KR20130103302A

KR20130103302A - Ｃｙｔｏｋｉｎｅ에 특이적으로 결합하는 ｃｙｔｏｋｉｎｅ―ｂｐｂ

Info

Publication number: KR20130103302A
Application number: KR1020127023553A
Authority: KR
Inventors: 전상용; 김성현; 박세호; 김대진; 이상헌
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2010-04-20
Filing date: 2011-04-20
Publication date: 2013-09-23
Also published as: WO2011132939A3; WO2011132939A8; WO2011132939A2

Abstract

본 발명은 (a) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및 (b) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m 개의 아미노산을 포함하는 Cytokine-타겟 결합 부위 I(Cytokine-target binding region I) 및 Cytokine-타겟 결합 부위 II(Cytokine-target binding region II)를 포함하는 Cytokine 에 특이적으로 결합하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더에 관한 것으로서, 본 발명의 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더는 Cytokine 에 대하여 매우 낮은 수준(예컨대, nM 수준)의 K_D 값(해리상수)을 나타내어, Cytokine 타겟에 매우 높은 친화도를 나타낸다. 본 발명의 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더는 의약으로서의 용도를 가질 뿐만 아니라, 인 비보 분자 이미징, 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

CYTOKINE 에 특이적으로 결합하는 CYTOKINE-BPB{CYTOKINE-BPB SPECIFICALLY BINDING TO CYTOKINE}

본 발명은 Cytokine 에 특이적으로 결합하는 Cytokine-BPB 에 관한 것이다.

항체는 B 세포가 생산하는 혈장단백질의 일종인 면역글로불린 단백질로써 외부에서 들어온 항원의 특정부위를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 항원을 비활성화하거나 무력화시킨다. 이러한 항원-항체 반응의 특이성과 고도의 친화도 및 수천만 종류의 항원을 구별할 수 있는 항체의 다양성을 응용하여 오늘날 진단제와 치료제 등을 포함하는 많은 종류의 항체 제품이 출현하게 되었다. 현재 FDA 에서는 21 개의 단일클론항체를 승인하였으며 리턱시맵(Rituximab) 및 헤르셉틴(Herceptin)과 같은 항체는 다른 치료에서 전혀 반응을 보이지 않던 환자들의 50% 이상에서 효과를 보인바 있으며 실질적으로 여러 연구에서 단일클론항체를 이용하여 림프종, 대장암 또는 유방암 등에 성공적인 임상치료를 보여주고 있다. 치료용 항체의 전체 시장 규모는 2004 년 100 억 달러 규모에서 2010 년에는 300 억 달러로 연평균 20%의 성장률을 보일 것으로 추정하고 있으며, 그 시장 규모는 기하급수적으로 증가할 것으로 추정되고 있다. 항체를 이용한 신약개발이 활발해지는 이유는 약품의 개발기간이 짧으며 투자비용이 작고 부작용을 쉽게 예측할 수 있기 때문이다. 또한 항체는 생약이어서 인체가 거의 영향을 받지 않으며 체내에서의 반감기가 저 분자량 약품에 비하여 압도적으로 길어서 환자에게 친화적이다. 이러한 유용성에도 불구하고 인간에서 단일클론항체는 외래 항원으로 인식하여 심한 알레르기 반응 또는 과민반응을 일으키기도 한다. 또한, 이러한 항암 기능의 단클론 항체를 임상적으로 사용할 경우 생산 단가가 높기 때문에 치료제로서의 가격이 급격히 상승한다는 단점이 있으며, 항체를 배양하는 방법 및 정제 방법 등 광범위한 분야의 기술들이 각종 지적 소유권에 의해 보호받고 있기 때문에 비싼 라이센싱비를 지불해야 한다.

따라서 이 문제를 해결하기 위해서 미국을 중심으로 유럽연합에서 항체 대체 단백질 개발이 태동기에 있다. 항체 대체 단백질은 항체와 같이 불변영역과 가변영역을 가질 수 있도록 만든 재조합 단백질로 크기가 작고 안정한 단백질의 일정부분을 무작위 서열의 아미노산으로 바꾸어 라이브러리를 만들고 이를 표적물질에 대해 스크리닝을 하여 높은 친화력과 좋은 특이성을 가진 물질을 찾을 수 있다. 예를 들어 항체 대체 단백질 중 아비머(avimer)와 아피바디(affibody)는 표적물질에 대해 피코몰(picomole) 정도의 친화력을 가진 예시가 보고되어 있다. 이런 항체 대체 단백질은 크기가 작고 안정해서 암세포에 깊이 침투 가능하며 일반적으로 면역반응을 적게 일으킨다고 보고되어 있다. 그리고 무엇보다도 광범위한 항체 특허 문제에서 벗어 날 수 있으며 박테리아에서 쉽게 대량정제 할 수 있기 때문에 생산단가가 낮아 경제적으로 항체보다 큰 장점을 가진다. 현재 개발된 항체 대체 단백질은 40 개가 있으나 이 중 벤처 회사나 다국적 제약회사에서 상용화를 시도하고 있는 항체 대체 단백질은 피브로넥틴 타입 III 도메인, 리포칼린, LDLR-A 도메인, 크리스탈린, 프로테인 A, 안키린 리피트(Ankyrin repeat), BPTI 라는 단백질을 이용하고 있으며 타겟에 대한 피코몰에서 수 나노몰정도의 높은 친화력을 가지고 있다. 그 중 애드넥틴(Adnectin), 아비머, 쿠니츠(Kunitz) 도메인은 현재 FDA 임상 실험이 진행 중이다.

본 발명은 지금까지의 단백질을 이용한 항체대체 단백질과는 다른 펩타이드 기반 항체대체 단백질에 초점을 맞추었다. 펩타이드는 항체에 비해 적절한 약물동력학, 대량생산성, 낮은 독성, 항원성 억제 및 낮은 생산 단가 등으로 인해 현재 항체 치료제를 대체하여 다양하게 활용되고 있다. 치료용 약으로서의 펩타이드의 장점은 생산 단가가 낮고, 안전성 및 반응성이 높으며, 특허 로얄티가 상대적으로 저렴하고, 원하지 않는 면역시스템에 덜 노출되어 펩타이드 자체에 대한 항체 생산을 억제 할 수 있으며, 합성을 통한 변형이 쉽고 정확하다는 것이다. 그러나 대부분의 펩타이드는 항체에 비해 특정 단백질 타켓에 대해 낮은 친화력 및 특이성을 보이기 때문에 여러 응용분야에 사용되지 못하는 단점이 있다. 따라서, 펩타이드의 단점을 극복할 수 있는 새로운 펩타이드 기반 항체 대체 단백질 개발에 대한 요구가 당업계에 대두되고 있다. 이에 본 발명자들은 생물학적 타겟 분자에 높은 친화성으로 특이적 결합이 가능한 펩타이드 물질을 개발하고자 노력하였다. 이는 현재 매우 많은 타겟에 대해 보고된 낮은 친화력를 가진 펩타이드를 이용하여 빠른 시간안에 높은 친화성 및 특이성을 가진 신약후보를 만들 수 있는 기술이 될 것으로 기대된다.

한편, 사이토카인은 세포들 사이에서 시그널을 운반하는 특정 면역세포에서 분비하는 물질이다. 사이토카인은 면역세포를 자극하여 면역반응을 활성화 시키거나 혹은 억제하는 작용을 한다.

사이토카인은 다양한 생물학적 현상 및 병리학적 현상(예컨대, 자가면역질환)에 관여를 하며, 이를 타겟으로 한 의약들에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 본 발명자들은 Cytokine 결합성 및 특이성에 기초하여 다양한 물질들을 세포 내 또는 세포 표면에 운반할 수 시스템을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 비교적 리지드(rigid)한 펩타이드 골격을 가지는 구조안정화 부위의 양 말단에 무작위적(random)으로 펩타이드를 결합시키고, 이 두 펩타이드를 공동으로 Cytokine 분자에 결합시키는 경우에는 크게 증가된 결합능 및 특이성을 가지는 바이포달 펩타이드 바인더(BPB)를 얻을 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더(Cytokine-BPB)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더(Cytokine-BPB)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더(Cytokine-BPB)을 제공한다:

(a) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및

(b) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m 개의 아미노산을 포함하는 Cytokine-타겟 결합 부위 I(Cytokine-target binding region I) 및 Cytokine-타겟 결합 부위 II(Cytokine-target binding region II)를 포함하는 Cytokine 에 특이적으로 결합하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더.

본 발명자들은 본 발명자들은 Cytokine 결합성 및 특이성에 기초하여 다양한 물질들을 세포 내 또는 세포 표면에 운반할 수 시스템을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 비교적 리지드(rigid)한 펩타이드 골격을 가지는 구조안정화 부위의 양 말단에 무작위적(random)으로 펩타이드를 결합시키고, 이 두 펩타이드를 공동으로 Cytokine 분자에 결합시키는 경우에는 크게 증가된 결합능 및 특이성을 가지는 바이포달 펩타이드 바인더(BPB)를 얻을 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 기본적인 전략은 리지드한 펩타이드 골격의 양 말단에 타겟에 결합되는 펩타이드를 연결하는 것이다. 이 경우 리지드한 펩타이드 골격은 바이포달 펩타이드 바이더의 전체적인 구조를 안정화시키는 작용을 하며, 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 II가 타겟 분자에 결합되는 것을 강화시킨다.

본 발명에서 이용 가능한 구조안정화 부위는 패러럴, 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 포함하며, 가닥간(interstrand) 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 비공유결합이 형성되는 단백질 구조 모티프들을 포함한다. 가닥간 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 형성되는 비공유결합은 구조안정화 부위의 견고성(rigidity)에 기여한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조안정화 부위에서의 가닥간(interstrand) 비공유결합은 수소결합, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용 또는 이들의 조합을 포함한다.

선택적으로, 구조화안정화 부위에 공유결합이 있을 수 있다. 예를 들어, 구조화안정화 부위에 이황화결합을 형성시켜 구조안정화 부위의 견고성을 더 증가시킬 수 있다. 이러한 공유결합에 의한 견고성 증가는 바이포달 펩타이드 바인더의 타겟에 대한 특이도 및 친화도를 고려하여 부여한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결되어 있다. 본 명세서에서 가닥을 언급하면서 사용되는 용어 "링커" 는 가닥과 가닥을 연결시켜 주는 물질을 의미한다. 예컨대, 구조안정화 부위로서 β-헤어핀이 이용되는 경우에는 β-헤어핀에 있는 턴 서열이 링커의 역할을 하며, 루이신 지퍼가 이용되는 경우에는 루이신 지퍼의 두 C-말단을 연결하는 물질(예컨대, 펩타이드 링커)이 링커의 역할을 한다.

