CN113336860B - 一种具有靶向和长效功能的重组水蛭素融合蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有靶向和长效功能的重组水蛭素融合蛋白及其编码基因和应用。所述融合蛋白，由“促凝血小板”靶向结合肽、水蛭素，以及白蛋白结合结构域融合组成。该融合蛋白具有前药性质，能体内快速激活、发挥抗血栓形成效应；且和水蛭素的效应相当，但抗凝效应的持续时间和水蛭素相比显著延长，出血时间和水蛭素相比显著减少，接近于生理盐水的水平，系统性出血风险非常低，具有广阔的应用前景。

Description

一种具有靶向和长效功能的重组水蛭素融合蛋白及其编码基 因和应用

技术领域

本发明涉及一种具有靶向和长效功能的重组水蛭素融合蛋白及其编码基因，及其在抗凝、预防血栓形成中的应用，本发明属于生物技术领域。

背景技术

心脑血管疾病是严重危害人类生命健康的最常见疾病，在人群的死亡原因中排名第一，具有发病率高、致残率高、致死率高、复发率高以及并发症多的特点。世界卫生组织于2018年5月公布了2016年全球前10位的死亡原因，当年5690万死亡病例中，约有1/ 3死于心血管疾病和脑卒中(Global Health Estimates 2016:Deaths by Cause,Age,Sex, byCountry and by Region,2000-2016.Geneva,World Health Organization；2018)。因此，如何通过有效的预防手段和治疗手段，降低心脑血管疾病的发病率和致死率，已经成为一个亟待解决的重大公共卫生问题。

血栓是血流在心血管系统血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块，由聚集的血小板，纤维蛋白和其他聚集的细胞(如白细胞、红细胞等)组成，血栓堵塞血管可引起多种心脑血管疾病，包括脑卒中(CVA)、深静脉血栓(DVT)、肺栓塞(PE)、急性冠脉病例综合征(ACS)等。预防血栓形成是减少这些疾病发生，以及血栓治疗后预防其再形成的最重要的手段。抗血栓形成药包括抗血小板聚集药和抗凝药。

传统的抗凝药物肝素、低分子量肝素和华法林应用广泛，然而这些药物属于多靶点抗凝药物，药效学或药动学存在不可预测性，需要持续检测，有严重不良反应，如出血等(T. Wilkins,B.Wheeler,M.Carpenter,Upper Gastrointestinal Bleeding in Adults:Evaluation and Management,Am Fam Physician,101(2020)294-300)。新型抗凝药物为靶点专一的药物，针对特异的凝血因子，例如抑制凝血酶的水蛭素、阿加曲班等，抑制 FXa因子的利伐沙班、阿哌沙班等。近年来，针对其它凝血因子如TF/VIIa复合物、FIXa、 FVa和FVIII因子的抑制剂正处于各研究阶段(N.Mackman,W.Bergmeier,G.A.Stouffer,J.I.Weitz,Therapeutic strategies for thrombosis：new targets and approaches,Nat Rev Drug Discov,19(2020)333-352)。尽管这种靶点特异的抗凝药相比肝素等传统抗凝药有更高的效应和安全性，但仍有较高的出血风险(U.Baber,I.Mastoris,R. Mehran,Balancing ischaemia and bleeding risks with novel oral anticoagulants, NatRev Cardiol.2014(12)：693-703.)。

与肝素、枸橼酸纳、华法林等传统的抗凝血药物不同，水蛭素能够和凝血酶以非共价键的形式形成1:1的复合物，而不依赖其他的辅助因子，产生抗凝作用。此外，水蛭素不仅能抑制游离的凝血酶，还能和血栓中的凝血酶结合，产生抗血栓作用(Markwardt F,Kaiser B,Richter M.Haemostyptic effects of batroxobin with regard to hirudintreatment.Thromb Res,1992,68(6):475-482)。

重组水蛭素来匹卢定(lepirudin)是第一个被批准用于临床的凝血酶抑制剂(Greinacher A,Warkentin T.The direct thrombin inhibitor hirudin[J].Thrombosisand Haemostasis，2017,99(11):819-829)，在1997年和1998年先后被欧洲医学评价机构(EMEA)及美国FDA批准上市，用于治疗肝素诱导引起的血小板减少症(HIT)并发的血栓形成。随后另一个重组水蛭素地西卢定(desirudin)也被批准用于矫形外科术后血栓形成的预防(Markwardt F.Hirudin as alternative anticoagulant--a historicalreview.Semin Thromb Hemost,2002,28(5):405-414；Coppens M,Eikelboom J W,Gustafsson D,et al.Translational success stories：development of directthrombin inhibitors.Circ Res，2012，111(7):920-929)。重组水蛭素一般用于急性心血梗死溶栓治疗的辅助药以预防冠脉再闭塞，动、静脉血栓性疾病的防治、播散性血管内凝血的抗凝治疗，也可用于ATIII缺乏症和血小板减少症时的抗凝剂，在血管成形术后的抗凝治疗、不稳定型心绞痛等方面都显示出比较好的应用前景。

尽管重组水蛭素作为一种有效预防血栓的药物，尽管具有多种优点：迄今发现的最强的天然凝血酶抑制剂、低免疫原性、毒性低等(Lu W,Cai X,Gu Z,et al.Productionand characterization of hirudin variant-1by SUMO fusion technology in E.coli[J]. Mol Biotechnol,2013,53(1):41-48)。但因其对凝血酶的强抑制作用，伴有全身或系统性出血风险Loscalzo J.Thrombin inhibitors in fibrinolysis.A Hobson's choiceof alternatives.Circulation,1996，94(5)：863-865)；同时还具有较高的肾清除率，半衰期短，不到1小时，给药频繁，限制了其临床应用(Markwardt F,Nowak G,Sturzebecher U,et al.Studies on the pharmacokinetics of hirudin.Biomed Biochim Acta, 1987,46(4):237-244)。因此，在不降低水蛭素药理学活性的前提下，延长半衰期、降低其出血风险是一个亟待解决的关键问题。

活化的血小板在止血和血栓形成中具有双重作用，一方面，它们聚集在血管损伤部位形成血小板塞以达到快速止血；另一方面，其为凝血因子的组装(形复合物)提供表面场所，激活凝血系统。近年来发现，这两种功能是由不同的血小板亚群实现的。止血功能由常规血小板执行；促进凝血系统激活的功能由“促凝血小板”(procoagulant platelets)执行(Podoplelova N A,Sveshnikova A N,Kotova Y N,et al.Coagulation factorsbound to procoagulant platelets concentrate in cap structures to promoteclotting. Blood,2016,128(13):1745-1755；Hua V M,Abeynaike L,Glaros E,etal.Necrotic platelets provide a procoagulant surface during thrombosis.Blood,2015,126(26):2852-2862；Agbani E O,van den Bosch M T,Brown E,et al.CoordinatedMembrane Ballooning and Procoagulant Spreading in HumanPlatelets.Circulation, 2015,132(15):1414-1424.)。如图1所示，“促凝血小板”内Ca²⁺浓度增加时，磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)会从血小板内膜翻转到血小板外膜；外膜上的PS为凝血因子(以FVa和FXa为主)提供锚定场所，FVa和FXa结合形成“促凝血酶复合物”，其使凝血酶原转变成凝血酶，进而启动凝血(Agbani E O,Poole A W.Procoagulantplatelets:generation,function,and therapeutic targeting in thrombosis.Blood,2017,130(20):2171-2179)。因此，靶向“促凝血小板”而递送水蛭素可以将其递送至凝血起始处局部富集，并且可以利用“促凝血小板”表面丰富的FXa因子进行水蛭素前药的剪切激活。

