JP2013507123A - Ｃ型レクチンドメインをベースとするコンビナトリアルライブラリー - Google Patents

Ｃ型レクチンドメインをベースとするコンビナトリアルライブラリー Download PDF

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Abstract

本発明は、ランダム化ループ領域を有するＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドを含むポリペプチドライブラリー及びそのようなポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸ライブラリーに関する。本発明はまた、ランダム化ポリペプチド及びポリペプチドライブラリーを生成するための方法に関する。本発明は、対象の標的分子に対する修飾ＣＴＬＤの特異的な結合に基づいて、ポリペプチド及び核酸のライブラリーをスクリーニングするための方法にさらに関する。本発明はまた、対象の標的分子に結合するようなライブラリーに由来するポリペプチドにも関する。

Description

本出願は、２００９年１０月９日に提出された米国特許出願第１２／５７７０６７号の一部継続及び２００９年１０月９日に提出された国際特許出願ＰＣＴ ＵＳ０９／６０２７１の一部継続であり、これらの出願は全て、それらの全体が本明細書において参照によって組み込まれる。
配列表の記載
配列表は、電子フォーマットのみで本出願において提出され、参照によって本明細書において組み込まれる。配列表テキストファイル「０９−４９３＿Ｓｕｂｓｔ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」は、２０１０年３月２１日に作成され、サイズが３８５キロバイトである。
本発明は、ランダム化ループ領域を有するＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドを含むポリペプチドライブラリー及びそのようなポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸ライブラリーに関する。本発明はまた、ランダム化ポリペプチド及びポリペプチドライブラリーを生成するための方法に関する。本発明は、対象の標的分子に対する修飾ＣＴＬＤの特異的な結合に基づいて、ポリペプチド及び核酸のライブラリーをスクリーニングするための方法にさらに関する。本発明はまた、対象の標的分子に結合するようなライブラリーに由来するポリペプチドにも関する。
Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）は、様々な動物種から単離された多くのタンパク質において同定されたタンパク質モチーフである（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ及びＴａｙｌｏｒ（１９９３）並びにＤｒｉｃｋａｍｅｒ（１９９９）において概説される）。最初に、ＣＴＬＤドメインは、いわゆるＣ型レクチン（カルシウム依存性炭水化物結合タンパク質）に共通のドメインとして同定され、「炭水化物認識ドメイン」（「ＣＲＤ」）と命名された。より最近では、このドメインは、多くの真核生物タンパク質の間で共有されることが明らかになり、これらのいくつかのものは、糖成分に結合せず、よって、標準的なドメインは、「ＣＴＬＤ」と命名された。
ＣＴＬＤは、炭水化物、脂質、タンパク質、及び氷さえ含む広く様々な化合物に結合することが報告された（Ａｓｐｂｅｒｇら（１９９７）、Ｂｅｔｔｌｅｒら（１９９２）、Ｅｗａｒｔら（１９９８）、Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら（１９９８）、Ｍｉｚｕｍｏら（１９９７）、Ｓａｎｏら（１９９８）、及びＴｏｒｍｏら（１９９９））。いくつかのタンパク質は、ＣＴＬＤの単一のコピーを含有するが、他のタンパク質は、このドメインの２コピー〜多コピーを含有する。生理学的機能単位において、ＣＴＬＤの数の多様性は、単一コピータンパク質プロトマーを集合させて、より大きな構造にすることによって多くの場合、達成される。
ＣＴＬＤは、およそ１２０のアミノ酸残基を含有し、特徴的に、２つ又は３つの鎖内ジスルフィド架橋を含有する。異なるタンパク質由来のＣＴＬＤの一次配列は、比較的低いアミノ酸配列相同性を共有するが、多くのＣＴＬＤの二次及び三次構造は、類似しており、高度に保存された三次元構造をもたらし、構造の変異性は、ＣＴＬＤループ領域に本質的に限られる。５つまでのループを典型的に含有するＣＴＬＤループ領域は、リガンド結合及びカルシウム結合において役割を果たす。いくつかのＣＴＬＤは、カルシウムに対する１つ又は２つの結合部位を含有し、カルシウムと相互作用するほとんどの側鎖は、ループ領域中に位置する。
入手可能な三次元構造の情報に基づいて、標準的なＣＴＬＤは、以下の順で連続して現われる、７つの主要な二次構造エレメント（５つのβ−ストランド及び２つのα−ヘリックス）：β１；α１；α２；β２；β３；β４；及びβ５（図１）によって特徴づけられる。三次元構造が決定されたＣＴＬＤにおいて、β−ストランドは、一方はβ１及びβ５から構成され、他方はβ２、β３、及びβ４から構成される２の逆平行β−シートで配置する。さらなるβ−ストランド、β０は、多くの場合、配列においてβ１に先行し、存在する場合、β１，β５シートとのさらなるストランド統合を形成する。さらに、２つのジスルフィド架橋、α１とβ５をつなぐジスルフィド架橋（ＣＩ−ＣＩＶ、図１）及びβ３と、β４とβ５をつなぐポリペプチドセグメントをつなぐジスルフィド架橋（ＣＩＩ−ＣＩＩＩ、図１）は、これまで特徴づけられた全てのＣＴＬＤにおいて一様に見つけられる。
ＣＴＬＤ三次元構造において、保存された二次及び三次構造エレメントは、多くのループについて緻密な骨格を形成し、本文脈において、集団的に、「ループ領域」と呼ばれ、コアから外に突出している。ＣＴＬＤのループ領域の一次構造は、２つのセグメント、ループセグメントＡ（ＬＳＡ）及びループセグメントＢ（ＬＳＢ）に体系づけられる。ＬＳＡは、β２とβ３をつなぐ長いポリペプチドセグメントを表し、このポリペプチドセグメントは、多くの場合、規則的な二次構造を欠き、４つまでのループを含有する。ＬＳＢは、β−ストランドβ３とβ４をつなぐポリペプチドセグメントを表す。ループ領域を含むＣＴＬＤの図を、図４〜６中に示す。β４における単一残基と共にＬＳＡにおける残基は、テトラネクチンのＣＴＬＤを含むいくつかのＣＴＬＤのＣａ２＋及びリガンド結合部位に特性をもたせることが示された。例えば、単一又はいくつかの残基の置換を伴う突然変異誘発研究は、結合特異性、Ｃａ２＋感受性、及び／又は親和性における変化が、ＣＴＬＤドメインによって調節することができることを示した（Ｗｅｉｓ及びＤｒｉｃｋａｍｅｒ（１９９６）、Ｃｈｉｂａら（１９９９）、Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら（２０００））。
テトラネクチンは、ヒト血漿から単離され、ある種の組織中の細胞外マトリックス中に存在することが分かった三量体糖タンパク質である（Ｈｏｌｔｅｔら（１９９７）、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９７））。テトラネクチンは、カルシウム、複合多糖、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン／フィブリン、及びアポリポタンパク質（ａ）に結合することが知られている。プラスミノーゲン及びアポリポタンパク質（ａ）との相互作用は、その中のクリングル４タンパク質ドメインによって媒介される。この相互作用は、カルシウム及びアミノ酸リシンの誘導体に対して感受性であることが知られている（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら（１９９８））。
ヒトテトラネクチン遺伝子は、特徴づけられており、ヒト及びマウステトラネクチンｃＤＮＡクローンの両方が単離されている。ヒト及びマウステトラネクチンの両方の成熟タンパク質は、１８１のアミノ酸残基を含む。その全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０１５４９０１号を参照されたい。完全長組換えヒトテトラネクチン及び単離テトラネクチンＣＴＬＤの三次元構造は、２つの別個の研究において独立して決定された（Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９７）及びＫａｓｔｒｕｐら（１９９８））。テトラネクチンは、２又はおそらく３ドメインタンパク質である、つまり、ポリペプチド鎖の主要な部分は、ＣＴＬＤを含む（アミノ酸残基Ｇｌｙ５３〜Ｖａｌ１８１）が、領域Ｌｅｕ２６〜Ｌｙｓ５２は、ホモ三量体平行コイルドコイルの形成を介してのタンパク質の三量体形成を支配するα−ヘリックスをコードする。ポリペプチドセグメントＧｌｕ１〜Ｇｌｕ２５は、複合多糖に対する結合部位（Ｌｙｓ６〜Ｌｙｓ１５）を含有し（Ｌｏｒｅｎｔｓｅｎら（２０００））、三量体構造の安定化に寄与するように思われる（Ｈｏｌｔｅｔら（１９９７））。ループ４中に配置する２つのアミノ酸残基Ｌｙｓ１４８及びＧｌｕ１５０並びにＡｓｐ１６５（β４中に配置する）は、プラスミノーゲンクリングル４結合に決定的に重要であることが示され、残基Ｉｌｅ１４０（ループ３中）並びにＬｙｓ１６６及びＡｒｇ１６７（β４中）は、同様に重要なことが示された（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら（１９９８））。Ｔｈｒ１４９（ループ４中）の芳香族残基との置換は、クリングル４に対するテトラネクチンの親和性を著しく増加させ、且つクリングル４に対する野生型テトラネクチンの親和性に匹敵するレベルまでプラスミノーゲンクリングル２に対する親和性を増加させることが示された（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら（２０００））。テトラネクチンの三量体形成可能な（ｔｒｉｍｅｒｉｚａｂｌｅ）切断が、記載されている。その全体が本明細書において参照によって組み込まれる２００９年４月８日に提出されたＵＳ２０１０／００２８９９５を参照されたい。
以下の非限定的な例を含む、ＣＴＬＤを有する多くの他のタンパク質が知られている：リトスタチン、マウスマクロファージガラクトースレクチン、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞受容体、ニワトリニューロカン、パールシン（ｐｅｒｌｕｃｉｎ）、アシアロ糖タンパク質受容体、軟骨プロテオグリカンコアタンパク質、ＩｇＥ Ｆｃ受容体、膵炎関連タンパク質、マウスマクロファージ受容体、ナチュラルキラー群、幹細胞増殖因子、第ＩＸ／Ｘ因子結合タンパク質、マンノース結合タンパク質、ウシコングルチニン、ウシＣＬ４３、コレクチン肝臓１（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ ｌｉｖｅｒ １）、サーファクタントタンパク質Ａ、サーファクタントタンパク質Ｄ、ｅ−セレクチン、被嚢動物ｃ型レクチン、ＣＤ９４ ＮＫ受容体ドメイン、ＬＹ４９Ａ ＮＫ受容体ドメイン、ニワトリ肝臓レクチン、マスｃ型レクチン、ＨＩＶ ｇｐ １２０結合ｃ型レクチン、樹状細胞免疫受容体、及び多くのヘビ毒タンパク質。
天然に存在するＣＴＬＤの間の結合部位立体配置の変異は、それらの共通のコア構造がリガンド結合部位の本質的に異なる立体配置を調節することができることを示す（例えば、本明細書において参照によって組み込まれるＵＳ ２００７／０２７５３９３を参照されたい）。そのため、ＣＴＬＤは、特に、対象の標的分子に対する所望の結合特性を有する新しく有用なタンパク質産物を構築するためのベースとして果たすのに十分に適している。
例えば、ＣＴＬＤベースのタンパク質産物におけるそれぞれの結合部位が単一の構造的に独立したタンパク質ドメイン中に保護されるので、ＣＴＬＤ（又はＣＴＬＤベースのタンパク質産物）は、抗体誘導体に比べて利点を有する。さらに、ＣＴＬＤドメインは、タンパク質分解に対して抵抗性であり、安定性もリガンド結合部位への到達も、ＣＴＬＤのＮ又はＣ末端への他のタンパク質ドメインの結合によって損なわれない。
治療上の使用に関して、ＣＴＬＤベースのタンパク質産物は、体内に既に存在する対応する自然のＣＴＬＤタンパク質と同一であり、そのため、患者において最小限の免疫応答しか誘発しないことが期待される。単一ＣＴＬＤは、抗体の約半分の質量であり、それが、よりよい組織浸透及び分布並びに循環中のより短い半減期を提供するかもしれないので、いくつかの用途において有利であるかもしれない。ＣＴＬＤタンパク質の多価形態は、結合能力及び結合活性の増加並びにより長い循環半減期を提供するかもしれない。
本発明は、コンビナトリアルＣＴＬＤポリペプチドライブラリー及び対象の標的分子に対する所望の結合特性を有する新しく有用なタンパク質産物を構築するためのベースとして果たすようにＣＴＬＤを同定し、単離するための方法を提供する。
一態様において、本発明は、ＣＴＬＤの天然配列から修飾されているランダム化ループ領域を有するＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供する。本発明は、ランダム化ループ領域を有するＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリー及びポリペプチドのライブラリーをコードする核酸のライブラリーであって、ＣＴＬＤのループ領域は、以下のスキームの１つによってランダム化される、上記ライブラリーを提供する：
（ａ）ループ１における少なくとも１つのアミノ酸の挿入及びループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
（ｂ）ループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換及びループ２内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
（ｃ）ループ１内の少なくとも７つのアミノ酸のランダム置換及びループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
（ｄ）ループ３における少なくとも１つのアミノ酸挿入及びループ３内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
（ｅ）２つのループを組み合わせて、単一のループにする修飾を含み、２つの組み合わせられたループがループ３及びループ４である、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
（ｆ）ループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入及びループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
（ｇ）ループ３における少なくとも５つのアミノ酸残基のランダム置換及びループ５内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおける及びループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるアミノ酸修飾；
（ｈ）ループ３における少なくとも１つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも６つのアミノ酸の挿入を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
（ｉ）（１）ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換並びに（２）ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも１つのアミノ酸挿入の混合物を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；並びに
（ｊ）ループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおける少なくとも４つ以上のアミノ酸挿入を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つ又はＣＴＬＤのループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるループ５におけるアミノ酸修飾。
一態様では、ライブラリーのポリペプチドのＣＴＬＤは、以下の二次構造を有する：
ａ．β１、α１、α２、β２、β３、β４、及びβ５の順で連続して現われる、一方はβ１及びβ５から構成され、他方はβ２、β３、及びβ４から構成される２つの逆平行β−シートで配置する５つのβ−ストランド及び２つのα−ヘリックス；
ｂ．少なくとも２つのジスルフィド架橋、α１とβ５をつなぐジスルフィド架橋及びβ３と、β４とβ５をつなぐポリペプチドセグメントをつなぐジスルフィド架橋；並びに
ｃ．β２とβ３をつなぐループセグメントＡ（ＬＳＡ）及びβ３とβ４をつなぐループセグメントＢ（ＬＳＢ）を含有するループ領域。
様々なさらなる態様では、ライブラリーのポリペプチドは、Ｃ末端方向に、ループ２のＣ末端に隣接して位置するアミノ酸のランダム置換を有する。さらに、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来のものである場合、ＣＴＬＤは、アルギニン−１３０のランダム置換をさらに含むことができる。さらに、ＣＴＬＤがマウステトラネクチン由来のものである場合、ＣＴＬＤは、ロイシン−１３０のランダム置換をさらに含むことができる。（ａ）〜（ｊ）の修飾のいくつかにおいて、ＣＴＬＤがヒト又はマウステトラネクチン由来のものである場合、ＣＴＬＤは、プロリン１４４のランダム置換をさらに含むことができる。
様々なさらなる実施形態では、ライブラリーのポリペプチドは、カルシウム調整及び／又はプラスミノーゲン結合に関与する１つ又は複数のアミノ酸のランダム置換を有することができる。例えば、ＣＴＬＤがテトラネクチン由来のものである場合、ＣＴＬＤは、リシン−１４８のアラニンへの置換（ループ４中）をさらに含むことができる。
ある実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ａ）の修飾ＣＴＬＤを有する場合、アミノ酸修飾は、ループ１における２つのアミノ酸挿入及びループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換を含む。他の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ａ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ１における少なくとも１つのアミノ酸挿入及びループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換を含み、アルギニン１３０のランダム置換を含む。特定の一実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ａ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ１における２つのアミノ酸挿入、ループ１内の５つのアミノ酸のランダム置換、及びアルギニン１３０のランダム置換を含む。特定の一実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ａ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがマウステトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ１における２つのアミノ酸挿入、ループ１内の５つのアミノ酸のランダム置換、及びロイシン１３０のランダム置換を含む。スキーム（ａ）についての実施形態のいずれかにおいても、アミノ酸修飾は、リシン−１４８のアラニンへの置換をさらに含むことができる。
ある実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｂ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ１における少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換、ループ２における少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含み、アルギニン１３０のランダム置換を含む。一実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｂ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ１における５つのアミノ酸のランダム置換、ループ２における３つのアミノ酸のランダム置換、及びアルギニン１３０のランダム置換を含む。ある他の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｂ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがマウステトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ１における少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換、ループ２における少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含み、ロイシン１３０のランダム置換を含む。一実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｂ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがマウステトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ１における５つのアミノ酸のランダム置換、ループ２における３つのアミノ酸のランダム置換、及びロイシン１３０のランダム置換を含む。スキーム（ｂ）についての実施形態のいずれかにおいても、アミノ酸修飾は、リシン−１４８のアラニンへの置換をさらに含むことができる。他の特定の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーの個々のメンバーは、下記の実施例における表３によって提供されるポリペプチド配列のいずれか又は全てを含むループ領域を含む。
ある実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｃ）の修飾を有する場合、アミノ酸修飾は、任意選択で、少なくとも２つのアミノ酸のランダム置換をさらに含む。ある他の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｃ）の修飾を有する場合、アミノ酸修飾は、ループ４内の３つのアミノ酸挿入を含み、任意選択で、少なくとも２つのアミノ酸のランダム置換をさらに含む。一実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ１内の少なくとも７つのアミノ酸のランダム置換、ループ４における少なくとも３つのアミノ酸挿入、及びループ４内の少なくとも２つのアミノ酸のランダム置換を含む。特定の一実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ１内の７つのアミノ酸のランダム置換、ループ４における３つのアミノ酸挿入、及びループ４内の２つのアミノ酸のランダム置換を含む。他の特定の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーの個々のメンバーは、下記の実施例における表３によって提供されるポリペプチド配列のいずれか又は全てを含むループ領域を含む。
他の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｄ）の修飾ＣＴＬＤを有する場合、アミノ酸修飾は、ループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入をさらに含むことができ、ループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換をさらに含むことができる。スキーム（ｄ）について記載される実施形態のいずれかにおいて、アミノ酸修飾は、ループ３における３つのアミノ酸挿入を含むことができる。スキーム（ｄ）について記載される実施形態のいずれかにおいて、アミノ酸修飾は、ループ４における３つのアミノ酸挿入を含むことができる。したがって、ある実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ３内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換、ループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換、ループ３における少なくとも１つのアミノ酸挿入、及びループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入を含む。ある実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ３内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換、ループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換、ループ３における少なくとも３つのアミノ酸挿入、及びループ４における少なくとも３つのアミノ酸挿入を含む。特定の一実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ３内の３つのアミノ酸のランダム置換、ループ４内の３つのアミノ酸のランダム置換、ループ３における３つのアミノ酸挿入、及びループ４における３つのアミノ酸挿入を含む。他の特定の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーの個々のメンバーは、下記の実施例における表３によって提供されるポリペプチド配列のいずれか又は全てを含むループ領域を含む。
ある実施形態では、コンビナトリアルライブラリーのメンバーがスキーム（ｅ）の修飾ＣＴＬＤを有する場合、アミノ酸修飾は、ループ３内の少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換及びループ４内の少なくとも４つのアミノ酸のランダム置換を含む。特定の一実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ３内の６つのアミノ酸のランダム置換及びループ４内の４つのアミノ酸のランダム置換を含む。スキーム（ｅ）についての実施形態のいずれかにおいて、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、プロリン−１４４のランダム置換をさらに含むことができる。特定の一実施形態では、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ３内の６つのアミノ酸のランダム置換、ループ４内の４つのアミノ酸のランダム置換、及びプロリン１４４のランダム置換を含み、例えば、ＮＷＥＸＸＸＸＸＸＸ ＸＧＧＸＸＸＮ（配列番号５７８）を含む、組み合わせられたループ３及びループ４のアミノ酸配列をもたらし、Ｘは、任意のアミノ酸であり、配列番号５７８のアミノ酸配列は、単一のループ領域を形成する。他の特定の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーの個々のメンバーは、下記の実施例における表３によって提供されるポリペプチド配列のいずれか又は全てを含むループ領域を含む。
他の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｆ）の修飾ＣＴＬＤを有する場合、アミノ酸修飾は、ループ４における４つのアミノ酸挿入を含む。一実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｆ）の修飾ＣＴＬＤを有する場合、アミノ酸修飾は、ループ４における少なくとも４つのアミノ酸挿入及びループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む。特定の一実施形態では、アミノ酸置換は、ループ４における４つのアミノ酸挿入及びループ４内の３つのアミノ酸のランダム置換を含む。他の特定の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーの個々のメンバーは、下記の実施例における表３によって提供されるポリペプチド配列のいずれか又は全てを含むループ領域を含む。
他の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｇ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ＣＴＬＤのプラスミノーゲン結合親和性を調整する、ループ４における１つ又は複数のアミノ酸修飾、例えば、リシン１４８のアラニンへの置換をさらに含むことができる。したがって、ある実施形態では、ＣＴＬＤがヒト又はマウステトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ３における少なくとも５つのアミノ酸残基のランダム置換、ループ５における少なくとも３つのアミノ酸残基のランダム置換、及びループ４におけるリシン１４８のアラニンへの置換を含む。特定の一実施形態では、アミノ酸修飾、ループ３における５つのアミノ酸残基のランダム置換及びループ５における３つのアミノ酸残基のランダム置換を含み、他の特定の実施形態では、ＣＴＬＤがヒト又はマウステトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ４におけるリシン１４８のアラニンへの置換をさらに含む。他の特定の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーの個々のメンバーは、下記の実施例における表３によって提供されるポリペプチド配列のいずれか又は全てを含むループ領域を含む。
ある実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｈ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ＣＴＬＤのプラスミノーゲン結合親和性を調整する、ループ４における１つ又は複数のアミノ酸修飾、例えば、リシン１４８のアラニンへの置換をさらに含むことができる。ある実施形態では、ＣＴＬＤがヒト又はマウステトラネクチン由来のものである場合、コンビナトリアルライブラリーのメンバーは、少なくとも１つのアミノ酸のランダム置換、ループ３における少なくとも６つのアミノ酸の挿入、及びループ４におけるリシン１４８のアラニンへの置換を有する。特定の一実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｈ）の修飾ＣＴＬＤを有する場合、アミノ酸修飾は、ループ３における１つのアミノ酸のランダム置換及び６つのアミノ酸の挿入を含む。特定の一実施形態では、ＣＴＬＤがヒト又はマウステトラネクチン由来のものである場合、コンビナトリアルライブラリーのメンバーは、ループ３における１つのアミノ酸のランダム置換及び６つのアミノ酸の挿入並びにループ４におけるリシン１４８のアラニンへの置換を有する。これらの実施形態のいずれかにおいて、ＣＴＬＤがヒト又はマウステトラネクチン由来のものである場合、置換の１つはイソロイシン１４０の置換である。他の特定の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーの個々のメンバーは、下記の実施例における表３によって提供されるポリペプチド配列のいずれか又は全てを含むループ領域を含む。
一実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｉ）の修飾ＣＴＬＤを有する場合、アミノ酸修飾は、ループ３における６つのアミノ酸のランダム置換、ループ３における６つのアミノ酸のランダム置換及び１つのアミノ酸挿入、並びにループ３における６つのアミノ酸のランダム置換及び２つのアミノ酸挿入の混合物を含む。スキーム（ｉ）の実施形態のいずれかにおいて、ＣＴＬＤがテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ４におけるリシン１４８のアラニンへの置換をさらに含む。
本発明のさらなる態様では、コンビナトリアルポリペプチドライブラリーのポリペプチドメンバーは、ループセグメントＡ（ＬＳＡ）及びループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるループの２つ、３つ、４つ、又は５つの任意の組み合わせにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾を有する。ポリペプチドメンバーはまた、ＬＳＡ及びＬＳＢ以外の領域におけるアミノ酸修飾を有するＣＴＬＤ領域をも含むことができる。他の特定の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーの個々のメンバーは、下記の実施例における表１７によって提供されるポリペプチド配列のいずれか又は全てを含むループ領域を含む。
本発明のある実施形態では、コンビナトリアルライブラリーは、ヒト又はマウステトラネクチン由来のＣＴＬＤにおいて修飾ループ領域を有するポリペプチドメンバーから構成される。ある実施形態では、ポリペプチドメンバーはまた、ＣＴＬＤのＮ末端伸長部分及び／又はＣ末端伸長部分をも有することができる。Ｎ末端伸長部分及び／又はＣ末端伸長部分は、エフェクター機能、酵素機能、さらなる結合機能、又は多量体形成機能を提供することができる。一実施形態では、Ｎ末端伸長部分及びＣ末端伸長部分の少なくとも１つは、天然Ｃ型レクチン様タンパク質又はＣ型レクチン又は機能的膜貫通ドメインを欠くＣ型レクチンの非ＣＴＬＤ部分を含む。一実施形態では、タンパク質は、ＣＴＬＤを含む成分の多量体である。
本発明の他の実施形態では、ポリペプチドメンバーは、エフェクター機能、酵素機能、さらなる結合機能、又は多量体形成機能を提供することができる、ペプチド移植によって導入される又はパニングによって同定される、ループ領域におけるさらなる改変を有することができる。
他の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーは、完全長ヒト又はマウステトラネクチンのＣＴＬＤ領域において修飾ループ領域を有するポリペプチドメンバーから構成される。ある実施形態では、ポリペプチドメンバーは、テトラネクチンの三量体形成ドメインのＮ末端伸長部分を有することができる。Ｎ末端伸長部分は、エフェクター機能、酵素機能、さらなる結合機能、又は多量体形成機能を提供することができる。一実施形態では、Ｎ末端伸長部分は、知られている機能を有するペプチド若しくはポリペプチド又はパニングによって同定されるペプチドである。
他の態様では、本発明は、本明細書において記載されるポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子のライブラリーを対象とする。一実施形態では、本発明は、ランダム化ループ領域を有するＣＴＬＤを有するポリペプチドをコードする核酸分子のライブラリーを提供し、ＣＴＬＤのループ領域は、本明細書において記載されるスキーム（ａ）〜（ｉ）のいずれかに従ってランダム化される。他の実施形態では、本発明は、スキーム（ａ）〜（ｉ）のいずれかに従ってランダム化されるＣＴＬＤを有し、本明細書において記載されるさらなる修飾又は配列のいずれかを有するポリペプチドをコードする核酸分子のライブラリーを提供する。
核酸分子のライブラリーは、ディスプレイされた発現産物の少なくとも１つの特性を表す観察可能な表現型及び対応する遺伝子型を有するディスプレイ系において発現することができる。適したディスプレイ系の例は、ファージディスプレイ系；酵母ディスプレイ系；ウイルスディスプレイ系；細胞ベースのディスプレイ系；リボソーム連結ディスプレイ系；又はプラスミド連結ディスプレイ系を含む。
他の態様では、本発明は、本明細書において記載されるポリペプチドのいずれかのコンビナトリアルライブラリーを生成するための方法を対象とする。したがって、本発明は、ランダム化ループ領域を有するＣＴＬＤを有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを生成するための方法を提供し、ＣＴＬＤのループ領域は、本明細書において記載されるスキーム（ａ）〜（ｉ）のいずれかに従ってランダム化される。一実施形態では、方法は、ＣＴＬＤのＬＳＡ領域における４つのループの少なくとも１つにおいて少なくとも１つのランダム突然変異を生成することを含む。他の実施形態では、方法は、ＬＳＡ領域における４つのループの少なくとも１つにおいて少なくとも１つのランダム突然変異を生成すること及びＣＴＬＤのＬＢＡ領域におけるループにおいて少なくとも１つのランダム突然変異を生成することを含む。ランダム突然変異は、オリゴヌクレオチド特異的ランダム化、ランダムな断片化によるＤＮＡシャフリング、ループシャフリング、ループウォーキング、又はエラープローンＰＣＲ突然変異誘発及び当技術分野において知られている他の方法によって引き起こすことができる。他の実施形態では、本発明は、スキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかに従ってランダム化されるＣＴＬＤを有し、本明細書において記載されるさらなる修飾又は配列のいずれかを有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを生成するための方法を提供する。
他の態様では、本発明は、標的分子に対して特異的な結合活性を有するポリペプチドを同定する及び単離するための方法を対象とする。一実施形態では、方法は、ＣＴＬＤを有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを提供するステップであって、ＣＴＬＤのループ領域は、スキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかに従ってランダム化される上記ステップ、ポリペプチド及び標的分子の間の結合を可能にする条件下でコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを標的分子と接触させるステップ、並びに標的分子に結合するポリペプチドを単離するステップを含む。他の実施形態では、方法は、スキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかに従ってランダム化されるＣＴＬＤ及び本明細書において記載されるさらなる修飾又は配列のいずれかを有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを提供するステップ、ポリペプチド及び標的分子の間の結合を可能にする条件下でコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを標的分子と接触させるステップ、並びに標的分子に結合するポリペプチドを単離するステップを含む。方法は、本明細書において記載されるコンビナトリアルポリペプチドライブラリーのポリペプチドをコードする核酸分子のライブラリーをさらに含み、核酸のライブラリーは、ディスプレイ系において発現され、ディスプレイ系は、ディスプレイされた発現産物の少なくとも１つの特性を表す観察可能な表現型及び対応する遺伝子型を含む。
本発明はまた、核酸分子のライブラリーを使用する、標的に特異的に結合するポリペプチドの同定及び単離のための方法を対象とする。一実施形態では、本発明は、標的に特異的に結合することができるポリペプチドの同定及び単離のための方法であって、ランダム化ループ領域を有するＣＴＬＤを有するポリペプチドをコードする核酸のライブラリーを提供するステップであって、ＣＴＬＤのループ領域は、スキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかに従ってランダム化される上記ステップ、ディスプレイ系において核酸ライブラリーを発現させて、１つ又は複数の配列位置のアミノ酸残基が、その異なるメンバーの間で異なるポリペプチド集合体を得るステップ、ポリペプチド集合体を当該標的と接触させるステップ、並びに当該標的に特異的に結合することができるポリペプチドを単離するステップを含む、上記方法を提供する。他の実施形態では、方法は、スキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかに従ってランダム化されるＣＴＬＤを有し、本明細書において記載されるさらなる修飾又は配列のいずれかを有するポリペプチドをコードする核酸分子のライブラリーを提供することを含む。
他の態様では、本発明は、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を有するポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、そのＣＴＬＤの自然の標的以外の標的に結合し、ＣＴＬＤのＣＴＬＤ骨格構造は、スキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかに従って修飾される。一実施形態では、ＣＴＬＤ骨格構造は、スキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかに従って修飾され、本明細書において記載されるさらなる修飾のいずれか、例えば、ＣＴＬＤループ領域の外側の修飾をさらに含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ヒト又はマウステトラネクチン由来のＣＴＬＤの骨格構造を有し、プラスミノーゲン以外の標的に結合する。
ポリペプチドは、ＣＴＬＤを有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを使用し、ＣＴＬＤのループ領域は、スキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかに従ってランダム化され、ポリペプチド及び標的分子の間の結合を可能にする条件下で標的分子とコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを接触させ、並びにそのＣＴＬＤの自然の標的ではない標的分子に結合するポリペプチドを単離して生成することができる。この方法の一実施形態では、ＣＴＬＤは、ヒト又はマウステトラネクチンである。この方法の他の実施形態では、ＣＴＬＤは、スキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかに従ってランダム化され、本明細書において記載されるさらなる修飾のいずれか、例えば、ＣＴＬＤループ領域の外側の修飾を含む。
