ES2928578T3 - Andamiajes de proteínas basados en la repetición de fibronectina tipo III con superficies de unión alternativas - Google Patents

Abstract

Los andamios de proteínas y las bibliotecas de andamios basados en una repetición de fibronectina tipo III (FN3) con un diseño de superficie de unión alternativo, los ácidos nucleicos aislados que codifican los andamios de proteínas, los vectores, las células huésped y los métodos para fabricarlos son útiles en la generación de moléculas terapéuticas y el tratamiento. y diagnóstico de enfermedades y trastornos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Andamiajes de proteínas basados en la repetición de fibronectina tipo III con superficies de unión alternativas CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a andamiajes de proteínas y bibliotecas de andamiajes basadas en una repetición de fibronectina tipo III (FN3) con diseños de superficie de unión alternativos. Más particularmente, la presente invención se refiere a andamiajes y bibliotecas de FN3 que tienen sitios de unión cóncavos formados por cadenas beta y giros seleccionados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los anticuerpos monoclonales son la clase de proteínas terapéuticas más ampliamente usada cuando se desea una alta afinidad y especificidad por una molécula objetivo. Sin embargo, las proteínas que no son anticuerpos que tienen estructuras tridimensionales relativamente definidas que pueden manipularse para que se unan a las moléculas objetivo deseadas, comúnmente conocidas como andamiajes de proteínas, pueden tener ventajas sobre los anticuerpos tradicionales debido a su pequeño tamaño, carencia de enlaces disulfuro, alta estabilidad, y la capacidad de expresarse en huéspedes procariotas. Estos andamiajes contienen típicamente una o más regiones que son susceptibles de variación de secuencia específica o aleatoria, y dicha aleatorización de secuencias se lleva a cabo a menudo para producir bibliotecas de proteínas de las que pueden seleccionarse los productos deseados. Los nuevos métodos de purificación se aplican fácilmente; los andamiajes se conjugan fácilmente con fármacos/toxinas, penetran eficientemente en los tejidos y pueden formarse en aglutinantes multiespecíficos (Binz y Pluckthun, Curr Opin Biotechnol, 16, 459-469, 2005; Skerra, J Mol Recognit, 13, 167-187, 2000).

Uno de tales andamiajes de proteínas es el dominio de fibronectina tipo III (FN3) identificado en una multitud de proteínas, que tiene una estructura terciaria característica con 6 giros conectados por 7 cadenas beta. Tres giros en particular, los giros FG, BC y DE son estructuralmente análogos a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de los anticuerpos. Estos giros se han aleatorizado para generar bibliotecas de los andamiajes del dominio de FN3 para seleccionar con éxito aglutinantes específicos para una serie de objetivos diferentes a la vez que se conservan propiedades biofísicas importantes (Getmanova et al., Chem Biol, 13, 549-556, 2006; Hackel et al., J Mol Biol, 381, 1238-1252, 2008, Karatan et al., Chem Biol, 11, 835-844, 2004, Koide et al., J Mol Biol, 284, 1141-1151, 1998; Koide et al., Proc Natl Acad Sci USA, 104, 6632-6637, 2007; Parker et al., Protein Eng Des Sel, 18, 435-444, 2005; Xu et al., Chemistry & Biology, 9, 933-942, 2002). Se han generado bibliotecas de los dominios de FN3 aleatorizando también los giros AB, EF y CD (Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2011/0038866; Publicación de Patente Internacional N° WO2011/05133; Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2011/0124527). Otras referencias para bibliotecas de FN3 incluyen las Publicaciones de Patente Internacional N° WO2002/32925, WO2003/104418, WO2009/023184 y W02010/060095. La Publicación de Patente Internacional N2 WO2012/016245 describe bibliotecas de dominios de FN3 que usan giros CD y FG junto con residuos expuestos en la superficie de la lámina beta.

La US 2005/038229 se refiere a una proteína no de anticuerpo que comprende un dominio que tiene un pliegue similar a inmunoglobulina. La WO 2010/051274 analiza andamiajes de proteínas en base a una secuencia de consenso de proteínas de FN3, como Tenascina humana

Sería ventajoso obtener proteínas de andamiaje de dominio de fibronectina mejoradas tanto para propósitos terapéuticos como de diagnóstico. La presente divulgación proporciona tales proteínas mejoradas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un andamiaje de proteínas que comprende un dominio de módulo de fibronectina tipo III (FN3), que tiene una superficie alternativa C-CD-F-FG diversificada capaz de unirse específicamente a una molécula objetivo, en donde el dominio de FN3 comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 27.

La presente invención proporciona además un ácido nucleico que codifica el andamiaje de proteínas de la invención.

La presente invención proporciona además un vector que comprende el ácido nucleico de la invención. La presente invención proporciona además una célula huésped que comprende el ácido nucleico o el vector de la invención.

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende el andamiaje de proteínas de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona además el andamiaje de proteínas de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, para su uso en un método de tratamiento.

Las realizaciones de la invención se resumen en algunos de los casos a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO

La Figura 1 muestra diagramas de cinta del dominio de FN3 y las estructuras del dominio de VH del anticuerpo. Están marcados los giros del dominio de FN3 estructuralmente análogos a las CDR.

La Figura 2 muestra diagramas estructurales que permiten la comparación entre A) bibliotecas de FN3 convencionales con giros aleatorizados (Figura 2A); B) Biblioteca de FN3 con una superficie alternativa C-CD-F-FG aleatorizada (biblioteca TCL14) (Figura 2B); C) Biblioteca de FN3 con una superficie A-AB-B-BC-E aleatorizada (biblioteca TCL15) (Figura 2C). Las posiciones aleatorizadas en estos diseños de bibliotecas se representan en negro sólido en los diagramas de cinta.

La Figura 3 muestra una alineación de secuencias del andamiaje Tencon27 (SEQ ID NO: 27) y la biblioteca TCL14 (SEQ ID NO: 28) que tiene una superficie alternativa C-CD-F-FG aleatorizada. Los residuos de giro están encuadrados. Las regiones particulares del giro y de la cadena beta se indican encima de las secuencias.

La Figura 4 muestra una alineación de secuencias del andamiaje Tencon27 (SEQ ID NO: 27) y una biblioteca de TCL15 que tiene una superficie alternativa A-AB-B-BC-E aleatorizada (SEQ ID NO: 61). Los residuos de giro están encuadrados. Las regiones particulares del giro y de la cadena beta se indican encima de las secuencias. La Figura 5 muestra un diagrama de topología del diseño de la biblioteca en Tencon27 (SEQ ID NO: 27) con una superficie alternativa C-CD-F-FG aleatorizada (la biblioteca TCN14). Las cadenas beta se representan como flechas con residuos de las cadenas que están unidas por enlaces de hidrógeno entre sí en la estructura Tencon27 colocada de forma adyacente en el gráfico. Las posiciones de los residuos aleatorizados se representan con óvalos sombreados en gris.

La Figura 6 muestra un diagrama de topología del diseño de la biblioteca en Tencon27 (SEQ ID NO: 27) con una superficie alternativa A-AB-B-BC-E aleatorizada (la biblioteca TCL15). Las cadenas beta se representan como flechas con residuos de las cadenas que están unidas por enlaces de hidrógeno entre sí en la estructura tencon colocada de forma adyacente en el gráfico. Las posiciones de los residuos aleatorizados se representan con óvalos sombreados en gris.

La Figura 7 muestra distribuciones de aminoácidos esperadas y observadas en posiciones aleatorizadas en la biblioteca TCL14.

La Figura 8 muestra una alineación de secuencias de Tencon27, TCL14 y las bibliotecas diseñadas en FN10, TN3 y Fibcon con una superficie alternativa C-CD-F-FG aleatorizada. La numeración de residuos se basa en la secuencia Tencon27. Las secuencias de aminoácidos de las bibliotecas se muestran en las SEQ ID NO: 28, 98, 99 y 62, respectivamente). Los residuos de giro están encuadrados. Las regiones particulares del giro y de la cadena beta se indican encima de las secuencias.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

El término "dominio del módulo de fibronectina tipo III (FN3)" o "dominio de FN3" como se usa en la presente se refiere a un dominio que se presenta con frecuencia en proteínas que incluyen fibronectinas, tenascina, proteínas del citoesqueleto intracelular, receptores de citoquinas y enzimas procariotas (Bork y Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89, 8990-8994, 1992; Meinke et al., J Bacteriol 175, 1910-1918, 1993; Watanabe et al., J Biol Chem 265, 15659-15665, 1990). Los dominios de FN3 (o módulos) ejemplares son los 15 dominios de FN3 diferentes presentes en la tenascina C humana y los 15 dominios de FN3 diferentes presentes en la fibronectina humana (FN). Los dominios de FN3 individuales se denominan por número de dominio y nombre de proteína, por ejemplo, el 3° dominio de FN3 de tenascina (TN3) o el 10° dominio de FN3 de fibronectina (FN10).

El término "dominio de FN3 de referencia" como se usa en la presente se refiere a un dominio de FN3 de tipo salvaje o de origen no natural que se usa como plantilla en el que se realizan sustituciones para generar andamiajes de proteínas que se unen específicamente a una molécula objetivo.

El término "superficie alternativa", como se usa en la presente, se refiere a una superficie en un lado del dominio de FN3 que comprende dos o más cadenas beta y por lo menos un giro. Las superficies alternativas ejemplares son una superficie C-CD-F-FG que está formada por aminoácidos en las cadenas beta C y F y los giros CD y FG, y una superficie A-AB-B-BC-E que está formada por aminoácidos en las cadenas beta A, B y E y el giro BC.

El término "sustituir" o "sustituido" o "mutar" o "mutado" como se usa en la presente se refiere a alterar, eliminar o insertar uno o más aminoácidos o nucleótidos en una secuencia de polipéptidos o de polinucleótidos para generar una variante de esa secuencia.

El término "aleatorizar" o "aleatorizado" o "diversificado" o "diversificar" como se usa en la presente se refiere a realizar por lo menos una sustitución, inserción o deleción en una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos.

"Variante", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido o polinucleótido que difiere de un polipéptido de referencia o un polinucleótido de referencia en una o más modificaciones, por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones.

El término "se une específicamente" o "unión específica", como se usa en la presente, se refiere a la capacidad del dominio de FN3 de la invención para unirse a una molécula objetivo con una afinidad (Kd) de por lo menos 1x10-6 M, y/o unirse a una molécula objetivo con una afinidad que es por lo menos diez veces mayor que su afinidad por un antígeno no específico (por ejemplo, BSA o caseína) medida por resonancia de plasmones de superficie.

El término "molécula objetivo", como se usa en la presente, se refiere a una proteína, péptido, carbohidrato, lípido y similares que tienen un antígeno o un epítopo que es reconocido por el dominio de FN3 de la invención. La molécula objetivo puede ser de origen natural o no natural.

El término "biblioteca" se refiere a una colección de variantes. La biblioteca puede estar compuesta por variantes de polipéptidos o polinucleótidos.

El término "tenascina C", como se usa en la presente, se refiere a la tenascina C humana que tiene una secuencia que se muestra en el N° de registro de GenBank NP_002151 y en la SEQ ID NO: 57. La tenascina C tiene 15 dominios de FN3 en tándem que tienen secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO: 1-15, respectivamente. La secuencia de aminoácidos del tercer dominio de FN3 de tenascina C (TN3) se muestra en la SEQ ID NO: 3.

El término "estabilidad", como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de una molécula para mantener un estado plegado en condiciones fisiológicas de tal manera que retenga por lo menos una de sus actividades funcionales normales, por ejemplo, unirse a una molécula objetivo.

Los dominios de FN3 de la invención se unen específicamente a una molécula objetivo y, por tanto, pueden usarse ampliamente en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. La invención se basa en el descubrimiento de que una superficie alternativa en un lado del dominio de FN3 que comprende dos o más cadenas beta y por lo menos un giro puede aleatorizarse para generar y seleccionar andamiajes de proteínas que se unen específicamente a una molécula objetivo con alta afinidad. Las bibliotecas de dominios basadas en FN3 publicadas se generaron diversificando los giros superiores o inferiores, áreas que se asemejan estructuralmente a las CDR en las cadenas variables de anticuerpos, proporcionando superficies de unión curvas. En esta divulgación, las moléculas de unión de alta afinidad se seleccionan de bibliotecas de dominios de FN3 que muestran superficies de interacción cóncavas generadas aleatorizando una superficie alternativa; aumentando por tanto probablemente el número de epítopos y objetivos contra los que pueden seleccionarse andamiajes de proteínas de unión de alta afinidad. La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican los dominios de proteínas o los ácidos nucleicos complementarios de los mismos, vectores, células huésped y métodos para elaborarlos y usarlos. En la presente se divulgan métodos para hacer bibliotecas de dominios de FN3 y bibliotecas hechas por los métodos divulgados en la presente.