白蛋白是血液中丰度最高的蛋白，约占全部血浆蛋白的50％。由于Fc受体(FcRn)介导的再循环和Megalin/Cubilin-complex逃离肾清除，人血清白蛋白(Human serumalbumin，HSA)表现出大约19天的长半衰期。将HSA与蛋白/多肽药物通过基因重组做成融合蛋白，可以显著改善蛋白及多肽药物的半衰期(Larsen M T,Kuhlmann M,Hvam M L,etal.Albumin-based drug delivery:harnessing nature to cure disease. Molecularand Cellular Therapies,2016,4(1))，例如Albiglutide(阿必鲁肽)是 GLP1-HSA融合蛋白，为长效的GLP1类似物，2014年EMEA批准用于2型糖尿病治疗，一周一次给药(Davis P N,Ndefo U A,Oliver A,et al.Albiglutide:A once-weekly glucagon-like peptide-1receptor agonist for type 2diabetes mellitus.American Journal of Health-System Pharmacy,2015，72(13):1097-1103.)。Idelvion是重组凝血因子FIX和白蛋白融合组成FIX-HSA，2016年被FDA批准，和单独的FIX相比，半衰期延长能达16天，大大减少了注射频率(Zhang Y,Roberts J,Bensen-Kennedy D,et al.Population pharmacokinetics ofa new long-acting recombinant coagulation factor IX albumin fusion proteinfor patients with severe hemophilia B.Journal of Thrombosis and Haemostasis,2016,14(11):2132-2140)。

由于人白蛋白分子量较大(约70kd)，其再和较大的蛋白融合则会加大下游表达纯化等工艺的难度。有研究者采用另一种策略，即目的蛋白与内源性白蛋白结合(搭车方式)形成复合物达到目的蛋白在体内长循环。据报道，由天然链球菌G蛋白改造而成的白蛋白结合结构域(albumin binding domain，ABD)对血清白蛋白具有很强的结合力，如 ABD035变体是一种由46个氨基酸组成的多肽，和白蛋白有高效特异结合作用，形成稳定的复合物，其与白蛋白的亲合力可高达fM级(Jonsson A,Dogan J,Herne N,et al. Engineering of afemtomolar affinity binding protein to human serum albumin. ProteinEngineering Design and Selection,2008,21(8)：515-527)。

本发明的目的是寻找一种可以精准抗凝的物质，在预防血栓的同时具有很低的出血风险。设计包含三个方面：1)抗凝药为前药，只在凝血部位才激活起效，避免全身性出血风险；2)在凝血部位更有效富集，提高抗凝效应；3)抗凝药长效，避免频繁给药。

我们对水蛭素进行设计改造，根据上述三种功能要求设计由三个功能结构域组成的“靶向性长效水蛭素前药”。

前期我们设计了水蛭素融合蛋白Annexin V-hirudin 3-ABD(hAvHA)(H.H.Han，H.T. Zhang，R.Wang，Y.Yan，X.Liu，Y.Wang，Y.Zhu，J.C.Wang，Improving longcirculation and procoagulant platelet targeting by engineering of hirudinprodrug， International Journal of Pharmaceutics，589(2020)119869)，其组合元件Annexin V 可以和“促凝血小板”表面的磷酯酰丝氨酸结合，ABD035可以和白蛋白高亲和力结合，水蛭素变体3(hirudin variant 3)为抗凝核心。实验表明该水蛭素前药融合蛋白hAvHA 具有前药性质，能够被FXa剪切激活起抗凝作用，能够靶向结合“促凝血小板”，并且能体外和白蛋白高效结合，和水蛭素相比能显著减少小鼠割尾实验出血时间；但hAvHA和水蛭素相比并不能显著延长体内的药效时间，说明其在体内并不能通过白蛋白而延长半衰期。白蛋白及其融合蛋白能够在体内长效是因为其可以和受体FcR结合，进而吞入进入细胞，并不被细胞降解而再次从细胞中分泌出来，达到长循环的效果(C.Chaudhury，S.Mehnaz，J.M.Robinson，W.L.Hayton,D.K.Pearl,D.C.Roopenian，C.L.Anderson, Themajor histocompatibility complex-related Fc receptor for IgG(FcRn)bindsalbumin and prolongs its lifespan,J Exp Med,197(2003)315-322)。我们推测，融合蛋白hAvHA的大小为50.4kd，白蛋白的大小为66.5kd，二者结合的二元复合物分子量比较大，其很可能影响了白蛋白再和FcR的结合形成三元复合物，进而阻碍了白蛋白发挥长循环特性。

因此，在本发明中，我们在前期研究的基础上，重新设计包含水蛭素前药、白蛋白结合功能、“促凝血小板”靶向三种功能的水蛭素前药融合蛋白。将35kd分子量的annexin V替换为六肽R824(PGDLSR)，能与PS高亲和力特异性结合，IC₅₀为1.38×10^-9M(Burtea C,Laurent S,Lancelot E,et al.Peptidic Targeting of Phosphatidylserine for theMRI Detection of Apoptosis in Atherosclerotic Plaques.MolecularPharmaceutics, 2009,6(6)：1903-1919；Wuest M,Perreault A,Kapty J,et al.Radiopharmacological evaluation of 18F-labeled phosphatidylserine-binding peptidesfor molecular imaging of apoptosis.Nuclear Medicine and Biology,2015,42(11):864-874)，但显著减小了水蛭素融合蛋白的分子量，使其能够体内结合白蛋白而发挥长循环特性，延长水蛭素的半衰期。并将水蛭素变体3替换成了水蛭素变体2(hirudin variant2)。

