KR20240035847A - 인간 파이브로넥틴 유형 iii 단백질 스캐폴드 - Google Patents
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Abstract
대체 결합 표면 설계를 가진 파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인에 기초한 단백질 스캐폴드 및 스캐폴드 라이브러리, 단백질 스캐폴드를 암호화하는 단리된 핵산, 벡터, 숙주세포, 이들의 제조 방법, 그리고 질환 및 장애의 치료 및 진단을 위한 치료 분자로서의 용도.
Description
관련 출원
본 출원은, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는, 2021년 7월 19일자로 출원된 미국 가출원 제63/203,343호에 대한 우선권을 주장한다.
기술분야
본 개시내용은 파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인 분자, 그리고 해당 분자를 제조하는 방법 및 사용하는 방법에 관한 것이다.
단클론성 항체는 표적 분자에 대한 높은 친화성 및 특이성이 요구되는 경우에 가장 널리 사용되는 치료용 단백질의 부류이다. 그러나, 통상 단백질 스캐폴드로 지칭되는, 목적하는 표적 분자에 결합하도록 조작될 수 있는 비교적 정의된 3차원 구조를 갖는 비-항체 단백질은, 작은 크기, 이황화 결합의 결여, 높은 안정성 및 원핵생물 숙주에서 발현될 능력으로 인해 전통적인 항체에 비해서 이점을 가질 수 있다. 이들 스캐폴드는 전형적으로 특이적 또는 무작위 서열 변이에 순응할 수 있는 하나 이상의 영역을 함유하고, 이러한 서열 무작위화는 종종 목적하는 산물이 선택될 수 있는 단백질의 라이브러리를 생산하기 위해 수행된다. 신규한 정제 방법이 용이하게 적용되고; 스캐폴드가 약물/독소에 쉽게 접합되고, 조직 내로 효율적으로 침투하며, 다중특이적 결합제로 포맷될 수 있다(Binz and Pluckthun, Curr Opin Biotechnol, 16, 459-469, 2005; Skerra, J Mal Recognit, 13, 167-187, 2000).
하나의 이러한 단백질 스캐폴드는, 7개의 베타 가닥에 의해 연결된 6개의 루프를 갖는 특징적인 3차 구조를 갖는, 다수의 단백질에서 확인된 파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인이다. 3개의 루프, 특히, FG, BC 및 DE 루프는 항체의 상보성 결정 영역(CDR)과 구조적으로 유사하다. 이들 루프는 중요한 생물물리학적 특성을 유지하면서 다수의 상이한 표적에 대한 특이적 결합제를 성공적으로 선택하기 위해 FN3 도메인 스캐폴드의 라이브러리를 생성하도록 무작위화하였다(Getmanova et al., Chem Biol, 13, 549-556, 2006; Hackel et al., J Mol Biol, 381, 1238-1252, 2008; Karatan et al., Chem Biol, 11, 835-844, 2004; Koide et al., J Mol Biol, 284, 1141-1151, 1998; Koide et al., Proc Natl Acad Sci US A, 104, 6632-6637, 2007; Parker et al., Protein Eng Des Sel, 18, 435-444, 2005; Xu et al., Chemistry & Biology, 9, 933-942, 2002).
치료제, 예컨대, 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제의 전달을 촉진시킬 수 있는 표적화 모이어티로서 사용될 수 있거나, 또는 표적 분자에 결합함으로써 직접적인 치료 효과를 가질 수 있는 대체 결합 도메인에 대한 필요성이 있다. 본 개시내용은 이러한 개선된 단백질을 제공한다.
일부 실시형태에서, 복수의 파이브로넥틴 유형 III 모듈(FN3) 도메인(폴리펩타이드)을 포함하는 라이브러리가 제공되되, 라이브러리는 다양한 C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 및 G 베타-가닥을 포함하는 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면(alternative surface)을 갖고, 폴리펩타이드는 서열번호 44의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하되; 복수의 폴리펩타이드는 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 갖는 FN3 도메인 라이브러리를 형성하는 C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 또는 G 베타-가닥 중 하나 이상에 또는 각각에 서열번호 24와 비교해서 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 라이브러리를 생산하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 인간 파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인의 라이브러리를 제조하는 방법이 제공되되, 라이브러리는 C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 및 G 베타-가닥의 다양한 하나 이상 또는 각각을 포함하는 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 포함하고, 상기 방법은 서열번호 44의 아미노산 서열과 적어도 80, 85, 또는 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 참조 FN3 도메인 폴리펩타이드를 제공하는 단계; 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 갖는 인간 FN3 도메인 라이브러리를 형성하는 다음 도메인: C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 및 G 베타-가닥 잔기 중 어느 하나의 적어도 하나의 잔기를 돌연변이시킴으로써 참조 FN3 도메인 폴리펩타이드에 다양성을 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생산된 라이브러리가 제공된다.
일부 실시형태에서, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 갖는 인간 파이브로넥틴 유형 III 모듈(FN3) 도메인을 포함하는 단백질 스캐폴드를 얻는 방법이 제공되되, 해당 방법은 라이브러리를 표적 분자와 접촉시키거나 패닝(panning)시키는 단계 및 미리 정해진 친화성으로 표적 분자에 특이적으로 결합하는 단백질 스캐폴드를 단리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 분자에 결합하거나 특이적으로 결합하는 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 갖는 파이브로넥틴 유형 III 모듈(FN3) 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 얻는 방법이 제공되되, 해당 방법은 본 명세서에 개시된 라이브러리를 표적 분자와 접촉 또는 패닝(스크리닝)시키는 단계 및 표적 분자에 결합하거나 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 단리시키는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인"(FN3 도메인)은 파이브로넥틴, 테나신(tenascin), 세포내 세포골격 단백질, 사이토카인 수용체 및 원핵생물 효소를 비롯한 단백질에서 자주 발생하는 도메인을 지칭한다(Bork and Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89:8990-8994, 1992; Meinke et al., J Bacteriol 175:1910-1918, 1993; Watanabe et al., J Biol Chem 265:15659-15665, 1990). 예시적인 FN3 도메인은 인간 테나신 C에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인, 인간 파이브로넥틴(FN)에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인 및 예를 들어 미국 특허 번호 8,278,419에 기재되어 있는 비천연 합성 FN3 도메인이다. 개별 FN3 도메인은 도메인 번호와 단백질명, 예를 들어, 테나신의 3번째 FN3 도메인(TN3) 또는 파이브로넥틴의 10번째 FN3 도메인(FN10)으로 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "대체 표면"은 하나 이상의 베타 가닥 및 하나 이상의 루프를 포함하는 FN3 도메인의 측면 상의 표면을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 대체 표면은 C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 및 G 베타-가닥 내 아미노산에 의해 형성된 C-CD-D-F-FG-G 표면이다. 일부 실시형태에서, 대체 표면은 다양한 C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 및 G 베타-가닥을 포함한다.
용어 "생물학적 샘플"은 혈액, 조직, 골수, 가래 등을 지칭한다.
용어 "진단 시약"은 생물학적 샘플을 분석하는 데 사용될 수 있는 임의의 물질을 지칭하며, 이러한 물질이 단일 물질로서 또는 진단 키트 내의 다른 물질과 조합하여 분포되는지의 여부는 불문한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "치환하는" 또는 "치환된" 또는 "돌연변이시키는" 또는 "돌연변이된"은 서열의 변이체를 생성하기 위해 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에서 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드를 변경하거나, 결실시키거나, 삽입하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "무작위화하는" 또는 "무작위화된" 또는 "다양한" 또는 "다양화하는"은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열에서 적어도 하나의 치환, 삽입 또는 결실을 형성하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "변이체"는 하나 이상의 변형, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실에 의해 참조 폴리펩타이드 또는 참조 폴리뉴클레오타이드와는 상이한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적 결합"은 약 1×10-6M 이하, 예를 들어 약 1×10-7M 이하, 약 1×10-8M 이하, 약 1×10-9M 이하, 약 1×10-10M 이하, 약 1×10-11M 이하, 약 1×10-12M 이하, 또는 약 1×10-13M 이하의 해리 상수(KD)로 미리 결정된 항원에 결합하는 본 명세서에 기재된 FN3 도메인의 능력을 지칭한다. 전형적으로 FN3 도메인은, 예를 들어, Proteon Instrument(BioRad)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정할 때 비특이적 항원(예를 들어, BSA 또는 카세인)에 대한 KD보다 적어도 10배 더 적은 KD로 미리 결정된 항원(즉, 인간 PSMA)에 결합한다. 그러나, 인간 PSMA에 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인은 다른 관련 항원에 대해, 예를 들어, 마카카 파시쿨라리스(Macaca Fascicularis)(사이노몰구스 원숭이(cynomolgous monkey), cyno) 또는 판 트로글로디테스(Pan troglodytes)(침팬지)와 같은 다른 종(상동체)으로부터의 동일한 미리 결정된 항원에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "표적 분자"는 FN3 도메인에 의해 인식되는 항원 또는 에피토프를 갖는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 지질 등을 지칭한다. 표적 분자는 천연적으로 또는 비천연적으로 발생될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "에피토프"는 FN3 도메인이 특이적으로 결합하는 항원의 일부분을 의미한다. 에피토프는 보통 아미노산 또는 다당류 측쇄와 같은 모이어티의 화학적 활성(예컨대, 극성, 비극성 또는 소수성) 표면 그룹으로 이루어지며, 비전하(specific charge) 특징뿐만 아니라 특정한 3차원 구조 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 구조적 공간 단위를 형성하는 인접 및/또는 비인접 아미노산으로 구성될 수 있다. 비인접 에피토프의 경우, 항원의 선형 서열의 상이한 부분으로부터의 아미노산은 단백질 분자의 접힘을 통해 3차원 공간에서 매우 근접하게 된다.