図１は、既知の三次元構造の１０個のＣＴＬＤのアミノ酸配列のアラインメントを示す。主要な二次構造要素の配列位置は、各配列の上に示され、連続した番号順で標識され、ここで、「αＸ」はαヘリックスの数Ｘを示し、及びβＹはβ−ストランドの数Ｙを示す。ＣＴＬＤの２つの保存されたジスルフィド架橋の形成に関与する４つのシステイン残基が示され、ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩ、及びＣＩＶとして番号付けられている。この場合、ジスルフィド架橋はＣＩ−ＣＩＶ及びＣＩＩ−ＣＩＩＩによって形成される。ヒトテトラネクチン配列における種々のループ領域は下線によって示される。
種々のＣＴＬＤには、「ｈＴＮ」（ヒトテトラネクチン、Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９７））；「ＭＢＰ」（マンノース結合タンパク質、Ｗｅｉｓら、（１９９１）；Ｓｈｅｒｉｆｆら、（１９９４））；「ＳＰ−Ｄ」（サーファクタントタンパク質Ｄ、Ｈａｋａｎｓｓｏｎら、（１９９９））；「ＬＹ４９Ａ」（ＮＫ受容体ＬＹ４９Ａ、Ｔｏｒｍｏら、（１９９９））；「Ｈ１−ＡＳＲ」（アシアロ糖タンパク質受容体のＨ１サブユニット、Ｍｅｉｅｒら、（２０００））；「ＭＭＲ−４」（マクロファージマンノース受容体ドメイン４、Ｆｅｉｎｂｅｒｇら、（２０００））；「ＩＸ−Ａ」及び「ＩＸ−Ｂ」（それぞれ凝固因子ＩＸ／Ｘ結合タンパク質ドメインＡ及びＢ、Ｍｉｚｕｎｏら、（１９９７）；「Ｌｉｔ」（リトスタチン、Ｂｅｒｔｒａｎｄら、（１９９６））；及び「ＴＵ１４」（被嚢類Ｃ型レクチン、Ｐｏｇｅｔら、（１９９９））が含まれる。
図２は、既知の二次構造要素の表示を伴う、ヒト及びマウスのテトラネクチンの成熟形態のコーディング領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のアラインメントを示す。
図３は、ヒト（Swissprot P05452）、マウス（Swissprot P43025）、トリ（Swissprot Q9DDD4）、ウシ（Swissprot Q2KIS7）、大西洋サケ（Swissprot B5XCV4）、カエル（Swissprot Q5I0R9）、ゼブラフィッシュ（GenBank XP_701303）から単離されたテトラネクチンからのいくつかのＣ型レクチンドメイン、並びに蓄牛（Swissprot u22298）及びリーフシャーク（Swissprot p26258）の軟骨から単離された関連ＣＴＬＤホモログのアラインメントを示す。
図４は、ヒトテトラネクチンの三次元構造（リボンフォーマット）を示し、このタンパク質の二次構造的特徴を示す。構造はＣａ２＋結合形態で解明された。
図５Ａは、ヒトテトラネクチン（ＨＴＮ）のＣＴＬＤ及びいくつかのテトラネクチンホモログのＣＴＬＤの三次元オーバーレイ構造を示し、ホモログにはヒトマンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ラットマンノース結合タンパク質−Ｃ（ＭＢＰ−Ｃ）、ヒトサーファクタントタンパク質Ｄ、ラットマンノース結合タンパク質−Ａ（ＭＢＰ−Ａ）、及びラットサーファクタントタンパク質Ａが含まれる。ＣＴＬＤオーバーレイ構造は、鋳型としてヒトテトラネクチンの三次元構造を用いて、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用のＳｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒ Ｄｅｅｐ Ｖｉｅｗ ｖ．４．０．１により生じさせた。 図５Ｂは、図５Ａに示されたヒトテトラネクチンのＣＴＬＤ、及びテトラネクチンホモログのＣＴＬＤの対応するアミノ酸配列を示す。図Ｂでは、１ＨＵＰ＝ヒトマンノース結合タンパク質、１ＢＶ４Ａ＝ラットマンノース結合タンパク質、２ＧＧＵＡ＝ヒトサーファクタントタンパク質Ｄ、１ＫＸＯＡ＝ラットマンノース結合タンパク質Ａ、１Ｒ１３＝ラットサーファクタントタンパク質Ａである。
図６Ａは、ヒトテトラネクチン（ＨＴＮ）のＣＴＬＤ及びいくつかのテトラネクチンホモログのＣＴＬＤの三次元構造オーバーレイ構造を示し、ホモログにはヒト膵炎関連タンパク質、ヒト樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３捕獲非インテグリン２（ＤＣ−ＳＩＧＮＲ）、ラットアグリカン、マウススカベンジャー受容体、及びヒトスカベンジャー受容体が含まれる。ＣＴＬＤオーバーレイ構造は、鋳型としてヒトテトラネクチンの三次元構造を用いて、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用のＳｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒ Ｄｅｅｐ Ｖｉｅｗ ｖ．４．０．１により生じさせた。 図６Ｂは、図６Ａに示されたヒトテトラネクチンのＣＴＬＤ、及びテトラネクチンホモログのＣＴＬＤの対応するアミノ酸配列を示す。図６Ｂでは、１ＴＤＱＢ＝ラットアグリカン、１ＵＶ０Ａ＝ヒト膵炎関連タンパク質、２ＯＸ８Ａ＝ヒトスカベンジャー受容体、２ＯＸ９Ａ＝マウススカベンジャー受容体、及び１ＳＬ６Ａ＝ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲである。
図７は、ＣＴＬＤにおけるランダム化ループを作製するためのＰＣＲ戦略を示す。
図８は、クローニングするために制限部位を含むように修飾されたヒトテトラネクチンＣＴＬＤのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示し、Ｃａ２＋結合部位を示す。制限部位を実線で下線を付す。ループを破線で下線を付す。カルシウム配位残基は太字イタリックであり、部位１：Ｄ１１６、Ｅ１２０、Ｇ１４７、Ｅ１５０、Ｎ１５１；部位２：Ｑ１４３、Ｄ１４５、Ｅ１５０、Ｄ１６５を含む。ＣＴＬＤドメインは太字のアミノ酸Ａ４５（即ち、ＡＬＱＴＶＣＬ．．．）で始まる。天然のテトラネクチン（ＴＮＣＴＬＤ）塩基配列の変化を小文字で示す。制限部位は、天然のアミノ酸配列を変更しないサイレントな突然変異を用いて作製された。
図９は、ＣＴＬＤループ領域において伸長し、ランダム化を導入するための非制限的な戦略を示す。
図１０は、５つのＤＲ５のＡＴＲＩＭＥＲ（商標）：４ａ８ｃ、２ａ１ａ、１ａ７ｂ、９ｂ３ｄ及び８ｂ６ｂの存在下で細胞死を測定する実験の結果を示す。Ｈ２１２２肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｎｏｍａ）細胞及びＡ２７８０卵巣癌細胞は、ＤＲのＡＴＲＩＭＥＲ（商標）（２０μｇ／ｍＬ）又はＴＲＡＩＬ（０．２μｇ／ｍＬ）と共に１×１０４細胞／ウェルでインキュベートされた。データは、各緩衝液対照と比較した細胞死の割合として表される。
図１１は、ヒトＩＬ−２３Ｒへの本発明のポリペプチド及び天然のヒトＩＬ−２３の結合を比較する実験の結果を示す。
図１２は、本発明のＡＴＲＩＭＥＲ（商標）複合体４Ｇ８、天然のヒトＩＬ−２３、及びウステキヌマブの存在下でのＩＬ−２３誘導によるＩＬ−１７生成を比較する実験の結果を示す。
図１３は、本発明のＡＴＲＩＭＥＲ（商標）複合体１Ａ４及びウステキヌマブの存在下でのＩＬ−２３誘導によるＩＬ−１７生成を比較する実験の結果を示す。
図１４は、本発明のＡＴＲＩＭＥＲ（商標）複合体４Ｇ８、天然のヒトＩＬ−２３、及びウステキヌマブの存在下でのＩＬ−１２誘導によるＩＦＮγ生成を比較する実験の結果を示す。
図１５は、ＩＬ−２３及び本発明のポリペプチドに反応したＮＫＬ細胞におけるＳｔａｔ−３リン酸化を比較する実験の結果を示す。
図１６Ａは、本発明のいくつかのＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体と関連した実験結果を示す表である。 図１６Ｂは、本発明のいくつかのＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体と関連した実験結果を示す表である。
定義
出願の全体にわたって使用される科学用語及び専門用語は全て、他に別段の指定がない限り、それらの共通の科学的な／専門的な意味を有するように理解されるべきである。同様に、用語又は冠詞の単数形が使用される場合、それはまた、その用語又は冠詞の複数形を包含するように理解されるべきである。
用語「Ｃ型レクチン様タンパク質」及び「Ｃ型レクチン」は、任意の真核生物種のゲノムにおいて存在する又はコードされる任意のタンパク質又はポリペプチドに指すように使用され、タンパク質又はポリペプチドは、１つ若しくは複数のＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）又はＣＴＬＤの任意のサブグループに属する１つ若しくは複数のドメイン（例えば、炭水化物リガンドに結合することができるＣＲＤ）を含有する。定義は、膜結合Ｃ型レクチン様タンパク質及びＣ型レクチン、機能的膜貫通ドメインを欠く「可溶性」Ｃ型レクチン様タンパク質及びＣ型レクチン、並びに１つ又は複数のアミノ酸残基が、グリコシル化又は任意の他の合成後修飾によってｉｎ ｖｉｖｏにおいて改変された変異Ｃ型レクチン様タンパク質及びＣ型レクチン並びにＣ型レクチン様タンパク質及びＣ型レクチンの化学的な及び酵素による修飾によって得られる任意の産物を含む。請求項において及び明細書の全体にわたって、ある種の改変は、ＣＴＬＤ又はＣＴＬＤ含有タンパク質の特定のアミノ酸残基番号に関連して定義することができる。糖鎖生物学の要説（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第二版、Ａ．Ｖａｒｋｉ、Ｒ．Ｄ．Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｊ．Ｄ．Ｅｓｋｏ、ＨＨ．Ｆｒｅｅｚｅ， Ｐ．Ｓｔａｎｌｅｙ、Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ、Ｇ．Ｗ．Ｈａｒｔ、Ｍ．Ｅ．Ｅｔｚｌｅｒ編、ＣＨＳ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
ＣＴＬＤは、およそ１２０のアミノ酸残基から成り、特徴的に、２つ又は３つの鎖内ジスルフィド架橋を含有する。異なるタンパク質由来のＣＴＬＤの間のアミノ酸配列レベルでの類似性は、比較的低いが、多くのＣＴＬＤの三次元構造は、高度に保存されていることが分かっており、構造の変異性は、５つまでのループによって多くの場合決定されるループ領域に本質的に限られる。いくつかのＣＴＬＤは、カルシウムに対する１つ又は２つの結合部位を含有し、カルシウムと相互作用するほとんどの側鎖は、ループ領域中に位置する。
三次元構造の情報が入手可能なＣＴＬＤに基づいて、標準的なＣＴＬＤは、β１、α１、α２、β２、β３、β４、及びβ５の順で連続して現われる、７つの主要な二次構造エレメント（例えば、５つのβ−ストランド及び２つのα−ヘリックス）によって構造的に特徴づけられることが推論された。図１は、１０種のＣ型レクチンの知られている三次元構造のＣＴＬＤのアライメントを示す。三次元構造が決定された全てのＣＴＬＤにおいて、β−ストランドは、一方はβ１及びβ５から構成され、他方はβ２、β３、及びβ４から構成される２の逆平行β−シートで配置する。さらなるβ−ストランド、β０は、多くの場合、配列においてβ１に先行し、存在する場合、β１，β５−シートとのさらなるストランド統合を形成する。さらに、２つのジスルフィド架橋、α１とβ５をつなぐジスルフィド架橋（ＣＩ−ＣＩＶ）及びβ３と、β４とβ５をつなぐポリペプチドセグメントをつなぐジスルフィド架橋（ＣＩＩ−ＣＩＩＩ）は、現在まで特徴づけられた全てのＣＴＬＤにおいて一様に見つけられる。
保存された二次構造エレメント（アルファヘリックス及びベータシート）は、多くのループについて緻密な骨格を形成し、本文脈において、集団的に、「ループ領域」と呼ばれ、コアから外に突出している。ＣＴＬＤの一次構造では、これらのループは、２つのセグメント、ループセグメントＡ、ＬＳＡ及びループセグメントＢ、ＬＳＢに体系づけられる。ＬＳＡは、規則的な二次構造を多くの場合、欠き、４つまでのループを含有する、β２とβ３をつなぐ長いポリペプチドセグメントを表す。ＬＳＢは、β−ストランドβ３とβ４をつなぐポリペプチドセグメントを表す。β４における単一残基と共にＬＳＡにおける残基は、テトラネクチンのＣＴＬＤを含むいくつかのＣＴＬＤのＣａ２＋及びリガンド結合部位に特性をもたせることが示された。例えば、１つ又はいくつかの残基の置換を伴う突然変異誘発研究は、結合特異性、Ｃａ２＋感受性、及び／又は親和性における変化が、ＣＴＬＤドメインによって調節することができることを示した。
本明細書において議論されるように、以下の非限定的な例を含む、ＣＴＬＤを有する多くのタンパク質が知られている：テトラネクチン、リトスタチン、マウスマクロファージガラクトースレクチン、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞受容体、ニワトリニューロカン、パールシン、アシアロ糖タンパク質受容体、軟骨プロテオグリカンコアタンパク質、ＩｇＥ Ｆｃ受容体、膵炎関連タンパク質、マウスマクロファージ受容体、ナチュラルキラー群、幹細胞増殖因子、第ＩＸ／Ｘ因子結合タンパク質、マンノース結合タンパク質、ウシコングルチニン、ウシＣＬ４３、コレクチン肝臓１、サーファクタントタンパク質Ａ、サーファクタントタンパク質Ｄ、ｅ−セレクチン、被嚢動物ｃ型レクチン、ＣＤ９４ ＮＫ受容体ドメイン、ＬＹ４９Ａ ＮＫ受容体ドメイン、ニワトリ肝臓レクチン、マスｃ型レクチン、ＨＩＶ ｇｐ １２０結合ｃ型レクチン、及び樹状細胞免疫受容体。その全体が本明細書において参照によって組み込まれるＵ．Ｓ．２００７／０２７５３９３を参照されたい。
用語「アミノ酸」、「アミノ酸（複数）」、及び「アミノ酸残基」は、全ての天然に存在するＬ−アミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸を指す。この定義は、ノルロイシン、オルニチン、及びホモシステインを含むことを意味する。天然に存在するＬ−アミノ酸は、それらの側鎖の化学組成及び特性に従って分類することができる。それらは、荷電及び無電荷の２つのグループにおおまかに分類される。これらのグループのそれぞれは、アミノ酸をより正確に分類するためにサブグループに分けられる：Ａ．荷電アミノ酸−（Ａ．１．酸性残基）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（Ａ．２．塩基性残基）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ；Ｂ．無電荷アミノ酸−（Ｂ．１．親水性残基）：Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（Ｂ．２．脂肪族残基）：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ；（Ｂ．３．無極性残基）：Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｈｃｙ；（Ｂ．４．芳香族残基）：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
「非天然アミノ酸」又は「天然に存在しないアミノ酸」は、例えば、天然にコードされるアミノ酸（２０種の一般的なアミノ酸又はピロールリジン及びセレノシステインを含むが、これらに限定されない）の修飾（例えば、翻訳後修飾）によって生じるが、それら自体、翻訳複合体によって、成長しているポリペプチド鎖に天然に組み込まれないアミノ酸を含む、２０種の一般的なアミノ酸の１つでないアミノ酸を指す。そのような天然に存在しないアミノ酸の例は、Ｎ−アセチルグルコサミン−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミン−Ｌ−トレオニン、及びＯ−ホスホチロシンを含むが、これらに限定されない。
本発明において使用するのに適した非天然アミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ）又はＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡ）から市販で入手可能である。市販で入手可能でないものは、本明細書において提供されるように又は様々な刊行物において提供されるように又は当業者らに知られている標準的な方法を使用して任意選択で合成される。有機合成技術については、例えば、Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ及びＦｅｓｓｅｎｄｏｎによるＯｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２、第二版、Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、１９８５、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；並びにＣａｒｅｙ及びＳｕｎｄｂｅｒｇによるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、Ａ及びＢ部、１９９０、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。非天然アミノ酸の合成を記載するさらなる刊行物は、例えば、「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ」と題するＷＯ ２００２／０８５９２３；Ｍａｔｓｏｕｋａｓら、（１９９５） Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．， ３８、４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ， Ｆ．Ｅ．＆ Ｋｉｄｄ， Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９）フチル化中間体からのグルタミン及びグルタミン酸のガンマ−ジペプチドの新しい合成（Ａ Ｎｅｗ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｏｆ ．ｇａｍｍａ．−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｏ．Ｍ．＆ Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ， Ｒ．（１９５９）抗腫瘍剤のためのモデル基質としてのグルタミンの誘導体の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｓ Ｍｏｄｅｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１、３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ， Ｊ．Ｃ．ら（１９８８）７−クロロ−４［［４−（ジエチルアミノ）−１−メチルブチル］アミノ］キノリン（クロロキン）のエナンチオマーの絶対立体配置（Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ ｏｆ ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ （Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ））Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３、１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ， Ｍ．、Ｖｉｌｍｏｎｔ， Ｍ．＆ Ｆｒａｐｐｉｅｒ， Ｆ．（１９９１）潜在的な抗マラリア薬としてのグルタミン類似体（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６， ２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ， Ａ．Ｍ．Ｐ．＆ Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｈ．（１９８９）立体配置的に束縛されたアミノ酸類似体としての４−置換プロリンの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｐｒｏｌｉｎｅｓ ａｓ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４， １８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ， Ｂ．Ｄ．＆ Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｈ．（１９８５）Ｌ−アスパラギンからの光学的に純粋なピペコレートの合成。アミノ酸脱カルボニル及びイミニウムイオン環化を通しての（＋）−アポビンカミンの全合成への適用（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｐｕｒｅ Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ （＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｉｎｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９： １８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎら、（１９８７）ラジカル化学を使用する新規なα−アミノ酸及び誘導体の合成：Ｌ−及びＤ−α−アミノ−アジピン酸、Ｌ−α−アミノピメリン酸、及び適切な不飽和誘導体の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌ−ａｎｄ Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４３： ４２９７−４３０８；並びにＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら、（１９９２）キスカル酸類似体：ベータ−ヘテロ環式２−アミノプロパン酸誘導体の合成及び新規なキスカレート増感部位でのそれらの活性（Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｓｉｔｅ）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５： ４６０２−７を含む。それらの全体のそれぞれが本明細書において参照によって組み込まれるＵＳ ２００４／０１９８６３７及びＵＳ ２００５／０１７０４０４もまた参照されたい。
用語「アミノ酸修飾（単数又は複数）」及び「修飾（単数又は複数）」は、天然配列に比べた、アミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、欠失、若しくは挿入又はその任意の組み合わせを指す。本明細書における置換変異体は、天然ＣＴＬＤ配列における少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、異なるアミノ酸が同じ位置のその場所に挿入されたものである。分子における１つのアミノ酸のみが置換される場合、置換は、単一であってもよい又は２つ以上のアミノ酸が同じ分子において置換される場合、それらは複数であってもよい。ＣＴＬＤにおける１つを超えるアミノ酸置換に対する特定の言及は、それぞれの個々のアミノ酸置換が、連続及び非連続アミノ酸位置を含むＣＴＬＤ内の任意のアミノ酸位置で生じ得る複数の置換を指す。同様に、ＣＴＬＤにおける１つを超えるアミノ酸の挿入又は欠失に対する特定の言及は、それぞれの個々のアミノ酸の挿入又は欠失が、連続及び非連続アミノ酸位置を含むＣＴＬＤ内の任意のアミノ酸位置で生じ得る複数の挿入又は欠失を指す。
用語「〜をコードする核酸分子」、「〜をコードするＤＮＡ配列」、及び「〜をコードするＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸のストランドに沿ったデオキシリボヌクレオチドの順又は配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順は、ポリペプチド鎖に沿ったアミノ酸の順を決定する。ＤＮＡ配列は、したがって、アミノ酸配列をコードする。
用語「ランダム化する」、「ランダム化すること」、及び「ランダム化された」並びにランダム化ポリペプチド配列又は核酸配列を識別するためにあらゆる文脈において使用される任意の同様の用語は、ポリペプチド又は核酸の配列又はセグメントの集合体を指し、１つ又は複数の配列位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドは、ポリペプチド集合体又は核酸集合体の異なるメンバーの間で異なっていてもよく、それぞれのそのような配列位置で生じるアミノ酸残基又はヌクレオチドは、全ての可能なアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを含んでいてもよいアミノ酸残基若しくはヌクレオチドのセット又はその任意の限られたサブセットに属する。用語は、可能なアミノ酸残基又はヌクレオチドの数が集合体のそれぞれのメンバーについて同じである集合体を指すために多くの場合使用されるが、また、集合体のそれぞれのメンバーにおける可能なアミノ酸残基又はヌクレオチドの数が整数の数の適切な範囲内の任意の整数の数であってもよいそのような集合体を指すために使用されてもよい。
用語「調整する」又は「調整すること」は、プラスミノーゲン、金属（例えば、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋など）又は任意の他の標的分子に対するＣＴＬＤの結合親和性に関連して使用される場合、天然（非修飾）ＣＴＬＤポリペプチドの結合親和性に比べた、プラスミノーゲン又は金属イオン又は標的分子に対する修飾ＣＴＬＤポリペプチドの結合親和性における変化を指す。したがって、「調整すること」は、結合親和性を増加させること、結合親和性を減少させること、及び／又は結合親和性を消失させる若しくは抑止することを含む（但し、プラスミノーゲン、金属イオン、又は標的分子結合活性を「消失させること」又は「抑止すること」という用語の特定の詳説を除外しない）。
リガンド／受容体、抗体／抗原、又は他の結合ペアなどの結合ペアを指す場合、結合は、結合ペアの他のメンバーの不均質な集団における結合ペアのメンバーの存在の決定因となる結合反応において測定される。指定される条件下で、「特異的な結合」は、結合ペアの一方のメンバーが非相同集団において結合ペアのもう一方のメンバーに結合する場合に生じ、試料中に存在する他のタンパク質又はポリペプチドに有意な量で結合しない。特異的な結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ及びＥＬＩＳＡを含む、本明細書において記載される方法を使用して測定することができる。
用語「１Ｘ−２ライブラリー」は、ＣＴＬＤのＬＳＡにおける４つのループの少なくとも１つにおいてアミノ酸修飾を含むＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを指し、アミノ酸修飾は、ＣＴＬＤのループ１における少なくとも２つのアミノ酸挿入及びループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換を含む。
用語「１−２ライブラリー」は、ＣＴＬＤのＬＳＡにおける４つのループの少なくとも１つにおいてアミノ酸修飾を含むＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを指し、アミノ酸修飾は、ループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換及びループ２内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む。
用語「１−４ライブラリー」は、ＣＴＬＤのＬＳＡにおける４つのループの少なくとも１つにおいてアミノ酸修飾を含むＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを指し、アミノ酸修飾は、ループ１内の少なくとも７つのアミノ酸のランダム置換、ループ４における少なくとも３つのアミノ酸挿入、及び少なくとも２つのアミノ酸のランダム置換を含む。
用語「３Ｘライブラリー」は、ＣＴＬＤのＬＳＡにおける４つのループの少なくとも１つにおいてアミノ酸修飾を含むＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを指し、アミノ酸修飾は、ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換、少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも１つのアミノ酸置換、並びに少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも２つのアミノ酸置換の混合物を含む。
用語「３−４Ｘライブラリー」は、ＣＴＬＤのＬＳＡにおける４つのループの少なくとも１つにおいてアミノ酸修飾を含むＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを指し、アミノ酸修飾は、ループ３における少なくとも３つのアミノ酸挿入及びループ３内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含み、ループ４における少なくとも３つのアミノ酸挿入及びループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む。
用語「３−４コンボライブラリー」は、ＣＴＬＤのＬＳＡにおける４つのループの少なくとも１つにおいてアミノ酸修飾を含むＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを指し、アミノ酸修飾は、２つのループを組み合わせて、単一のループにする修飾を含み、２つの組み合わせられたループは、ループ３及びループ４である。
用語「４ライブラリー」は、ＣＴＬＤのＬＳＡにおける４つのループの少なくとも１つにおいてアミノ酸修飾を含むＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを指し、アミノ酸修飾は、ループ４における少なくとも４つのアミノ酸挿入及びループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む。
用語「３−５ライブラリー」は、ＣＴＬＤのＬＳＡにおける４つのループの少なくとも１つにおいてアミノ酸修飾を含むＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを指し、アミノ酸修飾は、ループ３内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換及びループ５内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む。
用語「ループ３Ｘループライブラリー」は、ＣＴＬＤのＬＳＡにおける４つのループの少なくとも１つにおいてアミノ酸修飾を含むＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを指し、アミノ酸修飾は、少なくとも１つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも６つのアミノ酸挿入を含む。
修飾ＣＴＬＤを有するコンビナトリアルポリペプチドライブラリー
本発明は、一般に、ＣＴＬＤの天然配列から修飾されているランダム化ループ領域を有するＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーに関する。ＣＴＬＤのランダム化ループ領域は、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾を含むことができ、ループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるループ（ループ５としても知られている）における１つ又は複数のアミノ酸修飾をさらに含むことができる。本発明はまた、ランダム化コンビナトリアルポリペプチドライブラリーを生成し、使用するための方法にも関する。化学、組換えタンパク質、及び抗体の技術分野において知られている標準的なコンビナトリアル方法を適用することによって、本発明のライブラリー及び方法は、対象の標的分子に対して結合特異性を示すタンパク質産物の生成、スクリーニング、及び同定を可能にする。
天然に存在するＣＴＬＤの間の結合部位立体配置の変異は、それらの共通のコア構造が、リガンド結合部位の本質的に異なる多くの立体配置を調節することができることを示す（例えば、ＵＳ ２００７／０２７５３９３を参照されたい）。そのため、ＣＴＬＤは、特に、所望の結合特性を有するそのような新しく有用なタンパク質産物を構築するためのベースとして果たすのに十分に適している。したがって、一態様では、本発明は、ＣＴＬＤのループ領域（ＬＳＡ及びＬＳＢ）に対する修飾を含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーに関するが、一般的なＣＴＬＤコア構造（つまりβ−ストランド及びα−ヘリックス）に対する他の修飾は、本明細書において記載されるライブラリーの有用性に影響することなくなすことができる。当業者は、ＣＴＬＤ機能性を保持するＣＴＬＤコア構造における特定の修飾を標的にすることができる。例えば、ＣＴＬＤを含む様々なポリペプチドの二次及び三次構造に基づいて、疎水性親水性指標、電荷（イオン）、及び水素結合相互作用は全て、考慮に入れることができ、ＣＴＬＤ機能を保持する適切な置換をなすことができる。そのような修飾は、保存的アミノ酸置換を含む。ＣＴＬＤのループ領域に外部の領域における欠失、挿入又は置換変異体などの変異体を含む実施形態では、同一性パーセントは、５０％しかない。ＣＴＬＤ領域内のそのような変異を含む他の実施形態では、変異体は、任意の所定のＣＴＬＤ配列又はＣＴＬＤコンセンサス配列に対して少なくとも８０％同一である。ある実施形態では、そのような変異体は、任意のＣＴＬＤ配列又はＣＴＬＤコンセンサス配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である。
コンビナトリアルライブラリーにおいて使用されるＣＴＬＤは、任意のＣＴＬＤに由来し得る。適したＣＴＬＤの例は、本明細書（つまり図１〜３）において及びその全体が本明細書において参照によって組み込まれるＵＳ ２００７／０２７５３９３（つまり図１及び表１）において記載されるＣＴＬＤ並びに当技術分野においてその他に知られているＣＴＬＤである。ある実施形態では、ＣＴＬＤは、以下の二次構造を有する：β１、α１、α２、β２、β３、β４、及びβ５の順で連続して現われる、一方はβ１及びβ５から構成され、他方はβ２、β３、及びβ４から構成される２つの逆平行β−シートで配置する５つのβ−ストランド及び２つのα−ヘリックス、少なくとも２つのジスルフィド架橋、α１とβ５をつなぐジスルフィド架橋及びβ３と、β４とβ５をつなぐポリペプチドセグメントをつなぐジスルフィド架橋、並びにβ２とβ３をつなぐループセグメントＡ（ＬＳＡ）及びβ３とβ４をつなぐループセグメントＢ（ＬＳＢ）を含有するループ領域。
特定の実施形態では、ＣＴＬＤ配列は、本発明に従って修飾されるヒト又はマウステトラネクチンＣＴＬＤ配列である。図２は、ヒト及びマウステトラネクチンＣＴＬＤの核酸及びポリペプチド配列のアライメントを示す。他の実施形態では、ＣＴＬＤは、様々なペプチド、例えば、ヒト（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ Ｐ０５４５２）、マウス（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ Ｐ４３０２５）、ニワトリ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ Ｑ９ＤＤＤ４）、ウシ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ Ｑ２ＫＩＳ７）、大西洋サケ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ Ｂ５ＸＣＶ４）、カエル（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ Ｑ５Ｉ０Ｒ９）、ゼブラフィッシュ（ＧｅｎＢａｎｋ ＸＰ＿７０１３０３）、及びウシの軟骨から単離された関連するＣＴＬＤホモログ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ ｕ２２２９８）、並びにリーフシャーク（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ ｐ２６２５８）から単離されたテトラネクチン由来のいくつかのＣＴＬＤのアライメントを示す図３において示されるもの由来のものである。
したがって、広い態様では、本発明は、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含むポリペプチドメンバーを含むポリペプチドライブラリーを提供し、ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおいて及び／又はループセグメントＢ（ＬＳＢ）（ループ５）におけるループにおいて１つ又は複数のアミノ酸修飾を含む。ＣＴＬＤのループ領域（ＬＳＡ及びＬＳＢ）における５つのループの少なくとも１つにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾を含むＣ型レクチンドメインを有するポリペプチドを含むポリペプチドライブラリーの例は、本明細書において記載される。
ポリペプチドライブラリーのある実施形態では、ポリペプチドメンバーは、ＣＴＬＤループの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つが１つ又は複数のアミノ酸修飾を有するＣＴＬＤを有し、１つ又は複数の修飾は、その本来の長さを超えてループ領域を伸長させる少なくとも１つのアミノ酸挿入を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、１つ又は複数の修飾は、ループ領域（ＬＳＡ及びＬＳＢ）における任意の単一のループにおいて、１〜約３０のアミノ酸挿入（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０のアミノ酸挿入）を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、１つ又は複数の修飾は、ループ領域における５つのループの少なくとも２つにおける少なくとも１つのアミノ酸挿入を含む（例えば、ＬＳＡにおける２つ、３つ、又は４つのループ又はＬＳＡにおける１つ、２つ、又は３つのループ及びＬＳＢにおける１つのループ）。
ある実施形態では、ポリペプチドライブラリーは、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含むポリペプチドメンバーを含み、ＣＴＬＤは、ループ領域（ＬＳＡ及びＬＳＢ）における５つのループの少なくとも１つにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾を含み、ループ領域におけるある種のＣａ２＋調整アミノ酸は、保持される。他の実施形態では、ポリペプチドライブラリーは、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含むポリペプチドメンバーを含み、ＣＴＬＤは、ループ領域（ＬＳＡ及びＬＳＢ）における５つのループの少なくとも１つにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾を含み、プラスミノーゲン結合活性と関連するある種のアミノ酸（単数又は複数）は、排除される。
この態様のある実施形態では、ポリペプチドライブラリーは、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含むポリペプチドメンバーを含み、ＣＴＬＤは、ＬＳＡ及びＬＳＢの領域の外部にあるＣＴＬＤの領域における１つ又は複数のアミノ酸修飾を含む。したがって、そのような修飾は、ベータストランド及び／又はアルファヘリックス領域の任意の１つ又は複数において設計することができる又はランダムに生成することができる。この例は、表１７において示す。
任意のＣＴＬＤのループ領域は、まだ識別されていない又は特徴づけられていない場合、任意の単一の構造的に特徴づけられたＣＴＬＤ又は構造的に特徴づけられたＣＴＬＤの任意の組み合わせについての既存の配列ベースの情報を使用する任意の多種多様の構造又は配列ベースの分析を使用して同定することができる。典型的に、ループ領域は、ＣＴＬＤアミノ酸配列のより規則的な領域の間で（例えば、α−ヘリックス又はβ−ストランドの間で）見つけられるアミノ酸のストレッチであり、典型的に、より可動性の立体配座を有する。ＣＴＬＤにおけるループセグメントＡ（ＬＳＡ）は、標準的なＣＴＬＤモチーフのβ２及びβ３ストランドの間に典型的にある。（ＬＳＡ）は、（ＬＳＡ）にある程度の規則を提供する小さなベータシート構造の間に普通位置するより小さなループ領域（ループ１、２、３、及び４）を含有する（例えば、図４を参照されたい）。ＣＴＬＤは、典型的に、β３及びβ４の間に位置するより小さなループ構造（ループセグメントＢ、「ＬＳＢ」又は「ループ５」）を有する。
