JP2015504038A - 低減した免疫原性を有するフィブロネクチン結合ドメイン - Google Patents

低減した免疫原性を有するフィブロネクチン結合ドメイン Download PDF

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Abstract

低減した免疫原性と関連付けられる新規デザインを有するフィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）結合ドメインを提供する。本願は、宿主生物による自己抗原としての認識を維持するために、結合物質を作製する際に、一定の免疫原領域を修飾しない、代替的１０Ｆｎ３結合ドメインを記載する。本願は、ＨＬＡアンカー領域が破壊されていて、それにより、隣接領域の免疫原性寄与が低減している、１０Ｆｎ３結合ドメインも記載する。所望のターゲットに高アフィニティで結合することができる修飾領域の新規組み合わせを有する１０Ｆｎ３ドメインも提供する。

Description

［配列表］
本願には配列表が含まれ、これは、ＥＦＳ−Ｗｅｂを使ってＡＳＣＩＩフォーマットで提出されたものであり、引用により、その全体が本明細書に組み込まれる。２０１２年１０月３１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＭＸＩ５２３ＰＣ．ｔｘｔという名称で、サイズは４８，７７９バイトである。
［序論］
フィブロネクチンは細胞外マトリックスの形成および細胞間相互作用に不可欠な役割を果たす大きなタンパク質であり、これは、３タイプ（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）の小さなドメインが数多く繰り返すことで構成されている。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（Ｆｎ３）は大きなサブファミリーであり、そのメンバーは、細胞接着分子、細胞表面のホルモン受容体およびサイトカイン受容体、シャペロン、および糖質結合ドメインの一部分として、よく見いだされる。概観するには、Ｂｏｒｋ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９（１９）：８９９０−４ （１９９２）；Ｂｏｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２４２（４）：３０９−２０ （１９９４）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＆ Ｓｐｉｔｚｆａｄｅｎ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２（５）：３３３−７ （１９９４）；Ｈａｒｐｅｚ ＆ Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２３８（４）：５２８−３９ （１９９４）を参照されたい。
フィブロネクチンベーススキャフォールドは免疫グロブリン様フォールドを有するタンパク質のファミリーである。フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）またはＦｎ３様ドメインに由来するスキャフォールドを一般に利用しているこれらのタンパク質は、天然抗体または改変抗体（すなわち、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または単鎖抗体）に特有の様式で機能すると共に、構造上の利点も有している。具体的に述べると、これらの抗体模倣物の構造は、抗体では構造と機能の喪失に通常つながるような条件下でさえ最適なフォールディング、安定性、および可溶性を持つように、最適化されていることが多い。フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の一例はアドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（商標））（Ａｄｎｅｘｕｓ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂの全額出資子会社）である。フィブロネクチンベーススキャフォールドのＣＤＲ様ループ領域を修飾することで、任意の目的化合物に結合する能力を有するタンパク質を進化させうることが示されている。例えば、米国特許第７，１１５，３９６号に記載のＦｎ３ドメインタンパク質では、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループへの改変が高アフィニティＴＮＦα結合物質をもたらす。米国特許第７，８５８，７３９号に記載のＦｎ３ドメインタンパク質では、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループへの改変が高アフィニティＶＥＧＦＲ２結合物質をもたらす。
タンパク質医薬は、多くの場合、患者において、ある程度の免疫原性と関連する。これらの免疫原性問題は、タンパク質治療薬の効力の低下をもたらしうると共に、患者において潜在的に有害な免疫応答をもたらしうる。したがって、低減した免疫原性と関連付けられ、治療目的にも診断目的にも使用することができる、改良されたフィブロネクチンドメインスキャフォールドタンパク質を得ることができれば、有利であるだろう。
［概要］
本願の一態様は、改良されたターゲット結合と関連する、修飾されたループ領域とスキャフォールド領域、例えばβストランドとの新規な組み合わせを含む、フィブロネクチンベーススキャフォールドポリペプチドを提供する。本願のもう一つの態様は、低減した免疫原性と関連付けられる、新規フィブロネクチンベーススキャフォールドポリペプチドを提供する。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドはヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含み、ここで、１０Ｆｎ３ドメインは、（ｉ）野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループとの比較で、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループから選択される少なくとも１つのノースポール（ｎｏｒｔｈ ｐｏｌｅ）ループのアミノ酸配列中の修飾と、（ｉｉ）野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループとの比較で、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループから選択される少なくとも１つのサウスポール（ｓｏｕｔｈ ｐｏｌｅ）ループのアミノ酸配列中の修飾とを含み、前記少なくとも１つの修飾ノースポールループおよび前記少なくとも１つの修飾サウスポールループが同じターゲットへの結合に寄与する。いくつかの実施形態において、本ポリペプチドのノースポールループの少なくとも１つまたはサウスポールループの少なくとも１つは、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドはヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含み、ここで、１０Ｆｎ３ドメインは、（ｉ）野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループとの比較で、ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、またはＦＧの少なくとも１つのアミノ酸配列中の修飾と、（ｉｉ）野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドとの比較で、少なくとも１つのβストランドのアミノ酸配列中の修飾とを含み、前記少なくとも１つの修飾ループおよび前記少なくとも１つの修飾βストランドが同じターゲットへの結合に寄与する。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドが少なくとも１つのβストランドおよび少なくとも２つのループに修飾アミノ酸配列を含みうる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの少なくとも１つの修飾ループが、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループから選択されるノースポールループであり、少なくとも１つの修飾ループが、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループから選択されるサウスポールループであって、両方のループがターゲットへの結合に寄与する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのループが無修飾である。すなわち、少なくとも１つのループは野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドはヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含み、ここで、１０Ｆｎ３ドメインは、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列との比較で、ＣＤおよびＦＧループのアミノ酸配列中に修飾を含み、ＣＤループおよびＦＧループが同じターゲットへの結合に寄与する。いくつかの実施形態では、ＣＤループのアミノ酸のうちの、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＣＤループの配列との比較で、修飾されている。いくつかの実施形態では、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基４６または４７に対応するＣＤループの１つ以上のアミノ酸残基が、その位置における野生型アミノ酸と同じである。いくつかの実施形態では、ＦＧループのアミノ酸のうちの、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループの配列との比較で、修飾されている。いくつかの実施形態では、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基７５または８７に対応するＦＧループの１つ以上のアミノ酸残基が、その位置における野生型アミノ酸と同じである。いくつかの実施形態では、ＣＤループ、ＦＧループ、またはその両方のアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている。それらの組み合わせも考えられる。例えば、ＣＤループおよびＦＧループの少なくとも１つのアミノ酸配列は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループとの比較で、長さが延長されていてもよいし、ＣＤループおよびＦＧループの少なくとも１つのアミノ酸配列は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループとの比較で、長さが短縮されていてもよい。いくつかの実施形態において、修飾ＣＤおよびＦＧループを有する１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドは、さらに、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドの配列との比較で、βストランドＣ、およびβストランドＤ、βストランドＦおよび／またはβストランドＧの１つ以上にアミノ酸配列修飾を含みうる。いくつかの実施形態において、修飾ＣＤおよびＦＧループを有するポリペプチドはさらに、ＢＣループの少なくとも一部分にアミノ酸配列修飾を含むことができ、例えば野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基３０および３１に対応するＢＣループの１つ以上のアミノ酸残基に修飾を含みうる。いくつかの実施形態では、修飾βストランドの１つ以上が、修飾ループと共に、同じターゲットへの結合に寄与する。いくつかの実施形態では、ＡＢ、ＤＥおよびＥＦループの１つ以上が無修飾である。すなわち、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドはヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含み、ここで、１０Ｆｎ３ドメインは、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列との比較で、ＣＤおよびＤＥループのアミノ酸配列に修飾を含み、ＣＤループおよびＤＥループが同じターゲットへの結合に寄与する。本ポリペプチドはさらに、ＥＦループ、βストランドＣ、βストランドＤ、および／またはβストランドＦの１つ以上のアミノ酸配列に修飾を含むことができ、そのような追加の修飾は、ＣＤおよびＤＥループと共に同じターゲットへの結合に寄与しうる。いくつかの実施形態では、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の残基３６〜６６に対応するアミノ酸間の残基のうちの、少なくとも１０、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個または３１個全てが、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである。いくつかの実施形態において、ＣＤループは、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＣＤループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドはヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含み、ここで、１０Ｆｎ３ドメインは、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列との比較で、ＥＦおよびＦＧループのアミノ酸配列に修飾を含み、ＥＦループおよびＦＧループが同じターゲットへの結合に寄与する。いくつかの実施形態において、本ポリペプチドはさらに、ＡＢループ、βストランドＡおよび／またはβストランドＧの１つ以上にアミノ酸配列修飾を含むことができ、そのような追加の修飾は、ＥＦおよびＦＧループと共にターゲットへの結合に寄与しうる。いくつかの実施形態において、本ポリペプチドはさらに、Ｎ末端および／またはＣ末端に配列修飾を含むことができる。特に、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の最初の７アミノ酸のアミノ酸または残基９３〜９７に対応するアミノ酸のアミノ酸配列を、野生型配列中の対応する残基との比較で修飾することができる。末端におけるこれら追加の修飾も、他の配列修飾と共にターゲットへの結合に寄与しうる。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインの最初の１５アミノ酸残基のうちの、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個または１５個全てが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）中の対応する残基との比較で、修飾されていてもよい。いくつかの実施形態では、ＥＦループのアミノ酸残基のうちの、少なくとも３、４または５個が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）中の対応する残基との比較で、修飾されていてもよい。いくつかの実施形態では、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の残基８０〜９７に対応するアミノ酸間の残基のうちの、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７個または１８個全てが、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されていてよい。いくつかの実施形態において、ＦＧループのアミノ酸配列は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドはヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含み、ここで、１０Ｆｎ３ドメインは、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドおよびループの配列との比較で、βストランドＡ、ループＡＢ、βストランドＢ、ループＣＤ、βストランドＥ、ループＥＦ、およびβストランドＦのアミノ酸配列に修飾を含み、修飾ループおよび修飾ストランドが同じターゲットへの結合に寄与する。いくつかの実施形態において、ＣＤループのアミノ酸配列は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＣＤループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている。いくつかの実施形態において、本ポリペプチドはさらに、βストランドＧおよび／またはＣ末端テールに修飾を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドはヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含み、ここで、１０Ｆｎ３ドメインは、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のループＦＧのアミノ酸残基７７〜８３の配列との比較で、ＦＧループに配列修飾を含み、１０Ｆｎ３は５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する。いくつかの実施形態では、ＦＧループのうち、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基７７〜８３に対応する部分が、野生型ＦＧループのアミノ酸残基７７〜８３の配列との比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている。いくつかの実施形態では、ＦＧループが単独でターゲットへの結合を媒介する。いくつかの実施形態では、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥまたはＥＦループの１つ以上が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列を有する。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドはヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含み、ここで、１０Ｆｎ３ドメインは、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループおよびβストランドの配列との比較で、ＢＣループおよびβストランドＢまたはβストランドＣの少なくとも１つに配列修飾を含み、１０Ｆｎ３ドメインは、βストランドＢまたはβストランドＣの少なくとも１つに野生型との比較で配列修飾を有さない等価な１０Ｆｎ３ドメインと比較して、低減した免疫原性を有する。いくつかの実施形態において、ＢＣループのアミノ酸配列は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインがさらに、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の最初の７アミノ酸残基のアミノ酸配列との比較で、最初の７アミノ酸残基のアミノ酸配列に修飾を含む。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインがさらに、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列との比較で、ＤＥループ、ＦＧループ、またはその両方に修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＤＥループのアミノ酸配列は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＤＥループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている。いくつかの実施形態において、ＦＧループのアミノ酸配列は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、ＤＥループに配列修飾を含み、さらに、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドの配列との比較で、βストランドＤ、βストランドＥ、またはその両方に配列修飾を含む。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、ＦＧループに配列修飾を含み、さらに、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドの配列との比較で、βストランドＦ、βストランドＧ、またはその両方に配列修飾を含む。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドのＢＣループの少なくとも一部分は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列を有する。例えば、ＢＣループの最初の１、２、３、４、５、６、７または８残基は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループ中の対応する残基と同じでありうる。さらに別の実施形態では、ＢＣループ全体が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＢＣループの少なくとも一部分が野生型配列を持つポリペプチドは、ＢＣループに追加の修飾を有する等価なポリペプチドとの比較で、低減した免疫原性を有する。
特定の実施形態において、ここに提供するポリペプチドはヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含み、ここで、１０Ｆｎ３ドメインは、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループとの比較で、ＢＣループの一部分およびＦＧループの一部分に配列修飾を含み、１０Ｆｎ３ドメインは、ＢＣループのより大きな部分が野生型ＢＣループとの比較で修飾されている等価な１０Ｆｎ３ドメインと比較して、低減した免疫原性を有する。いくつかの実施形態では、ＢＣループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループの残基２８〜２９、２７〜２９、２６〜２９、２５〜２９、または２４〜２９に対応しうる。いくつかの実施形態では、ＦＧループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループの残基７７〜７９、７７〜８０、７７〜８１、７７〜８２、７７〜８３、７７〜８４、７７〜８５、または７７〜８６に対応しうる。いくつかの実施形態では、ＦＧループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループの対応する部分との比較で、挿入または欠失を有する。いくつかの実施形態では、ＢＣループおよびＦＧループがターゲットへの結合に寄与する。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインがさらに、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＤＥループの配列との比較で、ＤＥループの一部分に配列修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＤＥループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）のＢＣループの残基５２および５３に対応する。いくつかの実施形態において、１０Ｆｎ３ドメインは、野生型ＢＣループ中の対応する部分との比較でアミノ酸残基２３〜２７の１つ以上にさらに修飾を含む等価な１０Ｆｎ３ドメインと比較して、低減した免疫原性を有する。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する。
いくつかの実施形態では、ここに提供するポリペプチドのＦＧループが、ＲＧＤインテグリン結合部位を含有しない。
いくつかの実施形態では、ここに提供するポリペプチドの疎水性コア残基が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）との比較で、修飾されていない。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドの修飾ループの少なくとも１つのアミノ酸配列は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されたものである。別の実施形態において、修飾ループの少なくとも１つのアミノ酸配列は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列との比較で、長さが短縮されたものである。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドのＣ末端テールのアミノ酸配列は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＣ末端テールのアミノ酸配列との比較で、修飾されている。いくつかの実施形態では、最初の７アミノ酸残基のアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の最初の７アミノ酸残基のアミノ酸配列との比較で、修飾されている。別の実施形態では、本ポリペプチドが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）との比較で、Ｎ末端から１〜７アミノ酸が切断されているか、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）との比較で、Ｃ末端から１〜９アミノ酸が切断されているか、またはその両方である。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドは、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１、２、６０または６）のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％の同一性を有する。別の実施形態では、本ポリペプチドが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１、２、６０または６）のアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％の同一性を有する。一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号１、２、６０または６によって表される天然ヒト１０Ｆｎ３ドメインと少なくとも６０、７０、８０または９０％同一なアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドはフィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含み、ここで、１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２または６０に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ１００ｎＭ未満のＫｄでターゲット分子に結合し、１０Ｆｎ３ドメインはさらに、ＤＫ配列を含有しないＣ末端テールを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端テールが配列番号７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端テールがさらにシステイン残基を含む。別の実施形態では、Ｃ末端テールが配列番号８の配列を含む。別の実施形態において、Ｃ末端テールは、配列番号２３〜３１のいずれか１つの配列を含みうる。
一定の実施形態において、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、野生型１０Ｆｎ３ドメインが結合しないターゲットに結合する。
いくつかの実施形態において、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の１０Ｆｎ３ドメインはさらに、１〜１０アミノ酸を含むＮ末端伸長部を含む。一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号１または６の最初のアミノ酸のＮ末端側にＭ、ＭＧまたはＧを含む。別の実施形態では、配列番号１または６のアミノ酸１〜８に対応するアミノ酸残基が、配列番号９〜１１または１６〜２１のいずれか１つと置き換えられている。
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質がさらに、ポリオキシアルキレン成分、ヒト血清アルブミン結合タンパク質、シアル酸、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ、ＩｇＧ結合タンパク質、およびＦｃフラグメントから選択される１つ以上の薬物動態（ＰＫ）成分を含む。いくつかの実施形態では、ＰＫ成分がポリオキシアルキレン成分であり、そのポリオキシアルキレン成分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ成分がＣｙｓアミノ酸またはＬｙｓアミノ酸を介してフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧが約０．５ｋＤａ〜約１００ｋＤａである。
一定の実施形態において、本願は、本明細書に記載する新規１０Ｆｎ３ドメインを含む医薬上許容される組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本組成物は本質的にパイロジェンフリーである。いくつかの実施形態において、本組成物は、微生物汚染を実質的に含まず、それゆえに、インビボ投与に適している。本組成物は、例えば静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）または皮下（ＳｕｂＱ）投与のために製剤化することができる。いくつかの実施形態では、本組成物が生理的に許容される単体を含む。いくつかの実施形態では、本組成物のｐＨが４．０〜６．５であるか、４．０〜５．５であるか、または４．０、４．５、５．０もしくは５．５に等しい。いくつかの実施形態では、組成物中のフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の濃度が５ｍｇ／ｍｌである。
一定の実施形態において、本願は、本明細書に記載する新規１０Ｆｎ３ドメインをコードする核酸を提供する。そのようなタンパク質のポリヌクレオチドを含有するベクターも包含される。好適なベクターには、例えば発現ベクターがある。本願のさらにもう一つの態様は、１０Ｆｎ３ドメインをコードするポリヌクレオチド、ベクター、または発現ベクターを含む細胞を提供する。配列は、使用する細胞タイプにおける発現が最大になるように、好ましく最適化される。いくつかの実施形態では、発現が大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）などの細菌細胞で起こる。別の実施形態では、発現が哺乳動物細胞で起こる。ある実施形態では、細胞が、本明細書に記載する１０Ｆｎ３ドメインを含むタンパク質を発現する。一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインをコードするポリヌクレオチドが、選択した細胞タイプにおける発現に関してコドン最適化される。本明細書に記載する１０Ｆｎ３ドメインを生産する方法であって、１０Ｆｎ３ドメインをコードする核酸、ベクター、または発現ベクターを含む宿主細胞を培養すること、および発現したタンパク質を培養から回収することを含む方法も提供される。
一定の実施形態において、本願は、本明細書に記載するフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質のライブラリーを提供する。ここに提供するライブラリーは、例えば少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１２、１０１３、もしくは１０１４個、またはそれ以上のメンバーを含みうる。目的のターゲットに特異的に結合するフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を、本明細書に記載するライブラリーの１つから単離するための方法も提供される。例えば、ライブラリー単離方法は、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質のライブラリーを目的のターゲットと接触させること、およびターゲットに（例えば特定のアフィニティまたは適切な洗浄条件下で）結合するライブラリーのメンバーを単離することなどを含みうる。単離ステップはファージディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイなどの任意の適切な方法を使って実行することができる。同様に、ターゲット結合は、例えばターゲットを固形支持体（例えばカラム、チップ、ビーズなど）に固定化し、タンパク質結合を許すのに適した条件下で固定化ターゲットをライブラリーと混合することなどといった、任意の適切な方法を使って行うことができる。次に、結合したライブラリーメンバーを、結合していないライブラリーメンバーから分離して、ターゲットに結合する単離されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を得ることができる。一定の実施形態において、本単離方法は、ターゲット結合ステップと単離ステップとのラウンドの繰り返しを伴いうる。
