KR20170137929A - 효소 활성화 인자 XII(FXIIa)의 신규한 저해제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펩타이드 (X¹)(X²)(X³)_n(X⁴)RL(X⁵)(X⁶)_m(X⁷)(X⁹)_l(X¹⁰)(X¹¹)(X¹²)(X¹³)(X¹⁴)_k(X¹⁵)(X¹⁶)를 포함하거나 구성되는 응고 효소 활성화 인자 XII(FXIIa)의 바이사이클릭 저해제에 관한 것으로, 상기 (X¹)은 존재하거나 그렇지 않으며, 존재하는 경우 아미노산이고; (X²)는 측쇄를 가진 아미노산이며; (X³)는 아미노산이며, n은 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이고; (X⁴)는 지방족 L-아미노산 또는 환형의 L-아미노산, 바람직하게는 L, P 또는 방향족 L-아미노산, 및 가장 바람직하게는 방향족 L-아미노산이며; (X⁵)는 아미노산이고; (X⁶)은 아미노산이며, m은 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이며; (X⁷)은 측쇄를 가진 아미노산이고; (X⁹)는 아미노산이며, l은 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이며; (X¹⁰)은 아미노산이고; (X¹¹)은 아미노산, 바람직하게는 Q이며; (X¹²)는 소수성 L-아미노산, 바람직하게는 지방족 L-아미노산, 및 가장 바람직하게는 L이고; (X¹³)은 아미노산이며; (X¹⁴)는 아미노산이며, k는 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이고; (X¹⁵)는 측쇄를 가진 아미노산이며; 및 (X¹⁶)은 존재하거나 그렇지 않으며, 존재하는 경우, 아미노산이고; 그리고 여기서, 상기 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)의 측쇄는 연결 분자를 통해 연결되고, 상기 연결 분자는 적어도 세 개의 작용기를 가지며 각 작용기는 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)의 측쇄 중 하나와 공유 결합을 형성한다.

Description

효소 활성화 인자 XII(FXIIa)의 신규한 저해제

본 발명은 펩타이드 (X¹)(X²)(X³)_n(X⁴)RL(X⁵)(X⁶)_m(X⁷)(X⁹)_l(X¹⁰)(X¹¹)(X¹²)(X¹³)(X¹⁴)_k(X¹⁵)(X¹⁶)를 포함하거나 구성되는 응고 효소 활성화 인자 XII(FXIIa)의 바이사이클릭 저해제에 관한 것으로, 상기 (X¹)은 존재하거나 그렇지 않으며, 존재하는 경우 아미노산이고; (X²)는 측쇄를 가진 아미노산이며; (X³)는 아미노산이며, n은 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이고; (X⁴)는 지방족 L-아미노산 또는 환형의 L-아미노산, 바람직하게는 L, P 또는 방향족 L-아미노산, 및 가장 바람직하게는 방향족 L-아미노산이며; (X⁵)는 아미노산이고; (X⁶)은 아미노산이며, m은 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이며; (X⁷)은 측쇄를 가진 아미노산이고; (X⁹)는 아미노산이며, l은 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이며; (X¹⁰)은 아미노산이고; (X¹¹)은 아미노산, 바람직하게는 Q이며; (X¹²)는 소수성 L-아미노산, 바람직하게는 지방족 L-아미노산, 및 가장 바람직하게는 L이고; (X¹³)은 아미노산이며; (X¹⁴)는 아미노산이며, k는 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이고; (X¹⁵)는 측쇄를 가진 아미노산이며; 및 (X¹⁶)은 존재하거나 그렇지 않으며, 존재하는 경우, 아미노산이고; 그리고 여기서, 상기 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)의 측쇄는 연결 분자를 통해 연결되고, 상기 연결 분자는 적어도 세 개의 작용기를 가지며 각 작용기는 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)의 측쇄 중 하나와 공유 결합을 형성한다.

본 명세서에서, 특허 출원 및 제조사 매뉴얼을 포함하는 다수의 문헌이 인용되어 있다. 이들 문헌의 개시는 본 발명의 특허성에는 관련이 없는 것으로 간주하지만, 그 전체가 참고로 여기에 포함된다. 보다 상세하게는, 각각의 개별 문헌이 구체적으로 및 개별적으로 표시되어 참고로 포함되는 것처럼 참고된 문헌들 모두 동일한 정도로 참고로 포함된다.

혈액 응고 검사는 환자의 응고 효율을 평가하기 위해 임상 실험실에서 일상적으로 수행된다. 대부분의 응고 검사에서, 혈액 응고는 강한 유발제(trigger)를 사용하여 유도되고, 응고 시간은 응고 가능성의 지표로 사용된다. 이들 검사는 진단적으로 유용하지만, 환자의 출혈이나 혈전성 위험과의 관련성으로 인해 제한적이다. 트롬보엘라스토그래피(thromboelastography: TEG), 트롬보엘라스토메트리(thromboelastometry: TEM) 및 calibrated automated thrombography(CAT)와 같은 최신 글로벌 응고 분석은 응고 과정의 매개변수를 더 많이 전달하고, 응고 가능성을 더 잘 예측한다. 전혈에서 지혈을 검사하기 위한 TEG 및 TEM, 점막 내시경 방법의 사용에 대해 주요 노력이 있어 왔다. 그들은 모방 혈관 흐름 하에서의 응고 단계 및 후속 용해를 연구할 수 있게 한다. 점막 내시경 방법은 이미 수술 전 출혈 관리를 위해 클리닉에서 사용된다. TEG는 병원에서 분석 방법으로 사용된다. 일부 TEG 및 CAT 분석에서, 응고 유발 조직 인자(TF)는 환자의 응고 가능성을 최적으로 반영하기 위해 낮은 농도로 사용되어야 한다. 그러나 그러한 분석들에서, FXII와 시료 튜브의 접촉은 내인성 응고 경로를 시작하여 결과를 위조할 수 있다. 옥수수 종자에서 분리된 13.6 kDa 단백질이고, 24 nM의 Ki로 FXIIa를 억제하는 옥수수 트립신 저해제(CTI)가 지금까지 이들 효과를 억제하는데 사용되었다.^{1 , 2} 따라서, FXIIa의 천연 저해제이다. 그러나 CTI는 일반적으로 사용되는 농도(30-100 ㎍/mL)에서 접촉 활성화를 완전히 차단하지는 못한다. 또한, 최근 연구에 따르면 CTI는 FXIa와 같은 다른 관련 프로테아제들을 억제한다.³ CTI의 또 다른 한계는 높은 가격이다: 일반적으로 분석당 사용된 50 ㎍의 연구 등급 CTI는 제공자에 따라 5-10 달러이다. TEM은 수술 전 출혈 관리를 위해 클리닉에서 일상적으로 사용된다. 최근에 중증 및 경미한 혈우병 장애를 구별하기 위해 TEM을 사용하는 컨소시엄이 만들어졌다. 그러한 분류는 낮은 TF 농도에 의해 유발되는 EXTEM 검사(외인성 경로를 통한 응고의 특정 유도를 갖는 TEM)를 수행할 것을 요구한다. TEM과 low-TF로 유도된 TGA 둘 다 접촉 활성화 저해제의 사용이 요구된다.

최근 몇몇 연구들은 내인성 응고가 병리학적 응고에 관련되며, 혈액 응고 인자 FXII가 치료 표적으로서 특징이 있음을 암시하였다.^{4 -10} DNA, RNA, 단백질 응집체, 폴리포스페이트 및 콜라겐과 같은 생리학적 물질들은 FXII를 활성화하고 혈전증을 유발하는 것으로 보고되었다.¹¹ FXII-결핍 마우스는 정상적인 지혈을 나타내면서 혈전 형성으로부터 보호되는 것으로 밝혀졌다.⁸ 코호트 연구의 데이터에 따르면 상승된 혈장 FXII 수준은 관상동맥 사건들의 위험 증가와 관련이 있다.^{4 , 12} 동시에, 내인성 경로의 결핍들이 심각한 병리학적 결과를 가져오지는 않는다. FXII가 결핍된 개체는 정상적인 지혈 용량을 나타낸다.^{13 , 14} FXII의 항체-매개 억제는 영장류에서 이 발견을 확인하였다.⁷ 다양한 기원과 작용 방식의 다양한 FXII 저해제들이 개발되었다. RNA-앱타머 R4cXII-1.9 및 마우스 mAb 15H8은 FXII의 자가활성화를 억제한다.⁷ 재조합 흡혈성 곤충 단백질 도메인 인페스틴 4(rHA-인페스틴-4; Ki=0.3 nM)^{15, 16} 및 파지 디스플레이-유래 인간화 항체 3F7은 FXII의 활성화된 형태(Ki=13 nM)의 직접적인 저해제이다.⁶ 그들은 모두 인 비트로 응고 분석에서 응고의 내인성 경로의 선택적 억제를 보여준다. 15H8, rHA-인페스틴-4 및 3F7은 연관된 출혈 없이 다양한 혈전증 모델 및 종에서 혈전 형성으로부터 효과적인 인 비보 보호를 나타냈다.^{4 , 6, 7, 9, 10} 몇 가지 소분자 FXIIa 저해제들이 개발되었지만 그들은 구조적으로 관련된 트립신 유사 세린 프로테아제를 억제하였다.¹⁷ 최근 관련된 프로테아제들(> 100배)에 비해 높은 선택도를 갖는 합성 FXIIa 저해제가 개발되었다.¹⁸ 그러나 그 효능(Ki=1.2 μM)은 치료 화합물의 생성을 위해 그것을 더 발전시키는 것을 허용하지 않았다. 내인성 응고 캐스케이드에서 FXII의 중요한 역할에도 불구하고, 나노 몰 범위의 결합 상수를 갖는 선택적 합성 FXII 저해제는 현재 존재하지 않는다.

따라서, FXIIa의 현재 이용 가능한 저해제들과 관련된 단점 중 적어도 하나를 극복하는 FXIIa의 추가 저해제에 대한 지속적인 요구가 있다. 그러한 저해제들은 특히 하기에서 기술된 FXIIa의 저해제의 진단적 및 치료적 적용에 관심이 있다. 특히, 나노 몰 범위에서 FXIIa의 선택적 억제를 제공하는 저해제가 필요하다. 이러한 요구는 본 발명에 의해 해결된다.

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따라서, 본 발명은 제1 양태에서 펩타이드 (X¹)(X²)(X³)_n(X⁴)RL(X⁵)(X⁶)_m(X⁷)(X⁸)를 포함하거나 구성되는 응고 효소 활성화 인자 XII(FXIIa)의 사이클릭 저해제에 관한 것으로, 여기서, (X¹)은 존재하거나 그렇지 않으며, 존재하는 경우 아미노산이고; (X²)는 측쇄를 가진 아미노산이며; (X³)는 아미노산이며, n은 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이고; (X⁴)는 지방족 L-아미노산 또는 환형의 L-아미노산, 바람직하게는 L, P 또는 방향족 L-아미노산, 및 가장 바람직하게는 방향족 L-아미노산이며; (X⁵)는 아미노산이고; (X⁶)은 아미노산이며, m은 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이며; (X⁷)은 측쇄를 가진 아미노산이고; 및 (X⁸)은 존재하거나 그렇지 않으며, 존재하는 경우, 아미노산이고; 그리고 여기서, 상기 (X²) 및 (X⁷)의 측쇄는 연결 분자를 통해 연결되고, 상기 연결 분자는 적어도 두 개의 작용기를 가지며 각 작용기는 (X²) 및 (X⁷)의 측쇄 중 하나와 공유 결합을 형성한다.

용어 "포함하다/포함하는"은 일반적으로 함유/함유하는, 즉, 하나 이상의 특징 또는 성분의 존재를 허용한다는 의미로 사용된다. 용어 "포함하다" 및 "포함하는"은 또한 보다 제한된 용어 "구성하다" 및 "구성하는"을 포함한다.

명세서 및 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 다르게 지시하지 않는 한 복수의 참고를 포함한다.

여기에 사용된 바와 같이, "활성화 인자 XII" 또는 "FXIIa" (EC 3.4.21.38)는 음으로 하전된 표면과의 접촉(접촉 활성화로 지칭됨)을 통해, 내인성 응고 경로를 개시하는 트립신 유사 세린 프로테아제를 의미한다. 그것은 FXI, FIX, FX 및 트롬빈을 포함하는 프로테아제의 캐스케이드를 활성화한다. 트롬빈은 최종적으로 혈전을 형성하는 피브리노겐을 활성화한다. 보다 상세하게, 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 전환하는 것을 촉매하고, 혈소판과 함께 혈전을 형성한다. 외상 후 혈전 형성에 필수적인 외인성 경로와는 달리, 내인성 경로는 항상성을 요구하지 않는다. FXII-결핍 개체는 정상적인 지혈 용량을 나타낸다.⁹ 최근의 몇몇 연구들은 내인성 응고가 병리학적 응고 및 이로 인한 해로움과 관련되어 있음을 제시하였다.^{3 -7, 10, 11} FXII-결핍 마우스는 정상적인 지혈을 나타내면서 혈전 형성으로부터 보호되는 것으로 밝혀졌다(3). FXII의 항체 매개 억제는 영장류에서 이 발견을 확인하였다.⁴ 따라서, 이 응고 인자를 표적으로 하는 약물은 지혈을 손상하지 않으면서 혈전성 사건들을 방지할 수 있는 항혈전제의 개발로 이어질 수 있다. 본 발명에 따르면, FXIIa는 바람직하게는 인간 또는 마우스의 FXIIa이며, 가장 바람직하게는 인간 α-FXIIa 또는 β-FXIIa이다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 "저해제"는 촉매화된 반응에서 촉매의 유효성을 감소시키는 화합물을 지칭한다. 본 발명에 따르면, 촉매는 응고 효소 FXIIa이다. FXIIa에 의해 촉매되는 주요 반응은 인자 XIa를 형성하기 위해 인자 XI에서 Arg-/-Ile 결합의 선택적 절단이다. 용어 "사이클릭 저해제"는 저해제 중의 하나 이상의 일련의 원자/들이 연결되어 고리(ring) 또는 환(cycle)을 형성하는 것을 의미한다.

용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산의 짧은 사슬을 지칭한다. 가능한 가장 짧은 펩타이드는 단일 펩타이드 결합에 의해 연결된 두 개의 아미노산으로 구성된다. 본 발명의 제1 양태에 따르면, 펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 연결된 적어도 여섯 개의 아미노산을 포함한다. 펩타이드는 크기에 기초하여 단백질 또는 폴리펩타이드와 구별되며, 일반적으로 50개 미만의 아미노산을 포함한다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산"은 일반적으로 각 아미노산에 특이적인 측쇄와 함께 아민(-NH₂) 및 카르복실산(-COOH) 작용기로 구성된 유기 화합물을 의미한다. 가장 간단한 아미노산인 글리신은 측쇄를 갖지 않는다(화학식 H₂NCH₂COOH). α-탄소에 부착된 탄소 사슬을 갖는 아미노산(예컨대, 라이신)에서, 탄소는 α, β, γ, δ 등의 순으로 표지된다. 일부 아미노산에서, 아민기는 예를 들어, α-, β- 또는 γ-탄소에 부착될 수 있어 이들은 각각 α-, β- 또는 γ-아미노산으로 불린다. 모든 아미노산은 본 발명에 따르면, 바람직하게는 일반적으로 일반식 H₂NCHRCOOH(여기서, R은 "측쇄"로 지칭되는 유기 치환기이다)를 갖는 α-아미노산(2-, 또는 알파-아미노산으로도 지칭됨)이다. 가장 간단한 α-아미노산인 알라닌(화학식: H₂NCHCH₃COOH)에서 측쇄는 메틸기이다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따르면 아미노산은 L-α-아미노산으로, L-아미노산은 L-입체이성질체(또는 "왼손잡이"이성질체)임을 나타낸다.

언급한 바와 같이, 아미노산의 측쇄는 α-아미노산의 경우 α-탄소 원자에 연결되는 유기 치환기이다. 따라서, 측쇄는 아미노산의 모핵 구조로부터의 분지이다. 아미노산은 보통 측쇄의 특성에 따라 분류된다. 예를 들어, 측쇄는 아미노산을 약산(예를 들어, 아미노산 D 및 E) 또는 약염기(예를 들어, 아미노산 K 및 R)로 만들 수 있고, 측쇄가 극성이면 친수성(예를 들어, 아미노산 L 및 I)으로, 비극성이면 소수성(예를 들어, 아미노산 S 및 C)으로 만들 수 있다. 지방족 아미노산은 지방족기인 측쇄를 가진다. 지방족기는 아미노산을 비극성 및 소수성으로 만든다. 지방족기는 바람직하게는 비치환된 분지형 또는 선형 알킬이다. 지방족 아미노산의 비제한적 예로 A, V, L 및 I가 있다. 환형 아미노산에서 측쇄의 하나 이상의 일련의 원자/들은 연결되어 고리를 형성한다. 환형 아미노산의 비제한적 예로 P, F, W, Y 및 H가 있다. 상기 고리는 적어도 두 개의 작용기를 갖는 연결 분자에 의해 형성되는 고리와는 별개로 유지되어야 하며, 각 작용기는 (X²) 및 (X⁷)의 측쇄 중 하나와 공유 결합을 형성하는 것으로 이해된다. 환형 아미노산의 전자의 고리는 단일 아미노산의 측쇄의 일부분이지만, 후자의 고리는 연결 분자를 통해 두 개의 아미노산 (X²) 및 (X⁷)의 측쇄 사이에 형성된다. 또한, 하기에서 논의되는 바람직한 구현예에 따라 존재하는 연결 분자를 통해 (X⁷) 및 (X¹⁵) 사이에 형성되는 고리는 두 개의 아미노산의 측쇄 사이에 형성된다. 방향족 아미노산은 환형 아미노산의 바람직한 형태이다. 방향족 아미노산에서 고리는 방향족 고리이다. 분자의 전자 성질의 측면에서, 방향족성은 불포화 결합의 공액 고리, 전자의 고립전자쌍, 또는 공분자 오비탈이 공액 단독의 안정화에 의해 기대되는 것보다 더 강한 안정화를 나타내는 방식을 기술한다. 방향족성은 환형의 비편재화(delocalization) 및 공명의 징후로 간주될 수 있다. 환형 아미노산의 비제한적 예로 F, W, Y 및 H가 있다. 소수성 아미노산은 아미노산을 소수성으로 만드는 비극성 측쇄를 가진다. 소수성 아미노산의 비제한적 예로 M, P, F, W, G, A, V, L 및 I가 있다. 극성의 하전되지 않은 아미노산은 하전된 잔기가 없는 비극성 측쇄를 가진다. 극성의 하전되지 않은 아미노산의 비제한적 예로 S, T, N, Q, C, U 및 Y가 있다. 극성의 하전된 아미노산은 적어도 하나의 하전된 잔기를 갖는 비극성 측쇄를 가진다. 극성의 하전된 아미노산의 비제한적 예로 D, E, H, K 및 R이 있다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 "연결 분자"는 공유 결합을 통해 적어도 두 개의 아미노산의 측쇄를 연결하여 고리 또는 환을 형성할 수 있는 분자를 의미한다. 공유 결합은 원자 사이에 전자쌍을 공유하는 것을 포함하는 화학 결합이다. 이 목적을 위해 연결 분자는 적어도 두 개의 작용기를 포함한다. 작용기는 상기 적어도 두 개의 아미노산의 아미노산 측쇄를 연결 분자에 연결하는 역할을 하는 연결 분자 내의 원자 또는 결합의 특정 기를 지칭한다. 이 목적을 위해, 작용기는 일반적으로 아미노산의 측쇄에서 적어도 하나의 원자와 화학 반응을 진행한다. 화학 반응은 작용기와 측쇄 사이의 공유 결합을 초래한다. 작용기의 비제한적 예로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 페닐, 벤질, 할로(플루오로 또는 클로로 같은), 하이드록실, 카르보닐, 알데히드, 할로포르밀, 카보네이트 에스테르, 카르복실레이트, 카르복실, 에스테르, 메톡시, 하이드로페록시, 페록시, 에테르, 헤미아세탈, 헤미케탈, 아세탈, 케탈, 올쏘에스테르, 헤테로사이클, 오르쏘카보네이트, 에스테르, 카복사마이드, 아민(1급, 2급 및 3급 아민 포함), 이민, 아자이드, 아조 화합물, (이소)시아네이트, 나이트레이트, 나이트라이트, 설프하이드릴, 설파이드, 디설파이드, 설피닐, 설포닐, 설핀, 설포, (이소)티오시아네이트, 카르보노티올, 카르보노티오일, 포스피노(포스페이트 같은), 보로노, 보로네이트, 보로니에이트 및 보리노가 있다. 연결 분자의 적어도 두 개의 작용기는 같거나 다를 수 있고, 바람직하게는 같다.

여기 하기 실시예들로부터 알 수 있는 바와 같이, SEQ ID NO: 1의 펩타이드(여기에서 FXII618로 명명됨)는 크고 구조적으로 다양한 바이사이클릭 펩타이드 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하여 얻었다. 파지 디스플레이에 의한 과도한 스크리닝 노력은 기존의 소분자 FXIIa 저해제보다 몇 배 더 강력하고 선택적인 FXIIa 저해제를 수득하였다. 보다 상세하게는, FXIIa에 대한 >1010의 상이한 바이사이클릭 펩타이드가 초기에 라이브러리로부터 분리되었다. 라이브러리의 추가 패닝(도 1 참조) 및 FXIIa에 대한 분리된 바이사이클릭 펩타이드의 친화도 성숙화 노력(도 2 참조)에 의해 22 nM의 Ki를 갖는 FXIIa의 바이사이클릭 펩타이드 저해제(FXII618)를 수득하였고, 엑스 비보 및 인 비보 응고의 내인적 경로의 억제에 의해 입증된 바와 같이(하기의 실시예들 참조) FXIIa의 효율적이고 선택적인 억제를 나타내었다. 비-선택적 소분자 FXIIa 저해제 PCK(D-Pro-Phe-Arg 클로로메틸 케톤; IC50 = 180 nM)보다 약 8배 더 강력하고, 적당히 선택적인 소분자 FXIIa 저해제 44, 쿠마린 유도체(Ki=4 μM)보다 >200배 더 강력하다. 또한, FXII402보다 60배 더 강력하고, >10배 더 선택적이며, FXII61815¹⁵와 비교하여 최근에 제시되고 상당히 다른 아미노산 서열을 갖는 바이사이클릭 펩타이드 FXIIa 저해제이다. FXII618은 혈장과 전혈에서 내인성 응고 경로의 개시를 억제한다.

임상 실험실에서 글로벌 응고 분석을 사용하는데 상당히 관심이 있다. 전혈 또는 혈장 시료에서 low-조직 인자(TF) 의존적 분석을 시도할 때 접촉 개시 응고 경로의 억제가 필수적이다. 상기 기술된 트롬빈 생성 분석(TGA) 및 트롬보엘라스토메트리(TEM)과 같은 진단 응고 검사에서, FXII618은 후속 시료 처리 단계 동안 접촉 활성화된 혈액 응고를 방지하여 인 비트로 인공물을 감소시키는데 용이하게 사용될 수 있다. TGA는 연구실에서 사용되고 점점 클리닉에서 사용되는 응고 검사이다. 임상 해석을 위해 많은 노력을 기울여 왔고, 트롬비노스코프 장치는 향후 몇 년 내에 일상적인 실험실에 진입할 것으로 예상된다(예를 들어, 간 질환 환자를 위해). TEM 및 low-TF로 유도된 TGA는 접촉 활성화 저해제의 사용을 요구한다.

옥수수 트립신 저해제(CTI)는 응고 분석에서 응고 저해제의 현재 절대표준(gold-standard)이다. 시료 수집 순간에 CTI를 첨가하면 후속 시료 처리 단계 동안 응고 경로의 접촉 활성화가 방지된다. 놀랍게도 서열 분석 및 상동성 모델링은 바이사이클릭 펩타이드 FXII618의 제1 거대환 고리가 구조적으로 (CTI)의 결합 루프와 유사하며, 상기 루프가 FXIIa에 대한 CTI의 억제 활성을 매개함을 나타냈다(도 3 참조). 이러한 관점에서, CTI의 결정 구조(그것의 결합 상태에서)는 선행기술로부터 이용 가능하지 않았다는 것을 주목해야 한다(실시예 4 참조). 따라서, CTI가 FXIIa에 결합하는 방법은 완전히 밝혀지지 않았다. 이러한 예상치 못한 구조적 유사성을 고려할 때, FXII618의 제1 거대환 고리는 FXIIa에 대한 FXII618의 억제 능력을 주로 나타내는 반면 FXII618의 제2 거대환 고리의 경우 FXIIa의 특이도 포켓과의 상호 작용이 발견되지 않는다고 믿어진다(도 3에서 FXIIa 활성 부위로의 제1 고리의 스너그 핏 역시 참조할 것). FXII618의 제1 거대환 고리에서 어느 아미노산들이 FXIIa에 대한 FXII618의 억제 능력을 주로 나타내는지를 측정하기 위해 아미노산 변화가 고리에 도입된 후 돌연변이된 저해제의 Ki를 측정하였다(도 6 참조). 제1 거대환 고리에서 디펩타이드 RL은 필수적이며 억제 능력을 현저하게 감소시키지 않으면 변하지 않을 수 있음이 밝혀졌다. 반면, 제1 거대환 고리 내의 다른 아미노산들은 변화될 수 있다는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 제1 양태를 구성하는 구현예에 기재된 일반 펩타이드 서열은 바이사이클릭 펩타이드 FXII618의 제1 거대환 고리의 구조에 기초한다. 위치 (X³)_n 및 (X⁶)_m의 아미노산과 관련하여, 바이사이클릭 펩타이드 FXII618의 제1 고리에서 n 및 m이 0임을 주목하였다. 다른 말로 하면, 이들 아미노산이 FXII618에는 존재하지 않는다. FXIIa에 대한 억제 활성을 실질적으로 제한하지 않으면서 추가의 아미노산을 제1 고리에 첨가할 수 있다고 생각하지만, FXII618에서와 같이 n 및 m이 0인 것이 가장 바람직하다.

하기 실시예들에서 입증된 바와 같이, FXII618은 응고의 내인성 경로를 억제하여 CTI보다 더 강력하고 선택적이며(도 4 참조), 더욱 우수한 특이도 프로파일을 갖는다. 또한, FXII618은 현재 적용되는 절대-표준 CTI에 비해 비용 효율적인 대안이다. 그램 규모에서 CTI의 생산 단가는 그램 당 약 20,000달러이다. 대조적으로, 1 그램의 바이사이클릭 펩타이드 FXII618은 약 2,000달러의 비용이 소요되므로 약 10배 미만의 비용이 든다. 더욱이 CTI는 옥수수 종자로부터 크로마토그래피로 정제해야 한다. 작은 펩타이드 FXII618은 펩타이드 합성 회사로부터 유리하게 쉽게 주문할 수 있고, 또한 시판용 연구 시약으로 이용 가능하게 될 수 있다. 따라서 FXII618은 상기 논의된 진단 검사에서 CTI의 매우 매력적인 대안이며, 응고 및 혈장의 칼리크레인 유발성 염증 장애에서 FXII 활성을 제어하는 유망한 후보물질이다. 따라서, FXII618은 연구 및 일상 실험실 둘 다에서 광범위하게 사용할 수 있는 강력한 잠재력이 있다. CTI에 비해 FXII618의 유리한 특성들을 고려하면, FXII618은 여러 응고 분석에서 CTI를 대체할 것으로 기대된다.

FXII618의 유리한 특성들의 관점에서, 본 발명의 제1 양태의 사이클릭 저해제뿐만 아니라 하기에 기술된 이의 임의의 바람직한 형태는 선호도가 증가함에 따라 3개 이하, 2개 및 하나의 아미노산(들) 변화에 의해 SEQ ID NO:1과 다른 펩타이드를 포함하거나 구성되는 것이 또한 바람직하다. 아미노산 변화는 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가일 수 있으며, 바람직하게는 치환이다.

본 발명의 제1 양태의 바람직한 구현예에 따르면, 저해제의 FXIIa에 대한 저해상수(Ki)는 500 nM 미만, 바람직하게는 250 nM 미만, 보다 바람직하게는 100 nM 미만, 훨씬 더 바람직하게는 50 nM 미만, 가장 바람직하게는 25 nM 미만이다.

저해상수(Ki)는 효소 억제 분야에서 잘 알려진 측정법이다. Ki는 저해제가 얼마나 강력한지를 보여준다; 최대 억제 반감기를 생산하는데 필요한 농도이다. 반면 화합물에 대한 IC₅₀ 값은 실험마다 다를 수 있지만 Ki는 절대값이다. Cheng-Prusoff 방정식에 기초한 Ki의 계산은 하기 실시예들에서 추가로 설명된다. 상기에서 논의된 바와 같이, FXIIa에 대한 FXII618의 Ki는 22 nM이고, FXIIa에 대한 CTI의 Ki는 24 nM이다. 따라서, FXIIa에 대해 25 nM 미만의 가장 바람직한 Ki는 적어도 FXII618 및 CTI 만큼 우수한 저해제를 의미한다. 또한, Ki 값과 관련하여 FXIIa는 인간 α-FXIIa 또는 β-FXIIa인 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 제1 양태의 추가의 바람직한 구현예에 따르면, 저해제는 FXIIa를 특이적으로 억제한다.

용어 "저해제가 FXIIa를 특이적으로 억제한다"는 저해제가 관련된 프로테아제, 특히 FXIIa 저해제의 각각의 적용에서 억제되어서는 안 되는 프로테아제를 실질적으로 억제하지 않는다(예를 들어, 치료적 적용에서 생리적으로 중요한 프로테아제는 실질적으로 억제되지 않음)는 것을 의미한다. 저해제는 100 nM, 250 nM, 500 nM 및 1000 nM 만큼 높은 농도에서 선호도가 증가함에 따라 이들 프로테아제를 억제하지 않는다. 용어 "관련된 프로테아제"는 바람직하게는 트립신, 보다 바람직하게는 트립신, 트롬빈, 플라스민, FXIa, PK(plasm kallikrein), uPA(urokinase-type plasminogen activator), tPA(tissue-type plasminogen activator), FXa 및 FVIIa를 포함하거나 구성되는 프로테아제를 의미한다. 하기 실시예들에서 입증된 바와 같이, CTI는 이미 20 nM 만큼 낮은 농도에서 이미 트립신의 활성을 억제하지만, FXII618의 경우 1000 nM 만큼 높은 농도에서 트립신의 억제가 관찰되지 않는다(도 4 참조).

본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 아미노산 (X⁴)는 바람직하게는 방향족 L-아미노산이고, 여기서, 방향족 L-아미노산의 알파-탄소는 단일 CH₂기에 의해 방향족 고리 구조에 부착되며, 가장 바람직하게는 방향족 L-아미노산이고, 여기서, 방향족 L-아미노산의 알파-탄소는 단일 CH₂기에 의해 방향족 고리 구조에 부착되며, 방향족 L-아미노산의 고리 구조는 다른 치환기를 가지지 않는다.

도 6의 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 펩타이드 FXII618의 3번 위치의 아미노산 F가 이 바람직한 구현예에 따른 구조적 특징을 갖는 아미노산으로 대체되는 경우 FXIIa의 억제 용량은 크게 영향을 받지 않거나 심지어 증가한다.

본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 아미노산 (X⁴)는 L, P, F, W, Y, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 3-플루오로-페닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 및 2-니트로-페닐알라닌으로 구성된 군, 바람직하게는 F, W, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 및 2-니트로-페닐알라닌으로 구성된 군, 보다 바람직하게는 F, W, 2-나프틸알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 및 2-니트로-페닐알라닌으로 구성된 군, 그리고, 가장 바람직하게는 2-나프틸알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 및 2-니트로-페닐알라닌으로 구성된 군으로부터 선택된다.

펩타이드 FXII618의 3번 위치의 아미노산 F는 아미노산 (X⁴)에 대응한다. 도 6의 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 펩타이드 FXII618의 3번 위치의 아미노산 F가 L, P, F, W, Y, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 3-플루오로-페닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 또는 2-니트로-페닐알라닌으로 대체되는 경우, 모든 경우에 100 nM 미만의 Ki가 유지된다. F, W, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 또는 2-니트로-페닐알라닌으로 대체되는 경우, 50 nM 미만의 Ki가 유지된다. F, W, 2-나프틸알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 또는 2-니트로-페닐알라닌으로 대체되면 Ki가 FXII618 또는 CTI의 Ki와 본질적으로 적어도 유사하게 된다. F가 2-나프틸알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 또는 2-니트로-페닐알라닌으로 대체되는 경우, 모든 경우에서 Ki는 15 nM 미만으로 현저하게 개선된다.

본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 아미노산 (X⁵)는 소수성 L-아미노산 또는 극성의 하전되지 않은 L-아미노산, 보다 바람직하게는 소수성 L-아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 S, A, L 또는 P, 그리고 가장 바람직하게는 L 또는 P이다.

펩타이드 FXII618의 6번 위치의 아미노산 P는 아미노산 (X⁵)에 대응한다. 도 6의 표에서 볼 수 있는 바와 같이, 6번 위치의 아미노산 P가 다른 소수성 L-아미노산 또는 극성의 하전되지 않은 L-아미노산으로 대체되는 경우 억제 용량은 현저히 감소되지는 않는다. 다른 소수성 L-아미노산으로 대체되면, 억제 용량은 크게 유지되지만, L로 대체되면 억제 용량은 약간 개선된다. 예를 들어, 도 6에서 P가 S, A 또는 L로 대체되면 FXIIa의 Ki는 모든 경우 100 nM 미만을 나타낸다.

본 발명의 제1 양태의 다른 바람직한 구현예에 따르면, (X²) 및 (X⁷)의 측쇄는 작용기를 포함하고, 바람직하게는 (X²) 및 (X⁷) 각각은 독립적으로 -NH₂ -COOH, -OH, -SH, 알켄, 알킨, 아자이드 및 클로로아세타마이드로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 -NH₂ 및 -SH, 가장 바람직하게는 -SH이다.

연결 분자의 적어도 두 개의 작용기는 같거나 다를 수 있고, 바람직하게는 같다. 펩타이드에서 위치 2번 및 7번의 FXII618 아미노산은 아미노산 (X²) 및 (X⁷)에 대응한다. 아미노산의 측쇄 내 작용기의 정확한 구조는 연결 분자를 통한 고리의 형성을 허용하는 한 특별히 중요하지는 않다고 여겨진다. 작용기 -NH₂ -COOH, -OH, -SH, 알켄, 알킨, 아자이드 및 클로로아세타마이드는 특히 이들 작용기에 대해 고리를 형성하기 위해 요구되는 화학 반응이 당해 기술 분야에 잘 확립되어 있으므로 바람직하다. FXII618에서 2번 및 7번 위치의 아미노산은 모두 시스테인이므로 -SH가 가장 바람직하다.

본 발명의 제1 양태의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 아미노산 (X²) 및 (X⁷)은 각각 독립적으로 K, 오르니틴, 티알라이신, 2,3-디아미노프로파노익 애시드, 디아미노부티릭 애시드, D, E, C, 호모시스테인, 페니실라민 및 프로파길글리신이고, 바람직하게는 C 또는 호모시스테인, 그리고 가장 바람직하게는 둘 다 C이다.

두 개의 아미노산 (X²) 및 (X⁷)은 같거나 다를 수 있고, 바람직하게는 같다. 이 보다 바람직한 구현예에서 나열된 아미노산은 -NH₂ -COOH, -OH, -SH, 알켄, 알킨, 아자이드 및 클로로아세타마이드로부터 선택된 작용기를 그들의 측쇄에 포함한다. FXII618에서 2번 및 7번 위치의 아미노산은 모두 시스테인이므로 시스테인이 가장 바람직하다.

본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, (X²)는 5-머캅토 노르발린, 호모시스테인 또는 C, 바람직하게는 호모시스테인 또는 C, 그리고 가장 바람직하게는 C이다; 및/또는 (X⁷)은 호모시스테인 또는 C, 바람직하게는 C이다.

언급된 바와 같이, FXII618에서 2번 및 7번 위치의 아미노산은 둘 다 C이다. 도 6에서 명백한 바와 같이, C는 FXIIa에 대한 억제 용량을 현저하게 감소하지 않으면서 아미노산의 2번 및/또는 7번 위치에서 다른 아미노산에 의해 대체될 수 있다. 예를 들어, (X²)에서 C가 5-머캅토 노르발린 또는 호모시스테인으로 대체되는 경우 FXIIa에 대한 Ki는 여전히 100 nM 미만이다. (X⁷)에서 C가 호모시스테인으로 대체되는 경우 FXIIa에 대한 Ki는 여전히 50 nM 미만이다.

본 발명의 제1 양태의 다른 바람직한 구현예에 따르면, (X¹) 및 (X⁸)이 존재하고, 각각 독립적으로 지방족 L-아미노산 또는 극성의 염기성 L-아미노산이며; 바람직하게는 아민기를 갖는 극성의 염기성 L-아미노산; 보다 바람직하게는 (X¹) 및 (X⁸)는 각각 독립적으로 라이신, 호모라이신, 아르기닌, 호모아르기닌으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 둘 다 아르기닌이다.

아미노산 (X¹) 및 (X⁸)는 같거나 다를 수 있고, 바람직하게는 같다. 펩타이드 FXII618에서 1번 및 8번 위치의 아미노산은 아미노산 (X¹) 및 (X⁸)에 대응한다. (X¹) 및 (X⁸) 위치에서 아미노산의 정확한 성질은 특별히 중요하지는 않다고 여겨진다. 펩타이드 FXII618에서 1번 및 8번 위치의 아미노산이 R이기 때문에, 상기 바람직한 구현예에 따른 (X¹) 및 (X⁸)의 바람직한 아미노산은 R과 구조적으로 유사하고, 바람직하게는 R인 아미노산이다.

본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, (X¹)은 D-Arg, 호모아르기닌, L, 노르아르기닌, 4-구아니디노페닐알라닌, 호모라이신, D-Arg-D-Ser 또는 L-Arg, 바람직하게는 호모아르기닌, L, 노르아르기닌, 4-구아니디노페닐알라닌, 호모라이신, D-Arg-D-Ser 또는 L-Arg, 그리고 가장 바람직하게는 호모라이신, D-Arg-D-Ser 또는 R이며; 및/또는 (X⁸)는 G, H 또는 R, 바람직하게는 H 또는 R이다. 언급된 바와 같이, FXII618에서 1번 및 8번 위치의 아미노산은 둘 다 R이다. 도 6에서 명백한 바와 같이, FXIIa에 대한 억제 용량을 현저하게 감소하지 않으면서 R은 아미노산 1번 및/또는 8번 위치에서 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. 예를 들어, (X¹)에서 R이 호모라이신 또는 D-Arg-D-Ser로 대체되는 경우, FXIIa에 대한 Ki는 적어도 FXII618의 FXIIa에 대한 Ki 만큼 우수하다. 또한, (X⁸)에서 R이 H로 대체되는 경우 FXIIa에 대한 Ki는 적어도 FXII618의 FXIIa에 대한 Ki 만큼 우수하다.

본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 연결 분자는 본 출원의 도 7에 나타낸 3가 및 2가의 링커로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 1,3-디아크릴로일-1,3,5-트리아지난(DATA), 1,3-디아크릴로일-1,3-디아지난(DADA) 또는 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난(TATA)이다.

펩타이드 FXII618에서, 연결 분자는 TATA이다. 상기 바람직한 구현예는 FXII618의 제1 고리만을 포함하므로, TATA는 DATA 또는 DADA로 대체될 수 있음이 명백하다. 두 개의 작용기는 아미노산 (X²) 및 (X⁷)을 연결하여 고리를 형성하기에 충분하다. 연결 분자의 정확한 성질은 특히 중요하지는 않은 것으로 보인다. 이것은 고리 구조 자체가 FXIIa와의 상호작용으로부터 오는 것이 아니라, 펩타이드 내의 아미노산을 3D-입체 구조로 유도하며, 여기서, 펩타이드는 FXIIa와 이상적으로 상호 작용할 수 있고, 상기 상호작용이 FXIIa의 억제를 유발하기 때문이다. 따라서, TATA에 의해 유도된 3D-입체 구조와 적어도 유사한 3D-입체 구조로 아미노산을 유도할 수 있는 임의의 링커가 본 발명에서 적합한 연결 분자일 것으로 기대된다.

본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 아미노산 (X⁸)은 존재하지 않으며, 저해제는 펩타이드 (X¹)(X²)(X³)_n(X⁴)RL(X⁵)(X⁶)_m(X⁷)(X⁹)_l(X¹⁰)(X¹¹)(X¹²)(X¹³)(X¹⁴)_k(X¹⁵)(X¹⁶)를 포함하거나 구성되는 바이사이클릭 저해제이며, 여기서, (X¹) 내지 (X⁷), n 및 m은 상기에서 정의된 바와 같으며; (X⁹)는 아미노산이며, l은 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이며; (X¹⁰)은 아미노산이고; (X¹¹)은 아미노산, 바람직하게는 Q이며; (X¹²)는 소수성 L-아미노산, 바람직하게는 지방족 L-아미노산, 및 가장 바람직하게는 L이고; (X¹³)은 아미노산이며; (X¹⁴)는 아미노산이며, k는 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이고; (X¹⁵)는 측쇄를 가진 아미노산이며; 및 (X¹⁶)은 존재하거나 그렇지 않으며, 존재하는 경우, 아미노산이고; 그리고 여기서, 상기 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)의 측쇄는 연결 분자를 통해 연결되고, 상기 연결 분자는 적어도 세 개의 작용기를 가지며 각 작용기는 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)의 측쇄 중 하나와 공유 결합을 형성한다.

따라서, 본 발명은 제2 양태에서 펩타이드 (X¹)(X²)(X³)_n(X⁴)RL(X⁵)(X⁶)_m(X⁷)(X⁹)_l(X¹⁰)(X¹¹)(X¹²)(X¹³)(X¹⁴)_k(X¹⁵)(X¹⁶)를 포함하거나 구성되는 응고 효소 활성화 인자 XII(FXIIa)의 바이사이클릭 저해제에 관한 것으로, 여기서, (X¹)은 존재하거나 그렇지 않으며, 존재하는 경우 아미노산이고; (X²)는 측쇄를 가진 아미노산이며; (X³)는 아미노산이며, n은 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이고; (X⁴)는 지방족 L-아미노산 또는 환형의 L-아미노산, 바람직하게는 L, P 또는 방향족 L-아미노산, 및 가장 바람직하게는 방향족 L-아미노산이며; (X⁵)는 아미노산이고; (X⁶)은 아미노산이며, m은 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이며; (X⁷)은 측쇄를 가진 아미노산이고; (X⁹)는 아미노산이며, l은 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이며; (X¹⁰)은 아미노산이고; (X¹¹)은 아미노산, 바람직하게는 Q이며; (X¹²)는 소수성 L-아미노산, 바람직하게는 지방족 L-아미노산, 및 가장 바람직하게는 L이고; (X¹³)은 아미노산이며; (X¹⁴)는 아미노산이며, k는 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이고; (X¹⁵)는 측쇄를 가진 아미노산이며; 및 (X¹⁶)은 존재하거나 그렇지 않으며, 존재하는 경우, 아미노산이고; 그리고 여기서, 상기 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)의 측쇄는 연결 분자를 통해 연결되고, 상기 연결 분자는 적어도 세 개의 작용기를 가지며 각 작용기는 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)의 측쇄 중 하나와 공유 결합을 형성한다.

적용 가능한 경우, 본 발명의 제1 양태와 관련하여 상기 기재된 정의 및 바람직한 구현예들은 본 발명의 바이사이클릭 저해제에 동일하게 적용된다. 예를 들어, 또한 바이사이클릭 저해제는 FXIIa에 대해 500 nM 미만, 바람직하게는 250 nM 미만, 보다 바람직하게는 100 nM 미만, 훨씬 더 바람직하게는 50 nM 미만 그리고 가장 바람직하게는 25 nM 미만의 저해상수(Ki)를 가질 수 있다. 마찬가지로, 이 저해제는 바람직하게는 FXIIa를 특이적으로 억제한다.

상기에서 논의된 바와 같이, 펩타이드 FXII618(SEQ NO: 1)은 FXIIa의 바이사이클릭 저해제이다. 본 발명의 제1 양태의 상기 바람직한 구현예에 기재된 일반 펩타이드 서열 및 본 발명의 제2 양태에 기재된 펩타이드 서열은 바이사이클릭 펩타이드 FXII618의 두 개의 거대환 고리의 구조에 기초한다. 일반 펩타이드 서열에서 (X²) 및 (X⁷) 사이에는 제1 고리가 형성되나, 제2 고리는 (X⁷) 및 (X¹⁵) 사이에 형성된다.

위치 (X³)_n 및 (X⁶)_m, (X⁹)_l 및 (X¹⁴)_k 위치의 아미노산들과 관련하여, n, m, l 및 k는 바이사이클릭 펩타이드 FXII618의 고리에서 모두 0임을 나타낸다. 다른 말로 하면, 이들 아미노산이 FXII618에는 없다. FXIIa에 대한 억제 활성을 실질적으로 제한하지 않으면서 추가의 아미노산을 제1 고리에 첨가할 수 있다고 생각하지만, FXII618에서와 같이 n, m, l 및 k 모두 0인 것이 가장 바람직하다.

하기의 실시예들에서 나타난 바와 같이, 제2 환은 FXIIa와 임의의 특정 상호작용을 형성하지 않을 가능성이 가장 높다. 이러한 이유로, 상기 바람직한 구현예의 가장 넓은 의미에서 제2 환에 고정되는 아미노산은 없다. FXII618의 9번 및 10번 위치의 아미노산은 상기 바람직한 구현예의 일반 펩타이드 서열의 아미노산 (X¹¹) 및 (X¹²)에 대응한다. 도 6에 도시된 Gln9 및 Leu10의 아미노산 변화로부터 명백한 바와 같이, 대응하는 위치 (X¹¹) 및 (X¹²)의 특정 아미노산에 어느 정도 선호도가 주어질 수 있다. 이러한 이유로, (X¹¹)은 바람직하게는 Q이고, (X¹²)는 지방족 L-아미노산이고, 바람직하게는 호모루신, 노르루신, 3-에틸노르발린, 3-터트-부틸알라닌 또는 L이고, 보다 바람직하게는 3-터트-부틸알라닌 또는 L이며, 가장 바람직하게는 L이다. 제2 환에서 이들 아미노산은 FXIIa의 억제에 이상적인 3D 입체 구조로 펩타이드 FXII618을 유도하는데 기여할 것이다.

본 발명의 제2 양태의 바람직한 구현예에 따르면, (X⁴)는 L, P, F, W, Y, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 3-플루오로-페닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 및 2-니트로-페닐알라닌으로 구성된 군, 바람직하게는 F, W, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 및 2-니트로-페닐알라닌으로 구성된 군, 보다 바람직하게는 F, W, 2-나프틸알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 및 2-니트로-페닐알라닌으로 구성된 군, 그리고 가장 바람직하게는 2-나프틸알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 및 2-니트로-페닐알라닌으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 제2 양태의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, (X⁵)는 소수성 L-아미노산 또는 극성의 하전되지 않은 L-아미노산이고, 바람직하게는 소수성 L-아미노산, 보다 바람직하게는 S, A, L 또는 P, 그리고 가장 바람직하게는 L 또는 P이다.