링커는 패러럴, 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 연결한다. 예컨대, 패러럴 방식으로 정렬된 최소 2 개의 가닥(바람직하게는 2 개의 가닥), 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 2 개의 가닥(바람직하게는 2 개의 가닥), 패러럴 및 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 3 개의 가닥(바람직하게는 3 개의 가닥)을 링커가 연결하게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 링커는 턴 서열 또는 펩타이드 링커이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 턴 서열은 β-턴, γ-턴, α-턴, π-턴 또는 ω-loop 이다(Venkatachalam CM (1968), Biopolymers, 6, 1425-1436; Nemethy G and Printz MP. (1972), Macromolecules, 5, 755-758; Lewis PN et al., (1973), Biochim. Biophys. Acta, 303, 211-229; Toniolo C. (1980) CRC Crit. Rev. Biochem., 9, 1-44; Richardson JS. (1981), Adv. Protein Chem., 34, 167-339; Rose GD et al., (1985), Adv. Protein Chem., 37, 1-109; Milner-White EJ and Poet R. (1987), TIBS, 12, 189-192; Wilmot CM and Thornton JM. (1988), J. Mol. Biol., 203, 221-232; Milner-White EJ. (1990), J. Mol. Biol., 216, 385-397; Pavone V et al. (1996), Biopolymers, 38, 705-721; Rajashankar KR and Ramakumar S. (1996), Protein Sci., 5, 932-946). 가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 턴 서열은 β-턴이다.

턴 서열로서 β-턴이 이용되는 경우, 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II', 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, 보다 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 턴 서열이고, 보다 더 바람직하게는 타입 I' 또는 타입 II' 턴 서열이며, 가장 바람직하게는 타입 I' 턴 서열이다(B. L. Sibanda et al., J. Mol. Biol., 1989, 206, 4, 759-777; B. L. Sibanda et al., Methods Enzymol., 1991, 202, 59-82).

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 턴 서열로서 이용될 수 있는 것은 H. Jane Dyson et al., Eur. J. Biochem. 255:462-471(1998)에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 턴 서열로 이용될 수 있는 것은 다음의 아미노산 서열을 포함한다: X-Pro-Gly-Glu-Val; Ala-X-Gly-Glu-Val (X 는 20 개의 아미노산으로부터 선택된다).

본 발명의 일 구현예에 따라, 구조안정화 부위로서 β-쉬트 또는 루이신 지퍼가 이용되는 경우, 패러럴 방식으로 정렬된 2 개의 가닥 또는 안티패러럴 방식으로 정렬된 2 개의 가닥을 펩타이드 링커가 연결하는 것이 바람직하다.

펩타이드 링커는 당업계에 공지된 어떠한 것도 이용 가능하다. 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션(flexible extended conformation)에 적용될 수 있는 능력; (b) 생물학적 타겟 분자와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 생물학적 타겟 분자와 상호작용하는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재. 바람직한 펩타이드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. Thr 및 Ala 과 같은 다른 중성 아미노산들도 링커 서열에 포함될 수 있다. 링커에 적합한 아미노산 서열은 Maratea et al., Gene 40:39-46( 1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 83:8258-8562(1986); 미국 특허 제 4,935,233 호, 제 4,751,180 호 및 제 5,990,275 호에 개시되어 있다. 펩타이드 링커 서열은 1-50 아미노산 잔기로 구성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조안정화 부위는 β-헤어핀, 링커로 연결된 β-쉬트 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼이고, 보다 바람직하게는 구조안정화 부위는 β-헤어핀 또는 링커로 연결된 β-쉬트이며, 가장 바람직하게는 β-헤어핀이다.

본 명세서에서 용어 "β-헤어핀" 은 두 개의 β 가닥을 포함하는 가장 간단한 단백질 모티프를 의미하며, 이 두 개의 β 가닥은 서로 안티패러럴한 정렬을 나타낸다. 이 β-헤어핀에서 두 개의 β 가닥은 일반적으로 턴 서열에 의해 연결된다.

바람직하게는, β-헤어핀에 적용되는 턴 서열은 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II', 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, 보다 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 턴 서열이고, 보다 더 바람직하게는 타입 I' 또는 타입 II' 턴 서열이며, 가장 바람직하게는 타입 I' 턴 서열이다. 또한, X-Pro-Gly-Glu-Val; 또는 Ala-X-Gly-Glu-Val (X 는 20 개의 아미노산으로부터 선택된다)으로 표시되는 턴 서열도 β-헤어핀에 이용될 수 있다.

본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 타입 I 턴 서열은 Asp-Asp-Ala-Thr-Lys-Thr 이고, 타입 I' 턴 서열은 Glu-Asn-Gly-Lys 이며, 타입 II 턴 서열은 X-Pro-Gly-Glu-Val; 또는 Ala-X-Gly-Glu-Val (X 는 20 개의 아미노산으로부터 선택된다)이고, 타입 II' 턴 서열은 Glu-Gly-Asn-Lys 또는 Glu-D-Pro-Asn-Lys 이다.

β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,914,123 호 및 Andrea G. Cochran et al., PNAS, 98(10):5578-5583)에 개시되어 있는 트립토판 지퍼, WO 2005/047503 에 개시되어 있는 주형-고정된 β-헤어핀 미멕틱, 미국 특허 제 5,807,979 호에 개시되어 있는 β-헤어핀 변형체들이 잘 알려져 있다. 이외에도, β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드는 Smith ＆ Regan (1995) Science 270:980-982; Chou ＆ Fassman (1978) Annu. Rev. Biochem. 47:251-276; Kim ＆ Berg (1993) Nature 362:267-270; Minor ＆ Kim (1994) Nature 367:660-663; Minor ＆ Kim (1993) Nature 371:264-267; Smith et al. Biochemistry (1994) 33:5510-5517; Searle et al. (1995) Nat. Struct. Biol. 2:999-1006; Haque ＆ Gellman (1997) J. Am. Chem. Soc. 119:2303-2304; Blanco et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:5887-5888; de Alba et al. (1996) Fold. Des. 1: 133-144; de Alba et al. (1997) Protein Sci. 6:2548-2560; Ramirez-Alvarado et al. (1996) Nat. Struct. Biol. 3:604-612; Stanger ＆ Gellman (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:4236-4237; Maynard ＆ Searle (1997) Chem. Commun. 1297-1298; Griffiths-Jones et al. (1998) Chem. Commun. 789-790; Maynard et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:1996-2007; 및 Blanco et al. (1994) Nat. Struct. Biol. 1:584-590 에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드를 구조안정화 부위로 이용하는 경우, 가장 바람직하게는 트립토판 지퍼를 이용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 트립토판 지퍼는 다음 일반식 I로 표시된다:

일반식 I

X₁은 Ser 또는 Gly-Glu 이고, X₂ 및 X'₂는 서로 독립적으로 Thr, His, Val, Ile, Phe 또는 Tyr 이며, X₃는 Trp 또는 Tyr 이고, X₄는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₅는 Trp 또는 Phe 이며, X₆는 Trp 또는 Val 이고, X₇는 Lys 또는 Thr-Glu 이다.

보다 바람직하게는, 상기 일반식 I 에서 X₁은 Ser 또는 Gly-Glu 이고, X₂ 및 X'₂는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val 이며, X₃ 는 Trp 또는 Tyr 이고, X₄는 타입 I, 타입 I', 타입 II 또는 타입 II' 턴 서열이고, X₅는 Trp 또는 Phe 이며, X₆는 Trp 또는 Val 이고, X₇는 Lys 또는 Thr-Glu 이다.

보다 더 바람직하게는, 일반식 I 에서 X₁은 Ser 또는 Gly-Glu 이고, X₂ 및 X'₂는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val 이며, X₃는 Trp 이고, X₄는 타입 I, 타입 I', 타입 II 또는 타입 II' 턴 서열이고, X₅는 Trp 이며, X₆는 Trp 이고, X₇는 Lys 또는 Thr-Glu 이다.

보다 더욱 더 바람직하게는, 일반식 I 에서 X₁은 Ser 이고, X₂ 및 X'₂는 Thr 이며, X₃는 Trp 이고, X₄는 타입 I' 또는 타입 II' 턴 서열이고, X₅는 Trp 이며, X₆는 Trp 이고, X₇는 Lys 이다.

가장 바람직하게는, 일반식 I 에서 X₁ 은 Ser 이고, X₂ 및 X'₂ 는 Thr 이며, X₃는 Trp 이고, X₄는 타입 I' 턴 서열 (ENGK) 또는 타입 II' 턴 서열(EGNK)이고, X₅는 Trp 이며, X₆는 Trp 이고, X₇는 Lys 이다.

본 발명에 적합한 트립토판 지퍼의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제 1 서열 내지 제 3 서열 및 제 5 서열 내지 제 10 서열에 기재되어 있다.

본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용가능한 β-헤어핀 펩타이드는 단백질 G 의 B1 도멘인으로부터 유래된 펩타이드, 즉 GB1 펩타이드이다.

본 발명에서 GB1 펩타이드가 이용되는 경우, 바람직하게는 구조안정화 부위는 다음 일반식 II로 표시된다:

일반식 II

X₁은 Arg, Gly-Glu 또는 Lys-Lys 이고, X₂는 Gln 또는 Thr 이며, X₃는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₄는 Gln, Thr-Glu 또는 Gln-Glu 이다.

보다 바람직하게는, 일반식 II의 구조안정화 부위는 다음 일반식 II'으로 표시된다:

일반식 II

X₁은 Gly-Glu 또는 Lys-Lys 이고, X₂는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₃ 는 Thr-Glu 또는 Gln-Glu 이다.

본 발명에 적합한 GB1 β-헤어핀의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제 4 서열 및 제 14 서열 내지 제 15 서열에 기재되어 있다.

본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 β-헤어핀 펩타이드는 HP 펩타이드이다. 본 발명에서 HP 펩타이드가 이용되는 경우, 바람직하게는 구조안정화 부위는 다음 일반식 III으로 표시된다:

일반식 III

X₁은 Lys 또는 Lys-Lys 이고, X₂는 Trp 또는 Tyr 이고, X₃는 Val 또는 Thr 이며, X₄는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₅는 Trp 또는 Ala 이며, X₆는 Trp 또는 Val 이고, X₇은 Glu 또는 Gln-Glu 이다.

