MX2014014384A - Dominios de union a albumina consenso no naturales. - Google Patents

Abstract

Dominios de unión a albúmina no natural, polinucleótidos que codifican a los mismos y métodos para hacer y usar estos dominios y polinucleótidos, son útiles para controlar la vida media de moléculas terapéuticas para pacientes.

Description

DOMINIOS DE UNIÓN A ALBÚMINA CONSENSO NO NATURALES CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con dominios de unión a albúmina y metodos para elaborarlos y usarlos. Más particularmente, la presente invención está dirigida a una secuencia consenso de dominio de unión a albúmina no natural y variantes de esta, como se describe en la presente descripción.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La eliminación rápida de moléculas bioterapéuticas por medio de aclaramiento renal contribuye a la eficacia clínica limitada o a una dosificación más frecuente para el paciente. El aclaramiento renal debido al filtrado glomerular está más asociado con agentes bioterapéuticos menores, debido a que las velocidades de filtración renal se reducen en gran medida para las moléculas con un peso molecular mayor que 50,000 dalton (Kontermann, Curr Opin Biotechnol 22:868-76, 2011). Diversos medicamentos bioterapéuticos aprobados contienen porciones activas que, por sí mismas, caen por debajo del límite de filtración y, por lo tanto, se eliminan rápidamente. Para superar esta limitación, se ha introducido varias teenologías para incrementar efectivamente el tamaño de la molécula terapéutica para reducir la filtración renal y la vida media resultante.

La pegilación (PEG) de medicamentos es una manera efectiva para incrementar el radio hidrodinámico de la proteína y reducir el filtrado glomerular. Una o muchas cadenas de PEG pueden acoplarse a la proteína, con la máxima frecuencia, por medio de la combinación con grupos libres de tiol o amina en la superficie de la proteína. Todas las versiones pegiladas de adenosina deaminasa, L-asparaginasa, interferón alfa-2b, G-CSF, hormona humana del crecimiento, eritropoyetina, uricasa y un fragmento de anticuerpos anti-TNFalfa han sido aprobadas para el tratamiento humano (Kontermann, Curr Opin Biotechnol 22:868-76, 2011). Las limitaciones de la pegilación incluyen la producción de productos heterogeneos y la dificultad para controlar la cantidad de moléculas de PEG unidas a ciertas proteínas. La pegilación introduce una combinación adicional, así como etapas de purificación a la producción de proteínas terapéuticas, lo que produce rendimientos reducidos y costos incrementados de los productos. La pegilación puede producir, además, vacuolización tubular renal en animales y pacientes debido a que las cadenas de PEG son no degradables en los riñones (Gaberc-Porekar et al., Curr Opin Drug Discov Devel 11:242-250, 2008).

El acoplamiento de un medicamento a una región Fe de los anticuerpos para generar proteínas de fusión de Fe puede usarse para incrementar la vida media en suero de las moléculas terapéuticas. Las inmunoglobulinas pueden mostrar vidas medias prolongadas de aproximadamente varias semanas en humanos debido a su gran tamaño y recielado por medio de FcRn (Kuo et al., J Clin Immunol 30:777-789, 2010). El receptor 2 del TNF, LFA-3, CTLA-4, IL-1R y moleculas del péptido mimético de TPO son todos terapias aprobadas producidas como fusiones de Fe (Kontermann, Curr Opin Biotechnol 22:868-76, 2011). Las proteínas de fusión de Fe no son ideales para todas las clases de medicamentos por diversas razones. La naturaleza homodimérica de la región Fe causa la producción de una proteína terapéutica dimérica, lo cual posiblemente produce la activación celular debido a la agrupación de receptores. Las fusiones de Fe pueden producirse, además, en sistemas de expresión de mamíferos que podrían ser más costosos que los sistemas de procariotas.

Además de Fe, la albúmina muestra una vida media prolongada in vivo debido al reciclado de FcRn. A una concentración de aproximadamente 40 g/l, la albúmina sérica humana (HSA, por sus siglas en inglés) es la proteína más abundante que se encuentra en la sangre. El reciclado de FcRn produce una vida media prolongada de aproximadamente 19 días en humanos. Adicionalmente, los estudios de biodistribución sugieren que la albúmina puede distribuirse dentro del cuerpo hasta áreas importantes para centrarse en la enfermedad, tal como articulaciones inflamadas o tumores (Wunder et al., J Immunol 170:4793-4801, 2003). Por lo tanto, la vida media en suero de muchas proteínas se ha incrementado al producirlas ya sea como fusiones C-terminal o N-terminal a HSA. Las fusiones exitosas incluyen interferón alfa (Flisiak and Flisiak, Expert Opin Biol Ther 10:1509-1515, 2010), hormona humana del crecimiento (Osborn et al., Eur J Pharmacol 456:149- 158, 2002), factor de necrosis tumoral (Muller et al., Biochem Biophys Res Commun 396:793-799, 2010), factor de coagulación IX (Metzner et al., Thromb Haemost 102: 634-644, 2009), factor de coagulación Vlla (Schulte, Thromb Res 122 Suppl 4: S14-19, 2008), insulina (Duttaroy et al., Diabetes 54:251-258, 2005), uroquinasa (Bretón et al., Eur J Biochem 231 :563-569, 1995), hirudina (Sheffield et al., Blood Coagul Fibrinolysis 12:433-443, 2001) y fragmentos de anticuerpos biespecíficos (Muller et al., J Biol Chem 282:12650-12660, 2007). Las proteínas de fusión de HSA pueden tener vidas medias en suero prolongadas; sin embargo, la producción a gran escala de estas proteínas de fusión se limita predominantemente a sistemas de expresión de levadura. Además, el gran tamaño de la HSA puede provocar una perdida de actividad del medicamento terapéutico debido al impedimento esté rico.

Las proteínas terapéuticas pueden producirse, además, como proteínas de fusión hasta péptidos o proteínas que se unen a la albúmina sérica en el flujo sanguíneo para incrementar su vida media. Tales péptidos de unión a la albúmina incluyen péptidos limitados a cisteína o fragmentos de anticuerpos para albúmina. La expresión de un fragmento de anticuerpos Fab como una fusión a los péptidos limitados a cisteína incrementó significativamente la vida media en suero del Fab (Dennis et al., J Biol Chem 277:35035-35043, 2002; patente de los Estados Unidos núm. 2004/0253247A1). El acoplamiento del péptido limitado a cisteína a un fragmento de anticuerpos produjo una mejor acumulación tumoral pico y una distribución tumoral más homogénea en comparación con las moléculas Fab y mAb que tienen como objetivo el mismo antígeno (Dennis et al., Cáncer Res 67:254-261 , 2007; patente de los Estados Unidos núm. 2005/0287153A1). Además, varios fragmentos de anticuerpos que se unen, específicamente, a albúmina se han acoplado a las porciones terapéuticas para incrementar la vida media del medicamento terapéutico. Un fragmento de anticuerpos VHH de camélido (Nanobodies®) que se une a HSA se fusionó con otro Nanobody® que se une a TNF-alfa (Coppieters et al., Arthritis Rheum 54: 1856-1866, 2006) o anti-EGFR Nanobodies® (Tijink et al., Mol Cáncer Ther 7:2288-2297, 2008). Se ha generado anticuerpos del dominio anti-albúmina (dAbs) que se unen a albúmina y se han fusionado para, por ejemplo, el receptor de interleucina-1 (Holt et al., Protein Eng Des Sel 21 :283-288, 2008) y el interferón alfa 2b (Walker et al., Protein Eng Des Sel 23:271-278, 2010) para mejorar su vida media.

Varios dominios de proteína de origen natural a partir de bacterias son conocidos por interactuar con albúmina, probablemente para ayudar a tales bacterias a distribuirse por todo el organismo huésped. Estos son dominios de proteína con un grupo de 3 hélices con aproximadamente 6 kDa de tamaño, que usan un lado del grupo de 3 hélices para interactuar con la albúmina sérica (Cramer et al., FEBS Lett 581 :3178-3182, 2007; Lejon et al., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 64:64-69, 2008; Johansson et ai, FEBS Lett 374:257-261 , 1995; Johansson et al., J Mol Biol 266:859-865, 1997; Johansson et al., J Biol Chem 277:8114-8120, 2002). Tal dominio de unión a albúmina derivado de proteína G del estreptococo (Jonsson et al., Protein Eng Des Sel 21:515-527, 2008) se ha usado ampliamente para prolongar la vida media en suero de las proteínas. Se ha demostrado que la fusión a este dominio incrementa la vida media del receptor del complemento soluble tipo 1 (Makrides et al., J Pharmacol Exp Ther 277:534-542, 1996), un anticuerpo biespecífico (Stork et al., Protein Eng Des Sel 20:569-576, 2007), CD4 (Nygren et al., Vaccines 91:363-368, 1991; patente de los Estados Unidos núm. 6267,964B1), PÍ155/RESA (Stahl et al., J Immunol Methods 124:43-52, 1989), G-CSF (Frejd, F. PEGS Europe, 5 de octubre de 2010) y moleculas Affibody que se unen a varios objetivos (Andersen et al., J Biol Chem 286:5234-5241, 2011) (Frejd, F. PEGS Europe, 5 de octubre de 2010). Sin embargo, la producción de anticuerpos contra el dominio se ha reportado en pacientes y, por lo tanto, el uso de la molécula para aplicaciones terapéuticas puede ser desafiante (Goetsch et al., Clin Diagn Lab Immunol 10:125-132, 2003; Libón etal., Vaccine 17:406-414, 1999).

