JP2018518945A - 可溶性キメラインターロイキン−１０受容体およびその療法使用 - Google Patents

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Abstract

インターロイキン１０の可溶性キメラ受容体、ならびに腫瘍の処置、および高いインターロイキン１０産生を特徴とする疾患、たとえば全身性エリテマトーデスの処置における関連の使用。【選択図】なし

Description

本発明はインターロイキン１０(ＩＬ １０)に対する新規な可溶性キメラ受容体に関するものであり、それは低い免疫原性を特徴とし、ＩＬ−１０と宿主の細胞上にあるそれの受容体との相互作用を遮断でき、特に、腫瘍の処置、および高レベルのインターロイキン１０産生を特徴とする病態、たとえば全身性エリテマトーデス(systemic lupus erythematosus)（ＳＬＥ）の処置に有用である。
一般的な腫瘍療法のアプローチには下記のものが含まれる：
１）外科処置による腫瘍の切除、
２）化学療法、放射線療法および免疫療法による腫瘍の破壊。
現在までに適用されている免疫療法へのアプローチには下記のものが含まれる：
１）種々の機序で腫瘍細胞の溶解を仲介できる抗体の注射、
２）抗腫瘍免疫応答を活性化できる可能性のあるサイトカインの注入、
３）腫瘍を直接死滅させることができる可能性のあるリンパ球の注入、
４）腫瘍由来の細胞性ペプチド、タンパク質または溶解物による免疫化、
５）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡの形態のもの）による免疫化、
６）特異的生物製剤（抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、抗ＰＤ１−リガンド抗体）による、免疫制御機能の阻害。
それにもかかわらず、一般的な療法は組織タイプまたは腫瘍病期との関連で変動する結果を生じる。免疫療法に関しては、行なわれる療法のタイプに関係なく不満足な結果が得られた（種々の臨床プロトコルにおいて２０〜３０％の臨床応答；唯一の例外は、特定の疾患、たとえばＢ細胞リンパ腫および乳癌におけるモノクローナル抗体の使用に関連する）。
全体として、腫瘍に対して現在までに用いられている療法の集積は主に、癌を破壊する目的をもつ薬剤の使用による攻撃的策略からなり、それらは健康な個体において腫瘍の出現または進行を阻止する正常な免疫制御プロセスを促進するものではない。
生物学的性質をもつ多数の理由のため腫瘍の完全欠失を達成できるのは稀であるので、治療を受けていて状態ですら大部分の腫瘍患者の体内に生存腫瘍細胞が残存する。これらの細胞は事実、腫瘍依存性生体因子および前記の抗腫瘍療法の両方によって依然として無力である免疫系を回避する能力を維持している：したがって、それらは腫瘍の再発および進行を誘発する可能性がある。実際に、正常な自己細胞に関して形態、表現型および機能の点から実質的な修飾を誘発する異常な遺伝子を腫瘍がもっているとしても、これらは免疫監視を回避する。腫瘍は腫瘍関連抗原(tumor-associated antigen)（ＴＡＡ）を発現し、腫瘍特異的Ｔリンパ球により浸潤されるという事実を考慮すると、この現象はよりいっそう驚異的である。腫瘍による免疫回避を保証するのに寄与する種々の既知の生物学的メカニズムのうち、制御性Ｔリンパ球の活性は重要な役割をもつ−これらは腫瘍部位にＩＬ １０を分泌する。この現象を中和するためには、制御性Ｔリンパ球の活性を阻害できる分子を腫瘍部位に供給することが必要であろう。そのような分子の投与は腫瘍の免疫回避を制限し、宿主の免疫系が有効な抗腫瘍反応性を回復するのを可能にするであろう。
全身性エリテマトーデス処置の現在の療法に関して、これはステロイドおよび免疫抑制薬の投与からなる；それらは作用機序に関して特異性をもたない薬物であり、さらにそれらは重篤で多様な副作用を引き起こす可能性がある。より最近の療法は、ベリムマブ(Belimumab)、すなわち抗Ｂｌｙｓヒト抗体、言い換えるとＢリンパ球の活性化を阻害できる療法薬の投与を提供する。
ＳＬＥは、他の自己免疫性病態と共に、Ｂリンパ球の異常な免疫応答およびＩＬ−１０の分泌亢進を特徴とし、それが自己抗体の過剰産生を引き起こし、結果的に全身性炎症プロセスを活性化する(Llorente et al., “In vivo production of interleukin-10 by non T-cell in rheumatoid arthritis, Sjoegren’ syndrome and systemic lupus erythematosus: a potential mechanism of B-lymphocyte hyperactivity and autoimmunity” Arthritis Rheum, 1994; 37: 1647-55”)。抗ＩＬ １０モノクローナル抗体によるＳＬＥ患者の処置が有益な好ましい療法効果をもっていたのは興味深い(Llorente L. et al., “Clinical and biological effects of antiinterleukin 10 monoclonal antibody administration in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum.2000; 43: 1790-1800)。したがって、たとえばＩＬ−１０の中和により自己抗体の産生を低減できる療法薬の提供に対するニーズがある。
発明の背景
抗ＩＬ １０イムノアドヘシン(immunoadhesin)、すなわち免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ部分およびＩＬ−１０受容体のアルファ鎖により構成される融合タンパク質が先に記載された(Terai M. et al “Human intertleukin 10 receptor 1/ IgG1-Fc fusion proteins for human IL-10 with therapeutic potential” Cancer Immunol. Immunother. 2009 Aug.; 58(8): 1307-17 EPUB.2009 Jan 14)。
この融合タンパク質は、それがＩｇＧ１のＦｃ部分を含有するという事実により引き起こされる一連の欠点をもつ。
実際に、免疫グロブリンは、Ｆｃが免疫系の大部分の細胞上に存在するそれの受容体に結合することにより仲介される免疫／炎症反応（抗体依存性細胞傷害(antibody-dependent cellular cytotoxicity)−ＡＤＣＣ）または補体に結合することにより仲介される反応（補体依存性細胞傷害(complement-dependent cytoxicity)−ＣＤＣ−）を引き起こす可能性がある。これは製剤の安全性および耐容性に著しい影響を及ぼす可能性のある付随的な免疫／炎症反応をもたらす可能性がある(Antibody Fc: Linking Adaptive and Innate Immunity, Margaret Ackerman and Falk Nimmerjahn, Academic Press 2014; Kapur R, Einarsdottir HK, Vidarsson G: IgG-effector functions: “the good, the bad and the ugly”. Immunol Lett. 2014 Aug;160(2):139-44; Karsten CM, Koehl J: The immunoglobulin, IgG Fc receptor and complement triangle in autoimmune diseases. Immunobiology. 2012 Nov; 217(11):1067-79; Dijstelbloem HM, van de Winkel JG, Kallenberg CG: Inflammation in autoimmunity: receptors for IgG revisited. Trends Immunol. 2001 Sep;22(9):510-6)。
