEÍNA COM BASE EM REPETIÇÃO DE FIBRONECTINA TIPO III COM SUPERFÍCIES DE LIGAÇÃO ALTERNATIVAS. A presente invenção refere-se a arcabouços de proteína e a bibliotecas de arcabouços com base em uma repetição de fibronectina tipo III (FN3) com um modelo de superfície de ligação alternativo, ácidos nucleicos isolados que codificam os arcabouços de proteína, vetores, células hospedeiras e métodos de produção dos mesmos que são úteis na geração de moléculas terapêuticas e tratamento e diagnóstico de doenças e distúrbios.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a arcabouços de proteína e a bibliotecas de arcabouço com base em uma repetição de fibronectina tipo III (FN3) com modelos de superfície de ligação alternativos. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a arcabouços e bibliotecas de FN3 que têm sítios de ligação côncavos formados por beta-filamentos e laços selecionados.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os anticorpos monoclonais são a classe mais amplamente usada de proteínas terapêuticas quando são desejadas alta afinidade e especificidade para uma molécula-alvo. Entretanto, proteínas não anticorpo que têm estruturas tridimensionais relativamente definidas que podem ser projetadas para ligar moléculas-alvo desejadas, comumente denominadas arcabouços de proteína, podem ter vantagens em relação a anticorpos tradicionais devido a seu tamanho pequeno, falta de ligações de dissulfeto, alta estabilidade, e capacidade de expressão em hospedeiros procarióticos. Esses arcabouços tipicamente contêm uma ou mais regiões que são sensíveis a variação de sequência específica ou aleatória, e tal aleatorização de sequência é com frequência executada para produzir bibliotecas de proteínas a partir das quais produtos desejados podem ser selecionados. Métodos inovadores de purificação são prontamente empregados; os arcabouços são facilmente conjugados a fármacos/toxinas, penetram eficazmente em tecidos e podem ser formatados em ligantes multiespecíficos (Binz and Pluckthun, Curr Opin Biotechnol, -16, 459 a 469, 2005, Skerra, J Mol Recognit, 13, 167 a 187, 2000).

[003] Um desses arcabouços de proteína é o domínio de fibronectina tipo III (FN3) identificado em diversas proteínas, que tem uma estrutura característica terciária com 6 laços conectados por 7 filamentos beta. Três laços em particular, os laços FG, BC e DE são estruturalmente análogos às regiões que determinam a complementaridade (CDRs) de anticorpos. Esses laços foram selecionados aleatoriamente para gerar bibliotecas dos arcabouços de domínio de FN3 para selecionar corretamente ligantes específicos a inúmeros alvos diferentes enquanto retêm propriedades biofísicas importantes (Getmanova et al., Chem Biol, 13, 549 a 556, 2006, Hackel et al., J Mol Biol, 381, 1238 a 1252, 2008, Karatan et al., Chem Biol, 11, 835 a 844, 2004; Koide et al., J Mol Biol, 284, 1141 a 1151, 1998; Koide et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 6632 a 6637, 2007; Parker et al., Protein Eng Des Sel, -18, 435 a 444, 2005; Xu et al., Chemistry & Biology, 9, 933 a 942, 2002). Bibliotecas dos domínios de FN3 foram geradas ao selecionar aleatoriamente também os laços AB, EF e CD (publicação de patente US n° 2011/0038866; publicação de patente internacional n WO2011/05133; publicação de patente US n° 2011/0124527). Outras referências de bibliotecas de FN3 incluem as publicações de patente internacional n°s WO2002/32925, WO2003/104418, WO2009/023184 e WO2010/060095. A publicação de patente internacional n° WO2012/016245 descreve bibliotecas de domínio de FN3 com o uso de laços CD e FG juntamente com resíduos expostos à superfície da beta-lâmina.

[004] Seria vantajoso obter proteínas de arcabouço de domínio de fibronectina aprimoradas para ambos os fins terapêuticos e de diagnóstico. A presente descrição apresenta tais proteínas aprimoradas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] Uma modalidade da invenção é um método para fabricação de uma biblioteca de domínios de módulo de fibronectina tipo III (FN3) que têm uma superfície alternativa C-CD-F-FG diversificada formada por um beta-filamento C, um laço CD, um beta-filamento F e um laço FG, que compreende fornecer um polipeptídeo de domínio de FN3 de referência que tem a sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica àquela da SEQ ID NO: 27; introduzir diversidade no polipeptídeo de domínio de FN3 de referência ao realizar a mutação de pelo menos um resíduo de beta-filamento C e pelo menos um resíduo de beta-filamento F para formar a biblioteca de domínio de FN3 que tem a superfície alternativa C-CD-F-FG diversificada.

[006] Outro aspecto da invenção é uma biblioteca produzida pelos métodos da invenção aqui descrita.

[007] Ainda outro aspecto da invenção é um método para obter um arcabouço de proteína que compreende um domínio de módulo de fibronectina tipo III (FN3) que tem uma alternativa C-CD-F-FG diversificada que especificamente liga a uma molécula-alvo, que compreende entrar em contato com ou pesquisar a biblioteca da reivindicação 11 com a molécula-alvo e isolar um arcabouço de proteína que liga especificamente à molécula-alvo com uma afinidade predefinida.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[008] A Figura 1 mostra diagramas em fita de domínio de FN3 e estruturas de domínio de anticorpo VH. Os laços do domínio de FN3 estruturalmente análogo a CDRs são identificados.

[009] A Figura 2 mostra diagramas estruturais que permitem a comparação entre A) bibliotecas de FN3 convencionais com laços selecionados aleatoriamente (Figura 2A); B) biblioteca de FN3 com uma superfície alternativa de C-CD-F-FG selecionada aleatoriamente (biblioteca TCL14) (Figura 2B); C) biblioteca de FN3 com uma superfície A-AB-B-BC-E selecionada aleatoriamente (biblioteca TCL15) (Figura 2C). As posições selecionadas aleatoriamente nesses modelos de biblioteca são mostradas como linhas sólidas nos diagramas em fita.

[0010] A Figura 3 mostra um alinhamento de sequências do arcabouço Tencon27 (SEQ ID NO: 27) e a biblioteca TCL14 (SEQ ID NO: 28) que tem uma superfície alternativa de C-CD-F-FG selecionada aleatoriamente. Os resíduos de laço são confinados. As regiões de laço e beta-filamento particulares são indicadas acima das sequências.

[0011] A Figura 4 mostra um alinhamento de sequências do arcabouço Tencon27 (SEQ ID NO: 27) e uma biblioteca TCL15 que tem uma superfície alternativa A-AB-B-BC-E selecionada aleatoriamente (SEQ ID NO: 61). Os resíduos de laço são confinados. As regiões de laço e beta-filamento particulares são indicadas acima das sequências.

[0012] A Figura 5 mostra um diagrama de topologia do modelo de biblioteca em Tencon27 (SEQ ID NO: 27) com uma superfície alternativa de C-CD-F-FG selecionada aleatoriamente (a biblioteca TCN14). Beta- filamentos são mostrados como setas com resíduos dos filamentos que são ligados um ao outro por hidrogênio na estrutura Tencon27 colocada de modo adjacente na plotagem. As posições de resíduos selecionados aleatoriamente são mostradas com formatos ovais sombreados em cinza.

[0013] A Figura 6 mostra um diagrama de topologia do modelo de biblioteca em Tencon27 (SEQ ID NO: 27) com uma superfície alternativa A-AB-B-BC-E selecionada aleatoriamente (a biblioteca TCL15). Beta- filamentos são mostrados como setas com resíduos dos filamentos que são ligados um ao outro por hidrogênio na estrutura tencon colocada de modo adjacente na plotagem. As posições de resíduos selecionados aleatoriamente são mostradas com formatos ovais sombreados em cinza.

[0014] A Figura 7 mostra distribuições de aminoácido esperadas e observadas em posições selecionadas aleatoriamente na biblioteca TCL14.

[0015] A Figura 8 mostra um alinhamento de sequências de Tencon27, TCL14, e as bibliotecas projetadas em FN10, TN3 e Fibcon com uma superfície alternativa de C-CD-F-FG selecionada aleatoriamente. A numeração de resíduo tem por base a sequência de Tencon27. As sequências de aminoácido das bibliotecas são mostradas nas SEQ ID NOs: 28, 98, 99 e 62, respectivamente). Os resíduos de laço são confinados. As regiões de laço e beta-filamento particulares são indicadas acima das sequências.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0016] O termo "domínio de módulo de fibronectina tipo III (FN3)" ou "domínio de FN3", conforme usado no presente documento, refere-se a um domínio que ocorre frequentemente em proteínas, incluindo fibronectinas, tenascina, proteínas citoesqueletais intracelulares, receptores de citocina e enzimas procarióticas (Bork and Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89, 8990 a 8994, 1992; Meinke et al., J Bacteriol 175, 1910 a 1918, 1993; Watanabe et al., J Biol Chem 265, 15659 a 15665, 1990). Domínios de FN3 exemplificadores (ou módulos) são os 15 domínios de FN3 diferentes presentes em tenascina C de ser humano e os 15 domínios de FN3 diferentes presentes em fibronectina de ser humano (FN). Domínios de FN3 individuais são referidos por número de domínio e nome de proteína, por exemplo, o 3° domínio de FN3 de tenascina (TN3), ou o 10° domínio de FN3 de fibronectina (FN10).

[0017] O termo "domínio de FN3 de referência", conforme usado no presente documento, refere-se a um domínio de FN3 de tipo selvagem ou que não tem ocorrência natural que é usado como um gabarito ao qual substituições são feitas para gerar arcabouços de proteína que ligam especificamente a uma molécula-alvo.

[0018] O termo "superfície alternativa", conforme usado no presente documento, refere-se a uma superfície em um lado do domínio de FN3 que compreende dois ou mais beta filamentos, e pelo menos um laço. Superfícies alternativas exemplificadoras são uma superfície C-CD-F- FG que é formada por aminoácidos nos beta-filamentos C e F e nos laços CD e FG, e uma superfície A-AB-B-BC-E que é formada por aminoácidos nos beta-filamentos A, B e E e no laço BC.

[0019] O termo "substituir" ou "substituídas" ou ‘sofrer mutação" ou "sofreu mutação", conforme usado no presente documento, refere-se a alterar, deletar ou inserir um ou mais aminoácidos ou nucleotídeos em uma sequência de polipeptídeo ou polinucleotídeo para gerar um variante daquela sequência.

[0020] O termo "tornar aleatório" ou "selecionado aleatoriamente" ou "diversificado" ou "diversificar", conforme usado no presente documento, refere-se a realizar pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em uma sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo.

[0021] "Variante", conforme usado no presente documento, refere- se a um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que difere de um polipeptídeo de referência ou um polinucleotídeo de referência por uma ou mais modificações, por exemplo, substituições, inserções ou deleções.

[0022] O termo "liga especificamente" ou "ligação específica", conforme usado no presente documento, refere-se à capacidade do domínio de FN3 da invenção de ligar a uma molécula-alvo com uma afinidade (Kd) de pelo menos 1x10-6 M, e/ou ligar a uma molécula-alvo com uma afinidade que é pelo menos dez vezes maior que sua afinidade para um antígeno não específico (por exemplo, BSA ou caseína), conforme medido por ressonância de plásmon de superfície.

[0023] O termo "molécula-alvo", conforme usado no presente documento, refere-se a uma proteína, peptídeo, carboidrato, lipídio e similares tendo um antígeno ou um epítopo que é reconhecido pelo domínio de FN3 da invenção. A molécula-alvo pode ser de ocorrência natural ou ocorrência não natural.

[0024] O termo "biblioteca" refere-se a uma coleção de variantes. A biblioteca pode ser composta por variantes de polipeptídeo ou polinucleotídeo.

[0025] O termo "tenascina C", conforme usado no presente documento, refere-se a tenascina C de ser humano que tem uma sequência mostrada no n° de acesso no GenBank NP_002151 e na SEQ ID NO: 57. A tenascina C tem 15 domínios de FN3 em tandem que têm sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 1 a 15, respectivamente. A sequência de aminoácidos do 3° domínio de FN3 de tenascina C (TN3) é mostrada na SEQ ID NO: 3.

[0026] O termo "estabilidade", conforme usado no presente documento, refere-se à capacidade de uma molécula manter um estado dobrado em condições fisiológicas de modo que a mesma retenha pelo menos uma de suas atividades funcionais normais, por exemplo, ligar a uma molécula-alvo.

