KR20150016585A

KR20150016585A - 비-천연 컨센서스 알부민 결합 도메인

Info

Publication number: KR20150016585A
Application number: KR1020147035989A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 제이콥스
Original assignee: 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2013-05-23
Publication date: 2015-02-12
Also published as: CA2874646A1; AU2017261625A1; US9156887B2; ES2670442T3; MX2014014384A; CN104470944A; AU2013266215B2; US20130316952A1; JP2021019595A; AU2017261625B2; WO2013177398A2; JP2015519345A; BR112014029409A2; EP2855509B1; WO2013177398A3; AU2013266215A1; BR112014029409B1; IL235808A0; US10280200B2; US20160083436A1

Abstract

비-천연 알부민 결합 도메인, 그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이들 도메인 및 폴리뉴클레오티드의 제조 및 사용 방법은 환자를 위한 치료 분자의 반감기의 제어에 유용하다.

Description

비-천연 컨센서스 알부민 결합 도메인 {NON-NATURAL CONSENSUS ALBUMIN BINDING DOMAINS}

본 발명은 알부민 결합 도메인 및 이들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-천연 알부민 결합 도메인 컨센서스 서열 및 그의 변이체에 관한 것이다.

신 청소(renal clearance)를 통한 생물치료 분자의 신속한 제거는 제한된 임상적 유효성 또는 환자에 대한 더 빈번한 투여의 원인이 된다. 분자량이 50,000 달톤 초과인 분자의 경우에 신장 여과의 속도가 크게 감소되므로, 사구체 여과로 인한 신 청소는 더 작은 생물치료제와 주로 연계된다(문헌[Kontermann, Curr Opin Biotechnol 22:868-76, 2011]). 몇몇 승인된 생물치료 약물은 단독으로 여과 한계 미만이 되는 활성 부분을 함유하므로 빠르게 청소된다. 이러한 한계를 극복하기 위하여, 신장 여과를 감소시키기 위한 치료 분자의 크기 및 이에 따른 반감기를 효과적으로 증가시키기 위한 다수의 기술이 도입되었다.

치료제의 PEG화(PEG)는 단백질의 유체역학적 반경을 증가시키고 사구체 여과를 감소시키기 위한 효과적인 방법이다. 가장 통상적으로는 단백질 표면 상의 자유 티올 또는 아민 기에 대한 접합을 통해 하나 또는 몇개의 PEG 쇄가 단백질에 커플링될 수 있다. 아데노신 데아미나아제, L-아스파라기나아제, 인터페론 알파-2b, G-CSF, 인간 성장 호르몬, 에리트로포이에틴, 유리카아제, 및 항-TNF 알파 항체 단편의 PEG화 버전은 모두 인간 요법을 위해 승인되어 있다(문헌[Kontermann, Curr Opin Biotechnol 22:868-76, 2011]). PEG화의 한계는 불균질 산물의 생성 및 소정의 단백질에 부착되는 PEG 분자의 수를 제어함에 있어서의 난점을 포함한다. PEG화는 치료 단백질의 생성에 정제 단계와 더불어 부가적인 접합 단계를 도입함으로써, 감소된 수율 및 증가된 상품 가격을 유발한다. PEG 쇄가 신장에서 비-분해성이므로, PEG화는 또한 동물 및 환자에게서 신 세뇨관 공포화를 유발할 수 있다(문헌[Gaberc-Porekar et al., Curr Opin Drug Discov Devel 11:242-250, 2008]).

치료제를 항체 Fc 영역에 커플링하여 Fc-융합 단백질을 생성시키는 단계를 사용하여 치료 분자의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 면역글로불린은, 그들의 큰 크기 및 FcRn을 통한 재순환으로 인해 인간에게서 수주 가량의 긴 반감기를 나타낼 수 있다(문헌[Kuo et al., J Clin Immunol 30:777-789, 2010]). TNF 수용체 2, LFA-3, CTLA-4, IL-1R, 및 TPO-유사 펩티드 분자는 모두 Fc-융합체로서 생성된 승인된 치료제이다(문헌[Kontermann, Curr Opin Biotechnol 22:868-76, 2011]). 몇몇 이유로 인해, Fc-융합 단백질이 모든 치료 클래스에 있어서 이상적인 것은 아니다. Fc 영역의 동종이량체성 성질은 이량체성 치료 단백질의 생성을 유발하며, 이는 수용체 클러스터링으로 인한 세포 활성화를 유발할 가능성이 있다. Fc-융합체는 또한 포유류 발현 시스템에서 제조되어야 하며, 이는 원핵생물 시스템보다 비용이 더 많이 들 수 있다.

Fc에 부가하여, 알부민은 FcRn 재순환으로 인해 생체내에서 긴 반감기를 나타낸다. 대략 40 g/L의 농도로, 인간 혈청 알부민(HSA)은 혈액 내에서 확인되는 가장 풍부한 단백질이다. FcRn 재순환은 인간에게서 대략 19 일의 긴 반감기를 유발한다. 부가적으로, 생체분포 연구는 체내에서 염증을 일으킨 관절 또는 종양과 같이 질환 표적화에 중요한 영역에 알부민이 분포될 수 있음을 제시한다(문헌[Wunder et al., J Immunol 170:4793-4801, 2003]). 따라서, 단백질을 HSA에 대한 C-말단 또는 N-말단 융합체로서 생성시킴으로써 다수의 단백질의 혈청 반감기가 증가되었다. 성공적인 융합체는 인터페론 알파(문헌[Flisiak and Flisiak, Expert Opin Biol Ther 10:1509-1515, 2010]), 인간 성장 호르몬(문헌[Osborn et al., Eur J Pharmacol 456:149-158, 2002]), 종양 괴사 인자(문헌[Muller et al., Biochem Biophys Res Commun 396:793-799, 2010]), 응고 인자 IX(문헌[Metzner et al., Thromb Haemost 102: 634-644, 2009]), 응고 인자 VIIa(문헌[Schulte, Thromb Res 122 Suppl 4: S14-19, 2008]), 인슐린(문헌[Duttaroy et al., Diabetes 54:251-258, 2005]), 유로키나아제(문헌[Breton et al., Eur J Biochem 231:563-569, 1995]), 히루딘(문헌[Sheffield et al., Blood Coagul Fibrinolysis 12:433-443, 2001]), 및 이중특이적 항체 단편(문헌[Muller et al, J Biol Chem 282:12650-12660, 2007])을 포함한다. HSA 융합 단백질은 긴 혈청 반감기를 가질 수 있지만, 이들 융합 단백질의 대규모 생성은 주로 효모 발현 시스템으로 제한된다. 부가적으로, HSA의 큰 크기는 입체 방해로 인해 치료제의 활성 손실을 유발할 수 있다.

치료 단백질은 또한, 혈류 내에서 혈청 알부민에 결합하여 그들의 반감기를 증가시키는 펩티드 또는 단백질에 대한 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 이러한 알부민 결합 펩티드는 알부민에 대한 항체 단편 또는 시스테인-속박(cysteine-constrained) 펩티드를 포함한다. 시스테인-속박 펩티드에 대한 융합체로서의 Fab 항체 단편의 발현은 Fab의 혈청 반감기를 현저하게 증가시켰다(문헌[Dennis et al., J Biol Chem 277:35035-35043, 2002]; 제US2004/0253247A1호). 시스테인-속박 펩티드를 항체 단편에 커플링하는 것은 동일한 항원을 표적화하는 Fab 및 mAb 분자에 비교하여 더 양호한 피크 종양 축적(peak tumor accumulation) 및 더 균질한 종양 분포를 유발했다(문헌[Dennis et al., Cancer Res 67:254-261, 2007]; 제US2005/0287153A1호). 추가로, 알부민에 특이적으로 결합하는 다수의 항체 단편을 치료 부분(therapeutic moiety)에 커플링하여 치료제의 반감기를 증가시켰다. HSA에 결합하는 낙타과 V_HH 항체 단편(나노바디즈(Nanobodies)(등록상표))을 TNF-알파에 결합하는 다른 나노바디(등록상표)(문헌[Coppieters et al., Arthritis Rheum 54: 1856-1866, 2006]) 또는 항-EGFR 나노바디즈(등록상표)(문헌[Tijink et al., Mol Cancer Ther 7:2288-2297, 2008])에 융합시켰다. 알부민에 결합하는 항-알부민 도메인 항체(dAb)를 생성시키고, 예를 들어, 인터류킨-1 수용체(문헌[Holt et al., Protein Eng Des Sel 21:283-288, 2008]) 및 인터페론 알파 2b(문헌[Walker et al., Protein Eng Des Sel 23:271-278, 2010])에 융합시켜 그들의 반감기를 개선하였다.

박테리아로부터 천연적으로 발생하는 다수의 단백질 도메인이, 알부민과 상호작용하여 아마도 이러한 박테리아가 숙주 유기체 전체에 분포되도록 보조하는 것으로 공지되어 있다. 이들은 크기가 대략 6 kDa인 3-나선 번들 단백질 도메인이며, 이는 3-나선 번들의 일면을 사용하여 혈청 알부민과 상호작용한다(문헌[Cramer et al., FEBS Lett 581:3178-3182, 2007]; 문헌[Lejon et al., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 64:64-69, 2008]; 문헌[Johansson et al., FEBS Lett 374:257-261, 1995]; 문헌[Johansson et al., J Mol Biol 266:859-865, 1997]; 문헌[Johansson et al., J Biol Chem 277:8114-8120,2002]). 스트렙토코커스 단백질 G로부터 유도된 하나의 이러한 알부민 결합 도메인(문헌[Jonsson et al., Protein Eng Des Sel 21:515-527, 2008])이, 단백질의 혈청 반감기를 연장하기 위해 가장 널리 사용되어 왔다. 이 도메인에 대한 융합체는 가용성 보체 수용체 유형 1(문헌[Makrides et al., J Pharmacol Exp Ther 277:534-542, 1996]), 이중특이적 항체(문헌[Stork et al., Protein Eng Des Sel 20:569-576, 2007]), CD4(문헌[Nygren et al., Vaccines 91:363-368, 1991]; 제US 6267,964B1호), Pf155/RESA(문헌[Stahl et al., J Immunol Methods 124:43-52, 1989]), G-CSF(문헌[Frejd, F. PEGS Europe, October 5, 2010]), 및 다수의 표적에 결합하는 어피바디(affibody) 분자(문헌[Andersen et al., J Biol Chem 286:5234-5241, 2011])(문헌[Frejd, F. PEGS Europe, October 5, 2010])의 반감기를 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 환자에게서 상기 도메인에 대한 항체 생성이 보고되었으며, 따라서 상기 분자를 치료적 응용에 사용하는 것은 어려울 수 있다(문헌[Goetsch et al., Clin Diagn Lab Immunol 10:125-132, 2003]; 문헌[Libon et al.,Vaccine 17:406-414, 1999]).