본 발명의 제1 양태의 보다 바람직한 구현예 및 본 발명의 제2 양태의 바람직한 구현예에 따르면, (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)의 측쇄는 작용기를 포함하고, 바람직하게는 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵) 각각은 독립적으로 -NH₂, -COOH, -SH, 알켄, 알킨, 아자이드 및 클로로아세타마이드로부터 선택되고, 바람직하게는 -NH₂ 및 -SH, 그리고 가장 바람직하게는 -SH이다.

연결 분자의 적어도 세 개의 작용기는 같거나 다를 수 있고, 바람직하게는 같다. 펩타이드 FXII618에서 2번, 7번 및 12번 위치의 아미노산은 아미노산 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)에 대응한다. 아미노산의 측쇄 내의 작용기의 정확한 구조는 연결 분자를 통한 고리의 형성을 허용하는 한 특별히 중요하지는 않지만, 작용기 -NH₂ -COOH, -OH, -SH, 알켄, 알킨, 아자이드 및 클로로아세타마이드는 특히 이들 작용기에 대해 필요한 화학 반응이 당해 기술 분야에서 잘 확립되어 있으므로 바람직한 것으로 보인다. FXII618에서 2번, 7번 및 12번 위치의 아미노산이 모두 시스테인이므로 -SH가 가장 바람직하다.

본 발명의 제1 양태의 보다 바람직한 구현예 및 본 발명의 제2 양태의 바람직한 구현예에 따르면, 아미노산 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)는 각각 독립적으로 K, 오르니틴, 티알라이신, 2,3-디아미노프로파노익 애시드, 디아미노부티릭 애시드, D, E, C, 호모시스테인, 페니실라민 또는 프로파길글리신이고, 바람직하게는 C 또는 호모시스테인이며, 가장 바람직하게는 모두 C이다.

세 개의 아미노산 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)는 같거나 다를 수 있고, 바람직하게는 같다. 이보다 바람직한 구현예에서 나열된 아미노산은 -NH₂ -COOH, -OH, -SH, 알켄, 알킨, 아자이드 및 클로로아세타마이드로부터 선택된 하나의 작용기를 그들의 측쇄에 포함한다. FXII618에서 2번, 7번 및 12번 위치의 아미노산이 모두 시스테인이므로 아미노산 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)에 대해 시스테인이 가장 바람직하다.

본 발명의 제1 양태의 보다 바람직한 구현예 및 본 발명의 제2 양태의 바람직한 구현예에 따르면, (X²)는 5-머캅토-노르발린, 호모시스테인 또는 C이고, 바람직하게는 호모시스테인 또는 C이며, 가장 바람직하게는 C이다; 및/또는 (X⁷)는 호모시스테인 또는 C이고, 바람직하게는 C이다; 및/또는 (X¹⁵)는 5-머캅토-노르발린, 호모시스테인 또는 C이고, 바람직하게는 호모시스테인 또는 C이다.

FXII618의 2번, 7번 및 12번 위치의 아미노산은 모두 C이다. 상기 보다 바람직한 구현예에서 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)는 각각 FXII618의 아미노산 위치 2번, 7번 및 12번에 대응한다. 도 6으로부터 더 명백한 바와 같이, C는 FXIIa에 대한 억제능을 현저히 감소시키지 않으면서 아미노산 위치 2번, 7번 및/또는 15번에서 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. 예를 들어, (X¹⁵)의 C가 호모시스테인으로 대체된 경우 FXIIa에 대한 Ki는 16 nM이므로, FXII618의 FXIIa에 대한 Ki보다 심지어 더 우수하다.

본 발명의 제1 양태의 보다 바람직한 구현예 및 본 발명의 제2 양태의 바람직한 구현예에 따르면, 아미노산 (X¹) 및 (X¹⁶)은 존재하고, 각각 독립적으로 지방족 L-아미노산 또는 극성의 염기성 L-아미노산이며; 바람직하게는 아민기를 갖는 극성의 염기성 L-아미노산; 보다 바람직하게는 (X¹) 및 (X¹⁶) 각각은 각각 독립적으로 라이신, 호모라이신, 아르기닌, 호모아르기닌으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 둘 다 아르기닌이다.

본 발명의 제1 양태의 보다 바람직한 구현예 및 본 발명의 제2 양태의 바람직한 구현예에 따르면, 아미노산 (X¹⁰) 및 (X¹³)은 각각 독립적으로 지방족 L-아미노산 또는 극성의 염기성 L-아미노산이고; 바람직하게는 아민기를 갖는 극성의 염기성 L-아미노산; 보다 바람직하게는 (X¹⁰) 및 (X¹³)은 각각 독립적으로 라이신, 호모라이신, 아르기닌, 호모아르기닌으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 둘 다 아르기닌이다.

펩타이드 FXII618에서 8번 및 11번 위치의 아미노산은 아미노산 (X¹⁰) 및(X¹³)에 대응한다. 위치 (X¹⁰) 및 (X¹³)의 아미노산의 정확한 성질은 그들이 FXIIa와 상호 작용을 하지 않기 때문에 특히 중요하다고는 여겨지지 않는다. 펩타이드 FXII618에서 8번 및 11번 위치의 아미노산이 R이기 때문에, 상기 바람직한 구현예에 따른 (X¹⁰) 및 (X¹³)의 바람직한 아미노산은 구조적으로 R과 유사한 아미노산이다.

본 발명의 제1 양태의 또 다른 보다 바람직한 구현예 및 본 발명의 제2 양태의 바람직한 구현예에 따르면, (X¹)은 D-Arg, 호모아르기닌, L, 노르아르기닌, 4-구아니디노페닐알라닌, 호모라이신, D-Arg-D-Ser 또는 L-Arg, 바람직하게는 호모아르기닌, L, 노르아르기닌, 4-구아니디노페닐알라닌, 호모라이신, D-Arg-D-Ser 또는 L-Arg이고, 가장 바람직하게는 호모라이신, D-Arg-D-Ser 또는 L-Arg이며; 및/또는 (X¹⁰)은 G, H 또는 R, 바람직하게는 H 또는 R이며; (X¹³)는 A, G, (S)-β3-호모아르기닌 또는 R, 바람직하게는 (S)-β3-호모아르기닌 또는 R이며, 및/또는 (X¹⁶)는 R이거나 존재하지 않는다.

FXII618의 1번, 8번, 11번 및 13번 위치의 아미노산은 모두 R이다. FXII618의 1번, 8번, 11번 및 13번 위치의 아미노산은 각각 상기 보다 바람직한 구현예에서 위치 (X¹), (X¹⁰), (X¹³) 및 (X¹⁶)에 대응한다. 도 6에서 명백한 바와 같이, R은 하나 이상의 아미노산 위치 1번, 8번, 11번 및 13번에서 FXIIa에 대한 억제능을 현저히 감소시키지 않으면서 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. 예를 들어, (X¹³)에서 R이 (S)-β3-호모아르기닌으로 대체되는 경우, FXIIa에 대한 Ki는 FXII618의 FXIIa에 대한 Ki와 비교하여 심지어 개선된다. 위치 (X¹⁶)의 R이 존재하지 않으면(즉, R이 FXII618로부터 결실됨), FXIIa에 대한 Ki는 FXII618의 FXIIa에 대한 Ki 만큼 본질적으로 우수하다.

저해제가 바이사이클릭 저해제인 본 발명의 제1 양태의 다른 보다 바람직한 구현예및 본 발명의 제2 양태의 바람직한 구현예에 따르면, 연결 분자는 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난(TATA), 1,3,5-트리스(클로로아세틸)-1,3,5-트리아지난(TCAT), 1,3,5-트리스(브로모아세틸)-1,3,5-트리아지난(TBAT), 1,3,5-트리스(브로모메틸)벤젠(TBMB) 및 2,4,6-트리스(브로모메틸)-1,3,5-트리아진(TBMT)로부터 선택되며, 바람직하게는 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난(TATA)이다.

본 발명의 제1 양태의 보다 바람직한 구현예 및 제2 양태의 바람직한 구현예에 따른 모든 연결 분자는 상기 논의된 바이사이클릭 저해제의 두 개의 고리를 형성할 수 있도록 세 개의 작용기를 갖는다. 언급된 바와 같이, 바이사이클릭 펩타이드 FXII618에서 연결 분자는 TATA이다. 이러한 이유로, TATA가 가장 바람직하다. 바람직한 구현예에서 인용된 다른 링커들은 구조적으로 TATA와 유사하므로, TATA에 대한 적절한 대안의 비제한적 예시들이다. 이는 TBAT 및 TBMT에 대한 하기 실시예들에서 예시적으로 보여주고 있다. FXII618에서 TBAT 또는 TBMT에 의한 TATA의 대체에도 불구하고 FXIIa에 대한 특이적인 억제능은 유지되었다.

본 발명의 제1 양태의 다른 보다 바람직한 구현예 및 본 발명의 제2 양태의 바람직한 구현예에 따르면, 다음 항목 (i) 내지 (iv) 중 적어도 하나가 적용된다: (i) (X¹)은 D-Arg-D-Ser이고, (ii) (X⁴)는 4-플루오로-페닐알라닌이며, (iii) (X¹⁰)는 H이고, 및/또는 (iv) (X¹³)은 (S)-β3-호모아르기닌이다; 여기서 (X¹⁶)은 선택적으로 존재하지 않으며, 연결 분자는 바람직하게는 TATA이다.

용어 "적어도 하나"는 선호도가 적어도 둘, 적어도 셋 및 넷 모두 증가하는 것을 의미한다.

하기 실시예들에서 보여주고 상기 논의된 바와 같이, FXII618의 아미노산 서열에서 아미노산 위치 4번 및 5번에서 각각 R 및 L 이외의 아미노산으로 대체하면 일반적으로 FXII618의 FXIIa에 대한 Ki보다 훨씬 우수한 FXIIa에 대한 Ki를 갖는 FXII618의 유도체들이 된다. 실시예들은 위치 (X¹), (X⁴), (X¹⁰) 및 (X¹³)이 각각 FXII618의 아미노산 위치 1번, 4번, 8번 및 11번에 대응함을 나타내면서, (X¹)에서 대체 아미노산 D-Arg-D-Ser, (X⁴)에서 4-플루오로-페닐알라닌, (X¹⁰)에서 H, 및 (X¹³)에서 (S)-β3-호모아르기닌이다.

특히 (X¹)에서 대체 아미노산 D-Arg-D-Ser, (X⁴)에서 4-플루오로-페닐알라닌, (X¹⁰)에서 H, 및 (X¹³)에서 (S)-β3-호모아르기닌은 FXII618에서 둘 이상의 유리한 아미노산 치환의 조합 효과를 입증하기 위해 추가로 조사되었기 때문에 이들 아미노산 치환은 특히 바람직하다. 하기 실시예들에서, 이들 아미노산 치환의 임의의 세 개 또는 네 개 모두 FXII618의 아미노산 서열에 도입되는 경우, 각각의 단일 아미노산 치환의 유리한 효과가 합쳐져서 이들 아미노산 치환체 중 하나만 갖는 FXII618 유도체보다 훨씬 강력한 FXII618 유도체들이 된다는 것을 보여준다. 이들 아미노산 치환 중 임의의 세 개 또는 네 개 모두 FXII618의 아미노산 서열에 도입되는 경우, 생성된 FXII618 유도체들은 FXII618에 대해 1 nM 또는 심지어 그 아래의 pM 범위의 Ki를 갖는다(실시예 5.3에서 표 참조).

실시예 5.3의 표에서 나타난 FXII618 유도체들은 여기에 기술된 FXIIa에 대한 가장 효과적인 저해제들이므로 본 발명의 제1 양태 및 제2 양태의 가장 바람직한 저해제들이다. 이들 가장 바람직한 저해제는 rsCF^4FRLPCHQLR^bCR, rsCF^4FRLPCHQLRCR, rsCF^4FRLPCRQLR^bCR, rsCFRLPCHQLR^bCR 및 rsCF^4FRLPCHQLR^bC이고, 여기서, rs는 D-Arg-D-Ser이고; F^4F는 4-플루오로-페닐알라닌이며, R^b는 (S)-β3-호모아르기닌이다.

이들 조합 실험의 맥락에서, 추가로 FXII618 유도체들의 마지막 아미노산 위치의 R은 불필요하며, 이 불필요한 아미노산은 (X¹⁶)에 대응한다는 것을 알 수 있다. 여기에 개시된 대부분의 FXII618 유도체들에서, 조합성 FXII618 유도체들에서 연결 분자는 FXII618에서와 같이 TATA이다.

요약하면, 실시예 5.3의 예시된 조합성 FXII618 유도체들에 기초하여, 본 발명과 관련하여 FXII618의 억제능을 추가로 개선하기 위해 발견된 아미노산 변화가 조합될 수 있고, 일반적으로 개개의 아미노산의 변화의 개선을 넘어서는 개선을 조합하여 생산할 수 있음이 보인다.

저해제의 고리 내 변이체 아미노산 위치의 각각에 대해, 만약 존재하는 경우, 저해제의 제2 고리 내 각 변이체 아미노산 위치 및 연결 분자에 대해 본 발명의 제1 양태 및 제2 양태를 정의하는 구현예와 제1 양태 및 상기 제2 양태의 상기 바람직한 그리고 보다 바람직한 구현예들의 바람직한 선택은 FXII618의 억제능을 유지하거나 본질적으로 유지하거나 심지어 개선을 구성하는 도 6에서 FXII618의 구조 및 이의 변이체들의 구조와 더욱더 유사한 증가하는 선호도에 따른 구조들을 정의한다. 따라서, 당업자는 각 변이체 아미노산 위치에 대래 점차적으로 바람직한 아미노산의 임의의 조합을 포함하는 구현예들 및 선택적으로 연결 분자에 대한 바람직한 구조는 본 발명의 일부를 형성한다는 것을 즉시 이해할 수 있다.

그러한 구현예의 비제한적 예는 펩타이드 (X¹)(X²)(X³)_n(X⁴)RL(X⁵)(X⁶)_m(X⁷)(X⁸)을 포함하거나 구성되는 응고 효소 활성화 인자 XII(FXIIa)의 사이클릭 저해제이며, 여기서, (X¹)는 아미노산, 바람직하게는 R이고; (X²)는 C이며; (X³)는 아미노산이고, n은 0이며; (X⁴)는 F, W, 2-나프틸알라닌 및 3-벤조티에닐알라닌, 바람직하게는 2-나프틸알라닌이며, (X⁵)는 L 또는 P이고; (X⁶)는 아미노산이고, m은 0이며; (X⁷)는 C이고; 및 (X⁸)는 아미노산, 바람직하게는 R이며; 그리고 여기서, (X²) 및 (X⁷)의 측쇄는 연결 분자에 의해 연결되고, 상기 연결 분자는 1,3-디아크릴로일-1,3,5-트리아지난(DATA), 1,3-디아크릴로일-1,3-디아지난(DADA) 및 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난(TATA)로부터 선택된다. 또한, 이 구현예와 관련하여, 저해제는 바람직하게는 100 nM 미만, 보다 바람직하게는 50 nM 미만, 가장 바람직하게는 25 nM 미만의 FXIIa에 대한 저해상수(Ki)를 가지며, 및/또는 저해제는 FXIIa를 특이적으로 억제한다.

그러한 구현예의 추가의 비제한적 예시는 펩타이드 (X¹)(X²)(X³)_n(X⁴)RL(X⁵)(X⁶)_m(X⁷)(X⁸)를 포함하거나 구성되는 응고 효소 활성화 인자 XII(FXIIa)의 사이클릭 저해제이며, 여기서, (X¹)는 아미노산, 바람직하게는 D-Arg-D-Ser 또는 D-Arg이며; (X²)는 C이고; (X³)는 아미노산이고, n은 0이며; (X⁴)는 F, W, 2-나프틸알라닌 및 3-벤조티에닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 또는 2-니트로-페닐알라닌이며; 및 바람직하게는 2-나프틸알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 또는 2-니트로-페닐알라닌이며, (X⁵)는 L 또는 P이고; (X⁶)는 아미노산이고, m은 0이며; (X⁷)는 C이고; 및 (X⁸)는 아미노산, 바람직하게는 H 또는 R이며; 그리고 여기서, (X²) 및 (X⁷)의 측쇄는 연결분자에 의해 연결되고, 상기 연결 분자는 1,3-디아크릴로일-1,3,5-트리아지난(DATA), 1,3-디아크릴로일-1,3-디아지난(DADA) 및 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난(TATA)로부터 선택된다. 또한, 이 구현예와 관련하여, 저해제는 바람직하게는 100 nM 미만, 보다 바람직하게는 50 nM 미만, 가장 바람직하게는 25 nM 미만의 FXIIa에 대한 저해상수(Ki)를 가지며, 및/또는 저해제는 FXIIa를 특이적으로 억제한다.

그러한 구현예의 또 다른 비제한적 예시는 펩타이드 (X¹)(X²)(X³)_n(X⁴)RL(X⁵)(X⁶)_m(X⁷)(X⁹)_l(X¹⁰)(X¹¹)(X¹²)(X¹³)(X¹⁴)_k(X¹⁵)(X¹⁶)를 포함하거나 구성되는 응고 효소 활성화 인자 XII(FXIIa)의 바이사이클릭 저해제이며, 여기서, (X¹)는 아미노산, 바람직하게는 R이며; (X²)는 C이고; (X³)는 0이며; (X⁴)는 F, W, 2-나프틸알라닌 및 3-벤조티에닐알라닌, 및 바람직하게는 2-나프틸알라닌이며; (X⁵)는 L 또는 P이고; (X⁶)는 0이며; (X⁷)는 C이고; (X⁹)는 아미노산이고, l은 0이며; (X¹⁰)는 아미노산, 바람직하게는 R이며; (X¹¹)는 Q이고; (X¹²)는 L이며; (X¹³)는 아미노산, 바람직하게는 R이며; (X¹⁴)는 아미노산이고, k는 0이며, (X¹⁵)는 C이고; 및 (X¹⁶)는 아미노산이고, 바람직하게는 R이며; 그리고 여기서, (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)의 측쇄는 연결 분자에 의해 연결되고, 상기 연결 분자는 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난(TATA)이다. 유사하게, 이 구현예와 관련하여, 저해제는 바람직하게는 100 nM 미만, 보다 바람직하게는 50 nM 미만, 가장 바람직하게는 25 nM 미만의 FXIIa에 대한 저해상수(Ki)를 가지며, 및/또는 저해제는 FXIIa를 특이적으로 억제한다.

그러한 구현예의 또 다른 비제한적 예시는 펩타이드 (X¹)(X²)(X³)_n(X⁴)RL(X⁵)(X⁶)_m(X⁷)(X⁹)_l(X¹⁰)(X¹¹)(X¹²)(X¹³)(X¹⁴)_k(X¹⁵)(X¹⁶)을 포함하거나 구성되는 응고 효소 활성화 인자 XII(FXIIa)의 바이사이클릭 저해제이며, 여기서, (X¹)는 아미노산, 바람직하게는 호모라이신, D-Arg-D-Ser 또는 D-Arg이며; (X²)는 C이고; (X³)는 아미노산이고, n은 0이며; (X⁴)는 F, W, 2-나프틸알라닌 및 3-벤조티에닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 또는 2-니트로-페닐알라닌; 및 바람직하게는 2-나프틸알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 또는 2-니트로-페닐알라닌이며, (X⁵)는 L 또는 P이고; (X⁶)는 아미노산이고, m은 0이며; (X⁷)는 C이고; (X⁹)은 아미노산이고, l은 0이며; (X¹⁰)는 아미노산, 바람직하게는 H 또는 R이며; (X¹¹)은 Q이고, (X¹²)은 L이며; (X¹³)은 아미노산, 바람직하게는 (S)-β-호모아르기닌 또는 R이며; (X¹⁴)는 아미노산이고, k는 0이며, (X¹⁵)는 호모시스테인 또는 C이고; 및 (X¹⁶)는 아미노산, 바람직하게는 존재하지 않거나 R이며; 그리고 여기서, (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)의 측쇄는 연결 분자에 의해 연결되고, 상기 연결 분자는 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난(TATA)이다. 유사하게, 이 구현예와 관련하여, 저해제는 바람직하게는 100 nM 미만, 보다 바람직하게는 50 nM 미만, 가장 바람직하게는 25 nM 미만의 FXIIa에 대한 저해상수(Ki)를 가지며, 및/또는 저해제는 FXIIa를 특이적으로 억제한다.

본 발명은 또한 펩타이드 (X¹)RL(X²)를 포함하거나 구성되는 응고 효소 활성화 인자 XII(FXIIa)의 사이클릭 저해제에 관한 것으로, 여기서, (X¹) 및 (X²)는 아미노산, 바람직하게는 알파-아미노산, 가장 바람직하게는 각각 F 및 P이고, 펩타이드 결합에 의해 결합되며; 또는, 여기서, (X¹) 및 (X²)는 측쇄를 가진 아미노산이고, (X¹) 및 (X²)는 연결 분자에 의해 연결되며, 상기 연결 분자는 적어도 두 개의 작용기를 가지며, 각 작용기는 (X²) 및 (X⁷)의 측쇄 중 하나와 공유 결합을 형성한다.

적용 가능한 경우, 본 발명의 제1 양태 및/또는 제2 양태와 관련하여 상기 기재된 정의 및 바람직한 구현예들은 본 발명의 이 추가의 사이클릭 저해제에 동등하게 적용된다. 또한, 이 저해제는 FXIIa에 대해 500 nM 미만, 바람직하게는 250 nM 미만, 보다 바람직하게는 100 nM 미만, 훨씬 더 바람직하게는 50 nM 미만, 그리고 가장 바람직하게는 25 nM 미만의 저해상수(Ki)를 가질 수 있다. 유사하게, 이 저해제는 바람직하게는 FXIIa를 특이적으로 억제한다. FXIIa의 효소 활성을 억제하는 엑스 비보 방법은 FXIIa와 본 발명의 저해제를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서, FXIIa는 바람직하게는 혈액, 혈장 또는 혈청 시료에 존재한다. (X¹) 및 (X²)가 측쇄를 가진 아미노산인 경우, 측쇄는 작용기를 포함하는 것이 바람직하고, 바람직하게는 (X¹) 및 (X²) 각각은 독립적으로 -NH₂ -COOH, -OH, -SH, 알켄, 알킨, 아자이드 및 클로로아세타마이드로부터 선택되고, 바람직하게는 -NH₂ 및 -SH, 그리고 가장 바람직하게는 -SH이다. 또한, (X¹) 및 (X²)가 측쇄를 가진 아미노산이라면, 아미노산 (X¹) 및 (X²)는 각각 독립적으로 K, 오르니틴, 티알라이신, 2,3-디아미노프로파노익 애시드, 디아미노부티릭 애시드, D, E, C, 호모시스테인, 페니실라민 또는 프로파길글리신, 바람직하게는 C 또는 호모시스테인, 그리고 가장 바람직하게는 둘 다 C이다. 연결 분자는 도 7에 도시된 3가 및 2가 링커들로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 1,3-디아크릴로일-1,3,5-트리아지난(DATA), 1,3-디아크릴로일-1,3-디아지난(DADA) 또는 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난(TATA)이다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 거대환 고리를 포함하는 것을 특징으로 하는 응고 효소 FXIIa의 저해제에 관한 것이다. 보통, 상기 거대환 고리는 i) 적어도 12개의 원자들 및 42개 이하의 원자들의 고리 크기를 가지며, ii) 2개의 인접한 아미노산 X₁X₂를 포함하며, 두 아미노산은 L 배열을 가지며 펩타이드 결합에 의해 연결되고, 여기서, 제1 아미노산 X₁의 측쇄는 적어도 네 개의 원자 결합의 알파-탄소 원자로부터의 거리를 가진 양전하를 함유하고, 여기서, 상기 저해제는 500 nM 미만의 저해상수(Ki)로 응고 효소 FXIIa에 결합한다.

바람직하게는 아미노산 X₁은 측쇄에 구아니딘, 아미딘, 벤자미딘 또는 아미노기를 포함하는 아미노산의 군으로부터 선택된다. 아미노산 서열 X₁X₂은 일반적으로 아미노산에 의해 각 측면에 위치하며, 네 개의 아미노산은 펩타이드 결합에 의해 연결된다. 거대환 고리는 화학적 링커 또는 이황화 브릿지를 통해 연결된 적어도 두 개의 시스테인을 함유하는 펩타이드에 기초한다.

또한, 바람직하게는 상기 저해제는 400 nM 미만, 보다 바람직하게는 200 nM 미만, 훨씬 더 바람직하게는 100 nM 미만의 저해상수(Ki)로 응고 효소 FXIIa에 결합한다. 다르게는, 본 발명의 저해제는 측쇄를 통해 화학적 링커에 연결된 적어도 세 개의 시스테인을 함유하는 펩타이드에 의해 형성된 두 개의 거대환 고리를 포함한다. 바람직하게는 펩타이드는 다음의 서열(SEQ ID No 1): Arg-Cys-Phe-Arg-Leu-Pro-Cys-Arg-Gln-Leu-Arg-Cys-Arg를 가지며, 화학적 링커는 시약 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난(TATA)이거나 이를 기반으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 본질적으로 아미노산 서열 Xaa1-Cys-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Xaa8(SEQ ID No. 2)로 구성된 응고 효소 FXIIa의 바이사이클릭 펩타이드 저해제에 관한 것으로, 여기서, 적어도 세 개의 아미노산은 하기에 나타낸 바와 같거나 독립적으로 Xaa2=Trp; Xaa3=Gly; Xaa4=Ala; Xaa5=Leu; Xaa6=Asn; Xaa7=Val로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 바이사이클릭 펩타이드 저해제는 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난으로 고리화되었다.

본 발명의 또 다른 목적은 본질적으로 아미노산 서열 Xaa1-Cys-Cys-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Cys-Xaa8(SEQ ID No. 3)로 구성된 응고 효소 FXIIa의 바이사이클릭 펩타이드 저해제를 제공하는 것으로, 여기서, 적어도 두 개의 아미노산은 아래에 나타낸 바와 같으며: Xaa2=Tyr; Xaa3=Leu; Xaa4=Arg, 상기 바이사이클릭 펩타이드 저해제는 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난으로 고리화되었다.

본 발명의 또 다른 목적은 본질적으로 아미노산 서열 Xaa1-Cys-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Cys-Xaa14(SEQ ID No. 4)로 구성된 응고 효소 FXIIa의 바이사이클릭 펩타이드 저해제를 제공하는 것으로, 여기서, 적어도 두 개의 아미노산은 아래에 나타낸 바와 같으며: Xaa2=Trp; Xaa3=Gly; Xaa4=Ala; Xaa5=Ala, 여기서, 상기 바이사이클릭 펩타이드 저해제는 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난으로 고리화되었다.

본 발명은 또한 SEQ ID NOs: 1 및 5 내지 89의 아미노산 서열(도 9 참조), 상기 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 응고 효소 FXIIa의 저해제에 관한 것이다. SEQ ID NOs: 1 및 5 내지 89에서 SEQ ID NO: 1이 가장 바람직하다.

본 발명은 또한 SEQ ID NOs: 1 및 5 내지 89의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 응고 효소 FXIIa의 저해제에 관한 것으로, 여기서, 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 첨가되었다. 이와 관련하여, 용어, 1 내지 수개는 바람직하게는 세 개, 두 개 또는 단지 하나의 아미노산이 결실, 치환 또는 첨가된 것을 선호하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 저해제는 측쇄를 통해 화학적 링커에 연결된 적어도 세 개의 시스테인을 함유하는 펩타이드에 의해 형성된 두 개의 거대환 고리를 포함할 수 있다. 바람직하게는 펩타이드는 다음의 서열을 가지며(SEQ ID NO 1): Arg-Cys-Phe-Arg-Leu-Pro-Cys-Arg-Gln-Leu-Arg-Cys-Arg, 화학적 링커는 시약 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난(TATA)에 기초한다.

본 발명은 또한 항체의 Fc 도메인, 알부민 바인더, IgG 바인더 또는 항체에 융합된 본 발명의 저해제를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.

여기에 사용된 바와 같이 용어 "융합 단백질"은 일반적으로 분리된 (폴리)펩타이드를 암호화하는 둘 이상의 핵산 분자의 결합을 통해 생성된 (폴리)펩타이드 구조물을 지칭한다. 다른 말로, 이 융합된 핵산 분자의 번역 결과 원래 (폴리)펩타이드들 각각에서 유래한 기능적 특성들이 있는 단일 (폴리)펩타이드가 생성된다. (폴리)펩타이드들은 직접 융합되거나 링커, 즉 짧은 펩타이드 서열을 통해 융합될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질들은 당업자에게 잘 알려진 재조합 DNA-기술에 의해 인공적으로 생성된다. 그러나 본 발명의 융합 단백질들은 평범한 유기 합성 전략, 고체상-관련 합성 기술과 같은 많은 종래의 공지된 기술 또는 상업적으로 이용 가능한 자동 합성기에 의해 제조될 수 있다. 융합 단백질들은 생물학적 연구나 치료 요법에 사용될 수 있다.

바람직하게는 Fc 도메인은 본 발명의 저해제의 인 비보 반감기를 연장하는 것을 허용하는 하나 이상의 인간 기능성 Fc 도메인이다. 본 발명의 저해제들은 하나 이상의 기능성 Fc 도메인의 N- 또는 C-말단 중 어느 하나 또는 하나 이상의 Fc 도메인의 N- 및 C-말단 모두에 융합될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질들은 적어도 하나의 측면, 예를 들어, 하나 이상의 바람직하게는 하나의 Fc 도메인의 N-말단에 융합된 본 발명의 저해제들의 사량체, 삼량체 또는 이량체와 같은 다량체를 포함할 수 있다. 알부민 바인더 및 IgG 바인더의 예는 문헌 Gebauer and Skerra (2009), 13:245-255에 기술되어 있다. 따라서, 알부민 바인더 및 IgG 바인더의 바람직한 예는 인간 단일 Ig 도메인(dubbled Albumin Dab), 나노바디, 스트렙토코컬 프로테인 G에서 유래된 자연 발생 알부민 바인딩 도메인(ABD) 및 IgG에 결합하는 도메인이다. 또한, 그러한 융합 단백질들은 예를 들어 인 비보 또는 엑스 비보에서 특히 혈액 내 본 발명의 저해제의 반감기를 증가시킨다.

본 발명은 또한 약학적 활성 화합물, 진단적 활성 화합물 및/또는 혈청 반감기를 조절하는 성분에 융합된 본 발명의 저해제를 포함하는 융합 구조물에 관한 것이다.

여기에 사용된 바와 같은 "융합 구조물"은 본 발명의 저해제와 화합물의 융합을 정의하며, 이 화합물은 약학적 활성 화합물, 진단적 활성 화합물 및/또는 혈청 반감기를 조절하는 성분으로 구성된 군으로부터 선택된다. 화합물은 단백질성 화합물 또는 비-단백질성 화합물일 수 있다. 화합물이 단백질성 화합물(예를 들어, 하기에 기술된 바와 같은 항체)인 경우, 융합 구조물은 또한 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질이다. 다른 말로, 용어 "융합 구조물"은 융합 단백질을 포함한다. 화합물은 본 발명의 저해제에 직접 융합되거나 링커를 통해 융합될 수 있다. 본 발명에 따른 링커는 바람직하게는 1 내지 30개의 탄소 원자를 가진 알킬, 1 내지 20개의 에틸렌 잔기를 가진 폴리에틸렌글리콜, 1 내지 2O개의 잔기를 가진 폴리글리신, 1 내지 20개의 잔기를 가진 Gly-Ser 링커, 카프로익 애시드, 치환되거나 비치환된 폴리-p-페닐렌 및 트리아졸로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 구현예에서, 상기 링커는 아미노-n-알킬, 머캅토-n-알킬, 아미노-n-알킬-X-알킬, 머캅토-n-알킬-X-알킬로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서 X는 O, S-S 및 SO₂로 구성된 군에서 선택되며, 그리고 여기서, 독립적으로 서로 다른 알킬기는 1 내지 30개의 탄소 원자, 바람직하게는 3, 6, 또는 12개의 탄소 원자를 가지며; 또는 올리고에틸렌글리콜은 1 내지 약 10개의 에틸렌글리콜 모이어티를 가지며, 바람직하게는 트리- 또는 헥사-에틸렌글리콜이다. 이들 추가 적당한 링커들은 당업계에 잘 알려져 있으며 상업적으로 이용 가능하다(예컨대, Glen Research, 22825 Davis Drive, Sterling, Virginia, 20164 USA의 카탈로그 참조). 링커들의 추가 예시는 다음과 같다: 5'-아미노-변형체들(예컨대, B.A. Connolly and P. Rider, Nucleic Acids Res., 1985, 13, 4485; B.S. Sproat, B.S. Beijer, P. Rider, and P. Neuner, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 4837; R. Zuckerman, D. Corey, and P. Shultz, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 5305; P. Li, et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 5275; G.B. Dreyer and P.B. Dervan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 968. 참조); 5'-티올-변형체 C6(예컨대, B.A. Connolly and P. Rider, Nucleic Acids Res., 1985, 13, 4485; B.S. Sproat, B.S. Beijer, P. Rider, and P. Neuner, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 4837; R. Zuckerman, D. Corey, and P. Shultz, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 5305; P. Li, et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 5275. 참조); 3'-말단에 S-S 및 티올기가 있는 5'-티올-변형체 C6(예컨대, B.A. Connolly and R. Rider, Nucleic Acids Res., 1985, 13, 4485; B.A. Connolly, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 3131-3139; N.D. Sinha and R.M. Cook, Nucleic Acids Res., 1988, 16, 2659; A. Kumar, S. Advani, H. Dawar, and G.P. Talwar, Nucleic Acids Res., 1991, 19, 4561; R. Zuckermann, D. Corey, and P. Schultz, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 5305; K.C. Gupta, P. Sharma, S. Sathyanarayana, and P. Kumar, Tetrahedron Lett., 1990, 31, 2471-2474; U. Asseline, E. Bonfils, R. Kurfurst, M. Chassignol, V. Roig, and N.T. Thuong, Tetrahedron, 1992, 48, 1233-1254; Gregg Morin, Geron Corporation, Personal Communication. 참조); 스페이서 C3, 스페이서 C12 및 dSpacer 포스포아미다이트(예컨대, M. Durard, K. Chevrie, M. Chassignol, N.T. Thuong, and J.C. Maurizot, Nucleic Acids Res., 1990, 18, 6353; M. Salunkhe, T.F. Wu, and R.L. Letsinger, J. Amer. Chem. Soc., 1992, 114, 8768-8772; N.G. Dolinnaya, M. Blumenfeld, I.N. Merenkova, T.S. Oretskaya, N.F.Krynetskaya, M.G. Ivanovskaya, M. Vasseur, and Z.A. Shabarova, Nucleic Acids Res., 1993, 21, 5403-5407; M. Takeshita, C.N. Chang, F. Johnson, S. Will, and A.P. Grollman, J. Biol. Chem., 1987, 262, 10171-10179; M.W. Kalnik, C.N. Chang, A.P. Grollman, and D.J. Patel, Biochemistry, 1988, 27, 924-931. 참조); 3'-아미노-변형체 C7 CPG(예컨대, J.G. Zendegui, K.M. Vasquez, J.H. Tinsley, D.J. Kessler, and M.E. Hogan, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 307. 참조); 3'-아미노 포토레이블 C6 CPG(예컨대, D.J. Yoo and M.M. Greenberg, J. Org . Chem., 1995, 60, 3358-3364.; H. Venkatesan and M.M. Greenberg, J. Org . Chem., 1996, 61, 525-529; D.L. McMinn and M.M. Greenberg, Tetrahedron, 1996, 52, 3827-3840 참조).

혈청 반감기를 조절하는 성분은 바람직하게는 알부민 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)이다.

약학적 활성 화합물 또는 진단적 활성 화합물은 바람직하게는 (a) 형광 염료, (b) 광감각제, (c) 방사성 핵종, (d) 의료 영상화를 위한 조영제, (e) 사이토카인, (f) 독성 화합물, (g) 케모카인, (h) 응혈원 인자, (i) 전구-약물 활성화를 위한 효소, 또는 (k) ACE 저해제, 레닌 저해제, ADH 저해제, 알도스테론 저해제 또는 안지오텐신 수용체 차단제로 구성된 군으로부터 선택된다.

형광 염료는 바람직하게는 Alexa Fluor 또는 Cy 염료로부터 선택된 성분이다.

광감각제는 바람직하게는 광독성 적색 형광 단백질 킬러레드 또는 헤마토포르피린이다.

방사성 핵종은 바람직하게는 감마선 방출 동위원소 군, 보다 바람직하게는 ^99mTc, ¹²³I, ¹¹¹In, 및/또는 양전자 방출기 군, 보다 바람직하게는 ¹⁸F, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸⁶Y, ¹²⁴I, 및/또는 베타-방출기 군, 보다 바람직하게는 ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ⁶⁷Cu, 또는 알파-방출기 군, 바람직하게는 ²¹³Bi, ²¹¹At로부터 선택된 어느 하나이다.

여기에 사용된 바와 같이 조영제는 의료 영상화에서 체내 구조 또는 유체의 대비를 향상시키기 위해 사용되는 물질이다. 일반적인 조영제는 X-선 감작 및 자기공명신호 향상을 기반으로 작동한다.

사이토카인은 바람직하게는 IL-2, IL-12, TNF-알파, IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, B70, TNF 베타, LT-베타, CD-40 리간드, Fas-리간드, TGF-베타, IL-1알파 및 IL-1베타로 구성된 군으로부터 선택된다.

독성 화합물은 바람직하게는 작은 유기 화합물 또는 폴리펩타이드이고, 보다 바람직하게는 독성 화합물은 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 네오카르지노스타틴, 에스페라마이신, 다이네미신, 케다르시딘, 마두로펩틴, 독소루비신, 다우노루비신, 아루리스타틴, 리신-A 체인, 모데씬, 트런케이티드 슈도모나스 엑소톡신 A, 디프테리아 독소 및 재조합 젤로닌으로 구성된 군으로부터 선택된다.

케모카인은 바람직하게는 IL-8, GRO 알파, GRO 베타, GRO 감마, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1알파/베타, BUNZO/STRC33, I-TAC, BLC/BCA-1, MIP-1알파, MIP-1 베타, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC-CK1, MIP-3 알파, MIP-3 베타, MCP-1-5, 에오탁신, 에오탁신-2, I-309, MPIF-1, 6Ckine, CTACK, MEC, 림포탁틴 및 프락탈카인으로 구성된 군으로부터 선택된다.

응혈원 인자는 바람직하게는 조직 인자이다.

전구-약물 활성화를 위한 효소는 바람직하게는 카르복시-펩티다아제, 글루쿠로니다아제 및 글루코시다아제로 구성된 군으로부터 선택된 효소이다.

본 발명은 제3 양태에서 본 발명의 저해제, 융합 단백질 또는 융합 구조물을 FXIIa와 접촉하는 것을 포함하는 FXIIa의 효소 활성을 억제하는 엑스 비보 방법에 관한 것으로, 여기서, FXIIa는 바람직하게는 혈액, 혈장 또는 혈청 시료에 존재한다.

방법은 원칙적으로 유사하게 인 비보에서 수행될 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, FXIIa의 저해제들은 현재 연구실과 점차 클리닉에서 사용되는 응고 검사에 사용된다. 상기 엑스 비보 방법은 그러한 응고 검사에 사용될 수 있다. 혈액, 혈장 또는 혈청 시료는 바람직하게는 인간 혈액, 혈장 또는 혈청 시료이다. 연구실에서 혈액, 혈장 또는 혈청 이외의 시료도 관심의 대상이 될 수 있다; 예를 들어, 재조합 형태의 FXIIa의 성능을 시험하기 위해.

본 발명은 제4 양태에서 본 발명의 저해제, 융합 단백질 또는 융합 구조물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 용어 "약학적 조성물"은 환자, 바람직하게는 인간 환자에 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 저해제를 포함한다. 선택적으로 본 발명의 화합물의 특징들을 변경할 수 있는, 예를 들어, 이들의 기능을 안정화, 조절 및/또는 활성화할 수 있는 추가의 분자를 포함할 수 있다. 조성물은 고체, 액체 또는 기체 형태일 수 있고, 특히 분말(들), 정제(들), 용액(들) 또는 에어로졸(들)의 형태일 수 있다.

이들 약학적 조성물은 적절한 투여량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 복용법은 담당 의사와 임상적 요인들에 따라 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함하여 많은 인자에 의해 결정된다. 주어진 상황에 대한 치료학적 유효량은 통상적인 실험에 의해 용이하게 결정될 것이며, 통상적인 임상의 또는 의사의 기술 및 판단 범위 내에 있다. 일반적으로, 약학적 조성물의 규칙적인 투여로서 요법은 하루에 1 ㎍ 내지 5 g 단위의 범위 내에 있어야 한다. 그러나 보다 바람직한 투여량은 하루에 0.01 mg 내지 100 mg, 훨씬 더 바람직하게는 0.01 mg 내지 50 mg, 그리고 가장 바람직하게는 0.01 mg 내지 10 mg이다.

또한, 투여되는 약학적 조성물의 총 약학적 유효량은 보통 체중 1 kg 당 약 75 mg 미만, 예를 들어, 체중 1 kg 당 약 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 또는 0.0005 mg 미만일 것이다. 보다 바람직하게는 약학적 조성물의 약학적 유효량은 체중 1 kg 당 2000 nmol 미만의 저해제, 예를 들어, 체중 1 kg 당 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7.5, 1.5, 0.75, 0.15, 0.075, 0.015, 0.0075, 0.0015, 0.00075 또는 0.00015 nmol 미만의 저해제일 것이다.

변화를 관찰하는데 필요한 치료 기간과 반응을 일으키는 치료 후 간격은 원하는 효과에 따라 다양하다. 특정 함량은 당업자에게 공지된 통상적인 검사에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. "약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제"는 임의의 유형의 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충진제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제형 보조제를 의미한다(Handbook of Pharmaceutical Excipients 6ed. 2010, Published by the Pharmaceutical Press 참조). 적합한 약학적 담체 및 부형제들의 예는 당업계에 잘 알려져 있으며, 인산 완충 식염수, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 다양한 형태의 습윤제, 멸균 용액, DMSO 등을 포함하는 유기용매를 포함한다. 그러한 담체 또는 부형제들을 포함하는 조성물은 공지된 통상의 방법들에 따라 제형화될 수 있다. 약학적 조성물은 예를 들어, 경구, 비경구, 예를 들어 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 경막내, 경피내, 점막하, 경막하, 이온토페레시스에 의한 국지 또는 국소적, 설하, 흡입 스프레이에 의해, 에어로졸 또는 직장 등으로 임의로 통상적인 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제들을 포함하는 투여 단위 제형으로 투여될 수 있다.

본 발명은 제5 양태에서 혈전성 질환, 바람직하게는 혈전, 심부정맥 혈전증, 유전성 혈관 부종 및 당뇨병성 황반 부종에서 선택된 혈전성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 저해제, 융합 단백질 또는 융합 구조물에 관한 것이다.

FXII의 특이 억제는 영장류를 포함한 혈전 형성의 다양한 전임상 모델에서 안전한 항-혈전 전략으로 입증되었다. 따라서, 본 발명의 저해제들, 특히 FXII618은 혈전성 질환의 예방 또는 치료에 적합하다. 혈전성 질환의 비제한적 예로 혈전, 심부정맥 혈전증, 유전성 혈관 부종 및 당뇨병성 황반 부종이 있다. FXII618은 그 자체로 치료 화합물일 뿐만 아니라 추가 치료 화합물 개발을 위한 선도 화합물로서의 역할을 할 수 있다. FXII618은 FXIIa의 직접적인 저해제이므로 응고 FXII의 혈전 및 염증 기능을 방해하는 이전에 개발된 저해제들에 비해 뚜렷한 장점이 있다. 본 발명의 저해제들은 심장 수술 중의 체외 순환 또는 2차 뇌졸중 사건의 예방과 같은 급성 상황에서 특히 유용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 저해제, 융합 단백질 또는 융합 구조물의 치료적 유효량을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 혈전성 질환, 바람직하게는 혈전, 심부정맥 혈전증, 유전성 혈관 부종 및 당뇨병성 황반 부종으로부터 선택된 혈전성 질환의 치료 및/또는 예방 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 적용되는 바와 같이, 투여는 본 발명의 저해제와 치료될 대상체, 바람직하게는 인간과의 접촉을 의미한다. 저해제의 치료적 유효량은 인간 또는 동물 유기체에 투여될 때, 응고 효소 FXIIa의 효소 활성을 억제하는 검출 가능한 약리적 및/또는 생리적 효과를 유도하는 저해제의 함량이다.

전신 투여를 위해, 치료적 유효량 또는 투여량은 초기에 인 비트로 분석으로부터 추정될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양에서 결정된 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위해 투여량을 동물 모델에서 공식화할 수 있다. 그러한 정보는 인간에게 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 또한, 초기 투여량은 당업계에 잘 알려진 기술을 이용하여 인 비보 데이터, 즉, 동물모델로부터 추정될 수 있다. 당업자는 동물 데이터에 기초하여 인간에 대한 투여를 용이하게 최적화할 수 있으며, 물론 치료하고자 하는 대상체, 대상체의 체중, 장애의 중증도, 투여 방식에 의해 결정될 것이다.

본 발명의 제6 양태에서 혈관, 튜브, 바늘, 주사기, 멤브레인 또는 의료 기기를 코팅하기 위한 본 발명의 저해제, 융합 단백질 또는 융합 구조물의 용도에 관한 것이다.

항응고제는 응고가 혈액에서 형성되는 것을 방지하는데 도움이 되는 약물이다. 본 발명의 저해제들의 항-응고 효과의 관점에서, 그들은 또한 혈관, 튜브, 바늘, 주사기, 멤브레인 또는 의료 기기에 적합한 코팅이다. 그러한 코팅된 물체는 코팅이 접촉 활성화에 의해 구동되는 혈전증을 방지하기 때문에 대응하는 코팅되지 않은 물체와 비교하여 유리하다. 예를 들어, CTI는 개선된 혈액 적합성 결과를 가지므로 이미 표면 개질제로 사용되어 왔다.^{27 , 28} FXII618의 작은 크기와 합성 성질로 인해 이 저해제는 심폐 바이패스 시스템에서 관상동맥 중재에 사용되는 카테터 또는 가스 교환 모세혈관과 같은 혈액-접촉 표면에 이 저해제를 접합시키는데 특히 적합하다. 코팅은 혈관, 튜브, 바늘, 주사기, 멤브레인 또는 의료 기기의 표면에 저해제를 공유 결합시킴으로써 달성될 수 있다.

본 발명은 제7 양태에서 본 발명의 저해제, 융합 단백질 또는 융합 구조물을 포함하는 혈액 응고 검사용 키트에 관한 것이다.

FXIIa의 저해제들이 현재 응고 검사에서 사용됨에 따라 그러한 검사를 수행하기 위한 키트는 본 발명의 범위 내에 있다. 키트는 바람직하게는 키트를 사용하는 방법에 관한 설명서를 포함한다. 키트의 다양한 성분들은 하나 이상의 바이알과 같은 하나 이상의 용기에 포장될 수 있다. 바이알은 성분들 외에도 저장용 방부제 또는 완충용액들을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 저해제, 융합 단백질 또는 융합 구조물이 예를 들어, 혈액, 혈장 또는 혈청에서 인자 XIIa를 억제하거나, 인자 XIIa에 특이적으로 결합하는데 사용되는 진단 분석을 제공한다. 진단 분석의 비제한적 예로 TGA 및 트롬보엘라스토메트리를 포함한다.

