EA036487B1 - Искусственный альбумин-связывающий домен и содержащий его слитый белок для доставки биоактивного агента - Google Patents
Искусственный альбумин-связывающий домен и содержащий его слитый белок для доставки биоактивного агента Download PDFInfo
- Publication number
- EA036487B1 EA036487B1 EA201590136A EA201590136A EA036487B1 EA 036487 B1 EA036487 B1 EA 036487B1 EA 201590136 A EA201590136 A EA 201590136A EA 201590136 A EA201590136 A EA 201590136A EA 036487 B1 EA036487 B1 EA 036487B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- abdcon
- albumin
- seq
- protein
- amino acid
- Prior art date
Links
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 title claims abstract description 111
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 title claims abstract description 111
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 77
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 29
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 61
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 56
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 38
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 claims 1
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 claims 1
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 52
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 23
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 20
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 20
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 14
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 14
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 12
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 10
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 10
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 9
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 9
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 5
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 4
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 3
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 3
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 3
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 3
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 101000930477 Mus musculus Albumin Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 3
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 3
- 230000013878 renal filtration Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000192016 Finegoldia magna Species 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 108700011201 Streptococcus IgG Fc-binding Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- DGXRZJSPDXZJFG-UHFFFAOYSA-N docosanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O DGXRZJSPDXZJFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M lithium bromide Chemical compound [Li+].[Br-] AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- BNJOQKFENDDGSC-UHFFFAOYSA-N octadecanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O BNJOQKFENDDGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-N suberic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCC(O)=O TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- HQHCYKULIHKCEB-UHFFFAOYSA-N tetradecanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCCCC(O)=O HQHCYKULIHKCEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 1
- 102100025573 1-alkyl-2-acetylglycerophosphocholine esterase Human genes 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-M Arachidonate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC([O-])=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-M 0.000 description 1
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010084313 CD58 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 102220627586 Coagulation factor IX_A37V_mutation Human genes 0.000 description 1
- GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N DMF Natural products CC1=CC=C(C)O1 GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002538 Polyethylene Glycol 20000 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220586173 Protein downstream neighbor of Son_Y22S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000194015 Streptococcus sp. G148 Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 102220506898 Taste receptor type 2 member 9_Y21A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220506917 Taste receptor type 2 member 9_Y22A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 108010092464 Urate Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001243 acetic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012436 analytical size exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940114078 arachidonate Drugs 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L aspartate group Chemical group N[C@@H](CC(=O)[O-])C(=O)[O-] CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-M behenate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940116224 behenate Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004294 calcium hydrogen sulphite Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 238000003508 chemical denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC([O-])=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 1
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 1
- 150000004678 hydrides Chemical class 0.000 description 1
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 102000014909 interleukin-1 receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040006732 interleukin-1 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229940070765 laurate Drugs 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229940105132 myristate Drugs 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 108010094020 polyglycine Proteins 0.000 description 1
- 229920000232 polyglycine polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 102220003816 rs387906480 Human genes 0.000 description 1
- 102220104186 rs561111097 Human genes 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940114926 stearate Drugs 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940034880 tencon Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Изобретение относится к выделенному искусственному альбумин-связывающему домену, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 21-34, а также к содержащему его слитому белку для доставки биоактивного агента.
Description
Область применения изобретения
Настоящее изобретение относится к альбумин-связывающим доменам и способам их получения и применения. В частности, настоящее изобретение относится к искусственной консенсусной последовательности альбумин-связывающих доменов и ее вариантам, представленным в настоящем документе.
Уровень техники настоящего изобретения
Быстрое выведение биотерапевтических молекул через почечный клиренс приводит к ограниченной клинической эффективности или необходимости в учащении дозировки для пациента. Из-за клубочковой фильтрации почечный клиренс чаще всего связывают с малыми биотерапевтическими молекулами, так как для молекул с молекулярной массой выше 50000 Да скорость фильтрации в почках сильно снижается (Kontermann, Curr Opin Biotechnol 22:868-76, 2011 г.). Несколько разрешенных к применению биотерапевтических лекарственных средств содержат активные части, которые сами по себе оказываются меньше предела фильтрации и, таким образом, быстро выводятся. Чтобы преодолеть это ограничение, внедрен ряд технологий, которые эффективно увеличивают размер терапевтической молекулы для снижения фильтрации в почках и получаемого в результате периода полужизни.
Пегилирование (ПЭГ) лекарственных средств является эффективным способом увеличения гидродинамического радиуса белка и снижения клубочковой фильтрации. Одну или несколько цепей ПЭГ можно связать с белком, чаще всего с помощью конъюгации к свободным тиоловым или аминным группам на поверхности белка. Пегилированные варианты аденозиндеаминазы, L-аспарагиназы, интерферона альфа^Ц Г-КСФ (гранулоцитарного колониестимулирующего фактора), гормона роста человека, эритропоэтина, уриказы и фрагмента анти-ФНО-альфа-антител были все разрешены к применению для лечения людей (Kontermann, Curr Opin Biotechnol 22:868-76, 2011 г.). Ограничения пегилирования включают формирование неоднородных продуктов и сложности в контролировании числа молекул ПЭГ, прикрепленных к определенным белкам. Пегилирование вводит дополнительные стадии конъюгации и очистки в производство терапевтических белков, приводя в итоге к уменьшению выхода и увеличению стоимости продукции. Пегилирование может также приводить к почечной трубчатой вакуолизации у животных и у пациентов, так как цепи ПЭГ не распадаются в почках (Gaberc-Porekar et al., Curr Opin Drug Discov Devel 11:242-250, 2008 г.).
Для увеличения периода полужизни терапевтических молекул в сыворотке можно применять связывание лекарственного средства с Fc-участком антитела для создания Fc-слитого белка. Иммуноглобулины у человека могут показывать длительный период полужизни, порядка нескольких недель, из-за большого размера и рециклинга с помощью рецептора FcRn (Kuo et al., J Clin Immunol 30:777-789, 2010 г.). Молекулы рецепторов ФНО 2, LFA-3, CTLA-4, IL-1R и ТРО-миметического пептида все являются разрешенными к применению терапевтическими средствами, формируемыми в виде Fc-слияний (Kontermann, Curr Opin Biotechnol 22:868-76, 2011 г.). Fc-слитые белки не идеальны для всех классов терапевтических веществ по нескольким причинам. Гомодимерный характер Fc-участка приводит к формированию димерного терапевтического белка, возможно вызывая клеточную активацию через образование рецепторных кластеров. Fc-слитые белки необходимо также получать в экспрессирующих системах млекопитающих, что может оказаться дороже прокариотных систем.
Кроме Fc, длительный период полужизни in vivo благодаря FcRn-рециклингу также показывает альбумин. Имея концентрацию приблизительно 40 г/л, человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) является наиболее распространенным белком крови. FcRn-рециклинг ведет к длительному периоду полужизни - приблизительно 19 дней у человека. Кроме того, исследования биораспределения указывают на то, что альбумин может распределяться в теле на участки, которые важны для воздействия на заболевание, например воспаленные суставы или опухоли (Wunder et al., J Immunol 170:4793-4801, 2003 г.). Таким образом, период полужизни в сыворотке для ряда белков увеличили путем их формирования в виде или С-концевого, или N-концевого слияния с ЧСА. Успешные слияния включают интерферон альфа (Flisiak and Flisiak, Expert Opin Biol Ther 10:1509-1515, 2010 г.), гормон роста человека (Osborn et al., Eur J Pharmacol 456:149-158, 2002 г.), фактор некроза опухоли (Muller et al., Biochem Biophys Res Commun 396:793-799, 2010 г.), фактор свертывания крови IX (Metzner et al., Thromb Haemost 102:634-644, 2009 г.), фактор свертывания крови VIIa (Schulte, Thromb Res 122 Suppl 4:S14-19, 2008 г.), инсулин (Duttaroy et al., Diabetes 54:251-258, 2005 г.), урокиназу (Breton et al., Eur J Biochem 231:563-569, 1995 г.), гирудин (Sheffield et al., Blood Coagul Fibrinolysis 12:433-443, 2001 г.) и фрагменты биспецифических антител (Muller et al., J Biol Chem 282:12650-12660, 2007 г.). Слитые белки ЧСА могут иметь длительный период полужизни в сыворотке, однако крупномасштабное производство этих слитых белков ограничено преимущественно дрожжевыми экспрессирующими системами. Кроме того, большой размер ЧСА может приводить к потере терапевтической активности вследствие стерических затруднений.
Терапевтические белки также можно формировать как слитые белки с пептидами или белки, которые связываются с сывороточным альбумином в потоке крови, что увеличивает период их полужизни. Такие альбумин-связывающие пептиды включают ограниченные цистеином пептиды или фрагменты антител к альбумину. Экспрессия Fab-фрагмента антитела в качестве слияния с ограниченными цистеином пептидами значительно увеличивает период полужизни Fab в сыворотке (Dennis et al., J Biol Chem 277:35035-35043, 2002 г.; US 2004/0253247 A1). Соединение ограниченного цистеином пептида с фраг- 1 036487 ментом антитела приводило к улучшению пиковой аккумуляции в опухоли и более однородному распределению по опухоли по сравнению с ситуацией, когда тот же самый антиген является мишенью для молекул Fab и mAb (Dennis et al., Cancer Res 67:254-261, 2007 г.; US 2005/0287153 A1). Дополнительно, для увеличения периода полужизни терапевтического средства с терапевтическими фрагментами соединили ряд фрагментов антител, которые специфически связываются с альбумином. Фрагмент антитела VHH семейства верблюдовых (наноантитела Nanobodies®), который связывается с ЧСА, соединили с другим наноантителом Nanobody®, которое связывается с ФНО-альфа (Coppieters et al., Arthritis Rheum 54:18561866, 2006 г.) или анти-EGFR-наноантителами Nanobodies® (Tijink et al., Mol Cancer Ther 7:2288-2297, 2008 г.). Получены антитела к антиальбуминовым доменам (dAbs), которые связываются с альбумином и слиты, например, с рецептором интерлейкина-1 (Holt et al., Protein Eng Des Sel 21:283-288, 2008 г.) и интерфероном альфа^ (Walker et al., Protein Eng Des Sel 23:271-278, 2010 г.), увеличивая период полужизни последних.