Varios dominios de proteínas o péptidos que se unen a albúmina tienen la capacidad de prolongar la vida media en suero y producir un patrón de biodistribución más favorable de las proteínas terapéuticas. Para usar estos dominios de unión a albúmina en aplicaciones terapéuticas, se debe cumplir con varios requisitos biofísicos, tales como niveles de expresión altos en un huésped, solubilidad y estabilidad, e inmunogenicidad mínima. La porción de unión a albúmina debe unirse a la albúmina sérica con una afinidad que equilibra efectivamente la vida media en suero y la biodistribución con actividad de la porción terapeutica cuando está unida y cuando no está unida a albúmina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención es una proteína que comprende un dominio de unión a albúmina no natural aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21. Otro aspecto de la presente invención es un dominio de unión a albúmina aislado no natural que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 21.

Otro aspecto adicional de la presente invención es un dominio de unión a albúmina aislado no natural que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21 que tiene sustituciones en los residuos 1, 2, 3, 4, 5 y/o 6 y, preferentemente, en donde las sustituciones en los residuos 1, 2, 3, 4, 5 y/o 6 pueden producirse en las posiciones de aminoácidos Y21, Y22, L25, K30, T31 , E33, G34, A37, L38, E41, I42 y/o A45 de la SEQ ID NO: 21 o en las posiciones de aminoácidos Y21, Y22, K30, T31, A37 y/o E41 de la SEQ ID NO: 21.

Un aspecto adicional de la presente invención es un dominio de unión a albúmina aislado no natural que comprende una secuencia de aminoácidos: LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6lLKA (SEQ ID NO: 22); en donde Xi, X2, X3, X4, X5 y Cb pueden ser cualquier aminoácido o un subgrupo de ciertos aminoácidos.

En un aspecto adicional de la presente invención, el dominio de unión a albúmina aislado no natural comprende una extensión de 5 aminoácidos en su extremo N-terminal.

Otro aspecto de la presente invención es un método para elaborar un dominio de unión a albúmina no natural de la presente invención; el método comprende proporcionar un polinucleótido que codifica el dominio de unión a albúmina no natural; expresar el polinucleótido en un huésped o in vitro ; y recuperar el dominio de unión a albúmina no natural. Otro aspecto de la presente invención es un polinucleótido aislado que codifica los dominios de unión a albúmina de la presente invención. Otro aspecto de la presente invención es un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido de la SEQ ID NO: 35.

Otro aspecto de la presente invención es un vector aislado que comprende el polinucleótido aislado de la presente invención y una célula huésped que comprende el vector aislado de la presente invención.

Otro aspecto de la presente invención es una proteína de fusión que comprende una proteína de unión a albúmina de la presente invención y un agente bioactivo.

Otro aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de la presente invención y por lo menos un portador farmaceuticamente aceptable o diluyente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra un análisis de SDS-PAGE de ABDCon purificado. Las muestras son de la siguiente manera banda 1) productor de SeeBlue plus 2, 2) lisado celular total, 3) lisado celular soluble, 4) flujo directo en columna, 5-12) fracciones eluidas. Los pesos moleculares de algunas de las franjas marcadoras se muestran a la izquierda.

La Figura 2 muestra una espectrometría de masas de ionización por electrorrociado de la muestra del ABDCon purificado.

La Figura 3 muestra un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del ABDCon purificado que se lleva a cabo en PBS.

Las Figuras 4A y 4B muestran la temperatura de fusión (Figura 4A) y la reversibilidad del desplegamiento de ABDCon (Figura 4B) según la DSC en PBS. Los datos sustraídos de los valores iniciales normalizados para la primera exploración se muestran en la Figura 4A. Después de la primera exploración, la muestra se enfrió hasta 20 °C y la exploración se repitió para determinar la reversibilidad del plegamiento. Los rastros de los datos crudos para la primera y la segunda exploración están superpuestos en la Figura 4B.

La Figura 5 muestra la farmacocinética de una proteína de fusión Tencon25-ABDCon en ratones cuando se dosifica a 2 mg/kg por vía intravenosa.

La Figura 6 muestra la farmacocinética de una molécula de Tencon25 (residuos 1-90 de la SEQ ID NO: 39) fusionada a ABDCon (SEQ ID NO: 21), ABDCon3 (SEQ ID NO: 26), ABDcon5 (SEQ ID NO: 28), ABDCon7 (SEQ ID NO: 30) y ABDCon9 (SEQ ID NO: 32) en ratones cuando se dosifica a 2 mg/kg por vía intravenosa.

Las Figuras 7A y 7B muestran la estabilidad de (Figura 7A) ciertas proteínas de fusión de ABDCon del dominio FN3 (SEQ ID NO: 1) y (Figura 7B) proteínas de fusión del dominio FN3-ABDCon12 (SEQ ID NO: 46) que tienen una hélice en el extremo N-terminal extendida en ABDCon cuando se incuba a 37 °C durante 0 o 28 días en PBS.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El término “dominio de unión a albúmina” o “dominio”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un polipéptido que se une a albúmina in vivo o in i /¡tro. La albúmina puede derivarse de cualquier especie animal, por ejemplo, humano, mono o roedor.

El término “KD”, como se usa en la presente descripción, se refiere a la constante de disociación entre la albúmina y el dominio de unión a albúmina.

El término “Kon”, como se usa en la presente descripción, se refiere a la constante de velocidad de asociación de un dominio de unión a albúmina a la albúmina para formar un complejo de dominio de unión a albúmina/albúmina.

El termino “K0ff”, como se usa en la presente descripción, se refiere a la constante de la velocidad de disociación de un dominio de unión a albúmina a partir del complejo de dominio de unión a albúmina/albúmina.

El término “no natural”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un dominio que es sintético, es decir, que tiene una secuencia de aminoácidos no presente en polipéptidos naturales.

El término “que sustituye” o “sustituciones”, como se usa en la presente descripción, se refiere a alterar, eliminar o insertar, o a las alteraciones, deleciones o inserciones de uno o más aminoácidos o nucleótidos en una secuencia de polipéptidos o de polinucleótidos para generar una variante de esa secuencia.

El término “variante”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un polipéptido o un polinucleótido que difiere de un polipéptido de referencia o un polinucleótido de referencia en una o más modificaciones, por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones.

El término “agente bioactivo”, como se usa en la presente descripción, se refiere a proteínas, anticuerpos, péptidos, nucleótidos, productos farmacéuticos moleculares pequeños y similares que cuando se administran a un paciente animal proporcionan un beneficio a ese paciente. Este término incluye las porciones producidas sintéticamente, derivadas naturalmente o producidas de manera recombinante. Los agentes bioactivos pueden ser análogos, derivados, agonistas, antagonistas, enantiómeros o sales farmaceuticamente aceptables de agentes bioactivos.

El término “estabilidad”, como se usa en la presente descripción, se refiere a la capacidad de una molécula de mantener un estado plegado en condiciones fisiológicas de manera que retiene por lo menos una de sus actividades funcionales normales, por ejemplo, la vida media.

El término “vector” se refiere a un polinucleótido con la capacidad de duplicarse dentro de un sistema biológico o que puede moverse entre dichos sistemas. Los polinucleótidos vectores contienen, típicamente, elementos tales como orígenes de repllcación, señal de poliadenilación o marcadores de selección, que funcionan para facilitar la duplicación o mantenimiento de esos polinucleótidos en un sistema biológico. Los ejemplos de tales sistemas biológicos pueden incluir una célula, bacteria, virus, animal, planta y sistemas biológicos reconstituidos que usan componentes biológicos con la capacidad de duplicar un vector. El polinucleótido que comprende un vector puede ser moléculas de ADN o ARN o un híbrido de éstas.

El término “vector de expresión” significa un vector que puede usarse en un sistema biológico o en un sistema biológico reconstituido para dirigir la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos presente en el vector de expresión.

El término “unido operativamente”, como se usa en la presente descripción, se refiere al posicionamiento de componentes de manera que funcionan de la manera prevista.

Los aminoácidos se mencionan en la presente descripción con el uso de sus códigos convencionales de tres letras o de una letra: Composiciones del dominio de unión a albúmina La presente invención proporciona un dominio sintetico de unión a albúmina (ABDCon) (SEQ ID NO: 21) y variantes de este. El ABDCon puede estar unido operativamente a un agente bioactivo para mejorar la vida media en suero y la biodistribución del agente terapéutico. El ABDCon y las variantes de este pueden expresarse en niveles altos en E. coli, son solubles y tienen una estabilidad térmica alta. La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican el ADBCon y variantes de este, ácidos nucleicos complementarios, vectores, células huésped y métodos para elaborarlos y usarlos.

La presente invención proporciona, además, un dominio sintético de unión a albúmina (ABDCon) que tiene una extensión de 5 aminoácidos en el extremo N-terminal. La extensión mejora la estabilidad de ABDCon.

