CN104470944B - 非天然共有白蛋白结合结构域 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了可用于控制治疗剂分子对于患者的半衰期的非天然白蛋白结合结构域、编码其的多核苷酸以及制备和使用这些结构域和多核苷酸的方法。
Description
技术领域
本发明涉及白蛋白结合结构域及其制备和使用方法。更具体地讲，本发明涉及非天然白蛋白结合结构域共有序列及其如本文所述的变体。
背景技术
经由肾清除的生物治疗剂分子快速消除导致有限的临床效果或更频繁地对患者给药。肾小球过滤所导致的肾清除与较小的生物治疗剂最为相关，因为对于分子量大于50,000道尔顿的分子而言肾过滤速率大大降低(Kontermann，Curr Opin Biotechnol 22：868-76，2011)。若干种已获批的生物治疗药物包含本身会降至过滤极限以下并因此被快速清除的活性部分。为了克服此限制，已引入多种技术来有效增加治疗剂分子的大小以减少肾过滤和所产生的半衰期。
治疗剂聚乙二醇化(PEG)是增加蛋白的流体动力学半径和减少肾小球过滤的有效方法。一条或若干条PEG链可偶联至蛋白，最常见的方式是通过与蛋白表面上的游离硫醇或胺基团共轭。腺苷脱氨酶、L-天冬酰胺酶、干扰素α-2b、G-CSF、人类生长激素、促红细胞生成素、尿酸酶和抗-TNFα抗体片段的聚乙二醇化型式已被批准用于人类治疗(Kontermann，Curr Opin Biotechnol，22：868-76，2011)。聚乙二醇化的缺陷包括生成异质产物并且难以控制连接到某些蛋白的PEG分子的数量。聚乙二醇化对治疗性蛋白的制备引入附加的共轭步骤以及纯化步骤，从而导致产率下降以及产品成本增加。聚乙二醇化还可导致动物和患者的肾小管空泡，因为PEG链在肾脏中是不可降解的(Gaberc-Porekar等人，Curr OpinDrug Discov Devel 11：242-250，2008)。
将治疗剂与抗体Fc区偶联以生成Fc-融合蛋白可用于增加治疗剂分子的血清半衰期。免疫球蛋白由于其较大的尺寸和透过FcRn的再循环可在人体内表现出大约数周的长半衰期(Kuo等人，J Clin Immunol 30：777-789，2010)。TNF受体2、LFA-3、CTLA-4、IL-1R和TPO-拟肽分子均为获批的制备为Fc-融合物的治疗剂(Kontermann，Curr OpinBiotechnol，22：868-76，2011)。由于若干原因，Fc-融合蛋白并非对所有治疗剂类别均是理想的。Fc区的同型二聚体性质导致产生二聚体治疗性蛋白，这可能由于受体聚簇而导致细胞活化。Fc-融合物还可在比原核系统更昂贵的哺乳动物表达系统中制成。
除了Fc之外，白蛋白由于FcRn再循环而表现出体内长半衰期。在约40g/L的浓度下，人血清白蛋白(HSA)是存在于血液中的最丰富的蛋白。FcRn再循环导致人体内约19天的长半衰期。另外，生物学分布研究表明白蛋白可在体内分布至对于靶标疾病(诸如发炎关节或肿瘤)而言重要的区域(Wunder等人，J Immunol 170：4793-4801，2003)。因此，多种蛋白的血清半衰期已通过将其制备为对HSA的C-端或N-端融合物而增加。成功的融合物包括干扰素α(Flisiak and Flisiak，Expert Opin Biol Ther 10：1509-1515，2010)、人类生长激素(Osborn等人，Eur J Pharmacol 456：149-158，2002)、肿瘤坏死因子(Muller等人，Biochem Biophys Res Commun396：793-799，2010)、凝结因子IX(Metzner等人，ThrombHaemost 102：634-644，2009)、凝结因子VIIa(Schulte，Thromb Res 122Suppl 4：S14-19，2008)、胰岛素(Duttaroy等人，Diabetes 54：251-258，2005)、尿激酶(Breton等人，Eur JBiochem 231：563-569，1995)、水蛭素(Sheffield等人，Blood Coagul Fibrinolysis 12：433-443，2001)和双特异性抗体片段(Muller等人，J Biol Chem 282：12650-12660，2007)。HSA融合蛋白可具有长血清半衰期，然而这些融合蛋白的较大规模的制备主要限于酵母表达系统。另外，HSA的大尺寸可由于空间位阻而导致治疗剂的活性损失。
治疗剂蛋白也可制备为与肽的融合蛋白或与血流中的血清白蛋白结合的蛋白，从而增加其半衰期。此类白蛋白结合肽包括半胱氨酸限制性肽或白蛋白的抗体片段。Fab抗体片段表达为与半胱氨酸限制性肽的融合物，其显著增加了Fab的血清半衰期(Dennis等人，JBiol Chem，277：35035-35043，2002；US2004/0253247A1)。与靶标同一抗原的Fab和mAb分子相比，半胱氨酸限制性肽与抗体片段偶联导致更佳的峰值肿瘤积聚和更均匀的肿瘤分布(Dennis等人，Cancer Res 67：254-261，2007；US2005/0287153A1)。另外，已将特异性结合白蛋白的多个抗体片段偶联至治疗部分以增加治疗剂的半衰期。结合HSA的骆驼科动物VHH抗体片段
与结合TNF-α的另一
(Coppieters等人，ArthritisRheum 54：1856-1866，2006)或抗-EGFR
(Tijink等人，Mol Cancer Ther 7：2288-2297，2008)融合。已生成结合白蛋白的抗-白蛋白结构域抗体(dAbs)，并且已与例如白介素-1受体(Holt等人，Protein Eng Des Sel 21：283-288，2008)和干扰素α2b(Walker等人，Protein Eng Des Sel，23：271-278，2010)融合以改善其半衰期。
已知来自细菌的多种天然存在的蛋白结构域可与白蛋白相互作用，据推测有助于此类细菌在整个宿主生物体中分布。存在大小为约6kDa的3-螺旋束蛋白结构域，其使用3-螺旋束的一个面与血清白蛋白相互作用(Cramer等人，FEBS Lett 581：3178-3182，2007；Lejon等人，Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 64：64-69，2008)；Johansson等人，FEBS Lett，374：257-261，1995；Johansson等人，J Mol Biol 266：859-865，1997；Johansson等人，J Biol Chem，277：8114-8120，2002)。来源于链球菌蛋白G的一种此类白蛋白结合结构域(Jonsson等人，Protein Eng Des Sel，21：515-527，2008)已被广泛用于延长蛋白的血清半衰期。与此结构域的融合已被证实用于增加以下各项的半衰期：1型可溶性补体受体(Makrides等人，J Pharmacol Exp Ther 277：534-542，1996)、双特异性抗体(Stork等人，Protein Eng Des Sel，20：569-576，2007)、CD4(Nygren等人，Vaccines91：363-368，1991；US 6267，964B1)，Pf155/RESA(Stahl等人，J Immunol Methods 124：43-52，1989)、G-CSF(Frejd，F.PEGS Europe，October 5，2010)和结合多个靶的抗体分子(Andersen等人，J Biol Chem，286：5234-5241，2011)(Frejd，F.PEGS Europe，2010年10月5日)。然而，针对结构域的抗体制备已在患者中有所报道，因此使用分子进行治疗剂应用可为具有挑战性的(Goetsch等人，Clin Diagn Lab Immunol 10：125-132，2003；Libon等人，Vaccine，17：406-414，1999)。