알부민에 결합하는 다수의 단백질 도메인 또는 펩티드가 혈청 반감기를 연장하고 치료 단백질의 더 유익한 생체분포 패턴을 생성시킬 수 있다. 이들 알부민 결합 도메인을 치료적 응용에 사용하기 위해서는, 숙주 내에서의 높은 발현 수준, 용해도 및 안정성, 및 최소의 면역원성과 같은 다수의 생물리학적 요건을 충족시킬 필요가 있다. 알부민 결합 부분은, 알부민에 결합한 경우와 결합하지 않은 경우의 치료 부분의 활성과 혈청 반감기 및 생체분포가 효과적으로 균형을 이루는 친화력으로 혈청 알부민에 결합해야 한다.

본 발명의 일 태양은, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 단리된 비-천연 알부민 결합 도메인을 포함하는 단백질이다. 본 발명의 다른 태양은, 서열 번호 21과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 비-천연 알부민 결합 도메인이다.

본 발명의 또 다른 태양은, 1, 2, 3, 4, 5, 및/또는 6개 잔기에 치환을 가지며, 바람직하게는, 여기서 1, 2, 3, 4, 5, 및/또는 6개 잔기에서의 치환이 서열 번호 21의 아미노산 위치 Y21, Y22, L25, K30, T31, E33, G34, A37, L38, E41, I42, 및/또는 A45에서, 또는 서열 번호 21의 아미노산 위치 Y21, Y22, K30, T31, A37, 및/또는 E41에서 일어날 수 있는, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 비-천연 알부민 결합 도메인이다.

본 발명의 추가의 태양은, 아미노산 서열 LKEAKEKAIEELKKAGITSDX₁X₂FDLINKAX₃X₄VEGVNX₅LKDX₆ILKA(서열 번호 22)를 포함하며; 여기서 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, 및 X₆이 임의의 아미노산 또는 소정의 아미노산의 서브세트일 수 있는, 단리된 비-천연 알부민 결합 도메인이다.

본 발명의 추가의 태양에서, 단리된 비-천연 알부민 결합 도메인은 그의 N-말단에 5개 아미노산의 연장부를 포함한다.

본 발명의 다른 태양은, 비-천연 알부민 결합 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; 숙주 내에서, 또는 시험관내에서 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계; 및 비-천연 알부민 결합 도메인을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 비-천연 알부민 결합 도메인의 제조 방법이다. 본 발명의 다른 태양은, 본 발명의 알부민 결합 도메인을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명의 다른 태양은, 서열 번호 35의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명의 다른 태양은, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 벡터, 및 본 발명의 단리된 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.

본 발명의 다른 태양은, 본 발명의 알부민 결합 단백질 및 생물활성제(bioactive agent)를 포함하는 융합 단백질이다.

본 발명의 다른 태양은, 본 발명의 융합 단백질 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물이다.

<도 1>
도 1은 정제된 ABDCon의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 샘플은 하기와 같다: 레인 1) 씨블루 플러스(SeeBlue plus) 2 마커, 2) 총 세포 용해물, 3) 가용성 세포 용해물, 4) 컬럼 통과액, 5 내지 12) 용출 분획. 마커 밴드 중 일부의 분자량을 좌측에 나타낸다.
<도 2>
도 2는 정제된 ABDCon 샘플의 전기-분무 이온화 질량분석법을 나타낸다.
<도 3>
도 3은 PBS 중에 실행된 정제된 ABDcon의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 나타낸다.
<도 4>
도 4는 PBS 중에 DSC에 의해 측정된 융해 온도 A) 및 ABDCon 언폴딩(unfolding)의 가역성 B)를 나타낸다. 제1 스캔에 대한 정규화되고 기준선 감산된 데이터는 A에 나타낸다. 제1 스캔 후에, 샘플을 20℃로 냉각시키고 스캔을 반복하여 폴딩(folding)의 가역성을 결정하였다. 제1 및 제2 스캔에 대한 원 데이터 트레이스는 파트 B에 중첩되어 있다.
<도 5>
도 5는 2 mg/㎏으로 정맥내 투여할 경우에 마우스에서의 텐콘25-ABDCon 융합 단백질의 약동력학을 나타낸다.
<도 6>
도 6은 2 mg/㎏으로 정맥내 투여할 경우에 마우스에서의 ABDCon(서열 번호 21), ABDCon3(서열 번호 26), ABDcon5(서열 번호 28), ABDCon7(서열 번호 30), 및 ABDCon9(서열 번호 32)에 융합된 텐콘25(서열 번호 39의 잔기 1 내지 90) 분자의 약동력학을 나타낸다.
<도 7>
도 7은 37℃에서 0 또는 28 일 동안 PBS 중에 인큐베이션할 경우에 A) 소정의 FN3 도메인 ABDCon(서열 번호 1) 융합 단백질 및 B) ABDCon에 연장된 N-말단 나선을 갖는 FN3 도메인-ABDCon12(서열 번호 46) 융합 단백질의 안정성을 나타낸다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "알부민 결합 도메인" 또는 "도메인"은 생체내 또는 시험관내에서 알부민에 결합하는 폴리펩티드를 지칭한다. 알부민은 임의의 동물 종, 예를 들어, 인간, 원숭이, 또는 설치류로부터 유도될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "K_D"는 알부민과 알부민 결합 도메인 사이의 해리 상수를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "K_on"는 알부민 결합 도메인/알부민 복합체를 형성하기 위한 알부민 결합 도메인의 알부민에 대한 회합의 결합 속도 상수(on rate constant)를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "K_off"는 알부민 결합 도메인/알부민 복합체로부터 알부민 결합 도메인의 해리에 대한 해리 속도 상수(off rate constant)를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "비-천연"은 합성의, 즉, 천연 폴리펩티드에 존재하지 않는 아미노산 서열을 갖는 도메인을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치환함" 또는 "치환"은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내의, 그 서열의 변이체를 생성시키기 위한, 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 변경, 결실, 또는 삽입, 또는 변경들, 결실들, 또는 삽입들을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 하나 이상의 개질, 예를 들어, 치환, 삽입, 또는 결실에 의해 기준 폴리펩티드 또는 기준 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "생물활성제"는 동물 환자에게 투여할 경우에 그 환자에게 이익을 제공하는 단백질, 항체, 펩티드, 뉴클레오티드, 소분자 의약품 등을 지칭한다. 합성에 의해 생성된, 자연적으로 유도된 또는 재조합적으로 생성된 부분(moiety)이 이 용어 내에 포함된다. 생물활성제는 생물활성제의 유사체, 유도체, 작용제, 길항제, 경상이성체, 또는 약제학적으로 허용가능한 염일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "안정성"은, 분자가 그의 정상적 작용 활성(예를 들어, 반감기) 중 하나 이상을 유지하도록, 생리학적 조건 하에서 폴딩된 상태를 유지하는 분자의 능력을 지칭한다.

용어 "벡터"는 생물 시스템 내에서 복제될 수 있거나 이러한 시스템들 사이에서 이동할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 전형적으로 벡터 폴리뉴클레오티드는 생물 시스템에서 이들 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 유지를 돕는 기능을 하는 복제 기점, 폴리아데닐화 신호 또는 선발 마커와 같은 요소들을 포함한다. 이러한 생물 시스템의 예는 벡터를 복제할 수 있는 생물 구성요소를 이용하는 세포, 박테리아, 바이러스, 동물, 식물, 및 재구성된 생물 시스템을 포함할 수 있다. 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 분자 또는 이들의 혼성체일 수 있다.

용어 "발현 벡터"는 발현 벡터 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 번역을 유도하기 위하여 생물 시스템 또는 재구성된 생물 시스템에서 이용될 수 있는 벡터를 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "작동적으로 연결된"은 구성요소들이 그들의 의도된 방식으로 작용하도록 구성요소들을 위치시킴을 지칭한다.

본 명세서에서 아미노산은 그들의 표준 3문자 코드 또는 1문자 코드를 사용하여 지칭된다.

알부민 결합 도메인 조성물

본 발명은 합성 알부민 결합 도메인(ABDCon)(서열 번호 21) 및 그의 변이체를 제공한다. ABDCon은 치료제의 혈청 반감기 및 생체분포의 향상을 위해 생물활성제에 작동적으로 연결될 수 있다. ABDCon 및 그의 변이체는 E. 콜라이(E. coli)에서 높은 수준으로 발현되고, 가용성이며, 높은 열 안정성을 가질 수 있다. 본 발명은 ADBCon 및 그의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상보적 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및 그들의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

본 발명은 N-말단에 5개 아미노산 연장의 연장부를 갖는 합성 알부민 결합 도메인(ABDCon)을 추가로 제공한다. 연장부는 ABDCon의 안정성을 개선한다.

스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.) G148 단백질 G(서열 번호 1)로부터의 ABD를 주형으로 사용하여 비-중복 단백질 데이터베이스에 기탁된 소정의 3-나선 번들 알부민 결합 도메인(ABD) 서열의 컨센서스 아미노산 서열을 계산하고, 각각의 서열 위치에서 가장 우세한 아미노산을 선택함으로써 ABDCon 결합 도메인을 설계하였다(표 6). ABDCon은, 본 명세서에 특정된 조건을 이용하여 시험할 경우에 75 pM의 K_D 및 3.02×10^-5 1/s의 K_off를 동반하여 인간 알부민에 대한 높은 친화력을 가지므로, ABDCon에 작동적으로 연결된 생물활성제는 일단 동물 환자에게 투여되면 알부민에 주로 결합될 수 있다. 인간 환자에서, 혈청 알부민에 너무 약하게 결합하는 분자는 신 여과로 인해 짧은 혈청 반감기를 가질 것이며(문헌[Hopp et al., Protein Eng Des Sel 23:827-834, 2010]), 반면에 혈청 알부민에 너무 강하게 결합하는 분자는 바람직한 작용 부위(site of action)에서 알부민으로부터 방출되지 않을 것이므로, 일부 경우에는 목적하는 표적의 활성을 조정하고 치료적 이익을 제공하는 능력이 감소될 수 있다. 그러므로, 알부민에 대한 친화력의 스펙트럼을 가짐으로써 ABDCon 변이체 및 결합 도메인에 작동적으로 연결된 생물활성제의 반감기를 조정하는 능력을 제공하는 ABDCon 변이체 및 결합 도메인을 가지며 이를 생성시킬 수 있는 것이 본 발명의 일 태양이다.

본 발명의 일 실시 형태는, 서열 번호 21(ABDCon): LKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA와 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 비-천연 알부민 결합 도메인이다.

본 발명의 다른 실시 형태는, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 잔기에서 치환을 갖는 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 알부민 결합 도메인이다.