Dominio de fibronectina tipo III

El dominio (o módulo) de fibronectina tipo III (FN3) es un dominio de repetición prototípico identificado inicialmente en la fibronectina y que ahora se sabe que está presente en varias familias de proteínas animales, incluyendo los receptores de la superficie celular, las proteínas de la matriz extracelular, las enzimas y las proteínas musculares. Estructuralmente, los dominios de FN3 tienen una topología muy similar a la de los dominios de tipo inmunoglobulina, excepto por la falta de enlaces disulfuro. Como se sabe en la técnica, los dominios de FN3 de origen natural tienen una estructura de sándwich beta que tiene siete cadenas beta, denominadas A, B, C, D, E, F y G, enlazadas por seis giros, denominados giros AB, BC, CD, DE, EF y FG (Bork y Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89, 8990-8992, 1992; Patente de Estados Unidos N° 6.673.901). Tres giros, los giros BC, DE y FG están en la parte superior del dominio de FN3, y tres, los giros AB, CD y EF en la parte inferior del dominio (Figura 1). La Tabla 1 muestra varias proteínas que contienen dominios de FN3 y el número de dominios de FN3 diferentes asociados con cada proteína. Aunque las conformaciones del dominio de FN3 están muy conservadas, la similitud entre diferentes dominios a nivel de aminoácidos es bastante baja.

Los dominios de FN3 pueden ser de origen natural o no natural. Ejemplos de dominios de FN3 de origen no natural son un dominio de FN3 de consenso diseñado en base a una alineación de dominios de FN3 seleccionados presentes en una determinada proteína y que incorporan el aminoácido más conservado (frecuente) en cada posición para generar el dominio de FN3 no natural. Por ejemplo, un dominio de FN3 de origen no natural se diseña en base a una secuencia consenso de los 15 dominios de FN3 de la tenascina C humana, o en base a una secuencia consenso de los 15 dominios de FN3 de la fibronectina humana. Estos dominios de FN3 de origen no natural conservan la topología típica de los dominios de FN3 y pueden mostrar propiedades mejoradas como estabilidad mejorada en comparación con los dominios de FN3 de tipo salvaje. Los dominios de FN3 de origen no natural ejemplares son los dominios Tencon y Fibcon que se muestran en las SEQ ID NO: 16 y 58, respectivamente, y se describen en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2010/0216708 y la Publicación de Patente de Estados Unidos N22010/0255056.

Tabla 1.

En la Tabla 2 se muestran los residuos de aminoácidos que definen cada giro y cada cadena beta para el andamiaje de FN3 Tencon27 (SEQ ID NO: 27). Las posiciones de cada giro y cadena beta en el tercer dominio de FN3 de tenascina C (TN3) (SEQ ID NO: 3) y Fibcon (SEQ ID NO: 58) son idénticos a los de Tencon27. Los residuos de cadena beta pueden identificarse usando métodos bien conocidos, por ejemplo, mediante análisis de estructuras tridimensionales generadas por difracción de rayos X, resonancia magnética nuclear o modelado molecular. Cuando los modelos no están disponibles, puede usarse el análisis de alineaciones de secuencias con otras moléculas de FN3 conocidas para predecir los límites de las regiones de cadena y giro. Finalmente, pueden usarse algoritmos informáticos para predecir la presencia de cadenas beta a partir de secuencias primarias de proteínas.

Tabla 2.

Superficies alternativas en dominios de FN3

Los giros superiores (BC, DE y FG) e inferiores (AB, CD y EF), por ejemplo, las superficies de unión informadas en los dominios de FN3 están separadas por las cadenas beta que forman el centro de la estructura de FN3 (Figuras 1, 2A). Las superficies alternativas que residen en los dos "lados" de los dominios de FN3 que tienen formas diferentes a las de las superficies formadas solo por giros pueden visualizarse rotando la estructura del dominio de FN3 90 grados (Figuras 2B, 2C). Una superficie ligeramente cóncava está formada en un lado del dominio de FN3 por dos cadenas beta antiparalelas, las cadenas beta C y F, y los giros CD y FG, y en la presente se denomina superficie C-CD-F-FG. También se forma una superficie alternativa en el lado opuesto de la superficie C-CD-F-FG por las cadenas beta A, B y E y los giros AB y BC, denominada en la presente superficie A-AB-B-BC-E..

Las superficies alternativas en los dominios de FN3 están codificadas por tramos no contiguos de aminoácidos en cada dominio de FN3. Por ejemplo, la superficie C-CD-F-FG de Tencon27 está formada por los residuos de aminoácidos 29-43 y 65-81 de la SEQ ID NO: 27, y la superficie A-AB-B-BC-E de Tencon27 está formada por los residuos de aminoácidos 1-28 y 55-59 de la SEQ ID NO: 27, como se muestra en la Tabla 2.

Andamiajes de proteínas basados en la aleatorización de superficies alternativas

Una realización de la invención es un andamiaje de proteínas aislado que comprende un dominio de FN3 que comprende una superficie alternativa, en donde la superficie alternativa tiene por lo menos una sustitución de aminoácidos en cada cadena beta y cada giro que forma la superficie alternativa en comparación con un dominio de FN3 de referencia, y en donde el dominio de FN3 comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 27.

En otra realización, el andamiaje de proteínas de la invención se une específicamente a una molécula objetivo a la que no se une específicamente el dominio de FN3 de referencia.

En otra realización, el dominio de FN3 de referencia comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.

En otra realización, el andamiaje de proteínas de la invención comprende una superficie alternativa C-CD-F-FG formada por una cadena beta C, un giro CD, una cadena beta F y un giro FG.

En otra realización, la cadena beta C, el giro CD, la cadena beta F o el giro FG que forman la superficie alternativa C-CD-F-FG comprenden ciertas secuencias de aminoácidos como se muestra en las Tablas 4 y 5 y en las SEQ ID NO: 45-48.

En otra realización, la cadena beta C comprende una secuencia de aminoácidos DSFLIQYQE (SEQ ID NO: 33) que tiene sustituciones en 1, 2, 3 o 4 residuos, la cadena beta F comprende una secuencia de aminoácidos TEYTVSIYGV (SEQ ID NO:: 39) que tiene sustituciones en 1, 2, 3, 4 o 5 residuos, la cadena beta C y el giro CD comprenden una secuencia de aminoácidos DSFLIQYQESEKVGE (SEQ ID NO: 42) que tiene sustituciones en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos, o la cadena beta F y el giro FG comprenden una secuencia de aminoácidos TEYTVSIYGVKGGHRSN (SEQ ID NO: 43) que tiene sustituciones en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 residuos.

En otra realización, la cadena beta C y la cadena beta F comprenden una secuencia de aminoácidos por lo menos un 67% idéntica a la SEQ ID NO: 33 y por lo menos un 70% idéntica a la SEQ ID NO: 39, respectivamente, la cadena beta C y el giro CD comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 53% idéntica a la SEQ ID NO: 42, o la cadena beta F y el giro FG comprenden una secuencia de aminoácidos por lo menos un 65% idéntica a la SEQ ID NO: 43.

En otra realización, el andamiaje de proteínas de la invención comprende un dominio de FN3 que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 28.

En otra realización, el andamiaje de proteínas de la invención comprende un módulo de fibronectina de dominio tipo III (FN3) que comprende:

una cadena beta A, un giro AB, una cadena beta B, un giro BC, una cadena beta D, un giro DE, una cadena beta E, un giro EF y una cadena beta G que tienen secuencias de aminoácidos idénticas a la SEQ ID NO: 27 en los residuos 1-12, 13-16, 17-21,22-28, 44-50, 51 -54, 55-59, 60-64 y 82-89, respectivamente;

una cadena beta C y un giro CD que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos un 53% idéntica a la SEQ ID NO: 42; y

una cadena beta F y un giro FG que tienen una secuencia de aminoácidos por lo menos un 65% idéntica a la SEQ ID NO: 43, que tiene opcionalmente por lo menos una sustitución en las posiciones de aminoácidos correspondientes a los residuos de aminoácidos 11, 14, 17, 37, 46, 73 u 86 de la SEQ ID NO: 27, en donde el andamiaje de proteínas se une específicamente a una molécula objetivo a la que no se une específicamente un dominio de FN3 de referencia.

En otra realización, el andamiaje de proteínas de la invención comprende un dominio de FN3 que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a las secuencias de aminoácidos que se muestran en la SEQ ID NO: 27.

En otra realización, el andamiaje de proteínas de la invención comprende una superficie alternativa A-AB-B-BC-E formada por una cadena beta A, un giro AB, una cadena beta B, un giro BC y una cadena beta E.

En otra realización, la cadena beta A, el giro AB, la cadena beta B y el giro BC que forman la superficie alternativa A-AB-B-BC-E comprenden ciertas secuencias de aminoácidos como se muestra en las Tablas 4 y 5 y en las SEQ ID NO: 49 y 50.

En otra realización, la cadena beta A, el giro AB, la cadena beta B y el giro BC comprenden una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 59% idéntica a la SEQ ID NO: 44, y la cadena beta E comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 60% idéntica a la SEQ ID NO: 37.

En otra realización, el andamiaje de proteínas de la invención comprende un dominio de FN3 que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 61.

En otra realización, un andamiaje de proteínas aislado de la invención comprende un dominio de FN3 que comprende:

una cadena beta C, un giro CD, una cadena beta D, un giro DE, un giro EF, una cadena beta F, un giro FG y una cadena beta G que tienen secuencias de aminoácidos idénticas a la SEQ ID NO: 27 en los residuos 29-37, 38­ 43, 44-50, 51-54, 60-64, 65-74, 75-81 y 82-89, respectivamente;

una cadena beta A, un giro AB, una cadena beta B y un giro BC que tienen una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 59% idéntica a la SEQ ID NO: 44; y una cadena beta E que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 60% idéntica a la SEQ ID NO: 37, que tiene opcionalmente por lo menos una sustitución en las posiciones de aminoácidos correspondientes a los residuos de aminoácidos 11, 14, 17, 37, 46, 73, o 86 de la SEQ ID NO: 27, en donde el andamiaje de proteínas se une específicamente a una molécula objetivo a la que no se une específicamente un dominio de FN3 de referencia.

Los dominios de FN3 que se unen específicamente a una molécula objetivo pueden generarse aleatorizando un subconjunto de los residuos que forman la superficie alternativa. Por ejemplo, pueden aleatorizarse por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez residuos en cada cadena beta y cada giro contribuyendo a la superficie alternativa. Pueden aleatorizarse residuos adicionales para aumentar la diversidad de la biblioteca. Por ejemplo, pueden aleatorizarse el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de los residuos en cada cadena beta y cada giro que forma la superficie alternativa. Alternativamente, los dominios de FN3 que se unen específicamente a una molécula objetivo pueden generarse aleatorizando un subconjunto de los residuos en las cadenas beta que contribuyen a la superficie alternativa, sin aleatorizar ninguno de los giros. Por ejemplo, pueden aleatorizarse por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez residuos en cada cadena que contribuyen a la superficie alternativa. La diversidad de la biblioteca puede aumentarse aleatorizando residuos adicionales que residen en las cadenas beta. Por ejemplo, pueden aleatorizarse el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de los residuos en cada cadena beta que forma la superficie alternativa.

Las cadenas beta tienen una estructura repetitiva con la cadena lateral de cualquier otro residuo expuesto a la superficie de la proteína. Las cadenas laterales expuestas a la superficie se determinan mediante examen de estructuras tridimensionales o mediante comparación con secuencias de dominios de FN3 con estructura conocida por alineación de múltiples secuencias. Pueden elegirse para ser aleatorizados todos o un subconjunto de residuos expuestos en la superficie en las cadenas beta que contribuyan a la superficie alternativa. Por ejemplo, la superficie alternativa C-CD-F-FG de Tencon27 (SEQ ID NO: 27) tiene cuatro residuos expuestos en la superficie en la cadena beta C (S30, L32, Q34 y Q36) y cinco residuos expuestos en la superficie en la cadena beta F (E66, T68, S70, Y72 y V74), numeración de residuos en base a la SEQ ID NO: 27. Pueden aleatorizarse uno o más de estos residuos para generar una biblioteca. Los residuos en la unión de la superficie alternativa, como S30, E66 y V74 pueden aleatorizarse o no. La aleatorización de los residuos enterrados de las cadenas beta puede dar como resultado la desestabilización del andamiaje debido a la pérdida de contactos hidrófobos en el núcleo de la estructura. Los residuos enterrados pueden aleatorizarse de tal manera que solo se use un subconjunto de aminoácidos, por ejemplo, solo aminoácidos hidrófobos.