El dominio de unión ABDCon se diseñó al calcular una secuencia consenso de aminoácidos de ciertas secuencias del dominio de unión a albúmina (ABD) con un grupo de 3 hélices depositadas en la base de datos de proteínas no redundantes con el uso del ABD de la proteína G de Streptococcus sp. G148 (SEQ ID NO: 1) como una plantilla y al seleccionar el aminoácido más predominante en cada posición de secuencias (Tabla 6). El ABDCon tiene una afinidad alta con la albúmina humana con una KD de 75 pM y una K0ff de 3.02x105 1/s cuando se analiza con las condiciones especificadas en la presente descripción y, por lo tanto, los agentes bioactivos unidos operativamente al ABDCon pueden unirse en gran medida a la albúmina una vez que se administra a un paciente animal. En un paciente humano, las moleculas que se unen a albúmina sérica de manera muy débil tienen una vida media en suero corta debido al filtrado renal (Hopp et al., Protein Eng Des Sel 23:827-834, 2010), mientras que las moléculas que se unen a albúmina sérica de manera fuerte no se liberan de la albúmina en el sitio de acción preferido y, por lo tanto, en algunos casos, pueden tener una capacidad reducida para modular la actividad del objetivo deseado y para proporcionar un beneficio terapéutico. Por lo tanto, hay un aspecto de la presente invención que tiene y que puede generar variantes del ABDCon y dominios de unión que tienen un espectro de afinidades a la albúmina y, por lo tanto, proporcionan la capacidad de modular la vida media del agente bioactivo unido operativamente a variantes del ABDCon y dominios de unión.

Una modalidad de la presente invención es un dominio de unión a albúmina aislado no natural que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 21 (ABDCon): LKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA.

Otra modalidad de la presente invención es un dominio aislado de unión a albúmina que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21 que tiene sustituciones en los residuos 1 , 2, 3, 4, 5 o 6.

Las variantes del ABDCon pueden diseñarse al examinar la estructura cristalina de una proteína de unión a albúmina con un grupo de 3 helices ilustrativa que forma un complejo con albúmina y al asumir que el ABDCon puede unirse a albúmina de manera similar a la proteína ilustrativa. Una estructura cristalina ilustrativa que puede usarse es la de un módulo GA (módulo de unión a albúmina relacionada con la proteína G) de la proteína PAB de una bacteria anaerobia Finegoldia magna (anteriormente Peptostreptococcus magnus) en un complejo con albúmina humana (código de la base de datos de proteínas (PDB, por sus siglas en inglés) 1TF0 (Leion et al., J Biol Chem 279:42924-42928, 2004).

Las variantes del ABDCon que tienen una afinidad reducida para albúmina pueden diseñarse por diversas estrategias, tales como por interrupción de los contactos hidrofóbicos previstos, por interrupción del apilamiento pi previsto entre residuos aromáticos, por introducción de choques estéricos por sustitución con aminoácidos más grandes, por interrupción de puentes de sal por eliminación de residuos con carga, y por interrupción de enlaces de hidrógeno previstos para producirse entre el ABDCon y la albúmina. Los cambios introducidos están diseñados para reducir la afinidad de unión sin cambiar la superficie de unión de una manera que elimina la unión. Por ejemplo, el residuo Y21 puede sustituirse por aminoácidos con carga (Lys, Arg, Asp, Glu) o aminoácidos más pequeños (Ala, Gly) para reducir las interacciones hidrofóbicas entre este residuo y los residuos de albúmina V325 y F326. Adicionalmente, el residuo Y21 del ABDCon forma un enlace de hidrógeno con la cadena principal de los residuos de albúmina N318 y D324 de manera que los cambios menores, tales como la mutación para Phe, pueden debilitar ligeramente las interacciones. El residuo Y22 del ABDCon está previsto para formar interacciones hidrofóbicas, así como interacciones de apilamiento pi, con los residuos de albúmina F309 y F326. Por lo tanto, la sustitución de Y22 por los aminoácidos neutros más pequeños Ala, Ser, Val o por los aminoácidos con carga Lys, Arg, Asp o Glu puede reducir los contactos hidrofóbicos y la afinidad reducida de la variante del ABDCon a albúmina. El residuo K30 en el ABDCon está previsto para formar un puente de sal con el residuo de albúmina E227 y, por lo tanto, K30 puede sustituirse por Asp o Glu para introducir cargas de repulsión y potencialmente reducir la afinidad del ABDCon a albúmina. La mutación a cualquier aminoácido sin carga puede, además, reducir la afinidad al eliminar el puente de sal. El residuo T31 del ABDCon está previsto para formar un enlace de hidrógeno intermolecular con el residuo de albúmina N267 y las sustituciones para Ala o Gly pueden usarse para interrumpir el enlace de hidrógeno intermolecular sin introducir un gran choque esterico que podría desestabilizar significativamente la interacción. El residuo A37 del ABDCon puede sustituirse por Val, Tyr u otro aminoácido más grande para introducir choques estéricos. El residuo E41 puede sustituirse por Gln o Asn para eliminar la carga. La introducción de residuos con carga positiva, tales como Lys o Arg, puede estar prevista para reducir adicionalmente la afinidad de unión. Los residuos L25, E33, G34, L38, I42 y A45 del ABDCon están previstos para formar un contacto directo con albúmina, y es probable que las sustituciones en estos residuos regulen la afinidad del ABDCon a la albúmina. Las posiciones de los residuos se refieren al ABDCon de la SEQ ID NO: 21 y albúmina humana de la SEQ ID NO: 36.

Alternativamente, se puede usar un cóctel aleatorio de aminoácidos con el uso de, por ejemplo, codones de NNK para las sustituciones en las posiciones identificadas, y se determina la unión a albúmina de las variantes resultantes con el uso de métodos convencionales y métodos descritos en la presente descripción.

Las variantes del ABDCon ilustrativas son variantes que tienen sustituciones en por lo menos un residuo seleccionado de Y21, Y22, L25, K30, T31 , E33, G34, A37, L38, E41 , I42 y A45 de la SEQ ID NO: 21.

Las variantes del ABDCon ilustrativas son variantes que tienen sustituciones en por lo menos un residuo seleccionado de Y21, Y22, K30, T31, A37 y E41 de la SEQ ID NO: 21.

Una variante del ABDCon ilustrativa comprende una secuencia de aminoácidos LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA (SEQ ID NO: 22; en donde X1, X2, X3, X4, X5 y Ce puede ser cualquier aminoácido.

En otras modalidades, una variante del ABDCon ilustrativa comprende la secuencia de aminoácidos LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA (SEQ ID NO: 23), en donde i) X-i es lisina (K), arginina (R), aspartato (D), glutamato (E), alanina (A), glicina (G), fenilalanina (F) o tirosina (Y); ii) X2 es alanina (A), serina (S), valina (V), lisina (K), arginina (R), aspartato (D), glutamato (E) o tirosina (Y); 111) X3 es aspartato (D), glutamato (E) o lisina (K); iv) X4 es alanina (A), glicina (G) o treonina (T); v) X5 es valina (V), tirosina (Y) o alanina (A); y vi) X6 es glutamina (Q), asparagina (N), lisina (K), arginina (R) o glutamato (E).

En otras modalidades, una variante del ABDCon ilustrativa comprende la secuencia de aminoácidos LKEAKEKAIEELKKAGITSDX^sFDLINKAX^VEGVNXgLKDXelLKA (SEQ ID NO: 24), en donde i) X1 es lisina (K), alanina (A) o tirosina (Y); ii) X2 es alanina (A), serina (S), valina (V) o tirosina (Y); iii) X3 es aspartato (D) o lisina (K); iv) X4 es alanina (A) o treonina (T); v) X5 es valina (V), tirosina (Y) o alanina (A); y vi) X6 es glutamina (Q) o glutamato (E).

Las variantes del ABDCon ilustrativas comprenden secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NOS: 25-34. La unión a albúmina de las variantes del ABDCon se analiza con el uso de métodos muy conocidos, por ejemplo, en un ensayo in vitro con el uso de resonancia de plasmones (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Suecia). La afinidad determinada de una variante particular de la interacción ABDCon/albúmina puede variar si se determina en condiciones diferentes (por ejemplo, osmolaridad, pH). Por lo tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión (por ejemplo, KD, Kon, K0ff) se realizan, preferentemente, con soluciones estandarizadas de variante del ABDCon y albúmina, y un regulador estandarizado, tal como el regulador descrito en la presente descripción. La afinidad de las variantes del ABDCon a albúmina puede estar en el intervalo de por lo menos aproximadamente 1x105 M, por lo menos aproximadamente 1X106 M, por lo menos aproximadamente 1x107 M, por lo menos aproximadamente 1x108 M, por lo menos aproximadamente 1x109 M, por lo menos aproximadamente 1x101° M, por lo menos aproximadamente 1x10 11 M, por lo menos aproximadamente 1x1012 M o por lo menos aproximadamente 1x1013 M. Por ejemplo, diversas sustituciones en Y22 del ABDCon (SEQ ID NO: 21) redujeron la afinidad de las variantes a albúmina aproximadamente 300 - 1,000 veces, según una sustitución (Tabla 4). Aquellos con experiencia en la téenica pueden diseñar y generar otras variantes adicionales que tienen sustituciones en posiciones definidas o en combinaciones de posiciones y pueden analizar la afinidad de unión a albúmina deseada con el uso de métodos de rutina.