용어 "라이브러리"는 변이체의 집합을 지칭한다. 라이브러리는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 변이체로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "안정성"은 정상적인 기능적 활성 중 적어도 하나, 예를 들어, 미리 결정된 항원에 대한 결합을 유지하도록 생리학적 조건하에서 접힌 상태를 유지하는 분자의 능력을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "텐콘(Tencon)"은 미국 특허 공개 번호 US2010/0216708에 기재된 서열을 갖는 합성 파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "테나신 C"는 GenBank 수탁 번호 NP_002151에 나타낸 서열을 갖는 인간 테나신 C를 지칭한다. 테나신 C는 15개의 탠덤 FN3 도메인을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "암세포" 또는 "종양 세포"는 새로운 유전 물질의 흡수를 반드시 수반하는 것은 아닌 자발적 또는 유도된 표현형 변화를 갖는 생체내, 생체외 및 조직 배양에서의 암성, 전암성 또는 형질전환된 세포를 지칭한다. 형질전환 바이러스에 의한 감염 및 새로운 게놈 핵산의 혼입 또는 외인성 핵산의 흡수로 인해 형질전환이 발생할 수 있지만, 자발적으로 또는 발암 물질에 노출된 후에 발생함으로써, 내인성 유전자를 돌연변시킬 수도 있다. 형질전환/암은, 예를 들어, 시험관내, 생체내 및 생체외에서, 누드 마우스 등과 같은 적합한 동물 숙주에서 형태학적 변화, 세포의 불멸화, 이상 성장 제어, 병소 형성, 증식, 악성 종양, 종양 특이적 마커 수준, 침습성, 종양 성장 또는 억제로 예시된다(Freshney, Culture of Anima Cells: A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)).
"성장을 저해한다"(예를 들어, 종양 세포와 같은 세포를 지칭함)는 당업계에 널리 공지된 적절한 제어 조건에서 성장된 동일한 세포의 성장과 비교할 때 치료제 또는 치료제 또는 약물의 조합물과 접촉될 때 시험관내 또는 생체내 세포 성장의 측정 가능한 감소를 지칭한다. 시험관내 또는 생체내 세포의 성장 저해는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 또는 100%일 수 있다. 세포 성장의 저해는 다양한 기전에 의해, 예를 들어, 세포자멸사, 괴사에 의해, 또는 세포 증식의 저해, 또는 세포 용해의 저해에 의해 일어날 수 있다.
용어 "벡터"는 생물학적 시스템 내에서 복제될 수 있거나 이러한 시스템 사이에서 이동될 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 벡터 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 생물학적 시스템에서 이러한 폴리뉴클레오타이드의 복제 또는 유지를 용이하게 하도록 기능하는 복제 기점, 폴리아데닐화 신호 또는 선택 마커와 같은 요소를 포함한다. 이러한 생물학적 시스템의 예는 세포, 바이러스, 동물, 식물, 및 벡터를 복제할 수 있는 생물학적 구성요소를 활용하는 재구성된 생물학적 시스템을 포함할 수 있다. 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 분자 또는 이들의 하이브리드일 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 발현 벡터에 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 번역을 지시하기 위해 생물학적 시스템에서 또는 재구성된 생물학적 시스템에서 이용될 수 있는 벡터를 의미한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 당-포스페이트 골격 또는 다른 동등한 공유 화학물질에 의해 공유 결합된 뉴클레오타이드의 사슬을 포함하는 분자를 의미한다. 이중 및 단일-가닥 DNA 및 RNA는 폴리뉴클레오타이드의 전형적인 예이다.
용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 폴리펩타이드를 형성하기 위해 펩타이드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 약 50개 미만의 아미노산으로 이루어진 작은 폴리펩타이드는 "펩타이드"로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "와 조합하여"는, 2가지 이상의 치료제가 단일 작용제로서 동시에 또는 임의의 순서로 단일 제제로서 순차적으로 혼합물로 함께 대상체에게 투여될 수 있다는 것을 의미한다.
용어 "이종성"은 기재된 폴리펩타이드가 상이한 세포 유형 또는 상이한 종으로부터 유래되었고 자연에서 존재하지 않는 것을 의미한다.
본 실시형태는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인을 제공하고, 따라서 치료 용도 및 진단 용도에서 광범위하게 사용될 수 있다. FN3 폴리펩타이드는 하나 이상의 베타-가닥 및 하나 이상의 루프를 포함하는 도메인을 가지며, 이는 무작위화되어 단백질 스캐폴드를 생성하고 높은 친화도로 표적 분자에 특이적으로 결합하는 단백질 스캐폴드를 선택할 수 있다. 공개된 FN3-기반 도메인 라이브러리는 상부 또는 하부 루프, 항체 가변 사슬에서 CDR과 구조적으로 유사한 영역을 다양화하여, 만곡된 결합 표면을 제공함으로써 생성되었다. 대조적으로, 높은 친화성 결합 분자는 오목한 상호작용 표면을 나타내는 본 명세서에서 제공되는 FN3 도메인 라이브러리로부터 선택될 수 있고, 이는 참조 서열에 기반하여 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 대체 표면을 무작위화함으로써 생성된다. 이것은, 예를 들어, 높은 친화성 결합 단백질 스캐폴드가 선택될 수 있는 에피토프 및 표적의 수를 증가시키기 위해 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보성 핵산, 벡터, 숙주세포, 및 이들을 제조하고 사용하는 방법이 제공된다. 본 실시형태는 또한 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 FN3 도메인의 라이브러리를 제조하는 방법 및 전술한 것으로 구성된 라이브러리르 제공한다.
파이브로넥틴 유형 III 도메인
파이브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인(또는 모듈)은 초기에 파이브로넥틴에서 식별되고 현재 세포 표면 수용체, 세포외 기질 단백질s, 효소 및 근육 단백질을 포함하는 다양한 동물 단백질 패밀리에 존재하는 것으로 공지된 프로토타입 반복 도메인이다. 구조적으로 FN3 도메인은, 이황화 결합의 결여를 제외하고, 면역글로불린-유사 도메인의 토폴로지와 매우 유사한 토폴로지를 갖는다. 당업계에 공지된 바와 같이, 천연 발생 FN3 도메인은 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG 루프로 지칭되는 6개의 루프로 연결된 A, B, C, D, E, F 및 G로 지칭되는 7개의 베타-가닥을 갖는 베타-샌드위치 구조를 갖는다(Bork and Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89, 8990-8992, 1992; 미국 특허 번호 6,673,901). 3개의 루프인, BC, DE 및 FG 루프는 FN3 도메인의 상부에 있고, 3개의 AB, CD 및 EF 루프는 도메인의 하부에 있다. FN3 도메인 형태는 고도로 보존되지만, 아미노산 수준에서 상이한 도메인 사이의 유사성은 상당히 낮다. FN3 도메인은 천연 또는 비천연 발생일 수 있다. 예시적인 비천연 발생 FN3 도메인은 소정의 단백질에 존재하는 선택 FN3 도메인의 정렬을 기반으로 설계되고 각각의 위치에서 가장 보존된(빈번한) 아미노산을 혼입시켜 비천연 발생 FN3 도메인을 생성시키는 컨센서스 FN3 도메인이다. 예를 들어, 비천연 발생 FN3 도메인은 인간 테나신 C로부터의 15개의 FN3 도메인의 컨센서스 서열에 기초하여, 또는 인간 파이브로넥틴으로부터의 15개의 FN3 도메인의 컨센서스 서열에 기초하여 설계된다. 이들 비천연 발생 FN3 도메인은 FN3 도메인의 전형적인 토폴로지를 유지하고, 야생형 FN3 도메인과 비교할 때 개선된 안정성과 같은 개선된 특성을 나타낼 수 있다. 예시적인 비천연 발생 FN3 도메인은 미국 특허 공개 번호 2010/0216708 및 미국 특허 공개 번호 2010/0255056에 기재된 텐콘 도메인과 피브콘(Fibcon) 도메인이다. 그러나, 개선된 결합 분자에 대한 필요성이 여전히 있다.