Pueden aleatorizarse un subconjunto o todos los residuos en las regiones del giro que contribuyen a la superficie alternativa. Por ejemplo, las posiciones 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 pueden sustituirse en los giros CD y/o FG que contribuyen a la superficie alternativa. Los residuos de glicina en los giros, como G42, G76 y/o G77 en Tencon27, pueden proporcionar flexibilidad y pueden aleatorizarse o no. Los residuos en los límites de la cadena beta/giro, como E43 en Tencon27, pueden aleatorizarse o no. Pueden incluirse o excluirse de la aleatorización residuos adicionales en las regiones de giro o cadena beta. Por ejemplo, los residuos que parecen ser necesarios para la estabilización identificados en base, por ejemplo, al análisis de las estructuras cristalinas de los dominios de FN3, pueden aleatorizarse o no. Por ejemplo, S80 en Tencon27 hace contacto con el núcleo del dominio de FN3 para estabilizar potencialmente el giro FG, y K75 se aleja parcialmente de la superficie alternativa. Por tanto, ambos residuos pueden excluirse del diseño inicial de la biblioteca. En una biblioteca de dominios de FN3 ejemplar que tiene una superficie C-CD-F-FG aleatorizada, los residuos que pueden aleatorizarse incluyen residuos en las posiciones 30, 32, 34, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 u 81 de la SEQ ID NO: 27. En una biblioteca de dominio de FN3 ejemplar que tiene una superficie A-AB-B-BC-E aleatorizada, los residuos que pueden aleatorizarse incluyen los residuos en las posiciones 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 55 y 57.

La diversidad en los giros que contribuyen a superficies alternativas puede lograrse mediante la inserción y/o deleciones de residuos en los giros. Por ejemplo, los giros FG y/o CD pueden extenderse en 1-22 aminoácidos o disminuirse en 1-3 aminoácidos. El giro FG en Tencon27 tiene una longitud de 7 aminoácidos, mientras que el giro correspondiente en las cadenas pesadas del anticuerpo varía entre 4 y 28 residuos. Para proporcionar la máxima diversidad, los giros que contribuyen a superficies alternativas, por ejemplo, el giro FG, pueden diversificarse en secuencia así como en longitud para que correspondan al intervalo de longitud de CDR3 del anticuerpo de 4-28 residuos.

Los dominios de FN3 resultantes que se unen específicamente a una molécula objetivo pueden modificarse adicionalmente en los residuos que residen fuera o dentro de la superficie alternativa con el propósito de, por ejemplo, mejorar la estabilidad, reducir la inmunogenicidad, mejorar la afinidad de unión, la tasa de asociación, la tasa de disociación, la vida media, la solubilidad, o cualquier otra característica adecuada. En una manera de lograr este objetivo, las proteínas del andamiaje pueden prepararse opcionalmente mediante un proceso de análisis de las secuencias originales y varios productos de ingeniería conceptual usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y modificadas. Los modelos tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias candidatas seleccionadas y pueden medir la posible inmunogenicidad (por ejemplo, programa de inmunofiltro de Xencor, Inc. de Monrovia, CA). La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata, por ejemplo, residuos que influyen en la estabilidad de la proteína del andamiaje o la capacidad de la proteína del andamiaje candidata para unirse a su molécula objetivo. De esta manera, pueden seleccionarse y combinarse los residuos a partir de las secuencias original y de referencia para lograr las características deseadas, como una estabilidad del andamiaje mejorada. Alternativamente, o además de los procedimientos anteriores, pueden usarse otros métodos de manipulación adecuados como se conoce en la técnica.

Las propiedades físicas deseables de los dominios de FN3 de la invención incluyen alta estabilidad térmica y reversibilidad del plegado y desplegado térmico. Se han aplicado varios métodos para aumentar la estabilidad térmica aparente de proteínas y enzimas, incluyendo el diseño racional basado en la comparación con secuencias termoestables altamente similares, el diseño de puentes disulfuro estabilizadores, las mutaciones para aumentar la propensión a la hélice alfa, la manipulación de puentes de sales, la alteración de la carga superficial de la proteína, evolución dirigida y composición de secuencias consenso (Lehmann y Wyss, Curr Opin Biotechnol, 12, 371-375, 2001). La alta estabilidad térmica puede aumentar el rendimiento de la proteína expresada, mejorar la solubilidad o la actividad, disminuir la inmunogenicidad y minimizar la necesidad de una cadena de frío en la fabricación.

Los residuos que pueden sustituirse para mejorar cualquier característica de los dominios de FN3 de la invención pueden determinarse realizando la sustitución y analizando las características deseadas del andamiaje. El andamiaje basado en el dominio de FN3 ejemplar con características mejoradas es el andamiaje Tencon (SEQ ID NO: 16) o el andamiaje Tencon27 (SEQ ID NO: 27) que se modifica en una o más de las posiciones de residuos de aminoácidos 11, 14, 17, 37, 46, 73 u 86.

En términos de pérdida de estabilidad, es decir, "desnaturalizar" o "desnaturalización" de una proteína, se entiende el proceso en el que parte o la totalidad de la conformación tridimensional que imparte las propiedades funcionales de la proteína se ha perdido con la consiguiente pérdida de actividad. y/o solubilidad. Las fuerzas alteradas durante la desnaturalización incluyen enlaces intramoleculares, por ejemplo, fuerzas electrostáticas, hidrófobas, de Van der Waals, enlaces de hidrógeno y disulfuros. La desnaturalización de la proteína puede estar provocada por fuerzas aplicadas a la proteína o a una solución que comprende la proteína, como fuerza mecánica (por ejemplo, fuerza de compresión o de cizallamiento), tensión térmica, osmótica, cambio de pH, campos eléctricos o magnéticos, radiación ionizante, radiación ultravioleta y deshidratación, y por desnaturalizantes químicos.

La medición de la estabilidad de la proteína y de la labilidad de la proteína pueden verse como aspectos iguales o diferentes de la integridad de la proteína. Las proteínas son sensibles o "lábiles" a la desnaturalización provocada por el calor, la radiación ultravioleta o ionizante, los cambios en la osmolaridad y el pH del ambiente si se encuentran en una solución líquida, la fuerza de cizallamiento mecánica impuesta por la filtración de tamaño de poro pequeño, la radiación ultravioleta, la radiación ionizante, como por irradiación gamma, deshidratación química o térmica, o cualquier otra acción o fuerza que pueda provocar la alteración de la estructura de la proteína. La estabilidad de la molécula puede determinarse usando métodos estándar. Por ejemplo, la estabilidad de una molécula puede determinarse midiendo la temperatura de fusión térmica ("TM"), la temperatura en° Celsius (° C) a la que se desdobla la / de las moléculas, usando métodos estándar. Típicamente, cuanto más alta sea la TM, más estable será la molécula. Además del calor, el ambiente químico también cambia la capacidad de la proteína para mantener una estructura tridimensional particular.

En una realización, los dominios de FN3 de la invención muestran una mayor estabilidad en por lo menos un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% o más en comparación con el mismo dominio antes de la manipulación medido por el aumento en la TM.

La desnaturalización química también puede medirse mediante una variedad de métodos. Los desnaturalizantes químicos incluyen clorhidrato de guanidinio, tiocianato de guanidinio, urea, acetona, solventes orgánicos (DMF, benceno, acetonitrilo), sales (sulfato de amonio, bromuro de litio, cloruro de litio, bromuro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de sodio); agentes reductores (por ejemplo, ditiotreitol, beta-mercaptoetanol, dinitrotiobenceno e hidruros, como borohidruro de sodio), detergentes iónicos y no iónicos, ácidos (por ejemplo, ácido clorhídrico (HCl), ácido acético (CH³COOH), ácidos acéticos halogenados), moléculas hidrófobas (por ejemplo, fosfolípidos) y desnaturalizantes dirigidos. La cuantificación de la extensión de la desnaturalización puede depender de la pérdida de una propiedad funcional, como la capacidad de unirse a una molécula objetivo, o de propiedades fisicoquímicas, como la tendencia a la agregación, la exposición de residuos anteriormente inaccesibles al solvente o la alteración o formación de enlaces disulfuro.

En una realización, los andamiajes de la invención muestran una mayor estabilidad en por lo menos un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% o más en comparación con el mismo andamiaje antes de la manipulación medido usando clorhidrato de guanidinio como desnaturalizante químico. El aumento de la estabilidad puede medirse en función de la disminución de la fluorescencia del triptófano tras el tratamiento con concentraciones crecientes de clorhidrato de guanidina usando métodos bien conocidos.

Los dominios de FN3 que se unen específicamente a una molécula objetivo de la invención pueden generarse usando cualquier dominio de FN3 como plantilla para las sustituciones de acuerdo con los métodos proporcionados en la misma. Los dominios de FN3 ejemplares que tienen superficies alternativas aleatorizadas son el tercer dominio de FN3 de tenascina C (TN3) (SEQ ID NO: 3), Tencon (SEQ ID NO: 16), Tencon27 (SEQ ID NO: 27), Fibcon (SEQ ID NO: 58), y el décimo dominio de FN3 de fibronectina (FN10) (SEQ iD NO: 97). Las posiciones de aminoácidos que delimitan las superficies alternativas en Tencon27 se muestran en la Tabla 2 y la Figura 8, y son idénticas en secuencia lineal a Tencon, TN3 y Fibcon. Las posiciones de aminoácidos que delimitan la superficie alternativa en FN10 se muestran en la Figura 8. Los residuos que forman las superficies alternativas en otros dominios de FN3 pueden identificarse mediante el examen de estructuras tridimensionales cuando estén disponibles o mediante el análisis de alineaciones de secuencias de dominios de FN3 mediante métodos bien conocidos.

Los dominios de FN3 de la invención pueden generarse como monómeros, dímeros o multímeros, por ejemplo, como un medio para aumentar la valencia y, por tanto, la avidez de la unión de la molécula objetivo, o para generar andamiajes biespecíficos o multiespecíficos que se unen simultáneamente dos o más moléculas objetivo. Los dímeros y multímeros pueden generarse enlazando andamiajes de proteínas monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos, por ejemplo, mediante la inclusión de un conector de aminoácidos, por ejemplo, un conector que contiene poliglicina, glicina y serina, o alanina y prolina. El uso de conectores peptídicos tanto de origen natural como artificiales para conectar polipéptidos en nuevos polipéptidos de fusión enlazados es bien conocido en la bibliografía (Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; Patente de Estados Unidos N° 5.856.456).

Los dominios de FN3 de la presente invención pueden usarse como moléculas biespecíficas en donde la primera superficie alternativa en un dominio tiene especificidad por una primera molécula objetivo y la segunda superficie alternativa en el mismo dominio tiene especificidad por una segunda molécula objetivo. Un dominio de proteínas biespecífico ejemplar es una variante de Tencon27 que se une a una primera molécula objetivo en la superficie C-CD-F-FG y a una segunda molécula objetivo en la superficie A-AB-B-BC-E.

Los dominios de FN3 de la presente invención pueden incorporar otras subunidades, por ejemplo, mediante interacción covalente. Puede unirse toda o una parte de una región constante de anticuerpo al dominio de FN3 para impartir propiedades similares a las de un anticuerpo, especialmente aquellas propiedades asociadas con la región Fc, por ejemplo, actividad del complemento, vida media, etc. Por ejemplo, pueden proporcionarse y/o controlarse las funciones efectoras de Fc como unión a C1q, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión al receptor de Fc, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis, regulación por disminución de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. mediante la modificación de residuos en el Fc responsable de estas actividades (para una revisión, consultar Strohl, Curr Opin Biotechnol. 20, 685-691,2009).