본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 또 다른 β-헤어핀 펩타이드는 다음 일반식 IV로 표시된다:

일반식 IV

X₁은 Lys-Thr 또는 Gly 이고, X₂는 Trp 또는 Tyr 이고, X₃는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₄는 Thr-Glu 또는 Gly 이다.

일반식 III 및 IV 의 β-헤어핀의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제 11 서열 내지 제 12 서열, 제 15 서열 및 제 16 서열 내지 제 19 서열에 기재되어 있다.

본 발명에 따르면, 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 β-쉬트를 이용할 수 있다. β-쉬트 구조에서 패러럴 또는 안티패러럴한, 바람직하게는 안티패러럴한 두 개의 아미노산 가닥이 뻗은 구조(extended form)로 되어 있으며, 아미노산 가닥 사이에 수소 결합이 형성된다.

β-쉬트 구조에서 두 개의 아미노산 가닥의 인접한 두 말단은 링커에 의해 연결된다. 링커로서는 상술한 다양한 턴-서열 또는 펩타이드 링커가 이용될 수 있다. 턴-서열이 링커로 이용되는 경우, β-턴 서열이 가장 바람직하다.

본 발명의 다른 변형예에 따르면, 구조안정화 부위로서 루이신 지퍼 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼가 이용될 수 있다. 루이신 지퍼는 패러럴한 2 개의 α-사슬의 다이머화를 야기하는 보존성 펩타이드 도메인이며, 일반적으로 유전자 발현에 관여하는 단백질에 발견되는 다이머화 도메인이다("Leucine scissors". Glossary of Biochemistry and Molecular Biology (Revised). (1997). Ed. David M. Glick. London: Portland Press; Landschulz WH, et al. (1988) Science 240:1759-1764). 루이신 지퍼는 일반적으로 헵태드(heptad) 반복 서열을 포함하며, 루이신 잔기가 4 번째 또는 5 번째에 위치해 있다. 예를 들어. 본 발명에 이용될 수 있는 루이신 지퍼는 LEALKEK, LKALEKE, LKKLVGE, LEDKVEE, LENEVAR 또는 LLSKNYH 의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에서 이용되는 루이신 지퍼의 구체적인 예를 서열목록 제 39 서열에 기재되어 있다. 루이신 지퍼의 각각의 반은 짧은 α-사슬로 이루어져 있으며, α-사슬간의 직접적인 루이신 접촉이 있다. 전사인자에 있는 루이신 지퍼는 일반적으로 소수성 루이신 지퍼 부위 및 염기성 부위(DNA 분자의 주 그루브와 상호작용하는 부위)로 이루어져 있다. 본 발명에서 루이신 지퍼가 이용되는 경우에는 염기성 부위는 반드시 필요로 하지 않는다. 루이신 지퍼 구조에서 두 개의 아미노산 가닥(즉, 두 개의 α-사슬)의 인접한 두 말단은 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커로서는 상술한 다양한 턴-서열 또는 펩타이드 링커가 이용될 수 있으며, 바람직하게는 루이신 지퍼의 구조에 영향을 미치지 않는 펩타이드 링커가 이용된다.

상술한 구조안정화 부위의 양 말단에는 무작위 아미노산 서열이 결합된다. 상기 무작위 아미노산 서열이 Cytokine-타겟 결합 부위 I 및 Cytokine-타겟 결합 부위 II를 형성한다. 본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 구조안정화 부위의 양쪽 말단에 Cytokine-타겟 결합 부위 I 및 Cytokine-타겟 결합 부위 II를 연결하여 바이포달 방식으로 펩타이드 바인더를 제작하는 것이다. Cytokine-타겟 결합 부위 I 및 Cytokine-타겟 결합 부위 II는 서로 협동적으로(cooperatively) 타겟에 결합함으로써, Cytokine 에 대한 친화도를 크게 증가시킨다.

Cytokine-타겟 결합 부위 I 의 아미노산 개수 n 은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 2-100 의 정수, 보다 바람직하게는 2-50 의 정수, 보다 더욱 더 바람직하게는 2-20 의 정수, 가장 바람직하게는 3-10 의 정수이다.

Cytokine-타겟 결합 부위 II의 아미노산 개수 m 은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 2-100 의 정수, 보다 바람직하게는 2-50 의 정수, 보다 더욱 더 바람직하게는 2-20 의 정수, 가장 바람직하게는 3-10 의 정수이다.

Cytokine-타겟 결합 부위 I 및 Cytokine-타겟 결합 부위 II에는 서로 각각 다른 또는 동일한 개수의 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. Cytokine-타겟 결합 부위 I 및 Cytokine-타겟 결합 부위 II에는 서로 각각 다른 또는 동일한 아미노산 서열이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 서로 각각 다른 아미노산 서열이 포함된다.

Cytokine-타겟 결합 부위 I 및/또는 Cytokine-타겟 결합 부위 II에 포함되는 아미노산 서열은 선형의 아미노산 서열 또는 환형의 아미노산 서열이다. 타겟 결합 부위의 펩타이드 서열의 안정성을 증가시키기 위하여, Cytokine-타겟 결합 부위 I 및/또는 Cytokine-타겟 결합 부위 II에 포함되는 아미노산 서열 중에서 적어도 하나의 아미노산 잔기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 변형될 수 있다.

생물학적 타겟 분자에 결합되는 본 발명의 Cytokine-BPB 는 생체 내 생리학적 반응의 조절, 생체 내 물질의 검출, 인 비보 분자 이미징, 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조 안정화 부위, Cytokine-타겟 결합 부위 I 또는 Cytokine-타겟 결합 부위 II(보다 바람직하게는, 구조안정화 부위, 보다 더 바람직하게는 구조안정화 부위의 링커)에 카르고가 결합되어 있다. 상기 카르고의 예는 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블, 화학약물, 바이오약물 또는 나노입자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질(예컨대, Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질(예컨대, 초상자성 물질(예: 마그네타이트, Fe₃O₄, γ-Fe₂O₃, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)), 방사성 동위 원소(예컨대, ¹¹C, ¹⁵O, ¹³N, P³², S³⁵, ⁴⁴Sc, ⁴⁵Ti, ¹¹⁸I, ¹³⁶La, ¹⁹⁸Tl, ²⁰⁰Tl, ²⁰⁵Bi 및 ²⁰⁶Bi), 형광물질(플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3 와 Cy5), 화학발광단, 자기입자, 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

Cytokine-타겟 결합 부위 I 및/또는 Cytokine-타겟 결합 부위 II는 Cytokine 에 결합하는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 BPB 분자가 결합하는 Cytokine 은 당업계에 공지된 다양한 Cytokine 을 포함하며, 바람직하게는 TNF(tumor necrosis factor) alpha, TNF beta, interleukin-10(IL-10), interferon beta(IFNβ), interferon alpha(IFNα), interferon gamma (IFNγ), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), leukemia inhibitory factor (LIF), human growth hormone (hGH), ciliary neurotrophic factor (CNTF), leptin, oncostatin M, interleukin-6 (IL-6) and interleukin-12 (IL-12), erythropoietin (EPO), granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), interleukin-2 (IL-2), interleukin-3 (IL-3), interleukin-4 (IL-4), interleukin-5 (IL-5), interleukin-13 (IL-13), Flt13 ligand 및 stem cell factor (SCF)를 포함한다.

본 발명의 Cytokine-BPB 는 Cytokine 에 결합하여 Cytokine 의 작용을 억제하는 작용을 한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 전형적으로 "N-Cytokine-타겟 결합 부위 I-구조안정화 부위의 한 가닥-링커-구조안정화 부위의 다른 가닥-Cytokine-타겟 결합 부위 II-C"의 컨스트럭트를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더에서 Cytokine-타겟 결합 부위 I 과 구조안정화 부위의 한 가닥 사이 및/또는 구조안정화 부위의 다른 가닥-Cytokine-타겟 결합 부위 II 사이에는, Cytokine-타겟 결합 부위와 구조안정화 부위 간의 상호 구조적 영향을 차단하는 구조영향 억제부위(structure influence inhibiting region)를 포함한다. 회전 부위에는 펩타이드 분자에서 φ와 ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산이 위치한다. 바람직하게는, φ와 ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산은 글라이신, 알라닌 및 세린이다. 구조영향 억제부위에는 1-10 개, 바람직하게는 1-8 개, 보다 바람직하게는 1-3 개의 아미노산 잔기가 위치할 수 있다.

상술한 컨스트럭트를 갖는 본 발명의 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 얻을 수 있다. 이 라이브러리에서 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더는 무작위 서열을 갖게 되며, 이는 Cytokine-타겟 결합 부위 I 및/또는 Cytokine-타겟 결합 부위 II의 어떤 위치에서도 서열 선호도(sequence preference)가 없거나 또는 지정(또는 고정)된 아미노산 잔기가 없다는 것을 의미한다.

예를 들어, Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 고상지지체(예컨대, 폴리스틸렌 또는 폴리아크릴아미드 수지) 상에서 실시되는 스플리트-합성 방법(Lam et al. (1991) Nature 354:82; WO 92/00091)에 따라 구축될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 세포 표면 전시(cell surface display)방식(예컨대, 파아지 디스플레이, 박테리아 디스플레이 또는 이스트 디스플레이)으로 구축된다. 바람직하게는, Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 플라스미드, 박테리오파아지, 파아지미드, 이스트, 박테리아, mRNA 또는 라이보좀을 기반으로 하는 디스플레이방법을 통하여 제작될 수 있다.

파아지 디스플레이는 파아지의 표면 상의 코트 단백질에 융합된 단백질 형태로 다양한 폴리펩타이드를 디스플레이하는 기술이다(Scott, J. K. and Smith, G. P. (1990) Science 249: 386; Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Clackson and Lowman, Phage Display, Oxford University Press(2004)). 필라멘트성 파아지(예컨대, M13)의 유전자 III 또는 유전자 VIII에 발현하고자 하는 유전자를 융합시켜 무작위 펩타이드를 디스플레이한다.

파이지 디스플레이에는 파아지미드가 이용될 수 있다. 파아지미드는 박테리아의 복제원점(예컨대, ColE1) 및 박테리오파아지의 인터제닉(intergenic) 부위의 한 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 이 파아지미드에 클로닝된 DNA 단편은 플라스미드처럼 증식된다.

Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리를 파아지 디스플레이 방식으로 구축하는 경우, 본 발명의 바람직한 구현예는 다음의 단계를 포함한다: (i) 파아지 코트 단백질(예컨대, M13 과 같은 필라멘트성 파아지의 유전자 III 또는 유전자 VIII 코트 단백질)을 코딩하는 유전자와 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 유전자가 융합된 융합 유전자; 및 상기 융합 유전자에 작동적으로 결합된 전사 조절 서열(예컨대, lac 프로모터)을 포함하는 발현 벡터의 라이브러리를 제작하는 단계; (ii) 상기 발현 벡터 라이브러리를 적합한 숙주 세포에 도입시키는 단계; (iii) 상기 숙주세포를 배양하여 재조합 파아지 또는 파아지미드 바이러스 파티클을 형성시켜 융합 단백질이 표면에 디스플레이 되도록 하는 단계; (iv) Cytokine 분자와 상기 바이러스 파티클을 접촉시켜 파티클을 타겟 분자에 결합시키는 단계; 및 (v) Cytokine 분자에 결합하지 않은 파티클을 분리하는 단계.

파아지 디스플레이를 이용하여 펩타이드 라이브러리를 구축하고 이들 라이브러리를 스크리닝 하는 방법은 미국 특허 제 5,723,286 호, 제 5,432,018 호, 제 5,580,717 호, 제 5,427,908 호, 제 5,498,530 호, 제 5,770,434 호, 제 5,734,018 호, 제 5,698,426 호, 제 5,763,192 호 및 제 5,723,323 호에 개시되어 있다.

바이포달 펩타이드 바인더를 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제작하는 방법은 당업계에 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어, 공지의 파아지미드 또는 파아지 벡터(예컨대, pIGT2, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1, m663, fdtetDOG, pHEN1, pComb3, pComb8, pCANTAB 5E (Pharmacia), LamdaSurfZap, pIF4, PM48, PM52, PM54, fdH 및 p8V5)에 바이포달 펩타이드 바인더를 유전자를 삽입시켜 발현 벡터를 제작할 수 있다.

대부분의 파아지 디스플레이 방법이 필라멘트성 파아지를 이용하여 실시되지만, 람다 파아지 디스플레이(WO 95/34683; 미국 특허 제 5,627,024 호), T4 파아지 디스플레이(Ren et al. (1998) Gene 215:439; Zhu (1997) CAN 33:534) 및 T7 파아지 디스플레이(미국 특허 제 5,766,905 호)도 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리를 구축하는 데 이용될 수 있다.

벡터 라이브러리를 적합한 숙주 세포에 도입시키는 방법은 다양한 형질전환 방법에 따라 실시될 수 있으며, 가장 바람직하게는 전기천공(electroporation) 방법에 따라 실시된다(참조: 미국 특허 제 5,186,800 호, 제 5,422,272 호, 제 5,750,373 호). 본 발명에 적합한 숙주는 세포는 E. coli 와 같은 그람 음성 박테리아 세포이며, 적합한 E. coli 숙주는 JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 및 E. coli XL-1Blue (Stratagene)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 숙주세포는 형질전환 전에 컴피턴스 세포로 준비하는 것이 바람직하다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 형질전환된 세포의 선별은 일반적으로 항생제(예컨대, 테트라사이클린 및 암피실린)를 포함하는 배지에서 배양하여 실시된다. 선별된 형질전환 세포를 헬퍼 파아지의 존재 하에서 추가적으로 배양하여 재조합 파아지 또는 파아지미드 바이러스 파티클을 생성시킨다. 상기 헬퍼 파아지 파아지로 적합한 것은, Ex 헬퍼 파아지, M13-KO7, M13-VCS 및 R408 을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

생물학적 타겟 분자와 결합하는 바이러스 파티클의 선별은 통상적으로 바이오패닝 과정을 통하여 실시될 수 있다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Clackson and Lowman, Phage Display, Oxford University Press(2004)).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자" 는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자 이외에 상기 핵산 분자에, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자의 5 '-방향쪽에 시그널 서열(예컨대, pelB)를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 바이포달 펩타이드 바인더가 파아지의 표면에 잘 발현되었는지를 확인하기 위한 태깅 서열(예컨대, myc tag)을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 파아지 코트 단백질, 바람직하게는 M13 과 같은 필라멘트성 파아지의 유전자 III 또는 유전자 VIII 코트 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 박테리아의 복제원점(예컨대, ColE1) 및/또는 박테리오파아지의 복제원점을 포함한다. 한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명의 형질전환체는 바람직하게는 E. coli 와 같은 그람 음성 박테리아 세포이며, 적합한 E. coli 숙주는 JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 및 E. coli XL-1Blue (Stratagene)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (미국 특허 제 5,186,800 호, 제 5,422,272 호, 제 5,750,373 호) 등에 의해 실시될 수 있다.

본 발명의 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더는 매우 낮은 수준(예컨대, nM 수준)의 K_D 값(해리상수)을 나타내어, Cytokine 분자에 매우 높은 친화도를 나타내는 펩타이드를 제공한다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 모노포달 방식으로 제작된 바인더와 비교하여 바이포달 펩타이드 바인더는 약 10²-10⁵ 배 (바람직하게는, 약 10³-10⁴ 배) 높은 친화도를 나타낸다.

본 발명의 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더는 의약으로서의 용도를 가질 뿐만 아니라, 생체 내 물질의 검출, 인 비보 분자 이미징, 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 Cytokine 에 특이적으로 결합하는 Cytokine-BPB 를 제공한다.

(ii) 본 발명의 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더에서 구조안정성 부위의 양 말단에 결합되어 있는 이격된(distal) 두 개의 Cytokine-타겟 결합 부위는 서로 협동적으로(cooperatively), 시너직(synergetically)하게 타겟에 결합한다.

(iii) 이에, 본 발명의 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더는 매우 낮은 수준(예컨대, nM 수준)의 K_D 값(해리상수)을 나타내어, 타겟에 매우 높은 친화도를 나타낸다.

(iv) 본 발명의 Cytokine-BPB 는 Cytokine 결합성 및 특이성에 기초하여 다양한 물질들을 세포표면 또는 세포 내로 운반할 수 있다.

도 1a 는 구조안정화 부위로서 β-헤어핀(hairpin)을 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(bipodal-peptide binder) 및 Cytokine-BPB 의 모식도를 나타낸다.
도 1b 는 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 β-쉬트를 포함하는 Cytokine-BPB 의 모식도를 나타낸다.
도 1c 는 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 루이신 지퍼를 포함하는 Cytokine-BPB 의 모식도를 나타낸다.
도 1d 는 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 루이신-리치 모티프(leucine-rich motif)를 포함하는 Cytokine-BPB 의 모식도를 나타낸다.
도 2 는 Cytokine-BPB 라이브러리를 클로닝하기 위한 전략을 나타낸다. pIGT2 파이지미드 벡터 맵에서, pelB 시그널서열, myc tag 은 목적 유전자가 파아지의 표면에 잘 발현되었는지를 확인하기 위한 태깅 서열이다. 프로모터로서 lac 프로모터가 이용되었다.
도 3 은 TNFα-BPB 의 TNF-α 세포독성 억제 분석 결과이다.
도 4a 는 피르로넥틴 ED-B 단백질에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 4b 는 바이포달 펩타이드 바인더 BPB 의 공동 작용 효과의 증명을 위한 친화력을 측정한 결과이다.
도 5 는 바이포달 펩타이드 바인더에서 구조 안정화 부위를 트립토판 지퍼 대신 여러 β-헤어핀 모티프로 바꾸어 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 6 은 바이포달 펩타이드 바인더에서 구조 안정화 부위를 트립토판 지퍼 대신 루이신 지퍼로 바꾸어 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 7 은 VEGF 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더를 선별하기 위하여 실시한 VEGF 단백질에 대한 바이오 패닝 결과이다.
도 8 은 VEGF 에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 특이성을 측정한 결과이다. a) BPB1_VEGF b)BPB2_VEGF c)BPB3_VEGF d)BPB4_VEGF
도 9 는 VEGF 에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 세포에서 VEGF 활성 억제 정도를 측정한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

실시예 1: 라이브러리의 제작

바이포달 펩타이드 바인더 유전자 제작 및 파아지미드 벡터에의 삽입

두 개의 올리고뉴클레오티드 Beta-F1 (5'-TTCTATGCGGCCCAGCTGGCC(NNK)₆GGATCTTGGACATGGGAAAACGGAAAA-3') 및 Beta-B1 (5'-AACAGTTTCTGCGGCCGCTCCTCC TCC(MNN)₆TCCCTTCCATGTCCATTTTCCGTT-3')(N 은 A, T, G 또는 C; K 는 G 또는 T; M 은 C 또는 A)를 합성하였다. 이중 사슬을 만들기 위해서 Beta-F1 4 μM, Beta-B1 4 μM, 2.5 mM dNTP 혼합액 4 ㎕, ExTaq DNA 중합효소 1 ㎕(Takara, Seoul, Korea) 및 10×PCR 버퍼 5 ㎕를 혼합하여 총 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 총 25 개 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응(94℃에서 5 분, 60 싸이클: 30℃에서 30 초, 72℃에서 30 초 및 72℃에서 7 분)을 하여 이중 사슬로 만든 후 PCR 정제 키트(GeneAll, Seoul, Korea) 를 이용하여 정제하여, 바이포달 펩타이드 바인더 유전자를 얻었다. 바이포달 펩타이드 바인더에 삽입시킬 유전자를 pIGT2 파아지미드 벡터(Ig therapy, Chuncheon, Korea) 에 연결하기 위해 인서트 유전자와 pIGT2 파아지미드 벡터에 제한효소를 처리하였다. 약 11 ㎍의 인서트 DNA 를 SfiI(New England Biolabs(NEB, Ipswich) 및 NotI(NEB, Ipswich)으로 각각 4 시간 씩 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 또한, 약 40 ㎍의 pIGT2 파아지미드 벡터를 SfiI 및 NotI 으로 각각 4 시간 씩 반응시킨 후 CIAP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)(NEB, Ipswich)를 넣고 1 시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 이들을 UV-가시광선 분광기(Ultrospec 2100pro, Amersham Bioscience)로 정량하여 2.9 ㎍의 인서트 유전자를 T4 DNA 리가아제(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 pIGT2 파아지미드 벡터 12 ㎍과 18℃에서 15 시간 동안 연결한 후, 에탄올로 침전시켜 TE 버퍼 100 ㎕로 DNA 를 용해시켰다.

컴피턴트 세포의 준비

E. coli XL1-BLUE 세포(American Type Culture Collection, Manassas, USA)를 LB 아가-플레이트에 선상 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5 ㎖의 LB 배지에 접종한 후 37℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양하였다. 배양된 10 ㎖의 세포들을 2 ℓ의 LB 배지에 접종하고 같은 방식으로 600 nm 의 파장에서 흡광도가 0.3-0.4 가 될 때까지 배양하였다. 배양된 플라스크를 30 분 동안 얼음에 방치한 후, 4℃ 에서 4,000× g 로 20 분 동안 원심 분리하여 가라앉은 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 1 ℓ의 냉각된 멸균 증류수로 현탁시켰다. 이것을 다시 같은 방법으로 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 1 ℓ의 냉각된 멸균 증류수로 재현탁시키고 같은 방식으로 10% 글리세롤 용액 40 ㎖로 세척을 반복하여 원심 분리한 후, 마지막으로 10% 글리세롤 용액 4 ㎖으로 현탁시킨 후, 200 ㎕씩 분주하여 액체 질소에 냉동시킨 뒤 -80℃에 보관하였다.

전기 천공법

파아지미드 벡터 12 ㎍과 바이포달 펩타이드 바인더에 인서트 DNA 2.9 ㎍을 연결 반응시킨 100 ㎕를 25 개로 분주하여 전기 천공을 수행하였다. 컴피턴트 세포를 얼음 위에서 녹이고, 200 ㎕의 컴피턴트 세포를 연결 반응시킨 용액 4 ㎕와 혼합한 후, 냉각하여 준비된 0.2 cm 의 큐벳에 넣은 뒤 1 분 동안 얼음 위에 두었다. 전기 천공기 (BioRad, Hercules, CA)를 200 Ω에서 25 μF 및 2.5 kV 의 조건으로 프로그램하고 준비된 큐벳의 물기를 제거하고 전기 천공기에 위치시킨 후 펄스를 주었다(시간 상수는 4.5-5 msec). 이후 즉시 37℃로 준비한 20 mM 의 글루코오스가 포함된 1 ㎖의 LB 액체배지에 넣고 얻어진 총 25 ㎖의 세포를 100 ㎖ 시험관에 옮겼다. 한 시간 동안 37℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하며 배양한 후 라이브러리의 개수를 측정하기 위해 10 ㎕를 희석해서 암피실린 아가 배지에 도말하였다. 남은 세포를 1 ℓ의 LB 에 20 mM 글루코오스 및 50 ㎍/㎖의 암피실린을 넣고 30℃에서 하루 동안 배양하였다. 4℃ 에서 4,000×g 로 20 분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 40 ㎖의 LB 로 재현탁시킨 후 글리세롤을 최종 농도 20% 이상 넣고 -80℃에 보관하였다.

라이브러리에서 재조합 파아지 생산과 PEG 침전

-80℃에 저장된 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리에서 재조합 파아지를 생산하였다. 500 ㎖ 플라스크에 100 ㎖의 LB 액체배지에 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 20 mM 의 글루코오스를 넣은 후, -80℃ 에 보관된 라이브러리 1 ㎖을 추가하여 한 시간 동안 37℃에서 150 rpm 의 속도로 혼합하며 배양하였다. 여기에 1×10¹¹ pfu 의 Ex 헬퍼 파아지(Ig therapy, Chuncheon, Korea)를 넣고 다시 한 시간 동안 같은 조건으로 배양하였다. 1,000×g 로 10 분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하고 여기에 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 LB 액체배지 100 ㎖을 넣고 하루 동안 배양하여 재조합 파아지를 생산하였다. 배양액을 3,000×g 로 10 분 동안 원심 분리하여 얻은 상층액 100 ㎖에 PEG/NaCl 25 ㎖을 혼합하고 얼음에 1 시간 동안 방치시킨 후, 4℃에서 20 분 동안 10,000× g 로 원심 분리하여 상층액은 조심스럽게 제거하고 2 ㎖의 PBS(pH 7.4)로 펠렛을 재현탁시켰다.

실시예 2: 단백질의 준비

Human 과 Mouse TNFa 유전자 제작과 Expression vector 에 삽입

한국생명공학 연구원에서 Human and Mouse TNFa 유전자를 공급받았다. 두 개의 primer 인 5' - AATAAAACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3' (mTNF_F1)와 5' -ATGGATCCCAGAGCAATGACTCC-3' (mTNF_B1)을 합성하여 mTNF-F1 20 pmol, mTNF-B1 20 pmol, 2.5mM dNTP mixture 4μl, Ex Taq DNA polymerase 1μl (10 U), 10×PCR buffer 5μl 를 섞고 총 50μl 가 되도록 증류수를 추가한 혼합액을 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응 (94℃ 5 분, 30 cycle: 55 ℃ 30 초와 72 ℃ 1 분, 94℃ 30 초)을 하여 mTNFa Insert 로 만든 후 PCR purification kit 을 이용하여 정제하였다. mTNFa Insert 유전자를 pET28b 벡터에 연결하기 위해 mTNFa Insert 유전자와 pET28b 벡터에 제한효소처리를 시행하였다. 약 2μg 의 Insert DNA 를 BamHI (NEB)와 NdeI(NEB)로 4 시간씩 반응시킨 후 PCR purification kit 을 이용하여 정제하였다. 그리고 약 2ug 의 pET28b 벡터를 BamHI (NEB)와 NdeI(NEB)로 3 시간씩 반응시킨 후 Calf Intestinal Alkaline Phosphatase(CIP)를 1 시간 반응한 후 PCR purification kit 을 이용하여 정제하였다. 이들을 molar ratio vector: Insert=1:3 으로 T4 DNA ligase(Bioneer)를 이용하여 18℃, 10 시간 동안 연결한 후 XL-1 competent cell 에 transformation 을 한 후 kanamycine agar 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 집락을 5 ml 의 LB 배지에 접종한 뒤 37 ℃ 에서 200 rpm 의 속도로 섞어주면서 하룻동안 배양한 후 plasmid preparation kit 을 이용하여 plasmid 을 정제하여 sequencing 을 하여 클로닝이 성공했는지 확인하였다. Human TNFa 도 위와 똑 같은 방법으로 pET28b 벡터에 삽입하였다.

TNFa 발현 및 정제

TNF-a 를 클로닝한 pET28b vector 를 BL21 cell 에 transformation 한 후 kanamycine agar 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 집락을 kanamycine(25ug/ml)을넣어준 5ml LB 배지에 접종한 뒤 37 ℃ 에서 200 rpm 의 속도로 섞어주면서 하룻동안 배양한 후 50ml kanamycine(25ug/ml) LB 배지에 옮겨 3 시간 키웠다. 이렇게 키운 E.coli 을 2L LB 에 kanamycine(25ug/ml)을 넣고 50ml 키운 E.coli 를 넣고 OD=0.6-0.8 까지 키웠다. 그 다음 1mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)를 넣어주어 37℃ 에서 200rpm 의 속도로 섞어주면서 8 시간 키웠다. 4,000 g 로 20 분간 원심 분리하여 가라앉은 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, lysis buffer (50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl and 5 mM imidazole)로 재부유시켰다. -80 ℃ 에 하루동안 보관한 후 Sonicator 를 이용하여 E.coli 용해시킨 후에 15,000 g 로 1 시간 동안 원심 분리하여 상층액을 Ni-NTA affinity resin 에 붙인다. Lysis buffer 로 resin 을 씻어 준 후 Elution buffer (50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl and 300 mM imidazole)을 이용하여 N-terminal His-tag TNFa 단백질을 떨어뜨려 모은다. 이렇게 모은 단백질을 superdex75 column 와 PBS(pH7.4) buffer 을 이용하여 gel filtration 을 하여 순도 높은 TNFa 단백질을 모은다.

실시예 3: 바이오 패닝

Cytokine 의 대표적인 단백질로서 TNF-α에 대하여 바이오 패닝을 하였다. 또한, BPB 의 기본적인 작동을 확인하기 위한 모델 단백질로서 피브로넥틴(Fibronectin) ED-B 를 선택하였고, 이에 대하여도 바이오 패닝을 하였다.

상기 실시예 1 에서 제작한 BPB(Bipodal-peptide binder) 라이브러리를 각각의 단백질에 대해 5 차에 걸쳐 바이오패닝을 실시하고 각 패닝 단계에서 회수한 파아지 펩타이드들의 output phage/input phage 비(ratio)를 결정하였다.

상기 단백질(5 ㎍/㎖)을 96 웰 ELISA 플레이트(Corning)의 10 개의 웰에 50 ㎕씩 넣은 후, 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였고, 다음날 2% BSA 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹한 후, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST 로 3 회 세척하였다. 여기에 바이포달 펩타이드 바인더 재조합 파아지 포함용액 800 ㎕ 및 10% BSA 200 ㎕을 혼합하여 GPR 39 단백질에 결합한 10 개의 웰에 옮겨 상온에서 1 시간 동안 방치하였다. 10 개 웰의 용액을 모두 제거하고 0.1% PBST 로 10 회 세척한 뒤 0.2 M 글리신/HCl(pH 2.2) 1 ㎖을 각 웰당 50 ㎕씩 넣어 20 분간 파아지를 용리시키고 1 ㎖을 튜브에 모아 여기에 2M Tris-base(pH 9.0) 150 ㎕를 넣어 용액을 중화시켰다. 각 바이오 패닝마다 인풋 파아지 및 일루트 파아지의 수를 측정하기 위해 OD=0.7 인 XL-1 BLUE 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 10 ㎖의 E. coli XL1-BLUE 세포와 섞어 37℃에서 1 시간 동안 200 rpm 의 속도로 혼합하며 배양하였다. 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 20 mM 글루코오스를 혼합한 후, 2×10¹⁰ pfu 의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 200 rpm 의 속도로 혼합하며 배양하였다. 배양액을 1,000×g 로 10 분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 40 ㎖ LB 액체 배지로 재현탁하여 30℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 4,000×g, 20 분 및 4℃의 조건으로 원심 분리하였다. 상층액에 8 ㎖의 5x PEG/NaCl[20% PEG(w/v) 및 15% NaCl(w/v)]을 첨가한 후 4℃에서 1 시간 동안 정치시켰다. 원심분리 후 PEG 용액을 완전히 제거하고 1 ㎖의 PBS 용액으로 파아지 펩타이드 펠렛을 녹인 다음 2 차 바이오패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며, 세척과정만 단계별로 각각 20회 및 30회(0.1% PBST) 증가시켰다.