El ABDCon y variantes de este se pueden modificar adicionalmente por adición de una extensión de 5 aminoácidos en el extremo N-terminal del ABDCon o variante del ABDCon. La extensión de 5 aminoácidos puede comprender una secuencia de aminoácidos TIDEWL (SEQ ID NO: 43) o cualquier secuencia de aminoácidos que se muestra en las SEQ ID NOS: 42 o 45-55. Al incorporar la extensión de 5 aminoácidos en el extremo N-terminal en el ABDCon y variantes de este se puede incrementar la estabilidad de la molecula. La extensión de 5 aminoácidos en el extremo N-terminal se puede ordenar estructuralmente como parte de la primera hélice alfa del ABDCon y variantes. Por lo tanto, la estabilidad mejorada de las moléculas extendidas en el extremo N-terminal puede ser a causa de la estabilización de la estructura general de la hélice. Las variantes del ABDCon en el extremo N-terminal se pueden producir con el uso de métodos convencionales y su estabilidad, por ejemplo, la estabilidad térmica, se puede evaluar como se describe en la presente descripción. Cualquier dominio de unión a albúmina (ABD) se puede modificar con la adición de los 5 aminoácidos en el extremo N-terminal para estabilizar la estructura del ABD y mejorar la estabilidad, tal como la estabilidad térmica de la molécula resultante.

El ABDCon y las variantes de este se pueden modificar adicionalmente en los residuos que no afectan la unión a albúmina para el propósito de, por ejemplo, mejorar la estabilidad, reducir la inmunogenicidad, mejorar la solubilidad o cualquier otra característica adecuada. En una manera para alcanzar este objetivo, el ABDCon y las variantes de este se pueden preparar, opcionalmente, por un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos conceptuales modificados genéticamente con el uso de modelos tridimensionales de las secuencias parentales y modificadas genéticamente. Los modelos tridimensionales se encuentran comúnmente disponibles y resultan familiares para aquellas personas con conocimiento en la teenica. Se encuentran disponibles programas que ilustran y exhiben estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias candidatas seleccionadas y pueden medir la posible inmunogenicidad (por ejemplo, programa Immunofilter de Xencor, Inc. de Monrovia, CA). La inspección de estas exposiciones permite el análisis de la posible función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata, por ejemplo, los residuos que promueven la estabilidad del dominio ABDCon. De esta manera, los residuos pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias parentales y de referencia para alcanzar las características deseadas, tales como una estabilidad mejorada. Alternativamente, o adicionalmente a los procedimientos anteriores, otros métodos de modificación adecuados pueden usarse como se conoce en la técnica.

Las propiedades físicas deseables de los dominios de unión a albúmina de la presente invención incluyen una alta estabilidad térmica y reversibilidad del plegamiento y desplegamiento térmico. Se ha aplicado diversos métodos para incrementar la estabilidad térmica evidente de las proteínas y enzimas, estos métodos incluyen el diseño racional a base de comparación con secuencias termoestables altamente similares, el diseño de puentes disulfuro estabilizantes, mutaciones para incrementar la propensión de hélices alfa, modificación de puentes de sal, alteración de la carga de superficie de la proteína, evolución dirigida y composición de secuencias consenso (Lehmann and Wyss, Curr Opin Biotechnol 12:371-375, 2001). La estabilidad termica alta puede aumentar el rendimiento de la proteína expresada, mejorar la solubilidad o actividad, disminuir la inmunogenicidad, y minimizar la necesidad de una cadena fría en la fabricación.

Los residuos que se pueden sustituir para mejorar cualquier característica de los dominios de unión a albúmina de la presente invención pueden determinarse al realizar la sustitución y análisis de las características deseadas del dominio de unión a albúmina. Por ejemplo, la exploración de alanina se puede usar para identificar las posiciones en el ABDCon y variantes de este que pueden afectar la estabilidad del dominio de unión a albúmina.

En términos de pérdida de estabilidad, es decir, “desnaturalizante” o “desnaturalización” de una proteína, significa el proceso, en donde parte o toda la conformación tridimensional que imparten las propiedades funcionales de la proteína, se ha perdido, con una subsiguiente pérdida de actividad y/o solubilidad. Las fuerzas alteradas durante la desnaturalización incluyen enlaces intramoleculares, por ejemplo, electroestáticos, hidrofóbicos, fuerzas de Van der Waals, enlaces de hidrógeno, y disulfuros. La desnaturalización de proteínas puede ser causada por fuerzas aplicadas a la proteína o una solución que comprende la proteína, tal como una fuerza mecánica (por ejemplo, fuerza de cizallamiento o compresión), térmica, estrés ósmico, cambio en el pH, campos eléctricos o magnéticos, radiación por ionización, radiación ultravioleta y deshidratación, y por desnaturalizantes químicos.

La medición de la estabilidad de la proteína y la labilidad de la proteína, se puede ver como aspectos ¡guales o diferentes de la integridad de la proteína. La proteínas son sensibles o “lábiles” a las desnaturalización a causa del calor, la radiación por ionización o ultravioleta, cambios en la osmolaridad ambiental y pH si es en solución líquida, fuerza de cizallamiento mecánica impuesta por una filtración en poros de pequeño tamaño, radiación ultravioleta, radiación por ionización, tal como por radiación gamma, deshidratación por calor o química, o cualquier otra acción o fuerza que pueda causar una alteración en la estructura de la proteína. La estabilidad de la molecula puede determinarse mediante el uso de métodos estándar. Por ejemplo, la estabilidad de una molécula puede determinarse al medir la temperatura de fusión térmica (Tm), la temperatura en ° Celsius (°C) a la cual la mitad de las moléculas se despliegan con el uso de métodos convencionales. Típicamente, cuanto más alta es la Tm, más estable es la molécula. Además del calor, el entorno químico cambia, además, la habilidad de la proteína para mantener una estructura tridimensional particular.

La desnaturalización química puede medirse, además, por una variedad de métodos. Los desnaturalizantes químicos incluyen clorhidrato de guanidinio, tiocianato de guanidinio, urea, acetona, solventes orgánicos (DMF, benceno, acetonitrilo), sales (sulfato de amonio, bromuro de litio, cloruro de litio, bromuro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de sodio); agentes reductores (por ejemplo, ditiotreitol, beta-mercaptoetanol, dinitrotiobenceno, e hidruros, tal como borohidruro de sodio), detergentes iónicos y no iónicos, ácidos (por ejemplo, ácido clorhídrico (HCI), ácido acetico (CH3COOH), ácidos acéticos halogenados), moléculas hidrofóbicas (por ejemplo, fosfolípidos), y desnaturalizantes objetivos. La cuantificación del alcance de la desnaturalización puede depender de la pérdida de una propiedad funcional, tal como la habilidad para unirse a una molécula objetivo, o por propiedades fisioquímicas, tales como la tendencia a la agregación, exposición a residuos anteriormente inaccesibles de solventes, o alteración o formación de enlaces de disulfuro.

El dominio de unión ABDCon y variantes de este pueden unirse operativamente a un agente bioactivo. Los agentes bioactivos ilustrativos son péptidos y proteínas que pueden unirse operativamente al ABDCon y variantes de este con el uso de conectores muy conocidos, por ejemplo, un conector que contiene poli-glicina, glicina y serina (conector de Gly-Ser), o alanina y prolina. El uso de conectores peptídicos de origen natural así como artificiales es muy conocido en la literatura (Hallewell et al., J Biol Chem 264:5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8:725-731, 1995; Robinson y Sauer, Biochemistry 35:109-116, 1996; patente de los Estados Unidos núm. 5,856,456). El agente bioactivo puede unirse al ABDCon o variante de este desde su extremo C-terminal o N-terminal. Los agentes bioactivos multiespecíficos pueden unirse, además, al ABDCon. En estos casos, el ABDCon puede unirse al extremo N-terminal o al extremo C-terminal de la molécula. El ABDCon puede estar, además, posicionado internamente en un agente multiespecífico, de manera que se une al extremo C-terminal de un agente y al extremo N-term¡nal de otro. Los agentes bioactivos pueden acoplarse, además, a los dominios de unión a albúmina de la presente invención con el uso de reticulación química muy conocida en la teenica, por ejemplo, con el uso de enlace de hidrazona o de semicarbazona. Los agentes bioactivos ilustrativos son proteínas que se unen específicamente a un antígeno objetivo, tal como proteínas identificadas de fibronectina tipo III (FN3), genotecas de proteínas de repetición, tales como las genotecas a base de Tencon25 descritas en la patente núm. WO2011/137319A2 y en la patente núm. WO2010/093627A2.

En el ABDCon o variantes de este de la presente invención se puede incorporar otras porciones adicionales, tales como conjugados de toxina, moléculas de polietilenglicol (PEG), tales como PEG5000 o PEG20.000, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos de cadenas de longitudes diferentes, por ejemplo, laurato, miristato, estearato, araquidato, behenato, oleato, araquidonato, ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico y similares, polilisina, octano, carbohidratos (dextrano, celulosa, oligo- o polisacáridos) para las propiedades deseadas. Estas porciones pueden ser fusiones directas con las secuencias codificantes del ABDCon y pueden producirse por técnicas convencionales de clonación y expresión. Alternativamente, se puede usar métodos muy conocidos de acoplamiento químico para unir las porciones al ABDCon producido de manera recombinante de la invención.