Известен ряд встречающихся в природе белковых доменов из бактерий, которые взаимодействуют с альбумином, предположительно помогая таким бактериям распределяться по организму-хозяину. Ими являются домены 3-спирального пучкового белка размером приблизительно 6 кДа, которые используют одну поверхность 3-спирального пучка для взаимодействия с сывороточным альбумином (Cramer et al., FEBS Lett 581:3178-3182, 2007 г.; Lejon et al., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2008 г., 64:64-69; Johansson et al., FEBS Lett, 1995 г., 374:257-261; Johansson et al., J Mol Biol, 1997 г., 266:859-865; Johansson et al., J Biol Chem, 2002 г., 277:8114-8120). Один из таких альбумин-связывающих доменов, полученный из стрептококкового белка G (Jonsson et al., Protein Eng Des Sel 21:515-527, 2008 г.), наиболее часто применяют для увеличения периода полужизни белков в сыворотке. Показано, что слияние с этим доменом увеличивает период полужизни растворимого комплементарного рецептора типа 1 (Makrides et al., J Pharmacol Exp Ther 277:534-542, 1996 г.), биспецифического антитела (Stork et al., Protein Eng Des Sel 20:569-576, 2007 г.), CD4 (Nygren et al., Vaccines 91:363-368, 1991 г.; US 6267964 B1), Pf155/RESA (Stahl et al., J Immunol Methods 124:43-52, 1989 г.), Г-КСФ (Frejd, F. PEGS Europe, 5 октября 2010 г.) и молекул типа affibody, связывающихся с рядом мишеней (Andersen et al., J Biol Chem 286:52345241, 2011 г.) (Frejd, F. PEGS Europe, 5 октября 2010 г.). Однако у пациентов наблюдали формирование антител к данному домену, таким образом, применение этой молекулы в терапевтических целях может представлять сложность (Goetsch et al., Clin Diagn Lab Immunol 10:125-132, 2003 г.; Libon et al., Vaccine 17:406-414, 1999 г.).
Ряд белковых доменов или пептидов, которые связываются с альбумином, способны увеличивать период полужизни в сыворотке и давать более эффективное биораспределение терапевтических белков. Для применения этих альбумин-связывающих доменов в терапевтических целях необходимо выполнить ряд биофизических требований, таких как высокий уровень экспрессии в организме-носителе, растворимость и стабильность и минимальная иммуногенность. Альбумин-связывающий фрагмент должен связываться с сывороточным альбумином с аффинностью, которая обеспечивает эффективный баланс между периодом полужизни в сыворотке и биораспределением с активностью терапевтического фрагмента в связанном с альбумином и не связанном с альбумином состоянии.
Изложение сущности изобретения
Один аспект настоящего изобретения представляет собой выделенный искусственный альбуминсвязывающий домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2134.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения выделенный искусственный альбуминсвязывающий домен содержит расширение из 6 аминокислот на своем N-конце.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой слитый белок, содержащий альбуминсвязывающий белок согласно настоящему изобретению и биоактивный агент.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлен анализ очищенного ABDCon с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза. Представлены следующие дорожки образцов: 1) маркер молекулярной массы SeeBlue Plus 2, 2) общий клеточный лизат, 3) растворимый клеточный лизат, 4) протекание через колонку, 5-12) элюированные частицы. Слева представлена молекулярная масса для некоторых маркерных полосок.
На фиг. 2 представлен результат масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией очищенного образца ABDCon.
На фиг. 3 представлены результаты эксклюзионной хроматографии очищенного ABDcon, проведенной в ФСБ (фосфатно-солевом буфере).
На фиг. 4 представлена температура плавления А) и обратимость разворачивания ABDCon В), измеренные методом дифференциальной сканирующей калориметрии в ФСБ. В части А представлены нормированные данные с компенсацией базовой линии для первого сканирования. После первого сканирования образец охлаждали до 20°С и повторяли сканирование, чтобы определить обратимость сворачивания. Кривые необработанных данных первого и второго сканирований наложены друг на друга в части В.
- 2 036487
На фиг. 5 представлена фармакокинетика слитого белка Tencon25-ABDCon у мышей при дозировке мг/кг внутривенно.
На фиг. 6 представлена фармакокинетика молекулы Tencon25 (остатки 1-90 в последовательности SEQ ID NO: 39), слитой с ABDCon (SEQ ID NO: 21), ABDCon3 (SEQ ID NO: 26), ABDcon5 (SEQ ID NO: 28), ABDCon7 (SEQ ID NO: 30) и ABDCon9 (SEQ ID NO: 32), у мышей при дозировке 2 мг/кг внутривенно.
На фиг. 7 представлена стабильность: А) некоторых слитых белков ABDCon (SEQ ID NO: 1) и домена FN3 и В) слитых белков ABDCon12 (SEQ ID NO: 46) и домена FN3, имеющих расширенную Nконцевую спираль на ABDCon, при инкубации при 37°С в течение от 0 до 28 дней в ФСБ.
Подробное описание изобретения
Используемый в рамках изобретения термин альбумин-связывающий домен или домен относится к полипептиду, который связывает альбумин in vivo или in vitro. Альбумин может быть получен от любого вида животного, например человека, обезьяны или грызуна.
Используемый в рамках изобретения термин KD относится к константе диссоциации между альбумином и альбумин-связывающим доменом.
Используемый в рамках изобретения термин Kon относится к константе скорости ассоциации альбумин-связывающего домена с альбумином с образованием комплекса альбумин-связывающий домен/альбумин.
Используемый в рамках изобретения термин Koff относится к константе скорости диссоциации альбумин-связывающего домена из комплекса альбумин-связывающий домен/альбумин.
Используемый в рамках изобретения термин искусственный относится к синтетическому домену, т.е. имеющему аминокислотную последовательность, отсутствующую в природных полипептидах.
Используемый в рамках изобретения термин замена или замены относится к изменению, делеции или вставке или к изменениям, делециям или вставкам одной или более аминокислот или нуклеотидов в последовательности полипептида или полинуклеотида для получения варианта этой последовательности.
Используемый в рамках изобретения термин вариант относится к полипептиду или полинуклеотиду, который отличается от исходного полипептида или исходного полинуклеотида одной или более модификациями, например заменами, вставками или делециями.
Используемый в рамках изобретения термин биоактивный агент относится к белкам, антителам, пептидам, нуклеотидам, низкомолекулярным фармацевтическим препаратам и т.п., которые при введении пациенту-животному оказывают благоприятное воздействие на этого пациента. В этот термин включаются синтетически формируемые, выделенные из природных материалов или рекомбинантно формируемые соединения. Биоактивными агентами могут быть аналоги, производные, агонисты, антагонисты, энантиомеры или фармацевтически приемлемые соли биоактивных агентов.
Используемый в рамках изобретения термин стабильность относится к способности молекулы сохранять свернутое состояние в физиологических условиях так, что она сохраняет по меньшей мере одну из своих нормальных функциональных возможностей, например период полужизни.
Термин вектор обозначает полинуклеотид, способный к воспроизведению в биологической системе или который можно переместить между такими системами. Полинуклеотиды-векторы, как правило, содержат элементы, такие как точки начала репликации, сигнал полиаденилирования или маркеры выбора, обеспечивающие воспроизведение или сохранение таких полинуклеотидов в биологической системе. Примерами упомянутых биологических систем могут служить клетки, бактерии, вирусы, животные, растения и реконструированные биологические системы, использующие биологические компоненты, способные к воспроизведению вектора. Содержащий вектор полинуклеотид может представлять собой молекулы ДНК или РНК либо их гибрид.
Понятие вектор экспрессии обозначает вектор, который может использоваться в биологической системе или реконструированной биологической системе для прямой трансляции полипептида, закодированного полинуклеотидной последовательностью, имеющейся в векторе экспрессии.
Используемый в рамках изобретения термин функционально связанный относится к такому взаимному размещению компонентов, при котором они функционируют запланированным образом.
В рамках изобретения аминокислоты обозначаются их стандартными трех- или однобуквенными кодами.
Композиции альбумин-связывающих доменов.
Настоящее изобретение относится к синтетическому альбумин-связывающему домену (ABDCon) (SEQ ID NO: 21) и его вариантам. ABDCon может быть функционально связан с биоактивным агентом для увеличения периода полужизни в сыворотке и улучшения биораспределения терапевтического средства. ABDCon и его варианты могут экспрессироваться на высоких уровнях в Е. coli, растворимы и имеют высокую термостойкость. В настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, кодирующие ADBCon и их варианты, комплементарные к ним нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева, а также способы их получения и применения.
Настоящее изобретение дополнительно относится к синтетическому альбумин-связывающему до- 3 036487 мену (ABDCon), который имеет расширение из 6 аминокислот на N-конце. Это расширение улучшает стабильность ABDCon.