疎水性コアアミノ酸残基が示された野生型１０Ｆｎ３アミノ酸配列（配列番号１）。βストランドをボールド体で記載し、ループ領域を文字対で指定し、疎水性コア残基にはボールド体で下線を付す。アミノ酸９５〜１０１はテールに対応し、配列番号１を有する１０Ｆｎ３分子にこれが存在しない場合は、配列番号６を有する１０Ｆｎ３分子になる。 （Ａ〜Ｆ）：変異させることで代表的な修飾１０Ｆｎ３ポリペプチドパッチライブラリーを与えうるアミノ酸位置が、完全長配列（配列番号１）中に示されている、野生型１０Ｆｎ３アミノ酸配列（配列番号１または６）。各クラスのパッチライブラリー１０Ｆｎ３ポリペプチドのそれぞれを生成させるために修飾することができる潜在的位置を下線付きのボールド体で記載する。表示した位置のいずれか１つまたは組み合わせを変異させることで、ノースウエスト（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ）結合物質（図２Ａ）、ノースイースト（Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ）結合物質（図２Ｂ）、ウエストサイド（Ｗｅｓｔ Ｓｉｄｅ）結合物質（図２Ｃ）、サウスフロント（Ｓｏｕｔｈ−Ｆｒｏｎｔ）結合物質（図２Ｄ）、ＡＧストランド結合物質（図２Ｅ）およびサウスウエスト（Ｓｏｕｔｈ Ｗｅｓｔ）結合物質（図２Ｆ）のいずれかを生成させることができる。 （Ａ〜Ｆ）：さまざまな考えうる結合界面のビューが示されている野生型１０Ｆｎ３ドメインの結晶構造。野生型から変異させうる残基を黒色で示す。６つのループのうちの１つのメンバーではない変異残基には、スティックを付加している。野生型１０Ｆｎ３ドメインのノースウエスト結合界面（図３Ａ）、ノースイースト結合界面（図３Ｂ）、ウエストサイド結合界面（図３Ｃ）、サウスフロント結合界面（図３Ｄ）、ＡＧストランド結合界面（図３Ｅ）およびサウスウエスト結合界面（図３Ｆ）の結晶構造ビューが示されている。 １０Ｆｎ３ポリペプチドの５つの異なるペプチドセグメントへの５つの異なるＨＬＡアレルタンパク質のＩＣ５０結合アフィニティ（μＭ）を示すＨＬＡ結合データ。配列番号５８、５１および５２は、それぞれＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのループ領域クラスターであり、ループ領域残基に下線が付されている。配列番号５３および５４は、それぞれ、１０Ｆｎ３ポリペプチドの野生型および修飾スキャフォールド領域セグメントである。表示のとおり、ＢＣループ領域クラスター（配列番号５８）と試験した２つのスキャフォールド領域ペプチドセグメント（配列番号５３および５４）は、試験したＨＬＡアレルタンパク質の大半の、強い結合物質（＜２５μＭ）であった。スキャフォールド領域ペプチドセグメント（配列番号５３および５４）の予測免疫優性領域に下線を付す。 Ｎｏｔｃｈ１：マウスＤＬＬ４競合アッセイ結果。Ｂｉａｃｏｒｅ分析で決定した場合、配列番号３および４のＷＳ−ＬＩ１結合物質が、Ｎｏｔｃｈ１とマウスＤＬＬ４との間の相互作用を１００％阻害する能力を有し、配列番号５のＷＳ−ＬＩ１結合物質が、７５％阻害する能力を有することを示している。 配列番号３のＷＳ−ＬＩ１結合物質が主として単量体型であり、配列番号４および５のＷＳ−ＬＩ１結合物質が、単量体型タンパク質と凝集タンパク質との混合物を含有していたことを示す、サイズ排除クロマトグラフィー結果。太いトレースは試験したＷＳ−ＬＩ１結合物質に対応し、太くないトレースは分子量マーカーに対応する。ＷＳ−ＬＩ１結合物質単量体は第３マーカーピークと第５マーカーピークの間に溶出すると予想される。 配列番号４５〜４７のＷＳ−ＬＩ１結合物質が主として単量体型であることを示すサイズ排除クロマトグラフィー結果。太いトレースは試験したＷＳ−ＬＩ１結合物質に対応し、太くないトレースは分子量マーカーに対応する。ＷＳ−ＬＩ１結合物質単量体は第３マーカーピークと第５マーカーピークの間に溶出すると予想される。 配列番号４８〜４９のＷＳ１結合物質が主として単量体型であることを示すサイズ排除クロマトグラフィー結果。太いトレースは試験したＷＳ１結合物質に対応し、太くないトレースは分子量マーカーに対応する。ＷＳ１結合物質単量体は第３マーカーピークと第５マーカーピークの間に溶出すると予想される。 （Ａ〜Ｃ）：非従来型１０Ｆｎ３結合物質のためのライブラリーデザイン。図９Ａは、ＢＣループが実質的にまたは完全に無修飾である（すなわちＢＣループの全てまたは大半が野生型配列のまま残されている）ライブラリーデザインを示している。図９Ａに図示するライブラリーのＣＤおよびＦＧループは全てサイズが可変であり、特に、ＳＰ１、ＷＳ２’、ＷＳ２’−ＣＤ、フロント（Ｆｒｏｎｔ）３およびＣＤ１−ループのループＣＤは、長さが可変である。バック（Ｂａｃｋ）３のループＦＧもサイズは可変であり、ＣＤ１−ループの最初の３アミノ酸（すなわちＶＳＤ）は欠失させてもよい。図９Ｂは、ＢＣループのＮ末端のさまざまな部分が野生型のまま残されているライブラリーデザインを示している。図９Ｃは、ＢＣループと、ＢＣループに隣接するβストランド領域の一方または両方とが修飾されるライブラリーデザインを示している。ライブラリーＮＰ−６は、７１番めのスレオニンを一定に保ち、かつ／またはアミノ酸１〜７の長さを一定に保つことによって構築することもできる。ライブラリーＮＰ４−５は、７１番めのスレオニンを一定に保ち、かつ／またはアミノ酸１〜７の長さを一定に保ち、かつ／またはループＢＣを一定に保つことによって構築することもできる。図９Ａ〜Ｃのそれぞれでは、完全長野生型１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）を、アミノ酸１からアミノ酸１０１までの番号ならびにループ領域およびストランド領域を示す印と一緒に、最上部に示す。１０Ｆｎ３野生型ドメインの記述の下にあるのが、古典的なノースポールライブラリーデザイン（すなわちＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが修飾されるもの）の記述である。非従来型ライブラリーデザインを古典的ノースポールライブラリーデザインの下に示す。置換によって修飾されうる位置を下線付きのボールド体で示し、置換、挿入および／または欠失によって修飾されうる領域を囲み枠付きのボールド体で示し、非野生型のアミノ酸残基に影を付ける。図９Ｂでは、全ての配列が配列番号１に基づいている。図９Ｃでは、ＷＴ１０Ｆｎ３、古典的ＮＰ、ＮＰ１、ＮＥ１、ＮＰ４−５、ＮＰ６−１、およびＮＷ２配列が、配列番号１として開示されており、残りの配列は全て配列番号５９として開示されている。図９Ａでは、ＷＴ１０Ｆｎ３、古典的ＮＰ、ＷＳ１、ＷＳ２、ＷＳ３、ＬＩ−３（ａ）、ＷＳ−ＬＩ１、ＷＳ２’およびＷＳ２’−ＣＤが配列番号１に基づき；残りの配列は全て配列番号５９に基づいている。全てのライブラリーは、配列番号６または配列番号１２、すなわちそれぞれ配列番号１および５９のアミノ酸９５〜１０１を欠くものにも基づいている。 ヒトＰＸＲリガンド結合ドメインに特異的に結合する８つの１０Ｆｎ３ポリペプチド（アドネクチン−１〜アドネクチン−８）と親１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）との配列アラインメント。βストランドの場所を配列アラインメントの下の矢印で示し、対応するアミノ酸をボールド体で示す。アドネクチン−３（配列番号６２）およびアドネクチン−４（配列番号６３）は、６×Ｈｉｓテール（配列番号４４）が追加された配列番号４８および４９に対応する。アドネクチン−１、−２、−５、−６、−７および−８（それぞれ配列番号７０〜７２および１３〜１５）は、それぞれ、６×Ｈｉｓテール（配列番号４４）が追加された配列番号６４〜６９に対応する。 固定化インテグリンαＶβ３に対する（左から右に）ビトロネクチン、フィブロネクチン、非結合性対照アドネクチン（ＲＧＤがＲＧＥに変化しているもの）および特異的ターゲットに結合しかつＲＧＤ配列を含まない３つの異なる１０Ｆｎ３分子（それぞれ１０Ｆｎ３ Ａ、ＢおよびＣ）の結合の程度を示すヒストグラム。 野生型ヒト１０Ｆｎ３（配列番号６）のアミノ酸配列（一番上の行）とライブラリーＷＳ４、ＷＳ５、ＷＳ６およびＷＳ７のアミノ酸配列。下線付きボールド体および囲み枠付きのアミノ酸は、置換、欠失および付加によって変化させることができる。下線付きのアミノ酸は置換によって変化させることができる。
［詳細な説明］
定義
「ポリペプチド」とは、長さ、翻訳後修飾、または機能を問わず、２つ以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書においては可換的に使用される。ポリペプチドは、天然アミノ酸および非天然アミノ酸、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５５９，１２６号に記載されているものを含むことができる。ポリペプチドは種々の標準的な化学的方法のいずれかで修飾することもできる（例えばアミノ酸は保護基で修飾することができ；カルボキシ末端アミノ酸は末端アミド基にすることができ；アミノ末端残基は、例えば親油性を強化するための基などで修飾することができ；あるいは、ポリペプチドを化学的にグリコシル化するか、他の方法で修飾して、安定性またはインビボ半減期を増加させることができる）。ポリペプチド修飾には、そのポリペプチドへのもう一つの構造、例えば環状化合物または他の分子などの取付けを含めることができ、立体配置（すなわちＲもしくはＳ；またはＬもしくはＤ）が変化している１つ以上のアミノ酸を含有するポリペプチドも含めることができる。
本明細書にいう１０Ｆｎ３ドメインの「領域」は、ヒト１０Ｆｎ３ドメインのループ（ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧ）、βストランド（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ）、Ｎ末端（配列番号１のアミノ酸残基１〜７に対応する）、またはＣ末端（配列番号１のアミノ酸残基９３〜１０１に対応する）のいずれかを指す。
「ノースポールループ」は、フィブロネクチン・ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのいずれか１つを指す。
「サウスポールループ」は、フィブロネクチン・ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインのＡＢ、ＣＤおよびＥＦループのいずれか１つを指す。
「スキャフォールド領域」は、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの任意の非ループ領域を指す。スキャフォールド領域には、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧβストランドならびにＮ末端領域（配列番号１の残基１〜７に対応するアミノ酸）およびＣ末端領域（配列番号１の残基９３〜１０１に対応するアミノ酸）が含まれる。