La vida media del ABDCon y variantes de este, así como las proteínas de fusión de los agentes bioactivos y ABDCon se puede analizar con el uso de propiedades de farmacocinetica muy conocidas en modelos in vivo. El ABDCon y variantes de este ilustrativos se unen a albúmina con una KD entre aproximadamente 1 pM y 1 mM, entre 75 pM y 860 nM, entre 100 pM y 500 nM o entre 1 nM y 100 nM.

Generación v producción del ABDCon v variantes de éste La generación de los dominios de unión a albúmina de la presente invención se logra, típicamente, en el nivel del ácido nucleico con el uso de métodos convencionales. Las variantes del ABDCon que tienen codones sustituidos en uno o más residuos específicos pueden sintetizarse, por ejemplo, con el uso de métodos convencionales de clonación de PCR, o síntesis química de genes de conformidad con los métodos descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 6,521,427 y en la patente de los Estados Unidos núm. 6,670,127 o con el uso de la mutagénesis Kunkel (Kunkel et al., Methods Enzymol 154:367-382, 1987). Si se usa codones aleatorizados para cualquier posición de residuos, la aleatorización se puede lograr con el uso de métodos muy conocidos, por ejemplo, oligonucleótidos degenerados que coinciden con la diversidad diseñada o, por ejemplo, con el uso de codones de NNK, los cuales codifican todos los 20 aminoácidos de origen natural. En otros esquemas de diversificación, los codones DVK pueden usarse para codificar los aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, y Cys. Alternativamente, los codones NNS pueden usarse para dar lugar a los 20 residuos de aminoácido y, simultáneamente, reducir la frecuencia de los codones de terminación. Las designaciones del codón son de acuerdo con el código IUB muy conocido.

La síntesis de oligonucleótidos con la “degeneración” de nucleótidos seleccionada en ciertas posiciones es muy conocida en la teenica, por ejemplo, el método TRIM (Knappek et al., J Mol Biol 296:57-86, 1999; Garrard y Henner, Gene 128:103-109, 1993). Esos conjuntos de nucleótidos, que tienen ciertos conjuntos de codones, pueden sintetizarse mediante el uso de nucleótidos o reactivos de nucleósido y aparatos disponibles comercialmente.

Se usan técnicas convencionales de clonación y expresión para clonar el ABDCon o variantes de este en un vector o para sintetizar el ADNc bicatenario del ABDCon para expresar o para traducir la proteína in vitro. Los agentes bioactivos pueden unirse operativamente al ABDCon o variantes de este con el uso de métodos muy conocidos.

Moléculas v vectores de ácido nucleico La presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican el ABDCon o variantes de este de la presente invención como polinucleótidos aislados o como porciones de vectores de expresión o como porciones de secuencias de ADN lineal, que incluyen secuencias de ADN lineal usadas para la transcripción/traducción in vitro, vectores compatibles con la expresión de fago procariota, eucariota o filamentoso, secreción y/o exhibición de las composiciones. En la presente descripción se describe ciertos polinucleótidos ilustrativos; sin embargo, otros polinucleótidos los cuales, debido a la degeneración del código genético o las preferencias codónicas en un sistema de expresión específico, codifican el ABDCon o variantes de este de la presente invención también se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

Los polinucleótidos de la invención se pueden producir por síntesis química, tal como la síntesis de polinucleótidos en fase sólida en un sintetizador de polinucleótidos automatizado y se pueden agrupar en moléculas mono o bicatenarias completas. Alternativamente, los polinucleótidos de la presente invención se pueden producir por otras téenicas, tales como una PCR seguida por una clonación de rutina. Las técnicas para producir u obtener polinucleótidos de una secuencia conocida determinada se conocen bien en la técnica.

Los polinucleótidos de la invención pueden comprender por lo menos una secuencia no codificante, tal como una secuencia promotora o potenciadora, intrón, señal de poliadenilación y similares. Las secuencias de polinucleótidos pueden comprender, además, secuencias adicionales que codifican aminoácidos adicionales que codifican, por ejemplo, un marcador o una secuencia marcadora, tal como una etiqueta de hexahistidina o de HA para facilitar la purificación o detección de la proteína, una secuencia señal, una proteína de fusión acompañante, tal como ADNc que codifica un agente bioactivo, y similares.

Un polinucleótido ilustrativo comprende secuencias que codifican ABDCon, secuencias para un sitio de unión al ribosoma, secuencia promotora, secuencia terminadora, gen de resistencia a antibióticos, y un origen bacteriano de replicación (ori). Los polinucleótidos ilustrativos que codifican dominios de unión a albúmina de la presente invención se muestran en la SEQ ID NO: 35.

Otra modalidad de la invención es un vector que comprende al menos un polinucleótido de la invención. Esos vectores pueden ser vectores plasmídicos, vectores virales, vectores para la expresión de baculovirus, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para introducir, por cualquier medio, los polinucleótidos de la invención en un organismo o fondo genetico dado. Tales vectores pueden ser vectores de expresión que comprenden elementos de la secuencia de ácido nucleico que pueden controlar, regular, causar o permitir la expresión de un polipéptido codificado por un vector de este tipo. Dichos elementos pueden comprender sitios de unión potenciadores de la transcripción, sitios de iniciación de la ARN polimerasa, sitios de unión al ribosoma, y otros sitios que facilitan la expresión de los polipéptidos codificados en un sistema de expresión determinado. Dichos sistemas de expresión pueden ser sistemas basados en célula, o libres de célula bien conocidos en la téenica.

Selección de célula huésped o manipulación genética de célula huésped El ABDCon y variantes de este de la presente invención se pueden producir, opcionalmente, por una línea celular, una línea celular mezclada, una célula inmortalizada o una población clonal de células inmortalizadas, como se conoce en la téenica. Ver, por ejemplo, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wilcy & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.° edición, Coid Spring Harbor, NY (1989); Harlow y Lañe, Antibodies, a Laboratory Manual, Coid Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in proteína Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).

La célula huésped seleccionada para la expresión puede ser de origen mamífero o se puede seleccionar de células COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, HeLa, de mieloma, linfoma, levadura, insectos o plantas o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de estas. Alternativamente, la célula huésped puede seleccionarse de una especies u organismo incapaz de glicosilar polipéptidos, por ejemplo, una célula u organismo procariota, tal como BL21, BL21(DE3), BL21-GOLD(DE3), XL1-Blue, JM109, HMS174, HMS174(DE3), y cualquier cepa natural o modificada de E. coli spp, Klebsiella spp., o Pseudomonas spp.

Usos de los dominios de unión a albúmina de la invención Las composiciones del dominio de unión a albúmina no natural ABDCon y variantes de este de la presente invención pueden usarse para modular la vida media y/o la biodistribución de un agente bioactivo dentro del tejido de un animal al unir operativamente el ABDCon y el agente bioactivo, y en donde la administración de la composición a un animal produce una vida media y/o biodistribución del agente bioactivo que es diferente a la distribución del tejido obtenida con la administración del agente activo solo.

Composiciones farmaceuticas que comprenden ABDCon o variantes de éste El ABDCon o variantes de este que se unen a albúmina que están unidos operativamente a agentes bioactivos pueden aislarse con el uso de procedimientos de separación muy conocidos en la téenica para la captura, inmovilización, distribución o sedimentación, y pueden purificarse en la medida necesaria para la aplicación comercial.

Para uso terapéutico, las proteínas de fusión de moléculas bioactivas-ABDCon se pueden preparar como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad efectiva de la proteína de fusión de agente bioactivo-ABDCon como un ingrediente activo en un portador farmacéuticamente aceptable. El término “portador” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto activo. Tales vehículos pueden ser líquidos, tal como agua en aceites, que incluyen los de petróleo, animal, vegetal o de origen sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, se puede usar 0.4 % de solución salina y 0.3 % de glicina. Estas soluciones son esteriles y, generalmente, libres de materia particulada. Se pueden esterilizar mediante téenicas de esterilización convencionales y muy conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y reguladores, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración de la proteína de fusión de agente bioactivo-ABDCon en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente 0.5 %, usualmente, a o por lo menos aproximadamente 1 % hasta tanto como 15 o 20 % en peso y se selecciona principalmente en base a la dosis, volúmenes de fluido, viscosidades, etc. que se requiere, de conformidad con el modo de administración particular seleccionado. Las formulaciones y vehículos adecuados se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21.° edición, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams y Wilkins, Filadelfia, PA 2006, parte 5, Pharmaceutical Manufacturing, págs. 691-1092, ver especialmente las págs. 958-989.

El modo de administración para uso terapéutico de la proteína de fusión de agente bioactivo-ABDCon puede ser cualquier vía adecuada que suministre el agente al huésped, tal como la administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea, pulmonar; transmucosa (oral, intranasal, intravaginal, rectal); con el uso de una formulación en una tableta, cápsula, solución, suspensión, polvo, gel, partícula; y contenida en una jeringa, un dispositivo implantado, bomba osmótica, cartucho, microbomba; u otros medios apreciados por la persona con experiencia y conocidos en la téenica. La administración a un sitio específico puede lograrse, por ejemplo, por la entrega intrarticular, intrabronquial, íntraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavidad, intraceliaca, intracelebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intracardiaca, intraosteal, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intraretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravascular, intravesical, intralesional, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, o transdérmica.