结合白蛋白的多种蛋白结构域或肽能够延长血清半衰期并且产生更有益的治疗剂蛋白生物学分布模式。为了将这些白蛋白结合结构域用于治疗应用中，需要满足多个生物物理要求，例如在宿主中的高表达水平、溶解度和稳定性以及最低免疫原性。白蛋白结合部分应以对血清半衰期和生物学分布与结合或不结合白蛋白时的治疗部分的活性进行有效平衡的亲和力结合血清白蛋白。
发明内容
本发明的一个方面为一种蛋白，其包含具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的分离的非天然白蛋白结合结构域。本发明的另一个方面为一种分离的非天然白蛋白结合结构域，其包含与SEQ ID NO：21至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
本发明的另一个方面为一种分离的非天然白蛋白结合结构域，其包含在1、2、3、4、5和/或6个残基处具有取代的SEQ ID NO：21的氨基酸序列，优选地，其中1、2、3、4、5和/或6个残基处的取代可发生在SEQ ID NO：21的氨基酸位置Y21、Y22，L25、K30，T31、E33、G34、A37、L38、E41、I42和/或A45处或在SEQ ID NO：21的氨基酸位置Y21、Y22、K30、T31、A37和/或E41处。
本发明的另一个方面为一种分离的非天然白蛋白结合结构域，其包含氨基酸序列：LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA(SEQ ID NO：22)；其中X1、X2、X3、X4、X5和X6可为任意氨基酸或某些氨基酸的子集。
在本发明的另一个方面，所述分离的非天然白蛋白结合结构域包含在其N-端的5个氨基酸的延长。
本发明的另一个方面为一种制备本发明的非天然白蛋白结合结构域的方法，所述方法包括：提供编码所述非天然白蛋白结合结构域的多核苷酸；在宿主中或体外表达所述多核苷酸；以及回收所述非天然白蛋白结合结构域。本发明的另一个方面为一种编码本发明的白蛋白结合结构域的分离的多核苷酸。本发明的另一个方面为一种包含SEQ ID NO：35的多核苷酸的分离的多核苷酸。
本发明的另一个方面为一种包含本发明的分离的多核苷酸的分离的载体以及一种包含本发明的分离的载体的宿主细胞。
本发明的另一个方面为一种融合蛋白，其包含本发明的白蛋白结合蛋白和生物活性剂。
本发明的另一个方面为一种药物组合物，其包含本发明的融合蛋白和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
附图说明
图1示出经纯化的ABDCon的SDS-PAGE分析。样品如下：泳道1)SeeBlue+2标记物、2)总细胞裂解液、3)可溶性细胞裂解液、4)柱流通液、5-12)洗脱级分。标记物带中一些的分子量在左边示出。
图2示出经纯化的ABDCon样品的电喷雾电离质谱。
图3示出如在PBS中运行的经纯化的ABDcon的尺寸排阻色谱法分析。
图4示出如通过在PBS中的DSC所测量的熔融温度A)和ABDCon解折叠的可逆性B)。第一次扫描的扣除数据的归一化基线在A中示出。在第一次扫描后，使样品冷却至20℃并且重复扫描以测定折叠可逆性。第一次扫描和第二次扫描的原始数据迹线在B部分中叠加。
图5示出当以2mg/kg静脉内给药时小鼠体内Tencon25-ABDCon融合蛋白的药代动力学。
图6示出当以2mg/kg静脉内给药时小鼠体内与ABDCon(SEQ ID NO：21)、ABDCon3(SEQ ID NO：26)、ABDcon5(SEQ ID NO：28)、ABDCon7(SEQ ID NO：30)和ABDCon9(SEQ IDNO：32)融合的Tencon25(SEQ ID NO：39的残基1-90)分子的药代动力学。
图7示出当在PBS中在37℃下孵育0或28天时的A)某些FN3结构域ABDCon(SEQ IDNO：1)融合蛋白和B)在ABDCon处具有延伸的N-端螺旋的FN3结构域-ABDCon12(SEQ ID NO：46)融合蛋白的稳定性。
具体实施方式
如本文所用，术语“白蛋白结合结构域”或“结构域”是指在体内或体外结合白蛋白的多肽。白蛋白可来源于任何动物物种，例如人、猴类或啮齿动物。
如本文所用，术语“KD”是指白蛋白与白蛋白结合结构域之间的解离常数。
如本文所用，术语“Kon”是指白蛋白结合结构域与白蛋白缔合形成白蛋白结合结构域/白蛋白复合物的结合速率常数。
如本文所用，术语“Koff”是指白蛋白结合结构域与白蛋白结合结构域/白蛋白复合物解离的解离速率常数。
如本文所用，术语“非天然”是指合成的(即，具有不存在于原生多肽中的氨基酸序列)的结构域。
如本文所用，术语“取代的”或“取代”是指在多肽或多核苷酸序列中改变、缺失或插入一个或多个氨基酸或核苷酸，或一个或多个氨基酸或核苷酸的改变、缺失或插入，以生成所述序列的变体。
如本文所用，术语“变体”是指不同于参考多肽或参考多核苷酸一处或多处修饰，例如取代、插入或缺失的多肽或多核苷酸。
如本文所用，术语“生物活性剂”是指当施用给动物患者时向所述患者提供有益效果的蛋白、抗体、肽、核苷酸、小分子药物，等等。通过合成制得的、天然源的或重组产生的部分也包括在该术语中。生物活性剂可为生物活性剂的类似物、衍生物、激动剂、拮抗剂、对映体或配药学上可接收的盐。
如本文所用，术语“稳定性”是指在生理条件下分子保持折叠状态使得其保持其正常功能活性中的至少一种例如半衰期的能力。
术语“载体”是指能够在生物系统内复制或可以在此类系统间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记的元件，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的例子可包括细胞、细菌、病毒、动物、植物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可以是DNA或RNA分子或这些分子的杂合分子。
术语“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽的翻译的载体。
如本文所用，术语“操作性连接的”是指使得元件以其预期方式起作用的元件布置。
氨基酸在本文中采用它们的标准三字母或单字母代码提及：
白蛋白结合结构域组合物
本发明提供一种合成白蛋白结合结构域(ABDCon)(SEQ ID NO：21)及其变体。ABDCon可操作性连接至生物活性剂以增强治疗剂的血清半衰期和生物学分布。ABDCon及其变体可在大肠杆菌(E.coli)中以高水平表达，为可溶性的并且具有高热稳定性。本发明提供编码ABDCon及其变体的多核苷酸或其互补核酸、载体、宿主细胞以及制备和使用它们的方法。
本发明还提供合成白蛋白结合结构域(ABDCon)，其在N-端具有5个氨基酸延长的延长。所述延长改善ABDCon的稳定性。
ABDCon结合结构域如下设计：使用来自链球菌属G148蛋白G(SEQID NO：1)的ABD作为模板对保藏在无冗余蛋白质数据库中的某些3-螺旋束白蛋白结合结构域(ABD)序列的共有氨基酸序列进行计算，并选择每个序列位置处的最常见氨基酸(表6)。当用本文指定的条件进行测试时，ABDCon对人白蛋白具有高亲和力，其中KD为75pM，Koff为3.02×10-5l/s，因此可操作性连接至ABDCon的生物活性剂一旦施用给动物患者就可主要地结合白蛋白。在人类患者中，过弱结合血清白蛋白的分子将由于肾过滤而具有短血清半衰期(Hopp，ProteinEng Des Sel，23：827-834，2010)，而过紧密地结合血清白蛋白的分子将无法从优选作用位点处的白蛋白中释放，因此在一些情况下可降低对所需靶的活性调节能力并且提供治疗有益效果。因此本发明的一个方面是具有并且能够生成对白蛋白具有亲和力谱的ABDCon变体和结合结构域并因此提供对可操作性地连接至ABDCon变体和结合结构域的生物活性剂的半衰期进行调节的能力。