本发明对重新设计的水蛭素前药融合蛋白R824-HV-ABD和ABD-HV-R824进行了克隆、表达和纯化，发现整个水蛭素融合蛋白的分子量显著减小后，其在大肠杆菌表达中更容易的获得了高产量的、可溶性的表达，有利于规模性生产。并利用大鼠体内抗颈动脉血栓模型和小鼠割尾模型对该水蛭素前药的药理活性、出血时间进行评价，发现水蛭素融合蛋白R824-HV-ABD和ABD-HV-R824具有前药的性质，能高效体内激活；体内抗血栓形成效应的时间和水蛭素相比显著延长，说明其能结合体内白蛋白而增加循环时间；水蛭素前药的出血副作用风险远低于水蛭素，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的水蛭素出血风险高、半衰期短的问题。基于此目的，本发明设计具有靶向富集、长效循环、局部激活、精准抗凝的白蛋白结合型长效靶向重组水蛭素前药(图 2)。

本发明具体采用了以下技术手段：

设计一种重组水蛭素融合蛋白，其结构为：[R]_n-[H]_m-[A]_k，或[A]_k-[H]_m-[R]_n，其中， R为促凝血小板靶向结合肽的结构域，或其片段或变体；H为包含水蛭素元件的结构域，或其片段或变体；A为包含白蛋白结合肽的结构域，或其片段或变体；n,m,k为≥1的整数；

任选的，所述融合蛋白，还可以包含可以被凝血因子X(FXa)酶切的结构域[X]_p,其中p为≥1的整数，所述的结构域[X]选自：IEGR、PQGR、IQGR、IDGR、EKGR、PRAR、YRGR、 LQGR、LRWR、QQGR、RLGR、PSGR、LLQR、SQGR，或其片段或变体，或其他能够被凝血因子 X识别切割的多肽或其片段或变体。

本发明所述的重组水蛭素融合蛋白，所述的促凝血小板靶向结合肽为可以和细胞表面磷酯酰丝氨酸结合的多肽或其片段或变体。

本发明所述的重组水蛭素融合蛋白，所述的促凝血小板靶向结合肽选自具有如下序列的多肽：SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12。

本发明所述的重组水蛭素融合蛋白，其中优选的水蛭素元件选自水蛭素变体2(hirudin variant-2，HV2)，其氨基酸序列：SEQ ID NO.13。

本发明所述的重组水蛭素融合蛋白，其中所述的白蛋白结合结构域，为由天然链球菌 G蛋白改造而成的能够与白蛋白结合的结构域(albumin binding domain，ABD)或其片段或变体。

本发明所述的重组水蛭素融合蛋白，优选的，其中所述的白蛋白结合结构域是ABD035，其氨基酸序列：SEQ ID NO.14。

本发明所述的重组水蛭素融合蛋白，优选R824-HV-ABD，其氨基酸序列：SEQ IDNO.1 和ABD-HV-R824，其氨基酸序列：SEQ ID NO.2。

本发明进一步提供一种核酸分子，其含有编码本发明所述的重组水蛭素融合蛋白的多核苷酸，优选的核苷酸序列选自SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。

本发明还提供一种表达载体，其含有本发明所述的任一核苷酸序列。

本发明还提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的任一种表达载体。

本发明的重组水蛭素融合蛋白，其中该蛋白多肽序列与SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2 所示的序列一致性是大于80％，优选大于90％，更优选大于95％，更优选大于96％，甚至更优选大于97％，更优选大于98％，更优选大于99％，最优选是与SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2 所示的序到一致。

本发明还提供一种制备本发明水蛭素融合蛋白的方法，其特征在于：水蛭素融合蛋白的计算机辅助设计、大肠杆菌可溶性表达、镍亲和纯化。

本发明还提供一种含有本发明所述的重组水蛭素融合蛋白的组合物或制剂，其包含药学上可接受的载体或赋形剂。以及一种纳米粒或微粒，其包含本发明所述的重组水蛭素融合蛋白。

本发明所述的重组水蛭素融合蛋白、组合物或制剂、纳米粒子具有抗凝血、治疗血栓或预防血栓形成的作用。

本发明还提供一种延长水蛭素在哺乳动物中的半衰期并提高其靶向性的方法，所述方法包括，使得所述水蛭素蛋白与促凝血小板靶向结合肽，以及白蛋白结合肽融合产生如本发明所述的重组融合蛋白，籍此延长水蛭素蛋白的半衰期，并提高凝血起始处靶向性。

本发明还提供一种降低水蛭素在哺乳动物中的引起出血风险等副作用的方法，所述方法包括，使得所述水蛭素蛋白与促凝血小板靶向结合肽，以及白蛋白结合肽融合产生如本发明所述的重组融合蛋白，籍此显著减少水蛭素在哺乳动物中的出血风险。

本发明的水蛭素融合蛋白，其中“促凝血小板”结合肽有利于结合“促凝血小板”达到在凝血部位靶向富集；白蛋白结合域有利于体内结合内源性白蛋白达到长循环，延长水蛭素的半衰期；水蛭素N端和C端都被封闭，使水蛭素融合蛋白处于前药状态，当融合蛋白靶向富集到凝血部位后，被FXa快速、高效剪切激活，释放游离水蛭素。

本发明对上述融合蛋白进行了克隆、表达和纯化，并利用体外体内模型对其进行了评价；体外实验发现水蛭素融合蛋白在能和促凝血小板结合，能和人白蛋白高亲和力结合，能被FXa因子剪切而激活水蛭素前药；大鼠体内抗颈动脉血栓模型表明水蛭素融合蛋白能激活，发挥出水蛭素相当的抗颈动脉血栓形成效果，并且药效持续时间远大于水蛭素；小鼠割尾模型发现水蛭素融合蛋白的出血时间远远低于水蛭素，具有更低的出血风险和更好的安全性。

本发明的提出为增加水蛭素的药效时间、降低系统性出血风险，促进其在抗凝、预防血栓形成药物中的应用提供了一种新的技术手段，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1，“促凝血小板”膜表面磷脂酰丝氨酸外翻与凝血系统启动示意图；

图2，水蛭素前药设计思路示意图；

图3，水蛭素融合蛋白R824-HV-ABD和ABD-HV-R824组成示意图；

图4，水蛭素融合蛋白R824-HV-ABD和ABD-HV-R824同源模建图；

图5，水蛭素融合蛋白R824-HV-ABD表达质粒构建图

图6，水蛭素融合蛋白ABD-HV-R824表达质粒构建图

图7，水蛭素融合蛋白R824-HV-ABD和ABD-HV-R824表达纯化图；B：菌体表达后超声裂解，离心取上清进行SDS-PAGE电泳，融合蛋白为可溶性表达；C和D:R824-HV-ABD 与ABD-HV-R824镍柱亲和纯化，条带较为单一，其纯度约为80-90％；

图8，R824-HV-ABD的nano-LC-MS/MS(含酶切)分析；

图9，ABD-HV-R824的nano-LC-MS/MS(含酶切)分析；

图10，R824-HV-ABD的飞行时间质谱图；

图11，ABD-HV-R824的飞行时间质谱图；

图12，R824-HV-ABD和ABD-HV-R824的前药及激活性质。A，融合蛋白体外被FXa剪切激活的抗凝血酶活性(时间曲线)；B，融合蛋白体外被FXa剪切激活的抗凝血酶活性(剂量曲线)；