Aun cuando se ha descrito la invención en términos generales, adicionalmente, en los siguientes ejemplos se describirán las modalidades de la invención, que no se deben considerar como limitantes del alcance de las reivindicaciones.

EJEMPLO 1 Generación del dominio de unión a albúmina no natural Diseño del dominio de unión a albúmina no natural consenso (ABDCon) Un dominio de unión a albúmina no natural (ABD) se diseñó al calcular una secuencia consenso de aminoácidos de secuencias de ABD con un grupo de 3 hélices depositadas en la base de datos de proteínas no redundantes. Para determinar la secuencia consenso, el ABD a partir de la proteína G de Streptococcus sp. G148 (SEQ ID NO: 1) se usó como una secuencia de plantilla para una búsqueda BLAST en comparación con la base de datos de proteínas del NCBI no redundantes (http:_bblast_ncbi_nlm_nih_gov/Blast_cgi). Todos los parámetros predeterminados se usaron para la búsqueda BLAST; umbral previsto = 10, tamaño de palabra = 3, matriz = BLOSUM62, costos de interrupción = existencia 11, extensión 1 y ajustes composicionales = ajuste de matriz de puntaje composicional condicional. A partir de esta búsqueda, se seleccionó los 20 dominios de proteína con la relación más cercana, los cuales se enumeran en la Tabla 1 (SEQ ID NOS: 1-20), para incluirlos en un alineamiento de múltiples secuencias para determinar un consenso. Se seleccionó únicamente secuencias no redundantes. Diversos números de registro de proteínas se enumeran múltiples veces en la Tabla 1, lo cual indica que algunas proteínas contienen diversos dominios ABD relacionados estrechamente. La SEQ ID NO: 4 es un ABD no natural derivado por exhibición de fagos y barajado de genes. (He et al., Protein Sci 16: -.1490-1494, 2007).

TABLA 1 Un alineamiento de múltiples secuencias se generó a partir de las secuencias enumeradas con el uso del programa AlignX (con el uso de todos los parámetros predeterminados). Se usó el alineamiento de secuencias que se muestra en la Tabla 6 para seleccionar el aminoácido con la máxima prevalencia en cada posición de las secuencias para derivar la secuencia consenso del dominio de unión a albúmina, ABDCon (SEQ ID NO: 21, Tabla 6). El aminoácido Tyr se seleccionó en lugar de lie para la posición 21 debido a que no había un consenso claro para esta posición y los residuos aromáticos Tyr y Phe estuvieron bien representados. Las identidades de secuencias en pares entre ABDCon se encuentran en el intervalo de 45 % (SEQ ID NO: 3) a 82 % (SEQ ID NOS: 8, 13, 14 y 16).

Síntesis de genes La secuencia de aminoácidos del dominio de unión a albúmina consenso (ABDCon) se tradujo a la inversa a una secuencia de ácido nucleico que codifica para el ABDCon con el uso de los codones preferidos para la expresión de E. coli como se describe a continuación (SEQ ID NO: 35) y se produjo un gen sintetico (BlueHeron Biotechnologies). Las secuencias de ADN 5’ y 3’ se agregaron a la secuencia del gen sintético de la SEQ ID NO: 34 para agregar los sitios Ndel y Xhol para subclonación, así como las secuencias de ADN que codifican para una etiqueta de 8-His en el extremo N-terminal para la purificación de proteínas. Este gen se clonó en un vector de pET26 (Novagen) para la expresión impulsada por una secuencia promotora de T7 y transformada en la cepa BL21(DE3) de E. coH (Novagen).

Expresión v purificación Para la expresión del ABDcon, 50 mi de medio de LB suplementado con 30 mg/ml de canamicina se inocularon con 1 colonia y se cultivaron durante la noche a 37 °C, 220 rpm de agitación. El día siguiente, 10 mi del cultivo cultivado durante la noche se agregó a 100 mi de caldo de cultivo Terrific suplementado con 30 pg/ml de canamicina y el cultivo cultivado a 37 °C, 220 rpm durante 2.5 horas. Se agregó IPTG a una concentración final de 1 mM y la temperatura se redujo hasta 30 °C para inducir la expresión proteica. Las células se recolectaron 14 horas después por centrifugación a 4000 X g durante 20 minutos y los comprimidos celulares se almacenaron a - 20 °C. Los comprimidos celulares congelados se suspendieron nuevamente en 5 mi de BugBuster HT (Novagen) por gramo de comprimido húmedo y se mezclaron moderadamente a temperatura ambiente durante 30 minutos. La molecula de ABDCon con marcador de poli-histidina se purificó por cromatografía Ni-NTA (GE Healthcare), eluyente en un regulador de fosfato sódico 50 mM a un pH de 7.4, cloruro de sodio 500 mM con un gradiente de imidazol 10-250 mM. Las fracciones que contienen ABDCon se agruparon y se purificaron adicionalmente por cromatografía de exclusión por tamaño con el uso de una columna Superdex75 16/60 (GE Healthcare) con una fase móvil de PBS. La pureza se analizó por un análisis de SDS-PAGE (Figura 1). La espectrometría de masas determinó que la masa era de 6383 Da, de conformidad con la masa teórica de 6382 Da (Figura 2). La cromatografía analítica de exclusión por tamaño con el uso de una columna Superdex 75 5/150 (GE Healthcare) muestra que la preparación del ABDCon se encuentra libre de agregados y se eluye en un momento que coincide con una proteína monomérica (Figura 3).

EJEMPLO 2 Caracterización de ABDCon Estabilidad térmica del ABDCon El ABDCon se concentró hasta 2.175 mg/ml en PBS a un pH de 7.4 y la estabilidad térmica se analizó por calorimetría de barrido diferencial (DSC). Los datos de estabilidad se generaron por calentamiento de 400 mI de la solución de ABDCon desde 25 °C hasta 100 °C a una frecuencia de exploración de 1 °C por minuto en un instrumento VP-DSC (MicroCal). Una segunda exploración idéntica se completó en la muestra para analizar la reversibilidad del plegamiento/desplegamiento térmico. Los datos se ajustaron a un modelo de desplegamiento de 2 estados para calcular la temperatura de fusión. Las Figuras 4A y 4B muestran que el ABDCon tiene una estabilidad térmica alta de 81.5 °C en PBS y que el plegamiento es completamente reversible.

Unión del ABDCon a albúmina La cinética de la unión del ABDCon a albúmina sérica humana y a albúmina sérica de ratón se determinaron en un sistema de matriz de interacción de proteínas ProteOn™ XPR-36 (Bio-Rad) con el uso de chips sensores GLC. Las albúminas séricas humana (SEQ ID NO: 36), de macaco Rhesus (SEQ ID NO: 37) y murina (SEQ ID NO: 38) se adquirieron de Sigma (catálogo núm. A4327 para humana, núm. A3559 para murina y núm. A4297 para macaco Rhesus) y se suspendieron nuevamente en PBS a concentraciones diferentes. Cada albúmina sérica se inmovilizó directamente en un canal de ligando en la orientación vertical de un chip GLC por medio de acoplamiento de amina convencional a 2.1 mg/ml a un pH de 5.0 para obtener las superficies con densidades del ligando de 500 a 1000 unidades de resonancia. La unión del ABDCon recombinante se analizó con un flujo de cinco concentraciones diferentes (por ejemplo, 1 mM diluido en una serie de concentración de 3 veces) como analitos simultáneamente en la orientación horizontal sobre las superficies de albúmina serica inmovilizada. Las fases de disociación para todas las concentraciones se monitorearon durante dos horas a una velocidad de flujo de 100 mI/min con el uso de PBST (PBS, Tween20 al 0.005 %) como regulador en uso. Se inyectó una sexta muestra (regulador únicamente) para monitorear la estabilidad de los valores iniciales. Las superficies se regeneraron con el uso de 1 pulso corto (18 mI) de ácido fosfórico al 0.8 %.

TABLA 2 Los datos crudos de respuesta se procesaron, primero, al sustraer las respuestas únicas del regulador y la unión no específica entre los analitos y el chip. Los datos procesados de las cinco concentraciones se ajustaron globalmente a un modelo de unión Langmuir simple 1:1 para cada superficie del ligando. La Tabla 2 describe la cinética de unión determinada para cada especie de albúmina.