[0027] A presente invenção fornece domínios de FN3 que ligam especificamente a uma molécula-alvo e, dessa forma, podem ser amplamente usados em aplicações terapêuticas e de diagnóstico. A invenção tem por base uma constatação de que uma superfície alternativa em um lado do domínio de FN3 que compreende dois ou mais beta-filamentos e pelo menos um laço pode ser selecionada aleatoriamente para gerar e selecionar arcabouços de proteína que ligam especificamente uma molécula-alvo com alta afinidade. Bibliotecasde domínio com base em FN3 publicadas foram geradas diversificando-se os laços de topo ou fundo, áreas que estruturalmente se assemelham a CDRs em cadeias variáveis de anticorpo, fornecendo superfícies de ligação curvas. Nessa invenção, moléculas de ligação de alta afinidade são selecionadas dentre bibliotecas de domínio de FN3 que exibem superfícies de interação côncavas geradas por seleção aleatória de uma superfície alternativa; aumentando, assim, provavelmente o número de epítopos e alvos contra aos quais arcabouços de proteína de ligação de alta afinidade podem ser selecionados. A presente invenção apresenta polinucleotídeos que codificam os domínios de proteína ou ácidos nucleicos complementares dos mesmos, vetores, células hospedeiras e métodos de preparo e uso dos mesmos. A presente invenção apresenta métodos de preparo de bibliotecas de domínios de FN3, e bibliotecas produzidas por métodos da invenção.

Domínio de fibronectina de tipo III

[0028] O domínio (ou módulo) de fibronectina de tipo III (FN3) é um domínio de repetição prototípico inicialmente identificado em fibronectina e que agora sabe-se estar presente em várias famílias de proteína animal, incluindo receptores de superfície celular, proteína de matriz extracelular, enzimas e proteínas musculares. Estruturalmente, os domínios de FN3 têm uma topologia muito similar àquela de domínios similares a imunoglobulina, exceto pela falta de ligações de dissulfeto. Tal como é conhecido na técnica, domínios de FN3 de ocorrência natural têm uma estrutura em sanduíche beta que tem sete beta- filamentos, chamados de A, B, C, D, E, F e G, ligados por seis laços, chamados de laços AB, BC, CD, DE, EF e FG (Bork e Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89, 8990 a 8992, 1992; patente US n° 6.673.901). Três laços, os laços BC, DE e FG estão no topo do domínio de FN3, e três, os laços AB, CD e EF, no fundo do domínio (Figura 1). A Tabela 1 mostra várias proteínas contendo domínio de FN3, e o número de diferentes domínios de FN3 associados a cada proteína. Embora conformações de domínio de FN3 sejam altamente conservadas, a similaridade entre diferentes domínios no nível de aminoácido é bastante baixo.

[0029] Os domínios de FN3 podem ser de ocorrência natural ou não natural. Domínios de FN3 de ocorrência não natural exemplificadores são um domínio de FN3 de consenso projetado com base em um alinhamento de domínios de FN3 selecionados presentes em certa proteína e que incorpora o aminoácido mais conservado (frequente) em cada posição para gerar o domínio de FN3 de ocorrência não natural. Por exemplo, um domínio de FN3 de ocorrência não natural é projetado com base em uma sequência consensual dos 15 domínios de FN3 de tenascina C de ser humano, ou com base em uma sequência consensual dos 15 domínios de FN3 de fibronectina de ser humano. Esses domínios de FN3 de ocorrência não natural retêm a topologia típica dos domínios de FN3, e podem exibir propriedades aprimoradas, como estabilidade aprimorada quando comparada aos domínios de FN3 de tipo selvagem. Domínios de FN3 de ocorrência não natural exemplificadores são os domínios Tencon e Fibcon mostrados nas SEQ ID NOs: 16 e 58, respectivamente, e descritos na publicação de patente US n° 2010/0216708 e publicação de patente US n° 2010/0255056.Tabela 1

[0030] Resíduos de aminoácidos definindo cada laço e cada beta- filamento são mostrados para arcabouço de FN3 Tencon27 (SEQ ID NO: 27) na Tabela 2. As posições de cada laço beta-filamento E em 3° domínio de FN3 de tenascina C (TN3) (SEQ ID NO: 3) e Fibcon (SEQ ID NO: 58) são idênticas àquelas de Tencon27. Resíduos de beta- filamento podem ser identificados com o uso de métodos bem conhecidos, por exemplo, por análise de estruturas tridimensionais geradas por difração de raios X, ressonância magnética nuclear, ou modelagem molecular. Quando modelos não estão disponíveis, a análise de alinhamentos de sequência com outras moléculas de FN3 conhecidas pode ser usada para prever os limites de regiões de filamento e laço. Finalmente, algoritmos de computador podem ser usados para prever a presença de beta filamentos de sequências primárias de proteína.Tabela 2

Superfícies alternativas em domínios de FN3

[0031] Os laços de topo (BC, DE e FG) e de fundo (AB, CD e EF), por exemplo, as superfícies de ligação relatadas nos domínios de FN3, são separados pelos beta-filamentos que formam o centro da estrutura de FN3 (Figuras 1, 2A). As superfícies alternativas que residem nos dois "lados" dos domínios de FN3 que têm diferentes formatos do que as superfícies formadas por laços apenas podem ser visualizadas ao girar o domínio de estrutura de FN3 em 90 graus (Figuras 2B, 2C). Uma superfície levemente côncava é formada em um lado do domínio de FN3 por dois beta-filamentos antiparalelos, os beta-filamentos C e F, e os laços CD e FG, e é denominada no presente documento a superfície C- CD-F-FG. Uma superfície alternativa também é formada no lado oposto da superfície C-CD-F-FG pelos beta-filamentos A, B e E e os laços AB e BC, denominada no presente documento superfície A-AB-B-BC-E.

[0032] As superfícies alternativas nos domínios de FN3 são codificadas por trechos não contíguos de aminoácidos em cada domínio de FN3. Por exemplo, a superfície C-CD-F-FG de Tencon27 é formada pelos resíduos de aminoácidos 29-43 e 65-81 da SEQ ID NO: 27, e a superfície A-AB-B-BC-E de Tencon27 é formada pelos resíduos de aminoácidos 1-28 e 55-59 da SEQ ID NO: 27, conforme mostrado na Tabela 2.

Arcabouços de proteína com base em superfícies alternativas de seleção aleatória

[0033] Uma modalidade da invenção é um arcabouço de proteína isolado que compreende um domínio de FN3 que compreende uma superfície alternativa, em que a superfície alternativa tem pelo menos uma substituição de aminoácido em cada beta-filamento e cada laço formando a superfície alternativa quando comparada a um domínio de FN3 de referência.

[0034] Em uma outra modalidade, o arcabouço de proteína da invenção especificamente liga a uma molécula-alvo não especificamente ligada pelo domínio de FN3 de referência.

[0035] Em uma outra modalidade, o domínio de FN3 de referência compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.

[0036] Em uma outra modalidade, o arcabouço de proteína da invenção compreende uma superfície alternativa de C-CD-F-FG formada por um beta-filamento C, um laço CD, um beta-filamento F e um laço FG.

[0037] Em outra modalidade, o beta-filamento C, o laço CD, o beta- filamento F, ou o laço FG formando a superfície alternativa de C-CD-F- FG compreendem certas sequências de aminoácidos, conforme mostrado nas Tabelas 4 e 5 e nas SEQ ID NOs: 45 a 48.

[0038] Em outra modalidade, o beta-filamento C compreende uma sequência de aminoácidos DSFLIQYQE (SEQ ID NO: 33) que tem substituições em 1, 2, 3 ou 4 resíduos, o beta-filamento F compreende uma sequência de aminoácidos TEYTVSIYGV (SEQ ID NO: 39) que tem substituições em 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos, o beta-filamento C e o laço CD compreende uma sequência de aminoácidos DSFLIQYQESEKVGE (SEQ ID NO: 42) que tem substituições em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos, ou o beta-filamento F e o laço FG compreende uma sequência de aminoácidos TEYTVSIYGVKGGHRSN (SEQ ID NO: 43) que tem substituições em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 resíduos.

[0039] Em outra modalidade, o beta-filamento C e o beta-filamento F compreendem uma sequência de aminoácidos pelo menos 67% idêntica à SEQ ID NO:33 e pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO:39, respectivamente, o beta-filamento C e o laço CD compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 53% idêntica à SEQ ID NO: 42, ou o beta-filamento F e o laço FG compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 65% idêntica à SEQ ID NO: 43.

[0040] Em outra modalidade, o arcabouço de proteína da invenção compreende um domínio de FN3 que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 28.

[0041] Em outra modalidade, o arcabouço de proteína da invenção compreende um módulo de fibronectina de domínio de tipo III (FN3) que compreende:

[0042] um beta-filamento A, um laço AB, um beta-filamento B, um laço BC, um beta-filamento D, um laço DE, um beta-filamento E, um laço EF e um beta-filamento G tendo sequências de aminoácidos idênticas à SEQ ID NO: 27 nos resíduos 1-12, 13-16, 17-21, 22-28, 44-50, 51-54, 55-59, 60-64, e 82-89, respectivamente;

[0043] um beta-filamento C e um laço CD tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 53% idêntica à SEQ ID NO: 42; e

[0044] um beta-filamento F e um laço FG tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 65% idêntica à SEQ ID NO: 43, tendo opcionalmente pelo menos uma substituição nas posições de aminoácido que correspondem aos resíduos de aminoácidos 11, 14, 17, 37, 46, 73, ou 86 da SEQ ID NO: 27, em que o arcabouço de proteína especificamente liga a uma molécula-alvo não especificamente ligada por um domínio de FN3 de referência.

[0045] Em outra modalidade, o arcabouço de proteína da invenção compreende um domínio de FN3 que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica às sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID NO: 27.

[0046] Em outra modalidade, o arcabouço de proteína da invenção compreende uma superfície alternativa A-AB-B-BC-E formada por um beta-filamento A, um laço AB, um beta-filamento B, um laço BC e um beta-filamento E.

[0047] Em outra modalidade, o beta-filamento A, o laço AB, o beta- filamento B e o laço BC formando a superfície alternativa A-AB-B-BC-E compreendem certas sequências de aminoácidos, conforme mostrado nas Tabelas 4 e 5 e nas SEQ ID NOs: 49 e 50.

[0048] Em outra modalidade, o beta-filamento A, o laço AB, o beta- filamento B e o laço BC compreendem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 59% idêntica à SEQ ID NO:44, e o beta-filamento E compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica à SEQ ID NO: 37.

[0049] Em outra modalidade, o arcabouço de proteína da invenção compreende um domínio de FN3 que compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 61.

[0050] Em outra modalidade, um arcabouço de proteína isolado da invenção compreende um domínio de FN3 que compreende:

[0051] um beta-filamento C, um laço CD, um beta-filamento D, um laço DE, um laço EF, um beta-filamento F, um laço FG e um beta- filamento G tendo sequências de aminoácidos idênticas à SEQ ID NO: 27 nos resíduos 29-37, 38-43, 44-50, 51-54, 60-64, 65-74, 75-81 e 8289, respectivamente;

[0052] um beta-filamento A, um laço AB, uma beta-filamento B e um laço BC tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 59% idêntica à SEQ ID NO: 44; e

[0053] um beta-filamento E que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica à SEQ ID NO: 37, que tem opcionalmente pelo menos uma substituição nas posições de aminoácido que correspondem aos resíduos de aminoácidos 11, 14, 17, 37, 46, 73 ou 86 da SEQ ID NO: 27, em que o arcabouço de proteína especificamente liga a uma molécula-alvo não especificamente ligada por um domínio de FN3 de referência.

[0054] Os domínios de FN3 que ligam especificamente a uma molécula-alvo podem ser gerados selecionando-se aleatoriamente um subconjunto do resíduos que formam a superfície alternativa. Por exemplo, pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez resíduos podem ser selecionados aleatoriamente em cada beta- filamento e cada laço contribuindo para a superfície alternativa. Resíduos adicionais podem ser selecionados aleatoriamente para aumentar a diversidade da biblioteca. Por exemplo, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% dos resíduos em cada beta-filamento e cada laço formando a superfície alternativa pode ser selecionado aleatoriamente. Alternativamente, domínios de FN3 que ligam especificamente a uma molécula-alvo podem ser gerados selecionando-se aleatoriamente um subconjunto dos resíduos nos beta- filamentos contribuindo para a superfície alternativa, sem selecionar aleatoriamente qualquer um dos laços. Por exemplo, pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez resíduos em cada filamento contribuindo para a superfície alternativa podem ser selecionados aleatoriamente. A diversidade de biblioteca pode ser aumentada selecionando-se aleatoriamente resíduos adicionais que residem nos beta-filamentos. Por exemplo, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% dos resíduos em cada beta- filamento formando a superfície alternativa pode ser selecionado aleatoriamente.