Pueden incorporarse fracciones adicionales en los dominios de FN3 de la invención, como conjugados de toxinas, albúmina o aglutinantes de albúmina, moléculas de polietilenglicol (PEG), como PEG5000 o PEG20.000, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos de diferentes longitudes de cadena, por ejemplo laurato, miristato, estearato, araquidato, behenato, oleato, araquidonato, ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico y similares, polilisina, octano, carbohidratos (dextrano, celulosa, oligo- o polisacáridos) para las propiedades deseadas. Estas fracciones pueden ser fusiones directas con las secuencias codificantes del andamiaje de proteínas y pueden generarse mediante técnicas de clonación y expresión estándar. Alternativamente, pueden usarse métodos de acoplamiento químico bien conocidos para unir las fracciones a los dominios de FN3 de la invención producidos recombinantemente.

La funcionalidad de los dominios de FN3 que incorporan fracciones adicionales puede compararse mediante varios ensayos bien conocidos. Por ejemplo, las propiedades alteradas del dominio de FN3 debidas a la incorporación de dominios Fc y/o variantes del dominio Fc pueden analizarse en ensayos de unión al receptor Fc usando formas solubles de los receptores, como los receptores FcyRI, FcyRII, FcyRIII o FcRn, o usando ensayos basados en células bien conocidos que miden, por ejemplo, ADCC o CDC, o evaluando las propiedades farmacocinéticas del andamiaje de proteínas en modelos in vivo.

Generación y producción de proteínas de dominios de FN3

En la presente se divulga un método para elaborar una biblioteca de dominios de FN3 que comprenden una superficie alternativa, en donde la superficie alternativa tiene por lo menos una sustitución de aminoácidos en comparación con un dominio de FN3 de referencia, que comprende: proporcionar un polinucleótido que codifica un dominio de FN3 de referencia; generar una biblioteca de secuencias de polinucleótidos del dominio de FN3 de referencia aleatorizando la superficie alternativa; traducir la biblioteca in vitro o expresar la biblioteca en un huésped.

Un caso de la divulgación es un método para elaborar una biblioteca de dominios de FN3 que tienen una superficie alternativa C-CD-F-FG diversificada formada por una cadena beta C, un giro CD, una cadena beta F y un giro FG, que comprende proporcionar un polipéptido del dominio de FN3 de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos un 90% idéntica a la de la SEQ ID NO: 27; introducir la diversidad en el polipéptido del dominio de FN3 de referencia mutando por lo menos un residuo de cadena beta C y por lo menos un residuo de cadena beta F para formar la biblioteca de dominios de FN3 que tiene la superficie alternativa C-CD-F-FG diversificada.

En los métodos para elaborar la biblioteca de la divulgación, pueden mutarse 1, 2, 3 o 4 residuos en la cadena beta C con la condición de que no se mute S30 (numeración de residuos de acuerdo con la SEQ ID NO: 27).

En los métodos para elaborar la biblioteca de la divulgación pueden mutarse, los residuos L32, Q34 y Q36 de la cadena beta C (numeración de residuos de acuerdo con la SEQ ID NO: 27).

En los métodos para elaborar la biblioteca de la divulgación, pueden mutarse 1, 2, 3 o 4 residuos en la cadena beta F con la condición de que no se mute E66 (numeración de residuos de acuerdo con la SEQ ID NO: 27).

En los métodos para elaborar la biblioteca de la divulgación, pueden mutarse los residuos T68, S70 e Y72 de la cadena F-beta (numeración de residuos de acuerdo con la SEQ ID NO: 27).

En los métodos para elaborar la biblioteca de la divulgación, pueden mutarse 1, 2, 3 o 4 residuos en los residuos del giro CD con la condición de que no se muten G42 y E43 (numeración de residuos de acuerdo con la SEQ ID NO: 27).

En los métodos para elaborar la biblioteca de la divulgación, pueden mutarse los residuos S38, E39, K40 y V41 en el giro CD.

En los métodos para elaborar la biblioteca de la divulgación, pueden mutarse 1, 2, 3 o 4 residuos en el giro FG con la condición de que no se muten los residuos K75, G76, G77 y S80 (numeración de residuos de acuerdo con la SEQ ID NO: 27).

En los métodos para elaborar la biblioteca de la divulgación, pueden mutarse los residuos H78, R79 y N81 en el giro FG (numeración de residuos de acuerdo con la SEQ ID NO: 27).

En los métodos para elaborar la biblioteca de la divulgación, el dominio de FN3 de referencia comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, que comprende opcionalmente por lo menos una sustitución en las posiciones de aminoácidos 11, 14, 17, 37, 46, 73 o 86.

En los métodos de la divulgación pueden usarse otros dominios de FN3 de referencia, como Tencon (SEQ ID NO: 16) o variantes del mismo como se muestra en las SEQ ID NO: 17-26 y en la Tabla 3.

Otro caso de la divulgación es una biblioteca producida por los métodos de la divulgación.

La generación de las proteínas de andamiaje, los dominios (o módulos) de FN3 de la invención, se logra típicamente a nivel de ácidos nucleicos. Las bibliotecas de los dominios de FN3 de la invención que tienen codones sustituidos en uno o más residuos específicos pueden sintetizarse, por ejemplo, usando métodos de clonación por PCR estándar, o síntesis génica química de acuerdo con los métodos descritos en la Patente de Estados Unidos N° 6.521.427 y la Patente de Estados Unidos N° 6.670.127. Los codones pueden aleatorizarse usando métodos bien conocidos, por ejemplo, oligonucleótidos degenerados que se ajustan a la diversidad diseñada, o usando mutagénesis de Kunkel (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154, 367-382, 1987).

Las bibliotecas pueden aleatorizarse en codones elegidos usando un conjunto de aminoácidos aleatorio o definido. Por ejemplo, las variantes en la biblioteca que tienen sustituciones aleatorias pueden generarse usando codones NNK, que codifican los 20 aminoácidos de origen natural. En otros esquemas de diversificación, pueden usarse codones DVK para codificar los aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly y Cys. Alternativamente, pueden usarse codones NNS para dar lugar a los 20 residuos de aminoácidos y reducir simultáneamente la frecuencia de los codones de parada. Las designaciones de codones son de acuerdo con el código IUB bien conocido.

Los dominios de FN3 de la invención, como cualquier otra proteína, son propensos a una variedad de inestabilidades físicas y/o químicas, lo que da como resultado efectos adversos en el procesamiento en sentido descendente. Por ejemplo, la inestabilidad física y química puede provocar agregación, degradación, rendimiento reducido del producto, pérdida de potencia, potencial aumentado de inmunogenicidad, heterogeneidad molecular y pérdida de actividad. Por tanto, la presencia de posibles residuos inductores de inestabilidad y secuencias de reconocimiento puede minimizarse durante el diseño de las bibliotecas. Por ejemplo, la metionina y el triptófano expuestos en la superficie pueden oxidarse en las condiciones de almacenamiento, lo que posiblemente lleve a una pérdida de la potencia del andamiaje de proteínas. La presencia de asparagina, además de contribuir a los bien conocidos sitios de reconocimiento de N-glicosilación (NXS/T), puede desamidarse cuando le sigue la glicina, posiblemente generando heterogeneidad (Robinson, Proc Natl Acad Sci USA, 99, 5283-5288, 2002). Por tanto, algunos o todos estos aminoácidos pueden omitirse o no de la mezcla usada para aleatorizar la posición seleccionada. Además, pueden omitirse la cisteína y la prolina para minimizar la formación de puentes disulfuro y la alteración de las láminas beta.

Las bibliotecas de dominios de FN3 con distribución de aminoácidos desplazada en las posiciones que se van a diversificar pueden sintetizarse, por ejemplo, usando la tecnología Slonomics® (http:_//www_sloning_com). Esta tecnología usa una biblioteca de tripletes de doble cadena prefabricados que actúan como bloques de construcción universales suficientes para miles de procesos de síntesis génica. La biblioteca de tripletes representa todas las combinaciones de secuencias posibles necesarias para construir cualquier molécula de ADN deseada.

La síntesis de oligonucleótidos con "degeneración" de nucleótidos seleccionada en ciertas posiciones es bien conocida en la técnica, por ejemplo, el enfoque TRIM (Knappek et al., J Mol Biol 296, 57-86, 1999; Garrard & Henner, Gene 128, 103-109, 1993). Tales conjuntos de nucleótidos que tienen ciertos conjuntos de codones pueden sintetizarse usando reactivos y aparatos de nucleótidos o nucleósidos disponibles comercialmente.

En un esquema de diversificación ejemplar, los residuos L32, Q34 y Q36 del dominio de FN3 de Tencon27 (SEQ ID NO: 27) en la cadena beta C, S38, E39, K40 y V41 en el giro CD, T68, S70 e Y72 en la cadena beta F, y H78, R79 y N81 en el giro FG se aleatorizan con codones NNS.

Para clonar las bibliotecas en un vector o sintetizar casetes de ADNc de doble cadena de la biblioteca, para expresar o traducir las bibliotecas in vitro se usan técnicas estándar de clonación y expresión. Por ejemplo, puede usarse la presentación en cis para ligar fragmentos de ADN que codifican las proteínas de andamiaje a un fragmento de ADN que codifica RepA para generar un grupo de complejos proteína-ADN formados después de la traducción in vitro en donde cada proteína está asociada de manera estable con el ADN que la codifica (Patente de Estados Unidos N° 7.842.476; Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA 101,2806-2810, 2004). Pueden usarse otros métodos, por ejemplo, presentación de ribosomas (Hanes and Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 4937-4942, 1997), presentación de ARNm (Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297-12302, 1997), u otros sistemas libres de células (Patente de Estados Unidos N° 5.643.768). Las bibliotecas de andamiajes de proteínas pueden expresarse como proteínas de fusión presentadas en la superficie, por ejemplo, de cualquier bacteriófago adecuado. Los métodos para presentar polipéptidos de fusión en la superficie de un bacteriófago son bien conocidos (Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2011/0118144; Publicación de Patente Internacional N° WO2009/085462; Patente de Estados Unidos N° 6.969.108; Patente de Estados Unidos N° 6.172.197; Patente de Estados Unidos N° 5.223.409; Patente de Estados Unidos N° 6.582.915; Patente de Estados Unidos N° 6.472.147).

Selección

La selección de dominios de FN3 de proteínas modificados o bibliotecas de variantes de dominios de FN3 modificadas para la unión específica a moléculas objetivo puede lograrse, por ejemplo, produciendo la biblioteca usando la presentación en cis como se describe en los ejemplos y en Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 2806-2810, 2004, y analizando la biblioteca para la unión específica a una molécula objetivo mediante cualquier método conocido en la técnica. Los ejemplos de métodos bien conocidos que pueden usarse son ELISA, inmunoensayos en sándwich y ensayos competitivos y no competitivos (ver, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York).

Los dominios de FN3 de la invención pueden unirse a proteínas humanas o de otros mamíferos con una amplia variedad afinidades (K^d). Típicamente, un dominio de FN3 de la presente invención puede unirse a una proteína objetivo con una K^d igual o inferior a aproximadamente 10^-7 M, 10^-8 M, 10^-9 M, 10^-10M, 10^-11 M, 10^-12 M, 10^-13 M, 10^-14 M o 10^-15 M según se determina por resonancia de plasmones superficiales o el método Kinexa, según los practican los expertos en la técnica. La afinidad de un dominio de FN3 por un antígeno puede determinarse experimentalmente usando cualquier método adecuado. (Ver, por ejemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions", en Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press: Nueva York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: Nueva York, NY (1992); y los métodos descritos en la presente). La afinidad medida de una interacción antígeno-dominio de FN3 particular puede variar si se mide en diferentes condiciones (por ejemplo, osmolaridad, pH). Por tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión a antígeno (por ejemplo, K^d, Kon, Koff) se realizan preferiblemente con soluciones estandarizadas de andamiaje de proteínas y antígeno, y un tampón estandarizado, como el tampón descrito en la presente.

Moléculas y vectores de ácidos nucleicos

La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican los dominios de FN3 de la invención como polinucleótidos aislados o como porciones de vectores de expresión o como porciones de secuencias de ADN lineal, incluyendo las secuencias de ADN lineal usadas para la transcripción/traducción in vitro, vectores compatibles con expresión de fagos procariotas, eucariotas o filamentosos de fagos, secreción y/o presentación de las composiciones o mutágenos dirigidos de las mismas. En la presente se divulgan ciertos polinucleótidos ejemplares, sin embargo, también están dentro del alcance de la invención otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o las preferencias de codones en un sistema de expresión dado, codifican los andamiajes de proteínas y las bibliotecas de los andamiajes de proteínas de la invención.