图13，R824-HV-ABD和ABD-HV-R824与人白蛋白(HSA)体外结合；A，非还原性凝胶电泳分析融合蛋白和HSA之间的相互作用。固定HSA的浓度为5μM，使融合蛋白和HSA 的摩尔比为5:0、0:2、2:5。B，表面等离子共振法(SPR)分析融合蛋白和HSA之间的相互作用；

图14，R824-HV-ABD和ABD-HV-R824与促凝血小板的结合。融合蛋白FITC荧光标记，流式细胞术检测其与促凝血小板的结合；

图15，R824-HV-ABD和ABD-HV-R824抗大鼠颈动脉血栓形成；

图16，小鼠割尾模型检测水蛭素以及水蛭素融合蛋白给药后小鼠的出血时间。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1、水蛭素前药融合蛋白的设计

本发明的目的是解决水蛭素出血风险高、半衰期短的问题。基于此，本发明设计了由三种功能结构域组成的“靶向性长效水蛭素前药”——水蛭素融合蛋白，使其具有靶向富集、长效循环、局部激活、精准抗凝的特点(图2)。

1、本发明发明人在NCBI蛋白质库网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)中获取了水蛭素变体2(hirudin variant-2，HV2)多肽的序列(UniProtKB/Swiss-Prot:P09945.1，序列SEQ ID NO.13)。R824肽，由6个氨基酸(PGDLSR，序列SEQ ID NO.5) 组成，能与PS高亲和力特异性结合，IC₅₀为1.38×10^-9M，做为靶向“促凝血小板”的靶头可将含R824的融合蛋白靶向“促凝血小板”而富集。从已报道文献中获得白蛋白结合结构域(albuminbinding domain，ABD)ABD035的序列(序列SEQ ID NO.14)。

2、使HV2居中，ABD035和R824分别位于其两侧，由柔性linker(GGGS)₃连接成融合蛋白R824-HV-ABD(氨基酸序列SEQ ID NO.1)和ABD-HV-R824(氨基酸序列SEQ ID NO.2)，并引入FXa切割识别序列(IEGR)和组氨酸标签(图3)。

3、采用计算机辅助软件Discovery studio 2016，预测出融合蛋白的结构，如图4所示(组成融合蛋白的各元件的颜色和图3对应)。

实施例2、编码R824-HV-ABD和ABD-HV-R824蛋白的cDNA分子合成

1.根据大肠杆菌偏好密码子设计编码水蛭素融合蛋白的的基因序列，编码R824-HV-ABD 的cDNA序列为SEQ ID NO.3，和编码ABD-HV-R824的cDNA序列为SEQ ID NO.4。

2.序列合成、表达载体构建

委托上海捷瑞生物工程有限公司合成上述两条编码序列，并构建插入到pET30a载体中(以NdeI和XhoI为插入酶切位点)，获得重组质粒pET30a/R824-HV-ABD(图5)和pET30a/ABD-HV-R824(图6)，然后转化大肠杆菌克隆菌株E.coli JM101。提取重组质粒，经DNA测序验证正确。

将构建好的表达质粒pET30a/R824-HV-ABD和pET30a/ABD-HV-R824转入感受态E.coli BL21(DE3)菌株，获得BL21/pET30a-R824-HV-ABD和BL21/pET30a-ABD-HV-R824。

实施例3、目的蛋白的表达获取

1、根据《分子克隆指南》，首先将-20℃冻存的甘油菌(实施例2构建)1：1000接种于含有kan⁺(50μg/mL)的LB培养基中，37℃震荡过夜。

2、将上述震荡过夜的菌液1：100接种于含有kan⁺(50μg/mL)的LB培养基(NaCl1％，胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，高压蒸汽灭菌后待用)中，37℃快速震荡4～5h，至OD_600nm≈0.6左右，可每隔相应时间提取菌液进行OD_600nm的测定，并绘制成OD曲线来预测OD_600nm≈0.6的时间。

3、在进行诱导之前预降温30min，降温至诱导温度后，加入IPTG(0.5M)至终浓度诱导8h。

4、预先称重离心瓶，将过夜诱导的菌液4000rpm离心30min，倒掉培养基后收集菌体并称量湿重，如不立即使用可于-80℃冻存，通常可得到1.5～2g/L的菌液。

5、按照1.5～2g：30～40mL细胞裂解液的比例加入细胞超声裂解液重悬细胞，15～20 mL/50mL离心管分装好，放入压实的冰内超声破碎5min(40％功率，超声5s停10s)

6、破碎后的菌液9mL/10mL离心管分装，4℃，12000rpm离心10min，取上清保存为表达上清。

7、SDS-PAGE蛋白电泳分析表达结果：

融合蛋白表达后裂解离心后的上清提取物在SDS-PAGE电泳中的结果如图7B所示，可见R824-HV-ABD和ABD-HV-R824蛋白均有可溶性表达。

实施例4、目的蛋白的纯化

本实验中的实验方法主要根据《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克和公司提供的产品说明书进行操作。

1.溶液配制：

20mM咪唑缓冲液：20mM咪唑，500mM NaCl，20mM Tris-Cl，盐酸调整pH＝8.0；

50mM咪唑缓冲液：50mM咪唑，500mM NaCl，20mM Na₃PO₄，盐酸调整pH＝8.0；

150mM咪唑缓冲液：150mM咪唑，500mM NaCl，20mM Tris-Cl，盐酸调整pH＝8.0；2.BL21/pET30a-R824-HV-ABD和BL21/pET30a-ABD-HV-R824表达

1)取少量冻存的甘油菌(实施例3构建)接种于100mL含有kan⁺的LB培养基中， 37℃，200rpm振荡过夜；

2)将过夜振荡的菌株按照1:100接种于2L含有kan⁺的LB培养基中，37℃，300rpm快速振荡至OD₆₀₀＝0.6；

3)加入终浓度为0.05μM的IPTG，37℃，250rpm诱导4h或30℃诱导8h；

4)4000rpm常温离心30min，弃上清收集菌体。

5)每1.5～2g细胞重悬于30～40mL的20mM咪唑缓冲液中，冰上超声(130W，13min)，10000g，4℃离心10min，收集上清，为可溶蛋白。

3.镍柱亲和法纯化水蛭素融合蛋白

融合蛋白使用Ni亲和柱纯化，步骤如下：

1)样品的制备：根据上步提取到可溶蛋白溶液。

2)样品过滤：溶液分别用0.45μm滤膜和0.22μm滤膜过滤去除不溶物。

3)平衡：用5倍柱体积的ddH2O清洗柱子，置换柱子中的20％乙醇溶液，然后用5倍柱体积的上样缓冲液平衡柱子。

4)上样：周质蛋白溶液上样，5倍柱体积的上样缓冲液平衡至A280 nm吸收值基本保持不变。

5)目的蛋白洗脱：依次以10mM～500mM梯度浓度咪唑缓冲液洗脱柱子，收集洗脱液。

6)清洗柱子：依次用5倍柱体积的洗脱缓冲液、ddH2O、20％乙醇溶液清洗柱子，层析柱保存于4℃。

7)确定洗脱条件：通过SDS-PAGE检测各浓度洗脱液中目的蛋白的含量及纯度，确定最佳洗脱条件，并在之后的实验中应用。

8)收集纯化的蛋白：R824-HV-ABD的纯化如图7C所示，为250mM咪唑洗脱结果，收集洗脱液。ABD-HV-R824的纯化如图7D所示，为150mM咪唑洗脱结果，收集洗脱液。