本发明的一个实施例为一种分离的非天然白蛋白结合结构域，其包含与SEQ IDNO：21(ABDCon)：LKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
本发明的另一个实施例为一种分离的白蛋白结合结构域，其包含在1、2、3、4、5和/或6个残基处具有取代的SEQ ID NO：21的氨基酸序列。
ABDCon变体可如下设计：检验与白蛋白复合的示例性3-螺旋束白蛋白结合蛋白的晶体结构并且假设ABDCon可以类似于示例性蛋白的方式结合白蛋白。可采用的示例性晶体结构为与人白蛋白复合的厌氧细菌大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)(原先称为大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus))的蛋白PAB的GA模块(蛋白G-相关白蛋白-结合模块)的结构(蛋白质数据库(PDB)代码1TFO(Leion等人，JBiol Chem 279：42924-42928，2004)。
具有对白蛋白的降低的亲和力的ABDCon变体可通过各种策略进行设计，诸如通过破坏预计的疏水性接触；破坏芳族残基之间的预计的pi-堆叠；通过用较大的氨基酸取代来引入空间位阻；通过去除带电荷的残基来破坏盐桥；以及破坏预计在ABDCon与白蛋白之间进行的氢键合。对引入的改变进行设计以降低结合亲和力，而不以消除结合的方式改变结合表面。例如，残基Y21可取代带电荷的氨基酸(Lys、Arg、Asp、Glu)或较小的氨基酸(Ala、Gly)以减小此残基与白蛋白残基V325和F326之间的疏水性相互作用。此外，ABDCon的Y21与白蛋白残基N318和D324的主链形成氢键，使得微小的变化(诸如Phe的突变)可略微减弱相互作用。预计ABDCon的残基Y22与白蛋白残基F309和F326形成疏水的以及pi-堆叠的相互作用。因此，Y22取代较小的中性氨基酸Ala、Ser、Val或带电荷的氨基酸Lys、Arg、Asp或Glu可降低疏水性接触并且降低ABDCon变体对白蛋白的亲和力。预计ABDCon中的残基K30与白蛋白残基E227形成盐桥，因此K30可取代Asp或Glu以引入排斥电荷并且可能降低对白蛋白的ABDCon亲和力。任何不带电荷的氨基酸的突变还可通过消除盐桥降低亲和力。预计ABDCon残基T31与白蛋白残基N267形成分子间氢键并且对Ala或Gly的取代可用于破坏分子间氢键而不引入可显著使相互作用不稳定的大的空间位阻。ABDCon残基A37可取代Val、Tyr或其它较大的氨基酸以引入空间位阻。残基E41可取代Gln或Asn以去除电荷。带正电荷的残基诸如Lys或Arg的引入可预期进一步降低结合亲和力。预计ABDCon残基L25、E33、G34、L38、I42和A45形成与白蛋白的直接接触，并且这些残基处的取代很有可能调节对白蛋白的ABDCon亲和力。残基位置是指SEQ ID NO：21的ABDCon和SEQ ID NO：36的人白蛋白。
或者，可使用氨基酸的无规混合物，利用例如NNK密码子进行识别位置处的取代，并且使用标准方法和本文所述的方法来测量所得变体与白蛋白的结合。
示例性ABDCon变体为在选自SEQ ID NO：21的Y21、Y22、L25、K30、T31、E33、G34、A37、L38、E41、I42和A45的至少一种残基中具有取代的变体。
示例性ABDCon变体为在选自SEQ ID NO：21的Y21、Y22、K30、T31、A37和E41的至少一种残基中具有取代的变体。
示例性ABDCon变体包含氨基酸序列LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA(SEQ ID NO：22；其中X1、X2、X3、X4、X5和X6可为任意氨基酸。
在其它实施例中，示例性ABDCon变体包含氨基酸序列LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA(SEQ ID NO：23)，其中
i)X1为赖氨酸(K)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)；
ii)X2为丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或酪氨酸(Y)；
iii)X3为天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或赖氨酸(K)；
iv)X4为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)或苏氨酸(T)；
v)X5为缬氨酸(V)、酪氨酸(Y)或丙氨酸(A)；并且
vi)X6为谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)或谷氨酸(E)。
在其它实施例中，示例性ABDCon变体包含氨基酸序列LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA(SEQ ID NO：24)，其中
i)X1为赖氨酸(K)、丙氨酸(A)或酪氨酸(Y)；
ii)X2为丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)或酪氨酸(Y)；
iii)X3为天冬氨酸(D)或赖氨酸(K)；
iv)X4为丙氨酸(A)或苏氨酸(T)；
v)X5为缬氨酸(V)、酪氨酸(Y)或丙氨酸(A)；并且
vi)X6为谷氨酰胺(Q)或谷氨酸(E)。
另外的示例性ABDCon变体包含SEQ ID NO：25-34中示出的氨基酸序列。使用熟知的方法，例如在采用等离振子共振的体外测定(BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，Sweden)中测试ABDCon变体的白蛋白结合。如果在不同的条件(例如，同渗容摩、pH)下测量，特定ABDCon变体/白蛋白抗原相互作用的测量的亲和力可变化。因此，亲和力和其它结合参数(例如，KD、Kon、Koff)的测量优选地用ABDCon变体和白蛋白的标准溶液，以及标准缓冲液，诸如本文所述的缓冲液进行。ABDCon变体对白蛋白的亲和力可在至少约1×10-5M、至少约1×10-6M、至少约1×10-7M、至少约1×10-8M、至少约1×10-9M、至少约1×10-10M、至少约1×10- 11M、至少约1×10-12M或至少约1×10-13M的范围内。例如，在ABDCon(SEQ ID NO：21)的Y22处的各种取代将变体对白蛋白的亲和力降低约300-1,000倍，这取决于取代(表4)。在定义位置或位置组合处具有取代的另外的变体可由本领域的技术人员设计和生成并且使用常规方法测试所需的白蛋白结合亲和力。
可通过向ABDCon或ABDCon变体的N-端添加5个氨基酸延长来对ABDCon及其变体进行进一步修饰。所述5个氨基酸延长可由氨基酸序列TIDEWL(SEQ ID NO：43)或SEQ ID NO：42或45-55中示出的任意氨基酸序列组成。将N-端5个氨基酸延长并入ABDCon及其变体中可提高分子的稳定性。所述N-端5个氨基酸延长可在结构上排序作为ABDCon和变体的第一α螺旋的一部分。因此稳定螺旋的整体结构可改善N-端延伸分子的稳定性。N-端ABDCon变体可使用标准方法制备，其稳定性例如热稳定性如本文所述进行评估。任何白蛋白结合结构域(ABD)均可通过添加5个N-端氨基酸进行修饰以使ABD结构稳定并改善所得分子的稳定性，诸如热稳定性。