[0055] Beta-filamentos têm uma estrutura de repetição com a cadeia lateral de um ou outro resíduo exposto à superfície da proteína. As cadeias laterais expostas à superfície são determinadas por exame de estruturas tridimensionais ou por comparação à sequências de domínios de FN3 com estrutura conhecida por alinhamento de múltiplas sequências. Todos ou um subconjunto de resíduos expostos à superfície nos beta-filamentos contribuindo para a superfície alternativa podem ser escolhidos para serem selecionados aleatoriamente. Por exemplo, a superfície alternativa C-CD-F-FG de Tencon27 (SEQ ID NO: 27) tem quatro resíduos expostos à superfície no beta-filamento C (S30, L32, Q34 e Q36) e cinco resíduos expostos à superfície no beta- filamento F (E66, T68, S70, Y72 e V74), com numeração de resíduo com base na SEQ ID NO: 27. Um ou mais desses resíduos pode ser selecionado aleatoriamente para gerar uma biblioteca. Resíduos na junção da superfície alternativa, como S30, E66 e V74, podem ou podem não ser selecionados aleatoriamente. A seleção aleatória dos resíduos sepultados dos beta-filamentos pode resultar na desestabilização do arcabouço devido à perda de contatos hidrofóbicos no núcleo da estrutura. Os resíduos sepultados podem ser selecionados aleatoriamente de modo que apenas um subconjunto de aminoácidos seja usado, por exemplo, apenas aminoácidos hidrofóbicos.

[0056] Um subconjunto ou todos os resíduos nas regiões de laço contribuindo para a superfície alternativa podem ser selecionados aleatoriamente. Por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 posições podem ser substituídas nos laços CD e/ou FG contribuindo para a superfície alternativa. Resíduos de glicina nos laços, como G42, G76 e/ou G77 em Tencon27, podem fornecer flexibilidade e podem ou não ser selecionados aleatoriamente. Resíduos nos limites de beta- filamento/laço, como E43 em Tencon27, podem ou não ser selecionados aleatoriamente. Os resíduos adicionais nas regiões de beta-filamento ou laço podem estar incluídos ou excluídos da seleção aleatória. Por exemplo, resíduos que parecem ser necessários para estabilização identificada com base em, por exemplo, análise de estruturas cristalinas dos domínios de FN3, podem ou não ser selecionados aleatoriamente. Por exemplo, S80 em Tencon27 faz contato com o núcleo de domínio de FN3 para potencialmente estabilizar o laço FG, e K75 se volta parcialmente para longe da superfície alternativa. Dessa forma, ambos esses resíduos podem ser excluídos de modelo de biblioteca inicial. Em uma biblioteca de domínio de FN3 exemplificadora que tem superfície C-CD-F-FG selecionada aleatoriamente, os resíduos que podem ser selecionados aleatoriamente incluem os resíduos nas posições 30, 32, 34, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 ou 81 da SEQ ID NO: 27. Em uma biblioteca de domínio de FN3 exemplificadora que tem superfície A-AB-B-BC-E selecionada aleatoriamente, resíduos que podem ser selecionados aleatoriamente incluem resíduos na posições 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 55 e 57.

[0057] A diversidade em laços contribuindo a superfícies alternativas pode ser alcançada por inserção e/ou deleções de resíduos em laços. Por exemplo, os laços FG e/ou CD podem ser estendidos em 1 a 22 aminoácidos, ou diminuídos por 1 a 3 aminoácidos. O laço FG em Tencon27 tem 7 aminoácidos de comprimento, enquanto que o laço correspondente em cadeias pesadas de anticorpo fica na faixa de 4 a 28 resíduos. Para fornecer diversidade máxima, os laços contribuindo para superfícies alternativas, por exemplo, o laço FG, podem ser diversificados em sequência, assim como em comprimento para corresponder ao comprimento de anticorpo CDR3 na faixa de 4 a 28 resíduos.

[0058] Os domínios de FN3 resultantes que ligam especificamente a uma molécula-alvo podem ser adicionalmente modificados nos resíduos que residem fora de ou dentro da superfície alternativa com o propósito de, por exemplo, aprimorar estabilidade, reduzir imunogeneicidade, acentuar a afinidade de ligação, taxa para associação, taxa para dissociação, meia vida, solubilidade ou quaisquer outras características adequadas. Em um modo para alcançar esse objetivo, as proteínas de arcabouço podem ser opcionalmente preparadas por um processo de análise das sequências parentais e vários produtos manipulados conceituais com o uso modelos tridimensionais das sequências parentais e manipuladas. Os modelos tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares para os versados na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveis estruturas conformacionais tridimensionais de sequências candidatas selecionadas, e podem medir a possível imunogenicidade (por exemplo, o programa Immunofilter da Xencor, Inc., de Monrovia, CA, EUA). A inspeção dessas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de candidato, por exemplo, resíduos que influenciam a estabilidade da proteína em arcabouço ou a capacidade da proteína em arcabouço de candidato de ligar sua molécula-alvo. Desse modo, resíduos podem ser selecionados e combinados desde as sequências parental e de referência de modo que as características desejadas, como estabilidade de arcabouço aprimorada, sejam alcançadas. Alternativa ou adicionalmente aos procedimentos acima, outros métodos adequados de engenharia podem ser usados conforme conhecido na técnica.

[0059] Propriedades físicas desejadas de domínios de FN3 da invenção incluem alta estabilidade térmica e reversibilidade de dobramento e desdobramento térmico. Vários métodos foram aplicados para aumentar a estabilidade térmica aparente de proteínas e enzimas, incluindo modelo racional com base em comparação a sequências termoestáveis altamente similares, modelo de pontes de dissulfeto estabilizantes, mutações para aumentar a propensão da alfa-hélice, manipulação de pontes salinas, alteração da carga superficial da proteína, evolução dirigida e composição de sequências consenso (Lehmann e Wyss, Curr Opin Biotechnol, 12, 371 a 375, 2001). A alta estabilidade térmica pode aumentar o rendimento da proteína expressa, aperfeiçoar a solubilidade ou atividade, diminuir a imunogeneicidade e minimizar a necessidade por uma cadeia fria na fabricação.

[0060] Os resíduos que podem ser substituídos para aprimorar quaisquer características dos domínios de FN3 da invenção podem ser determinados realizando-se a substituição e testando para as características desejadas do arcabouço. Arcabouço com base em domínio de FN3 exemplificador com características aprimoradas são o arcabouço Tencon (SEQ ID NO: 16) ou o arcabouço Tencon27 (SEQ ID NO: 27), que é modificado em uma ou mais posições de resíduos de aminoácidos 11, 14, 17, 37, 46, 73 ou 86.

[0061] Em termos de perda de estabilidade, isto é, "desnaturar" ou "desnaturação" de uma proteína, significa-se o processo em que alguma ou toda a conformação tridimensional que confere as propriedades funcionais da proteína foi perdida com uma consequente perda de atividade e/ou solubilidade. As forças perturbadoras durante a desnaturação incluem ligações intramolecular, por exemplo, forças eletrostáticas, hidrofóbicas, de Van der Waals, ligações de hidrogênio e dissulfetos. A desnaturação de proteína pode ser causada por forças aplicadas à proteína ou uma solução que compreende a proteína, como uma força mecânica (por exemplo, compressiva ou força de cisalhamento), térmica, estresse osmótico, mudança no pH, campos elétricos ou magnéticos, radiação ionizante, radiação ultravioleta e desidratação, e por desnaturantes químicos.

[0062] A medição da estabilidade da proteína e suscetibilidade de proteína pode ser vista como aspectos iguais ou diferentes da integridade da proteína. As proteínas são sensíveis ou "instáveis" à desnaturação causada pelo calor, por radiação ultravioleta ou ionizante, alterações da osmolaridade ambiente e pH em solução líquida, força de cisalhamento mecânico imposta por filtração por poros pequenos, radiação ultravioleta, radiação ionizante, como irradiação gama, desidratação química ou por calor, ou qualquer outra ação ou força que possa causar a perturbação da estrutura proteica. A estabilidade da molécula pode ser determinada com o uso de métodos padrão. Por exemplo, a estabilidade de uma molécula pode ser determinada mediante a medição da temperatura de fusão térmica ("TM"), a temperatura em ° Celsius (°C) na qual % das moléculas se tornam desdobradas, com o uso de métodos padrão. Tipicamente, quanto mais alta a TM, mais estável é a molécula. Em adição ao calor, o ambiente químico também altera a capacidade da proteína de manter uma estrutura tridimensional particular.

[0063] Em uma modalidade, os domínios de FN3 da invenção exibem maior estabilidade por pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais, em comparação com o mesmo domínio antes da manipulação medida pelo aumentar na TM.

[0064] A desnaturação química pode, de modo semelhante, ser medida por uma variedade de métodos. Desnaturantes químicos incluem o cloridrato de guanidínio, tiocianeto de guanidínio, ureia, acetona, solventes orgânicos (DMF, benzeno, acetonitrilo), sais (brometo de lítio sulfato de amônio, cloreto de lítio, brometo de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de sódio); agentes de redução (por exemplo, ditiotreitol, beta-mercaptoetanol, dinitrotiobenzeno e hidretos, como boroidreto de sódio), detergentes não iônicos e iônicos, ácidos (por exemplo, ácido clorídrico (HCl), ácido acético (CH3COOH), ácidos acéticos halogenados), moléculas hidrofóbicas (por exemplo, fosofolipídeos), e desnaturantes alvejados. A quantificação da extensão da desnaturação pode depender da perda de uma propriedade funcional, como a capacidade de se ligar a uma molécula-alvo, ou por propriedades fisioquímicas, como a tendência a agregação, exposição de resíduos de solventes anteriormente inacessíveis, ou perturbação ou formação de ligações dissulfeto.

[0065] Em uma modalidade, os arcabouços da invenção exibem maior estabilidade por pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais, em comparação com o mesmo arcabouço antes da manipulação medida com o uso de cloridrato de guanidínio como um desnaturante químico. A maior estabilidade pode ser medida como uma função de menor fluorescência de triptofano mediante tratamento em função de concentrações crescentes de cloridrato de guanidina com o uso de métodos bem conhecidos.

[0066] Os domínios de FN3 que ligam especificamente a uma molécula-alvo da invenção podem ser gerados com o uso de qualquer domínio de FN3 como um gabarito para substituições, de acordo com métodos fornecidos aqui. Domínios de FN3 exemplificadores que têm superfícies alternativas selecionadas aleatoriamente são o 3° domínio de FN3 de tenascina C (TN3) (SEQ ID NO: 3), Tencon (SEQ ID NO: 16), Tencon27 (SEQ ID NO: 27), Fibcon (SEQ ID NO: 58), e o 10° domínio de FN3 de fibronectina (FN10) (SEQ ID NO: 97). As posições de aminoácido que delineiam as superfícies alternativas em Tencon27 são mostradas na Tabela 2 e Figura 8, e são idênticas na sequência linear Tencon, TN3 e Fibcon. As posições de aminoácido que delineiam a superfície alternativa em FN10 é mostrado na Figura 8. Os resíduos formando as superfícies alternativas em outros domínios de FN3 podem ser identificados por exame de estruturas tridimensionais onde estiverem disponíveis ou por análise de alinhamentos de sequência de domínios de FN3 por métodos bem conhecidos.

[0067] Os domínios de FN3 da invenção podem ser gerados como monômeros, dímeros ou multímeros, por exemplo, como um meio para aumentar a valência e, assim, a avidez de ligação de molécula-alvo, ou para gerar arcabouços bi ou multiespecíficos simultaneamente, ligando duas ou mais moléculas-alvo diferentes. Os dímeros e multímeros podem ser gerados por ligação de arcabouços de proteína monoespecíficos, bi- ou multiespecíficos, por exemplo, pela inclusão de um conector de aminoácido, por exemplo, um conector contendo poliglicina, glicina e serina, ou alanina e prolina. O uso de conectores de peptídeo de ocorrência natural, assim como artificial, para conectar polipeptídeos em polipeptídeos de fusão ligados inovadores é bem conhecido na literatura (Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260 a 5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725 a 731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109 a 116, 1996; patente US n° 5.856.456).

[0068] Os domínios de FN3 da presente invenção podem ser usados como moléculas biespecíficas em que a primeira superfície alternativa em um domínio tem especificidade para uma primeira molécula-alvo e a segunda superfície alternativa no mesmo domínio tem especificidade para uma segunda molécula-alvo. Um domínio de proteína biespecífico exemplificador é um variante de Tencon27 que liga uma primeira molécula-alvo na superfície C-CD-F-FG, e uma segunda molécula-alvo na superfície A-AB-B-BC-E.

[0069] Os domínios de FN3 da presente invenção podem incorporar outras subunidades, por exemplo, por meio de interação covalente. O todo ou uma porção de uma região constante de anticorpo pode ser fixada ao domínio de FN3 para conferir propriedades similares a anticorpo, especificamente aquelas propriedades associadas à região Fc, por exemplo, atividade complementar, meia vida, etc. Por exemplo, funções efetoras de Fc, como ligação de C1q, citotoxicidade dependente complementar (CDC), ligação de receptor Fc, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc. podem ser fornecidas e/ou controladas modificando-se resíduos no Fc responsável por essas atividades (para análise; consulte Strohl, Curr Opin Biotechnol. 20, 685 a 691, 2009).

