ES2670442T3

ES2670442T3 - Dominios de unión a albúmina de consenso no naturales

Info

Publication number: ES2670442T3
Application number: ES13793564.9T
Authority: ES
Inventors: Steven Jacobs
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2013-05-23
Publication date: 2018-05-30
Anticipated expiration: 2033-05-23
Also published as: BR112014029409A2; MX2014014384A; EP2855509A4; EA201590136A1; DK2855509T3; CN104470944B; IL235808A; AU2013266215B2; KR20150016585A; IL254652A0; BR112014029409B1; IL254652B; PT2855509T; JP2015519345A; EA036487B1; CN104470944A; AU2013266215A1; EP2855509B1; CA2874646A1; AU2017261625A1

Abstract

Un dominio de unión a albúmina aislado no natural que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Dominios de unión a albúmina de consenso no naturales Descripción

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a dominios de unión a albúmina y a métodos para elaborarlos y usarlos. Más particularmente, la presente invención está dirigida a una secuencia de consenso del dominio de unión a albúmina no natural y a variantes de la misma como se describe en la presente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La eliminación rápida de moléculas bioterapéuticas mediante depuración renal contribuye a una eficacia clínica limitada o una dosificación más frecuente para el paciente. La depuración renal debida a la filtración glomerular está más asociada con bioterapéuticos más pequeños, ya que las velocidades de filtración renal se reducen en gran medida para las moléculas con un peso molecular de más de 50.000 daltons (Kontermann, Curr Opin Biotechnol 22:868-76, 2011). Varios fármacos bioterapéuticos aprobados contienen porciones activas que por sí mismas caen por debajo del límite de filtración y por lo tanto se depuran rápidamente. Para superar esta limitación, se han introducido una variedad de tecnologías para aumentar eficazmente el tamaño de la molécula terapéutica a fin de reducir la filtración renal y la vida media resultante.

La PEGilación (PEG) de agentes terapéuticos es una forma eficaz de aumentar el radio hidrodinámico de la proteína y reducir la filtración glomerular. Una o varias cadenas de PEG pueden acoplarse a la proteína más comúnmente a través de la conjugación a grupos tiol o amina libres en la superficie de la proteína. Las versiones PEGiladas de Adenosina deaminasa, L-Asparaginasa, Interferón alfa-2b, G-CSF, Hormona de Crecimiento Humano, Eritropoyetina, Uricasa y un fragmento de anticuerpo anti-TNFalfa han sido todos aprobados para terapia humana (Kontermann, Curr Opin Biotechnol 22:868-76, 2011). Las limitaciones de la PEGilación incluyen la producción de productos heterogéneos y la dificultad para controlar el número de moléculas PEG unidas a ciertas proteínas. La PEGilación introduce una conjugación adicional así como pasos de purificación para la producción de proteínas terapéuticas, lo que da como resultado rendimientos reducidos y costos aumentados de los productos. La PEGilación también puede conducir a la vacuolización tubular renal en animales y pacientes ya que las cadenas de PEG no son degradables en los riñones (Gaberc-Porekar et al., Curr Opin Drug Discov Devel 11:242-250, 2008).

El acoplamiento de un agente terapéutico a un región Fc de un anticuerpo para generar proteínas de fusión Fc se puede usar para aumentar la vida media en suero de las moléculas terapéuticas. Las inmunoglobulinas pueden mostrar vidas medias largas del orden de varias semanas en humanos debido a su gran tamaño y al reciclaje a través de FcRn (Kuo et al., J Clin Immunol 30:777-789, 2010). El receptor 2 de TNF, LFA-3, CTLA-4, IL- 1R, y moléculas de péptido miméticas de TPO son todas terapias aprobadas producidas como fusiones de Fc (Kontermann, Curr Opin Biotechnol 22:868-76, 2011). Las proteínas de fusión Fc no son ideales para todas las clases terapéuticas por varias razones. La naturaleza homodimérica de la región Fc da como resultado la producción de una proteína terapéutica dimérica, llevando posiblemente a la activación celular debido a la agrupación del receptor. Las fusiones Fc también pueden hacerse en sistemas de expresión mamíferos que pueden ser más costosas que los sistemas procariotas.

Además de Fc, la albúmina muestra una vida media larga in vivo debido al reciclado de FcRn. A una concentración de aproximadamente 40 g/l, la Albúmina Sérica Humana (HSA) es la proteína más abundante encontrada en la sangre. El reciclado de FcRn lleva a una vida media larga de aproximadamente 19 días en humanos. Adicionalmente, los estudios de biodistribución sugieren que la albúmina puede distribuirse dentro del cuerpo a áreas importantes para atacar la enfermedad, como articulaciones inflamadas o tumores (Wunder et al., J Immunol 170:4793-4801,2003). Por tanto, la vida media en suero de un número de proteínas se ha incrementado al producirlas como fusiones C-terminales o N-terminales para HSA. Las fusiones exitosas incluyen interferón alfa (Flisiak and Flisiak, Expert Opin Biol Ther 10:1509-1515, 2010), hormona de crecimiento humano (Osborn et al., Eur J Pharmacol 456:149-158, 2002), factor de necrosis tumoral (Muller et al., Biochem Biophys Res Commun 396:793- 799, 2010), factor de coagulación IX (Metzner et al., Thromb Haemost 102: 634-644, 2009), factor de coagulación VIIa (Schulte, Thromb Res 122 Suppl 4: S14-19, 2008), insulina (Duttaroy et al., Diabetes 54:251-258, 2005), uroquinasa (Breton et al., Eur J Biochem 231:563-569, 1995), hirudina (Sheffield et al., Blood Coagul Fibrinolysis 12:433-443, 2001), y fragmentos de anticuerpos biespecíficos (M Muller et al, J Biol Chem 282:12650-12660, 2007). Las proteínas de fusión HSA pueden tener vidas medias en suero largas, sin embargo la producción a gran escala de estas proteínas de fusión está limitada predominantemente a sistemas de expresión de levadura. Adicionalmente, el gran tamaño de la HSA puede llevar a una pérdida en la actividad de los agentes terapéuticos debido al impedimento estérico.

Las proteínas terapéuticas también pueden producirse como proteínas de fusión para péptidos o proteínas que se unen a la albúmina sérica en el torrente sanguíneo para aumentar su vida media. Dichos péptidos de unión a albúmina incluyen péptidos restringidos por cisteína o fragmentos de anticuerpos para albúmina. La expresión de un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

fragmento de anticuerpo Fab como una fusión a péptidos restringidos por cisteína aumentó significativamente la vida media en suero del Fab (Dennis et al., J Biol Chem 277:35035-35043, 2002; US2004/0253247A1). El acoplamiento del péptido restringido por cisteína a un fragmento de anticuerpo llevó a una mejor acumulación tumoral máxima y a una distribución tumoral más homogénea en comparación con las moléculas Fab y mAb dirigidas al mismo antígeno (Dennis et al., Cancer Res 67:254-261,2007; US2005/0287153A1) . Además, una serie de fragmentos de anticuerpo que se unen específicamente a la albúmina se han acoplado a fracciones terapéuticas para aumentar la vida media del agente terapéutico. Un fragmento de anticuerpo Vhh de camélido (Nanobodies®) que se une a HSA se fusionó con otro Nanobody® que se une a TNF-alfa (Coppieters et al., Arthritis Rheum 54: 1856-1866, 2006) o anti-EGFR Nanobodies® (Tijink et al., Mol Cancer Ther 7:2288-2297, 2008). Se han generado anticuerpos del dominio antialbúmina (dAbs) que se unen a la albúmina y se han fusionado con, por ejemplo, el receptor de interleucina-1 (Holt et al., Protein Eng Des Sel 21:283-288, 2008) y el interferón alfa 2b (Walker et al., Protein Eng Des Sel 23:271-278, 2010) para mejorar su vida media.

Se sabe que una serie de dominios de proteínas de origen natural de bacterias interactúan con la albúmina, presumiblemente para ayudar a que tales bacterias se distribuyan por todo el organismo huésped. Estos son dominios de proteínas de haz de 3 hélices de aproximadamente 6 kDa de tamaño que usan una cara del haz de 3 hélices para interactuar con la albúmina del suero (Cramer et al., FEBS Lett 581:3178-3182, 2007; Lejon et al., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 64:64-69, 2008; Johansson et al., FEBS Lett 374:257-261, 1995; Johansson et al., J Mol Biol 266:859-865, 1997; Johansson et al., J Biol Chem 277:8114-8120 ,2002). Uno de tales dominios de unión a albúmina derivado de la proteína G estreptocócica (Jonsson et al., Protein Eng Des Sel 21:515-527, 2008), ha sido usado ampliamente para extender la vida media en suero de las proteínas. Se ha demostrado que la fusión a este dominio aumenta la vida media del receptor de complemento soluble tipo 1 (Makrides et al., J Pharmacol Exp Ther 277:534-542, 1996), un anticuerpo biespecífico ((Stork et al., Protein Eng Des Sel 20:569-576, 2007), CD4 (Nygren et al., Vaccines 91:363-368, 1991; US 6267,964B1) , Pf155/RESA (Stahl et al., J Immunol Methods 124:43-52, 1989), G-CSF (Frejd, F. PEGS Europe, 5 de octubre de 5, 2010), y moléculas de aficuerpos que se unen a una serie de objetivos (Andersen et al., J Biol Chem 286:5234-5241, 2011) (Frejd, F. PEGS Europe, 5 de octubre del 2010). Sin embargo, se ha informado en pacientes la producción de anticuerpos contra el dominio y por tanto el uso de la molécula para aplicaciones terapéuticas puede ser un desafío (Goetsch et al., Clin Diagn Lab Immunol 10:125-132, 2003; Libon et al., Vaccine 17:406-414, 1999).

Una serie de dominios de proteínas o péptidos que se unen a la albúmina son capaces de extender la vida media en suero y producir un patrón de biodistribución más beneficioso de proteínas terapéuticas. Para usar estos dominios de unión a albúmina en aplicaciones terapéuticas, se deben cumplir una serie de requisitos biofísicos, como altos niveles de expresión en un huésped, solubilidad y estabilidad, e inmunogenicidad mínima. La fracción de unión a la albúmina debe unirse a la albúmina de suero con una afinidad que equilibre eficazmente la vida media en el suero y la biodistribución con la actividad de la fracción terapéutica cuando se une y no se une a la albúmina.

La WO 2010/141329 se refiere a moléculas que comprenden un dominio de unión a albúmina y una fracción de unión a FcRn, que tienen vidas medias extendidas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Un aspecto de la invención es una proteína que comprende un dominio de unión a albúmina aislado, no natural que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21. Otro aspecto de la invención es un dominio de unión a albúmina aislado no natural que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 21.

Otro aspecto más de la invención es un dominio de unión a albúmina aislado no natural que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21 que tiene sustituciones en los residuos 1, 2, 3, 4, 5 y/o 6, y, preferiblemente, en donde las sustituciones en los residuos 1, 2, 3, 4, 5 y/o 6 pueden tener lugar en las posiciones de aminoácidos Y21, Y22, L25, K30, T31, E33, G34, A37, L38, E41, 142 y/o A45 de la SEQ ID NO: 21 o en las posiciones de aminoácidos Y21, Y22, K30, T31, A37, y/o E41 de la SEQ ID NO: 21.