ABDCon及其变体可进一步在不影响与白蛋白结合的残基处进行修饰以例如改善稳定性、降低免疫原性、改善溶解度或任何其它合适的特性。在实现这一目的的一种方式中，可通过使用亲本和工程改造序列的三维模型分析亲本序列和各种概念上的工程改造产物的过程任选地制备ABDCon及其变体。三维模型是本领域技术人员可公共获得的和熟悉的。计算机程序可供图解和展示选定的候选序列的可能三维构象结构并可测量可能的免疫原性(例如，Immunofilter程序(Xencor，Inc.，Monrovia，CA))。对这些显示的检测允许分析对候选序列的功能起作用的残基的可能作用，例如，影响ABDCon结构域的稳定性的残基。按此方式，可由亲本和参考序列选择并组合残基以实现期望的特性，诸如获得改善的稳定性。另选地，或除了以上过程，可如本领域所已知使用其它合适的工程改造方法。
本发明的白蛋白结合结构域的所需物理特性包括高热稳定性以及热折叠和解折叠的可逆性。多种方法已应用于增加蛋白质和酶的表观热稳定性，包括基于与高度相似的热稳定序列比较的合理设计、稳定二硫桥的设计、增加α-螺旋倾向的突变、对盐桥进行工程改造、蛋白质表面电荷的改变、定向进化和共有序列的构成(Lehmann和Wyss，Curr OpinBiotechnol，12：371-375，2001)。高度的热稳定性可增加所表达蛋白的产量、改善溶解度或活性、降低免疫原性并且使生产中对冷链的需要最小化。
可通过进行取代并测定白蛋白结合结构域的所需特性来确定可被取代以改善本发明的白蛋白结合结构域的任何特性的残基。例如，可采用丙氨酸扫描来识别可影响白蛋白结合结构域稳定性的ABDCon及其变体中的位置。
根据稳定性的丧失，即，蛋白的“变性(denaturing/denaturation)”意指其中赋予蛋白的功能特性的三维构象的一些或全部已伴随活性和/或溶解性的丧失而丧失的过程。在变性过程中被破坏的力包括分子内键，例如，静电力、疏水力、范德华力、氢键和二硫键。蛋白变性可由施加于蛋白或包含蛋白的溶液的力以及由化学变性剂引起，所述力诸如机械力(例如压力或剪切力)，热、渗透应力、pH的变化、电场或磁场、电离辐射、紫外线辐射和脱水。
蛋白稳定性和蛋白易变性的测量可视为蛋白完整性的相同或不同方面。蛋白对由热、由紫外线或电离辐射、环境同渗容摩和pH(如果在液体溶液中)的变化、由小孔径过滤施加的机械剪切力、紫外线辐射、电离辐射(诸如由γ辐射)、化学或热脱水或任何其它可造成蛋白结构破坏的作用或力引起的变性敏感或“易变”。可使用标准方法测定分子的稳定性。例如，可通过使用标准方法测量热熔融(Tm)温度，即一半的分子变为解折叠的以摄氏度(℃)表示的温度来测定分子的稳定性。通常，Tm越高，分子越稳定。除了热之外，化学环境也改变蛋白的稳定性以保持特定的三维结构。
可通过多种方法同样地测量化学变性。化学变性剂包括盐酸胍、硫氰酸胍、脲、丙酮、有机溶剂(DMF、苯、乙腈)、盐(硫酸铵、溴化锂、氯化锂、溴化钠、氯化钙、氯化钠)；还原剂(例如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、二硝基硫苯和氢化物，诸如硼氢化钠)、非离子和离子型去污剂、酸(例如盐酸(HCl)、乙酸(CH3COOH)、卤代乙酸)、疏水分子(例如，磷脂)和靶向变性剂。变性程度的定量可依赖于功能特性的丧失，诸如结合靶分子的能力，或通过物理化学特性定量，诸如聚集的趋势、先前溶剂不可及残基的暴露或二硫键的破坏或形成。
ABDCon结合结构域及其变体可操作性地连接至生物活性剂。示例性生物活性剂为可使用熟知的连接子可操作性地连接至ABDCon及其变体的肽和蛋白，所述连接子为例如包含聚-甘氨酸、甘氨酸和丝氨酸(Gly-Ser连接子)或丙氨酸和脯氨酸的连接子。使用天然存在的以及人工肽连接子在文献中是熟知的(Hallewell等人，J Biol Chem，264：5260-5268，1989；Alfthan等人，Protein Eng 8：725-731，1995；Robinson&Sauer，Biochemistry，35：109-116，1996；美国专利5,856,456)。生物活性剂可从ABDCon或变体的C-端或N-端与其连接。多特异性生物活性剂还可连接至ABDCon。在这些情况中，ABDCon可连接至分子的N-端或C-端。ABDCon还可位于此类多特异性剂的内部，使得其连接至一种剂的C-端以及另一种剂的N-端。使用本领域熟知的化学交联，例如使用腙或缩氨基脲键，也可以使生物活性剂与本发明的白蛋白结合结构域偶联。示例性生物活性剂为特异性结合靶抗原的蛋白，诸如从III型纤连蛋白(FN3)重复蛋白文库(诸如WO2011/137319A2和WO2010/093627A2中所述的基于Tencon25的文库)中识别的蛋白。
另外的部分可结合到本发明的ABDCon或其变体，诸如用于期望特性的毒素缀合物；聚乙二醇(PEG)分子，诸如PEG5000或PEG20,000；不同链长的脂肪酸和脂肪酸酯，例如，月桂酸酯、肉豆蔻酸酯，硬脂酸酯、花生酸酯、二十二烷酸酯、油酸酯、花生四烯酸、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等、聚赖氨酸、辛烷、糖类(葡聚糖、纤维素、寡糖或多糖)。这些部分可与ABDCon编码序列直接融合并且可通过标准的克隆和表达技术生成。另选地，熟知的化学偶联方法可用于将这些部分连接至本发明的重组制备的ABDCon。
可使用熟知的药代动力学特性以体内模型评估ABDCon及其变体以及生物活性剂与ABDCon的融合蛋白的半衰期。示例性ABDCon及其变体以约介于1pM-1μM之间、介于75pM-860nM之间、介于100pM-500nM之间或介于1nM-100nM之间的KD结合白蛋白。
ABDCon及其变体的生成和制备
本发明的白蛋白结合结构域的生成通常使用标准方法在核酸水平上实现。使用标准PCR克隆方法，或根据美国专利No.6,521,427和美国专利No.6,670,127中描述的方法的化学基因合成，或使用Kunkel诱变(Kunkel等人，Methods Enzymol，154：367-382，1987)来合成在一个或多个特异性残基处具有取代的密码子的ABDCon变体。如果要对任意残基位置使用随机化密码子，则可使用熟知的方法例如匹配设计多样性的简并寡核苷酸，或例如使用NNK密码子(其编码所有20种天然存在的氨基酸)来实现随机化。在其它多样化方案中，DVK密码子可用于编码氨基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly和Cys。另选地，NNS密码子可用于产生所有20种氨基酸残基并同时降低终止密码子的频率。密码子命名根据熟知的IUB密码。
用某些位置处所选的核苷酸“简并性”合成寡核苷酸是本领域熟知的，例如TRIM方法(Knappek等人，J Mol Biol，296：57-86，1999；Garrard&Henner，Gene，128：103-109，1993)。可使用可商购获得的核苷酸或核苷试剂和设备来合成具有某些密码子组的核苷酸的此类组。
标准的克隆和表达技术用于将ABDCon或其变体克隆进载体或合成ABDCon的双链cDNA以在体外表达或翻译蛋白。可使用熟知的方法使生物活性剂可操作性地连接至ABDCon或其变体。
核酸分子和载体
本发明将编码本发明的ABDCon或其变体的核酸提供为分离的多核苷酸或表达载体的部分或线性DNA序列的部分，包括用于体外转录/翻译的线性DNA序列，与原核、真核或丝状噬菌体表达、组合物的分泌和/或展示相容的载体。某些示例性多核苷酸在本文中公开，然而，考虑到遗传密码的简并性和给定表达系统中的密码子偏好，编码本发明的ABDCon或其变体的其它多核苷酸也在本发明的范围内。