Связывающий домен ABDCon выполнили путем расчета консенсусной аминокислотной последовательности ряда последовательностей 3-спиральных пучковых альбумин-связывающих доменов (ABD), депонированных в неизбыточной базе данных белков, с применением ABD белка G из штамма стрептококка G148 (SEQ ID NO: 1) в качестве шаблона и выбором наиболее широко распространенной аминокислоты в каждой позиции в последовательности (табл. 6). ABDCon имеет высокую аффинность к человеческому альбумину с KD 75 пМ и Koff3,02x 10-5 1/с при тестировании в указанных в рамках изобретения условиях, поэтому биоактивные агенты, функционально связанные с ABDCon, могут в значительной степени связываться с альбумином сразу после введения пациенту-животному. У пациента-человека молекулы, которые слишком слабо связываются с сывороточным альбумином, будут иметь короткий период полужизни в сыворотке из-за почечной фильтрации (Норр et al., Protein Eng Des Sel 23:827-834, 2010 г.), тогда как молекулы, которые слишком прочно связываются с сывороточным альбумином, не будут освобождаться от альбумина в предпочтительном месте действия и, таким образом, в некоторых случаях могут иметь сниженную способность модулировать активность желаемой мишени и обеспечивать терапевтический эффект. Поэтому один из аспектов настоящего изобретения состоит в том, чтобы иметь и быть способным создавать варианты и связывающие домены ABDCon, имеющие целый спектр аффинности к альбумину, и, таким образом, обеспечивать способность модулировать период полужизни биоактивного агента, который функционально связан с вариантами и связывающими доменами ABDCon.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенный искусственный альбумин-связывающий домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 (ABDCon): LKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA.
Варианты ABDCon можно выполнить путем изучения кристаллической структуры типичного 3спирального пучкового альбумин-связывающего белка в комплексе с альбумином и предположения, что ABDCon может связывать альбумин так же, как это делает типичный белок. Типичной кристаллической структурой, которую можно использовать, является структура GA-модуля (альбумин-связывающий модуль, относящийся к белку G) белка РАВ анаэробной бактерии Finegoldia magna (ранее называемой Peptostreptococcus magnus) в комплексе с человеческим альбумином (код 1TF0 в банке данных Protein Data Base (PDB) (Leion et al., J Biol Chem 279:42924-42928, 2004 г.)).
Варианты ABDCon, имеющие пониженную аффинность к альбумину, можно выполнить с помощью различных стратегий, например путем нарушения прогнозируемых гидрофобных контактов, нарушения прогнозируемого пи-стэкинга между ароматическими остатками, введения стерических затруднений путем замены более крупными аминокислотами, нарушения солевых мостиков путем удаления заряженных остатков и нарушения водородных связей, прогнозируемых между ABDCon и альбумином. Внесенные изменения выполняют с возможностью уменьшить аффинность связывания, не изменяя поверхность связывания до такой степени, что связывание может не состояться. Например, остаток Y21 можно заместить заряженными аминокислотами (Lys, Arg, Asp, Glu) или малыми аминокислотами (Ala, Gly), чтобы уменьшить гидрофобные взаимодействия между этим остатком и остатками альбумина V325 и F326. Кроме того, остаток Y21 из ABDCon образует водородную связь с остовом альбуминовых остатков N318 и D324, так что незначительные изменения, например мутация на Phe, могут слегка ослабить эти взаимодействия. Предполагается, что остаток Y22 из ABDCon образует гидрофобное, а также пи-стэкингвзаимодействие с альбуминовыми остатками F309 и F326. Поэтому замена Y22 малыми нейтральными аминокислотами Ala, Ser, Val или заряженными аминокислотами Lys, Arg, Asp или Glu может ослабить гидрофобные контакты и уменьшить аффинность варианта ABDCon к альбумину. Предполагается, что остаток K30 в ABDCon образует солевой мостик с альбуминовым остатком Е227, и, таким образом, K30 можно заменять на Asp или Glu, чтобы ввести отталкивающие заряды и потенциально уменьшить аффинность ABDCon к альбумину. Мутация на любую незаряженную аминокислоту также может уменьшить аффинность путем удаления солевого мостика. Предполагается, что остаток ABDCon T31 образует межмолекулярную водородную связь с альбуминовым остатком N267, а замену на Ala или Gly можно применять для нарушения этой межмолекулярной водородной связи без создания крупного стерического затруднения, которое может значительно дестабилизировать это взаимодействие. Остаток ABDCon A37 можно заменять на Val, Tyr или другую крупную аминокислоту для создания стерических затруднений. Для удаления заряда остаток Е41 можно заменять на Gln или Asn. Можно ожидать, что введение положительно заряженных остатков, например Lys или Arg, дополнительно уменьшит аффинность связывания. Предполагается, что остатки ABDCon L25, Е33, G34, L38, I42 и А45 образуют прямой контакт с альбумином, и замены этих остатков, вероятно, будут модулировать аффинность ABDCon к альбумину. Позиции остатков относятся к ABDCon последовательности SEQ ID NO: 21 и человеческому альбумину последовательности SEQ ID NO: 36.
Альтернативно можно использовать случайную смесь аминокислот, используя, например, кодоны NNK для замены в выявленных позициях, а полученные варианты измеряют на связывание с альбумином, используя стандартные способы и способы, описанные в настоящем описании.
Примерами вариантов ABDCon являются варианты, имеющие замены по меньшей мере в одном ос- 4 036487 татке, выбранном из Y21, Y22, L25, K30, Т31, Е33, G34, А37, L38, Е41, I42 и А45 в последовательности
SEQ ID NO: 21.
Примерами вариантов ABDCon являются варианты, имеющие замены по меньшей мере в одном остатке, выбранном из Y21, Y22, K30, Т31, А37 и Е41 в последовательности SEQ ID NO: 21.
Пример варианта ABDCon содержит аминокислотную последовательность LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA(SEQ ID NO: 22; где Xb X2, Х3, Х4, Х5 и Х6 может представлять собой любую аминокислоту).
В других вариантах осуществления пример варианта ABDCon содержит аминокислотную последовательность LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA (SEQ ID NO: 23), в которой:
i) Xi представляет собой лизин (K), аргинин (R), аспартат (D), глутамат (Е), аланин (А), глицин (G), фенилаланин (F) или тирозин (Y);
ii) X2 представляет собой аланин (А), серин (S), валин (V), лизин (K), аргинин (R), аспартат (D), глутамат (Е) или тирозин (Y);
iii) Х3 представляет собой аспартат (D), глутамат (Е) или лизин (K);
iv) X4 представляет собой аланин (А), глицин (G) или треонин (Т);
v) X5 представляет собой валин (V), тирозин (Y) или аланин (А); и vi) X6 представляет собой глутамин (Q), аспарагин (N), лизин (K), аргинин (R) или глутамат (Е).
В других вариантах осуществления пример варианта ABDCon содержит аминокислотную последовательность LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA (SEQ ID NO: 24), в которой:
i) X1 представляет собой лизин (K), аланин (А) или тирозин (Y);
ii) X2 представляет собой аланин (А), серин (S), валин (V) или тирозин (Y);
iii) Х3 представляет собой аспартат (D) или лизин (K);
iv) X4 представляет собой аланин (А) или треонин (Т);
v) X5 представляет собой валин (V), тирозин (Y) или аланин (А); и vi) X6 представляет собой глутамин (Q) или глутамат (Е).
Дополнительные примеры вариантов ABDCon содержат аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 25-34. Варианты ABDCon тестируют на связывание с альбумином, применяя хорошо известные способы, например анализ in vitro с применением плазмонного резонанса (BIAcore, GE-Healthcare, г. Упсала, Швеция). Измеренная аффинность взаимодействия в конкретной паре вариант ABDCon/альбумин может меняться в зависимости от разных условий измерения (например, осмолярности, рН). Следовательно, измерения аффинности и других параметров связывания (KD, Kon, Koff и т.д.) предпочтительно производить с использованием стандартизированных растворов варианта ABDCon и альбумина и стандартизированного буфера, например, описанного в рамках изобретения. Аффинность вариантов ABDCon к альбумину может находиться в диапазоне по меньшей мере от приблизительно 1х 10-5 М, по меньшей мере приблизительно 1х 10-6 М, по меньшей мере приблизительно 1х 10-7 М, по меньшей мере приблизительно 1х 10-8 М, по меньшей мере приблизительно 1х 10-9 М, по меньшей мере приблизительно 1х10-10 М, по меньшей мере приблизительно 1х 10-11 М, по меньшей мере приблизительно 1х10-1 М или по меньшей мере приблизительно 1х10-1 М. Например, различные замены Y22 в ABDCon (SEQ ID NO: 21) уменьшали аффинность этих вариантов к альбумину приблизительно в 3001000 раз в зависимости от замены (табл. 4). Специалисты в данной области могут выполнить и создать дополнительные варианты, имеющие замены в определенных позициях или комбинациях позиций, и, применяя стандартные способы, испытать их на желаемую аффинность связывания с альбумином.
ABDCon и его варианты можно дополнительно модифицировать присоединением расширения из 5 аминокислот к N-концу ABDCon или варианта ABDCon. Расширение из 5 аминокислот может состоять из аминокислотной последовательности TIDEWL (SEQ ID NO: 43) или любой аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 42 или 45-55. Включение расширения из 5 аминокислот на N-конце в ABDCon или его вариантах может повысить стабильность молекулы. Расширения из 5 аминокислот на N-конце можно структурно упорядочить как часть первой альфа-спирали ABDCon и его вариантов. Таким образом, улучшенная стабильность молекул, расширенных на N-конце, может быть следствием стабилизации общей структуры спирали. N-концевые варианты ABDCon можно получить, применяя стандартные способы, а их стабильность, например термостойкость, можно оценить способом, описанным в рамках изобретения. Любой альбумин-связывающий домен (ABD) можно модифицировать присоединением 5 N-концевых аминокислот для стабилизации структуры ABD и улучшения стабильности, например термостойкости, полученной молекулы.