Un aspecto adicional de la invención es un dominio de unión a albúmina aislado no natural que comprende una secuencia de aminoácidos: LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA (SEQ ID NO: 22); en donde X1, X2, X3, X4, X5 y X6 pueden ser cualquier aminoácido o un subconjunto de ciertos aminoácidos.

En algunas realizaciones el dominio de unión a albúmina aislado no natural comprende una extensión de 5 aminoácidos en su extremo N-terminal.

Otro aspecto de la invención es un método para elaborar un dominio de unión a albúmina no natural de la invención que comprende proporcionar un polinucleótido que codifica el dominio de unión a albúmina no natural; expresar el polinucleótido en un huésped o in vitro; y recuperar el dominio de unión a albúmina no natural. Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado que codifica los dominios de unión a albúmina de la invención. Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido de la SEQ ID NO: 35.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Otro aspecto de la invención es un vector aislado que comprende el polinucleótido aislado de la invención y una célula huésped que comprende el vector aislado de la invención.

Otro aspecto de la invención es una proteína de fusión que comprende una proteína de unión a albúmina de la invención y un agente bioactivo.

Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de la invención y por lo menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra el análisis SDS-PAGE de ABDCon purificado. Las muestras son como sigue línea 1) marcador SeeBlue plus 2, 2) lisado celular total, 3) lisado celular soluble, 4) flujo de columna, 5-12) fracciones eluidas. Los pesos moleculares de algunas de las bandas de marcadores se muestran a la izquierda.

La Figura 2 muestra la espectrometría de masas por ionización por electrospray de la muestra de ABDCon purificada.

La Figura 3 muestra el análisis por cromatografía de exclusión por tamaño de ABDCon purificado como se ejecuta en PBS.

La Figura 4 muestra la temperatura de fusión A) y la reversibilidad del despliegue de ABDCon B) medido por DSC en PBS. Los datos restados iniciales normalizados para el primer escaneo se muestran en A. Después del primer escaneo, la muestra se enfrió a 20° C y el escaneo se repitió para determinar la reversibilidad del plegamiento. Las trazas de datos brutos para el primer y segundo escaneo están cubiertos en la parte B.

La Figura 5 muestra las farmacocinéticas de una proteína de fusión Tencon25-ABDCon en ratones cuando se dosifica a 2 mg/kg por vía intravenosa.

La Figura 6 muestra las farmacocinéticas de una molécula Tencon25 (residuos 1-90 de la SEQ ID NO: 39) fusionada a ABDCon (SEQ ID NO: 21), ABDCon3 (SEQ ID NO: 26), ABDcon5 (SEQ ID NO: 28), ABDCon7 (SEQ ID NO: 30) y ABDCon9 (SEQ ID NO: 32) en ratones cuando se dosifican a 2 mg/kg por vía intravenosa. La Figura 7 muestra la estabilidad de A) ciertas proteínas de fusión ABDCon del dominio FN3 (SEQ ID NO: 1) y B) dominio FN3-ABDCon12 (SEQ ID NO: 46) que tienen una hélice N-terminal extendida en ABDCon cuando se incuban a 37° C durante 0 ó 28 días en PBS.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El término "dominio de unión a albúmina" o "dominio" como se usa en la presente se refiere a un polipéptido que se une a la albúmina in vivo o in vitro. La albúmina puede derivarse de cualquier especie animal, por ejemplo, humano, mono o roedor.

El término "Kd", como se usa en la presente, se refiere a la constante de disociación entre la albúmina y el dominio de unión a albúmina.

El término "Kon", como se usa en la presente, se refiere a la constante de velocidad para la asociación de un dominio de unión a albúmina con la albúmina para formar un complejos dominio de unión a albúmina/albúmina.

El término "Koff", como se usa en la presente, se refiere a la constante de velocidad para la disociación de un dominio de unión a albúmina del complejo dominio de unión a albúmina/albúmina.

El término "no natural" como se usa en la presente se refiere a un dominio que es sintético, es decir, que tiene una secuencia de aminoácidos no presente en polipéptidos nativos.

El término "sustituir" o "sustituciones" como se usa en la presente se refiere a alterar, eliminar o insertar, o a alteraciones, deleciones o inserciones de uno o más aminoácidos o nucleótidos en un polipéptido o secuencia de polinucleótidos para generar una variante de esa secuencia.

El término "variante", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido o un polinucleótido que difiere de un polipéptido de referencia o un polinucleótido de referencia por una o más modificaciones, por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones

El término "agente bioactivo" como se usa en la presente se refiere a proteínas, anticuerpos, péptidos, nucleótidos, productos farmacéuticos moleculares pequeños y similares, que, cuando se administran a un paciente animal proporcionan un beneficio a ese paciente. En este término se incluyen fracciones producidas sintéticamente, derivadas naturalmente o producidas recombinantemente. Los agentes bioactivos pueden ser análogos, derivados, agonistas, antagonistas, enantiómeros o sales farmacéuticamente aceptables de agentes bioactivos.

El término "estabilidad", como se usa en la presente se refiere a la capacidad de una molécula para

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

mantener un estado plegado bajo condiciones fisiológicas de tal manera que retiene por lo menos una de sus actividades funcionales normales, por ejemplo, la vida media.

El término "vector" significa un polinucleótido capaz de ser duplicado dentro de un sistema biológico o que puede moverse entre dichos sistemas. Los polinucleótidos del vector típicamente contienen elementos, como orígenes de replicación, señal de poliadenilación o marcadores de selección, que funcionan para facilitar la duplicación o mantenimiento de estos polinucleótidos en un sistema biológico. Ejemplos de tales sistemas biológicos pueden incluir una célula, bacteria, virus, sistemas biológicos animales, vegetales y reconstituidos que utilizan componentes biológicos capaces de duplicar un vector. El polinucleótido que comprende un vector puede ser moléculas de ADN o ARN o un híbrido de estas.

El término "vector de expresión" significa un vector que puede utilizarse en un sistema biológico o en un sistema biológico reconstituido para dirigir la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos presente en el vector de expresión.

El término "ligado operativamente" como se usa en la presente se refiere a un posicionamiento de componentes tal que funcionen en su manera pretendida.

Los aminoácidos son referidos en la presente usando sus códigos estándar de tres o una letra: Composiciones del Dominio de Unión a Albúmina

La presente invención proporciona un dominio de unión a albúmina sintético (ABDCon) (SEQ ID NO: 21) y variantes del mismo. El ABDCon puede ligarse operativamente a un agente bioactivo para mejorar la vida media en suero y biodistribución del agente terapéutico. El ABDCon y las variantes del mismo se pueden expresar a niveles elevados en E. coli, son solubles y tienen alta estabilidad térmica. La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican ABDCon y variantes del mismo, ácidos nucleicos complementarios, vectores, células huésped, y métodos para elaborarlos y usarlos.

La presente invención proporciona además dominio de unión a albúmina sintético (ABDCon) que tiene una extensión de 5 aminoácidos en el extremo N-terminal. La extensión mejora la estabilidad de ABDCon.

El dominio de unión de ABDCon se diseñó calculando una secuencia de aminoácidos de consenso de ciertas secuencias de dominio de unión a albúmina (ABD) de haz de 3 hélices depositadas en la base de datos de proteínas no redundante usando ABD de Streptococcus sp. Proteína G G148 (SEQ ID NO: 1) como una plantilla, y seleccionando el aminoácido más prevalente en cada posición de la secuencia (Tabla 6). El ABDCon tiene una alta afinidad por la albúmina humana con un Kd de 75 pM y Koff de 3.02x10-5 1/s cuando se prueba con las condiciones especificadas en la presente y, por lo tanto, los agentes bioactivos ligados operativamente a ABDCon pueden unirse en gran medida a la albúmina una vez administrados a un paciente animal. En un paciente humano, las moléculas que se unen demasiado débilmente a la albúmina sérica tendrán una vida media en suero corta debido al filtrado renal (Hopp et al., Protein Eng Des Sel 23:827-834, 2010), mientras que las moléculas que unen a la albúmina sérica con demasiada fuerza no se liberarán de la albúmina en el sitio de acción preferido y, por tanto en algunos casos pueden tener una capacidad reducida para modular la actividad del objetivo deseado y proporcionar un beneficio terapéutico. Es, por lo tanto, un aspecto de la invención tener y ser capaz de generar variantes de ABDCon y dominios de unión que tengan un espectro de afinidades para la albúmina y proporcionen por lo tanto la capacidad de modular la vida media del agente bioactivo ligado operativamente a variantes de ABDCon y dominios de unión.

Una realización de la invención es un dominio de unión a albúmina aislado no natural que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 21 (ABDCon):

LKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA.

Otra realización de la invención es un dominio de unión a albúmina aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21 que tiene sustituciones en 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos.

Las variantes de ABDCon pueden diseñarse examinando la estructura cristalina de una proteína de unión a albúmina de haz de 3 hélices ejemplar en complejo con albúmina y asumiendo que el ABDCon puede unirse a la albúmina de una manera similar a la proteína ejemplar. Una estructura cristalina ejemplar que se puede utilizar es la de un módulo GA (módulo de unión a albúmina relacionado con la proteína G) de la proteína PAB de una bacteria anaeróbica Finegoldia magna (anteriormente Peptostreptococcus magnus) en complejo con albúmina humana (Protein Data Base (PDB) código 1TF0 (Leion et al., J Biol Chem 279:42924-42928, 2004).

Las variantes de ABDCon que tienen afinidad disminuida para la albúmina se pueden diseñar mediante varias estrategias, como alterando los contactos hidrófobos previstos, interrumpiendo el apilamiento pi previsto entre residuos aromáticos, introduciendo choques estéricos por sustitución con aminoácidos más grandes, alterando los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

puentes de sales mediante eliminación de residuos cargados, y alterando los enlaces de hidrógeno que se ha previsto que se producirán entre ABDCon y la albúmina. Los cambios introducidos están diseñados para disminuir la afinidad de unión sin cambiar la superficie de unión de una manera que eliminaría la unión. Por ejemplo, el residuo Y21 puede sustituirse por aminoácidos cargados (Lys, Arg, Asp, Glu) o aminoácidos más pequeños (Ala, Gly) para reducir las interacciones hidrófobas entre este residuo y los residuos de albúmina V325 y F326. Además, Y21 de ABDCon forma un enlace de hidrógeno con el esqueleto de los residuos de albúmina N318 y D324 de tal manera que los cambios menores, como la mutación a Phe, pueden debilitar ligeramente las interacciones. Se prevé que el residuo Y22 de ABDCon forme interacciones hidrófobas así como apilamiento pi con los residuos de albúmina F309 y F326. Por lo tanto la sustitución de Y22 por aminoácidos neutros más pequeños Ala, Ser, Val o aminoácidos cargados Lys, Arg, Asp, o Glu puede disminuir los contactos hidrófobos y la afinidad reducida de la variante ABDCon con la albúmina. Se prevé que el residuo K30 en ABDCon formará un puente de sal con el residuo de albúmina E227 y por tanto K30 puede sustituirse por Asp o Glu para introducir cargas repulsivas y reducir potencialmente la afinidad de ABDCon con la albúmina. La mutación a cualquier aminoácido no cargado también puede reducir la afinidad eliminando el puente de sal. Se prevé que el residuo T31 de ABDCon forme un enlace de hidrógeno intermolecular con el residuo de albúmina N267 y las sustituciones por Ala o Gly pueden usarse para alterar el enlace de hidrógeno intermolecular sin introducir un choque estérico grande que podría desestabilizar significativamente la interacción. El residuo A37 de ABDCon se puede sustituir por Val, Tyr, u otro aminoácido más grande para introducir choques estéricos. El residuo E41 se puede sustituir por Gln o Asn para eliminar la carga. Puede esperarse que la introducción de residuos cargados positivamente como Lys o Arg reduzca más la afinidad de unión. Se prevé que los residuos de ABDCon L25, E33, G34, L38, 142, y A45 formen contacto directo con la albúmina, y las sustituciones en estos residuos pueden modular probablemente la afinidad de ABDCon con la albúmina. Las posiciones de residuos se refieren a ABDCon de la SeQ ID NO: 21 y albúmina humana de la SEQ ID NO: 36.