Vida media en suero de la fusión al ABDCon en ratones La capacidad del ABDCon para prolongar la vida media en suero de una proteína de fusión se evaluó al producir un gen sintetico que codifica una fusión del ABDCon al extremo C-terminal de Tencon25. Tencon25 es un andamio de proteína con base en una secuencia consenso de una proteína de repetición de fibronectina tipo III (FN3) que tiene una secuencia que se muestra en los residuos 1-90 de la SEQ ID NO: 39, y se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 2011/0274623A1. El Tencon25 y los dominios de proteína ABDCon se fusionaron por un conector peptídico (G4S)2 (SEQ ID NO: 40). La proteína de fusión resultante tiene una secuencia de polipéptidos que se muestra en la SEQ ID NO: 39. Un marcador de poli-histidina se incorporó en el extremo C-terminal para propósitos de purificación. Sesenta y nueve ratones hembra BALB/c se dividieron en 3 grupos (N=3 grupo 1 control no tratado, y N= 33 grupos 2-3). Los ratones se trataron con una sola dosis intravenosa de la proteína de fusión de Tencon25-ABDCon a 2 mg/kg. La dosificación se basó en el peso de los animales el día de la administración. A los ratones se les practicó eutanasia en los siguientes momentos específicos después de la inyección: 10 min, 30 min, 1 , 4, 6 horas y 1, 2, 3, 7, 10, 14 días. Las muestras de sangre se tomaron de cada animal por medio de punción cardíaca. Se dejó que las muestras de sangre se coagularan a temperatura ambiente durante 30 minutos, pero no más de 1 hora. Después, las muestras de sangre se centrifugaron a aproximadamente 3,500 rpm durante 15 minutos. Las muestras de suero se analizaron con el uso de una prueba ELISA tipo sándwich homogénea en la plataforma Mesoscale Discovery. Las placas con estreptavidina-oro (Mesoscale Discovery) se bloquearon durante 1 hora con Superblock (TBS) Tween-20 (Thermo). Se usó anticuerpo policlonal anti-Tencon25 tanto para la captura (biotinilado) como para la detección (marcado con MSD Sulfo-Tag (Mesoscale Discovery)) a 0.625 mg/ml. El antígeno y los anticuerpos se agregaron a las placas, las cuales se incubaron durante 2 horas con agitación vigorosa a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con TBS-T (Sigma) y se agregó regulador de lectura MSD con surfactante (Mesoscale Discovery). Las placas se lcyeron con el uso del equipo MSD Sector Imager 6000. Los datos se analizaron con el uso de GraphPad Prism. Los estudios anteriores han demostrado que una molécula de Tencon no fusionada similar se despeja del torrente sanguíneo rápidamente con una vida media en suero de aproximadamente 20 minutos en ratones. La fusión de Tencon25 al ABDCon prolonga la vida media en suero hasta más de 60 horas (Figura 5).

EJEMPLO 3 Modificación genética del ABDCon para cambiar la afinidad a la albúmina sérica La afinidad de unión a la albúmina sérica puede no solo determinar la vida media en suero de una proteína terapéutica, sino, además, la capacidad de esa molécula para unirse a y neutralizar su objetivo. Por ejemplo, una molécula que se une a albúmina sérica muy débilmente tiene una vida media en suero corta debido al filtrado renal, mientras no se une a albúmina (Hopp et al., Protein Eng Des Sel 23:827-834, 2010). Al contrario, una molécula que se une a albúmina muy estrechamente no se libera de la albúmina en el sitio de acción preferido y, por lo tanto, puede ser incapaz de neutralizar el objetivo deseado, en algunos casos. Por lo tanto, es preferible alcanzar la extensión de la vida media por medio de la unión a albúmina en una manera en la que la interacción de albúmina es únicamente lo suficientemente fuerte para obtener la vida media en suero deseada. Debido a que la secuencia del ABDCon descrita en la presente descripción se une a albúmina sérica humana con una afinidad de 75 p y una constante de disociación de 3.02x105 1/s (en las condiciones experimentales descritas en la presente descripción), las moléculas fusionadas al ABDCon se unen en gran medida a la albúmina una vez que se administran a un animal o paciente. Para algunos objetivos y fusiones, se puede preferir que la unión a la albúmina sérica sea menos fuerte. Diez versiones de mutantes del ABDCon se diseñaron para reducir la afinidad de unión del ABDCon para albúmina. La Tabla 3 resume estos mutantes: TABLA 3 * Numeración de aminoácidos de conformidad con la SEQ ID NO: 21 Los mutantes del ABDCon se seleccionaron al examinar la estructura cristalina del módulo GA (módulo de unión a albúmina relacionada con proteína G) que se une a albúmina sérica humana (código de PDB 1TF0) (Lejon et al., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 64:64-69, 2008) y al asumir que el ABDCon se une a albúmina de una manera muy similar a GA. Los mutantes se diseñaron para reducir la afinidad del ABDCon para albúmina al interrumpir los contactos hidrofóbicos, introducir choques estéricos, interrumpir puentes de sal e interrumpir los enlaces de hidrógeno (Tabla 3). Los cambios introducidos se diseñaron para reducir la afinidad de unión sin cambiar la superficie de unión muy radicalmente que pueda eliminar la unión. Cada muíante se expresó y se purificó a partir de E. coli como se describe para el ABDCon. Se descubrió que el mutante del ABDCon11 es insoluble y, por lo tanto, se excluyó del análisis adicional. Las afinidades de cada variante para albúmina sérica humana, de ratón y de macaco Rhesus se determinaron por resonancia de plasma superficial y se muestran en la Tabla 4. Además de las posiciones enumeradas en la Tabla 3, los residuos L25, E33, G34, L38, 142 y A45 se pueden mutar para incrementar o reducir la afinidad del ABDCon para albúmina debido a que están previstos para formar contactos directos con albúmina.

TABLA 4 EJEMPLO 4 Vida media en suero de las proteínas de fusión de variantes del ABDCon Tencon25 (aminoácidos 1-90 de la SEQ ID NO: 39) se fusionó a las variantes del ABDCon 3, 5, 7 y 9 (Tabla 3) para evaluar la correlación entre la afinidad del ABDCon para albúmina con la extensión de la vida media. Estas moleculas se dosificaron en ratones a 2 mg/kg como se describió anteriormente en estudios anteriores y se analizaron con el uso de métodos idénticos como se describió para las fusiones de Tencon25-ABDCon. Un sumario de los parámetros de PK obtenidos para estas moléculas se muestra en la Tabla 5 y en la Figura 6. Aquí se demuestra que la velocidad de eliminación reduce a medida que la afinidad para albúmina se incrementa hasta alcanzar una afinidad de 103 nM, momento en el cual no se obtiene ninguna diferencia grande en los parámetros de PK. Los datos en la Tabla 5 demuestran la capacidad para adaptar propiedades, tales como la vida media, la velocidad de eliminación y la exposición total (AUC) al modificar la afinidad de la molecula de ABDCon para albúmina.

TABLA 5 TABLA 6 EJEMPLO 5 Estabilización de dominios de unión a albúmina Los estudios se completaron para determinar la estabilidad de ABDCon (SEQ ID NO: 21) cuando se produce como proteínas de fusión con diversos dominios de fibronectina tipo III (FN3) (ver, por ejemplo, la publicación de la patente de los Estados Unidos núm. US2010/0216708). Las proteínas de fusión de dominio FN3-ABDCon se generaron con el uso de téenicas de clonación convencionales. La secuencia de aminoácidos de una de las proteínas de fusión, Tencon-ABDCon, se muestra en la SEQ ID NO: 41. Otras proteínas de fusión de dominio FN3-ABDCon elaboradas fueron Tencon25-ABDCon, 83-ABDCon y 71 -ABDCon. Estas proteínas se produjeron con marcadores de poli-histidina en el extremo C-terminal y se purificaron mediante una combinación de afinidad al níquel y cromatografía de exclusión por tamaño con el uso de metodos convencionales. Cada molécula purificada se incubó en PBS a un pH de 7.4 a 37 °C durante 28 días antes del análisis por SDS-PAGE y la espectrometría de masas. La Figura 7A demuestra que se descubrió que cada proteína de fusión de dominio FN3-ABDCon se degrada durante esta incubación como lo demuestra la aparición de bandas de peso molecular bajo en el gel de SDS-PAGE. El análisis de espectrometría de masas confirmó que el patrón de degradación principal fue el recorte de estas moléculas en los residuos L1, K2 y E3 de la secuencia del ABDCon (SEQ ID NO: 21). Adicionalmente, se observó que la proteína G ABD de Streptococcus natural (SEQ ID NO: 1) fusionada a un dominio FN3 demostró un patrón de degradación similar con recorte en el residuo L1 cuando se incubó a 4 °C durante 6-8 meses (los datos no se muestran). Finalmente, se observó que diversos lotes purificados de ABD natural (SEQ ID NO: 1) y ABDCon (SEQ ID NO: 21) son inactivos y no detectadles en solución por SDS-PAGE una vez que se almacenan durante varios meses a 4 °C, lo que indica una degradación severa.

Las observaciones anteriores sugirieron que la hélice alfa en el extremo N-terminal de las estructuras de ABDCon y de ABD natural como se usan para prolongar la vida media en suero es inestable. Esta falta de estabilidad para tales proteínas de fusión es indeseable debido a que limita potencialmente la vida en estante de tales moléculas para investigación, así como las aplicaciones terapeuticas. Por lo tanto, se desarrolló una estrategia para mejorar la estabilidad de estas moléculas. El análisis de las estructuras tridimensionales de los dominios de unión a albúmina depositados en el Protein Data Bank muestra que la secuencia de aminoácidos TIDQWL (SEQ ID NO: 42) encontrada en el extremo N-terminal al inicio del ABD natural (SEQ ID NO: 1) está estructuralmente ordenada como parte de la primera hélice alfa de esta molécula en diversas estructuras cristalinas (por ejemplo, PDB 2VDB, Acta Cryst 2008 F64, 64-69). Esto es en contraste a la estructura de RMN original del ABD la cual demostró que esta región está desordenada en solución (PDB 1GAB, Johansson et al., J.Mol.Biol. 266: 859-865, 1997). Por lo tanto, se planteó como hipótesis que al extender la primera hélice alfa de las secuencias de ABD y de ABDCon se podría impartir mayor estabilidad a esta región, debido a que la extensión de hélices alfa puede impartir mayor estabilidad a tal hélice (Su et al., Biochemistry 33:15501-15510, 1994).