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、本明細書では、最大のパーセント配列同一性が得られるように配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後に、保存的置換をいずれも配列同一性の一部であるとはみなさずに、選択した配列中のアミノ酸残基と同一な、候補配列中のアミノ酸残基の百分率と定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野の技能の範囲内にあるさまざまな方法で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使って、達成することができる。当業者は、アラインメントをはかるための適当なパラメータを、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、決定することができる。ただし、ここでの目的には、％アミノ酸配列同一性値が、後述のように、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．によって作成され、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ２０５５９）に利用者向け文書と共に登録申請されて、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されており、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）を通して公的に入手することができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはｄｉｇｉｔａｌ ＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄ上で使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動しない。
ここでの目的には、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、または所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対する％アミノ酸配列同一性（これは、所与のアミノ酸配列Ｂに、または所与のアミノ酸配列Ｂと、または所与のアミノ酸配列Ｂに対して、一定の％アミノ酸配列同一性を有する、または含む、所与のアミノ酸配列Ａと、言い換えることもできる）は、以下のように算出される：１００×分率Ｘ／Ｙ（ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２が、そのプログラムによるＡとＢのアラインメントにおいて、完全一致（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｍａｔｃｈ）とスコアリングしたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性が、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくなくなることは、理解されるであろう。
本明細書において、ポリペプチドのアミノ酸残基は、（１）その残基の側鎖または主鎖の非水素原子のいずれかが、複合体の実験的に決定された三次元構造に基づいて、結合ターゲットの任意の原子から５オングストローム以内に見いだされ、かつ／または（２）その残基を、野生型１０Ｆｎ３（例えば配列番号１または６）におけるその等価物、アラニン、または問題の残基と類似するサイズの側鎖または問題の残基より小さい側鎖を有する残基に変異させると、それが、ターゲットに対する平衡解離定数の測定値の増加（例えばｋｏｎの増加）につながるのであれば、ターゲットの「結合に寄与する」とみなされる。
ポリペプチドの「半減期」は、一般に、そのポリペプチドの血清中濃度が、インビボで、例えばポリペプチドの分解および／または自然の機序によるポリペプチドのクリアランスもしくは隔離などによって、５０％減少するのに要する時間と定義することができる。半減期は、例えば薬物動態分析によるなど、自体公知の任意の方法で決定することができる。好適な技法は当業者には明らかであるだろうが、例えば一般的には、霊長類に適切な用量のポリペプチドを投与するステップ；前記霊長類から血液試料または他の試料を定期的に収集するステップ；前記血液試料中のポリペプチドのレベルまたは濃度を決定するステップ；およびこうして得たデータ（のプロット）から、ポリペプチドのレベルまたは濃度が投薬時の初期レベルと比較して５０％低減するまでの時間を算出するステップを伴いうる。半減期を決定するための方法は、例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈら「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ： Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ」（１９８６）、Ｐｅｔｅｒｓら「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（１９９６）、およびＭ Ｇｉｂａｌｄｉ ＆ Ｄ Ｐｅｒｒｏｎ「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ刊）第２改訂版（１９８２）に見出すことができる。
半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを使って表現することができる。本明細書において「半減期の増加」とは、これらのパラメータのいずれか１つ、これらのパラメータのいずれか２つ、またはこれら３つのパラメータの全ての増加を指す。一定の実施形態において、半減期の増加は、ｔ１／２−βの増加を指し、ｔ１／２−αおよび／もしくはＡＵＣまたはその両者の増加を伴う場合も、伴わない場合もある。
概観
１０Ｆｎ３ドメインは、抗体に、具体的には抗体の可変領域に、構造的にも機能的にも類似している。歴史的には、１０Ｆｎ３結合ドメインのデザインは、１０Ｆｎ３ドメイン構造が抗体のＶＨドメインの構造と類似していることに依拠していた。特に、１０Ｆｎ３結合ドメインは、従来、１０Ｆｎ３ドメインのＣＤＲ様ループのアミノ酸配列中の修飾に依拠してきた。１０Ｆｎ３ドメインのＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループは、フレキシブルであり、１０Ｆｎ３ドメインの全体的構造を改変することなくアミノ酸配列に修飾を加えることが容易であるという点で、免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）と類似している。さらにまた、１０Ｆｎ３ドメインの一面（すなわち「ノースポール」）に沿うＣＤＲ様ループのセットを修飾することによって、所望のターゲットに結合する１０Ｆｎ３ドメインの開発が可能になることが示されている（例えばＰＣＴ公開ＷＯ０２／０３２９２５、ＷＯ２００８／０９７４９７、およびＷＯ２００８／０６６７５２を参照されたい）。これらの従来型１０Ｆｎ３スキャフォールドデザインでは、ループ間のタンパク質配列、すなわちβストランドは、典型的には修飾されないか、最小限にしか修飾されない。なぜなら、それらは１０Ｆｎ３の全体的な構造コンフォメーションの維持に、役割を果たしているからである。本発明者らは、驚いたことに、従来とは異なる方法で１０Ｆｎ３ドメインを修飾することで、適切な安定性を維持しつつ、所望のターゲットに結合するタンパク質を生産することが可能であることを、ここに見いだした。
特に本願は、改良された性質と関連する、修飾ループ領域と修飾スキャフォールド領域との新規な組み合わせを含む、フィブロネクチンベーススキャフォールドポリペプチドを提供する。本明細書に記載するフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、１つ以上の所望のターゲットに結合するように修飾された１つ以上のヒト第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含む。本願は、一つには、フィブロネクチンドメインループおよび／またはスキャフォールド領域修飾の新規な組み合わせが、特異的ターゲット結合と関連するという驚くべき発見に関する。特に、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質における新規スキャフォールド領域（例えば非ループ）修飾を特異的ループ修飾と組み合わせることで、特異的ターゲット結合が得られることを見いだした。このような新規スキャフォールドデザインにより、１０Ｆｎ３ベースの結合タンパク質のデザインに新しい可能性が広がる。例えば、本明細書に記載する非従来型のスキャフォールドデザインは、１０Ｆｎ３ドメイン内に配列修飾のための新しい区域を開拓することによって、より大きな多様性を持つライブラリーの作成を可能にする。加えて、非従来型のスキャフォールドデザインは、従来のＣＤＲ様ループ界面が与える界面ジオメトリーと比較して、代替的な表面界面ジオメトリーを可能にする。これらの非従来型結合物質が提供する追加の多様性および代替表面ジオメトリーは、例えば所与のターゲットに対するアフィニティが向上している１０Ｆｎ３結合ドメインを提供することによって、または所与のターゲット上の異なるエピトープに結合する１０Ｆｎ３結合ドメインを提供することによって、望ましい性質を有する１０Ｆｎ３結合ドメインの開発を容易にしうる。
本願は、低減した免疫原性と関連付けられる新規フィブロネクチンベーススキャフォールドポリペプチドも記述する。本明細書の実施例で説明するように、βストランドＢ／ＢＣループ／βストランドＣ領域は、強いＨＬＡ結合活性に基づく免疫原性「ホットスポット」でありうることを見いだした。特にこの領域は、ＨＬＡ結合のための強いアンカー配列として作用するようである。実施例では、βストランドＢ／ＢＣループ／βストランドＣ領域の野生型配列が霊長類宿主によって自己抗原として認識されることも示す。それゆえに、強いＨＬＡ結合にもかかわらず、野生型配列に対する免疫応答は生じない。そこで、本発明者らは、βストランドＢ／ＢＣループ／βストランドＣ領域内のキー区域は野生型のまま残されているが、同配列の他の領域の修飾が、高アフィニティターゲット結合を可能にする、代替的１０Ｆｎ３スキャフォールドを開発した。そのような代替的結合物質により、宿主生物における望ましくない免疫応答を回避する高アフィニティ１０Ｆｎ３結合ドメインを生成させるチャンスが増大するであろう。なぜなら、βストランドＢ／ＢＣループ／βストランドＣ領域の免疫原性ホットスポットは無改変であり、それゆえに、宿主生物によって自己抗原として認識されるはずだからである。本願は、βストランドＢ／ＢＣループ／βストランドＣ領域中のＨＬＡアンカー配列が破壊されていて、それがこの領域の潜在的免疫原性を低減するはずである、代替的１０Ｆｎ３結合ドメインも提供する。アンカー配列が除去されているそのような１０Ｆｎ３結合ドメインは、この領域に関連する望ましくない免疫応答を依然として回避しつつ、ＢＣループの全部または一部分の多様化を可能にするはずである。ＨＬＡアンカー配列は、ＢＣループ領域への修飾と合わせて、βストランドＢおよび／またはβストランドＣ領域中のキー残基を修飾することによって、除去または破壊することができる。低減した潜在的免疫原性を有する例示的非従来型１０Ｆｎ３結合ドメインを以下にさらに説明する。
本明細書に記載する新規フィブロネクチンベーススキャフォールドポリペプチドは、任意の目的のターゲットに結合するようにデザインすることができる。例示的実施形態では、ターゲットが、目的の抗原、ポリペプチドまたは治療用タンパク質ターゲットである。治療上望ましいターゲットの例には、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、デルタ様タンパク質４（ＤＬＬ４）、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）、およびプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）などがある。