9)在得到的较为纯净的目的蛋白样品中加入10％甘油，在预冷的去离子水中低温透析 8h(3.5kDa透析袋，每两小时更换一次去离子水)，以脱去溶液中的盐离子；

10)15mL/50mL离心管分装透析后的蛋白水溶液，于-80℃冰箱中，倾斜15°冻存样品6h，用封口膜替换盖子缠紧离心管口并扎孔，在-80℃中继续冷冻30分钟(此时可以打开真空冷干机预冷)；

11)30min后，将冻实的蛋白样品放入冷干机打开真空泵，在目测样品抽干后关闭冷干机，将得到目的蛋白样品迅速转移到-80℃冻存待用。

4.BCA法测定蛋白的浓度

1)根据样品数量，按照100μL试剂A+2μL试剂B/每孔的量配置BCA工作液，充分混匀；

2)准备蛋白标准品，按照梯度稀释用PBS配置10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.15625 mg/ml BSA；

3)按照2μL蛋白样品+100μL BCA工作液/孔比例混匀于96孔板中，37℃孵育30min；

4)在562nm处测定吸光值

5)绘制蛋白标准品浓度和吸光值的标准曲线

6)根据待测样品吸光值计算样品浓度

实施例5、水蛭素融合蛋白R824-HV-ABD和ABD-HV-R824的鉴定

1.nano-LC-MS/MS法鉴定水蛭素融合蛋白

1)实验方法：

将融合蛋白溶解在碳酸氢铵(50mM，pH 8.3)的溶液中，使其终浓度为1mg/mL，在95℃下加热15min，加入DTT(10mM)，并在65℃下孵育约15min。被还原的蛋白质用碘乙酰胺(10mM)在室温暗中烷基化45min。将测序级胰蛋白酶/Glu-C添加到蛋白质溶液中，在37℃下过夜消化，并用2％FA终止。胰蛋白酶消化物储存在-20℃。

将蛋白质(2μL)加载到C18预柱上，用Easy-LC nano-HPLC仪器，通过nano-LC-MS /MS进行分离。为了进行梯度分离，将H2O/FA(99.9：0.1)用作流动相A，而将ACN/ FA(99.9：0.1)用作流动相B。首先，对于B相，20min内从5％增加到30％，4min内从30％增至50％，然后用3min从50％增至100％，并在100％保持3min。流速为300nL /min。

质谱分析是使用LTQ Orbitrap Velos pro进行的。喷雾电压为2.2kV，毛细管温度为300℃。MS/MS谱图是通过数据依赖的碰撞诱导解离(CID)模式获得的，范围为35-2000 m/z，分辨率为60，000，选择MS的前15个最强离子。用于获取CID的参数如下：激活时间为10ms，归一化能量为35，Q激活为0.25。动态排除设置如下：重复计数1，持续时间30s，排除列表大小为500，排除持续时间30s。

数据库搜索和数据分析。使用Proteome Discoverer v1.4.1.14(ThermoScientific) 在已添加的UniProt Home数据库中搜索所有获得的MS/MS光谱。

2)实验结果：

检测结果如图8，图9及表1所示，检测到的多肽片段跟目标蛋白的覆盖率均在30％以上，表明融合蛋白R824-HV-ABD和ABD-HV-R824的序列中含有hirudin varaiant 2及 ABD的片段，与理论设计相符。

表1.融合蛋白RhHA的蛋白片段分析

2.MALDI-TOF/TOF法鉴定水蛭素融合蛋白

1)实验方法：

将0.5μL蛋白质上样到不锈钢靶标上，然后添加0.5μL复合物，该复合物为50％(v/v)20mg/mL SA的CAN溶液，并向其中添加了0.1％TFA。在配备有钕：钇铝石榴石激光(激光波长为349nm)的AB SCIEX MALDI TOF-TOF 5800分析仪上以线性正离子模式采集MALDI-TOF质谱。

2)实验结果：

通过飞行时间质谱测定融合蛋白的分子量，结果如图10，图11和由表2所示，纯化所得的融合蛋白分子量和理论一致(检测分子量和理论分子量的误差在10％以内)。

表2.MALDI-TOF/TOF检测融合蛋白的分子量

融合蛋白	理论分子量(道尔顿)	检测分子量(道尔顿)	误差(％)
				R824-HV-ABD	16447.99	16469.98	1.34
ABD-HV-R824	16447.99	16590.47	8.67

实施例6、水蛭素前药R824-HV-ABD和ABD-HV-R824体外被FXa剪切激活的性质鉴定1.目的和原理：

R824-HV-ABD和ABD-HV-R824的linker包含FXa可特异性识别的序列 Ile-Glu-Gly-Arg。在凝血启动时，融合蛋白在六肽R824的作用下靶向结合促凝血小板，而FXa聚集于促凝血小板表面，能将前药激活，达到局部激活的作用，从而发挥抗凝血酶的作用。本实验体外模拟FXa的切割作用，通过S-2238凝血酶底物法考察R824-HV-ABD和 ABD-HV-R824被FXa切割前后的抗凝血酶活性。

2.主要实验材料：

FXa，美国NEB公司；

凝血酶，美国Sigma公司；

S-2238，爱必信(上海)生物科技有限公司；

主要溶液：

FXa切割缓冲液：20mM Tris-HCl，100mM NaCl，2mM CaCl2，pH 8.0；

抗凝缓冲液：50mM Tris，150mM NaCl，0.1％BSA，PH 8.0；

S-2238溶液：1mg/mL的S-2238。

3.实验方法：

FXa切割融合蛋白：

400μL反应体系(FXa切割缓冲液)中，终浓度为0.05mg/mL的融合蛋白作为底物，加入8μL(1μg/μL)的Xa因子蛋白酶，于25℃温育5min、30min、3h、6 h，取45μL样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，根据电泳条带分子量的大小判断FXa剪切的效率。

S-2238凝血酶底物法考察融合蛋白活性参考文献(Sheffield W P，Eltringham-Smith L J,Bhakta V.A factor XIa-activatable hirudin-albumin fusion proteinreduces thrombosis in mice without promoting blood loss.BMC Biotechnology,2018,18(1))：