Los polinucleótidos de la invención pueden producirse mediante síntesis química como síntesis de polinucleótidos en fase sólida en un sintetizador de polinucleótidos automatizado y ensamblarse en moléculas completas de cadena sencilla o doble. Alternativamente, los polinucleótidos de la invención pueden producirse mediante otras técnicas como una PCR seguido de clonación rutinaria. Las técnicas para producir u obtener polinucleótidos de una secuencia conocida dada son bien conocidas en la técnica.

Los polinucleótidos de la invención pueden comprender por lo menos una secuencia no codificante, como una secuencia promotora o potenciadora, un intrón, una señal de poliadenilación, una secuencia cis que facilita la unión a RepA y similares. Las secuencias de polinucleótidos también pueden comprender secuencias adicionales que codifican aminoácidos adicionales que codifican, por ejemplo, un marcador o una secuencia etiqueta como una etiqueta de histidina o una etiqueta de HA para facilitar la purificación o detección de la proteína, una secuencia señal, una proteína de fusión asociada como RepA, Fc o proteína de cubierta de bacteriófago como pIX o pIII. Un polinucleótido ejemplar comprende secuencias para un promotor Tac, secuencias que codifican la biblioteca de dominios de FN3 y repA, el elemento cis y un origen bacteriano de replicación (ori). Otro polinucleótido ejemplar comprende una secuencia señal pelB u ompA, proteína de cubierta de bacteriófagos pIII o pIX, dominio de FN3 y un sitio poliA. En la SEQ ID NO: 100 y 101, respectivamente, se muestran los polinucleótidos ejemplares que codifican la biblioteca TCL14 y Tencon27.

Otra realización de la invención es un vector que comprende por lo menos un polinucleótido de la invención. Tales vectores pueden ser vectores plasmídicos, vectores virales, vectores para la expresión de baculovirus, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción de los polinucleótidos de la invención en un organismo dado o trasfondo genético por cualquier medio. Tales vectores pueden ser vectores de expresión que comprenden elementos de secuencias de ácidos nucleicos que pueden controlar, regular, provocar o permitir la expresión de un polipéptido codificado por dicho vector. Tales elementos pueden comprender sitios de unión a potenciadores transcripcionales, sitios de iniciación de ARN polimerasa, sitios de unión a ribosomas y otros sitios que facilitan la expresión de polipéptidos codificados en un sistema de expresión dado. Tales sistemas de expresión pueden ser sistemas basados en células o libren células bien conocidos en la técnica.

Selección de células huésped o manipulación de células huésped

Un dominio de FN3 de la presente invención puede producirse opcionalmente por una línea celular, una línea celular mixta, una célula inmortalizada o una población clonal de células inmortalizadas, como es bien conocido en la técnica. Ver, por ejemplo, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow y Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).

La célula huésped elegida para la expresión puede ser de origen mamífero o puede seleccionarse células COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, de mieloma, linfoma, levadura, insecto o planta, o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de las mismas. Alternativamente, la célula huésped puede seleccionarse de una especie u organismo incapaz de glicosilar polipéptidos, por ejemplo, una célula u organismo procariota, como BL21, BL21(DE3), BL21-GOLD(DE3), XL1-Blue, JM109, HMS174, HMS174 (DE3) y cualquiera de las cepas naturales o manipuladas de E. coli spp, Klebsiella spp. o Pseudomonas spp.

Usos de los Dominios de FN3 de la Invención

Las composiciones de las moléculas basadas en el dominio (módulo) de FN3 descritas en la presente y generadas mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente pueden usarse para diagnosticar, monitorizar, modular, tratar, aliviar, ayudar a prevenir la incidencia o reducir los síntomas de enfermedades o patologías específicas humanas en células, tejidos, órganos, fluidos o, en general, un huésped. Puede usarse un dominio de FN3 manipulado para un propósito específico para tratar una enfermedad inmunomediada o de inmunodeficiencia, una enfermedad metabólica, un trastorno o enfermedad cardiovascular; una enfermedad maligna; un trastorno o enfermedad neurológica; una infección como una infección bacteriana, viral o parasitaria; u otra afección relacionada conocida o especificada que incluye hinchazón, dolor y necrosis o fibrosis tisular.

Dicho método puede comprender administrar una cantidad eficaz de una composición o una composición farmacéutica que comprende por lo menos un dominio de FN3 que se une específicamente a una molécula objetivo de una célula, tejido, órgano, animal o paciente con necesidad de tal modulación, tratamiento, alivio, prevención, o reducción de síntomas, efectos o mecanismos. La cantidad eficaz puede comprender una cantidad de aproximadamente 0,001 a 500 mg/kg por administración única (por ejemplo, bolo), múltiple o continua, o para lograr una concentración sérica de 0,01-5000 pg/ml por administración única, múltiple o continua, o cualquier intervalo o valor eficazo en la misma, como se hace y determina usando métodos conocidos, como se describe en la presente o se conoce en las técnicas relevantes.

Composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas basadas en dominiose de FN3

Los dominios de FN3 que se unen específicamente a moléculas objetivo que son monómeros, dímeros o multímeros modificados o no modificados, mono-, bi- o multiespecíficos, pueden aislarse usando procedimientos de separación bien conocidos en la técnica para la captura, inmovilización, división o sedimentación, y purificado en la medida necesaria para su aplicabilidad comercial.

Para uso terapéutico, los dominios de FN3 que se unen específicamente a una molécula objetivo pueden prepararse como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del dominio de FN3 como ingrediente activo en un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto activo. Tales vehículos pueden ser líquidos, como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, puede usarse solución salina al 0,4% y glicina al 0,3%. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de partículas. Pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales y bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas como agentes tamponadores y de ajuste del pH, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración del agente de la invención en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente el 0,5%, habitualmente al o por lo menos aproximadamente el 1% hasta tanto como el 15 o el 20% en peso y se seleccionará principalmente en base a la dosis, los volúmenes de fluido, las viscosidades, etc. requeridos, de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Los vehículos y formulaciones adecuados, incluidas otras proteínas humanas, por ejemplo, albúmina sérica humana, se describen, por ejemplo en, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Parte 5, Pharmaceutical Manufacturing pág. 691-1092, Ver especialmente las págs. 958-989.

El modo de administración para el uso terapéutico de los dominios de FN3 que se unen específicamente a una molécula objetivo puede ser cualquier vía adecuada que suministre el agente al huésped, como la administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea, pulmonar; transmucosal (oral, intranasal, intravaginal, rectal); usando una formulación en un comprimido, cápsula, solución, polvo, gel, partícula; y contenida en una jeringuilla, un dispositivo implantado, bomba osmótica, cartucho, microbomba; u otros medios apreciados por el experto en la técnica, como son bien conocidos en la técnica. La administración en un sitio específico puede lograrse, por ejemplo, por administración intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelosa, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intracardíaca, intraósea, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravascular, intravesical, intralesional, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmica.

Aunque se ha descrito la invención en términos generales, se divulgarán adicionalmente en los siguientes las realizaciones de la invención ejemplos que no deben interpretarse como limitativas del alcance de las reivindicaciones.

EJEMPLO 1. Andamiaje Tencon

Diseño Tencon

El tercer módulo de fibronectina del dominio de tipo III (Fn3) de la tenascina C humana (SEQ ID NO: 3) puede usarse como un andamiaje de proteínas que puede manipularse para que se una a moléculas objetivo específicas. La temperatura de fusión de este dominio es de 54° C en PBS en su forma nativa.

Para producir un andamiaje de proteínas con una estructura similar y propiedades físicas mejoradas, como una estabilidad térmica mejorada, se diseñó una secuencia de consenso basada en una alineación de 15 dominios de FN3 de tenascina C humana (que se muestra en las SEQ ID NO: 1-15). Los 15 dominios de FN3 seleccionados tienen identidades de secuencia entre sí que varían desde el 13 al 80%, con una identidad de secuencia media entre pares del 29%. Se diseñó una secuencia de consenso designada como Tencon (SEQ ID NO: 16) incorporando el aminoácido más conservado (frecuente) en cada posición (ver Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2010/0216708). En alineaciones por pares, Tencon es idéntico a los dominios de FN3 de tenascina C en el 34-59% de las posiciones con una identidad de secuencia media del 43%.

Expresión y purificación de Tencon

La secuencia de aminoácidos de Tencon se retrotradujo, dando como resultado la secuencia de ADNc que se muestra en la SEQ ID NO: 59. El ADNc se amplificó y se clonó en el vector pET15 modificado usando métodos de rutina. La proteína se expresó como una proteína de fusión His6 C-terminal en forma soluble en E. coli, y se purificó usando agarosa Ni-NTA estándar usando elución en imidazol 500 mM. Las fracciones deseadas se agruparon y dializaron en PBS pH 7,4. Como segundo paso de purificación, la proteína se cargó en una columna Superdex-75 HiLoad 16/60 (GE Healthcare) equilibrada en PBS. Las fracciones que contenían Tencon se combinaron y concentraron usando un concentrador Centriprep UltraCel YM-3 (Amicon). El análisis SDS-PAGE mostró que Tencon migra entre 6 y 14 kDa, de acuerdo con la masa esperada de 10,7 kDa para la proteína monomérica. Se obtuvo un rendimiento de >50 mg de proteína Tencon pura por litro de cultivo.

Caracterización biofísica de Tencon

La estructura y estabilidad de Tencon se caracterizó por espectroscopía de dicroísmo circular (CD) y calorimetría diferencial de barrido (DSC). Las mediciones de CD se realizaron en un espectrómetro AVIV a 20° C en PBS y una concentración de 0,2 mg/ml. El espectro mostró un mínimo a 218 nm, lo que sugiere una estructura de hoja beta como se esperaba para una proteína perteneciente a la familia FN3. Los datos de DSC se obtuvieron calentando soluciones de 0,5 mg/ml del tercer dominio de FN3 de tenascina C (TN3) o Tencon en PBS de 35° C a 95° C a una tasa de 1° C/minuto en un calorímetro N-DSCII (Applied Thermodynamics). A partir de estos datos, se calcularon temperaturas de fusión de 54° C y 78° C para TN3 y Tencon, respectivamente, usando el software CpCalc (Applied Thermodynamics). El plegamiento y despliegue de ambos dominios es reversible a estas temperaturas. Por tanto, el andamiaje Tencon generado demuestra una estabilidad térmica mejorada en comparación con el de TN3. En base a este aumento de la estabilidad, es probable que el andamiaje Tencon sea más susceptible a la sustitución de aminoácidos y más fácil de fabricar. Es probable que las mutaciones que disminuyen la estabilidad de la proteína sean mejor toleradas en el contexto de un andamiaje más estable y, por tanto, es probable que un andamiaje con estabilidad mejorada produzca aglutinantes bien plegados más funcionales a partir de una biblioteca de variantes de anfamiajes.

Presentación de Tencon en fago M13

El ADNc (SEQ ID NO: 59) que codifica la secuencia de aminoácidos de Tencon se subclonó en el vector de expresión fagémido pPep9 (Publicación de Patente Internacional N° WO2008/079973) mediante PCR estándar y clonación de digestión de restricción, lo que da como resultado el vector pTencon-pIX. Este vector expresa Tencon etiquetado con Myc N-terminalmente como una fusión C-terminal al extremo N-terminal de la proteína pIX del bacteriófago M13 bajo el promotor Lac (permitiendo niveles más bajos de expresión sin IPTG y expresión aumentada después de la adición de IPTG) utilizando la secuencia señal OmpA. Se insertó un conector TSGGGGS corto (SEQ ID NO: 60) entre Tencon y pIX para evitar interacciones estéricas entre estas proteínas.

Para confirmar la presentación en la superficie de la partícula del fago M13, se cultivaron transformantes de una sola colonia de pTencon-pIX en XL1-Blue E. coli a 37° C hasta alcanzar la fase logarítmica media y se rescataron con 610 pfu de fago auxiliar VCSM13. Los sobrenadantes se recogieron de los cultivos rescatados después de 16 horas de expansión en medio 2YT suplementado con ampicilina seguido de inducción con IPTG 1 mM, se centrifugaron a 4000 X g durante 20 minutos y se almacenaron a 4° C para su análisis.