실시예 4: TNF-α 또는 피브로넥틴 ED-B 에 특이적인 파아지 펩타이드 검색(파아지 ELISA)

아웃풋 파아지/인풋 파아지 비율이 가장 높은 바이오패닝 단계에서 회수한 파아지를 XL1-BLUE 세포에 감염시킨 후 플라크가 플레이트당 100-200 개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크 60 개를 2 ㎖의 LB-암피실린(50 ㎍/㎖) 배양액에 접종한 후 37℃에서 5 시간 동안 진탕 배양하여 OD=0.8-1 에서 5×10⁹ pfu 의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 200 rpm 의 속도로 혼합하며 배양하였다. 배양액을 1,000×g 로 10 분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 1 ㎖의 LB 액체배지로 재현탁하여 30℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 10,000×g, 20 분 및 4℃의 조건으로 원심 분리하여 상층액을 회수한 후 2%의 탈지 우유를 넣고 이를 파아지 펩타이드 검색에 사용하였다. 96 웰 ELISA 플레이트에 5 ㎍/㎖의 GPR 39 또는 Fibronectin ED-B 을 각 웰당 50 ㎕씩 30 개의 웰에 넣고, 또한 10 ㎍/㎖의 BSA 을 각 웰당 50 ㎕씩 30 개의 웰에 넣어 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰을 0.1% PBST 로 3 회 세척하고 PBS 로 희석한 2% 탈지 우유를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST 로 3 회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 파아지 펩타이드 용액 100 ㎕씩을 모든 웰에 분주하고 27℃에서 1 시간 30 분 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 5 회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항-M13 항체(GE Healthcare)를 1:1,000 으로 희석하여 27℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 0.1% PBST 로 5 회 세척한 후 TMB 용액 100 ㎕를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100 ㎕의 1 M HCl 를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450 nm 에서 흡광도를 측정하여 BSA 에 비해 흡광도가 높은 클론들을 선택하였다. 이들의 파아지를 XL1 세포에 감염시킨 후 플라크가 플레이트당 100-200 개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크를 4 ㎖의 LB-암피실린(50 ㎍/㎖) 배양액에 접종한 후 37℃에서 하루 동안 진탕 배양하여 플라스미드 프랩 키트을 이용하여 플라스미드를 정제하여 시퀀싱을 의뢰하였다(Genotech, Daejeon, Korea). 시퀀싱 프라이머는 벡터 시퀀스인 5'-GATTACGCCAAGCTTTGGAGC-3'을 사용하였다.

실시예 5: 바인딩 어세이

DNA 시퀀싱에서 중복되어 나온 ED-B 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더 펩타이드를 합성(애니젠, 한국)을 하였다. 친화도의 측정은 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 수행하였다. ED-B 는 스트랩타비딘 SA 칩(Biacore)에 바이오틴-EDB 을 2,000 RU 만큼 흘려주어 고정시켰다. 러닝 버퍼로는 PBS(pH 7.4)을 사용하였고, 플로우는 분당 30 ㎕로 흘리면서 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation 소프트웨어(Biacore AB, Uppsala, Sweden)로 친화도를 계산하였다.

실시예 6: TNF-α의 세포독성 억제 실험

합성한 TNF-α-BPP 가 TNF-α의 세포독성 억제 실험을 TNF-α sensitive 세포인 L929 fibroblast 를 이용하여 실험을 하였다. L929 세포를 10⁵ 개를 96 well plate 에 넣은 다음에 12 시간 후에 TNF-α와 TNF-α-BPB 를 5 uM 로 처리한 후에 20 시간 후에 MTT solution 을 처리하여 세포독성 억제 정도를 측정하였다.

실험 결과

실시예 7: 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리의 제작

바이포달 펩타이드 바인더의 구조 안정화 부위로는 안정한 베타-헤어핀 모티프를 사용하였다. 특히 트립토판-트립토판 아미노산의 상호 작용에 의해 베타-헤어핀 모티프 구조를 안정하게 이루어 주는 트립토판 지퍼(Andrea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 98:5578-5583(2001))을 이용하였다. 뼈대인 트립토판 지퍼의 N- 및 C-말단 부분에 각각 6 개 아미노산을 무작위로 배열함으로써 두 부분에 가변적 부위를 생성하였다(도 1a). 이를 바이포달 펩타이드 바인더라고 명명하였으며 양쪽의 가변적 부위를 가지고 있어 항원에 공동작용으로 붙을 수 있어 높은 친화력 및 특이성을 가질 수 있다. 또한, 바이포달 펩타이드 바인더의 구조 안정화 부위는 도 1b 내지 도 1e 와 같이 여러 가지로 구성될 수 있다.

합성한 2 개의 무작위 서열 올리고뉴클레오티드를 PCR 반응을 통해 이중 사슬로 만든 후 제한효소인 SfiI 및 NotI 으로 자른 후 pIGT2 파아지미드 벡터에 클로닝을 하여 8×10⁸ 이상의 라이브러리를 구축하였다(도 2).

실시예 8: 바이오 패닝 결과

바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리를 피브로넥틴 ED-B 또는 TNF-α 단백질에 대해 3-5 차에 걸쳐 바이오 패닝을 실시하고 각 패닝 단계에서 회수한 파아지 펩타이드들의 아웃풋 파아지/인풋 파아지의 비율을 결정하였다(표 1a 및 1b).

[표 1a]

[표 1b]

실시예 9: 타겟에 특이적인 파아지 펩타이드 검색(파아지 ELISA) 및 시퀀싱

각 라이브러리의 패닝 단계중 아웃풋/인풋의 비율이 가장 높은 단계에서 회수한 파아지를 플라크 형태로 확보하였다. 각 플라크로부터 60 개의 파아지를 증폭시킨 후 BSA 에 대해 ELISA 를 수행하였다. BSA 에 비해 흡광도가 높은 클론들을 선택하여 DNA 시퀀싱을 의뢰하였다. 이로부터 중복된 각각의 단백질에 특이적인 펩타이드 시퀀스를 얻었다(표 2a 및 표 2b).

[표 2a]

[표 2b]

실시예 10: TNF-α 세포독성 억제 실험

TNF-α sensitive 한 세포인 L929 세포를 이용한 TNFα-BPB 의 억제 실험을 진행하였다. TNFα-BPB 를 5 uM 을 TNF-α와 같이 투여하였을 때 의미있게 아폽토시스가 억제됨을 볼 수 있다(도 3).

실시예 11: 피브로넥틴 ED-B 의 친화도의 측정

피브로넥틴 ED-B 에 대한 상기 펩타이드를 합성하여 SPR Biacore system(Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 친화도를 측정하였다. 피브로넥틴 ED-B 에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1 은 620 nM 를 나타내었고, 펩타이드 2 는 75 nM 를 나타내었으며, 펩타이드 3 은 2.5 μM 을 나타내었다(도 4a).

실시예 12: SPR(Surface Plasmon Resonance)에 의한 공동 작용 효과 확인

바이포달 펩타이드 바인더의 항원에 대한 공동 작용 효과를 증명하기 위해서 친화력이 가장 좋은 표 2a 의 ED-B 에 대한 펩타이드 2 의 N- 및 C-말단 한쪽 부위만 각각 제거한 펩타이드를 합성하여 친화력을 측정하였다. N-말단 부분은 592 μM 을 가지며 C-말단 부분은 12.8 μM 을 나타내었다(도 4b). 바이포달 펩타이드 바인더에서 양발(bipodal)을 가지고 있음으로써 나타내는 공동 작용 효과는 43 nM 의 친화력임을 증명하였다(도 4a).

실시예 13: 다른 β-헤어핀에 대한 바인딩 어세이

트립토판 지퍼 이외에 다른 β-헤어핀 골격인 GB1m3 및 HP7 에 ED-B 에 특이적으로 결합하는 Peptide2 의 N-말단 시퀀스(HCSSAV)와 C-말단 시퀀스(IIRLEQ)를 가지도록 펩타이드를 합성하였다(애니젠, 한국). 즉, 트립토판 지퍼를 포함한 바이포달 펩타이드 바인더의 시퀀스는 HCSSAVGSWTWENGKWTWKGIIRLEQ 이며 GB1m3 을 포함한 바이포달 펩타이드 바인더는 HCSSAVGKKWTYNPATGKFTVQEGIIRLEQ 이고, HP7 을 포함한 바이포달 펩타이드 바인더는 HCSSAVGKTWNPATGKWTEGIIRLEQ 이다. 각 펩타이드의 친화도는 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 측정하였다. 스트랩타비딘 SA 칩(Biacore AB, Uppsala, Sweden)에 비오틴-EDB 를 2,000 RU 만큼 흘려주어 고정시켰다. 러닝 버퍼로는 PBS(pH 7.4)를 사용하였고 플로우는 분당 30 ㎕로 흘리면서 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation 으로 친화도를 계산하였다. 친화도를 측정한 결과 GB1m3 가 70 nM, HP7 이 84 nM 로 트립토판 지퍼(43 nM)와 비슷한 친화력을 가짐을 확인하였다(도 5). 이는 모든 안정한 β-헤어핀 모티프가 구조 안정화 부위로서 가능함을 증명하는 결과이다.

실시예 14: 구조안정화 부위로서 루이신 지퍼를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더에 대한 바인딩 어세이

β-헤어핀 골격 대신 구조안정화 부위로서 루이신 지퍼에 ED-B 에 특이적으로 결합하는 펩타이드 2 의 N-말단 시퀀스(HCSSAV)와 C-말단 시퀀스(IIRLEQ)를 가지도록 CSSPIQGGSMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER 및 IIRLEQGGSMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER 펩타이드를 합성하였다(애니젠, 한국). 두 펩타이드를 다이머로 만든 다음 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 친화도를 측정하였다. 친화도를 측정한 결과, 루이신 지퍼는 5 μM 의 친화도를 나타내었고 이는 트립토판 지퍼(43 nM)의 비슷한 친화도보다 떨어지는 친화도이기는 하지만 루이신 지퍼도 바이포달 펩타이드 바인더의 구조 안정화 부위로서 기능할 수 있음을 알 수 있다(도 6).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

실시예 15: 사이토카인 VEGF121 에 특이적인 BPB

VEGF121 의 발현 및 정제

VEGF121 를 클로닝한 pET32a 벡터(Novagen)를 각각 AD494 세포에 형질전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(25 ㎍/㎖)이 포함된 5 ㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(25 ㎍/㎖)이 포함된 50 ㎖의 LB 배지에 옮겨 3 시간 배양하였다. 배양한 E. coli 를 암피실린(25 ㎍/㎖)이 포함된 2 ℓ의 LB 에 접종하고 OD=0.6-0.8 까지 배양하였다. 이후 1 mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 37℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하면서 8 시간 동안 배양하였다. 4,000×g 로 20 분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(50 mM 소듐 포스페이트(pH 8.0), 300 mM NaCl 및 5 mM 이미다졸)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 소니케이터를 이용하여 E. coli 를 용해시킨 후에 15,000×g 로 1 시간 동안 원심 분리하여 상층액을 Ni-NTA 친화성 레진(Elpisbio, Daejeon, Korea)에 결합시킨다. 라이시스 버퍼로 레진을 세척한 후 일루션 버퍼(50 mM 소듐 포스페이트(pH 8.0), 300 mM NaCl 및 300 mM 이미다졸)을 이용하여 Trx-VEGF121 단백질을 용출시켜 획득하였다. 이렇게 획득한 단백질을 Superdex75 컬럼(GE Healthcare, United Kingdom) 및 PBS(pH 7.4) 버퍼를 이용하여 겔 여과법(gel filtration)으로 순도 높은 VEGF-Trx 단백질을 얻었다. 순수한 VEGF 을 얻기 위하여 트롬빈으로 VEGF 와 Trx(thioredoxin reductase) 사이를 잘라 VEGF121 을 얻었다.

VEGF 의 바이오 패닝 방법

정제한 VEGF(5 ㎍/㎖)을 96 웰 ELISA 플레이트(Corning)의 10 개의 웰에 50 ㎕씩 넣은 후, 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였고, 다음날 2% BSA 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹한 후, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST 로 3 회 세척하였다. 여기에 바이포달 펩타이드 바인더 재조합 파아지 포함용액 800 ㎕ 및 10% BSA 200 ㎕을 혼합하여 VEGF 가 결합한 10 개의 웰에 옮겨 상온에서 1 시간 동안 방치하였다. 10 개 웰의 용액을 모두 제거하고 0.1% PBST 로 10 회 세척한 뒤 0.2 M 글리신/HCl(pH 2.2) 1 ㎖을 각 웰당 50 ㎕씩 넣어 20 분간 파아지를 용리시키고 1 ㎖을 튜브에 모아 여기에 2M Tris-base(pH 9.0) 150 ㎕를 넣어 용액을 중화시켰다. 각 바이오패닝마다 인풋 파아지 및 일루트 파아지의 수를 측정하기 위해 OD=0.7 인 XL-1 BLUE 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 10 ㎖의 E. coli XL1-BLUE 세포와 섞어 37℃에서 1 시간 동안 200 rpm 의 속도로 혼합하며 배양하였다. 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 20 mM 글루코오스를 혼합한 후, 2×10¹⁰ pfu 의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 200 rpm 의 속도로 혼합하며 배양하였다. 배양액을 1,000×g 로 10 분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 40 ㎖ LB 액체 배지로 재현탁하여 30℃에서 200 rpm 의 속도로 혼합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 4,000×g, 20 분 및 4℃의 조건으로 원심 분리하였다. 상층액에 8 ㎖의 5x PEG/NaCl[20% PEG(w/v) 및 15% NaCl(w/v)]을 첨가한 후 4℃에서 1 시간 동안 정치시켰다. 원심분리 후 PEG 용액을 완전히 제거하고 1 ㎖의 PBS 용액으로 파아지 펩타이드 펠렛을 녹인 다음 2 차 바이오패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며, 세척과정만 단계별로 각각 20 회 및 30 회(0.1% PBST) 증가시켰다.

VEGF 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 특이성 측정

VEGF 단백질에 특이적으로 결합하는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해서 특이성 검사를 ELISA 을 이용하여 시행하였다. 96-웰 ELISA 플레이트에 각각의 단백질을 5 ㎍/㎖을 50 ㎕씩 웰에 넣고 다음날 0.1% PBST(Tween-20)로 3 회 세척하고 2% BSA 를 사용하여 상온에서 2 시간 동안 블로킹을 한 후, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST 로 3 회 세척하였다. 여기에 본 발명의 펩타이드를 가지는 재조합 파아지를 2% BSA 와 잘 혼합하여 100 ㎕씩 10 개의 단백질이 결합되어 있는 웰에 분주하고 27℃에서 2 시간 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 5 회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이션 항-M13 항체(GE Healthcare)를 1:1,000 으로 희석하여 27℃에서 1 시간 반응시켰다. 0.1% PBST 로 5 회 세척한 후 TMB 용액 100 ㎕를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 1M HCl 100 ㎕을 첨가하여 반응을 중지시킨 다음 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

VEGF 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력 측정

DNA 시퀀싱에서 중복되어 나온 VEGF 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더 펩타이드를 합성(애니젠, 한국)을 하였다. 친화도의 측정은 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 수행하였다. VEGF 를 EDC/NHS 을 이용하여 CM5 칩(Biacore)에 고정하였다. 러닝 버퍼로는 PBS(pH 7.4)을 사용하였고, 플로우는 분당 30 ㎕로 흘리면서 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation 소프트웨어(Biacore AB, Uppsala, Sweden)로 친화도를 계산하였다.

VEGF 활성 억제 실험(HUVEC 증식 분석)

HUVEC 세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cell, ATCC)를 1% FBS 가 들어간 M199 배지(Gibco)에서 기아(starvation)시킨 다음 96-웰 플레이트에 각 웰 당 5000 개의 세포를 부착시켰다. 12 시간 후에 여러 농도의 BPB1_VEGF, BPB2_VEGF, BPB3_VEGF, BPB4_VEGF 와 20ng/ml 의 VEGF₁₆₅(R＆D Systems)를 동시에 넣은 배지를 세포에 처리하였다. 그런 다음, 72 시간 후에 세포의 성장도를 측정하기 위한 EZ-cytox cell 생존도 분석 키트(Daeil Labservice, 대한민국)를 이용하여 HUVEC 세포의 성장을 얼마나 저해했는지 측정하였다.

바이오 패닝 결과

바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리를 VEGF 에 대해 4 차에 걸쳐 바이오 패닝을 실시하고 각 패닝 단계에서 회수한 파아지 펩타이드들의 아웃풋 파아지/인풋 파아지의 비율을 결정하였다(도 7).

타겟에 특이적인 파아지 펩타이드 검색(파아지 ELISA) 및 시퀀싱

각 라이브러리의 패닝 단계중 아웃풋/인풋의 비율이 가장 높은 단계에서 회수한 파아지를 플라크 형태로 확보하였다. 각 플라크로부터 60 개의 파아지를 증폭시킨 후 BSA 에 대해 ELISA 를 수행하였다. BSA 에 비해 흡광도가 높은 클론들을 선택하여 DNA 시퀀싱을 의뢰하였다. 이로부터 중복된 각각의 단백질에 특이적인 펩타이드 시퀀스를 얻었다(표 3).

[표 3]

VEGF 에 대한 친화도의 측정

VEGF 에 대한 상기 펩타이드를 합성하여 SPR Biacore system(Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 친화도를 측정하였다. VEGF 에 대한 친화도는 다음과 같다(표 4).

[표 4]

VEGF 에 대한 특이성 분석

도 8 에서 확인할 수 있듯이, VEGF 에 특이적인 BPB 각각은 VEGF 에 대하여 특이성을 갖는다는 것을 알 수 있다.

VEGF 활성 억제 실험(HUVEC 증식 분석)

HUVEC 세포에서 BPB_VEGF 가 VEGF 의 활성을 억제시킬 수 있는지 HUVEC 증식 분석을 시도 하였다. VEGF 는 상피세포의 성장을 촉진시키는 성장호르몬으로서 이를 막으면 상피세포의 성장을 억제할 수 있다. 도 9 에서 볼 수 있듯이, 20 μM, 10 μM 및 5 μM BPB_VEGF 을 처리했을 때, 20 μM 에서 VEGF 의 활성을 완전히 저해하였다. 그 중 BPB3_VEGF 가 IC₅₀ 활성이 5 μM 로 가장 우수하였다.