1)取样品40μL或不同浓度的水蛭素40μL，加入40μL 1.54U/mL的凝血酶在37℃孵育5min。

2)加入40μL抗凝缓冲液，于405nm处测0min时的吸光度。

3)加入40μL 1mg/mL的S-2238溶液，混匀，立即测吸光度，每隔3min测一次，测30min。

4)根据此公式计算抗凝血酶活性：

4.实验结果：

如图12A所示，500nM的R824-HV-ABD和ABD-HV-R824在FXa切割前均不具有抗凝活性，随时间无变化；经FXa切割后产生活性，在5min时，即具有约65％的抗凝血酶活性，说明FX啊切割效率非常快；随着时间的延长，抗凝血酶活性缓慢增加，在3h时约达到最高，为80％左右。

如图12B所示，以FXa完全切割时的3h为孵育时间，观察抗凝活性随浓度的变化规律。R824-HV-ABD和ABD-HV-R824若不被FXa切割，始终不具有活性，处于前药状态。当蛋白和FXa孵育3h后，随着融合蛋白浓度的增加(0.1-1000nM)，其抗凝活性也逐渐增加，在500nM左右处达到最高，约为80％。

综上表明，R824-HV-ABD和ABD-HV-R824具有前药性质，在体外可以迅速被FXa剪切转化成有活性的形式，起抗凝血酶作用。

实施例7、水蛭素融合蛋白R824-HV-ABD和ABD-HV-R824和白蛋白的结合 1.目的和原理：

R824-HV-ABD和ABD-HV-R824中有白蛋白结合域ABD片段，该片段理论上可以跟内源性白蛋白结合达到长循环，从而延长水蛭素的半衰期。非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)，不会破坏蛋白之间的作用力，所以常被用来考察蛋白之间的作用。表面等离子共振(SPR)可以实时观测到分子结合、薄膜形成等表面现象，并能给出高灵敏度、高选择性同时最小的非特异结合的信号，所以可用其来测定融合蛋白和白蛋白结合的亲和力。

2.实验方法：

1)Native-PAGE法考察融合蛋白和人血清白蛋白(HSA)之间的相互作用：

i.孵育：HSA的终浓度为5μM不变，将融合蛋白和HSA以摩尔比为5：0、0：2、 2:5在4℃过夜孵育。

ii.在蛋白质样品中加入5×非变性蛋白上样缓冲液。

iii.Native-PAGE凝胶电泳

a)按下表所示配制分离胶和浓缩胶，灌胶，插入梳子，凝固待用。

b)上样：胶充分凝固后，加入足量非变性电泳缓冲液(非变性10×电泳缓冲液配置：称取30.3g Tris，144g Glycine，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解后定容至1L，使用时用去离子水稀释至1×)，按每孔等量蛋白上样；

iv.电泳：80V 30min；120V 2h。

v.染色：

a)电泳结束后，取胶放入约50-100mL蒸馏水中，在摇床上摇动5min，倒弃液体，再重复两次，共洗涤三次；

b)弃蒸馏水，加入适当体积的考马斯亮蓝染色液，使染色液能盖住凝胶，且液面至少高出三个胶的厚度为宜，在侧摆摇床或水平摇床上进行染色。置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1h；

c)倒出染色液，加入适量脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。

d)置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色2-4h。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期；

e)完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，观察拍照。

2)SPR法考察融合蛋白和HSA之间的相互作用：

a)封闭前期的流速为10μL/min，所用溶液为PBS(含0.05％Tween 20)。

b)活化芯片：将CM5芯片放入Biacore 8K系统中，待基线平稳后，将50μL 0.4mol /L的EDC和50μL 0.1mol/L的NHS混合，注入70μL混合物以活化芯片。

c)固定：用pH为4.0的醋酸钠溶解HSA，使其浓度为20ng/mL，将其固定到CM5 芯片上，使其偶联量达到1200-1500Ru；

d)封闭：用70μL乙醇胺封闭未结合的位点；

e)依次通入0.37nM、1.1nM、3.3nM、10nM、30nM的融合蛋白溶液，流速为30μL /min，结合时间为240s，解离时间为600s。

3.实验结果

HSA的终浓度为5μM不变，将R824-HV-ABD和ABD-HV-R824和HSA以摩尔比为5：0、 0：2、2:5在4℃孵育10h，取出样品进行非还原性凝胶电泳，然后考马斯亮蓝染色，如图13A所示，R824-HV-ABD和ABD-HV-R824和HSA孵育后，与HSA相比较，产生有新的明显较粗的条带(用红色→标示)，推测新产生的条带为水蛭素融合蛋白和HAS结合的复合物。由于电泳为非还原性凝胶电泳，所以Marker显示的分子量(根据变性电泳的分子量进行标注)和实际分子量有误差。

SPR法分析实验中，将蛋白HSA固定到芯片上，封闭芯片上多余的位点后，从小到大依次通入不同浓度的融合蛋白溶液，通过响应值的变化来分析融合蛋白和HSA之间是否有相互作用。如图13B所示，随着融合蛋白进样量的增加，响应值增大，即结合到HSA上的蛋白逐渐增大；随着融合蛋白浓度的增加，结合到HSA上的蛋白也逐渐增大。通过软件分析计算，得到各融合蛋白和HSA的结合常数Ka、解离常数Kd和亲和力KD，如表3所示， R824-HV-ABD和ABD-HV-R824和HSA以高亲和力结合，KD分别为117fM和559fM。

表3.SPR检测融合蛋白与HAS的结合参数

实施例8、水蛭素蛋白R824-HV-ABD和ABD-HV-R824和“促凝血小板”的结合

1.目的和原理：

“促凝血小板”是活化血小板中的一个亚群，其不参与血小板聚集，功能为促进凝血系统的激活。当静息的血小板被激活为“促凝血小板”时，其胞内Ca²⁺浓度增加，位于血小板膜内侧的磷酯酰丝氨酸(PS)翻转到血小板膜的外侧。融合蛋白R824-HV-ABD和 ABD-HV-R824中包含R824肽，理论上可以和促凝血小板表面的PS结合，达到靶向凝血部位的目的。提取大鼠的血小板，体外用凝血酶和Ca2⁺使其部分激活为促凝血小板，通过流式细胞仪技术考察融合蛋白和促凝血小板在体外能否结合。

2.材料与方法：

常用溶液：

2×交联反应液：7.56g NaHCO₃，1.06g Na₂CO₃，7.36g NaCl，加水定容至500mL，pH9.0。

抗凝剂：42mM的柠檬酸钠，pH 6.6。

HEPES缓冲液1：10mM HEPES，136mM NaCl，2.68mM KCl，2mM MgCl₂,25mM葡萄糖，0.5％BSA，9体积中加入1体积的抗凝剂，pH 6.6。