Se usó la unión de las partículas de fago a un anticuerpo anti-Myc (Life Technologies, Carlsbad, CA) para confirmar la presentación del constructo Myc-Tencon en la superficie del fago M13. Se recubrió una placa Maxisorp durante la noche a una concentración de 2,5 pg/ml con un anticuerpo anti-Myc o anti-av (control negativo) y se bloqueó con SuperBlock T20 (Thermo Scientific, Rockford IL). Se realizaron diluciones en serie dobles del sobrenadante del cultivo fagémido descrito anteriormente en PBS y se añadieron a los pocillos de la placa recubierta. Después de 1 hora, la placa se lavó con TBST y se añadió un anticuerpo anti-M13 HRP a cada pocillo y se lavó con TBST después de una incubación de 1 hora. Se añadió el sustrato Roche BD ELISA POD y se detectó la luminiscencia en un lector de placas Tecan

EJEMPLO 2: Mutaciones estabilizadoras en Tencon

Se han descrito bibliotecas de Tencon, FG7 y BC6/FG7, diseñadas para introducir diversidad en los giros FG y FG y BC simultáneamente (Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2010/0255056; Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2010/0216708).

Diseño de variantes

Se diseñaron mutantes para mejorar la estabilidad de plegamiento de Tencon (SEQ ID NO: 16). Se realizaron varias mutaciones puntuales para producir la sustitución de residuos individuales de la SEQ ID NO: 16, como N46V (Tencon17; SEQ ID NO: 17), E14P (Tencon18; SEQ ID NO: 18), E11N (Tencon19; SEQ ID NO: 19), E37P (Tencon20; SEQ ID NO: 20) y G73Y (Tencon21; SEQ ID NO: 21) que se predijo que mejorarían la estabilidad del andamiaje mediante el programa PoPMuSiC v2.0 (Dehouck et al., Bioinformatics, 25, 2537-2543, 2009). Se había descubierto previamente que el mutante E86I (Tencon22; SEQ ID NO: 22) estabilizaba una proteína homóloga, el tercer dominio de FN3 de la tenascina C humana (WO2009/086116). Se descubrió que la mutación L17A (Tencon26; SEQ ID NO: 26) estabilizaba significativamente Tencon durante los experimentos de escaneo de alanina en los que todos los residuos de giro de Tencon se reemplazaron con alanina de forma independiente (datos no mostrados). Después de una ronda inicial de ensayos de estabilidad, se produjeron los mutantes combinatorios N46V/E86I (Tencon23; SEQ ID NO: 23), E14P/N46V/E86I (Tencon24; SEQ ID NO: 24) y L17A/N46V/E86I (Tencon25; SEQ ID NO: 24) NO:25) para aumentar aún más la estabilidad.

Expresión y purificación

Las mutaciones en la secuencia codificante de Tencon se realizaron usando un kit de mutagénesis QuikChange (Stratagene), y las proteínas mutantes se expresaron y purificaron usando protocolos estándar como proteínas de fusión HIS6. Las proteínas se eluyeron de columnas Ni-NTA (Novagen) en fosfato de sodio 50 mM pH 7,4, NaCl 500 mM e imidazol 250 mM. Después de la elución, las proteínas se dializaron en PBS pH 7,4.

Caracterización de la estabilidad Térmica

Se midieron las estabilidades térmicas de Tencon y de cada proteína mutante en pBS pH 7,4 (2-3 mg/ml) mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) capilarmente. Se midieron las temperaturas de fusión para estas muestras usando un instrumento VP-DSC equipado con un muestreador automático (MicroCal, LLC). Las muestras se calentaron de 10° C a 95° C o 100° C a una tasa de 1° C por minuto. Se completó un escaneo de solo tampón entre cada escaneo de muestra para calcular un valor de referencia para la integración. Los datos se ajustaron a un modelo de despliegue de dos estados después de la resta de la señal de solo tampón. La reversibilidad de la desnaturalización térmica se determinó repitiendo el escaneo para cada muestra sin retirarla de la celda. La reversibilidad se calculó comparando el área bajo la curva del primer escaneo con el segundo escaneo. Los resultados de los experimentos de DSC se presentan en la Tabla 3 como los valores derivados de las curvas de fusión completas (Tm (Kcal)). Los mutantes individuales Tencon17, Tencon18, Tenconl9 y Tencon22 tenían una estabilidad térmica mejorada en comparación con la secuencia de Tencon original. Solo Tencon21 fue significativamente desestabilizador. Los mutantes combinatorios Tencon23, Tencon24 y Tencon25 y todos tenían una mejora significativamente mayor de la estabilidad, lo que indica que las mutaciones diseñadas son aditivas con respecto a la mejora de la estabilidad térmica.

Desnaturalización por clorhidrato de guanidina

Se usaron las capacidades de Tencon y de cada muíante para permanecer plegados tras el tratamiento con concentraciones crecientes de clorhidrato de guanidina (GdmCl) medido por fluorescencia de triptófano para evaluar la estabilidad. Tencon contiene solo un residuo de triptófano. El residuo de triptófano está enterrado dentro del núcleo hidrófobo y, por tanto, la emisión de fluorescencia a 360 nm es una medida sensible del estado plegado de esta proteína. Se pipetearon 200 gl de una solución que contenía fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM y concentraciones variables de GdmCl de 0,48 a 6,63 M, en placas negras que no se unen de 96 pocillos (Greiner), para producir una titulación de 17 puntos. Se añadieron 10 gl de una solución que contenía los mutantes de Tencon a cada pocillo de la placa para obtener una concentración de proteína final de 23 gM y se mezcló pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 24 horas, se leyó la fluorescencia utilizando un lector de placas Spectramax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) con excitación a 280 nm y emisión a 360 nm. La señal de fluorescencia se convirtió en fracción desplegada usando la ecuación (Pace, Methods Enzymol 131:, 266-280, 1986):

^{/« =} (jF-y)/(yF-¥u)

Donde yF es la señal de fluorescencia de la muestra plegada e yu de la muestra desplegada. Los puntos medios de la transición de despliegue y la pendiente de la transición se determinaron ajustando la siguiente ecuación (Clarke et al., 1997)

„ (« * jfiWM)

r = ------------------------

Donde F es la fluorescencia a la concentración de desnaturalizante dada, aN y aD son las intersecciones con el eje y del estado nativo y desnaturalizado, @ⁿ y @^d son las pendientes de los valores de referencia para el estado nativo y desnaturalizado, [D] es la concentración de GdmCl, [D]50% la concentración de GdmCl en cuyo punto se desnaturaliza el 50% de la muestra, m la pendiente de la transición, R la constante del gas y T la temperatura. La energía libre de plegamiento para cada muestra se estimó usando la ecuación (Pace 1986 supra; Clarke et al., J Mol Biol 270, 771-778, 1997): AG = m[D]5ü%

A menudo es difícil medir con precisión la pendiente de la transición, m, para tales curvas. Además, no se espera que las mutaciones descritas aquí alteren el mecanismo de plegamiento de tencon. Por tanto, se midió el valor de m para cada mutante y se promediaron los valores (Pace 1986 supra) para producir una m = 3544 cal/mol/M usada para todos los cálculos de energía libre. Los resultados de estos cálculos se presentan en la Tabla 3. Los resultados de los experimentos de despliegue de GdmCl demuestran que los mismos mutantes que estabilizan Tencon con respecto a la estabilidad térmica también estabilizan la proteína frente a la desnaturalización inducida por GdmCl.

Tabla 3.

Cromatografía de exclusión por tamaño

Se usó cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para evaluar el estado de agregación de Tencon y cada variante de Tencon. Se inyectaron 5 gl de cada muestra en una columna Superdex 755/150 (GE Healthcare) a un caudal de 0,3 ml/min con una fase móvil de PBS. La elución de la columna se monitorizó mediante absorbancia a 280 nm. Para evaluar el estado de agregación, la columna fue previamente calibrada con estándares globulares de peso molecular (Sigma). Todas las muestras probadas, con la excepción de Tencon21, eluyeron en un pico a un volumen de elución consistente con el de una muestra monomérica. Tencon21 eluyó con 2 picos, lo que indica la presencia de agregados.

EJEMPLO 3: Generación de bibliotecas de Tencon que tienen superficies de unión alternativas Diseño de la biblioteca TCL14

La elección de los residuos que se aleatorizarán en un diseño de biblioteca en particular determina la forma general de la superficie de interacción creada. Se demostró que el análisis cristalográfico de rayos X de un dominio de FN3 que contiene proteína de andamiaje seleccionada para unirse a la proteína de unión a maltosa (MBP) de una biblioteca en la que se aleatorizaron los giros BC, DE y FG tiene una interfaz en gran parte curvada que encaja en el sitio activo de MBP (Koide et al., Proc Natl Acad Sci USA, 104, 6632-6637, 2007). Por el contrario, se descubrió que una proteína de andamiaje repetida de anquirina que se seleccionó para unirse a MBP tenía una superficie de interacción mucho más plana y se unía a la superficie externa de MBP lejana del sitio activo (Binz et al., Nat Biotechnol, 22, 575-58, 2004). Estos resultados sugieren que la forma de la superficie de unión de una molécula de andamiaje (curvada frente a plana) puede dictar qué proteínas objetivo o epítopos específicos en esas proteínas objetivo pueden unirse de manera efectiva al andamiaje. Los esfuerzos publicados en torno a la manipulación de andamiajes de proteínas que contienen dominios de FN3 para la unión a proteínas se han basado en la manipulación de giros adyacentes (Figura 1) para la unión a los objetivos, produciendo por tanto superficies de unión curvadas. Este enfoque puede limitar el número de objetivos y epítopos al que pueden acceder tales andamiajes.

Tencon y otros dominios de FN3 contienen dos conjuntos de giros similares a CDR que se encuentran en las caras opuestas de la molécula, el primer conjunto formado por los giros BC, DE y FG, y el segundo conjunto formado por los giros AB, CD y EF. Los dos conjuntos de giros están separados por las cadenas beta que forman el centro de la estructura de FN3 (Figuras 1,2A). Si la imagen de la estructura de Tencon presentada en la Figura 1 se rota 90 grados, puede visualizarse una superficie alternativa (Figura 2B). Esta superficie ligeramente cóncava está formada por los giros CD y FG y dos cadenas beta antiparalelas, las cadenas beta C y F, y en la presente se denomina superficie C-CD-F-FG (Figura 2B). La superficie C-CD-F-FG puede usarse como plantilla para diseñar bibliotecas de superficies de interacción de andamiajes de proteínas aleatorizando un subconjunto de residuos que forman la superficie. Las cadenas beta tienen una estructura repetitiva con la cadena lateral de cualquier otro residuo expuesta a la superficie de la proteína. Por tanto, puede elaborarse una biblioteca aleatorizando algunos o todos los residuos expuestos en la superficie en las cadenas beta. Eligiendo los residuos apropiados en las cadenas beta, la estabilidad inherente del andamiaje de Tencon debe verse mínimamente comprometida a la vez que proporciona una superficie de andamiaje única para la interacción con otras proteínas.

Se diseñó una nueva biblioteca, denominada en la presente TCL14 (SEQ ID NO: 28), en el andamiaje Tencon25 (SEQ ID NO: 25) que tiene una sustitución E11R adicional (Tencon27, SEQ ID NO: 27) (Figuras 2B, 3). Las posiciones de los giros y cadenas y sus secuencias se muestran en la Tabla 4 y la Tabla 5 para Tencon27 (SEQ ID NO: 27) y TCL14 (SEQ iD NO: 28), respectivamente. En la Tabla 5, "X" indica cualquier aminoácido.

Tencon27 (SEQ ID NO: 27):

LPAPKNLVV SRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQY QESEKVGEAIVLTVPGSERSY

DLTGLKPGTEYTV SIY GVKGGHRSNPLSAIFTT

Biblioteca TCL14 (SEQ ID NO: 28):

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFXIXYXEXXXXGEAIVLTVPGSERS

YDLTGLKPGTEYXVXIXGVKGGXXSXPLSAIFTT;

donde "X" es cualquier aminoácido.

Las dos cadenas beta que forman la superficie C-CD-F-FG en Tencon27 tienen un total de 9 residuos expuestos en la superficie que podrían aleatorizarse; cadena C: S30, L32, Q34, Q36; Cadena F: E66, T68, S70, Y72 y V74, mientras que el giro CD tiene 6 residuos potenciales: S38, E39, K40, V41, G42 y E43 y el giro FG tiene 7 residuos potenciales: K75, G76, G77, H78, R79, S80 y N81 (Figura 5). Se eligieron residuos selectos para su inclusión en el diseño de TCL14 debido al mayor tamaño teórico de la biblioteca si se aleatorizasen los 22 residuos.