Alternativamente, se puede usar un cóctel aleatorio de aminoácidos, utilizando por ejemplo codones NNK para sustituciones en posiciones identificadas, y las variantes resultantes se miden por su unión a albúmina usando métodos estándar y métodos descritos en la presente.

Variantes de ABDCon ejemplares son variantes que tienen sustituciones en por lo menos un residuo seleccionado de Y21, Y22, L25, K30, T31, E33, G34, A37, L38, E41, I42 y A45 de la SEQ ID NO: 21.

Variantes de ABDCon ejemplares son variantes que tienen sustituciones en por lo menos un residuo seleccionado de Y21, Y22, K30, T31, A37 y E41 de la SEQ ID NO: 21.

Una variante de ABDCon ejemplar comprende una secuencia de aminoácidos KEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA (SEQ ID NO: 22; en donde X1, X2, X3 , X4, X5, y Xa, pueden ser cualquier aminoácido.

En otras realizaciones, una variante de ABDCon ejemplar comprende la secuencia de aminoácidos LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA (SEQ ID NO: 23), en la que

i) X1 es lisina (K), arginina (R), aspartato (D), glutamato (E), alanina (A ), glicina (G), fenilalanina (F) o tirosina

(Y);

ii) X2 es alanina (A), serina (S), valina (V), lisina (K), arginina (R), aspartato (D), glutamato (E) o tirosina (Y);

iii) X3 es aspartato (D), glutamato (E) o lisina (K);

iv) X4 es alanina (A), glicina (G) o treonina (T);

v) X5 es valina (V), tirosina (Y) o alanina (A); y

vi) X6 es glutamina (Q), asparagina (N), lisina (K), arginina (R) o glutamato (E).

En otras realizaciones, una variante de ABDCon ejemplar comprende la secuencia de aminoácidos LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA (SEQ ID NO: 24), en la que

i) X1 es lisina (K), alanina (A) o tirosina (Y);

ii) X2 es alanina (A), serina (S), valina (V) o tirosina (Y);

iii) X3 es aspartato (D) o lisina (K);

iv) X4 es alanina (A) o treonina (T);

v) X5 es valina (V), tirosina (Y) o alanina (A); y

vi) X6 es glutamina (Q) o glutamato (E).

Variantes de ABDCon ejemplares adicionales comprenden las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO: 25-34. Las variantes de ABDCon se prueban para la unión a albúmina usando métodos bien conocidos, por ejemplo, en un ensayo in vitro usando resonancia de plasmones ((BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Suecia). La afinidad medida de una interacción de variante de ABDCon /albúmina particular puede variar si se mide bajo diferentes condiciones (por ejemplo, osmolaridad, pH). Por tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión (por ejemplo, Kd, Kon, Kf se hacen preferiblemente con soluciones estandarizadas de la variante de ABDCon y albúmina, y un tampón estandarizado, como el tampón descrito en la presente. La afinidad de las

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

variantes de ABDCon para albúmina puede variar desde por lo menos aproximadamente 1x10-5 M, por lo menos aproximadamente 1x10-6 M, por lo menos aproximadamente 1x10-7 M, por lo menos aproximadamente 1x10-8 M, por lo menos aproximadamente 1x10-9 M, por lo menos aproximadamente 1x10-10 M, por lo menos aproximadamente 1x10-11 M, por lo menos aproximadamente 1x10-12 M, o por lo menos aproximadamente 1x10-13 M. Por ejemplo, varias sustituciones en Y22 de ABDCon (SEQ ID NO: 21) redujeron la afinidad de las variantes para la albúmina alrededor de 300-1.000 veces dependiendo de una sustitución (Tabla 4). Los expertos en la técnica pueden diseñar y generar variantes adicionales que tienen sustituciones en posiciones definidas o en combinaciones de posiciones y se prueban para una afinidad de unión a albúmina deseada usando métodos rutinarios.

El ABDCon y sus variantes pueden modificarse adicionalmente mediante la adición de una extensión de 6 aminoácidos al extremo N-terminal de ABDCon o la variante de ABDCon. La extensión de 6 aminoácidos puede consistir de una secuencia de aminoácidos TIDEWL (SEQ ID NO: 43), o cualquier secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 42 o 45-55. La incorporación de la extensión de 6 aminoácidos N-terminales en el ABDCon y variantes del mismo puede aumentar la estabilidad de la molécula. La extensión de 6 aminoácidos N- terminales puede ordenarse estructuralmente como parte de la primera hélice alfa de ABDCon y sus variantes. La estabilidad mejorada de las moléculas extendidas N-terminalmente puede por lo tanto dar como resultado la estabilización de la estructura general de la hélice. Las variantes ABDCon N-terminales pueden elaborarse usando métodos estándar y su estabilidad, por ejemplo estabilidad térmica, evaluarse como se describe en la presente. Cualquier dominio de unión a albúmina (ABD) puede modificarse con la adición de los 6 aminoácidos N-terminales para estabilizar la estructura de ABD y mejorar la estabilidad, como la estabilidad térmica de la molécula resultante.

El ABDCon y las variantes del mismo pueden modificarse adicionalmente en residuos que no afectan a la unión a la albúmina con el propósito de, por ejemplo, mejorar la estabilidad, reducir la inmunogenicidad, mejorar la solubilidad o cualquier otra característica adecuada. En una forma de lograr este objetivo, el ABDCon y las variantes del mismo pueden prepararse opcionalmente mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos diseñados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y diseñadas. Los modelos tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias candidatas seleccionadas y que pueden medir la inmunogenicidad posible (por ejemplo, el programa Immunofilter de Xencor, Inc. de Monrovia, cA). La inspección de estas pantallas permite el análisis del posible papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata, por ejemplo, los residuos que influyen en la estabilidad del dominio ABDCon. De esta manera, pueden seleccionarse y combinarse residuos a partir de las secuencias inicial y de referencia para alcanzar las características deseadas, como una estabilidad mejorada. Alternativamente, o adicionalmente a los procedimientos anteriores, pueden usarse otros métodos de diseño adecuados como se conocen en la técnica.

Las propiedades físicas deseables de los dominios de unión a albúmina de la invención incluyen alta estabilidad térmica y reversibilidad del pliegue y despliegue térmico. Se han aplicado varios métodos para aumentar la estabilidad térmica aparente de proteínas y enzimas, incluyendo el diseño racional basado en la comparación con secuencias termoestables muy similares, diseño de puentes disulfuro estabilizadores, mutaciones para aumentar la propensión a la hélice alfa, diseño de puentes de sal, alteración de la carga superficial de la proteína, evolución dirigida, y composición de secuencias de consenso ((Lehmann and Wyss, Curr Opin Biotechnol 12:371-375, 2001). La alta estabilidad térmica puede aumentar el rendimiento de la proteína expresada, mejorar la solubilidad o la actividad, disminuir la inmunogenicidad y minimizar la necesidad de una cadena de frío en la fabricación.

Los residuos que pueden sustituirse para mejorar cualquier característica de los dominios de unión a albúmina de la invención pueden determinarse haciendo la sustitución y ensayando las características deseadas del dominio de unión a albúmina. Por ejemplo, puede emplearse exploración con alanina para identificar posiciones en el ABDCon y variantes del mismo que puedan afectar a la estabilidad del dominio de unión a albúmina.

En términos de pérdida de estabilidad, es decir, "desnaturalizar" o "desnaturalización" de una proteína, se entiende el proceso en el que algunas o todas las conformaciones tridimensionales que imparten las propiedades funcionales de la proteína se han perdido con la consiguiente pérdida de actividad y/o solubilidad. Las fuerzas alteradas durante la desnaturalización incluyen enlaces intramoleculares, por ejemplo, fuerzas electrostáticas, hidrófobas, de Van der Waals, enlaces de hidrógeno y disulfuros. La desnaturalización de proteínas puede estar provocada por fuerzas aplicadas a la proteína o una solución que comprende la proteína, como fuerza mecánica (por ejemplo, fuerza de compresión o cizallamiento), estrés térmico, osmótico, cambio en el pH, campos eléctricos o magnéticos, radiación ionizante, radiación ultravioleta y deshidratación, y por desnaturalizantes químicos.

La medición de la estabilidad de la proteína y la labilidad de la proteína se puede ver como los mismos o diferentes aspectos de la integridad de la proteína. Las proteínas son sensibles o "lábiles" a la desnaturalización provocada por calor, por radiación ultravioleta o ionizante, cambios en la osmolaridad ambiental y pH si está en solución líquida, fuerza de cizallamiento mecánica impuesta por filtración por tamaño de poro pequeño, radiación ultravioleta, radiación ionizante, como por radiación gamma, deshidratación química o por calor, o cualquier otra acción o fuerza que pueda provocar la alteración de la estructura de la proteína. La estabilidad de la molécula se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

puede determinar usando métodos estándar. Por ejemplo, la estabilidad de una molécula puede determinarse midiendo la temperatura de fusión térmica (Tm), la temperatura en ° Celsius (°C) a la que la mitad de las moléculas se despliegan, usando métodos estándar. Típicamente, cuanto mayor sea Tm, más estable será la molécula. Además del calor, el entorno químico también cambia la capacidad de la proteína para mantener una estructura tridimensional particular.

La desnaturalización química puede medirse de igual manera mediante una variedad de métodos. Los desnaturalizantes químicos incluyen hidrocloruro de guanidinio, tiocianato de guanadinio, urea, acetona, solventes orgánicos (DMF, benceno, acetonitrilo), sales (sulfato de amonio bromuro de litio, cloruro de litio, bromuro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de sodio); agentes reductores (por ejemplo, ditiotreitol, beta-mercaptoetanol, dinitrotiobenceno e hidruros, como borohidruro de sodio), detergentes no iónicos e iónicos, ácidos (por ejemplo, ácido clorhídrico (HCl), ácido acético (CH3COOH), ácidos acéticos halogenados), moléculas hidrófobas (por ejemplo fosfolípidos) y desnaturalizantes selectivos. La cuantificación de la extensión de la desnaturalización puede basarse en la pérdida de una propiedad funcional, como la capacidad de unirse a una molécula objetivo, o por propiedades fisicoquímicas, como tendencia a la agregación, exposición de residuos anteriormente inaccesibles por solventes o alteración o formación de enlaces disulfuro.