HEPES缓冲液2：10mM HEPES，136mM NaCl，2.68mM KCl，2mM MgCl₂，25mM葡萄糖，0.5％BSA，9体积中加入1体积的抗凝剂，pH 7.5。

HBS-Ca²⁺：10mM HEPES，140mM NaCl，2.5mM CaCl₂，pH 7.4。

1)FITC标记融合蛋白：

a)在融合蛋白(1mg/mL)中加入2×交联反应液。

b)将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/mL，每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。

c)按蛋白质：FITC为1mg：15μg的比例，将FITC缓慢加入于蛋白溶液中，边加边轻轻晃动使其与蛋白混合均匀，暗处4℃反应8h。

d)加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2h。

e)将交联物转移到Millpore超滤管中，超滤管滤膜可以拦截分子量大于3kd的分子，配平后4℃5000g离心至透析液清亮。

f)FITC交联的融合蛋白置于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，4℃避光保存。

2)流式细胞仪检测融合蛋白和促凝血小板的结合能力：

a)血小板的收集(参考Tans G等描述的方法收集血小板并激活(Tans,G.,Rosing,J.,Thomassen,M.C.,Heeb,M.J.,Zwaal,R.F.,Griffin,J.H., 1991.Comparison ofanticoagulant and procoagulant activities of stimulated platelets andplatelet-derived microparticles.Blood 77, 2641–2648))：一只350g雄性的SD大鼠，用1.05mL 10％水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露腹股沟主动脉，用预先加入1mL抗凝剂的10mL注射器取血， 180g 25℃离心10min。取上清，500g 25℃离心15min，弃去上清。

b)洗涤血小板：将血小板沉淀重悬于HEPES缓冲液1中，500g 25℃离心15min，洗涤两次后，重悬于HEPES缓冲液2中至终浓度为3×10⁸个/mL。

c)血小板的激活：在血小板溶液中加入凝血酶(终浓度2U/mL)和HBS-Ca2+溶液，37℃激活15min。

d)孵育：加入FITC标记的融合蛋白，使其终浓度分别为10nM、200nM、500nM、1000nM，总体积为350μL，避光，37℃孵育2h。

e)洗涤：用PBS溶液洗涤两次，条件为500g 25℃离心15min。

f)检测：流式细胞仪测量细胞中FITC荧光强度，采集50000个细胞，采集数据使用FCS Express V3软件分析。

3.统计学方法：

采用GraphPad Prism软件(Version 5)进行数据的统计处理。所有数据均采用均数±标准差的方式表示。对于两组独立数据，使用单因素t检验进行分析；对于多组独立数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行检验，利用Tukey法进行事后检验。p<0.05，认为有统计学差异。

4.实验结果

荧光标记的蛋白和促凝血小板结合的流式细胞术检测结果如图所示(图14A为代表性图，图14B为统计结果)，阳性对照FITC-Annexin V显示出了很强的荧光，空白生理盐水对照无荧光。水蛭素本身没有促凝血小板靶向结合性，但水蛭素和促凝血小板结合还是有微弱荧光(平均强度约30左右)，属于非特异性结合。融合蛋白R824-HV-ABD and ABD-HV-R824和促凝血小板结合后的荧光远大于水蛭素和促凝血小板的结合，平均强度约 70左右。因此，该体外实验表明水蛭素前药R824-HV-ABD and ABD-HV-R824均能和促凝血小板表面磷酯酰丝氨酸结合。

实施例9、水蛭素蛋白R824-HV-ABD和ABD-HV-R824在大鼠颈动脉血栓模型中的抗凝作用

1.目的和原理：

检验水蛭素融合蛋白前药能否在体内激活，起到抗凝作用；并且和单独的水蛭素比较，该水蛭素前药能否延长体内半衰期，进而延长体内效应时间。

2.材料与方法：

1)实验动物：SD雄性大鼠(220g左右)，购自北京大学医学部动物部。

2)剂量选择与分组

将动物随机分成4组，每组8只。分别为：生理盐水；水蛭素；融合蛋白R824-HV-ABD；融合蛋白ABD-HV-R824。按照水蛭素的剂量为1mg/kg、融合蛋白和水蛭素等摩尔量给药。

3)大鼠颈总动脉血栓模型制备与评价方法

大鼠腹腔注射35％水合氯醛350mg/kg麻醉。仰卧位固定，分离右侧颈总动脉，将颈总动脉置于BT87.4型试验性体内血栓形成测定仪的刺激电极和温度探头钩上，温度探头在远心端，刺激电极靠近心端。大鼠给药后10分钟开始刺激，温控电流强度80pA，刺激电流2mA，刺激5分钟后，取下刺激电极，温控电流强度调零。记录从刺激开始到动脉温度骤降仪器报警所需的时间(秒)，即为动脉血栓形成时间。1h后，分离左侧颈总动脉，同样方法测量血栓形成时间。

3.统计学分析

采用GraphPad Prism软件(Version 5)进行数据的统计处理。所有数据均采用均数±标准差的方式表示。对于两组独立数据，使用单因素t检验进行分析；对于多组独立数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行检验，利用Tukey法进行事后检验。p<0.05，认为有统计学差异。

4.实验结果

分别于给药后10分钟、1小时测量大鼠颈动脉血栓形成时间(n＝8)。从图15中可以看出，给药10分钟后，水蛭素组(626±25秒)、融合蛋白R824-HV-ABD(642±26秒) 和ABD-HV-R824(637±42秒)三组在延长动脉血栓形成时间方面无显著性差异，均显著高于对照生理盐水组(4506±15秒)，表明水蛭素前药融合蛋白可在体内被FXa剪切激活，符合前药的性质；且抗血栓效应和水蛭素相当。

为了测试更长时间的药效，给药1小时后建模型进行检测抗血栓效果。水蛭素组(515 ±22秒)和生理盐水组(451±16秒)相比，有轻微的延长血栓形成时间的效果，但无显著性统计差异，表明这个时候体内的水蛭素大多已代谢，浓度不足。而融合蛋白 R824-HV-ABD(618±44秒)和ABD-HV-R824(574±40秒)组与生理盐水组相比，还有显著的延长血栓形成的时间。且R824-HV-ABD组和水蛭素组相比也具有显著性差异。

综上表明，水蛭素融合蛋白前药R824-HV-ABD和ABD-HV-R824能够在体内剪切激活，起抗凝作用，效果和水蛭素相当；和水蛭素相比，前药在体内的起效时间更长，间接表明融合蛋白的ABD结构域能和体内白蛋白结合，延长半衰期；R824-HV-ABD在1小时后的作用效果好于ABD-HV-R824，表明ABD片段位于融合蛋白的C端时，其延长半衰期的能力大于在融合在N端。