[0070] Porções químicas adicionais podem ser incorporadas nos domínios de FN3 da invenção, como conjugados de toxina, albumina ou aglutinantes de albumina, moléculas de polietilenoglicol (PEG), como PEG5000 ou PEG20,000, ácidos graxos e ésteres de ácido graxo de diferentes comprimentos de cadeia, por exemplo, laurato, miristato, estearato, araquidato, beenato, oleato, araquidonato, ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octanodecanodioico, ácido docossanodioico e similares, polilisina, octano, carboidratos (dextrano, celulose, oligo- ou polissacarídeos) para propriedades desejadas. Essas porções químicas podem ser fusões diretas com as sequências de codificação de arcabouço de proteína e podem ser geradas por clonagem padrão e técnicas de expressão. Alternativamente, métodos de acoplamento químico bem conhecidos podem ser usados para fixar as porções químicas a domínios de FN3 produzidos de modo recombinante da invenção.

[0071] Os domínios de FN3 que incorporam porções químicas adicionais podem ser comparados para funcionalidade por vários ensaios bem conhecidos. Por exemplo, propriedades de domínio de FN3 alteradas devido à incorporação de domínios de Fc e/ou variantes de domínio de Fc podem ser ensaiadas em ensaios de ligação de receptor de Fc com o uso de formas solúveis dos receptores, como os receptores FCYRI, FCYRII, FCYRIII ou FcRn, ou com o uso de ensaios com base celular bem conhecidos que medem, por exemplo, ADCC ou CDC, ou que avaliam propriedades farmacocinéticas de arcabouço de proteína em modelos in vivo.

Geração e produção de proteínas de domínio de FN3

[0072] Uma modalidade da invenção é um método para fabricação de uma biblioteca de domínios de FN3 compreendendo uma superfície alternativa, em que a superfície alternativa tem pelo menos uma substituição de aminoácido quando comparada a um domínio de FN3 de referência, que compreende: fornecer um polinucleotídeo que codifica um domínio de FN3 de referência; gerar uma biblioteca de sequências de polinucleotídeo do domínio de FN3 de referência selecionando-se aleatoriamente a superfície alternativa; transladar a biblioteca in vitro ou expressar a biblioteca em um hospedeiro.

[0073] Outra modalidade da invenção é um método para fabricação de uma biblioteca de domínios de FN3 que têm uma superfície alternativa de C-CD-F-FG diversificada formada por um beta-filamento C, um laço CD, um beta-filamento F e um laço FG, que compreende fornecer um polipeptídeo de domínio de FN3 de referência que tem a sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica àquela da SEQ ID NO: 27; introduzir diversidade no polipeptídeo de domínio de FN3 de referência ao realizar a mutação de pelo menos um resíduo de beta- filamento C e pelo menos um resíduo de beta-filamento F para formar a biblioteca de domínio de FN3 que tem a superfície alternativa C-CD-F- FG diversificada.

[0074] Nos métodos de preparo da biblioteca da invenção, 1, 2, 3 ou 4 resíduos no beta-filamento C podem sofrer mutação com a condição de que S30 não sofra mutação (numeração de resíduo de acordo com a SEQ ID NO: 27).

[0075] Nos métodos de preparo da biblioteca da invenção, os resíduos de beta-filamento C L32, Q34 e Q36 podem sofrer mutação (numeração de resíduo de acordo com a SEQ ID NO: 27).

[0076] Nos métodos de preparo da biblioteca da invenção, 1, 2, 3 ou 4 resíduos no beta-filamento F podem sofrer mutação com a condição de que E66 não sofra mutação (numeração de resíduo de acordo com a SEQ ID NO: 27).

[0077] Nos métodos de preparo da biblioteca da invenção, os resíduos de F-beta filamento T68, S70 e Y72 podem sofrer mutação (numeração de resíduo de acordo com a SEQ ID NO: 27).

[0078] Nos métodos de preparo da biblioteca da invenção, 1, 2, 3 ou 4 resíduos nos resíduos de laço CD podem sofrer mutação com a condição de que G42 e E43 não sofram mutação (numeração de resíduos de acordo com a SEQ ID NO: 27).

[0079] Nos métodos de preparo da biblioteca da invenção, os resíduos S38, E39, K40 e V41 no laço CD podem sofrer mutação.

[0080] Nos métodos de preparo da biblioteca da invenção, 1, 2, 3 ou 4 resíduos no laço FG podem sofrer mutação com a condição de que os resíduos K75, G76, G77 e S80 não sofram mutação (numeração de resíduo de acordo com a SEQ ID NO: 27).

[0081] Nos métodos de preparo da biblioteca da invenção, os resíduos H78, R79 e N81 no laço FG podem sofrer mutação (numeração de resíduo de acordo com a SEQ ID NO: 27).

[0082] Nos métodos de preparo da biblioteca da invenção, o domínio de FN3 de referência compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, que compreende opcionalmente pelo menos uma substituição nas posições de aminoácido 11, 14, 17, 37, 46, 73 ou 86.

[0083] Outros domínios de FN3 de referência podem ser usados nos métodos da invenção, como Tencon (SEQ ID NO: 16) ou variantes do mesmo, conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 17 a 26 e na Tabela 3.

[0084] Outra modalidade da invenção é uma biblioteca produzida pelos métodos da invenção.

[0085] A geração das proteínas em arcabouço, domínios (ou módulos) de FN3 da invenção, é tipicamente alcançada no nível de ácido nucleico. As bibliotecas dos domínios de FN3 da invenção que têm códons substituídos em um ou mais resíduos específicos podem ser sintetizadas, por exemplo, com o uso de métodos de clonagem por PCR padrão, ou síntese de gene química de acordo com métodos descritos na patente US n° 6.521.427 e patente US n° 6.670.127. Os códons podem ser selecionados aleatoriamente com o uso de métodos bem conhecidos, por exemplo, degenerar oligonucleotídeos que correspondem à diversidade projetada, ou usar mutagênese Kunkel de Kunkel et al., Methods Enzymol. 154, 367 a 382, 1987).

[0086] As bibliotecas podem ser selecionadas aleatoriamente nos códons escolhidos com o uso de um conjunto aleatório ou definido de aminoácidos. Por exemplo, variantes na biblioteca que têm substituições aleatórias podem ser gerados com o uso de códons NNK, que codificam todos os 20 aminoácidos de ocorrência natural. Em outros esquemas de diversificação, códons DVK podem ser usados para codificar aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, e Cys. Alternativamente, códons NNS podem ser usados para dar origem a todos os 20 resíduos de aminoácidos e simultaneamente reduzir a frequência de códons de parada. As designações de códon são de acordo com a bem conhecida codificação IUB (International Union of Biochemistry).

[0087] Os domínios de FN3 da invenção, assim como quaisquer outras proteínas, são propensos a uma variedade de instabilidades físicas e/ou químicas, resultando em efeitos colaterais no processamento a jusante. Por exemplo, a instabilidade física e química pode levar a agregação, degradação, rendimento do produto reduzido, perda de potência, maior potencial para imunogeneicidade, heterogeneidade molecular, e perda de atividade. Dessa forma, a presença de possíveis resíduos de indução de instabilidade e sequências de reconhecimento pode ser minimizada durante a modelagem das bibliotecas. Por exemplo, triptofano e metionina expostos à superfície podem ser oxidados em condições de armazenamento, possivelmente levando a perda na potência de arcabouço de proteína. A presença de asparagina, além de contribuir para sítios de reconhecimento de N-glicosilação (NXS/T) bem conhecidos, pode ser desaminada quando seguida de glicina, possivelmente gerando heterogeneicidade (Robinson, Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 5283 a 5288, 2002). Alguns ou todos esses aminoácidos, então, podem ou não ser omitidos da mistura usada para selecionar aleatoriamente a posição selecionada. Adicionalmente, cisteína e prolina podem ser omitidos para minimizar a formação de ponte de dissulfeto e ruptura de lâminas beta.

[0088] Bibliotecas de domínios de FN3 com distribuição polarizada de aminoácido em posições a serem diversificadas podem ser sintetizadas, por exemplo, com o uso de tecnologia Slonomics® (http:_//www_sloning_com). Essa tecnologia usa uma biblioteca de tripletos de filamento duplo pré-produzidos que agem como blocos de construção universais suficientes para milhares de processos de síntese de gene. A biblioteca de tripleto representa todas as combinações de sequência possíveis necessárias para construir qualquer molécula de DNA desejada.

[0089] A síntese de oligonucleotídeos com "degenerescência" de nucleotídeo selecionada em certas posições é bem conhecida naquela técnica, por exemplo, a abordagem TRIM (Knappek et al., J Mol Biol 296, 57 a 86, 1999; Garrard & Henner, Gene 128,103 a 109, 1993). Esses conjuntos de nucleotídeos que têm certos conjuntos de códons podem ser sintetizados com o uso de reagentes de nucleotídeo e nucleosídeo e aparelhos comercialmente disponíveis.

[0090] Em um esquema de diversificação exemplificador, resíduos de domínio de FN3 Tencon27 (SEQ ID NO: 27) L32, Q34 e Q36 no beta- filamento C, S38, E39, K40 e V41 no laço CD, T68, S70 e Y72 no beta- filamento F, e H78, R79, e N81 no laço FG são selecionados aleatoriamente com códons NNS.

[0091] As técnicas de clonagem e expressão padrão são usadas para clonar as bibliotecas em um vetor ou sintetizar cassetes de cDNA de filamento duplo da biblioteca, para expressar, ou até traduzir as bibliotecas in vitro. Por exemplo, a exibição de cis pode ser usadas para ligar fragmentos de DNA que codificam as proteínas em arcabouço a um fragmento de DNA que codifica RepA para gerar um agrupamento de complexos de proteína-DNA formados após a tradução in vitro, em que cada proteína é associada de maneira estável ao DNA que codifica a mesma (patente US n° 7.842.476; Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101, 2806 a 2810, 2004). Outros métodos podem ser usados, por exemplo, exibição de ribossoma (Hanes e Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 4937 a 4942, 1997), exibição de mRNA (Roberts e Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297 a 12302, 1997), ou outros sistemas livres de célula (patente US n° 5.643.768). As bibliotecas de arcabouços de proteína podem ser expressas como proteínas de fusão exibidas sobre a superfície, por exemplo, de qualquer bacteriófago adequado. Os métodos para exibir polipeptídeos de fusão sobre a superfície de um bacteriófago são bem conhecidos (publicação de patente US n° 2011/0118144; publicação de patente internacional n° WO2009/085462; patente US n° 6.969.108; patente US n° 6.172.197; patente US n° 5.223.409; patente US n° 6.582.915; patente US n° 6.472.147).

Triagem

[0092] A triagem de domínios de FN3 de proteína manipulada ou bibliotecas de variantes de domínio de FN3 para ligação específica a moléculas-alvo pode ser alcançada, por exemplo, produzindo-se a biblioteca com o uso de exibição de cis conforme descrito nos Exemplos e em Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101, 2.806 a 2.810, 2004 e avaliando-se a biblioteca para ligação específica a uma molécula-alvo por meio de qualquer método conhecido na técnica. Os métodos bem conhecidos exemplificadores que podem ser usados são ELISA, imunoensaios em sanduíche e ensaios competitivos e não competitivos (consulte, por exemplo, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, EUA).

[0093] Os domínios de FN3 da invenção podem ligar proteínas de seres humanos ou de outros mamíferos com uma ampla gama de afinidades (KD). Tipicamente, um domínio de FN3 da presente invenção pode ligar-se a uma proteína-alvo com uma KD igual a ou menor que cerca de 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M, 10-14 M ou 10-15 M conforme determinado por meio de ressonância de plasma de superfície ou o método de Kinexa, conforme praticado pelo versado na técnica. A afinidade de um domínio de FN3 para um antígeno pode ser determinada experimentalmente com o uso de qualquer método adequado. (Consulte, por exemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, EUA (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, EUA (1992); e métodos aqui descritos). A afinidade medida de uma interação entre domínio de FN3 e antígeno particular pode variar se for medida sob diferentes condições (por exemplo, osmolaridade, pH). Portanto, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação a antígeno (por exemplo, KD, Kon, Koff) são, de preferência, feitas com soluções padronizadas de arcabouço de proteína e antígeno, e com um tampão padronizado, como o tampão aqui descrito.

Vetores e moléculas de ácido nucleico

[0094] A invenção fornece ácidos nucleicos que codificam os domínios de FN3 da invenção como polinucleotídeos isolados ou como porções de vetores de expressão ou como porções de sequências de DNA linear, incluindo sequências de DNA linear usadas para transcrição/tradução in vitro, vetores compatíveis com expressão de fago procariótico, eucariótico ou filamentoso, secreção e/ou exibição das composições ou mutagênicos direcionados disso. Certos polinucleotídeos exemplificadores são apresentados no presente documento, entretanto, outros polinucleotídeos que, dada a degenerescência do código genético ou preferências de códon em um dado sistema de expressão, codificam os arcabouços de proteína e bibliotecas dos arcabouços de proteína da invenção também estão no escopo da invenção.