ABDCon и его варианты можно дополнительно модифицировать по остаткам, не влияющим на связывание с альбумином, например, с целью улучшить стабильность, уменьшить иммуногенность, улучшить растворимость или любые другие соответствующие характеристики. В одном способе достижения данной цели ABDCon и его варианты можно необязательно получить с помощью процесса анализа родительских последовательностей и различных концептуальных сконструированных продуктов с примене- 5 036487 нием трехмерных моделей родительских и сконструированных последовательностей. Трехмерные модели широкодоступны и известны специалистам в данной области. Существуют компьютерные программы, иллюстрирующие и показывающие вероятные трехмерные конформационные структуры отобранных последовательностей-кандидатов и способные измерять потенциальную иммуногенность (например, программа Immunofilter компании Xencor, Inc., г. Монровия, штат Калифорния). Изучение этих изображений позволяет анализировать вероятную роль остатков в функционировании потенциальной последовательности, например остатков, влияющих на стабильность домена ABDCon. Таким образом, возможны выбор и комбинирование остатков из родительской и контрольной последовательностей так, чтобы достичь желаемых характеристик, таких как улучшенная стабильность. Альтернативно или в дополнение к вышеописанным процедурам можно применять другие соответствующие способы конструирования, известные специалистам в данной области.
Желаемые физические свойства альбумин-связывающих доменов настоящего изобретения включают высокую термостабильность и обратимость термического сворачивания и разворачивания. Для повышения эффективной термостабильности белков и ферментов использовали несколько способов, включая рациональное выполнение на основании сравнения с термостабильными последовательностями с высокой степенью сходства, выполнение стабилизирующих дисульфидных мостиков, мутации для повышения склонности к образованию альфа-спирали, конструирование солевых мостиков, изменение поверхностного заряда белка, направленную эволюцию, а также состав консенсусных последовательностей (Lehmann and Wyss, Curr Opin Biotechnol 12:371-375, 2001 г.). Высокая термостабильность может повышать выход экспрессируемого белка, повышать растворимость или активность, снижать иммуногенность и минимизировать необходимость в холодной линии для производства.
Остатки, которые можно заменить для улучшения любых характеристик альбумин-связывающих доменов настоящего изобретения, можно определить путем выполнения замены и анализа желаемых характеристик альбумин-связывающего домена. Например, для определения в ABDCon и его вариантах тех позиций, которые могут влиять на стабильность альбумин-связывающего домена, можно применять сканирование аланином.
В отношении потери стабильности, т.е. денатурирование или денатурация белка означают процесс, в котором происходит потеря части или всей трехмерной конформации, приводящая к потере функциональных свойств белка с соответствующей потерей активности и/или растворимости. Разрушаемые при денатурации силы включают внутримолекулярные связи, например электростатические, гидрофобные, ван-дер-ваальсовы силы, водородные связи и дисульфиды. Денатурацию белка можно вызвать путем приложения к белку или содержащему белок раствору сил, таких как механическое воздействие (например, компрессионное или сдвиговое усилие), тепловой, осмотический стресс, изменение рН, электрические или магнитные поля, ионизирующее излучение, ультрафиолетовое излучение и дегидратация, а также путем воздействия химических денатурирующих веществ.
Измерение стабильности белка и лабильности белка можно рассматривать как один и тот же или как различные аспекты целостности белка. Белки чувствительны или лабильны к денатурации, вызванной нагревом, ультрафиолетовым или ионизирующим облучением, изменением осмолярности и рН при нахождении в жидком растворе, механическим сдвиговым усилием, вызванным фильтрованием через поры малого размера, ультрафиолетовым облучением, ионизирующим облучением, таким как гаммаоблучение, химической или термической дегидратацией или любым другим воздействием или силой, которые могут привести к разрушению структуры белка. Стабильность молекулы можно определить стандартными способами. Например, стабильность молекулы можно определить путем измерения температуры термического плавления (Tm) - температуры в градусах Цельсия (°С), при которой половина молекул разворачивается, применяя стандартные способы. Как правило, чем выше Tm, тем более стабильной является молекула. Помимо нагрева, способность белка сохранять конкретную трехмерную структуру также можно изменять в зависимости от химического окружения.
Химическую денатурацию можно также измерить различными способами. Химические денатурирующие вещества включают гидрохлорид гуанидиния, тиоцианат гуанидиния, мочевину, ацетон, органические растворители (ДМФА, бензол, ацетонитрил), соли (сульфат аммония, бромид лития, хлорид лития, бромид натрия, хлорид кальция, хлорид натрия); восстановители (например, дитиотреитол, бетамеркаптоэтанол, динитротиобензол, а также гидриды, такие как боргидрид натрия), неионные и ионные моющие средства, кислоты (например, соляная кислота (HCl), уксусная кислота (СН3СООН), галогензамещенные уксусные кислоты), гидрофобные молекулы (например, фосфолипиды), а также направленные денатурирующие агенты. Количественное определение степени денатурации может быть основано на потере функционального свойства, такого как способность связываться с молекулой-мишенью, или на физико-химических свойствах, таких как склонность к агрегации, открытие доступа к ранее недоступным растворителю остаткам либо разрушение или образование дисульфидных связей.
Связывающий домен ABDCon и его варианты могут быть функционально связаны с биоактивным агентом. Примерами биоактивных агентов являются пептиды и белки, которые могут быть функционально связаны с ABDCon и его вариантами с помощью хорошо известных линкеров, например линкера, содержащего полиглицин, глицин и серин (линкер Gly-Ser) или аланин и пролин. Применение природ
- 6 036487 ных, а также искусственных пептидных линкеров хорошо известно в отраслевой литературе (Hallewell et al., J Biol Chem 264:5260-5268, 1989 г.; Alfthan et al., Protein Eng. 8:725-731, 1995 г.; Robinson & Sauer, Biochemistry 35:109-116, 1996 г.; патент США № 5856456). Биоактивный агент может быть связан с ABDCon или его вариантами по своему С- или N-концу. С ABDCon также можно связать полиспецифические биоактивные агенты. В таких случаях ABDCon может быть связан с N-концом или С-концом молекулы. ABDCon также можно разместить внутри такого полиспецифического агента, связав его с Сконцом одного агента и N-концом другого. Биоактивные агенты также можно соединять с альбуминсвязывающими доменами настоящего изобретения с применением химического перекрестного сшивания, хорошо известного в отрасли, например с применением гидразонового или семикарбазонового мостика. Примерами биоактивных агентов являются белки, специфически связывающие антигены-мишени, например белки, идентифицированные из библиотек белков с повторами фибронектина III типа (FN3), например библиотек на основе Tencon25, описанных в патентах WO 2011/137319 A2 и WO 2010/093627 A2.
В ABDCon или его варианты, составляющие предмет настоящего изобретения, можно встроить дополнительные фрагменты, такие как конъюгаты токсинов, молекулы полиэтиленгликоля (PEG), такие как PEG5000 или PEG20000, жирные кислоты и эфиры жирных кислот с различной длиной цепи, например лаурат, миристат, стеарат, арахидат, бегенат, олеат, арахидонат, октандиовую кислоту, тетрадекандиовую кислоту, октадекандиовую кислоту, докозандиовую кислоту и т.п., полилизин, октан, углеводы (декстран, целлюлозу, олиго- или полисахариды) для получения желаемых свойств. Эти фрагменты могут представлять собой результаты прямого слияния с кодирующими ABDCon последовательностями, и их можно создавать стандартными методиками клонирования и экспрессии. Альтернативно для прикрепления фрагментов в формируемые рекомбинантным способом ABDCon настоящего изобретения можно применять хорошо известные способы химического связывания.
ABDCon и его варианты, а также слитые белки биоактивных агентов и ABDCon можно оценивать по периоду их полужизни, применяя хорошо известные фармакокинетические свойства в моделях in vivo. Примеры ABDCon и его вариантов связывают альбумин с KD приблизительно в диапазоне 1 пМ-1 мкМ, в диапазоне 75 пМ-860 нМ, в диапазоне 100 пМ-500 нМ или в диапазоне 1-100 нМ.
Создание и формирование ABDCon и его вариантов.
Создание альбумин-связывающих доменов согласно настоящему изобретению обычно осуществляют на уровне нуклеиновой кислоты с использованием стандартных способов. Варианты ABDCon, имеющие замененные кодоны по одному или более конкретным остаткам, можно синтезировать, например, с применением стандартных способов клонирования с помощью ПЦР или химического синтеза генов в соответствии со способами, описанными в патентах США № 6521427 и № 6670127, или посредством мутагенеза по Кункелю (Kunkel et al., Methods Enzymol 154:367-382, 1987 г.). Если для каких-либо позиций остатков планируют применять рандомизированные кодоны, рандомизацию можно провести с применением хорошо известных способов, например вырожденных олигонуклеотидов, соответствующих заданному разнообразию, или, например, с применением кодонов NNK, которые кодируют все 20 природных аминокислот. В других схемах диверсификации можно применять кодоны DVK для кодирования аминокислот Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly и Cys. Альтернативно можно применять кодоны NNS для получения всех 20 аминокислотных остатков и одновременного снижения частоты стоп-кодонов. Для обозначения кодонов используется хорошо известный код IUB.
Специалистам в данной области хорошо известен синтез олигонуклеотидов с выбранной вырожденностью нуклеотидов в определенных позициях, например, подход TRIM (Knappek et al., J Mol Biol 296:57-86, 1999 г.; Garrard & Henner, Gene 128:103-109, 1993 г.). Такие наборы нуклеотидов, имеющие определенные наборы кодонов, можно синтезировать с применением доступных в продаже нуклеотидных или нуклеозидных реагентов и устройств.
Для клонирования ABDCon или его вариантов в вектор или синтеза двухцепочечной кДНК ABDCon для экспрессии или трансляции белка in vitro применяют стандартные методики клонирования и экспрессии. Биоактивные агенты можно функционально связать с ABDCon или его вариантами с применением хорошо известных способов.
Хотя настоящее изобретение выше было описано в общих чертах, варианты осуществления настоящего изобретения будут дополнительно описаны в следующих примерах, которые никоим образом не ограничивают действия пунктов формулы изобретения.
Пример 1. Создание искусственного альбумин-связывающего домена.
Выполнение консенсусной последовательности для искусственного альбумин-связывающего домена (ABDCon).