알부민과의 복합체 내에서 예시적인 3-나선 번들 알부민 결합 단백질의 결정 구조를 시험하고 예시적인 단백질과 유사한 방식으로 ABDCon이 알부민에 결합될 수 있다는 가정을 함으로써 ABDCon 변이체를 설계할 수 있다. 이용할 수 있는 예시적인 결정 구조는, 인간 알부민과의 복합체 내의 혐기성 박테리아 피네골디아 마그나(Finegoldia magna)(이전에는 펩토스트렙토코커스 마그너스(Peptostreptococcus magnus))의 단백질 PAB의 GA 모듈(단백질 G-관련 알부민-결합 모듈)의 결정 구조이다(단백질 데이터 베이스(PDB: Protein Data Base) 코드 1TF0(문헌[Leion et al., J Biol Chem 279:42924-42928, 2004])).

예측되는 소수성 접촉의 붕괴, 예측되는 방향족 잔기 사이의 파이-적층의 붕괴, 더 큰 아미노산으로 치환함에 의한 입체적 충돌의 도입, 하전된 잔기의 제거에 의한 염 가교의 붕괴, 및 ABDCon과 알부민 사이에 일어날 것으로 예측되는 수소 결합의 붕괴에 의한 것과 같은 다양한 전략에 의해 알부민에 대한 감소된 친화력을 갖는 ABDCon 변이체를 설계할 수 있다. 도입되는 변화는, 결합을 파기할 방식으로 결합 표면을 변경하지 않으면서 결합 친화력을 감소시키도록 설계된다. 예를 들어, 잔기 Y21을 하전된 아미노산(Lys, Arg, Asp, Glu) 또는 더 작은 아미노산(Ala, Gly)으로 치환하여 이 잔기와 알부민 잔기 V325 및 F326 사이의 소수성 상호작용을 감소시킬 수 있다. 부가적으로, ABDCon의 Y21은 알부민 잔기 N318 및 D324의 골격과 수소 결합을 형성하므로, Phe로의 돌연변이와 같은 소폭의 변화가 상호작용을 약간 약화시킬 수 있다. ABDCon의 잔기 Y22는 알부민 잔기 F309 및 F326와의 파이-적층 상호작용과 더불어 소수성 상호작용을 형성할 것으로 예측된다. 그러므로 Y22를 더 작은 중성 아미노산 Ala, Ser, Val, 또는 하전된 아미노산 Lys, Arg, Asp, 또는 Glu로 치환하는 것은 소수성 접촉을 감소시키고 ABDCon 변이체의 알부민에 대한 친화력을 감소시킬 수 있다. ABDCon 내의 잔기 K30은 알부민 잔기 E227과 염-가교를 형성할 것으로 예측되므로, K30을 Asp 또는 Glu로 치환하여 반발 전하를 도입하고 알부민에 대한 ABDCon 친화력을 잠재적으로 감소시킬 수 있다. 임의의 비-하전된 아미노산으로의 돌연변이 또한 염-가교의 제거에 의해 친화력을 감소시킬 수 있다. ABDCon 잔기 T31은 알부민 잔기 N267과 분자간 수소 결합을 형성할 것으로 예측되며, Ala 또는 Gly로의 치환을 사용하여 상호작용을 현저하게 불안정화시킬 수 있는 큰 입체적 충돌을 도입하지 않으면서 분자간 수소 결합을 붕괴시킬 수 있다. 입체적 충돌을 도입하기 위하여 ABDCon 잔기 A37을 Val, Tyr, 또는 다른 더 큰 아미노산으로 치환할 수 있다. 잔기 E41을 Gln 또는 Asn으로 치환하여 전하를 제거할 수 있다. Lys 또는 Arg와 같은 양성 하전된 잔기의 도입은 결합 친화력을 추가로 감소시킬 것으로 예상할 수 있다. ABDCon 잔기 L25, E33, G34, L38, I42, 및 A45는 알부민과 직접 접촉을 형성할 것으로 예측되며, 이들 잔기에서의 치환은 알부민에 대한 ABDCon 친화력을 조정할 가능성이 있다. 잔기 위치는 서열 번호 21의 ABDCon 및 서열 번호 36의 인간 알부민에 관련된다.

대안적으로, 예를 들어 동정된 위치에서의 치환을 위해 NNK 코돈을 이용하는 아미노산의 무작위 칵테일(random cocktail)을 사용할 수 있으며, 생성되는 변이체를 표준 방법 및 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 알부민에 대한 그들의 결합에 대해 측정한다.

예시적인 ABDCon 변이체는 서열 번호 21의 Y21, Y22, L25, K30, T31, E33, G34, A37, L38, E41, I42, 및 A45로부터 선택된 하나 이상의 잔기에 치환을 갖는 변이체이다.

예시적인 ABDCon 변이체는 서열 번호 21의 Y21, Y22, K30, T31, A37, 및 E41로부터 선택된 하나 이상의 잔기에 치환을 갖는 변이체이다.

예시적인 ABDCon 변이체는 아미노산 서열 LKEAKEKAIEELKKAGITSDX₁X₂FDLINKAX₃X₄VEGVNX₅LKDX₆ILKA(서열 번호 22)를 포함하며; 여기서 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, 및 X₆은 임의의 아미노산일 수 있다.

다른 실시 형태에서, 예시적인 ABDCon 변이체는 아미노산 서열 LKEAKEKAIEELKKAGITSDX₁X₂FDLINKAX₃X₄VEGVNX₅LKDX₆ILKA(서열 번호 23)를 포함하며, 여기서

i) X₁은 라이신(K), 알지닌(R), 아스파테이트(D), 글루타메이트(E), 알라닌(A), 글리신(G), 페닐알라닌(F), 또는 타이로신(Y)이고;

ii) X₂는 알라닌(A), 세린(S), 발린(V), 라이신(K), 알지닌(R), 아스파테이트(D), 글루타메이트(E), 또는 타이로신(Y)이며;

iii) X₃은 아스파테이트(D), 글루타메이트(E), 또는 라이신(K)이고;

iv) X₄는 알라닌(A), 글리신(G), 또는 트레오닌(T)이며;

v) X₅는 발린(V), 타이로신(Y), 또는 알라닌(A)이고;

vi) X₆은 글루타민(Q), 아스파라긴(N), 라이신(K), 알지닌(R), 또는 글루타메이트(E)이다.

다른 실시 형태에서, 예시적인 ABDCon 변이체는 아미노산 서열 LKEAKEKAIEELKKAGITSDX₁X₂FDLINKAX₃X₄VEGVNX₅LKDX₆ILKA(서열 번호 24)를 포함하며, 여기서

i) X₁은 라이신(K), 알라닌(A), 또는 타이로신(Y)이고;

ii) X₂는 알라닌(A), 세린(S), 발린(V), 또는 타이로신(Y)이며;

iii) X₃은 아스파테이트(D) 또는 라이신(K)이고;

iv) X₄는 알라닌(A) 또는 트레오닌(T)이며;

v) X₅는 발린(V), 타이로신(Y), 또는 알라닌(A)이고;

vi) X₆은 글루타민(Q) 또는 글루타메이트(E)이다.

부가적인 예시적 ABDCon 변이체는 서열 번호 25 내지 34에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 주지의 방법을 사용하여, 예를 들어 플라스몬 공명(바이아코어(BIAcore), 스웨덴 웁살라 소재의 GE-헬스케어(GE-Healthcare))을 사용하는 시험관내 어세이에서, ABDCon 변이체를 알부민 결합에 대해 시험한다. 특정 ABDCon 변이체/알부민 상호작용의 측정된 친화력은 상이한 조건(예를 들어, 삼투성, pH) 하에 측정할 경우에 변동될 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 결합 파라미터(예를 들어, K_D, K_on, K_off)의 측정은 바람직하게는 ABDCon 변이체 및 알부민의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충제, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 완충제를 이용하여 실행된다. 알부민에 대한 ABDCon 변이체의 친화력은 약 1×10^-5 M 이상, 약 1×10^-6 M 이상, 약 1×10^-7 M 이상, 약 1×10^-8 M 이상, 약 1×10^-9 M 이상, 약 1×10^-10 M 이상, 약 1×10^-11 M 이상, 약 1×10^-12 M 이상, 또는 약 1×10^-13 M 이상의 범위일 수 있다. 예를 들어, ABDCon(서열 번호 21)의 Y22에서의 다양한 치환은 알부민에 대한 변이체의 친화력을 치환에 따라 약 300 내지 1,000배 감소시켰다(표 4). 당업자는 정의된 위치 또는 위치의 조합에 치환을 갖는 부가적인 변이체를 설계하여 생성시키고 일상적인 방법을 사용하여 목적하는 알부민 결합 친화력에 대해 시험할 수 있다.

ABDCon 또는 ABDCon 변이체의 N-말단에 5개 아미노산 연장부를 첨가함으로써 ABDCon 및 그의 변이체를 추가로 개질할 수 있다. 5개 아미노산 연장부는 아미노산 서열 TIDEWL(서열 번호 43), 또는 서열 번호 42 또는 45 내지 55에 나타낸 임의의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. N-말단 5개 아미노산 연장부를 ABDCon 및 그의 변이체 내로 도입하는 것은 분자의 안정성을 증가시킬 수 있다. N-말단 5개 아미노산 연장부는 ABDCon 및 변이체의 제1 알파 나선의 일부로서 구조적으로 정돈(ordered)될 수 있다. 그러므로 N-말단이 연장된 분자의 개선된 안정성은 나선의 전체적인 구조의 안정화로부터 유발될 수 있다. 표준 방법을 사용하여 N-말단 ABDCon 변이체를 제조할 수 있으며, 그들의 안정성, 예를 들어 열 안정성을 본 명세서에 기재된 바와 같이 평가할 수 있다. ABD 구조를 안정화시키고 생성되는 분자의 열 안정성과 같은 안정성을 개선하기 위하여, 5개의 N-말단 아미노산의 첨가를 이용하여 임의의 알부민 결합 도메인(ABD)을 개질할 수 있다.