フィブロネクチンベーススキャフォールド
Ａ．一般構造
Ｆｎ３とはフィブロネクチン由来のＩＩＩ型ドメインを指す。Ｆｎ３ドメインは小さく、単量体型であり、可溶性であり、安定である。これはジスルフィド結合を持たないので、還元条件下で安定である。Ｆｎ３の全体的構造は免疫グロブリンフォールドに似ている。Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって順に、βまたはβ様ストランドＡ；ループＡＢ；βまたはβ様ストランドＢ；ループＢＣ；βまたはβ様ストランドＣ；ループＣＤ；βまたはβ様ストランドＤ；ループＤＥ；βまたはβ様ストランドＥ；ループＥＦ；βまたはβ様ストランドＦ；ループＦＧ；およびβまたはβ様ストランドＧを含む。７本の逆平行βストランドが２つのβシートとして配置され、それが安定なコアを形成すると同時に、βまたはβ様ストランドをつなぐループから構成される２つの「面」を作り出している。ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦが一つの面（「サウスポール」）に配置され、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧが反対の面（「ノースポール」）上に配置されている。ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧの一部または全部はリガンド結合に関与しうる。ヒトフィブロネクチンには少なくとも１５の異なるＦｎ３モジュールがあり、モジュール間の配列相動性は低いものの、三次構造の高い類似性は全てに共通している。
例示的実施形態では、本明細書に記載のリガンド結合性スキャフォールドタンパク質が、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、すなわちＦｎ３の第１０モジュール（１０Ｆｎ３）に基づく。天然ヒト１０Ｆｎ３のアミノ酸配列を配列番号１に示す：
Figure 2015504038
 （配列番号１）（ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループに下線を付し；ＢＣ、ＦＧ、およびＤＥループをボールド体で強調し；βストランドは各ループ領域間に配置され；Ｎ末端およびＣ末端領域はイタリック体で示す）。配列番号１は、テール（すなわちアミノ酸９５〜１０１）を含む１０Ｆｎ３分子の配列である。配列番号６は、テールを含まず、配列番号１のアミノ酸１〜９４からなる、野生型ヒト１０Ｆｎ３分子のアミノ酸配列である。
配列番号１において疎水性コアの形成に関与する残基（「コアアミノ酸残基」）には、配列番号１または６の以下のアミノ酸に対応するアミノ酸が含まれる：Ｌ８、Ｖ１０、Ａ１３、Ｌ１８、Ｉ２０、Ｗ２２、Ｙ３２、Ｉ３４、Ｙ３６、Ｆ４８、Ｖ５０、Ａ５７、Ｉ５９、Ｌ６２、Ｙ６８、Ｉ７０、Ｖ７２、Ａ７４、Ｉ８８、Ｉ９０およびＹ９２（ここでは、コアアミノ酸残基を一文字アミノ酸コードで表し、その後ろに配列番号１内でそれらが配置されている位置を付している）。例えばＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３６： １０７９−１０９２ （１９９４）を参照されたい。いくつかの実施形態では、疎水性コアの形成に関与する残基を使ってポリペプチドのループ領域の境界を決定する。例えば、ＡＢループは、βストランドＡの疎水性コア残基Ａ１３とβストランドＢの疎水性コア残基Ｌ１８との間のアミノ酸のストレッチであると定義することができる。図１参照。いくつかの実施形態では、疎水性コアアミノ酸が、野生型配列との比較で、修飾されない。別の実施形態では、以下の疎水性アミノ酸を変異させることができる：Ａ１３、これはβバルジの一部であり、表面残基に転化することができる；Ｙ３２およびＡ７４、これらは、近隣のループと異なる形で相互作用するように、一方または両方を変異させることができる；Ｉ８８、これは部分的に溶媒暴露残基であり、天然フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインでは、対応する位置が常に疎水性残基であるわけではない；およびＹ９２、これはＣ末端テールにつながっており、Ｃ末端領域を多様化するのであれば、多様化することができる。
いくつかの実施形態では、ＡＢループが配列番号１の残基１４〜１７に対応し、ＢＣループが残基２３〜３１に対応し、ＣＤループが残基３７〜４７に対応し、ＤＥループが残基５１〜５６に対応し、ＥＦループが残基６３〜６７に対応し、ＦＧループが残基７５〜８７に対応する。ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは分子の一面（すなわち「ノースポール」）に沿って並び、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループは、分子の反対の面（すなわち「サウスポール」）に沿って並ぶ。配列番号１において、βストランドＡは残基８〜１３に対応し、βストランドＢは残基１８〜２２に対応し、βストランドＣは残基３２〜３６に対応し、βストランドＤは残基４８〜５０に対応し、βストランドＥは残基５７〜６２に対応し、βストランドＦは残基６８〜７４に対応し、βストランドＧは残基８８〜９２に対応する。例えば、ストランドＡとストランドＢとが、ループＡＢにより、βストランドＡ、ループＡＢ、βストランドＢという構成でつながれているというように、βストランドは、対応するループによって互いにつながれている。Ｎ末端および／またはＣ末端領域（上記ではイタリック体の部分）を除去または改変することで、生物学的活性を保った配列番号２または配列番号６のアミノ酸配列を含む分子を生成させることができる。一定の実施形態では、配列番号１の最初の８アミノ酸残基および／または配列番号１の最後の７アミノ酸残基（すなわち配列番号１のアミノ酸残基９５〜１０１）を除去または改変して、配列番号６０または配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド（７つのＮ末端アミノ酸がない配列番号１に対応するもの、および配列番号１のアミノ酸１〜９４からなるもの）を生成させることができる。本明細書に記載するライブラリーは、配列番号１に示すＮ末端領域またはＣ末端領域を含みうる。一定の実施形態において、ライブラリーはＮ末端領域を含むが、Ｃ末端領域は含まない（すなわちそれらは配列番号６に基づく）。
上述のように、配列番号１の残基１４〜１７、２３〜３１、３７〜４７、５１〜５６、６３〜６７および７５〜８７に対応するアミノ酸残基は、それぞれＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループを規定する。しかし、所望のターゲットに対して強いアフィニティを有する１０Ｆｎ３結合ドメインを実現するためにループ領域内のすべての残基を修飾する必要はないことを理解すべきである。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤループのアミノ酸３９〜４５およびＦＧループの７７〜８７に対応する残基だけを修飾することで、高アフィニティ１０Ｆｎ３結合物質を作製した。（例えば配列番号３、４もしくは５のいずれかのアミノ酸配列を有するマウスＤＬＬ４結合性コア、または配列番号４５、４６もしくは４７のいずれかのアミノ酸配列を有するマウスＩＬ−１７結合性コアを参照されたい）。
加えて、ループ領域において挿入および欠失を行っても、依然として、高アフィニティ１０Ｆｎ３結合ドメインを作製することはできる。例えば、配列番号３を有するマウスＤＬＬ４結合物質のＣＤループは野生型１０Ｆｎ３ドメインと同じ長さのＣＤループを有する。すなわち、配列番号１の７つの残基３９〜４５が、配列番号３の７つの残基４１〜４７で置き換えられている。これに対し、配列番号３を有するマウスＤＬＬ４結合物質のＦＧループの長さは、野生型１０Ｆｎ３ドメインの対応するＦＧループより長い。すなわち、配列番号１の９つの残基７７〜８５が、配列番号３の１９個の残基７９〜９８で置き換えられている。
したがって、いくつかの実施形態において、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧから選択される１つ以上のループの長さは、野生型ヒト１０Ｆｎ３中の対応するループとの比較で、延長または短縮することができる。任意の所与のポリペプチドにおいて、１つ以上のループの長さを延長するか、１つ以上のループの長さを短縮するか、またはそれらの組み合わせを行うことができる。いくつかの実施形態では、所与のループの長さを、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１０〜２５、１０〜２０、または１０〜１５アミノ酸分、延長することができる。いくつかの実施形態では、所与のループの長さを、１〜１５、１〜１１、１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２、２〜１０、または２〜５アミノ酸分、短縮することができる。特に、１０Ｆｎ３のＦＧループは１３残基長であるのに対して、抗体重鎖中の対応するループは４〜２８残基の範囲である。それゆえに、ターゲット結合に関して、ＦＧに依拠するポリペプチドにおける抗原結合を最適化するために、１０Ｆｎ３のＦＧループの長さを配列と共に改変して、ターゲット結合において可能な限りのフレキシビリティとアフィニティを得ることができる。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合モチーフ「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」（ＲＧＤ）（配列番号１または６のアミノ酸７８〜８０）の１つ以上の残基を、インテグリン結合が妨害されるように置換することができる。いくつかの実施形態では、ここに提供するポリペプチドのＦＧループがＲＧＤインテグリン結合部位を含有しない。ある実施形態では、ＲＧＤ配列が（Ｎ末端からＣ末端に向かう方向に）極性アミノ酸−中性アミノ酸−酸性アミノ酸配列で置き換えられる。もう一つの実施形態では、ＲＧＤ配列がＳＧＥで置き換えられる。さらにもう一つの実施形態では、ＲＧＤ配列がＲＧＥで置き換えられる。