Искусственный альбумин-связывающий домен (ABD) выполнили путем расчета консенсусной аминокислотной последовательности из 3-спиральных пучковых последовательностей ABD, депонированных в неизбыточной базе данных белков. Для определения консенсусной последовательности использовали ABD из белка G из штамма стрептококка G148 (SEQ ID NO:1) в качестве шаблонной последовательности для поиска с помощью программы BLAST в неизбыточной базе данных белков NCBI (http:_//blast_ncbi_nlm_nih_gov/Blast_cgi). Для BLAST-поиска использовали все настройки по умолча
- 7 036487 нию; порог ожидания (Expect threshold)=10, длина слова (word size)=3, матрица (matrix)=BLOSUM62, цены делеции (gap costs)=наличие 11, продление 1 и композиционные поправки (compositional adjustments)=условная композиционная поправка матрицы. Из этого поиска выбрали 20 наиболее близкородственных белковых доменов, приведенных в табл. 1 (SEQ ID NO: 1-20), чтобы включить их в множественное выравнивание последовательностей для определения консенсусной последовательности. Выбрали только неизбыточные последовательности. Несколько номеров доступа белков приведены в табл. 1 множество раз, что указывает на то, что некоторые белки содержат несколько близкородственных доменов ABD. Последовательность SEQ ID NO: 4 представляет собой искусственный ABD, полученный путем фагового отображения и перетасовки генов (Не et al., Protein Sci 16:1490-1494, 2007 г.).
Таблица 1
Множественное выравнивание последовательностей из перечисленных последовательностей получили с применением программного обеспечения AlignX (со всеми настройками по умолчанию). Выравнивание последовательности, показанное в табл. 6, применили для выбора наиболее широко распространенной аминокислоты в каждой позиции в последовательности, чтобы получить консенсусную последо вательность альбумин-связывающего домена, ABDCon (SEQ ID NO: 21, табл. 6). Для позиции 21 выбрали Tyr вместо Ile, так как для этой позиции явного консенсуса не было, а ароматические остатки Tyr и Phe были хорошо представлены. Степени попарной идентичности последовательностей с ABDCon находятся в диапазоне от 45% (SEQ ID NO: 3) до 82% (SEQ ID NO: 8, 13, 14 и 16).
Синтез гена.
Аминокислотную последовательность консенсусной последовательности альбумин-связывающего домена (ABDCon) транслировали обратно в нуклеотидную последовательность, кодирующую ABDCon, с применением предпочтительных кодонов для экспрессии в Е. coli, как показано ниже (SEQ ID NO: 35), и получили синтетический ген (BlueHeron Biotechnologies). К последовательности синтетического гена SEQ ID NO: 34 присоединили 5' и 3' последовательности ДНК для присоединения сайтов NdeI и XhoI для субклонирования, а также последовательности ДНК, кодирующие N-концевую 8-His метку для очистки белка. Этот ген клонировали в вектор рЕТ26 (Novagen) для экспрессии, стимулируемой промоторной последовательностью Т7, и трансформировали в штамм Е. coli BL21(DE3) (Novagen).
Экспрессия и очистка.
Для экспрессии ABDcon 50 мл среды LB, дополненной 30 мкг/мл канамицина, инокулировали одной колонией и выращивали в течение одной ночи при 37°С и встряхивании при 220 об/мин. На следующий день 10 мл ночной культуры добавили к 100 мл среды Terrific Broth, дополненной 30 мкг/мл канамицина, и выращивали культуру в течение 2,5 ч при 37°С и 220 об/мин. Затем добавили ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и уменьшили температуру до 30°С для индуцирования экспрессии белка. Клетки собрали через 14 ч путем центрифугирования при 4000xg в течение 20 мин, а клеточный осадок хранили при -20°С. Замороженный клеточный осадок повторно суспендировали в 5 мл реагента BugBuster HT (Novagen) на грамм влажного осадка и осторожно перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Молекулу ABDCon, меченную полигистидином, очистили с помощью хроматографии на Ni-NTA (GE Healthcare), элюируя в буфере с 50 мМ фосфата натрия при рН 7,4, 500 мМ хлорида натрия с градиентом 10-250 мМ имидазола. Содержащие ABDCon фракции объединили и дополнительно очистили путем эксклюзионной хроматографии с применением колонки Superdex75 16/60 (GE Healthcare) с ФСБ в качестве подвижной фазы. Чистоту оценивали с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза (фиг. 1). Масс-спектрометрия дала массу 6383 Да, что согласовалось с теоретической массой 6382 Да (фиг. 2). Аналитическая эксклюзионная хроматография с применением колонки Superdex 75 5/150 (GE Healthcare) показывает, что препарат ABDCon не содержит агрегатов и элюируется во время, согласующееся с мо
- 8 036487 номерным белком (фиг. 3).
Пример 2. Характеризация ABDCon.
Термостабильность ABDCon.
ABDCon концентрировали до 2,175 мг/мл в ФСБ рН 7,4 и оценили термостабильность с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Данные по стабильности получили нагреванием 400 мкл раствора ABDCon от 25 до 100°С при скорости нагрева 1°С в минуту в микрокалориметре VPDSC (MicroCal). Для оценки обратимости термического сворачивания/разворачивания провели на образце второе идентичное сканирование. Для вычисления температуры плавления полученные данные аппроксимировали в модели разворачивания с 2 состояниями. На фиг. 4 показано, что ABDCon имеет высокую термостабильность 81,5°С в ФСБ и что сворачивание полностью обратимо.
Связывание ABDCon с альбумином.
Кинетику связывания ABDCon с человеческим сывороточным альбумином и мышиным сывороточным альбумином измеряли с помощью системы для анализа белковых взаимодействий ProteOn™ XPR-36 (Bio-Rad) с применением сенсорных чипов GLC. Сывороточный альбумин человека (SEQ ID NO: 36), макака-резуса (SEQ ID NO: 37) и мыши (SEQ ID NO: 38) приобрели у компании Sigma (каталог № А4327 для альбумина человека, № А3559 для альбумина мыши и № А4297 для альбумина макака-резуса) и повторно суспендировали в ФСБ в разных концентрациях. Каждый сывороточный альбумин непосредственно иммобилизовали на канале лигандов в вертикальной ориентации чипа GLC посредством стандартного аминового связывания в концентрации 2,1 мкг/мл при рН 5,0, получив поверхности с плотностью лигандов 500-1000 резонансных единиц. Связывание рекомбинантного ABDCon тестировали одновременным пропусканием пяти разных концентраций (например, 1 мкМ с последовательным 3-кратным разбавлением) в качестве аналитов в горизонтальной ориентации на поверхностях с иммобилизованным сывороточным альбумином. Стадии диссоциации для всех концентраций отслеживали в течение двух часов при скорости потока 100 мкл/мин с применением PBST (ФСБ, 0,005% Tween20) в качестве подвижного буфера. Для отслеживания стабильности базовой линии ввели шестой образец (только буферный раствор). Поверхности восстанавливали применением 1 короткого импульса (18 мкл) 0,8% фосфорной кислоты.
Таблица 2
| Альбумин | kon (1/Мс) | (1/с) | КЬ (М) |
| Человек | 4,04Е+05 | 3,02Е-05 | 7,48Е-11 |
| Мышь | 2,41Е+05 | 7,76Е-04 | 3,22Е-09 |
| Макак-резус | 1,13Е+06 | 6,78Е-05 | 6,01Е-11 |
Полученные данные ответа сначала обработали вычитанием ответов на образец только с буферным раствором и неспецифического связывания между аналитами и чипом. Обработанные данные для всех пяти концентраций глобально аппроксимировали в простой ленгмюровской модели связывания 1:1 для каждой поверхности с лигандами. Табл. 2 описывает кинетику связывания, определенную для каждого вида альбумина.
Период полужизни слияния ABDCon в сыворотке у мышей.
Способность ABDCon увеличивать период полужизни слитого белка в сыворотке оценивали путем получения синтетического гена, кодирующего слияние ABDCon с С-концом Tencon25. Tencon25 является белковым каркасом, основанным на консенсусной последовательности белка с повторами фибронектина III типа (FN3), который имеет последовательность, приведенную в остатках 1-90 в последовательности SEQ ID NO: 39, и описан в патенте US 2011/0274623 А1. Для белковых доменов Tencon25 и ABDCon слияние осуществили с помощью пептидного линкера (G4S)2 (SEQ ID NO: 40). Полученный слитый белок имеет полипептидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 39. В целях очистки на С-конце включили полигистидиновую метку. 69 мышей женского пола инбредной линии BALB/c разделили на 3 группы (N=3 в группе 1, контроль без введения препаратов, и N=33 в группах 2-3). Мышам вводили одну дозу слитого белка Tencon25-ABDCon внутривенно в расчете 2 мг/кг. Дозировка основывалась на массе животных в день введения. Мышей умерщвляли в следующих временных точках после инъекции: 10 мин, 30 мин, 1, 4, 6 ч и 1, 2, 3, 7, 10, 14 суток. У каждого животного забирали образцы крови посредством пункции сердца. Образцам крови давали свернуться при комнатной температуре в течение 30 мин, но не дольше 1 ч. Затем образцы крови центрифугировали при приблизительно 3500 об/мин в течение 15 мин. Образцы сыворотки анализировали с применением гомогенного ИФА по сэндвичметоду на платформе Mesoscale Discovery. Планшеты Streptavidin-Gold (Mesoscale Discovery) блокировали на 1 ч раствором Superblock (TBS) Tween-20 (Thermo). Поликлональное антитело к Tencon25 использовали как для захвата (биотинилированное), так и для обнаружения (меченное MSD Sulfo-Tag (Mesoscale Discovery)) в концентрации 0,625 мкг/мл. К планшетам добавили антиген и антитела и инкубировали их в течение 2 ч при комнатной температуре и энергичном встряхивании. Планшеты промыли раствором TBS-T (Sigma) и добавили буферный раствор MSD Read Buffer с поверхностно-активным веществом (Mesoscale Discovery). Планшеты прочитали с помощью считывающего устройства MSD Sector Imager 6000. Данные проанализировали с помощью статистического программного пакета GraphPad Prism. Предыдущие исследования показали, что сходная неслитая молекула Tencon быстро выводится из
- 9 036487 крови: у мышей период полужизни в сыворотке составил приблизительно 20 мин. Слияние Tencon25 с
ABDCon увеличивает период полужизни в сыворотке до свыше 60 ч (фиг. 5).
Пример 3. Конструирование ABDCon с варьирующейся аффинностью к сывороточному альбумину.
Аффинность связывания с сывороточным альбумином может обуславливать не только период полужизни терапевтического белка в сыворотке, но и способность этой молекулы связывать и нейтрализовать свою мишень. Например, молекула, которая связывает сывороточный альбумин слишком слабо, будет иметь короткий период полужизни в сыворотке в связи с почечной фильтрацией в несвязанном с альбумином состоянии (Hopp et al., Protein Eng Des Sel 23:827-834, 2010 г.). И наоборот, молекула, которая слишком прочно связывается с альбумином, не будет освобождаться от альбумина в предпочтительном месте действия и, таким образом, в некоторых случаях может быть неспособна нейтрализовать желаемую мишень. Поэтому предпочтительнее достигать продления периода полужизни посредством связывания альбумина таким образом, чтобы прочность взаимодействия с альбумином обеспечивала только желаемый период полужизни в сыворотке. Поскольку описанная в рамках изобретения последовательность ABDCon связывается с человеческим сывороточным альбумином с аффинностью 75 пМ и скоростью диссоциации 3,02х10-5 1/с (при описанных в рамках изобретения экспериментальных условиях), молекулы, слитые с ABDCon, в значительной степени свяжутся с альбумином сразу после введения животному или пациенту. Для некоторых мишеней и слияний может быть желательной менее прочная связь с сывороточным альбумином. Для снижения аффинности связывания ABDCon с альбумином выполнили 10 мутантных вариантов ABDCon. Эти мутанты приведены в табл. 3:
Таблица 3
| Конструкт | Мутация* | SEQ IN NO: | Обоснование |
| ABDCon2 | Y21A | 25 | Нарушение ароматического стэкинга с альбуминовыми |
| остатками F309 и F326 | |||
| ABDCon3 | Y21K | 26 | Нарушение ароматического стэкинга с альбуминовыми остатками F309 и F326. Введение стерического затруднения |
| ABDCon.4 | Y22A | 27 | Ослабление гидрофобных контактов |
| ABDCon5 | Y22S | 28 | Ослабление гидрофобных контактов |
| ABDCon6 | Y22V | 29 | Незначительное ослабление гидрофобных контактов |
| ABDCon? | E41Q | 30 | Удаление заряда для нарушения солевого мостика |
| ABDCon.8 | K30D | 31 | Изменение заряда для нарушения солевого мостика |
| ABDCon9 | T31A | 32 | Удаление межмолекулярной водородной связи |
| ABDCon10 | A37V | 33 | Введение стерического затруднения |
| ABDConll | A37Y | 34 | Введение стерического затруднения |
* - нумерация аминокислот согласно SEQ ID NO: 21.
Мутантов ABDCon выбирали путем изучения кристаллической структуры GA-модуля (альбуминсвязывающего модуля, относящегося к белку G), связанного с человеческим сывороточным альбумином (код 1TF0 в банке данных Protein Data Base (PDB)) (Lejon et al., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 64:64-69, 2008 г.), при предположении, что ABDCon связывает альбумин так же, как это делает GA. Мутанты были выполнены с возможностью снижения аффинности ABDCon к альбумину путем нарушения гидрофобных контактов, введения стерических затруднений, нарушения солевых мостиков и нарушения водородных связей (табл. 3). Внесенные изменения были выполнены с возможностью уменьшить аффинность связывания, не изменяя поверхность связывания настолько резко, что связывание может не состояться. Каждого мутанта экспрессировали и очистили из Е. coli, как это было описано для ABDCon. Мутант ABDConll оказался нерастворимым, поэтому его исключили из дальнейшего анализа. Аффинность каждого варианта к сывороточному альбумину человека, мыши и макака-резуса определяли поверхностным плазмонным резонансом, полученные результаты представлены в табл. 4. В дополнение к позициям, приведенным в табл. 3, для увеличения или уменьшения аффинности ABDCon к альбумину можно мутировать остатки L25, Е33, G34, L38, I42 и А45, так как они предположительно будут входить в непосредственный контакт с альбумином.
Таблица 4
| Вариант | Kc человека (нМ) | Ко мыши (hM) | Ко макака-резуса (нМ) |
| ABDCon2 | 6, 1 | H/O | 17, 5 |
| АВПСопЗ | 1 | 103 | 5, 1 |
| ABDCon4 | 13, 6 | 571 | 43, 7 |
| ABDCon5 | 54, 8 | 1650 | 104 |
| АВПСопб | 2,7 | 190 | 8,4 |
| ABDCon? | 0,4 | 20, 6 | 0,5 |
| ABDConS | 43 | 1001,7 | 65 |
| ABDCon9 | 860 | 550,8 | 206 |
| ABDConlO | 0,8 | 37, 8 | 1,3 |
- 10 036487
Пример 4. Период полужизни слитых белков с вариантами ABDCon в сыворотке.
Для Tencon25 (аминокислоты 1-90 в последовательности SEQ ID NO: 39) выполнили слияние с вариантами ABDCon 3, 5, 7 и 9 (табл. 3) для оценки корреляции между аффинностью ABDCon к альбумину и увеличением периода полужизни. Эти молекулы ввели мышам дозами по 2 мг/кг, как было описано выше в предыдущих исследованиях, и проанализировали с применением способов, идентичных тем, которые применялись для слияний Tencon25-ABDCon. Обобщенные фармакокинетические параметры, полученные для этих молекул, приведены в табл. 5 и на фиг. 6. Здесь показано, что скорость выведения снижается по мере возрастания аффинности к альбумину, пока не будет достигнута аффинность 103 нМ, и в этой точке значительные различия в фармакокинетических параметрах отсутствуют. Данные в табл. 5 показывают способность регулировать такие свойства, как период полужизни, скорость выведения и общее воздействие (ПИК), путем варьирования аффинности молекулы ABDCon к альбумину.
Таблица 5
| Конструкт | Кр (нН) | Т (1/2) (часов) | Объем распределения (мл/кг) | Выведение (мл/ч/кг) | ппк (час*нг/мл) |
| Тепсоп25- ABDCon | 1, 86 | 60, 42 | 83,2873 | 0,9555 | 2054332 |
| Tencon2 5АВБСОПЗ | 103 | 45,8355 | 60,645 | 0, 915 | 2166461 |
| Тепсоп25- ABDCon5 | 1650 | 32,8715 | 223,86 | 4,72 | 423635 |
| Tencon25- ABDCon7 | 20, 6 | 46, 7499 | 49,915 | 0,74 | 2681641 |
| Tencon25- ABDConS | 550,8 | 34,1956 | 81, 87 | 1, 66 | 1205061 |
Таблица 6
| SEQ ID | Последовательность |
| 13 | LKEAKEKAVEELKENGITSEKYIDQINKAKTVEGVNALKDEIIKA |
| 14 | LKEAKEKAVEELKNNGITSEKYIDQINKAKTVEGVNALKDEIIKA |
| 17 | LKEAKEKAVEELKNNGITSEKYIEQINKAKTVEGVNALKDEIIKA |
| 20 | LKEAKEKAIEELKNNGITSEKYIEQINKAKTVEGVNALKDEIIKS |
| 7 | LKDAKEKAIEAIRKEGVKSKLYEDLINKAKTIDGVNALRDQIIEA |
| 1 | LAEAKVLANRELDKYGVS-DYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAA |
| 2 | LSEAKEMAIRELDAQGVS-DFYKNKINNAKTVEGWALKDLILNS |
| 3 | LDQAKQAALKEFDRYGVS-NYYKNLINKAKTVEGIMELQAQW-- |
| 12 | LAEAKKVAHEEFTKAGITGKIFHDAIDAAKTVEGLKAYVAETLAA |
| 15 | LAEAKKVAHEEFTKAGITGKIFHDAIDAAKTVEGLQAYVAETLAA |
| 18 | LAEAKNVAHAE FT KAGIT GKIFHDAIDAAKTVEGLQAYVAE T LAA |
| 19 | LAEAKKAAHEEFTKAGITGKIFHDAIDAAKTVEGLQAYVAETLKA |
| 4 | LAQAKEAAIKELKQYGIG-DYYIKLINNAKTVEGVESLKNEILKA |
| 5 | LLKAKEAAINELKQYGIS-DYYVTLINKAKTVEGVNALKAEILSA |
| 16 | LKNAKEDAIAELKKAGITSDFYFNAINKAKTVEEVNALKNEILKA |
| 10 | LKNAKEDAIKELKEAGIS SDIYFDAINKAKTVEGVEALKNEILKA |
| 11 | LKNAKEDAIKELKEAGITSDIYFDAINKAKTIEGVEALKNEILKA |
| 6 | LKNAKEDAIKELKEAGIKSQFFFNLINNAKTVEGVE SLKNEILKA |
| 9 | LKNAKEAAIKELKEAGITAEYLFNLINKAKTVEGVESLKNEILKA |
| 0 | LKNAKEEAIKELKEAGITSDLYFSLINKAKTVEGVEALKNEILKA |
| 21 | LKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA |
Пример 5. Стабилизация альбумин-связывающих доменов.
Провели исследование для определения стабильности ABDCon (SEQ ID NO: 21) при формировании слитых белков с различными доменами фибронектина III типа (FN3) (см., например, патент № US 2010/0216708). Слитые белки домена FN3 и ABDCon получили, используя стандартные методики клонирования. Аминокислотная последовательность одного из слитых белков Tencon-ABDCon представлена в SEQ ID NO: 41. Другими полученными слитыми белками домена FN3 и ABDCon стали Tencon25ABDCon, 83-ABDCon и 71-ABDCon. Эти белки сформировали с С-концевыми полигистидиновыми метками и очистили комбинацией аффинной хроматографии на никелевой агарозе и эксклюзионной хроматографии с применением стандартных способов. Каждую очищенную молекулу инкубировали в ФСБ при рН 7,4 при 37°С в течение 28 дней и затем анализировали с использованием ДСН-ПААГэлектрофореза и масс-спектрометрии. Фиг. 7А показывает, что каждый слитый белок домена FN3 и ABDCon распадался во время такой инкубации, о чем свидетельствует появление низкомолекулярных полос на геле для ДСН-ПААГ-электрофореза. Масс-спектрометрический анализ подтвердил, что основной схемой распада было разрезание данных молекул по остаткам L1, K2 и Е3 в последовательности
- 11 036487
ABDCon (SEQ ID NO: 21). Кроме того, наблюдали, что ABD нативного белка G стрептококка (SEQ ID NO: 1), слитый с доменом FN3, демонстрирует сходную схему разложения с разрезанием по остатку L1 при инкубации при 4°С в течение 6-8 месяцев (данные не представлены). Наконец, наблюдали, что несколько очищенных партий нативного ABD (SEQ ID NO: 1) и ABDCon (SEQ ID NO: 21) потеряли активность и не обнаруживались в растворе ДСН-ПААГ-электрофорезом после хранения в течение нескольких месяцев при 4°С, что свидетельствует о сильном разложении.
Приведенные выше наблюдения указывают, что N-концевая альфа-спираль ABDCon и структуры нативного ABD, применяемые для увеличения периода полужизни в сыворотке, нестабильны. Нехватка стабильности для таких слитых белков нежелательна, поскольку это ограничивает срок хранения таких молекул для исследований, а также для терапевтических целей. По существу, разработали стратегию для улучшения стабильности этих молекул. Анализ трехмерных структур альбумин-связывающих доменов, депонированных в банке данных Protein Data Bank, свидетельствует, что аминокислотная последовательность TIDQWL (SEQ ID NO: 42), обнаруженная на N-конце от начала нативного ABD (SEQ ID NO: 1), структурно упорядочена как часть первой альфа-спирали этой молекулы в нескольких кристаллических структурах (например, PDB 2VDB, Acta Cryst 2008 г., F64, 64-69). Этим она отличается от первоначальной структуры ЯМР ABD, которая показала, что эта область не упорядочена в растворе (PDB 1GAB, Johansson et al., J. Mol. Biol. 266:859-865, 1997 г.) . Таким образом, была выдвинута гипотеза, что расширение этой первой альфа-спирали последовательностей ABD и ABDCon может придать такой области большую стабильность, так как расширение альфа-спиралей может придать большую стабильность такой спирали (Su et al., Biochemistry 33:15501-15510, 1994 г.).
Множественное выравнивание последовательностей природных альбумин-связывающих доменов, представленное в табл. 1, не обнаружило четкой консенсусной последовательности для этих N-концевых остатков. Однако на N-конце в 5 из этих белковых доменов присутствует одна пептидная последовательность TIDEWL (SEQ ID NO: 43). Таким образом, присоединением последовательности TIDEWL к Nконцу ABDCon создали новый конструкт ABDCon12 (SEQ ID NO: 44). Этот белок экспрессировали с Nконцевой полигистидиновой меткой и очистили до гомогенности, применяя стандартные способы аффинной хроматографии на никелевой агарозе и эксклюзионной хроматографии. Очищенный ABDCon12 инкубировали при 37°С в ФСБ в течение 28 дней, а стабильность оценивали с помощью ДСН-ПААГэлектрофореза и масс-спектрометрии. ДСН-ПААГ-электрофорез показал слегка более быструю схему миграции после 14 дня, что указывает на распад. Однако анализ общей массы продемонстрировал, что этот распад происходит исключительно в полигистидиновой метке, а не в последовательности ABDCon12, что указывает на то, что последовательность TIDEWL улучшила стабильность ABDCon. Дополнительным доказательством стабильности выступает стабильность созданного слитого белка домена FN3 и ABDCon12 (фиг. 7В), в котором наблюдают значительно меньше продуктов распада в сравнении с первоначальными молекулами домена FN3 и ABDCon (фиг. 7А) в случае инкубации при 37°С в ФСБ в течение 28 дней.
Для исследования механизма стабилизации для этой молекулы определили температуру плавления ABDCon12 методом дифференциальной сканирующей калориметрии, применяя процедуру, описанную выше в примере 2. В ФСБ получили температуру плавления 90,9°С, на 9,4° выше по сравнению с исходной молекулой ABDcon, что позволяет предположить, что снижение протеолиза/распада, наблюдаемое для слитых белков ABDCon12 и ABDConl2, является результатом повышения конформационной стабильности, которое стало возможным благодаря расширению N-концевой альфа-спирали.
SEQ ID NO: 41: Tencon-ABDCon
MLPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYD LTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTTGGGGSGGGGSLKEAKEKAIEELKKAGITSDY YFDLINKAKTVEGVNALKDEILKAGGHHHHHH
SEQ ID NO: 42: N-концевая последовательность ABD из стрептококкового белка G
TIDQWL
SEQ ID NO: 43: N-концевая последовательность, присоединенная к ABDCon
TIDEWL
SEQ ID NO: 44: ABDCon12
TIDEWLLKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA
Пример 6. Характеризация ABDCon12.
Аффинность очищенного ABDCon12, связывающегося с человеческим и мышиным альбумином, определили методом поверхностного плазмонного резонанса, применяя те же способы, которые были описаны выше в примере 2. Для связывания ABDCon12 с человеческим и мышиным альбумином получили константы диссоциации 0,7 и 8,2 нМ соответственно. Способность ABDCon12 увеличивать период полужизни слитой молекулы в сыворотке продемонстрировали слиянием ABDCon12 с С-концом FNSдомена, который специфически связывает антиген. Эту молекулу ввели мышам интраперитонеальной инъекцией по 2 мг/кг и проанализировали так, как описано выше в примере 4. Для слитого белка из домена FN3 и ABDCon12 измеренный конечный период полужизни составил 55 ч.
Пример 7. Стабилизация альбумин-связывающих доменов.
- 12 036487
На основании анализа последовательностей природных альбумин-связывающих доменов ожидается, что другие последовательности, присоединяемые к N-концу альбумин-связывающих доменов, могут сделать их более стабильными. Например, для этих природных альбумин-связывающих доменов на Nконце имеются несколько разных последовательностей, таких как, без ограничений, APAVDV (SEQ ID NO: 45), IAKEKA (SEQ ID NO: 46), TIDQWL (SEQ ID NO: 42), VPAADV (SEQ ID NO: 47), TVKSIE (SEQ ID NO: 48), TPAVDA (SEQ ID NO: 49), TLKSIK (SEQ ID NO: 50), WEKAAA (SEQ ID NO: 51), AVDANS (SEQ ID NO: 52), QLAAEA (SEQ ID NO: 53), ALKAAA (SEQ ID NO: 54), EKLAAA (SEQ ID NO: 55). Присоединение этих последовательностей к альбумин-связывающим доменам может увеличить стабильность, если эти последовательности сформируют более длинные альфа-спирали. Кроме того, предполагается, что искусственные пептиды, которые увеличивают длину альфа-спирали или стабильность, будут также стабилизировать альбумин-связывающие домены.
Можно создать варианты с дополнительными N-концевыми последовательностями, применяя стандартные методики, и провести испытания их свойств так, как описано выше.
Ясно, что применение изобретения на практике может отличаться от приведенного в предшествующем описании и примерах. Многочисленные модификации и вариации настоящего изобретения возможны с учетом вышеизложенных идей, а, следовательно, в рамках прилагаемой формулы изобретения.
Claims (11)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Выделенный искусственный альбумин-связывающий домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 21-34.
- 2. Выделенный альбумин-связывающий домен по п.1, дополнительно содержащий расширение из 6 аминокислот на своем N-конце.
- 3. Выделенный альбумин-связывающий домен по п.2, в котором расширение из 6 аминокислот содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 42, 43, 45-55.
- 4. Выделенный альбумин-связывающий домен по п.2, в котором расширение из 6 аминокислот содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43.
- 5. Выделенный альбумин-связывающий домен по п.2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44.
- 6. Слитый белок для доставки биоактивного агента, содержащий альбумин-связывающий домен по π. 1 и указанный биоактивный агент.
- 7. Слитый белок по п.6, в котором биоактивным агентом является белковый каркас, специфически связывающийся с молекулой-мишенью.
- 8. Слитый белок по п.7, в котором белковый каркас включает аминокислотные остатки 1-90 последовательности SEQ ID NO: 39.
- 9. Слитый белок по п.6, в котором альбумин-связывающий белок и биоактивный агент функционально связаны линкером.
- 10. Слитый белок по п.9, в котором линкер представляет собой линкер Gly-Ser.