Se eligieron trece posiciones en Tencon27 (SEQ ID NO: 27) para la aleatorización: L32, Q34 y Q36 en la cadena C, S38, E39, K40 y V41 en el giro CD, T68, S70 e Y72 en la cadena F, H78, R79 y N81 en giro FG. En las cadenas C y F, S30 y E66 no se aleatorizaron ya que se encuentran justo más allá de los giros CD y FG y aparentemente no parecen ser parte de la superficie C-CD-F-FG. Para el giro CD, G42 y E43 no se aleatorizaron como glicina, proporcionando flexibilidad, puede ser valioso en las regiones del giro y E43 se encuentra en la unión de la superficie. El giro FG tenía excluidos K75, G76, G77 y S80. Las glicinas se excluyeron por las razones anteriores, mientras que una inspección cuidadosa de las estructuras cristalinas reveló que S80 hacía contactos clave con el núcleo para ayudar a formar el giro FG estable. K75 se aleja de la superficie de la superficie C-CD-F-FG y fue un candidato menos atractivo para la aleatorización. Aunque los residuos mencionados anteriormente no se aleatorizaron en el diseño de TCL14 original, podrían incluirse en diseños de bibliotecas posteriores para proporcionar diversidad adicional para la selección de novo o, por ejemplo, para una biblioteca de maduración por afinidad en un acierto específico objetivo de TCL14 seleccionado.

Tabla 4.

A diferencia de los diseños de biblioteca basados en andamiajes de FN3 existentes (Koide, et al., J Mol Biol, 284, 1141-1151, 1998; Koide et al., Proc Natl Acad Sci USA 104, 6632-6637, 2007; Dineen et al.., BMC Cancer, 8, 352-361, 2008; Olson y Roberts, Protein Sci, 16, 476-484, 2007; Xu et al., Chemistry & Biology, 9, 933-942, 2002; Karatan et al., Chem Biol 11,835-844, 2004; Hackel et al., J Mol Biol, 401,84-96, 2010; Hackel et al., J Mol Biol 381, 1238-1252, 2008; Koide et al., Proc Natl Acad Sci USA, 104, 6632-6637, 2007, Lipovsek et al., J Mol Biol, 368, 1024­ 1041, 2007, Publicación de Patente Internacional N° WO2009/133208; Publicación de Patente Internacional N° WO2009/058379; Patente de Estados Unidos N° 7.115.396), la superficie de la biblioteca TCL14 diseñada no tiene similitud en la estructura a la de los dominios variables de anticuerpos o CDR, o bibliotecas de FN3 descritas anteriormente. Debido a la gran superficie de interacción generada por este diseño, pueden aislarse rápidamente las moléculas de alta afinidad, posiblemente sin necesidad de pasos de maduración por afinidad. Porque este diseño no

Tabla 5.

aleatoriza tramos largos de aminoácidos consecutivos, puede producir moléculas de unión a FN3 que son más solubles y estables que las bibliotecas descritas anteriormente. La biblioteca TCL14 descrita produce una superficie de interacción plana o cóncava en comparación con la superficie curvada de las bibliotecas anteriores. Por tanto, es probable que las moléculas de FN3 seleccionadas de TCL14 se unan a distintos antígenos y epítopos que los encontrados en diseños de bibliotecas de FN3 anteriores. El diseño de la biblioteca TCL14 también puede permitir la producción de dos superficies de unión distintas en la misma molécula para lograr la biespecificidad.

Generación de la biblioteca TCL14

La biblioteca TCL14 descrita anteriormente se expresó usando el sistema de presentación en cis (Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA 101: 2806-2810, 2004). En este sistema, la biblioteca se liga a fragmentos de A^dN que codifican la secuencia codificante de RepA, los elementos cis y ori y un promotor Tac, y el producto de ligamiento resultante se transcribe/traduce in vitro. Las proteínas de fusión TCL14-RepA producidas se unen en cis al ADN por el que se codifican las proteínas de fusión. La biblioteca se selecciona en busca de moléculas de andamiaje que se unan específicamente a las proteínas de interés, las moléculas se aíslan y el ADN unido se amplifica para identificar las secuencias codificantes de las moléculas de andamiaje unidas.

La biblioteca TCL14 se generó aleatorizando las posiciones L32, Q34, Q36 (cadena C), S38, E39, K40, V41 (giro CD), T68, S70, Y72 (cadena F), H78, R79 y N81 (giro FG) en Tencon 27 (SEQ ID NO: 27) usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores degenerados y clonadod 5' al gen RepA para la presentación en cis usando protocolos estándar. Se usó el cebador C-CD N46V (SEQ ID NO. 51) para aleatorizar la cadena C y el giro C:D y se usó el cebador F-FG-Sf E86I-R (SEQ ID NO. 52) para aleatorizar la cadena F y el giro F:G. El ligamiento final se amplificó con los cebadores RlRecFor (SEQ ID NO: 53) y DigLigRev (SEQ ID NO: 54) para generar la biblioteca TCL14 para transcripción/traducción in vitro. La Tabla 6 muestra las secuencias de los cebadores utilizados. Se usaron codones NNS para la diversificación (código IUB; N que indica A, C, G o T; S que indica C o G).

Tabla 6.

Caracterización de la biblioteca TCL14

La biblioteca TCL14 generada se clonó por PCR en un vector pET15 modificado (EMD Biosciences) que contenía un sitio de clonación independiente de ligasa (pET154-LIC) usando los cebadores TCON6 (SEQ ID NO: 55) y TCON5 E86I corto (SEQ ID NO: 56), y las proteínas se expresaron como proteínas etiquetadas con His6 C-terminales después de las transformaciones y la inducción con IPTG (1 mM final, 30° C durante 16 horas) usando protocolos estándar. Las células se recogieron por centrifugación y posteriormente se lisaron con Bugbuster HT (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) suplementado con 0,2 mg/ml de lisozima de clara de huevo de gallina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los lisados bacterianos se clarificaron por centrifugación y los sobrenadantes se transfirieron a nuevas placas de 96 pocillos profundos. Las proteínas se purificaron usando una placa Ni-NTA Multitrap de 96 pocillos (GE Lifesciences, Piscataway, NJ).

Se recogió una selección aleatoria de clones y secuencias para evaluar la distribución obtenida en la biblioteca. La diversidad observada en la biblioteca estuvo de acuerdo con lo esperado (Figura 7). Para calcular la diversidad observada en los clones de biblioteca de longitud completa, se contó el número total de veces que apareció un aminoácido dado en las regiones de la biblioteca diversificada en todos los clones y se dividió por el número total de posiciones aleatorias (13 posiciones de biblioteca aleatorias * 69 clones de longitud completa) y se multiplicó por 100 para proporcionar el % de frecuencia. La diversidad esperada se basa en el codón degenerado NNS con la siguiente distribución de aminoácidos: Phe=1, Leu=3, Ile=1, Met=1, Val=2, Ser=3, Pro=2, Thr=2, Ala=2, Cys=1, Arg=3, Gly=2, Tyr=1, His=1, Gln=1, Asn=1, Lys=1, Asp=1, Glu=1, Trp=1 codón o codones dividido por el número total de codones (32) multiplicado por 100 para proporcionar el % de frecuencia.

Las proteínas purificadas se sometieron a cromatografía de exclusión por tamaño para determinar la propensión a la agregación de los miembros individuales de la biblioteca. Los perfiles de elución de los clones seleccionados se determinaron inyectando 10 pl de las proteínas purificadas en una columna Superdex 75 5/150 usando un HPLC Agilent 1200 con lectura de absorbancia a 280 nm. ~80% de los clones que no contienen cisteína eluyeron como un único pico monomérico, lo que significa que la mayoría de los miembros individuales de la biblioteca han conservado la solubilidad intrínseca y la estructura de la molécula original. Se descubrió que algunas moléculas que contienen cisteína libre se oxidan después de la purificación y, por tanto, eluyen como moléculas diméricas.

Se usó calorimetría diferencial de barrido (DSC) para caracterizar adicionalmente los clones que tenían un perfil monodisperso según se determinó por el análisis SEC. Los datos de DSC se obtuvieron calentando soluciones de 0,5 mg/ml para cada clon en PBS de 35° C a 95° C a una velocidad de 1° C/min en un microcalorímetro de células capilares VP-DSC (Microcal, LLC, Piscataway, NJ). Se calcularon las temperaturas de fusión para cada clon usando el software CpCalc (Microcal, LLC, Piscataway, NJ) con un resumen de los datos que se muestra en la Tabla 7. La temperatura de fusión media de las moléculas probadas fue de 70 ± 9° C. Los datos obtenidos demuestran que el diseño de la biblioteca TCL14 produce moléculas de andamiaje que han conservado una cantidad significativa de la estabilidad térmica de la molécula original Tencon25 (93° C) y son inherentemente térmicamente estables por sí mismas y se pliegan bien.

Tabla 7.

Selección de moléculas de la biblioteca TCL14 que se unen específicamente a moléculas objetivo de interés Se seleccionó la biblioteca TCL14 frente a varias proteínas objetivo de diferentes clases de proteínas que consistían de dominios extracelulares de receptores de superficie celular, citoquinas, quinasas, fosfatasas, proteínas de choque térmico e inmunoglobulinas y sus fragmentos para identificar moléculas de andamiaje que se unen específicamente a estas proteínas y/o dominios de proteínas. Las proteínas solubles purificadas expresadas en células HEK293 o E. coli se biotinilaron usando los microtubos EZ-Link No-Weigh Sulfo-NHS-LC-Biotina (Thermo Fisher, Rockford, IL) seguido de diálisis extensiva en PBS. Para las selecciones, se transcribieron y tradujeron in vitro (IVTT) 3 pg de la biblioteca TCL14 en extracto lineal S30 de E. Coli (Promega, Madison, WI) y la biblioteca expresada se bloqueó con Cis Block (BSA al 2% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 100 pg/ml de ADN de esperma de arenque (Promega, Madison, WI), 1 mg/ml de heparina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Para la selección, se añadió cada proteína objetivo biotinilada a concentraciones de 400 nM (Ronda 1), 200 nM (Rondas 2 y 3) y 100 nM (Rondas 4 y 5) Los miembros de la biblioteca unidos se recuperaron usando perlas magnéticas de neutravidina (Thermo Fisher, Rockford, IL) (Rondas 1, 3 y 5) o perlas magnéticas de estreptavidina (Promega, Madison, WI) (Rondas 2 y 4) y los miembros de la biblioteca no unidos se eliminaron lavando las perlas de 5 a 14 veces con 500 pl de PBST seguido de 2 lavados con 500 pl de PBS.

Después de 5 rondas de selección, el resultado de ADN se amplificó mediante PCR y se subclonó en pET154-LIC usando protocolos estándar.

Se realizaron rondas de selección adicionales para identificar moléculas de andamiaje con afinidades mejoradas para dos proteínas objetivo. Brevemente, los resultados de la ronda 5 se prepararon como se ha descrito anteriormente y se sometieron a rondas iterativas adicionales de selección con los siguientes cambios: la incubación con la proteína objetivo biotinilada se redujo de 1 hora a 15 minutos y la captura de perlas se redujo de 20 minutos a 15 minutos, la proteína objetivo biotinilada se redujo a 25 nM (Rondas 6 y 7) o 2,5 nM (Rondas 8 y 9), y se realizó un lavado adicional de 1 hora en presencia de un exceso de proteína objetivo no biotinilada. El objetivo de estos cambios era seleccionar simultáneamente aglutinantes con una constante de asociación potencialmente más rápida y una constante de disociación más lenta que proporcionaran una K^d sustancialmente más baja. El resultado de la 9a ronda se amplificó por PCR, se clonó y se expresó como se ha descrito anteriormente.