예를 들어 안정성의 개선, 면역원성의 감소, 용해도의 개선, 또는 임의의 다른 적합한 특징을 목적으로, 알부민에 대한 결합에 영향을 주지 않는 잔기에서 ABDCon 및 그의 변이체를 추가로 개질할 수 있다. 이러한 목표를 달성하기 위한 한가지 방법에서는, 모 서열 및 조작 서열의 3-차원 모델을 사용하는 모 서열 및 다양한 개념 조작 산물(conceptual engineered product)의 분석 과정에 의해 ABDCon 및 그의 변이체를 임의로 제조할 수 있다. 3-차원 모델이 통상 이용가능하고 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 서열의 가능한 3-차원 입체형태적 구조를 묘사하고 디스플레이하여 가능한 면역원성을 측정할 수 있는 컴퓨터 프로그램(예를 들어, 미국 캘리포니아주 몬로비아 소재의 젠코, 인크.(Xencor, Inc.)의 이뮤노필터(Immunofilter) 프로그램)이 입수가능하다. 이들 디스플레이의 조사는 후보 서열의 작용에 있어서 잔기의 예상 역할(예를 들어, ABDCon 도메인의 안정성에 영향을 미치는 잔기)의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 목적하는 특징, 예를 들어 개선된 안정성이 달성되도록 모 서열 및 기준 서열로부터 잔기를 선택하고 조합할 수 있다. 대안적으로, 또는 상기 절차에 부가하여, 당업계에 공지된 바와 같은 다른 적합한 조작 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 알부민 결합 도메인의 바람직한 물리적 특성은 높은 열 안정성 및 열 폴딩 및 언폴딩의 가역성을 포함한다. 단백질 및 효소의 겉보기 열 안정성을 증가시키기 위하여 몇몇 방법이 적용되었으며, 이는 고도로 유사한 열안정성 서열에 대한 비교를 기반으로 하는 합리적인 설계, 다이설파이드 가교를 안정화시키는 설계, 알파-나선 성향을 증가시키는 돌연변이, 염 가교의 조작, 단백질의 표면 전하의 변경, 지향 진화, 및 컨센서스 서열의 조합을 포함한다(문헌[Lehmann and Wyss, Curr Opin Biotechnol 12:371-375, 2001]). 높은 열 안정성은 발현 단백질의 수율을 증가시키고, 용해도 또는 활성을 개선하고, 면역원성을 감소시키고, 제조 중에 콜드 체인(cold chain)의 필요성을 최소화할 수 있다.

본 발명의 알부민 결합 도메인의 임의의 특징을 개선하기 위해 치환될 수 있는 잔기는, 치환을 실행하고 알부민 결합 도메인의 목적하는 특징에 대해 어세이함으로써 결정할 수 있다. 예를 들어, 알라닌 스캐닝을 채용하여 알부민 결합 도메인의 안정성에 영향을 줄 수 있는 ABDCon 및 그의 변이체 내의 위치를 동정할 수 있다.

안정성 상실의 관점에서, 즉, 단백질의 "변성됨" 또는 "변성"은, 활성 및/또는 용해도의 상실을 수반하여, 단백질의 작용 특성을 부여하는 3-차원 입체형태의 일부 또는 전부가 상실되는 과정을 의미한다. 변성 중에 붕괴되는 힘은 분자내 결합, 예를 들어, 정전기적, 소수성, 반 데르 발스 힘, 수소 결합, 및 다이설파이드를 포함한다. 단백질 변성은 단백질 또는 단백질을 포함하는 용액에 적용되는 힘, 예를 들어, 기계적 힘(예를 들어, 압축력 또는 전단력), 열적 응력, 삼투성 응력, pH의 변화, 전기장 또는 자기장, 이온화 방사, 자외선 방사, 및 탈수에 의해, 그리고 화학적 변성제에 의해 야기될 수 있다.

단백질 안정성 및 단백질 불안정성의 측정은 단백질 완전성(integrity)의 동일하거나 상이한 양상이라고 볼 수 있다. 단백질은 열에 의해, 자외선 또는 이온화 방사, 액체 용액 내의 경우에는 주위 삼투성 및 pH의 변화, 작은 기공-크기 여과에 의해 부과되는 기계적 전단력, 자외선 방사, 이온화 방사, 예를 들어 감마 조사에 의해, 화학적 탈수 또는 열 탈수, 또는 단백질 구조 붕괴를 야기할 수 있는 임의의 다른 작용 또는 힘에 의해 야기되는 변성에 민감하거나 "불안정"하다. 분자의 안정성은 표준 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 표준 방법을 사용하여 열 융해(T_m) 온도(분자의 절반이 언폴딩되는 섭씨 °(℃) 단위의 온도)를 측정함으로써 분자의 안정성을 결정할 수 있다. 전형적으로, T_m이 높을수록 분자가 더 안정하다. 열에 부가하여, 화학적 환경 또한 단백질이 특정 3차원 구조를 유지하는 능력을 변화시킨다.

화학적 변성을 다양한 방법에 의해 마찬가지로 측정할 수 있다. 화학적 변성제는 구아니디늄 하이드로클로라이드, 구아나디늄 티오시아네이트, 우레아, 아세톤, 유기 용매(DMF, 벤젠, 아세토니트릴), 염(암모늄 설페이트 리튬 브로마이드, 리튬 클로라이드, 소듐 브로마이드, 칼슘 클로라이드, 소듐 클로라이드); 환원제(예를 들어, 다이티오트레이톨, 베타-메르캅토에탄올, 다이니트로티오벤젠, 및 하이드라이드, 예를 들어, 소듐 보로하이드라이드), 비-이온성 및 이온성 세제, 산(예를 들어, 염산(HCl), 아세트산(CH₃COOH), 할로겐화 아세트산), 소수성 분자(예를 들어, 인지질), 및 표적화 변성제를 포함한다. 변성 정도의 정량화는 작용 특성, 예를 들어, 표적 분자에 결합하는 능력의 손실에 의존할 수 있거나, 물리화학적 특성, 예를 들어, 응집하는 경향, 이전에는 용매 접근불가능했던 잔기의 노출, 또는 다이설파이드 결합의 붕괴 또는 형성에 의한다.

ABDCon 결합 도메인 및 그의 변이체는 생물활성제에 작동적으로 연결될 수 있다. 예시적인 생물활성제는, 주지의 링커, 예를 들어 폴리-글리신, 글리신 및 세린(Gly-Ser 링커), 또는 알라닌 및 프롤린을 함유하는 링커를 사용하여 ABDCon 및 그의 변이체에 작동적으로 연결될 수 있는 펩티드 및 단백질이다. 인공 펩티드 링커와 더불어 천연적으로 발생하는 펩티드 링커의 용도는 문헌에 주지되어 있다(문헌[Hallewell et al., J Biol Chem 264:5260-5268, 1989]; 문헌[Alfthan et al., Protein Eng. 8:725-731, 1995]; 문헌[Robinson & Sauer, Biochemistry 35:109-116, 1996]; 미국 특허 제5,856,456호). 생물활성제는 그의 C- 또는 N-말단으로부터 ABDCon 또는 그의 변이체에 연결될 수 있다. 다중-특이적 생물활성제 또한 ABDCon에 연결될 수 있다. 이들 경우에, ABDCon은 분자의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다. ABDCon은 또한, 그것이 하나의 약제의 C-말단 및 다른 약제의 N-말단에 연결되도록 이러한 다중특이적 약제 내에 내부적으로 위치할 수 있다. 생물활성제는 또한, 예를 들어 하이드라존 또는 세미카르바존 연결을 사용하는 당업계에 주지된 화학적 가교결합을 사용하여 본 발명의 알부민 결합 도메인에 커플링될 수 있다. 예시적인 생물활성제는, 제WO2011/137319A2호 및 제WO2010/093627A2호에 기재된 텐콘25-기반의 라이브러리와 같은, 피브로넥틴 유형 III(FN3) 반복 단백질 라이브러리로부터 동정된 단백질과 같은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 단백질이다.

목적하는 특성을 위해 부가적인 부분, 예를 들어, 독소 접합체, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자, 예를 들어, PEG5000 또는 PEG20,000, 상이한 쇄 길이의 지방산 및 지방산 에스테르, 예를 들어, 라우레이트, 미리스테이트, 스테아레이트, 아라키데이트, 베헤네이트, 올레에이트, 아라키도네이트, 옥탄다이오산, 테트라데칸다이오산, 옥타데칸다이오산, 도코산다이오산 등, 폴리라이신, 옥탄, 탄수화물(덱스트란, 셀룰로오스, 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드)을 본 발명의 ABDCon 또는 그의 변이체 내로 혼입시킬 수 있다. 이들 부분은 ABDCon 코딩 서열과의 직접 융합일 수 있으며, 표준 클로닝 및 발현 기술에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 주지의 화학적 커플링 방법을 사용하여 본 발명의 재조합적으로 생성된 ABDCon에 그 부분을 부착할 수 있다.

생물활성제와 ABDCon의 융합 단백질과 더불어, ABDCon 및 그의 변이체를 생체내 모델에서 주지의 약동력학 특성을 사용하여 그들의 반감기에 대해 평가할 수 있다. 예시적인 ABDCon 및 그의 변이체는 약 1 pM 내지 1 μM, 75 pM 내지 860 nM, 100 pM 내지 500 nM, 또는 1 nM 내지 100 nM의 K_D로 알부민에 결합한다.

ABDCon 및 그의 변이체의 생성 및 제조

본 발명의 알부민 결합 도메인의 생성은 전형적으로 표준 방법을 사용하여 핵산 수준에서 달성된다. 예를 들어, 표준 PCR 클로닝 방법, 또는 미국 특허 제6,521,427호 및 미국 특허 제6,670,127호에 기재된 방법에 따른 화학적 유전자 합성을 사용하거나, 쿤켈(Kunkel) 돌연변이유발(문헌[Kunkel et al., Methods Enzymol 154:367-382, 1987])을 사용하여, 하나 이상의 특이적 잔기에 치환된 코돈을 갖는 ABDCon 변이체를 합성할 수 있다. 임의의 잔기 위치에 대해 무작위화된 코돈을 사용하고자 하는 경우에, 주지의 방법, 예를 들어 설계된 다양성에 일치하는 축퇴 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 또는 예를 들어 20개의 천연적으로 발생하는 아미노산 모두를 암호화하는 NNK 코돈 사용하여, 무작위화를 달성할 수 있다. 다른 다양화 스킴에서는, DVK 코돈을 사용하여 아미노산 Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, 및 Cys를 암호화할 수 있다. 대안적으로, NNS 코돈을 사용하여 20개 아미노산 잔기 모두를 발생시킴과 동시에 정지 코돈의 빈도를 감소시킬 수 있다. 코돈 표기는 주지의 IUB 코드에 따른다.

소정의 위치에 선택된 뉴클레오티드 "축퇴"를 가진 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 주지되어 있다(예를 들어, TRIM 접근법(문헌[Knappek et al., J Mol Biol 296:57-86, 1999]; 문헌[Garrard & Henner, Gene 128:103-109, 1993]). 구매가능한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 시약 및 장치를 사용하여, 소정 코돈 세트를 갖는 이러한 뉴클레오티드의 세트를 합성할 수 있다.

표준 클로닝 및 발현 기술을 사용하여, ABDCon 또는 그의 변이체를 벡터 내로 클로닝하거나 발현시킬 ABDCon의 이중 가닥 cDNA를 합성하거나, 시험관내에서 단백질을 번역한다. 주지의 방법을 사용하여 생물활성제를 ABDCon 또는 그의 변이체에 작동적으로 연결할 수 있다.