实施例10、在小鼠割尾模型中水检测蛭素蛋白R824-HV-ABD和ABD-HV-R824的出血风险

1.目的和原理：

检验水蛭素融合蛋白前药能否减少系统性出血风险，采用小鼠割尾实验，测定出血时间。

2.材料与方法：

1)实验动物：BALB/C雌性小白鼠(8周龄)，购自北京大学医学部动物部；

2)剂量选择与分组

将动物随机分成4组，每组11只。分别为：生理盐水；水蛭素；融合蛋白R824-HV-ABD；融合蛋白ABD-HV-R824。按照水蛭素的剂量为1mg/kg、融合蛋白和水蛭素等摩尔量，尾静脉单次给药。

3)给药10分钟后小鼠尾尖部5毫米处横断，然后将尾置于37℃生理盐水中观察，统计出血时间。

3.统计学分析

采用GraphPad Prism软件(Version 5)进行数据的统计处理。所有数据均采用均数±标准差的方式表示。对于两组独立数据，使用单因素t检验进行分析；对于多组独立数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行检验，利用Tukey法进行事后检验。p<0.05，认为有统计学差异。

4.实验结果

如图16所示，水蛭素给药组小鼠的平均出血时间为506±34秒，R824-HV-ABD和ABD-HV-R824给药组的平均出血时间分别为220±25秒和236±33秒，显著低于水蛭素给药组，和生理盐水给药组的出血时间(239±21秒)处于同一水平。表明本发明设计的水蛭素融合蛋白前药除了能够延长药效时间以外，还能显著的减少出血风险，具有更好的安全性。

序列表

<110> 北京大学

<120> 一种具有靶向和长效功能的重组水蛭素融合蛋白及其编码基因和应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 160

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Pro Gly Asp Leu Ser Arg Gly Gly Gly Ser His His His His His HisHis His His

His Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ile Glu Gly Arg Ile Thr Tyr ThrAsp Cys Thr

Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly LysGly Asn Lys

Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu GlyThr Pro Asn

Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr LeuGln Ile Glu

Gly Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ala GluAla Lys Val

Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys ArgLeu Ile Asn

Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His Ile Leu AlaAla Leu Pro

<210> 2

<211> 160

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr GlyVal Ser Asp

Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu AlaLeu Lys Leu

His Ile Leu Ala Ala Leu Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly GlyGly Ser Ile

Glu Gly Arg Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu CysLeu Cys Glu

Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asn GlyLys Gly Asn

Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Asn Pro Glu Ser His Asn Asn GlyAsp Phe Glu

Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln Ile Glu Gly Arg Gly Gly Gly Ser GlyGly Gly Ser

His His His His His His His His His His Gly Gly Gly Ser Pro Gly AspLeu Ser Arg

<210> 3

<211> 483

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgccgggtg atctgagccg tggtggtggt agccatcatc atcatcatca ccaccaccac 60

cacggtggtg gtagcggtgg tggtagcatc gaaggccgta ttacctatac cgattgcacc 120

gaaagcggcc agaatctgtg cctgtgcgaa ggcagcaatg tgtgcggcaa aggcaataaa 180

tgcattctgg gcagcaatgg caaaggcaat cagtgcgtga ccggcgaagg caccccgaat 240

ccggaaagcc ataataatgg cgattttgaa gaaattccgg aagaatatct gcagatcgaa 300

ggccgtggtg gtggtagcgg tggtggtagc ggtggtggta gcctggcgga agcgaaagtg 360

ctggcgaacc gtgaactgga taaatatggc gtgagcgatt tctataaacg tctgatcaac 420

aaagcgaaaa ccgtggaagg cgtggaagcg ctgaaactgc atatcctggc ggcgctgccg 480

taa 483

<210> 4

<211> 483

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgctggcgg aagcgaaagt gctggcgaac cgtgaactgg ataaatatgg cgtgagcgat 60

ttctataaac gtctgatcaa caaagcgaaa accgtggaag gcgtggaagc gctgaaactg 120

catatcctgg cggcgctgcc gggtggtggt agcggtggtg gtagcggtgg tggtagcatc 180

gaaggccgta ttacctatac cgattgcacc gaaagcggcc agaatctgtg cctgtgcgaa 240

ggcagcaatg tgtgcggcaa aggcaataaa tgcattctgg gcagcaatgg caaaggcaat 300

cagtgcgtga ccggcgaagg caccccgaat ccggaaagcc ataataatgg cgattttgaa 360

gaaattccgg aagaatatct gcagatcgaa ggccgtggtg gtggtagcgg tggtggtagc 420

catcatcatc atcatcacca ccaccaccac ggtggtggta gcccgggtga tctgagccgt 480

taa 483

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Pro Gly Asp Leu Ser Arg

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Leu Ile Lys Lys Pro Phe

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Asp Ala His Ser Phe Ser

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Thr Leu Val Ser Ser Leu

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Cys Leu Ser Tyr Tyr Pro Ser Tyr Cys

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Phe Asn Phe Arg Leu Lys Ala Gly Ala Lys Ile Arg Phe Gly

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Gly Ser Thr Leu Tyr Pro Glu Ser Arg Lys Leu Leu Lys Ser Trp His LeuPro Ser Val

<210> 12

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Gln Glu Gly Ile Ser Arg Phe Lys Ile Cys Pro Tyr His Trp Tyr Lys GlnHis Met Ser

Leu Leu Phe Arg Arg Tyr Tyr His Lys Leu Asp Ser Ile Ile

<210> 13

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys GluGly Ser Asn

Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly AsnGln Cys Val

Thr Gly Glu Gly Thr Pro Asn Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe GluGlu Ile Pro

Glu Glu Tyr Leu Gln

<210> 14

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly ValSer Asp Phe

Tyr Lys Arg Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala LeuLys Leu His

Ile Leu Ala Ala Leu Pro

Claims (7)

1.一种重组水蛭素融合蛋白，其包含结构为：[R]n-[H]m-[A]k或[A]k-[H]m-[R]n的多肽，其中，R为促凝血小板靶向结合肽的结构域，H为水蛭素元件的结构域，A为白蛋白结合肽的结构域，n, m, k 为1；其中，所述的促凝血小板靶向结合肽选自如下序列的多肽：SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12；所述的水蛭素元件为水蛭素变体2，氨基酸序列为SEQ ID NO.13，所述白蛋白结合结构域为SEQ ID NO.14所示的序列。

2.权利要求1所述的重组水蛭素融合蛋白，其中该蛋白多肽序列为SEQ ID NO.1或 SEQID NO.2所示的序列。

3.一种核酸分子，其含有编码权利要求2所述的重组水蛭素融合蛋白的多核苷酸，其序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示序列。

4.一种表达载体，其特征在于含有权利要求3所述的任一核苷酸序列。

5.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求4所述的任一种表达载体。

6.一种含有权利要求1或2所述的重组水蛭素融合蛋白的组合物，其包含药学上可接受的载体或赋形剂。

7.权利要求1或2所述的重组水蛭素融合蛋白、权利要求6所述组合物在制备抗凝血、治疗血栓或预防血栓形成药物中的应用。

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