US 20090111146（本発明者らがその先行刊行物の著者の一部である）には、ヒト抗体の定常領域がＩＬ−１０の細胞外領域と融合した融合タンパク質が記載されている。ヒト抗体の定常領域とは、特に下記のクラスから選択されるＩｇＧ定常領域を表わすものとする：
ａ）Ｆｃ部
ｂ）ＣＨ２およびＣＨ３を含む領域
ｃ）ヒンジ部、ＣＨ２およびＣＨ３を含む領域
ｄ）ＣＨ１〜ＣＨ３が連結した領域
ｅ）上記の領域ａ）〜ｄ）のうちの１つにおいて１個または数個のアミノ酸の欠失、付加、置換または挿入により得られた領域であって、定常領域として機能するもの。
この融合ポリペプチドタイプも関連のＩＬ−１０疾患に使用できる。特に、ＩＬ−１０受容体の細胞外領域が下記のものと融合した融合タンパク質：
ａ１）ＩｇＧ１の定常領域であって、ヒンジ領域の欠失が行なわれたもの、または
ａ２）ＩｇＧ１の定常領域であって、ヒンジ領域が変異したもの；二量体を形成しないようにヒンジ領域のシステインを変異させることにより作製（これらの分子は細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を促進するために使用できる）。
このタイプの融合タンパク質は癌の処置に使用できるが、それらの使用は、本質的に炎症促進性の分子部分、たとえばフラグメントＦｃまたはＦｃに含まれる重鎖ＣＨ１〜ＣＨ３（上記を参照）の存在と関連した副作用を誘発するリスクが潜在的に高い。そのような分子により誘発される可能性がある付随的な全身性免疫／炎症反応は、製剤の安全性および耐容性に著しい影響をもつ可能性がある。
US 20090111146
Llorente et al., "In vivo production of interleukin-10 by non T-cell in rheumatoid arthritis, Sjoegren’ syndrome and systemic lupus erythematosus: a potential mechanism of B-lymphocyte hyperactivity and autoimmunity" Arthritis Rheum, 1994; 37: 1647-55 Llorente L. et al., "Clinical and biological effects of antiinterleukin 10 monoclonal antibody administration in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum.2000; 43: 1790-1800 Terai M. et al "Human intertleukin 10 receptor 1/ IgG1-Fc fusion proteins for human IL-10 with therapeutic potential" Cancer Immunol. Immunother. 2009 Aug.; 58(8): 1307-17 EPUB.2009 Jan 14 Antibody Fc: Linking Adaptive and Innate Immunity, Margaret Ackerman and Falk Nimmerjahn, Academic Press 2014 Kapur R, Einarsdottir HK, Vidarsson G: IgG-effector functions: "the good, the bad and the ugly". Immunol Lett. 2014 Aug;160(2):139-44 Karsten CM, Koehl J: The immunoglobulin, IgG Fc receptor and complement triangle in autoimmune diseases. Immunobiology. 2012 Nov; 217(11):1067-79 Dijstelbloem HM, van de Winkel JG, Kallenberg CG: Inflammation in autoimmunity: receptors for IgG revisited. Trends Immunol. 2001 Sep;22(9):510-6
したがって本発明の目的は、ＩＬ−１０の阻害薬、特にＩＬ−１０が病原性をもつすべてのタイプの病態に対して有効でありかつ前記の既知ＩＬ−１０阻害薬の欠点をもたない療法薬剤として使用するための薬剤の作製である。
本発明の目的はまた、腫瘍の処置におけるそのようなＩＬ−１０阻害薬の使用である。
本発明のさらなる目的は、ＳＬＥの処置におけるそのようなＩＬ−１０阻害薬の使用である。
本発明のさらなる目的は、潜在的に炎症／免疫現象を誘発する可能性のある分子部分、たとえばヒト分子に含まれない抗体部分またはアミノ酸配列部分を含まない（よって、変異体または外因性分子を実質的に保有しない）ＩＬ−１０阻害薬を作製することである。これは、それの完全耐容性を確実にしかつ副作用の誘発に関連するリスクを排除するためのものである。
本発明の前記の目的は、細胞表面に存在する天然受容体へのＩＬ−１０の結合に拮抗できるキメラ融合タンパク質であるアルブミン−ＩＬ １０受容体の作製により達成される。
融合ポリペプチド内のアルブミンの存在は、この分子に安定性および可溶性を付与する。さらに、この分子は同系(syngeneic)個体において免疫原性がほとんどなく、したがって本発明の対象である融合タンパク質に対する免疫応答を発現するリスクが避けられる。
本発明のさらなる目的は、医薬(medication)として使用するための、特に関連するＩＬ−１０疾患を阻害するための、上記の融合タンパク質である。
本発明のさらなる目的は、腫瘍の処置に使用するための、上記の可溶性キメラ融合タンパク質であるアルブミン−ＩＬ １０である。
本発明のさらなる目的は、ＳＬＥの処置に使用するための、上記の融合タンパク質である。
本発明のさらなる目的は、この融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築体、好ましくは遺伝子である。
本発明のさらなる目的は、医薬として使用するための、特にＩＬ−１０により仲介される疾患を阻害するための、上記の遺伝子である。
本発明のさらなる目的は、腫瘍の処置に使用するための、上記の遺伝子である。
本発明のさらなる目的は、ＳＬＥの処置に使用するための、上記の遺伝子である。
図１は、腫瘍浸潤性リンパ球の表現型および機能分析を示す。ｙ軸は、２２人の患者から単離した腫瘍浸潤性リンパ球集団中に存在するＴ細胞の亜集団：ＣＤ８＋、ＣＤ８＋ＣＤ２８＋、ＣＤ８＋ＣＤ２８−、ＣＤ４＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋の個々の濃度パーセントを示す。この図は、平均パーセント間の有意差をもレポートする。 図２は、２３人の患者から単離した腫瘍浸潤性Ｔ細胞ＣＤ８＋ＣＤ２８＋、ＣＤ８＋ＣＤ２８−（左グラフ）により実施した免疫抑制活性をレポートし、これは抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により誘発したＴ細胞増殖の阻害のアッセイにおいて試験したものである。このデータは、単一の共培養において、増殖している細胞における３Ｈ−チミジンの取込みおよびベータカウンターによる読みにより測定し、毎分カウント（ｃｐｍ）として表示した、ＣＤ３誘発−増殖活性の阻害パーセントとして表わされる。右のグラフは、５人の患者に由来する腫瘍浸潤性Ｔ細胞ＣＤ４＋ＣＤ２５＋の免疫抑制機能を示す。ＩＬ−１０の生物活性を中和するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）による抑制活性の阻害は、リンパ球Ｔｒｅｇ ＣＤ８＋ＣＤ２８−について実施した機能試験の場合にのみレポートされる（左グラフ）。 図３は、２人の患者の原発性腫瘍に由来するＴ細胞ＣＤ２８＋ＣＤ２８−の存在下または非存在下において、ペプチドｐ５４０をパルス適用したＴ２細胞に対する、テロメラーゼのペプチドｐ５４０に対して特異的な細胞系ＣＴＬの細胞傷害活性の阻害を示す。Ｔリンパ球ＣＤ２８＋ＣＤ２８−を含有する培養は、Ｔリンパ球ＣＤ２８＋ＣＤ２８−をターゲット細胞（腫瘍系Ｔ２）および細胞傷害性リンパ球から隔離するために“トランスウェル(transwell)”プレート内で実施された。ａ）ＣＴＬ ＋ 非パルス適用Ｔ２細胞；ｂ）ＣＴＬ ＋ ペプチドｐ５４０をパルス適用したＴ２細胞；ｃ）ＣＴＬ ＋ ペプチドｐ５４０をパルス適用したＴ２細胞 ＋ ＣＤ２８＋ＣＤ２８−；ｄ）ＣＴＬ ＋ ペプチドｐ５４０をパルス適用したＴ２細胞 ＋ ＣＤ２８＋ＣＤ２８− ＋ 抗ＩＬ−１０ ｍＡｂ；ｅ）ＣＴＬ ＋ ペプチドｐ５４０をパルス適用したＴ２細胞 ＋ ＣＤ２８＋ＣＤ２８− ＋ 抗ＩＬ−１０ ｍＡｂのイソ型対照抗体。 図４は、Ｔ細胞の増殖に対して下記のものが及ぼす免疫抑制活性を示す：（Ａ）左グラフ：２３人の患者の転移リンパ節から、または６人の患者の無転移リンパ節から精製したＴ細胞ＣＤ２８＋ＣＤ２８−；（Ｂ）右グラフ：６人の患者の転移リンパ節または６人の患者の無転移リンパ節に由来するＴ細胞ＣＤ２４＋ＣＤ２５＋。データを抗ＣＤ３ ｍＡｂにより誘発されたＴ細胞増殖の阻害パーセントとして表わす；共培養による３Ｈ−チミジンの取込みおよび放射された毎分カウント（ｃｐｍ）のベータカウンターによる読みによって測定した。 図５は、それぞれ下記のものを注射したマウスにおけるメラノーマ病巣の平均面積をレポートする：−○− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞（対照マウス）；−□− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞を、メラノーマのｇｐ１００抗原をパルス適用した樹状細胞（ＤＣ）で処理したものを、筋肉内注射により接種した（２×１０６ ＤＣ／マウス×３回、腫瘍の投与日から開始して７日毎に）；−△− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞を、ｇｐ１００抗原をパルス適用したＤＣで処理したものを、筋肉内注射により接種し（２×１０６細胞／マウス×３回、７日毎に）、サイトカインの生物活性を遮断する抗ＩＬ−１０ ｍＡｂを皮下注射により注射した（１５０μｇ×３回、腫瘍の投与日から開始して７日毎に）。 図６は、下記のウェスタンブロットによる分析をレポートする：ネズミ融合タンパク質ＩＬ １０Ｒ−アルブミンをコードする遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３．１をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞の溶解物（レーン１）、空のｐｃＤＮＡ３．１をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞の溶解物（レーン２）、およびトランスフェクションしていない２９３Ｔ細胞の溶解物（レーン３）。 図７は、下記のウェスタンブロットによる分析をレポートする：ヒトＩＬ １０Ｒ−アルブミンタンパク質をコードする遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３．１をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞の溶解物（レーン１）；空のｐｃＤＮＡ３．１をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞の溶解物（レーン２）；ヒト融合タンパク質ＩＬ １０Ｒ−アルブミンをコードする遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３．１をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞の上清（レーン３）；空のｐｃＤＮＡ３．１をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞の上清（レーン４）。 図８は、それぞれ下記のものを注射したマウスにおいて観察したメラノーマ病巣の平均面積をレポートする：−●− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞（対照マウス）；−■− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞を対照プラスミド（ｐｃＤＮＡ ３．１）で処理したものを、皮内注射により注射した（１００μｇ×３回、腫瘍の投与日から開始して７日毎に）；−▲− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞を、本発明によるキメラ融合タンパク質をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ ３．１ ＩＬ １０Ｒ−ネズミ血清アルブミン（ＭＳＡ））で処理したものを、皮内注射により注射した（１００μｇ×３回、腫瘍の投与日から開始して７日毎に）。この図にはグループ間の有意差もレポートする。 図９は、下記のものを注射したマウスにおいて観察したメラノーマ病巣の平均面積を示す：−●− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞（対照マウス）；−■− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞を、本発明によるキメラ融合タンパク質をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ ３．１ ＩＬ １０Ｒ−ＭＳＡ）で処理したものを、皮内注射により注射した（１００μｇ×３回、腫瘍の投与日から開始して７日毎に）；−▲− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞を、本発明によるキメラ融合タンパク質をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ ３．１ ＩＬ １０Ｒ−ＭＳＡ）で処理したものを、皮内注射により注射し（１００μｇ×３回、腫瘍の投与日から開始して７日毎に）、抗原ｍｇｐ１００をパルス適用したＤＣを筋肉内注射により注射した（皮内注射した）（２×１０６細胞／マウス×３回、腫瘍の投与日から開始して７日毎に）；−◆− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞を皮内注射し、抗原ｍｇｐ１００をパルス適用したＤＣを筋肉内注射により注射した（２×１０６細胞／マウス×３回、腫瘍の投与日から開始して７日毎に）。この図にはグループ間の有意差もレポートする。 図１０は、それぞれ下記のものを注射したマウスにおいて観察した病巣の平均面積をレポートする：−●− １×１０５個の同系膀胱腫瘍細胞系ＭＢ４９（対照）；−■− １×１０５の同系膀胱腫瘍ＭＢ４９を対照プラスミド（ｐｃＤＮＡ ３．１）で処理したものを、皮内注射した（１００μｇ×３回、腫瘍の投与日から開始して１回の投与と次の投与の間の間隔７日で）；−▲− １×１０５の同系膀胱腫瘍細胞ＭＢ４９を、本発明によるキメラ融合タンパク質をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ ３．１ ＩＬ １０Ｒ−ＭＳＡ）で処理したものを、皮内注射した（１００μｇ×３回、腫瘍の投与日から開始して１回の投与と次の投与の間の間隔７日で）。この図にはグループ間の有意差もレポートする。 図１１は、それぞれＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ ３．１ ＩＬ １０Ｒ−ＭＳＡ）を接種した４匹のマウスおよび接種しなかった１匹のマウス（対照）の脾臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞および末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cell)（ＰＢＭＣ）４×１０６個から抽出した後の細胞ＤＮＡにおけるトランスジーンＩＬ １０Ｒ−ＭＳＡの検出を示す： 接種後（Ａ）２４時間目、（Ｂ）１４日目、（Ｃ）２０日目、上記ＤＮＡそれぞれのネステッド（二段階）ＰＣＲによる増幅の後。 図１２Ａは、本発明による精製ヒト融合タンパク質についてＥＬＩＳＡ試験を実施することにより得られた図１２Ｂにレポートした検証結果を、説明図の形でレポートする；図１２Ａのｘ軸はＩＬ−１０の濃度をレポートし、ｙ軸は光学濃度をレポートする。 図１３Ａは、本発明による精製ネズミタンパク質についてＥＬＩＳＡ試験を実施することにより得られた図１３Ｂにレポートした検証結果を、説明図の形でレポートする；図１３Ｂのｘ軸はＩＬ−１０の濃度をレポートし、ｙ軸は光学密度をレポートする。
本発明の目的に関して、キメラタンパク質とは、多数の異なるタンパク質のペプチド配列の融合から誘導されるタンパク質を表わす。
本発明の目的に関して、ポリヌクレオチド構築体とは、互いに異なる多数のタンパク質をコードする多数の異なる遺伝子の融合から誘導されるヌクレオチド配列を表わす。
本発明によるキメラ融合タンパク質中のアルブミンは、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトおよびネズミ、よりさらに好ましくはヒトのアルブミンである。
本発明による融合タンパク質であるアルブミン−インターロイキン１０受容体はキメラ遺伝子生成物であり、それはアルブミンがＩＬ−１０受容体のアルファ鎖の細胞外ドメインに結合していることをも特徴とする。
本発明の対象である融合タンパク質が細胞外ドメイン(extracellular domain)（ＥＣＤ）のみを含むという事実は、有利な側面である：これは、ＩＬ−１０受容体アルファ鎖の細胞質内部分、すなわち疎水性アミノ酸に富む部分を含まないからである。よって、細胞質内ドメインが存在しないことによって、本発明の対象である融合タンパク質は、ＩＬ−１０受容体のアルファ鎖全体を含む類似の融合タンパク質と対比して、より安定、より可溶性であり、かつ小さいサイズであるため作製工程（クローニング）においてより高い収率で得ることができる。最終的に、細胞質内ドメインが存在しないことによってそのタンパク質は免疫原性がより低くなり、こうして本発明の融合タンパク質に対して宿主が免疫応答を開始するリスクが阻止される。
インターロイキン１０に対する受容体（ＩＬ １０Ｒ）は２つの鎖により構成されている：ＩＬ １０との結合を仲介するアルファ鎖、および信号を細胞内部へ伝達するベータ鎖。本発明の目的はＩＬ−１０を遮断してそれが腫瘍微小環境内ではもはや利用できないようにすることであるので、アルファサブユニットのみをキメラ構築体にクローニングした。
アルブミンをＩＬ−１０受容体のアルファ鎖の細胞外ドメインにスペーサーによって結合させ、好ましくはそのスペーサーはＩｇＧ（イムノガンマグロブリン）のヒンジ領域である。
ＩｇＧは、好ましくは哺乳類ＩｇＧ１、より好ましくはヒトおよびネズミタイプのもの、よりさらに好ましくは末梢血リンパ球に由来するものである。
ＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１のヒンジ領域が存在することにより、ＩＬ １０受容体のアルファ鎖の細胞外ドメインにより構成された部分にフレキシビリティーが付与され、よってそれの関連リガンド（ＩＬ−１０）との結合が安定化され、この相互作用のアフィニティー／アビディティーが増大する。
特に関連のＩＬ−１０疾患を阻害する医薬として使用するための本発明の対象のキメラ融合タンパク質であるアルブミン−ＩＬ−１０受容体は、好ましくは静脈内、または局所にすら、好ましくは皮内投与、皮下投与などにより、非経口投与することができる。
また、前記のキメラ融合タンパク質であるアルブミン−インターロイキン１０受容体をコードする遺伝子は、特に関連のＩＬ−１０疾患を阻害する医薬としての用途に使用でき、好ましくは静脈内、または局所に、好ましくは皮内投与、皮下投与などにより、非経口投与することができる。
キメラ融合タンパク質または特に関連遺伝子を腫瘍の処置に使用する際、それらを上記の投与方法に従って非経口的に、局所にすら投与することができる。
いずれにしろ、癌療法においてキメラ融合タンパク質または関連遺伝子を使用できる：
ａ）それ自体で、抗癌免疫応答を増強するために。これはとりわけ疾患の初期に推奨できる；
ｂ）化学療法および／または放射線療法との組合わせで（腫瘍に対する免疫応答を支援するために、下記の事象が起きた段階で：腫瘍質量の低減、死滅しつつある細胞による多量の腫瘍抗原の放出、および壊死した物質の蓄積による炎症の再発）；
ｃ）免疫療法プロトコルとの組合わせで、これらの療法の有効性を増大させるために、制御性／抑制性細胞を並行阻害することにより内因性免疫応答の有効性を増強する目的で。
全身性エリテマトーデスの処置に際して、本発明によるキメラ融合タンパク質であるアルブミン−ＩＬ １０Ｒをそれ自体で、または一般的タイプの処置との組合わせで、全身静脈内投与により投与することができる。
以下にレポートするのは、下記の実施例であり、それらは、本発明による融合タンパク質をコードする遺伝子の投与により、腫瘍に浸潤する制御性リンパ球の免疫抑制作用の低減におけるインターロイキン１０阻害の重要な役割、およびそのようなタンパク質の抗腫瘍有効性を、インビボで立証する。
実施例１：腫瘍浸潤性リンパ球により分泌されるＩＬ−１０の重要な役割の立証
各患者からインフォームドコンセントを得た後、種々の起源の癌に罹患している４２人の患者グループから生検試料を入手し、それらの特徴を下記の表１にレポートし、それらについて腫瘍浸潤制御性Ｔリンパ球およびそれによって腫瘍微小環境に放出されるＩＬ−１０の重要な役割を立証するように適合させた一連の実験を実施した。
＊ 生体材料
＋ 入手できた
− 入手できなかった
実施例１Ａ：癌患者に由来する腫瘍浸潤性制御性Ｔリンパ球の集団の特性分析
２２人の患者から採取した生検試料に由来する腫瘍浸潤細胞（それらの特徴を表１にレポートする）の表現型および機能の分析を実施した。その目的で、適切な無菌フィルターを用いて腫瘍試料を微細に分断した。その後、得られた細胞懸濁液をＦｉｃｏｌｌ勾配上で成層および遠心した。最後に、種々のリンパ球亜集団を、特異的抗体とコンジュゲートした適切な磁性ボール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いる免疫磁気(immunomagnetic)“選別(sorting)”法により精製した。蛍光色素（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とコンジュゲートした抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を用いて実施した浸潤性リンパ球の免疫表現型分析(immunophenotype)により、図１にレポートするように腫瘍浸潤性リンパ球のうち２集団の制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）、すなわちＴｒｅｇリンパ球ＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＣＤ８＋ＣＤ２８−の特性分析が可能になった。
実施例１Ｂ：Ｔリンパ球に対する腫瘍浸潤細胞の免疫抑制活性の立証
抗ＣＤ３ ｍＡｂ抗体で活性化し、増殖している細胞による３Ｈ−チミジンの取込みを評価し、ベータ−カウンターで毎分カウント（ｃｐｍ）として読みを測定する、末梢血Ｔリンパ球増殖の阻害アッセイで、腫瘍浸潤性Ｔ細胞の免疫抑制活性を測定した。データを図２に、抗ＣＤ３ ｍＡｂの存在下でのＴ細胞増殖の阻害パーセントとして表わす。特に、この試験はＴ細胞ＣＤ８＋ＣＤ２８−による増殖抑制活性を示したが、２３人の患者から採取した腫瘍浸潤性Ｔ細胞ＣＤ８＋ＣＤ２８＋（図２，左グラフ）および５人の患者に由来する腫瘍浸潤性Ｔ細胞ＣＤ４＋ＣＤ２５＋（図２，右グラフ）による増殖抑制活性は示さなかった。そのような腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇリンパ球ＣＤ８＋ＣＤ２８−の抑制活性は、抗ＩＬ １０ ｍＡｂモノクローナル抗体の存在下では遮断される（図２，左グラフ）。
実施例１Ｃ：腫瘍特異的Ｔリンパ球の細胞傷害活性に対するＴ細胞ＣＤ８＋ＣＤ２８−の阻害活性
テロメラーゼのペプチドｐ５４０に対して特異的なヒト細胞系ＣＴＬの細胞傷害能に関して、癌試料に由来する細胞集団Ｔ ＣＤ８＋ＣＤ２８−の制御機能を同様に評価した。その目的で、この細胞系ＣＴＬの細胞傷害活性を、ＨＬＡ−Ａ２陽性前立腺腫瘍に罹患している２人の患者の原発性腫瘍塊から単離したＴｒｅｇ細胞ＣＤ８＋ＣＤ２８−の存在下または非存在下で、ペプチドｐ５４０をパルス適用したＴ２リンパ芽球腫瘍系に属する細胞に対して試験した。腫瘍内Ｔｒｅｇリンパ球ＣＤ２８＋ＣＤ２８−の存在下での共培養は、Ｔｒｅｇリンパ球をＴ２腫瘍系のターゲット細胞およびＣＴＬ ｐ５４０特異的リンパ球から物理的に隔離するのに適した“トランスウェル”プレート内で実施された。その際、下記の共培養を実施した：
ａ）ＣＴＬ ＋ 非パルス処理Ｔ２ターゲット細胞；
ｂ）ＣＴＬ ＋ ペプチドｐ５４０をパルス適用したＴ２ターゲット細胞；
ｃ）ＣＴＬ ＋ ペプチドｐ５４０をパルス適用したＴ２ターゲット細胞 ＋ 腫瘍内Ｔｒｅｇ ＣＤ２８＋ＣＤ２８−；
ｄ）ＣＴＬ ＋ ペプチドｐ５４０をパルス適用したＴ２ターゲット細胞 ＋ 腫瘍内Ｔｒｅｇ ＣＤ２８＋ＣＤ２８− ＋ 抗ＩＬ １０ ｍＡｂ；
ｅ）ＣＴＬ ＋ ペプチドｐ５４０をパルス適用したＴ２ターゲット細胞 ＋ 腫瘍内Ｔｒｅｇ ＣＤ２８＋ＣＤ２８− ＋ 有意な特異性の無いイソ型対照のｍＡｂ。
図３にレポートするこの実験の結果は、細胞傷害活性の阻害パーセントとして表わされ、集団Ｔｒｅｇ ＣＤ８＋ＣＤ２８−が腫瘍特異的Ｔ細胞の細胞傷害機能に対しても阻害活性を及ぼすことを指摘する。
実施例１Ｄ：抗ＩＬ−１０ ｍＡｂモノクローナル抗体による免疫抑制活性低減
腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ細胞の集団の免疫抑制活性は抗ＩＬ １０モノクローナル抗体によって対抗され、よってこのサイトカインの分泌に強く依存することが立証される。Ｔｒｅｇ ＣＤ８＋ＣＤ２８−およびＴｒｅｇ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋の蓄積は、腫瘍の浸潤が原発性腫瘍部位と転移部位の両方に存在する場合にのみ立証されるので、強く腫瘍依存性であると思われる。実際に、転移リンパ節のみに上記の制御性Ｔ細胞集団の浸潤がみられ、転移の無いものにはみられなかった（参照：図４）。
実施例１Ｅ：ＩＬ−１０の免疫抑制活性のインビボ検証
１×１０５個のＢ１６同系メラノーマ細胞を皮下注射されたＣ５７クロネズミは、注射を腹部に行なう場合、腹部内臓と近接していることによって壊滅的な局所浸潤および転移性拡散を特徴とするきわめて攻撃的なメラノーマを発症する。有効な免疫療法を同定する目的で、下記を含む種々の戦略を実施した：
ａ） −○−：メラノーマ関連のヒトまたはネズミ抗原ｇｐ１００をコードするプラスミドで遺伝子接種；
ｂ） −□−：ヒトｇｐ１００に由来する免疫原性ペプチド（ｈｇｐ１００２５−３３）またはネズミのもの（ｍｇｐ１００２５−３３）を、アジュバントＣｐＧ（シトシン−ホスフェート−グアニン）の存在下で皮下接種；
ｃ） −△−：同じ免疫原性ペプチド類（ｇｐ１００）を前装填した樹状細胞（ＤＣ）の接種。
同系(syngeneic)および異種(xenogeneic)の両方の状況で、ペプチドｇｐ１００をパルス適用した樹状細胞の接種によって、腫瘍質量の＞５０％低下を誘発する最大の防御処置が得られた。後続実験で、Ｂ１６メラノーマ細胞による“攻撃”を施したマウスを、抗ＩＬ １０ ｍＡｂの投与と組み合わせてプロトコル（ｃ）に従って免疫化した：図５にレポートするように、そのような戦略は処理したマウスの１００％において全腫瘍増殖を阻害するのに有効であった。
さらなる制御性Ｔ細胞を誘導できる免疫寛容型樹状細胞(tolerogenic dendritic cell)の腫瘍内分化をＩＬ−１０が引き起こすことは以前の研究により既に立証されている (Guiducci et al., Cancer Res. 2005; 65;3437-3446)ので、このデータは全体として、免疫監視からの腫瘍の回避が決定される際にＩＬ １０が重要な役割をもち、腫瘍内ＩＬ−１０の作用を機能／分子レベルで遮断する戦略は腫瘍の処置のための有効なアプローチとなる可能性があるという革新的考えを支持する。
実施例２：融合タンパク質構築体の作製：
− ヒトアルブミン−ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域−ヒトＩＬ １０受容体のアルファ鎖の細胞外ドメイン
− ネズミアルブミン−ネズミＩｇＧ１のヒンジ領域−ネズミＩＬ １０受容体のアルファ鎖の細胞外ドメイン
実施例２．１：プラスミド構築体ｐｃＤＮＡ ３．１ ヒト／ネズミアルブミン−ヒト／ネズミＩｇＧ１ヒンジ領域−ヒト／ネズミＩＬ １０受容体のアルファ鎖の細胞外ドメインの作製
試験に用いた発現プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の遺伝子のプロモーター、ならびに転写および翻訳の終止に必要なポリアデニル化ＳＶ４０のフラグメントを含む；さらに、それは遺伝子生成物の発現の評価および精製に有用なエピトープＶ５およびＨｉｓタグをも含む。Ｇ４１８に対する耐性遺伝子が存在するため、真核細胞におけるクローンの安定選択が可能である。それぞれヒトおよびネズミのＰＢＭＣ由来のインターロイキン１０受容体のアルファ鎖の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のｃＤＮＡを、ＡＴＣＣから入手したヒトおよびネズミ血清アルブミンｃＤＮＡのクローンに結合させることにより、２つの融合タンパク質（それぞれ、１つはヒト、１つはネズミ）を工学作製した。２つのｃＤＮＡを、それぞれＰＢＭＣ由来のヒトおよびネズミＩｇＧ１のヒンジ領域のみによって結合させた。下記の戦略を用いてクローニングを実施した：ネズミインターロイキン１０受容体のアルファ鎖の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のｃＤＮＡを、ＰＣＲにより、制限部位を挿入した下記のプライマー対を用いてクローニングした：ｍＩＬ １０Ｒ−ＫｐｎＩ フォワード５’−ＴＴＡＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＴＧＴＣＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＣ−３’、およびｍＩＬ １０Ｒ ＮｏｔＩ リバース５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣ−３’；ネズミ血清アルブミンのｃＤＮＡを、ＰＣＲにより、制限部位を挿入した下記のプライマー対を用いてクローニングした：ＭＳＡ−ＮｏｔＩ フォワード５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧ−３’、およびＭＳＡ−ＸｂａＩ リバース５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＡＡＧＧＣＧＴＣＴＴＴＧ−３’。ヒトインターロイキン１０受容体のアルファ鎖のＥＣＤのｃＤＮＡを、ＰＣＲにより、制限部位を挿入した下記のプライマー対を用いてクローニングした：ｈＩＬ １０Ｒ−ＫｐｎＩ フォワード５’−ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＴＣＧＴＡＧ−３’、およびｈＩＬ １０Ｒ ＮｏｔＩ リバース５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＣＡＡ；ヒト血清アルブミンのｃＤＮＡを、ＰＣＲにより、制限部位を挿入した下記のプライマー対を用いてクローニングした：ＨＳＡ−ＮｏｔＩ フォワード５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧ−３’、およびＨＳＡ−ＡｐａＩ リバース５’−ＧＧＧＣＣＣＴＴＡＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＣＡ−３’。ＰＣＲはＢｉｏｒａｄ Ｔ１００機器で実施された。
２つの遺伝子の厳密なアラインメントを確認するために、キメラ構築体を自動シーケンサー（ＡＢＩ ３１００， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）で配列決定した。
実施例２．２：本発明のネズミおよびヒト キメラ融合タンパク質の分析および特性分析
その後、下記の操作モードに従ったウェスタンブロット分析により遺伝子生成物を分析および評価した：２９３ＴまたはＨＥＫ２９３細胞に、２つのプラスミド、それぞれネズミｐｃＤＮＡ３．１ ＩＬ １０Ｒ−アルブミンおよびヒトｐｃＤＮＡ３．１ ＩＬ １０Ｒ−アルブミンをトランスフェクションした。前記の細胞培養物からの関連する溶解物および上清を還元条件での１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析し、遺伝子生成物に対して特異的な抗体（たとえば、ネズミ抗ＣＤ２１０モノクローナル抗体およびヒト抗ＩＬ １０Ｒアルファ モノクローナル抗体、ネズミ／ヒト抗アルブミンモノクローナル抗体）を用いるウェスタンブロットにより分析した。
トランスフェクションしていない細胞、および／または“空の”プラスミド（すなわち、キメラ遺伝子を含まないもの）でトランスフェクションした細胞の、細胞溶解物および上清を、陰性対照として並行分析した：予想どおり、これらにおいてはキメラ生成物の存在はみられなかった。この分析の結果をそれぞれ図６および７にレポートする。図６は、ネズミ遺伝子ＩＬ １０Ｒ−アルブミンを含有するプラスミドｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクションした２９３Ｔ細胞の細胞溶解物を含むレーンに９８Ｋｄに等しい予想分子量のバンドの存在を示すが、対照溶解物を走行させたレーンには示さない。図７は、ヒト遺伝子ＩＬ １０Ｒ−アルブミンを含有するプラスミドｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクションした２９３Ｔ細胞の細胞溶解物または上清を含むレーンに９８Ｋｄに等しい予想分子量のバンドの存在を示すが、対照溶解物または対照上清を走行させたレーンには示さない。全体として、そのようなデータにより、キメラ遺伝子（それぞれヒトおよびネズミ）を含有するプラスミドでトランスフェクションした細胞の溶解物および上清中に本発明の対象であるそれぞれネズミおよびヒトのキメラタンパク質が存在することが確認される。
実施例３：キメラ融合タンパク質であるアルブミン−ＩＬ １０受容体のアルファ鎖の細胞外ドメインの抗腫瘍活性についての予備インビボ試験
実施例３．１： Ｂ１６メラノーマ腫瘍細胞により誘発されたメラノーマに対する、構築体ｐｃＤＮＡ ３．１−ネズミアルブミン−ネズミＩｇＧ１のヒンジ領域−ネズミＩＬ １０受容体のアルファ鎖の細胞外ドメインによるインビボ抗腫瘍活性
３グループのＣ５７クロネズミにそれぞれ下記のものを注射した：
−●− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞（対照マウス）；
−■− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞を対照プラスミド（ｐｃＤＮＡ ３．１）で処理したものを、皮内注射により注射した（１００μｇ×３回、腫瘍の投与日から開始して１回の投与と次の投与の間の間隔７日で）；
−▲− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞を、本発明によるキメラ融合タンパク質をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ ３．１ ＩＬ １０Ｒ−ＭＳＡ）で処理したものを、皮内注射により注射した（１００μｇ×３回、腫瘍の投与日から開始して１回の投与と次の投与の間の間隔７日で）；
実験経過中に、腫瘍病巣の領域をモニターし、新生物塊の大径が２ｃｍの寸法に達した時、倫理規範を尊重して動物をと殺した。結果を図８にレポートする。この図から推測されるように、空のプラスミドの投与は非処理対照グループと対比して何ら有意差を誘発しなかった（生存時間＜２週間）。これに対し、本発明によるキメラ融合タンパク質をコードするプラスミド構築体で免疫化したマウスは、対照マウスのものより２０日間長い生存時間をもつほど劇的な有意のメラノーマ増殖曲線の変化を示した。
実施例３．２：Ｂ１６メラノーマ腫瘍細胞の投与後の、ペプチドｍｇｐ１００をパルス適用した樹状細胞による免疫化に付随する、プラスミド構築体ｐｃＤＮＡ ３．１−ネズミアルブミン−ネズミｉｇＧ１のヒンジ領域−ネズミＩＬ １０受容体のアルファ鎖の細胞外ドメインのインビボ抗腫瘍活性
４グループのＣ５７クロネズミにそれぞれ下記のものを注射した：
−●− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞（対照マウス）；
−■− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞、および本発明によるキメラ融合タンパク質をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ ３．１ ＩＬ １０Ｒ−ＭＳＡ）を、皮内注射により投与した（１００μｇ×３回、腫瘍の投与日から開始して１回の投与と次の投与の間の間隔７日で）；
−▲− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞、および本発明によるキメラ融合タンパク質をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ ３．１ ＩＬ １０Ｒ−ＭＳＡ））を皮内注射により投与した（１００μｇ×３回、腫瘍の投与日から開始して１回の投与と次の投与の間の間隔７日で）；付随して、ペプチドｍｇｐ１００２５−３３をパルス適用したＤＣ（樹状細胞）を筋肉内注射した（皮内接種）（２×１０６細胞／マウス×３回、腫瘍の投与日から開始して１回の投与と次の投与の間の間隔７日で）；
−◆− １×１０５のＢ１６メラノーマ細胞を皮内投与し、ペプチドｍｇｐ１００２５−３３をパルス適用したＤＣ（樹状細胞）を筋肉内注射した（２×１０６細胞／マウス×３回、腫瘍の投与日から開始して１回の投与と次の投与の間の間隔７日で）；
実験経過中に、腫瘍病巣の領域をモニターし、新生物塊の大径が２ｃｍの寸法に達した時、倫理規範を尊重して動物をと殺した。結果を図９にレポートする。このデータから、本発明の対象である融合タンパク質をコードするプラスミド構築体で処理したマウスは、ペプチドｍｇｐ１００２５−３３をパルス適用した樹状細胞で処理した後に得られたものと重ね合わせることができる実用的な腫瘍増殖曲線をもつという結果が得られる。樹状細胞の接種プロトコルはＢ１６メラノーマに対する免疫療法処置のうち最も有効なものであることが証明されている（前記１５頁の実施例１−Ｅを参照）ので、これはきわめて重要である：したがって、本発明の対象である融合タンパク質をコードするプラスミド構築体による処理は免疫療法処置のうち最良のものと同等な有効性を示した。さらに、ペプチドｍｇｐ１００２５−３３をパルス適用した樹状細胞の投与と付随して、本発明の対象である融合タンパク質をコードするプラスミド構築体で処理したマウスは、ペプチドｍｇｐ１００２５−３３をパルス適用した樹状細胞の投与のみまたは本発明の対象である融合タンパク質をコードするプラスミドのみで処理した動物と対比して認識可能な病巣の出現がさらに１週間遅延したので、新生物増殖曲線のさらに有意の遅延を示した。
実施例３．３：膀胱腫瘍細胞系Ｍ４９に対するプラスミド構築体ｐｃＤＮＡ ３．１−ネズミアルブミン−ネズミＩｇＧ１のヒンジ領域−ネズミＩＬ １０受容体のアルファ鎖の細胞外ドメインのインビボ抗腫瘍活性
３グループのＣ５７クロネズミにそれぞれ下記のものを注射した：
−●− １×１０５個の同系膀胱腫瘍細胞系ＭＢ４９（対照）；
−■− １×１０５の同系膀胱腫瘍細胞系ＭＢ４９および“空の”対照プラスミド（ｐｃＤＮＡ ３．１）を皮内注射により投与した（１００μｇ×３回、腫瘍の投与日から開始して１回の投与と次の投与の間の間隔７日で）；
−▲− １×１０５の同系膀胱腫瘍細胞系ＭＢ４９、および本発明によるキメラ融合タンパク質をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ ３．１ ＩＬ １０Ｒ−ＭＳＡ）を、皮内注射により投与した（１００μｇ×３回、腫瘍の投与日から開始して１回の投与と次の投与の間の間隔７日で）；
実験経過中に、腫瘍病巣の領域をモニターし、新生物塊の大径が２ｃｍの寸法に達した時、倫理規範を尊重して動物をと殺した。結果を図１０にレポートする。
この図から推測されるように、腫瘍細胞系ＭＢ４９について得られたデータはメラノーマ細胞を用いて得られたデータを再現する。実際に、空のプラスミドの投与は非処理対照グループと対比して何ら有意差を誘発しなかった（生存時間＜２週間）。これに対し、本発明によるキメラ融合タンパク質をコードするプラスミド構築体で免疫化したマウスは、対照マウスのものより２０日間長い生存時間をもつほど劇的な有意のメラノーマ増殖曲線の変化を示した。
実施例４：トランスジェニックＢリンパ球の検出
トランスジーンの持続性および組織分布を評価する目的で、ネズミアルブミン−ネズミＩｇＧ１のネズミヒンジ領域−ネズミＩＬ １０受容体のアルファ鎖の細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチド構築体を高い再潅流速度で静脈内接種した４匹のマウス、および接種しなかった１匹のマウス（対照）のＰＢＭＣおよび臓器（脾臓、腎臓、肝臓、肺）から、接種後２４時間目、１４日目および２０日目に細胞ＤＮＡを抽出した。結果を図１１にレポートする。この図から推測されるように、トランスジーンはそれの接種後２０日目にはもはや検出できず、これは生体内でのそれの半減期が約２週間であることを示す。
実施例５：本発明によるヒトキメラタンパク質の精製
本発明の対象である２種類のヒトおよびネズミキメラタンパク質を、ヒトおよびネズミ融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３およびＥＸＰＩ−２９３細胞の上清から精製した。
それぞれ、ヒトタンパク質につき２つの別個のバッチ、およびネズミタンパク質につき３つの別個のバッチに関するＥＬＩＳＡ試験を実施することにより、２種類のヒトおよびネズミタンパク質を確証した。
ヒトキメラタンパク質に関して実施したＥＬＩＳＡ試験は、ヒトキメラタンパク質がヒトＩＬ−１０を特異的に認識し、それが次いでＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）で標識した抗アルブミンヒト抗体により認識されることを立証した。
そのような試験の結果をそれぞれ図１２Ａおよび１２Ｂにレポートする。
この実験は、トランスフェクションした細胞により産生されるタンパク質がアルブミン構造体に付随するＩＬ−１０に対して特異的な受容体能をもつキメラタンパク質であることを立証する。
同様に、ネズミ融合タンパク質に関するＥＬＩＳＡ試験で得られた図１３Ａおよび１３Ｂにレポートする結果は、ネズミタンパク質がネズミインターロイキンを特異的に結合することを立証し、これにより受容体の有効性が確認された。この場合、ネズミタンパク質はヒスチジンコードをもつので、検出はＨＲＰで標識した抗ヒスチジン抗体により実施された。
以下に、本発明によるヒトおよびネズミ融合タンパク質の配列を、ＩＬ １０インターセプターのアルファユニットのＥＣＤドメインのフラグメント、イムノガンマグロブリンのヒンジ領域、アルブミン、および対応するポリヌクレオチド構築体のフラグメントに関してレポートする。
配列
--------
<213> 生物名 : ヒト
<400> PreSequenceString :
<212> タイプ : PRT
<211> 長さ : 238
配列名 : ヒト IL10 R アルファ細胞外ドメイン