El dominio de unión ABDCon y variantes del mismo pueden estar ligados operativamente a un agente bioactivo. Los agentes bioactivos ejemplares son péptidos y proteínas que se pueden ligar operativamente a ABDCon y variantes del mismo usando conectores bien conocidos, por ejemplo un conector que contiene poli- glicina, glicina y serina (conector Gly-Ser) o alanina y prolina. El uso de conectores de péptidos de origen natural así como artificiales es bien conocido en la bibliografía (Hallewell et al., J Biol Chem 264:5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8:725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35:109-116, 1996; Patente U.S. N° 5.856.456). El agente bioactivo se puede ligar a ABDCon o a una variante del mismo desde su extremo C- o N-terminal. Los agentes bioactivos multiespecíficos también pueden ligarse a ABDCon. En estos casos, el ABDCon puede estar ligado al extremo N-terminal o C-terminal de la molécula. El ABDCon también puede posicionarse internamente en dicho agente multiespecífico de tal manera que esté ligado unido al extremo C-terminal de un agente y al extremo N- terminal de otro. Los agentes bioactivos también pueden acoplarse a los dominios de unión a albúmina de la invención usando reticulación química bien conocida en la técnica, por ejemplo, utilizando ligamiento con hidrazona o semicarbazona. Los ejemplos de agentes bioactivos son proteínas que se unen específicamente a un antígeno objetivo como proteínas identificadas a partir de bibliotecas de proteínas de repetición de fibronectina tipo III (FN3), como bibliotecas basadas en Tencon25 descritas en la WO2011/137319A2 y la WO2010/093627A2.

Pueden incorporarse fracciones adicionales en ABDCon o variantes del mismo de la invención, como conjugados de toxinas, moléculas de polietilenglicol (PEG), como PEG5000 o PEG20,000, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos de diferentes longitudes de cadena, por ejemplo laurato, miristato, estearato, araquidato, behenato, oleato, araquidonato, ácido octanedioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico, y similares, polilisina, octano, carbohidratos (dextrano, celulosa, oligo- o polisacáridos) para las propiedades deseadas. Estas fracciones pueden ser fusiones directas con las secuencias de codificación de ABDCon y pueden generarse mediante técnicas de clonación y expresión estándar. Alternativamente, se pueden usar métodos de acoplamiento químico bien conocidos para unir las fracciones al ABDCon producido recombinantemente de la invención.

El ABDCon y las variantes del mismo, así como las proteínas de fusión de los agentes bioactivos y ABDCon pueden evaluarse para su vida media usando propiedades farmacocinéticas bien conocidas en modelos in vivo. El ABDCon y las variantes del mismo se unen a la albúmina con una Kd de aproximadamente entre 1 pM - 1 |jM, entre 75 pM - 860 nM, entre 100 pM - 500 nM, o entre 1 nM -100 nM.

Generación y Producción de ABDCon y variantes del mismo

La generación de los dominios de unión a la albúmina de la invención se logra típicamente a nivel de ácido nucleico usando métodos estándar. Las variantes de ABDCon que tienen codones sustituidos en uno o más residuos específicos pueden sintetizarse, por ejemplo, usando métodos de clonación por PCR estándar, o síntesis de genes química de acuerdo con los métodos descritos en las Patente U.S. N° 6.521.427 y la Patente U.S. N° 6.670.127, o usando mutagénesis de Kunkel (Kunkel et al., Methods Enzymol 154:367-382, 1987). Si se van a usar codones aleatorizados para cualquier posición de residuo, la aleatorización puede lograrse usando métodos bien conocidos, por ejemplo oligonucleótidos degenerados que coinciden con la diversidad diseñada, o por ejemplo usando codones NNK, que codifican los 20 aminoácidos de origen natural. En otros esquemas de diversificación, pueden usarse codones DVK para codificar los aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, y Cys. Alternativamente, pueden usarse codones NNS para dar lugar a los 20 residuos de aminoácidos y reducir simultáneamente la frecuencia de los codones de parada. Las designaciones de codones están de acuerdo con el código IUB bien conocido.

La síntesis de oligonucleótidos con "degeneración" de nucleótidos seleccionada en ciertas posiciones es bien conocida en esa técnica, por ejemplo, el enfoque TRIM (et al., J Mol Biol 296:57-86, 1999; Garrard & Henner,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Gene 128:103-109, 1993). Tales conjuntos de nucleótidos que tienen ciertos conjuntos de codones pueden sintetizarse usando reactivos y aparatos de nucleótidos o nucleósidos comercialmente disponibles.

Las técnicas clásicas de clonación y expresión estándar se usan para clonar ABDCon o variantes del mismo en un vector o sintetizar ADNc de cadena doble de ABDCon para expresar, o traducir la proteína in vitro. Los agentes bioactivos pueden ligarse operativamente a ABDCon o variantes del mismo usando métodos bien conocidos.

Moléculas y Vectores de Ácidos Nucleicos

La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican ABDCon o variantes del mismo de la invención como polinucleótidos aislados o como porciones de vectores de expresión o como porciones de secuencias de ADN lineales, incluyendo secuencias de ADN lineales usadas para transcripción/traducción in vitro, vectores compatibles con la expresión, secreción y/o presentación de fagos procariotas, eucariotas o filamentosos de las composiciones. En la presente se divulgan ciertos polinucleótidos ejemplares, sin embargo, otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o las preferencias de codones en un sistema de expresión dado, codifican ABDCon o variantes del mismo de la invención también están dentro del alcance de la invención.

Los polinucleótidos de la invención pueden producirse mediante síntesis química, como síntesis de polinucleótidos en fase sólida en un sintetizador de polinucleótidos automatizado y ensamblarse en moléculas de cadena sencilla o doble completas. Alternativamente, los polinucleótidos de la invención pueden producirse mediante otras técnicas, como PCR seguida de clonación rutinaria. Las técnicas para producir u obtener polinucleótidos a partir de una secuencia conocida dada son bien conocidas en la técnica.

Los polinucleótidos de la invención pueden comprender por lo menos una secuencia no codificante, como una secuencia promotora o potenciadora, intrón, señal de poliadenilación y similares. Las secuencias de polinucleótidos también pueden comprender secuencias adicionales que codifican aminoácidos adicionales que codifican por ejemplo un marcador o una secuencia etiqueta como una hexa-histidina o una etiqueta HA para facilitar la purificación o detección de la proteína, una secuencia señal, un socio de proteína de fusión, como ADNc que codifica un agente bioactivo, y similares.

Un polinucleótido ejemplar comprende las secuencias que codifican ABDCon, secuencias para un sitio de unión a ribosoma, secuencia promotora, secuencia terminadora, gen de resistencia a antibióticos, y un origen de replicación bacteriano (ori). Los polinucleótidos ejemplares que codifican los dominios de unión a albúmina de la invención se muestran en la SEQ ID NO: 35.

Otra realización de la invención es un vector que comprende por lo menos un polinucleótido de la invención. Tales vectores pueden ser vectores plasmídicos, vectores virales, vectores para la expresión de baculovirus, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción de los polinucleótidos de la invención en un organismo o fondo genético dado por cualquier medio. Tales vectores pueden ser vectores de expresión que comprenden elementos de secuencias de ácidos nucleicos que pueden controlar, regular, provocar o permitir la expresión de un polipéptido codificado por dicho vector. Tales elementos pueden comprender sitios de unión potenciadores transcripcionales, sitios de iniciación de ARN polimerasa, sitios de unión a ribosomas, y otros sitios que facilitan la expresión de polipéptidos codificados en un sistema de expresión dado. Tales sistemas de expresión pueden ser sistemas basados en células o sistemas libres de células bien conocidos en la técnica.

Selección de la Célula Huésped o Diseño de la Célula Huésped

El ABDCon y las variantes del mismo de la presente invención pueden producirse opcionalmente mediante una línea celular, una línea celular mixta, una célula inmortalizada o una población clonal de células inmortalizadas, como es bien conocido en la técnica. Ver, por ejemplo, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ediciónn, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow y Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).

La célula huésped elegida para la expresión puede ser de origen mamífero o puede seleccionarse de COS- 1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, HeLa, mieloma, linfoma, levadura , células de insectos o de plantas, o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de las mismas. Alternativamente, la célula huésped puede seleccionarse de una especie u organismo incapaz de glicosilar polipéptidos, por ejemplo, una célula u organismo procariota, como BL21, BL21(DE3), BL21-GOLD(DE3), XL1-Blue, JM109, HMS174, HMS174(DE3), y cualquiera de las cepas de E. coli spp, Klebsiella spp., o Pseudomonas spp. de origen natural o diseñadas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Usos de dominios de unión a albúmina de la invención

Las composiciones del dominio de unión a albúmina no natural ABDCon y las variantes del mismo de la invención pueden usarse para modular la vida media y/o la biodistribución de un agente bioactivo dentro del tejido de un animal ligando operativamente el ABDCon y el agente bioactivo, y en donde la administración de la composición a un animal da como resultado una vida media y/o biodistribución del agente bioactivo que es diferente de la distribución del tejido obtenida tras la administración del agente activo solo.

Composiciones farmacéuticas que comprenden ABDCon o variantes del mismo

El ABDCon o las variantes del mismo que se unen ligados operativamente a agentes bioactivos pueden aislarse usando procedimientos de separación bien conocidos en la técnica para la captura, inmovilización, división o sedimentación, y purificarse en la medida necesaria para su aplicabilidad comercial.

Para uso terapéutico, las proteínas de fusión de molécula bioactiva-ABDCon pueden prepararse como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz de la proteína de fusión agente bioactivo-ABDCon como un ingrediente activo en un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto activo. Tales vehículos pueden ser líquidos, como agua y aceites, incluidos de origen del petróleo, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, se puede usar un 0,4% de solución salina y un 0,3% de glicina. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de material particulado. Se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea requerido para aproximar condiciones fisiológicas como agentes de ajuste del pH y de tamponamiento, agentes estabilizadores, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración de la proteína de fusión agente bioactivo-ABDCon en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente el 0,5%, habitualmente a o por lo menos aproximadamente el 1% a tanto como el 15 o el 20% en peso y se seleccionará principalmente en base a la dosis requerida, volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado. Los vehículos y formulaciones adecuados se describen, por ejemplo, en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams y Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Parte 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, Ver especialmente pp. 958-989.