각각의 루프 및 각각의 베타-가닥을 규정하는 아미노산 잔기는 본 명세서에 기재된 FN3 스캐폴드에 대해서 표 1에 나타낸다. 각각의 도메인/영역에 대해서 아래에 나타낸 잔기는 2개의 서열, 즉, 서열번호 44의 기준 서열인 하나와, 질의 서열인 다른 하나를 정렬시킴으로써 또 다른 서열에 대해서 결정될 수 있다. 이들은, 예를 들어, Blastp(NBCI를 통해 입수 가능함)를 사용하여 정렬되어, 디폴트 세팅을 사용하여 2개의 서열을 정렬시킬 수 있다.
라이브러리 또는 또 다른 서열을 생성하기 위한 FN3 도메인의 가변성은 다음 영역 중 하나 이상에서 수행될 수 있다: C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 및 G 베타-가닥, 이는 "C-CD-D-F-FG-G 대체 표면"으로 지칭될 수 있다.
이 대체 표면은 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 다른 표적 분자와 같은 표적 모이어티와 결합하는 데 사용될 수 있는 폴리펩타이드의 라이브러리를 생성하기 위해 특정 위치에서 컨센서스 서열 및 돌연변이 잔기에 기초하여 다양화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 라이브러리는 서열번호 44의 컨센서스 서열에 기초하는 복수의 단백질을 포함한다:
여기서 각각의 X는, 독립적으로, 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, 서열번호 44의 선두 메티오닌은 제거될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 라이브러리는 서열번호 74의 컨센서스 서열에 기초하는 복수의 단백질을 포함한다:
여기서 각각의 X는, 독립적으로, 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이다.
본 명세서에서 FN3 도메인에 기재될 수 있는 대체 표면은 각각의 FN3 도메인에서 아미노산의 비인접 스트레치에 의해 암호화된다. 예를 들어, C-CD-D-F-FG-G 표면은 예를 들어, 표 2에 나타낸 바와 같은, 서열번호 44의 29 내지 37, 38 내지 43, 44 내지 50, 65 내지 74, 75 내지 80 및 81 내지 90번의 아미노산 서열 잔기에 의해 형성된다. 일부 실시형태에서, C-CD-D-F-FG-G 표면은 서열번호 44의 아미노산 잔기 29 내지 37, 38 내지 43, 44 내지 50, 65 내지 74, 75 내지 80 및 81 내지 90번을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되되, 폴리펩타이드는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 서열번호 44의 각각의 X는, 독립적으로, 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 서열번호 44의 각각의 X는 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공되되, 폴리펩타이드는 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 서열번호 74의 각각의 X는, 독립적으로, 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 서열번호 74의 각각의 X는 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이다.
랜덤화 대체 표면에 기반한 단백질 스캐폴드
일부 실시형태에서, 단리된 단백질 스캐폴드는 대체 표면을 포함하는 FN3 도메인을 포함하되, 여기서 대체 표면은 대체 표면을 형성하는 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면의 영역에 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는 서열번호 44의 아미노산 서열의 적어도 또는 약, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 단백질 또는 복수의 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 서열번호 24와 적어도 또는 약, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 서열번호 24의 32, 34, 36, 38, 39, 40, 41, 46, 48, 68, 70, 72, 78, 79, 81, 85 및/또는 87번 위치에 하나 이상의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이들 위치는 새로운 FN3 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 라이브러리를 생성하도록 돌이변이될 수 있는, 아래 표 2에 예시된 바와 같은 도메인에 대응한다.
일부 실시형태에서, 단백질 스캐폴드 또는 라이브러리는 C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 및 G 베타-가닥에 의해 형성된 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 스캐폴드 또는 라이브러리는 C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 및 G 베타-가닥을 포함하는 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 스캐폴드 또는 라이브러리는 다양한 C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 및/또는 베타-가닥을 포함하는 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 포함한다.
일부 실시형태에서, C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 형성하는 C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 또는 G 베타-가닥은 표 2에 나타낸 바와 같은 그리고 서열번호 45 내지 48의 소정의 아미노산 서열을 포함한다.
여기서 각각의 X는, 독립적으로, 임의의 아미노산이고, 일부 실시형태에서, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 1, 2 또는 3개의 잔기에 치환을 갖는 아미노산 서열 TGYXVXYXE(서열번호 45)를 갖는 C 베타-가닥을 포함하되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 1, 2, 3 또는 4개의 잔기에 치환을 갖는 XXXXGE(서열번호 46)의 아미노산 서열을 갖는 CD 루프를 포함하되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 1 또는 2개의 잔기에서 치환을 갖는 아미노산 서열 WKXVXVP(서열번호 47)를 갖는 D 베타-가닥을 포함하되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 1, 2 또는 3개의 잔기에 치환을 갖는 아미노산 서열 TEYXFXVXAV(서열번호 48)를 갖는 F 베타-가닥을 포함하되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 1 또는 2개의 잔기에 치환을 갖는 아미노산 서열 NGAXXG(서열번호 49)를 갖는 FG 루프를 포함하되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 1, 2 또는 3개의 잔기에 치환을 갖는 아미노산 서열 XPSQXVXVTT(서열번호 50)를 갖는 F 베타-가닥을 포함하되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는 TGYXVXYXE(서열번호 45), XXXXGE(서열번호 46), WKXVXVP(서열번호 47), TEYXFXVXAV(서열번호 48), NGAXXG(서열번호 49) 및 XPSQXVXVTT(서열번호 50)의 서열을 포함하는 복수의 폴리펩타이드를 포함하되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 1의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 2의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 3의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 4의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 5의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 6의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 7의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 8의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 9의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 10의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 11의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 12의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 13의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 14의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 15의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 16의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 17의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 18의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 19의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 20의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 21의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 22의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 23의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 24의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 25의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 26의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 27의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 28의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 29의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 30의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 31의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 32의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 33의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 34의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 35의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 36의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 37의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 38의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 39의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 40의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 41의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 42의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는, 서열번호 43의 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 컨센서스 또는 참조 서열에 기초한 얻어진 FN3 도메인은, 예를 들어, 안정성 개선, 면역원성 감소, 결합 친화성, 온-레이트(on-rate), 오프-레이트(off-rate), 반감기, 용해도 또는 임의의 다른 적합한 특징의 향상을 목적으로, 본 명세서에서 제공되는 것들과 같은 대체 표면 외부 또는 내에 존재하는 잔기에서 추가로 변형될 수 있다. 이 목적을 달성하기 위한 하나의 방식에서, 스캐폴드 단백질은 모(parental) 서열 및 조작된 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 각종 개념적인 조작된 산물의 분석 과정에 의해 선택적으로 제조될 수 있다. 3차원 모델은 통상 입수 가능하고 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 표시하며 가능한 면역원성을 측정할 수 있는 컴퓨터 프로그램(예를 들어, 캘리포니아주 몬로비아에 소재한 Xencor사의 Immunofilter 프로그램)이 이용 가능하다. 이들 디스플레이의 조사는 후보 서열의 작용화에서의 잔기, 즉, 스캐폴드 단백질의 안정성 또는 후보 스캐폴드 단백질이 이의 표적 분자에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 가능성 있는 역할의 분석을 허용한다. 이러한 방식에서, 잔기는 모 서열 및 참조 서열로부터 선택되고 조합될 수 있어, 개선된 스캐폴드 안정성과 같은 목적하는 특징이 달성되게 된다. 상기 절차에 대안적으로 또는 부가하여, 당업계에 공지된 바와 같은 다른 적합한 조작 방법이 사용될 수 있다.
FN3 도메인의 바람직한 물리적 특성은 열 접힘 및 펼침의 높은 열 안정성 및 가역성을 포함한다. 매우 유사한 열안정성 서열과의 비교에 기초한 합리적 설계, 이황화 가교의 안정화 설계, 알파-나선 경향을 증가시키기 위한 돌연변이, 염 다리(salt bridge)의 조작, 단백질의 표면 전하의 변경, 유도 진화, 및 컨센서스 서열의 조성을 비롯한 여러 방법이 단백질 및 효소의 명백한 열 안정성을 증가시키기 위해 적용되었다(Lehmann and Wyss, Curr Opin Biotechnol, 12, 371-375, 2001). 높은 열 안정성은 발현된 단백질의 수율을 증가시키고, 용해도 또는 활성을 개선시키며, 면역원성을 감소시키고, 제조 시 콜드 체인(cold chain)의 필요성을 최소화할 수 있다.
FN3 도메인의 임의의 특징을 개선하기 위해 치환될 수 있는 잔기는 치환을 만들고 스캐폴드의 원하는 특징을 검정함으로써 결정될 수 있다.
안정성 손실의 관점에서, 즉, 단백질의 "변성시키는" 또는 "변성"은 활성 및/또는 용해도의 동반 손실로 인해 단백질의 기능적 특성을 부여하는 3차원 구조의 일부 또는 전부가 손실되는 과정을 의미한다. 변성 동안 붕괴되는 힘은 분자내 결합, 예를 들어, 정전기, 소수성, 반데르발스 힘, 수소 결합 및 이황화물을 포함한다. 단백질 변성은 기계적 힘(예를 들어, 압축력 또는 전단력), 열, 삼투압 응력(osmotic stress), pH 변화, 전기장 또는 자기장, 이온화 방사선, 자외선 방사선 및 탈수와 같은 단백질 또는 단백질을 포함하는 용액에 가해지는 힘, 및 화학적 변성에 의해 야기될 수 있다.
단백질 안정성 및 단백질 능력의 측정은 단백질 통합의 동일한 또는 상이한 양상으로서 간주될 수 있다. 단백질은 열에 의해, 자외선 또는 이온화 방사선, 액체 용액에서 주위 삼투농도 및 pH의 변화, 작은 기공 크기 여과에 의해 부과되는 기계적 전단력, 자외선 방사선, 이온화 방사선에 의해, 예컨대, 감마 방사선에 의해, 화학적 또는 열 탈수, 또는 단백질 구조 파괴를 야기할 수 있는 임의의 다른 작용 또는 힘에 의해 야기되는 변성에 민감하거나 "불안정"하다. 분자의 안정성은 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 분자의 안정성은, 표준 방법을 사용하여, 열 용융(thermal melting)("TM") 온도, 분자의 ½이 펼쳐지는 °섭씨(℃) 온도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 전형적으로, TM이 높을수록, 분자는 더 안정적이다. 열에 부가하여, 화학적 환경은 또한 특정 3차원 구조를 유지하는 단백질의 능력을 변화시킨다.
일부 실시형태에서, FN3 도메인은 TM의 증가에 의해 측정된 조작 전의 동일한 도메인에 비해서 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과만큼 증가된 안정성을 나타낸다.
화학적 변성은 마찬가지로 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 화학적 변성제는 구아니디늄 하이드로클로라이드, 구아니디늄 티오사이아네이트, 우레아, 아세톤, 유기 용매(DMF, 벤젠, 아세토나이트릴), 염(암모늄 설페이트 리튬 브로마이드, 리튬 클로라이드, 나트륨 브로마이드, 칼슘 클로라이드, 나트륨 클로라이드); 환원제(예를 들어, 다이티오트레이톨, 베타-머캅토에탄올, 다이나이트로티오벤젠, 및 수소화물, 예컨대, 붕수소화나트륨), 비이온성 및 이온성 세제, 산(예를 들어, 염산(HCl), 아세트산(CH3COOH), 할로겐화 아세트산), 소수성 분자(예를 들어, 인지질) 및 표적화된 변성제를 포함한다. 변성 정도의 정량화는, 표적 분자에 결합하는 능력과 같은 기능적 특성의 손실, 또는 응집 경향, 이전의 용매 접근 불가능한 잔기의 노출, 또는 이황화 결합의 파괴 또는 형성과 같은 물리화학적 특성에 의해 의존할 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 화학적 변성제로서 구아니디늄 하이드로클로라이드를 사용하여 측정 시 조작 전의 동일한 스캐폴드에 비해서 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 초과만큼 증가된 안정성을 나타낸다. 증가된 안정성은 잘 알려진 방법을 사용하여 증가하는 농도의 구아니딘 하이드로클로라이드로 처리 시 감소된 트립토판 형광의 함수로서 측정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 FN3 도메인은 2개 이상의 상이한 표적 분자를 동시에 결합시키는 이중- 또는 다중특이성 스캐폴드를 생성하기 위해, 예를 들어, 표적 분자 결합의 원자가를 증가시키고 따라서 결합력을 증가시키기 위한 수단으로서 단량체, 이량체 또는 다량체로서 생성될 수 있다. 이량체 및 다량체는 단일특이성, 이중- 또는 다중특이성 단백질 스캐폴드를 연결함으로써, 예를 들어, 아미노산 링커, 예를 들어, 폴리-글리신, 글리신 및 세린 또는 알라닌 및 프롤린을 함유하는 링커를 포함시킴으로써 생성될 수 있다. 폴리펩타이드를 신규 연결된 융합 폴리펩타이드에 연결하기 위한 천연 발생뿐만 아니라 인공 펩타이드 링커의 사용은 문헌에 잘 알려져 있다(Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; 미국 특허 번호 5,856,456).
FN3 도메인은 이중특이적 분자로서 사용될 수 있으며, 여기서 도메인 내의 제1 대체 표면은 제1 표적 분자에 대한 특이성을 갖고, 동일한 도메인 내의 제2 대체 표면은 제2 표적 분자에 대한 특이성을 갖는다.
FN3 도메인은, 예를 들어, 공유적 상호작용을 통해 다른 서브유닛을 혼입시킬 수 있다. 항체 불변 영역의 전부 또는 일부는 Fe 영역과 연관된 특성, 예를 들어, 보체 활성, 반감기 등을 부여하기 위해 FN3 도메인에 부착될 수 있다. 예를 들어, Clq 결합, 보체 의존적 세포독성(complement dependent cytotoxicity: CDC), Fe 수용체 결합, 항체-의존적 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC), 식세포 작용, 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등과 같은 Fe 효과기 기능은 이들 활성을 담당하는 Fe에서 잔기를 변형시킴으로써 제공 및/또는 제어될 수 있다(검토를 위하여; 문헌[Strohl, Curr Opin Biotechnol. 20, 685-691, 2009]을 참조한다).
목적하는 특성을 위해 독신 접합체, 알부민 또는 알부민 결합제, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자, 예컨대, PEG5000 또는 PEG20,000, 다양한 사슬 길이의 지방산 및 지방산 에스터, 예를 들어, 라우레이트, 미리스테이트, 스테아레이트, 아라키데이트, 베헤네이트, 올레에이트, 아라키도네이트, 옥탄다이오산, 테트라데칸다이오산, 옥타데칸다이오산, 도코산다이오산 등, 폴리라이신, 옥탄, 탄수화물(덱스트란, 셀룰로스, 올리고- 또는 다당류)과 같은 추가적인 모이어티가 FN3 도메인에 혼입 또는 접합될 수 있다. 이들 모이어티는 단백질 코딩 서열과의 직접 융합체일 수 있고, 표준 클로닝 및 발현 기법에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 잘 알려진 화학적 커플링 방법이 본 명세서에 기재된 FN3 도메인을 재조합적으로 생산하는 모이어티를 부착시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, FN3은 안티센스 분자, siRNA, PMO 등과 같은 핵산 분자와 접합된다.
추가의 모이어티를 혼입하는 FN3 도메인은 몇몇 잘 알려진 검정에 의해 기능성에 대해 비교될 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인 및/또는 Fc 도메인 변이체의 혼입에 의한 변경된 FN3 도메인 특성은, FcyRI, FcyRII, FcyRIII 또는 FcRn 수용체와 같은 수용체의 가용성 형태를 사용하여, 또는 예를 들어 ADCC 또는 CDC를 측정하거나 단백질 스캐폴드 약동학적 특성을 생체내 모델에서 평가하는 잘 알려진 세포-기반 검정을 사용하여 Fc 수용체 결합 검정에서 검정될 수 있다.
FN3 도메인 단백질의 생성 및 생산
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 대체 표면을 포함하는 FN3 도메인의 라이브러리를 제조하는 방법이 제공되되, 여기서 대체 표면은 참조 FN3 도메인과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시형태에서, 방법은, 참조 FN3 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계; 대체 표면을 무작위화함으로써 참조 FN3 도메인의 폴리뉴클레오타이드 서열의 라이브러리를 생성하는 단계; 라이브러리를 시험관내에서 번역하거나 라이브러리를 숙주 내에서 발현하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 및 G 베타-가닥에 의해 형성된 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 갖는 FN3 폴리펩타이드의 라이브러리를 제조하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 서열번호 44의 아미노산 서열과 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 참조 FN3 도메인 폴리펩타이드를 제공하는 단계; 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 갖는 FN3 도메인 라이브러리를 형성하는 C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 및 G 베타-가닥에서 적어도 하나의 잔기를 돌연변이시킴으로써 컨센서스 FN3 도메인 폴리펩타이드에 다양성을 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 다양한 C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프, 또는 G 베타-가닥을 포함하는 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 갖는 FN3 폴리펩타이드의 라이브러리를 제조하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 서열번호 44의 아미노산 서열과 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 참조 FN3 도메인 폴리펩타이드를 제공하는 단계; 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 갖는 FN3 도메인 라이브러리를 형성하는 C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 및 G 베타-가닥에서 적어도 하나의 잔기를 돌연변이시킴으로써 컨센서스 FN3 도메인 폴리펩타이드에 다양성을 도입하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 기재된 라이브러리를 제조하는 방법에서, 서열번호 44의 C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 및 G 베타-가닥 중 어느 하나에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 잔기가 돌연변이 또는 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 치환, 삽입 또는 결실이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 방법에 의해 생산되는 라이브러리가 제공된다. 스캐폴드 단백질, FN3 도메인(폴리펩타이드 또는 모듈)의 생성은, 예를 들어, 핵산 수준에서 달성된다. 하나 이상의 특정 잔기에서 치환된 코돈을 갖는 FN3 도메인의 라이브러리는, 예를 들어, 표준 PCR 클로닝 방법, 또는 미국 특허 번호 6,521,427 및 미국 특허 번호 6,670,127에 기재된 방법에 따른 화학적 유전자 합성을 사용하여 합성될 수 있다. 코돈은 널리 공지된 방법, 예를 들어, 설계된 다양성과 일치하는 축중 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 또는 Kunkel 돌연변이(Kunkel et al., Methods Enzymol. 154, 367-382, 1987)를 사용하여 무작위화될 수 있다.
라이브러리는 아미노산의 무작위 또는 정의된 세트를 사용하여 선택된 코돈에서 무작위화될 수 있다. 예를 들어, 무작위 치환을 갖는 라이브러리에서의 변이체는 NNK 코돈을 사용하여 생성될 수 있으며, 이는 모든 20개의 천연 발생 아미노산을 암호화한다. 다른 다양화 방식에서, DVK 코돈은 아미노산 Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly 및 Cys를 암호화하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, NNS 코돈을 사용하여 모든 20개의 아미노산 잔기를 생성하고, 동시에 정지 코돈의 빈도를 감소시킬 수 있다. 코돈 지정은 잘 알려진 IUB 코드에 따른다. 일부 실시형태에서, 다양화는 돌연변이된 잔기에서 옵션으로서 메티오닌 및/또는 시스테인을 포함하지 않고 수행된다.
임의의 다른 단백질로서의 FN3 도메인은 다양한 물리적 및/또는 화학적 불안정성이 생기기 쉬워, 하류 처리에 악영향을 미친다. 예를 들어, 물리적 및 화학적 불안정성은 응집, 분해, 생성물 수율 감소, 효능 손실, 면역원성에 대한 가능성 증가, 분자 이질성(heterogeneicity) 및 활성 손실을 초래할 수 있다. 따라서, 가능한 불안정성-유도 잔기 및 인식 서열의 존재는 라이브러리의 설계 동안 최소화될 수 있다. 예를 들어, 표면 노출된 메티오닌 및 트립토판은 저장 조건에서 산화될 수 있으며, 이는 아마도 단백질 스캐폴드 효능의 손실을 초래할 수 있다. 널리 공지된 N-글리코실화 인식 부위(NXS/T)에 기여하는 것 외에도 아스파라긴의 존재는 글리신이 뒤따를 때 탈아마이드화되어 이질성을 발생시킬 수 있다(Robinson, Proc Natl Acad Sci US A, 99, 5283-5288, 2002). 따라서, 이들 아미노산의 일부 또는 전부는 선택된 위치를 무작위화하는 데 사용되는 혼합물로부터 생략될 수 있거나 생략되지 않을 수 있다. 또한, 이황화 가교 형성 및 베타 시트의 파괴를 최소화하기 위해 시스테인 및 프랄린이 생략될 수 있다.
다양화될 위치에서 편향된 아미노산 분포를 갖는 FN3 도메인의 라이브러리는, 예를 들어, Slonomics® 기술(http:_//www_sloning_com)을 사용하여 합성될 수 있다. 이 기술은 수천 개의 유전자 합성 과정에 충분한 범용 빌딩 블록으로서 작용하는 사전 제조된 이중 가닥 삼중항의 라이브러리를 사용한다. 삼중항 라이브러리는 임의의 목적하는 DNA 분자를 구축하는 데 필요한 모든 가능한 서열 조합을 나타낸다.
소정의 위치에서 선택된 뉴클레오타이드 "축중"(degeneracy)으로 올리고뉴클레오타이드의 합성은 그 종래 기술, 예를 들어, TRIM 접근법에서 잘 알려져 있다(Knappek et al., J Mal Biol 296, 57-86, 1999; Garrard & Renner, Gene 128,103-109, 1993). 소정의 코돈 세트를 갖는 이러한 뉴클레오타이드의 세트는 상업적으로 입수 가능한 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 시약 및 장치를 사용하여 합성될 수 있다.
표준 클로닝 및 발현 기술을 사용하여, 라이브러리를 벡터에 클로닝하거나 라이브러리의 이중 가닥 cDNA 카세트를 합성하고, 라이브러리를 발현하거나, 시험관 내에서 번역한다. 예를 들어, 시스-디스플레이를 사용하여, 스캐폴드 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 RepA를 암호화하는 DNA 단편에 결찰시켜 시험관내 번역 후에 형성된 단백질-DNA 복합체의 풀을 생성할 수 있으며, 여기서 각각의 단백질은 이를 암호화하는 DNA와 안정적으로 회합된다(미국 특허 번호 7,842,476; Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U SA 101, 2806-2810, 2004). 다른 방법, 예를 들어, 리보솜 디스플레이(Hanes and Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 4937-4942, 1997), mRNA 디스플레이(Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297-12302, 1997) 또는 다른 무세포 시스템(미국 특허 번호 5,643,768)이 사용될 수 있다. 단백질 스캐폴드의 라이브러리는, 예를 들어, 임의의 적합한 박테리오파지의 표면상에 디스플레이된 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 박테리오파지의 표면상에 융합 폴리펩타이드를 디스플레이하는 방법은 잘 알려져 있다(미국 특허 공개 번호 2011/0118144; 국제 특허 공개 번호 WO2009/085462; 미국 특허 번호 6,969,108; 미국 특허 번호 6,172,197; 미국 특허 번호 5,223,409; 미국 특허 번호 6,582,915; 미국 특허 번호 6,472,147).
스크리닝
표적 분자에 대한 특이적 결합에 대해 조작된 단백질 FN3 도메인 또는 FN3 도메인 변이체의 라이브러리를 스크리닝하는 것은, 예를 들어, 실시예 및 문헌[Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci US 101, 2806-2810, 2004]에 기재된 바와 같은 시스 디스플레이를 사용하여 라이브러리를 생산하고, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 표적 분자에 대한 특이적 결합에 대해 라이브러리를 검정함으로써 달성될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 잘 알려진 방법은 ELISA, 샌드위치 면역검정 및 경쟁적 및 비경쟁적 검정이다(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York] 참조). FN3 도메인은 광범위한 친화도(KD)로 인간 또는 다른 포유동물 단백질에 결합할 수 있다- 전형적으로 FN3 도메인은 당업자에 의해 실시되는 바와 같은, 표면 플라스몬 공명 또는 Kinexa 방법에 의해 결정 시 약 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M, 10-12M, 10-13M, 10-14M 또는 10-15M 이하의 KD로 표적 단백질에 결합할 수 있다. 항원에 대한 FN3 도메인의 친화성은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992)]; 및 본 명세서에 기재된 방법 참조). 특정 FN3 도메인-항원 상호작용의 측정된 친화성은 상이한 조건(예를 들어, 삼투농도, pH)하에서 측정된다면 변할 수 있다. 따라서, 친화성 및 다른 항원-결합 파라미터(예를 들어, KD, Kon, Koff)의 측정은 바람직하게는 단백질 스캐폴드 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충액, 예컨대, 본 명세서에 기재된 완충액으로 이루어진다. 다른 스크리닝 방법은 또한 미국 특허 번호 7,842,476 및 미국 특허 번호 8,679,781에 기재되어 있으며, 이들은 각각 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
핵산 분자 및 벡터
본 개시내용은 단리된 폴리뉴클레오타이드로서 또는 발현 벡터의 부분으로서, 또는 시험관내 전사/번역에 사용되는 선형 DNA 서열, 원핵생물, 진핵생물 또는 사상 파지 발현, 조성물 또는 이의 유도 돌연변이원의 분비 및/또는 디스플레이와 상용성인 벡터를 비롯한 선형 DNA 서열의 부분으로서 FN3을 암호화하는 핵산을 제공한다. 소정의 예시적인 폴리뉴클레오타이드가 본 명세서에 개시되어 있지만, 주어진 발현 시스템에서 유전자 코드 또는 코돈 선호도의 축중이 부여되면, 본 명세서에 개시된 단백질 스캐폴드 및 단백질 스캐폴드의 라이브러리를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오타이드가 또한 상기 범위 내이다.
본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드는 자동화된 폴리뉴클레오타이드 합성기상에서 고체상 폴리뉴클레오타이드 합성과 같은 화학적 합성에 의해 생산될 수 있고, 완전한 단일 또는 이중 가닥 분자로 조립될 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드는 PCR에 이어서 일상적인 클로닝과 같은 다른 기술에 의해 생산될 수 있다. 주어진 공지된 서열의 폴리뉴클레오타이드를 생산하거나 얻는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 비-코딩 서열, 예컨대, 프로모터 또는 인핸서 서열, 인트론, 폴리아데닐화 신호, RepA 결합을 용이하게 하는 시스 서열 등을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한, 예를 들어, 단백질의 정제 또는 검출을 용이하게 하기 위해 마커 또는 태그 서열, 예컨대, 히스티딘 태그 또는 HA 태그, 융합 단백질 파트너, 예컨대, RepA, Fe 또는 박테리오파지 코트 단백질, 예컨대 pIX 또는 pIII을 암호화하는 추가의 아미노산을 암호화하는 추가의 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 폴리뉴클레오타이드는 Tac 프로모터에 대한 서열, FN3 도메인 라이브러리 및 repA를 암호화하는 서열, 시스 요소 및 박테리아 복제 기점(ori)을 포함한다. 또 다른 예시적인 폴리뉴클레오타이드는 pelB 또는 ompA 신호 서열, pIII 또는 pIX 박테리오파지 코트 단백질, FN3 도메인 및 폴리A 부위를 포함한다.
또 다른 실시형태는 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터이다. 이러한 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 발현을 위한 벡터, 트랜스포존 기반 벡터 또는 임의의 수단에 의해 주어진 유기체 또는 유전적 배경 내로 폴리뉴클레오타이드를 도입하기에 적합한 임의의 다른 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 이러한 벡터에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 발현을 제어, 조절, 초래 또는 허용할 수 있는 핵산 서열 요소를 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 이러한 요소는 인핸서 결합 부위, RNA 폴리머라제 개시 부위, 리보솜 결합 부위, 및 주어진 발현 시스템에서 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 촉진하는 다른 부위를 포함할 수 있다. 이러한 발현 시스템은 당업계에 잘 알려진 세포 기반 또는 무세포 시스템일 수 있다.
숙주세포 선택 또는 숙주세포 조작
본 명세서에 개시된 FN3 도메인은, 당업계에 잘 알려진 바와 같은, 세포주, 혼합 세포주, 불멸화된 세포 또는 불멸화된 세포의 클론 집단에 의해 선택적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)]을 참조한다.
발현을 위해 선택된 숙주 세포는 포유류 기원의 것일 수 있거나, COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종, 림프종, 효모, 곤충 또는 식물 세포, 또는 이의 임의의 유도체, 불멸화 또는 형질전환 세포로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 숙주세포는 폴리펩타이드를 글리코실화할 수 없는 종 또는 유기체, 예를 들어, 원핵 세포 또는 유기체, 예컨대, BL21, BL2l(DE3), BL21-GOLD(DE3), XLl-Blue, JM109, HMSl 74, HMSl 74(DE3), 및 임의의 천연 또는 조작된 이.콜라이(E.coli) 종, 클렙시엘라(Klebsiella) 종, 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 종 균주로부터 선택될 수 있다.
FN3 도메인의 사용
본 명세서에 기재되고 위에서 기재된 방법 중 임의의 방법에 의해 생성된 FN3 도메인(모듈)-기반 분자의 조성물은 인간 질환 또는 세포, 조직, 기관, 체액 또는 일반적으로 숙주의 특정 병리의 증상을 진단, 모니터링, 조정, 치료, 완화, 발병의 예방을 돕거나 증상을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 특정 목적을 위해 조작된 FN3 도메인은 면역-매개 또는 면역-결핍 질환, 대사 질환, 심혈관 장애 또는 질환; 악성 질환; 신경계 장애 또는 질환; 감염, 예컨대, 박테리아, 바이러스 또는 기생충 감염; 또는 종창, 통증, 및 조직 괴사 또는 섬유증을 비롯한 다른 공지되거나 특정된 관련 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다.
이러한 방법은 증상, 효과 또는 기전의 조절, 치료, 완화, 예방 또는 감소를 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 표적 분자와 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 FN3 도메인을 포함하는, 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 유효량은, 본 명세서에 기재되거나 관련 분야에서 공지된 바와 같은 기지의 방법을 사용하여 수행되고 결정된 바와 같은, 단일(예를 들어, 볼루스), 다회 또는 연속 투여당 약 0.001 내지 500 mg/kg의 양, 또는 단일, 다회 또는 연속 투여당 0.01 내지 5000 μg/ml의 혈청 농도, 또는 그 안의 임의의 유효 범위 또는 값을 달성하기 위한 양을 포함할 수 있다.
FN3 폴리펩타이드는 치료제의 전달을 용이하게 하기 위해 또 다른 치료제에 연결될 수 있다. 따라서, FN3 폴리펩타이드는, FN3 폴리펩타이드가 결합하는 표적, 예컨대, CD71을 발현하는 세포에 치료제를 전달하는 데 사용될 수 있다.
FN3 도메인 기반 단백질을 포함하는 약제학적 조성물
변형된 또는 비변형, 단량체, 이량체 또는 다량체, 단일-, 이중- 또는 다중-특이적인 표적 분자에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은, 포획, 고정화, 분획화 또는 침강을 위해 당업계에 잘 알려진 분리 절차를 사용하여 단리되고, 상업적 적용성을 위해 필요한 정도로 정제될 수 있다. 이들은 또한 핵산 분자 또는 다른 치료제와 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 siRNA 또는 안티센스 분자이다.
치료 용도를 위하여, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은약제학적으로 허용 가능한 담체 내에 활성 성분으로서 유효량의 FN3 도메인을 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. 용어 "담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 비히클은 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들을 포함하는 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 식염수 및 0.3% 글리신이 사용될 수 있다. 이러한 용액은 멸균이고, 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들은 통상 잘 알려진 멸균 수법(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 안정화제, 증점제, 윤활제 및 착색제 등과 같은 생리학적 조건을 근사화하는 데 요구되는 바와 같은 약제학적으로 허용 가능한 보조 물질을 함유할 수 있다. 이러한 약제학적 제형 중 제제의 농도는 광범위하게, 즉, 중량 기준으로 약 0.5% 미만에서부터, 보통 정확히 또는 적어도 약 1% 내지 최대 15 또는 20%까지 다양할 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라 필요한 용량, 유체 부피, 점도 등에 기초하여 주로 선택될 것이다. 다른 인간 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민을 비롯한 적합한 비히클 및 제형은, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, 특히 pp. 958-989]에 기재되어 있다.
표적 분자에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인의 치료 용도를 위한 투여 방식은, 제제를 숙주에게 전달하는 임의의 적합한 경로, 예컨대, 비경구 투여, 예를 들어, 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내 또는 피하, 폐; 경점막(경구, 비강내, 질내, 직장)일 수 있거나; 정제, 캡슐, 용액, 분말, 겔, 입자로; 그리고 주사기, 이식 장치, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로 펌프; 또는 당업계에 잘 알려진 바와 같이 당업자가 인정하는 다른 수단에 포함된 제형을 사용하는 것일 수 있다. 부위 특이적 투여는, 예를 들어, 관절내, 기관지내, 복부내, 낭내(intracapsular), 연골내, 강내, 복내(intracelial), 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경관내, 위내, 간내, 심장내, 골내, 골반내, 심낭내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활막내, 흉부내, 자궁내, 혈관내, 방광내, 병변내, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내 또는 경피 전달에 의해 달성될 수 있다.
나열된 실시형태
본 명세서에서 제공되는 실시형태를 또한 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다:
실시형태를 일반적인 관점에서 기재하고 있지만, 소정의 실시형태는 다음의 예에 더욱 개시되는데, 이러한 예는 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
1. 다양한 C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 및 G 베타-가닥을 포함하는 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 갖는 복수의 파이브로넥틴 유형 III 모듈(FN3) 도메인(폴리펩타이드)을 포함하는 라이브러리로서, 상기 폴리펩타이드는,
의 아미노산 서열 또는 서열번호 44의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 각각의 X는, 독립적으로, 임의의 아미노산인, 라이브러리.
2. 실시형태 1에 있어서, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리.
3. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 상기 폴리펩타이드는, 상기 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 갖는 상기 FN3 도메인 라이브러리를 형성하는 상기 C 베타-가닥, 상기 CD 루프, 상기 D 베타-가닥, 상기 F 베타-가닥, 상기 FG 루프 또는 상기 G 베타-가닥 중 하나 이상에 또는 각각에 서열번호 24와 비교해서 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함하는, 라이브러리.
4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수의 폴리펩타이드는 서열번호 24의 32, 34, 36, 38, 39, 40, 41, 46, 48, 68, 70, 72, 78, 79, 81, 85 및/또는 87번 위치에 대응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실)를 갖는, 라이브러리.
5. 실시형태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 다양한 C 베타-가닥은 TGYXVXYXE(서열번호 45)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 다양한 CD 루프는 XXXXGE(서열번호 46)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리.
7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 다양한 D 베타-가닥은 WKXVXVP(서열번호 47)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리.
8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 다양한 F 베타-가닥은 TEYXFXVXAV(서열번호 48)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리.
9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 다양한 FG 루프는 NGAXXG(서열번호 49)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리.
10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 다양한 G 베타-가닥은 XPSQXVXVTT(서열번호 50)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리.
11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 라이브러리는, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 라이브러리.
12. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서,
상기 다양한 C 베타-가닥은 TGYXVXYXE(서열번호 45)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 CD 루프는 XXXXGE(서열번호 46)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 D 베타-가닥은 WKXVXVP(서열번호 47)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 F 베타-가닥은 TEYXFXVXAV(서열번호 48)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 FG 루프는 NGAXXG(서열번호 49)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고; 그리고
상기 다양한 G 베타-가닥은 XPSQXVXVTT(서열번호 50)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나의 라이브러리를 생산하는 방법으로서, 복수의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 단계를 포함하는, 방법.
14. C 베타-가닥, CD 루프, F 베타-가닥, FG 루프 및 G-베타 가닥 중 다양한 하나 이상 또는 각각을 포함하는 다양한 C-CD-F-FG-G 대체 표면을 갖는 유형 III의 파이브로넥틴 모듈(FN3) 도메인의 라이브러리를 제조하는 방법으로서,
a. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 또는 44의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 참조 FN3 도메인 폴리펩타이드를 제공하는 단계; 및
b. 상기 다양한 C-CD-F-FG-G 대체 표면을 갖는 FN3 도메인 라이브러리를 형성하는 상기 C 베타-가닥, CD 루프 영역, F 베타-가닥 영역, FG 루프 영역 또는 G-베타 가닥 영역에서 적어도 하나의 잔기를 돌연변이시킴으로써 상기 참조 FN3 도메인 폴리펩타이드에 다양성을 도입하는 단계
를 포함하되,
상기 다양한 C 베타-가닥은 TGYXVXYXE(서열번호 45)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 CD 루프는 XXXXGE(서열번호 46)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 D 베타-가닥은 WKXVXVP(서열번호 47)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 F 베타-가닥은 TEYXFXVXAV(서열번호 48)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 FG 루프는 NGAXXG(서열번호 49)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고; 그리고
상기 다양한 G 베타-가닥은 XPSQXVXVTT(서열번호 50)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 방법.
15. 실시형태 13 또는 14의 방법에 의해 생산된 라이브러리.
16. 표적 분자에 결합하거나 특이적으로 결합하는 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 갖는 파이브로넥틴 유형 III 모듈(FN3) 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 얻는 방법으로서, 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나의 라이브러리를 상기 표적 분자와 접촉시키는 단계 및 상기 표적 분자에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상기 폴리펩타이드를 단리시키는 단계를 포함하는, 방법.
17. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
18. 폴리펩타이드로서,
의 아미노산 서열을 포함하되, 각각의 X는, 독립적으로, 임의의 아미노산인, 폴리펩타이드.
19. 실시형태 18에 있어서, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 폴리펩타이드.
20. 폴리펩타이드로서,
의 아미노산 서열을 포함하되, 각각의 X는, 독립적으로, 임의의 아미노산인, 폴리펩타이드.
21. 실시형태 20에 있어서, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 폴리펩타이드.
22. 실시형태 17 내지 21 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물.
23. 실시형태 22의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
24. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나의 폴리펩타이드의 라이브러리를 암호화하는 복수의 핵산 분자.
25. 실시형태 24의 핵산 분자를 포함하는 숙주세포.
실시예
실시예 1: Fn3 도메인 인간 컨센서스 서열(HumCon)의 설계
파이브로넥틴 유형 III 도메인의 Prosite 서열 데이터베이스 정렬(http://prosite.expasy.org/PDOC50853)을 컨센서스 서열의 생성을 위한 시작점으로서 사용하였다. 이 정렬은 모든 비-인간 유도된 서열을 제거하기 위해 편집되었고, 결과적인 정렬은 806개의 인간 서열을 포함한다. 94개의 위치 각각에서 우세한 잔기가 후보 컨센서스 서열을 결정하는 데 사용되었다. 2개의 위치(47 및 89)에서, 2개의 잔기가 동등하게 우세하였다. 이들은 47번 위치에서 N 및 T이고 89번 위치에서 S 및 V이다. 다른 모든 위치에서는 단일 잔기가 지배적이다. 47 및 89번 위치에서의 모호성(ambiguity) 때문에, 4개의 컨센서스 서열이 생성되었다(표 3).
루프 설계:
루프 영역은 길이 및 서열 둘 다에서 매우 가변적일 수 있다. 806개의 서열을 정렬하여 컨센서스를 생성하고 대부분의 서열이 94개 위치의 각각에 잔기를 포함하는 반면, 일부 위치는 전형적으로 루프에서 발생하는 결실 때문에 더 적은 서열을 포함하였다. 따라서, 일부 루프는 단축될 수 있었고 더 안정적인 서열을 초래할 수 있었다. 추정 BC 및 CD 루프는 길이 가변성의 영역으로 식별되었다. 이들 루프가 단축될 수도 있다는 가설을 테스트하기 위하여, 서열번호 2를 골격 서열로서 사용하여 이들 영역에서의 일련의 결실을 설계하였다. 결과는 표 4에 열거된 서열번호 5 내지 13이다.
유전자 합성, 발현 및 특징규명
표 3 및 표 4로부터의 13개의 서열에 대한 유전자를 C-말단 His 태그로 설계하고, T5 프로모터의 제어하에 발현 벡터에 클로닝하였다. 배양액의 mg/L로서의 발현 수량(expression yield)을 진탕 플라스크에서 평가하고, 용융 온도를 시차 주사 열량측정법으로 평가하였다(표 5). MW 표준을 사용하여 단량체 균질성을 확인하기 위하여 SDS PAGE 검정을 확립하였다. 일부 클론은 SDS PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 입증될 수도 있는 가닥 스와핑에 기인하는 것으로 가정된 이량체 형성과 일치하는 거동을 가졌다.
추가의 최적화(N-말단, 프롤린, pI)
서열번호 2가 개선된 생물물리학적 특성을 위해 조작하기 위한 선두 후보로서 선택되었다. 일련의 돌연변이를 1) 가닥 스와핑을 최소화할 목적으로 다른 FN3 도메인 구조에 대한 상동성 모델링을 기반으로 하는 베타 시트 구조를 가질 것으로 예상되는 세그먼트로부터 프롤린을 제거하거나; 또는 2) 예측된 pI 값을 증가시켜 단순화된 제조 및 제형 특성을 가능하게 하도록 설계하였다. 이들 변이체에 대한 서열은 표 6에 나열되어 있다. 각 단백질을 이 콜라이에서 발현시키고, C-말단 His 태그를 통해 정제하고, 모 클론(서열번호 2)과 비교하여 용해도(가용성 단백질/L 이. 콜라이의 발현), 안정성(시차 주사 열량측정법에 의한 Tm) 및 단량체 균질성(SDS-PAGE)에 대해 평가하였다(표 7).
라이브러리 설계-알라닌 스캐닝
라이브러리 설계 전략의 생존력을 테스트하기 위하여, 각 변이체 단백질이 설계된 결합 계면의 일부로 의도된 고유 위치에서 하나의 알라닌 잔기를 암호화하는 19개의 돌연변이 단백질을 설계했다. 알라닌 스캐닝 돌연변이 서열은 표 8에 나열되어 있다. 각각의 단백질을 이 콜라이에서 발현시키고, C-말단 His 태그를 통해 정제하고, 생물물리학적 특성이 모 클론(서열번호 24)에 대한 특성과 일치함을 보장하도록 특성규명되었다. 단백질 변이체를 용해도(가용성 단백질/L의 발현), 안정성(시차 주사 열량측정법에 의한 Tm) 및 단량체 균질성(SDS-PAGE)에 대해 평가하였다(표 9).
CD71에 대한 특이적 결합을 스크리닝하는 것에 의한 라이브러리 검증
알라닌 돌연변이 실험에 의해 확인된 위치 중 17개를 18개의 가능한 아미노산(메티오닌 및 시스테인을 제외한 모든 아미노산)으로 돌연변이시키는 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 HumCon 변이체의 라이브러리를 구축하였다. 이 라이브러리를 CIS 디스플레이 벡터에 클로닝하고, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 CD71에 대한 결합제에 대해 패닝하였다. 특이적 결합제를 ELISA에 의해 결정하였다. CD71 표적에 성공적으로 결합한 라이브러리의 구성원이 표 10에 나열되어 있다.
본 명세에서 제공되는 본 실시예 및 실시형태는, 본 명세서에 제공된 FN3 도메인이 생성될 수 있고, 관심 표적 단백질에 결합할 수 있는 분자를 생산하기 위한 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있다. 이들 결과는 예측할 수 없었으며, 따라서 분자의 라이브러리, 이를 포함하는 조성물, 및 이를 사용하는 방법은 예측할 수 없는 방식으로 본 명세서에 제공된다. 실시형태는 전술한 설명 및 실시예에서 특별히 기재된 것과 다르게 실시될 수 있음은 명백할 것이다. 본 실시형태의 다양한 변형 및 변화는 상기 교시에 비추어 가능하고, 따라서 첨부된 청구범위의 범주 내이다.
Claims (25)
- 다양한 C 베타-가닥, CD 루프, D 베타-가닥, F 베타-가닥, FG 루프 및 G 베타-가닥을 포함하는 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면(alternative surface)을 갖는 복수의 파이브로넥틴 유형 III 모듈(FN3) 도메인(폴리펩타이드)을 포함하는 라이브러리로서, 상기 폴리펩타이드는,
의 아미노산 서열 또는 서열번호 44의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 각각의 X는, 독립적으로, 임의의 아미노산인, 라이브러리. - 제1항에 있어서, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는, 상기 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 갖는 상기 FN3 도메인 라이브러리를 형성하는 상기 C 베타-가닥, 상기 CD 루프, 상기 D 베타-가닥, 상기 F 베타-가닥, 상기 FG 루프 또는 상기 G 베타-가닥 중 하나 이상에 또는 각각에 서열번호 24와 비교해서 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함하는, 라이브러리.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 폴리펩타이드는 서열번호 24의 32, 34, 36, 38, 39, 40, 41, 46, 48, 68, 70, 72, 78, 79, 81, 85 및/또는 87번 위치에 대응하는 위치에 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실)를 갖는, 라이브러리.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다양한 C 베타-가닥은 TGYXVXYXE(서열번호 45)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다양한 CD 루프는 XXXXGE(서열번호 46)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다양한 D 베타-가닥은 WKXVXVP(서열번호 47)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다양한 F 베타-가닥은 TEYXFXVXAV(서열번호 48)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다양한 FG 루프는 NGAXXG(서열번호 49)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다양한 G 베타-가닥은 XPSQXVXVTT(서열번호 50)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 라이브러리는, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 라이브러리.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다양한 C 베타-가닥은 TGYXVXYXE(서열번호 45)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 CD 루프는 XXXXGE(서열번호 46)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 D 베타-가닥은 WKXVXVP(서열번호 47)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 F 베타-가닥은 TEYXFXVXAV(서열번호 48)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 FG 루프는 NGAXXG(서열번호 49)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고; 그리고
상기 다양한 G 베타-가닥은 XPSQXVXVTT(서열번호 50)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 라이브러리. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 라이브러리를 생산하는 방법으로서, 복수의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 단계를 포함하는, 방법.
- C 베타-가닥, CD 루프, F 베타-가닥, FG 루프 및 G-베타 가닥 중 다양한 하나 이상 또는 각각을 포함하는 다양한 C-CD-F-FG-G 대체 표면을 갖는 유형 III의 파이브로넥틴 모듈(FN3) 도메인의 라이브러리를 제조하는 방법으로서,
a. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 또는 44의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 참조 FN3 도메인 폴리펩타이드를 제공하는 단계; 및
b. 상기 다양한 C-CD-F-FG-G 대체 표면을 갖는 FN3 도메인 라이브러리를 형성하는 상기 C 베타-가닥, CD 루프 영역, F 베타-가닥 영역, FG 루프 영역 또는 G-베타 가닥 영역에서 적어도 하나의 잔기를 돌연변이시킴으로써 상기 참조 FN3 도메인 폴리펩타이드에 다양성을 도입하는 단계
를 포함하되,
상기 다양한 C 베타-가닥은 TGYXVXYXE(서열번호 45)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 CD 루프는 XXXXGE(서열번호 46)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 D 베타-가닥은 WKXVXVP(서열번호 47)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 F 베타-가닥은 TEYXFXVXAV(서열번호 48)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고;
상기 다양한 FG 루프는 NGAXXG(서열번호 49)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산이고; 그리고
상기 다양한 G 베타-가닥은 XPSQXVXVTT(서열번호 50)의 아미노산 서열을 갖되, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 방법. - 제13항 또는 제14항의 방법에 의해 생산된 라이브러리.
- 표적 분자에 결합하거나 특이적으로 결합하는 다양한 C-CD-D-F-FG-G 대체 표면을 갖는 파이브로넥틴 유형 III 모듈(FN3) 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 얻는 방법으로서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 라이브러리를 상기 표적 분자와 접촉시키는 단계 및 상기 표적 분자에 결합하거나 특이적으로 결합하는 상기 폴리펩타이드를 단리시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 동일하거나, 적어도 또는 약, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 폴리펩타이드로서,
의 아미노산 서열을 포함하되, 각각의 X는, 독립적으로, 임의의 아미노산인, 폴리펩타이드. - 제18항에 있어서, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 폴리펩타이드.
- 폴리펩타이드로서,
의 아미노산 서열을 포함하되, 각각의 X는, 독립적으로, 임의의 아미노산인, 폴리펩타이드. - 제20항에 있어서, 각각의 X는, 독립적으로, 메티오닌 또는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산인, 폴리펩타이드.
- 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제22항의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드의 라이브러리를 암호화하는 복수의 핵산 분자.
- 제24항의 핵산 분자를 포함하는 숙주세포.
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