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、配列番号１、２、６０または６のアミノ酸配列を有するヒト１０Ｆｎ３ドメインに対して少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の同一性を有する１０Ｆｎ３ドメインを含む。一定の実施形態では、ここに提供するポリペプチドが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１、２、６０または６）のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％の同一性を有する。別の実施形態では、ポリペプチドが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１、２、６０または６）のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の同一性を有する。一定の実施形態では、ループの１つ以上が、野生型配列の対応するループの配列との比較で、無修飾であり、かつ／またはβストランドの１つ以上が、野生型配列の対応するβストランドの配列との比較で、無修飾であるだろう。一定の実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質中の１０Ｆｎ３ドメインのβまたはβ様ストランドのそれぞれが、配列番号１または６の対応するβまたはβ様ストランドの配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一なアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列から本質的になるか、または前記アミノ酸配列からなりうる。好ましくは、βストランド領域中の変異は、生理的条件におけるポリペプチドの安定性を妨害しないであろう。例示的実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭまたはそれ以下を下回るＫｄで所望のターゲットに結合する。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンベースタンパク質スキャフォールドの１０Ｆｎ３ドメインが、１ｐＭ〜１μＭ、１００ｐＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、または１ｎＭ〜１００ｎＭのＫｄで、所望のターゲットに結合する。例示的実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、野生型１０Ｆｎ３ドメイン（特に野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン）が結合しないターゲットに、特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、本開示は、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、ループＡＢ；ループＢＣ；ループＣＤ；ループＤＥ；ループＥＦ；およびループＦＧを含み、配列番号１のヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列との比較で改変されたアミノ酸配列を持つループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有する、ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが改変されている。別の実施形態では、ＣＤおよびＦＧループが改変されている。別の実施形態では、ＣＤ、ＤＥおよびＥＦループが改変されている。別の実施形態では、ＥＦおよびＦＧループが改変されている。別の実施形態では、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループが改変されている。別の実施形態では、ＦＧループが、改変されている唯一のループである。別の実施形態では、ＣＤおよびＦＧループがどちらも改変されている。別の実施形態では、ＣＤおよびＥＦループが改変されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の特異的スキャフォールド改変が１つ以上のループ改変と組み合わされる。「改変」とは、テンプレート配列（すなわち、対応する野生型ヒトフィブロネクチンドメイン）との比較で、１つ以上のアミノ酸配列改変を意味し、これにはアミノ酸の付加、欠失および置換が含まれる。
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、配列番号１または６の非ループ領域に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または１００％同一なアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３ドメインを含み、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループが改変されている。例えば、一定の実施形態において、ＡＢループは、４個までのアミノ酸置換、１０個までのアミノ酸挿入、３つまでのアミノ酸欠失、またはそれらの組み合わせを有することができ；ＢＣループは、１０個までのアミノ酸置換、４個までのアミノ酸欠失、１０個までのアミノ酸挿入、またはそれらの組み合わせを有することができ；ＣＤループは、６個までのアミノ酸置換、１０個までのアミノ酸挿入、４個までのアミノ酸欠失、またはそれらの組み合わせを有することができ；ＤＥループは、６個までのアミノ酸置換、４個までのアミノ酸欠失、１３個までのアミノ酸挿入、またはそれらの組み合わせ；ＥＦループは、５個までのアミノ酸置換、１０個までのアミノ酸挿入、３つまでのアミノ酸欠失、またはそれらの組み合わせを有することができ；かつ／またはＦＧループは、１２個までのアミノ酸置換、１１個までのアミノ酸欠失、２５個までのアミノ酸挿入、またはそれらの組み合わせを有することができる。
一定の実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、一般に以下の配列によって定義される１０Ｆｎ３ドメインを含む：
Figure 2015504038
 （配列番号２２）
配列番号２２において、ＡＢループは（Ｘ）ｕによって表され、ＢＣループは（Ｘ）ｖによって表され、ＣＤループは（Ｘ）ｗによって表され、ＤＥループは（Ｘ）ｘによって表され、ＥＦループは（Ｘ）ｙによって表され、ＦＧループはＸｚによって表される。Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘに続く下付き文字はアミノ酸の数の整数を表す。特に、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜８、５〜２０、５〜１５、５〜１０、５〜８、６〜２０、６〜１５、６〜１０、６〜８、２〜７、５〜７、または６〜７アミノ酸のいずれであってもよい。βストランドの配列（下線部）は、配列番号２２に示す対応するアミノ酸との比較で、７つ全てのスキャフォールド領域にわたって、０個から１０個まで、０個から８個まで、０個から６個まで、０個から５個まで、０個から４個まで、０個から３個まで、０個から２個まで、または０個から１個までのいずれかの置換、欠失または付加を有しうる。いくつかの実施形態において、βストランドの配列は、配列番号２２に示す対応するアミノ酸との比較で、７つ全てのスキャフォールド領域にわたって、０個から１０個まで、０個から８個まで、０個から６個まで、０個から５個まで、０個から４個まで、０個から３個まで、０個から２個まで、または０個から１個までのいずれかの保存的置換を有しうる。一定の実施形態では、疎水性コアアミノ酸残基（上記配列番号２２においてボールド体の残基）が固定され、置換、保存的置換、欠失または付加はいずれも、疎水性コアアミノ酸残基以外の残基に存在する。いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドの疎水性コア残基は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）との比較で、修飾されていない。
Ｂ．スキャフォールド領域修飾
１０Ｆｎ３の非ループ配列、すなわち「スキャフォールド領域」は、１０Ｆｎ３ドメインがターゲット結合機能および／または構造安定性を保っているという条件で、改変することができる。いくつかの実施形態では、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９、およびＡｓｐ２３の１つ以上が、別のアミノ酸、例えば非負荷電アミノ酸残基（例えばＡｓｎ、Ｌｙｓなど）で置き換えられる。これらの変異は、野生型と比較して中性ｐＨにおける変異型１０Ｆｎ３の安定性の向上を促進する効果を有すると報告されている（ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０４５２３参照）。有益であるか中立的である１０Ｆｎ３スキャフォールド中のさまざまな改変は他にも開示されている。例えばＢａｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ２００２ １５（１２）：１０１５−２０；Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１ ４０（３４）：１０３２６−３３を参照されたい。
１０Ｆｎ３のスキャフォールド領域、例えばβストランドならびに／またはＮ末端およびＣ末端は、所望のターゲットへのポリペプチドの結合を増加させるために、または免疫原性を低減するために、修飾することができる。いくつかの実施形態では、疎水性コアの形成に関与する残基、すなわち、配列番号１または６の残基Ｌ８、Ｖ１０、Ａ１３、Ｌ１８、Ｉ２０、Ｗ２２、Ｙ３２、Ｉ３４、Ｙ３６、Ｆ４８、Ｖ５０、Ａ５７、Ｉ５９、Ｌ６２、Ｙ６８、Ｉ７０、Ｖ７２、Ａ７４、Ｉ８８、Ｉ９０およびＹ９２に対応する残基を変異させない。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ポリペプチドスキャフォールド領域の残基１〜７、９〜１５、１９、２１、３３、３５、３６、４９、５８、６０、６１、６９、７１、７３、８８、８９および９１〜１０１に対応する残基のいずれか１つまたはいずれか１つの組み合わせを、配列番号１または６に示すアミノ酸配列中に存在する対応するアミノ酸と比較して異なるアミノ酸に変異させる。
いくつかの実施形態では、以下の特異的変異の１つ以上を除外するという条件で、本ポリペプチドのスキャフォールド領域に変異を加えることができる：Ｖ１Ａ；Ｓ２Ｐ；Ｓ２Ｔ；Ｄ３Ｇ；Ｄ３Ｓ；Ｐ５Ｓ；Ｒ６Ｇ；Ｒ６Ｓ；Ｄ７Ｇ；Ｄ７Ｋ；Ｌ８Ｐ；Ｌ８Ｑ；Ｅ９Ｄ；Ｅ９Ｋ；Ｅ９Ｒ；Ｅ９Ｖ；Ｖ１０Ａ；Ｖ１０Ｉ；Ａ１２Ｄ；Ａ１２Ｅ；Ａ１２Ｖ；Ｌ１８Ｅ；Ｌ１８Ｉ；Ｌ１８Ｐ；Ｌ１８Ｑ；Ｌ１８Ｒ；Ｌ１９Ｑ；Ｓ２１Ｃ；Ｓ２１Ｇ；Ｓ２１Ｎ；Ｒ２９Ｇ；Ｒ２９Ｓ；Ｒ２９Ｙ；Ｙ３１Ｈ；Ｙ３２Ｆ；Ｒ３３Ｇ；Ｉ３４Ｔ；Ｉ３４Ｖ；Ｔ３５Ａ；Ｔ３５Ｆ；Ｔ３５Ｉ；Ｙ３６Ｈ；Ｆ４８Ｌ；Ｆ４８Ｓ；Ｔ４９Ａ；Ｔ４９Ｉ；Ｖ５０Ａ；Ｖ５０Ｅ；Ｖ５０Ｍ；Ａ５７欠失；Ｔ５８Ａ；Ｔ５８Ｉ；Ｔ５８欠失；Ｉ５９Ｖ；Ｉ５９欠失；Ｓ６０Ｇ；Ｓ６０Ｎ；Ｓ６０Ｒ；Ｇ６１Ｃ；Ｇ６１Ｒ；Ｌ６２Ｒ；Ｄ６７Ｇ；Ｄ６７Ｋ；Ｄ６７Ｎ；Ｙ６８Ａ；Ｙ６８Ｄ；Ｔ６９Ｉ；Ｉ７０Ｎ；Ｉ７０Ｓ；Ｉ７０Ｖ；Ｔ７１Ａ；Ｖ７２Ａ；Ｖ７２Ｇ；Ｙ７３Ｃ；Ｙ７３Ｈ；Ａ７４Ｇ；Ａ７４Ｔ；Ｉ８８Ｓ；Ｉ８８Ｔ；Ｉ８８Ｖ；Ｓ８９Ｐ；Ｉ９０Ｆ；Ｉ９０Ｔ；Ｉ９０Ｖ；Ｎ９１Ｄ；Ｎ９１Ｓ；Ｎ９１Ｔ；Ｙ９２Ｃ；Ｙ９２Ｈ；Ｙ９２Ｌ；Ｙ９２Ｒ；Ｙ９２欠失；Ｒ９３Ｑ；Ｒ９３ＴおよびＴ９４Ａ。一定の実施形態では、これらの特異的スキャフォールド変異が、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが修飾されている１０Ｆｎ３ドメインにおいては除外される。
いくつかの実施形態では、以下の変異の組み合わせを除外するという条件で、ポリペプチドのスキャフォールド領域に変異を加えることができる：
・Ｌ１８Ｒ、Ｓ２１ＣおよびＳ６０Ｇ；
・Ｅ９Ｄ、Ｌ１８Ｒ、Ｖ５０ＥおよびＴ５６Ｉ；
・Ｌ１８Ｒ、Ｔ４９ＩおよびＮ９１Ｄ；
・Ｆ４８ＳおよびＴ７１Ａ；
・Ｐ５Ｓ、Ｖ１０Ａ、Ｓ６０ＧおよびＳ８９Ｐ；
・Ｌ１８Ｒ、およびＹ９２Ｃ；
・Ｌ１８ＲおよびＦ４８Ｓ；
・Ｌ１８ＲおよびＶ７２Ａ；
・Ｌ１８Ｑ、Ｒ３３ＧおよびＦ４８Ｓ；
・Ｙ６８ＤおよびＹ９２Ｈ；
・Ｒ６Ｓ、Ｌ６２ＲおよびＮ９１Ｓ；
・Ｌ８Ｐ、Ｅ９Ｖ、Ｉ３４Ｖ、Ｔ７１ＡおよびＹ９２欠失；
・Ｅ９Ｋ、Ｌ１８ＲおよびＦ４８Ｌ；
・Ｅ９Ｒ、Ｌ１８Ｒ、Ｓ６０ＧおよびＩ７０Ｖ；