述べられるように、任意のＣＴＬＤのループ領域は、任意の単一の構造的に特徴づけられたＣＴＬＤ又は構造的に特徴づけられたＣＴＬＤの任意の組み合わせについての既存の配列情報に基づいた構造及び／又は配列ベースの分析を使用して同定することができる。例えば、任意の特徴づけられていないＣＴＬＤのループ領域の位置は、図１において示される、構造が特徴づけられたＣＴＬＤのグループと、予期されるＣＴＬＤ配列をアライメントすることによって同定することができる。図１において示される配列アライメントは、実際の三次元構造データから正確に解明された。フレームワークの対応する構造エレメントのポリペプチドセグメントもまた強いアミノ酸配列類似性を示すということを考慮すれば、図１は、配列アライメントから容易に推論することができる直接的な配列−構造の特徴のセットを提供する。図１において示されるように、ループ領域（ＬＳＡ及びＬＳＢ）は、β２−、β３−、及びβ４−ストランドに対応するセグメントが側面に位置する（ＬＳＡのループ１〜４は、典型的に、標準的なＣＴＬＤのβ２及びβ３ストランドの間にあり、ＬＳＢのループ５は、典型的に、ＣＴＬＤのβ３及びβ４の間に位置する）。β２−、β３−、及びβ４−ストランドは、それぞれのコンセンサス配列の同定によって同定することができる（米国特許出願公開第２００７／０２７５３９３において公開される）。予期されるＣＴＬＤのループ領域は、図１において示される配列と、予期されるＣＴＬＤの配列をアライメントし、配列アライメントによって誘導されるようにフレームワーク構造エレメントのおよその位置を割り当て、つまり、β２−、β３−、及びβ４−ストランドを同定し、これまでに特徴づけられた全てのＣＴＬＤにおいて常に見つけられる２つの保存ジスルフィド架橋（図１におけるＣＩ−ＣＩＶ及びＣＩＩ−ＣＩＩＩ）の形成に関与する４つの標準的なシステイン残基の正確なアライメントを確実にするためにアライメントを調節することによって、同定することができる。さらに、予期されるＣＴＬＤのループ領域は、図１におけるＣＴＬＤ配列のいずれかと、予期されるＣＴＬＤの配列をアライメントすることによって、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒ ＤｅｅｐＶｉｅｗ ｖ．４．０．１ ｆｏｒ ＭａｃＩｎｔｏｓｈなどの知られているタンパク質構造モデリングプログラムを使用して同定することができる。同じ方法において使用することができる他のタンパク質モデリングプログラムは、当技術分野において知られており、公共の使用のために入手可能であり、例えば、ＭＯＤＥＬＬＥＲ及びＳｅｌｖｉｔａ ＳＰＭＰ ２．０がある（Ｓａｌｉ Ａ、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ＴＬ．（１９９３）空間的制限を充足することによる比較タンパク質モデリング（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｂｙ ｓａｔｉｓｆａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐａｔｉａｌ ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４， ７７９−８１５；Ｍａｒｔｉ−Ｒｅｎｏｍ ＭＡ、Ｓｔｕａｒｔ Ａ、Ｆｉｓｅｒ Ａ、Ｓａｎｃｈｅｚ Ｒ、Ｍｅｌｏ Ｆ、Ｓａｌｉ Ａ．（２０００）遺伝子及びゲノムの比較タンパク質構造モデリング（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅｓ）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２９， ２９１−３２５；Ｆｉｓｅｒ Ａ、Ｓａｌｉ Ａ．（２００３）Ｍｏｄｅｌｌｅｒ：相同性ベースのタンパク質構造モデルの生成及び精密化（Ｍｏｄｅｌｌｅｒ： ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｓ）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３７４：４６１−９１を参照されたい）。
配列−構造分析はまた、新しいクラスのＣＴＬＤライブラリーの構築においてフレームワークとしてＣＴＬＤを使用することができることを実証する。正確な三次元構造がまだ決定されていないＣＴＬＤに基づいた新しいクラスのＣＴＬＤライブラリーの構築のために出発物質を調製することに関与するさらなるステップは、以下を含む：（１）図１において示される配列との新しいＣＴＬＤの配列のアライメント；（２）配列アライメントによって誘導される、フレームワーク構造エレメントのおよその位置の割り当て、２つの保存ジスルフィド架橋（図１におけるＣＩ−ＣＩＶ及びＣＩＩ−ＣＩＩＩ）の形成に関与する４つの標準的なシステイン残基の正確なアライメントを確実にするためにアライメントの小さな調節のためのあらゆる要求に従うこと。
本発明のポリペプチドライブラリーにおいて使用されるＣＴＬＤを含むポリペプチドは、ＣＴＬＤを有する完全長タンパク質又は部分的なタンパク質、例えば、本明細書において記載されるタンパク質及びその他に知られているタンパク質のいずれかの完全長アミノ酸配列又は部分的なアミノ酸配列とすることができる。その代わりに、本発明のポリペプチドライブラリーにおいて使用されるＣＴＬＤを含むポリペプチドは、ＣＴＬＤ配列、例えば、本明細書において記載されるＣＴＬＤ及びその他に知られているＣＴＬＤのいずれかのアミノ酸配列のみを含むポリペプチドとすることができる。ＣＴＬＤ配列を含むポリペプチドは、さらなる側面に位置するＣ末端及び／又はＮ末端（非ＣＴＬＤ）アミノ酸配列を有することができる。
一態様では、本発明は、コンビナトリアルペプチドライブラリー及びライブラリーのポリペプチドをコードする核酸配列のライブラリーを提供し、ポリペプチドのＣＴＬＤを、多くのスキームに従って修飾し、スキーム（ａ）〜（ｊ）として同定の目的のみのために標識した。それぞれのスキームは、特に、本明細書において記載されるが、修飾は、少なくとも以下の通りである。
ループ１における少なくとも１つのアミノ酸の挿入及びループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
ループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換及びループ２内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
ループ１内の少なくとも７つのアミノ酸のランダム置換及びループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
ループ３における少なくとも１つのアミノ酸挿入及びループ３内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
２つのループを組み合わせて、単一のループにする、２つの組み合わせられたループは、ループ３及びループ４である修飾を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
ループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入及びループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
ループ３における少なくとも５つのアミノ酸残基のランダム置換及びループ５内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）及びループセグメントＢ（ＬＳＢ）における５つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
ループ３における少なくとも１つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも６つのアミノ酸の挿入を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
（ｉ）（１）ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換並びに（２）ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも１つのアミノ酸挿入の混合物を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；並びに
（ｊ）ループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおける少なくとも４つ以上のアミノ酸挿入を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つ又はＣＴＬＤのループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるループ５におけるアミノ酸修飾。
スキーム（ａ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのＬＳＡにおける４つのループ又はＬＳＢにおけるループの少なくとも１つにおいてアミノ酸修飾を含み、アミノ酸修飾は、ループ１における少なくとも１つのアミノ酸挿入及びループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換を含む。
コンビナトリアルライブラリーの本態様のある実施形態では、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来のものである場合、ＣＴＬＤはまた、アルギニン−１３０のランダム置換をも有する。ヒトテトラネクチンのＣＴＬＤ以外のＣＴＬＤについては、このペプチドは、Ｃ末端方向に、ループ２のＣ末端ペプチドに対して直接隣接して位置する。例えば、マウステトラネクチンでは、このペプチドはグリシン−１３０である。コンビナトリアルライブラリーの本態様のある実施形態では、ＣＴＬＤがテトラネクチン、例えば、ヒト又はマウステトラネクチン由来のものである場合、ＣＴＬＤは、ループ４においてリシン−１４８のアラニンへの置換を含む。
ある実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ａ）の修飾ＣＴＬＤを有する場合、アミノ酸修飾は、ループ１における２つのアミノ酸挿入及びループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換を含む。他の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ａ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ１における少なくとも１つのアミノ酸挿入及びループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換を含み、アルギニン１３０のランダム置換を含む。特定の一実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ａ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ１における２つのアミノ酸挿入、ループ１内の５つのアミノ酸のランダム置換、及びアルギニン１３０のランダム置換を含む。特定の一実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ａ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがマウステトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ１における２つのアミノ酸挿入、ループ１内の５つのアミノ酸のランダム置換、及びロイシン１３０のランダム置換を含む。スキーム（ａ）についての実施形態のいずれかにおいても、アミノ酸修飾は、リシン−１４８のアラニンへの置換をさらに含むことができる。したがって、コンビナトリアルライブラリーの本態様の特定の一実施形態では、ＣＴＬＤは、ループ１における２つのアミノ酸挿入、ループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換、アルギニン−１３０又はＣ末端方向に、ループ２の外部に隣接して位置する他のアミノ酸のランダム置換、及びループ４におけるリシン−１４８のアラニンへの置換を含む。
スキーム（ｂ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのＬＳＡにおける４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を含み、アミノ酸修飾は、ループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換及びループ２内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む。
スキーム（ｂ）のコンビナトリアルライブラリーの本態様のある実施形態では、ＣＴＬＤがテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換、ループ２内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換、及びアルギニン−１３０又はＣ末端方向に、ループ２の外部に隣接して位置する他のアミノ酸のランダム置換を含む。ある実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｂ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ１における少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換、ループ２における少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含み、アルギニン１３０のランダム置換を含む。一実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｂ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ１における５つのアミノ酸のランダム置換、ループ２における３つのアミノ酸のランダム置換、及びアルギニン１３０のランダム置換を含む。ある他の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｂ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがマウステトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ１における少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換、ループ２における少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含み、ロイシン１３０のランダム置換を含む。一実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｂ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがマウステトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ１における５つのアミノ酸のランダム置換、ループ２における３つのアミノ酸のランダム置換、及びロイシン１３０のランダム置換を含む。スキーム（ｂ）についての実施形態のいずれかにおいても、アミノ酸修飾は、リシン−１４８のアラニンへの置換をさらに含むことができる。したがって、特定の一実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換、ループ２内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換、アルギニン−１３０又はＣ末端方向に、ループ２の外部に隣接して位置する他のアミノ酸のランダム置換、及びループ４におけるリシン−１４８のアラニンへの置換を含む。
スキーム（ｃ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を含み、アミノ酸修飾は、ループ１内の少なくとも７つのアミノ酸のランダム置換及びループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入を含む。
コンビナトリアルライブラリーの本態様のある実施形態では、コンビナトリアルライブラリーのポリペプチドメンバーは、ループ４内の少なくとも２つのアミノ酸のランダム置換をさらに含む。本態様のある他の実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ４内の３つのアミノ酸挿入を含み、任意選択で少なくとも２つのアミノ酸のランダム置換をさらに含む。一実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ１内の少なくとも７つのアミノ酸のランダム置換、ループ４における少なくとも３つのアミノ酸挿入、及びループ４内の少なくとも２つのアミノ酸のランダム置換を含む。特定の一実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ１内の７つのアミノ酸のランダム置換、ループ４における３つのアミノ酸挿入、及びループ４内の２つのアミノ酸のランダム置換を含む。
スキーム（ｄ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を含み、アミノ酸修飾は、ループ３における少なくとも１つのアミノ酸挿入及びループ３内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む。
ある実施形態では、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｄ）の修飾ＣＴＬＤを有する場合、アミノ酸修飾は、ループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入をさらに含むことができ、ループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換をさらに含むことができる。スキーム（ｄ）について記載される実施形態のいずれかにおいて、アミノ酸修飾は、ループ３における３つのアミノ酸挿入を含むことができる。スキーム（ｄ）について記載される実施形態のいずれかにおいて、アミノ酸修飾は、ループ４における３つのアミノ酸挿入を含むことができる。したがって、ある実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ３内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換、ループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換、ループ３における少なくとも１つのアミノ酸挿入、及びループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入を含む。ある実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ３内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換、ループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換、ループ３における少なくとも３つのアミノ酸挿入、及びループ４における少なくとも３つのアミノ酸挿入を含む。特定の一実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ３内の３つのアミノ酸のランダム置換、ループ４内の３つのアミノ酸のランダム置換、ループ３における３つのアミノ酸挿入、及びループ４における３つのアミノ酸挿入を含む。記載される実施形態のいずれかにおいて、ＣＴＬＤがテトラネクチンである場合、アミノ酸修飾は、リシン−１４８のアラニンへの又はループ４におけるランダム置換をさらに含むことができる。
スキーム（ｅ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を含み、アミノ酸修飾は、２つのループを組み合わせて、単一のループにする修飾を含み、２つの組み合わせられたループは、ループ３及びループ４である。ある実施形態では、コンビナトリアルライブラリーのメンバーがスキーム（ｅ）の修飾ＣＴＬＤを有する場合、アミノ酸修飾は、ループ３内の少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換及びループ４内の少なくとも４つのアミノ酸のランダム置換を含む。特定の一実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ３内の６つのアミノ酸のランダム置換及びループ４内の４つのアミノ酸のランダム置換を含む。スキーム（ｅ）についての実施形態のいずれかにおいて、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、プロリン−１４４のランダム置換をさらに含むことができる。特定の一実施形態では、ＣＴＬＤがヒトテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ３内の６つのアミノ酸のランダム置換、ループ４内の４つのアミノ酸のランダム置換、及びプロリン１４４のランダム置換を含み、例えば、ＮＷＥＸＸＸＸＸＸＸ ＸＧＧＸＸＸＮ（配列番号５７８）を含む、組み合わせられたループ３及びループ４のアミノ酸配列をもたらし、Ｘは、任意のアミノ酸であり、配列番号５７８のアミノ酸配列は、単一のループ領域を形成する。したがって、特定の一実施形態では、コンビナトリアルライブラリーのポリペプチドメンバーは、配列ＮＷＥＸＸＸＸＸＸＸ ＸＧＧＸＸＸＮ（配列番号５７８）を含み、Ｘは、任意のアミノ酸であり、配列番号５７８のアミノ酸配列は、組み合わせられ、修飾されたループ３及びループ４から単一のループを形成する。
スキーム（ｆ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を含み、アミノ酸修飾は、ループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入及びループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む。ある実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ４における４つのアミノ酸挿入を含む。一実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ４における少なくとも４つのアミノ酸挿入及びループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む。特定の一実施形態では、アミノ酸置換は、ループ４における４つのアミノ酸挿入及びループ４内の３つのアミノ酸のランダム置換を含む。
スキーム（ｇ）に関して、コンビナトリアルライブラリーのポリペプチドメンバーは、修飾ループ３及び修飾ループ５を含み、修飾ループ３は、５つのアミノ酸残基のランダム化を含み、修飾ループ５は、３つのアミノ酸残基のランダム化を含む。一実施形態では、コンビナトリアルライブラリーのポリペプチドメンバーは、修飾ループ３、修飾ループ５、及び修飾ループ４を含み、ループ４に対する修飾は、プラスミノーゲン結合を抑止する。例えば、コンビナトリアルライブラリーがスキーム（ｇ）の修飾ＣＴＬＤを有し、ＣＴＬＤがテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ＣＴＬＤのプラスミノーゲン結合親和性を調整する、ループ４における１つ又は複数のアミノ酸修飾、例えば、リシン１４８のアラニンへの置換をさらに含むことができる。したがって、ある実施形態では、ＣＴＬＤがヒト又はマウステトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ３における少なくとも５つのアミノ酸残基のランダム置換、ループ５における少なくとも３つのアミノ酸残基のランダム置換、及びループ４におけるリシン１４８のアラニンへの置換を含む。特定の一実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ３における５つのアミノ酸残基のランダム置換及びループ５における３つのアミノ酸残基のランダム置換を含み、他の特定の実施形態では、ＣＴＬＤがヒト又はマウステトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ４におけるリシン１４８のアラニンへの置換をさらに含む。
スキーム（ｈ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を含み、アミノ酸修飾は、少なくとも１つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも６つのアミノ酸挿入を含む。ある実施形態では、ＣＴＬＤがテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ＣＴＬＤのプラスミノーゲン結合親和性を調整する、ループ４における１つ又は複数のアミノ酸修飾、例えば、リシン１４８のアラニンへの置換をさらに含むことができる。ある実施形態では、ＣＴＬＤがヒト又はマウステトラネクチン由来のものである場合、コンビナトリアルライブラリーのメンバーは、少なくとも１つのアミノ酸のランダム置換、ループ３における少なくとも６つのアミノ酸の挿入、及びループ４におけるリシン１４８のアラニンへの置換を有する。特定の一実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ３における１つのアミノ酸のランダム置換及び６つのアミノ酸の挿入を含む。特定の一実施形態では、ＣＴＬＤがヒト又はマウステトラネクチン由来のものである場合、コンビナトリアルライブラリーのメンバーは、ループ３における１つのアミノ酸のランダム置換及び６つのアミノ酸の挿入並びにループ４におけるリシン１４８のアラニンへの置換を有する。これらの実施形態のいずれかにおいて、ＣＴＬＤがヒト又はマウステトラネクチン由来のものである場合、置換の１つはイソロイシン１４０の置換である。
スキーム（ｉ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を含み、アミノ酸修飾は、ループ３における６つのアミノ酸のランダム置換並びにループ３における６つのアミノ酸のランダム置換及び１つのアミノ酸挿入の混合物を含む。一実施形態では、混合物は、ループ３における６つのアミノ酸のランダム置換及び２つのアミノ酸挿入をさらに含む。したがって、一実施形態では、アミノ酸修飾は、ループ３における６つのアミノ酸のランダム置換、ループ３における６つのアミノ酸のランダム置換及び１つのアミノ酸挿入、並びにループ３における６つのアミノ酸のランダム置換及び２つのアミノ酸挿入の混合物を含む。スキーム（ｉ）の実施形態のいずれかにおいて、ＣＴＬＤがテトラネクチン由来のものである場合、アミノ酸修飾は、ループ４におけるリシン１４８のアラニンへの置換をさらに含む。
スキーム（ｉ）に関して、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ランダム化ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を含み、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾、アミノ酸修飾は、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つ又はループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるループ５における少なくとも４つ以上のアミノ酸挿入を含む。
コンビナトリアルライブラリーがループ４領域に対する１つ又は複数のアミノ酸修飾（単独で又はＣＴＬＤの他の領域に対する修飾と組み合わせて）を含む実施形態では、いくつかの修飾（単数又は複数）は、ＣＴＬＤの金属イオンに結合する親和性を維持する、調整する、又は抑止するように設計される。そのような修飾は、ＣＴＬＤのプラスミノーゲン結合活性に影響する（例えば、Ｎｉｅｌｂｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００４， ４３ （２７）、８６３６〜８６４３頁；又はＧｒａｖｅｒｓｅｎ １９９８を参照されたい）。
ライブラリーのポリペプチドメンバーは、ＣＴＬＤの４つのＬＳＡループ及びＬＳＢループ（ループ５）の任意の組み合わせで、１つ又は複数のアミノ酸修飾（例えば、挿入、置換、伸長、又はランダム化による）を含むことができる。したがって、本明細書において記載される様々な実施形態のいずれかにおいて、ランダム化ＣＴＬＤは、単独で又はＬＳＡループ領域（ループ１〜４）の任意の１つ、２つ、３つ、又は４つのループにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾と組み合わせて、ＬＳＢループ領域（ループ５）のループにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾を含むことができる。一態様では、本発明は、ランダム化Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供し、ランダム化ＣＴＬＤは、ループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾及びＣＴＬＤのループセグメントＢ（ＬＳＢ）（ループ５）におけるループにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾を含み、１つ又は複数のアミノ酸修飾は、ＬＳＢアミノ酸残基のランダム化を含む。
本明細書において記載される様々な実施形態に従って、コンビナトリアルライブラリーのポリペプチドメンバーは、ＣＴＬＤのループ領域（ＬＳＡ及びＬＳＢ）における任意の２つ、３つ、４つ、又は５つのループにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾を有することができる（例えば、２つのループに対する、３つのループに対する、４つのループに対する、又は５つ全てのループに対する、ランダムなアミノ酸修飾の任意のランダムな組み合わせ）。コンビナトリアルライブラリーのポリペプチドメンバーは、α−ヘリックス又はβ−ストランドにおいてなどのように、ループ領域（ＬＳＡ及びＬＳＢ）の外部のＣＴＬＤの領域に対するさらなるアミノ酸修飾をさらに含むことができる（例えば、図１を参照されたい）。
さらなる本発明の実施形態では、ＣＴＬＤループ領域は、下記の非限定的な実施例において詳述される例示的な構築物を超えて伸長させることができる。
一態様では、本発明はまた、上記態様及び実施形態のいずれか１つによるコンビナトリアルポリペプチドライブラリーのポリペプチドをコードする核酸分子のライブラリーを提供する。本態様の一実施形態では、本発明は、ライブラリーのポリペプチドをコードする核酸配列のライブラリーを提供し、ポリペプチドのＣＴＬＤは、スキーム（ａ）〜（ｊ）に従って修飾されている。
組換えＣＴＬＤ修飾ループライブラリーの生成
一態様では、本発明は、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を有するポリペプチドメンバーを含むポリペプチドライブラリーを生成するための方法を提供し、ＣＴＬＤは、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおける及び／又はループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるループ（ループ５）における１つ又は複数のアミノ酸修飾を含む。
本態様の実施形態では、方法は、ＣＴＬＤのＬＳＡ領域における４つのループの少なくとも１つにおける及び／又はＬＳＢ領域におけるループにおける少なくとも１つのランダム突然変異を生成することを含み、少なくとも１つのランダム突然変異は、（ａ）少なくとも１つのループにおける１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入又は（ｂ）少なくとも１つのループ内の若しくはそれに直接隣接する１若しくは複数のアミノ酸の置換又は（ｃ）少なくとも１つのループ内の又はそれに直接隣接する１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失、（ｄ）２つの隣接するループを組み合わせる修飾、又は（ｅ）その任意の組み合わせを含む。
本態様のある実施形態では、方法は、スキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかに従って、ＣＴＬＤのＬＳＡ領域における４つのループの少なくとも１つにおける及び／又はＬＳＢ領域におけるループにおけるランダム突然変異を生成することを含む。
本態様のある実施形態では、組換えＣＴＬＤライブラリーのポリペプチドは、ループ領域におけるある種のＣａ２＋調整アミノ酸（単数又は複数）が保持されている修飾ＣＴＬＤを含む及び／又はプラスミノーゲン結合活性が排除されている修飾ＣＴＬＤを含む。
さらに、本態様のある実施形態では、組換えＣＴＬＤライブラリーは、修飾ＣＴＬＤ領域を有するポリペプチドを含むことができ、アミノ酸修飾は、ＣＴＬＤのループ領域（ＬＳＡ及びＬＳＢ）の外部にある。したがって、そのような修飾は、ベータストランド及び／又はアルファヘリックス領域の任意の１つ又は複数において設計することができる又はランダムに生成することができる。
対象の標的に特異的に結合することができるタンパク質産物を得るための、ランダム化され、最適化された組換えＣＴＬＤライブラリーの生成は、例えば、オリゴヌクレオチド特異的ランダム化及びエラープローンＰＣＲ突然変異誘発、ランダムな断片化によるＤＮＡシャフリング、ループシャフリング、ループウォーキング、体細胞超突然変異（例えば、参照によって組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００７５３７８号を参照されたい）、及び最適な結合活性を有する分子を生成するために配列多様性を引き起こすための当技術分野における他の知られている方法（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｗ．Ｐ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、（Ｏｃｔ．１９９４） ９１：１０７４７−７５１； Ｐａｔｒｉｃｋ， Ｗ．Ｍ．＆ Ｆｉｒｔｈ， Ａ．Ｅ．、Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， （２００５） ２２：１０５−１１２； Ｆｉｒｔｈ， Ａ．Ｅ．＆ Ｐａｔｒｉｃｋ， Ｗ．Ｍ．、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， （２００５） ２１（１５）：３３１４−３３１５；及びＬｕｔｚ Ｓ．＆ Ｐａｔｒｉｃｋ， Ｗ．Ｍ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， （２００４） １５：２９１−２９７を参照されたい）などの当技術分野において知られている任意の技術によって実行することができる。
ある実施形態では、生成し、最適化する方法は、ループを突然変異誘発するためのオリゴヌクレオチド特異的ランダム化（ＮＮＫ又はＮＮＳ）戦略を含む。例えば、図１及び図４において示されるヒトテトラネクチン（ｈＴＮ）ＣＴＬＤは、５つのループ（ＬＳＡにおける４つのループ及びＬＳＢにおける１つのループ）を含有し、これらは、対象の任意の標的分子（単数又は複数）に対するＣＴＬＤの結合を与えるために改変することができる。ランダムアミノ酸配列（ランダム化、置換、挿入などを介して生成される）は、所望の結合特性を有するＣＴＬＤドメインを選択することができるライブラリーを生成するために１つ又は複数のこれらのループに導入することができる。ヒトテトラネクチンＣＴＬＤの５つのループのいずれか又は全ての内に制限されるランダムペプチドを含有するこれらのライブラリーの構築は、本明細書において記載されるＮＮＫ又はＮＮＳを使用して達成することができる。これらのライブラリーは、ＬＳＡ又はＬＳＢ領域（例えば、α−ヘリックス及び／又はβ−ストランド）の外部にあるＣＴＬＤの領域中に導入されるアミノ酸修飾をさらに含むことができる。以下手順は、７つのランダムペプチドをｈＴＮ ＣＴＬＤのループ１に挿入することができる方法の非限定的で例示の例を記載する。
ＰＣＲは、以下の戦略を使用して、第１の断片（断片Ａ、図７を参照されたい）を生成するために使用することができる。Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ及びＫ＝Ｇ又はＴである（５’−ＧＧ ＣＴＧ ＧＧＣ ＣＴＧ ＡＡＣ ＧＡＣ ＡＴＧ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＴＧＧ ＧＴＧ ＧＡＴ ＡＴＧ ＡＣＴ ＧＧＣ ＧＣＣ−３’；配列番号１３７）についてのフォワードオリゴ１Ｘは、ＣＴＬＤのループ１を取り囲む領域をコードするが、ループ１の５つのアミノ酸（ＡＡＥＧＴ；配列番号５７９）をコードする１５のヌクレオチドを７つのＮＮＫコドンと交換する。７つのランダムなアミノ酸をコードするこれらのＮＮＫコドンは、５つの天然テトラネクチンアミノ酸をコードする野生型コドンに取って代わる。（配列番号１３７）についてのオリゴ１Ｘは、リバースオリゴ１Ｘ ｒｅｖ２（５’−ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＡＴ ＣＴＣ ＡＧＴ ＴＴＣ ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＴＡ ＧＧＣ ＧＡＴ ＧＣＧ ＧＧＣ ＧＣＣ ＡＧＴ ＣＡＴ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＣＡ−３’；配列番号５８０）とアニールすることができる。２つのオリゴは、それらの３’末端の２１ヌクレオチドにわたって相補的である。図７を参照すると、ＰＣＲは、オーバーラップするこれら２つのオリゴから断片Ａ（１０１ｂｐ）を生成するために使用される。同様に、断片Ｂ（図７を参照）は、１０５ｂｐ断片を生成するために、（５’−ＡＣＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＣＴＧ ＡＧＡ ＴＣＡ ＣＣＧ ＣＣＣ ＡＡＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＧＣＧ ＧＣＧ ＣＡＡ ＣＣＧ ＡＧＡ ＡＣＴ ＧＣＧ ＣＧＧ ＴＣＣ ＴＧ−３’；配列番号１３９）についてのフォワードオリゴＢｓｔＸ１及びリバースプライマーＰｓｔＢｓｓＲｅｖＣ（５’− ＣＣＣ ＴＧＣ ＡＧＣ ＧＣＴ ＴＧＴ ＣＧＡ ＡＣＣ ＡＣＴ ＴＧＣ ＣＧＴ ＴＧＧ ＣＧＧ ＣＧＣ ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＧＡ ＣＣＧ ＣＧＣ ＡＧＴ ＴＣＴ−３’；配列番号１４０）を使用して、ＰＣＲを実行することによって作ることができる。ＰＣＲは、高忠実度ポリメラーゼ又はｔａｑブレンド及び標準的なＰＣＲサーモサイクリング条件を使用して実行することができる。断片Ａの３’末端は、断片Ｂの５’末端に対して相補的である。これらの断片は、ゲル単離し、続いて、外側のプライマーＢｇｌｆｏｒ１２（配列番号１４１）及びＰｓｔＲｅｖ（配列番号１４２）を使用して、オーバーラップ伸長ＰＣＲのために組み合わせることができる。結果として生じる１９５ｂｐ断片は、ゲル単離し、その後、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩを用いて消化し、この後で、最終１８５ｂｐ断片はゲル単離し、遺伝子ＩＩＩに融合された、下記に示される制限修飾ＣＴＬＤを含有するファージディスプレイベクター（ＣＡＮＴＡＢ ５Ｅなど）の中にクローニングすることができ、これは、クローニングのためのＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩを用いて同様に消化される。
ランダム化アミノ酸を用いる置換による他のループの修飾は、本明細書において記載されるように同様に実行することができる。ランダム化アミノ酸とのループ内の決定されたアミノ酸の置換は、あらゆる特定のループにも限られず、それは、ループの本来のサイズにも限られない。同様に、ループの完全な置換は必要とされず、部分的な置換は、ループのいずれについても可能である。いくつかの場合では、カルシウム調整アミノ酸などのループ内の本来のアミノ酸のいくつかの保持が、望ましくてもよい。これらの場合では、ランダム化アミノ酸との置換は、カルシウム調整アミノ酸を保持するために、ループ内のより少数のアミノ酸について生じてもよい又はさらなるランダム化アミノ酸は、ループの全体的なサイズを増加させるために、ループに追加され、なおこれらのカルシウム調整アミノ酸を保持してもよい。非常に大きなペプチドは、ループ１及び２又はループ３及び４などのループ領域を組み合わせて、１つのより大きな置換ループにすることによって調節し、試験することができる。
核酸分子は、核酸断片の化学合成においてそれぞれのステップで純粋なヌクレオチド単量体の予め決定された組み合わせ又はヌクレオチド単量体の任意の組み合わせの混合物を追加するために、段階的合成を指示することによって、核酸の化学合成についての通常の方法によって得ることができる。このように、１つの特有の核酸配列から最も複雑な混合物まで、任意のレベルの配列縮重を生成することが可能であり、これは、Ｎは配列中のヌクレオチドの数である４Ｎの最大数の特有の配列の完全又は不完全な表現を表すことになる。
複数の核酸断片を含む複合組成物は、その代わりに、例えば、任意の生物から抽出したゲノム核酸などの高分子量核酸組成物の化学的、物理的、又は酵素による断片化によって、核酸断片の混合物を生成することによって調製することができる。本明細書に記載されるように、核酸断片のそのような混合物を組換えライブラリーの生成において有用にするために、最初の切断ステップにおいて得られた断片の粗製混合物は、典型的に、サイズ制限オリゴヌクレオチド断片のリンカー埋め込み混合物の、受け取り側の核酸ベクターの中への挿入を容易にするように設計されたリンカー核酸の適したペアにその後典型的に付加されることになるおよその分子量範囲の断片を得るためにサイズにより分画される。
核酸断片は、化学的に合成された核酸が受け取り側の核酸の中にコピーエディティングされる適切に設計されたＰＣＲ操作などによって、核酸の分子クローニングの任意の一般的な方法によって、受け取り側の核酸の中に、特定の位置に挿入することができ、その場合には、エンドヌクレアーゼ制限部位は挿入に必要とされない。その代わりに、核酸断片の挿入／削除は、適切に設計されたオリゴヌクレオチド断片が核酸の分子クローニングの標準的な方法を使用して挿入されてもよい標的核酸へのエンドヌクレアーゼ制限部位の適切な組み合わせを操作することによって容易にされてもよい。
特異的な標的（例えば、真核細胞、ウイルス、細菌、特異的タンパク質、多糖、他のポリマー、有機化合物など）に対する選択のラウンドの後に、ＤＮＡは、特異的なファージから単離され、リガンド結合領域をコードするセグメントのヌクレオチド配列は、決定され、ファージミドＤＮＡから切り取られ、所望の産物の異種生成のために適切な誘導体発現ベクターに移される。原核生物における異種生成は、所望の産物の単離に使用することができる。
コンビナトリアルＣＴＬＤライブラリーの構築を容易にするために、制限部位をＣＴＬＤの中に導入することができる。例えば、ヒト及びマウステトラネクチンの両方におけるβ２、β３、及びβ４をコードする核酸配列の近くに位置する、適した制限部位は、改変された配列によってコードされるポリペプチド配列の最小限の変動を伴って設計される。下記に詳述されるように、同一のエンドヌクレアーゼ制限部位を２つの配列における対応する位置に導入することができ、対象のループ領域変異体を組換えマウスＣＴＬＤから容易に切り取り、ヒトテトラネクチンのＣＴＬＤフレームワークに正確に挿入することを可能にする又はその逆も成立する設計戦略を確立することが可能であることが分かった。
ヒトテトラネクチン（図２）の成熟形態をコードするヌクレオチド配列の分析は、制限酵素ＢｇｌＩＩについての認識部位は位置３２６〜３３１（ＡＧＡＴＣＴ）に見つけられ、β２のコード残基Ｇｌｕ１０９、Ｉｌｅ１１０、及びＴｒｐ１１１を含み、制限エンドヌクレアーゼＫａｓ Ｉについての認識部位は位置３８２〜３８７（ＧＧＣＧＣＣ）に見つけられ、コードアミノ酸残基Ｇｌｙ１２８及びＡｌａ１２９（ループ２においてＣ−末端に位置する）を含むことを明らかにする。テトラネクチン配列において天然に存在するアミノ酸について代替のコドンを利用することによって、制限エンドヌクレアーゼ部位ＰｓｔＩ（ＣＴＧＣＡＧ）及びＭｆｅ Ｉ（ＣＡＡＴＴＧ）は、全てβ４及びβ５の間に位置するコードアミノ酸残基Ａｒｇ１６７、Ｃｙｓ１６８、及びＡｒｇ１６９を含む位置５０１〜５０６（もともとＣＴＧＣＣＧ）並びにコードアミノ酸残基Ｇｌｎ１７１及びＬｅｕ１７２を含む位置５１１〜５１６（もともとＣＡＧＣＴＧ）で、テトラネクチンコード配列の中に操作された。
本発明のある他の態様では、本明細書において記載される少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写カセット、又は発現カセットの形態をした核酸構築物が、提供される。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び他の配列を必要に応じて含む適切な調節配列を含有する、適したベクターを選ぶ又は構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、又はファージミドであってもよい。さらなる詳細については、例えば、分子クローニング：実験マニュアル：第二版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ： ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
本発明はまた、本明細書において記載される１つ又は複数の構築物を含む組換え宿主細胞を提供する。適した宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、酵母、及びバキュロウイルス系を含む。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野において入手可能な哺乳動物細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞、及び他の多くのものを含む。一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
ディスプレイ系
本明細書において記載される、結果として生じる組換えＣＴＬＤライブラリーは、本明細書において記載され、当技術分野において知られている、多くの代替技術を使用してディスプレイすることができる。ディスプレイ系において核酸分子ライブラリーを発現するための方法は、その全体が本明細書において参照によって組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０２７５３９３号において記載される。一実施形態では、ディスプレイ系は、ディスプレイされた発現産物の少なくとも１つの特性を表す観察可能な表現型及び対応する遺伝子型を含む。適したディスプレイ系の例は、ファージディスプレイ系；酵母ディスプレイ系；ウイルスディスプレイ系；細胞ベースのディスプレイ系；リボソーム連結ディスプレイ系；若しくはプラスミド連結ディスプレイ系；その任意の組み合わせ、又は当技術分野において知られている任意の他の適したディスプレイ系を含む。
したがって、一態様では、本発明は、上記態様及び実施形態のいずれか１つによるコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを含むディスプレイ系を提供する。本態様の一実施形態では、本発明は、スキーム（ａ）〜（ｉ）によるコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを含むディスプレイ系を提供する。
本態様のある実施形態では、ディスプレイ系は、ファージディスプレイ系；酵母ディスプレイ系；ウイルスディスプレイ系；細胞ベースのディスプレイ系；リボソーム連結ディスプレイ系；若しくはプラスミド連結ディスプレイ系；その任意の組み合わせ、又は当技術分野において知られている任意の他のディスプレイ系を含む。
推定上のリガンド結合モジュール又は推定上の酵素活性を有するモジュールの点から、表現型をディスプレイするいくつかの系は、記載されている。これらは、ファージディスプレイ（例えば、線状ファージｆｄ（Ｄｕｎｎ （１９９６）； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ及びＤｕｎｃａｎ （１９９８）； Ｍａｒｋｓら（１９９２））、ファージラムダディスプレイ（Ｍｉｋａｗａら（１９９６））、真核生物ウイルス上のディスプレイ（例えば、バキュロウイルス（Ｅｒｎｓｔら（２０００）））、細胞ディスプレイ（例えば、細菌細胞上のディスプレイ（Ｂｅｎｈａｒら（２０００）））、酵母細胞（Ｂｅｎｈａｒら（２０００）））、及び哺乳動物細胞（Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎら（１９９５））、リボソーム連結ディスプレイ（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌら（１９９９））、並びにプラスミド連結ディスプレイ（Ｇａｔｅｓら（１９９６））を含む。
表現型ディスプレイのために及びこれを遺伝子型に連結させるために一般に使用される方法は、ファージディスプレイによるものである。これは、骨格タンパク質又は対象のタンパク質をコードするリーディングフレームの、表面曝露されるファージタンパク質への挿入によって達成される。線状ファージｆｄ（例えば、Ｍ１３）は、この目的に有用であることが証明された。
米国特許出願公開第２００７／０２７５３９３は、ＣＴＬＤライブラリーの生成のためにディスプレイ系を遂行するための手順を記載する。一般に、記載されるＣＴＬＤライブラリーのためのディスプレイ系を生成するための方法は、
（１）ＣＴＬＤのループ領域の位置を同定すること；
（２）ＣＴＬＤにおいてβ２、β３、及びβ４をコードする配列の近くにエンドヌクレアーゼ制限部位の事前の挿入を伴って又は伴わないで、最適なＣＴＬＤをコードする核酸断片をタンパク質ディスプレイベクター系の中へサブクローニングすること；並びに
（３）多くの核酸断片から成る集合体のランダムに選択されたメンバーと、最適なＣＴＬＤのループ領域のいくつか又は全てをコードする核酸断片を置換し、ＣＴＬＤの本来のループ領域のランダム化及び／又は伸長をもたらすことを含む。置換されたループセグメント又は全ループ領域を有する新しいポリペプチドをコードする、クローニングされた核酸断片のそれぞれは、その新しい配列構成内で決定されるリーディングフレームにおいて解読される。
ＣＴＬＤのループ領域の位置は、以前に本明細書において記載される方法を使用して同定することができる。手短に言えば、ループ領域は、そのような情報が入手可能な場合、最適なＣＴＬＤの三次元構造を参照することによって又はそうでなければ、β２及びβ３コンセンサス配列エレメントに対応する配列エレメント並びにβ４−ストランド特性並びに図１において本明細書において開示される保存システイン残基の同定によって支援されるように、図１において示される配列との配列アライメントによってβ２−、β３−、及びβ４−ストランドの配列位置を同定することによって同定することができる。
標的分子に結合するＣＴＬＤポリペプチドを同定し、単離するための戦略
一態様では、本発明は、標的分子に対して特異的な結合活性を有するポリペプチドを同定する及び単離するための方法を提供し、方法は、（ａ）本発明のコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供するステップ；（ｂ）ポリペプチド及び標的分子の間の結合を可能にする条件下で標的分子とコンビナトリアルポリペプチドライブラリーのポリペプチドを接触させるステップ、並びに（ｃ）標的分子に結合するポリペプチドを単離するステップを含む。様々な実施形態では、標的分子は、細胞（真核細胞、腫瘍細胞、免疫細胞、細菌細胞、原生動物、菌類、及びウイルスに感染した細胞など）の表面と関連する任意の分子；タンパク質（受容体タンパク質、可溶性タンパク質、酵素、又は抗体など）；多糖；ポリマー；並びに小さな有機化合物を含むことができる。
他の態様では、本発明は、標的分子に対して特異的な結合活性を有するポリペプチドを同定する及び単離するための方法を提供し、方法は、コンビナトリアルポリペプチドライブラリーのポリペプチドをコードする核酸分子のライブラリーをさらに含み、核酸のライブラリーは、ディスプレイ系において発現される。一実施形態では、ディスプレイ系は、ディスプレイされた発現産物の少なくとも１つの特性を表す観察可能な表現型及び対応する遺伝子型を含む。
他の態様では、本発明は、標的分子に対して特異的な結合活性を有するポリペプチドを同定する及び単離するための方法であって、（ａ）請求項１に記載のポリペプチドライブラリーをコードする核酸分子のライブラリーを提供するステップ、（ｂ）１つ又は複数の配列位置のアミノ酸残基が、その異なるメンバーの間で異なるポリペプチド集合体を得るために、ディスプレイ系において核酸分子のライブラリーを発現するステップ、（ｃ）ポリペプチド及び標的分子の間の結合を可能にする条件下で前記標的分子とポリペプチド集合体を接触させるステップ、並びに（ｄ）前記標的分子に結合することができるポリペプチドを単離するステップを含む方法を提供する。
これらの態様及び実施形態のいずれかにおいて、本発明は、標的分子に対して特異的な結合活性を有するポリペプチドを同定する及び単離するための方法を提供し、ポリペプチドは、スキーム（ａ）〜（ｉ）のいずれかに従って修飾されている。
対象の標的分子に対する特異的な結合メンバーは、標的分子に特異的に結合する、ライブラリーのメンバーの選択によってポリペプチドのランダムライブラリーから得ることができる。本明細書において議論されるように、推定上のリガンド結合部位を有する表現型をディスプレイする多くの系が知られている。これらは、ファージディスプレイ（例えば、線状ファージｆｄ［Ｄｕｎｎ （１９９６）； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ及びＤｕｎｃａｎ （１９９８）； Ｍａｒｋｓら（１９９２）］、ファージラムダ［Ｍｉｋａｗａら（１９９６）］）、真核生物ウイルス上のディスプレイ（例えば、バキュロウイルス［Ｅｒｎｓｔら（２０００）］）細胞ディスプレイ（例えば、細菌細胞上のディスプレイ［Ｂｅｎｈａｒら（２０００）］、酵母細胞［Ｂｏｄｅｒ及びＷｉｔｔｒｕｐ （１９９７）］、並びに哺乳動物細胞［Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎら（１９９５）］、リボソーム連結ディスプレイ［Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌら（１９９９）］、並びにプラスミド連結ディスプレイ［Ｇａｔｅｓら（１９９６）］を含む。
標的分子に対して結合活性を有するポリペプチドについて選択するために、ライブラリーは、構築することができ、単量体エレメントとして、ファージの表面上にディスプレイされる単一の単量体ＣＴＬＤドメイン又は個々のペプチドとして、標的分子への結合について最初にスクリーニングすることができる。ライブラリーは、ファージの表面上にディスプレイされるＣＴＬＤ骨格内の１つ又は複数の５つの異なるループにおける（又はループの外部の）アミノ酸をランダム化することによって構築することができる。標的分子への結合は、ファージディスプレイパニングによって選択することができる。
いくつかの戦略は、ファージディスプレイライブラリーの構築において使用することができる。１つの戦略は、ランダムペプチドファージディスプレイライブラリーを構築する及び／又は使用することである。ランダム線状ペプチド及び／又はジスルフィドにより束縛されたループとして構築されたランダムペプチドをファージ粒子の表面上に個々にディスプレイされ、ファージディスプレイ「パニング」を通して所望の標的分子への結合について選択することができる。所望の結合活性を有するペプチドクローンを得た後、これらのペプチドは、ヒトテトラネクチンの三量体形成ドメイン上へ移植する又はＣＴＬＤドメインのループの中に移植し、その後に続いて三量体形成ドメイン上に移植することができ、アゴニスト活性についてスクリーニングすることができる。
ファージディスプレイライブラリー及び三量体形成ドメイン構築物の構築のためにもう１つの戦略は、ＣＴＬＤ由来の結合剤を得ることを含む。ライブラリーは、ファージの表面上にディスプレイされるＣＴＬＤ骨格内の（つまりヒトテトラネクチンの）１つ又は複数の５つの異なるループにおけるアミノ酸をランダム化することによって構築することができる。標的分子への結合は、ファージディスプレイパニングを通して選択することができる。所望の結合活性を示すペプチドループを有するＣＴＬＤクローンを得た後には、ＣＴＬＤクローンは、ヒトテトラネクチンの三量体形成ドメイン上に移植し、アゴニスト活性についてスクリーニングすることができる。
もう１つの戦略は、対象の標的に対して知られている結合能力を有するペプチド配列を使用すること並びにペプチドの側面に位置するランダム化アミノ酸又は／及びペプチド内のランダム化され、選択された内部アミノ酸を有する新しいライブラリーを生成することによって、それらの結合を最初に改善し、その後に続いて、ファージディスプレイを通して、結合の改善について選択することを含む。改善された親和性を有する結合剤を得た後、これらのペプチドの結合剤は、例えば、ヒトテトラネクチンの三量体形成ドメインなどの他の機能的なタンパク質ドメインに融合することができ（本明細書において下記に議論され、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ０９／６０２７１及びＵＳ．２０１０／００２８９９５において詳細に議論される）、所望の活性について評価することができる。本方法では、最初のライブラリーは、第１の戦略におけるように、ファージ粒子の表面上にディスプレイされる遊離ペプチドとして又は上記に議論される第２の戦略におけるように、ＣＴＬＤ骨格内の束縛されたループとして、構築することができる。これらのディスプレイ戦略は、その全体が本明細書において参照によって組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ０９／６０２７１において詳細に記載される。
対象の標的分子と特異的な結合活性を有するポリペプチドを同定し、単離するための例示的な戦略は、下記にさらに詳細に記載される。これらの戦略はファージディスプレイに集中するが、ポリペプチドを同定する他の等価な方法を使用することができる。
戦略１
これに限定されないが、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｐｈ．Ｄ．Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔｓなどのペプチドディスプレイライブラリーキットは、市販で売られており、対象の標的分子に対して特異的な結合活性を有する新しく新規なペプチドの選択において使用するために購入することができる。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓキットの３つの形態が入手可能である：ライブラリーサイズが２．８×１０９独立クローンの、長さが７アミノ酸の線状ランダムペプチドを含有するＰｈ．Ｄ．−７ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ、長さが７アミノ酸のランダムペプチド及び１．２×１０９独立クローンのライブラリーサイズを有する、ジスルフィドにより束縛されたループとして構築されるペプチドを含有するＰｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ、並びにライブラリーサイズが２．８×１０９独立クローンの、長さが１２アミノ酸の線状ランダムペプチドを含有するＰｈ．Ｄ．−１２ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ。
その代わりに同様のライブラリーは、これらのキットに類似するランダムアミノ酸を含有するペプチドを用いて新規に構築することができる。新規に構築については、ランダムヌクレオチドは、ＮＮＫ又はＮＮＳ戦略を使用して生成することができ、Ｎは、４つの核酸塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴの等しい混合物を表す。Ｋは、Ｇ又はＴの等しい混合物を表し、Ｓは、Ｇ又はＣの等しい混合物を表す。これらのランダム化された位置は、ファージ又はファージミドディスプレイベクター系において遺伝子ＩＩＩタンパク質上にクローニングすることができる。ＮＮＫ及びＮＮＳ戦略の両方は、コードされるアミノ酸についてわずかに異なる頻度で２０の可能なアミノ酸及び１つの終止コドンを全て包含する。細菌形質転換効率の限界のために、ファージディスプレイのために生成されるライブラリーサイズは、上記に持ち出される程度のものであり、したがって、７つまでのランダム化アミノ酸位置を含有するペプチドを生成することができ、なお、理論的な組み合わせの全レパートリーを包含する（２０７＝１．２８×１０９）。より長いペプチドライブラリーは、ＮＮＫ又はＮＮＳ戦略を使用して構築することができるが、実際のファージディスプレイライブラリーサイズは、細菌形質転換についての必要により、そのような長さと関連して、おそらく、可能な全ての理論的なアミノ酸の組み合わせを包含するとは限らないであろう。
したがって、より大きな／より長いランダムペプチドが含まれる場合、リボソームディスプレイライブラリーは、有益であり得るであろう。ジスルフィドにより束縛されたライブラリーについては、同様のＮＮＫ又はＮＮＳランダムヌクレオチド戦略を使用することができる。しかしながら、これらのランダム位置は、システインアミノ酸残基が側面に位置し、ジスルフィド架橋形成を可能にする。Ｎ末端システインに、アラニンなどのさらなるアミノ酸が多くの場合、先行する。さらに、これに限定されないがいくつかのグリシン残基から構成される可動性のリンカーは、上記のランダムペプチドライブラリーのいずれについても、ペプチド及び遺伝子ＩＩＩタンパク質の間のスペーサーとして作用してもよい。
戦略２
図１及び４において示されるヒトテトラネクチンＣＴＬＤは、５つのループ（ＬＳＡにおける４つのループ及びＬＳＢを含む１つのループ）を含有し、これらは、異なるタンパク質標的に対するＣＴＬＤの結合を与えるために改変することができる。ランダムアミノ酸配列は、所望の結合特性を有するＣＴＬＤドメインを選択することができるライブラリーを生成するために１つ又は複数のこれらのループに配置することができる。例えば、本明細書において記載されるＣＴＬＤポリペプチドライブラリー、つまりスキーム（ａ）〜（ｉ）のいずれかに従って修飾されるＣＴＬＤを有するポリペプチドのいずれも、使用することができる。ヒトテトラネクチンＣＴＬＤの５つのループのいずれか又は全ての内に制限されるランダムペプチドを含有するこれらのライブラリーの構築は、戦略１において上記に記載される及びまた本明細書において他のところにも詳細に記載されるＮＮＫ又はＮＮＳを使用して（これに限定されないが）達成することができる。
戦略３
対象の標的分子に対して結合活性を有する他のペプチドが同定された場合では、これらのペプチドを、遊離線状ペプチドとして又はシステインを使用するジスルフィドにより束縛されたループとして、テトラネクチンの三量体形成ドメインのＮ又はＣ末端上に直接クローニングすることができ、利用することができる戦略を、利用することができる。対象の標的に結合することができる単鎖抗体又はドメイン抗体も、三量体形成ドメインのどちらかの端上にクローニングすることができる。さらに、知られている結合特性を有するペプチドは、ＴＮ ＣＴＬＤのループ領域のいずれか１つに直接クローニングすることができる。ジスルフィドにより束縛されたループ又は抗体の相補性決定領域として選択されたペプチドは、ヒトテトラネクチンのＣＴＬＤのループ領域への再配置に実際適用可能であり得るであろう。結合は、単量体形態をしたこれらの構築物の全てについて試験することができ、結合及びアゴニスト活性化は、ＣＴＬＤが三量体形成ドメインと融合される場合、三量体形態で試験することができる。
ＣＴＬＤポリペプチド
本発明のコンビナトリアルポリペプチドライブラリーは、対象の標的分子に対して所望の結合特性を有するＣＴＬＤを含むポリペプチドを生成し、同定するために使用することができる。
一態様では、本発明は、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を有するポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、そのＣＴＬＤの自然の標的以外の標的に結合し、ＣＴＬＤのＣＴＬＤ骨格構造は、スキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかに従って修飾される。一実施形態では、ＣＴＬＤ骨格構造は、スキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかに従って修飾され、本明細書において記載されるさらなる修飾のいずれか、例えば、ＣＴＬＤループ領域の外側の修飾をさらに含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ヒト又はマウステトラネクチン由来のＣＴＬＤの骨格構造を有し、プラスミノーゲン以外の標的に結合する。
本発明のＣＴＬＤポリペプチドは、本明細書において記載される方法及びコンビナトリアルライブラリーのいずれかを使用して生成することができる。例えば、一実施形態では、ポリペプチドは、そのループ領域がスキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかに従ってランダム化されているＣＴＬＤを有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを使用し、ポリペプチド及び標的分子の間の結合を可能にする条件下でコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを標的分子と接触させ、そのＣＴＬＤの自然の標的ではない標的分子に結合するポリペプチドを単離して生成することができる。この方法の一実施形態では、ＣＴＬＤは、ヒト又はマウステトラネクチンである。この方法の他の実施形態では、ＣＴＬＤは、スキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかに従ってランダム化され、本明細書において記載されるさらなる修飾のいずれか、例えば、ＣＴＬＤループ領域の外側の修飾を含む。
本発明による修飾ＣＴＬＤについての非天然標的は、免疫学的ハプテン、ステロイドホルモンなどのホルモン、若しくは任意の生体高分子又はその断片、例えば、タンパク質若しくはタンパク質ドメイン；ペプチド；オリゴデオキシヌクレオチド；核酸；アラキドン酸若しくはその代謝産物、脂質若しくはその代謝産物；脂肪酸若しくはその代謝産物；フリーラジカル；オリゴ糖若しくは多糖又はそのコンジュゲート；又は乱用若しくは治療上の使用の化学的に合成された若しくは自然の薬剤の特徴を示す遊離又はコンジュゲート形態をした任意の化学化合物とすることができる。一態様では、標的は、タンパク質である。タンパク質は、任意の球状可溶性タンパク質又は受容体タンパク質、例えば、細胞シグナル伝達に関与する膜貫通タンパク質、ＭＨＣ分子などの免疫系の構成要素、又は特異疾患を示す細胞表面受容体とすることができる。タンパク質は、グリコシル化及びミリストイル化を含むが、これらに限定されない、アセテート、ホスフェート、並びに／又は様々な脂質及び炭水化物などの生化学的官能基の追加を有する翻訳後修飾タンパク質とすることができる。本発明の修飾ＣＴＬＤはまた、タンパク質断片にも結合することができる。例えば、ＣＴＬＤは、それが細胞膜中に固定された受容体の一部である場合、細胞表面受容体のドメインに結合することができ、このドメインを同様に可溶性タンパク質として生成することができる場合、溶液中の同じドメインに結合することができる。ＣＴＬＤはまた、ビオチン、フルオレセイン、又はジゴキシゲニンなどの低（より低い）分子量のリガンドに対して特異的な結合親和性を有することができる。
様々な実施形態では、１つ又は複数の標的分子（単数又は複数）に結合するＣＴＬＤポリペプチド配列は、１つ又は複数の標的分子（単数又は複数）に対する天然に存在するリガンドの結合親和性とほぼ等しい結合親和性を有することができる。ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、天然リガンドが同じ標的分子（単数又は複数）に対して有する結合親和性よりも強い、１つ又は複数の標的分子（単数又は複数）に対する結合親和性を有する。そのようなポリペプチドは、例えば、いくつかの場合では、結合メンバーの活性をブロックするために又は他の場合、例えば、修飾ＣＴＬＤが受容体に結合し、受容体をアンタゴナイズするようにさらに選択される場合に、より強力にアンタゴナイズするために有用である。他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、天然リガンドが同じ標的分子（単数又は複数）に対して有する結合親和性よりも弱い、１つ又は複数の標的分子（単数又は複数）に対する結合親和性を有する。天然リガンドよりも標的分子（単数又は複数）に対する弱い親和性を有するＣＴＬＤポリペプチドは、腫瘍若しくは組織に浸透するための改善された能力を有してもよい及び／又は所望の目的が、標的の活性を完全にブロックすることではなくそれを弱めることである場合、有用であり得るであろう。天然リガンドに対してより低い結合親和性を有するＣＴＬＤもまた、例えば、最適な選択活性が、標的への結合後の細胞の中への内部移行に基づく場合、望まれ得る。
修飾ＣＴＬＤはまた、１つ又は複数の受容体（単数又は複数）に結合し、アゴニストとして作用することができる。そのような実施形態では、アゴニストのそれぞれの結合親和性は、決定することができ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡｃｏｒｅ並びに当技術分野において知られている他のアッセイによって、天然リガンド又はその部分の結合特性と比較することができる。ある実施形態では、本発明の受容体選択的アゴニストは、少なくとも１つのタイプの哺乳動物細胞（例えば、がん細胞）において生物学的活性を阻害する又は誘導し、そのような活性は、知られている当技術分野の方法によって決定することができる。アゴニストとして作用する、本明細書において提供される方法を使用して同定されるＣＴＬＤの例は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合するポリペプチドである。
他の実施形態では、修飾ＣＴＬＤは、１つ若しくは複数の受容体（単数若しくは複数）又は受容体（単数若しくは複数）に対して親和性を有する１つ若しくは複数のリガンド（単数若しくは複数）に結合し、アンタゴニスト（受容体ブロッカー）として作用することができる。そのような実施形態では、アゴニストのそれぞれの結合親和性は、決定することができ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡｃｏｒｅ並びに当技術分野において知られている他のアッセイによって、天然リガンド又はその部分の結合特性と比較することができる。ある実施形態では、本発明のアンタゴニストは、少なくとも１つのタイプの哺乳動物細胞（例えば、がん細胞）において生物学的活性を阻害する又は誘導し、そのような活性は、知られている当技術分野の方法によって決定することができる。アンタゴニストとして作用する、本明細書において提供される方法を使用して同定されるＣＴＬＤの例は、ＩＬ−２３Ｒに結合するポリペプチドである。
対象の標的分子に特異的に結合するＣＴＬＤを含むポリペプチドは、ＣＴＬＤの全て又は一部を含む「結合メンバー」を含むことができる。本明細書において使用される用語「結合メンバー」は、互いに結合特異性を有する分子のペアのメンバーを指す。結合ペアのメンバーは、天然に由来してもよい又は全体として若しくは部分的に合成的に生成されてもよい。ペアの分子の一方のメンバーは、そのため、分子のペアの他方のメンバーに結合し、その特定の空間及び極性構造に相補的である、その表面又はくぼみ上のエリアを有する。したがって、ペアのメンバーは、互いに特異的に結合する特性を有する。
マウス及びヒトテトラネクチンを用いて本明細書において例証されるように、ＣＴＬＤベースのタンパク質産物が哺乳動物テトラネクチンに由来する実施形態では、構造は、他の全ての哺乳動物テトラネクチンとほとんど同一である。この種保存構造は、オルソログ（例えば、マウス及びヒトテトラネクチン誘導体）の間の、リガンド結合特異性を決定するポリペプチドセグメントの直接のスワッピングを可能にする。したがって、そのような実施形態では、このプラットフォームは、多くの合併症を伴い得るマウス抗体誘導体の「ヒト化」に対して特定の利点を提供する。
一態様では、本発明は、多量体形成ドメインを有するポリペプチドを提供し、少なくとも１つの標的分子に結合する少なくとも１つのＣＴＬＤポリペプチド結合メンバーを含む。本明細書において使用されるように、用語「多量体形成ドメイン」は、２つ以上の他のアミノ酸配列と関連して、三量体又は他の多量体複合体を形成することができる機能性を含むアミノ酸配列を意味する。したがって、本発明の様々な実施形態では、多量体形成ドメインは、二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、四量体化ドメイン、五量体化ドメインなどである。これらのドメインは、本発明の２つ、３つ、４つ、又は５以上のポリペプチドのポリペプチド複合体を形成することができる。
一実施例では、ポリペプチドは、２つの他の三量体化ドメインと三量体複合体を形成するアミノ酸配列−「三量体化ドメイン」−−を含有する。三量体化ドメインは、同一のアミノ酸配列の他の三量体化ドメイン（ホモ三量体を形成する）又は異なるアミノ酸配列の三量体化ドメイン（ヘテロ三量体を形成する）と関連することができる。相互作用は、三量体タンパク質又はポリペプチドを生成するタイプのものである。そのような相互作用は、三量体化ドメインの構成要素の間の共有結合並びに水素結合力、疎水性力、ファンデルワールス力、及び塩橋によって引き起こされてもよい。三量体化ドメインの三量体化作用は、２つの他の三量体化ドメインのコイルドコイル構造と相互作用して、比較的高温でさえ安定しているトリプルアルファヘリックスコイルドコイル三量体を形成するコイルドコイル構造によって引き起こされる。様々な実施形態、例えば、テトラネクチン構造エレメントをベースとする三量体化ドメインでは、複合体は、例えば、少なくとも６０℃で、いくつかの実施形態では少なくとも７０℃で安定している。
一実施形態では、多量体を形成したポリペプチドは、三量体、例えば、テトラネクチン三量体化モジュールである（ＵＳ ２００７／０１５４９０１を参照されたい）。ＣＴＬＤを含む三量体複合体は、本明細書において「ａｔｒｉｍｅｒ」と呼ばれる。「ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）」ポリペプチド複合体は、またＣＬＴＤを含む、３つの三量体化ドメインの三量体複合体を指す（Ａｎａｐｈｏｒｅ， Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。
本発明に従って、結合メンバーは、多量体形成ドメインのＮ又はＣ末端アミノ酸残基に連結されてもよい。さらに、ある実施形態では、単量体の多量体形成ドメインのＮ末端及びＣ末端の両方に結合メンバーを有し、それによって多量体ポリペプチド複合体を提供することは有利であり得るであろう。例えば、多量体ペプチドが類似の分子と三量体を形成する場合、対象の標的分子に結合することができる、６つの結合メンバーは、単一の三量体複合体と関連することができる。
本発明の他の態様では、対象の標的分子に特異的に結合するポリペプチドは、ＣＴＬＤのループ領域における１つ又は複数のループにおいて含有される。本態様では、ＣＴＬＤは、三量体化ドメインのＣ末端で、任意の知られている三量体化ドメインに結合することができる。さらに、本発明の融合タンパク質は、三量体化ドメインのＮ末端に融合された第２のＣＴＬＤドメインを含むことができる。本態様の変形では、融合タンパク質は、三量体化ドメインの末端の一方で第１の標的分子及び末端の他方でＣＴＬＤに結合するポリペプチドを含む。１つ、２つ、又は３つのそのようなタンパク質は、１つ又は複数の標的分子に対する６つまでの特異的ＣＴＬＤ結合メンバーを含有する三量体複合体の一部になり得る。
他の態様では、本発明は、３つのタンパク質の多量体複合体を提供し、それぞれのタンパク質は、多量体形成ドメイン及び少なくとも１つの対象の標的分子に結合する、少なくとも１つのＣＴＬＤポリペプチドを含む。一実施形態では、多量体複合体は、テトラネクチン三量体化構造エレメント（テトラネクチン三量体化モジュール）、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）三量体化ドメイン、コレクチンネック領域（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ ｎｅｃｋ ｒｅｇｉｏｎ）、及び他の同様の成分から選択される多量体形成ドメインを有する融合タンパク質を含む。多量体複合体は、互いに関連して、多量体を形成することができる多量体形成ドメインから構成することができる。したがって、ある実施形態では、多量体複合体は、同じアミノ酸配列を有するタンパク質から構成されるホモ多量体複合体である。他の実施形態では、多量体複合体は、例えば、異なる多量体形成ドメイン及び／又は異なる標的分子に結合する異なるＣＴＬＤポリペプチドなどの異なるアミノ酸配列を有するタンパク質から構成されるヘテロ多量体複合体である。そのような実施形態では、ＣＴＬＤポリペプチドは全て、１つの標的分子に特異的に結合してもよい。他の実施形態では、ＣＴＬＤポリペプチドは、異なる標的分子に特異的に結合する。したがって、ある実施形態では、多量体複合体は、本発明の融合タンパク質を含み、融合タンパク質はそれぞれ、１つの標的分子に結合する少なくとも１つのＣＴＬＤポリペプチドを含み、ポリペプチドは、第２の標的分子に結合する同じ若しくは異なる及び／又は少なくとも１つのＣＴＬＤポリペプチドとすることができ、第２の標的分子に結合するポリペプチドは、同じ又は異なるものとすることができる。
本発明のポリペプチドの三量体化ドメインは、その全体が参照によって組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０１５４９０１号（’９０１出願）において記載されるようにテトラネクチンに由来し得る。成熟ヒトテトラネクチン単鎖ポリペプチド配列は、配列番号１１として本明細書において提供される。テトラネクチン三量体化ドメインの例は、配列番号４０のアミノ酸１７〜４９、１７〜５０、１７〜５１、及び１７〜５２を含み、これらは、ヒトテトラネクチン遺伝子のエキソン２によってコードされるアミノ酸及び任意選択で、遺伝子のエキソン３によってコードされる最初の１つ、２つ、又は３つのアミノ酸を表す。他の例は、アミノ酸１〜４９、１〜５０、１〜５１、及び１〜５２を含み、これは、エキソン１及び２の全て並びに任意選択で、遺伝子のエキソン３によってコードされる最初の１つ、２つ、又は３つのアミノ酸を表す。その代わりに、エキソン１によってコードされるアミノ酸配列の一部のみが、三量体化ドメイン中に含まれる。特に、三量体化ドメインのＮ末端は、配列番号４０の残基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、及び１７のいずれかで始まってもよい。特定の実施形態では、Ｎ末端は、Ｉ１０又はＶ１７であり、Ｃ末端は、Ｑ４７、Ｔ４８、Ｖ４９、Ｃ（Ｓ）５０、Ｌ５１、又はＫ５２である（配列番号４０による番号付け）。その全体が本明細書において参照によって組み込まれるＰＣＴ ＵＳ０９／６０２７１を参照されたい。
三量体化ドメインは、その全体が参照によって本明細書において組み込まれるＵＳ ２００７／００１５４９０１においてより十分に記載されるように、テトラネクチンファミリー三量体化構造エレメントのコンセンサス配列である配列番号４０のアミノ酸配列を有するテトラネクチン三量体化構造エレメント（「ＴＴＳＥ」）とすることができる。ＴＴＳＥは、タンパク質のテトラネクチンファミリーの天然に存在するメンバーの変異体、特に、ＴＴＳＥがアルファヘリックスコイルドコイル三量体を形成する能力に対して、実質的な程度に不利に影響することなくアミノ酸配列が修飾された変異体を包含する。本発明の様々な態様では、本発明による三量体ポリペプチドは、配列番号４９のコンセンサス配列に対して少なくとも６６％のアミノ酸配列同一性；例えば、配列番号４０のコンセンサス配列に対して、少なくとも７３％、少なくとも８０％、少なくとも８６％、又は少なくとも９２％の配列同一性を有する三量体化ドメインとしてＴＴＳＥを含む（決定された（Ｘではない）残基のみを数えて）。言いかえれば、配列番号４０において決定されたアミノ酸の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つは、置換されてもよい。
特定の一実施形態では、配列番号４０の位置５０のシステイン（Ｃ５０）は、望まれない多量体化に至り得る望まれない鎖間ジスルフィド架橋の形成を回避するために、セリン、トレオニン、メチオニン、又は任意の他のアミノ酸残基に有利に突然変異誘発させることができる。他の知られている変異体は、任意の非ヘリックス破壊アミノ酸残基によって置換されてもよいアミノ酸残基番号６、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３１、３２、３５、３９、４１、及び４２（配列番号４０による番号付け）から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。これらの残基は、天然テトラネクチンモノマーの３つのＴＴＳＥの間の三量体複合体を安定させる分子間相互作用に直接関与しないことが示された。図２において示される一態様では、ＴＴＳＥは、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇ（Ｎ〜Ｃ）を有する７アミノ酸繰り返しを有し、残基ａ及びｄ（つまり位置２６、３０、３３、３７、４０、４４、４７、及び５１は、任意の疎水性アミノ酸であってもよい（配列番号４０による番号付け）。
さらなる実施形態では、ＴＴＳＥ三量体形成ドメインは、ポリヒスチジン配列及び／又はプロテアーゼ切断部位、例えば、血液凝結因子Ｘａ又はグランザイムＢの組み込みによって（参照によって本明細書において組み込まれるＵＳ ２００５／０１９９２５１を参照されたい）並びにＣ末端ＫＧ又はＫＧＳ配列を含むことによって修飾することができる。さらに、精製を支援するために、位置２のプロリンは、グリシンと置換されてもよい。
ＴＴＳＥ切断及び変異体の特定の非限定的な例は、ＰＣＴ ＵＳ０９／６０２７１（図３Ａ〜３Ｄ）において示される。さらに、ヒトテトラネクチンの三量体化ドメインに対して実質的な相同性（６６％を超える）を有する多くの三量体化ドメインが知られている。
Figure 2013507123
三量体化することが知られている他のヒトポリペプチドは、表２において見つけられるものを含む。
Figure 2013507123
三量体化ドメインの他の例は、コレクチンネック領域を含むポリペプチドを記載する米国特許第６，１９０，８８６号（その全体が本明細書において参照によって組み込まれる）において開示される。そういう訳で、三量体は、コレクチンネック領域アミノ酸配列を含む３つのポリペプチドを用いて適切な条件下で作成することができる。以下を含む多くのコレクチンが、同定されている。
ヒトＳＰ−Ｄのコレクチンネック領域：
Figure 2013507123
ウシＳＰ−Ｄのコレクチンネック領域：
Figure 2013507123
ラットＳＰ−Ｄのコレクチンネック領域：
Figure 2013507123
ウシコングルチニンのコレクチンネック領域：
Figure 2013507123
ウシコレクチンのコレクチンネック領域：
Figure 2013507123
ヒトＳＰ−Ｄのネック領域：
Figure 2013507123
ＭＢＰの三量体化ドメインの他の例は、その全体が参照によって組み込まれるＷＯ ２００９／０３６３４９として公開されたＰＣＴ特許出願第ＵＳ０８／７６２６６号において記載される。この三量体化ドメインは、さらにオリゴマー化することができ、より高次の多量体複合体を生成することができる。
本発明はまた、最初に選択されたタンパク質誘導体の最終タンパク質産物への確実な変換のための一般的で単純な手順をも提供し、これは、さらに再配列することなく、小及び大規模の両方において、細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））において生成されてもよい（国際特許出願公開ＷＯ ９４／１８２２７ Ａ２）。ある実施形態では、いくつかの同一又は同一ではない結合部位は、弱い親和性さえ利用を可能にする単純で一般的な手段によって、相互作用における結合活性の手段又は二若しくはヘテロ機能性分子集合体の構築によって同じ機能的タンパク質ユニット中に含むことができる（その全体が参照によって組み込まれる国際特許出願公開ＷＯ ９８／５６９０６）。ある実施形態では、結合は、ＣＴＬＤにおける１つ又は複数の保存金属結合部位（単数又は複数）を有する組み合わせのライブラリーにおける二価金属イオン（例えば、カルシウムイオン）の追加又は除去によって調整することができる。その代わりに、結合は、ｐＨを変化させることによって調整することができる。
ＣＴＬＤポリペプチドの使用
本発明のコンビナトリアルポリペプチドライブラリーは、例えば、抗体産物が典型的に試薬として使用される診断又は治療上の用途を含む多くの用途において、生化学的アッセイ系、医療用のｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏ診断アッセイ系において、又は治療用組成物における活性構成要素として使用するために、対象の標的分子に対して所望の結合特性を有するＣＴＬＤを生成し、同定するために使用することができる。コンビナトリアルポリペプチドライブラリーは、選択された標的成分に対する高親和性結合分子の生成を可能にする、改変されたループ領域を含む。
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系の使用については、ＣＴＬＤベースのタンパク質産物におけるそれぞれの結合部位が単一の構造的に独立したタンパク質ドメイン中に保護されるので、ＣＴＬＤ（又はＣＴＬＤベースのタンパク質産物）は、抗体誘導体に比べて利点を有する。ＣＴＬＤドメインは、タンパク質分解に対して抵抗性であり、安定性もリガンド結合部位への到達も、ＣＴＬＤのＮ又はＣ末端への他のタンパク質ドメインの結合によって損なわれない。したがって、ＣＴＬＤ結合モジュールは、例えば、同一若しくは同一ではない特異性の複数のＣＴＬＤ、レポーター分子、酵素分子（ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ）、エフェクター分子、放射性同位元素、又は当技術分野において知られている任意の他のシグナル伝達分子を持つモジュール分子集合体（例えば、Ｎ及び／又はＣ末端伸長）の構築のための基本単位として容易に利用されてもよい。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける診断又は治療上の目的に使用されることとなる組成物の本質的な構成要素としてのｉｎ ｖｉｖｏにおける使用の点から、ＣＴＬＤベースのタンパク質産物は、事実上、体内に既に存在する対応する自然のＣＴＬＤタンパク質と同一であり、そのため、患者において最小限の免疫応答しか誘発しないことが期待される。単一のＣＴＬＤは、最も小さな機能的抗体誘導体、単鎖Ｆｖ誘導体の約半分の質量であり、この小さなサイズは、それが、よりよい組織浸透及び分布並びに循環中のより短い半減期を提供し得るので、いくつかの用途において有利であり得る。完全なテトラネクチン三量体又はさらに多量体形成したコレクチン（例えば、マンノース結合タンパク質）をベースとするものなどのＣＴＬＤタンパク質の多価形態は、結合能力及び結合活性の増加並びにより長い循環半減期をもたらす。
セクションの項目は、構成上の目的のみのために本明細書において使用され、記載される主題を限定するものとして決して解釈されないことに注意されたい。本明細書において引用される参考文献は全て、全ての目的のためにそれらの全体が参照によって組み込まれる。
続く実施例は、単に、本発明のある実施形態の例証であり、添付の請求項によって決定される本発明を限定するものとして解釈されない。
［実施例］
以下の実施例において検討されるベクター（ｐＡＮＡ）は、従来報告されたベクターから誘導される［米国特許出願公開第２００７／０２７５３９３号参照］。ある種のベクター配列は配列表に提供され、当業者は本明細書に与えられた記載を考慮してベクターを誘導することができる。ｐＰｈＣＰＡＢファージディスプレイベクター（配列番号５０）は、ＡＬＱＴをコードするｈＴＮ配列（など）にリンカーで融合されたｇＩＩＩシグナルペプチドコード領域を有する。ＣＴＬＤ領域のＣ末端を残りのｇＩＩＩコーディング領域にリンカーを介して融合する。ＣＴＬＤ領域内で、コーディング配列を変更しないが、変更ループ領域を含むＰＣＲ断片のクローニングに適した制限部位を生じさせたヌクレオチド突然変異を生成した。ループ領域の一部は、全てのライブラリーファージが、野生型テトラネクチンではなく、組換えテトラネクチンだけを発現することができるようにこれらの制限部位間で除かれた。マウスＴＮ ＣＴＬＤファージディスプレイベクターを同様に設計する。これらのベクターの別の実施形態はｐＡＮＡ２７（配列番号６４）であり、そこでは、遺伝子ＩＩＩのＣ末端領域が切断され、ｈＴＮコーディング配列の末端の抑制可能な終止コドンがグルタミンをコードするように変更させている。マウスベクターｐＡＮＡ２８（配列番号６５）を同様にして構築した。
（例１）
ライブラリー構築：ループ１の突然変異及び伸長
ヒトテトラネクチン及びマウステトラネクチンの配列、並びにループ１、２、３、４（ＬＳＡ）及び５（ＬＳＢ）の位置を図１、２及び４に示す。ヒト及びマウスのテトラネクチンのＣ型レクチン結合ドメインの１−２拡張ライブラリー（それぞれ「ヒト１Ｘ−２」及び「マウス１Ｘ−２」）について、表３に示される配列をコードするように、ループ１のコーディング配列を修飾し、この場合、５つのアミノ酸ＡＡＥＧＴ（配列番号５７９；ヒト）又はＡＡＥＧＡ（配列番号５８１；マウス）をヌクレオチドＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ（配列番号５８２）によってコードされる７つのランダムアミノ酸で置換した；ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを示す；ＫはＧ又はＴを示す。また、ループ２の直後のアミノ酸アルギニンは、コーディング鎖のヌクレオチドＮＮＫを用いることによって完全にランダム化された。このアミノ酸は、アルギニンがループ１のアミノ酸と接触するためにランダム化され、ループ１のランダム化によって達成され得る立体配置を抑制することができる。さらに、プラスミノーゲン結合を無効にさせるために、リシン１４８（Ｋ）の代わりにアラニン（Ａ）をコードするようにループ４のコーディング配列を変更し、これはループ４のリシンに依存することを示している（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら、１９９８）。ヒトテトラネクチン及びマウステトラネクチンの配列、並びにループ１、２、３、４、及び５の位置を図２に示す。
Figure 2013507123
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ヒトループ１拡張ライブラリーを以下のようにオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた（プライマー配列を表４に示す）。プライマー１Ｘｆｏｒ（配列番号１３７）及び１Ｘｒｅｖ（配列番号１３８）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、並びにプライマーＢｓｔＸ１ｆｏｒ（配列番号１３９）及びＰｓｔＢｓｓＲｅｖＣ（配列番号１４０）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、外側のプライマーＢｇｌｆｏｒ１２（配列番号１４１）及びＰｓｔＲｅｖ（配列番号１４２）の存在下で混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲル精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで切断し、ファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。ファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢをｐＣＡＮＴＡＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から誘導し、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩタンパク質に融合されたヒトテトラネクチンＣＴＬＤの一部を含んだ。ループ１〜４の側面に位置するＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ制限酵素部位を含むようにＣＴＬＤ領域を修飾し、この１〜４領域は終止コドンを含むように変更され、その結果、インフレーム挿入物の連結なしにベクターから機能性遺伝子ＩＩＩタンパク質は生成することができなかった。ｐＡＮＡ２７は、ＢａｍＨＩからＣｌａＩ領域を配列番号６４のＢａｍＨＩからＣｌａＩ配列で置換することによってｐＰｈＣＰＡＢから誘導された（ｐＡＮＡ２７）。これは、アンバーの抑制可能な終止コドンをグルタミンコドンで置換し、遺伝子ＩＩＩのアミノ末端領域を切断する。
連結された材料をエレクトロコンピテントなＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、４〜８リットルの細胞を終夜増殖させ、ＤＮＡを単離して、パンニング用にマスターライブラリーＤＮＡストックを生じさせた。１．５×１０８のライブラリーサイズが得られ、調べられたクローンは標的領域において多様な配列を示した。
マウスループ１拡張ライブラリーを以下のようにオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた。プライマーＭｕ１Ｘｆｏｒ（配列番号１４３）及びＭｕ１Ｘｒｅｖ（配列番号１４４）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、並びにプライマーＭｕ１ＸＳａｌ１ｆｏｒ（配列番号１４５）及びＭｕ１ＸＰｓｔＲｅｖ（配列番号１４６）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、外側のプライマーＢｓｔＢＢｓｓＨ（配列番号１４７）及びＭｕ Ｐｓｔ（配列番号１４８）の存在下で混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲル精製し、ＢｓｓＨＩＩ及びＰｓｔＩで切断し、同様にして消化されたファージディスプレイベクターｐＡＮＡ１６又はｐＡＮＡ２８に連結した。ヒトテトラネクチンＣＴＬＤをマウステトラネクチンＣＴＬＤで置換することによって、ｐＰｈＣＰＡＢからファージディスプレイベクターｐＡＮＡ１６（配列番号６３）を誘導した。マウステトラネクチンＣＴＬＤは、クローニングを促進するために、ループ１〜４領域内のＢｓｔＢＩ、ＢｓｓＨＩＩとＳａｌＩ部位、及びｐＰｈＣＰＡＢに類似したループ４領域後にＰｓｔＩ部位を含んだ。さらに、この領域を上述されるように終止コドンを含むように変更した。ＢａｍＨＩからＣｌａＩ領域を配列番号６５に示されるＢａｍＨＩからＣｌａＩ配列で置換することによって、ｐＡＮＡ１６（配列番号６３）からファージディスプレイベクターｐＡＮＡ２８（配列番号６５）を誘導した。連結された材料をエレクトロコンピテントなＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、４〜８リットルの細胞を終夜増殖させ、ＤＮＡを単離して、パンニング用にマスターライブラリーＤＮＡストックを生じさせた。２．６５×１０１０のライブラリーサイズが得られ、調べられたクローンは標的領域において多様な配列を示した。
Figure 2013507123
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（例２）
ライブラリー構築：ループ１及び２の突然変異
ヒト及びマウスのテトラネクチンＣ型レクチン結合ドメインのループ１〜２ライブラリー（それぞれ「ヒト１〜２」及び「マウス１〜２」）について、表１に示される配列をコードするようにループ１のコーディング配列を修飾し、この場合、５つのアミノ酸ＡＡＥＧＴ（配列番号５７９；ヒト）又はＡＡＥＧＡ（配列番号５８１；マウス）はヌクレオチドＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ（配列番号５８３）によってコードされる５つのランダムアミノ酸で置換された；ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを示す；ＫはＧ又はＴを示す。ループ２（隣接するアルギニンを含む）において、ヒトにおける４つのアミノ酸ＴＧＡＲ（配列番号５８４）、又はマウスにおけるＴＧＧＲ（配列番号５８５）は、ヌクレオチドＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ（配列番号５８６）によってコードされた４つのランダムアミノ酸で置換された。さらに、プラスミノーゲン結合を無効にさせるために、このループにおけるリシン（Ｋ）の代わりにアラニン（Ａ）をコードするようにループ４のコーディング配列を変更し、これはループ４のリシンに依存することが示されている（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら、１９９８）。
ヒト１〜２ライブラリーを以下のようにオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた（プライマー配列を表４に示す）。プライマー１−２ｆｏｒ（配列番号１４９）及び１−２ｒｅｖ（配列番号１５０）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、外側のプライマーＢｇｌｆｏｒ１２（配列番号１４１）及びＰｓｔＲｅｖ１２（配列番号１５１）の存在下で混合し、ＰＣＲによって伸長した。上記したように、得られた断片をゲル精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで切断し、同様に消化されたファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。４．８６×１０８のライブラリーサイズが得られ、調べられたクローンは標的領域において多様な配列を示した。
マウスループ１〜２ライブラリーを以下のようにオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた。プライマーＭｕ１Ｘｆｏｒ（配列番号１４３）及びＭｕ１２ｒｅｖ（配列番号１５２）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、並びにプライマーＭｕ１２３４ｆｏｒ（配列番号１５３）及びＭｕ１ＸＰｓｔＲｅｖ（配列番号１４６）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、外側のプライマーＢｓｔＢＢｓｓＨ（配列番号１４７）及びＭｕＰｓｔ（配列番号１４８）の存在下で混合し、ＰＣＲによって伸長した。上記したように、得られた断片をゲルから精製し、ＢｓｓＨＩＩ及びＰｓｔＩで切断し、
同様にして消化されたファージディスプレイベクターｐＡＮＡ１６又はｐＡＮＡ２８にクローニングした。１．６３×１０９のライブラリーサイズが得られ、調べられたクローンは標的領域において多様な配列を示した。
（例３）
ライブラリー構築：ループ１と４の突然変異及び伸長
ヒト及びマウスのテトラネクチンＣ型レクチン結合ドメインのループ１〜４ライブラリー（それぞれ「ヒト１〜４」及び「マウス１〜４」）について、表３に示される配列をコードするようにループ１のコーディング配列を修飾し、この場合、７つのアミノ酸ＤＭＡＡＥＧＴ（配列番号５８７；ヒト）又はＤＭＡＡＥＧＡ（配列番号５８８；マウス）はヌクレオチドＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ（配列番号５８２）によってコードされる７つのランダムアミノ酸で置換された；ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを示す；ＫはＧ又はＴを示す。ループ４において、２つのアミノ酸であるヒトにおけるＫＴ又はマウスにおけるＫＡは、ヌクレオチドＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ（配列番号５８３）によってコードされる５つのランダムアミノ酸で置換された。
ヒト１〜４ライブラリーを以下のようにオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた（プライマー配列を表４に示す）。プライマーＢｇｌＢｓｓｆｏｒ（配列番号１５４）及びＢｓｓＢｇｌｒｅｖ（配列番号１５５）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、並びにプライマーＢｓｓＰｓｔｆｏｒ（配列番号１５６）及びＰｓｔＢｓｓＲｅｖ（配列番号１５７）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、外側のプライマーＢｇｌｆｏｒ（配列番号１５８）及びＰｓｔＲｅｖ（配列番号１４２）の存在下で混合し、ＰＣＲによって伸長した。上記される通り、得られた断片をゲル精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で切断し、同様にして消化されたファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。２×１０９のライブラリーサイズが得られ、パンニング前に調べられた１２個のクローンは標的領域において多様な配列を示した。
マウス１〜４ライブラリーを以下のようにオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた（プライマー配列を表４に示す）。プライマーＭｕ１−４ＡＦ（配列番号２０１）及びＭｕ１−４ＡＲ（配列番号２０２）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、並びにプライマーＭｕ１−４ＢＦ（配列番号２０３）及びＭｕ１−４ＢＲ（配列番号２０４）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、外側のプライマーＭｕ１−４ＯＦ（配列番号２０５）及びＭｕ１−４ＯＲ（配列番号２０６）の存在下で混合し、ＰＣＲによって伸長した。上記される通り、得られた断片をゲル精製し、ＢｓｔＢＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で切断し、同様にして消化されたファージディスプレイベクターｐＡＮＡ２８にクローニングした。４．７×１０９のライブラリーサイズが得られ、パンニング前に２０を超える調べられたクローンは標的領域において多様な配列を示した。
（例４）
ライブラリー構築：ループ３と４の突然変異及び伸長
ヒト及びマウスのテトラネクチンＣ型レクチン結合ドメインのループ３〜４拡張ライブラリー（それぞれ「ヒト３−４Ｘ」及び「マウス３−４Ｘ」）について、表４に示される配列をコードするようにループ３のコーディング配列を修飾し、この場合、ヒト又はマウスのテトラネクチンの３つのアミノ酸ＥＩＴは、コーディング鎖におけるヌクレオチドＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ（配列番号５８９）によってコードされる６つのランダムアミノ酸で置換された（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを示す；ＫはＧ又はＴを示す）。さらに、ループ４において、３つのアミノ酸であるヒトにおけるＫＴＥ又はマウスにおけるＫＡＥは、ヌクレオチドＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ（配列番号５８９）によってコードされる６つのランダムアミノ酸で置換された。
ヒト３〜４拡張ライブラリーを以下のようにオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた（プライマー配列を表４に示す）。プライマーＨループ１−２−Ｆ（配列番号１６３）及びＨループＥｘｔ−Ｒ（配列番号１６４）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、並びにプライマーＨループ３−４Ｅｘｔ−Ｆ（配列番号１６５）及びＨループ５−Ｒ（配列番号１６６）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、追加のＨループ１−２−Ｆ（配列番号１６３）及びＨループ５−Ｒ（配列番号１６６）の存在下で混合し、ＰＣＲによって伸長した。上記される通り、得られた断片をゲル精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で切断し、同様にして消化されたファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。７．９×１０８のライブラリーサイズが得られ、調べられたクローンは標的領域において多様な配列を示した。
マウス３〜４拡張ライブラリーを以下のようにオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた。プライマーＭＳａｃＩＩ−Ｆ（配列番号１６７）及びＭループＥｘｔ−Ｒ（配列番号１６８）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、並びにプライマーＭループ３−４Ｅｘｔ−Ｆ（配列番号１６９）及びＭループ５−Ｒ（配列番号１７０）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、追加のＭＳａｃＩＩ−Ｆ（配列番号１６７）及びＭループ５−Ｒ（配列番号１７０）の存在下で混合し、ＰＣＲによって伸長した。上記される通り、得られた断片をゲル精製し、ＳａｃＩＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で切断し、同様にして消化されたファージディスプレイベクターｐＡＮＡ１６又はｐＡＮＡ２８にクローニングした。４．９５×１０９のライブラリーサイズが得られ、調べられたクローンは標的領域において多様な配列を示した。
（例５）
ライブラリー構築：ループ３と４の突然変異及びループ間のＰＲＯ
ヒト及びマウスのテトラネクチンＣ型レクチン結合ドメインのループ３〜４コンボライブラリー（それぞれ「ヒト３〜４コンボ」及び「マウス３〜４コンボ」）について、ループ３と４のコーディング配列、及びこれらの２つのループ間のプロリンは、表３に示される配列をコードするように変更され、この場合、ヒト配列ＴＥＩＴＡＱＰＤＧＧＫＴＥ（配列番号５９０）又は対応するマウス配列ＴＥＩＴＴＱＰＤＧＧＫＡＥ（配列番号５９１）は、１３個のアミノ酸配列ＸＸＸＸＸＸＸＸＧＧＸＸＸ（配列番号：５９２）によって置換され、この場合、Ｘは配列ＮＮＫによってコードされるランダムアミノ酸を表す（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを示す；ＫはＧ又はＴを示す）。
ヒト３〜４コンボライブラリーを以下のようにオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた（プライマー配列を表４に示す）。プライマーＨループ１−２−Ｆ（配列番号１６３）及びＨループ３−４コンボ−Ｒ（配列番号１７１）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、追加のＨループ１−２−Ｆ（配列番号１６３）及びＨループ５−Ｒ（配列番号１６６）の存在下で混合し、ＰＣＲによって伸長した。上記される通り、得られた断片をゲル精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で切断し、同様にして消化されたファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。４．９５×１０９のライブラリーサイズが得られ、調べられたクローンは標的領域において多様な配列を示した。
マウス３〜４コンボライブラリーを以下のようにオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた。プライマーＭＳａｃＩＩ−Ｆ（配列番号１６７）及びＭループ３−４コンボ−Ｒ（配列番号１７２）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、外側のプライマーＭＳａｃＩＩ−Ｆ（配列番号１６７）及びＭループ５−Ｒ（配列番号１７０）の存在下で混合し、ＰＣＲによって伸長した。上記される通り、得られた断片をゲル精製し、ＳａｃＩＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で切断し、同様にして消化されたファージディスプレイベクターｐＡＮＡ１６又はｐＡＮＡ２８にクローニングした。７．２９×１０８のライブラリーサイズが得られ、調べられたクローンは標的領域において多様な配列を示した。
（例６）
ライブラリー構築：ループ４の突然変異及び伸長
ヒト及びマウスのテトラネクチンＣ型レクチン結合ドメインのループ４拡張ライブラリー（それぞれ「ヒト４」及び「マウス４」）について、表３に示される配列をコードするようにループ４のコーディング配列を修飾し、この場合、３つのアミノ酸であるヒトテトラネクチンのＫＴＥ又はマウステトラネクチンのＫＡＥは、ヌクレオチドＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ（配列番号５８２）によってコードされる７つのランダムアミノ酸で置換された；ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを示す；ＫはＧ又はＴを示す。
ヒト４拡張ライブラリーを以下のようにオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた（プライマー配列を表４に示す）。プライマーＨループ１−２−Ｆ（配列番号１６３）及びＨループ３−Ｒ（配列番号１７３）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、並びにプライマーＨループ４Ｅｘｔ−Ｆ（配列番号１７４）及びＨループ５−Ｒ（配列番号１６６）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、追加のＨループ１−２−Ｆ（配列番号１６３）及びＨループ５−Ｒ（配列番号１６６）の存在下で混合し、ＰＣＲによって伸長した。上記される通り、得られた断片をゲル精製し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で切断し、同様にして消化されたファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。２．７×１０９のライブラリーサイズが得られ、調べられたクローンは標的領域において多様な配列を示した。
マウス４拡張ライブラリーを以下のようにオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた。プライマーＭＳａｃＩＩ−Ｆ（配列番号１６７）及びＭループ３−Ｒ（配列番号１７５）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、並びにプライマーＭループ４Ｅｘｔ−Ｆ（配列番号１７６）及びＭループ５−Ｒ（配列番号１７０）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、追加のＭＳａｃＩＩ−Ｆ（配列番号１６７）及びＭループ５−Ｒ（配列番号１７０）の存在下で混合し、ＰＣＲによって伸長した。上記される通り、得られた断片をゲル精製し、ＳａｃＩＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で切断し、同様にして消化されたファージディスプレイベクターｐＡＮＡ１６又はｐＡＮＡ２８にクローニングした。
（例７）
ライブラリー構築：ループ３の伸長の有無による突然変異
ヒト及びマウスのテトラネクチンＣ型レクチン結合ドメインのループ３変更ライブラリーについて、表３に示される配列をコードするようにループ３のコーディング配列を修飾し、この場合、６個のアミノ酸であるヒトテトラネクチンのＥＴＥＩＴＡ（配列番号５９３）又はマウステトラネクチンのＥＴＥＩＴＴ（配列番号５９４）は、ヌクレオチドＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ（配列番号５８３）、ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ（配列番号５８２）、及びＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ（配列番号５９５）によってコードされる６、７、又は８個のランダムアミノ酸で置換された；ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴを示す；ＫはＧ又はＴを示す。さらに、ループ４において、３つのアミノ酸であるヒトにおけるＫＴＥ又はマウスにおけるＫＡＥは、ヌクレオチドＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ（配列番号５８９）によってコードされる６つのランダムアミノ酸で置換された。さらに、プラスミノーゲン結合を無効にさせるために、ループにおけるリシン（Ｋ）の代わりにアラニン（Ａ）をコードするようにループ４のコーディング配列を変更し、これはループ４のリシンに依存することを示している（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら、１９９８）。
ヒトループ３変更ライブラリーを以下のようにオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた。プライマーＨループ３Ｆ６、Ｈループ３Ｆ７、及びＨループ３Ｆ８（それぞれ配列番号１７７〜１７９）を個別にＨループ４Ｒ（配列番号１８０）と混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、オリゴＨループ１−２Ｆ（配列番号１６３）、ＨｕＢｇｌｆｏｒ（配列番号１９３）及びＰｓｔＲｅｖ（配列番号１４２）の存在下で混合し、ＰＣＲによって伸長した。上記される通り、得られた断片をゲル精製し、ＢａｌＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で消化し、同様にして消化されたファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。ライブラリー生成後、３つのライブラリーをパンニング用にプールした。
マウスループ３変更ライブラリーを以下のようにオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた。プライマーＭループ３Ｆ６、Ｍループ３Ｆ７、及びＭループ３Ｆ８（それぞれ配列番号１８１〜１８３）を個別にプライマーＭＳａｃＩＩ−Ｆ（配列番号１６７）と混合し、ＰＣＲによって伸長した。さらに、プライマーＭループ４Ｆ（配列番号２０７）及びＭＭｆｅＲ（配列番号２０８）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、混合し、プライマーＭ３ＸＯＦ（配列番号１８４）及びＭ３ＸＯＲ（配列番号１９２）の存在下でＰＣＲに供した。上記される通り、生成物をＳａｌＩ（又はＳａｃＩＩ）及びＰｓｔＩ制限酵素で消化し、精製された断片を同様にして消化されたファージディスプレイベクターｐＡＮＡ１６又はｐＡＮＡ２８にクローニングした。
ループ３の代替のループ伸長
ヒトループ３ループライブラリーを以下のようなオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた。プライマーループ３ＡＦ２（配列番号１８７）及びループ３ＡＲ２（配列番号１８８）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、並びにプライマーループ３ＢＦ（配列番号１８９）及びループ３ＢＲ（配列番号１９０）を混合し、ＰＣＲによって伸長する。得られた断片をゲルから精製し、混合し、プライマーＢｇｌｆｏｒ（配列番号１５８）及びループ３ＯＲ（配列番号１９１）の存在下でＰＣＲに供した。上記される通り、生成物をＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で消化し、精製された断片を同様にして消化されたファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングする。さらに、プラスミノーゲン結合を無効にさせるために、ループにおけるリシン（Ｋ）の代わりにアラニン（Ａ）をコードするようにループ４のコーディング配列を変更し、これはループ４のリシンに依存することを示している（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら、１９９８）。同様のアプローチを用いて、対応するマウスＴＮライブラリーを生成することができる。
（例８）
ループ３及び５の突然変異
ヒト及びマウスのテトラネクチンＣ型レクチン結合ドメインのループ３及び５の変更ライブラリーについて、表３に示される配列をコードするようにループ３及び５のコーディング配列を修飾し、この場合、５個のアミノ酸であるヒトテトラネクチンのＴＥＩＴＡ（配列番号５９６）又はマウステトラネクチンのＴＥＩＴＴ（配列番号５９７）は、ヌクレオチドＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫ（配列番号５８３）によってコードされる５つのアミノ酸で置換され、並びにヒト又はマウスの３つのループ５アミノ酸ＡＡＮは、ヌクレオチドＮＮＫ ＮＮＫ ＮＮＫによってコードされる３つのアミノ酸で置換された。さらに、プラスミノーゲン結合を無効にさせるために、ループにおけるリシン（Ｋ）の代わりにアラニン（Ａ）をコードするようにループ４のコーディング配列を変更し、これはループ４のリシンに依存することを示している（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら、１９９８）。
ヒトループ３及び５の変更ライブラリーを以下のようなオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた。プライマーｈ３−５ＡＦ（配列番号２１３）及びｈ３−５ＡＲ（配列番号２１４）を混合し、ＰＣＲによって伸長し、並びにプライマーｈ３−５ＢＦ（配列番号２１５）及び３−５ＢＲ（配列番号２１６）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、ｈ３−５ＯＦ（配列番号２１７）及びＰｓｔＲｅｖ（配列番号１４２）の存在下で混合し、ＰＣＲによって伸長した。上記される通り、得られた断片をゲル精製し、ＢａｌＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で消化し、同様にして消化されたファージディスプレイベクターｐＰｈＣＰＡＢ又はｐＡＮＡ２７にクローニングした。
マウスループ３及び５の変更ライブラリーを以下のようなオーバーラップＰＣＲを用いて生じさせた。プライマーｍ３−５ｆｏｒ（配列番号２０９）及びｍ３−５ｒｅｖ（配列番号２１０）を混合し、ＰＣＲによって伸長した。得られた断片をゲルから精製し、プライマーｍ３−５ＯＦ（配列番号２１１）及びｍ３−５ＯＲ（配列番号２１２）を用いてＰＣＲによって再度増幅した。上記される通り、生成物をＳａｌＩ及びＰｓｔＩ制限酵素で消化し、精製された断片を同様にして消化されたファージディスプレイベクターｐＡＮＡ１６又はｐＡＮＡ２８にクローニングした。
例９〜２２は、本発明のコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを用いて、ＴＲＡＩＬ死受容体に特異的なポリペプチド配列を単離するための典型的な方法を提供する。ＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンド、特に文献においてはＡｐｏ２Ｌ及びＴＮＦＳＦ１０とも称される）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属し、腫瘍細胞において、プログラムされた細胞死、又はアポトーシスの活性化因子として同定されている。ＴＲＡＩＬは、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、及び樹状細胞を含む免疫系の細胞において発現され、細胞膜に位置する。ＴＲＡＩＬは、システインプロテアーゼによって処理され、そのタンパク質の可溶化形態を生じ得る。ＴＲＡＩＬの膜結合形態及び可溶化形態の両方は、三量体として機能し、標的細胞に位置するＴＲＡＩＬ受容体との相互作用を介してアポトーシスを誘発し得る。ヒトにおいて、ＴＲＡＩＬに対して結合活性を有する５つの受容体が同定されている。これらの５つの受容体のうち２つであるＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４、ＴＮＦＳＦ１０ａ）及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５、ＴＮＦＲＳＦ１０ｂ）は、死ドメイン（ＤＤ）と呼ばれる細胞質領域を含む。これらの２つの受容体分子上の死ドメインは、受容体へのＴＲＡＩＬの結合に応じた、外因性アポトーシス経路のＴＲＡＩＬ活性化に対して必要とされる。残りの３つのＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（ＤｃＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１０ｃ）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＤｃＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１０ｄ）及び循環性オステオプロテゲリン（ＯＰＧ、ＴＮＦＲＳＦ１１ｂ）と呼ばれる）は、おとり受容体として機能を果たすと考えられている。これらの３つの受容体は機能性ＤＤを欠損し、ＴＲＡＩＬを隔離するか又は生存促進性シグナルを刺激することによって、アポトーシスを負に制御することに主に関与していると考えられている。
ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）又は−Ｒ２（ＤＲ５）へのＴＲＡＩＬの結合により、三量体化された受容体は、死誘導性シグナル複合体（ＤＩＳＣ）を形成するいくつかの細胞質タンパク質を救済し、その後、カスパーゼ−８又はカスパーゼ−１０の活性化をもたらす。これは、不可逆的細胞死を引き起こす２つの異なる経路の１つを誘発する。その１つでは、カスパーゼ−８は細胞の分解をもたらすエフェクターカスパーゼ（カスパーゼ−３、−６、−７）を直接活性化し、他の経路は、死促進性Ｂｃｌ２ファミリータンパク質、Ｂｉｄのカスパーゼ−８依存性切断を伴い、ミトコンドリアの又は固有の死経路を必要とする。
この細胞死活性を考慮すると、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合する分子は、幅広いがんの治療において治療的役割を有する可能性がある。したがって、本発明のＣＴＬＤポリペプチドライブラリーは、ＴＲＡＩＬＲ１及びＴＲＡＩＬＲ２への特異的結合活性を有するＣＴＬＤベースのポリペプチドを同定し、単離することを目指してスクリーニングされた。
（例９）
ヒトライブラリー１〜４のパンニング及びスクリーニング
ヒトライブラリー１〜４から生じたファージは、組換えＴＲＡＩＬＲ１（ＤＲ４）／Ｆｃキメラ、及びＴＲＡＩＬＲ２（ＤＲ５）／Ｆｃキメラに対してパンニングされた。ＥＬＩＳＡプレートアッセイを用いた、３、４、及び／又は５ラウンドのパンニング後のこれらの結合パネルのスクリーニングは、全ての場合において受容体特異的結合物を同定した。
（例１０）
ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４及びＤＲ５についてのアゴニストを選択及びスクリーニングするためのライブラリー及びクローンの構築
様々な長さの線状又は環状のランダム化されたペプチドを発現するファージライブラリーは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）などの製造業者から商業的に購入することができる。或いは、ヒトテトラネクチンのＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）のループにおけるランダム化されたペプチドを含むファージディスプレイライブラリーを生成することができる。ＣＴＬＤのＬＳＡのループ１、２、３、及び４を図４に示す。これらのループ内のアミノ酸は、ＮＮＳ又はＮＮＫオーバーラップＰＣＲ突然変異誘発戦略を用いてランダム化され得る。任意の１つのループにおける１〜７個のコドンは、突然変異原性ＮＮＳ又はＮＮＫコドンによって置換され、スクリーニングのためのライブラリーを生成してもよい；或いは、突然変異したアミノ酸の数は、置換された数を超えていてもよい（２つのアミノ酸は、例えば、５個置換され、より大きなランダム化ループを作製してもよい）。さらに、１を超えるループを同時に変更してもよい。オーバーラップＰＣＲ戦略は、ループ２と３の間の最終ＤＮＡ構築物においてＫｐｎＩ部位のいずれかを生じさせることができ、それは、ループ間のアミノ酸の１つを変更し、元のアラニンをトレオニンに交換する。或いは、ＢｓｓＨＩＩ部位は、元のアミノ酸配列を変更しない、ループ２と３の間に組み込むことができる。
（例１１）
ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４及びＤＲ５に対するアゴニストの選択及びスクリーニング
ファージを発現する細菌コロニーは、ファージライブラリー又はライブラリーＤＮＡのグリセロールファージストックのいずれかを用いて、それぞれ大腸菌ＴＧ−１又はＸＬ−１Ｂｌｕｅなどの細菌の感染又はトランスフェクションによって生じさせた。Ｏ．Ｄ．６００が１．０である５０ｍｌの感染された／トランスフェクトされた細菌を１５分間室温（ＲＴ）にて増殖させ、その時間後、最終濃度が４０％の選択可能な薬剤マーカーを培養物に添加し、１時間３７℃でインキュベートする。そのインキュベーション後、選択のための残りの薬剤を添加し、さらに１時間３７℃でインキュベートする。ヘルパーファージＶＣＳ Ｍ１３を添加し、２時間インキュベートした。カナマイシン（７０μｇ／ｍＬ）を培養物に添加し、次に、振とうしながら終夜３７℃でインキュベートする。ファージは、遠心分離され、３分の１体積の２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００／２．５Ｍ ＮａＣｌを用いて、上清からファージの冷却沈殿によって回収された。プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ不含）を含む緩衝液中でファージを再度懸濁させ、その後、滅菌ろ過する。ファージライブラリーは、大腸菌ＴＧ−１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、又は他の適切な細菌宿主において滴定される。
ヒトＤＲ４及び／又はＤＲ５に対して陽性選択の複数回ラウンドにおいてファージをパンニングする。ヒトＤＲ４及びＤＲ５（ａｋａヒトＴＲＡＩＬ死受容体１及び２）は可溶性形態で（Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、又はＦｃ（Ｇｅｎｗａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）若しくはＧＳＴ融合物（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）として）市販されている。ＰＢＳ中の可溶性ＤＲ４又はＤＲ５をマイクロプレートウェル（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２Ｂプレート）の底などの固体支持体に、又はＤｙｎａｂｅａｄなどの磁気ビーズに直接結合させる。約２５０ｎｇ〜５００ｎｇの可溶性ＤＲ４又はＤＲ５は、終夜ＰＢＳ中、４℃又はＲＴでインキュベーションによって固体基質に結合される。次に、プレート（又はビーズ）をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０中で３回洗浄し、続いてＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウムなどのブロッキング剤を添加し、少なくとも０．５時間ＲＴでインキュベートし、非特異的な表面へのさらなるステップの材料の結合を妨げる。また、３％脂肪不含粉ミルク又は煮沸カゼインを含むＰＢＳなどのブロッキング剤を用いることもできる。
代替のプロトコールでは、ＤＲ４又はＤＲ５ Ｆｃ融合タンパク質を結合させるために、プレート又はビーズは、最初にＰＢＳ中の市販の０．５〜１μｇの抗Ｆｃ抗体と共にインキュベートされる。プレート（又はビーズ）を上記の通り洗浄し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウムでブロックし、次に、５μｇ／ｍＬで死受容体融合タンパク質と共にインキュベートし、２時間ＲＴでインキュベートする。続いて、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０でプレートを３回洗浄する。
約１０１１又は１０１２ｐｆｕ／ｍＬ濃度のファージライブラリーは、直接的又は間接的に結合された死受容体を含むウェル（又はビーズ）に添加される。ファージを少なくとも２時間ＲＴでインキュベートするが、異なる結合特性についてスクリーニングするために、インキュベーション時間及び温度を変化させることができる。ウェルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で少なくとも８回洗浄し、次にＰＢＳで洗浄（８×）する。次第に緩衝液の酸性を増すことで、例えば、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ５．０、Ｔｒｉｓ ｐＨ４．０、及びＴｒｉｓ ｐＨ３．０を用いて、選択の後期のラウンドにおいてウェルを洗浄することができる。結合したファージをトリプシン消化（ＰＢＳ中の１００μＬの１ｍｇ／ｍＬトリプシンで３０分間）することによって溶出する。また、結合したファージは０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．２を用いて溶出され得る。或いは、結合したファージは、ＣＴＬＤ、又は死受容体への結合についてＴＲＡＩＬと競合するペプチドについて選択するためにＴＲＡＩＬ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃから市販されている）を用いて溶出することができる。さらに、結合したファージは、死受容体結合についてＴＲＡＩＬと競合することが知られている化合物を用いて溶出することができる。
溶出されたファージは、ＯＤ６００が０．８である、１０ｍＬの新たに増殖させた細菌と共に１５分間インキュベートされ、感染細菌は、第２ラウンドのパンニングのためのファージを生じさせるために上記の通りに処理される。２又は３回の追加ラウンドの陽性パンニングを行う。
支持体に直接的又は間接的に結合されたＤＲ４及び／又はＤＲ５を用いる代わりに、がん細胞系によって内因的に発現された、又は２９３細胞などのトランスフェクトされた細胞によって発現されたＤＲ４及び／又はＤＲ５は、陽性選択の複数回ラウンドにおいて使用されてもよい。トランスフェクトされた細胞について、トランスフェクションは、パンニングの２日前、例えば、Ｑｉａｇｅｎ Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅ（商標）プロトコール、ＤＲ４又はＤＲ５を有するｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＥＰ４、又はｐＣＥＰ５などの適切な発現プラスミドを用いることによって行われる。トリプシン不含溶解緩衝液に細胞を溶解し、６×１０６個の細胞を２ｍＬのＩＭＤＭ緩衝液に再懸濁させる。パンニングされるべきファージは、細胞に添加される前に透析され、２時間、ＲＴでインキュベートされる。ＩＭＤＭ中でペレット化及び再懸濁を複数回行うことによって細胞を洗浄し、ファージをグリシン緩衝液で溶出する。
おとり受容体ではないが、ＤＲ４及び／又はＤＲ５に対して親和性を有するそれらのペプチドを選択するために、陰性選択ラウンド又は陽性選択と同時に陰性選択を行う。陰性選択は、おとり受容体ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、可溶性ＤｃＲ３及び／又はオステオプロテゲリン（ＯＰＧ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてなされる。ＯＰＧ及び可溶性ＤｃＲ３は市販され（ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、同様にＦｃｏｒ ＧＳＴにコンジュゲートされたＤｃＲ１及びＤｃＲ２も市販されている（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）。陰性選択ラウンドについて、おとり受容体は、プレート又はビーズに結合され、選択の陽性ラウンドについて上記の通りにブロックされる。ビーズは、陰性選択分子のより大きな表面積がパンニングされるライブラリーに曝露され得るためより望ましい。初代ライブラリー又は陽性選択の他のラウンドからのファージは、おとり受容体と共に２時間室温で、又は終夜４℃でインキュベートされる。次に、未結合ファージを取り除き、選択の陽性選択に供される。
また、陽性選択は、陰性選択と同時に行われる。可溶性ＤＲ４又はＤＲ５で被覆されたウェル又はビーズはブロックされ、初代ライブラリー又は上記される選択ラウンド由来のファージに曝露されるが、ＤｃＲ１などのおとり受容体は１０μｇ／ｍＬの濃度でインキュベートされる。インキュベーション時間は、ＤＲ４又はＤＲ５に対するより大きな特異性及び親和性を有するファージを得るために、この戦略において溶出前に２時間から数日間４℃にて延長されてもよい。また、ＤＲ５特異的結合物を得るためにＤＲ４を用いた、又はＤＲ４特異的結合物を得るためにＤＲ５を用いた陰性選択は、上記で詳述されたアプローチを用いて行うこともできる。
また、陰性選択は、１つ又は複数のおとり受容体を発現するがん細胞又はトランスフェクトされた細胞に対して行うこともできる。陰性選択は、ファージがインキュベーション後に細胞を遠沈させた後の上清から回収され、次に選択の陽性ラウンドにおいて用いられることを除いては、上記した通りに陽性選択と同様に行われる。
（例１２）
三量体ＴＲＡＩＬ受容体アゴニスト及び三量体ＣＴＬＡ誘導性ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストのプラスミド構築
ファージディスプレイ由来の、又はペプチドグラフト化された、ペプチド三量化ドメイン（ＴＤ）融合物、ペプチド−ＴＤ−ＣＴＬＤ融合物、若しくはそれらの種々の組み合わせ由来の三量体ＴＲＡＩＬ受容体アゴニスト及び三量体ＣＴＬＤ誘導性ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストの種々の変形体は、小スケール又は大スケール生成のために、細菌用発現ベクター（ハウスベクターにおけるｐＴ７、又はｐＥＴ、ＮｏｖａＧｅｎ）、及び哺乳動物用発現ベクター（ｐＣＥＰ４、ｐｃＤＮＡ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングされる。
プライマーは、例１からの種々の機能性ディスプレイベクター由来の結合物／アゴニストのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するために設計される。５’末端用のプライマーは、ＢａｍＨＩ制限部位を側面に有し、ベクターｐＴ７ＣＩＩＨ６のリーダー配列とインフレームになる。また、５’プライマーは、プロテアーゼであるグランザイム（Ｇｒａｎｚｙｍｅ）Ｂ又は第Ｘａ因子の切断部位と共に組み込まれてもよい。３’プライマーの側面にはＥｃｏＲＩ制限部位が位置する。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、次に、同じ酵素で消化されたｐＴ７ＣＩＩＨ６に連結し、細菌性発現ベクターｐＴ７ＣＩＩＨ６−ＴＲＡＩＬａを作製する。
ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストＤＮＡは、いずれのリーダー配列及び６×Ｈｉｓも含めずにベクターｐＴ７ＣＩＩＨ６又はｐＥＴ２８ａ（ＮｏｖｏＧｅｎ）にサブクローニングされ得る。５’プライマーの側面にはＮｄｅＩ制限部位が位置され、３’プライマーの側面にはＥｃｏＲＩ制限部位が位置される。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、同じ酵素で消化されたベクターに連結し、発現ベクターｐＴ７−ＴＲＡＩＬａ及びｐＥＴ−ＴＲＡＩＬａを作製する。
ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストＤＮＡは、分泌シグナルペプチドと共にベクターｐＴ７ＣＩＩＨ６又はｐＥＴ２８ａ（ＮｏｖｏＧｅｎ）にサブクローニングされ得る。発現されたタンパク質は細菌ペリプラズムに運び出され、分泌シグナルペプチドは移行中に除かれる。５’プライマーの側面にはＮｄｅＩ制限部位が位置され、これらのプライマーは細菌分泌シグナルペプチド、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ又はＯｍｐＴに組み込まれる。３’プライマーの側面にはＥｃｏＲＩ制限部位が位置される。６×Ｈｉｓタグのコーディング配列は、３’プライマーに任意に組み込まれてもよい。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、同じ酵素で消化されたベクターに連結し、発現ベクターｐＴ７−ｓＴＲＡＩＬａ、ｐＥＴ−ｓＴＲＡＩＬａ、ｐＴ７−ｓＴＲＡＩＬａＨｉｓ、及びｐＥＴ−ｓＴＲＡＩＬＨｉｓを作製する。
また、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストＤＮＡは、分泌シグナルペプチドと共に哺乳動物用発現ベクターｐＣＥＰ４又はｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングされ得る。発現されたタンパク質は培地に分泌され、分泌シグナルペプチドは分泌過程中に除かれる。５’プライマーの側面にはＮｄｅＩ制限部位が位置され、これらのプライマーはテトラネクチン分泌シグナルペプチド、又は別の分泌シグナルペプチド（例えば、Ｉｇペプチド）に組み込まれる。３’プライマーの側面にはＸｈｏＩ制限部位が位置される。６×Ｈｉｓタグは３’プライマーに任意に組み込まれてもよい。ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで消化し、同じ酵素で消化されたベクターに連結し、発現ベクターｐＣＥＰ４−ＴＲＡＩＬａ、ｐｃＤＮＡ−ＴＲＡＩＬａ、ｐＣＥＰ４−ＴＲＡＩＬａＨｉｓ、及びｐｃＤＮＡ−ＴＲＡＩＬａＨｉｓを作製する。
（例１３）
細菌由来のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストの発現及び精製
細菌発現構築物を細菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換する。新しいプレート上の単一コロニーは、振とうフラスコ中の１００ｍＬの２×ＹＴ培地に植菌される。フラスコは、２５０ｒｐｍで回転している振とう器で３７℃にて１２時間又は終夜インキュベートされる。終夜培養物（５０ｍＬ）を用いて、４Ｌ振とうフラスコ中の１Ｌの２×ＹＴを植菌する。ＯＤ６００が約０．７になるまで細菌をフラスコ中で培養し、その時点で最終濃度が１ｍＭになるまでＩＰＴＧを培養物に添加する。４時間の誘導後、細菌ペレットを遠心分離によって回収し、続くタンパク質精製のために確保する。
細菌発酵は、１０リットルの発酵槽中で供給バッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）条件下で行われる。１リットルの複合発酵培地には、５ｇの酵母エキス、２０ｇのトリプトン、０．５ｇのＮａＣｌ、４．２５ｇのＫＨ２ＰＯ４、４．２５ｇのＫ２ＨＰ０４・３Ｈ２Ｏ、８ｇのグルコース、２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び３ｍＬの微量金属溶液（２．７％ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ／０．２％ＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ／０．２％ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ／０．１５％Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ／０．１％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ／０．１％ＣｕＣｌ２／０．０５％Ｈ３ＢＯ３／３．７％ＨＣｌ）が含まれる。発酵槽は、終夜培養物（５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）で植菌され、一定の操作条件下、ｐＨ６．９（水酸化アンモニウム及びリン酸を用いて調節される）、３０℃にて増殖される。気流速度及び撹拌は、最小溶存酸素濃度を４０％に維持するために変えられる。培養物中のグルコース濃度が１ｇ／Ｌを下回ったときに供給（４０％グルコースを用いる）を開始し、グルコース濃度を発酵の残りの間、０．５ｇ／Ｌで維持する。ＯＤ６００が約６０に達したとき、最終濃度が０．０５ｍＭになるようにＩＰＴＧを培養物に添加する。誘導の４時間後、細胞を回収する。細菌ペレットを遠心分離によって得て、次のタンパク質精製のために−８０℃で保存する。
可溶性であり、細菌細胞のペリプラズムに分泌され、及び親和性タグを含む発現されたタンパク質（例えば、６×Ｈｉｓタグを付したタンパク質）は、当業者に周知である標準的なクロマトグラフィー法、例えば、金属キレート化クロマトグラフィー（例えば、Ｎｉアフィニティーカラム）、陰イオン／陽イオンアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又はそれらの任意の組み合わせを用いて精製される。
発現されたタンパク質は、細菌細胞において不溶性の封入体を形成し得る。これらのタンパク質は、初期の精製ステップにおいて変性条件下で精製され、続くリフォールディング処理を受け、それは精製クロマトグラフィーカラム上で行うことができる。細菌ペレットは、溶解緩衝液（０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、及び１ｍＭのＥＤＴＡ）に懸濁され、超音波処理される。封入体を遠心分離によって回収し、続いて６Ｍ塩化グアニジン、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、及び０．１ＭのＤＴＴを含む結合緩衝液に溶解される。溶解された部分をＮｉアフィニティーカラムに適用する。カラムから未結合材料を洗浄後、タンパク質を溶出緩衝液（６Ｍ塩化グアニジン、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、２５０ｍＭイミダゾール）を用いて溶出する。単離されたタンパク質は、結合緩衝液に緩衝液交換され、Ｎｉ＋カラムに再度適用され、変性剤を除去する。カラムに充填されると、タンパク質は、変性剤（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＣａＣｌ２）を含まない緩衝液の５Ｃ．Ｖ．（カラム容積）を用いた直線勾配（０〜０．５ＭのＮａＣｌ）によってリフォールドされる。０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、及び２５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液を用いてタンパク質を溶出する。融合タグ（６×Ｈｉｓ、ＣＩＩ６Ｈｉｓ）は、第Ｘａ因子又はグランザイムＢで切断され、Ｎｉ＋−ＮＴＡアフィニティーカラムを通過させることによってタンパク質試料から除かれる。緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０及び２ｍＭのＣａＣｌ２）の１０Ｃ．Ｖ．全体で直線勾配（０〜０．５ＭのＮａＣｌ）を用いて、Ｑ−セファロース（ＧＥ）上のイオン交換クロマトグラフィーによってタンパク質をさらに精製する。１×ＰＢＳ緩衝液中にタンパク質を透析する。任意に、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｅフィルター（ＰＡＬＬ）を通過させることによって内毒素を除いてもよい。
ペリプラズムの発現タンパク質について細菌細胞からの可溶性抽出物を調製するために、細菌ペレットを泳動緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ６．０）中に懸濁し、超音波処理（又は、二者択一的にフレンチプレス）を用いて溶解する。遠心管に不溶性部分を遠沈後、可溶性抽出物をＳＰ ＦＦカラム（ＧＥ）に適用する。また、ペリプラズム抽出物を浸透圧衝撃又は「ソフト」超音波処理によって調製する。分泌された可溶性６×Ｈｉｓタグ化されたタンパク質は、上記される通りＮｉ＋−ＮＴＡカラムによって精製される。粗抽出物は、アフィニティーカラム泳動緩衝液に緩衝液交換され、次にＳＰ ＦＦカラムに適用される。４Ｃ．Ｖ．の泳動緩衝液で洗浄後、タンパク質は、高塩緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）による８Ｃ．Ｖ．全体で１００％勾配を用いて溶出される。溶出物は、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｅフィルターを通過させてろ過され、内毒素を除く。部分的に精製されたタンパク質は、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４に緩衝液交換され、次にＱ ＦＦカラムに充填される。１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０による７Ｃ．Ｖ．で洗浄後、タンパク質は、高塩緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０、０．５ＭのＮａＣｌ）による８Ｃ．Ｖ．全体で１００％勾配を用いて溶出される。再度、内毒素は、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｅフィルターを通過させることによって除去される。
（例１４）
哺乳動物由来のＴＲＡＩＬ受容体アゴニストの発現及び精製。
各発現構築物用のプラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｍａｘｉ Ｐｅｒｐ Ｋｉｔを用いて調製される。プラスミドを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を一過性にトランスフェクトする。組織培養上清は、トランスフェクション後の２〜４日間、タンパク質精製のために回収される。
大スケール生成について、ＣＨＯ又はＰＥＲ．Ｃ６細胞における安定な細胞系を開発して、ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストを過剰発現させる。細胞（５×１０８）を２０Ｌバイオリアクター（Ｗａｖｅ）中の２．５Ｌの培地に植菌する。細胞が２倍になったとき、新鮮な培地（１×開始体積）を添加し、最終体積が１０Ｌに到達するまで細胞が２倍になったときに続けて添加される。細胞生存率が２０％まで下がるまで、約１０日間細胞を培養する。次に、細胞培養上清を精製のために回収する。
Ｈｉｓタグ化タンパク質精製（Ｎｉ＋−ＮＴＡカラムによる）と非タグ化タンパク質精製（イオン交換クロマトグラフィーによる）の両方は、上記で詳述された通り使用される。
（例１５）
インシリコモデリングによって支援されるＴＲＡＩＬ受容体アゴニストの親和性成熟。
インシリコモデリングは、ＣＴＬＤファージディスプレイライブラリースクリーニングから同定される親和性成熟ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストに用いられる。アゴニストホモロジーモデルは、既知のテトラネクチン３Ｄ構造に基づいて構築される。アゴニストのホモロジーモデルのループ立体構造は、ＬＯＯＰＥＲ（ＤＳ２．１、Ａｃｃｅｌｒｙｓ）及びそれらの関連アルゴリズムを用いて精緻化され、最適化される。このプロセスには３つの基本ステップが含まれる：１．ループ骨格とタンパク質の残りとの最適化された相互作用を用いた１セットの可能なループ配座異性体の構築；２．ループ側鎖の構築と構造最適化、及び全てのループ原子に適用されるエネルギー最小化；３．ループ配座異性体の維持された改変体の最終スコアリング及びランキング。ＤＲ４／ＤＲ５細胞外ドメインに位置された潜在的な結合領域又はエピトープは、マニュアル及び分子動力学ベースのドッキングの組み合わせを用いて、アゴニストについて同定される。さらに、結合ドメインは、ＤＲ４／ＤＲ５細胞外ドメイン（単数又は複数）の欠失又は点突然変異及びアゴニストを用いた結合アッセイを行うことによって確認される。結合特異性の決定に関与されるアミノ酸残基（又は配列）は、ＤＲ４／ＤＲ５とＴＲＡＩＬ ＣＴＬＤアゴニストの両方について画定される。種々の標的位置でのランダム突然変異の組み合わせは、構造鋳型との適合性を決定するために、構造ベースの計算を用いてスクリーニングされる。見掛けの充填欠陥の分析に基づいて、ファージディスプレイ用のライブラリーを構築するために突然変異誘発について残基が選択される。
ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストペプチド及びＤＲ４／ＤＲ５の３Ｄモデルは、ペプチドをグラフト化したＣＴＬＤ及びＤＲ４／ＤＲ５モデリングを精緻化するために参照として用いることができる。ＴＲＡＩＬ受容体アゴニストペプチドがＣＴＬＤループにグラフト化されるとき、ループ立体構造は、インシリコモデリングを用いて、側面にある周囲のアミノ酸残基を変化させることによって、アゴニストペプチド／ＤＲ４／ＤＲ５結合を適合するために最適化され、再表面化される。ペプチドをグラフト化されたＣＴＬＤアゴニストホモロジーモデルは、既知のテトラネクチン３Ｄ構造に基づいて構築される。アゴニストのホモロジーモデルのループ立体構造は、上記される通り、ＬＯＯＰＥＲ（ＤＳ２．１、Ａｃｃｅｌｒｙｓ）及びそれらの関連アルゴリズムを用いて精緻化され、最適化される。種々の標的位置でのランダム突然変異の組み合わせは、構造鋳型とのそれらの適合性について構造ベースの計算によってスクリーニングされる。見掛けの充填欠陥の分析に基づいて、ペプチドの側面及び周囲にあるアミノ酸残基はファージディスプレイ用のライブラリーを構築するために突然変異誘発について選択される。
（例１６）
がん細胞増殖の阻害
ＤＲ４及び／又はＤＲ５を発現するヒトがん細胞系、例えば、ＣＯＬＯ２０５（結腸直腸腺癌）、ＮＣＩ−Ｈ２１２２（非小細胞肺がん）、ＭＩＡ ＰａＣａ−２（膵臓癌）、ＡＣＨＮ（腎細胞癌）、ＷＭ７９３Ｂ（黒色腫）及びＵ２６６Ｂ１（リンパ腫）（これら全てはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入される）は、各細胞系に適した条件下で培養され、細胞密度を５，０００〜２０，０００細胞／ウェル（各がん細胞系の増殖曲線によって適切に決定される）にして播種される。ＤＲ４／５アゴニスト分子は、０．０００１〜１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で添加される。任意に、ＤＲ４／ＤＲ５アゴニストは、化学療法（例えば、ボルテゾミブ）を含む治療法、又は放射線によって前感作される細胞と組み合わせられ、ＤＲ４若しくはＤＲ５を上方制御するか又はカスパーゼ活性を変更する相乗効果を生じさせてもよい。生存細胞数は、製造業者の指示書に従って、「ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔａｉｏｎ Ａｓｓａｙ」（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、２４時間後と４８時間後に評価され、ＤＲ４／ＤＲ５アゴニストに対するＩＣ５０濃度を決定する。
（例１７）
がん細胞系におけるＤＲ５及びＤＲ４アゴニスト分子によるカスパーゼの活性化
ＤＲ４及び／又はＤＲ５を発現するヒトがん細胞系、例えば、ＣＯＬＯ２０５（結腸直腸腺癌）、ＮＣＩ−Ｈ２１２２（非小細胞肺がん）、ＭＩＡ ＰａＣａ−２（膵臓癌）、ＡＣＨＮ（腎細胞癌）、ＷＭ７９３Ｂ（黒色腫）及びＵ２６６Ｂ１（リンパ腫）（これら全てはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入される）は、各細胞系に適した条件下で培養され、細胞密度を５，０００〜２０，０００細胞／ウェル（各がん細胞系の増殖曲線によって適切に決定される）にして播種される。ＤＲ４／５アゴニスト分子は、０．０００１〜１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で添加される。ＤＲ４／ＤＲ５アゴニストは、化学療法（例えば、ボルテゾミブ）などの他の治療法、又は放射線によって前感作される細胞と組み合わせることができ、このような組み合わせがＤＲ４若しくはＤＲ５の上方制御又はカスパーゼ活性の変更に対して相乗効果を有するかどうかを決定することができる。カスパーゼ活性は、製造業者の指示書に従って、「ＡＰＯ−ＯＮＥ Ｃａｓｐａｓｅ ａｓｓａｙ」（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、種々の時間点で決定される。
ウェスタンブロットによるさらなる分析は、上記した通り、２×１０６個の腫瘍細胞をインキュベートすることによって行われる。続く細胞溶解物は、ウェスタンブロット用に調製される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、ニトロセルロースメンブレンに移す。フィルターは、アポトーシスタンパク質ＰＡＲＰ、カスパーゼ３、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ｂｉｄ及びアクチンのプロ形態及び切断形態を認識する抗体と共にインキュベートされる。特異的タンパク質に対応するバンドは、ＨＲＰコンジュゲートされた二次抗体及び増大された化学発光によって検出される。
（例１８）
腫瘍異種移植モデルにおけるアゴニスト分子評価
がん細胞系（例えば、ＨＣＴ−１１６、ＳＷ６２０、ＣＯＬＯ２０５）をＢａｌｂ／ｃヌードマウス又はＳＣＩＤマウスに皮下注射する。腫瘍の長さと幅は、キャリパーを用いて１週間に２回測定される。腫瘍の大きさが２５０ｍｍ３に達したとき、マウスをランダム化し、静脈内又は皮下に１０〜１００ｍｇ／ｋｇのＤＲ４又はＤＲ５アゴニストで処置する。処置は、化学療法（例えば、イリノテカン、ボルテゾミブ、若しくは５ＦＵ）などの他の治療法又は放射線処置と組み合わせてもよい。腫瘍サイズが１５００ｍｍ３に達していない場合、腫瘍サイズを３０日間観測し、その場合にはマウスを屠殺する必要がある。
（例１９）
ヒトＤＲ４及びＤＲ５に対するヒトライブラリー１〜４のパンニング
１．ＤＲ４受容体に対するパンニング
ウェルあたり１００μＬのＰＢＳに希釈されたキャリアー不含の標的抗原の２５０ｎｇ〜１μｇで結合される前夜に新たに調製された、ＤＲ４／Ｆｃ抗原被覆（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）ウェル上のヒトＣＴＬＤのヒトループ１〜４ライブラリーを用いてパンニングを行った。抗原プレートを終夜４℃、次に１時間３７℃にてインキュベートし、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で２回、及びＰＢＳで２回洗浄し、続いて１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間３７℃にてパンニング前にブロックした。各ラウンドでは６ウェルを用い、精製されたファージ上清ストックの２点測定で、未希釈、１：１０希釈、及び１：１００希釈を用いて２時間３７℃にてウェルにファージを結合させた。標的抗原はＦｃ融合タンパク質として発現されたため、ファージ上清ストックは可溶性競合因子として作用する１μｇ／ｍＬの可溶性ＩｇＧ１ Ｆｃを含んだ。さらに、標的抗原結合前に、ファージ上清は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃと共に抗原ウェルに予め結合され、Ｆｃ結合物を除いた（可溶性ＩｇＧ１ Ｆｃ競合因子は予め結合中には存在しなかった）。
初期ラウンドのパンニングのためのファージを生成するために、１０μｇのライブラリーＤＮＡをエレクトロコンピテントＴＧ−１細菌に形質転換し、４０μｇ／ｍＬカルベニシリン及び２％グルコースと共にＳＢを含む１００ｍＬの培養物中で１時間３７℃にて増殖させた。次に、カルベニシリン濃度を５０μｇ／ｍＬに増大させ、培養物をさらに１時間増殖させた。続いて、培養体積を５００ｍＬに増加させ、感染の多重度（ＭＯＩ）を５×１０９ｐｆｕ／ｍＬにしたヘルパーファージで培養物を感染し、さらに１時間３７℃にて増殖させた。細菌を遠沈し、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン及び１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含む５００ｍＭのＳＢ中に再懸濁し、終夜室温にて２５０ｒｐｍで振とうしながら増殖させた。翌日、細菌を遠沈で除き、最終濃度が４％のＰＥＧ／０．５ＭのＮａＣｌを用いて氷上で１時間、ファージを沈殿させた。次に、沈殿したファージを１０，５００ｒｐｍで２０分間４℃にて遠沈させた。Ｒｏｃｈｅ ＥＤＴＡ不含完全プロテアーゼ阻害剤を含む１％ＢＳＡ／ＰＢＳにファージペレットを再懸濁させた。続いて、再懸濁されたファージは、遠沈管において１０分間、１３，２００ｒｐｍで遠沈させ、０．２μＭのフィルターを通過させて残渣の細菌を除いた。
上記される通り、ウェルあたり５０μＬの精製されたファージ上清ストックは、ＩｇＧ Ｆｃ被覆ウェルに１時間３７℃にて予め結合され、次に、適切に希釈された標的抗原被覆ウェルに２時間３７℃にて移された。その後、ウェルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で５分間、ピペットを上下して洗浄した（ラウンド１で１回洗浄、ラウンド２で５回洗浄、及びラウンド３及び４で１０回洗浄）。標的抗原に結合されたファージは、６０μＬ／ウェルの酸溶出緩衝液（グリシン ｐＨ２）で溶出され、２ＭのＴｒｉｓ ３．６μＬ／ウェルで中和された。次に、溶出されたファージを用いて、１５分間室温にてＴＧ−１細菌（２ｍＬ、ＯＤ６００が０．８〜１．０）を感染した。培養体積は、４０μｇ／ｍＬカルベニシリン及び２％グルコースを含むＳＢ中１０ｍＬにされ、２５０ｒｐｍで振とうしながら１時間３７℃にて増殖された。次に、カルベニシリン濃度を５０μｇ／ｍＬに増加させ、培養物をさらに１時間増殖させた。その後、培養体積を１００ｍＬに増大させ、ＭＯＩが５×１０９ｐｆｕ／ｍＬであるヘルパーファージで培養物を感染し、さらに１時間３７℃にて増殖した。細菌を遠沈し、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン及び１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含む１００ｍＬのＳＢに再懸濁し、２５０ｒｐｍで振とうしながら終夜室温にて増殖させた。続くラウンドのパンニングは、同様にしてより小さな培養体積に調整して行い、後のラウンドにて洗浄回数を増やした。４ラウンドのＤＲ４／Ｆｃに対してクローンをパンニングし、スクリーニングラウンド３及び４からクローンを得た。
２．ファージＥＬＩＳＡ
少なくとも４ラウンドについて、細菌のＴＧ−１菌株を用いてパンニングを行った。パンニングの各ラウンドで、試料力価を測定し、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン及び２％グルコースを含むＬＢプレート上にプレーティングした。受容体標的へのファージミドクローンの特異的結合についてスクリーニングするために、個々のコロニーは、後のラウンドのパンニングからのこれらのタイタープレートから採取され、上部に空気浸透性メンブレンを有するポリプロピレン製９６ウェルプレートにおいて、２％グルコース及び５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含む２５０μＬの２×ＹＴ培地中で２５０ｒｐｍで振とうしながら終夜室温にて増殖させた。翌日、３０μＬの前回の終夜培養物を用いて、２％グルコース及び５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含む５００μＬの２×ＹＴを植菌することによって、複製プレートを９６ウェル深底ウェルに設定した。残りの終夜培養物を用いて、１００μＬの５０％グリセロールを各ウェルに添加し、−８０℃にて保存することによってマスターストックプレートを作製した。複製培養プレートを、ＯＤ６００が０．５〜０．７になるまで約２時間２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃にて増殖させた。次に、ウェルは、５×１０９ｐｆｕ／ｍＬにてＫ０７ヘルパーファージを感染させ、混合し、振とうせずに３７℃にて３０分間インキュベートし、次に、さらに３０分間、３７℃にて２５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。その後、培養物を２５００ｒｐｍにて４℃で２０分間遠沈した。上清をウェルから除き、細菌細胞ペレットを、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン及び５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む５００μＬの２×ＹＴに再懸濁した。空気浸透性メンブレンを培養ブロックに設置し、細胞を２５０ｒｐｍで振とうしながら終夜室温にて増殖させた。
第３日に、培養物を遠沈し、ファージを含む上清を３％ミルク／ＰＢＳを用いて１時間室温にてブロックした。初期のファージＥＬＩＳＡは、ウェルあたり７５〜１００ｎｇの結合された抗原を用いて行われた。非特異的結合は、ウェルあたり７５〜１００ｎｇのヒトＩｇＧ１ Ｆｃを用いて測定された。ＤＲ４／Ｆｃ抗原（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）被覆ウェル及びＩｇＧ Ｆｃ被覆ウェルは、ウェルあたり１００μＬのＰＢＳにて希釈された上記量の抗原を結合させることによって、前夜に新たに調製された。抗原プレートを終夜４℃にて１時間インキュベートし、次に１時間３７℃にてインキュベートし、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で２回、及びＰＢＳで２回洗浄し、続いてＥＬＩＳＡ前に３％ミルク／ＰＢＳを用いて１時間ブロックした。ブロックされたファージを、ブロックされた抗原結合プレートに１時間結合させ、次に０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳで２回洗浄し、その後ＰＢＳでさらに２回洗浄した。続いて、３％ミルク／ＰＢＳにて希釈された、ＨＲＰコンジュゲートされた抗Ｍ１３二次抗体を適用し、上記した通り、１時間結合し、洗浄した。９０μＬのＴＭＢ基質ミックスを用いてＥＬＩＳＡシグナルを生じさせ、次に９０μＬの０．２Ｍ硫酸で停止させ、その後、ＥＬＩＳＡプレートを４５０ｎｍで読み込んだ。二次ＥＬＩＳＡスクリーニングは、同定された陽性結合クローンに対して行われ、特異性（ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１及びＤｃＲ２）について試験するために、さらなるＴＲＡＩＬ受容体及びおとり受容体に対するスクリーニングが行われた。二次ＥＬＩＳＡスクリーニングは、上記で詳述されたプロトコールと同様にして行われた。
ＤＲ４特異的結合クローン。ヒトＴＮ１〜４ライブラリーからＤＲ４受容体への特異的結合について選択されるループ１と４に対するアミノ酸配列の例を以下の表５に詳述する。
Figure 2013507123
Figure 2013507123
３．ＤＲ５受容体に対するパンニング
ＤＲ５受容体に対するパンニングは、５ラウンドのパンニングが行われ、ｇＧ１ ＦｃというよりはむしろＢＳＡで被覆されたウェル上で予め結合が行われたことを除いて、ＤＲ４受容体について上記で詳述したのと同様に行われた。しかしながら、ファージ上清ストックは、各ラウンド中のＦｃ結合について可溶性競合因子として作用する可溶性ＩｇＧ１ Ｆｃを含んだ。ＤＲ５特異的結合クローンはラウンド５からスクリーニングにより得られた。ＤＲ５特異的結合についてクローンから得られたループ１と４についてのアミノ酸配列を以下の表６に示す。
Figure 2013507123
Figure 2013507123
上述した通り、ループ１は、スクリーニングされたライブラリーにおいて７つのランダム化されたアミノ酸を含み、一方、ループ４は、２つの天然のアミノ酸に代えて５つのランダム化されたアミノ酸の挿入物を有した（表６において下線が付された領域）。変更ループにおいてグルタミン（Ｑ）を有するいくつかのクローンにおいて、アンバーの抑制可能な終止コドン（ＴＡＧ）はグルタミンをコードし、これは小文字「ｑ」で示される。パンニング中、これらの領域の外側での変化を含むいくつかのクローンは、例えば、ループ４において同定され、カルボキシを側面に有するアミノ酸は、いくつかの場合においてＥからＫに変更されている。
（例２０）
ヒトＤＲ４及びＤＲ５受容体に対するＡＴＲＩＭＥＲ（商標）結合物のサブクローニング及び生成
ループ領域ＤＮＡ断片は、ＢｇｌＩＩ及びＭｆｅＩ制限酵素を用いた二重消化によってＤＲ４／ＤＲ５結合物ＤＮＡから放出され、細菌用発現ベクターｐＡＮＡ４（配列番号５４）、ｐＡＮＡ１０（配列番号６０）又はｐＡＮＡ１９に連結され、大腸菌において分泌されるＡＴＲＩＭＥＲ（商標）を生成した。
発現構築物を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天上に細菌をプレーティングした。新しいプレート上の単一コロニーは、アンピシリンを含む２×ＹＴ培地に植菌された。ＯＤ６００が０．５に達するまで、２００ｒｐｍで振とう器において培養物を３７℃にてインキュベートし、次に室温に冷却した。アラビノーシス（Ａｒａｂｉｎｏｓｉｓ）を最終濃度が０．００２〜０．０２％になるまで添加した。１２０〜１５０ｒｐｍで振とうしながら、終夜室温にて誘導を行い、その後、細菌を遠心分離によって回収した。ペリプラズムタンパク質を浸透圧衝撃又は穏やかな超音波処理によって抽出した。
６×Ｈｉｓタグ化されたＡＴＲＩＭＥＲ（商標）をＮｉ＋−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。要約すると、ペリプラズムタンパク質をＨｉｓ結合緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）において再構築し、Ｈｉｓ結合緩衝液で予め平衡にしたＮｉ＋−ＮＴＡカラムに充填した。１０×体積の結合緩衝液でカラムを洗浄した。溶出緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）を用いてタンパク質を溶出した。精製されたタンパク質をＰＢＳ緩衝液中で透析し、細菌内毒素を陰イオン交換によって除去した。
ＳｔｒｅｐＩＩタグ化されたＡＴＲＩＭＥＲ（商標）をＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。要約すると、ペリプラズムタンパク質は１×結合緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）において再構築し、結合緩衝液で予め平衡にしたＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎカラムに充填した。１０×体積の結合緩衝液でカラムを洗浄した。溶出緩衝液（２．５ｍＭデスチオビオチンを含む結合緩衝液）でタンパク質を溶出させた。精製されたタンパク質を結合緩衝液中で透析し、細菌の内毒素を陰イオン交換によって除去した。
ループ領域のＤＮＡ断片を哺乳動物用発現ベクターｐＡＮＡ２（配列番号５２）及びｐＡＮＡ１１（配列番号６１）にサブクローニングし、ＨＥＫ２９３一過性発現系においてＡＴＲＩＭＥＲ（商標）を生成した。ループ領域のＤＮＡ断片は、ＢｇｌＩＩ及びＭｆｅＩ制限酵素を用いた二重消化によってＩＬ−２３Ｒ結合物ＤＮＡから放出され、ＢｇｌＩＩ及びＭｆｅＩで予め消化された発現ベクターｐＡＮＡ２及びｐＡＮＡ１１に連結された。発現プラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ）により細菌から精製された。ＨＥＫ２９３付着細胞について、一過性トランスフェクションは、製造業者のプロトコールに従って、Ｑｉａｇｅｎ ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ）によって行われた。トランスフェクションの翌日、培地を除き、２９３Ｉｓｏｐｒｏ血清不含培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に交換した。２日後、０．５ＭのＨＥＰＥＳ中の２０％グルコースを最終濃度が１％となるように培地に添加した。組織培養上清を精製のためにトランスフェクション後の４〜７日間回収した。ＨＥＫ２９３Ｆ懸濁細胞について、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３Ｆｅｃｔｉｎ及びそのプロトコールにより一過性トランスフェクションを行った。翌日、１×体積の新鮮な培地を培養物に添加した。組織培養上清を精製のためにトランスフェクション後の４〜７日間回収した。哺乳動物組織培養上清からのＨｉｓ−又はＳｔｒｅｐＩＩタグ化されたＡＴＲＩＭＥＲ（商標）精製を上述の通り行った。
ループ領域のＤＮＡ断片を哺乳動物用発現ベクターｐＡＮＡ５（配列番号５５）、ｐＡＮＡ６（配列番号５６）、ｐＡＮＡ７（配列番号５７）、ｐＡＮＡ８（配列番号５８）及びｐＡＮＡ９（配列番号５９）にサブクローニングし、ＨＥＫ２９３一過性発現系において異なるＣＴＬＤ提示配向を有するＡＴＲＩＭＥＲ（商標）複合体を生成させた。ｐＡＮＡ５は、ヒトＴＮにおいてＣ末端Ｈｉｓタグ及びＶ４９欠損を含む修飾されたｐＣＥＰ４ベクターである。同様に、ｐＡＮＡ６はＴ４８欠損を有し、ｐＡＮＡ７はＴ４８及びＶ４９欠損を有する。ｐＡＮＡ８は、野生型ＴＮより柔軟なＣＴＬＤを生じさせるために、Ｃ５０、Ｃ６０→Ｓ５０、Ｓ６０二重突然変異を有する。ｐＡＮＡ９は、グリコシル化部位を除くために、Ｅ１−Ｖ１７欠損を有する。ループ領域のＤＮＡ断片は、ＢｇｌＩＩ及びＭｆｅＩ制限酵素を用いた二重消化によってＩＬ−２３Ｒ結合物ＤＮＡから放出され、ＢｇｌＩＩ及びＭｆｅＩを用いて予め消化された発現ベクターｐＡＮＡ５、ｐＡＮＡ６、ｐＡＮＡ７、ｐＡＮＡ８及びｐＡＮＡ９に連結された。
（例２１）
Ｂｉａｃｏｒｅを用いたヒトＤＲ４及びＤＲ５受容体結合物の親和性の特徴づけ
三量体ＤＲ４及びＤＲ５結合物の見掛けの親和性をそれぞれ表７及び８に示す。ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）への抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ）の固相化は、標準的なアミンカップリング化学を用いて行われ、この表面を用いて、組換えヒトＤＲ４又はＤＲ５受容体Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を捕捉した。ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ＣＯＭＰＬＥＸ希釈物（１〜５００ｎＭ）を３０μｌ／分でＩＬ−２３受容体表面全体に注入され、速度定数は、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン３．１、Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いてセンサーグラムデータから導かれた。データ回収は、結合のための３分間、及び解離のための５分間であった。抗ヒトＩｇＧ表面は、３Ｍ塩化マグネシウムの３０秒パルスで再生された。全てのセンサーグラムは、活性化され、ブロックされたフローセル、並びに緩衝液注入に対して二重に参照された。
Figure 2013507123
Figure 2013507123
細胞アッセイの説明。
Ｈ２１２２肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｎｏｍａ）細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−５９８５）及びＡ２７８０卵巣癌細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、＃９３１１２５１９）は、９６ウェルの白色不透明プレート（Ｃｏｓｔａｒ）において、１０％ＦＢＳ／ＲＭＰＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＤＲ５ ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）（２０μｇ／ｍＬ）又はＴＲＡＩＬ（０．２μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に、１×１０４細胞／ウェルでインキュベートされた。対照ウェルに培地、及び各緩衝液：ＤＲ５ ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）についてはＴＢＳ及びＴＲＡＩＬについてはＰＢＳを入れた。２０時間後、細胞生存性をＶｉａＬｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ（Ｌｏｎｚａ）によって決定し、Ｇｌｏｍａｘルミノメータ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上で検出した。各緩衝液対照と比較した細胞死の割合としてデータを示した（図１０参照）。３点測定の平均及び標準誤差を、Ｅｘｃｅｌを用いてプロットした。５つのＤＲ５ ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ＣＯＭＰＬＥＸを試験した：４ａ８ｃ、２ａ１ａ、１ａ７ｂ、９ｂ３ｄ、及び８ｂ６ｂ。３つのＤＲ５ ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）（４ａ８ｃ、１ａ７ｂ及び８ｂ６ｂ）は、両細胞系において５０％を超える殺傷を示した。同様のデータは別の実験において観察された。
（例２２）
ヒトＤＲ５に対するＮＥＢペプチドライブラリーのパンニング及びＤＲ５特異的ペプチドの同定
ペプチドライブラリーのパンニングはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）Ｐｈ．Ｄ．ファージディスプレイライブラリーを用いて行われた。パンニングは、ウェルあたり１５０μＬの０．１ＭのＮａＨＣＯ３ ｐＨ８．６に希釈された３μｇの担体不含標的抗原で結合させる前夜に新たに調製されたＤＲ５／Ｆｃ抗原被覆された（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）ウェル上で行われた。２点測定のウェルを各ラウンドにおいて用いた。抗原プレートを終夜４℃にて、次に１時間３７℃にてインキュベートした。抗原を除き、次にウェルは、パンニング前にＰＢＳ ｐＨ７．４中の０．５％煮沸カゼインを用いて１時間３７℃にてブロックされた。その後、カゼインを除き、続いてウェルを３００μＬのＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ）で６回洗浄し、次にファージを添加した。標的抗原はＦｃ融合タンパク質として発現されたので、標的抗原結合前に、ファージ上清は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを用いて、抗原ウェルに１時間予め結合され、Ｆｃ結合物を除いた（ラウンド２から４の間）。Ｆｃ抗原を結合させたウェルは、上記で詳述した通り、ＤＲ５／Ｆｃ抗原を結合したウェルと同様に調製された。
初期ラウンドのパンニングについて、１００μＬのＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ）を各ウェルに添加し、３つのＮＥＢペプチドライブラリー（Ｐｈ．Ｄ．−７、Ｐｈ．Ｄ．−１２、及びＰｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ）の各々の５μｌを各ウェルに添加した。１時間室温にてプレートをゆっくりと揺らし、次にＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ）で１０回洗浄した。結合したファージは、１００μｇ／ｍｌ濃度の可溶性ＤＲ５／Ｆｃ標的抗原を含む１００μＬのＰＢＳで溶出させた。ファージを室温にて１時間揺って溶出させた。次に、溶出させたファージをウェルから取り出し、それを用いて、ＯＤ６００ｎｍが０．０５〜０．１である２０ｍｌのＥＲ２７３８細菌を感染させ、２５０ｒｐｍで３７℃にて４．５時間振とうしながら増殖させた。続いて、細菌は、１２Ｋ×Ｇで２０分間、４℃にて培養物から遠沈で除いた。細菌を新しいチューブに移し、再度遠沈した。再度、上清を新しいチューブに移し、２０％ＰＥＧ／２．５ＭのＮａＣｌの６分の１体積を添加することによってファージを沈殿させた。ファージを終夜４℃にて沈殿させた。翌日、沈殿したファージを１２Ｋ×Ｇで２０分間４℃にて遠沈した。上清を捨て、ファージペレットを１ｍｌのＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ）に再懸濁させた。残渣の細菌は、１３．２Ｋで１０分間４℃にて微量遠心管に遠沈によって取り除かれた。次に、ファージ上清を新しいチューブに移し、２０％ＰＥＧ／２．５ＭのＮａＣｌの６分の１体積を添加し、４℃にて氷上で１時間インキュベートすることによって再度沈殿した。沈殿されたファージは、１３．２Ｋで１０分間４℃にて微量遠心管に遠沈された。上清を捨て、ファージペレットを２００μＬのＴＢＳに再懸濁した。続くラウンドのパンニングは、ファージがＦｃ被覆ウェルに１時間予め結合され、前のラウンドからの４μＬの増幅されたファージストックを結合中にウェルあたりで使用されたことを除いてラウンド１と同様に行われた。さらに、Ｔｗｅｅｎ濃度は、１０回の洗浄中に使用されたＴＢＳＴにおいて０．５％に増加された。
ファージＥＬＩＳＡ
パンニングは、少なくとも４ラウンドで細菌のＥＲ２７３８菌株を用いて行われた。パンニングの各ラウンドで、試料力価を測定し、ＬＢ／Ｘｇａｌプレート上の上部寒天を用いてプレーティングし、プラークを得た。受容体標的へのファージクローンの特異的結合をスクリーニングするために、個々のプラークは、後のラウンドのパンニングからのこれらのタイタープレートから採取され、これを用いてＯＤ６００ｎｍが０．０５〜０．１のＥＲ２７３８細菌に感染させ、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃にて４．５時間増殖させた。次に、４℃にて終夜保存した。
第２日、１２Ｋ×Ｇで２０分間４℃にて培養物を遠沈させ、ファージを含む上清を３％ミルク／ＰＢＳを用いて１時間室温にてブロックした。初期のファージＥＬＩＳＡは、ウェルあたり７５〜１００ｎｇのＤＲ５／Ｆｃ抗原結合を用いて行われた。非特異的な結合は、ウェルあたり７５〜１００ｎｇのヒトＩｇＧ１Ｆｃを含むウェルを用いて測定された。ＤＲ５／Ｆｃ抗原（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）被覆ウェル及びＩｇＧ１ Ｆｃ被覆ウェルは、ウェルあたり１００μＬのＰＢＳに希釈された上記量の抗原を結合させることによって、前夜に新たに調製された。抗原プレートを４℃にて終夜、次に３７℃にて１時間インキュベートし、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で２回、ＰＢＳで２回洗浄し、その後、ＥＬＩＳＡ前に３％ミルク／ＰＢＳで１時間３７℃にてブロックした。ブロックされたファージは、ブロックされた抗原結合プレートに１時間結合され、次に０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳで２回洗浄され、その後、ＰＢＳでさらに２回洗浄された。続いて、３％ミルク／ＰＢＳに希釈されたＨＲＰコンジュゲートされた抗Ｍ１３二次抗体を適用し、１時間結合させ、上記されるように洗浄した。ＥＬＩＳＡシグナルは、９０μＬのＴＭＢ基質ミックスを用いて生じさせ、次に、９０μＬの０．２Ｍ硫酸で停止させ、その後、ＥＬＩＳＡプレートを４５０ｎｍで読み込んだ。二次ＥＬＩＳＡスクリーニングは、同定された陽性結合クローン上で行われ、追加のＴＲＡＩＬ受容体及びおとり受容体に対してスクリーニングし、特異性（ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１及びＤｃＲ２）について試験した。二次ＥＬＩＳＡスクリーニングは、上記で詳述されたプロトコールと同様に行われた。
ＤＲ５特異的結合クローン。ＤＲ受容体に特異的に結合させるために選択されたＮＥＢ Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃファージライブラリー由来のペプチドのアミノ酸配列の例を下記の表９に詳述する。
Figure 2013507123
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例２３〜３２は、本発明のコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを用いて、ＩＬ−２３受容体に特異的に結合するＣＴＬＤポリペプチドを同定及び単離するための典型的な方法を提供する。
ＩＬ−２３は、Ｔｈ１７細胞の生成及び生存のために必須のサイトカインである。Ｔｈ１７細胞が、多数の自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、炎症性大腸炎、乾鮮、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び多発性硬化症の病理学において重要な役割を果たすという前臨床モデル及び臨床経験からの証拠が増加している。ＩＬ−２３ＲはＴｈ１７細胞に対する主要な標的である。同様に、ＩＬ−２３サイトカインは、２つのサブユニットであるｐ１９及びｐ４０から構成され、ｐ１９サブユニットはＩＬ−２３に固有であり、ｐ４０はＩＬ−１２と共有される。ＩＬ−２３受容体は、ＩＬ−２３に結合し、ある種のＴ細胞サブセット、ＮＫ細胞及び骨髄性細胞の活性化を仲介するヘテロ二量体受容体である。ＩＬ−２３ヘテロ二量体受容体は、２つのサブユニットであるＩＬ−２３Ｒ及びＩＬ−１２Ｒβ１から構成され、ＩＬ−２３ＲはＩＬ−２３経路に固有のサブユニットである。ＩＬ−１２Ｒβ１はＩＬ−１２受容体、したがってＩＬ−１２経路と共有される。
重要なことには、ＩＬ−２３Ｒにおける遺伝的変異は、乾鮮及びクローン病への感受性と関連し、さらに、強直性脊椎炎、フォークト−コヤナギ−ハラダ病、全身性硬化症、ベーチェット病（ＢＤ）、原発性シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候への感受性に関与している。また、移植片対宿主拒絶反応及び慢性潰瘍におけるＩＬ−２３の重要性が示唆され、ＩＬ−２３は腫瘍形成に関与している。
ＩＬ−２３経路のブロックは、自己免疫疾患の多数の前臨床モデルにおいて有効である。しかしながら、ＩＬ−２３とＩＬ−１２経路の間の共有されるリガンド及び受容体サブセットの性質は、従来承認されたものよりも複雑な生物学をもたらし、ＩＬ−１２ブロックからのＩＬ−２３ブロックの分離は、有効性と安全性の両方に関する重要な治療的関連性を有するようである。一方若しくは他方、又は両方のブロックは、サイトカインサブユニット又は受容体サブユニットのレベルで行われ得る。
（例２３）
ヒトライブラリー１〜４のパンニング及びスクリーニング
ヒトライブラリー１〜４から生成されたファージは、組換えヒトＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び組換えマウスＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対してパンニングされた。ＥＬＩＳＡプレートアッセイを用いた、３、４、及び／又は５ラウンドのパンニング後のこれらの結合パネルのスクリーニングは、全ての場合において受容体特異的結合物を同定した。
パンニング用のファージを生成するために、マスターライブラリーＤＮＡをエレクトロポレーションによって細菌株ＴＧ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。ＳＯＣ（異化代謝産物抑制を有するスーパーオプティマル（Ｓｕｐｅｒ−Ｏｐｔｉｍａｌ）ブロス）培地中で３７℃にて振とうしながら１時間、細胞を回復させ、その後、最終濃度が２０％グルコース及び２０μｇ／ｍＬカルベニシリンとなるようにスーパーブロス（ＳＢ）を添加することによって１０倍体積に増加させた。３７℃にて１時間振とう後、さらに１時間、カルベニシリン濃度を５０μｇ／ｍＬに増加させ、その後、２％グルコース及び５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含む４００ｍＬのＳＢを、最終濃度が５×１０９ｐｆｕ／ｍＬになるようにヘルパーファージＭ１３Ｋ０７と共に添加した。３７℃にて、３０分間振とうせずに、次にさらに３０分間、１００〜１５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベーションを継続した。細胞を３２００ｇで４℃にて２０分間遠心分離し、次に、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン及び５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む５００ｍＬのＳＢ培地中に再懸濁させた。終夜室温（ＲＴ）にて、１５０ｒｐｍで振とうしながら細胞を増殖させた。１５，０００ｇで４℃にて２０分間遠心分離によって細菌細胞をペレット化することによりファージを単離した。上清は、氷上で３０分間、２０％ＰＥＧ／２．５ＭのＮａＣｌの４分の１体積（通常、２５０ｍＬの上清／ボトル＋６２．５ｍＬのＰＥＧ溶液）と共にインキュベートされた。１５，０００ｇ及び４℃にて２０分間遠心分離によってファージをペレットにした。ファージペレットは、製造業者の指示書に従って調製された、０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＢＳＡ ＰＢＳ／アジド）及び完全ミニＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）中に再懸濁させた。或いは、０．０５％煮沸カゼイン、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０、及びプロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液Ｄにファージを再懸濁させた。２５ｍｍ径、０．２μｍの孔サイズのＷｈａｔｍａｎ Ｐｕｒａｄｉｓｃフィルターを用いて材料をろ過滅菌した。
ヒトライブラリー１〜４から生成されたファージを、組換えヒトＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ＃１６８６−ＭＲ）についてパンニングした。ライブラリーパンニングは、プレート又はビーズフォーマットのいずれかを用いて行われた。プレートフォーマットについて、９６ウェルのＩｍｍｕｌｏｎ ＨＢ２ ＥＬＩＳＡプレートの６〜８ウェルは、ダルベッコＰＢＳ中の２５０〜１０００ｎｇ／ウェルの担体不含ヒトＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃで被覆された。材料をプレート上で終夜インキュベートし、その後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング緩衝液（０．０５％煮沸カゼイン（ｃａｓｓｅｉｎｇ）及び１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／アジド又は緩衝液Ｃのいずれか）を添加し、続いて、ウェルを少なくとも１時間３７℃にてインキュベートした。また、追加のウェルは、ブロッキング緩衝液に結合するファージの後の吸収のために、同時にブロッキング緩衝液で処理された。
３つに希釈したファージ調製物を用いた：ブロッキング緩衝液＋プロテアーゼ阻害剤において未希釈、１：１０、及び１：１００。いくつかのラウンドのパンニングにおいて、組換えヒトＩｇＧ１ Ｆｃは、最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように各希釈に添加された。ブロッキング緩衝液は、「ブロックのみ」（ブロッキングに対する前吸収）ウェルから除かれ、異なるファージ混合物はこれらのウェル中でさらに１時間３７℃にてインキュベートされた。各ファージ混合物の分割量（５０μＬ）は、洗浄及びブロックされた標的ウェルに移され、２時間３７℃にてインキュベートされた。第１ラウンドのパンニングについて、結合したファージを１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ又は緩衝液Ｄのいずれかで１回洗浄し、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むグリシン緩衝液、ｐＨ２．２を用いて溶出した。２ＭのＴｒｉｓ塩基（ｐＨ１１．５）で中和後、溶出されたファージは、酵母エキス−トリプトン（ＹＴ）培地中で、６００ｎｍで測定された約０．９の光学濃度（ＯＤ６００）である、２〜４ミリリットルのＴＧ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＲ２７３８（Ｌｕｃｉｇｅｎ若しくはＮＥＢ）、又はＳＳ３２０（Ｌｕｃｉｇｅｎ）細胞と共に、１５分間室温にてインキュベートされた。上記のプロトコールを用いてこの感染からファージを調製したが、約２０％（体積）スケールダウンさせた。溶出されたファージから調製されたファージを追加ラウンドのパンニングに供した。各ラウンドで、インプット及びアウトプットのファージの力価を適切な抗生物質を用いて寒天上に播種することによって決定し、これらのプレートからのコロニーを後にＥＬＩＳＡによって結合物についてスクリーニングするために用いた。
追加ラウンドのパンニングは、第２ラウンドのパンニングにおいて洗浄を５回まで増やし、続くラウンドにおいて洗浄を１０回に増やしたことを除いて、上記されるように行われた。３〜６ラウンドのパンニングを行った。最終ラウンドのパンニングについては、ファージは感染後に生成されなかった；むしろ、感染された細菌を終夜増殖させ、ｍａｘｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎキット）をＤＮＡから調製した。インプットファージのグリセロールストック（１５％）を各ラウンドから凍結（−８０℃にて）保存した。
ビーズパンニングフォーマットについて、製造業者の指示書に従って、ヒトＩＬ−２３Ｒをビオチン化し、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳマイクロビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製した。ファージは、ファージペレットがＰＢＳ中の０．５％煮沸カゼイン、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ ２０、及び追加されたＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含むカゼイン緩衝液中に懸濁されたことを除いて、上記プロトコールのようにマスターライブラリーからパンニング用に生成された。マグネットを用いて、ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｍｙｏｎｅ Ｔ１ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各々５０μＬ又は０．５ｍｇ含む２つのチューブ）を０．５％煮沸カゼイン、１％Ｔｗｅｅｎ ２０中で数回洗浄し、防腐剤を除いた。ファージプレップの１５０μＬ分割量を３０分間３７℃にてビーズの１つのチューブと共にプレインキュベートし、ストレプトアビジン結合物を除いた。次に、ファージプレップをビーズから取り出し、１μｇのビオチン化ＩＬ−２３Ｒを１００μｇ／ｍＬのヒトＦｃの１０μＬと共に添加し、２時間３７℃にて回転させながらインキュベートした。続いて、この材料を洗浄したビーズの残りのチューブに添加し、３７℃にて３０分間インキュベートした。磁気スタンドを用いて、ビーズをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。グリシン、ｐＨ２．０を用いてファージを溶出させ、中和し、上述されるように細菌を感染させるために用いた。続くラウンドのパンニングにおいて、ビーズに結合されたファージを溶出前に１０回洗浄した。インプット及びアウトプットのファージの力価を上記の通り決定した。
ＥＬＩＳＡスクリーニングについて、後期ラウンドのパンニング由来のコロニーは、２％グルコース及び抗生物質を含むＹＴ培地中で終夜増殖させ、次に、各々の分割量を用いてＯＤ６００が０．５になるまで増殖させる新鮮な培養物で開始する。ヘルパーファージを５×１０９ｐｆｕ／ｍＬになるまで添加し、３０分間３７℃にて感染させ、次に３７℃で撹拌しながら増殖させた。細菌を遠心分離し、カルベニシリンとカナマイシンを含むＹＴ培地に再懸濁し、終夜、ファージ生成のために増殖させた。次に、細菌をペレット化し、培地を除き、６×ＰＢＳ、１８％ミルクの５分の１体積（１：５のミルク混合物：上清）と混合した。７５〜１００ｎｇ／ウェルの組換えヒトＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃを含む５０〜１００μＬのＰＢＳと共に終夜４℃にてインキュベートすることによってＥＬＩＳＡプレートを調製した。ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で被覆された２点測定のプレートを対照として用いた。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、１×ＰＢＳ中の３％ミルクで１時間３７℃にてブロックし、１００μＬ／ウェルの各ミルク処理されたファージ混合物で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で１回、及びＰＢＳで２回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートされた抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳ／ＴｗｅｅｎとＰＢＳでそれぞれ３回洗浄し、ＴＭＢ基質（ＶＷＲ）と共にインキュベートした。硫酸を添加して呈色反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み込み、陽性結合物を同定した。
ヒトＩＬ−２３Ｒに対する結合物を第３と第４ラウンドのパンニングから同定した。ヒトＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃキメラに対するファージディスプレイされたＣＴＬＤ結合物からのループ１と４のランダム化領域由来の配列の例を表１１に示す。これらのデータの調査は、３６の結合物のうち３１について、ループ４のランダム化領域においてモチーフが明らかであることを示唆した：第２と第５のアミノ酸が通常グリシンであり、第４のアミノ酸が通常環状アミノ酸であるトリプトファン又はフェニルアラニンのうちの１つであり、第１のアミノ酸が疎水性であり、通常環状アミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンであり、第３のアミノ酸が疎水性であり、通常バリンであった。ループ１領域はそれほど一致していないが、グリシンとセリンは、主に第１と第２位置に見られ、バリンは、多くの場合、第７位置にあった。５つの追加の結合物はこの一致を有するようではないが、これらのうちの２つは、おそらくは、ループ４領域のＭＦＧＭＧ（配列番号５９８）又はＬＦＧＲＧ（配列番号５９９）を含む別の小グループを形成した。多くの結合物は、各々、多重クローンによって示された。
Figure 2013507123
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ＥＬＩＳＡアッセイは、これらの結合物がヒトＩｇＧ１ Ｆｃ又は組換えマウスＩＬ−２３Ｒのいずれとも交差反応しないことを示した。ＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅ結合アッセイは、精製された単量体ＣＴＬＤ又は候補クローン００１−６９．４Ｇ８等由来の全長三量体がヒトＩＬ−２３Ｒに対する結合についてＩＬ−２３に匹敵することを示した。ナノモルの親和性を有する競合的な候補が同定されている。
マウスＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃに対するファージディスプレイされたＣＴＬＤ結合物由来のループ１及び４のランダム化領域の配列の例を表１２に示す。この配列は、ヒトＩＬ−２３Ｒ結合物において見られる一次モチーフと類似性を有する（例えば、ループ１とＢ１２Ｃ、又はループ４とＣ１２Ｃと比較されたい）。興味深いことに、ループ４における位置４の不変の環状トリプトファン／フェニルアラニンをマウスＩＬ−２３Ｒ結合物におけるグリシンと置換した。
Figure 2013507123
（例２４）
ヒトＩＬ−２３Ｒに対する結合物の親和性成熟
ヒトＩＬ−２３Ｒのループ４領域が関連モチーフであるようなので、パンニングによって既に得られたループ４領域の多様性を維持するが、元のナイーブライブラリーからの全ての可能なループ１領域を用いてそれらを再分類するシャッフリングアプローチを開発した。この目的を達成するために、ヒトＩＬ−２３Ｒのラウンド４のパンニング由来のＤＮＡをＥｃｏＲＩとＢｓｓＨＩＩ制限酵素で消化し、それらはループ１とループ４領域の間を切断し、ループ４領域を含む約１．４ｋｂの断片が単離された。別々に、元のヒト１〜４ライブラリーＤＮＡを同じ酵素で消化し、ループ１領域を含む約３．５ｋｂの断片が単離された。これらの断片をともに連結し、新しいｈ１〜４シャッフルライブラリーを上記の通り生成した。ライブラリーは、各ラウンドのパンニングで、ビオチン化された組換えヒトＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃの量を２００ｎｇから（２０ｎｇ、２ｎｇ）０．１ｎｇに１０倍減少させたことを除いては、ビーズプロトコール（上述）を用いてパンニングされた。コロニーからのファージ上清を上記した通りＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、結合物を同定し、配列決定した。親和性成熟結合物のループ１と４の配列を表１３に示す。
Figure 2013507123
別の親和性成熟ライブラリーを生成し、そこでは初期のパンニングラウンド４において得られたループ１領域の多様性が維持され、ループ４オプションの制限された選択を利用し、ループ３を６つの位置でランダム化した。これは、鋳型としてヒトループ１〜４ライブラリーの元のパンニングラウンド４由来のＤＮＡを用いてループ１領域を増幅するためのプライマー、並びにＢｇｌｆｏｒ（配列番号１５８）及びＨ１−３−４Ｒ（配列番号１８５）のプライマーを生じさせることによって達成される。このプライマーはループ３と４について以下のアミノ酸配列をコードする：
ＲＩＡＹＫＮＷＥＸＸＸＸＸＱＰＸＧＧ（Ｆ／Ｌ）Ｇ（Ｆ／Ｙ／Ｖ／Ｄ）（Ｆ／Ｗ／Ｌ／Ｃ）ＧＥＮＣＡＶＬＳ（配列番号６００）。
この配列は、ループ４に対する主要な代替物、及びＣＴＬＤのループ３領域の改変体を組み込む。また、これに類似するが、ループ４領域配列により特異的である他のプライマーを、ループ３領域においてランダム化された別のライブラリーを生成するために生じさせ、使用した。対象の領域の残りは、プライマーＰｓｔループ４ｒｅｖ（配列番号１８６）及びＰｓｔＲｅｖ（配列番号１４２）を用いるオーバーラップＰＣＲによって生成された。
これらのライブラリーから得られた親和性成熟ＩＬ−２３Ｒ結合配列を表１４に示す。得られた結合物のいくつかは、追加の親和性成熟結合物を得るために、より有益なループ４又はループ１配列を他と交換することによって変更され、これらは表１４に含まれる。
Figure 2013507123
＊クローン１０１−８０−５Ｈ３は、計画されたループ４から欠失されたアミノ酸、及び変更領域のちょうど上流にあるループ４領域における２つの他のアミノ酸変化（ＧｌｙＧｌｙからＡｌａＡｌａ）を有した。
表１５は、Ｈ１−３−４Ｒ（配列番号１８５）の類似したプライマーを用いて作製されたいくつかの追加のクローンを示すが、以下のループ修飾のためのコード配列を有している。
Figure 2013507123
別の親和性成熟ライブラリーは、ループ４を５つのアミノ酸配列：ＦＧＶＦＧ（配列番号３８１）、ＷＧＶＦＧ（配列番号４０４）、ＦＧＹＦＧ（配列番号３８９）、ＷＧＹＦＧ（配列番号４１３）、及びＷＧＶＷＧ（配列番号４０９）に限定することによって生成され、ＩＬ−２３Ｒ結合物におけるループ１の開始部分に見られるＧｌｙＳｅｒを維持し、ＮＮＫ戦略を用いたループ１における続く５つのアミノ酸を変化させている。プライマーＧＳＸＸ（配列番号１９４）及び０９０８２７ＢｓｓＢｇｌｒｅｖ（配列番号１９５）を混合し、ＰＣＲを用いて伸長し、並びにプライマーＦＧＶＦＧｆｏｒ、ＦＧＹＦＧｆｏｒ、ＷＧＶＦＧｆｏｒ、ＷＧＹＦＧｆｏｒ、及びＷＧＶＷＧｆｏｒ（配列番号１９６〜２００）を個別にプライマーＰｓｔループ４ｒｅｖ（配列番号１８６）と混合し、ＰＣＲを用いて伸長した。得られた断片をゲル精製し、混合し、プライマーＢｇｌｆｏｒ（配列番号１５８）及びＰｓｔｒｅｖ（配列番号１４２）の存在下でＰＣＲによって伸長した。得られた断片をＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで消化し、ファージディスプレイのためにベクターｐＡＮＡ２７に挿入した。連続した標的希釈を用いたビーズパンニングを用いて、ライブラリーから親和性成熟候補を選択した。このライブラリーから得られた候補のための配列を表１６に示す。
Figure 2013507123
Figure 2013507123
Figure 2013507123
ループのアミノ酸配列及び周辺配列における追加の変化をアラニンスキャニングにより、即ち、当業者に知られている遺伝子部位特異的突然変異誘発によって特定のアミノ酸をアミノ酸アラニンに置換することにより生成した。表１７は、候補０５６−５３．Ｈ４Ｅ配列において行われたアラニン置換を記載する。このような置換は、示された残基に限定されず、任意の候補骨格において行うことができる。表１７は、これらの置換の多数が、親和性及び／又はタンパク質生成に有益であったことを示す。
Figure 2013507123
＊０５６−５３．Ｈ４Ｅアミノ酸の番号付けは、３つの追加のアミノ酸のループ４における導入のため、列挙された最後の４つの候補におけるＴＮ配列の番号付けから枝分かれすることに留意されたい。このようにして、０５６−５３．Ｈ４ＥにおけるＥ１５３は、元のＴＮ配列のＥ１５０に対応する（例えば、図２）。これはどの図と一緒か？
Figure 2013507123
（例２５）
ヒトＩＬ−２３Ｒに対するＣＴＬＤとＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体結合物のサブクローニング及び生成
ループ領域をコードするＤＮＡ断片は、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ（又はＭｆｅＩ）制限酵素を用いた制限消化によって得られ、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで予め消化された細菌ＣＴＬＤ発現ベクターｐＡＮＡ１（配列番号５１）、ｐＡＮＡ３（配列番号５３）、又はｐＡＮＡ１２（配列番号６２）に連結された。ｐＡＮＡ１はＣ末端の６×Ｈｉｓタグ化されたヒト単量体ＣＴＬＤを発現させるために設計されたＴ７ベースの発現ベクターである。ｐｅｌＢシグナルペプチドは、ペリプラズム又は増殖培地にタンパク質を仕向ける。ｐＡＮＡ３は、ｐＡＮＡ１のＣ末端のＨＡ−Ｈｉｓタグ化バージョンである。ｐＡＮＡ１２はｐＡＮＡ１のＣ末端のＨＡ−ＳｔｒｅｐＩＩタグ化バージョンである。三量体タンパク質の発現について、ループ領域は、大腸菌において分泌されるＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体を生成するために、ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体発現ベクターｐＡＮＡ４（配列番号５４）又はｐＡＮＡ１０（配列番号６０）にサブクローニングすることができる。ｐＡＮＡ４は、タンパク質をペリプラズム又は増殖培地に仕向けるために、ｏｍｐＡシグナルペプチドを有するＣ末端のＨｉｓ／Ｍｙｃタグ化された全長ヒトＴＮを含むｐＢＡＤベースの発現ベクターである。ｐＡＮＡ１０は、ｐＡＮＡ４のＣ末端のＨＡ−ＳｔｒｅｐＩＩタグ化バージョンである。
発現構築物を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。Ｓｔａｒ（ｐＡＮＡ１、ｐＡＮＡ３及びｐＡＮＡ１２用；単量体ＣＴＬＤ生成）又はＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＡＮＡ４及びｐＡＮＡ１０用；ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体生成）は、適切な抗生物質を含むＬＢ／寒天プレート上に播種された。新鮮なプレート上の単一コロニーは、１％グルコース及びカナマイシンを含むＳＢ（ｐＡＮＡ１及びｐＡＮＡ１２ベクター用）、又はアンピシリンを含む２×ＹＴ（２倍濃縮された酵母トリプトン）培地（ｐＡＮＡ４及びｐＡＮＡ１０ベクター用）のいずれか１Ｌに植菌された。３７℃にて２００ｒｐｍの振とう器でＯＤ６００が０．５になるまで培養物をインキュベートし、次に室温に冷却した。ｐＡＮＡ１及びｐＡＮＡ１２については最終濃度が０．０５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、一方、ｐＡＮＡ４及びｐＡＮＡ１０については最終濃度が０．００２〜０．０２％になるようにアラビノーシスを添加した。１２０〜１５０ｒｐｍで振とうしながら、終夜室温にて誘導を行い、その後、遠心分離によって細菌を回収した。浸透圧衝撃又は緩やかな超音波処理によってペリプラズムタンパク質を抽出した。
Ｎｉ＋−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて６×Ｈｉｓタグ化タンパク質を精製した。要約すると、ペリプラズムタンパク質をＨｉｓ結合緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）において再構成し、Ｈｉｓ結合緩衝液で予め平衡化されたＮｉ＋−ＮＴＡカラムに充填した。１０倍体積の結合緩衝液でカラムを洗浄した。溶出緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）を用いて結合されたタンパク質を溶出した。精製されたタンパク質を１×ＰＢＳ緩衝液中で透析し、陰イオン交換によって細菌の内毒素を除いた。
ＳｔｒｅｐＩＩタグ化された単量体ＣＴＬＤ及びＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体をＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。要約すると、ペリプラズムタンパク質を１×ＰＢＳ緩衝液中で再構成し、１×ＰＢＳ緩衝液で予め平衡化されたＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎカラムに充填した。カラムを１０倍体積のＰＢＳ緩衝液で洗浄した。タンパク質を溶出緩衝液（２．５ｍＭデスチオビオチンを含む１×ＰＢＳ）で溶出した。精製されたタンパク質を１×ＰＢＳ緩衝液中で透析し、陰イオン交換によって細菌の内毒素を除いた。
いくつかの細胞アッセイについて、ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体を哺乳動物細胞によって生成した。ループ領域をコードするＤＮＡ断片を哺乳動物用発現ベクターｐＡＮＡ２又はｐＡＮＡ１１にサブクローニングし、ＨＥＫ２９３一過性発現系においてＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体を生成した。ｐＡＮＡ２はＣ末端Ｈｉｓタグを含む修飾されたｐＣＥＰ４ベクターである。ｐＡＮＡ１１はｐＡＮＡ２のＣ末端ＨＡ−ＳｔｒｅｐＩＩタグ化バージョンである。ループ領域をコードするＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ及びＭｆｅＩを用いた二重消化によって得て、ＢｇｌＩＩ及びＭｆｅＩで予め消化された発現ベクターｐＡＮＡ２及びｐＡＮＡ１１に連結した。発現プラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細菌から精製された。ＨＥＫ２９３付着細胞について、一過性トランスフェクションは、製造業者のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて行われた。トランスフェクション後の翌日、培地を除き、２９３Ｉｓｏｐｒｏ血清不含培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と交換した。２日後、０．５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中のグルコースを最終濃度が１％となるように培地に添加した。組織培養上清は、精製のためにトランスフェクション後の４〜７日間回収された。ＨＥＫ２９３Ｆ懸濁細胞について、一過性トランスフェクションは、製造業者のプロトコールに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３Ｆｅｃｔｉｎによって行われた。翌日、１×体積の新鮮な培地を培養物に添加した。組織培養上清は、精製のためにトランスフェクション後の４〜７日間回収された。
哺乳動物組織培養上清からのＨｉｓ又はＳｔｒｅｐＩＩタグ化されたＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体の精製は、ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体を生成する大腸菌について記載した通りに行われた。
（例２６）
ＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡによる結合物の特徴づけ
ＥＬＩＳＡアッセイを例２３に記載されるように行い、ファージディスプレイされた結合物がヒトＩｇＧ１ Ｆｃ又は組換えマウスＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれとも交差反応しないことを示した。