本发明的多核苷酸可以通过化学合成(诸如在自动化多核苷酸合成仪上的固相多核苷酸合成)来生产，并装配成完整的单链或双链分子。另选地，本发明的多核苷酸可以通过其它技术来生产，诸如PCR之后进行常规克隆。制备或获得具有给定的已知序列的多核苷酸的技术是本领域熟知的。
本发明的多核苷酸可包含至少一个非编码序列，诸如启动子或增强子序列、内含子、聚腺苷酸化信号等。多核苷酸序列还可包含编码另外的氨基酸的另外序列，其编码例如标记物或标签序列，诸如六-组氨酸或HA标签以促进蛋白质的纯化或检测；信号序列；融合蛋白配偶体诸如编码生物活性剂的cDNA，等等。
示例性多核苷酸包含编码ABDCon的序列、针对核糖体结合位点的序列、启动子序列、终止子序列、抗生素抗性基因和细菌复制起点(ori)。编码本发明的白蛋白结合结构域的示例性多核苷酸在SEQ ID NO：35中示出。
本发明的另一实施例是包含至少一种本发明的多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、杆状病毒表达载体、基于转座子的载体或任何其它适用于通过任何手段将本发明的多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。此类载体可以是包含可控制、调节、引起或允许由这种载体编码的多肽的表达的核酸序列元件的表达载体。此类元件可包含转录增强子结合位点、RNA聚合酶起始位点、核糖体结合位点以及有利于被编码多肽在给定表达系统中的表达的其它位点。此类表达系统可以是本领域熟知的基于细胞的系统或无细胞系统。
宿主细胞选择或宿主细胞工程改造
本发明的ABDCon及其变体可任选地通过细胞系、混合的细胞系、无限增殖化细胞或无限增殖化细胞的克隆群体来生产，这是本领域熟知的。参见例如，Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.，NY，NY(1987-2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndEdition，Cold SpringHarbor，NY(1989)；Harlow和Lane，antibodies，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，NY(1989)；Colligan等人编辑，Current Protocols in Immunology，John Wiley &Sons，Inc.，NY(1994-2001)；Colligan等人，Current Protocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY，NY，(1997-2001)。
选择用于表达的宿主细胞可以是哺乳动物起源的或可选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1，Hep G2、653、SP2/0、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞，或它们的任何衍生物、无限增殖化细胞或转化的细胞。另选地，宿主细胞可选自不能够使多肽糖基化的物种或生物体，例如原核细胞或生物体，诸如BL21、BL21(DE3)、BL21-GOLD(DE3)、XLl-Blue、JMl09、HMSl74、HMSl74(DE3)以及任何天然或工程改造的大肠杆菌属(E.colispp)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)或假单胞菌属(Pseudomonas spp)菌株。
本发明的白蛋白结合结构域的用途
本发明的非天然白蛋白结合结构域ABDCon及其变体的组合物可用于通过可操作性地连接ABDCon和生物活性剂来调节所述生物活性剂在动物组织内的半衰期和/或生物学分布，并且其中给动物施用所述组合物所导致的生物活性剂半衰期和/或生物学分布与单独施用活性剂时所获得的组织分布不同。
包含ABDCon或其变体的药物组合物
可操作性地连接至生物活性剂的结合白蛋白的ABDCon或其变体可使用本领域熟知的用于捕获、固定、分配或沉淀的分离工序分离，并将其纯化至商业适用所必需的程度。
对于治疗剂的用途，可将生物活性分子-ABDCon融合蛋白制备为药物组合物，所述药物组合物包含有效量的生物活性剂-ABDCon融合蛋白作为药学上可接受的载体中的活性成分。术语“载体”是指活性化合物与其一起施用的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水溶液和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过常规的已知的灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。所述组合物可根据需要包含配药学上可接受的辅助性物质，以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。在此类药物制剂中生物活性剂-ABDCon融合蛋白的浓度可广泛改变，按重量计，即从小于约0.5％，通常为或至少约1％至多达15或20％，且将根据所选择的具体施用方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。合适的媒介物和制剂描述于例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Troy，D.B.编辑，Lipincott Williams and Wilkins，Philadelphia，PA2006，第5部分，Pharmaceutical Manufacturing第691-1092页，特别参见第958-989页。
生物活性剂-ABDCon融合蛋白的治疗用途的施用方式可以是将药剂递送至宿主的任何合适的途径，诸如非肠道施用，例如，真皮内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下、肺部；经粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)；使用片剂、胶囊、溶液、悬浮剂、粉末、凝胶、颗粒形式的制剂；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、盒、微型泵中；或技术人员所理解的本领域熟知的其它方式。可通过例如以下方式实现位点特异性施用：胃肠外、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮递送。
虽然以一般的术语描述了本发明，但是本发明的实施例还将在以下的实例中公开，所述实例不应理解为对本权利要求所保护的范围的限制。
实例1.非天然白蛋白结合结构域的生成
非天然白蛋白结合结构域共有序列(ABDCon)的设计
通过对保藏在无冗余蛋白质数据库中的3-螺旋束ABD序列的共有氨基酸序列进行计算来设计非天然白蛋白结合结构域(ABD)。为了测定共有序列，将来自链球菌属(Streptococcus sp)G148蛋白G(SEQID NO：1)的ABD用作针对无冗余NCBI蛋白质数据库进行BLAST检索的模板序列(http：_//blast_ncbi_nlm_nih_gov/Blast_cgi)。所有默认设置均用于BLAST检索；预期阈值＝10；字长＝3；矩阵＝BLOSUM62；空位权重＝存在11，延长1；组合调整＝有条件的组合评分矩阵调整。从此检索中，选择20个密切相关的蛋白结构域，在表1中列出(SEQ ID NO：1-20)以包含在多序列对比中，以便测定共有序列。仅选择无冗余序列。若干个蛋白登录号在表1中多次列出，表明一些蛋白包含若干个密切相关的ABD结构域。SEQ ID NO：4为源于噬菌体展示和基因改组的非天然ABD。(He等人，Protein Sci，16：1490-1494，2007)。
表1.