[0095] Os polinucleotídeos da invenção podem ser produzidos por síntese química como síntese de polinucleotídeo de fase sólida em um sintetizador de polinucleotídeo automatizado e montados em moléculas ramificadas de ramificação simples ou dupla completas. Alternativamente, os polinucleotídeos da invenção podem ser produzidos por meio de outras técnicas como PCR seguido de clonagem de rotina. As técnicas para produção ou obtenção de polinucleotídeos de uma dada sequência são bem conhecidos na técnica.

[0096] Os polinucleotídeos da invenção podem compreender pelo menos uma sequência não codificadora, como uma sequência promotora ou intensificadora, íntron, sinal de poliadenilação, uma sequência de cis que facilita ligação de RepA e similares. As sequências de polinucleotídeo também podem compreender sequências adicionais que codificam aminoácidos adicionais que codificam, por exemplo, um marcador ou uma sequência de etiqueta como uma etiqueta de histidina ou uma etiqueta de HA para facilitar a purificação ou a detecção da proteína, uma sequência de sinais, um parceiro de proteína de fusão como RepA, Fc ou proteína capsidial de bacteriófago como pIX ou pIII.

[0097] Um polinucleotídeo exemplificador compreende sequências para um promotor Tac, sequências que codificam a biblioteca de domínio de FN3 e repA, elemento cis e uma origem de replicação bacteriana (ori). Outro polinucleotídeo exemplificador compreende uma sequência de sinais pelB ou ompA, proteína capsidial de bacteriófago pIII ou pIX, domínio de FN3 e um sítio de polyA. Polinucleotídeos exemplificadores que codificam a biblioteca de TCL14 e Tencon27 são mostrados nas SEQ ID NOs: 100 e 101, respectivamente.

[0098] Outra modalidade da invenção é um vetor que compreende pelo menos um polinucleotídeo da invenção. Tais vetores podem ser vetores de plasmídeo, vetores virais, vetores para expressão de baculovirus, vetores à base de transpóson ou quaisquer outros vetores adequados para a introdução dos polinucleotídeos da invenção em um dado organismo ou antecedente genético por quaisquer meios. Tais vetores podem ser vetores de expressão que compreendem elementos de sequência de ácidos nucleicos que podem controlar, regular, ocasionar ou permitir a expressão de um polipeptídeo codificado por tal vetor. Esses elementos podem compreender sítios de ligação de intensificadores transcricionais, sítios de iniciação de RNA polimerase, sítios de ligação de ribossomas, e outros sítios que facilitam a expressão de polipeptídeos codificados em um dado sistema de expressão. Tais sistemas de expressão podem ser à base de célula, ou sistemas isentos de célula bem conhecidos na técnica.

Seleção de células hospedeiras ou engenharia de células hospedeiras

[0099] Um domínio de FN3 da presente invenção pode ser opcionalmente produzido por meio de uma linhagem de células, uma linhagem de células misturadas, uma célula imortalizada ou população clonal de células imortalizadas, como é conhecido na técnica. Consulte, por exemplo, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, EUA (1987 a 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor, NY, EUA (1989); Harlow e Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, EUA (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY, EUA (1994 a 2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, EUA, (1997 a 2001).

[00100] A célula hospedeira escolhida para a expressão pode ser de origem de mamífero ou pode ser selecionada dentre COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, mieloma, linfoma, levedura, células de inseto ou vegetais, ou qualquer célula derivada, imortalizada ou transformada disso. Alternativamente, a célula hospedeira pode ser selecionada dentre uma espécie ou organismo que não tem a capacidade de glicolisar polipeptídeos, por exemplo, uma célula ou organismo procariótico, como BL21, BL21(DE3), BL21-GOLD(DE3), XL1-Blue, JM109, HMS174,HMS174(DE3), e qualquer uma das cepas de E. coli spp, Klebsiella spp., ou Pseudomonas spp naturais ou manipuladas.

Usos de domínios de FN3 da invenção

[00101] As composições das moléculas à base de domínio de FN3 (módulo) descritas no presente documento e geradas por meio dos métodos descritos acima podem ser usadas para diagnosticar, monitorar, modular, tratar, aliviar, ajudar a evitar a incidência de, ou reduzir os sintomas de doenças humanas ou patologias específicas em células, tecidos, órgãos, fluidos ou, de modo geral, um hospedeiro. Um domínio de FN3 manipulado para um propósito específico pode ser usado para tratar uma doença mediada pelo sistema imunológico ou deficiência imunológica, uma doença metabólica, um distúrbio ou doença cardiovascular; uma doença maligna; um distúrbio ou doença neurológica; uma infecção como uma infecção bacteriana, viral ou parasítica; ou outra condição relacionada conhecida ou especificada incluindo inchaço, dor e necrose ou fibrose de tecido.

[00102] Tal método pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um domínio de FN3 que liga especificamente uma molécula-alvo a uma célula, tecido, órgão, de animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento, alívio, prevenção ou redução nos sintomas, efeitos ou mecanismos. A quantidade eficaz pode compreender de cerca de 0,001 a 500 mg/kg por administração única (por exemplo, bolus), múltipla ou contínua, ou o suficiente para atingir uma concentração sérica de 0,01 a 5.000 μg/ml por administração única, múltipla ou contínua, ou qualquer faixa ou valor eficaz nesse intervalo, conforme realizado e determinado mediante o uso de métodos conhecidos, conforme descrito na presente invenção ou conhecido nas técnicas relevantes.

Composições farmacêuticas que compreendem proteínas à base de domínio de FN3

[00103] Os domínios de FN3 que ligam especificamente moléculas- alvo que são modificadas ou não modificadas, monômeros, dímeros ou multímeros, mono, bi ou multiespecíficos, podem ser isolados com o uso de procedimentos de separação bem conhecidos na técnica para captura, imobilização, divisão ou sedimentação e purificados na medida necessária para aplicabilidade comercial.

[00104] Para uso terapêutico, os domínios de FN3 que ligam especificamente uma molécula-alvo podem ser preparados como composições farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz do domínio de FN3 como um ingrediente ativo em um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o composto ativo é administrado. Tais veículos podem ser líquidos, como água e óleos, inclusive aqueles derivados de petróleo, animal, origem vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Por exemplo, podem ser usadas solução salina a 0,4% e glicina a 0,3%. Estas soluções são estéreis e, em geral, livres de matéria particulada. As mesmas podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização bem conhecidas (por exemplo, filtração). As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme exigido para aproximá-las das condições fisiológicas como agentes de tamponamento e de ajuste de pH, de estabilização, espessantes, lubrificantes e corantes, etc. A concentração do agente da invenção em tal formulação farmacêutica pode variar amplamente, isto é, de menos que cerca de 0,5%, usualmente em ou pelo menos cerca de 1% até tanto quanto 15 ou 20%, em peso, e será selecionada primariamente com base na dosagem exigida, volume do fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo particular de administração selecionado. Veículos e formulações adequados, inclusive de outras proteínas humanas, por exemplo, albumina sérica humana, são descritos, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edição, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams e Wilkins, Filadélfia, PA, EUA, 2006, Parte 5, Pharmaceutical Manufacturing, páginas 691 a 1092. Consulte especificamente as páginas 958 a 989.

[00105] O modo de administração para uso terapêutico dos domínios de FN3 que ligam especificamente uma molécula-alvo pode ser qualquer rota adequada que aplica o agente ao hospedeiro, como administração parenteral, por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea, pulmonar; transmucosal (oral, intranasal, intravaginal, retal); com o uso de uma formulação em um comprimido, cápsula, solução, pó, gel, partícula; e contida em uma seringa, um dispositivo implantado, bomba osmótica, cartucho, microbomba; ou outros meios entendidos pelo versado, como bem conhecido na técnica. A administração sítio-específica pode ser alcançada, por exemplo, por aplicação intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitária, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra-hepática, intracardíaca, intraosteal, intrapélvica, intrapericardíaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinhal, intrassinovial, intratorácica, intrauterina, intravascular, intravesical, intralesional, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal ou transdérmica.

[00106] Embora a invenção tenha sido descrita em termos gerais, as modalidades da invenção serão descritas adicionalmente nos exemplos a seguir, os quais não devem ser compreendidos como limitadores do escopo das reivindicações.

Exemplo 1: Arcabouço Tencon Modelo de Tencon

[00107] O terceiro módulo de fibronectina de domínio tipo III (Fn3) de tenascina humana C (SEQ ID NO: 3) pode ser usado como um arcabouço de proteína que pode ser manipulado para ligar-se a moléculas-alvo específicas. A temperatura de fusão desse domínio é 54 °C em PBS, em sua forma nativa.

[00108] A fim de produzir um arcabouço de proteína com uma estrutura similar e propriedades físicas aprimoradas, como uma estabilidade térmica aprimorada, uma sequência de consenso foi projetada com base em um alinhamento de 15 domínios de FN3 de tenascina humana C (mostrado nas SEQ ID NOs: 1 a 15). Os 15 domínios de FN3 selecionados têm identidades de sequência entre si na faixa de 13 a 80%, com uma identidade de sequência média entre pares de 29%. Uma sequência de consenso projetada como Tencon (SEQ ID NO: 16) foi projetada incorporando-se o aminoácido mais conservado (frequente) em cada posição (consulte publicação de patente US n° 2010/0216708). Em alinhamentos de pares, Tencon é idêntica aos domínios de FN3 de tenascina C a 34 a 59% de posições com uma identidade de sequência média de 43%.

Expressão e purificação de Tencon

[00109] A sequência de aminoácidos de Tencon foi retrotraduzida, resultando na sequência de cDNA mostrada na SEQ ID NO: 59. O cDNA foi amplificado e clonado em vetor pET15 modificado com o uso de métodos habituais. A proteína foi expressa como uma proteína de fusão His6-C-terminal sob forma solúvel em E. coli e purificada com o uso de agarose Ni-NTA padrão com o uso de eluição em 500 mM de imidazol. As frações desejadas foram agrupadas e dialisadas em PBS com pH 7,4. Como uma segunda etapa de purificação, a proteína foi carregada em uma coluna Superdex-75 HiLoad 16/60 (GE Healthcare), equilibrada em PBS. As frações contendo Tencon foram agrupadas e concentradas com o uso de um concentrador UltraCel YM-3 Centriprep (Amicon). A análise por SDS-PAGE mostrou que Tencon migra entre 6 e 14 kDa, de acordo com a massa esperada de 10,7 kDa para a proteína monomérica. Obteve-se um rendimento de >50 mg de proteína Tencon pura por litro de cultura.

Caracterização biofísica de Tencon

[00110] A estrutura e a estabilidade de Tencon foram caracterizadas por meio de espectroscopia em dicroismo circular (CD) e calorimetria de varredura diferencial (CVD). As medições de dicroísmo circular foram feitas em um espectrômetro AVIV a 20°C em PBS, e com uma concentração de 0,2 mg/ml. O espectro mostrou um mínimo a 218 nm, o que sugere estrutura em folha-beta conforme esperado para a proteína que pertence à família FN3. Os dados de DSC foram obtidos aquecendo-se soluções de 0,5 mg/ml do 3° domínio de FN3 de tenascina C (TN3) ou Tencon em PBS de 35°C para 95°C a uma taxa de 1°C/minuto em um calorímetro N-DSCII (Applied Thermodynamics). A partir desses dados, foram calculadas as temperaturas de fusão de 54°C e 78°C para TN3 e Tencon, respectivamente, com o uso de software CpCalc (Applied Thermodynamics). A dobragem e desdobragem de ambos os domínios é reversível a essas temperaturas. Dessa forma, o arcabouço Tencon gerado demonstra uma estabilidade térmica aprimorada quando comparada àquele da TN3. Com base nesse aumento de estabilidade, esse arcabouço Tencon está propenso a ser mais compatível com a substituição de aminoácidos e mais fácil de fabricar. As mutações que diminuem a estabilidade da proteína tendem a ser melhor toleradas no contexto de um arcabouço mais estável e, portanto, um arcabouço com estabilidade otimizada está propenso a produzir ligantes mais funcionais e bem dobrados a partir de uma biblioteca de variantes de arcabouço.

Exibição de tencon em fago M13

[00111] O cDNA (SEQ ID NO: 59) que codifica a sequência de aminoácidos Tencon foi subclonado no vetor de expressão de fagomídeo pPep9 (pub. pat. int. n° WO2008/079973) por meio de PCR padrão e clonagem por digestão de restrição, resultando no vetor pTencon-pIX. Esse vetor expressa Tencon com etiqueta Myc N-terminal como uma fusão C-terminal para o N-terminal da proteína M13 pIX de bacteriófago sob promotor Lac (permitindo teores mais baixos de expressão sem IPTG e expressão aumentada após a adição de IPTG) utilizando a sequência de sinais OmpA. Um conector TSGGGGS curto (SEQ ID NO: 60) foi inserido entre Tencon e pIX para evitar interações estéricas entre essas proteínas.

[00112] Para confirmação de exibição sobre a superfície da partícula de fago de M13, transformantes de colônia simples de pTencon-pIX em XL1-Blue E. coli foram cultivados a 37°C até alcançar fase logarítmica intermediária e resgatado com 610 ufp de fago ajudante VCSM13. Os sobrenadantes foram coletados das culturas resgatadas após expansão de 16 horas em meio 2YT suplementado com ampicilina seguido de indução de IPTG a 1 mM, centrifugados a 4000 X g por 20 minutos e armazenados a 4°C para análise.

[00113] A ligação das partículas de fago a um anticorpo anti-Myc (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) foi usada para confirmar a exibição do construto Myc-Tencon na superfície de fago M13. Uma placa Maxisorp foi revestida de um dia para o outro a uma concentração de 2,5 μg/ml com anti-Myc ou um anticorpo anti-αv (controle negativo) e bloqueada com SuperBlock T20 (Thermo Scientific, Rockford IL, EUA). Diluições seriais duplas do sobrenadante da cultura de fagomídio descrita acima foram feitas em PBS e adicionadas às cavidades da placa revestida. Após 1 hora, a placa foi lavada com TBST e um anticorpo anti-M13 HRP foi adicionado a cada cavidade e lavada com TBST após uma incubação de 1 hora. O substrato BD ELISA POD Roche foi adicionado e foi detectada a luminescência em um leitor de placas Tecan

Exemplo 2: Mutações estabilizantes em Tencon

[00114] As bibliotecas de Tencon, FG7 e BC6/FG7, projetadas para introduzir diversidade nos laços FG e FG e BC simultaneamente foram descritas (publicação de patente US n° 2010/0255056; publicação de patente US n° 2010/0216708).

Modelo de variantes

[00115] Os mutantes foram projetados para aprimorar a estabilidade de flexão de Tencon (SEQ ID NO: 16). Várias mutações pontuais foram feitas para produzir a substituição de resíduos individuais da SEQ ID NO: 16, como N46V (Tencon17; SEQ ID NO:17), E14P (Tencon18; SEQ ID NO:18), E11N (Tencon19; SEQ ID NO:19), E37P (Tencon20; SEQ ID NO:20) e G73Y (Tencon21; SEQ ID NO:21) que eram previstos para aprimorar a estabilidade de arcabouço pelo programa PoPMuSiC v2.0 (Dehouck et al., Bioinformatics, 25, 2.537 a 2.543, 2009). Foi constatado anteriormente que o mutante E86I (Tencon22; SEQ ID NO:22) estabiliza uma proteína homóloga, o 3° domínio de FN3 de tenascina humana C (WO2009/086116). Constatou-se que a mutação L17A (Tencon26; SEQ ID NO: 26) estabiliza significativamente Tencon durante experimentos de varredura de alanina nos quais todos os resíduos de laço de Tencon foram substituídos por alanina independentemente (dados não mostrados). Após um ciclo inicial de ensaios de estabilidade, os mutantes combinatórios N46V/E86I (Tencon23; SEQ ID NO:23), E14P/N46V/E86I (Tencon24; SEQ ID NO:24) e L17A/N46V/E86I (Tencon25; SEQ ID NO:25) foram produzidos para aumentar ainda mais a estabilidade.

Expressão e purificação

[00116] As mutações na sequência de codificação de Tencon foram feitas com o uso de um kit de mutagênese QuikChange (Stratagene) e as proteínas mutantes foram expressadas e purificadas com o uso de protocolos padrão como proteínas de fusão HIS6. As proteínas foram eluídas a partir de colunas Ni-NTA (Novagen) em fosfato de sódio a 50 mM pH 7,4, NaCl a 500 mM e imidazol a 250 mM. Após a eluição, as proteínas foram dialisadas em PBS pH 7,4.

Caracterização da estabilidade térmica

[00117] As estabilidades térmicas de Tencon e cada proteína mutante em pBS pH 7,4 (2 a 3 mg/ml) foram medidas por calorimetria de varredura diferencial capilar (DSC). As temperaturas de fusão foram medidas para essas amostras com o uso de um instrumento VP-DSC equipado com um autoamostrador (MicroCal, LLC). As amostras foram aquecidas de 10°C a 95°C ou 100°C a uma taxa de 1°C por minuto. Uma varredura em solução tampão apenas foi completada entre cada varredura de amostra para calcular uma linha de base para integração dos dados. Os dados foram ajustados a um modelo de desdobramento de dois estados seguido de subtração do sinal apenas do tampão. A reversibilidade de desnaturação térmica foi determinada pela repetição da varredura para cada amostra sem removê-lo da célula. A reversibilidade foi calculada pela comparação da área sob a curva da 1a varredura com a 2a varredura. Os resultados dos experimentos de DSC são apresentados na Tabela 3 como os valores derivados de curvas de fusão completa (Tm (Kcal)). Os mutantes simples Tencon17, Tencon18, Tencon19 e Tencon22 aprimoraram a estabilidade térmica em comparação com a sequência de Tencon original. Apenas o Tencon21 foi significativamente desestabilizador. Os mutantes combinatórios Tencon23, Tencon24 e Tencon25 tiveram, todos, uma melhora significativamente maior da estabilidade, indicando que as mutações projetadas são aditivas em relação à melhora da estabilidade térmica. Desnaturação por cloridrato de guanidina

[00118] As capacidades de Tencon e de cada mutante de permanecer dobrado no tratamento com concentrações crescentes de cloridrato de guanidina (GdmCl) conforme medido pela fluorescência de triptofano foram usadas para avaliar a estabilidade. O tencon contém apenas um resíduo de triptofano. O resíduo de triptofano é enterrado no núcleo hidrofóbico e dessa forma a emissão de fluorescência a 360 nm é uma medida sensível do estado dobrado desta proteína. 200 μl de uma solução contendo fosfato de sódio a 50 mM pH 7,0, NaCl a 150 mM e concentrações variáveis de GdmCl de 0,48 a 6,63 M foram pipetados em placas de 96 cavidades sem ligação pretas (Greiner) a fim de produzir uma titulação de 17 pontos. 10 μl de uma solução contendo os mutantes Tencon foram adicionados a cada cavidade em toda a placa para produzir uma concentração de proteína final de 23 μM e misturados por pipetagem suave para cima e para baixo. Após incubação à temperatura ambiente durante 24 horas, a fluorescência foi lida com o uso de um leitor de placas Spectramax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) com excitação a 280 nm e emissão a 360 nm. O sinal de fluorescência foi convertido em fração desdobrada com o uso da equação (Pace, Methods Enzymol 131:,266 a 280, 1986):

[00119] Onde yF é o sinal de fluorescência da amostra dobrada e yu da amostra desdobrada.

[00120] Os pontos médios da transição de desdobramento e coeficiente angular da transição foram determinados pelo ajuste à equação abaixo (Clarke et al., 1997):

[00121] Onde F é a fluorescência em uma determinada concentração de desnaturante, aN e aD são as interceptações em y do estado nativo e desnaturado, βN e βD são os coeficientes angulares das linhas de base para o estado nativo e desnaturado, [D] é a concentração de GdmCl, [β]50% a concentração de GdmCl no ponto em que 50% da amostra é desnaturada, m o coeficiente angular da transição, R a constante de gás e T a temperatura. A energia livre de dobragem para cada amostra foi estimada com o uso da equação (Pace 1986 supra; Clarke et al., J Mol Biol 270, 771 a 778, 1997): ΔG = m[fl]5Oo/o

[00122] Com frequência é difícil medir exatamente o coeficiente angular da transição, m, para tais curvas. Adicionalmente, não se espera que as mutações aqui descritas alterem o mecanismo de dobragem de tencon. Dessa forma, o valor m para cada mutante foi medido e calculou-se as médias dos valores (Pace 1986 supra) para produzir um m = 3544 cal/mol/M usado para todos os três cálculos de energia livre. Os resultados desses cálculos são apresentados na Tabela 3. Os resultados para os experimentos de desdobramento de GdmCl demonstraram que os mesmos mutantes que estabilizam Tencon no que diz respeito à estabilidade térmica também estabilizam a proteína contra a desnaturação induzida por GdmCl.Tabela 3

Cromatogral ia de exclusão de tamanho

[00123] Foi usada a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para avaliar o estado de agregação de Tencon e cada variante de Tencon. 5 μl de cada amostra foram injetados em uma coluna 75 5/150 Superdex (GE Healthcare) a uma taxa de fluxo de 0,3 ml/min com uma fase móvel de PBS. A eluição a partir da coluna foi monitorada por absorbância a 280 nm. Para avaliar o estado de agregação, a coluna foi calibrada anteriormente com padrões de peso molecular globular (Sigma). Todas as amostras foram testadas, com exceção de Tencon21, eluídas em um pico a um volume de eluição consistente com aquele de uma amostra monomérica. O Tencon21 foi eluído com 2 picos, indicando a presença de agregados.

Exemplo 3: Geração de bibliotecas de Tencon que têm superfícies de ligação alternativas Modelo da biblioteca de TCL14

[00124] A escolha de resíduos a serem selecionados aleatoriamente em um modelo de biblioteca particular governa o formato total da superfície de interação criada. Mostrou-se que a análise cristalográfica por raios X de um domínio de FN3 contendo proteína em arcabouço selecionada para ligar proteína de ligação de maltose (MBP) de uma biblioteca na qual os laços BC, DE e FG foram selecionados aleatoriamente tem uma interface amplamente curva que se ajusta ao sítio ativo de MBP (Koide et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 6.632 a 6.637, 2007). Em contrapartida, constatou-se que uma proteína em arcabouço de repetição de anquirina que foi selecionada para ligar-se à MBP tem uma superfície de interação muito mais plana e se liga à superfície externa de MBP distante do sítio ativo (Binz et al., Nat Biotechnol, 22, 575 a 58, 2004). Esses resultados sugerem que o formato da superfície de ligação de uma molécula em arcabouço (curva vs. plana) pode ditar quais proteínas- alvo ou epítopos específicos naquelas proteínas-alvo têm a capacidade de serem ligados efetivamente pelo arcabouço. Os esforços publicados acerca da manipulação de arcabouços de proteína contendo domínios de FN3 para ligação de proteína dependem da manipulação de laços adjacentes (Figura 1) para ligação-alvo, produzindo assim superfícies de ligação curvas. Essa abordagem pode limitar o número de alvos e epítopos acessível por meio de tais arcabouços.

[00125] Tencon e outros domínios de FN3 contêm dois conjuntos de laços similares a CDR assentados sobre as faces opostas da molécula, o primeiro conjunto formado pelos laços BC, DE e FG e o segundo conjunto formado pelos laços AB, CD e EF. Os dois conjuntos de laços são separados pelos beta-filamentos que formam o centro da estrutura de FN3 (Figuras 1, 2A). Se a imagem da estrutura de Tencon apresentada na Figura 1 for girada em 90 graus, uma superfície alternativa pode ser visualizada (Figura 2B). Essa superfície ligeiramente côncava é formada pelos laços CD e FG e dois beta- filamentos antiparalelos, e os C e F beta-filamentos, e não é chamada no presente documento por superfície de C-CD-F-FG (Figura 2B). A superfície de C-CD-F-FG pode ser usada como um modelo para projetar bibliotecas de superfícies de interação de arcabouço de proteína selecionando-se aleatoriamente um subconjunto de resíduos que forma a superfície. Os beta-filamentos têm uma estrutura de repetição com a cadeia lateral de todo e qualquer resíduo exposto à superfície da proteína. Dessa forma, uma biblioteca pode ser produzida selecionando-se aleatoriamente parte ou a totalidade de resíduos expostos à superfície nos beta filamentos. Escolhendo-se os resíduos apropriados nos beta-filamentos, a estabilidade inerente do arcabouço Tencon deveria ser minimamente comprometida enquanto fornece uma superfície de arcabouço exclusiva para interação com outras proteínas.

[00126] Uma nova biblioteca, no presente documento chamada de TCL14 (SEQ ID NO: 28), foi projetada em arcabouço Tencon25 (SEQ ID NO: 25) que tem uma substituição de E11R adicional (Tencon27, SEQ ID NO: 27) (Figuras 2B, 3). São mostradas as posições dos laços e filamentos e suas sequências nas Tabelas 4 e 5 para Tencon27 (SEQ ID NO: 27) e TCL14 (SEQ ID NO: 28), respectivamente. Na Tabela 5, "X" indica qualquer aminoácido. Tencon27 (SEQ ID NO: 27): LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEK VGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT biblioteca TCL14 (SEQ ID NO: 28): LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFXIXYXEXXXX GEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYXVXIXGVKGGXXSXPLSAIFTT;

[00127] em que "X" é qualquer aminoácido.