El modo de administración para el uso terapéutico de la proteína de fusión agente bioactivo-ABDCon puede ser cualquier vía adecuada que administre el agente al huésped, como administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea, pulmonar; transmucosal (oral, intranasal, intravaginal, rectal); usando una formulación en un comprimido, cápsula, solución, suspensión, polvo, gel, partícula; y contenida en una jeringuilla, un dispositivo implantado, bomba osmótica, cartucho, microbomba; u otros medios apreciados por el experto en la técnica, como es bien sabido en la técnica. La administración específica del sitio puede lograrse, por ejemplo, por administración intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelosa, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intracardíaca, intraósea, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravascular, intravesical, intralesional, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmica.

Aunque se ha descrito la invención en términos generales, las realizaciones de la invención se divulgarán adicionalmente en los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitativos del alcance de las reivindicaciones.

EJEMPLO 1. Generación de dominio de unión a albúmina no natural Diseño del consenso del dominio de unión a albúmina no natural (ABDCon)

Se diseñó un dominio de unión a albúmina no natural (ABD) calculando una secuencia de aminoácidos de consenso de las secuencias de ABD de haz de 3 hélices depositadas en la base de datos de proteínas no redundante. Para determinar la secuencia de consenso, se usó como secuencia plantilla la ABD de la proteína G G148 de Streptococcus sp. (SEQID NO: 1) para una búsqueda BLAST contra la base de datos de proteínas NCBI no redundante (http:_//blast_ncbi_nlm_nih_gov/Blast_cgi). Se usaron todas las configuraciones predeterminadas para la búsqueda BLAST; Umbral esperado = 10, tamaño de palabra = 3, matriz = BLOSUM62, costes de espacios = existencia 11, extensión 1 y ajustes de composición = ajuste de matriz de puntuación composicional condicional. A partir de esta búsqueda, se seleccionaron los 20 dominios de proteína más estrechamente relacionados, enumerados en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1-20), para incluirlos en una alineación de secuencia múltiple para determinar un consenso. Solo se seleccionaron secuencias no redundantes. En la Tabla 1 se enumeran múltiples veces varios números de acceso de proteínas, lo que indica que algunas proteínas contienen varios dominios de ABD estrechamente relacionados. La SEQ ID NO: 4 es un ABD no natural derivado por presentación de fagos y transposición de genes. (He et al., Protein Sci 16::1490-1494, 2007).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tabla 1

Número de Acceso del Dominio de Proteína: SEQ ID NO:

P19909: 1

AAA26847: 2

AAA26847: 3

2FS1_A: 4

YP_002123072: 5

ZP_07321229: 6

ZP_07321229: 7

AAA67503: 8

AAA67503: 9

AAA67503: 10

AAA67503: 11

ZP_07734934: 12

ZP_06946534: 13

ZP_07321240: 14

ZP_07906833: 15

Q51911: 16

YP_001692809: 17

ZP_07702676: 18

ZP_07702676: 19

ZP_07268895: 20

Se generó una alineación de múltiples secuencias a partir de las secuencias enumeradas usando software AlignX ( usando todas las configuraciones predeterminadas). La alineación de secuencias mostrada en la Tabla 6 se usó para seleccionar el aminoácido más prevalente en cada posición de secuencia para derivar la secuencia de consenso del dominio de unión a albúmina, ABDCon (SEQ ID NO: 21, Tabla 6). Se eligió Tyr en lugar de Ile para la posición 21 ya que no había un consenso claro para esta posición y los residuos aromáticos Tyr y Phe estaban bien representados. Identidades de secuencias por parejas entre el intervalo de ABDCon del 45% (SEQID NO: 3) a 82% (SEQID NO: 8, 13, 14, y 16).

Síntesis génica

La secuencia de aminoácidos de consenso del dominio de unión a albúmina (ABDCon) se tradujo de vuelta a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica ABDCon utilizando codones preferidos para la expresión de E. coli como se indica a continuación (SEQID NO: 35) y un gen sintético producido (BlueHeron Biotechnologies). Se añadieron las secuencias de ADN 5' y 3' a la secuencia del gen sintético de la SEQ ID NO: 34 para añadir sitios NdeI y XhoI para la subclonación, así como secuencias de ADN que codifican una etiqueta 8-His N-terminal para la purificación de proteínas. Este gen se clonó en un vector pET26 (Novagen) para la expresión dirigida por una secuencia promotora T7 y se transformó en la cepa BL21 (DE3) de E. coli (Novagen).

Expresión y Purificación

Para la expresión de ABDcon, se inocularon 50 ml de medio LB suplementado con 30 pg/ml de kanamicina con 1 colonia y se cultivó durante toda la noche a 37° C, 220 rpm de agitación. Al día siguiente, se añadieron 10 ml del cultivo durante la noche a 100 ml de Terrific Broth suplementado con 30 pg/ml de kanamicina y el cultivo se hizo crecer a 37° C, a 220 rpm durante 2,5 horas. Se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM y la temperatura se redujo a 30° C para inducir la expresión de proteínas. Las células se recogieron 14 horas después por centrifugación a 4000 X g durante 20 minutos y los sedimentos celulares se almacenaron a -20° C. Los sedimentos celulares congelados se resuspendieron en 5 ml de BugBuster HT (Novagen) por gramo de sedimento húmedo y se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

mezclaron suavemente a temperatura ambiente durante 30 minutos. La molécula de ABDCon etiquetada con poli- histidina se purificó por cromatografía en Ni-NTA (GE Healthcare), eluyendo en un tampón de fosfato sódico 50 mM pH 7,4, cloruro sódico 500 mM con un gradiente de imidazol 10-250 mM . Las fracciones que contenían ABDCon se agruparon y se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna Superdex75 16/60 (GE Healthcare) con una fase móvil de PBS. La pureza se evaluó mediante análisis SDS-PAGE (Figura 1). La espectrometría de masas determinó que la masa era de 6383 Da, de acuerdo con la masa teórica de 6382 Da (Figura 2). La cromatografía de exclusión por tamaño analítica usando una columna Superdex 75 5/150 (GE Healthcare) muestra que la preparación de ABDCon está libre de agregados y eluye en un tiempo consistente con una proteína monomérica (Figura 3).

EJEMPLO 2. Caracterización de ABDCon

Estabilidad Térmica de ABDCon

El ABDCon se concentró a 2,175 mg/ml en PBS pH 7,4 y se evaluó la estabilidad térmica mediante calorimetría de barrido diferencial (DSC). Los datos de estabilidad se generaron calentando 400 pl de la solución de ABDCon de 25° C a 100° C a una velocidad de barrido de 1° C por minuto en un instrumento VP-DSC (MicroCal). Se completó un segundo barrido idéntico en la muestra para evaluar la reversibilidad del plegado/desplegado térmico. Los datos se ajustaron a un modelo de despliegue de 2 estados para calcular la temperatura de fusión. La Figura 4 muestra que ABDCon tiene una alta estabilidad térmica de 81,5° C en PBS y que el plegado es completamente reversible.

Unión de ABDCon a Albúmina

Se midieron las cinéticas de unión de ABDCon a albúmina de suero humano y albúmina de suero de ratón se midió en un Sistema de Matriz de Interacción de Proteínas ProteOn™ XPR-36 (Bio-Rad) usando chips de detección GLC. Las albúminas de suero humana (SEQ ID NO: 36), Rhesus (SEQ ID NO: 37) y murina (SEQ iD NO: 38) se adquirieron de Sigma (Catálogo N° A4327 para humanos, N° A3559 para murino, y N° A4297 para rhesus ) y se resuspendieron en PBS a diferentes concentraciones. Cada albúmina de suero se inmovilizó directamente en un canal de ligando en la orientación vertical de un chip GLC mediante acoplamiento de aminas estándar a 2,1 pg/ml a pH 5,0 para obtener superficies con densidades de ligandos de 500-1000 unidades de resonancia. La unión del ABDCon recombinante se probó mediante el flujo de cinco concentraciones diferentes (por ejemplo, 1 pM diluido en una serie de concentración de 3 veces) como analitos simultáneamente en la orientación horizontal sobre las superficies de albúmina de suero inmovilizadas. Las fases de disociación para todas las concentraciones se monitorizaron durante dos horas a un caudal de 100 pl/min usando PBST (PBS, 0,005% de Tween20) como tampón de ejecución. Se inyectó una sexta muestra (solo tampón) para monitorizar la estabilidad del valor inicial. Las superficies se regeneraron usando 1 pulso corto (18 pl) de 0,8% de ácido fosfórico.

Tabla 2.

Albúmina: kon (1/Ms) koff (1/s) Kd(M)

Humana: 4.04E+05 3.02E-05 7.48E-11

Ratón: 2.41E+05 7.76E-04 3.22E-09

Rhesus: 1.13E+06 6.78E-05 6.01 E-11

Los datos de respuesta sin procesar se procesaron primero restando las respuestas de sólo tampón y la unión no específica entre los analitos y el chip. Los datos procesados de las cinco concentraciones se ajustaron globalmente a un modelo de unión langmuir simple 1:1 para cada superficie del ligando. La Tabla 2 describe la cinética de unión determinada para cada especie de albúmina.

Vida media en suero de la fusión de ABDCon en ratones

Se evaluó la capacidad de ABDCon para extender la vida media en suero de una proteína de fusión produciendo un gen sintético que codifica una fusión de ABDCon con el extremo c-terminal de Tencon25. Tencon25 es un andamiaje de proteína basado en una secuencia consenso de una proteína de repetición de fibronectina tipo III (FN3) que tiene una secuencia que se muestra en los residuos 1-90 de la SEQ ID NO: 39, y se describe en la US2011/0274623A1. Los dominios de proteína Tencon25 y ABDCon se fusionaron mediante un conector peptídico

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(G4S)2 (SEQ ID NO: 40). La proteína de fusión resultante tiene una secuencia polipeptídica mostrada en la SEQ ID NO: 39. Se incorporó una etiqueta de poli-histidina en el extremo C-terminal con propósitos de purificación. Se dividieron sesenta y nueve ratones hembra BALB/c en 3 grupos (N= grupo 1 control no tratado, y N=33 grupos 23). Los ratones se trataron con una única dosis intravenosa de la proteína de fusión Tencon25-ABDCon a 2 mg/kg. La dosificación se basó en el peso de los animales el día de la administración. Los ratones fueron sacrificados en los siguientes puntos temporales después de la inyección: 10 minutos, 30 minutos, 1, 4, 6 horas, y 1, 2, 3, 7, 10, 14 días. Se tomaron muestras de sangre de cada animal mediante punción cardíaca. Se permitió que las muestras de sangre coagulasen a temperatura ambiente durante 30 minutos, pero no más de 1 hora. Las muestras de sangre se centrifugaron luego a aproximadamente 3.500 rpm durante 15 minutos. Las muestras de suero se analizaron usando un ELISA tipo sándwich homogéneo en la plataforma Mesoscale Discovery. Las placas de Estreptavidina-Oro (Descubrimiento de Mesoescala) se bloquearon durante 1 hora con Superblock (TBS) Tween-20 (Thermo). Se usó anticuerpo anti-Tencon25 policlonal tanto para la captura (biotinilado) como para la detección (marcado con MSD Sulfo-Tag (Mesoscale Discovery)) a 0,625 pg/ml. Se añadieron el antígeno y los anticuerpos a las placas, que se incubaron durante 2 horas con agitación vigorosa a RT. Las placas se lavaron con TBS-T (Sigma) y se añadió Tampón de Lectura MSD con Surfactante (Mesoescala Discovery). Las placas se leyeron usando un MSD Sector Imager 6000. Los datos se analizaron usando GraphPad Prism. Los estudios previos han demostrado que una molécula de Tencon sin fusionar similar se depura del torrente sanguíneo rápidamente con una vida media en suero de aproximadamente 20 minutos en ratones. La fusión de Tencon25 con ABDCon extiende la vida media en suero a más de 60 horas (Figura 5).