- 11. Слитый белок по п.9, в котором линкер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261651642P | 2012-05-25 | 2012-05-25 | |
| US201361776918P | 2013-03-12 | 2013-03-12 | |
| PCT/US2013/042429 WO2013177398A2 (en) | 2012-05-25 | 2013-05-23 | Non-natural consensus albumin binding domains |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201590136A1 EA201590136A1 (ru) | 2016-02-29 |
| EA036487B1 true EA036487B1 (ru) | 2020-11-16 |
Family
ID=49622071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201590136A EA036487B1 (ru) | 2012-05-25 | 2013-05-23 | Искусственный альбумин-связывающий домен и содержащий его слитый белок для доставки биоактивного агента |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9156887B2 (ru) |
| EP (1) | EP2855509B1 (ru) |
| JP (3) | JP2015519345A (ru) |
| KR (1) | KR102053674B1 (ru) |
| CN (1) | CN104470944B (ru) |
| AU (2) | AU2013266215B2 (ru) |
| BR (1) | BR112014029409B1 (ru) |
| CA (1) | CA2874646C (ru) |
| DK (1) | DK2855509T3 (ru) |
| EA (1) | EA036487B1 (ru) |
| ES (1) | ES2670442T3 (ru) |
| HK (1) | HK1209134A1 (ru) |
| IL (2) | IL235808A (ru) |
| MX (1) | MX355041B (ru) |
| PT (1) | PT2855509T (ru) |
| WO (1) | WO2013177398A2 (ru) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9695228B2 (en) | 2012-11-21 | 2017-07-04 | Janssen Biotech, Inc. | EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules |
| US10093921B2 (en) * | 2013-03-14 | 2018-10-09 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Scaffolded peptidic libraries and methods of making and screening the same |
| CN107531771A (zh) * | 2015-04-29 | 2018-01-02 | 意大利梅迪奥兰制药公司 | 可溶性嵌合白细胞介素‑10受体和其治疗用途 |
| WO2016204884A1 (en) * | 2015-06-18 | 2016-12-22 | Albert Einstein College Of Medicine, Inc. | Fgf receptor ligands for treating diabetes and obesity |
| CN106699842B (zh) * | 2015-11-17 | 2020-06-12 | 上海交通大学 | 一种新的抗炎小分子多肽及其应用 |
| EP3423480A1 (en) | 2016-03-01 | 2019-01-09 | The Board of Trustees of the University of Illinois | L-asparaginase variants and fusion proteins with reduced l-glutaminase activity and enhanced stability |
| EP3554561B1 (en) | 2016-12-14 | 2023-06-28 | Janssen Biotech, Inc. | Cd137 binding fibronectin type iii domains |
| EP3932432A1 (en) | 2016-12-14 | 2022-01-05 | Janssen Biotech, Inc. | Cd8a-binding fibronectin type iii domains |
| EP3574094A4 (en) | 2017-01-24 | 2020-11-11 | Northwestern University | LOW MOLECULAR WEIGHT ACTIVE VARIANTS OF ANGIOTENSIN II CONVERTING ENZYME (ECA II) |
| ES2965372T3 (es) | 2017-08-11 | 2024-04-15 | Univ Illinois | Variantes de L-asparaginasa de cobaya truncada y métodos de uso |
| EP3765496A1 (en) | 2018-03-13 | 2021-01-20 | Affibody AB | Polypeptides based on a novel scaffold |
| KR102282240B1 (ko) * | 2018-12-06 | 2021-07-28 | 경상국립대학교산학협력단 | 지속형 엑센딘-4 및 이의 용도 |
| WO2021076546A1 (en) | 2019-10-14 | 2021-04-22 | Aro Biotherapeutics Company | Cd71 binding fibronectin type iii domains |
| WO2021076574A2 (en) | 2019-10-14 | 2021-04-22 | Aro Biotherapeutics Company | Fn3 domain-sirna conjugates and uses thereof |
| AU2020405107A1 (en) * | 2019-12-18 | 2022-07-14 | Aro Biotherapeutics Company | Serum albumin-binding fibronectin type III domains and uses thereof |
| CN113336860B (zh) * | 2021-06-02 | 2022-07-01 | 北京大学 | 一种具有靶向和长效功能的重组水蛭素融合蛋白及其编码基因和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6162903A (en) * | 1992-05-07 | 2000-12-19 | Actinova Limited | Immunoglobulin binding proteins derived from L protein and their uses |
| US20120100165A1 (en) * | 2009-02-10 | 2012-04-26 | University Of The Ryukyus | Drug transporter, and adjuvant and vaccine each utilizing same |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6267964B1 (en) | 1989-08-01 | 2001-07-31 | Affibody Technology Sweden Ab | Stabilized protein or peptide conjugates able to bond albumin having extended biological half-lives |
| AU5670194A (en) | 1992-11-20 | 1994-06-22 | Enzon, Inc. | Linker for linked fusion polypeptides |
| US6670127B2 (en) | 1997-09-16 | 2003-12-30 | Egea Biosciences, Inc. | Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide |
| EP1015576B1 (en) | 1997-09-16 | 2005-05-04 | Egea Biosciences, LLC | Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes |
| US20050287153A1 (en) | 2002-06-28 | 2005-12-29 | Genentech, Inc. | Serum albumin binding peptides for tumor targeting |
| PT1240337E (pt) | 1999-12-24 | 2007-01-31 | Genentech Inc | Métodos e composições para prolongar as meias-vidas de eliminação de compostos bioactivos |
| EP2190863B1 (en) | 2007-07-31 | 2015-09-02 | Affibody AB | New albumin binding compositions, methods and uses |
| CA2729567C (en) | 2008-06-30 | 2018-04-24 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Anti-cd27 antibody |
| PL2356269T3 (pl) * | 2008-10-31 | 2016-12-30 | Kompozycje białek rusztowania oparte na domenie fibronektyny typu III, sposoby i zastosowania | |
| MX2011008566A (es) | 2009-02-12 | 2011-11-29 | Janssen Biotech Inc | Composiciones supercontigo basadas en el dominio de fibronectina tipo iii, metodos y usos. |
| EP2437767B1 (en) * | 2009-06-01 | 2015-07-08 | MedImmune, LLC | Molecules with extended half-lives and uses thereof |
| SG184310A1 (en) | 2010-04-13 | 2012-10-30 | Celldex Therapeutics Inc | Antibodies that bind human cd27 and uses thereof |
| HUE029622T2 (en) * | 2010-04-30 | 2017-03-28 | Janssen Biotech Inc | Stabilized fibronectin preparations, processes and applications |
| US9695228B2 (en) | 2012-11-21 | 2017-07-04 | Janssen Biotech, Inc. | EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules |
-
2013
- 2013-05-23 MX MX2014014384A patent/MX355041B/es active IP Right Grant
- 2013-05-23 CN CN201380039335.8A patent/CN104470944B/zh active Active
- 2013-05-23 EA EA201590136A patent/EA036487B1/ru unknown
- 2013-05-23 KR KR1020147035989A patent/KR102053674B1/ko active IP Right Grant
- 2013-05-23 JP JP2015514183A patent/JP2015519345A/ja not_active Withdrawn
- 2013-05-23 WO PCT/US2013/042429 patent/WO2013177398A2/en active Application Filing
- 2013-05-23 CA CA2874646A patent/CA2874646C/en active Active
- 2013-05-23 AU AU2013266215A patent/AU2013266215B2/en active Active
- 2013-05-23 DK DK13793564.9T patent/DK2855509T3/en active
- 2013-05-23 ES ES13793564.9T patent/ES2670442T3/es active Active
- 2013-05-23 PT PT137935649T patent/PT2855509T/pt unknown
- 2013-05-23 EP EP13793564.9A patent/EP2855509B1/en active Active
- 2013-05-23 US US13/901,013 patent/US9156887B2/en active Active
- 2013-05-23 BR BR112014029409-7A patent/BR112014029409B1/pt active IP Right Grant
-
2014
- 2014-11-20 IL IL235808A patent/IL235808A/en active IP Right Grant
-
2015
- 2015-09-01 US US14/842,218 patent/US20160083436A1/en not_active Abandoned
- 2015-10-06 HK HK15109729.2A patent/HK1209134A1/xx unknown
-
2017
- 2017-09-20 US US15/710,385 patent/US10280200B2/en active Active
- 2017-09-24 IL IL254652A patent/IL254652B/en active IP Right Grant
- 2017-11-17 AU AU2017261625A patent/AU2017261625B2/en active Active
-
2018
- 2018-06-18 JP JP2018115294A patent/JP7166081B2/ja active Active
-
2020
- 2020-09-23 JP JP2020158256A patent/JP2021019595A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6162903A (en) * | 1992-05-07 | 2000-12-19 | Actinova Limited | Immunoglobulin binding proteins derived from L protein and their uses |
| US20120100165A1 (en) * | 2009-02-10 | 2012-04-26 | University Of The Ryukyus | Drug transporter, and adjuvant and vaccine each utilizing same |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LEJON, S. et al. Structural Basis For The Binding Of Naproxen To Human Serum Albumin in The Presence Of Fatty Acids And The GA Module. Acta Crstallographica Section F: Structural Biology And Crystallization Communications. 01 February 2008; Vol. 64, No.2, pp 64-69; page 64, Introduction, first paragraph; page 64, third paragraph to page 65, left column, first paragraph; page 65, right column, second paragraph; DOI:10.1107/S174430910706770X; and accompanying NCBI Submission, Accession 2VDB_B GI:168988719, Deposited 04 October 2007, <URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=62694> * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7166081B2 (ja) | 非天然コンセンサスアルブミン結合ドメイン | |
| US9260496B2 (en) | Fibronectin based scaffold domain proteins that bind IL-23 | |
| KR102461666B1 (ko) | 혈청 알부민 결합 피브로넥틴 iii 형 도메인 | |
| WO2012171541A1 (en) | Human fusion proteins comprising interferons and hetero-dimeric modified ubiquitin proteins | |
| Baumann et al. | Identification of a potential modification site in human stromal cell‐derived factor‐1 | |
| EA045108B1 (ru) | Выделенный искусственный альбумин-связывающий домен и содержащий его слитый белок | |
| JP6525171B2 (ja) | 環状化サイトカイン及びその製法 | |
| Oshiro et al. | Imparting albumin-binding affinity to a human protein by mimicking the contact surface of a bacterial binding protein | |
| CA3224586A1 (en) | Human fibronectin type iii protein scaffolds | |
| CN116261568A (zh) | 用于补体因子h(cfh)的结合蛋白 | |
| CN115175691A (zh) | 结合血清白蛋白的纤连蛋白iii型结构域及其应用 |