競合的ＥＬＩＳＡアッセイは、ヒトＩＬ−２３Ｒに対するヒトＩＬ−２３の結合をブロックする陽性ヒトＩＬ−２３Ｒ（ＩＬ−２３Ｒ）結合物から、上記した通りに生成された、精製されたＣＴＬＤ又はＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体を用いて行われた。概して以下の通りにアッセイを行った。１００ｎｇの抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ＭＡＢ １１０クローン９７９２４）を含む１００μＬのＰＢＳと共にＩｍｍｕｌｏｎ ＨＢ２プレートの各ウェルを終夜４℃にてインキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で５回洗浄し、５０ｎｇの組換えヒトＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃを含む各１００μＬのＰＢＳと共にウェルを１．５時間ＲＴにてインキュベートした。プレートを前記の通り洗浄し、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）の１５０μＬを用いて１時間ＲＴにてブロックし、その後、上述した通りプレートを洗浄し、競合因子（ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチドコンプレキサー（ｃｏｐｍｌｅｘｏｒ）ＣＴＬＤ）の有無による、ＩＬ−２３を含む各１００μＬのＰＢＳと共にウェルを１〜２時間ＲＴにてインキュベートした。ＩＬ−２３含有溶液を以下の通りに調製した。ヒトＩＬ−２３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した。競合因子を最終濃度１μｇ／ｍＬでインキュベートした。インキュベート後、上記した通りにプレートを洗浄し、１：５０００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅカタログｎｏ．２１１３０）を含む各１００μＬのＰＢＳと共にウェルを４０分間ＲＴにてインキュベートした。洗浄後、最大３０分間ＲＴにて各１００μＬのＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂカタログｎｏ．ＴＭＢＨ−１０００−０）と共にウェルをインキュベートした。反応を等体積の０．２Ｍ硫酸で停止させた。
初期パンニングからのＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体を用いた競合アッセイ（ＩＬ−２３／ＩＬ−２３Ｒ相互作用を阻害する）の結果の例を図１１に示す。野生型ヒトテトラネクチン対照（ＴＮ）の左側に対するＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体は、ヒトループ１〜４ライブラリー（Ｐ１Ｄ１を除く）を用いたヒトＩＬ−２３Ｒに対する第３ラウンドのパンニングから得られた。テトラネクチン対照の右側に対するＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体は、ＩＬ−２３Ｒの量の減少に対する３〜４ラウンドのパンニング後のヒト１〜４シャッフルライブラリーから得られた。ＩＬ−２３Ｒに対するＩＬ−２３結合と競合する、親和性成熟パンニング手法からの候補分子の能力は、初期のパンニング手法からの候補の能力と比較して改善される。
多数のＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体は、ＩＣ５０値を決定するために、より広範囲に競合ＥＬＩＳＡにおいて試験された。表１９に示されるように、ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体は、低値のナノモルからナノモル以下のＩＣ５０を示した。
Figure 2013507123
ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体０５６−５３．Ｈ４Ｅを比較の標準として選択し、親和性成熟ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体を用いて追加の競合アッセイを行った。表２０は、アッセイ間で競合結果をより良好に比較するために、同じアッセイにおいて行われた０５６−５３．Ｈ４ＥのＩＣ５０に対する、試験されたＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体のＩＣ５０の比率を与える。
Figure 2013507123
（例２７）
ＢｉａｃｏｒｅによるヒトＩＬ−２３Ｒ結合物の親和性の特徴づけ
元のライブラリーのパンニングと親和性成熟ライブラリーのパンニングの両方に由来する単量体及び三量体結合物の見掛けの親和性を表２１、２２及び２３に与える。Ｂｉａｃｏｒｅ３０００バイオセンサー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒトＩＬ−２３Ｒと受容体結合物の相互作用を評価した。ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）への抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の固相化は、標準的なアミンカップリング化学を用いて行われ、この修飾された表面を用いて、組換えヒトＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を捕捉した。２００ＲＵ未満の低密度の受容体表面を全ての分析に用いた。ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体希釈物（１〜５００ｎＭ）を３０μｌ／分でＩＬ−２３Ｒ表面全体に注射し、速度定数は、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン３．１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてセンサーグラムデータから導かれた。データ回収は、結合のための３分間、及び解離のための５分間であった。抗ヒトＩｇＧ表面は、３Ｍ塩化マグネシウムの３０秒パルスで再生された。全てのセンサーグラムは、活性化され、ブロックされたフローセル、並びに緩衝液注入に対して二重に参照された。
Figure 2013507123
Figure 2013507123
Figure 2013507123
Figure 2013507123
（例２８）
ＩＬ−２３Ｒに結合するＡＴＲＩＭＥＲ（商標）複合体はＩＬ−１２Ｒβ１又はＩＬ−１２Ｒβ２を認識しない。
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００バイオセンサー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒトＩＬ−１２Ｒβ１／Ｆｃ又はＩＬ−１２Ｒβ２／ＦｃとＩＬ−２３Ｒ結合ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）複合体の相互作用を評価した。ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）への抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の固相化は、標準的なアミンカップリング化学を用いて行われ、この修飾された表面を用いて、組換えヒトＩＬ−１２Ｒβ１／Ｆｃ又はＩＬ−１２Ｒβ２／Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を捕捉した。２００ＲＵ未満の低密度の受容体表面を全ての分析に用いた。ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）複合体希釈物（１００ｎＭ）を３０μｌ／分でＩＬ−１２Ｒ表面全体に注射した。データ回収は、結合のための３分間、及び解離のための５分間であった。抗ヒトＩｇＧ表面は、３Ｍ塩化マグネシウムの３０秒パルスで再生された。全てのセンサーグラムは、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体表面、並びに緩衝液注入に対して二重に参照された。表２４に示されるように、ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）複合体は、ヒトＩＬ−１２Ｒβ１／Ｆｃ又はＩＬ−１２Ｒβ２／Ｆｃに対していずれも測定可能な結合を示さなかった。
Figure 2013507123
（例２９）
Ｂｉａｃｏｒｅを用いたＩＬ−２３Ｒ結合物の存在下でのＩＬ−２３Ｒに結合するヒトＩＬ−２３の競合アッセイ
ＩＬ−２３Ｒ結合ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体をＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアミンカップリングさせ、次にＩＬ−２３Ｒ（ＩＬ−２３Ｒ）をチップ表面全体に注射した。結合安定化後、ＩＬ−２３Ｒと相互作用するヒトＩＬ−２３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の能力を監視した。追加の競合アッセイは、ＩＬ−２３ＲとＩＬ−２３の間の複合体、又はＩＬ−２３ＲとＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体を３０分間室温にて予め形成させることによって行われた。次に、アミンカップリングされたＡＴＲＩＭＥＲ（商標）複合体と共に複合体を表面全体で注射した。Ａｔｒｉｍｅｒ Ａ５Ｆについて表２５に示されるように、ＩＬ−２３Ｒ Ａｔｒｉｍｅｒの残りの結合を決定し、競合因子（ＩＬ−２３又は異なるＡｔｒｉｍｅｒ）の不在下で結合の割合として表した。
Figure 2013507123
（例３０）
細胞ベースアッセイにおける選択されたＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体の活性化の試験
健常ドナー（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、１０％ＦＢＳ／Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＩＬ−２３Ｒ ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体又はウステキヌマブの存在下で、１×１０６細胞／ｍＬでヒト組換えＩＬ−２３（１ｎｇ／ｍＬ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＰＨＡ（１μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を用いて刺激された。培養４日後、細胞上清を回収し、ＩＬ−１７ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＥＬＩＳＡによって評価した。並行培養では、４日間、ＩＬ−２３Ｒ ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体又はウステキヌマブの存在下でＰＢＭＣをヒト組換えＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処理した。細胞上清をＩＦＮγ及びＩＬ−１７についてＬｕｍｉｎｅｘ（Ｐｒｏｃａｒｔａ、Ｐａｎｏｍｉｃｓ）によって評価し、Ｂｉｏｐｌｅｘ系（ＢｉｏＲａｄ）上で分析した。全ての処理を３点測定で行い、平均及び標準誤差をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてプロットした。図１２、１３及び１４に示されるように、ＩＬ−２３ ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体はＩＬ−２３誘導によるＩＬ−１７生成をブロックしたが、ＩＬ−１２誘導によるＩＦＮγ生成を阻害しなかった。予想通りに、ウステキヌマブはＩＬ−２３及びＩＬ−１２反応の両方を阻害した。
表２６は、ＰＢＭＣアッセイにおいて試験された親和性成熟ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体についての結果を示す。ＩＬ−２３誘導によるＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｆ、及びＩＬ−２２生成をブロックするＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体の能力を指示されるようにＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体について測定した。結果は、ウステキヌマブについてのＩＣ５０と比較した、分子がＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体についてのＩＣ５０である比率として示される。１を超えるアッセイの結果をいくつかのＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体について示す。
Figure 2013507123
（例３１）
ＮＫＬアゴニストアッセイ
ＩＬ−２３Ｒに対するＩＬ−２３Ｒ ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）ポリペプチド複合体のアゴニスト活性の欠損を示すために、ヘテロ二量体のＩＬ−２３受容体を発現するナチュラルキラー細胞系ＮＫＬに対する、選択されたＩＬ−２３Ｒ ＡＴＲＩＭＥＲ（商標）複合体の結合に対するＳＴＡＴ−３リン酸化を決定した。１５０μｇ／ｍＬ濃度のＡＴＲＩＭＥＲ（商標）複合体、又は陽性対照としての５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２３を９６ウェルプレート中で１４０，０００ＮＫＬ細胞／ウェルと共に３７℃にてインキュベートした。１０分後、細胞を１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞を溶解し、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＰＡＴＨ ＳＣＡＮ（登録商標）Ｐｈｏｓｐｈｏ Ｓｔａｔ ３サンドイッチＥＬＩＳＡキット、Ｃａｔ＃７３００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍｓａｓｓｈｃｕｓｔｔｓ）から得られるＳｔａｔ３リン酸化キットにおいて提供されるプロトコールに従って処理した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍでの吸光度によってＳｔａｔ−３リン酸化を測定した。例としてＨ４Ｅ及びＨ４ＥＰ１Ｅ９の複合体に関する図１５に示されるように、複合体によるＩＬ−２３Ｒ受容体の活性化は観察されず、一方、ＩＬ−２３は予想されたようにＳｔａｔ−３リン酸化をもたらした。同様の結果が、図１６Ａ及び１６Ｂにおいて概要されるように、１０１−５１−１Ａ４、１０１−５１−１Ａ７、１０５−０８−１Ａ８、１０１−５４−４Ｂ６、Ｈ４Ｅ Ｅ１３７Ａ、１０１−１１３−６Ｃ１０８及び１０１−５４−４Ｂ１０などの試験された全ての他のａｔｒｉｍｅｒについて観察された。
（例３２）
マウスＩＬ−２３Ｒに対するマウス１〜４ライブラリーのパンニング及びマウスＩＬ−２３Ｒ特異的ＣＴＬＤ結合物の同定
マウスライブラリー１〜４のパンニング及びスクリーニング
マウスライブラリー１〜４から生成されたファージを組換えマウスＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）上でパンニングした。３ラウンドのパンニング後のＥＬＩＳＡプレートアッセイを用いたこれらの結合パネルのスクリーニングは受容体特異的結合物を同定した。
パンニング用にファージを生成するために、マスターライブラリーＤＮＡをエレクトロポレーションによって細菌株ＥＲ２７３８（Ｌｕｃｉｇｅｎ又はＮＥＢ）に形質転換した。ＳＯＣ（異化代謝産物抑制を有するスーパーオプティマルブロス）培地中で３７℃にて振とうしながら１時間、細胞を回復させ、その後、最終濃度が２０％グルコース及び２０μｇ／ｍＬカルベニシリンとなるようにスーパーブロス（ＳＢ）を添加することによって体積を１０倍に増加させた。３７℃にて１時間振とう後、さらに１時間、カルベニシリン濃度を５０μｇ／ｍＬに増加させ、その後、２％グルコース及び５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含む４００ｍＬのＳＢを、最終濃度が５×１０９ｐｆｕ／ｍＬになるようにヘルパーファージＭ１３Ｋ０７と共に添加した。３７℃にて、３０分間振とうせずに、次にさらに３０分間、１００〜１５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベーションを継続した。細胞を３２００ｇで４℃にて２０分間遠心分離し、次に、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン及び５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む５００ｍＬのＳＢ培地中に再懸濁させた。終夜室温（ＲＴ）にて、１５０ｒｐｍで振とうしながら細胞を増殖させた。１５，０００ｇで４℃にて２０分間遠心分離によって細菌細胞をペレット化することによりファージを単離した。上清は、氷上で３０分間、２０％ＰＥＧ／２．５ＭのＮａＣｌの４分の１体積（通常、２５０ｍＬの上清／ボトル＋６２．５ｍＬのＰＥＧ溶液）と共にインキュベートされた。１５，０００ｇ及び４℃にて２０分間遠心分離によってファージをペレットにした。０．０５％煮沸カゼイン、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０、及びプロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液Ｄにファージペレットを再懸濁させた。２５ｍｍ径、０．２μｍの孔サイズのＷｈａｔｍａｎ Ｐｕｒａｄｉｓｃフィルターを用いて、材料をろ過滅菌した。
マウスライブラリー１〜４から生成されたファージは、プレートフォーマットを用いて、組換えマウスＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ＃１６８６−ＭＲ）に対してパンニングされた。９６ウェルのＩｍｍｕｌｏｎ ＨＢ２ ＥＬＩＳＡプレートの６ウェルは、ダルベッコＰＢＳ中の２５０〜１０００ｎｇ／ウェルの担体不含マウスＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃで被覆された。材料をプレート上で終夜インキュベートし、その後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング緩衝液（０．０５％煮沸カゼイン（ｃａｓｓｅｉｎｇ）及び１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む緩衝液Ｃ）を添加した。ウェルを少なくとも１時間３７℃にてインキュベートした。また、追加のウェルは、ブロッキング緩衝液に結合するファージの後の吸収のために、同時にブロッキング緩衝液で処理された。
３つに希釈したファージ調製物を用いた：緩衝液Ｄ＋プロテアーゼ阻害剤において未希釈、１：１０、及び１：１００。３ラウンドのパンニングにおいて、組換えヒトＩｇＧ１ Ｆｃは、最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように各希釈に添加された。ブロッキング緩衝液は、「ブロックのみ」（ブロッキングに対する前吸収）ウェルから除かれ、異なるファージ混合物はこれらのウェル中でさらに１時間３７℃にてインキュベートされた。各ファージ混合物の分割量（５０μＬ）は、洗浄及びブロックされた標的ウェルに移され、２時間３７℃にてインキュベートされた。第１ラウンドのパンニングについて、結合したファージを緩衝液Ｄで１回洗浄し、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むグリシン緩衝液、ｐＨ２．２を用いて溶出した。２ＭのＴｒｉｓ塩基（ｐＨ１１．５）で中和後、溶出されたファージは、酵母エキス−トリプトン（ＹＴ）培地中で、６００ｎｍで測定された約０．９の光学濃度（ＯＤ６００）である、２〜４ミリリットルのＥＲ２７３８細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ又はＮＥＢ）と共に、１５分間室温にてインキュベートされた。上記のプロトコールを用いてこの感染からファージを調製したが、約２０％（体積）スケールダウンさせた。溶出されたファージから調製されたファージを追加ラウンドのパンニングに供した。各ラウンドで、インプット及びアウトプットのファージの力価を適切な抗生物質を用いて寒天上に播種することによって決定し、これらのプレートからのコロニーを後にＥＬＩＳＡによって結合物についてスクリーニングするために用いた。
追加ラウンドのパンニングは、第２ラウンドのパンニングにおいて洗浄を５回まで増やし、続くラウンドにおいて洗浄を１０回に増やしたことを除いて、上記されるように行われた。３〜６ラウンドのパンニングを行った。最終ラウンドのパンニングについては、ファージは感染後に生成されなかった；むしろ、感染された細菌を終夜増殖させ、ｍａｘｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎキット）をＤＮＡから調製した。インプットファージのグリセロールストック（１５％）を各ラウンドから凍結（−８０℃にて）保存した。
ＥＬＩＳＡスクリーニングについて、後期ラウンドのパンニング由来のコロニーは、２％グルコース及び抗生物質を含むＹＴ培地中で終夜増殖され、次に、各々の分割量を用いてＯＤ６００が０．５になるまで増殖させる新鮮な培養物で開始する。ヘルパーファージを５×１０９ｐｆｕ／ｍＬになるまで添加し、３０分間３７℃にて感染させ、次に３７℃で撹拌しながら増殖させた。細菌を遠心分離し、カルベニシリンとカナマイシンを含むＹＴ培地に再懸濁し、終夜、ファージ生成のために増殖させた。次に、細菌をペレット化し、培地を除き、６×ＰＢＳ、１８％ミルクの５分の１体積（１：５のミルク混合物：上清）と混合した。７５〜１００ｎｇ／ウェルの組換えマウスＩＬ−２３Ｒ／Ｆｃを含む５０〜１００μＬのＰＢＳと共に終夜４℃にてインキュベートすることによってＥＬＩＳＡプレートを調製した。ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で被覆された２点測定のプレートを対照として用いた。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、１×ＰＢＳ中の３％ミルクで１時間３７℃にてブロックし、１００μＬ／ウェルの各ミルク処理されたファージ混合物で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で１回、及びＰＢＳで２回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートされた抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳ／ＴｗｅｅｎとＰＢＳでそれぞれ３回洗浄し、ＴＭＢ基質（ＶＷＲ）と共にインキュベートした。硫酸を添加して呈色反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み込み、陽性結合物を同定した。
マウスＩＬ−２３Ｒに十分に結合した、ファージディスプレイされたマウスＴＮ ＣＴＬＤを第３ラウンドのパンニングから同定した。この結合物由来のループ１と４のランダム化領域からの配列を表２７に示す。
Figure 2013507123
上記例は、これらのライブラリーに生じ得る変更の範囲を限定しない。他のライブラリーを生成することができ、そこでは様々な数のランダム又はより標的化されたアミノ酸を用いて、既存のアミノ酸を置換し、ループの異なる組み合わせを利用することができる。さらに、他の突然変異、及び突然変異を生じさせる方法、例えば、ランダムＰＣＲ突然変異誘発法を利用して、パンニングに供することができる多様なライブラリーを提供し得る。
本発明の種々の具体的な実施形態が本明細書に記載されているが、本発明はちょうどそれらの実施形態に限定されず、種々の変更又は修正が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなしに当業者によってそれらにおいて影響され得ることが理解されるべきである。
上記で与えられた例は単に例示的なものであり、本発明の全ての可能な実施形態、応用又は変更の包括的な羅列であることを意味しない。このようにして、本発明の上記された方法及び系の種々の変更及び変形は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなしに当業者に明らかとなる。本発明は具体的な実施形態と関連して記載されているが、請求される本発明はこのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解しなければならない。実際に、分子生物学、免疫学、化学、生化学又は関連する分野における当業者に明らかである、本発明を実施するための記載された様式の種々の変更は、添付される特許請求の範囲内にあることが意図される。
本発明は、本明細書に記載されている具体的な方法論、プロトコール、及び試薬などに限定されず、これらは、当業者が認識するように変更されてもよいことが理解される。また、本明細書で使用される専門用語は、具体的な実施形態だけを説明する目的で使用され、本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されるべきである。
本発明の実施形態、並びにその種々の特徴及び有利な詳細は、非制限的な実施形態を参照にしてより十分に説明され、並びに／又は添付の図面に例証され、及び以下の記載に詳述されている。図面に例証されている特徴は必ずしも一定の尺度で描かれているわけではなく、一実施形態の特徴は、たとえ本明細書に明示的に記述がなくても、当業者が理解するように他の実施形態と共に用いられてもよいことを留意するべきである。
本明細書中に記載される任意の数値は、低い値と高い値の間に少なくとも２単位のひらきがあれば、低い値から高い値まで１単位ずつ大きくなる値を全て含む。例えば、成分の濃度又はプロセス変量、例えば、サイズ、角度サイズ、圧力、時間などの値が、例えば、１〜９０、具体的には２０〜８０、さらに具体的には３０〜７０であると述べられた場合、本明細書中には１５〜８５、２２〜６８、４３〜５１、３０〜３２などの値が明記されたものと想定されている。１未満の値については、１単位は場合に応じて０．０００１、０．００１、０．０１又は０．１であると考えられる。これらは具体的に意図されているものの例示に過ぎず、記載された最低値と最高値の間の数値の可能な組み合わせは全て、本願において同様に明記されていると考えるべきである。
本明細書で引用されている全ての参考文献及び刊行物の開示は、あたかも各々が個別に参照により援用されている程度に、全体として参照により明示的に援用される。
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Claims (41)

  1. ランダム化ループ領域を有するＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含むポリペプチドメンバーを含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーであって、ＣＴＬＤループ領域は、ループ１〜４を含有するループセグメントＡ（ＬＳＡ）及びループ５を含有するループセグメントＢ（ＬＳＢ）を含み、且つ以下のスキーム：
    （ａ）ループ１における少なくとも１つのアミノ酸の挿入及びループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
    （ｂ）ループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換及びループ２内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
    （ｃ）ループ１内の少なくとも７つのアミノ酸のランダム置換及びループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
    （ｄ）ループ３における少なくとも１つのアミノ酸挿入及びループ３内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
    （ｅ）２つのループを組み合わせて単一のループにする修飾を含み、２つの組み合わせられたループがループ３及びループ４である、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
    （ｆ）ループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入及びループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
    （ｇ）ループ３における少なくとも５つのアミノ酸残基のランダム置換及びループ５内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおける及びループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるアミノ酸修飾；
    （ｈ）ループ３における少なくとも１つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも６つのアミノ酸の挿入を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；
    （ｉ）（１）ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換並びに（２）ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも１つのアミノ酸挿入の混合物を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾；並びに
    （ｊ）ループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおける少なくとも４つ以上のアミノ酸挿入を含む、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つ又はＣＴＬＤのループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるループ５におけるアミノ酸修飾
    の１つによってランダム化される、上記コンビナトリアルポリペプチドライブラリー。
  2. ＣＴＬＤは、以下の二次構造：
    （ａ）β１、α１、α２、β２、β３、β４、及びβ５の順で連続して現われる、一方はβ１及びβ５から構成され、他方はβ２、β３、及びβ４から構成される２つの逆平行β−シートで配置する５つのβ−ストランド及び２つのα−ヘリックス；
    （ｂ）少なくとも２つのジスルフィド架橋、α１とβ５をつなぐジスルフィド架橋及びβ３と、β４とβ５をつなぐポリペプチドセグメントをつなぐジスルフィド架橋；並びに
    （ｃ）β２とβ３をつなぐループセグメントＡ（ＬＳＡ）及びβ３とβ４をつなぐループセグメントＢ（ＬＳＢ）
    を含む、請求項１に記載のライブラリー。
  3. Ｃ末端方向に、ループ２のＣ末端に隣接して位置するアミノ酸のランダム置換をさらに含む、請求項１に記載のライブラリー。
  4. ＣＴＬＤは、ヒトテトラネクチン由来のものであり、アルギニン−１３０のランダム置換をさらに含む、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  5. ＣＴＬＤは、ヒト又はマウステトラネクチン由来のものであり、リシン−１４８のアラニンへの置換をさらに含む、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  6. アミノ酸修飾は、ループ１における２つのアミノ酸挿入、ループ１内の少なくとも５つのアミノ酸のランダム置換、及びリシン−１４８のアラニンへの置換を含む、スキーム（ａ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項４に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  7. アミノ酸修飾は、ループ４内の少なくとも２つのアミノ酸のランダム置換をさらに含む、スキーム（ｃ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  8. アミノ酸修飾は、ループ１内の少なくとも７つのアミノ酸のランダム置換、ループ４における少なくとも３つのアミノ酸挿入、及びループ４内の少なくとも２つのアミノ酸のランダム置換を含む、請求項７に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  9. アミノ酸修飾は、ループ４における少なくとも１つのアミノ酸挿入をさらに含む、スキーム（ｄ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  10. アミノ酸修飾は、ループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換をさらに含む、請求項９に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  11. アミノ酸修飾は、ループ３における３つのアミノ酸挿入を含む、請求項１０に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  12. アミノ酸修飾は、ループ４における３つのアミノ酸挿入を含む、請求項１１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  13. アミノ酸修飾は、ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換及びループ４における少なくとも４つのアミノ酸のランダム置換を含む、スキーム（ｅ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  14. ＣＴＬＤは、ヒト又はマウステトラネクチンであり、アミノ酸修飾は、プロリン−１４４のランダム置換をさらに含む、請求項１３に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  15. 組み合わせられたループ３及びループ４のアミノ酸配列は、ＮＷＥＸＸＸＸＸＸＸ ＸＧＧＸＸＸＮ（配列番号５７８）を含み、Ｘは、任意のアミノ酸であり、配列番号５７８のアミノ酸配列は、単一のループ領域を形成する、請求項１４に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  16. アミノ酸修飾は、ループ４における４つのアミノ酸挿入及びループ４内の少なくとも３つのアミノ酸のランダム置換を含む、スキーム（ｆ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  17. ＣＴＬＤのプラスミノーゲン結合親和性を調整するループ４領域の１つ又は複数のアミノ酸修飾をさらに含む、スキーム（ｇ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  18. ＣＴＬＤは、ヒト又はマウステトラネクチン由来のものであり、ループ４に対する修飾は、リシン１４８のアラニンへの置換を含む、請求項１７に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  19. ＣＴＬＤは、ヒト又はマウステトラネクチン由来のものであり、アミノ酸修飾は、イソロイシン１４０のランダム置換を含む、スキーム（ｈ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  20. ＣＴＬＤのプラスミノーゲン結合親和性を調整する、ループ４領域における１つ又は複数のアミノ酸修飾をさらに含む、請求項１９に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  21. ループ４に対する修飾は、リシン１４８のアラニンへの置換を含む、請求項２０に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  22. アミノ酸修飾は、ＣＴＬＤのループセグメントＡ（ＬＳＡ）における４つのループの少なくとも１つにおけるアミノ酸修飾を含み、アミノ酸修飾は、（１）ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換；（２）ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも１つのアミノ酸挿入；並びに（３）ループ３における少なくとも６つのアミノ酸のランダム置換及び少なくとも２つのアミノ酸挿入の混合物を含む、スキーム（ｉ）のランダム化ＣＴＬＤを有する、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  23. ＣＴＬＤは、ループセグメントＡ（ＬＳＡ）及びループセグメントＢ（ＬＳＢ）におけるループの２つ、３つ、４つ、又は５つの任意の組み合わせにおける１つ又は複数のアミノ酸修飾を含む、請求項２に記載のコンビナトリアルポリペプチドライブラリー。
  24. アミノ酸修飾は、ＬＳＡ及びＬＳＢ以外のＣＴＬＤアミノ酸に対する修飾を含む、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  25. ＣＴＬＤは、ヒトテトラネクチンのＣＴＬＤである、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  26. ＣＴＬＤは、マウステトラネクチンのＣＴＬＤである、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  27. ポリペプチドメンバーは、ＣＴＬＤのＮ末端伸長部分及びＣ末端伸長部分の少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  28. Ｎ末端伸長部分及びＣ末端伸長部分の少なくとも１つは、エフェクター機能、酵素機能、さらなる結合機能、又は多量体形成機能を提供するポリペプチドを含む、請求項２７に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  29. Ｎ末端伸長部分及びＣ末端伸長部分の少なくとも１つは、天然Ｃ型レクチン様タンパク質又はＣ型レクチン又は機能的膜貫通ドメインを欠くＣ型レクチンの非ＣＴＬＤ部分を含む、請求項２７に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  30. タンパク質は、ＣＴＬＤを含む成分の多量体である、請求項２９に記載のコンビナトリアルライブラリー。
  31. 請求項１に記載のコンビナトリアルポリペプチドライブラリーのポリペプチドをコードする核酸分子のライブラリー。
  32. ライブラリーの核酸分子は、ディスプレイ系において発現され、ディスプレイ系は、ディスプレイされた発現産物の少なくとも１つの特性を表す観察可能な表現型及び対応する遺伝子型を含む、請求項３１に記載の核酸分子のライブラリー。
  33. ディスプレイ系は、ファージディスプレイ系；酵母ディスプレイ系；ウイルスディスプレイ系；細胞ベースのディスプレイ系；リボソーム連結ディスプレイ系；及びプラスミド連結ディスプレイ系から選択される、請求項３１に記載の核酸分子のライブラリーを含むディスプレイ系。
  34. ＣＴＬＤのＬＳＡ領域における４つのループの少なくとも１つにおいて少なくとも１つのランダム突然変異を生成することによって、スキーム（ａ）〜（ｊ）のいずれかを引き起こすことを含む、請求項１に記載のコンビナトリアルライブラリーを生成するための方法。
  35. 少なくとも１つのランダム突然変異は、オリゴヌクレオチド特異的ランダム化；ランダムな断片化によるＤＮＡシャフリング；ループシャフリング；ループウォーキング；又はエラープローンＰＣＲ突然変異誘発によって引き起こされる、請求項３４に記載の方法。
  36. 標的分子に対して特異的な結合活性を有するポリペプチドを同定する及び単離するための方法であって、
    （ａ）請求項１に記載のコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供するステップ、
    （ｂ）ポリペプチドと標的分子の間の結合を可能にする条件下でコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを標的分子と接触させるステップ、並びに
    （ｃ）標的分子に結合するポリペプチドを単離するステップを含む、上記方法。
  37. 方法は、コンビナトリアルポリペプチドライブラリーのポリペプチドをコードする核酸分子のライブラリーをさらに含み、核酸のライブラリーは、ディスプレイ系において発現され、ディスプレイ系は、ディスプレイされた発現産物の少なくとも１つの特性を表す観察可能な表現型及び対応する遺伝子型を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 標的分子に特異的に結合することができるポリペプチドの同定及び単離のための方法であって、
    （ａ）請求項１に記載のポリペプチドライブラリーをコードする核酸分子のライブラリーを提供するステップ、
    （ｂ）ディスプレイ系において核酸分子のライブラリーを発現させて、１つ又は複数の配列位置のアミノ酸残基が、その異なるメンバーの間で異なるポリペプチド集合体を得るステップ、
    （ｃ）ポリペプチドと標的分子の間の結合を可能にする条件下でポリペプチド集合体を前記標的分子と接触させるステップ、並びに
    （ｄ）前記標的分子に結合することができるポリペプチドを単離するステップを含む、上記方法。
  39. Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を有するポリペプチドであって、ポリペプチドは、そのＣＴＬＤの自然の標的以外の標的に結合し、ＣＴＬＤのＣＴＬＤ骨格構造は、請求項１に記載のスキームのいずれかに従って修飾されている、上記ポリペプチド。
  40. ヒトテトラネクチンのＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を有し、ヒトテトラネクチンの自然の標的以外の標的に結合する、請求項３９に記載のポリペプチド。
  41. ポリペプチドと標的分子の間の結合を可能にする条件下で請求項１に記載のコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを標的分子と接触させるステップ並びに標的分子に結合するポリペプチドを単離するステップを含み、標的分子は、ＣＴＬＤの自然の標的ではない、請求項３９に記載のポリペプチドを生成するための方法。
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