EJEMPLO 3: Diseño de ABDCon para variar la afinidad para albúmina sérica

La afinidad de unión a la albúmina sérica puede dictar no solo la vida media en suero de una proteína terapéutica sino también la capacidad de esa molécula para unirse y neutralizar su objetivo. Por ejemplo, una molécula que se une demasiado débilmente a la albúmina sérica tendrá una vida media en suero corta debido a la filtración renal mientras no esté unida a la albúmina (Hopp et al., Protein Eng Des Sel 23:827-834, 2010). Por el contrario, una molécula que se une demasiado a la albúmina no se liberará de la albúmina en el sitio de acción preferido y, por tanto, puede ser incapaz de neutralizar el objetivo deseado en algunos casos. Por lo tanto, es preferible lograr la extensión de la vida media a través de la unión a la albúmina de manera que la interacción con la albúmina sea sólo lo suficientemente estrecha como para proporcionar la vida media en suero deseada. Como la secuencia de ABDCon descrita en la presente se une a la albúmina de suero humana con una afinidad de 75 pM y una velocidad de disociación de 3,02x1015 1/s (bajo condiciones experimentales descritas en la presente), las moléculas fusionadas con ABDCon se unirán en gran medida a la albúmina una vez administrada a un animal o paciente. Para algunos objetivos y fusiones, puede ser deseable unirse menos estrechamente a la albúmina sérica. Se diseñaron diez versiones mutantes de ABDCon para disminuir la afinidad de unión de ABDCon para la albúmina. La Tabla 3 resume estos mutantes:

Tabla 3.

Constructo: Mutación* SEQ ID NO: Razón fundamental

ABDCon2: Y21A 25 Alterar el apilamiento aromático con residuos de albúmina F309 y F326

ABDCon3: Y21K 26 Alterar el apilamiento aromático con residuos de albúmina F309 y F326. Insertar choque estérico

ABDCon4: Y22A 27 Disminuir contactos hidrófobos

ABDCon5: Y22S 28 Disminuir contactos hidrófobos

ABDCon6: Y22V 29 D Disminuir contactos hidrófobos ligeramente

ABDCon7: E41Q 30 Eliminar carga para alterar el puente de sal

ABDCon8: K30D 31 Alterar carga para alterar el puente de sal

ABDCon9: T31A 32 Eliminar el enlace de hidrógeno intermolecular

ABDCon10: A37V 33 Introducir choque estérico

ABDCon11: A37Y 34 Introducir choque estérico

*Numeración de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 21

Se seleccionaron mutantes de ABDCon examinando la estructura cristalina del módulo GA (módulo de unión a albúmina relacionado con proteína G) unida a albúmina en suero humana (PDB código 1TF0) (Lejon et al., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 64:64-69, 2008) y suponiendo que ABDCon se une a la albúmina de manera muy similar a GA. Los mutantes se diseñaron para disminuir la afinidad de ABDCon para la albúmina

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

alterando los contactos hidrófobos, introduciendo choques estéricos, alterando los puentes de sal y alterando el enlace de hidrógeno (Tabla 3). Los cambios introducidos se diseñaron para disminuir la afinidad de unión sin cambiar la superficie de unión tan drásticamente que se anulase la unión. Cada mutante se expresó y se purificó a partir de E. coli como se describe para ABDCon. Se descubrió que el mutante ABDCon11 era insoluble y por tanto se excluyó de un análisis posterior. Las afinidades de cada variante para albúmina sérica humana, de ratón y rhesus se determinaron mediante resonancia de plasma superficial y se muestran en la Tabla 4. Además de las posiciones enumeradas en la Tabla 3, los residuos L25, E33, G34, L38, 142, y A45 pueden mutarse para aumentar o disminuir la afinidad de ABDCon para la albúmina ya que se prevé que formen contactos directos con la albúmina.

Tabla 4.

Variante: Kq Humano (nM) Kq de ratón (nM) Kq Rhesus (nM)

ABDCon2: 6.1 ND 17.5

ABDCon3: 1 103 5.1

ABDCon4: 13.6 571 43.7

ABDCon5: 54.8 1650 104

ABDCon6: 2.7 190 8.4

ABDCon7: 0.4 20.6 0.5

ABDCon8: 43 1001.7 65

ABDCon9: 860 550.8 206

ABDCon10: 0.8 37.8 1.3

EJEMPLO 4: Vida media en suero de proteínas de fusión variantes de ABDCon

Se fusionaron Tencon24 (aminoácidos 1-90 de la SEQ ID NO: 39) con las variantes de ABDCon 3, 5, 7, y 9 (Tabla 3) para evaluar la correlación entre la afinidad de ABDCon para la albúmina con la extensión de la vida media. Estas moléculas se dosificaron en ratones a 2 mg/kg como se ha descrito con anterioridad en estudios previos y se analizaron usando métodos idénticos a los descritos para las fusiones Tencon25-ABDCon. Un resumen de los parámetros PK obtenidos para estas moléculas se muestra en la Tabla 5 y la Figura 6. Aquí se demuestra que la velocidad de depuración disminuye a medida que se aumenta la afinidad para la albúmina hasta alcanzar una afinidad de 103 nM, punto en el cual, no se obtuvieron grandes diferencias en los parámetros de PK. Los datos en la Tabla 5 demuestran la capacidad de ajustar propiedades tales como vida media, velocidad de depuración, y exposición total (AUC) variando la afinidad de la molécula de ABDCon para la albúmina.

Tabla 5.

Constructo: Kp(nM) T(1/2) (horas) Volumen de Distribución (ml/kg) Depuración (ml/hr/kg) AUC (hora*ng/ml)

Tencon25- ABDCon: 1.86 60.42 83.2873 0.9555 2054332

Tencon25- ABDCon3: 103 45.8355 60.645 0.915 2166461

Tencon25- ABDCon5: 1650 32.8715 223.86 4.72 423635

Tencon25- ABDCon7: 20.6 46.7499 49.915 0.74 2681641

Tencon25- ABDCon9: 550.8 34.1956 81.87 1.66 1205061

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tabla 6.

SEQ ID: Secuencia

13: LKEAKEKAVEELKENGITSEKYIDQINKAKTVEGVNALKDEMKA

14: LKEAKEKAVEELKNNGITSEKYIDQINKAKTVEGVNALKDEMKA

17: LKEAKEKAVEELKNNGITSEKYIEQINKAKTVEGVNALKDEIIKA

20: LKEAKEKAIEELKNNGITSEKYIEQINKAKTVEGVNALKDEIIKS

7: LKDAKEKAIEAIRKEGVKSKLYEDLINKAKTIDGVNALRDQIIEA

1: LAEAKVLANRELDKYGVS-DYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAA

2: LSEAKEMAIRELDAQGVS-DFYKNKINNAKTVEGVVALKDLILNS

3: LDQAKQAALKEFDRYGVS-NYYKNLINKAKTVEGIMELQAQVV--

12: LAEAKKVAHEEFTKAGITGKIFHDAIDAAKTVEGLKAYVAETLAA

15: LAEAKKVAHEEFTKAGITGKIFHDAIDAAKTVEGLQAYVAETLAA

18: LAEAKNVAHAEFTKAGITGKIFHDAIDAAKTVEGLQAYVAETLAA

19: LAEAKKAAHEEFTKAGITGKIFHDAIDAAKTVEGLQAYVAETLKA

4: LAQAKEAAIKELKQYGIG-DYYIKLINNAKTVEGVESLKNEILKA

5: LLKAKEAAINELKQYGIS-DYYVTLINKAKTVEGVNALKAEILSA

16: LKNAKEDAIAELKKAGITSDFYFNAINKAKTVEEVNALKNEILKA

10: LKNAKEDAIKELKEAGISSDIYFDAINKAKTVEGVEALKNEILKA

11: LKNAKEDAIKELKEAGITSDIYFDAINKAKTIEGVEALKNEILKA

6: LKNAKEDAIKELKEAGIKSQFFFNLINNAKTVEGVESLKNEILKA

9: LKNAKEAAIKELKEAGITAEYLFNLINKAKTVEGVESLKNEILKA

8: LKNAKEEAIKELKEAGITSDLYFSLINKAKTVEGVEALKNEILKA

21: LKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA

Ejemplo 5: Estabilización de dominios de unión a albúmina

Se completaron estudios para determinar la estabilidad de ABDCon (SEQ ID NO: 21) cuando se produjeron como proteínas de fusión con varios dominios de fibronectina tipo III (FN3) (ver, por ejemplo, Publicación de Patente U.S. N° US2010/0216708). Las proteínas de fusión de dominio FN3-ABDcon se generaron usando técnicas de clonación estándar. La secuencia de aminoácidos de una de las proteínas de fusión, Tencon-ABDCon se muestra en la SEQ ID NO: 41. Otras proteínas de fusión de dominio FN3-ABDCon preparadas fueron Tencon25-ABDCon, 83- ABDCon y 71-ABDCon. Estas proteínas se produjeron con etiquetas de poli-histidina c-terminales y se purificaron mediante una combinación de afinidad de níquel y cromatografía de exclusión por tamaño usando métodos estándar. Cada molécula purificada se incubó en PBS pH 7.4 a 37° C durante 28 días antes del análisis mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas. La Figura 7 demuestra que se descubrió que cada proteína de fusión de dominio FN3-ABDCon se degradó durante esta incubación como se evidencia por la aparición de bandas de bajo peso molecular en el gel SDS-PAGE. El análisis por espectrometría de masas confirmó que el patrón de degradación principal era la escisión de estas moléculas en los residuos L1, K2 y E3 de la secuencia ABDCon (SEQ ID NO: 21). Adicionalmente, se observó que la proteína G ABD nativa de Streptococcus (SEQ ID NO: 1) fusionada a un dominio FN3 mostraba un patrón de degradación similar con la escisión en el residuo L1 cuando se incubaba a 4° C durante 6-8 meses (datos no mostrados). Finalmente, se observó que varios lotes purificados de ABD nativo (SEQ ID NO: 1) y ABDCon (SEQ ID NO: 21) eran inactivos e indetectables en solución mediante SDS-PAGE una vez almacenados durante varios meses a 4° C, indicativo de una degradación grave.