使用AlignX软件(使用所有默认设置)由所列出的序列生成多序列对比。表6中示出的序列对比用于选择每个序列位置处的最常见氨基酸以衍生白蛋白结合结构域共有序列ABDCon(SEQID NO：21，表6)。对于位置21，选择Tyr来代替Ile，因为此位置不存在明显的共有序列，并且芳族残基Tyr和Phe充分展示。ABDCon之间的配对序列同一性在45％(SEQIDNO：3)至82％(SEQID NO：8、13、14和16)的范围内。
基因合成
使用大肠杆菌表达的优选密码子将白蛋白结合结构域共有序列(ABDCon)的氨基酸序列回译成如下编码ABDCon的核酸序列(SEQID NO：35)，和所产生的合成基因(BlueHeron Biotechnologies)。将5’和3’DNA序列加入SEQID NO：34的合成基因序列以添加供亚克隆的NdeI和XhoI位点以及编码用于蛋白纯化的N-端8-His标签的DNA序列。将此基因克隆到pET26载体(Novagen)以进行由T7启动子序列驱动并且转化成大肠杆菌(E.coli)菌株BL21(DE3)(Novagen)的表达。
表达和纯化
对于ABDcon的表达，将50mL的补充有30μg/mL的卡那霉素的LB培养基用1个菌落接种并在37℃和220rpm振荡下生长过夜。第二天，将10mL的过夜培养物添加至100mL的补充有30μg/mL的卡那霉素的Terrific肉汤中，并且使培养物在37℃和220rpm下生长2.5小时。将IPTG添加至1mM的终浓度并且将温度降至30℃以诱导蛋白表达。14小时后，通过以4000Xg离心20分钟来收获细胞并将细胞团块在-20℃下储存。将冷冻细胞团块按照每克湿团块重悬于5mL的BugBuster HT(Novagen)中并在室温下轻轻地混合30分钟。通过Ni-NTA色谱法(GEHealthcare)，在50mM的磷酸钠pH 7.4、500mM的氯化钠和10-250mM的咪唑梯度的缓冲液中进行洗脱来纯化聚组氨酸标记的ABDCon分子。将含有ABDCon的级分合并，并且通过使用流动相为PBS的Superdex75 16/60柱(GE Healthcare)的尺寸排阻色谱法来进一步纯化。通过SDS-PAGE分析来评估纯度(图1)。质谱测定的质量为6383Da，符合6382Da的理论质量(图2)。使用Superdex 75 5/150柱(GE Healthcare)的分析型尺寸排阻色谱法表明ABDCon制剂在符合单体蛋白的时间点不含聚集体和洗脱物(图3)。
实例2.ABDCon的表征
ABDCon的热稳定性
将ABDCon在PBS pH 7.4中浓缩至2.175mg/mL并通过差示扫描量热法(DSC)来评估热稳定性。通过将400μL的ABDCon溶液从25℃加热至100℃，在VP-DSC器械(MicroCal)中1℃/分钟的扫描速率来生成稳定性数据。在所述样品上完成第二次相同的扫描以评估热折叠/解折叠的可逆性。根据2-态解折叠模型拟合数据以计算熔融温度。图4示出ABDCon在PBS中具有81.5℃的高热稳定性，并且所述折叠是完全可逆的。
结合白蛋白的ABDCon
在ProteOnTM XPR-36Protein Interaction Array System(蛋白相互作用阵列系统)(Bio-Rad)上使用GLC传感器芯片来测量与人血清白蛋白和小鼠血清白蛋白结合的ABDCon的动力学。人(SEQ ID NO：36)、恒河猴(SEQ ID NO：37)和鼠(SEQ ID NO：38)血清白蛋白购自西格玛公司(Sigma)(人：目录号A4327；鼠：目录号A3559；恒河猴：目录号A4297)并且重悬于不同浓度的PBS中。将每种血清白蛋白通过在2.1μg/mL和pH 5.0下的标准胺偶联直接固定在GLC芯片垂直方向中的配体通道上，以获得配体密度为500-1000共振单位的表面。通过在固定的血清白蛋白表面上的水平取向上使五种不同的浓缩物(如以3倍浓度系列稀释的1μM)同时流动作为分析物来测试重组ABDCon的结合。将所有浓缩物的解离相监测两小时，流速为100μL/min，使用PBST(PBS，0.005％Tween20)作为运行缓冲液。注入第六种样品(单独缓冲液)来监测基线稳定性。利用1个0.8％磷酸的短脉冲(18μL)来使表面再生。
表2：
| 白蛋白 | k<sub>on</sub>(1/Ms) | k<sub>off</sub>(1/s) | K<sub>D</sub>(M) |
| 人 | 4.04E+05 | 3.02E-05 | 7.48E-11 |
| 小鼠 | 2.41E+05 | 7.76E-04 | 3.22E-09 |
| 恒河猴 | 1.13E+06 | 6.78E-05 | 6.01E-11 |
首先通过扣除单独缓冲液响应和分析物与芯片之间的非特异性结合来处理原始响应数据。针对每个配体表面，根据1：1简单朗缪尔结合模型(langmuir binding model)对所有五种浓缩物的经处理的数据进行全局拟合。表2描述针对每个白蛋白种类所测定的结合动力学。
小鼠体内ABDCon融合物的血清半衰期
通过产生编码ABDCon与Tencon25c-端的融合物的合成基因来评价ABDCon延长融合蛋白血清半衰期的能力。Tencon25为基于III型纤连蛋白(FN3)重复蛋白的共有序列的蛋白质支架，所述III型纤连蛋白(FN3)重复蛋白具有SEQ ID NO：39的残基1-90中示出的序列，并且在US201I/0274623A1中有所描述。Tencon25和ABDCon蛋白结构域通过(G4S)2肽连接子(SEQ ID NO：40)来融合。所得融合蛋白具有SEQ ID NO：39中示出的多肽序列。出于纯化目的，将聚组氨酸标签结合到C-端。将69只BALB/c雌性小鼠分成3组(N＝3，组1：未经处理的对照；N＝33，组2-3)。用单次静脉注射剂量的2mg/kg的Tencon25-ABDCon融合蛋白对小鼠进行处理。给药剂量基于给药当天的动物体重。在注射后的以下时间点使小鼠安乐死：10min、30min、1、4、6，小时和1、2、3、7、10、14天。通过心脏穿刺从每只动物获取血样。使血样在室温下凝块30分钟，但不长于1小时。然后将血样以约3,500rpm离心15分钟。使用均相夹心ELISA在Mesoscale Discovery平台上分析血清样品。将链霉抗生物素蛋白-金板(MesoscaleDiscovery)用Superblock(TBS)Tween-20(Thermo)阻滞1小时。将0.625μg/ml的多克隆抗-Tencon25抗体用于捕获(生物素酰化)和检测(用MSD Sulfo-Tag(Mesoscale Discovery)标记)。将抗原和抗体添加至板中，将其孵育2小时，同时在室温下激烈振荡。将板用TBS-T(Sigma)洗涤并添加具有表面活性剂的MSD Read缓冲液(Mesoscale Discovery)。使用MSDSector成像仪6000读取所述板。使用GraphPad Prism分析数据。先前的研究已经证实类似的未融合的Tencon分子从血流中快速清除，在小鼠体内的血清半衰期为约20分钟。Fusionof Tencon25与ABDCon的融合延长血清半衰期超过60个小时(图5)。
实例3：对ABDCon进行工程改造以改变对血清白蛋白的亲和力
与血清白蛋白的结合亲和力不仅可决定治疗性蛋白的血清半衰期而且可决定分子结合和中和其靶的能力。例如，过弱结合血清白蛋白的分子将由于肾过滤但不结合白蛋白而具有短血清半衰期(Hopp等人，Protein Eng Des Sel 23：827-834，2010)。相反，过紧密地结合白蛋白的分子将无法从优选作用位点处的白蛋白中释放，因此在一些情况下可能无法中和所需靶。因此，优选的是以其中白蛋白相互作用仅紧密到赋予所需血清半衰期的方式而通过白蛋白结合来实现半衰期延长。由于本文所述的ABDCon序列以75pM的亲和力和3.02×10-51/s的解离速率(在本文所述的实验条件下)与人血清白蛋白结合，与ABDCon融合的分子一旦施用给动物或患者则可主要地结合白蛋白。对于一些靶和融合物，可能有利的是不太紧密地结合血清白蛋白。设计十种ABDCon突变体型式以降低ABDCon对白蛋白的结合亲和力。表3汇总了这些突变体：