[00128] Os dois beta filamentos que formam a superfície de C-CD- F-FG em Tencon27 têm um total de 9 resíduos expostos à superfície que poderiam ser selecionados aleatoriamente; C-filamento: S30, L32, Q34, Q36; F-filamento: E66, T68, S70, Y72 e V74, enquanto o laço CD tem 6 resíduos potenciais: S38, E39, K40, V41, G42 e E43 e o laço FG tem 7 resíduos potenciais: K75, G76, G77, H78, R79, S80 e N81 (Figura 5). Os resíduos selecionados foram escolhidos para inclusão no modelo TCL14 devido ao maior tamanho teórico da biblioteca se todos os 22 resíduos foram selecionados aleatoriamente.

[00129] Treze posições em Tencon27 (SEQ ID NO: 27) foram escolhidas para seleção aleatória: L32, Q34 e Q36 no C-filamento, S38, E39, K40 e V41 no CD-laço, T68, S70 e Y72 no F-filamento, H78, R79 e N81 no laço FG. Em C e F, os filamentos S30 e E66 não foram selecionados aleatoriamente visto que os mesmos estão além dos laços CD e FG e não parecem fazer parte, aparentemente, da superfície de C-CD-F-FG. Para o laço CD, G42 e E43 não foram selecionados aleatoriamente visto que a glicina, que fornece flexibilidade, pode ser valiosa em regiões de laço e E43 se encontra na junção da superfície. O laço FG teve K75, G76, G77 e S80 excluídos. As glicinas foram excluídas pelas razões acima enquanto uma inspeção cuidadosa da estruturas de cristal revelou que S80 faz contatos-chave com o núcleo para ajudar a formar o laço FG estável. K75 fica voltado na direção oposta à superfície da superfície de C-CD-F-FG e era um candidato menos atraente para seleção aleatória. Embora os resíduos mencionados acima não tenham sido selecionados aleatoriamente no modelo de TCL14 original, os mesmos poderiam ser incluídos em modelos de biblioteca subsequentes para fornecer diversidade adicional para seleção de novo ou, por exemplo, para uma biblioteca de maturação de afinidade em um resultado específico de alvo de TCL14 selecionado. Tabela 4.

[00130] Em contrapartida aos modelos de biblioteca à base de arcabouço de FN3 existentes (Koide, et al. J Mol Biol, 284, 1.141 a 1.151, 1998;) Koide et al., Proc Natl Acad Sci USA 104, 6.632 a 6.637, 2007; (Dineen et al., BMC Cancer, 8, 352 a 361, 2008; Olson e Roberts, Protein Sci, 16, 476 a 484, 2007; Xu et al., Chemistry & Biology, 9, 933 a 942, 2002; Karatan et al., Chem Biol, 11, 835 a 844, 2004; Hackel et al., J Mol Biol, 401, 84 a 96, 2010; Hackel et al., J Mol Biol 381, 1.238 a 1.252, 2008; Koide et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 6.632 a 6.637, 2007; Lipovsek et al., J Mol Biol, 368, 1.024 a 1.041, 2007; Pub. Pat. Int. n° WO2009/133208; Pub. Pat. Int. n° WO2009/058379; patente US n° 7.115.396), a superfície de biblioteca de TCL14 projetada não tem estrutura similar àquela de domínios variáveis de anticorpo ou CDRs, ou bibliotecas de FN3 anteriormente descritas. Devido à grande superfície de interação gerada por esse modelo, as moléculas de alta afinidade podem ser isoladas rapidamente, possivelmente sem a necessidade de etapas de maturação de afinidade.Tabela 5

[00131] Devido ao fato de que esse modelo não seleciona aleatoriamente longos estiramentos de aminoácidos consecutivos, isso pode produzir moléculas de ligação de FN3 que são mais solúveis e estáveis do que as bibliotecas anteriormente descritas. A biblioteca de TCL14 descrita produz uma superfície de interação plana ou côncava em comparação à superfície curva de bibliotecas anteriores. Dessa forma, é provável que as moléculas de FN3 selecionadas de TCL14 se liguem a antígenos e epítopos distintos como aqueles encontrados em modelos de biblioteca de FN3 anteriores. O modelo de biblioteca de TCL14 também pode permitir a produção de duas superfícies de ligação distintas na mesma molécula para alcançar biespecificidade.

Geração da biblioteca de TCL14

[00132] A biblioteca de TCL14 descrita acima foi expressada com o uso do sistema de exibição de cis (Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA 101: 2.806 a 2.810, 2004). Nesse sistema, a biblioteca está ligada a fragmentos de DNA que codificam a sequência de codificação de elementos RepA, cis e ori e um promotor Tac e o produto de ligação resultante é transcrito/traduzido in vitro. As proteínas de fusão TCL14- RepA produzidas são ligadas em cis ao DNA através do qual as proteínas de fusão são codificadas. A biblioteca é varrida para moléculas em arcabouço que se ligam especificamente a proteínas de interesse, as moléculas são isoladas e o DNA ligado amplificado para identificar as sequências de codificação das moléculas em arcabouço ligadas.

[00133] A biblioteca de TCL14 foi gerada por meio de seleção aleatória de posições L32, Q34, Q36 (C-filamento), S38, E39, K40, V41 (CD-laço), T68, S70, Y72 (F-filamento), H78, R79 e N81 (FG-laço) em Tencon 27 (SEQ ID NO: 27) com o uso da sistema de reação em cadeia de polimerase (PCR) com iniciadores degenerados e 5’ clonado ao gene RepA para exibição de cis com o uso de protocolos padrão. O iniciador C-CD N46V (SEQ ID NO: 51) foi usado para selecionar aleatoriamente o C filamento e o laço C:D e o iniciador F-FG-Sf E86I-R (SEQ ID NO: 52) foi usado para selecionar aleatoriamente o F filamento e o laço F:G. A ligação final foi amplificada com os iniciadores R1RecFor (SEQ ID NO: 53) e DigLigRev (SEQ ID NO: 54) para gerar a biblioteca de TCL14 para transcrição/tradução in vitro. A Tabela 6 mostra as sequências dos iniciadores utilizadas. NNS de códon foram usados para diversificação (código IUB; N indicando A, C, G, ou T; S indicando C ou G).Tabela 6

Caracterização da biblioteca de TCL14

[00134] A biblioteca de TCL14 gerada foi clonada por PCR em um vetor modificado pET15 (EMD Biosciences) contendo um sítio de ligação independente de ligase (pET154-LIC) com o uso de iniciadores TCON6 (SEQ ID NO: 55) e TCON5 E86I curto (SEQ ID NO: 56) e as proteínas foram expressadas como proteínas com etiqueta His6 C- terminal após as transformação e indução de IPTG (1 mM final, 30°C por 16 horas) com o uso de protocolos padrão. As células foram sequestradas por meio de centrifugação e, subsequentemente, lisadas com Bugbuster HT (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, EUA) suplementado com 0,2 mg/ml de Lisozima de Clara de Ovo de Galinha (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Os lisatos bacterianos foram clarificados por meio de centrifugação e os sobrenadantes foram transferidos para novas placas de 96 cavidades profundas. As proteínas foram purificadas com o uso de uma Placa de 96 cavidades Ni-NTA Multitrap (GE Lifesciences, Piscataway, NJ, EUA).

[00135] Foi realizada uma seleção aleatória de clones e as sequências para avaliar a distribuição obtida na biblioteca. A diversidade observada na biblioteca estava plenamente de acordo com o esperado (Figura 7). Para calcular a diversidade observada nos clones de biblioteca de comprimento total, o número total de vezes que um dado aminoácido apareceu nas regiões de biblioteca diversificada foi contato em todos os clones e dividido pelo número total de posições aleatórias (13 posições de biblioteca aleatórias * 69 clones de comprimento total) e multiplicado por 100 para produzir % de frequência. A diversidade esperada tem por base o códon de degeneração de NNS com a seguinte distribuição de aminoácidos: Phe=1, Leu=3, Ile=1, Met=1, Val=2, Ser=3, Pro=2, Thr=2, Ala=2, Cys=1, Arg=3, Gly=2, Tyr=1, His=1, Gln=1, Asn=1, Lys=1, Asp=1, Glu=1, Trp=1 códon(s) dividido pelo número total de códons (32) multiplicado por 100 para produzir % de frequência.

[00136] As proteínas purificadas foram submetidas à cromatografia de exclusão de tamanho para determinar a propensão à agregação de membros de biblioteca individuais. Os perfis de eluição de clones selecionados foram determinados injetando-se 10 μl das proteínas purificadas em uma coluna 75 5/150 Superdex com o uso de uma HPLC 1200 Agilent com absorbância lida em 280 nm. ~80% dos clones não contendo cisteína eluíram como um pico único monomérico, significando assim que a maior parte dos membros de biblioteca individuais reteve a solubilidade intrínseca e a estrutura da molécula original. Verificou-se que algumas moléculas contendo cisteina livre oxidizam após a purificação e, dessa forma, eluem como moléculas diméricas.

[00137] Foi usada calorimetria de varredura diferencial (DSC) para caracterizar adicionalmente os clones que apresentaram um perfil monodisperso conforme determinado por meio de análise por SEC. Os dados de DSC foram obtida aquecendo-se soluções de 0,5 mg/ml para cada em PBS de 35°C a 95°C a uma taxa de 1°C/min em um microcalorímetro de célula capilar VP-DSC (Microcal, LLC, Piscataway, NJ, EUA). As temperaturas de fusão foram calculadas para cada clone com o uso de software CpCalc (Microcal, LLC, Piscataway, NJ, EUA) com um resumo dos dados mostrados na Tabela 7. A temperatura de fusão média das moléculas testadas era de 70 ± 9°C. Os dados obtidos demonstram que o modelo de biblioteca de TCL14 produz moléculas em arcabouço que retiveram uma quantidade significativa da estabilidade térmica da molécula original Tencon25 (93°C) e são, por si só, termicamente estável de modo inerente e bem dobradas. Tabela 7

Seleção de moléculas de biblioteca de TCL14 que se ligam especificamente a moléculas-alvo de interesse

[00138] A biblioteca de TCL14 foi varrida contra várias proteínas-alvo de diferentes classes de proteína que consistem em domínios extracelulares de receptor de superfície de célula, citocinas, quinases, fosfatases, proteínas de choque térmico e imunoglobulinas e seus fragmentos para identificar moléculas em arcabouço que se ligam especificamente a essas proteínas e/ou domínios de proteína. As proteínas solúveis purificadas expressadas em HEK293 ou células de E. coli foram biotiniladas com o uso dos Microtubos de Sulfo-NHS-LC- Biotina Sem Peso de Ligação- EZ (Thermo Fisher, Rockford, IL, EUA) seguido de diálise extensiva em PBS. Para seleções, 3 μg de biblioteca de TCL14 foram transcritas e traduzidas in vitro (IVTT) em Extrato Linear de E. Coli S30 (Promega, Madison, WI, EUA) e a biblioteca expressada bloqueada com Cis Block (BSA a 2% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), 100 μg/ml de DNA de Esperma de Arenque (Promega, Madison, WI, EUA), 1 mg/ml de heparina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Para seleção, cada proteína-alvo biotinilada foi adicionada a concentrações de 400 nM (ciclo 1), 200 nM (ciclos 2 e 3) e 100 nM (ciclos 4 e 5). Os membros de biblioteca ligados foram recuperados com o uso de microesferas magnéticas de neutravidina (Thermo Fisher, Rockford, IL, EUA) (ciclos 1, 3 e 5) ou microesferas magnéticas de estreptavidina (Promega, Madison, WI, EUA) (ciclos 2 e 4) e os membros de biblioteca não ligados foram removidos por meio de lavagem das microesferas 5 a 14 vezes com 500 μl de PBST seguido de 2 lavagens com 500 μl de PBS.

[00139] Após 5 ciclos de seleção, o resultado de DNA foi amplificado por meio de PCR e subclonado em pET154-LIC com o uso de protocolos padrão.

[00140] Foram realizados ciclos de seleção adicionais a fim de identificar moléculas em arcabouço com afinidades aprimoradas para duas proteínas-alvo. Brevemente, os resultados do ciclo 5 foram preparados conforme descrito acima e submetidos a ciclos iterativos adicionais de seleção com as seguintes alterações: a incubação com proteína-alvo biotinilada foi diminuída de 1 hora para 15 minutos e a captura de microesfera foi diminuída de 20 minutos para 15 minutos, a proteína-alvo biotinilada diminuiu para 25 nM (ciclos 6 e 7) ou 2,5 nM (ciclos 8 e 9) e uma lavagem adicional de 1 hora foi realizada na presença de um excesso de proteína-alvo não biotinilada. O objetivo dessas mudanças era selecionar simultaneamente aglutinantes com uma taxa para associação potencialmente mais rápida e uma taxa para dissociação mais lenta rendendo uma KD substancialmente inferior. O resultado do 9° ciclo foi amplificado por PCR, clonado e expressado conforme descrito acima.