<110> Gwangju Institute of Science and Technology <120> Cytokine-BPB Capable of Binding Specifically to Cytokine <150> 10-2010-0036607 <151> 2010-04-20 <160> 41 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip1 <400> 1 Ser Trp Thr Trp Glu Gly Asn Lys Trp Thr Trp Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip2 <400> 2 Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp Thr Trp Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip3 <400> 3 Ser Trp Thr Trp Glu Pro Asn Lys Trp Thr Trp Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gb1, 41-56 <400> 4 Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip4 <400> 5 Gly Glu Trp Thr Trp Asp Asp Ala Thr Lys Thr Trp Thr Trp Thr Glu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip5 <400> 6 Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Trp Thr Glu 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip6 <400> 7 Gly Glu Trp Thr Trp Asp Asp Ala Thr Lys Thr Trp Thr Val Thr Glu 1 5 10 15 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip7 <400> 8 Gly Glu Trp His Trp Asp Asp Ala Thr Lys Thr Trp Val Trp Thr Glu 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip8 <400> 9 Gly Glu Trp Val Trp Asp Asp Ala Thr Lys Thr Trp His Trp Thr Glu 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpzip9 <400> 10 Gly Glu Trp Val Trp Asp Asp Ala Thr Lys Thr Trp Val Trp Thr Glu 1 5 10 15 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (T3V)-HP6 <400> 11 Lys Tyr Val Trp Ser Asn Gly Lys Trp Thr Val Glu 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Espinosa-GB1(b) <400> 12 Arg Trp Gln Tyr Val Asn Gly Lys Phe Thr Val Gln 1 5 10 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GB1m2 <400> 13 Gly Glu Trp Thr Tyr Asn Pro Ala Thr Gly Lys Phe Thr Val Thr Glu 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GB1m3 <400> 14 Lys Lys Trp Thr Tyr Asn Pro Ala Thr Gly Lys Phe Thr Val Gln Glu 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HP5W4 <400> 15 Lys Lys Trp Thr Tyr Asn Pro Ala Thr Gly Lys Trp Thr Trp Gln Glu 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HP5W <400> 16 Lys Lys Tyr Thr Trp Asn Pro Ala Thr Gly Lys Trp Thr Val Gln Glu 1 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HP5A <400> 17 Lys Lys Tyr Thr Trp Asn Pro Ala Thr Gly Lys Ala Thr Val Gln Glu 1 5 10 15 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HP7 <400> 18 Lys Thr Trp Asn Pro Ala Thr Gly Lys Trp Thr Glu 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chignolin <400> 19 Gly Tyr Asp Pro Glu Thr Gly Thr Trp Gly 1 5 10 <210> 20 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-EB-B1 <400> 20 Met Ser Ala Asp Lys Ser Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Gln Val Arg Thr Arg Asp 20 25 <210> 21 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-ED-B2 <400> 21 His Cys Ser Ser Ala Val Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Ile Ile Arg Leu Glu Gln 20 25 <210> 22 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-ED-B3 <400> 22 His Ser Gln Gly Ser Pro Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Arg Tyr Ser His Arg Ala 20 25 <210> 23 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-VEGF1 <400> 23 His Ala Asn Phe Phe Gln Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Lys Tyr Asn Gln Ser 20 25 <210> 24 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-VEGF2 <400> 24 Ala Ser Pro Phe Trp Ala Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Val Pro Ser Asn Ala 20 25 <210> 25 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-VEGF3 <400> 25 His Ala Phe Tyr Tyr Thr Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Pro Val Thr Thr Ser 20 25 <210> 26 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-VEGF4 <400> 26 Tyr Gly Ala Tyr Pro Trp Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Arg Val Ser Arg Asp 20 25 <210> 27 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-VEGF5 <400> 27 Ala Ala Pro Thr Ser Phe Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Gln Met Trp His Arg 20 25 <210> 28 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-VCAM1 <400> 28 Gln Ala Arg Asp Cys Thr Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Pro Ser Ile Cys Pro Ile 20 25 <210> 29 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-nAchR1 <400> 29 Glu Ala Ser Phe Trp Leu Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Lys Gly Thr Leu Asn Arg 20 25 <210> 30 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-nAchR2 <400> 30 Tyr Ala Tyr Pro Leu Leu Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Tyr Gln Lys Trp Ile 20 25 <210> 31 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-nAchR3 <400> 31 Ala Ser Leu Pro Ala Trp Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Ser Thr Arg Thr Ala 20 25 <210> 32 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-BSA1 <400> 32 Ala Ala Ser Pro Tyr Lys Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Gly Trp Arg Met Lys Met 20 25 <210> 33 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-BSA2 <400> 33 Ser Ala Asn Ser Leu Tyr Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Thr Ser Arg Gln Arg Trp 20 25 <210> 34 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-BSA3 <400> 34 Tyr Ala His Val Tyr Tyr Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly His Arg Val Thr Gln Thr 20 25 <210> 35 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-BSA4 <400> 35 Tyr Gly Ala Tyr Pro Trp Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Trp Arg Val Ser Arg Asp 20 25 <210> 36 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-BSA5 <400> 36 Tyr Ala His Phe Gly Trp Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Thr Thr Asp Ser Gln Ser 20 25 <210> 37 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-MyD88-1 <400> 37 His Ser His Ala Phe Tyr Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Trp Thr 20 25 <210> 38 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPB-MyD88-2 <400> 38 Ala Ser Thr Ile Asn Phe Gly Ser Trp Thr Trp Glu Asn Gly Lys Trp 1 5 10 15 Thr Trp Lys Gly Tyr Thr Arg Arg Trp Asn 20 25 <210> 39 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leucine zipper for BPB <400> 39 Gly Gly Ser Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val 20 25 30 Gly Glu Arg 35 <210> 40 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPBLeu-ED-B-1 <400> 40 Cys Ser Ser Pro Ile Gln Gly Gly Ser Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys 1 5 10 15 Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala 20 25 30 Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg 35 40 <210> 41 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BPBLeu-ED-B-2 <400> 41 Ile Ile Arg Leu Glu Gln Gly Gly Ser Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys 1 5 10 15 Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala 20 25 30 Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg 35 40

Claims

다음의 단계를 포함하는 사이토카인(Cytokine) 타겟에 특이적으로 결합하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더(Cytokine-BPB)의 제조방법:
(a) (i) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성되는 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); (ii) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m 개의 아미노산을 포함하는 Cytokine-타겟 결합 부위 I(Cytokine-target binding region I) 및 Cytokine-타겟 결합 부위 II(Cytokine-target binding region II)를 포함하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더(Cytokine-BPB)의 라이브러리를 제공하는 단계;
(b) 상기 라이브러리와 타겟으로서의 Cytokine 을 접촉시키는 단계; 그리고,
(c) 상기 Cytokine 과 결합된 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더(Cytokine-BPB)를 선택하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위에 형성되는 가닥간 비공유결합은 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위는 β-헤어핀, 링커로 연결된 β-쉬트, 루이신 지퍼, 링커로 연결된 루이신 지퍼, 루이신 리치 모티프 또는 링커로 연결된 루이신 리치 모티프인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위는 β-헤어핀인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 서열목록 제 1 서열 내지 제 19 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 서열목록 제 2 서열, 제 14 서열 또는 제 18 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 I 로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
일반식 I

X₁은 Ser 또는 Gly-Glu 이고, X₂ 및 X'₂는 서로 독립적으로 Thr, His, Val, Ile, Phe 또는 Tyr 이며, X₃는 Trp 또는 Tyr 이고, X₄는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₅는 Trp 또는 Phe 이며, X₆는 Trp 또는 Val 이고, X₇는 Lys 또는 Thr-Glu 이다.
제 5 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 II로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
일반식 II

X₁은 Arg, Gly-Glu 또는 Lys-Lys 이고, X₂는 Gln 또는 Thr 이며, X₃는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₄는 Gln, Thr-Glu 또는 Gln-Glu 이다.
제 5 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 III으로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
일반식 III

X₁은 Lys 또는 Lys-Lys 이고, X₂는 Trp 또는 Tyr 이고, X₃는 Val 또는 Thr 이며, X₄는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₅는 Trp 또는 Ala 이며, X₆는 Trp 또는 Val 이고, X₇은 Glu 또는 Gln-Glu 이다.
제 5 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 IV로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
일반식 IV

X₁은 Lys-Thr 또는 Gly 이고, X₂는 Trp 또는 Tyr 이고, X₃는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₄는 Thr-Glu 또는 Gly 이다.
제 8 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 상기 일반식 I 에서 X₁은 Ser 또는 Gly-Glu 이고, X₂ 및 X'₂는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val 이며, X₃는 Trp 또는 Tyr 이고, X₄는 타입 I, 타입 I', 타입 II 또는 타입 II' 서열이고, X₅는 Trp 또는 Phe 이며, X₆는 Trp 또는 Val 이고, X₇는 Lys 또는 Thr-Glu 이다.
제 1 항에 있어서, 상기 Cytokine-타겟 결합 부위 I 의 아미노산 개수 n 은 2-20 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 Cytokine-타겟 결합 부위 II의 아미노산 개수 m 은 2-20 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 라이브러리는 플라스미드, 박테리오파아지, 파아지미드로, 이스트 또는 박테리아로부터 제작된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 Cytokine-타겟 결합 부위 I 및 Cytokine-타겟 결합 부위 II는 Cytokine 에 공동으로 작용하여 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위, Cytokine-타겟 결합 부위 I 또는 Cytokine-타겟 결합 부위 II에 추가적으로 기능성 분자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 기능성 분자는 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블, 화학약물, 바이오약물, 세포막투과 펩타이드(CPP) 또는 나노입자인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및
(b) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m 개의 아미노산을 포함하는 Cytokine-타겟 결합 부위 I(Cytokine-target binding region I) 및 Cytokine-타겟 결합 부위 II(Cytokine-target binding region II)를 포함하는 Cytokine 에 특이적으로 결합하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더.
제 19 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위에 형성된 가닥간 비공유결합은 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더.
제 19 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결된 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더.
제 19 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위는 β-헤어핀, 링커로 연결된 β-쉬트, 루이신 지퍼 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼, 루이신 리치 모티프인 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더.
제 19 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위는 β-헤어핀인 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더.
제 23 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 서열목록 제 1 서열 내지 제 19 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더.
제 24 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 서열목록 제 2 서열, 제 14 서열 또는 제 18 서열로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더.
제 23 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 I 로 표시되는 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더:
일반식 I

X₁은 Ser 또는 Gly-Glu 이고, X₂ 및 X'₂는 서로 독립적으로 Thr, His, Val, Ile, Phe 또는 Tyr 이며, X₃는 Trp 또는 Tyr 이고, X₄는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₅는 Trp 또는 Phe 이며, X₆는 Trp 또는 Val 이고, X₇는 Lys 또는 Thr-Glu 이다.
제 23 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 II로 표시되는 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더:
일반식 II

X₁은 Arg, Gly-Glu 또는 Lys-Lys 이고, X₂는 Gln 또는 Thr 이며, X₃는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₄는 Gln, Thr-Glu 또는 Gln-Glu 이다.
제 23 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 III으로 표시되는 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더:
일반식 III

X₁은 Lys 또는 Lys-Lys 이고, X₂는 Trp 또는 Tyr 이고, X₃는 Val 또는 Thr 이며, X₄는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₅는 Trp 또는 Ala 이며, X₆는 Trp 또는 Val 이고, X₇은 Glu 또는 Gln-Glu 이다.
제 23 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 IV로 표시되는 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더:
일반식 IV

X₁은 Lys-Thr 또는 Gly 이고, X₂는 Trp 또는 Tyr 이고, X₃는 타입 I, 타입 I', 타입 II, 타입 II' 또는 타입 III 또는 타입 III' 턴 서열이고, X₄는 Thr-Glu 또는 Gly 이다.
제 24 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 상기 일반식 I 에서 X₁은 Ser 또는 Gly-Glu 이고, X₂ 및 X'₂는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val 이며, X₃는 Trp 또는 Tyr 이고, X₄는 타입 I, 타입 I', 타입 II 또는 타입 II' 서열이고, X₅는 Trp 또는 Phe 이며, X₆는 Trp 또는 Val 이고, X₇는 Lys 또는 Thr-Glu 인 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더.
제 19 항에 있어서, 상기 Cytokine-타겟 결합 부위 I 의 아미노산 개수 n 은 2-20 인 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더.
제 19 항에 있어서, 상기 Cytokine-타겟 결합 부위 II의 아미노산 개수 m 은 2-20 인 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더.
제 19 항에 있어서, 상기 Cytokine-타겟 결합 부위 I 및 Cytokine-타겟 결합 부위 II는 Cytokine 에 공동으로 작용하여 결합하는 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더.
제 19 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위, Cytokine-타겟 결합 부위 I 또는 Cytokine-타겟 결합 부위 II에 추가적으로 기능성 분자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더.
제 34 항에 있어서, 상기 기능성 분자는 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블, 화학약물, 바이오약물, 세포막투과 펩타이드(CPP) 또는 나노입자인 것을 특징으로 하는 Cytokine-바이포달 펩타이드 바인더.
상기 제 19 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항의 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자.
상기 제 36 항의 핵산 분자를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 벡터.