表3：
*根据SEQ ID NO：21的氨基酸编号
ABDCon突变体通过如下方式选择：检验与人血清白蛋白(PDB代码1TFO)结合的GA模块(蛋白G-相关白蛋白结合模块)的晶体结构(Lejon等人，Acta Crystallogr Sect FStruct Biol Cryst Commun 64：64-69，2008)，并假设ABDCon以非常类似于GA的方式结合白蛋白。对突变体进行设计以通过破坏疏水性接触、引入空间位阻、破坏盐桥和破坏氢键来降低ABDCon对白蛋白的亲和力(表3)。引入的变化经设计以降低结合亲和力，而不会显著地改变结合表面使得结合被消除。如针对ABDCon所述，对每种突变体进行表达并从大肠杆菌纯化(E.coli)。发现突变体ABDCon11是不溶解的并因此从进一步的分析中排除。每种变体对人、鼠和恒河猴血清白蛋白的亲和力通过表面等离子体共振来测定并在表4中示出。除了表3中所列出的位置外，残基L25、E33、G34、L38、I42和A45可发生突变以提高或降低ABDCon对白蛋白的亲和力，因为预计它们与白蛋白形成直接接触。
表4：
实例4：ABDCon变体融合蛋白的血清半衰期
Tencon25(SEQ ID NO：39的氨基酸1-90)与ABDCon变体3、5、7和9(表3)融合以评估对白蛋白的ABDCon亲和力与半衰期延长之间的相关性。将这些分子按照如上所述(先前研究中)以2mg/kg给药给小鼠并且使用针对Tencon25-ABDCon融合物所述的相同方法进行分析。针对这些分子获得的PK参数的汇总在表5和图6中示出。此处证实清除率随着对白蛋白的亲和力的提高而降低直至达到103nM的亲和力，在该点处在PK参数中未获得大的差异。表5中的数据表明通过改变ABDCon分子对白蛋白的亲和力来调节诸如半衰期、清除率和总暴露(AUC)的特性的能力。
表5：
表6：
| SEQ ID | 序列 |
| 13 | LKEAKEKAVEELKENGITSEKYIDQINKAKTVEGVNALKDEIIKA |
| 14 | LKEAKEKAVEELKNNGITSEKYIDQINKAKTVEGVNALKDEIIKA |
| 17 | LKEAKEKAVEELKNNGITSEKYIEQINKAKTVEGVNALKDEIIKA |
| 20 | LKEAKEKAIEELKNNGITSEKYIEQINKAKTVEGVNALKDEIIKS |
| 7 | LKDAKEKAIEAIRKEGVKSKLYEDLINKAKTIDGVNALRDQIIEA |
| 1 | LAEAKVLANRELDKYGVS-DYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAA |
| 2 | LSEAKEMAIRELDAQGVS-DFYKNKINNAKTVEGVVALKDLILNS |
| 3 | LDQAKQAALKEFDRYGVS-NYYKNLINKAKTVEGIMELQAQVV-- |
| 12 | LAEAKKVAHEEFTKAGITGKIFHDAIDAAKTVEGLKAYVAETLAA |
| 15 | LAEAKKVAHEEFTKAGITGKIFHDAIDAAKTVEGLQAYVAETLAA |
| 18 | LAEAKNVAHAEFTKAGITGKIFHDAIDAAKTVEGLQAYVAETLAA |
| 19 | LAEAKKAAHEEFTKAGITGKIFHDAIDAAKTVEGLQAYVAETLKA |
| 4 | LAQAKEAAIKELKQYGIG-DYYIKLINNAKTVEGVESLKNEILKA |
| 5 | LLKAKEAAINELKQYGIS-DYYVTLINKAKTVEGVNALKAEILSA |
| 16 | LKNAKEDAIAELKKAGITSDFYFNAINKAKTVEEVNALKNEILKA |
| 10 | LKNAKEDAIKELKEAGISSDIYFDAINKAKTVEGVEALKNEILKA |
| 11 | LKNAKED AIKELKEAGITSDIYFDAINKAKTIEGVEALKNEILKA |
| 6 | LKNAKEDAIKELKEAGIKSQFFFNLINNAKTVEGVESLKNEILKA |
| 9 | LKNAKEAAIKELKEAGITAEYLFNLINKAKTVEGVESLKNEILKA |
| 8 | LKNAKEEAIKELKEAGITSDLYFSLINKAKTVEGVEALKNEILKA |
| 21 | LKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA |
实例5：白蛋白结合结构域的稳定
完成研究以测定ABDCon(SEQID NO：21)在制备为与各种III型纤连蛋白(FN3)结构域(参见例如，美国专利公开US2010/0216708)的融合蛋白时的稳定性。使用标准克隆技术生成FN3结构域-ABDCon融合蛋白。融合蛋白Tencon-ABDCon中的一者的氨基酸序列在SEQID NO：41中示出。制备的其它FN3结构域-ABDCon融合蛋白为Tencon25-ABDCon、83-ABDCon和71-ABDCon。这些蛋白用c-端聚组氨酸标签产生并且通过使用标准方法的镍亲和色谱法和尺寸排阻色谱法的组合进行纯化。在通过SDS-PAGE和质谱进行分析之前，将每个纯化分子在PBS(pH 7.4)中于37℃下温育28天。图7A表明发现每个FN3结构域-ABDCon融合蛋白在此温育期间降解，如通过SDS-PAGE凝胶上的低分子量带的外观所证实的那样。质谱分析证实主降解模式为在ABDCon序列(SEQ ID NO：21)的L1、K2和E3残基处对这些分子的切取。此外，据观察与FN3结构域融合的原生链球菌蛋白G ABD(SEQ ID NO：1)当在4℃下温育6-8个月时展示出类似的在残基L1处切取的降解模式(数据未示出)。最后，一旦在4℃下储存数月，则观察到若干纯化批次的原生ABD(SEQ ID NO：1)和ABDCon(SEQID NO：21)失活并且在溶液中不能被SDS-PAGE检测到，这表明严重的降解。
以上观察表明，如针对血清半衰期延长所使用的ABDCon和原生ABD结构的N-端α螺旋是不稳定的。此类融合蛋白的稳定性缺乏是不利的，因为其可能限制此类分子用于研究和治疗应用的储存寿命。因此，开发策略以改善这些分子的稳定性。对保藏在蛋白质数据库中的白蛋白结合结构域的三维结构的分析表明，存在于原生ABD(SEQ ID NO：1)起点的N-端的氨基酸序列TIDQWL(SEQ ID NO：42)在结构上排序作为此分子在若干晶体结构中的第一α螺旋的一部分(例如PDB 2VDB、Acta Cryst，2008F64，64-69)。这与ABD的原始MR结构形成对比，表明此区在溶液中是无序的(PDB 1GAB，Johansson等人，J.Mol.Biol.266：859-865，1997)。因此，据推测，延长ABD和ABDCon序列的此第一α螺旋可对此区赋予更高的稳定性，因为延长α螺旋可向此类螺旋赋予更高的稳定性(Su等人，Biochemistry，33：15501-15510，1994)。