Caracterização In vitro de moléculas em arcabouço que se ligam a proteínas e/ou domínios de proteína de interesse Aglutinação

[00141] Foi realizado um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) em 188 clones individuais dos resultados de pesquisa do ciclo 5. As placas Maxisorp (Nunc, Rochester, NY, EUA) foram revestidas com 0,1 μg de anticorpo anti-His (Qiagen, Valencia, CA, EUA) de um dia para o outro, lavadas com Solução Salina Tamponada por Tris, pH 7,4 com Tween-20 a 0,05% (TBST) e bloqueadas com o uso de Bloco de Partida T20 (Thermo Fisher, Rockford, IL, EUA). Os lisatos bacterianos clarificados contendo 1 μg/ml de fusões de TCL14-RepA com etiqueta His6ou uma proteína de controle (albumina sérica humana) foram aplicados sobre as cavidades das placas revestidas. As placas foram incubadas por 1 hora, lavadas com TBST e a proteína biotinilada detectada com estreptavidina-HRP (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, EUA) e substrato quemiluminescente POD (Roche, Indianapolis, IN, EUA) com o uso de leitor de placas M5 Molecular Devices. Avaliou-se o desempenho da biblioteca por meio de uma taxa de acertos. A taxa de acertos foi definida como o percentual (%) de moléculas em arcabouço que tem sinal de luminescência 10 vezes acima do sinal de controle dividido pelo número total de clones varridos (188). Conforme mostrado na Tabela 8, a biblioteca de TLC14 rendeu moléculas em arcabouço com taxas de acertos na faixa de 8% a 45% para oito proteínas distintas. A citocina 2 é IL-17A de camundongo.Tabela 8

Caracterização de aglutinantes de IL-17A de camundongos Inibição de receptor de IL-17A

[00142] Foi realizado um ensaio de inibição para determinar se os resultados de pesquisa dos ciclos 5 e 9 contra o IL-17A de camundongo (mIL-17A) inibiu a ligação de mIL-17A ao receptor de mIL-17A. As placas Maxisorp foram revestidas com 0,2 μg/ml de fusão de Fc de receptor de mIL-17A (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) de um dia para o outro, lavadas com solução salina tamponada com fosfato (STF), pH 7,4 com Tween-20 a 0,05% (TBST) e bloqueadas com BSA a 2%, sacarose a 5% em PBS. Foram adicionadas 10 ng/ml de mIL17A biotinilado (b-mIL-17A) aos lisatos bacterianos clarificados diluídos a uma razão de 1:50 em BSA a 1% em PBS e as misturas foram incubadas por 20 minutos. As placas bloqueadas foram lavadas e as incubações de b-mIL-17A/lisatos bacterianos foram transferidas sobre as placas. As placas foram incubadas durante mais uma hora, lavadas com PBST e a proteína biotinilada detectada com estreptavidina-HRP (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, EUA) e substrato colorimétrico de OPD (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). A absorbância a 490 nm foi lida com o uso de um leitor de placas M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) e os dados convertidos em % de inibição. A porcentagem de inibição para ligação de receptor de mIL- 17A:mIL-17 foi definida como 100-(amostra/controle negativo x 100).

[00143] Os lisatos bacterianos selecionados contendo as moléculas em arcabouço que inibem a interação de receptor de mIL-17A:mIL-17 foram adicionalmente caracterizados em um ensaio de inibição de resposta à dosagem com o uso do protocolo descrito acima, exceto que 100 μl de proteínas de fusão TCL14-His (Ni-NTA) purificadas foram usadas nos ensaios entre concentrações de 10 μM a 56 pM. Os valores IC50 foram calculados a partir das curvas de resposta à dosagem com o uso de um ajuste de resposta à dosagem sigmoidal. Conforme resumido na Tabela 9, os inibidores específicos de mIL-17A têm uma faixa de IC50s de ~9 a ~428 pM.Tabela 9

Medições de afinidade

[00144] As afinidades de moléculas selecionadas que se ligam a mIL-17A foram medidas com o uso de ressonância de plasma de superfície com o uso de instrumento ProteOn XPR-36 (Bio-Rad). As moléculas purificadas foram diretamente imobilizadas no chip através de acoplamento de amina com densidades diferentes (100~300 Rus) a pH 5,0 e uma taxa de fluxo de 30 μl/min por 5 minutos. mIL-17A a 100 nM diluído em uma série de concentração de 3 vezes foi testada para sua ligação a diferentes moléculas na superfície de chip. As fases de dissociação para todas as concentrações de todas as amostras foi monitorada por 1 ~ 2 horas a uma taxa de fluxo de 100 μl/min dependendo de sua taxa para dissociação. Uma amostra de tampão foi injetada para monitorar a estabilidade de linha de base e uma superfície não foi regenerada para uso adicional. Os dados de resposta para todas as séries de concentração para cada uma das superfícies diferentes das moléculas em arcabouço selecionadas da biblioteca de TLC14 foram globalmente ajustados para um modelo de ligação langmuir simples a uma razão de 1:1 para extrair estimativas das constantes cinéticas (kon, koff) e de afinidade (KD). Conforme resumido na Tabela 9, as afinidades das moléculas em arcabouço que se ligam especificamente a mIL-17A estavam a uma faixa subnanomolar.

[00145] As sequências de aglutinantes de mIL-17A selecionados são mostradas nas SEQ ID NOs: 85 a 96 e as sequências dos C e F beta- filamentos e dos laços CD e FG na Tabela 10.Tabela 10

Exemplo 4: Bibliotecas de Tencon27 selecionadas aleatoriamente em uma segunda superfície alternativa

[00146] Uma segunda superfície alternativa em Tencon27 reside no lado oposto da superfície de C-CD-F-FG conforme visto na Figura 2C, no presente documento chamada de superfície A-AB-B-BC-E, formada pelo A beta-filamento, pelo laço AB, pelo B beta-filamento, pelo laço BC e pelo E beta-filamento. A superfície A-AB-B-BC-E também é ligeiramente côncava e pode ser usada como um modelo para bibliotecas-modelo de superfícies de interação de arcabouço de proteína selecionando aleatoriamente um subconjunto de resíduos que formam a superfície. Os beta-filamentos têm uma estrutura de repetição com a cadeia lateral de todo e qualquer resíduo exposto à superfície da proteína. Dessa forma, uma biblioteca pode ser produzida selecionando-se aleatoriamente parte ou a totalidade de resíduos expostos à superfície nos beta filamentos. Escolhendo-se os resíduos adequados nos beta-filamentos, a estabilidade inerente do arcabouço Tencon27 deveria ser minimamente comprometida enquanto fornece uma superfície de arcabouço exclusiva para interação com outras proteínas. A seleção aleatória da superfície A-AB-B-BC-E irá produzir uma superfície de ligação no lado oposto da estrutura de Tencon27 quando comparada ao modelo de biblioteca de TCL14. O modelo de biblioteca em Tencon27 com superfície A-AB-B-BC-E selecionada aleatoriamente é mostrado na SEQ ID NO: 61 (a biblioteca de TCL15) e na Figura 6.

[00147] Biblioteca de TCL15 (SEQ ID NO: 61):

[00148] LPAPKXLXVXXVXXXXAXLXWXAPDAAFDSFLIQYQESEK VGEAIVLTVPGSERXYXLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFT T;

[00149] em que X é qualquer aminoácido.

[00150] A biblioteca de TCL15 é gerada e selecionada para arcabouços que ligam especificamente moléculas-alvo conforme descrito acima para a biblioteca de TCL14.

Exemplo 5: Outros domínios de FN3: geração de bibliotecas selecionando-se aleatoriamente superfícies alternativas

[00151] Os modelos de biblioteca que utilizam superfícies alternativas descritas nos exemplos para o arcabouço de Tencon27 podem ser aplicados a outros domínios de FN3 de várias proteínas devido à similaridade estrutural entre os domínios de FN3. Tais domínios de FN3 podem ser de ocorrência natural ou sintéticos e são, por exemplo, um arcabouço de consenso Fibcon (SEQ ID NO: 58) com base em uma sequência de consenso de domínios de fibronectina (publicação de patente US n° 2010/0255056), o 10° domínio de FN3 de fibronectina humana (FN10) (SEQ ID NO: 97) ou o 3° domínio de FN3 de tenascina humana (TN3) (SEQ ID NO: 3) ou qualquer domínio de FN3 presente em proteínas mencionadas na Tabela 1.

[00152] Os modelos de biblioteca para bibliotecas de Fibcon, FN10 e TN3 com superfícies alternativas C-CD-F-FG selecionadas aleatoriamente são mostrados na Figura 8 e nas SEQ ID NOS: 62, 98 e 99, respectivamente. As bibliotecas projetadas são sintetizadas, expressadas e selecionadas para aglutinantes específicos com o uso de protocolos descritos nisso.

[00153] Biblioteca de arcabouço de proteína à base de Fibcon com superfície de C-CD-F-FG selecionada aleatoriamente (SEQ ID NO: 62):

[00154] LDAPTDLQVTNVTDTSITVSWTPPSATITGYXIXYXPXXXX GEPKELTVPPSSTSVTITGLTPGVEYXVXLXALKDNXXSXPLVGTQTT;

[00155] em que X é qualquer aminoácido.

[00156] Biblioteca de arcabouço de proteína à base de BFN10 com superfície de C-CD-F-FG selecionada aleatoriamente (SEQ ID NO: 98):

[00157] VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYXIXYXEXXX XSPVQEFTVPGSKSTATISG LKPGVDYXIXVXAVTGRGDSPXXSXPISINYRT;

[00158] em que X é qualquer aminoácido.

[00159] Biblioteca de arcabouço de proteína à base de TN3-com superfície de C-CD-F-FG selecionada aleatoriamente (SEQ ID NO: 99):

[00160] DAPSQIEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGIXLXYXIXXXXGD RTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTEYXVXLXSRRGDXXSXPAKETFTT;

[00161] em que X é qualquer aminoácido.

[00162] De modo similar a conforme descrito para o arcabouço de Tencon27, alguns ou todos dentre os resíduos que compreendem os laços CD e/ou FG de outros domínios de FN3 podem ser substituídos por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 posições selecionadas aleatoriamente para gerar bibliotecas de comprimentos diferentes.

[00163] Ficará claro que a invenção pode ser posta em prática de outro modo do que aquele particularmente descrito na descrição e exemplos acima mencionados. Modificações numerosas e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima e, portanto, estão dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Método de fabricação de uma biblioteca de domínios de módulo de fibronectina tipo III (FN3) que têm uma superfície alternativa de C-CD-F-FG diversificada formada por um beta-filamento C, um laço CD, um beta-filamento F e um laço FG, caracterizado pelo fato de que compreende a. fornecer um polipeptídeo de domínio de FN3 de referência que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27; b. introduzir diversidade no polipeptídeo de domínio de FN3 de referência ao realizar mutação de pelo menos um resíduo de beta- filamento C e pelo menos um resíduo de beta-filamento F para formar a biblioteca de domínio de FN3 que tem a superfície alternativa de C-CD- F-FG diversificada.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que 1, 2, 3 ou 4 resíduos do beta-filamento C sofrem mutação e o resíduo S30 correspondendo à SEQ ID NO: 27 não sofre mutação.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que (a) os resíduos de beta-filamento C L32, Q34 e Q36 correspondendo à SEQ ID NO: 27 sofrem mutação; ou (b) 1, 2, 3 ou 4 resíduos no beta-filamento F sofrem mutação e o resíduo E66 correspondendo à SEQ ID NO: 27 não sofre mutação.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3b, caracterizado pelo fato de que os resíduos de beta-filamento F T68, S70 e Y72 correspondendo à SEQ ID NO: 27 sofrem mutação.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3b, caracterizado pelo fato de que 1, 2, 3 ou 4 resíduos na alça CD sofrem mutação e os resíduos G42 e E43 correspondendo à SEQ ID NO: 27 não sofrem mutação, particularmente em que os resíduos S38, E39, K40 e V41 correspondendo à SEQ ID NO: 27 sofrem mutação.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que 1, 2, 3 ou 4 resíduos no laço FG sofrem mutação e os resíduos K75, G76, G77 e S80 correspondendo à SEQ ID NO: 27 não sofrem mutação, particularmente em que os resíduos H78, R79 e N81 correspondendo à SEQ ID NO: 27 sofrem mutação, opcionalmente em que o domínio de FN3 de referência compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, por exemplo compreendendo pelo menos uma substituição em posições de aminoácidos 11, 14, 17, 37, 46, 73 ou 86.

7. Biblioteca, caracterizada pelo fato de que é produzida por meio do método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, opcionalmente em que a biblioteca compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28.

8. Método para obter um arcabouço de proteína, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de módulo de fibronectina tipo III (FN3) que tem uma superfície alternativa de C-CD- F-FG diversificada que tem a capacidade de ligar-se especificamente a uma molécula-alvo, que compreende entrar em contato ou selecionar a biblioteca, como definida na reivindicação 7, com a molécula-alvo e isolar um arcabouço de proteína que se liga especificamente à molécula-alvo com uma afinidade predefinida.