상기에 기술된 바와 같이, FXIIa의 저해제들은 현재 응고 분석에 사용되며, 결과적으로 본 발명의 신규한 FXIIa 저해제들 역시 그러한 분석에 사용될 수 있다. 그러한 분석의 적합한 형태는 분석을 포함하는 TGA 및 트롬보엘라스토메트리이다.

도 1은 바이사이클릭 펩타이드 FXIIa 저해제의 파지 선별을 나타낸 것이다. (a) 3라운드 선별 후 β-FXIIa에 대해 분리된 펩타이드 서열. 회색으로 강조된 세 개의 시스테인은 친화도 패닝 전 티올-반응성 링커 TATA로 고리화되었다. 펩타이드 간 서열 유사성은 색깔로 강조 표시된다. Kis의 경우 적어도 두 가지 측정의 평균값이 표시된다. (b) 라이브러리에서 선별된 가장 우수한 두 개의 FXIIa 저해제의 활성 및 특이도. 표준 편차가 표시된다. (c) 이전에 개발된 바이사이클릭 펩타이드 FXIIa 저해제(FXII402) 및 두 개의 새로 개발된 저해제 FXII512 및 FXII516의 aPTT와 PT. 표준 편차가 표시된다.
도 2는 바이사이클릭 펩타이드 FXIIa 저해제들의 친화도 성숙화, 특이도 프로파일링 및 억제 활성을 나타낸 것이다. (a) FXII516에 기초한 반-무작위 펩타이드 라이브러리로부터 분리된 펩타이드의 서열. 펩타이드 간의 서열 유사성은 색깔로 강조 표시된다. (b) 3회 아미노산 치환에 의한 FXII516의 결합 친화도 개선. 표시된 표준 편차는 세 개의 Ki 값에 기초하여 계산된다. (c) FXII618의 표적 선택도. 표준 편차는 세 개 이상의 Ki 값에 기초하여 계산된다. (d) 표시된 FXII618 농도에서 응고 매개변수 aPTT 및 PT, 그리고 FXII 활성(FXII:c). aPTT, PT 및 FXII:c의 표준 편차는 3회 측정에 기초하여 계산된다.
도 3은 CTI 및 바이사이클릭 펩타이드 FXII618의 구조를 나타낸 것이다. (a) CTI(좌측) 및 FXII618(우측)의 폴리펩타이드 서열. 화학적 링커 TATA는 바이사이클릭 펩타이드의 세 개의 시스테인을 티오에테르 결합을 통해 연결한다. FXIIa의 특이도 포켓 S2, S1 및 S1'에 결합하는 잔기들이 표시된다. (b) FXIIa에 결합된 CTI(상단 그림) 및 FXII618(하단)에 대한 구조 모델. 바이사이클릭 펩타이드의 TATA 링커는 녹색으로 표시된다. (c) FXIIa에 결합된 CTI 및 FXII618의 결합 루프의 슈퍼포지션. (d) FXIIa에 결합된 CTI(주황색), 자유 CTI(적색) 및 FXIIa-결합된 FXII618(파란색)에서 결합 루프의 파이(실선) 및 프시(점선)의 이면각. (e, f) FXIIa 활성 부위 영역에 대해 저해제들의 상보성을 보여주는 CTI(e) 및 FXII618(f)의 결합 루프.
도 4는 FXII618 및 CTI의 비교를 나타낸 것이다. (a) CTI(상단 패널) 및 FXII618(하단 패널)의 특이도 프로파일 및 억제 활성. 몇몇 트립신 유사 세린 프로테아제의 잔류 활성이 보인다. 표준 편차가 표시된다. (b) 동일한 양의 FXII618 및 CTI가 있는 경우에서 시트레이트화된 혈소판 빈 혈장에서 aPTT의 비교. 표준 편차는 3회 측정을 기초하여 계산된다. (c) 다양한 CTI(상단 패널) 및 FXII6189(하단 패널) 농도가 있는 경우에서 엘라직 애시드(내인성 경로 활성화)에 의해 유발된 시트레이트화된 혈소판 빈 혈장에서 CAT에 의한 트롬빈 생성.
도 5는 CAT에 의해 혈장에서 low-TF 유도된 TGA에서 FXII618 및 CTI의 비교를 나타낸 것이다. 시트레이트화된 혈소판 빈 혈장에서 트롬빈 생성은 100 ㎍/mL의 저해제 CTI 또는 FXII618이 있거나 없는 경우에서 0, 1 및 0.25 pM TF에 의해 유발되었다.
도 6은 FXIIa 저해제의 구조-활성 관계(SAR)를 나타낸 것이다.
도 7은 연결 분자의 화학적 구조를 나타낸 것이다.
도 8은 FXII618의 화학적 고리 구조를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명과 관련하여 확인된 응고 효소 FXIIa의 아미노산 서열 저해제들을 나타낸 것이다. 이들 아미노산 서열 저해제에서 시스테인이 TATA와 연결된다.
도 10(a)은 인간 혈장에서 바이사이클릭 펩타이드의 안정성을 나타낸다. 겉보기 IC₅₀는 37℃에서 제시된 시간 동안 인간 혈장에서 펩타이드를 인큐베이션한 후 측정되었다. 3회 측정의 평균값이 표시된다. (b) 바이사이클릭 펩타이드 73(FXII801)의 특이도. 적어도 3회 측정의 평균값이 표시된다. 표준 편차가 표시된다.
도 11은 바이사이클릭 펩타이드 1(FXII618), 61(FXII800) 및 73(FXII801)에 대해 응고 매개변수 aPTT(a) 및 PT(b)를 나타낸 것이다. aPTT, PT의 표준 편차는 3회 측정에 기초하여 계산된다.
도 12(a)는 FXII618(1)의 화학적 구조, (b)는 친화도 성숙화 전략을 나타낸 것이다. α-아미노산을 β-아미노산으로 대체하거나, 고리화 링커에 연결된 시스테인을 더 긴 측쇄를 가진 시스테인 동족체로 대체하여 탄소 원자를 펩타이드 백본에 삽입한다.
도 13은 FXII618, FXII700 및 FXII701에 대해 응고 매개변수 aPTT(a) 및 PT(b)를 나타낸 것이다.
도 14는 FXII618-TATA, FXII618-TBAT 및 FXII618-TBMT의 활성 및 특이도를 나타낸 것이다. 표준 편차가 표시된다.

실시예 1 - FXII618의 생성 및 시험

실시예 1.1 - 실험 과정

(활성화된 인간 FXII에 대한 파지 선별)

바이사이클릭 펩타이드 파지 디스플레이 라이브러리(라이브러리 3×3, 4×4 및 6×6)를 생산하고 전술한 과정²⁹에 따라 3라운드 파지 선별을 수행하였다. 각 선별에 대해, 파지는 0.5 L의 박테리아 배양물에서 생산되었다. 파지는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 침전으로 정제하였다. 시스테인 잔기는 80% 수성 완충용액(20 mM NH₄HCO₃, 5 mM EDTA, pH 8.0) 및 20% 아세토나이트릴에서 티올-반응 시약인 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난(TATA, 150 μM, 30℃, 1 h) 또는 N,N',N''-(벤젠-1,3,5-트리일)-트리스(2-브로모아세타마이드)(TBAB, 40 μM, 30℃, 1h)과의 화학 반응 전에 트리스(2-카르복실)포스핀(TCEP, 1 mM, 42℃, 1 h)에 의해 환원되었다. 인간 β-FXIIa(HFXIIAB; Molecular Innovations, Novi, MI, USA)는 바이오틴화되고, 5 ㎍을 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘 자성 비드 상에 고정하였다. 바인더는 산성 pH에서 용출되었다. 친화도 성숙화 선별에서, 두 선별 라운드에서 0.2 ㎍ 또는 제1라운드에서 2 ㎍ 그리고 제2라운드에서 0.2, 0.5 또는 1 ㎍ 중 적은 양의 바이오틴화된 FXIIa가 사용되었다.

(친화도 성숙화 라이브러리의 클로닝)

임의 추출된 DNA 서열은 PCR 반응에서 축퇴 프라이머에 의해 파지 p3의 유전자에 첨부되고, 산물은 두 개의 Sfil 제한 부위에서 파지 벡터 pECO2에 삽입되었다.²⁹ 정방향 프라이머: VBfLvb21_for(TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCANNKTGTNNKAGGCTGNNKTGCNNKCAGTTGNNKTGTNNKGGTTCTGGCGCTG)(SEQ ID NO: 91), 역방향 프라이머 sfi2notfo(CCATGGCCCCCGAGGCCGCGGCCGCATTGACAGG)(SEQ ID NO: 92). TG1 세포로의 4.4 ㎍의 연결 벡터의 전기천공을 통해 대형(직경 140 mm) 클로람페니콜(30 ㎍/mL) 2YT 한천 배지에서 8.8×10⁶ 콜로니 형성 단위(c.f.u.)를 수득하였다. 15% v/v 글리세롤을 보충한 2YT 배지로 플레이트에서 콜로니를 긁어내고, -80℃에서 보관하였다.

(aPTT, PT 및 FXII 응고제 활성(FXII:c) 측정)

응고 시간(aPTT, PT) 및 FXIIa 활성은 제조사의 설명서(Siemens)에 따라 자동 혈액 응고 분석기(Sysmex CS-5100, Siemens, Eschborn, Germany)를 사용하여 인간 혈장에서 측정하였다. 외인성 응고는 Innovin®(안정화 HEPES 완충용액 시스템에서 재조합 인간 조직 인자, 합성 인지질 및 칼슘; Dade Behring / Simens)을 사용하여 유발하였다. 내인성 응고는 Pathromtin^* SL (Siemens)를 사용하여 유발하였다. 본 연구에서 사용된 인간 혈장은 스위스의 Service Regional Vaudois de Transfusion Sanguine에서 제공하는 신선한 냉동 혈장 유닛의 풀에서 유래한 것이다.

(트롬빈 생성 분석: calibrated automated thrombography(CAT))

트롬빈 생성은 전술한 바와 같이 약간 변형하여 수행하였다.³⁰ 요약하면, 60 ㎕의 혈소판 빈 혈장(PPP), 20 ㎕의 FXIIa 저해제/HA 완충용액(Hepes 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4, 5 mg/mL BSA) 및 20 ㎕의 PPP 시약, PPP LOW 시약, MP 시약 또는 액틴 FS(HA 완충용액에서 1:170으로 희석됨)를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Immulon 2HB; Thermo Fisher Scientific)에서 혼합하고 37℃에서 15분간 인큐베이션 하였다. 트롬빈 생성은 37℃에서 20 ㎕의 기질/염화칼슘 완충용액(FLUKA)을 첨가함으로써 유발되었다. 시료는 각 조건에 대해 3회 시험하였다. 형광성 트롬빈 기질 가수분해는 390/460-nm(여기/방출) 필터 세트가 구비된 마이크로플레이트 형광계(Fluoroskan Ascent FL; Thermo Fisher Scientific)에서 20초마다 120분 동안 측정되었다. 데이터 분석은 트롬비노스코프 소프트웨어(Synapse BV)에서 수행되었다. PPP 시약(TF 5 pM, PL 4 μM), PPP LOW 시약(TF 1 pM, PL 4 μM), MP 시약(PL 4 μM), 트롬빈 캘리브레이터 및 FLUKA는 Synapse BV에서 구입하였다.

(전혈에서 저해제의 첨가 후 트롬빈 생성 측정을 위한 혈액 수집)

정맥혈은 3.2 %(w/v) 시트레이트화된 모노베트 플라스틱 튜브에서 19 게이지 바늘로 전신 정맥 전자에 의해 건강한 지원자로부터 수집하였다. 접촉 활성화를 최소화하기 위해 EDTA를 함유하는 첫 번째 수집 튜브를 표준 과정에 따라 버렸다. FXII618은 100 ㎍/mL의 최종 농도로 하여 튜브에 혈액 수집(< 1분) 직후에 첨가하였다. 그리고 나서, 혈액에 PPP를 처리한 다음 2,000g에서 5분 동안 초기 원심분리 단계를 진행하고, 이어서 10,000g에서 10분간 두 번째 원심분리 단계를 거쳤다. 혈장 앨리쿼트는 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

(바이사이클릭 펩타이드 합성)

펩타이드는 Fmoc-보호된 아미노산 및 Rink Amide AM 수지를 사용하여 표준 고체-상 펩타이드 합성에 의해 사내에서 합성되었다. 커플링 시약으로 HBTU 및 HOBt를 사용하여 아미노산을 4배 몰 과량으로 2회 커플링 시켰다. 합성된 모든 펩타이드는 자유 N-말단 및 아미드화된 C-말단을 가진다. 펩타이드를 환원 조건(90% TFA, 2.5% H₂O, 2,5% 티오아니솔, 2,5% 페놀, 2.5% 1,2-에탄디티올) 하에서 수지로부터 절단하였다. 1 mM 농도의 조 펩타이드(crude peptide)를 30℃에서 1시간 동안 70% 수성 완충용액(20 mM NH₄HCO₃, 5mM EDTA, pH 8.0) 및 30% 아세토나이트릴에서 1.5 mM TATA 또는 TBAB 중 어느 하나와 반응시켰다. 환화된(cyclized) 펩타이드를 C18 컬럼 상에서 역-상 크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 바이사이클릭 펩타이드(> 95% 순도)를 동결건조하고 물에 녹였다. 그들의 질량은 ESI로 확인하였다.

(프로테아제 억제 분석)

바이사이클릭 펩타이드의 억제 활성은 프로테아제와의 인큐베이션과 형광성 기질과의 그들의 잔류 활성의 정량화에 의해 측정되었다. 인간 b-FXIIa(HFXIIAB; Molecular Innovations) 및 마우스 a-FXIIa(MFXIIA; Molecular Innovations)의 최종 농도는 10 nM이었다. 펩타이드의 희석은 0.2-200 mM 범위에서 준비하였다. 형광 강도는 Infinite M200Pro 형광 플레이트 리더(355 nm에서 여기, 460 nm에서 방출; Tecan, Mannedorf, Switzerland)로 측정하였다. 반응은 RT에서 수행하였다. S자형 적정곡선은 다음의 용량 반응 방정식을 사용하여 데이터에 적용되었고, 여기서, x=펩타이드 농도, y=펩타이드가 없는 반응의 활성%, A1=100%, A2=0%, p=1. IC50 값은 적용된 곡선으로부터 유도되었다.

저해상수 Ki는 Cheng 및 Prusoff의 방정식²⁹, Ki=IC50/(1+([S]0/Km)에 따라 계산되었고, 여기서, IC50는 저해제의 기능 강도이고, [S]0은 총 기질 농도이며, Km은 Michaelis-Menten 상수이다.

(엑소 비보 응고 분석)

제조사의 설명서(Siemens Healthcare, Eschborn, Germany)에 따라 자동화 혈액 응고 분석기(Sysmex CA-7000)를 사용하여 표준 시약으로 인간 혈장에서 응고 시간(aPTT, PT) 및 FXIIa 활성을 적어도 2회 측정하였다. 본 연구에서 사용된 인간 혈장은 스위스의 Service Regional Vaudois de Transfusion Sanguine에서 제공하는 신선한 냉동 혈장 유닛의 풀에서 유래하였다.

(상동성 모델링)

S2, S1, S1' 및 S2' 서브-부위에 표준 메카니즘으로 결합된 CTI 및 FXII618의 테트라펩타이드를 이용한 β-FXIIa의 상동성 모델은 X-선 공결정 구조 데이터 세트 1PPE, 2XTT 및 4AOQ를 주형으로 사용하여 제작되었다. 비필수 물 분자 및 이온은 PDB 파일에서 삭제되었고, 펩타이드 리간드는 절단되어 P2, P1, P1' 및 P2' 잔기만 보유하였다. MODELLER 소프트웨어의 정렬 스크립트를 사용하여 β-FXIIa과 CTI 및 FXII618의 테트라펩타이드를 b-트립신과 3개의 리간드의 테트라펩타이드와 정렬시켰다.³⁰ 단백질과 펩타이드는 보존된 아미노산에 기초하여 정렬되었다. b-FXIIa는 b-트립신(아미노산 16-245, 키모트립신 넘버링)과 35.7%의 서열 동일성과 54.4% 서열 유사성을 공유한다. P1 아르기닌의 h 아미노산과 β-XIIa의 189번 아스파르트산의 d 산소 사이의 거리 제한은 2.9 +/- 0.1 Å이었다. MODELLER 소프트웨어는 결합된 펩타이드성 테트라펩타이드로 모델을 세우는데 사용되었다. 앰버 11 소프트웨어(R. Salomon-Ferrer, A. W. Gotz, 2013)를 사용한 분자 동력학 시뮬레이션을 위해 에너지가 가장 낮은 모델이 추가로 사용되었다. FXII618의 구조에서, 3개의 시스테인은 수동으로 TATA와 연결되었다. AMBER 포스필드는 tleap를 사용하여 샌더 인풋 파일을 제조하는데 사용되었다. TIP3P 물은 구조를 용매화 하는데 사용되었다. 시스템은 먼저 b-FXIIa 및 결합된 펩타이드의 구조화에 이어서 S2, S1, S1' 및 S2' 포켓에서 상호작용하는 잔기들 만 유지함으로써 최소화하였다. 그런 다음 시스템을 전체 시스템에서 평형화하기 전에 300K로 가열하였다. 생산 평형화는 20 ns 동안 일정한 압력과 주기적인 경계(periodic boundary)로 300K에서 실행되었다. Langevin 동력학은 1.0 ps-1의 충돌 주파수를 사용하여 온도를 제어하는데 사용되었다. 그 후 최종 구조를 분석하였다. 모든 계산은 EPFL의 SCITAS(scientific IT and application support)에서 제공하는 GPU 가속 클러스터 ELECTRA에서 수행되었다.

(인 비보에서 FXII 활성의 억제)

암컷 BALB/c 마우스를 125 mg/kg 펜토바비톨로 마취시켰다. 5분 후 마우스에 3.5 mg/kg FXII618과 3.5 mg/kg PK128(N = 3), 또는 대조군으로 PBS(N = 2)를 r.o. 로 주사하였다. 5분 후, 대정맥에서 1:9의 혈액 대 시트레이트 비율로 채혈하였다. 실온에서 2,400g로 10분 동안 원심분리하여 혈장을 준비하였다. FXIIa 활성은 전술한 바와 같이 평가하였다.

실시예 1.2 - 구조적으로 다양한 바이사이클릭 펩타이드 라이브러리의 스크리닝

새로운 펩타이드 환화(cyclization) 시약 및 보다 다양한 펩타이드 포맷을 사용하여 십억 개 이상의 서로 다른 바이사이클릭 펩타이드를 공동으로 포함하는 6개의 조합 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하였다. 라이브러리는 촉매 도메인만 포함하는 FXIIa의 자연적으로 발생하는 단백질 분해 산물인 인간 β-FXIIa에 대해 패닝시켰다. 라이브러리는 파지에 표시된 포맷 CXnCXnC(C = 시스테인, X = 무작위 아미노산; n = 3, 4, 6)의 선형 펩타이드를 티올-반응성 시약 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난(TATA) 또는 N,N',N''-(벤젠-1,3,5-트리일)-트리스(2-브로모아세타마이드)(TBAB) 중 어느 하나로 환화하여 생성하였다. 이들 화학적 링커는 이전에 사용된 시약 1,3,5-트리스(브로모메틸)벤젠(TBMB)^{19 , 20}과 비교하여 바이사이클릭 펩타이드에 다른 펩타이드 백본 구조를 부여한다. TBAB로 환화된 펩타이드로 수행된 친화도 선별은 바인더의 분리를 유도하나 저해제에 대해서는 그렇지 않았다. 대조적으로, TATA로 환화된 펩타이드 라이브러리로부터 분리된 바이사이클릭 펩타이드는 FXIIa에 대해 0.16 +/- 0.07 μM 내지 10.2 +/- 0.9 μM 범위의 Kis를 갖는 FXIIa 저해제들을 야기하였다(도 1a). 두 개의 가장 강력한 펩타이드 FXII512(Ki=0.16 +/- 0.07 μM) 및 FXII516(0.16 +/- 0.08 μM)의 추가적인 특징 규명을 통해 그들이 마우스 FXIIa에 대해 교차-반응함을 나타냈다(β-FXIIa: Ki= 각각 0.32 +/- 0.07 μM 및 0.45 +/- 0.16 μM)(도 1b). 구조적 및 기능적으로 관련된 세린 프로테아제의 패널을 이용한 특이도 프로파일링 결과, FXII512는 섬유소용해에 관련된 응고-관련 효소인 인간 조직-플라스미노겐 활성화제(tPA; K _i = 8.8 μM)를 억제하였다. FXII516은 50 μM 만큼 높은 농도에서 시험된 어떠한 프로테아제도 유의하게 억제하지는 못하였다.

FXIIa 억제와 관련하여 FXII512에 대한 FXII516의 더 높은 선택도는 응고 분석에서 추가로 관찰되었다. 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 및 프로트롬빈 시간(PT)을 FXII512 또는 FXII516의 존재하에서 3가지 상이한 농도로 인간 혈장에서 측정하였다. 비교를 위해 이전에 개발된 FXIIa 저해제(TBMB로 환화됨; Ki=1.2μM) FXII402(18)를 사용하였다. aPTT 및 PT는 내인성(aPTT) 또는 외인성 경로(PT)를 통한 응고 개시시 응고 시간을 측정한다. 선택적 FXIIa 억제는 aPTT를 증가시키나 PT는 그렇지 않을 것으로 예상된다. 완전한 FXIIa 억제의 경우, aPTT 및 PT는 FXII-결핍 혈장(aPTT > 170초 및 정상 상태 PT; Service and Central Laboratory of Hematology, Lausanne University Hospital, Switzerland)에서 측정한 것과 비교할만하다. 도 1c에 도시된 바와 같이, 새로 개발된 바이사이클릭 펩타이드들은 동일한 저해제 농도에 대해 더 긴 aPTT이 관찰되는 바와 같이, 응고의 내인성 경로를 억제하는 데 있어 FXII402 보다 더 강력하였다. FXII512는 내인성 경로를 가장 강력하게 억제하지만 50 μM 이상의 농도에서 연장된 비-생리적 PT를 나타냈다. 대조적으로, FXII516은 시험된 가장 높은 저해제 농도(100 μM)에서 조차 외인성 경로에 영향을 주지 않으면서 내인성 경로를 효과적으로 억제하여 유력한 실마리를 제공하였다. 새로 개발된 구조적으로 더 다양한 라이브러리를 스크리닝함으로써 이전에 파지 디스플레이에 의해 개발된 최상의 펩타이드¹⁸ 보다 실질적으로 더 강력한 저해제를 산출하였다.

실시예 1.3 - 강력하고 선택적인 FXIIa 저해제의 공학

FXII516의 효능은 컨센서스 영역 밖의 아미노산을 변경함으로써 더욱 개선되었다. XCXRLXCXQLXCX(컨센서스 서열은 밑줄로 표시됨, X=무작위 아미노산) 형태의 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝은 개선된 바인더를 산출하지는 않았지만 서열은 확장된 컨센서스 서열을 나타내었고, FXII516에서 유익한 아미노산 치환에 대한 힌트를 제공하였다(도 2a). 가장 주목할만한 것은 1번 위치의 아미노산이 지방족 아미노산과 아르기닌으로, 3번 및 6번 위치에서 프롤린으로, 8번 위치에서 알라닌으로, 11번 위치에서 아르기닌으로의 수렴 진화이다. 단일 아미노산 치환을 가진 FXII516의 변이체들은 억제 활성을 4배까지 개선하였다(도 2b; 제1라운드). 돌연변이 및 스크리닝의 2회 반복 사이클에 의한 추가 돌연변이들의 축적으로 인해 22 +/- 4 nM의 Ki로 인간 β-FXIIa를 억제하는 펩타이드 FXII618이 산출되었다(도 2b; 제2 및 제3라운드). α-FXIIa는 동일한 정도로 억제되었다(Ki=19 +/- 1 nM). FXII618 역시 252 +/- 29 nM의 Ki로 마우스 FXIIa를 억제하였으나, 구조적으로 관련되거나 기능적으로 중요한 프로테아제는 억제하지 않았다(도 2c). FXII618은 그것의 모체 FXII516와 이전에 개발된 TBMB-환화 저해제 FXII402와 비교하여 인간 FXIIa를 억제하는데 각각 8배 및 60배 개선 효과를 나타낸다. FXII618의 효능 및 특이도는 인 비트로 응고 분석에서 추가로 평가되었다. 40 μM 만큼 낮은 농도에서, 바이사이클릭 펩타이드는 외인성 경로(정상 상태 PT)에 영향을 미치지 않으면서 내인성 경로를 통한 응고의 개시(aPTT > 170초)를 완전히 억제하였다. 일관되게, 50 μM에서 FXII 응고 활성(FXII:c)은 < 5%로 감소하였다(도 2d).

실시예 1.4 - FXII618는 옥수수 트립신 저해제의 결합 방식을 모방한다

확인된 컨센서스 서열과 천연 FXIIa 저해제의 결합 루프를 비교하면, 가장 강력한 바이사이클릭 펩타이드 FXII618(RCFRLPCRQLRCR)의 제1 고리와 옥수수 트립신 저해제(CTI;...IGPRLPW...)(동일한 아미노산이 밑줄로 표시됨)의 결합 루프 사이에 현저한 유사성을 보였다. 상동성은 FXII618(XCPRLPCXQL^R/_KCX; 도 2a)의 개발을 유도하는 친화도 성숙화 접근에서 발견된 컨센서스 서열에 대해 더욱 두드러졌으며, 이 바이사이클릭 펩타이드는 CTI와 동일한 결합 방식을 가짐을 시사하였다(도 3a). CTI는 옥수수 종자의 13.6 kDa 단백질로 FXIIa와 트립신을 똑같이 억제한다. 이는 응고 분석에서 접촉 상의 활성화를 억제하기 위해 광범위하게 적용된다. 5개의 이황화 브릿지(PBD: 1BEA)를 함유한 127개의 아미노산 단백질은 저해제의 펩타이드 루프가 본질적으로 효소의 폴리펩타이드 기질로서 결합하는 억제의 소위 '표준 메커니즘'을 따르는 기준 저해제이다.²³ CTI의 Arg34는 FXIIa의 S1 특이도 포켓에 결합한다.²

FXII618이 실제로 상동성 모델링 및 분자 역학 시뮬레이션에 의해 FXIIa의 활성 부위에 상보적인 구조를 도입할 수 있는 지를 시험하였다. CTI와 FXIIa의 공-결정 구조가 존재하지 않기 때문에 CTI-FXIIa 복합체도 모형을 만들었다. 상동성 세린 프로테아제 소태아 β-트립신과 CMTI-1(스쿼시 종자의 트립신 저해제; PDB: 1PPE), SGPI-1-P02(사막 메뚜기(Schistocerca gregaria) 프로테아제 저해제 1; PDB: 2XTT) 및 SOTI-III(시금치(Spinacia oleracea) 트립신 저해제 III; PDB: 4AOQ)의 공-결정 구조는 상동성 모델링을 위한 구조 주형으로 사용되었다. FXII 촉매 도메인(아미노산 16-254) 및 소태아 β-트립신의 아미노산 중 36%가 동일하다. CMTI-I, SGPI-1-P02 및 SOTI-III는 표준 메커니즘에 따라 트립신과 결합한다. CTI 및 FXII618의 결합 루프는 FXIIa에 상보적인 구조를 형성하였다(도 3b). CTI 결합 루프의 아르기닌 측쇄 및 백본은 FXII618의 제1 고리 중 하나와 중첩되었다(도 3c). 저해제가 프로테아제에 결합되었을 때, 자유 CTI(PDB로부터 얻음: 1BEA)에서 결합 루프의 Ramachandran 각은 동일하게 유지되었다(도 3d). FXII618(FRLP)의 고리 1에서 4개의 아미노산의 2면각은 결합된 CTI의 모델에서 등가의 아미노산들의 것과 유사하였다(도 3d). 효소-저해제 복합체의 구조 표현은 바이사이클릭 펩타이드 고리 1의 프로테아제의 활성 부위와의 상보성을 강조한다(도 3f). FXII618의 제2 고리(고리 2) 역시 임의의 입체 충돌을 일으키지 않고 FXIIa의 표면에 끼워졌다. 그러나 FXIIa의 표면과 이 펩타이드 영역의 특이 접촉이 발견되지 않기 때문에 모델에서 고리 2의 구조가 확실하지 않다.

실시예 1.5 - FXII618은 CTI보다 내인성 응고 개시 억제 효과가 우수하다

FXII618 및 CTI의 활성 및 표적 특이도를 억제 분석에서 나란히 비교하였다(도 4). FXIIa 억제는 두 저해제에서 유사하였다. 대조적으로, FXII618의 표적 선택도는 FXII와 구조적 및 기능적 유사도를 공유하는 트립신 유사 세린 프로테아제의 패널로 평가할 때 CTI 보다 우수하였다. CTI는 실질적으로 3개의 프로테아제 트립신(Ki = 7 +/- 0.5 nM), 플라스민(Ki = 5 +/- 1.6 μM) 및 인자 XIa(Ki = 12.5 +/- 1.4 μM)를 억제하나(도 4, 상단 패널), 바이사이클릭 펩타이드는 트립신(Ki = 5 +/- 0.5 μM)만을 억제하였다(도 4, 하단 패널). CTI와 비교하여 FXII618은 트립신을 약 100배 약하게 억제하였다.

또한, FXII618 및 CTI를 인 비트로 응고 분석에서 내인성 경로의 개시를 억제하는 능력에 대해 나란히 비교하였다(도 4b). 서론에서 지적하였듯이, 제품 원가는 CTI의 적용 시 주요 제한 요소이다.²⁴ 연구원들은 일반적으로 FXIIa(30-100 ㎍/mL)를 크게 차단하는데 필요한 최소량의 CTI를 적용하여 비용을 제한한다. 따라서, 이 실험에서 두 저해제의 질량당 활성을 비교하였다. 분자당 활성은 두 가지 저해제(13.6 kDa [CTI]: 1956 Da [FXII618] = 인자 7)의 상이한 분자량을 고려하여 제시된 데이터에서 얻을 수 있다. 제1세트의 실험에서, aPTT는 다양한 저해제 농도가 있는 경우에서 측정되었다. FXII618은 100 ㎍/mL(aPTT > 170 초)에서 접촉으로 유발된 응고를 완전히 차단하였다. 동일한 양의 CTI는 65.4 +/- 0.5초의 최종 aPTT 값으로 응고를 지연하였다. 더 높은 CTI 농도에서, aPTT 값은 완전 억제에서 멀리 떨어진 정체기로 수렴하는 것으로 보였다. 제2세트의 실험에서, 두 저해제에 의한 접촉 활성화의 억제는 CAT를 사용하여 엘라직 애시드(EA)에 의해 유발된 실시간 트롬빈 생성 분석(TGA)²⁵에서 측정되었다(도 4c). FXII618은 EA에 의해 유도된 트롬빈 생성을 용량-의존적 방식으로 감소시키며, 이미 20 ㎍/mL의 FXII618(내재적 트롬빈 가능성(ETP) 및 피크의 >90% 감소)에서 트롬빈 형성의 완전한 억제에 도달하였다(도 4c, 하단 패널). 비교 가능한 TGA 결과는 FXII-결핍 혈장에서 얻었다. 트롬빈 생성을 백그라운드 수준(ETP ~ 90% 감소 및 피크의 > 96%; 도 4c, 상단 패널)으로 줄이기 위해 약 5배의 CTI가 더 필요하였다(100 ㎍/mL). 이들 결과는 내인성 경로의 활성화를 방지하는 데 있어 CTI보다 FXII618의 증가된 효능을 보여준다. 내인성 경로에 대한 FXII618의 특이도를 평가하기 위해, 고농도의 TF(5 pM)를 사용하는 외인성 경로를 통해 트롬빈 생성이 유도되었다. 100 ㎍/mL의 FXII618의 최고 농도에서도, 펩타이드 저해제는 TF에 의해 유도된 트롬빈 생성에 영향을 미치지 않았다. 정맥 천자 시 접촉 활성화가 일어날 수 있기 때문에 수득 후 직접 전혈에 FXII618을 첨가하는 효과를 시험하였다. 유사한 결과를 얻었다. 종합하면, 이들 데이터는 외인성 경로에 어떠한 영향도 미치지 않으면서 접촉 시스템을 억제하여 내인성 경로의 개시를 효과적으로 억제하는 FXII618의 강력한 효능과 특이도를 명확하게 입증한다.

실시예 1.6 - FXII618은 low- TF 진단 검사에서 접촉 활성화를 효과적으로 차단한다

서론에서 기술한 바와 같이, 낮은 TF 농도(< 1 pM)로 유발된 응고 분석은 생리적 조건하에서 응고 과정을 가장 잘 모방한다. 그러나 낮은 TF 유발 농도에서, 접촉 활성화는 실질적으로 트롬빈 생성에 기여하고, 그 결과를 위조한다. FXII618 및 CTI는 혈장 내 low-TF 트롬빈 생성 분석에서 접촉 활성화를 억제하는 능력이 비교되었다(도 5). 트롬빈 생성이 1 pM TF를 사용하여 유발되었을 때, FXII618 또는 CTI의 유의한 효과는 관찰되지 않았다(도 5, 상단 패널). 대신, 0.25 pM TF에서 FXII618은 내재적 트롬빈 가능성을 CTI와 비슷한 범위로 감소시키나, 지체 시간은 더 길어졌다(지체 시간: 각각 12.3 ± 0.3 및 8.0 ± 0.2)(도 5, 중간 패널). 외인성 또는 내인성 특이 유발이 없는 상태에서 수행된 트롬빈 생성에서, FXII618은 CTI보다 현저하게 강한 접촉 활성화를 억제하였다(지체 시간: 55.8 ± 3.7 및 38.7 ± 1.9, 및 피크: 각각 60.3 ± 0.8 및 78.0 ± 6.8, 도 5, 하단 패널).

혈액 샘플링 직후에 바이사이클릭 펩타이드가 전혈에 첨가되는 경우 트롬빈 생성을 훨씬 더 지연시킬 수 있는지를 최종적으로 시험하였다. 트롬빈 생성은 혈장에서 시험하였다. 저해제가 혈장에 첨가된 실험에서와 유사한 결과가 발견되었다. 외인성 또는 내인성 특이 유발이 없는 경우, FXII618은 심지어 트롬빈 활성화를 완전히 차단할 수 있다. 이 후자의 발견은 혈액 샘플링 튜브에서 일어나는 FXII 활성화가 채혈 직후에 저해제가 첨가되면 억제될 수 있음을 나타낸다. CTI와 비교하여 FXII618에 의한 접촉 활성화의 개선된 차단은 low-TF 진단 검사에서 CTI를 대체할 수 있는 이 합성 저해제의 가능성을 밝힌다.

실시예 1.7 - 마우스에서 내인성 응고의 선택적 억제

FXII618은 마우스에서 그것의 활성을 시험할 수 있는 마우스 FXIIa와 교차-반응한다. 마우스 FXIIa(252 +/- 29 nM)에 대한 Ki가 인간 FXIIa(22 +/- 4 nM)보다 11배 더 높기 때문에, FXII618은 이전에 기술된 혈장 칼리크레인(PK)의 바이사이클릭 펩타이드 저해제 PK12819와 결합하였다. 음으로 하전된 표면에 의한 소량의 FXII의 활성화 시, FXIIa는 혈장 칼리크레인(PK)을 활성화시켜 다량의 FXII를 상호 활성화시킨다. 두 프로테아제를 억제하면 FXII의 활성화뿐만 아니라 FXII의 활성을 억제함으로써 FXIIa의 시너지 차단을 초래한다. 3.5 mg/kg PK128과 병용 투여된 3.5 mg/kg FXII618는 FXII 활성을 49.7 +/- 13.9%로 감소시켰다. 인간 혈장에서 얻은 엑스 비보 데이터와 일치하여, PT 값은 저해제 처리된(7.1 +/- 0.2 초) 및 PBS-대조군 마우스(6.7 +/- 0.3 초) 사이에서 유사하였으며, 외인성 경로는 영향을 받지 않은 것으로 나타났다.

실시예 2 - FXII618에서 천연 및 비천연 아미노산 치환

실시예 2.1 - 재료 및 방법

(바이사이클릭 펩타이드 합성)

펩타이드는 Fmoc-보호된 아미노산과 Rink Amide AM 수지를 사용하여 표준 고체-상 펩타이드 합성에 의해 사내에서 합성되었다. 커플링 시약으로 HBTU 및 HOBt를 사용하여 아미노산을 4배 몰 과량으로 2회 커플링시켰다. 2 당량의 Fmoc-보호된 아미노산, 2 당량의 HATU 및 4 당량의 DIPEA를 첨가하여 비천연 아미노산의 커플링을 수동으로 수행하였다. 합성된 모든 펩타이드들은 자유 N-말단 및 아미드화된 C-말단을 가진다. 펩타이드를 환원 조건(90% TFA, 2.5% H₂O, 2,5% 티오아니솔, 2,5% 페놀, 2.5% 1.2-에탄디티올)하에서 수지로부터 절단하였다. 1 mM의 농도에서 조 펩타이드(crude peptide)를 30℃에서 1시간 동안 70% 수성 완충용액(50 mM NH₄HCO₃, pH 8.0) 및 30% 아세토나이트릴에서 1.5 mM TATA와 반응시켰다. 환화된 펩타이드는 C18 컬럼 상에서 역-상 크로마토그래피로 정제하였다. 순수 바이사이클릭 펩타이드(분석 HPLC에 의해 확인된 > 95% 순도)를 동결건조하고 물에 녹였다. 그들의 질량은 ESI로 확인하였다.

(프로테아제 억제 분석)

바이사이클릭 펩타이드의 억제 활성은 프로테아제와의 인큐베이션 및 형광성 기질과의 그들의 잔류 활성의 정량화에 의해 측정되었다. 잔류 효소 활성은 150 ㎕의 부피로 10 mM Tris-Cl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 0.1% w/v BSA, 0.01% v/v Triton-X100 및 5% v/v DMSO를 포함하는 완충용액에서 측정되었다. 제1시리즈의 실험에서, 50 μM의 형광성 기질 Z-Gly-Gly-Arg-AMC 및 2.5 nM의 효소(인간 β-FXIIa, HFXIIAB; Molecular Innovations)를 사용하였다. 나중에, 보다 민감한 기질 Boc-Gln-Gly-Arg-AMC를 사용하여 효소 농도를 0.5 nM로 감소시켜 보다 낮은 Ki값을 측정할 수 있게 하였다. 대조군 실험 결과, 하기 언급된 대응하는 K_M 값을 사용하여 두 개의 상이한 형광성 기질을 비교하였을 때 FXIIa-저해제들의 매우 유사한 저해상수를 얻었다.

펩타이드의 희석물은 0.00001-4 μM 범위에서 제조하였다. 형광 강도는 Infinite M200Pro 형광 플레이트 리더(368 nm에서 여기, 467 nm에서 방출; Tecan, Mannedorf, Switzerland)로 측정하였다. 반응은 25℃에서 수행되었다. S자형 적정곡선은 다음의 용량 반응 방정식을 사용하여 데이터에 적용되었고, 여기서, x=펩타이드 농도, y=펩타이드 없는 반응의 %활성, A₁ = 100%, A₂ = 0%, p = 1. IC ₅₀ 값은 적용된 곡선으로부터 유도되었다.

저해상수 Ki는 Cheng 및 Prusoff의 방정식, Ki=IC ₅₀/(1+([S]₀/Km)에 따라 계산되었고, 여기서, IC ₅₀는 저해제의 기능 강도이고, [S]₀은 총 기질 농도이며, K _M은 Michaelis-Menten 상수이다. 두 기질 Z-Gly-Gly-Arg-AMC 및 Boc-Gln-Gly-Arg-AMC에 대한 K _M는 각각 180 ± 31 및 256 ± 42 μM로 결정되었다(평균 ± SD, n = 4).

특이도 시험을 위해, 인간 세린 프로테아제의 다음 최종 농도가 사용되었다: tPA(Molecular Innovations) 7.5 nM, uPA(Molecular Innovations) 1.5 nM, 인자 XIa(Innovative Research, Novi, MI, U.S.) 6 nM, PK(Innovative Research) 0.25 nM, 트롬빈(Molecular Innovations) 1 nM, 플라스민(Molecular Innovations) 2.5 nM, 트립신(Molecular Innovations) 0.05 nM, 인자 VIIa(Haematologic Technologies Inc.) 50 nM 및 인자 Xa(Haematologic Technologies Inc.) 6 nM. 펩타이드의 희석은 0.04 내지 40 μM 범위에서 제조되었다. IC₅₀ 저해상수의 측정을 위해, 다음의 형광성 기질을 50 μM의 최종 농도로 사용하였다: Z-Phe-Arg-AMC(PK의 경우; Bachem, Bubendorf, Switzerland), Boc-Phe-Ser-Arg-AMC(인자 XIa의 경우; Bachem), Z-Gly-Gly-Arg-AMC(tPA, uPA, 트롬빈 및 트립신; Bachem), H-D-Val-Leu-Lys-AMC(플라스민의 경우; Bachem) 및 D-Phe-Pro-Arg-ANSNH-C₄H₉(FVIIa 및 FXa의 경우; Haematologic Technologies Inc.).

(혈장 안정성 분석)

펩타이드(H₂O 중 2 mM의 2 ㎕)를 398 ㎕의 인간 혈장에 첨가하였다(최종 펩타이드 농도는 400 ㎕ 최종 부피에서 10 μM이었다). 혼합물을 37℃의 수조에서 인큐베이션 하였다. 8개의 상이한 시점(0 h, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h 및 일부 경우 48h)에서 30 ㎕의 시료를 제거하고, 프로테아제 억제 분석(상기 참조)에 사용된 동일한 완충용액을 사용하여 200 ㎕로 희석하고, 65℃에서 20분 동안 열-불활성화시켰다. 이 단계 동안 혈장에 존재하는 프로테아제가 불활성화되며, 그렇지 않으면 이후에 수행되는 효소 분석을 방해하게 된다. 대조군 실험 결과, 인큐베이션 된 펩타이드는 열-불활성화 과정에 완전히 내성을 나타내었고, 펩타이드 저해제가 없는 불활성화된 혈장은 효소 분석에서 βFXIIa의 활성에 약하게 영향을 미쳤다. 혈장 시료의 열-불활성화 후, 후자는 FXIIa에 대한 억제 효능이 프로테아제 억제 분석에서 분석될 때까지 -20℃에서 유지되었다. 분석하기 전에, 혈장 시료를 16,000g에서 5분간 원심분리하고, 상등액을 수득하였다. 0.0005-0.5 μM 범위의 2배 희석 시리즈를 제조하였다. IC₅₀ 값은 상기 표시된 방정식을 이용하여 적용된 곡선으로부터 유도되었다. %의 잔류 억제는 다음 공식을 이용하여 계산하였다: IC₅₀, _0h /IC_{50, xh} *100, 여기서, IC₅₀, _0h는 0시간 지점에서 저해제의 기능 강도이고, IC_{50, xh}는 상기에서 언급된 다른 혈장 인큐베이션 기간 중 하나 이후 저해제의 기능 강도이다.

(aPTT 및 PT 응고제 활성 측정)

응고 시간(aPTT, PT)은 혈액 응고 분석기(STart Hemostasis coagulation analyzer, Diagnostica Stago)를 사용하여 인간 혈장에서 측정되었다. 외인성 응고는 Innovin(안정화된 HEPES 완충용액 시스템에서 재조합 인간 조직 인자, 합성 인지질 및 칼슘; Dade Behring/ Siemens)를 사용하여 유발되었다. 내인성 응고는 Pathromtin* SL(Siemens)로 유발되었다. 이 연구에서 사용된 정상 인간 혈장 풀은 Innovative research(USA)에 의해 제공되었다.

실시예 2.2 - 결과 및 논의

실시예 2.2에서, 번호 1 내지 73의 펩타이드가 참조된다. 번호 1의 펩타이드가 FXII618이다. 번호 3 내지 72의 펩타이드의 구조적 특징들과 억제능은 도 6에 도시하였다. 펩타이드 번호 73의 구조적 특징들과 억제능은 실시예에서 상세히 설명된다.

(억제 활성의 개선)

FXIIa에 대한 파지 선별에서 분리된 펩타이드의 서열 유사성에 기초하여, 펩타이드 1의 제1 고리의 4개의 아미노산(Phe3, Arg4, Leu5, Pro6)과 제2 고리 중 중간 2개의 아미노산(Gln9, Leu10)이 결합에 가장 중요한 것으로 보였다(도 1). 펩타이드 1의 억제 활성을 개선하기 위한 첫 번째 시도에서, 이들 위치의 아미노산을 유사한 측쇄를 가진 천연 아미노산으로 대체하는 것이 선택되었다. 적당한 아미노산 치환은 다른 아미노산에 의한 아미노산의 진화적 치환 가능성을 나타내는 2개의 스코어링 행렬 BLOSUM62 및 PAM250을 사용하여 선택되었다(도 6). 흡수 분광법에 의해 합성된 펩타이드들의 정확한 정량을 가능하게 하기 위해 모든 펩타이드의 C-말단에 트립토판 잔기가 부가되었다. 이 펩타이드 2는 26 ± 8 nM의 Ki를 가지며, 따라서, 펩타이드 1에 필적하는 활성을 가진다. 각각 6개의 위치 중 하나에서 치환된 하나의 아미노산을 가진 총 26개의 바이사이클릭 펩타이드가 합성되었다. 펩타이드 중 어느 것도 개선된 Ki를 갖지 않지만 귀중한 구조-활성 관계 데이터를 얻었다. Phe3 위치에서, 페닐알라닌을 트립토판으로 대체하면, 활성이 보존되었다(펩타이드 3; K _i = 26 ± 2). 이 위치에서 다른 모든 아미노산 치환은 2배 이상(티로신, 루신, 알라닌; 펩타이드 4-6) 또는 10배 이상(발린, 이소루신, 프롤린; 펩타이드 7-9) 활성을 감소시켰다. Arg4 위치에서, FXII의 S1 결합 포켓의 바닥에서 아스파르트산과의 이온 상호작용을 형성하기 위해 이 잔기가 양전하를 가져야 하므로 라이신으로의 치환만을 시험하였다. 이 위치에서 라이신은 억제 활성을 10배 감소시켰다(펩타이드 10; K _i = 283 ± 21). Leu5의 위치에서, 발린(펩타이드 11) 또는 이소루신(펩타이드 12)과 같이 루신과 매우 흡사한 아미노산을 포함하여 모든 치환이 친화도를 50배 이상 감소시켰다. 이 위치에서 메티오닌(펩타이드 13) 또는 알라닌(펩타이드 14)을 함유한 펩타이드는 시험한 최고 농도(3 μM)에서 FXIIa를 전혀 억제하지 않았다. Pro6 위치에서, 두 개의 아미노산 교체, 즉, 알라닌(펩타이드 15)과 루신(펩타이드 18)은 활성을 2배 미만 감소시켰다. 제2 거대환 고리에서, 모든 치환은 실질적으로 펩타이드 2의 활성을 감소시켰다. Gln9의 위치에서 아스파르트산(펩타이드 21; 54배) 및 Leu10 위치에서 이소루신(펩타이드 26; 8배)의 경우 가장 작은 손실이 발견되었다.