配列
--------
<213> 生物名 : ヒト
<400> Pre Sequence String :
EPKSCDKTHT CPAAA 15
<212> タイプ : PRT
<211> 長さ : 12
配列名 : ヒト ヒンジ

配列
--------
<213> 生物名 : ヒト
<400> Pre Sequence String :
<212> タイプ : PRT
<211> 長さ : 585
配列名 : ヒト アルブミン ドメイン

配列
--------
<213> 生物名 : ヒト
<400> Pre Sequence String :
<212> タイプ : DNA
<211> 長さ : 714
配列名 : ヒト IL 10 R アルファ細胞外ドメインのヌクレオチド

配列
--------
<213> 生物名 : ヒト
<400> Pre SequneceString :
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccagcgg ccgcg 45
<212> タイプ : DNA
<211> 長さ : 45
配列名 : ヒト ヒンジのヌクレオチド
配列
--------
<213> 生物名 : マウス
<400> Pre Sequence String :
<212> タイプ : PRT
<211> 長さ : 244
配列名 : マウス IL 10 R アルファ細胞外ドメイン

配列
--------
<213> 生物名 : マウス
<400> Pre Sequence String :
VPRDCGCKPC ICTGGR 16
<212> タイプ : PRT
<211> 長さ : 16
配列名 : マウス ヒンジ

配列
--------
<213> 生物名 : マウス
<400> Pre Sequence String :
<212> タイプ : PRT
<211> 長さ : 584
配列名 : ネズミ アルブミンドメイン
配列記載 :

配列
--------
<213> 生物名 : マウス
<400> PreSequence String :
<212> タイプ : DNA
<211> 長さ : 732
配列名 : マウス IL 10 R アルファ細胞外ドメインのヌクレオチド

配列
--------
<213> 生物名 : マウス
<400> PreSequenceString :
gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc atatgtacag gcggccgc 48
<212> タイプ : DNA
<211> 長さ : 48
配列名 : マウス ヒンジのヌクレオチド

配列
--------
<213> 生物名 : マウス
<400> PreSequenceString :
<212> タイプ : DNA
<211> 長さ : 1755
配列名 : ネズミ アルブミンドメインのヌクレオチド

配列
--------
<213> 生物名 : ヒト
<400> Pre Sequence String :
<212> タイプ : DNA
<211> 長さ : 1758
配列名: ヒト アルブミンドメインのヌクレオチド

Claims (18)

  1. アルブミンとＩＬ １０受容体のアルファユニットの細胞外ドメインとのキメラ融合タンパク質。
  2. アルブミンが哺乳類血清アルブミンである、請求項１に記載のキメラ融合タンパク質。
  3. 哺乳類血清がヒトまたはネズミのものである、請求項２に記載のキメラ融合タンパク質。
  4. ＩＬ １０受容体のアルファユニットの細胞外ドメインが哺乳類末梢血細胞（ＰＢＭＣ）に由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラ融合タンパク質。
  5. 末梢血細胞がヒトまたはネズミのものである、請求項４に記載のキメラ融合タンパク質。
  6. アルブミンが、インターロイキン１０受容体のアルファユニットの細胞外ドメインにスペーサーにより結合している、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラ融合タンパク質。
  7. スペーサーが、イムノガンマグロブリンＧ（ＩｇＧ）のヒンジ領域である、請求項６に記載のキメラ融合タンパク質。
  8. イムノガンマグロブリンがＩｇＧ１である、請求項７に記載のキメラ融合タンパク質。
  9. イムノガンマグロブリンが哺乳類末梢血細胞に由来する、請求項７または８に記載のキメラ融合タンパク質。
  10. 末梢血細胞がヒトまたはネズミのものである、請求項８に記載のキメラ融合タンパク質。
  11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキメラ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築体。
  12. 遺伝子の形態である、請求項１１に記載のポリヌクレオチド構築体。
  13. 請求項１２に記載の遺伝子を含むベクターの形態である、請求項１１に記載のポリヌクレオチド構築体。
  14. ベクターがプラスミドである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド構築体。
  15. ＩＬ １０関連病態の処置における医薬として使用するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキメラ融合タンパク質。
  16. 病態が癌および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、請求項１５に記載のキメラ融合タンパク質。
  17. ＩＬ １０関連病態の処置における医薬として使用するための、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築体。
  18. 病態が癌および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、請求項１７に記載の使用のためのポリヌクレオチド構築体。
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