Un alineamiento de múltiples secuencias de los dominios naturales de unión a albúmina presentados en la Tabla 1 no reveló ninguna secuencia consenso clara para estos residuos en N-terminal. Sin embargo, una secuencia de péptidos, TIDEWL (SEQ ID NO: 43), está presente en N-terminal para 5 de estos dominios de proteína. Por lo tanto, un nuevo constructo de ABDCon, ABDCon12 (SEQ ID NO: 44), se generó al agregar la secuencia de TIDEWL en el extremo N-terminal del ABDCon. Esta proteína se expresó con un marcador de poli-histidina en N-terminal y se purificó para homogeneidad con el uso de métodos convencionales para cromatografía por afinidad al níquel y cromatografía de exclusión por tamaño. El ABDCon12 purificado se incubó a 37 °C en PBS durante 28 días y la estabilidad se analizó por SDS-PAGE y espectrometría de masas. El análisis de SDS-PAGE mostró un patrón de migración ligeramente más rápido despues del día 14, lo cual indica una degradación. Sin embargo, el análisis de masa total demuestra que esta degradación ocurre exclusivamente en el marcador de polihistidina y no en la secuencia del ABDCon12, lo cual indica que la secuencia de TIDEWL mejoró la estabilidad de ABDCon. Otra prueba adicional de estabilidad se demostró en la estabilidad de una proteína de fusión de dominio FN3-ABDCon 12 generada (Figura 7B) que mostró significativamente menos productos de degradación en comparación con las moléculas de dominio FN3-ABDCon originales (Figura 7A) cuando se incubaron a 37 °C en PBS durante 28 días.

La temperatura de fusión de ABDCon12 se determinó por calorimetría de barrido diferencial con el uso de los procedimientos descritos en el Ejemplo 2 para investigar el mecanismo de estabilización para este molécula. Una temperatura de fusión de 90.9 °C se obtuvo en PBS, un incremento de 9.4° en comparación con la molécula de ABDcon original, lo cual sugiere que la reducción en la proteólisis/degradación observada para las proteínas de fusión de ABDCon12 y ABDCon12 es un resultado de la estabilidad conformacional incrementada debido a la extensión de la hélice alfa en el extremo N-terminal.

SEQ ID NO 41 : Tencon-ABDCon MLPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGS ERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTTGGGGSGGGGSLKEA KEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKAGGHHHHHH SEQ ID NO: 42: secuencia en el extremo N-terminal de G. ABD de Stre|Y TIDQWL SEQ ID NO: 43: secuencia en el extremo N-terminal agregada al ABDCon TIDEWL SEQ ID NO: 44: ABDCon12 TIDEWLLKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA EJEMPLO 6 Caracterización de ABDCon12 La afinidad de unión del ADBCon12 purificado a la albúmina humana y murina se determinó por resonancia de plasmones de superficie con el uso de los mismos metodos como se describió anteriormente en el Ejemplo 2. Las constantes de disociación de 0.7 nM y 8.2 nM se obtuvieron para el ABDCon12 que se une a albúmina humana y murina, respectivamente. La capacidad del ABDCon12 para prolongar la vida media en suero de una molécula de fusión se demostró al fusionar el ABDCon 12 al extremo C-terminal de un dominio FN3 que se une, específicamente, a un antígeno. Esta molécula se administró a ratones por inyección IP a 2 mg/kg y se analizó como se describió anteriormente en el Ejemplo 4. Se determinó una vida media terminal de 55 horas para la proteína de fusión de dominio FN3-ABDCon12.

EJEMPLO 7 Estabilización de los dominios de unión a albúmina En base al análisis de secuencias de los dominios de unión a albúmina de origen natural, se anticipa que otras secuencias agregadas al extremo N-terminal de los dominios de unión a albúmina podrían hacerlos más estables. Por ejemplo, varias secuencias diferentes se encuentran en el extremo N-terminal de estos dominios naturales de unión a albúmina, tales como, pero sin limitarse a, APAVDV (SEQ ID NO: 45), IAKEKA (SEQ ID NO: 46), TIDQWL (SEQ ID NO: 42), VPAADV (SEQ ID NO: 47), TVKSIE (SEQ ID NO: 48), TPAVDA (SEQ ID NO. 49), TLKSIK (SEQ ID NO: 50), WEKAAA (SEQ ID NO: 51), AVDANS (SEQ ID NO: 52), QLAAEA (SEQ ID NO: 53), ALKAAA (SEQ ID NO: 54), EKLAAA (SEQ ID NO: 55). La adición de estas secuencias en los dominios de unión a albúmina puede incrementar la estabilidad si estas secuencias producen helices alfa más largas. Adicionalmente, los péptidos no naturales que incrementan la longitud y la estabilidad de las hélices alfa están previstos, además, para estabilizar los dominios de unión a albúmina.

Los variantes con secuencias en el extremo N-terminal adicionales se pueden generar con el uso de téenicas convencionales y sus propiedades se pueden analizar como se describió anteriormente.

Queda claro que la invención puede llevarse a la práctica de otra manera aparte de la que particularmente se describió en la descripción y ejemplos precedentes. Es posible realizar numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención, en vista de las enseñanzas anteriores y, por lo tanto, están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (26)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un dominio de unión a albúmina aislado no natural que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21.

2. Un dominio de unión a albúmina aislado no natural que comprende un aminoácido de la SEQ ID NO: 21 que tiene sustituciones en los residuos 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6.

3. El dominio aislado de unión a albúmina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque las sustituciones en los residuos 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 se producen en una o más de las posiciones de aminoácidos Y21, Y22, L25, K30, T31, E33, G34, A37, L38, E41, 142 y A45 de la SEQ ID NO: 21.

4. El dominio aislado de unión a albúmina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque las sustituciones en los residuos 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 se producen en una o más de las posiciones de aminoácidos Y21 , Y22, K30, T31 , A37 y E41 de la SEQ ID NO: 21.

5. El dominio aislado de unión a albúmina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende adicionalmente una extensión de 5 aminoácidos en su extremo N-terminal.

6. El dominio aislado de unión a albúmina de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la extensión de 5 aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 42, 43 y 45 a 55.

7. El dominio aislado de unión a albúmina de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la extensión de 5 aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43.

8. Un dominio de unión a albúmina aislado no natural que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 21 a 34 ó 44.

9. El dominio aislado de unión a albúmina de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque comprende adicionalmente una extensión de 5 aminoácidos en su extremo N-terminal.

10. El dominio aislado de unión a albúmina de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la extensión de 5 aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 42, 43 ó 45 a 55.

11. El dominio aislado de unión a albúmina de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la extensión de 5 aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43.

12. El dominio aislado de unión a albúmina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el dominio de unión a albúmina tiene una constante de disociación (KD) de unión a la albúmina humana entre aproximadamente 50 pM y 1 mM con el uso del sistema de matriz de interacción de proteínas ProteOn™ XPR-36 (Bio-Rad) con el uso de chips sensores GLC a una velocidad de flujo de 100 mI/min con el uso de PBST (PBS, Tween20 al 0.005 %) como regulador en uso.

13. El dominio aislado de unión a albúmina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el dominio de unión a albúmina tiene una constante de velocidad de disociación (Koff) de unión a la albúmina humana entre 3.6x105 y 1.1x101 con el uso del sistema de matriz de interacción de proteínas ProteOn™ XPR-36 (Bio-Rad) con el uso de chips sensores GLC a una velocidad de flujo de 100 mI/min con el uso de PBST (PBS, Tween20 al 0.005 %) como regulador en uso.

14. Un método para producir el dominio aislado de unión a albúmina de conformidad con la reivindicación 1; que comprende a) proporcionar un polinucleótido que codifica el dominio aislado de unión a albúmina; b) expresar el polinucleótido en un huésped o in vitro ; y c) recuperar el dominio aislado de unión a albúmina.

15. Un polinucleótido aislado que codifica el dominio de unión a albúmina de conformidad con la reivindicación 1.

16. Un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica un dominio de unión a albúmina seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 21 a 34 ó 44.

17. Un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido de la SEQ ID NO: 35.

18. Un vector aislado que comprende el polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 15, 16 ó 17.

19. Una célula huésped que comprende el vector aislado de conformidad con la reivindicación 18.

20. Una proteína de fusión que comprende un dominio de unión a albúmina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 5 u 8 y un agente bioactivo.

21. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque el agente bioactivo es un andamio de proteína que se une, específicamente, a una molécula objetivo.

22. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada además porque el andamio de proteína se basa en Tencon25 que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 90 de la SEQ ID NO: 39 o variantes de éstos.

23. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada además porque la proteína de unión a albúmina y el agente bioactivo se unen operativamente con el uso de un conector.

24. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque el conector comprende un conector de Gly- Ser.

25. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque el conector comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.

26. Una composición farmaceutica que comprende la proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 20 y por lo menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptables.