CN107810190A - 酶活化因子XII (FXIIa)的新型抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X9)l(X10)(X11)(X12)(X13)(X14)k(X15)(X16)或由肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X9)l(X10)(X11)(X12)(X13)(X14)k(X15)(X16)组成的凝血酶活化因子XII(FXIIa)的双环抑制剂，其中(X1)存在或不存在，并且如果存在，则为氨基酸；(X2)是具有侧链的氨基酸；(X3)是氨基酸，并且n在0和3之间，优选0或1且最优选0；(X4)是脂肪族L‑氨基酸或环状L‑氨基酸，优选L、P或芳香族L‑氨基酸，且最优选芳香族L‑氨基酸；(X5)是氨基酸；(X6)是氨基酸，并且m在0和3之间，优选0或1，且最优选0；(X7)是具有侧链的氨基酸；(X9)是氨基酸，并且l在0和3之间，优选0或1，且最优选0；(X10)是氨基酸；(X11)是氨基酸，优选Q；(X12)是疏水性L‑氨基酸，优选脂肪族L‑氨基酸，且最优选为L；(X13)是氨基酸；(X14)是氨基酸，并且k在0和3之间，优选0或1，且最优选0，(X15)是具有侧链的氨基酸；并且(X18)存在或不存在，并且如果存在，则为氨基酸；并且其中(X2)、(X7)和(X15)的侧链经由连接分子连接，所述连接分子具有至少三个官能团，每个官能团与(X2)、(X7)和(X15)侧链之一形成共价键。

Description

酶活化因子XII(FXIIa)的新型抑制剂
技术领域
本发明涉及包含肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X9)l(X10)(X11)(X12)(X13)(X14)k(X15)(X16)或由肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X9)l(X10)(X11)(X12)(X13)(X14)k(X15)(X16)组成的凝血酶活化因子XII(FXIIa)的双环抑制剂，其中(X1)存在或不存在，并且如果存在，则为氨基酸；(X2)是具有侧链的氨基酸；(X3)是氨基酸，并且n在0和3之间，优选0或1且最优选0；(X4)是脂肪族L-氨基酸或环状L-氨基酸，优选L、P或芳香族L-氨基酸，且最优选芳香族L-氨基酸；(X5)是氨基酸；(X6)是氨基酸，并且m在0和3之间，优选0或1，且最优选0；(X7)是具有侧链的氨基酸；(X9)是氨基酸，并且l在0和3之间，优选0或1，且最优选0；(X10)是氨基酸；(X11)是氨基酸，优选Q；(X12)是疏水性L-氨基酸，优选脂肪族L-氨基酸，且最优选为L；(X13)是氨基酸；(X14)是氨基酸，并且k在0和3之间，优选0或1，且最优选0，(X15)是具有侧链的氨基酸；并且(X16)存在或不存在，并且如果存在，则为氨基酸；并且其中(X2)、(X7)和(X15)的侧链经由连接分子连接，所述连接分子具有至少三个官能团，每个官能团与(X2)、(X7)和(X15)侧链之一形成共价键。
背景技术
在本说明书中，引用了许多文件包括专利申请和制造商的手册。这些文件的公开内容虽然不视为与本发明的可专利性相关，但随同通过引用全文并入。更具体地，所有提及的文件通过引用并入，至如同每个个别文件特别且个别指出通过引用并入相同的程度。
血液凝固测试常规地在临床实验室中执行，以评价患者中的凝血功效。在大多数凝血测试中，用强触发剂诱导血液凝固，并且凝血时间用作凝血潜能的指标。虽然这些测试在诊断上有用，但它们在其与患者的出血或血栓形成风险相关的能力有限。更新的总体凝血测定法例如血栓弹力图(TEG)、血栓弹力描记术(TEM)和校准的自动化血栓造影术(thrombography)(CAT)递送了凝血过程的更多参数，并且有希望更好地预测凝血潜能。朝向使用TEG和TEM、粘弹法测定方法测试全血中的止血已做出了重大努力。它们允许在模拟静脉流动下研究凝血期和随后的裂解期。粘弹法测定方法已经在临床中用于围手术期出血管理。TEG用作医院中的分析方法。在一些TEG和CAT测定法中，凝血触发组织因子(TF)必须以低浓度使用，以便最佳地反映患者中的凝血潜能。然而，在这种测定法中，FXII与样品管的接触可以引发内源性凝血途径并且伪造结果。玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)，从以24nM的Ki抑制FXIIa的玉米种子中分离的13.6kDa蛋白质，迄今为止用于压制这些效应。1,2它因此是FXIIa的天然抑制剂。然而，CTI在通常使用的浓度(30-100μg/mL)下不能完全阻断接触活化。另外，近期研究显示CTI还抑制其他相关的蛋白酶如FXIa。3CTI的另一个限制是高价格：每个测定法通常使用的50μg研究级CTI花费5-10美元，取决于提供者。TEM在临床中常规用于围手术期出血管理。近期，已创建了使用TEM来区分严重和轻度嗜血病症的联盟。这种分类需要进行由低TF浓度触发的EXTEM测试(具有经由外源性途径的特异性诱导凝血的TEM)。TEM和低TF诱导的TGA两者都需要使用接触活化抑制剂。
几项近期研究指示内源性凝血牵涉病理性凝血，并且已将凝血因子FXII表征为治疗靶。4-10生理分子例如DNA、RNA、蛋白质聚集体、多磷酸盐和胶原据报道活化FXII且触发血栓形成。11发现FXII缺陷小鼠在呈现正常止血的同时保护免于血栓形成。8来自同类者研究的数据提示升高的血浆FXII水平与冠心病事件的风险增加相关。4,12同时，内源性途径中的缺陷没有严重的病理后果。FXII缺陷个体呈现正常的止血能力。13,14抗体介导的FXII抑制在灵长类动物中证实了这一发现。7已开发了各种起源和作用模式的一系列FXII抑制剂。RNA-适体R4cXII-1.9和小鼠mAb 15H8抑制FXII的自动活化。7重组吸血昆虫蛋白质结构域infestin 4(rHA-infestin-4；Ki＝0.3nM)15,16，并且噬菌体展示衍生的人源化抗体3F7是FXII的活化形式的直接抑制剂(Ki＝13nM)。6它们都显示在体外凝血测定法中凝血的内源性途径的选择性抑制。15H8、rHA-infestin-4和3F7在各种血栓形成模型和物种中显示有效的体内保护，而无相关出血。4,6,7,9,10开发了几种小分子FXIIa抑制剂，但它们抑制结构相关的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。17近期，开发了具有超过相关蛋白酶的高选择性(>100倍)的合成FXIIa抑制剂。18然而，它的效力(Ki＝1.2μM)不允许将其朝向治疗化合物的生成进一步开发。尽管FXII在内源性凝血级联中的关键作用，但目前尚不存在具有纳摩尔范围内的结合常数的选择性合成FXII抑制剂。
因此，持续需要FXIIa的进一步抑制剂，其克服了与目前可用的FXIIa抑制剂相关的至少一个缺点。这些抑制剂尤其对于本文下文所述的FXIIa抑制剂的诊断和治疗应用有利。特别地，需要提供在纳摩尔范围内的FXIIa的选择性抑制的抑制剂。这个需要由本发明解决。
发明内容
相应地，本发明在第一个方面涉及包含肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X8)或由肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X8)组成的凝血酶活化因子XII(FXIIa)的双环抑制剂，其中(X1)存在或不存在，并且如果存在，则为氨基酸；(X2)是具有侧链的氨基酸；(X3)是氨基酸，并且n在0和3之间，优选0或1且最优选0；(X4)是脂肪族L-氨基酸或环状L-氨基酸，优选L、P或芳香族L-氨基酸，且最优选芳香族L-氨基酸；(X5)是氨基酸；(X6)是氨基酸，并且m在0和3之间，优选0或1，且最优选0；(X7)是具有侧链的氨基酸；并且(X8)存在或不存在，并且如果存在，则为氨基酸；并且其中(X2)和(X7)的侧链经由连接分子连接，所述连接分子具有至少两个官能团，每个官能团与(X2)和(X7)侧链之一形成共价键。
具体实施方式
术语“包含(comprise)/包含(comprising)”一般以包括(include)/包括(including)的含义使用，即允许一个或多个特征或组分的存在。术语“包含(comprise)”和“包含(comprising)”也涵盖更有限的术语“由……组成(consist of)”和“由……组成(consisting of)”。
如在说明书和权利要求中使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”，“一种”和“该/所述”包括复数所指物。
如本文使用的，“活化因子XII”或“FXIIa”(EC 3.4.21.38)指通过与带负电的表面接触(称为接触活化)起始内源性凝血途径的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。它活化一系列蛋白酶，包括FXI、FIX、FX和凝血酶。凝血酶活化纤维蛋白原，其最终形成血块。更详细地，凝血酶催化纤维蛋白原转换为纤维蛋白，所述纤维蛋白聚合并且连同血小板一起形成血块。与损伤后的血块形成所必需的外源性途径相反，内源性途径对于稳态不需要。FXII缺陷个体呈现正常的止血能力9。几项近期研究提示内源性凝血牵涉病理性凝血，并且因此是有害的3-7,10,11。发现FXII缺陷型小鼠在呈现正常止血时被保护免于血栓形成3。抗体介导的FXII抑制在灵长类动物中证实了这一发现4。靶向该凝血因子的药物因此可以导致抗血栓剂的开发，所述抗血栓剂呈现血栓形成事件而不妥协止血。根据本发明，FXIIa优选为人或小鼠FXIIa，且最优选人α-FXIIa或β-FXIIa。
如本文使用的，术语“抑制剂”指示在催化反应中降低催化剂的有效性的化合物。根据本发明，催化剂是凝血酶FXIIa。由FXIIa催化的主要反应是在因子XI中选择性切割Arg-I-Ile键，以形成XIa因子。术语“环状抑制剂”意指抑制剂中的原子的一个或多个系列连接以形成环或循环。
术语“肽”指示通过肽键连接的氨基酸短链。最短的肽由两个通过单个肽键连接的氨基酸组成。根据本发明的第一个方面，肽包含通过肽键连接的至少六个氨基酸。肽基于大小区别于蛋白质或多肽，并且一般而言包含小于50个氨基酸。
如本文使用的，术语“氨基酸”指由胺(-NH2)和羧酸(-COOH)官能团组成的有机化合物，一般连同对于每个氨基酸特异性的侧链。最简单的氨基酸甘氨酸不具有侧链(式H2NCH2COOH)。在具有与α-碳附着的碳链的氨基酸(例如赖氨酸)中，碳以次序α、β、γ、δ等等进行标记。在一些氨基酸中，胺基可以附着到例如α-、β-或γ-碳，并且这些因此分别被称为α-、β-或γ-氨基酸。所有氨基酸根据本发明优选为α-氨基酸(也指名为2-或α-氨基酸)，其一般具有通式H2NCHRCOOH，其中R是指名为“侧链”的有机取代基)。在最简单的α-氨基酸丙氨酸(式：H2NCHCH3COOH)中，侧面是甲基。更优选地，氨基酸根据本发明是L-α-氨基酸，注意到L-氨基酸是L-立体异构体(或“左旋”异构体)。
如所提及的，氨基酸的侧链是有机取代基，其在α-氨基酸的情况下与α-碳原子连接。因此，侧链是来自氨基酸的母体结构的分支。氨基酸通常通过其侧链的性质进行分类。例如，侧链可以使氨基酸成为弱酸(例如氨基酸D和E)或弱碱(例如氨基酸K和R)，并且如果侧链是极性的，则成为亲水物(例如氨基酸L和I)，或如果它是非极性的，则成为疏水物(例如氨基酸S和C)。脂肪族氨基酸具有为脂肪族基团的侧链。脂肪族基团致使氨基酸非极性和疏水性。脂肪族基团优选为未被取代的支链或线性烷基。脂肪族氨基酸的非限制性实例是A、V、L和I。在环状氨基酸中，侧链中的原子的一个或多个系列连接以形成环。环状氨基酸的非限制性实例是P、F、W、Y和H。应当理解，所述环必须不同于通过具有至少两个官能团的连接分子形成的环，每个官能团与(X2)和(X7)的侧链之一形成共价键。虽然环状氨基酸的前一个环是单个氨基酸的侧链的部分，但后一个环经由连接分子在两个氨基酸(X2)和(X7)的侧链之间形成。另外，经由连接分子在(X7)和(X15)之间形成的环-其根据本文下文讨论的优选实施方案存在-在两个氨基酸的侧链之间形成。芳香族氨基酸是环状氨基酸的优选形式。在芳香族氨基酸中，环是芳环。就分子的电子性质而言，芳香性描述了不饱和键的共轭环、孤对电子或空分子轨道显示出比通过单独缀合稳定所预期的更强的稳定性的方式。芳香性可以视为循环离域和共振的表现。环状氨基酸的非限制性实例是F、W、Y和H。疏水性氨基酸具有使得氨基酸疏水的非极性侧链。疏水性氨基酸的非限制性实例是M、P；F、W、G、A、V、L和I。极性、不带电荷氨基酸具有不带电荷残基的非极性侧链。极性、不带电荷氨基酸的非限制性实例是S、T、N、Q、C、U和Y。极性、带电荷氨基酸具有至少一个带电荷残基的非极性侧链。极性、带电荷氨基酸的非限制性实例是D、E、H、K和R。
如本文使用的，术语“连接分子”指能够经由共价键连接至少两个氨基酸的侧链，从而形成环或循环的分子。共价键是涉及在原子之间的电子对共享的化学键。为此，连接分子包含至少两个官能团。官能团指示连接分子内的原子或键的特定基团，其负责将所述至少两个氨基酸的氨基酸侧链与连接分子连接。为此，官能团一般而言经历与氨基酸的侧链中的至少一个原子的化学反应。化学反应导致官能团和侧链之间的共价键。官能团的非限制性实例是烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、卤素(例如氟或氯)、羟基、羰基、醛、卤代甲酰基、碳酸酯、羧酸酯、羧基、酯、甲氧基、氢过氧自由基、过氧基、醚、半缩醛、半缩酮、缩醛、缩酮、原酸酯、杂环、原碳酸酯、甲酰胺、胺(包括伯胺、仲胺和叔胺)、亚胺、叠氮化物、偶氮化合物、(异)氰酸酯、硝酸盐、亚硝酸盐、巯基、硫化物、二硫化物、亚磺酰基、磺酰基、sulfin、磺基、(异)硫氰酸酯、碳硫醇(carbonothiol)、硫碳基、膦基(如磷酸酯)、硼、硼酸酯、boroniate和borino。连接分子的至少两个官能团可以相同或不同，且优选相同。
如从本文下文的实施例中可以获取的，通过筛选大型和结构上不同的双环肽噬菌体展示文库，已获得SEQ ID NO:1的肽(本文命名为FXII618)。通过噬菌体展示的过度筛选努力产生的FXIIa抑制剂比现有的小分子FXIIa抑制剂更有效和有选择性几个数量级。更详细地，从文库中最初分离了>1010种针对FXIIa的不同双环肽。文库的进一步淘选(参见图1)和分离的双环肽针对FXIIa的亲和力成熟努力(参见图2)产生FXIIa的双环肽抑制剂，其具有22nM的Ki(FXII618)，显示FXIIa的有效和选择性抑制，如通过离体和体内凝血的内源性途径的抑制所证明的(参见本文下文实施例)。它比中等选择性小分子FXIIa抑制剂44(香豆素衍生物(Ki＝4μM))>200倍更有效，并且比非选择性小分子FXIIa抑制剂PCK(D-Pro-Phe-Arg氯甲基酮；IC50＝180nM)约8倍更有效。此外，它比FXII402 60倍更有效和>10倍更有选择性，是近期呈现的双环肽FXIIa抑制剂，并且与FXII618相比具有相当不同的氨基酸序列15。FXII618抑制血浆和全血中的内源性凝血途径的启动。
在临床实验室中使用总体凝血测定法存在相当大的兴趣。当尝试在全血或血浆样品中执行低组织因子(TF)依赖性测定法时，接触起始的凝血途径的压制是必需的。在诊断凝血测试例如上文所述的凝血酶生成测定法(TGA)和血栓弹力描记术(TEM)中，FXII618可以容易地用于在后续样品加工步骤期间防止接触活化的血液凝固，从而减少体外的人工制品。TGA是在研究实验室和临床中越来越多使用的凝血测试。针对其临床转变已作出了重大努力，并且预期thrombinoscope装置在未来几年内进入常规实验室(例如用于患有肝病的患者)。TEM和低TF诱导的TGA两者均需要使用接触活化抑制剂。
玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)是凝血测定法中的凝血抑制剂的目前黄金标准。在样品收集时添加CTI阻止在后续样品加工步骤期间的凝血途径的接触活化。序列分析和同源建模令人惊讶地揭示，双环肽FXII618的第一大环在结构上类似于(CTI)的组合环，注意到所述环介导CTI针对FXIIa的抑制活性(参见图3)。在这方面，注意到根据现有技术中没有可用的CTI的晶体结构(以其结合状态)(参见实施例4)。因此，CTI如何结合FXIIa并未充分表征。鉴于这种出乎意料的结构相似性，认为FXII618的第一大环占优势地传输FXII618针对FXIIa的抑制能力，而对于FXII618的第二大环，未发现与FXIIa的特异性口袋的相互作用(还参见图3中第一环贴合进入FXIIa活性位点内)。为了进一步确定FXII618的第一大环中哪些氨基酸占优势地传输FXII618针对FXIIa的抑制能力，将氨基酸变化引入环内，并且其后测定突变抑制剂的Ki(参见图6)。发现在第一大环中，二肽RL是必需的，并且可以不改变，而不显著降低抑制能力。另一方面，已确定第一大环内的其他氨基酸可以改变。构成本发明的第一个方面的实施方案中阐述的通用肽序列因此基于双环肽FXII618的第一大环的结构。关于位置(X3)n和(X6)m中的氨基酸，注意到n和m在双环肽FXII618的第一环中为0。换言之，这些氨基酸在FXII618中不存在。虽然认为可以将进一步的氨基酸加入第一环内，而基本上不限制针对FXIIa的抑制活性，但最优选n和m是0，如在FXII618中。
如本文下文实施例中证实的，FXII618在抑制凝血的内源性途径方面比CTI更有效和有选择性(参见图4)，并且它具有更好的特异性概况。另外，FXII618是目前应用的黄金标准CTI的成本效益替代方案。在克规模上，CTI的生产成本为约20,000美元/克。相比之下，1克双环肽FXII618成本约2,000美元，并且因此少约10倍。此外，CTI需要从玉米种子中进行色谱纯化。小肽FXII618可以有利地容易地从肽合成公司订购，并且还可以作为商业研究试剂获得。FXII618因此是在上文讨论的诊断测试中CTI的非常有吸引力的替代方案，以及控制凝血和血浆激肽释放酶诱导的炎症病症中的FXII活性的有希望候选者。FXII618因此具有在研究和常规实验室两者中广泛使用的潜力。鉴于FXII618超过CTI的优点性质，FXII618预期在几种凝血测试中替换CTI。
鉴于FXII618的有利性质，还优选本发明的第一个方面的环状抑制剂以及本文下文所述的其任何优选形式包含肽或由肽组成，所述肽与SEQ IDNO:1相差不超过三、二和一个氨基酸改变，伴随渐增的优先。氨基酸变化可以是氨基酸的取代、缺失或添加，并且优选是取代。
根据本发明的第一个方面的优选实施方案，抑制剂具有对于FXIIa小于500nM，优选小于250nM，更优选小于100nM，甚至更优选小于50nM，且最优选小于25nM的抑制常数(Ki)。
抑制常数(Ki)是酶抑制领域中众所周知的量度。Ki指示抑制剂如何有效；它是产生半最大抑制所需的浓度。虽然化合物的IC50值可以在实验之间变化，但Ki是绝对值。在本文下文的实施例中进一步说明基于Cheng-Prusoff方程的Ki计算。如本文上文所讨论的，FXII618对于FXIIa的Ki为22nM，并且CTI对于FXIIa的Ki为24nM。因此，对于FXIIa小于25nM的最优选Ki指至少与FXII618和CTI一样良好的抑制剂。另外，在Ki值的这方面，FXIIa最优选为人α-FXIIa或β-FXIIa。
根据本发明的第一个方面的进一步优选实施方案，抑制剂特异性抑制FXIIa。
术语“抑制剂特异性抑制FXIIa”意指抑制剂基本上不抑制相关的蛋白酶，特别是基本上不抑制在FXIIa抑制剂的各自应用中不应被抑制的那些蛋白酶(例如在治疗应用中，生理上重要的蛋白酶基本上不被抑制)。抑制剂在高达100nM、250nM、500nM和1000nM的浓度下(伴随渐增的优先)不抑制这些蛋白酶。术语“相关蛋白酶”优选指包含下述或由下述组成的蛋白酶：胰蛋白酶且更优选除胰蛋白酶之外的凝血酶、纤溶酶、FXIa、PK(血浆激肽释放酶)、uPA(尿激酶型纤溶酶原激活物)、tPA(组织型纤溶酶原激活物)、FXa和FVIIa。如本文下文实施例中所证实的，CTI已在低至20nM的浓度下显著抑制胰蛋白酶的活性，而对于FXII618，在高达1000nM的浓度下并未观察到胰蛋白酶的抑制(参见图4)。
根据本发明的第一个方面的再进一步优选的实施方案，氨基酸(X4)优选为芳香族L-氨基酸，其中芳香族L-氨基酸的α-碳通过单个CH2基团附着到芳环结构，且最优选芳香族L-氨基酸，其中芳香族L-氨基酸的α-碳通过单个CH2基团附着到芳环结构，并且其中芳香族L-氨基酸的环结构不具有其他取代基。
如从图6中的表可以获取的，在肽FXII618的位置3中的氨基酸F替换为具有根据该优选实施方案的结构特征的氨基酸的情况下，FXIIa的抑制能力在很大程度上不受影响或甚至增加。
根据本发明的第一个方面的再进一步优选的实施方案，氨基酸(X4)选自L、P、F、W、Y、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、3-氟-苯丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸和2-硝基-苯丙氨酸，优选选自F、W、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸和2-硝基-苯丙氨酸，更优选选自F、W、2-萘基丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸和2-硝基-苯丙氨酸，且最优选选自2-萘基丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸和2-硝基-苯丙氨酸。
在肽FXII618的位置3中的氨基酸F对应于氨基酸(X4)。如从图6中的表可以获取的，在肽FXII618的位置3中的氨基酸F替换为L、P、F、W、Y、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、3-氟-苯丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸或2-硝基-苯丙氨酸，在所有情况下维持低于100nM的Ki。在替换为F、W、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸或2-硝基-苯丙氨酸的情况下，维持低于50nM的Ki。由F、W、2-萘基丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸或2-苯丙氨酸替换导致Ki基本上至少与FXII618或CTI的Ki一样良好。在F替换为2-萘基丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸或2-硝基-苯丙氨酸的情况下，Ki在所有情况下甚至显著改善至低于15nM。
根据本发明的第一个方面的进一步优选实施方案，氨基酸(X5)是疏水性L-氨基酸或极性、不带电荷的L-氨基酸，更优选疏水性L-氨基酸，甚至更优选S、A、L或P，且最优选L或P。
在肽FXII618的位置6中的氨基酸P对应于氨基酸(X5)。如从图6中的表可以获取的，在位置6中的氨基酸P替换为另一种疏水性L-氨基酸或极性、不带电荷的L-氨基酸的情况下，抑制能力不显著降低。由另一个疏水性L-氨基酸替换在很大程度上维持抑制能力，而由L替换甚至略微改善抑制能力。例如，图6中显示在P替换为S、A或L的情况下，FXIIa的Ki在所有情况下都低于100nM。
根据本发明的第一个方面的另一个优选实施方案，(X2)和(X7)的侧链包含官能团，所述官能团优选对于(X2)和(X7)各自独立地选自–NH2–COOH、-OH、-SH、烯烃、炔烃、叠氮化物和氯乙酰胺，更优选-NH2和-SH，且最优选-SH。
连接分子的至少两个官能团可以相同或不同，且优选相同。在肽中，在位置2和7处的FXII618氨基酸对应于氨基酸(X2)和(X7)。认为在氨基酸的侧链内官能团的确切结构不是特别关键的，只要它允许经由连接分子形成环。官能团–NH2–COOH、-OH、-SH、烯烃、炔烃、叠氮化物和氯乙酰胺是优选的，如特别对于这些官能团，形成环的所需化学反应是在本领域中充分确定的。-SH是最优选的，如在FXII618中，在位置2和7处的氨基酸均为半胱氨酸。
根据本发明的第一个方面的更优选实施方案，氨基酸(X2)和(X7)各自独立地为K、鸟氨酸、硫代赖氨酸、2,3-二氨基丙酸、二氨基丁酸、D、E、C、高半胱氨酸、青霉胺和炔丙基甘氨酸，优选C或高半胱氨酸，且最优选两者均为C。
两个氨基酸(X2)和(X7)可以相同或不同，且优选相同。在该更优选实施方案中列出的氨基酸在其侧链中携带选自–NH2–COOH、–OH、-SH、烯烃、炔烃、叠氮化物和氯乙酰胺的官能团。半胱氨酸是最优选的，如在FXII618中，在位置2和7处的氨基酸均为半胱氨酸。
根据本发明的第一个方面的再进一步优选的实施方案，(X2)是5-巯基正缬氨酸、高半胱氨酸或C，优选高半胱氨酸或C，且最优选C；和/或(X7)是高半胱氨酸或C，优选C。
如所提及的，在FXII618中的位置2和7处的氨基酸均为C。如由图6易知的，C可以在氨基酸位置2和/或7中替换为另一个氨基酸，而不显著降低针对FXIIa的抑制能力。例如，在(X2)中的C替换为5-巯基正缬氨酸或高半胱氨酸的情况下，关于FXIIa的Ki仍然低于100nM。在(X7)中的C替换为高半胱氨酸的情况下，关于FXIIa的Ki仍然低于50nM。
根据本发明的第一个方面的另一个优选实施方案，存在(X1)和(X8)，并且各自独立地为脂肪族L-氨基酸或极性、碱性L-氨基酸；优选具有胺基的极性、碱性L-氨基酸；更优选(X1)和(X8)各自独立地选自赖氨酸、高赖氨酸(homolysin)、精氨酸、高精氨酸，且最优选两者均为精氨酸。
氨基酸(X1)和(X8)可以相同或不同，且优选相同。在肽FXII618中，在位置1和8处的氨基酸对应于氨基酸(X1)和(X8)。认为在位置(X1)和(X8)中的氨基酸的确切性质不是特别关键。因为在肽FXII618中，在位置1和8处的氨基酸为R，根据上述优选实施方案的(X1)和(X8)的优选氨基酸是结构上类似于R的氨基酸且优选为R。
根据本发明的第一个方面的进一步优选实施方案，(X1)是D-Arg、高精氨酸、L、正精氨酸、4-胍基苯丙氨酸、高赖氨酸、D-Arg-D-Ser或L-Arg，优选高精氨酸、L、正精氨酸、4-胍基苯丙氨酸、高赖氨酸、D-Arg-D-Ser或L-Arg，且最优选高赖氨酸、D-Arg-D-Ser或R；和/或(X8)是G、H或R，优选H或R。
如所提及的，在FXII618中的位置1和8处的氨基酸均为R。如由图6易知的，R可以在氨基酸位置1和/或8中替换为另一个氨，而不显著降低针对FXIIa的抑制能力。例如，在(X1)中的R替换为高赖氨酸或D-Arg-D-Ser的情况下，关于FXIIa的Ki至少与FXII618关于FXIIa的Ki一样良好。另外，在(X8)中的R替换为H的情况下，关于FXIIa的Ki至少与FXII618关于FXIIa的Ki一样良好。
根据本发明的第一个方面再进一步优选的实施方案，连接分子选自本申请的图7所示的三价和二价接头，且最优选1,3-二丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(DATA)、1,3-二丙烯酰基-1,3-二嗪烷(DADA)或1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA)。
在肽FXII618中，连接分子是TATA。由于上文优选实施方案仅包含FXII618的第一环，易知TATA可以替换为DATA或DADA。两个官能团足以连接氨基酸(X2)和(X7)，以便形成环。看起来连接分子的确切性质不是特别关键。这是因为环结构本身不与FXIIa相互作用，而是将肽中的氨基酸引入3D构象内，其中肽可以理想地与FXIIa相互作用，所述相互作用导致FXIIa的抑制。由此可见，能够将氨基酸引入3D构象(其至少类似由TATA诱导的3D构象)内的任何接头预期是本发明中合适的连接分子。
根据本发明的第一个方面的进一步优选的实施方案，氨基酸(X8)不存在，并且抑制剂是包含肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X9)l(X10)(X11)(X12)(X13)(X14)k(X15)(X16)或由肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X9)l(X10)(X11)(X12)(X13)(X14)k(X15)(X16)组成的双环抑制剂，其中(X1)至(X7)、n和m如本文上文定义；(X9)是氨基酸，并且l在0和3之间，优选0或1，且最优选0；(X10)是氨基酸；(X11)是氨基酸，优选Q；(X12)是疏水性L-氨基酸，优选脂肪族L-氨基酸，且最优选为L；(X13)是氨基酸；(X14)是氨基酸，并且k在0和3之间，优选0或1，且最优选0，(X15)是具有侧链的氨基酸；并且(X16)存在或不存在，并且如果存在，则为氨基酸；并且其中(X2)、(X7)和(X15)的侧链经由连接分子连接，所述连接分子具有至少三个官能团，每个官能团与(X2)、(X7)和(X15)侧链之一形成共价键。
因此，本发明在第二个方面涉及包含肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X9)l(X10)(X11)(X12)(X13)(X14)k(X15)(X16)或由肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X9)l(X10)(X11)(X12)(X13)(X14)k(X15)(X16)组成的凝血酶活化因子XII(FXIIa)的双环抑制剂，其中(X1)存在或不存在，并且如果存在，则为氨基酸；(X2)是具有侧链的氨基酸；(X3)是氨基酸，并且n在0和3之间，优选0或1且最优选0；(X4)是脂肪族L-氨基酸或环状L-氨基酸，优选L、P或芳香族L-氨基酸，且最优选芳香族L-氨基酸；(X5)是氨基酸；(X6)是氨基酸，并且m在0和3之间，优选0或1，且最优选0；(X7)是具有侧链的氨基酸；(X9)是氨基酸，并且l在0和3之间，优选0或1，且最优选0；(X10)是氨基酸；(X11)是氨基酸，优选Q；(X12)是疏水性L-氨基酸，优选脂肪族L-氨基酸，且最优选为L；(X13)是氨基酸；(X14)是氨基酸，并且k在0和3之间，优选0或1，且最优选0，(X15)是具有侧链的氨基酸；并且(X16)存在或不存在，并且如果存在，则为氨基酸；并且其中(X2)、(X7)和(X15)的侧链经由连接分子连接，所述连接分子具有至少三个官能团，每个官能团与(X2)、(X7)和(X15)侧链之一形成共价键。
当适用时，与本发明的第一个方面有关的本文上文阐述的定义和优选实施方案同样适用于本发明的双环抑制剂。例如，双环抑制剂也可以具有关于FXIIa小于500nM，优选小于250nM，更优选小于100nM，甚至更优选小于50nM，且最优选小于25nM的抑制常数(Ki)。同样地，该抑制剂优选特异性抑制FXIIa。
如本文上文讨论的，肽FXII618(SEQ NO:1)是FXIIa的双环抑制剂。在本发明的第一个方面的上述优选实施方案中阐述的通用肽序列以及本发明的第二个方面阐述的肽序列基于双环肽FXII618的两个大环的结构。在通用肽序列中，第一环在(X2)和(X7)之间形成，而第二环在(X7)和(X15)之间形成。
关于位置(X3)n和(X6)m、(X9)l和(X14)k中的氨基酸，注意到n、m、l和k在双环肽FXII618的环中都为0。换言之，这些氨基酸在FXII618中不存在。尽管认为可以将进一步的氨基酸加入第一环内，而基本上不限制针对FXIIa的抑制活性，但最优选n、m、l和k都为0，如在FXII618中。
如本文下文的实施例所示，第二环很可能不与FXIIa形成任何特异性相互作用。为此，在上述优选实施方案的最广泛意义上的氨基酸无一在第二个环中是固定的。在FXII618的位置9和10中的氨基酸对应于上述优选实施方案的通用肽序列的氨基酸(X11)和(X12)。如从图6所示的Gln9和Leu10的氨基酸变化是易知的，某些优先可以给予在相应位置(X11)和(X12)中的某些氨基酸。为此，(X11)优选为Q，并且(X12)为脂肪族L-氨基酸，优选高亮氨酸、正亮氨酸、3-乙基正缬氨酸、3-叔丁基丙氨酸或L，更优选3-叔丁基丙氨酸或L，且最优选L。第二环中的这些氨基酸可能促成使肽FXII618达到三维构象，其对于FXIIa抑制是理想的
根据本发明的第二个方面的优选实施方案，(X4)选自L、P、F、W、Y、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、3-氟-苯丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸和2-硝基-苯丙氨酸，优选F、W、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸和2-硝基-苯丙氨酸，更优选F、W、2-萘基丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸和2-硝基-苯丙氨酸，且最优选2-萘基丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸和2-硝基-苯丙氨酸。
根据本发明的第二个方面的进一步优选的实施方案，(X5)是疏水性L-氨基酸或极性、不带电荷的L-氨基酸，优选疏水性L-氨基酸，更优选S、A、L或P，且最优选L或P。
根据本发明的第一个方面的更优选实施方案以及本发明的第二个方面的优选实施方案，(X2)、(X7)和(X15)的侧链包含官能团，优选对于(X2)、(X7)和(X15)各自独立地选自–NH2、-COOH、-SH、烯烃、炔烃、叠氮化物和氯乙酰胺，优选–NH2和-SH，且最优选-SH。
连接分子的至少三个官能团可以相同或不同，且优选相同。在肽FXII618中，在位置2、7和12处的氨基酸对应于氨基酸(X2)、(X7)和(X15)。看起来在氨基酸的侧链内官能团的确切结构不是特别关键的，只要它允许经由连接分子形成环。官能团–NH2–COOH、–OH、-SH、烯烃、炔烃、叠氮化物和氯乙酰胺是优选的，如特别对于这些官能团，所需化学反应是在本领域中充分确定的。-SH是最优选的，如在FXII618中，在位置2、7和12处的氨基酸都是半胱氨酸。
根据本发明的第一个方面的另一个更优选的实施方案以及本发明的第二个方面的优选实施方案，氨基酸(X2)、(X7)和(X15)各自独立地为K、鸟氨酸、硫代赖氨酸、2,3-二氨基丙酸、二氨基丁酸、D、E、C、高半胱氨酸、青霉胺或炔丙基甘氨酸，优选C或高半胱氨酸，且最优选都为C。
三个氨基酸(X2)、(X7)和(X15)可以相同或不同，且优选相同。在该更优选实施方案中列出的氨基酸在其侧链中携带选自–NH2–COOH、–OH、-SH、烯烃、炔烃、叠氮化物和氯乙酰胺的一种官能团。对于氨基酸(X2)、(X7)和(X15)半胱氨酸是最优选的，如在FXII618中，在位置2、7和12处的氨基酸都是半胱氨酸。
根据本发明的第一个方面的另一个更优选的实施方案以及本发明的第二个方面的优选实施方案，(X2)是5-巯基正缬氨酸、高半胱氨酸或C，优选高半胱氨酸或C，且最优选C；和/或(X7)是高半胱氨酸或C，优选C；和/或(X15)是5-巯基-正缬氨酸、高半胱氨酸或C，优选高半胱氨酸或C。
在FXII618的位置2、7和12处的氨基酸都是C。上文更优选的实施方案中的(X2)、(X7)和(X15)分别对应于FXII618中的氨基酸位置2、7和12。如由图6进一步易知的，C可以在氨基酸位置2、7和/或15中替换为另一个氨基酸，而不显著降低针对FXIIa的抑制能力。例如，在(X15)中的C替换为高半胱氨酸的情况下，关于FXIIa的Ki为16nM，并且因此甚至优于FXII618关于FXIIa的Ki。
根据本发明的第一个方面的进一步优选实施方案以及本发明的第二个方面的优选实施方案，存在氨基酸(X1)和(X16)，并且各自独立地为脂肪族L-氨基酸或极性、碱性L-氨基酸；优选具有胺基的极性、碱性L-氨基酸；更优选(X1)和(X16)各自独立地选自赖氨酸、高赖氨酸、精氨酸、高精氨酸，并且最优选均为精氨酸。
根据本发明的第一个方面的更优选实施方案以及本发明的第二个方面的优选实施方案，氨基酸(X10)和(X13)各自独立地为脂肪族L-氨基酸或极性、碱性L-氨基酸；优选具有胺基的极性、碱性L-氨基酸；更优选(X10)和(X13)各自独立地选自赖氨酸、高赖氨酸、精氨酸、高精氨酸，并且最优选均为精氨酸。
在肽FXII618中，在位置8和11处的氨基酸对应于氨基酸(X10)和(X13)。认为在位置(X10)和(X13)中的氨基酸的确切性质不是特别关键，因为它们不与FXIIa相互作用。因为在肽FXII618中，在位置8和11处的氨基酸是R，根据上述优选实施方案的(X10)和(X13)的优选氨基酸是结构上类似R的氨基酸。
根据本发明的第一个方面的再进一步更优选的实施方案以及本发明的第二个方面的优选实施方案，(X1)是D-Arg、高精氨酸、L、正精氨酸、4-胍基苯丙氨酸、高赖氨酸、D-Arg-D-Ser或L-Arg，优选高精氨酸、L、正精氨酸、4-胍基苯丙氨酸、高赖氨酸、D-Arg-D-Ser或L-Arg，且最优选高赖氨酸、D-Arg-D-Ser或L-Arg；和/或(X10)是G、H或R，优选H或R；(X13)是A、G、(S)-β3-高精氨酸或R，优选(S)-β3-高精氨酸或R，和/或(X16)是R或不存在。
在FXII618的位置1、8、11和13处的氨基酸都是R。在FXII618的位置1、8、11和13处的氨基酸对应于在上文更优选的实施方案中的位置(X1)、(X10)、(X13)和(X16)。如由图6易知的，R可以在氨基酸位置1、8、11和13中一个或多个替换为另一个氨基酸，而不显著降低针对FXIIa的抑制能力。例如，在R在(X13)中替换为(S)-β3-高精氨酸的情况下，与FXII618关于FXIIa的Ki相比，关于FXIIa的Ki甚至得到改善。在位置(X16)中的R不存在(即R从FXII618中删除)，则关于FXIIa的Ki基本上与FXII618关于FXIIa的Ki一样良好。
根据其中抑制剂是双环抑制剂的本发明的第一个方面的另一个更优选的实施方案以及本发明的第二个方面的优选实施方案，连接分子选自1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA)、1,3,5-三(氯乙酰基)-1,3,5-三嗪烷(TCAT)、1,3,5-三(溴乙酰基)-1,3,5-三嗪烷(TBAT)、1,3,5-三(溴甲基)苯(TBMB)和2,4,6-三(溴甲基)-1,3,5-三嗪(TBMT)，且优选1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA)。
根据本发明的第一个方面的该更优选实施方案和第二个方面的优选实施方案的所有连接分子具有三个官能团，使得可以形成上文讨论的双环抑制剂的两个环。如所提及的，在双环肽FXII618中，连接分子是TATA。为此，TATA是最优选的。在优选实施例中所述的其他接头在结构上类似TATA，并且因此是用于TATA的合适替代方案的非限制性例子。这已在本文下文的实施例中对于TBAT和TBMT中示例性显示。尽管FXII618中TATA替换为TBAT或TBMT，但关于FXIIa的特异性抑制能力得到维持。
根据本发明的第一个方面的另一个更优选的实施方案以及本发明第二个方面的优选实施方案，下述项目(i)至(iv)中的至少一个适用：(i)(X1)是D-Arg-D-Ser，(ii)(X4)是4-氟-苯丙氨酸，(iii)(X10)是H，和/或(iv)(X13)是(S)-β3-高精氨酸；其中(X16)任选不存在，并且连接分子优选为TATA。
术语“至少一个”意指至少两个、至少三个和所有四个，具有渐增的优先。
如本文下文的实施例所示和如本文上文所讨论的，替换FXII618的氨基酸序列中的氨基酸-分别在氨基酸位置4和5处除R和L外-一般导致FXII618的衍生物对于FXIIa具有的Ki甚至比FXII618对于FXIIa的Ki更好。实例是(X1)中的替换氨基酸D-Arg-D-Ser、(X4)中的4-氟-苯丙氨酸、(X10)中的H和(X13)中的(S)-β3-高精氨酸，注意到位置(X1)、(X4)、(X10)和(X13)分别对应于FXII618的氨基酸位置1、4、8和11。
因为特别地进一步研究(X1)中的D-Arg-D-Ser、(X4)中的4-氟-苯丙氨酸、(X10)中的H和(X13)中的(S)-β3-高精氨酸，以便示出FXII618中的两个或多个有利氨基酸取代的组合效应，所以这些氨基酸取代是特别优选的。在本文下文的实施例中显示，在将这些氨基酸取代中的任何三个或所有四个引入FXII618的氨基酸序列内的情况下，每个单个氨基酸取代的有利效应加合，并且导致比具有这些氨基酸取代中的仅一个的FXII618衍生物明显更有效的FXII618衍生物。在将这些氨基酸取代中的任何三个或所有四个引入FXII618的氨基酸序列内的情况下，所得到的FXII618衍生物对于FXII618具有的Ki为1nM或甚至更低在pM范围内(参见实施例5.3中的表)。
实施例5.3的表中所示的FXII618的衍生物是本文所述的针对FXIIa的最有效的抑制剂，并且因此是本发明的第一个方面和第二个方面的最优选抑制剂。这些最优选的抑制剂是rsCF4FRLPCHQLRbCR、rsCF4FRLPCHQLRCR、rsCF4FRLPCRQLRbCR、rsCFRLPCHQLRbCR和rsCF4FRLPCHQLRbC，其中rs是D-Arg-D-Ser；F4F是4-氟-苯丙氨酸，并且Rb是(S)-β3-高精氨酸。
在这些组合实验的上下文中，另外发现在FXII618衍生物的最后一个氨基酸位置处的R是不必要的，注意到该非必需氨基酸对应于(X16)。对于本文公开的大多数FXII618衍生物，组合FXII618衍生物中的连接分子是如在FXII618中的TATA。
总之，基于实施例5.3中例示的组合FXII618衍生物，显示可以组合发现与本发明有关的氨基酸变化以进一步改善FXII618的抑制能力，并且一般组合产生的改善超越每个个别氨基酸变化的改善。
在限定本发明的第一个方面和第二个方面的实施方案以及第一个方面和第二个方面的上述优选和更优选的实施方案内的优选选项-对于抑制剂的环内的每个变体氨基酸位置，如果存在的话，对于在抑制剂的第二环内的每个变体氨基酸位置和对于连接分子-限定越来越类似图6中的FXII618的结构及其这些变体的结构(伴随渐增的优先)，其保留或基本上保留FXII618的抑制能力或甚至构成改善。因此，技术人员立即理解对于每个变体氨基酸位置掺入渐增优选氨基酸以及任选地对于连接分子的优选结构的任何组合的实施方案形成本发明的部分。
这种实施方案的非限制性实例是包含肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X8)或由肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X8)组成的凝血酶活化因子XII(FXIIa)的环状抑制剂，其中(X1)是氨基酸，优选R；(X2)是C；(X3)是氨基酸，并且n是0；(X4)是F、W、2-萘基丙氨酸和3-苯并噻吩丙氨酸，且优选2-萘基丙氨酸，(X5)是L或P；(X6)是氨基酸，并且m是0；(X7)是C；并且(X8)是氨基酸，优选R；并且其中(X2)和(X7)的侧链经由连接分子连接，所述连接分子选自1,3-二丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(DATA)、1,3-二丙烯酰基-1,3-二嗪烷(DADA)和1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA)。还与该实施方案有关，抑制剂优选具有关于FXIIa小于100nM，更优选小于50nM，且最优选小于25nM的抑制常数(Ki)和/或所述抑制剂特异性抑制FXIIa。
这种实施方案的进一步非限制性实例是包含肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X8)或由肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X8)组成的凝血酶活化因子XII(FXIIa)的环状抑制剂，其中(X1)是氨基酸，优选D-Arg-D-Ser或D-Arg；(X2)是C；(X3)是氨基酸，并且n是0；(X4)是F、W、2-萘基丙氨酸和3-苯并噻吩丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸或2-硝基-苯丙氨酸；且优选为2-萘基丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸或2-硝基-苯丙氨酸，(X5)是L或P；(X6)是氨基酸，并且m是0；(X7)是C；并且(X8)是氨基酸，优选H或R；并且其中(X2)和(X7)的侧链经由连接分子连接，所述连接分子选自1,3-二丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(DATA)、1,3-二丙烯酰基-1,3-二嗪烷(DADA)和1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA)。还与该实施方案有关，抑制剂优选具有关于FXIIa小于100nM，更优选小于50nM，且最优选小于25nM的抑制常数(Ki)和/或所述抑制剂特异性抑制FXIIa。
其中还存在第二环的这种实施方案的再进一步的非限制性实例是包含肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X9)l(X10)(X11)(X12)(X13)(X14)k(X15)(X16)或由肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X9)l(X10)(X11)(X12)(X13)(X14)k(X15)(X16)组成的凝血酶活化因子XII(FXIIa)的双环抑制剂，其中(X1)是氨基酸，优选R；(X2)是C；(X3)是0；(X4)是F、W、2-萘基丙氨酸和3-苯并噻吩丙氨酸，且优选2-萘基丙氨酸，(X5)是L或P；(X6)是0；(X7)是C；(X9)是氨基酸，并且l是0；(X10)是氨基酸，优选R；(X11)是Q；(X12)是L；(X13)是氨基酸，优选R；(X14)是氨基酸，并且k是0，(X15)是C；并且(X16)是氨基酸，优选R；并且其中(X2)、(X7)和(X15)的侧链经由连接分子连接，所述连接分子是1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA)。同样与该实施方案有关，抑制剂优选具有关于FXIIa小于100nM，更优选小于50nM，且最优选小于25nM的抑制常数(Ki)和/或所述抑制剂特异性抑制FXIIa。
其中还存在第二环的这种实施方案的再进一步的非限制性实例是包含肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X9)l(X10)(X11)(X12)(X13)(X14)k(X15)(X16)或由肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X9)l(X10)(X11)(X12)(X13)(X14)k(X15)(X16)组成的凝血酶活化因子XII(FXIIa)的双环抑制剂，其中(X1)是氨基酸，优选高赖氨酸、D-Arg-D-Ser或D-Arg；(X2)是C；(X3)是氨基酸，并且n是0；(X4)是F、W、2-萘基丙氨酸和3-苯并噻吩丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸或2-硝基-苯丙氨酸；且优选为2-萘基丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸或2-硝基-苯丙氨酸，(X5)是L或P；(X6)是氨基酸，并且m是0；(X7)是C；(X9)是氨基酸，并且l是0；(X10)是氨基酸，优选H或R；(X11)是Q；(X12)是L；(X13)是氨基酸，优选(S)-β-高精氨酸或R；(X14)是氨基酸，并且k是0，(X15)是高半胱氨酸或C；并且(X16)是氨基酸，优选不存在或R；并且其中(X2)、(X7)和(X15)的侧链经由连接分子连接，所述连接分子是1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA)。同样与该实施方案有关，抑制剂优选具有关于FXIIa小于100nM，更优选小于50nM，且最优选小于25nM的抑制常数(Ki)和/或所述抑制剂特异性抑制FXIIa。
本发明另外涉及包含肽(X1)RL(X2)或由肽(X1)RL(X2)组成的凝血酶活化因子XII(FXIIa)的环状抑制剂，其中(X1)和(X2)分别为通过肽键连接的氨基酸，优选α-氨基酸，最优选F和P；或其中(X1)和(X2)是具有侧链的氨基酸，并且(X1)和(X2)经由连接分子连接，所述连接分子具有至少两个官能团，每个官能团与(X2)和(X7)的侧链之一形成共价键。
当适用时，与本发明的第一个方面和/或第二个方面有关的本文上文阐述的定义和优选实施方案同样适用于本发明的该进一步环状抑制剂。另外，该抑制剂可以具有对于FXIIa小于500nN，优选小于250nM，更优选小于100nM，甚至更优选小于50nM，且最优选小于25nM的抑制常数(Ki)。同样地，该抑制剂优选特异性抑制FXIIa。抑制FXIIa的酶促活性的离体方法包括将本发明的抑制剂与FXIIa接触，其中FXIIa优选存在于血液、血浆或血清样品中。在(X1)和(X2)是具有侧链的氨基酸的情况下，优选侧链包含官能团，优选对于(X1)和(X2)各自独立地选自–NH2–COOH、–OH、-SH、烯烃、炔烃、叠氮化物和氯乙酰胺，优选-–NH2和-SH，且最优选-SH。此外，如果(X1)和(X2)是具有侧链的氨基酸，则优选氨基酸(X1)和(X2)各自独立地为K、鸟氨酸、硫代赖氨酸、2,3-二氨基丙酸、二氨基丁酸、D、E、C、高半胱氨酸、青霉胺或炔丙基甘氨酸，优选C或高半胱氨酸，且最优选两者均为C。连接分子可以选自图7所示的三价和二价接头，且优选1,3-二丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(DATA)、1,3-二丙烯酰基-1,3-二嗪烷(DADA)或1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA)。
本发明另外涉及凝血酶FXIIa的抑制剂，其特征在于它包含至少一个大环。通常，所述大环i)具有至少12个原子且不超过42个原子的环尺寸，和ii)含有两个邻近的氨基酸X1X2，两个氨基酸具有L构型且通过肽键连接，其中第一氨基酸X1的侧链含有与至少四个原子键的α-碳原子具有一定距离的正电荷，并且其中所述抑制剂以小于500nM的抑制常数(Ki)结合凝血酶FXIIa。
优选地，氨基酸X1选自在其侧链中包含胍、脒、苯甲脒或氨基的氨基酸。氨基酸序列X1X2通常在每侧上侧面为氨基酸，并且四个氨基酸通过肽键连接。大环基于含有经由化学接头或二硫桥连接的至少两个半胱氨酸的肽。
还优选地，所述抑制剂结合凝血酶FXIIa，其抑制常数(Ki)小于400nM，更优选小于200nM，甚至更优选小于100nM。可替代地，本发明的抑制剂包含通过肽形成的两个大环，所述肽含有经由侧链连接到化学接头的至少三个半胱氨酸。优选地，肽具有下述序列(SEQ IDNo 1)：Arg-Cys-Phe-Arg-Leu-Pro-Cys-Arg-Gln-Leu-Arg-Cys-Arg，并且化学接头是或基于试剂1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA)。
本发明的另一个目的涉及基本上由氨基酸序列Xaa1-Cys-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Xaa8(SEQ ID No.2)组成的凝血酶FXIIa的双环肽抑制剂，其中至少三个氨基酸如下所示或独立地选自：Xaa2＝Trp；Xaa3＝Gly；Xaa4＝Ala；Xaa5＝Leu；Xaa6＝Asn；Xaa7＝Val，并且其中所述双环肽抑制剂已用1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷环化。
本发明的进一步目的是提供基本上由氨基酸序列Xaa1-Cys-Cys-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Cys-Xaa8(SEQ ID No.3)组成的凝血酶FXIIa的双环肽抑制剂，其中所述氨基酸中的至少两个如下所示：Xaa2＝Tyr；Xaa3＝Leu；Xaa4＝Arg，并且其中所述双环肽抑制剂已用1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷环化。
另外一个目的是提供基本上由氨基酸序列Xaa1-Cys-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Cys-Xaa14(SEQ ID No.4)组成的凝血酶FXIIa的双环肽抑制剂，其中所述氨基酸中的至少两个如下所示：Xaa2＝Trp；Xaa3＝Gly；Xaa4＝Ala；Xaa5＝Ala，并且其中所述双环肽抑制剂已用1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷环化。
本发明还涉及选自SEQ ID NO 1和5至89(参见图9)的氨基酸序列，以及与所述氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸的凝血酶FXIIa的抑制剂。在SEQ ID NO 1和5至89内，SEQ ID NO:1是最优选的。
本发明同样涉及选自SEQ ID NO 1和5至89的氨基酸序列的凝血酶FXIIa的抑制剂，其中一至几个氨基酸已被缺失、取代或加入。在这方面，术语一至几个意指随着渐增的优先，高达三个、两个或仅一个氨基酸已被缺失、取代或加入。
另外，本发明的抑制剂可以包含通过肽形成的两个大环，所述肽含有经由侧链连接到化学接头的至少三个半胱氨酸。优选地，肽具有下述序列(SEQ ID NO 1)：Arg-Cys-Phe-Arg-Leu-Pro-Cys-Arg-Gln-Leu-Arg-Cys-Arg，并且化学接头基于试剂1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA)。
本发明还涉及融合蛋白，其包含与抗体的Fc结构域融合的本发明抑制剂、白蛋白粘合剂、IgG粘合剂或抗体。
如本文使用的，术语“融合蛋白”是涉及通过连接编码分离(多)肽的两个或多个核酸分子生成的(多)肽构建体的一般术语。换言之，该融合核酸分子的翻译导致具有衍生自每个原始(多)肽的功能性质的单一(多)肽。(多)肽可以直接融合或经由接头即短肽序列融合。一般而言，融合蛋白通过技术人员众所周知的重组DNA技术人工生成。然而，本发明的融合蛋白可以通过许多常规和众所周知的技术中的任一种，例如纯有机合成策略、固相辅助合成技术或通过商购可得的自动合成仪来制备。融合蛋白可以用于生物研究或治疗。
优选地，Fc结构域是允许延长本发明抑制剂的体内半衰期的一个或多个人功能Fc结构域。本发明的抑制剂可以融合到一个或多个功能性Fc结构域的N-或C-末端或者一个或多个Fc结构域的N-和C-末端两者。本发明的融合蛋白可以包含多聚体，例如与至少一侧(例如一个或多个，优选一个Fc结构域的N-末端)融合的本发明抑制剂的四聚体、三聚体或二聚体。白蛋白粘合剂和IgG粘合剂的实例在Gebauer和Skerra(2009),13:245-255中描述。相应地，白蛋白粘合剂和IgG粘合剂的优选实例是人单Ig结构域(双重(dubbled)白蛋白Dab)、纳米抗体、衍生自链球菌蛋白G的天然存在的白蛋白结合结构域(ABD)和与IgG结合的结构域。另外，这样的融合蛋白例如增加本发明的抑制剂特别是在体内或离体的血液中的半衰期。
本发明另外涉及融合构建体，其包含与药物活性化合物、诊断活性化合物和/或调节血清半衰期的组分融合的本发明的抑制剂。
如本文使用的，“融合构建体”定义了本发明的抑制剂与化合物的融合，由此该化合物选自药学活性化合物、诊断活性化合物和/或调节血清半衰期的组分。该化合物可以是蛋白质化合物或非蛋白质化合物。在化合物是蛋白质化合物(例如，如本文下文所述的抗体)的情况下，融合构建体也是如本文上文定义的融合蛋白。换言之，术语“融合构建体”包含融合蛋白。化合物可以直接与本发明的抑制剂融合或经由接头融合。根据本发明的接头优选选自具有1至30个碳原子的烷基、具有1至20个亚乙基部分的聚乙二醇、具有1至20个残基的聚丙氨酸、具有1至20个残基的聚甘氨酸、具有1至20个残基的Gly-Ser接头、己酸、取代或未被取代的聚对苯撑和三唑。
在进一步优选的实施方案中，所述接头选自氨基-正烷基、巯基-正烷基、氨基-正烷基-X-烷基、巯基-正烷基-X-烷基，其中X选自O、S-S和SO2，并且其中烷基彼此独立地具有1至30个碳原子，优选3、6或12个碳原子；或具有1至约10个乙二醇部分的寡聚乙二醇，优选三乙二醇或六乙二醇。这些和进一步合适的接头是本领域众所周知并且商购可得的(参见例如，来自Glen Research,22825Davis Drive,Sterling,Virginia,20164USA的目录)。接头的进一步实例如下：5'-氨基-改性剂(参见例如B.A.Connolly和P.Rider，Nucleic AcidsRes.,1985,13,4485；B.S.Sproat,B.S.Beijer,P.Rider和P.Neuner,Nucleic Acids Res.,1987,15,4837；R.Zuckerman,D.Corey和P.Shultz,Nucleic Acids Res.,1987,15,5305；P.Li等人，Nucleic Acids Res.,1987,15,5275；G.B.Dreyer和P.B.Dervan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1985,82,968.)；5'-硫醇改性剂C6(参见例如B.A.Connolly和P.Rider,Nucleic Acids Res.,1985,13,4485；B.S.Sproat,B.S.Beijer,P.Rider和P.Neuner,Nucleic Acids Res.,1987,15,4837；R.Zuckerman,D.Corey和P.Shultz,Nucleic Acids Res.,1987,15,5305；P.Li等人，Nucleic Acids Res.,1987,15,5275.)；在3'末端处的5'-硫醇改性剂C6S-S和硫醇基(参见例如B.A.Connolly和R.Rider,NucleicAcids Res.,1985,13,4485；B.A.Connolly,Nucleic Acids Res.,1987,15,3131-3139；N.D.Sinha和R.M.Cook,Nucleic Acids Res.,1988,16,2659；A.Kumar,S.Advani,H.Dawar和G.P.Talwar,Nucleic Acids Res.,1991,19,4561；R.Zuckermann,D.Corey和P.Schultz,Nucleic Acids Res.,1987,15,5305；K.C.Gupta,P.Sharma,S.Sathyanarayana和P.Kumar,Tetrahedron Lett.,1990,31,2471-2474；U.Asseline,E.Bonfils,R.Kurfurst,M.Chassignol,V.Roig和N.T.Thuong,Tetrahedron,1992,48,1233-1254；Gregg Morin,Geron Corporation,Personal Communication.)；间隔物C3、间隔物C12和dSpacer亚磷酰胺(参见例如M.Durard,K.Chevrie,M.Chassignol,N.T.Thuong和J.C.Maurizot,NucleicAcids Res.,1990,18,6353；M.Salunkhe,T.F.Wu和R.L.Letsinger,J.Amer.Chem.Soc.,1992,114,8768-8772；N.G.Dolinnaya,M.Blumenfeld,I.N.Merenkova,T.S.Oretskaya,N.F.Krynetskaya,M.G.Ivanovskaya,M.Vasseur和Z.A.Shabarova,Nucleic Acids Res.,1993,21,5403-5407；M.Takeshita,C.N.Chang,F.Johnson,S.Will和A.P.Grollman,J.Biol.Chem.,1987,262,10171-10179；M.W.Kalnik,C.N.Chang,A.P.Grollman和D.J.Patel,Biochemistry,1988,27,924-931.)；3'-氨基改性剂C7CPG(参见例如J.G.Zendegui,K.M.Vasquez,J.H.Tinsley,D.J.Kessler和M.E.Hogan,Nucleic AcidsRes.,1992,20,307.)；3'-氨基光不稳定C6CPG(参见例如D.J.Yoo和M.M.Greenberg,J.Org.Chem.,1995,60,3358-3364.；H.Venkatesan和M.M.Greenberg,J.Org.Chem.,1996,61,525-529；D.L.McMinn和M.M.Greenberg,Tetrahedron,1996,52,3827-3840。
调节血清半衰期的组分优选为白蛋白或聚乙二醇(PEG)。
药物活性化合物或诊断活性化合物优选选自(a)荧光染料，(b)光敏剂，(c)放射性核素，(d)用于医学成像的造影剂，(e)细胞因子(f)有毒化合物，(g)趋化因子，(h)促凝血因子，(i)用于前药活化的酶，或(k)ACE抑制剂、肾素抑制剂、ADH抑制剂、醛固酮抑制剂或血管紧张素受体阻断剂。
荧光染料优选为选自Alexa Fluor或Cy染料的组分。
光敏剂优选为光毒性红色荧光蛋白KillerRed或血卟啉。
放射性核素优选选自γ发射同位素，更优选99mTc、123I、111In，和/或正电子发射体，更优选18F、64Cu、68Ga、86Y、124I，和/或β-发射体，更优选131I、90Y、177Lu、67Cu，或者α发射体，优选213Bi、211At。
如本文使用的，造影剂是用于在医学成像中增强体内结构或流体的对比度的物质。常规造影剂基于X射线衰减和磁共振信号增强工作。
细胞因子优选选自IL-2、IL-12、TNF-α、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-10、IL-15、IL-24、GM-CSF、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、LIF、CD80、B70、TNFβ、LT-β、CD-40配体、Fas配体、TGF-β、IL-1α和IL-1β。
有毒化合物优选为小有机化合物或多肽，更优选为选自加利车霉素、美登木素、新制癌菌素、埃斯波霉素、达内霉素、克达西啶、maduropeptin、多柔比星、柔红霉素、澳瑞他汀、蓖麻毒素A链、蒴莲根毒素、截短的假单胞菌外毒素A、白喉毒素和重组白树毒素。
趋化因子优选选自IL-8、GROα、GROβ、GROγ、ENA-78、LDGF-PBP、GCP-2、PF4、Mig、IP-10、SDF-1α/β、BUNZO/STRC33、I-TAC、BLC/BCA-1、MIP-1α、MIP-1β、MDC、TECK、TARC、RANTES、HCC-1、HCC-4、DC-CK1、MIP-3α、MIP-3β、MCP-1-5、嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)、嗜酸细胞活化趋化因子-2、I-309、MPIF-1、6Ckine、CTACK、MEC、淋巴细胞趋化因子和fractalkine。
促凝血因子优选为组织因子。
用于前药活化的酶优选为选自羧基-肽酶、葡萄糖醛酸酶和葡糖苷酶的酶。
本发明在第三个方面涉及抑制FXIIa的酶促活性的离体方法，其包括将本发明的抑制剂、融合蛋白或融合构建体与FXIIa接触，其中FXIIa优选存在于血液、血浆或血清样品中。
该方法原则上同样可以在体内执行。如本文上文讨论的，FXIIa的抑制剂目前用于研究实验室和临床中越来越多使用的凝血测试中。上述离体法可以用于这种凝血测试中。血液、血浆或血清样品优选为人血液、血浆或血清样品。在研究实验室中，除血液、血浆或血清外的另外样品可以是有利的；例如测试FXIIa重组形式的性能。
本发明在第四个方面涉及包含本发明的抑制剂、融合蛋白或融合构建体的药物组合物。
根据本发明，术语“药物组合物”涉及用于施用于患者，优选人患者的组合物。本发明的药物组合物包含本发明的至少一种抑制剂。它可以任选地包含能够改变本发明化合物的特征的进一步分子，从而例如稳定、调节和/或活化其功能。组合物可以是固体、液体或气体形式，并且可以尤其是粉末、片剂、溶液或气溶胶的形式。
这些药物组合物可以以合适的剂量施用于对象。给药方案由主治医生和临床因素决定。如在医学领域中众所周知的，任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康和同时施用的其他药物。对于给定情况的治疗有效量将通过例行实验容易地确定，并且在普通临床医生或医生的技术和判断之内。一般地，作为药物组合物的常规施用的方案应当在1μg至5g单位/天的范围内。然而，更优选的剂量可以在0.01mg至100mg，甚至更优选0.01mg至50mg，且最优选0.01mg至10mg/天的范围内。
此外，所施用的药物组合物的总药学有效量通常小于约75mg/kg体重，例如小于约70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg/kg体重。更优选地，药物组合物的药学有效量将小于2000nmol抑制剂/kg体重，例如小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075或0.00015nmol抑制剂/kg体重。
观察变化所需的治疗时间长度和治疗后应答发生的间隔取决于所需效应而变化。特定量可以通过本领域技术人员众所周知的常规测试来确定。
本发明的药物组合物优选包含药学可接受的载体或赋形剂。“药学可接受的载体或赋形剂”意指任何类型的无毒固体、半固体或液体填料、稀释剂、包封材料或制剂辅助剂(还参见Handbook of Pharmaceutical Excipients 6ed.2010，由Pharmaceutical Press出版)。合适的药物载体和赋形剂的实例是本领域众所周知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液例如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液、有机溶剂包括DMSO等。包含这种载体或赋形剂的组合物可以通过众所周知的常规方法进行配制。药物组合物可以在任选包含常规药学可接受的载体或赋形剂的剂量单位制剂中，例如经口、肠胃外例如皮下、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、经皮、经粘膜、硬膜外、经由离子导入局部或部分、舌下、通过吸入喷雾、气溶胶或直肠等等进行施用。
本发明在第五个方面涉及用于治疗或预防血栓性疾病，优选选自血栓、深静脉血栓形成、遗传性血管性水肿和糖尿病性黄斑水肿的血栓性疾病中的本发明的抑制剂、融合蛋白或融合构建体。
FXII的特异性抑制已证明是血栓形成的各种临床前模型(包括灵长类动物)中的安全抗血栓形成策略。本发明的抑制剂特别是FXII618因此适合于治疗或预防血栓性疾病。血栓性疾病的非限制性实例是血栓、深静脉血栓形成、遗传性血管性水肿和糖尿病性黄斑水肿。FXII618不仅本身是治疗化合物，而且还可以充当进一步治疗化合物的开发的前导化合物。FXII618是FXIIa的直接抑制剂，并且因此具有超过先前开发的抑制剂以干扰凝血FXII的血栓形成和炎症功能两者的明显优势。本发明的抑制剂可以在急性情况如在心脏手术期间的体外循环或预防继发性中风事件中特别有用。
本发明的另一个目的是提供治疗和/或预防血栓性疾病，优选选自血栓、深静脉血栓形成、遗传性血管性水肿和糖尿病性黄斑水肿的血栓性疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的抑制剂、融合蛋白或融合构建体施用于有此需要的患者。
如在本发明中适用的，施用指本发明的抑制剂与待治疗的对象，优选人接触。当施用于人或动物生物时，抑制剂的治疗有效量是诱导抑制凝血酶FXIIa的酶促活性的可检测的药理学和/或生理学效应的抑制剂的量。
对于全身施用，治疗有效量或剂量最初可以从体外测定进行估计。例如，可以在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC50的循环浓度范围。这些信息可以用于更精确地确定人中的有用剂量。初始剂量也可以从体内数据例如动物模型进行估计，使用本领域众所周知的技术。本领域普通技术人员可以基于动物数据容易地优化对人的施用，并且当然依赖于待治疗的对象、对象的重量、病症的严重程度、施用方式。
本发明在第五个方面涉及本发明的抑制剂、融合蛋白或融合构建体用于涂布器皿、管、针、注射器、膜或医疗装置的用途。
抗凝剂是帮助预防血液中的血块形成的药剂。鉴于本发明的抑制剂的抗凝效应，它们也是用于器皿、管、针、注射器、膜或医疗装置的合适涂层。与相应的未涂布物体相比，这种涂布物体是有利的，因为涂层防止接触活化驱动的血栓形成。例如，CTI以前已被用作具有改善的血液相容性结果的表面改性剂。27,28FXII618的小尺寸和合成性质使得该抑制剂特别适合于将其与血液接触表面缀合，如在心肺转流术系统中用于冠状动脉介入的导管或气体交换毛细血管。可以通过将抑制剂与器皿、管、针、注射器、膜或医疗装置的表面共价连接来实现涂布。
本发明在第七个方面涉及包含本发明的抑制剂、融合蛋白或融合构建体的用于血液凝固的试剂盒。
因为FXIIa的抑制剂目前用于凝血测试中，所以用于执行这种测试的这种试剂盒在本发明的范围内。试剂盒优选包括如何使用试剂盒的说明书。试剂盒的各种组分可以包装在一个或多个容器中，例如一个或多个小瓶。除组分之外，小瓶可以包含用于贮存的防腐剂或缓冲剂。
本发明还提供了诊断测定法，其中本发明的抑制剂、融合蛋白或融合构建体用于抑制因子XIIa或结合特异性结合例如在血液、血浆或血清中的因子XIIa。诊断测定法的非限制性实例包含TGA和血栓弹力描记术。
如本文上文所述，FXIIa的抑制剂目前用于凝血测定法中，并且因而本发明的新型FXIIa抑制剂也可以用于此类测定法中。这种测定的合适形式是包括测定法的TGA和血栓弹力描记术。
附图说明
图1双环肽FXIIa抑制剂的噬菌体选择。(a)在3轮选择后针对β-FXIIa分离的肽序列。在亲和淘选之前，用硫醇反应性接头TATA将以灰色突出显示的三个半胱氨酸环化。肽之间的序列相似性以颜色突出显示。对于Ki，指示至少两次测量的平均值。(b)选自文库的最好的两种FXIIa抑制剂的活性和特异性。指示了标准差。(c)先前开发的双环肽FXIIa抑制剂(FXII402)以及两种新开发的抑制剂FXII512和FXII516的aPTT和PT。指示了标准差。
图2双环肽FXIIa抑制剂的亲和力成熟、特异性概况分析和抑制活性。(a)从基于FXII516的半随机肽文库中分离的肽序列。肽之间的序列相似性以颜色突出显示。(b)通过三轮氨基酸取代改善FXII516的结合亲和力。所示标准差基于三个Ki值进行计算。(c)FXII618的靶选择性。标准差基于三个或更多个Ki值进行计算。(d)在所示FXII618浓度下的凝血参数aPTT和PT以及FXII活性(FXII:c)。aPTT、PT和FXII:c的标准差基于三次测量进行计算。
图3CTI和双环肽FXII618的结构。(a)CTI(左)和FXII618(右)的多肽序列。化学接头TATA经由硫醚键连接双环肽的三个半胱氨酸。指示了与FXIIa的特异性口袋S2、S1和S1'结合的残基。(b)与FXIIa结合的CTI(上图)和FXII618(下图)的结构模型。双环肽的TATA接头以绿色显示。(c)与FXIIa结合的CTI和FXII618的组合环叠加。(d)与FXIIa(橙色)、游离CTI(红色)和FXIIa结合的FXII618(蓝色)结合的CTI中的组合环的(实线)和ψ(虚线)的二面角。(e,f)CTI(e)和FXII618(f)的组合环，示出了抑制剂与FXIIa活性位点区域的互补性。
图4FXII618和CTI的比较。(a)CTI(上图)和FXII618(下图)的特异性概况和抑制活性。显示了几种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的残留活性。显示了标准差。(b)在相同数量的FXII618和CTI的存在下，柠檬酸盐贫血小板血浆中aPTT的比较。标准差基于三次测量进行计算。(c)在各种CTI(上图)和FXII618浓度(下图)的存在下，通过鞣花酸(内源性途径活化)触发的柠檬酸盐贫血小板血浆中通过CAT的凝血酶生成。
图5通过CAT在血浆中低TF诱导的TGA的FXII618和CTI的比较。在100μg/mL抑制剂CTI或FXII618的不存在或存在下，柠檬酸盐贫血小板血浆中的凝血酶生成由0、1和0.25pMTF触发。
图6FXIIa抑制剂的结构-活性关系(SAR)。
图7连接分子的化学结构。
图8FXII618的化学环结构。
图9已结合本发明鉴定的凝血酶FXIIa的氨基酸序列抑制剂。这些氨基酸序列抑制剂中的半胱氨酸与TATA连接。
图10(a)人血浆中双环肽的稳定性。将肽在人血浆中在37℃下温育所示时间段后测定表观IC50。指示三个测量值的平均值。(b)双环肽73(FXII801)的特异性。至少三次测量的平均值。指示了标准差。
图11双环肽1(FXII618)、61(FXII800)和73(FXII801)的凝血参数aPTT(a)和PT(b)。基于三次测量计算aPTT、PT的标准差。
图12(a)FXII618(1)的化学结构。(b)亲和成熟策略。通过用β-氨基酸替换α-氨基酸，或者通过用具有较长侧链的半胱氨酸同系物替换连接到环化接头的半胱氨酸，将碳原子插入肽主链内。
图13FXII618、FXII700和FXII701的凝血参数aPTT(a)和PT(b)。
图14FXII618-TATA、FXII618-TBAT和FXII618-TBMT的活性和特异性。指示了标准差。
实施例示出了本发明。
实施例1-FXII618的生成和测试
实施例1.1-实验程序
针对活化的人FXII的噬菌体选择
产生双环肽噬菌体展示文库(文库3x3、4x4和6x6)，并且遵循先前描述的程序执行三轮噬菌体选择。29对于每个选择，在0.5L细菌培养中产生噬菌体。通过聚乙二醇(PEG)沉淀纯化噬菌体。在80％水性缓冲液(20mM NH4HCO3,5mM EDTA,pH 8.0)和20％乙腈中，在与硫醇反应性试剂1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA，150μM，30℃，1小时)或N,N’,N”-(苯-1,3,5-三基)-三(2-溴乙酰胺)(TBAB，40μM，30℃，1小时)化学反应之前，用三(2-羧乙基)膦(TCEP，1mM，42℃，1小时)还原半胱氨酸残基。将人β-FXIIa(HFXIIAB；MolecularInnovations,Novi,MI,USA)生物素化，并且将5μg固定在链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白磁珠上。粘合剂在酸性pH下洗脱。在亲和力成熟选择中，使用较少生物素化的FXIIa：在两轮选择中为0.2μg，或在第一轮为2μg且在第二轮为0.2、0.5或1μg。
亲和力成熟文库的克隆
随机DNA序列在PCR反应中通过简并引物附加到噬菌体p3的基因，并且将产物插入在两个SfiI限制性位点处的噬菌体载体pECO2内。29正向引物：VBfLvb21_for(TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCANNKTGTNNKAGGCTGNNKTGCNNKCAGTTGNNKTGTNNKGGTTCTGGCGCTG)(SEQ ID NO:91)，反向引物sfi2notfo(CCATGGCCCCCGAGGCCGCGGCCGCATTGACAGG)(SEQ IDNO:92)。将4.4μg连接的载体电穿孔到TG1细胞内，在大型(140mm直径)氯霉素(30μg/mL)2YT琼脂平板上产生8.8x 106菌落形成单位(c.f.u.)。用2YT培养基(补充有15％v/v甘油)将菌落从板上刮下并且贮存于-80℃下。
aPTT、PT和FXII凝血活性(FXII:c)测量
根据制造商的说明书(Siemens)，使用自动化血液凝固分析仪(Sysmex CS-5100,Siemens,Eschborn，德国)在人血浆中测定凝血时间(aPTT、PT)和FXIIa活性。使用(稳定的HEPES缓冲系统中的重组人组织因子、合成磷脂和钙；Dade Behring/Simens)触发外源性凝血。使用Pathromtin*SL(Siemens)触发内源性凝血。本研究中使用的人血浆衍生自通过Service Régional Vaudois de Transfusion Sanguine，瑞士提供的新鲜冷冻血浆单元库。
凝血酶生成测定法：校准的自动化血栓造影术(CAT)
如先前所述伴随一些修改执行凝血酶生成。简言之，60μL贫血小板血浆(PPP)、20μL FXIIa抑制剂/HA缓冲液(Hepes 20mM,NaCl 140mM,pH7.4,5mg/mL BSA)、以及20μL PPP试剂、PPP LOW试剂、MP试剂或Actin FS(在HA缓冲液中1:170稀释)在96孔微量滴定板(Immulon 2HB；Thermo Fisher Scientific)中混合，并且在37℃下温育15分钟。通过在37℃下加入20μL底物/氯化钙缓冲液(FLUKA)触发凝血酶生成。样品对于每种条件一式三份进行测试。在具有390/460-nm(激发/发射)滤器组的微孔板荧光计(Fluoroskan Ascent FL；Thermo Fisher Scientific)上每20s测量荧光凝血酶底物水解共120分钟。数据分析在Thrombinoscope软件(Synapse BV)上执行。PPP试剂(TF 5pM、PL 4μM)、PPP LOW试剂(TF1pM、PL 4μM)、MP试剂(PL 4μM)、凝血酶校准物和FLUKA购自Synapse BV。
血液收集用于在全血中抑制剂添加后的凝血酶生成测量
在3.2％(w/v)柠檬酸盐Monovette塑料管中，通过用19号针的肘前静脉穿刺从健康志愿者收集静脉血。为了最小化接触活化，根据标准程序弃去含有EDTA的第一收集管。在血液收集后不久(<1分钟)，将FXII618加入管中至100μg/mL的最终浓度。然后将血液通过以2,000g共5分钟的初始离心步骤加工至PPP，随后为以10,000g共10分钟的第二离心步骤。将血浆等分试样贮存于-80℃下直到分析。
双环肽合成
使用受Fmoc保护的氨基酸和Rink Amide AM树脂，通过标准固相肽合成内部合成肽。使用HBTU和HOBt作为偶联剂，氨基酸以4倍摩尔过量偶联两次。合成的所有肽都具有游离的N-末端和酰胺化的C-末端。在还原条件下(90％TFA、2.5％H2O、2.5％茴香硫醚、2.5％苯酚、2.5％1,2-乙二硫醇)，将树脂从树脂上切下。以1mM浓度的粗制肽与在70％水性缓冲液(20mM NH4HCO3,5mM EDTA,pH 8.0)和30％乙腈中的1.5mM TATA或TBAB在30℃下反应1小时。环化肽通过C18柱上的反相色谱进行纯化。将纯双环肽(>95％纯化)冻干且溶解于水中。它们的质量通过ESI得到证实。
蛋白酶抑制测试法
通过与蛋白酶温育并且用荧光底物定量其残留活性来测定双环肽的抑制活性。人b-FXIIa(HFXIIAB；Molecular Innovations)和小鼠a-FXIIa(MFXIIA；MolecularInnovations)的最终浓度为10nM。制备范围为0.2-200mM的肽稀释度。用Infinite M200Pro荧光板阅读器(在355nm处激发，在460nm处发射；Tecan，瑞士)测量荧光强度。反应在RT下执行。使用下述剂量响应方程将S形曲线与数据拟合，其中x＝肽浓度，y＝不含肽的反应活性％，A1＝100％，A2＝0％，p＝1。IC50值衍生自拟合曲线。
根据Cheng和Prusoff29的方程Ki＝IC50/(1+([S]0/Km)计算抑制常数Ki，其中IC50是抑制剂的功能强度，[S]0是总底物浓度，并且Km是米-曼二氏常数。
离体凝血测定法
根据制造商的说明书(Siemens Healthcare，Eschborn，德国)，使用具有标准试剂的自动化血液凝固分析仪(Sysmex CA-7000)，在人血浆中至少一式两份测定凝血时间(aPTT、PT)和FXIIa活性。本研究中使用的人血浆衍生自通过Service Régional Vaudoisde Transfusion Sanguine，瑞士提供的新鲜冷冻血浆单元库。
同源性建模
使用X射线共晶结构数据集1PPE、2XTT和4AOQ作为模板，构建了其中CTI和FXII618四肽以标准机制结合到S2、S1、S1'和S2'亚位点的β-FXIIa同源性模型。非必需水分子和离子在PDB文件中被删除，并且肽配体被截短以仅保留P2、P1、P1'和P2'残基。使用来自MODELLER软件30的比对脚本，将β-FXIIa以及CTI和FXII618的四肽与b-胰蛋白酶和三种配体的四肽进行比对。基于保守氨基酸比对蛋白质和肽。b-FXIIa与b-胰蛋白酶(氨基酸16-245，胰凝乳蛋白酶编号)共享35.7％的序列同一性和54.4％的序列相似性。定义了P1精氨酸的h氨基与β-XIIa中天冬氨酸189的d氧之间的距离约束。MODELLER软件用于构建具有结合肽四肽的模型。具有最低能量的模型进一步用于使用Amber 11软件(R.Salomon-Ferrer,A.W.2013)的分子动力学模拟。在FXII618的结构中，三个半胱氨酸与TATA手动连接。AMBER力场用于制备具有tleap的打磨器输入文件。TIP3P水用于溶解结构。首先通过保持b-FXIIa和结合肽的构象，然后仅在S2、S1、S1'和S2'口袋处的相互作用残基来最小化该系统。最后整个系统被最小化。然后在整个系统上平衡之前，将系统加热至300K。生产平衡在300K下以恒定压力和周期边界运行20ns。使用Langevin动力学来使用1.0ps-1的碰撞频率来控制温度。然后分析最终结构。所有的计算都在由EPFL处的科学IT和应用支持(SCITAS)提供的GPU加速集群ELECTRA中执行。
体内FXII活性的抑制
雌性BALB/c小鼠用125mg/kg戊巴比妥进行麻醉。在五分钟后，用与3.5mg/kgPK128(N＝3)组合的3.5mg/kg FXII618或PBS(N＝2)作为对照r.o.注射小鼠。五分钟后，以1:9的血液与柠檬酸盐比从腔静脉采集血液。通过在RT下以2,400g离心10分钟制备血浆。如上所述评价FXIIa活性。
实施例1.2-筛选结构上不同的双环肽文库
使用新型肽环化试剂和更多样的肽形式开发了六个组合噬菌体展示文库，其共同包含超过100亿种不同的双环肽。将文库针对人β-FXIIa(仅包含催化结构域的FXIIa的天然存在的蛋白水解产物)淘选。通过使噬菌体上展示的形式CXnCXnC(C＝半胱氨酸，X＝随机氨基酸；n＝3、4、6)的线性肽环化来生成文库，使用硫醇反应性试剂1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA)或N,N’,N”-(苯-1,3,5-三基)-三(2-溴乙酰胺)(TBAB)中的任一种。与先前应用的试剂1,3,5-三(溴甲基)苯(TBMB)相比，这些化学接头在双环肽中施加不同的肽主链构象.19,20用TBAB环化肽执行的亲和力选择导致粘合剂而不是抑制剂的分离。相比之下，从TATA-环化肽文库分离的双环肽产生FXIIa抑制剂，其对于β-FXIIa的Ki范围为0.16+/-0.07μM至10.2+/-0.9μM(图1a)。两种最有效的肽FXII512(0.16+/-0.07μM的Ki)和FXII516(0.16+/-0.08μM)的进一步表征显示它们与小鼠FXIIa交叉反应(β-FXIIa；分别为0.32+/-0.07μM和0.45+/-0.16μM的Ki)(图1b)。用结构和功能相关的丝氨酸蛋白酶实验对象组的特异性概况分析显示，FXII512抑制人组织型纤溶酶原激活物(tPA；Ki＝8.8μM)，纤维蛋白溶解中涉及的凝血相关酶。在高达50μM的浓度下，FXII516并不显著抑制所有测试的蛋白酶中的任一种。
在凝血测定法中进一步观察到关于FXIIa抑制FXII516超过FXII512的较高选择性。在三种不同浓度的FXII512或FXII516存在下，在人血浆中测量活化部分凝血活酶时间(aPTT)和凝血酶原时间(PT)。FXII402，先前开发的FXIIa抑制剂(用TBMB环化；Ki＝1.2μM)，18用于比较。aPTT和PT测量经由内源性(aPTT)或外源性途径(PT)在凝血开始后的凝血时间。选择性FXIIa抑制预期增加aPTT而不是PT。在完全FXIIa抑制的情况下，aPTT和PT应与在FXII缺陷血浆中测量的那些可比较(aPTT>170秒和稳态PT；Service and CentralLaboratory of Hematology,Lausanne University Hospital，瑞士)。如图1c所示，新开发的双环肽在抑制内源性凝血途径方面比FXII402更有效，如通过对于同样的抑制剂浓度较长的aPTT观察到的。FXII512最强抑制内源性途径，但在50μM及以上的浓度下呈现延长的非生理学PT。相比之下，即使在测试的最高抑制剂浓度(100μM)下，FXII516也有效地抑制内源性途径而不影响外源性途径，并且提供了有前途的潜力。筛选新开发的结构更多样的文库因此已产生比先前由噬菌体展示开发的最佳肽基本上更有效的抑制剂。18
实施例1.3-有效和选择性FXIIa抑制剂的改造
通过改变共有区域外的氨基酸，FXII516的效力得到进一步改善。形式XCXRLXCXQLXCX(共有序列是有下划线的，X＝随机氨基酸)的噬菌体展示文库的筛选不产生改善的粘合剂，但序列显示扩展的共有序列，并且给出FXII516中的有益氨基酸取代的提示(图2a)。最显著的是在位置1中的氨基酸至脂肪族氨基酸和精氨酸、以及在位置3和6中至脯氨酸、在位置8中至丙氨酸、以及在位置11中至精氨酸的会聚进化。具有单一氨基酸取代的FXII516变体显示高达4倍改善的抑制活性(图2b；第1轮)。通过突变和筛选的两个迭代循环累积进一步突变产生抑制人β-FXIIa的肽FXII618，其Ki为22+/-4nM(图2b；第2轮和第3轮)。α-FXIIa被抑制至相同程度(Ki＝19+/-1nM)。FXII618还以252+/-29nM的Ki抑制小鼠FXIIa，但不抑制结构相关或功能重要的蛋白酶(图2c)。与其母体FXII516和先前开发的TBMB环化抑制剂FXII402相比，FXII618分别呈现了在抑制人FXIIa方面的8倍和60倍改善。在体外凝血测定法中进一步评价FXII618的效力和特异性。在低至40μM的浓度下，双环肽经由内源性途径(aPTT>170秒)完全抑制凝血起始，而不影响外源性途径(稳态PT)。一致地，在50μM下，FXII凝血活性(FXII:c)降低至<5％(图2d)。
实施例1.4-FXII618模拟玉米胰蛋白酶抑制剂的结合模式
鉴定的共有序列与天然FXIIa抑制剂的结合环的比较显示最有效的双环肽FXII618(RCFRLPCRQLRCR)的第一环与玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI；…IGPRLPW…)的组合环之间惊人的相似性(相同氨基酸是有下划线的)。对于导致FXII618(XCPRLPCXQLR/KCX；图2a)开发的亲和力成熟方法中发现的共有序列，同源性甚至更显著，并且提示该双环肽具有与CTI相同的结合模式(图3a)。CTI是来自玉米种子的13.6kDa蛋白质，其同等抑制FXIIa和胰蛋白酶。它广泛应用于压制凝血测定法中的接触相活化。含有5个二硫桥(PBD:1BEA)的127个氨基酸蛋白质是遵守所谓的抑制‘标准机制’的经典抑制剂23，其中抑制剂的肽环基本上与酶的多肽底物结合。CTI的Arg34结合到FXIIa2的S1特异性口袋内。2
通过同源建模和分子动力学模拟测试FXII618是否可以真正采用与FXIIa的活性位点互补的构象。由于不存在CTI和FXIIa的共晶体结构，因此也对CTI-FXIIa复合物进行了建模。同源丝氨酸蛋白酶牛β-胰蛋白酶和CMTI-1(来自南瓜种子的胰蛋白酶抑制剂；PDB：1PPE)、SGPI-1-P02(沙漠蝗(Schistocerca gregaria)蛋白酶抑制剂1；PDB：2XTT)和SOTI-III(菠菜(Spinacia oleracea)胰蛋白酶抑制剂III；PDB：4AOQ)的共晶结构充当用于同源性建模的结构模板。FXII催化结构域(氨基酸16-254)和牛β-胰蛋白酶的36％氨基酸是相同的。CMTI-1、SGPI-1-P02和SOTI-III根据标准机制结合胰蛋白酶。CTI和FXII618的结合环形成与FXIIa的互补结构(图3b)。CTI中的组合环的主链和精氨酸的侧链与FXII618的第一环之一叠加(图3c)。在抑制剂与蛋白酶结合时，游离CTI(取自PDB：1BEA)的组合环的Ramachandran角度保持基本上相同(图3d)。FXII618(FRLP)的环1中的4个氨基酸的二面角类似于结合CTI模型中的等价氨基酸的那些(图3d)。酶-抑制剂复合物的结构表示强调了双环肽环1与蛋白酶的活性位点的互补性(图3f)。FXII618的第二环(环2)也适合FXIIa的表面，而不产生任何空间冲突。然而，模型中环2的构象较不确定，因为没有发现该肽区域与FXIIa表面的特异性接触。
实施例1.5-FXII618在压制内源性凝血起始方面优于CTI
FXII618和CTI的活性和靶特异性在抑制测定法中并列比较(图4)。FXIIa抑制与两种抑制剂可比较。相比之下，FXII618的靶选择性优于CTI的那种，如用与FXII共享结构和功能相似性的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶实验对象组评价的。虽然CTI基本上抑制了三种蛋白酶胰蛋白酶(Ki＝7+/-0.5nM)、纤溶酶(Ki＝5+/-1.6μM)和因子XIa(Ki＝12.5+/-1.4μM)(图4，上图)，但双环肽仅抑制胰蛋白酶(Ki＝5+/-0.5μM)(图4，下图)。与CTI相比，FXII618抑制胰蛋白酶弱约100倍。
FXII618和CTI还在体外凝血测定法中就其抑制内源性途径起始的能力并列比较(图4b)。如引言所示，商品成本是CTI应用的主要限制因子。24研究者通常通过应用在很大程度上阻断FXIIa所需的最少量CTI(30-100μg/mL)来限制费用。因此，在本实验中，比较两种抑制剂的活性/质量。活性/分子可以通过考虑两种抑制剂的不同分子量(13.6kDa[CTI]:1956Da[FXII618]＝因子7)衍生自所呈现的数据。在第一组实验中，在各种抑制剂浓度的存在下测量aPTT。FXII618以100μg/mL(aPTT>170秒)完全阻断接触触发的凝血。相同数量的CTI延迟凝血至仅65.4+/-0.5秒的最终aPTT值。在更高的CTI浓度下，aPTT值看起来会聚于远离完全抑制的平台。在第二组实验中，使用CAT，通过两种抑制剂的接触活化的抑制在由鞣花酸(EA)触发的实时凝血酶生成测定法(TGA)25中进行测量(图4c)。FXII618以剂量依赖性方式减少EA诱导的凝血酶生成，达到已经在20μg/mL的FXII618下凝血酶形成的完全抑制(内源性凝血酶潜能[ETP]和峰值的>90％降低)(图4c，下图)。用FXII缺陷血浆获得可比较的TGA结果。需要多约5倍的CTI(100μg/mL)，以将凝血酶生成降低到背景水平(ETP的～90％降低和峰值的>96％降低；图4c，上图)。这些结果显示FXII618在预防内源性途径的活化中超过CTI的增加效力。为了评价FXII618对于内源性途径的特异性，使用高浓度TF(5pM)经由外源性途径诱导凝血酶生成。即使在100μg/mL FXII618的最高浓度下，肽抑制剂也不影响TF诱导的凝血酶生成。由于接触活化可以在静脉穿刺期间发生，因此测试了在收集后直接向全血中加入FXII618的效应。得到类似的结果。总之，这些数据明确证实FXII618的强效力和特异性，其有效地抑制接触系统，从而有效地抑制了内源性途径的起始，而对外源性途径没有任何作用。
实施例1.6-FXII618在低TF诊断测试中有效地阻断接触活化
如引言所述，用低TF浓度(<1pM)触发的凝血测定法最佳模拟在生理条件下的凝血过程。然而，在低TF触发剂浓度下，接触活化基本上促成凝血酶生成，且伪造结果。FXII618和CTI就其在血浆中的低TF凝血酶生成测定法中抑制接触活化的能力进行比较(图5)。当使用1pM TF触发凝血酶生成时，无法观察到FXII618或CTI的显著作用(图5，上图)。相反，在0.25pM TF下，FXII618将内源性凝血酶潜能降低到与CTI相似的程度，但更有效延迟滞后时间(滞后时间：分别为12.3±0.3和8.0±0.2)(图5，中图)。在不存在外源性或内源性特异性触发剂的情况下执行的凝血酶生成中，FXII618比CTI明显更强地抑制接触活化(滞后时间：分别为55.8±3.7和38.7±1.9，以及峰值：分别为60.3±0.8和78.0±6.8；图5，下图)。
最后测试如果在血液取样后立即将双环肽加入全血中，双环肽是否可以延迟甚至更多的凝血酶生成。凝血酶生成在血浆中进行测试。发现与其中将抑制剂加入血浆中的实验相似的结果。在不存在外源性或内源性特异性触发剂的情况下，FXII618甚至可以完全阻断凝血酶活化。后一个发现指示如果在血液取样后立即加入抑制剂，则可以压制在血液取样管中发生的FXII活化。与CTI相比，通过FXII618的改善的接触活化阻断解释了这种合成抑制剂在低TF诊断测试中替换CTI的潜力。
实施例1.7-小鼠中的内源性凝血的选择性抑制
FXII618与小鼠FXIIa交叉反应，这允许在小鼠中测试其活性。因为关于小鼠FXIIa的Ki(252+/-29nM)比人FXIIa(22+/-4nM)高11倍，所以将FXII618与先前描述的血浆激肽释放酶(PK)的双环肽抑制剂PK12819组合。在具有带负电荷表面的少量FXII的活化时，FXIIa活化血浆激肽释放酶(PK)，其相互活化更大量的FXII。通过抑制FXII的活性以及其活化，抑制两种蛋白酶导致FXIIa的协同阻断。施用与3.5mg/kg PK128组合的3.5mg/kg FXII618使FXII活性降低至49.7+/-13.9％。与人血浆中获得的离体数据一致，PT值在抑制剂治疗(7.1+/-0.2秒)和PBS对照小鼠(6.7+/-0.3秒)之间是可比较的，显示外源性途径保持不受影响。
实施例2-FXII618中的天然和非天然氨基酸取代
实施例2.1-材料和方法
双环肽合成：
使用受Fmoc保护的氨基酸和Rink Amide AM树脂，通过标准固相肽合成内部合成肽。使用HBTU和HOBt作为偶联剂，氨基酸以4倍摩尔过量偶联两次。通过加入2当量的受Fmoc保护的氨基酸，2当量的HATU和4当量的DIPEA，手动执行非天然氨基酸的偶联。合成的所有肽都具有游离的N-末端和酰胺化的C-末端。在还原条件下(90％TFA、2.5％H2O、2.5％茴香硫醚、2.5％苯酚、2.5％1,2-乙二硫醇)，将树脂从树脂上切下。以1mM浓度的粗制肽与在70％水性缓冲液(50mM NH4HCO3,pH 8.0)和30％乙腈中的1.5mM TATA在30℃下反应1小时。环化肽通过C18柱上的反相色谱进行纯化。将纯双环肽(通过分析型HPLC确认的>95％纯度)冻干且溶解于水中。它们的质量通过ESI得到证实。
蛋白酶抑制测定法
通过与蛋白酶温育并且用荧光底物定量其残留活性来测定双环肽的抑制活性。在150μL体积中含有10mM Tris-Cl pH 7.4、150mM NaCl、10mM MgCl2、1mM CaCl2、0.1％w/vBSA、0.01％v/v Triton-X100和5％v/v DMSO的缓冲液中测量残留的酶促活性。在第一系列实验中，使用50μM荧光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC和2.5nM酶(人β-FXIIa，HFXIIAB；MolecularInnovations)。以后，使用更敏感的底物Boc-Gln-Gly-Arg-AMC，允许将酶浓度降低至0.5nM，并且因此能够测量较低的Ki值。对照实验显示当使用下述相应的KM值比较两种不同的荧光底物时，获得FXIIa-抑制剂的非常相似的抑制常数。
制备范围为0.00001-4μM的肽稀释度。用Infinite M200Pro荧光板阅读器(在368nm处激发，在467nm处发射；Tecan，瑞士)测量荧光强度。反应在25℃下执行。使用下述剂量响应方程将S形曲线与数据拟合，其中x＝肽浓度，y＝不含肽的反应活性％，A1＝100％，A2＝0％，p＝1。IC50值衍生自拟合曲线。
根据Cheng和Prusoff的方程Ki＝IC50/(1+([S]0/Km)计算抑制常数Ki，其中IC50是抑制剂的功能强度，[S]0是总底物浓度，并且KM是米-曼二氏常数。关于两种底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC和Boc-Gln-Gly-Arg-AMC的KM已分别测定为180±31和256±42μM(平均值±SD，n＝4)。
对于特异性测试，使用下述终浓度的人丝氨酸蛋白酶：tPA(MolecularInnovations)7.5nM，uPA(Molecular Innovations)1.5nM，因子XIa(Innovative Research,Novi,MI,U.S.)6nM，PK(Innovative Research)0.25nM，凝血酶(Molecular Innovations)1nM，纤溶酶(Molecular Innovations)2.5nM，胰蛋白酶(Molecular Innovations)0.05nM，因子VIIa(Haematologic Technologies Inc.)50nM和因子Xa(Haematologic Technologies Inc.)6nM。制备范围为0.04至40μM的肽稀释度。为了测定IC50抑制常数，使用终浓度为50μM的下述荧光底物：Z-Phe-Arg-AMC(对于PK；Bachem，Bubendorf，瑞士)，Boc-Phe-Ser-Arg-AMC(对于因子XIa；Bachem)，Z-Gly-Gly-Arg-AMC(tPA、uPA、凝血酶和胰蛋白酶；Bachem)，HD-Val-Leu-Lys-AMC(对于纤溶酶；Bachem)和D-Phe-Pro-Arg-ANSNH-C4H9(对于FVIIa和FXa；Haematologic Technologies Inc.)。
血浆稳定性测定法
将肽(2μl在H2O中2mM)加入398μl人血浆(最终肽浓度在400μl最终体积中为10μM)中。将混合物在37℃下的水浴中温育。在8个不同的时间点(0小时、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时以及在某些情况下48小时)，取出30μl的样品，由用于蛋白酶抑制测定法的缓冲液稀释至200μl(参见上文)，并且在65℃下热灭活20分钟。在此步骤期间，存在于血浆中的蛋白酶被灭活，所述蛋白酶否则将干扰后续执行的酶促测定法。对照实验显示温育的肽对热灭活程序是完全抗性的，并且不含肽抑制剂的灭活血浆仅在酶促测定法中弱影响βFXIIa的活性。在血浆样品的热灭活后，将后者保持在-20℃下，直至在蛋白酶抑制测定法中分析其针对FXIIa的抑制效力。在分析前，血浆样品以16’000g离心5分钟，并且收集上清液。制备范围为0.0005-0.5μM的两倍稀释系列。使用上述方程从拟合曲线得到IC50值。使用下式计算以％的残留抑制：IC50,0h/IC50,xh*100，其中IC50,0h是抑制剂在时间点0时的功能强度，并且IC50,xh是在上述不同血浆温育期之一后抑制剂的功能强度。
aPTT和PT凝结剂活性测量
使用血液凝固分析仪(Start Hemostasis凝血分析仪，Diagnostica Stago)在人血浆中测定凝血时间(aPTT、PT)。使用Innovin(稳定的HEPES缓冲系统中的重组人组织因子、合成磷脂和钙；Dade Behring/Siemens)触发外源性凝血。使用Pathromtin*SL(Siemens)触发内源性凝血。本研究中使用的合并正常人血浆由Innovative research(USA)提供。
实施例2.2-结果与讨论
在实施例2.2中，参考编号1至73的肽。编号1的肽是FXII618。编号3至72的肽的结构特征和抑制能力也显示于图6中。肽编号73的结构特征和抑制能力在该实施例中详细描述。
改善抑制活性
基于在针对FXIIa的噬菌体选择中分离的肽的序列相似性，肽1的第一环(Phe3、Arg4、Leu5、Pro6)和第二环的中间两个氨基酸(Gln9、Leu10)看起来对于结合最重要(图1)。在改善肽1的抑制活性的第一次尝试中，选择用具有相似侧链的天然氨基酸替换这些位置中的氨基酸。使用两个评分矩阵BLOSUM62和PAM250来选择合适的氨基酸取代，其指示氨基酸通过另一个的进化取代概率(图6)。为了允许通过吸收光谱法精确定量所合成的肽，将色氨酸残基附加到所有肽的C末端。该肽2具有26±8nM的Ki，并且因此具有与肽1可比较的活性。合成了总共26种双环肽，各自具有在六个位置之一中取代的一个氨基酸。肽无一具有改善的Ki，但获得了有价值的结构-活性关系数据。在Phe3的位置中，用色氨酸替换苯丙氨酸保存活性(肽3；Ki＝26±2)。该位置中的所有其他氨基酸取代将活性降低超过2倍(酪氨酸、亮氨酸、丙氨酸；肽4-6)或超过10倍(缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸；肽7-9)。在位置Arg4中，仅测试对赖氨酸的取代，因为该残基应具有正电荷，以在FXII的S1结合口袋的底部处与天冬氨酸形成离子相互作用。在该位置中的赖氨酸将抑制活性降低10倍(肽10；Ki＝283±21)。在Leu5的位置中，所有取代，即使具有与亮氨酸非常相似的氨基酸例如缬氨酸(肽11)或异亮氨酸(肽12)的那些，也将亲和力降低超过50倍。在该位置中含有甲硫氨酸(肽13)或丙氨酸(肽14)的肽在所测试的最高浓度(3μM)下根本不抑制FXIIa。在位置Pro6中，氨基酸取代中的两个将活性降低至少于2倍，即丙氨酸(肽15)和亮氨酸(肽18)。在第二大环中，所有取代基基本上降低了肽2的活性。在Gln9的位置中，对于天冬氨酸发现最小损失(肽21；54倍)，并且在位置Leu10中，对于异亮氨酸发现最小损失(肽26；8倍)。
在改善肽1的活性的第二次尝试时，选择用结构上更紧密类似原始残基的非天然残基替换氨基酸(图6)。在位置Phe3中，测试类似苯丙氨酸(肽29-32)和色氨酸(肽33-37)的非天然氨基酸，因为具有这两个天然氨基酸的肽最活跃(肽2和3)。苯丙氨酸类似物中的两种将活性降低了约30倍(肽29和30)，并且两种在所测试的最高浓度下不抑制FXIIa(1μM，肽31和32)。具有色氨酸类似物的五种肽中的一种具有稍微改善的活性：含有2-萘基丙氨酸的肽33具有2倍改善的抑制活性(Ki＝12±4)。在位置Arg4中，用一种赖氨酸类似物(高赖氨酸；肽38)和三个精氨酸类似物(高精氨酸、正精氨酸和4-胍基苯丙氨酸；肽39-41)替换氨基酸。所有这些取代都将肽的结合亲和力降低5倍或更多。在两个位置Leu5和Leu9中，测试了结构上类似亮氨酸的几种脂肪族氨基酸。在位置Leu5中，这些取代将肽的结合亲和力降低很多倍，其中对于正缬氨酸发现亲和力中的最小下降(肽42)。在位置Leu10中，所有五种非天然氨基酸将亲和力降低了少于8倍。
上述48种肽变体中的许多都具有基本上降低的活性，尽管事实上每次仅替换一个氨基酸，并且大多数插入的氨基酸在结构上类似于取代的氨基酸。肽1最可能已进化出与FXIIa表面互补的形状，并且不耐受大多数氨基酸位置中的较大结构变化。对于通过X射线晶体学研究的所有双环肽，先前发现配体和靶之间的高结构形状互补性。在改善肽1的抑制活性的第三次尝试中，目的是测试导致侧链中甚至更小的结构变化的氨基酸取代。选择修饰位置Phe3，因为这是其中使用非天然氨基酸的两个取代已产生轻微改善的抑制剂的唯一位点(图6)。在邻位(肽51)和对位(肽53)中对Phe3的苯环添加甲基使活性降低约5倍。相比之下，间位中的甲基将亲和力增加2.5倍(肽52；Ki＝10.4±0.6)。这些结果指示苯丙氨酸侧链周围的一些空间是可用的，但这个空间是有限的。随后将它转变为其中替换现有原子的甚至更小的结构变化。在间位中的苯环中用氮替换碳原子将活性改善约3倍(肽54；Ki＝8.4±0.3)。对位中的相同取代将抑制活性降低约6倍(肽55)。用卤素原子取代苯环上的氢原子在两个方向上显著地改变了活性。间位中的氟将活性降低约2.5倍(肽57)。相比之下，邻位和对位中的氟分别将活性增加2和11倍(肽56：Ki＝13.1±1.2；肽58：Ki＝2.31±0.36)。起因于对位中的氟的大改善很可能起因于电子分布中的变化。肽1和FXIIa的相互作用的结构建模提示苯丙氨酸被掩埋在芳香口袋中，并且与Tyr439和His393相互作用。在肽的苯环上存在吸电子基团如氟可能增加与蛋白酶的酪氨酸残基的π-π堆叠相互作用的强度，并且因此导致更高的结合亲和力。随后测试影响苯环中的电子分布的在对位中的更多取代基。碘的添加将活性降低超过10倍(肽59)，并且硝基将结合亲和力改善6倍(肽60；Ki＝4.5±0.7)。最后，合成了缺少C-末端色氨酸的肽58的变体，所述C-末端色氨酸仅由于其在280nm处的大消光系数而引入，允许基于吸收的浓度精确定量。与肽1仅相差在苯丙氨酸上的对氟原子的所得到的肽61具有2.01±0.07nM的Ki。也称为FXII800的双环肽61是具有单数位纳摩尔抑制常数的首个合成的FXIIa抑制剂。
改善蛋白水解稳定性
当在人血浆中在37℃下温育延长时间段(t1/2＝3.9±1.9小时)时，发现双环肽1通过蛋白水解失活。尽管四小时的半衰期足以阻断体外应用中使用的血浆样品中的接触活化，但如我们以前的工作所证实的，它对于其中FXIIa需要在更长时间段内被抑制的临床应用可能不够长。在人血浆中温育的肽1的质谱分析显示，第一次蛋白水解修饰是去除对应于精氨酸质量的156Da片段。不含N-和C-末端精氨酸的双环肽分别具有932±80nM(肽62)和28.8±2.0nM(肽63)的Ki。该结果提示血浆蛋白酶在N末端处剪切精氨酸。对于稳定性的改善，搜索在位置Arg1中的氨基酸取代，其i)不降低太多结合亲和力，和ii)阻止第一个氨基酸的蛋白水解切割(图6)。合成具有Arg1替换的双环肽，不含C-末端色氨酸残基。天然氨基酸例如异亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸代替Arg1都将亲和力降低>5倍(肽64-66)。用赖氨酸替换保存结合亲和力(肽67；27.4±3.8)，提示侧链中的正电荷是重要的。D-精氨酸将结合亲和力降低3倍(肽68；Ki＝89.4±2.3)。基于该结构-活性数据，测试了具有带正电荷侧链的许多非天然氨基酸(肽69-72)。具有这些氨基酸的肽具有略微更差或更好的亲和力，Ki在18.5和43.1nM之间。
接下来，通过将它们以10μM的浓度在人血浆中在37℃下温育不同的时间段，并且测量残留抑制活性，来测试双环肽69-72的稳定性。通过将样品在65℃下温育10分钟将血浆蛋白酶的活性热灭活。热处理不影响双环肽的活性。与肽1相比，四种肽中的两种具有改善的稳定性(图10a)。对于在N-末端处具有正精氨酸残基的肽71发现最长的半衰期。它具有21.7±2.5小时的半衰期，并且因此与肽1相比，5.5倍改善的稳定性。然后将正精氨酸取代与最佳改善肽1的抑制活性的氨基酸替换(在位置3中的4-氟-苯丙氨酸)组合。所得到的肽73也称为FXII801，具有3.90±0.43nM的Ki和15.5±3.9小时的血浆半衰期。
靶选择性
通过测量结构相关或功能重要的蛋白酶的抑制，来评价肽73的靶选择性，并且与肽1的特异性概况进行比较。在测试的最高浓度(40μM)下，10种蛋白酶中的8种被抑制小于20％。仅两种旁系同源蛋白酶被肽73抑制，即胰蛋白酶(1.30±0.01μM)和血浆激肽释放酶(45.1±1.5μM)。相同的两种蛋白酶也在相似的程度上被肽1抑制。这些结果因此显示针对FXIIa的亲和力可以得到改善，而针对其他蛋白酶的活性基本上保持不变。新的FXIIa抑制剂肽73因此显示出超过胰蛋白酶(血液中不存在的蛋白酶)300倍的良好选择性，以及超过其他血浆蛋白酶至少11,000倍的选择性。
内源性凝血途径的抑制
在体外凝血测定法中评价选择性压制内源性凝血途径的能力。活化部分凝血活酶时间(aPTT)和凝血酶原时间(PT)测量经由内源性(aPTT)或外源性途径(PT)开始凝血后的凝血时间。这些测试在不同浓度的FXIIa抑制剂存在下在人血浆中执行。选择性FXIIa抑制预期增加aPTT而不是PT。凝血测试用具有优异抑制活性的肽61和活性稍低但更稳定的变体肽73进行，并且用于与先前开发的FXIIa抑制剂肽1比较。肽抑制剂的存在以浓度依赖性方式延长aPTT(图11a)，而对于所测试的所有肽，PT在40μM的浓度下保持几乎不受影响(图11b)。在5μM肽抑制剂的浓度下，在120秒内不发生经由内源性途径的凝血。另外，在针对FXIIa的抑制活性和aPTT延长的程度之间存在相关性。与肽1相比，肽61和73显著增加aPTT延长。
实施例3–在FXII618的大环环内的改变
实施例3.1-材料与方法
材料
Fmoc-L-α-氨基酸、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)和Rink Amide AM树脂购自GL Biochem(中国)。Fmoc-β-氨基酸购自Chemimpex(USA)和Polypeptide(法国)。
肽合成
通过固相肽合成使用标准Fmoc程序(0.03mmol规模)在Advanced ChemTech 348-Ω肽合成仪(Aapptec,USA)上合成肽。Rink Amide AM树脂用作固体载体，并且DMF用作溶剂。使用HBTU/HOBt(4当量，在DMF中0.45M)和DIPEA(6当量，在DMF中0.5M)将每个氨基酸偶联两次(4当量，在DMF中0.2M)。在偶联反应后将树脂用DMF洗涤四次。用DMF中的20％(v/v)哌啶去除N-末端Fmoc保护基团(RT，2x5分钟，400rpm)。在脱保护后，将树脂用DMF洗涤5次。
来自树脂的肽切割
通过伴随振荡与5mL裂解混合物(90％v/v TFA、2.5％v/v 1,2-乙二硫醇、2.5％w/v苯酚、2.5％v/v茴香硫醚、2.5％v/v H2O)的2小时温育，将肽侧链脱保护并且从RinkAmide AM树脂切割。通过真空过滤去除树脂，并且用冰冷的二乙醚(50mL)沉淀肽，在-20℃下温育30分钟，并且以4000rpm(2700g)离心5分钟进行沉淀。弃去二乙醚，然后用乙醚将沉淀物洗涤两次。剩余的溶剂在RT下蒸发。
用TATA的肽环化：
将粗制肽(通常～50mg)溶解于6mL 33％MeCN和67％H2O(给出～3.5mM的浓度)中。向溶液中加入在MeCN中的1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA)(10mM，1.2当量)。通过加入脱气的水性NH4HCO3缓冲液(60mM，pH＝8.0)开始反应，直到1mM的最终肽浓度。将反应在30℃水浴下静置1小时，然后冻干。
通过反相HPLC的肽纯化
将修饰的肽粉末溶解于1mL DMSO、含有0.1％TFA的2mL MeCN和含有0.1％TFA的7mL H2O中，并且使用溶剂B(MeCN 0.1％v/v TFA)超过溶剂A(H2O,0.1％v/v TFA)的线性梯度(13分钟，15-28％，流速：20mL/分钟-1)，在制备型C18柱(Vydac C18TP1022 250,22mm,10mm)上进行纯化。通过ESI-MS分析鉴定所需产物的峰值且冻干。
蛋白酶抑制测定法
通过与蛋白酶温育并且使用荧光底物定量在各种肽浓度下的残留活性来测定合成的双环肽的抑制活性。对于每种肽制备在H2O中的2mM(按重量技)原液。对于该测定法，使用含有10mM TRIS、150mM NaCl、10mM MgCl(六水合物)、1mM CaCl2(二水合物)、0.01％(v/v)Triton X-100、0.1％(w/v)BSA的水性缓冲液，从肽原液制备连续稀释物，并且将pH调节至7.4。人β-FXIIa(HFXIIAB；Molecular Innovations)的最终浓度为1nM或0.5nM。取决于亲和力，制备在3000-0.1nM范围内的肽稀释度。荧光底物Boc-Q-G-R-AMC(Bachem)的最终浓度为50μM，并且最终的DMSO含量为5％。使用Infinite M200Pro板阅读器(Tecan)测量荧光，具有用于激发的滤光片368nm和用于发射的滤光片467nm。测量在25℃下执行60分钟，伴随每分钟读数。使用GraphPad Prism 5软件计算IC50和Ki值。
凝血测定法
根据制造商的说明书，使用STAGO START4凝血分析仪(Diagnostica)在人血浆中测定凝血时间(aPTT和PT)。使用Innovin(稳定的HEPES缓冲系统中的重组人组织因子、合成磷脂和钙；Dade Behring/Siemens)触发外源性凝血。使用Pathromtin*SL(Siemens)触发内源性凝血。本研究中使用的人单一供体血浆由Innovative research(USA)提供。
实施例3.2-结果与讨论
在实施例3.2中，参考编号1和74至107的肽。编号1的肽是FXII618。编号74至106的肽的结构特征和抑制能力也显示于图6中。肽编号107的结构特征和抑制能力在该实施例中详细描述。
在该实施例中，双环肽FXII抑制剂FXII618已通过改变主链而不是侧链而亲和力成熟(1)。具体地，提出在大环的不同位置中插入碳原子。在噬菌体展示筛选中不取样具有扩大的环大小的肽是合理的。进一步推测，在主链的一些位点中插入碳原子可能允许一些基团在环肽中的更好定位，并且这依次又可以潜在地改善现有分子相互作用的强度。插入或缺失在肽配体的大环中不同位置处的单个碳原子并未报道为用于改善结合亲和力的系统方法。在文献中描述的几个实例中，原子在其中肽被环化的位点处插入或缺失。
用于将碳原子插入肽的大环内的技术上简单且快速的策略是通过用在氨基和羧基之间含有另外碳原子的β-氨基酸替换规范的α-氨基酸(图12a)。β-氨基酸被广泛用于改善α-螺旋肽的稳定性。31-34在一些研究中，β-氨基酸除稳定性之外还具有改善的结合亲和力，如例如在甲状旁腺激素受体类似物-1激动剂的类似物35或基于Z-结构域的改造的VEGF信号传导抑制剂中。36对于FXII618(1)的亲和力成熟，选择用β-氨基酸取代在两个大环的不同位置中的α-氨基酸。
为了鉴定其中碳原子的插入可以潜在地改善FXII618的结合亲和力的氨基酸位置，37合成了两个系列的肽变体：一个具有替换为β-丙氨酸取代的个别氨基酸，并且另一个具有替换为甘氨酸的个别氨基酸(图6)。在特定位置中含有β-丙氨酸和甘氨酸的肽的比较允许理解如果另外的碳原子增强与FXII的结合，而不依赖于氨基酸侧链。将Phe3、Arg4和Leu5取代为β-丙氨酸(74、76、78)完全灭活抑制剂，不允许与这些位置中具有甘氨酸的肽的比较(75、77、79；在2μM下无抑制)。将Pro6取代为β-丙氨酸(80)和甘氨酸(81)分别将亲和力降低约5.5倍和22倍。对于β-丙氨酸变体发现在结合亲和力中的较小损失，指示在该位置中插入一个碳原子增强了与FXII的结合。最可能地，另外的弹性允许双环肽采用其中现有非共价相互作用中的一种或几种得到增强的构象。在Arg8处的氨基酸替换具有相反的效应，对于具有β-丙氨酸(82、83)的肽给予更大的亲和力下降。在位置Gln9和Leu10中，对β-丙氨酸和甘氨酸的取代将亲和力降低相同的约200倍(84、85、86、87)。最后，在Arg11位置中，对于β-丙氨酸(88)和甘氨酸变体(89)，亲和力损失很小且相似(5倍)。鉴于亲和力的小损失，存在具有精氨酸侧链的β-氨基酸插入可以改善FXII618(1)的亲和力的现实机会。
基于β-丙氨酸/甘氨酸筛选的结果，Pro6和Arg11视为用于插入具有合适侧链的β-氨基酸的最有希望的位点。β-氨基酸可以具有在α(C2)碳或β(C3)碳上的侧链，并且分别指名为β2-和β3-残基。鉴于这些碳原子可以具有R或S构型，对于任何给定的侧链，存在四种非对映异构体β-氨基酸。Pro6首先被一系列环状β-氨基酸取代(图6)。所有这些取代将抑制剂活性降低至少100倍或将其完全失活(90-94)。环状β-氨基酸显然对FXII618施加了构象约束，其阻碍与FXII的有效结合。随后合成其中Pro6被具有与碳3、碳2或氨基连接的甲基的无环β-氨基酸取代的肽(95-99；图6)。甲基可以替换由脯氨酸侧链中的三个碳原子之一形成的相互作用是合理的。这些肽中的三种具有在中等微摩尔范围内的抑制常数(95、98、99)，但它们都具有比在这个位置中具有β-丙氨酸的肽更弱的Ki。鉴定为耐受β-丙氨酸取代的第二个位置是Arg11。该氨基酸被替换为类似结构上最好的L-Arg的β3-氨基酸(C3中的S构型；(S)-β3-高精氨酸)(100)。该取代产生具有4倍改善的Ki的肽(双环肽称为FXII700；5.4±0.1nM；图6)。鉴于在该位置中具有β-丙氨酸和甘氨酸的两个肽具有可比较的亲和力，可能由(S)-β3-高精氨酸达到的大的亲和力改善起因于精氨酸侧链的相互作用，其对于β3-氨基酸优于L-Arg。
将碳原子插入双环肽FXII618(1)的环系统内的另一种有效的合成策略是用分别在侧链中具有一个和两个另外的碳的高半胱氨酸或5-巯基-正缬氨酸取代半胱氨酸。合成了FXII618(1)的六个变体，各自具有三个半胱氨酸之一被两个半胱氨酸同源物中的任一个替换(图6)。用高半胱氨酸替换Cys12将结合改善1.3倍(105的Ki＝16.3±3nM)。替换其他两个半胱氨酸降低了结合。具有优异Ki的双环肽105被命名为FXII701。随后合并了给予极好亲和力改善的两种修饰，Arg11至(S)-β3-高精氨酸和Cys12至高半胱氨酸。所得到的肽(107)具有18±2nM的Ki，显示两个修饰物不提供进一步的亲和力增强。鉴于Arg11和Cys12的接近性，它可以是用两种修饰实现的亲和力改善是相关的，并且因此不是附加的分子基础。推测在两个位置中插入碳原子允许在大环的该区域中的小构象变化是诱人的，并且改善了分子相互作用的质量，如例如精氨酸侧链的相互作用。
总之，通过将大环的大小改变一个或两个碳原子，可以改善体外进化的环肽配体的结合亲和力。这种化学空间不是通过筛选遗传编码的环肽文库进行取样，并且可能潜在地提供用于略微改善的配体的丰富来源是合理的。实际上，双环肽FXII抑制剂FXII618的仅34个肽变体的合成和筛选产生具有基本上改善的Ki的两种抑制剂。
实施例4-FXII618的连接分子的取代
肽FXII618(RCFRLPCRQLRCR)被下述接头修饰：
修改方案：
将合成的肽以1mM的最终浓度溶解于水性缓冲液NH4HCO3(60mM)pH 8.0中。将溶解于乙腈中的接头加入肽中，以得到1.5mM的最终浓度和20％乙腈。将反应溶液保持在30℃水浴中1小时。反应产物通过反相HPLC纯化。
蛋白酶抑制测定法：
在含有10mM TrisCl pH 7.4、150mM NaCl、10mM MgCl2、1mM CaCl2、0.1％w/v牛血清白蛋白(BSA)、0.01％v/v Triton-X100和5％v/v DMSO的缓冲液(150μL)中测量残留活性。人因子XIIβ(Innovative Research)10nM的最终浓度；Z-Gly-Gly-Arg-AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)衍生的荧光底物(Bachem)以50μM的最终浓度使用。荧光强度用TecanInfinite M 200Pro板阅读器(在368nm处的激发，在468nm处的发射)进行测量。读数一式三份进行测量。
根据Cheng-Prusoff方程计算抑制常数(Ki)：Ki＝IC50/(1+([S]0/KM))，其中IC50是抑制剂的功能强度，[S]0是总底物浓度，并且KM是米-曼二氏常数。关于Z-Gly-Gly-Arg-AMC的KM为180μM。
Ki值：
FXII618-TATA：24.9±5.7nM
FXII618-TBAT：338±32nM
FXII618-TBMT：1218±94nM
FXII618-TATA、FXII618-TBAT和FXII618-TBMT的活性和特异性也显示于图14中。
实施例5-FXII618中的精氨酸变化以及FXII618中的有利氨基酸取代组合
实施例5.1-FXII618的位置Arg8和Arg11中的氨基酸变化
这两个位置在第一次亲和力成熟的努力中没有被彻底修饰。合成在这两个位置具有取代的肽，并且测试人FXIIa、小鼠FXIIa的抑制和稳定性。下述肽显示对小鼠FXIIa的改善活性，并且具有改善得多的稳定性。
肽 改变的氨基酸 氨基酸取代 人FXIIa Ki[nM] 小鼠FXIIa Ki[nM]
JS17m Arg8 His 21.6±4 80±30
实施例5.2-FXII618的氨基酸Arg1的变化以改善蛋白水解稳定性
为了进一步增加抑制剂的蛋白水解稳定性，测试了在N-末端处的另外氨基酸。具体地，筛选D-氨基酸，其中在位置1中的L-Arg(Arg1)替换为两个D-氨基酸。在Arg1取代中，下述肽显示最好的抑制活性。
肽 改变的氨基酸 氨基酸取代 人FXIIa Ki[nM]
JS7m Arg1 D-Arg-D-Ser 18±4
实施例5.3-有利突变的组合
给出基本上改善的FXII618中的氨基酸残基概述：
Arg1→D-Arg-D-Ser(rs) Ki(人FXIIa)＝18±4nM
Phe3→4-氟-苯丙氨酸(F4F) Ki(人FXIIa)＝2.0±0.3nM
Arg8→His(H) Ki(人FXIIa)＝21.6±4nM
Arg11→(S)-β3-高精氨酸(Rb) Ki(人FXIIa)＝5.4±0.1nM
3或4个有利突变的组合：
序列 人FXIIa Ki[nM] t1/2人血浆(小时)
FXII618 RCFRLPCRQLRCR 22±4 3.9±1.9
JS33 rsCF4FRLPCHQLRbCR 0.36±0.2 144±30
JS34 rsCF4FRLPCHQLRCR 0.64±0.1 38.7
JS35 rsCF4FRLPCRQLRbCR 0.32±0.1 21.9
JS36 rsCFRLPCHQLRbCR 1.0±0.2 N.D
JS33-R rsCF4FRLPCHQLRbC 0.4±0.1 127
N.D.＝未测定
参考文献
(1)Behnke,C.A.,Yee,V.C.,Trong,I.L.,Pedersen,L.C.,Stenkamp,R.E.,Kim,S.S.,Reeck,G.R.和Teller,D.C.(1998)Structural determinants of the bifunctionalcorn Hageman factor inhibitor:x-ray crystal structure at 1.95A resolution,Biochemistry 37,15277-15288.
(2)Mahoney,W.C.,Hermodson,M.A.,Jones,B.,Powers,D.D.,Corfman,R.S.和Reeck,G.R.(1984)Amino acid sequence and secondary structural analysis of thecorn inhibitor of trypsin and activated Hageman Factor,J Biol Chem 259,8412-8416.
(3)Hansson,K.M.,Nielsen,S.,Elg,M.和Deinum,J.(2014)The effect of corntrypsin inhibitor and inhibiting antibodies for FXIa and FXIIa on coagulationof plasma and whole blood,Journal of thrombosis and haemostasis:JTH 12,1678-1686.
(4)Hagedorn,I.,Schmidbauer,S.,Pleines,I.,Kleinschnitz,C.,Kronthaler,U.,Stoll,G.,Dickneite,G.和Nieswandt,B.(2010)Factor XIIa inhibitor recombinanthuman albumin Infestin-4abolishes occlusive arterial thrombus formationwithout affecting bleeding,Circulation 121,1510-1517.
(5)Kleinschnitz,C.,Stoll,G.,Bendszus,M.,Schuh,K.,Pauer,H.U.,Burfeind,P.,Renne,C.,Gailani,D.,Nieswandt,B.和Renne,T.(2006)Targeting coagulationfactor XII provides protection from pathological thrombosis in cerebralischemia without interfering with hemostasis,The Journal of experimentalmedicine 203,513-518.
(6)Larsson,M.,Rayzman,V.,Nolte,M.W.,Nickel,K.F.,Bjorkqvist,J.,Jamsa,A.,Hardy,M.P.,Fries,M.,Schmidbauer,S.,Hedenqvist,P.,Broome,M.,Pragst,I.,Dickneite,G.,Wilson,M.J.,Nash,A.D.,Panousis,C.和Renne,T.(2014)A factor XIIainhibitory antibody provides thromboprotection in extracorporeal circulationwithout increasing bleeding risk,Science translational medicine 6,222ra217.
(7)Matafonov,A.,Leung,P.Y.,Gailani,A.E.,Grach,S.L.,Puy,C.,Cheng,Q.,Sun,M.F.,McCarty,O.J.,Tucker,E.I.,Kataoka,H.,Renne,T.,Morrissey,J.H.,Gruber,A.和Gailani,D.(2014)Factor XII inhibition reduces thrombus formation in aprimate thrombosis model,Blood 123,1739-1746.
(8)Renne,T.,Pozgajova,M.,Gruner,S.,Schuh,K.,Pauer,H.U.,Burfeind,P.,Gailani,D.和Nieswandt,B.(2005)Defective thrombus formation in mice lackingcoagulation factor XII,The Journal of experimental medicine 202,271-281.
(9)Woodruff,R.S.,Xu,Y.,Layzer,J.,Wu,W.,Ogletree,M.L.和Sullenger,B.A.(2013)Inhibiting the intrinsic pathway of coagulation with a factor XII-targeting RNA aptamer,Journal of thrombosis and haemostasis:JTH 11,1364-1373.
(10)Xu,Y.,Cai,T.Q.,Castriota,G.,Zhou,Y.,Hoos,L.,Jochnowitz,N.,Loewrigkeit,C.,Cook,J.A.,Wickham,A.,Metzger,J.M.,Ogletree,M.L.,Seiffert,D.A.和Chen,Z.(2014)Factor XIIa inhibition by Infestin-4:in vitro mode of actionand in vivo antithrombotic benefit,Thrombosis and haemostasis 111,694-704.
(11)Renne,T.,Schmaier,A.H.,Nickel,K.F.,Blomback,M.和Maas,C.(2012)Invivo roles of factor XII,Blood 120,4296-4303.
(12)Endler,G.,Marsik,C.,Jilma,B.,Schickbauer,T.,Quehenberger,P.和Mannhalter,C.(2007)Evidence of a U-shaped association between factor XIIactivity and overall survival,Journal of thrombosis and haemostasis:JTH 5,1143-1148.
(13)Schloesser,M.,Zeerleder,S.,Lutze,G.,Halbmayer,W.M.,Hofferbert,S.,Hinney,B.,Koestering,H.,Lammle,B.,Pindur,G.,Thies,K.,Kohler,M.和Engel,W.(1997)Mutations in the human factor XII gene,Blood 90,3967-3977.
(14)Halbmayer,W.M.,Haushofer,A.,Schon,R.,Mannhalter,C.,Strohmer,E.,Baumgarten,K.和Fischer,M.(1994)The prevalence of moderate and severe FXII(Hageman factor)deficiency among the normal population:evaluation of theincidence of FXII deficiency among 300healthy blood donors,Thrombosis andhaemostasis 71,68-72.
(15)Campos,I.T.,Amino,R.,Sampaio,C.A.,Auerswald,E.A.,Friedrich,T.,Lemaire,H.G.,Schenkman,S.和Tanaka,A.S.(2002)Infestin,a thrombin inhibitorpresents in Triatoma infestans midgut,a Chagas'disease vector:gene cloning,expression and characterization of the inhibitor,Insect Biochem Mol Biol 32,991-997.
(16)Campos,I.T.,Tanaka-Azevedo,A.M.和Tanaka,A.S.(2004)Identificationand characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagousinsect,Triatoma infestans (Hemiptera:Reduviidae),FEBS letters 577,512-516.(17)Robert,S.,Bertolla,C.,Masereel,B.,Dogne,J.M.和Pochet,L.(2008)Novel 3-carboxamide-coumarins as potent and selective FXIIa inhibitors,Journal ofmedicinal chemistry 51,3077-3080.
(18)Baeriswyl,V.,Calzavarini,S.,Gerschheimer,C.,Diderich,P.,Angelillo-Scherrer,A.和Heinis,C.(2013)Development of a selective peptidemacrocycle inhibitor of coagulation factor XII toward the generation of asafe antithrombotic therapy,Journal of medicinal chemistry 56,3742-3746.
(19)Chen,S.,Bertoldo,D.,Angelini,A.,Pojer,F.和Heinis,C.(2014)Peptideligands stabilized by small molecules,Angewandte Chemie 53,1602-1606.
(20)Chen,S.,Morales-Sanfrutos,J.,Angelini,A.,Cutting,B.和Heinis,C.(2012)Structurally diverse cyclisation linkers impose different backboneconformations in bicyclic peptides,Chembiochem 13,1032-1038.
(21)Hojima,Y.,Pierce,J.V.和Pisano,J.J.(1980)Hageman factor fragmentinhibitor in corn seeds:purification and characterization,Thrombosis research20,149-162.
(22)Spronk,H.M.,Dielis,A.W.,Panova-Noeva,M.,van Oerle,R.,Govers-Riemslag,J.W.,Hamulyak,K.,Falanga,A.和Cate,H.T.(2009)Monitoring thrombingeneration:is addition of corn trypsin inhibitor needed？,Thrombosis andhaemostasis 101,1156-1162.
(23)Laskowski,M.和Qasim,M.A.(2000)What can the structures of enzyme-inhibitor complexes tell us about the structures of enzyme substratecomplexes？,Biochimica et biophysica acta 1477,324-337.
(24)Van Veen,J.J.,Gatt,A.,Cooper,P.C.,Kitchen,S.,Bowyer,A.E.和Makris,M.(2008)Corn trypsin inhibitor in fluorogenic thrombin-generationmeasurements is only necessary at low tissue factor concentrations andinfluences the relationship between factor VIII coagulant activity andthromblogram parameters,Blood Coagul Fibrin 19,183-189.
(25)Campo,G.,Pavasini,R.,Pollina,A.,Fileti,L.,Marchesini,J.,Tebaldi,M.和Ferrari,R.(2012)Thrombin generation assay:a new tool to predict andoptimize clinical outcome in cardiovascular patients？,Blood coagulation&fibrinolysis:an international journal in haemostasis and thrombosis 23,680-687.
(26)Chitlur,M.,Rivard,G.E.,Lillicrap,D.,Mann,K.,Shima,M.,Young,G.和Haemostasi,I.S.T.(2014)Recommendations for performing thromboelastography/thromboelastometry in hemophilia:communication from the SSC of the ISTH,Journal of Thrombosis and Haemostasis 12,103-106.
(27)Alibeik,S.,Zhu,S.,Yau,J.W.,Weitz,J.I.和Brash,J.L.(2011)Surfacemodification with polyethylene glycol-corn trypsin inhibitor conjugate toinhibit the contact factor pathway on blood-contacting surfaces,Actabiomaterialia 7,4177-4186.
(28)Yau,J.W.,Stafford,A.R.,Liao,P.,Fredenburgh,J.C.,Roberts,R.,Brash,J.L.和Weitz,J.I.(2012)Corn trypsin inhibitor coating attenuates theprothrombotic properties of catheters in vitro and in vivo,Acta biomaterialia8,4092-4100.
(29)Rentero Rebollo,I.和Heinis,C.(2013)Phage selection of bicyclicpeptides,Methods 60,46-54.
(30)Hemker,H.C.,Giesen,P.,Al Dieri,R.,Regnault,V.,de Smedt,E.,Wagenvoord,R.,Lecompte,T.和Beguin,S.(2003)Calibrated automated thrombingeneration measurement in clotting plasma,Pathophysiology of haemostasis andthrombosis 33,4-15.
(31)Seebach,D.；Matthews,J.L.beta-peptides:a surprise at everyturn.Chemical Communications 1997,2015-2022.
(32)Horne,W.S.；Johnson,L.M.；Ketas,T.J.；Klasse,P.J.；Lu,M.；Moore,J.P.；Gellman,S.H.Structural and biological mimicry of protein surface recognitionby alpha/beta-peptide foldamers.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 2009,106,14751-14756.
(33)Johnson,L.M.；Gellman,S.H.alpha-Helix Mimicry with alpha/beta-Peptides.Methods in Protein Design 2013,523,407-429.
(34)Johnson,L.M.；Barrick,S.；Hager,M.V.；McFedries,A.；Homan,E.A.；Rabaglia,M.E.；Keller,M.P.；Attie,A.D.；Saghatelian,A.；Bisello,A.；Gellman,S.H.APotent alpha/beta-Peptide Analogue of GLP-1 with Prolonged Action inVivo.Journal of the American Chemical Society 2014,136,12848-12851.
(35)Cheloha,R.W.；Maeda,A.；Dean,T.；Gardella,T.J.；Gellman,S.H.Backbonemodification of a polypeptide drug alters duration of action in vivo.NatureBiotechnology 2014,32,653-+.
(36)Checco,J.W.；Kreitler,D.F.；Thomas,N.C.；Belair,D.G.；Rettko,N.J.；Murphy,W.L.；Forest,K.T.；Gellman,S.H.Targeting diverse protein-proteininteraction interfaces with alpha/beta-peptides derived from the Z-domainscaffold.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 2015,112,4552-4557.
(37)Baeriswyl,V.；Calzavarini,S.；Chen,S.；Zorzi,A.；Bologna,L.；Angelillo-Scherrer,A.；Heinis,C.A Synthetic Factor XIIa Inhibitor BlocksSelectively Intrinsic Coagulation Initiation.ACS Chem Biol 2015,10,1861-70.
序列表
<110> 洛桑联邦政府综合工科学校（EPFL)
<120> 酶活化因子XII (FXIIa)的新型抑制剂
<130> Y1452 PCT
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<151> 2015-04-28
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Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr
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<221> VARIANT
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<221> VARIANT
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<220>
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Xaa
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<213> Artificial Sequence
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Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr
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<221> VARIANT
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Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr
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<221> VARIANT
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Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr
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<223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro,
Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr
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Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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Ile Cys Pro Arg Leu Pro Cys Ser Gln Leu Arg Cys Ala
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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Arg Cys Phe Arg Leu Pro Cys Ala Gln Leu Arg Cys Arg
1 5 10

Claims (15)

1.一种包含肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X9)l(X10)(X11)(X12)(X13)(X14)k(X15)(X16)或由肽(X1)(X2)(X3)n(X4)RL(X5)(X6)m(X7)(X9)l(X10)(X11)(X12)(X13)(X14)k(X15)(X16)组成的凝血酶活化因子XII(FXIIa)的双环抑制剂，
其中
(X1)存在或不存在，并且如果存在，则为氨基酸；
(X2)是具有侧链的氨基酸；
(X3)是氨基酸，并且n在0和3之间，优选0或1，且最优选0；
(X4)是脂肪族L-氨基酸或环状L-氨基酸，优选L、P或芳香族L-氨基酸，且最优选芳香族L-氨基酸；
(X5)是氨基酸；
(X6)是氨基酸，并且m在0和3之间，优选0或1，且最优选0；
(X7)是具有侧链的氨基酸；
(X9)是氨基酸，并且l在0和3之间，优选0或1，且最优选0；
(X10)是氨基酸；
(X11)是氨基酸，优选Q；
(X12)是疏水性L-氨基酸，优选脂肪族L-氨基酸，且最优选为L；
(X13)是氨基酸；
(X14)是氨基酸，并且k在0和3之间，优选0或1，且最优选0，
(X15)是具有侧链的氨基酸；和
(X16)存在或不存在，并且如果存在，则为氨基酸；和
其中(X2)、(X7)和(X15)的侧链经由连接分子连接，所述连接分子具有至少三个官能团，每个官能团与(X2)、(X7)和(X15)侧链之一形成共价键。
2.权利要求1的抑制剂，其中(X4)选自
L、P、F、W、Y、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、3-氟-苯丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸和2-硝基-苯丙氨酸，
优选选自F、W、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸和2-硝基-苯丙氨酸，
更优选选自F、W、2-萘基丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸和2-硝基-苯丙氨酸，和
最优选选自2-萘基丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、2-氨基-3-(吡啶-3-基)丙酸、2-氟-苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸和2-硝基-苯丙氨酸。
3.权利要求1或2的抑制剂，其中(X5)是疏水性L-氨基酸或极性、不带电荷的L-氨基酸，优选疏水性L-氨基酸，更优选S、A、L或P，且最优选L或P。
4.权利要求1至3中任一项的抑制剂，其中(X2)、(X7)和(X15)的侧链包含官能团，所述官能团优选对于(X2)、(X7)和(X15)各自独立地选自-NH2、-COOH、-SH、烯烃、炔烃、叠氮化物和氯乙酰胺，优选-NH2和-SH，且最优选-SH。
5.权利要求1至3中任一项的抑制剂，其中(X2)、(X7)和(X15)各自独立地为K、鸟氨酸、硫代赖氨酸、2,3-二氨基丙酸、二氨基丁酸、D、E、C、高半胱氨酸、青霉胺或炔丙基甘氨酸，优选C或高半胱氨酸，且最优选都为C。
6.权利要求1至3中任一项的抑制剂，其中
(X2)是5-巯基正缬氨酸、高半胱氨酸或C，优选高半胱氨酸或C，且最优选C；和/或
(X7)是高半胱氨酸或C，优选C；和/或
(X15)是5-巯基-正缬氨酸、高半胱氨酸或C，优选高半胱氨酸或C。
7.权利要求1至6中任一项的抑制剂，其中
(X1)是D-Arg、高精氨酸、L、正精氨酸、4-胍基苯丙氨酸、高赖氨酸、D-Arg-D-Ser或L-Arg，优选高精氨酸、L、正精氨酸、4-胍基苯丙氨酸、高赖氨酸、D-Arg-D-Ser或L-Arg，且最优选高赖氨酸、D-Arg-D-Ser或L-Arg；和/或
(X10)是G、H或R，优选H或R；
(X13)是A、G、(S)-β3-高精氨酸或R，优选(S)-β3-高精氨酸或R，和/或
(X16)是R或不存在。
8.权利要求1至7中任一项的抑制剂，其中所述连接分子选自1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA)、1,3,5-三(氯乙酰基)-1,3,5-三嗪烷(TCAT)、1,3,5-三(溴乙酰基)-1,3,5-三嗪烷(TBAT)、1,3,5-三(溴甲基)苯(TBMB)和2,4,6-三(溴甲基)-1,3,5-三嗪(TBMT)，且优选1,3,5-三丙烯酰基-1,3,5-三嗪烷(TATA)。
9.权利要求1至8中任一项的抑制剂，其中下述项(i)至(iv)中的至少一个适用：
(i)(X1)是D-Arg-D-Ser，
(ii)(X4)是4-氟-苯丙氨酸，
(iii)(X10)是H，和/或
(iv)(X13)是(S)-β3-高精氨酸；
其中(X16)任选不存在，并且所述连接分子优选为TATA。
10.权利要求1至9中任一项的抑制剂，其中所述抑制剂对于FXIIa具有小于100nM的抑制常数(Ki)。
11.一种抑制FXIIa的酶促活性的离体方法，其包括使权利要求1至10中任一项的抑制剂与FXIIa接触，其中FXIIa优选存在于血液、血浆或血清样品中。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1至10中任一项的抑制剂。
13.权利要求1-10中任一项的抑制剂，其用于治疗或预防血栓性疾病，优选选自血栓、深静脉血栓形成、遗传性血管性水肿和糖尿病性黄斑水肿的血栓性疾病。
14.权利要求1至10中任一项的抑制剂用于涂布器皿、管、针、注射器、膜或医疗装置的用途。
15.一种用于测试血液凝固的试剂盒，其包含权利要求1至10中任一项的抑制剂。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113474045A (zh) * 2018-12-21 2021-10-01 拜斯科技术开发有限公司 Pd-l1特异性的双环肽配体

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7301757B2 (ja) 2017-06-26 2023-07-03 バイスクルアールディー・リミテッド 検出可能部分を持つ二環式ペプチドリガンドおよびその使用
JP2020529427A (ja) 2017-08-04 2020-10-08 バイスクルテクス・リミテッド Ｃｄ１３７に対して特異的な二環式ペプチドリガンド
GB201721265D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for EphA2
TWI825046B (zh) * 2017-12-19 2023-12-11 英商拜西可泰克斯有限公司 Epha2特用之雙環胜肽配位基
GB201810327D0 (en) * 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to IL-17
GB201810316D0 (en) 2018-06-22 2018-08-08 Bicyclerd Ltd Peptide ligands for binding to EphA2
US11180531B2 (en) * 2018-06-22 2021-11-23 Bicycletx Limited Bicyclic peptide ligands specific for Nectin-4
GB201810329D0 (en) * 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to integrin avB3
GB201810320D0 (en) * 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to CD38
JP7135620B2 (ja) * 2018-09-07 2022-09-13 ソニーグループ株式会社 血液凝固系解析装置、血液凝固系解析方法及び血液凝固系解析プログラム
GB201900530D0 (en) * 2019-01-15 2019-03-06 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for CD38
TW202110485A (zh) 2019-07-30 2021-03-16 英商拜西可泰克斯有限公司 異質雙環肽複合物
US20230021419A1 (en) * 2019-12-16 2023-01-26 Bicycletx Limited Bicyclic peptide ligands specific for il-17
GB201918557D0 (en) * 2019-12-16 2020-01-29 Bicycle Tx Ltd Bicyclic peptide ligands specific for IL-17
GB201918559D0 (en) * 2019-12-16 2020-01-29 Bicycle Tx Ltd Bicyclic peptide ligands specific for IL-17
GB201918558D0 (en) * 2019-12-16 2020-01-29 Bicycle Tx Ltd Bicyclic peptide ligands specific for IL-17
US20230117920A1 (en) * 2019-12-27 2023-04-20 The University Of Tokyo Library Construction Method, Cyclic Peptide, FXIIa Binder and IFNGR1 Binder

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006066878A1 (en) * 2004-12-23 2006-06-29 Csl Behring Gmbh Prevention of thrombus formation and/or stabilization
CN101538317A (zh) * 2007-02-08 2009-09-23 中国人民解放军总医院 凝血酶直接抑制剂多肽水合盐及合成方法
EP2371857A1 (en) * 2010-04-01 2011-10-05 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for treating interstitial lung disease

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006066878A1 (en) * 2004-12-23 2006-06-29 Csl Behring Gmbh Prevention of thrombus formation and/or stabilization
CN101538317A (zh) * 2007-02-08 2009-09-23 中国人民解放军总医院 凝血酶直接抑制剂多肽水合盐及合成方法
EP2371857A1 (en) * 2010-04-01 2011-10-05 CSL Behring GmbH Factor XII inhibitors for treating interstitial lung disease
CN103068845A (zh) * 2010-04-01 2013-04-24 尤斯图斯-李比希-吉森大学 用于治疗间质性肺病的因子xii抑制剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHIYU CHEN等: "Structurally Diverse Cyclisation Linkers Impose Different Backbone Conformations in Bicyclic Peptides", 《CHEMBIOCHEM》 *
VANESSA BAERISWYL等: "Development of a Selective Peptide Macrocycle Inhibitor of Coagulation Factor XII toward the Generation of a Safe Antithrombotic Therapy", 《JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113474045A (zh) * 2018-12-21 2021-10-01 拜斯科技术开发有限公司 Pd-l1特异性的双环肽配体

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