핵산 분자 및 벡터

본 발명은, 시험관내 전사/번역에 사용되는 선형 DNA 서열, 조성물의 원핵생물, 진핵생물, 또는 사상 파아지 발현, 분비, 및/또는 디스플레이와 상용성인 벡터를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 또는 발현 벡터의 일부로서, 또는 선형 DNA 서열의 일부로서, 본 발명의 ABDCon 또는 그의 변이체를 암호화하는 핵산을 제공한다. 소정의 예시적인 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에 개시되나, 주어진 발현 시스템 내에서 유전자 코드의 축퇴 또는 코돈 선호도를 고려하여, 본 발명의 ABDCon 또는 그의 변이체를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 범주 내에 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 자동화 폴리뉴클레오티드 합성기 상에서 고체상 폴리뉴클레오티드 합성과 같은 화학적 합성에 의해 생성되고 완전한 단일 또는 이중 가닥 분자로 조립될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 PCR 후의 일상적인 클로닝과 같은 다른 기술에 의해 생성될 수 있다. 주어진 공지된 서열의 폴리뉴클레오티드를 생성하거나 얻는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 비-코딩 서열, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서 서열, 인트론, 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 또한, 예를 들어, 단백질의 정제 또는 검출을 용이하게 하기 위한 헥사-히스티딘 또는 HA 태그와 같은 마커 또는 태그 서열, 신호 서열, 융합 단백질 파트너, 예를 들어 생물활성제를 암호화하는 cDNA 등을 암호화하는, 부가적인 아미노산을 암호화하는 부가적인 서열을 포함할 수 있다.

예시적인 폴리뉴클레오티드는 ABDCon을 암호화하는 서열, 리보솜 결합 부위를 위한 서열, 프로모터 서열, 터미네이터 서열, 항생제 내성 유전자, 및 박테리아 복제 기점(ori)을 포함한다. 본 발명의 알부민 결합 도메인을 암호화하는 예시적인 폴리뉴클레오티드를 서열 번호 35에 나타낸다.

본 발명의 또 다른 실시 형태는 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 이들 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 배큘로바이러스(baculovirus) 발현용 벡터, 트랜스포존(transposon) 기반의 벡터, 또는 임의의 수단에 의한 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 주어진 유기체 또는 유전자 백그라운드(genetic background)로의 도입에 적절한 임의의 다른 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 이러한 벡터에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 발현을 제어하거나, 조절하거나, 야기하거나, 허용할 수 있는 핵산 서열 요소를 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 그러한 요소는 전사 인핸서(enhancer) 결합 부위, RNA 폴리머라아제 개시 부위, 리보좀 결합 부위, 및 주어진 발현 시스템에서 암호화된 폴리펩티드의 발현을 돕는 기타 부위를 포함할 수 있다. 그러한 발현 시스템은 당업계에 잘 알려진 세포 기반 시스템 또는 무세포 시스템일 수 있다.

숙주 세포 선발 또는 숙주 세포 조작

당업계에 주지된 바와 같이, 세포주, 혼합 세포주, 불멸화(immortalized) 세포 또는 불멸화 세포의 클론 집단에 의해, 본 발명의 ABDCon 및 그의 변이체를 임의로 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001)]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; 문헌[Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)]을 참조한다.

발현용으로 선택된 숙주 세포는 포유류 기원의 것일 수 있거나, COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, HeLa, 골수종, 림프종, 효모, 곤충 또는 식물 세포, 또는 그의 임의의 유도체, 불멸화 또는 형질전환 세포로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는, 폴리펩티드를 글리코실화할 수 없는 종 또는 유기체, 예를 들어, 원핵 세포 또는 유기체, 예를 들어, BL21, BL21(DE3), BL21-GOLD(DE3), XL1-Blue, JM109, HMS174, HMS174(DE3), 및 천연 또는 조작된 E. 콜라이 종(E. coli spp), 클렙시엘라 종(Klebsiella spp.), 또는 슈도모나스 종(Pseudomonas spp) 균주 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 알부민 결합 도메인의 용도

본 발명의 비-천연 알부민 결합 도메인 ABDCon 및 그의 변이체의 조성물을 사용하여, ABDCon과 생물활성제를 작동적으로 연결함으로써 동물의 조직 내에서 생물활성제의 반감기 및/또는 생체분포를 조정할 수 있으며, 여기서 동물에 대한 조성물의 투여는 활성제 단독 투여시에 얻어지는 조직 분포와는 상이한 생물활성제의 반감기 및/또는 생체분포를 유발한다.

ABDCon 또는 그의 변이체를 포함하는 약제학적 조성물

생물활성제에 작동적으로 연결된 알부민에 결합하는 ABDCon 또는 그의 변이체를, 포획, 고정화, 분배, 또는 침강을 위한 당업계에 주지된 분리 절차를 사용하여 단리하고, 상업적 응용성을 위해 필요한 정도로 정제할 수 있다.

치료적 용도를 위해, 약제학적으로 허용가능한 담체 내에 유효량의 생물활성제-ABDCon 융합 단백질을 활성 성분으로서 함유하는 약제학적 조성물로서 생물활성 분자-ABDCon 융합 단백질을 제조할 수 있다. 용어 "담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 비히클은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 것들, 예를 들어, 낙화생유, 대두유, 광물유, 참기름 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신을 사용할 수 있다. 이들 용액은 무균성이고 일반적으로 입자상 물질이 없다. 이들은 통상적인 잘 알려져 있는 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다(예를 들어, 여과). 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 안정화제, 농후제, 윤활제, 및 착색제 등과 같은 생리적 조건에 근접시키기 위하여 필요한, 약제학적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수 있다. 이러한 약제학적 제형에서 생물활성제-ABDCon 융합 단백질의 농도는 광범위하게, 즉, 약 0.5 중량% 미만, 통상적으로 약 1 중량%, 또는 약 1 중량% 내지 15 또는 20 중량% 정도로 변동될 수 있고, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 주로 필요한 용량, 유체 부피, 점도 등을 기반으로 선택될 것이다. 적합한 비히클 및 제형은, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092(특히 pp. 958-989 참조)]에 기재되어 있다.

생물활성제-ABDCon 융합 단백질의 치료적 용도를 위한 투여 방식은 약제를 숙주에 전달하는 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 비경구 투여, 예를 들어, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 또는 피하, 폐; 경점막(경구, 비강내, 질내, 직장); 정제, 캡슐, 액제, 현탁액, 분제, 겔, 입자 중의 제형의 사용; 및 주사기, 이식 디바이스, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로펌프 내에 포함되는 제형의 사용; 또는 당업계에 주지된 바와 같이, 당업자에 의해 인식되는 다른 수단일 수 있다. 부위 특이적 투여는, 예를 들어, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 혈관내, 방광내, 병변내, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 전달에 의해 달성될 수 있다.

본 발명을 일반적인 개념으로 개시하였지만, 본 발명의 실시 형태는 특허청구범위의 범주를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 되는 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이다.

실시예 1. 비-천연 알부민 결합 도메인의 생성

비-천연 알부민 결합 도메인 컨센서스(ABDCon)의 설계

비-중복 단백질 데이터베이스에 기탁된 3-나선 번들 ABD 서열의 컨센서스 아미노산 서열을 계산함으로써 비-천연 알부민 결합 도메인(ABD)을 설계하였다. 컨센서스 서열을 결정하기 위하여, 스트렙토코커스 종 G148 단백질 G(서열 번호 1)로부터의 ABD를 비-중복 NCBI 단백질 데이터베이스(http:_//blast_ncbi_nlm_nih_gov/Blast_cgi)에 대한 블라스트(BLAST) 검색을 위한 주형 서열로 사용하였다. 모든 초기 설정을 블라스트 검색에 사용하였다(예상 임계값(Expect threshold) = 10, 단어 크기(word size) = 3, 매트릭스(matrix) = BLOSUM62, 갭 코스트(gap cost) = 기존(existence) 11, 연장(extension) 1, 및 조합 조정(compositional adjustment) = 조건부 조합 점수 매트릭스 조정(conditional compositional score matrix adjustment)). 이 검색으로부터, 표 1(서열 번호 1 내지 20)에 열거된 가장 밀접하게 관련된 20개의 단백질 도메인이 컨센서스를 결정하기 위한 다중 서열 정렬에 포함되도록 선택되었다. 비-중복 서열만 선택되었다. 몇몇 단백질 수탁 번호는 표 1에 여러번 열거되어 있으며, 이는 일부 단백질이 밀접하게 관련된 몇몇 ABD 도메인을 함유함을 시사한다. 서열 번호 4는 파아지 디스플레이 및 유전자 셔플링(gene shuffling)에 의해 유도된 비-천연 ABD이다(문헌[He et al., Protein Sci 16::1490-1494, 2007]).

얼라인X(AlignX) 소프트웨어(모든 초기 설정을 사용함)를 사용하여, 열거된 서열로부터 다중 서열 정렬을 생성시켰다. 각각의 서열 위치에서 가장 우세한 아미노산을 선택하기 위하여, 표 6에 나타낸 서열 정렬을 사용하여 알부민 결합 도메인 컨센서스 서열, ABDCon(서열 번호 21, 표 6)을 유도하였다. 위치 21에 대해 Ile 대신에 Tyr을 선택하였으며, 이는 이 위치에 대한 명확한 컨센서스가 없었고 방향족 잔기 Tyr 및 Phe가 잘 대표되었기 때문이다. ABDCon 사이의 쌍별 서열 동일성은 45%(서열 번호 3) 내지 82%(서열 번호 8, 13, 14, 및 16)의 범위이다.

유전자 합성

알부민 결합 도메인 컨센서스(ABDCon)의 아미노산 서열을, 하기와 같이 E. 콜라이 발현에 바람직한 코돈을 사용하여 ABDCon을 암호화하는 핵산 서열로 역번역하고(서열 번호 35) 합성 유전자를 생성시켰다(블루헤런 바이오테크놀로지스(BlueHeron Biotechnologies)). 단백질 정제를 위한 N-말단 8-His 태그를 암호화하는 DNA 서열과 더불어, 서브클로닝을 위한 NdeI 및 XhoI 부위를 첨가하기 위하여, 서열 번호 34의 합성 유전자 서열에 5' 및 3' DNA 서열을 첨가하였다. 이 유전자를 T7 프로모터 서열에 의해 유도되는 발현용 pET26 벡터(노바젠(Novagen)) 내로 클로닝하고 E. 콜라이 균주 BL21(DE3)(노바젠) 내로 형질전환시켰다.