Las observaciones anteriores sugirieron que la hélice alfa N-terminal de las estructuras ABDCon y ABD nativa como se usan para la extensión de vida media en suero son inestables. Esta falta de estabilidad para tales proteínas de fusión es indeseable ya que limita potencialmente la vida útil de dichas moléculas para investigación así como para aplicaciones terapéuticas. Como tal, se desarrolló una estrategia para mejorar la estabilidad de estas moléculas. El análisis de las estructuras tridimensionales de los dominios de unión a albúmina depositados en el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Banco de Datos de Proteínas muestra que la secuencia de aminoácidos TIDQWL (SEQ ID NO: 42) encontrada N- terminal al inicio del ABD nativo (SEQ ID NO: 1) está estructuralmente ordenada como parte de la primera hélice alfa de esta molécula en varias estructuras cristalinas (por ejemplo, PDB 2VDB, Acta Cryst 2008 F64, 64-69). Esto se opone a la estructura de NMR original de ABD que mostraba que esta región estaba desordenada en solución PDB 1GAB, Johansson et al., J.Mol.Biol.266: 859-865, 1997). Por tanto, se hipotetizó que extender esta primera hélice alfa de las secuencias ABD y ABDCon podría impartir mayor estabilidad a esta región ya que la extensión de las hélices alfa puede impartir mayor estabilidad a dicha hélice (Su et al., Biochemistry 33:15501-15510, 1994).

Una alineación de secuencias múltiples de los dominios de unión a albúmina naturales presentados en la Tabla 1 no reveló una secuencia de clara consenso para estos residuos N-terminales. Sin embargo, una secuencia peptídica, TIDEWL (SEQ ID NO: 43), está presente N-terminal para 5 de estos dominios de proteína. Por tanto, se generó un nuevo constructo ABDCon, ABDCon12 (SEQ ID NO: 44), añadiendo la secuencia TIDEWL al extremo N- terminal de ABDCon. Esta proteína se expresó con una etiqueta de poli-histidina N-terminal y se purificó hasta la homogeneidad usando métodos estándar para cromatografía de afinidad de níquel y cromatografía de exclusión por tamaño. El ABDCon12 purificado se incubó a 37° C en PBS durante 28 días y la estabilidad se evaluó mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas. La SDS-PAGE mostró un patrón de migración ligeramente más rápido después del día 14 indicativo de degradación. Sin embargo, el análisis de masa total demuestra que esta degradación se produce exclusivamente en la etiqueta de polihistidina y no en la secuencia de ABDCon12, indicando que la secuencia TIDEWL mejoró la estabilidad de ABDCon. Se demostró una prueba adicional de estabilidad en la estabilidad de una proteína de fusión de dominio FN3-ABDCon12 generada (Figura 7B) que mostró productos de la degradación significativamente menores en comparación con las moléculas de dominio FN3-ABDCon originales (Figura 7A) cuando se incubaron a 37° C en PBS durante 28 días.

La temperatura de fusión de ABDCon12 se determinó mediante calorimetría de barrido diferencial usando los procedimientos esbozados en el Ejemplo 2 anterior para investigar el mecanismo de estabilización para esta molécula. Se obtuvo una temperatura de fusión de 90,9° C en PBS, un aumento de 9,4° en comparación con la molécula ABDcon original, sugiriendo que la disminución en la proteolisis/degradación observada para ABDCon12 y las proteínas de fusión ABDCon12 es un resultado de una mayor estabilidad conformacional proporcionada por la extensión de hélice alfa N-terminal.

SEQ ID NO 41: Tencon-ABDCon

MLPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERS

YDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTTGGGGSGGGGSLKEAKEKAIEE

LKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKAGGHHHHHH

SEQ ID NO: 42: Secuencia N-terminal de Strep G. ABD TIDQWL

SEQ ID NO: 43: secuencia N-terminal añadida a ABDCon

TIDEWL

SEQ ID NO: 44: ABDCon12

TIDEWLLKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA Ejemplo 6: Caracterización de ABDCon12

Se determinó la afinidad de la unión de ABDCon12 purificada a albúmina humana y murina mediante resonancia de plasmones superficiales usando los mismos métodos que se han descrito anteriormente en el Ejemplo 2. Se obtuvieron constantes de disociación de 0,7 nM y 8,2 nM para la unión de ABDCon12 a albúmina humana y murina, respectivamente. La capacidad de ABDCon12 para extender la vida media en suero de una molécula de fusión se demostró fusionando ABDCon12 con el extremo C-terminal de un dominio FN3 que se une específicamente a un antígeno. Esta molécula se administró a ratones mediante inyección IP a 2 mg/kg y se analizó como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 4. Se midió una vida media terminal de 55 horas para la proteína de fusión dominio FN3-ABNCon12.

Ejemplo 7: Estabilización de dominios de unión a albúmina

En base al análisis de secuencia de dominios de unión a albúmina de origen natural, se anticipa que otras secuencias añadidas al extremo N-terminal de los dominios de unión a albúmina pueden hacerlos más estables. Por

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ejemplo, un número de secuencias diferentes se encuentran N-terminales para estos dominios naturales de unión a albúmina como, pero no limitados a, APAVDV (SEQ ID NO: 45), IAKEKA (SEQ ID NO: 46), TIDQWL (SEQ ID NO: 42), VPAADV (SEQ ID NO: 47), TVKSIE (SEQ ID NO: 48), TPAVDA (SEQ ID NO: 49), TLKSIK (SEQ ID NO: 50), WEKAAA (SEQ ID NO: 51), AVDANS (SEQ ID NO: 52), QLAAEA (SEQ ID NO: 53), ALKAAA (SEQ ID NO: 54), EKLAAA (SEQ ID NO: 55). La adición de estas secuencias a los dominios de unión a albúmina podría aumentar la estabilidad si estas secuencias producen hélices alfa más largas. Adicionalmente, se prevé que los péptidos de origen no natural que aumentan la longitud o estabilidad de la hélice alfa también estabilicen los dominios de unión a la albúmina.

Las variantes con secuencias N-terminales adicionales pueden generarse usando técnicas estándar y probarse sus propiedades como se describe más arriba.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Jacobs, Steven

<120> Dominios de unión a albúmina de consenso no naturales

<130> JBI5009WOPCT

<140> A determinar <141> 2013-03-23

<150> 61/651,642 <151> 2012-05-25

<150> 61/776,918 <151> 2013-03-12

<160> 55

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 <211> 44 <212> PRT

<213> Streptococcus sp. G148 <400> 1

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys 15 10

Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu lie Asn Asn Ala Lys Thr 20 25 30

Gly Val Lys Ala Leu lie Asp Glu lie Leu Ala Ala 35 40

<210> 2 <211> 44 <212> PRT

<213> Streptococcus canis <400> 2

Tyr Gly 15

Val Glu

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Val Ser Asp Phe Tyr Lys Asn Lys lie Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val Val Ala Leu Lys Asp Leu lie Leu Asn Ser 35 40

<210>3 <211> 42 <212> PRT

<213> Streptococcus canis <400>3

Leu Asp Gln Ala Lys Gln Ala Ala Leu Lys Glu Phe Asp Arg Tyr Gly 15 10 15

Val Ser Asn Tyr Tyr Lys Asn Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly lie Met Glu Leu Gln Ala Gln Val Val 35 40

<210>4 <211> 44 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Dominio de unión a albúmina no natural <400>4

Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala lie Lys Glu Leu Lys Gln Tyr Gly 15 10 15

lie Gly Asp Tyr Tyr lie Lys Leu lie Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val Glu Ser Leu Lys Asn Glu lie Leu Lys Ala 35 40

<210>5 <211> 44 <212> PRT

<213> Streptococcus equi <400>5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

lie Ser Asp Tyr Tyr Val Thr Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30

Gly Val Asn Ala Leu Lys Ala Glu lie Leu Ser Ala 35 40

<210>6 <211> 45 <212> PRT

<213> Finecoldia Magna <400>6

Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala lie Lys Glu Leu Lys Glu Ala Gly 15 10 15

lie Lys Ser Gln Phe Phe Phe Asn Leu lie Asn Asn Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ser Leu Lys Asn Glu lie Leu Lys Ala 35 40 45

<210>7 <211> 45 <212> PRT

<213> Finecoldia Magna <400>7

Leu Lys Asp Ala Lys Glu Lys Ala lie Glu Ala lie Arg Lys Glu Gly 15 10 15

Val Lys Ser Lys Leu Tyr Glu Asp Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr lie 20 25 30

Asp Gly Val Asn Ala Leu Arg Asp Gln lie lie Glu Ala 35 40 45

<210>8 <211> 45 <212> PRT

<213> Peptostreptococcus magnus <400>8

Leu Lys Asn Ala Lys Glu Glu Ala lie Lys Glu Leu Lys Glu Ala Gly 15 10 15

lie Thr Ser Asp Leu Tyr Phe Ser Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Asn Glu lie Leu Lys Ala 35 40 45

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210>9 <211> 45 <212> PRT

<213> Peptostreptococcus magnus <400> 9

Leu Lys Asn Ala Lys Glu Ala Ala lie Lys Glu Leu Lys Glu Ala Gly 15 10 15

lie Thr Ala Glu Tyr Leu Phe Asn Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ser Leu Lys Asn Glu lie Leu Lys Ala 35 40 45

<210> 10 <211> 45 <212> PRT

<213> Peptostreptococcus magnus

<400> 10

Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala lie Lys Glu Leu Lys Glu Ala Gly 15 10 15

lie Ser Ser Asp lie Tyr Phe Asp Ala lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Asn Glu lie Leu Lys Ala 35 40 45

<210> 11 <211> 45 <212> PRT

<213> Peptostreptococcus magnus <400> 11

Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala lie Lys Glu Leu Lys Glu Ala Gly 15 10 15

lie Thr Ser Asp lie Tyr Phe Asp Ala lie Asn Lys Ala Lys Thr lie 20 25 30

Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Asn Glu lie Leu Lys Ala 35 40 45

<210> 12 <211> 45 <212> PRT

<213> Finegoldia magna <400> 12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

lie Thr Gly Lys lie Phe His Asp Ala lie Asp Ala Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Leu Lys Ala Tyr Val Ala Glu Thr Leu Ala Ala 35 40 45

<210> 13 <211> 45 <212> PRT

<213> Finegoldia magna <400> 13

Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala Val Glu Glu Leu Lys Glu Asn Gly 15 10 15

lie Thr Ser Glu Lys Tyr lie Asp Gln lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu lie lie Lys Ala 35 40 45

<210> 14 <211> 45 <212> PRT

<213> Finegoldia magnoa

<400> 14

Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala Val Glu Glu Leu Lys Asn Asn Gly 15 10 15

lie Thr Ser Glu Lys Tyr lie Asp Gln lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu lie lie Lys Ala 35 40 45

<210> 15 <211> 45 <212> PRT

<213> Lactobacillus iners <400> 15

Leu Ala Glu Ala Lys Lys Val Ala His Glu Glu Phe Thr Lys Ala Gly 15 10 15

lie Thr Gly Lys lie Phe His Asp Ala lie Asp Ala Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Leu Gln Ala Tyr Val Ala Glu Thr Leu Ala Ala 35 40 45

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 16 <211> 45 <212> PRT

<213> Peptostreptococcus magnus <400> 16

Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala lie Ala Glu Leu Lys Lys Ala Gly 15 10 15

lie Thr Ser Asp Phe Tyr Phe Asn Ala lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Glu Val Asn Ala Leu Lys Asn Glu lie Leu Lys Ala 35 40 45