펩타이드 1의 활성을 개선하기 위한 두 번째 시도에서, 아미노산을 원래의 아미노산과 구조적으로 훨씬 가깝게 닮은 비천연 잔기로 대체하는 것이 선택되었다(도 6). Phe3 위치에서, 이들 두 개의 천연 아미노산을 가진 펩타이드가 가장 활성이 높았으므로(펩타이드 2 및 3), 페닐알라닌(펩타이드 29-32) 및 트립토판(펩타이드 33-37)과 닮은 비천연 아미노산을 시험하였다. 페닐알라닌 유사체 중 2개는 활성을 약 30배 감소시켰고(펩타이드 29 및 30), 2개는 시험한 최고 농도에서 FXIIa를 억제하지 않았다(1 μM; 펩타이드 31 및 32). 트립토판 유사체를 갖는 5개의 펩타이드 중 하나는 활성이 약간 개선되었다: 2-나프틸알라닌을 포함하는 펩타이드 33은 2배 개선된 억제 활성을 보였다(K _i = 12 ± 4). Arg4 위치에서, 아미노산은 1개의 라이신 유사체(호모라이신; 펩타이드 38) 및 3개의 아르기닌 유사체(호모아르기닌, 노르아르기닌 및 4-구아니디노페닐알라닌; 펩타이드 39-41)로 대체되었다. 이들 치환 모두는 펩타이드의 결합 친화도를 5배 이상 감소시켰다. Leu5 및 Leu9의 두 위치에서, 루신과 구조적으로 유사한 몇 가지 지방족 아미노산을 시험하였다. Leu5 위치에서, 이들 치환은 큰 인자들에 의해 펩타이드의 결합 친화도를 감소시켰고, 여기서, 노르발린(펩타이드 42)의 경우에서 친화도의 가장 작은 저하가 발견되었다. Leu10 위치에서, 5개의 비천연 아미노산 모두는 친화도를 8배 미만으로 감소시켰다.

한 번에 오직 한 개의 아미노산이 대체되었고, 삽입된 아미노산의 대부분이 치환된 것과 구조적으로 유사하다는 사실에도 불구하고, 상기 기술된 48개의 펩타이드 변이체중 상당수는 활성이 실질적으로 감소하였다. 펩타이드 1은 FXIIa의 표면에 상보적인 형태를 나타내었고, 대부분의 아미노산 위치에서 더 큰 구조 변화를 용납하지 않는다. 리간드와 표적 간의 높은 구조적 형태 상보성은 이전에 X-선 결정학에 의해 연구된 모든 바이사이클릭 펩타이드에서 발견된 바 있다. 펩타이드 1의 억제 활성을 개선하기 위한 세 번째 시도에서, 측쇄에서 보다 작은 구조 변화를 초래하는 아미노산 치환을 시험하는 것을 목적으로 하였다. Phe3 위치는 비천연 아미노산을 이용한 2개의 치환이 약간 개선된 저해제들을 산출한 유일한 부위이므로 이 위치를 변형시키는 것으로 선택되었다(도 6). 오르토-(펩타이드 51) 및 파라-위치(펩타이드 53)에서 Phe3의 페닐 고리에 메틸기를 첨가하면 활성이 약 5배 감소하였다. 대조적으로, 메타-위치에 메틸기를 첨가하면 친화도를 2.5배 증가시켰다(펩타이드 52; K _i = 10.4 ± 0.6). 이들 결과는 페닐알라닌의 측쇄 주위의 일부 공간이 이용 가능하지만 이 공간은 제한되어 있음을 나타냈다. 그것은 기존의 원자들이 대체된 더 작은 구조적 변화로 이어졌다. 메타-위치에서 페닐 고리의 탄소 원자를 질소로 대체하면 활성이 약 3배 개선되었다(펩타이드 54; K _i = 8.4 ± 0.3). 파라-위치에서 동일한 치환은 억제 활성을 약 6배 감소시켰다(펩타이드 55). 페닐 고리 상에서 수소 원자를 할로겐 원자로 치환하면, 두 방향 모두에서 활성이 극적으로 바뀌었다. 메타-위치에서 불소는 활성을 약 2.5배 감소시켰다(펩타이드 57). 대조적으로, 오르토- 및 파라-위치에서 불소는 각각 활성을 2배 및 11배 향상시켰다(펩타이드 56: K _i = 13.1 ± 1.2; 펩타이드 58: K _i = 2.31 ± 0.36). 파라 위치에서 불소로 인한 커다란 개선은 전자 분포의 변화로 인한 것일 수 있다. 펩타이드 1과 FXIIa의 상호작용의 구조 모델링은 페닐알라닌이 방향족 포켓에 묻혀 Tyr439 및 His393과 상호작용함을 시사하였다. 불소와 같은 펩타이드의 페닐 고리에서 전자-제거기의 존재는 프로테아제의 티로신 잔기와의 pi-pi 스태킹 상호작용의 강도를 증가시키므로 더 높은 결합 친화도를 유도한다. 이어서 페닐 고리의 전자 분포에 영향을 미치는 파라 위치에서 더 많은 치환체를 시험하였다. 요오드의 첨가는 활성을 10배 이상 감소시켰고(펩타이드 59), 니트로기는 결합 친화도를 6배 향상시켰다(펩타이드 60: K _i = 4.5 ± 0.7). 마지막으로, 280 nm에서의 큰 흡광계수로 인해 도입된 C-말단의 트립토판이 결핍된 펩타이드 58의 변이체가 합성되어 흡광도에 기초한 농도의 정확한 정량화가 가능해졌다. 페닐알라닌 상의 파라-플루오로 원자에 의해 펩타이드 1과는 다른 생성된 펩타이드 61은 2.01 ± 0.07 nM의 Ki를 가졌다. FXII800이라고도 불리는 바이사이클릭 펩타이드 61은 단일-자리 나노 몰 저해상수를 가진 최초의 합성 FXIIa 저해제이다.

(단백질 분해 안정성의 개선)

바이사이클릭 펩타이드 1은 37℃에서 연장된 기간 동안(t_1/2 = 3.9 ± 1.9 h) 인간 혈장에서 인큐베이션될 때 단백질 분해에 의해 불활성화되는 것으로 밝혀졌다. 4시간의 반감기는 우리의 이전 연구에서 입증된 바와 같이 인 비트로 적용에서 사용된 혈장 시료에서 접촉 활성화를 차단하기에 충분하지만 FXIIa가 더 오랫동안 억제되어야 하는 임상 적용에는 충분하지 않을 수 있다. 인간 혈장에서 인큐베이션 된 펩타이드 1의 질량 분광 분석은 첫 번째 단백질 분해 변형이 아르기닌의 질량에 대응하는 156 Da 단편의 제거임을 보여주었다. N-말단 및 C-말단 아르기닌을 가지지 않는 바이사이클릭 펩타이드는 각각 932 ± 80 nM(펩타이드 62) 및 28.8 ± 2.0 nM(펩타이드 63)의 Kis를 가진다. 이 결과는 혈장 프로테아제가 N-말단의 아르기닌을 제거한다는 것을 시사한다. 안정성의 개선에 따라, Arg1 위치에서 아미노산의 치환은 i) 결합 친화도를 많이 감소시키지 않고, 및 ii) 첫 번째 아미노산의 단백질 분해 절단을 방지함을 조사하였다(도 6). Arg1이 치환된 바이사이클릭 펩타이드는 C-말단 트립토판 잔기가 없이 합성되었다. Arg1 대신에 이소루신, 발린, 알라닌과 같은 천연 아미노산은 모두 친화도를 > 5배 감소시켰다(펩타이드 64-66). 라이신으로 대체하면, 결합 친화도가 보존되어 측쇄의 양전하가 중요함을 시사한다(펩타이드 67: 27.4 ± 3.8). D-아르기닌은 결합 친화도를 3배 감소시켰다(펩타이드 68: K _i = 89.4 ± 2.3). 이 구조-활성 데이터에 기초하여, 양으로 하전된 측쇄를 가진 다수의 비천연 아미노산을 시험하였다(펩타이드 69-72). 이들 아미노산을 가진 펩타이드들은 약간 나쁘거나 더 좋은 친화도를 가지며, Kis는 18.5 내지 43.1 nM이다.

다음으로, 바이사이클릭 펩타이드 69-72의 안정성을 시간대별로 37℃에서 인간 혈장에서 10 μM 농도로 인큐베이션하고, 잔류 억제 활성을 측정하여 시험되었다. 혈장 프로테아제 활성은 시료를 65℃에서 10분 동안 인큐베이션 함으로써 열-불활성화되었다. 열-처리는 바이사이클릭 펩타이드의 활성에 영향을 미치지 않았다. 4개의 펩타이드 중 2개는 펩타이드 1과 비교하여 개선된 안정성을 가졌다(도 10a). 가장 긴 반감기는 N-말단에 노르아르기닌 잔기를 가진 펩타이드 71에서 발견되었다. 그것은 21.7 ± 2.5 h의 반감기를 가지므로 펩타이드 1에 비해 5.5배 개선된 안정성을 보였다. 그리고 나서, 노르아르기닌 치환을 펩타이드 1의 억제 활성을 가장 잘 개선한 아미노산 교체(3번 위치에서 4-플루오로-페닐알라닌)과 조합하였다. 생성된 펩타이드 73은 또한 FXII801로 불리며, Ki는 3.90 ± 0.43 nM이고, 혈장 반감기는 15.5 ± 3.9 h이었다.

(표적 선택도)

펩타이드 73의 표적 선택도는 구조적으로 관련되거나, 기능적으로 중요한 프로테아제의 억제를 측정함으로써 평가되었고, 펩타이드 1의 특이도 프로파일과 비교되었다. 10개의 프로테아제 중 8개가 시험한 최고 농도(40 μM)에서 20% 미만으로 억제되었다. 파라로거스 프로테아제 중 2개 즉, 트립신(1.30 ± 0.01 μM)과 혈장 칼리크레인(45.1 ± 1.5 μM)만이 펩타이드 73에 의해 억제되었다. 동일한 두 프로테아제는 비슷한 범위에서 펩타이드 1에 의해서도 억제되었다. 따라서, 이들 결과는 다른 프로테아제에 대한 활성이 본질적으로 변하지 않는 동안 FXIIa에 대한 친화도가 개선될 수 있음을 보여주었다. 따라서, 새로운 FXIIa 저해제인 펩타이드 73은 트립신(혈액에 존재하지 않은 프로테아제)에 비해 300배 우수한 선택도를 나타내며, 다른 혈장 프로테아제보다 적어도 11,000배의 선택도를 나타낸다.

(내인성 응고 경로의 억제)

내인성 응고 경로를 선택적으로 억제하는 능력은 인 비트로 응고 분석에서 평가되었다. 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 및 프로트롬빈 시간(PT)은 내인성(aPTT) 또는 외인성 경로(PT)를 통해 응고 개시시 응고 시간을 측정한다. 이들 시험은 다양한 농도의 FXIIa-저해제의 존재하에서 인간 혈장에서 수행되었다. 선택적 FXIIa 억제는 aPTT를 증가시키지만 PT는 그렇지 않을 것으로 예상된다. 응고 검사는 우수한 억제 활성을 갖는 펩타이드 61과, 약간 덜 활성적이지만 보다 안정한 변이체 펩타이드 73으로 수행하였고, 이전에 개발된 FXIIa-저해제 펩타이드 1과 비교하였다. 펩타이드 저해제의 존재는 농도 의존적 방식으로 aPTT를 연장하였지만(도 11a), PT는 시험된 모든 펩타이드에 대해 40 μM 농도에서 거의 영향을 받지 않았다(도 11b). 5 μM 펩타이드 저해제의 농도에서, 내인성 경로를 통한 응고는 120초 이내에 발생하지 않았다. 또한, FXIIa에 대한 억제 활성과 aPTT 연장의 정도 사이에는 상관관계가 있었다. 펩타이드 61과 73은 펩타이드 1에 비해 aPTT 연장을 현저하게 증가하였다.

실시예 3 - FXII618의 거대환 고리 내 변경

실시예 3.1 - 재료 및 방법

(재료)

Fmoc-L-α-아미노산, O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'- 테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물(HOBt) 및 Rink Amide AM 수지는 각각 GL Biochem(중국)에서 구입하였다. Fmoc-β-아미노산은 Chemimpex(미국)와 Polypeptide(프랑스)에서 구입하였다.

(펩타이드 합성)

펩타이드는 Advanced ChemTech 348-Ω peptide synthesizer(Aapptec, USA)에서 표준 Fmoc 과정을 이용하여 고체상 펩타이드 합성에 의해 합성되었다(0.03 mmol 규모). Rink Amide AM 수지를 고체 지지체로, DMF를 용매로 사용하였다. 각 아미노산은 HBTU/HOBt(4 당량, DMF 중 0.45 M) 및 DIPEA(6 당량, DMF 중 0.5 M)를 사용하여 2회 커필링되었다(4 당량, DMF 중 0.2 M). 커플링 반응 후 DMF로 수지를 4회 세척하였다. N-말단 Fmoc 보호기를 DMF 중 20% (v/v) 피페리딘으로 제거하였다(RT, 2×5 분, 400 rpm). 탈보호 후 DMF로 수지를 5회 세척하였다.

(수지로부터 펩타이드 절단)

펩타이드는 측쇄 탈보호되었고, 5 mL의 절단 칵테일(90% v/v TFA, 2.5% v/v 1,2-에탄디티올, 2.5% w/v 페놀, 2.5% v/v 티오아니솔, 2.5% v/v H₂O)과 2시간 동안 진탕으로 인큐베이션하여 Rink Amide AM 수지로부터 절단되었다. 진공 여과로 수지를 제거하고, 빙-냉 디에틸 에테르(50 mL)로 펩타이드를 침전시키고, -20℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 4000 rpm (2700 g)에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛을 만들었다. 디에틸 에테르를 버린 다음, 침전물을 디에틸 에테르로 2회 세척하였다. 잔류 용매는 RT에서 증발시켰다.

(TATA를 이용한 펩타이드 환화)

조 펩타이드(보통 ~50 mg)를 6 mL 33% MeCN 및 67% H₂O(~3.5 mM의 농도로 제공)에서 녹였다. 상기 용액에 MeCN 중의 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난(TATA)(10 mM, 1.2 당량)을 첨가하였다. 최종 펩타이드 농도가 1 mM이 될 때까지 탈기 수용성 NH₄HCO₃ 완충용액(60 mM, pH = 8.0)을 첨가하여 반응을 개시하였다. 반응은 30℃의 수조에서 1시간 동안 둔 후 동결건조하였다.

(역-상 HPLC에 의한 펩타이드 정제)

변형된 펩타이드 분말을 1 mL DMSO, 0.1% TFA를 포함하는 2 mL MeCN 및 0.1% TFA를 포함하는 7 mL의 H₂O에서 녹이고, 용매 A(H₂O, 0.1% v/v TFA) 상에서 용매 B(MeCN 0.1% v/v TFA)의 선형 구배를 사용하여 예비 C18 컬럼(Vydac C18 TP1022 250, 22 mm, 10 mm) 상에서 정제하였다(13 분, 15-28%, 유속: 20 mLmin^-1). 원하는 산물의 피크를 ESI-MS 분석을 통해 확인하고 동결건조하였다.

(프로테아제 억제 분석)

합성된 바이사이클릭 펩타이드의 억제 활성은 프로테아제와의 인큐베이션 및 형광성 기질을 사용한 다양한 펩타이드 농도에서 잔류 활성의 정량화에 의해 측정되었다. 각 펩타이드에 대해 H₂O 중의 2 mM 스톡 용액(중량비)을 제조하였다. 분석을 위해, 10 mM TRIS, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl(6수화물), 1 mM CaCl₂(2수화물), 0.01%(v/v) Triton X-100, 0.1 %(w/v) BSA를 포함하는 수용성 완충용액(pH를 7.4로 조정)을 이용하여 펩타이드 스톡 용액으로부터 연속 희석을 만들었다. 인간 β-FXIIa(HFXIIAB; Molecular Innovations)의 최종 농도는 1 nM 또는 0.5 nM이었다. 친화도에 따라 펩타이드의 희석은 3000-0.1 nM의 범위에서 이루어졌다. 형광성 기질 Boc-Q-G-R-AMC(Bachem)의 최종 농도는 50 μM이었고, 최종 DMSO 함량은 5%였다. 형광은 368 nm 여기, 467 nm 방출 필터를 가진 infinite M200 Pro plate reader(Tecan)를 사용하여 측정하였다. 측정은 25℃에서 1분 마다 판독하여 60분 동안 수행하였다. IC50 및 K _i 값은 GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.

(응고 분석)

응고 시간(aPTT 및 PT)은 제조사의 설명서에 따라 STAGO STart4 응고 분석기(Diagnostica)를 사용하여 인간 혈장에서 측정하였다. 외인성 응고는 Innovin(안정화된 HEPES 완충용액 시스템에서 재조합 인간 조직 인자, 합성 인지질 및 칼슘: Dade Behring/Siemens)을 사용하여 유발되었다. 내인성 응고는 Pathromtin* SL(Siemens)를 사용하여 유발되었다. 이 연구에서 사용된 인간 단일 기증자 혈장은 Innovative research(USA)에서 제공받았다.

실시예 3.2 - 결과 및 논의

실시예 3.2에서, 번호 1 및 74 내지 107의 펩타이드가 참조된다. 번호 1의 펩타이드는 FXII618이다. 번호 74-106의 펩타이드의 구조적 특징들 및 억제능은 또한 도 6에 도시되었다. 펩타이드 번호 107의 구조적 특징들 및 억제능은 실시예에서 상세히 설명된다.

이 실시예에서, 바이사이클릭 펩타이드 FXII 저해제 FXII618은 측쇄보다는 백본을 변형함으로써 성숙된 친화도(1)를 갖게 되었다. 특히, 거대환 고리의 다른 위치에서 탄소 원자들을 삽입하는 것이 제안되었다. 고리 크기가 확대된 펩타이드들은 파지 디스플레이 스크린에서 시료로 만들어지지 않았다는 것이 합리적이었다. 또한, 백본의 일부 위치에 탄소 원자들을 삽입하면, 사이클릭 펩타이드의 일부 기(groups)를 더 잘 위치시킬 수 있으며, 이로 인해 기존의 분자 상호작용의 강도가 잠재적으로 개선될 수 있다고 추측된다. 펩타이드 리간드의 거대환 고리 내의 상이한 위치에 단일 탄소 원자를 삽입 또는 결실시키는 것은 결합 친화도를 개선하기 위한 체계적인 접근으로 보고되지는 않았다. 문헌에 기술된 몇 가지 예시들에서, 펩타이드가 환화되는 부위에 원자들이 삽입되거나 결실되었다.

펩타이드의 거대환 고리에 탄소 원자들을 삽입하는 기술적으로 간단하고 빠른 전략은 아미노기와 카르복실기 사이에 추가의 탄소 원자를 포함하는 β-아미노산으로 표준적인 α-아미노산을 대체하는 것이다(도 12a). β-아미노산은 α-나선 펩타이드의 안정성을 개선하기 위해 널리 사용되었다.^{31 - 34} 일부 연구에서, β-아미노산은 예를 들어 부갑상선 호르몬 수용체-1 작용제의 유사체³⁵ 또는 Z-도메인에 기초한 조작된 VEGF 신호 전달 저해제³⁶에서와 같이 안정성뿐만 아니라 결합 친화도 역시 개선하였다. FXII618(1)의 친화도 성숙화에 따라, 2개의 거대환 고리의 다른 위치에서 α-아미노산을 β-아미노산으로 치환하는 것이 선택되었다.

탄소 원자의 삽입이 FXII618의 결합 친화도를 잠재적으로 개선할 수 있는 아미노산 위치를 확인하기 위해³⁷, 두 시리즈의 펩타이드 변이체를 합성하였다: 하나는 개별 아미노산이 β-알라닌으로 대체된 것이고, 다른 하나는 글리신으로 대체된 것이다(도 6). 특정 위치에 β-알라닌과 글리신을 포함하는 펩타이드를 비교하면, 추가적인 탄소 원자가 아미노산 측쇄와는 무관하게 FXII와의 결합을 향상시키는지 이해할 수 있었다. Phe3, Arg4 및 Leu5의 β-알라닌으로의 치환(74, 76, 78)은 저해제를 완전히 불활성화시켜 이들 위치에서 글리신을 가진 펩타이드와 비교할 수 없었다(75, 77, 79; 2 μM에서 억제가 없음). Pro6을 β-알라닌(80)과 글리신(81)으로 치환하면 친화도는 각각 5.5배 및 22배 감소하였다. β-알라닌 변이체에 대해 발견된 결합 친화도의 손실이 더 적으므로 이 위치에 하나의 탄소 원자가 삽입되면 FXII와의 결합이 향상된다는 것을 알 수 있다. 대부분의 경우, 추가의 유연성은 바이사이클릭 펩타이드가 기존의 비-공유 상호작용 중 하나 또는 여러 개가 강화된 구조를 취하도록 허용하였다. Arg8에서의 아미노산 교체는 β-알라닌과 함께 펩타이드에 대한 더 큰 친화도 저하를 주는 반대 효과를 갖는다(82, 83). Gln9 및 Leu10 위치에서 β-알라닌 및 글리신으로의 치환은 약 200의 동일한 인자에 의해 친화도를 감소시켰다(84, 85, 86, 87). 마지막으로, Arg11 위치에서, 친화도 손실은 작았고 β-알라닌(88) 및 글리신 변이체들(89)에서 유사하였다(5배). 친화도의 작은 손실을 감안할 때, 아르기닌 측쇄를 가진 β-아미노산의 삽입은 FXII618(1)의 친화도를 개선할 수 있는 실질적인 기회가 있었다.

β-알라닌/글리신 스크린의 결과에 기초하여, Pro6 및 Arg11은 적당한 측쇄를 가진 β-아미노산의 삽입을 위한 가장 유망한 부위로서 고려되었다. β-아미노산은 알파(C2) 탄소 또는 베타(C3) 탄소에서 측쇄를 가질 수 있으며, 각각 β²- 및 β³-잔기로 지칭된다. 이들 탄소 원자가 R 또는 S 배열을 가질 수 있다고 가정할 때, 임의의 주어진 측쇄에 대해 4개의 부분입체이성질체 β-아미노산이 존재한다. Pro6는 처음에는 일련의 사이클릭 β-아미노산의 범위로 치환되었다(도 6). 이들 치환 모두는 저해제 활성을 적어도 100배 감소시키거나 완전히 불활성화시켰다(90-94). 사이클릭 β-아미노산은 FXII6에 효율적으로 결합하는 것을 방해하는 FXII618에 구조적 제한을 부과한 것으로 보인다. Pro6가 탄소 3, 탄소 2 또는 아미노기에 연결된 메틸기를 가진 사슬 모양의(acyclic) β-아미노산으로 치환된 펩타이드를 이어서 합성하였다(95-99: 도 6). 프롤린의 측쇄에 있는 3개의 탄소 원자 중 하나에 의해 형성된 상호작용을 메틸기가 대체할 수 있다고 추론했다. 이들 펩타이드 중 3개는 중간 마이크로몰 범위에서 저해상수를 가졌지만(95, 98, 99), 이 위치에서 β-알라닌을 가진 펩타이드보다 Ki가 약했다. β-알라닌 치환을 용인하는 것으로 확인된 두 번째 위치는 Arg11이었다. 이 아미노산은 구조적으로 가장 우수한 L-Arg(C3에서 S 배열; (S)-β³-호모아르기닌)(100)과 유사한 β³-아미노산으로 대체되었다. 이 치환은 4배 개선된 Ki를 갖는 펩타이드를 산출하였다(바이사이클릭 펩타이드를 FXII700이라 함; 5.4 ± 0.1 nM; 도 6). 이 위치에서 β-알라닌과 글리신을 가진 2개의 펩타이드가 유사한 친화도를 가졌다면, (S)-β³-호모아르기닌으로 달성된 큰 친화도 개선은 β ³-아미노산에 대해 L-Arg보다 더 큰 아르기닌 측쇄의 상호작용에서 기인할 가능성이 있다.