발현 및 정제

ABDcon의 발현을 위하여, 30 ㎍/mL 카나마이신으로 보충된 50 mL의 LB 배지를 1개의 콜로니로 접종하고 220 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 다음 날에, 10 mL의 밤샘 배양물을 30 ㎍/mL 카나마이신으로 보충된 100 mL의 테리픽 브로스(Terrific Broth)에 첨가하고 37℃, 220 rpm에서 2.5 시간 동안 배양물을 성장시켰다. IPTG를 1 mM의 최종 농도로 첨가하고 온도를 30℃로 감소시켜 단백질 발현을 유도하였다. 14 시간 후에 4000 X g에서 20 분 동안의 원심분리에 의해 세포를 수확하고 세포 펠렛을 -20℃에 보관하였다. 습윤 펠렛의 그램 당 5 mL의 버그버스터(BugBuster) HT(노바젠)에 냉동 세포 펠렛을 재현탁하고 실온에서 30 분 동안 온화하게 혼합하였다. Ni-NTA 크로마토그래피(GE 헬스케어)에 의해, 50 mM 소듐 포스페이트(pH 7.4), 500 mM 소듐 클로라이드의 완충제 중에 10 내지 250 mM 이미다졸의 경사로 용출시켜, 폴리-히스티딘 태깅된 ABDCon 분자를 정제하였다. ABDCon을 함유하는 분획을 합하고, PBS의 이동상과 함께 수퍼덱스(Superdex)75 16/60 컬럼(GE 헬스케어)을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. SDS-PAGE 분석에 의해 순도를 평가하였다(도 1). 질량분석법에 의해 질량이 6383 Da으로 결정되었으며, 이는 6382 Da의 이론적 질량과 일치한다(도 2). 수퍼덱스 75 5/150 컬럼(GE 헬스케어)을 사용하는 분석용 크기 배제 크로마토그래피는 ABDCon 제제에 응집물이 없으며 단량체성 단백질과 일치하는 시간에 용출됨을 나타낸다(도 3).

실시예 2. ABDCon의 특성화

ABDCon의 열 안정성

ABDCon을 PBS(pH 7.4) 중에 2.175 mg/mL로 농축하고 시차 주사 열량법(DSC: differential scanning calorimetry)에 의해 열 안정성을 평가하였다. VP-DSC 기기(마이크로칼(MicroCal)) 내에서 400 μL의 ABDCon 용액을 25℃로부터 100℃까지 1℃/분의 스캔 속도로 가열함으로써 안정성 데이터를 생성시켰다. 열 폴딩/언폴딩의 가역성을 평가하기 위하여 동일한 제2 스캔을 샘플에 완료하였다. 융해 온도를 계산하기 위하여 2-상태 언폴딩 모델에 데이터를 적합시켰다. 도 4는 ABDCon이 PBS 중에 81.5℃의 높은 열 안정성을 가지며 폴딩이 완전히 가역적임을 나타낸다.

알부민에 대한 ABDCon 결합

인간 혈청 알부민 및 마우스 혈청 알부민에 대한 ABDCon 결합의 동력학을 GLC 센서 칩을 사용하는 프로테온(ProteOn)(상표) XPR-36 단백질 상호작용 어레이 시스템(Protein Interaction Array System)(바이오-라드(Bio-Rad)) 상에서 측정하였다. 인간(서열 번호 36), 레수스(Rhesus)(서열 번호 37), 및 쥐과(서열 번호 38) 혈청 알부민을 시그마(Sigma)(카탈로그 #A4327(인간), #A3559(쥐과), 및 #A4297(레수스))로부터 구매하고 상이한 농도로 PBS 중에 재현탁하였다. pH 5.0에서 2.1 ㎍/mL에서의 표준 아민 커플링을 통해 GLC 칩의 수직 배향으로 리간드 채널 상에 각각의 혈청 알부민을 직접 고정시켜 500 내지 1000 공명 단위의 리간드 밀도를 가진 표면을 얻었다. 분석물로서 5가지의 상이한 농도(예를 들어, 3-배 농도 시리즈로 희석된 1 μM)를 고정된 혈청 알부민 표면 위에 수평 배향으로 동시에 유동시킴으로써 재조합 ABDCon의 결합을 시험하였다. PBST(PBS, 0.005% 트윈(Tween)20)를 실행 완충제로 사용하여 100 μL/min의 유속에서 2 시간 동안 모든 농도에 대한 해리 단계를 모니터링하였다. 제6 샘플(완충제 단독)을 주입하여 기준선 안정성을 모니터링하였다. 0.8% 인산의 짧은 펄스(18 μL) 1회를 사용하여 표면을 재생시켰다.

먼저 완충제 단독 반응 및 분석물과 칩 사이의 비-특이적 결합을 감산함으로써 원 반응 데이터를 처리하였다. 5가지의 농도 전부의 처리된 데이터를 각각의 리간드 표면에 대한 1:1 단순 랭뮤어 결합 모델(1:1 simple langmuir binding model)에 포괄적으로 적합시켰다. 표 2에는 각각의 종의 알부민에 대해 결정된 결합 동력학이 기재되어 있다.

마우스에서 ABDCon 융합체의 혈청 반감기

텐콘25의 c-말단에 대한 ABDCon의 융합체를 암호화하는 합성 유전자를 생성시킴으로써 ABDCon이 융합 단백질의 혈청 반감기를 연장하는 능력을 평가하였다. 텐콘25는, 제US2011/0274623A1호에 기재되고 서열 번호 39의 잔기 1 내지 90에 나타낸 서열을 갖는 피브로넥틴 유형 III(FN3) 반복 단백질의 컨센서스 서열을 기반으로 하는 단백질 스캐폴드이다. (G₄S)₂ 펩티드 링커(서열 번호 40)에 의해 텐콘25와 ABDCon 단백질 도메인을 융합시켰다. 생성되는 융합 단백질은 서열 번호 39에 나타낸 폴리펩티드 서열을 갖는다. 정제 목적으로 폴리-히스티딘 태그를 C-말단에 혼입시켰다. 69 마리의 BALB/c 자성 마우스를 3개의 군으로 분할하였다(군 1은 N=3인 비-처리 대조군이고, 군 2 내지 3은 N= 33임). 2 mg/㎏에서 텐콘25-ABDCon 융합 단백질의 단일 정맥내 용량으로 마우스를 처리하였다. 투여는 투여일에 동물의 중량을 기반으로 하였다. 주사 후 하기의 시점에 마우스를 안락사시켰다: 10 min, 30 min, 1, 4, 6 시간, 및 1, 2, 3, 7, 10, 14 일. 심장 천공을 통해 각각의 동물로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 실온에서 30 분 동안(그러나 1 시간 이하) 혈액 샘플이 응고되도록 하였다. 이어서, 대략 3,500 rpm에서 15 분 동안 혈액 샘플을 원심분리하였다. 메조스케일 디스커버리(Mesoscale Discovery) 플랫폼 상에서 균질 샌드위치 ELISA(homogenous sandwich ELISA)를 사용하여 혈청 샘플을 분석하였다. 스트렙타비딘-금 플레이트(메조스케일 디스커버리)를 수퍼블록(Superblock)(TBS) 트윈-20(서모(Thermo))으로 1 시간 동안 블로킹하였다. 포획(바이오틴화됨) 및 검출(MSD 설포-태그(메조스케일 디스커버리)로 표지됨) 양자 모두를 위해 0.625 ㎍/ml로 다클론 항-텐콘25 항체를 사용하였다. 항원 및 항체를 플레이트에 첨가하고, 이를 RT에서 격렬하게 진탕하면서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBS-T(시그마)로 세척하고 계면활성제를 가진 MSD 판독 완충제(메조스케일 디스커버리)를 첨가하였다. MSD 섹터 이미저(Sector Imager) 6000을 사용하여 플레이트를 판독하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용하여 데이터를 분석하였다. 이전의 연구에서는, 마우스에서 유사한 융합되지 않은 텐콘 분자가 대략 20 분의 혈청 반감기로 혈류로부터 빠르게 청소되는 것으로 나타났다. ABDCon에 대한 텐콘25의 융합체는 혈청 반감기를 60 시간 초과로 연장한다(도 5).

실시예 3: 혈청 알부민에 대한 친화력을 변동시키기 위한 ABDCon의 조작

혈청 알부민에 대한 결합의 친화력은 치료 단백질의 혈청 반감기 뿐 아니라 그 분자가 그의 표적에 결합하여 중화시키는 능력 또한 좌우할 수 있다. 예를 들어, 혈청 알부민에 너무 약하게 결합하는 분자는 알부민에 결합되지 않은 동안의 신 여과로 인해 짧은 혈청 반감기를 가질 것이다(문헌[Hopp et al., Protein Eng Des Sel 23:827-834, 2010]). 반면에, 알부민에 너무 강하게 결합하는 분자는 바람직한 작용 부위에서 알부민으로부터 방출되지 않을 것이므로, 일부 경우에는 목적하는 표적을 중화시키지 못할 수 있다. 그러므로 알부민 상호작용이 목적하는 혈청 반감기를 제공하기에 딱 맞게 충분한 방식으로 알부민 결합을 통한 반감기 연장을 달성하는 것이 바람직하다. 본 명세서에 기재된 ABDCon 서열은 75 pM의 친화력 및 3.02×10^-5 1/s의 해리 속도(본 명세서에 기재된 실험 조건 하에서)로 인간 혈청 알부민에 결합하므로, 일단 동물 또는 환자에게 투여되면 ABDCon에 융합된 분자는 알부민에 주로 결합할 것이다. 일부 표적 및 융합체의 경우, 혈청 알부민에 덜 강하게 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 알부민에 대한 ABDCon의 결합 친화력을 낮추기 위해 ABDCon의 10개의 돌연변이체 버전이 설계되었다. 표 3은 이들 돌연변이체를 요약한다:

인간 혈청 알부민에 결합된 GA 모듈(단백질 G-관련 알부민 결합 모듈)(PDB 코드 1TF0)의 결정 구조를 시험하고(문헌[Lejon et al., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 64:64-69, 2008]) GA와 매우 유사한 방식으로 ABDCon이 알부민에 결합한다는 가정을 함으로써 ABDCon 돌연변이체를 선택하였다. 소수성 접촉의 붕괴, 입체적 충돌의 도입, 염 가교의 붕괴, 및 수소 결합의 붕괴에 의해 알부민에 대한 ABDCon의 친화력을 감소시키기 위해 돌연변이체를 설계하였다(표 3). 도입된 변화는, 결합이 파기될 정도로 극적으로 결합 표면을 변경하지 않으면서 결합 친화력을 감소시키도록 설계되었다. ABDCon에 대해 기재된 바와 같이 E. 콜라이로부터 각각의 돌연변이체를 발현시키고 정제하였다. 돌연변이체 ABDCon11은 불용성인 것으로 확인되었으므로 추가의 분석으로부터 배제되었다. 표면 플라스몬 공명에 의해 인간, 마우스, 및 레수스 혈청 알부민에 대한 각각의 변이체의 친화력을 결정하였으며, 표 4에 나타냈다. 표 3에 열거된 위치에 부가하여, 잔기 L25, E33, G34, L38, I42, 및 A45를 돌연변이화하여(이들이 알부민과의 직접 접촉을 형성할 것으로 예측되므로) 알부민에 대한 ABDCon의 친화력을 증가시키거나 감소시킬 수 있다.