<210> 17 <211> 45 <212> PRT

<213> Finegoldia magna <400> 17

Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala Val Glu Glu Leu Lys Asn Asn Gly 15 10 15

lie Thr Ser Glu Lys Tyr lie Glu Gln lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu lie lie Lys Ala 35 40 45

<210> 18 <211> 45 <212> PRT

<213> Lactobacillus iners <400> 18

Leu Ala Glu Ala Lys Asn Val Ala His Ala Glu Phe Thr Lys Ala Gly 15 10 15

lie Thr Gly Lys lie Phe His Asp Ala lie Asp Ala Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Leu Gln Ala Tyr Val Ala Glu Thr Leu Ala Ala 35 40 45

<210> 19 <211> 45 <212> PRT

<213> Lactobacillus iners

<400> 19

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

lie Thr Gly Lys lie Phe His Asp Ala lie Asp Ala Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Leu Gln Ala Tyr Val Ala Glu Thr Leu Lys Ala 35 40 45

<210> 20 <211> 45 <212> PRT

<213> Finegoldia magna <400> 20

Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala lie Glu Glu Leu Lys Asn Asn Gly 15 10 15

lie Thr Ser Glu Lys Tyr lie Glu Gln lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu lie lie Lys Ser 35 40 45

<210> 21 <211> 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Dominio de unión a albúmina no natural <400> 21

Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala lie Glu Glu Leu Lys Lys Ala Gly 15 10 15

lie Thr Ser Asp Tyr Tyr Phe Asp Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu lie Leu Lys Ala 35 40 45

<210> 22 <211> 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Dominio de unión a albúmina no natural <220>

<221> MOD_RES <222> (21)..(21)

<223> Xaa1 puede ser cualquier aminoácido <220>

<221> MOD_RES <222> (22)..(22)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<223> Xaa2 puede ser cualquier aminoácido <220>

<221> MOD_RES <222> (30)..(30)

<223> Xaa3 puede ser cualquier aminoácido <220>

<221> MOD_RES <222> (31)..(31)

<223> Xaa4 puede ser cualquier aminoácido <220>

<221> MOD_RES <222> (37)..(37)

<223> Xaa5 puede ser cualquier aminoácido <220>

<221> MOD_RES <222> (41)..(41)

<223> Xaa6 puede ser cualquier aminoácido <400> 22

Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala lie Glu Glu Leu Lys Lys Ala Gly 15 10 15

lie Thr Ser Asp Xaa Xaa Phe Asp Leu lie Asn Lys Ala Xaa Xaa Val 20 25 30

Glu Gly Val Asn Xaa Leu Lys Asp Xaa lie Leu Lys Ala 35 40 45

<210> 23 <211> 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Dominio de unión a albúmina no natural <220>

<221> MOD_RES <222> (21)..(21)

<223> Xaa1 es Lys, Arg, Asp, Glu, Ala, Gly, Phe o Tyr <220>

<221> MOD_RES <222> (22)..(22)

<223> Xaa2 es Ala, Ser, Val, Lys, Arg, Asp, Glu o Tyr <220>

<221> MOD_RES <222> (30)..(30)

<223> Xaa3 es Asp, Glu o Lys

<220>

<221> MOD_RES <222> (31)..(31)

<223> Xaa4 es Ala, Gly o Thr

<220>

<221> MOD RES

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<222> (37)..(37)

<223> Xaa5 es Val, Tyr o Ala

<220>

<221> MOD_RES <222> (41)..(41)

<223> Xaa6 es Qln, Asn, Lys, Arg o Glu <400> 23

Ala Gly 15

Xaa Val

Glu Gly Val Asn Xaa Leu Lys Asp Xaa lie Leu Lys Ala 35 40 45

<210> 24 <211> 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Dominio de unión a albúmina no natural <220>

<221> MOD_RES <222> (21)..(21)

<223> Xaa1 es Lys, Ala o Tyr

<220>

<221> MOD_RES <222> (22)..(22)

<223> Xaa2 es Ala, Ser, Val o Tyr <220>

<221> MOD_RES <222> (30)..(30)

<223> Xaa3 es Asp o Lys

<220>

<221> MOD_RES <222> (31)..(31)

<223> Xaa4 es Ala o Thr

<220>

<221> MOD_RES <222> (37)..(37)

<223> Xaa5 es Val, Tyr o Ala

<220>

<221> MOD_RES <222> (41)..(41)

<223> Xaa6 es Qln o Glu

<400> 24

imagen1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

imagen2

<210> 25 <211> 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Dominio de unión a albúmina no natural ABDCon2 <400> 25

imagen3

<210> 26 <211> 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Dominio de unión a albúmina no natural ABDCon3 <400> 26

imagen4

<210> 27 <211> 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Dominio de unión a albúmina no natural ABDCon4 <400> 27

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

imagen5

<210> 28 <211> 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Dominio de unión a albúmina no natural ABDCon5 <400> 28

Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala lie Glu Glu Leu Lys Lys Ala Gly 15 10 15

lie Thr Ser Asp Tyr Ser Phe Asp Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu lie Leu Lys Ala 35 40 45

<210> 29 <211> 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Dominio de unión a albúmina no natural ABDCon6 <400> 29

Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala lie Glu Glu Leu Lys Lys Ala Gly 15 10 15

lie Thr Ser Asp Tyr Val Phe Asp Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu lie Leu Lys Ala 35 40 45

<210> 30 <211> 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Dominio de unión a albúmina no natural ABDCon7 <400> 30

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

lie Thr Ser Asp Tyr Tyr Phe Asp Leu lie Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30

Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Gln lie Leu Lys Ala 35 40 45

<210> 31 <211> 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Dominio de unión a albúmina no natural ABDCon8

<400> 31

imagen6

<210> 32 <211> 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Dominio de unión a albúmina no natural ABDCon9 <400> 32

Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala lie Glu Glu Leu Lys Lys Ala Gly 15 10 15

lie Thr Ser Asp Tyr Tyr Phe Asp Leu lie Asn Lys Ala Lys Ala Val 20 25 30

Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu lie Leu Lys Ala 35 40 45

<210> 33 <211> 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Dominio de unión a albúmina no natural ABDCon10 <400> 33

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

imagen7

<210> 34 <211> 45 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Dominio de unión a albúmina no natural ABDConll

<400> 34

imagen8

<210> 35 <211> 135 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ADNc optimizado con codón para expresar dominio de unión a albúmina no natural ABDCon <400> 35

ctgaaagaag cgaaagaaaa agcgattgaa gaactgaaaa aagcgggcat taccagcgat tattattttg atctgattaa caaagcgaaa accgtggaag gcgtgaacgc gctgaaagat

60

120

<210> 36 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 36

imagen9

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Reivindicaciones

1. Un dominio de unión a albúmina aislado no natural que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21.
2. El dominio de unión a albúmina aislado no natural de la reivindicación 1, que comprende un aminoácido de la SEQ ID NO: 21 que tiene sustituciones en los residuos 1, 2, 3, 4, 5, o 6.
3. El dominio de unión a albúmina aislado de la reivindicación 2, en donde las sustituciones en los residuos 1,2, 3, 4, 5, o 6 tienen lugar en una o más posiciones de aminoácidos Y21, Y22, L25, K30, T31, E33, G34, A37, L38, E41, I42 y A45 de la SEQ ID NO: 21.
4. El dominio de unión a albúmina aislado de la reivindicación 2, en donde las sustituciones en los residuos 1, 2, 3, 4,
5. o 6 tienen lugar en una o más posiciones de aminoácidos Y21, Y22, K30, T31, A37, y E41 de la SEQ ID NO: 21.
5. El dominio de unión a albúmina aislado no natural de cualquier reivindicación anterior, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 21-34 o 44.
6. El dominio de unión a albúmina aislado no natural de cualquier reivindicación anterior, que comprende además una extensión de 6 aminoácidos en su extremo N-terminal, opcionalmente en donde la extensión de 6 aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 42, 43 y 45-55, opcionalmente en donde la extensión de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43.
7. El dominio de unión a albúmina aislado de cualquier reivindicación anterior, en donde el dominio de unión a albúmina tiene:

a) una constante de disociación (Kd) de unión a albúmina humana entre aproximadamente 50 pM-1 pM usando resonancia de plasmones superficiales a un caudal de 100 pl/min usando PBST (PBS, 0005% de Tween20) como tampón de ejecución; y/o

b) una constante de velocidad de disociación (Koff) de unión a albúmina humana a 3,6x10'5 a 1,1x10-1 usando resonancia de plasmones superficiales a un caudal de 100 pl/min usando PBST (PBS, 0005% de Tween20) como tampón de ejecución.
8. Un método para elaborar el dominio de unión a albúmina aislado de cualquier reivindicación anterior, que comprende:

a) proporcionar una polinucleótido que codifica el dominio de unión a albúmina aislado;

b) expresar el polinucleótido en un huésped o in vitro; y

c) recuperar el dominio de unión a albúmina aislado.
9. Un polinucleótido aislado que codifica el dominio de unión a albúmina de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende opcionalmente:

a) un polinucleótido que codifica una dominio de unión a albúmina seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 21-34 ó 44; o

b) un polinucleótido de la SEQ ID NO: 35.
10. Un vector aislado que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 9.
11. Una célula huésped que comprende el vector aislado de la reivindicación 10.
12. Una proteína de fusión que comprende un dominio de unión a albúmina de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un agente bioactivo.
13. La proteína de fusión de la reivindicación 12, en donde el agente bioactivo es un andamiaje de proteína que se une específicamente a una molécula objetivo, opcionalmente en donde el andamiaje de proteína está basado en Tencon25 que comprende los residuos de aminoácidos 1-90 de la SEQ ID NO: 39, o variantes del mismo.
14. La proteína de fusión de la reivindicación 13, en donde la proteína de unión a albúmina y el agente bioactivo se ligan operativamente usando un conector, opcionalmente en donde el conector comprende un conector Gly-Ser, como en donde el conector comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
15. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de la reivindicación 14 y por lo menos un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Figura 1

imagen1

imagen2

mAU

Figura 3.

imagen3

imagen4

0 ÜOOOO

&5

Temperatura (°C)

Figura 4B

-o.oeoos-

■■0.00010 -1

-0,00012-

■0,00014-

O .0.00016-

1
-0.00018 ■

a -0.0002Í) -
-0.00022
-0.00024-t

■0.00026
0.00028 ■

Temperatura (°C)

4A

Figura

2 0

imagen5

05

Tiempo (horas)

Figura 5.

Farmacocinéticas fusión Tencon25-ABDCon

en

o

imagen6

H

ÍD

25

O

O

25

K>

eri

03

O

O

o

25

CO

25 O

O o

25 25

í*0 ¡\3

en en

> >

03 03 C¡ O

O o

o o

25 23

-**j en

CD* CD*

25

O

O

25

ÍN3 í\5

en en

i i > > 03 03

O o O o O O

=f 3

co

<§'

3

ON

imagen7

imagen8