바이사이클릭 펩타이드 FXII618(1)의 고리 시스템에 탄소 원자들을 삽입하기 위한 다른 효과적인 합성 전략은 시스테인을 측쇄에 각각 1개 및 2개의 추가 탄소를 가진 호모시스테인 또는 5-머캅토-노르발린으로 치환하는 것이다. FXII618(1)의 6개 변이체를 합성하였고, 각각은 3개의 시스테인 중 하나가 2개의 시스테인 동족체로 대체되었다(도 6). Cys12를 호모시스테인으로 대체하면 결합이 1.3배 개선되었다(105의 Ki = 16.3 ± 3 nM). 다른 두 시스테인의 교체는 결합을 감소시켰다. 우수한 Ki를 갖는 바이사이클릭 펩타이드 105를 FXII701로 명명하였다. 이어서, 우수한 친화도 개선을 제공하는 Arg11이 (S)-β³-호모아르기닌으로, 및 Cys12가 호모시스테인으로의 두 가지 변형이 결합되었다. 생성된 펩타이드(107)은 18 ± 2 nM의 Ki를 가지며, 이는 두 가지 변형이 더 이상의 친화도 향상을 제공하지 않음을 나타낸다. Arg11 및 Cys12의 근접성을 감안할 때, 두 가지 변형으로 달성된 친화도 개선을 위한 분자 기반이 관련되어 있으므로 첨가물이 될 수 없다. 2개의 위치에서 탄소 원자의 삽입은 거대환의 이 영역에서 작은 구조 변화를 허용하고, 예를 들어, 아르기닌 측쇄의 상호작용과 같은 분자 상호작용의 품질이 개선된다고 추측하고 싶다.

요약하면, 인 비트로 진화된 사이클릭 펩타이드 리간드의 결합 친화도는 1개 또는 2개의 탄소 원자에 의해 거대환 고리의 크기를 변화시킴으로써 개선될 수 있다. 이 화학적 공간은 유전적으로 암호화된 사이클릭 펩타이드 라이브러리를 스크리닝함으로써 시료로 만들어지지 않으며, 잠재적으로 약간 개선된 리간드를 위한 풍부한 공급원을 제공할 수 있다고 추론된다. 실제로, 바이사이클릭 펩타이드 FXII 저해제 FXII618의 34개 펩타이드 변이체들의 합성 및 스크리닝 결과 실질적으로 개선된 Kis를 갖는 2가지 저해제만을 산출하였다.

실시예 4 - FXII618의 연결 분자의 치환

펩타이드 FXII618(RCFRLPCRQLRCR)은 다음 링커에 의해 변형되었다

(변형 프로토콜)

합성 펩타이드를 수성 완충용액 NH₄HCO₃(60 mM) pH 8.0에서 최종 농도 1 mM로 녹였다. 아세토나이트릴에 녹인 링커를 펩타이드에 첨가하여 1.5 mM 및 20% 아세토나이트릴의 최종 농도를 얻었다. 반응 용액을 30℃의 수조에서 1시간 동안 유지시켰다. 반응 산물을 역-상 HPLC로 정제하였다.

(프로테아제 억제 분석)

잔류 활성은 10 mM TrisCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1mM CaCl₂, 0.1 % w/v 소태아 혈청 알부민(BSA), 0.01% v/v Triton-X100 및 5% v/v DMSO를 포함하는 완충용액(150 ㎕)에서 측정하였다. 인간 인자 XII 베타(Innovative Research)의 최종 농도는 10 nM; Z-Gly-Gly-Arg-AMC(7-아미노-4-메틸쿠마린)-유래된 형광성 기질(Bachem)은 50 μM의 최종 농도에서 사용하였다. 형광 강도는 Tecan Infinite M 200 Pro plate reader(368 nm에서 여기, 468 nm에서 방출)로 측정하였다. 판독은 3반복으로 측정하였다.

저해상수(Ki)는 Cheng-Prusoff 방정식에 따라 계산하였다: K _i= IC₅₀/(1+([S]₀/K_M)), 여기서, IC₅₀는 저해제의 기능 강도이고, [S]₀는 총 기질 농도이며, K_M는 Michaelis-Menten 상수이다. Z-Gly-Gly-Arg-AMC에 대한 K_M는 180 μM이다.

Ki 값:

FXII618-TATA: 24.9 ± 5.7 nM

FXII618-TBAT: 338 ± 32 nM

FXII618-TBMT: 1218 ± 94 nM

또한, FXII618-TATA, FXII618-TBAT 및 FXII618-TBMT의 활성 및 특이도는 도 14에 도시하였다.

실시예 5 - FXII618에서 아르기닌의 변이 및 FXII618에서 유리한 아미노산 치환들의 조합

실시예 5.1 - FXII618의 Arg8 및 Arg11 위치에서 아미노산의 변이

이들 두 위치는 첫 번째 친화도 성숙화 노력에서 완전히 변형되지는 않았다. 이들 두 위치에서 치환된 펩타이드를 합성하고, 인간 FXIIa, 마우스 FXIIa의 억제 및 안정성에 대해 시험하였다. 다음 펩타이드는 마우스 FXIIa에서 개선된 활성을 나타냈고, 훨씬 개선된 안정성을 보였다.

펩타이드	변경된 아미노산	아미노산 치환	인간 FXIIa K i [nM]	마우스 FXIIa K i [nM]
JS17m	Arg8	His	21.6 ± 4	80 ± 30

실시예 5.2 - 단백질 분해 안정성을 개선하기 위한 FXII618의 아미노산 Arg1 의 변이

저해제의 단백질 분해 안정성을 추가로 증가시키기 위해, N-말단의 추가 아미노산들을 시험하였다. 구체적으로, 1번 위치에서 L-Arg(Arg1)이 2개의 D-아미노산으로 대체된 D-아미노산을 스크리닝하였다. Arg1 치환 중, 하기 펩타이드가 가장 우수한 억제 활성을 나타내었다.

펩타이드	변경된 아미노산	아미노산 치환	인간 FXIIa K i [nM]
JS7m	Arg1	D-Arg-D-Ser	18 ± 4

실시예 5.3 - 유익한 돌연변이의 조합

실질적 개선을 제공하는 FXII618의 아미노산 치환의 개요:

Arg1 → D-Arg-D-Ser(rs) K _i(인간 FXIIa) = 18 ± 4 nM

Phe3 → 4-플루오로-페닐알라닌(F^4F) K _i(인간 FXIIa) = 2.0 ± 0.3 nM

Arg8 → His(H) K _i(인간 FXIIa) = 21.6 ± 4 nM

Arg11 → (S)-β3-호모아르기닌(R^b) K _i(인간 FXIIa) = 5.4 ± 0.1 nM

유익한 돌연변이의 3개 또는 4개의 조합:

	서열	인간 FXIIa K i [nM]	t1/2 인간 혈장(h)
FXII618	RCFRLPCRQLRCR	22 ± 4	3.9 ± 1.9
JS33	rsCF4FRLPCHQLRbCR	0.36 ± 0.2	144 ± 30
JS34	rsCF4FRLPCHQLRCR	0.64 ± 0.1	38.7
JS35	rsCF4FRLPCRQLRbCR	0.32 ± 0.1	21.9
JS36	rsCFRLPCHQLRbCR	1.0 ± 0.2	N.D
JS33-R	rsCF4FRLPCHQLRbC	0.4 ± 0.1	127

N.D. = 측정 안됨

<110> Ecole Polytechnique Federale de Lausanne (EPFL) <120> Novel inhibitors of the enzyme activated factor XII (FXIIa) <130> I17O10C0076P/DE <150> EP 15 16 5508.1 <151> 2015-04-28 <160> 89 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII618 <400> 1 Arg Cys Phe Arg Leu Pro Cys Arg Gln Leu Arg Cys Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cons. Seq. <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <400> 2 Xaa Cys Trp Gly Ala Cys Leu Asn Val Cys Xaa 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cons. Seq. <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> la, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <400> 3 Xaa Cys Cys Tyr Leu Arg Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cons. Seq. <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (12) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (13) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (14) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (15) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (17) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <400> 4 Xaa Cys Trp Gly Ala Ala Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 10 15 Xaa <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII501 <400> 5 Lys Cys Trp Gly Ala Cys Leu Asn Thr Cys Pro 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII502 <400> 6 Arg Cys Trp Gly Ala Cys Leu Asn Val Cys Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII503 <400> 7 Lys Cys Trp Gly Ala Cys Leu Asn Ala Cys Pro 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII504 <400> 8 Val Cys Trp Gly Ala Cys Leu Asn Val Cys Pro 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII505 <400> 9 Gln Cys Trp Gly Ala Cys Leu Asn Val Cys Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII506 <400> 10 Ala Cys Trp Gly Ala Cys Gln Asn Val Cys Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII507 <400> 11 Phe Cys Asn Pro Tyr Cys Met Met Lys Cys Ala 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII508 <400> 12 Asp Cys Asn Pro Tyr Cys Gln Met Lys Cys Met 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII509 <400> 13 Arg Cys Trp Tyr Gly Cys Val Pro Gln Cys Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII510 <400> 14 Phe Cys Thr Lys Glu Cys Leu Gln Ser Cys Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII511 <400> 15 Arg Cys Leu Gln Lys Cys Phe Pro Pro Cys Leu 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII512 <400> 16 Gly 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Cys Val Gln Gly Ala Ser Asn Cys 1 5 10 15 Gly <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII520 <400> 24 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Ala Gly Cys Val Ser Val His Gln Ser Cys 1 5 10 15 Gly <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII521 <400> 25 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Ala Lys Cys Ser Gln Thr Trp Ser Gly Cys 1 5 10 15 Gly <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII522 <400> 26 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Ala Lys Cys Pro Gln Thr Ala Ala Gln Cys 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII523 <400> 27 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Ala Thr Cys Asn Gln Gln Gln Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII524 <400> 28 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Ala His Cys Gln Leu Pro Lys Asp Arg Cys 1 5 10 15 Gly <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII525 <400> 29 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Val Gly Cys Asn Ser Pro Arg Gly Pro Cys 1 5 10 15 Gly <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII526 <400> 30 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Val Ser Cys Glu Thr Gln Ser Ser Leu Cys 1 5 10 15 Gly <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII527 <400> 31 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Leu Ser Cys Asn Pro Gln Gly Ser Arg Cys 1 5 10 15 Gly <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII528 <400> 32 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Gln Arg Cys Lys Val Asn Gln Gly Glu Cys 1 5 10 15 Gly <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII529 <400> 33 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Gln Lys Cys Lys Met Asn Gly Gln Asn Cys 1 5 10 15 Gly <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII530 <400> 34 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Gln Leu Cys Gly Arg Pro Gln Met Pro Cys 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII531 <400> 35 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Gln Ala Cys Ile Pro Gln Met Ala Ala Cys 1 5 10 15 Gly <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII532 <400> 36 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Gln His Cys Gln Ala Ser Asn Asn Ser Cys 1 5 10 15 Gly <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII533 <400> 37 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Ser Gly Cys Asn Gln Thr Gly Asn Asp Cys 1 5 10 15 Gly <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII534 <400> 38 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Ser Ala Cys Gln Gln Gly Gly Ala Lys Cys 1 5 10 15 Gly <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII535 <400> 39 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Ser Arg Cys Thr Val Ile Ser Gly Arg Cys 1 5 10 15 Gly <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII536 <400> 40 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Arg Gly Cys Pro Asp Gln His Gly Val Cys 1 5 10 15 Gly <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII537 <400> 41 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Lys Leu Cys Gly Ala Ala Arg Asp Gly Cys 1 5 10 15 Gly <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII538 <400> 42 Ala Cys Trp Gly Ala Ala Glu Arg Cys Lys Gln Ala Asp Asn Ser Cys 1 5 10 15 Gly <210> 43 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cons. Seq. <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> (13) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <400> 43 Xaa Cys Xaa Arg Leu Xaa Cys Xaa Gln Leu Xaa Cys Xaa 1 5 10 <210> 44 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII572 <400> 44 Arg Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Gln Cys Pro 1 5 10 <210> 45 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII573 <400> 45 Ile Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Arg Cys Val 1 5 10 <210> 46 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII574 <400> 46 Val Cys Pro Arg Leu Pro Cys Gly Gln Leu Arg Cys Gly 1 5 10 <210> 47 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII575 <400> 47 Ile Cys Pro Arg Leu Pro Cys Arg Gln Leu Ser Cys Met 1 5 10 <210> 48 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII576 <400> 48 Val Cys Pro Arg Leu Pro Cys His Gln Leu Arg Cys Gly 1 5 10 <210> 49 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII577 <400> 49 Arg Cys Pro Arg Leu Pro Cys Glu Gln Leu Arg Cys Ala 1 5 10 <210> 50 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII578 <400> 50 Ile Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Val Cys Thr 1 5 10 <210> 51 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII579 <400> 51 Leu Cys Pro Arg Leu Pro Cys Gly Gln Leu Arg Cys Thr 1 5 10 <210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII580 <400> 52 Ile Cys Pro Arg Leu Pro Cys Gly Gln Leu Ser Cys Gln 1 5 10 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII581 <400> 53 Arg Cys Pro Arg Leu Pro Cys Glu Gln Leu Ala Cys Gly 1 5 10 <210> 54 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII582 <400> 54 Gly Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Arg Cys Ser 1 5 10 <210> 55 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII583 <400> 55 Ile Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ser Gln Leu Arg Cys Ala 1 5 10 <210> 56 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII584 <400> 56 Lys Cys Pro Arg Leu Pro Cys Gly Gln Leu Arg Cys Ala 1 5 10 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII585 <400> 57 Ala Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Pro Cys Arg 1 5 10 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII586 <400> 58 Arg Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ser Gln Leu Val Cys Gly 1 5 10 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII587 <400> 59 Arg Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Glu Cys Gln 1 5 10 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII588 <400> 60 Ile Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Lys Cys Arg 1 5 10 <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII589 <400> 61 Leu Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Arg Cys Pro 1 5 10 <210> 62 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII590 <400> 62 Ala Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ser Gln Leu Lys Cys Gly 1 5 10 <210> 63 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII591 <400> 63 Phe Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Lys Cys Ser 1 5 10 <210> 64 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII592 <400> 64 Val Cys Pro Arg Leu Ala Cys Gly Gln Leu Arg Cys Asp 1 5 10 <210> 65 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII593 <400> 65 Arg Cys Pro Arg Leu Met Cys Ala Gln Leu His Cys Pro 1 5 10 <210> 66 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII594 <400> 66 Gly Cys Pro Arg Leu Met Cys Ala Gln Leu Gln Cys Trp 1 5 10 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII595 <400> 67 Arg Cys Pro Arg Leu Ala Cys Glu Gln Leu His Cys Val 1 5 10 <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII596 <400> 68 Arg Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ser Gln Leu Val Cys Gly 1 5 10 <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII597 <400> 69 Val Cys Pro Arg Leu Gln Cys His Gln Leu Arg Cys Thr 1 5 10 <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII598 <400> 70 Ile Cys Pro Arg Leu Ala Cys Gly Gln Leu Arg Cys Glu 1 5 10 <210> 71 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII599 <400> 71 Val Cys Ala Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Lys Cys Gln 1 5 10 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII600 <400> 72 Ala Cys Phe Arg Leu Pro Cys Leu Gln Leu Ala Cys His 1 5 10 <210> 73 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII601 <400> 73 Arg Cys Phe Arg Leu Pro Cys Ser Gln Leu Thr Cys Val 1 5 10 <210> 74 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII602 <400> 74 Arg Cys Ala Arg Leu Pro Cys His Gln Leu His Cys Leu 1 5 10 <210> 75 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII603 <400> 75 Arg Cys Ala Arg Leu Pro Cys His Gln Leu Lys Cys Ser 1 5 10 <210> 76 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII604 <400> 76 Lys Cys Leu Arg Leu Phe Cys Asp Gln Leu Pro Cys Arg 1 5 10 <210> 77 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII605 <400> 77 Gly Cys Phe Arg Leu Leu Cys Ser Gln Leu Lys Cys Ala 1 5 10 <210> 78 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII606 <400> 78 Trp Cys Leu Arg Leu Gln Cys Glu Gln Leu Met Cys Gly 1 5 10 <210> 79 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII607 <400> 79 Arg Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Ser Cys Glu 1 5 10 <210> 80 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII608 <400> 80 Arg Cys Phe Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Arg Cys Glu 1 5 10 <210> 81 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII609 <400> 81 Arg Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Arg Cys Glu 1 5 10 <210> 82 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII610 <400> 82 Ala Cys Phe Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Ser Cys Glu 1 5 10 <210> 83 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII611 <400> 83 Arg Cys Phe Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Ser Cys Ala 1 5 10 <210> 84 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII612 <400> 84 Arg Cys Phe Arg Leu Pro Cys Glu Gln Leu Ser Cys Glu 1 5 10 <210> 85 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII613 <400> 85 Arg Cys Phe Arg Leu Pro Cys Ser Gln Leu Ser Cys Glu 1 5 10 <210> 86 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII614 <400> 86 Arg Cys Phe Arg Leu Pro Cys Arg Gln Leu Ser Cys Glu 1 5 10 <210> 87 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII615 <400> 87 Arg Cys Phe Arg Leu Pro Cys Trp Gln Leu Ser Cys Glu 1 5 10 <210> 88 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII616 <400> 88 Arg Cys Phe Arg Leu Pro Cys Arg Gln Leu Arg Cys Ala 1 5 10 <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FXII617 <400> 89 Arg Cys Phe Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Arg Cys Arg 1 5 10

Claims (15)

1. 펩타이드 (X¹)(X²)(X³)_n(X⁴)RL(X⁵)(X⁶)_m(X⁷)(X⁹)_l(X¹⁰)(X¹¹)(X¹²)(X¹³)(X¹⁴)_k(X¹⁵)(X¹⁶)를 포함하거나 구성되는 응고 효소 활성화 인자 XII(FXIIa)의 바이사이클릭 저해제,
   여기서, (X¹)은 존재하거나 그렇지 않으며, 존재하는 경우 아미노산이고;
   (X²)는 측쇄를 가진 아미노산이며;
   (X³)는 아미노산이며, n은 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이고;
   (X⁴)는 지방족 L-아미노산 또는 환형의 L-아미노산, 바람직하게는 L, P 또는 방향족 L-아미노산, 및 가장 바람직하게는 방향족 L-아미노산이며;
   (X⁵)는 아미노산이고;
   (X⁶)은 아미노산이며, m은 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이며;
   (X⁷)은 측쇄를 가진 아미노산이고;
   (X⁹)는 아미노산이며, l은 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이며;
   (X¹⁰)은 아미노산이고;
   (X¹¹)은 아미노산, 바람직하게는 Q이며;
   (X¹²)는 소수성 L-아미노산, 바람직하게는 지방족 L-아미노산, 및 가장 바람직하게는 L이고;
   (X¹³)은 아미노산이며;
   (X¹⁴)는 아미노산이며, k는 0 내지 3, 바람직하게는 0 또는 1, 및 가장 바람직하게는 0이고;
   (X¹⁵)는 측쇄를 가진 아미노산이며; 및
   (X¹⁶)은 존재하거나 그렇지 않으며, 존재하는 경우, 아미노산이고; 그리고
   여기서, 상기 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)의 측쇄는 연결 분자를 통해 연결되고, 상기 연결 분자는 적어도 세 개의 작용기를 가지며 각 작용기는 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)의 측쇄 중 하나와 공유 결합을 형성한다.
2. 제1항에 있어서,
   (X⁴)는 L, P, F, W, Y, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 3-플루오로-페닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 및 2-니트로-페닐알라닌으로 구성된 군,
   바람직하게는 F, W, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 및 2-니트로-페닐알라닌으로 구성된 군,
   보다 바람직하게는 F, W, 2-나프틸알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 및 2-니트로-페닐알라닌으로 구성된 군, 및
   가장 바람직하게는 2-나프틸알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, 2-아미노-3-(피리딘-3-일)프로피오닉 애시드, 2-플루오로-페닐알라닌, 4-플루오로-페닐알라닌 및 2-니트로-페닐알라닌으로 구성된 군에서 선택되는, 저해제.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   (X⁵)는 소수성 L-아미노산 또는 극성의 하전되지 않은 L-아미노산, 바람직하게는 소수성 L-아미노산, 보다 바람직하게는 S, A, L 또는 P, 및 가장 바람직하게는 L 또는 P인, 저해제.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)의 측쇄는 작용기를 포함하고, 바람직하게는 각각의 (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)는 독립적으로 -NH₂, -COOH, -SH, 알켄, 알킨, 아자이드 및 클로로아세타마이드로부터 선택되며, 바람직하게는 -NH₂ 및 -SH, 및 가장 바람직하게는 -SH인, 저해제.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   (X²), (X⁷) 및 (X¹⁵)는 각각 독립적으로 K, 오르니틴, 티알라이신, 2,3-디아미노프로파노익 애시드, 디아미노부티릭 애시드, D, E, C, 호모시스테인, 페니실라민 또는 프로파길글리신이고, 바람직하게는 C 또는 호모시스테인, 및 가장 바람직하게는 모두 C인, 저해제.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   (X²)는 5-머캅토-노르발린, 호모시스테인 또는 C, 바람직하게는 호모시스테인 또는 C, 및 가장 바람직하게는 C이고; 및/또는
   (X⁷)는 호모시스테인 또는 C, 바람직하게는 C이며; 및/또는
   (X¹⁵)는 5-머캅토-노르발린, 호모시스테인 또는 C, 바람직하게는 호모시스테인 또는 C이, 저해제.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   (X¹)는 D-Arg, 호모아르기닌, L, 노르아르기닌, 4-구아니디노페닐알라닌, 호모라이신, D-Arg-D-Ser 또는 L-Arg, 바람직하게는 호모아르기닌, L, 노르아르기닌, 4-구아니디노페닐알라닌, 호모라이신, D-Arg-D-Ser 또는 L-Arg, 및 가장 바람직하게는 호모라이신, D-Arg-D-Ser 또는 L-Arg이고; 및/또는
   (X¹⁰)는 G, H 또는 R, 바람직하게는 H 또는 R이며;
   (X¹³)는 A, G, (S)-β3-호모아르기닌 또는 R, 바람직하게는 (S)-β3-호모아르기닌 또는 R이고, 및/또는
   (X¹⁶)는 R 또는 존재하지 않은 것인, 저해제.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   연결 분자는 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난(TATA), 1,3,5-트리스(클로로아세틸)-1,3,5-트리아지난(TCAT), 1,3,5-트리스(브로모아세틸)-1,3,5-트리아지난(TBAT), 1,3,5-트리스(브로모메틸)벤젠(TBMB) 및 2,4,6-트리스(브로모메틸)-1,3,5-트리아진(TBMT)로부터 선택되며, 및 바람직하게는 1,3,5-트리아크릴로일-1,3,5-트리아지난(TATA)인, 저해제.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   다음 항목 (i) 내지 (iv) 중 적어도 하나가 적용되는 저해제:
   (i) (X¹)는 D-Arg-D-Ser이고,
   (ii) (X⁴)는 4-플루오로-페닐알라닌이며,
   (iii) (X¹⁰)는 H이고, 및/또는
   (iv) (X¹³)는 (S)-β3-호모아르기닌이며;
   여기서, (X¹⁶)는 선택적으로 존재하지 않으며, 연결 분자는 바람직하게는 TATA이다.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    저해제는 FXIIa에 대한 저해상수(K_i)가 100 nM 미만인, 저해제.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 저해제를 FXIIa와 접촉하는 것을 포함하고, FXIIa는 바람직하게는 혈액, 혈장 또는 혈청 시료에서 존재하는 것인, FXIIa의 효소 활성을 억제하는 엑스 비보 방법.
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 저해제를 포함하는 약학적 조성물.
13. 혈전성 질환, 바람직하게는 혈전, 심부정맥 혈전증, 유전성 혈관 부종 및 당뇨병성 황반 부종에서 선택된 혈전성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 저해제.
14. 혈관, 튜브, 바늘, 주사기, 멤브레인 또는 의료 기기를 코팅하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 저해제의 용도.
15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 저해제를 포함하는 혈액 응고 검사용 키트.
    
    
    
    

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