실시예 4: ABDCon 변이체 융합 단백질의 혈청 반감기

알부민에 대한 ABDCon 친화력과 반감기 연장 사이의 상관관계를 평가하기 위하여, 텐콘25(서열 번호 39의 아미노산 1 내지 90)를 ABDCon 변이체 3, 5, 7, 및 9에 융합시켰다(표 3). 이전의 연구에서 상기 기재된 바와 같이 이들 분자를 2 mg/㎏으로 마우스에 투여하고 텐콘25-ABDCon 융합체에 대해 기재된 바와 동일한 방법을 사용하여 분석하였다. 이들 분자에 대해 얻어진 PK 파라미터의 요약을 표 5 및 도 6에 나타낸다. 여기에서, 103 nM의 친화력에 도달할 때까지(이 지점에서는 PK 파라미터의 큰 차이가 얻어지지 않음) 알부민에 대한 친화력이 증가함에 따라 청소 속도가 감소하는 것으로 나타난다. 표 5의 데이터는, 알부민에 대한 ABDCon 분자의 친화력을 변동시킴으로써 반감기, 청소 속도, 및 총 노출(AUC)과 같은 특성을 조정하는 능력을 나타낸다.

실시예 5: 알부민 결합 도메인의 안정화

다양한 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인과의 융합 단백질로서 생성되는 경우에 ABDCon(서열 번호 21)의 안정성을 결정하기 위한 연구가 완료되었다(예를 들어, 미국 특허 공개 제US2010/0216708호 참조). 표준 클로닝 기술을 사용하여 FN3 도메인-ABDCon 융합 단백질을 생성시켰다. 융합 단백질 중 하나인 텐콘-ABDCon의 아미노산 서열을 서열 번호 41에 나타낸다. 제조된 다른 FN3 도메인-ABDCon 융합 단백질은 텐콘25-ABDCon, 83-ABDCon, 및 71-ABDCon이었다. 이들 단백질은 c-말단 폴리 히스티딘 태그를 동반하여 생성되었으며 표준 방법을 사용하는 니켈 친화력 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합에 의해 정제되었다. 각각의 정제된 분자를 37℃에서 28 일 동안 PBS(pH 7.4) 중에 인큐베이션한 후에 SDS-PAGE 및 질량분석법에 의해 분석하였다. 도 7a는, SDS-PAGE 겔 상의 저분자량 밴드의 출현에 의해 입증되는 바와 같이 각각의 FN3 도메인-ABDCon 융합 단백질이 이러한 인큐베이션 중에 분해되는 것으로 확인되었음을 나타낸다. 질량분석법 분석에서는 주요 분해 패턴이 ABDCon 서열(서열 번호 21)의 잔기 L1, K2, 및 E3에서의 이들 분자의 절단이었음이 확인되었다. 부가적으로, 4℃에서 6 내지 8 개월 동안 인큐베이션할 경우에 FN3 도메인에 융합된 천연 스트렙토코커스 단백질 G ABD(서열 번호 1)가 잔기 L1에서의 절단을 동반하는 유사한 분해 패턴을 나타냈음이 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 마지막으로, 일단 4℃에서 수 개월 동안 보관되면, 몇몇 정제된 로트의 천연 ABD(서열 번호 1) 및 ABDCon(서열 번호 21)이 불활성이고 SDS-PAGE에 의해 용액 중에 검출가능하지 않음이 관찰되었다(심각한 분해를 시사함).

상기 관찰은, ABDCon 및 천연 ABD 구조의 N-말단 알파 나선이 혈청 반감기 연장을 위해 사용될 때 불안정함을 제시하였다. 이러한 융합 단백질에 있어서 이러한 안정성의 결여는, 그것이 치료적 응용과 더불어 연구를 위한 이러한 분자의 저장 수명을 잠재적으로 제한하므로 바람직하지 않다. 그러므로, 이들 분자의 안정성을 개선하기 위한 전략이 개발되었다. 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank)에 기탁된 알부민 결합 도메인의 3차원 구조의 분석은, 천연 ABD(서열 번호 1)의 시작점에 대해 N-말단에서 확인되는 아미노산 서열 TIDQWL(서열 번호 42)이 몇몇 결정 구조에서 이 분자의 제1 알파 나선의 일부로서 구조적으로 정돈됨을 나타낸다(예를 들어, PDB 2VDB, 문헌[Acta Cryst 2008 F64, 64-69]). 이는 이 영역이 용액 중에 정돈되지 않는 것으로 나타난 ABD의 원래 NMR 구조와 대조적이다(PDB 1GAB, 문헌[Johansson et al., J.Mol.Biol. 266: 859-865, 1997]). 따라서, 알파 나선의 연장은 이러한 나선에 더 큰 안정성을 부여할 수 있으므로, ABD 및 ABDCon 서열의 이러한 제1 알파 나선의 연장은 이 영역에 더 큰 안정성을 부여할 수 있을 것으로 가정되었다(문헌[Su et al., Biochemistry 33:15501-15510, 1994]).

표 1에 제공된 천연 알부민 결합 도메인의 다중 서열 정렬은 이들 N-말단 잔기에 대한 명확한 컨센서스 서열을 드러내지 않았다. 그러나 하나의 펩티드 서열, TIDEWL(서열 번호 43)이 이들 단백질 도메인 중 5개에 대한 N-말단에 존재한다. 따라서, TIDEWL 서열을 ABDCon의 N-말단에 첨가함으로써 새로운 ABDCon 작제물, ABDCon12(서열 번호 44)를 생성시켰다. 이 단백질은 N-말단 폴리 히스티딘 태그를 동반하여 발현시켰으며 니켈 친화력 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 대한 표준 방법을 사용하여 균질하게 정제하였다. 정제된 ABDCon12를 37℃에서 PBS 중에 28 일 동안 인큐베이션하고 SDS-PAGE 및 질량분석법에 의해 안정성을 평가하였다. 14 일 후에 SDS-PAGE는 분해를 시사하는 약간 더 빠른 이동 패턴을 나타냈다. 그러나 총 질량 분석은 이러한 분해가 ABDCon12 서열에서가 아니라 폴리히스티딘 태그에서 배타적으로 발생함을 나타내며, 이는 TIDEWL 서열이 ABDCon의 안정성을 개선했음을 시사한다. 안정성의 추가의 증거는 생성된 FN3 도메인-ABDCon12 융합 단백질의 안정성(도 7b)에서 나타났으며, 이는 37℃에서 PBS 중에 28 일 동안 인큐베이션할 경우에 원래의 FN3 도메인-ABDCon 분자(도 7a)에 비교하여 현저하게 더 적은 분해 산물을 나타냈다.

이 분자에 대한 안정화의 기전을 조사하기 위하여, 상기 실시예 2에 약술된 절차를 사용하는 시차 주사 열량법에 의해 ABDCon12의 융해 온도를 결정하였다. PBS 중에 90.9℃의 융해 온도(원래의 ABDcon 분자에 비교하여 9.4 ° 증가)가 얻어졌으며, 이는 ABDCon12 및 ABDCon12 융합 단백질에 대해 관찰되는 단백질 가수분해/분해의 감소가 N-말단 알파 나선의 연장에 의해 제공되는 증가된 입체형태적 안정성의 결과임을 제시한다.

서열 번호 41: 텐콘-ABDCon

MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTTGGGGSGGGGSLKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKAGGHHHHHH

서열 번호 42: 스트렙 G. ABD의 N-말단 서열

TIDQWL

서열 번호 43: ABDCon에 첨부된 N-말단 서열

TIDEWL

서열 번호 44: ABDCon12

TIDEWLLKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA

실시예 6: ABDCon12의 특성화

실시예 2에 상기 기재된 바와 동일한 방법을 사용하는 표면 플라스몬 공명에 의해 인간 및 쥐과 알부민에 결합하는 정제된 ABDCon12의 친화력을 결정하였다. 인간 및 쥐과 알부민에 결합하는 ABDCon12에 대해 각각 0.7 nM 및 8.2 nM의 해리 상수가 얻어졌다. 항원에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인의 C-말단에 ABDCon12를 융합시킴으로써, ABDCon12가 융합체 분자의 혈청 반감기를 연장하는 능력을 나타냈다. IP 주사에 의해 이 분자를 2 mg/㎏으로 마우스에 투여하고 실시예 4에 상기 기재된 바와 같이 분석하였다. FN3 도메인-ABDCon12 융합 단백질에 대해 55 시간의 말단 반감기가 측정되었다.

실시예 7: 알부민 결합 도메인의 안정화

천연적으로 발생하는 알부민 결합 도메인의 서열 분석을 기반으로, 알부민 결합 도메인의 N-말단에 첨가된 다른 서열이 그들을 더 안정하게 만들 수 있을 것으로 예상된다. 예를 들어, 이들 천연 알부민 결합 도메인에 대한 N-말단에서, APAVDV(서열 번호 45), IAKEKA(서열 번호 46), TIDQWL(서열 번호 42), VPAADV(서열 번호 47), TVKSIE(서열 번호 48), TPAVDA(서열 번호 49), TLKSIK(서열 번호 50), WEKAAA(서열 번호 51), AVDANS(서열 번호 52), QLAAEA(서열 번호 53), ALKAAA(서열 번호 54), EKLAAA(서열 번호 55)와 같은(그러나, 이로 제한되지 않음) 다수의 상이한 서열들이 확인된다. 이들 서열이 더 긴 알파 나선을 생성시킨다면, 이들 서열을 알부민 결합 도메인에 첨가하는 것은 안정성을 증가시킬 수 있을 것이다. 부가적으로, 알파 나선 길이 또는 안정성을 증가시키는 비-천연 펩티드는 또한 알부민 결합 도메인을 안정화시킬 것으로 예측된다.

표준 기술을 사용하여 부가적인 N-말단 서열을 가진 변이체를 생성시키고 앞서 기재된 바와 같이 그들의 특성을 시험할 수 있다.

본 발명은 상기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 실시예에서 구체적으로 설명된 것과 다르게 실시할 수 있음이 명백할 것이다. 상기 교시 내용에 비추어 본 발명의 많은 변형 및 변경이 가능하며, 따라서 이들은 첨부된 특허청구범위의 범주 내이다.