Caracterización in vitro de moléculas de andamiaje que se unen a proteínas y/o dominios de proteínas de interés

Unión

Se realizó un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) en 188 clones individuales de los resultados de adsorción de la ronda 5. Se recubrieron placas Maxisorp (Nunc, Rochester, NY) con 0,1 gg de anticuerpo anti-His (Qiagen, Valencia, CA) durante la noche, se lavaron con solución salina tamponada con Tris, pH 7,4 con Tween-20 al 0,05% (TBST) y se bloquearon usando Starting Block T20 (Thermo Fisher, Rockford, IL). Se aplicaron lisados bacterianos clarificados que contenían 1 gg/ml de fusiones TCL14-RepA etiquetadas con His6 o una proteína de control (albúmina de suero humano) sobre los pocillos de las placas recubiertas. Las placas se incubaron durante 1 hora, se lavaron con TBST y la proteína biotinilada se detectó con estreptavidina-HRP (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) y sustrato quimioluminiscente POD (Roche, Indianapolis, IN) usando un lector de placas M5 de Molecular Devices. El rendimiento de la biblioteca se evaluó mediante una tasa de aciertos. La tasa de aciertos se definió como el porcentaje (%) de moléculas de andamiaje que tenían una señal de luminiscencia diez veces superior a la señal de control dividida por el número total de clones examinados (188). Como se muestra en la Tabla 8, la biblioteca TLC14 produjo moléculas de andamiaje con tasas de aciertos que variaban entre el 8% y el 45% para ocho proteínas distintas. La citoquina 2 es IL-17A de ratón.

Tabla 8.

Caracterización de los aglutinantes de IL-17A de ratón

Inhibición del receptor IL-17A

Se realizó un ensayo de inhibición para determinar si los resultados de adsorción de las rondas 5 y 9 contra IL-17A de ratón (mIL-17A) inhibían la unión de mIL-17A al receptor de mIL-17A. Se recubrieron placas Maxisorp con 0,2 gg/ml de fusión receptor de mIL-17A Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN) durante la noche, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 con Tween-20 al 0,05% (TBST) y se bloquearon con BSA al 2%, sacarosa al 5% en PBS. Se añadieron 10 ng/ml de mIL17A biotinilada (b-mIL-17A) a los lisados bacterianos clarificados diluidos 1:50 en BSA al 1% en PBS, y las mezclas se incubaron durante 20 minutos. Se lavaron las placas bloqueadas y las incubaciones de lisados bacterianos/b-mIL-17A se transfirieron a las placas. Las placas se incubaron durante una hora adicional, se lavaron con PBST y la proteína biotinilada se detectó con estreptavidina-HRP (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) y sustrato colorimétrico OPD (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Se leyó la absorbancia a 490 nm usando un lector de placas M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y los datos se convirtieron en % de inhibición. El porcentaje de inhibición para la unión de mIL-17A: receptor de mIL-17 se definió como 100-(muestra/control negativo x 100).

Los lisados bacterianos seleccionados que contenían las moléculas de andamiaje que inhibían la interacción de mIL-17A: receptor de mIL-17 se caracterizaron adicionalmente en un ensayo de inhibición de la respuesta a la dosis usando el protocolo descrito anteriormente, excepto que se usaron 100 gl de proteínas de fusión TCL14-His (Ni-NTA) purificadas en los ensayos entre concentraciones de 10 gM a 56 pM. Los valores de IC50 se calcularon a partir de las curvas de respuesta a la dosis usando un ajuste de respuesta a la dosis sigmoidal. Como se resume en la Tabla 9, los inhibidores específicos de mIL-17A tienen un intervalo de IC50 de ~9 a ~428 pM.

Tabla 9.

continuación

Mediciones de afinidad

Las afinidades de moléculas seleccionadas que se unen a mIL-17A se midieron usando resonancia de plasmones superficiales usando un instrumento ProteOn XPR-36 (Bio-Rad). Las moléculas purificadas se inmovilizaron directamente en el chip mediante acoplamiento de amina con densidades variables (100~300 Rus) a pH 5,0 y un caudal de 30 pl/min durante 5 minutos. Se probó mIL-17A a 100 nM diluido en una serie de concentraciones de 3 veces para determinar su unión a diferentes moléculas en la superficie del chip. Se monitorizaron las fases de disociación para todas las concentraciones de todas las muestras durante 1 ~ 2 horas a un caudal de 100 pl/min dependiendo de su tasa de disociación. Se inyectó una muestra de tampón para monitorizar la estabilidad del valor de referencia y la superficie no se regeneró para su uso posterior. Los datos de respuesta para toras las series de concentraciones para cada una de las superficies diferentes de las moléculas de andamiaje seleccionadas de la biblioteca TLC14 se ajustaron globalmente a un modelo de unión simple langmuir 1:1 para extraer las estimaciones de las constantes cinéticas (kon, koff) y de afinidad (KD). Como se resume en la Tabla 9, las afinidades de las moléculas de andamiaje que se unen específicamente a mIL-17A estaban en un intervalo subnanomolar.

Las secuencias de aglutinantes de mIL-17A seleccionados se muestran en las SEQ Ib NO: 85-96, y las secuencias de las cadenas beta C y F y los giros Cb y FG en la Tabla 10.

Tabla 10

continuación

EJEMPLO 4: bibliotecas Tencon27 aleatorias en una segunda superficie alternativa

Una segunda superficie alternativa en Tencon27 reside en el lado opuesto de la superficie C-CD-F-FG como se visualiza en la Figura 2C, denominada en la presente superficie A-AB-B-BC-E, formada por la cadena beta A, el giro AB, la cadena beta B, el giro BC y la cadena beta E. La superficie A-AB-B-BC-E también es ligeramente cóncava y puede usarse como plantilla para diseñar bibliotecas de superficies de interacción de andamiajes de proteínas aleatorizando un subconjunto de residuos que forman la superficie. Las cadenas beta tienen una estructura repetitiva con la cadena lateral de cualquier otro residuo expuesto a la superficie de la proteína. Por tanto, puede elaborarse una biblioteca aleatorizando algunos o todos los residuos expuestos en la superficie en las cadenas beta. Eligiendo los residuos apropiados en las cadenas beta, la estabilidad inherente del andamiaje Tencon27 debe verse mínimamente comprometida a la vez que se proporciona una superficie de andamiaje única para la interacción con otras proteínas. Aleatorizar la superficie A-AB-B-BC-E producirá una superficie de unión en el lado opuesto de la estructura Tencon27 en comparación con el diseño de la biblioteca TCL14. El diseño de la biblioteca en Tencon27 con superficie aleatoria A-AB-B-BC-E se muestra en la SEQ ID NO: 61 (la biblioteca TCL15) y enla Figura 6.

Biblioteca TCL15 (SEQ ID NO: 61):

LPAPKXLXVXXVXXXXAXLXWXAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSER

XYXLTGLKPGTEYTV SIY GVKGGHRSNPLS AIFTT;

donde X es cualquier aminoácido.

La biblioteca TCL15 se genera y selecciona para andamiajes que se unen específicamente a moléculas objetivo como se ha descrito anteriormente para la biblioteca TCL14.

EJEMPLO 5: Otros dominios de FN3: generación de bibliotecas aleatorizando superficies alternativas Los diseños de bibliotecas que utilizan superficies alternativas descritas en los ejemplos para el andamiaje Tencon27 pueden aplicarse a otros dominios de FN3 de varias proteínas debido a la similitud estructural entre los dominios de FN3. Tales dominios de FN3 pueden ser de origen natural o sintéticos y son, por ejemplo, un andamiaje consenso de Fibcon (SEQ ID NO: 58) basado en una secuencia consenso de dominios de fibronectina (Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2010/0255056), el 10° dominio de FN3 de fibronectina humana (FN10) (SEQ ID NO: 97), o el 3° dominio de FN3 de tenascina humana (TN3) (SEQ ID NO: 3), o cualquier dominio de Fⁿ3 presente en las proteínas enumeradas en Tabla 1.

Los diseños de bibliotecas para las bibliotecas Fibcon, FN10 y TN3 con superficies alternativas C-CD-F-FG aleatorizadas se muestran en la Figura 8 y en las SEQ ID NO: 62, 98 y 99, respectivamente. Las bibliotecas diseñadas se sintetizan, expresan y seleccionan para aglutinantes específicos usando los protocolos descritos en la presente.

Biblioteca de andamiajes de proteínas basada en Fibcon con superficie C-CD-F-FG aleatorizada (SEQ ID NO: 62):

LDAPTDLQVTNVTDTSITV SWTPPS ATITGYXIXYXPXXXXGEPKELTVPPS STS VT

ITGLTPGV EY X VXLXALKDN XXSXPL V GTQTT;

en donde X es cualquier aminoácido.

Biblioteca de andamiajes de proteínas basada en FN10 con superficie C-CD-F-FG aleatoriazada (SEQ ID NO:

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un andamiaje de proteínas que comprende un dominio de módulo de fibronectina tipo III (FN3), que tiene una superficie alternativa C-CD-F-FG diversificada capaz de unirse específicamente a una molécula objetivo, en donde el dominio de FN3 comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO:27.

2. El andamiaje de proteínas de la reivindicación 1, en donde el dominio de FN3 comprende:

a) una cadena beta C que comprende una secuencia de aminoácidos DSFLIQYQE (SEQ ID NO: 33) que tiene sustituciones en 1,2, 3 o 4 residuos;

b) una cadena beta F que comprende una secuencia de aminoácidos TEYTVSIYGV (SEQ ID NO: 39) que tiene sustituciones en 1,2, 3, 4 o 5 residuos;

c) una cadena beta C y un giro CD que comprenden una secuencia de aminoácidos DSFLIQYQESEKVGE (SEQ ID NO: 42) que tiene sustituciones en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos; o

d) una cadena beta F y un giro FG que comprenden una secuencia de aminoácidos TEYTVSIYGVKGGHRSN (SEQ ID NO: 43) que tiene sustituciones en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 residuos.

3. El andamiaje de proteínas de la reivindicación 1, en donde el dominio de FN3 comprende:

a) una cadena beta A, un giro AB, una cadena beta B, un giro BC, una cadena beta D, un giro DE, una cadena beta E, un giro EF y una cadena beta G que tienen secuencias de aminoácidos idénticas a la SEQ ID NO: 27 en los residuos 1-12, 13-16, 17-21,22-28, 44-50, 51-54, 55-59, 60-64 y 82-89, respectivamente;

b) una cadena beta C y un giro CD que tienen una secuencia de aminoácidos por lo menos un 53% idéntica a la SEQ ID NO: 42; y

c) una cadena beta F y un giro FG que tienen una secuencia de aminoácidos por lo menos un 65% idéntica a la SEQ ID NO: 43, que tiene opcionalmente por lo menos una sustitución en las posiciones de aminoácidos correspondientes a los residuos de aminoácidos 11, 14, 17, 37, 46, 73 u 86 de la SEQ ID NO: 27, en donde el andamiaje de proteínas se une específicamente a una molécula objetivo a la que no se une específicamente un dominio de FN3 de referencia.

4. El andamiaje de proteínas de la reivindicación 1, en donde el dominio de FN3 comprende:

a) una cadena beta C, un giro CD, una cadena beta D, un giro DE, un giro EF, una cadena beta F, un giro FG y una cadena beta G que tienen secuencias de aminoácidos idénticas a la SEQ ID NO: 27 en los residuos 29-37, 38-43, 44-50, 51-54, 60-64, 65-74, 75-81 y 82-89, respectivamente;

b) una cadena beta A, un giro AB, una cadena beta B y un giro BC que tienen una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 59% idéntica a la SEQ ID NO: 44; y

c) una cadena beta E que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 60% idéntica a la SEQ ID NO: 37, que tiene opcionalmente por lo menos una sustitución en las posiciones de aminoácidos correspondientes a los residuos de aminoácidos 11, 14, 17, 37, 46, 73 u 86 de la SEQ ID NO: 27, en donde el andamiaje de proteínas se une específicamente a una molécula objetivo a la que no se une específicamente un dominio de FN3 de referencia.

5. El andamiaje de proteínas de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la molécula objetivo es una proteína seleccionada de clases de proteínas que consisten de dominios extracelulares del receptor de la superficie celular, citoquinas, quinasas, fosfatasas, proteínas de choque térmico e inmunoglobulinas y sus fragmentos, por ejemplo, en donde la molécula objetivo es IL-17A;

6. Un ácido nucleico que codifica el andamiaje de proteínas de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6.

8. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6 o el vector de la reivindicación 7.

9. Una composición farmacéutica que comprende el andamiaje de proteínas de cualquiera de las reivindicaciones 1­ 5 y un portador farmacéuticamente aceptable.

10. El andamiaje de proteínas de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o la composición farmacéutica de la reivindicación 9, para su uso en un método de tratamiento.