表1中所示天然白蛋白结合结构域的多序列对比显示这些N-端残基无明显的共有序列。然而，一条肽序列TIDEWL(SEQ ID NO：43)存在于这些蛋白结构域中的5个的N-端。因此，通过向ABDCon的N-端添加TIDEWL序列生成新的ABDCon构建体ABDCon12(SEQ ID NO：44)。将此蛋白用N-端聚组氨酸标签表达并且使用针对镍亲和色谱法和尺寸排阻色谱法的标准方法纯化至均质。将经纯化的ABDCon12在37℃下于PBS中孵育28天并通过SDS-PAGE和质谱评估稳定性。SDS-PAGE显示在指示降解14天后的稍快迁移模式。然而总质量分析证实此降解仅发生在聚组氨酸标签中而不在ABDCon12序列中，这指示出TIDEWL序列改善了ABDCon的稳定性。稳定性的进一步证据在生成的FN3结构域-ABDCon12融合蛋白(图7B)的稳定性中得以证实，所述融合蛋白当在37℃下于PBS中温育28天时与原始FN3结构域-ABDCon分子(图7A)相比显示出显著较少的降解产物。
使用以上实例2概述的工序通过差示扫描量热法来测定ABDCon12的熔融温度以研究此分子的稳定机制。在PBS中获得90.9℃的熔融温度，与原始ABDcon分子相比增加9.4°，这表明针对ABDCon12和ABDCon12融合蛋白所观察到的蛋白质水解/降解的降低是N-端α螺旋的延长赋予的增强的构象稳定性所致。
SEQ ID NO41：Tencon-ABDCon
MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTTGGGGSGGGGSLKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKAGGHHHHHH
SEQ ID NO：42：链球菌蛋白G ABD的N-端序列
TIDQWL
SEQ ID NO：43：添加至ABDCon的N-端序列
TIDEWL
SEQ ID NO：44：ABDCon12
TIDEWLLKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA
实例6：ABDCon12的表征
使用实例2中所述相同的方法通过表面等离振子共振来测定经纯化的ABDCon12结合人和鼠白蛋白的亲和力。获得的与人和鼠白蛋白结合的ABDCon12的解离常数分别为0.7nM和8.2nM。通过将ABDCon12与特异性结合抗原的FN3结构域的C-端融合来证实ABDCon12延长融合分子的血清半衰期的能力。将此分子通过IP注射以2mg/kg施用给小鼠并如以上实例4中所述进行分析。测得FN3结构域-ABDCon12融合蛋白的终末半衰期为55小时。
实例7：使白蛋白结合结构域稳定
基于对天然存在的白蛋白结合结构域的序列分析，预期添加至白蛋白结合结构域N-端的其它序列可使其更加稳定。例如，在这些天然白蛋白结合结构域的N-端发现多个不同的序列，诸如但不限于APAVDV(SEQ ID NO：45)、IAKEKA(SEQ ID NO：46)、TIDQWL(SEQ IDNO：42)、VPAADV(SEQ ID NO：47)、TVKSIE(SEQ ID NO：48)、TPAVDA(SEQ IDNO：49)、TLKSIK(SEQ ID NO：50)、WEKAAA(SEQ ID NO：51)、AVDANS(SEQ ID NO：52)、QLAAEA(SEQ ID NO：53)、ALKAAA(SEQ ID NO：54)、EKLAAA(SEQ ID NO：55)。如果这些序列产生更长的α螺旋则将这些序列添加至白蛋白结合结构域可增加稳定性。此外，预计增加α螺旋长度或稳定性的非天然肽也使白蛋白结合结构域稳定。
可使用标准技术生成具有另外的N-端序列的变体并且它们的特性可按如上所述进行测试。
显而易见的是，本发明可以与前面的说明和实例中具体描述的方式不同的方式来实施。根据上面的教导，可以作出本发明的多种修改和变型，并且这些修改和变型落入所附权利要求的范围内。
Claims (22)
1.一种具有白蛋白结合亲和力的分离的非天然白蛋白结合结构域，其为
(a) SEQ ID NO: 21的并且具有以下的一个取代的氨基酸序列：Y21A、Y21K、Y22A、Y22S、Y22V、K30D、T31A、A37V或E41Q，或者
(b) SEQ ID NO: 21的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的分离的白蛋白结合结构域，还包含在其N-端的6个氨基酸的延长，其中所述6个氨基酸的延长包含选自SEQ ID NO: 42、43和45-55的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的分离的白蛋白结合结构域，其中所述6个氨基酸的延长包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列。
4.一种分离的非天然白蛋白结合结构域，其为选自SEQ ID NO: 21、25-33或44的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的分离的白蛋白结合结构域，还包含在其N-端的6个氨基酸的延长。
6.根据权利要求5所述的分离的白蛋白结合结构域，其中所述6个氨基酸的延长包含SEQ ID NO: 42、43或45-55的氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的分离的白蛋白结合结构域，其中所述6个氨基酸的延长包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的分离的白蛋白结合结构域，其中所述白蛋白结合结构域具有结合人白蛋白的介于50pM至1µM之间的解离常数(KD)，所述解离常数是采用ProteOn™XPR-36蛋白相互作用阵列系统使用GLC传感器芯片测量的，流速为100µL/min，使用PBS，0.005%的Tween20作为运行缓冲液。
9.根据权利要求1所述的分离的白蛋白结合结构域，其中所述白蛋白结合结构域具有结合人白蛋白的在3.6×10-5至1.1×10-1的解离速率常数(Koff)，所述解离速率常数是采用ProteOn™ XPR-36蛋白相互作用阵列系统使用GLC传感器芯片测量的，流速为100µL/min，使用PBS，0.005%的Tween20作为运行缓冲液。
10.一种制备权利要求1所述的分离的白蛋白结合结构域的方法，所述方法包括
a) 提供编码所述分离的白蛋白结合结构域的多核苷酸；
b) 在宿主中或体外表达所述多核苷酸；以及
c) 回收所述分离的白蛋白结合结构域。
11.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1所述的白蛋白结合结构域。
12.一种分离的多核苷酸，其为编码选自SEQ ID NO: 21、25-33或44的白蛋白结合结构域的多核苷酸。
13.一种分离的多核苷酸，其为SEQ ID NO: 35的多核苷酸。
14.一种分离的载体，其包含权利要求11、12或13所述的分离的多核苷酸。
15.一种宿主细胞，其包含权利要求14所述的分离的载体。
16.一种融合蛋白，其包含权利要求1、2或4中任一项所述的白蛋白结合结构域和生物活性剂。
17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述生物活性剂为特异性结合靶分子的蛋白质支架。
18.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中所述蛋白质支架基于包含SEQ ID NO: 39的氨基酸残基1-90或其变体的Tencon25。
19.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中所述白蛋白结合蛋白和所述生物活性剂使用连接子操作性连接。
20.根据权利要求19所述的融合蛋白，其中所述连接子包含Gly-Ser连接子。
21.根据权利要求20所述的融合蛋白，其中所述连接子包含SEQ ID NO: 40的氨基酸序列。
22.一种药物组合物，其包含权利要求16所述的融合蛋白和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
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