SEQUENCE LISTING <110> Jacobs, Steven <120> Non-natural consensus albumin binding domains <130> JBI5009WOPCT <140> To be determined <141> 2013-03-23 <150> 61/651,642 <151> 2012-05-25 <150> 61/776,918 <151> 2013-03-12 <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Streptococcus sp. G148 <400> 1 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala 35 40 <210> 2 <211> 44 <212> PRT <213> Streptococcus canis <400> 2 Leu Ser Glu Ala Lys Glu Met Ala Ile Arg Glu Leu Asp Ala Gln Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Asn Lys Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Val Ala Leu Lys Asp Leu Ile Leu Asn Ser 35 40 <210> 3 <211> 42 <212> PRT <213> Streptococcus canis <400> 3 Leu Asp Gln Ala Lys Gln Ala Ala Leu Lys Glu Phe Asp Arg Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asn Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Ile Met Glu Leu Gln Ala Gln Val Val 35 40 <210> 4 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-natural albumin binding domain <400> 4 Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Ile Lys Glu Leu Lys Gln Tyr Gly 1 5 10 15 Ile Gly Asp Tyr Tyr Ile Lys Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ser 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Ala 35 40 45 <210> 16 <211> 45 <212> PRT <213> Peptostreptococcus magnus <400> 16 Leu Lys Asn Ala Lys Glu Asp Ala Ile Ala Glu Leu Lys Lys Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Ser Asp Phe Tyr Phe Asn Ala Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30 Glu Glu Val Asn Ala Leu Lys Asn Glu Ile Leu Lys Ala 35 40 45 <210> 17 <211> 45 <212> PRT <213> Finegoldia magna <400> 17 Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala Val Glu Glu Leu Lys Asn Asn Gly 1 5 10 15 Ile Thr Ser Glu Lys Tyr Ile Glu Gln Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30 Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu Ile Ile Lys Ala 35 40 45 <210> 18 <211> 45 <212> PRT <213> Lactobacillus iners <400> 18 Leu Ala Glu Ala Lys Asn Val Ala His Ala Glu Phe Thr Lys Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Gly Lys Ile Phe His Asp Ala Ile Asp Ala Ala Lys Thr Val 20 25 30 Glu Gly Leu Gln Ala Tyr Val Ala Glu Thr Leu Ala Ala 35 40 45 <210> 19 <211> 45 <212> PRT <213> Lactobacillus iners <400> 19 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Ala Ala His Glu Glu Phe Thr Lys Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Gly Lys Ile Phe His Asp Ala Ile Asp Ala Ala Lys Thr Val 20 25 30 Glu Gly Leu Gln Ala Tyr Val Ala Glu Thr Leu Lys Ala 35 40 45 <210> 20 <211> 45 <212> PRT <213> Finegoldia magna <400> 20 Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala Ile Glu Glu Leu Lys Asn Asn Gly 1 5 10 15 Ile Thr Ser Glu Lys Tyr Ile Glu Gln Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30 Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu Ile Ile Lys Ser 35 40 45 <210> 21 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-natural albumin binding domain <400> 21 Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala Ile Glu Glu Leu Lys Lys Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Ser Asp Tyr Tyr Phe Asp Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30 Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Lys Ala 35 40 45 <210> 22 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-natural albumin binding domain <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Xaa1 may be any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Xaa2 may be any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Xaa3 may be any amino acid 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ABDCon5 <400> 28 Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala Ile Glu Glu Leu Lys Lys Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Ser Asp Tyr Ser Phe Asp Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30 Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Lys Ala 35 40 45 <210> 29 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-natural albumin binding domain ABDCon6 <400> 29 Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala Ile Glu Glu Leu Lys Lys Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Ser Asp Tyr Val Phe Asp Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30 Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Lys Ala 35 40 45 <210> 30 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-natural albumin binding domain ABDCon7 <400> 30 Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala Ile Glu Glu Leu Lys Lys Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Ser Asp Tyr Tyr Phe Asp Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30 Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Gln Ile Leu Lys Ala 35 40 45 <210> 31 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-natural albumin binding domain ABDCon8 <400> 31 Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala Ile Glu Glu Leu Lys Lys Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Ser Asp Tyr Tyr Phe Asp Leu Ile Asn Lys Ala Asp Thr Val 20 25 30 Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Lys Ala 35 40 45 <210> 32 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-natural albumin binding domain ABDCon9 <400> 32 Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala Ile Glu Glu Leu Lys Lys Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Ser Asp Tyr Tyr Phe Asp Leu Ile Asn Lys Ala Lys Ala Val 20 25 30 Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Lys Ala 35 40 45 <210> 33 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-natural albumin binding domain ABDCon10 <400> 33 Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala Ile Glu Glu Leu Lys Lys Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Ser Asp Tyr Tyr Phe Asp Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30 Glu Gly Val Asn Val Leu Lys Asp Glu Ile Leu Lys Ala 35 40 45 <210> 34 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-natural albumin binding domain ABDCon11 <400> 34 Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala Ile Glu Glu Leu Lys Lys Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Ser Asp Tyr Tyr Phe Asp Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val 20 25 30 Glu Gly Val Asn Tyr Leu Lys Asp Glu Ile Leu Lys Ala 35 40 45 <210> 35 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized cDNA for expressing non-natural albumin bindind domain ABDCon <400> 35 ctgaaagaag cgaaagaaaa agcgattgaa gaactgaaaa aagcgggcat taccagcgat 60 tattattttg atctgattaa caaagcgaaa accgtggaag gcgtgaacgc gctgaaagat 120 gaaattctga aagcg 135 <210> 36 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu 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Asn Glu Ala Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Ala Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Asp 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Met Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Leu Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Tyr Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Met Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Ala 340 345 350 Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Val Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ala Lys Cys Cys Lys Leu Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Leu Asp Glu Ala 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Ala Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Met Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Lys Gln Val Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Gly Val Met Asp Asn Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Lys Phe Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Ala 580 <210> 38 <211> 584 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Lys Cys Ser Tyr Asp Glu His Ala Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Ala Ile Pro Asn Leu 65 70 75 80 Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp Cys Cys Thr Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu 100 105 110 Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala Glu Ala Met Cys Thr Ser Phe Lys 115 120 125 Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly His Tyr Leu His Glu Val Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Gln 145 150 155 160 Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys Cys Ala Glu Ala Asp Lys Glu Ser 165 170 175 Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly Val Lys Glu Lys Ala Leu Val Ser 180 185 190 Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys Ser Ser Met Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Thr Phe Pro 210 215 220 Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr Lys Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met Cys Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp Lys Pro Leu Leu Lys Lys Ala His 275 280 285 Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp Thr Met Pro Ala Asp Leu Pro Ala 290 295 300 Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Gln Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys 340 345 350 Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Glu Ala Asn Pro Pro Ala 355 360 365 Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Asp Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg 420 425 430 Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu Pro Glu Asp Gln Arg Leu Pro Cys 435 440 445 Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile Leu Asn Arg Val Cys Leu Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His Val Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser 465 470 475 480 Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Ala Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala Gln Phe Leu Asp Thr Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe Ser Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val 565 570 575 Thr Arg Cys Lys Asp Ala Leu Ala 580 <210> 39 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein Tencon25-ABDcon <400> 39 Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg 65 70 75 80 Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Ser Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Ala Ile Glu Glu Leu 100 105 110 Lys Lys Ala Gly Ile Thr Ser Asp Tyr Tyr Phe Asp Leu Ile Asn Lys 115 120 125 Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Asn Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Lys 130 135 140 Ala 145 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 40 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 41 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> 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Claims

서열 번호 21의 아미노산 서열과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 비-천연 알부민 결합 도메인.
1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 잔기에서 치환을 갖는 서열 번호 21의 아미노산을 포함하는, 단리된 비-천연 알부민 결합 도메인.
제2항에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 잔기에서의 치환이 서열 번호 21의 아미노산 위치 Y21, Y22, L25, K30, T31, E33, G34, A37, L38, E41, I42, 및 A45 중 하나 이상에서 발생하는, 단리된 알부민 결합 도메인.
제2항에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 잔기에서의 치환이 서열 번호 21의 아미노산 위치 Y21, Y22, K30, T31, A37, 및 E41 중 하나 이상에서 발생하는, 단리된 알부민 결합 도메인.
제1항에 있어서, 그의 N-말단에 5개 아미노산의 연장부(extension)를 추가로 포함하는, 단리된 알부민 결합 도메인.
제5항에 있어서, 5개 아미노산의 연장부가 서열 번호 42, 43, 및 45 내지 55로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 알부민 결합 도메인.
제5항에 있어서, 5개 아미노산의 연장부가 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 알부민 결합 도메인.
서열 번호 21 내지 34 또는 44로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 비-천연 알부민 결합.
제8항에 있어서, 그의 N-말단에 5개 아미노산의 연장부를 추가로 포함하는, 단리된 알부민 결합 도메인.
제9항에 있어서, 5개 아미노산의 연장부가 서열 번호 42, 43, 또는 45 내지 55의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 알부민 결합 도메인.
제9항에 있어서, 5개 아미노산의 연장부가 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 알부민 결합 도메인.
제1항에 있어서, PBST(PBS, 0.005% 트윈(Tween)20)를 실행 완충제(running buffer)로 사용하여 100 μL/min의 유속으로 GLC 센서 칩을 사용하는 프로테온(ProteOn)(상표) XPR-36 단백질 상호작용 어레이 시스템(Protein Interaction Array System)(바이오-라드(Bio-Rad))을 사용할 때 알부민 결합 도메인의 인간 알부민에 대한 결합의 해리 상수(K_D)가 약 50 pM 내지 1 μM인, 단리된 알부민 결합 도메인.
제1항에 있어서, PBST(PBS, 0.005% 트윈20)를 실행 완충제로 사용하여 100 μL/min의 유속으로 GLC 센서 칩을 사용하는 프로테온(상표) XPR-36 단백질 상호작용 어레이 시스템(바이오-라드)을 사용할 때 알부민 결합 도메인의 인간 알부민에 대한 결합의 해리 속도 상수(off rate constant)(Koff)가 3.6×10^-5 내지 1.1×10^-1인, 단리된 알부민 결합 도메인.
a) 단리된 알부민 결합 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
b) 숙주 내에서, 또는 시험관내에서 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계; 및
c) 단리된 알부민 결합 도메인을 회수하는 단계를 포함하는, 제1항의 단리된 알부민 결합 도메인의 제조 방법.
제1항의 알부민 결합 도메인을 암호화하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
서열 번호 21 내지 34 또는 44로 구성된 군으로부터 선택된 알부민 결합 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
서열 번호 35의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
제15항, 제16항, 또는 제17항 중 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단리된 벡터.
제18항의 단리된 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
제1항, 제5항, 또는 제8항 중 어느 한 항의 알부민 결합 도메인 및 생물활성제(bioactive agent)를 포함하는, 융합 단백질.
제20항에 있어서, 생물활성제가 표적 분자에 특이적으로 결합하는 단백질 스캐폴드인, 융합 단백질.
제21항에 있어서, 단백질 스캐폴드가 서열 번호 39의 아미노산 잔기 1 내지 90을 포함하는 텐콘25 또는 그의 변이체를 기반으로 하는, 융합 단백질.
제21항에 있어서, 링커를 사용하여 알부민 결합 단백질과 생물활성제가 작동적으로 연결되는, 융합 단백질.
제23항에 있어서, 링커가 Gly-Ser 링커를 포함하는, 융합 단백질.
제24항에 있어서, 링커가 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
제20항의 융합 단백질 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
본 명세서에 기재된 임의의 발명.