・Ｌ１８Ｒ、Ｉ８８ＶおよびＩ９０Ｔ；
・Ｌ１８Ｒ、Ｎ９１ＤおよびＹ９２Ｃ；
・Ｌ１８ＲおよびＩ３４Ｔ；
・Ｌ１８ＲおよびＧ６１Ｃ；
・Ｙ３２Ｆ、Ｔ７１ＡおよびＴ９４Ａ；
・Ｌ１８Ｒ、Ｔ５８Ａ、Ｙ９２ＬおよびＲ９３Ｔ；
・Ｖ５０Ｍ、Ｔ５８Ａ、Ｓ８９Ｐ、Ｉ９０ＦおよびＹ９２Ｒ；
・Ｓ２Ｔ、Ｄ７Ｇ、Ｅ９Ｋ、Ｖ１０Ｉ、Ｔ５８Ａ、Ｓ６０ＮおよびＳ８９Ｐ；
・Ｉ５９Ｖ、Ｓ６０ＮおよびＴ９４Ａ；
・Ｒ６Ｇ、Ｓ２１Ｇ、Ｔ３５Ａ、Ｔ５８ＩおよびＳ６０Ｇ；
・Ｌ１８Ｐ、Ｓ２１Ｃ、Ｔ５８Ａ、Ｙ７３ＨおよびＹ９２Ｃ；
・Ｙ３１Ｈ、Ｒ３３ＧおよびＧ６１Ｒ；
・Ａ７４Ｇ、Ｒ９３ＱおよびＴ９４Ａ
・Ｓ２ＰおよびＴ５８Ｉ；
・Ｔ５８ＩおよびＩ８８Ｔ；
・Ｔ５８ＩおよびＩ９０Ｔ；
・Ｇ６１ＲおよびＡ７４Ｔ
・Ａ５７欠失、Ｔ５８欠失およびＩ５９欠失
・Ｒ３３Ｇ、Ｔ３５ＩおよびＶ５０Ｍ
・Ｖ１Ａ、Ｒ３３ＧおよびＶ５０Ｍ
・Ｒ３３ＧおよびＶ５０Ｍ
・Ｒ３３Ｇ、Ｉ３４ＶおよびＶ５０Ｍ
・Ｄ３Ｇ、Ｌ１８Ｉ、Ｒ３３Ｇ、Ｖ５０Ｍ、Ｙ７３ＨおよびＮ９１Ｔ
・Ｒ６Ｇ、Ｔ３５ＦおよびＶ７２Ａ
・Ａ１２Ｖ、Ｓ２１ＮおよびＴ３５Ａ
・Ｓ２１ＧおよびＴ４９Ａ
・Ｄ３ＳおよびＤ７Ｋ
・Ａ１２ＶおよびＬ１９Ｑ
・Ａ１２Ｄ、Ｌ１８ＩおよびＬ１９Ｑ
・Ａ１２Ｅ、Ｌ１８ＩおよびＬ１９Ｑ。
一定の実施形態では、スキャフォールド変異のこれらの特異的組み合わせが、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが修飾されている１０Ｆｎ３ドメインにおいては除外される。
いくつかの実施形態において、配列番号１または６の位置２１に対応する位置に変異を有するポリペプチドは、この位置における変異が配列番号１または６の位置１〜７、１９、３１、４９、５８、６０、７３、７５および８９に対応するアミノ酸位置の任意の１つにおける１つまたは複数の変異と組み合わされない限り、除外される。いくつかの実施形態において、配列番号１の位置６０に対応する位置に変異を有するポリペプチドは、この位置における変異が、配列番号１または６の位置１〜７、９〜１７、１９、２１、２３〜３１、３３、３５、４９、５１〜５６、６５〜６７、７５〜８７および８９のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数の変異と組み合わされない限り、除外される。いくつかの実施形態において、配列番号１または６の位置６１に変異を有するポリペプチドは、この位置における変異が、配列番号１または６の位置１１、１２、１９、４６、６６〜６７、６９および９１のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数の変異と組み合わされない限り、排除される。いくつかの実施形態において、配列番号１または６の位置９３または９４に変異を有するポリペプチドは、これらの位置のいずれかにおける変異が、配列番号１または６のアミノ酸位置１〜７、９〜１４、６５〜６７、８９および９１のいずれか１つに対応する位置における１つまたは複数の変異と組み合わされない限り、除外される。一定の実施形態では、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが修飾された１０Ｆｎ３ドメインにおいて、これらの除外が適用される。
一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインの非ループ領域を、１つ以上の保存的置換で修飾することができる。１０Ｆｎ３スキャフォールド中のアミノ酸の５％、１０％、２０％、さらには３０％またはそれ以上を、リガンドに対する１０Ｆｎ３のアフィニティを実質的に改変することなく、保存的置換によって改変することができる。一定の実施形態では、スキャフォールドが、０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、２〜１５、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、５〜１５、または５〜１０個のいずれかの保存的アミノ酸置換を含みうる。例示的実施形態では、スキャフォールド修飾が、好ましくは、リガンドに対する１０Ｆｎ３結合物質の結合アフィニティを、１００分の１未満、５０分の１未満、２５分の１未満、１０分の１未満、５分の１未満、または２分の１未満に低減する。このような変化は、おそらくインビボでの１０Ｆｎ３の免疫原性を変化させ、免疫原性が減少する場合には、そのような変化は望ましいであろう。本明細書にいう「保存的置換」とは、対応する参照残基と物理的または機能的に類似する残基である。すなわち、保存的置換とその参照残基とは、類似するサイズ、形状、電荷、化学的性質（共有結合または水素結合を形成する能力を含む）などを有する。好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５−３５２ （１９７８ ＆ Ｓｕｐｐ．）において、許容される点突然変異について規定された基準を満たすものである。保存的置換の例は、以下の群内での置換である：（ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸；（ｅ）アスパラギン、グルタミン；（ｆ）セリン、スレオニン；（ｇ）リジン、アルギニン、メチオニン；および（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。
いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３分子が、ここに示すライブラリーデザイン、例えば図２、９および１２（またはそのアミノ酸１〜９４；配列番号６）に示すライブラリーデザインの、いずれかのアミノ酸配列を含み、ループおよび／またはストランドに含まれる追加の置換、付加または欠失は、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個である。一定の実施形態では、１０Ｆｎ３分子が、ここに示すライブラリーデザイン、例えば図２、９および１２（またはそのアミノ酸１〜９４；配列番号６）に示すライブラリーデザインの、いずれかのアミノ酸配列を含み、他のアミノ酸修飾を伴わない。ここに示すライブラリーデザイン、例えば図２、９および１２（またはそのアミノ酸１〜９４；配列番号６）に示すライブラリーデザインのいずれかのアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３分子は、変異位置に任意のアミノ酸を含むことができ、場合によっては野生型１０Ｆｎ３分子のアミノ酸も含むことができる。一定の実施形態では、ここに示すライブラリーデザイン、例えば図２、９および１２（またはそのアミノ酸１〜９４；配列番号６）に示すライブラリーデザインのいずれかのアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３分子が、変異箇所と表示した位置（下線または囲み枠付きでボールド体のもの）のそれぞれに、非野生型アミノ酸だけを含む。
Ｃ．Ｎ末端およびＣ末端領域
いくつかの実施形態では、ここに提供するポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端領域のアミノ酸配列を、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応する領域のアミノ酸配列との比較で、欠失、置換または挿入によって修飾することができる。１０Ｆｎ３ドメインは一般的には配列番号１のアミノ酸番号１から始まる。しかし、アミノ酸欠失を持つドメインも、本発明に包含される。いくつかの実施形態では、配列番号１の最初の８アミノ酸（すなわち、残基１〜８）および最後の７アミノ酸（すなわち、残基９５〜１０１）を欠失させて、配列番号６０のアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３ドメインを生成させる。一定の実施形態では、配列番号１の最後の７アミノ酸（すなわち、残基９５〜１０１）を欠失させて、配列番号６のアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３ドメインを生成させる。配列番号１、２、６、または６０のアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端またはＣ末端に、追加の配列を付加することもできる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部が、Ｍ、ＭＧ、およびＧからなる群より選択されるアミノ酸配列からなる群より選択される。
一定の実施形態において、ここに提供するポリペプチドでは、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）中の対応するアミノ酸の配列との比較で、配列番号１または６の最初の１、２、３、４、５、６、７、８または９残基のアミノ酸配列が修飾されているか、欠失していてもよい。例示的実施形態では、配列番号１または６のアミノ酸１〜８に対応するアミノ酸が、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１アミノ酸の長さを持つ代替的Ｎ末端領域で置き換えられる。例示的な代替Ｎ末端領域には、（一文字アミノ酸コードで表す）Ｍ、ＭＧ、Ｇ、ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号９）およびＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号１１）、または配列番号９および１１のいずれか１つのＮ末端切断が含まれる。他の好適な代替Ｎ末端領域には、例えばＸｎＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号１６）、ＸｎＤＶＰＲＤＬ（配列番号１７）、ＸｎＶＰＲＤＬ（配列番号１８）、ＸｎＰＲＤＬ（配列番号１９）、ＸｎＲＤＬ（配列番号２０）、ＸｎＤＬ（配列番号２１）、またはＸｎＬがあり、ここで、ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１の場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２の場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである。Ｍｅｔ−Ｇｌｙ配列が１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端に付加された場合、通常はＭが切り離されて、Ｎ末端にＧが残ることになる。別の実施形態では、代替Ｎ末端領域がアミノ酸配列ＭＡＳＴＳＧ（配列番号５０）を含む。
一定の実施形態において、ここに提供するポリペプチドでは、配列番号１のアミノ酸９３〜１０１、９４〜１０１、９５〜１０１、９６〜１０１、９７〜１０１、９８〜１０１、９９〜１０１、１００〜１０１、または１０１に対応するアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）中の対応するアミノ酸の配列との比較で、欠失または修飾される。例示的実施形態では、配列番号１のアミノ酸９５〜１０１に対応するアミノ酸が、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１アミノ酸の長さを持つ代替Ｃ末端領域で置き換えられる。代替Ｃ末端領域配列の具体例として、例えば、ＥＩＥＫ（配列番号７）、ＥＧＳＧＣ（配列番号２３）、ＥＩＥＫＰＣＱ（配列番号２４）、ＥＩＥＫＰＳＱ（配列番号２５）、ＥＩＥＫＰ（配列番号２６）、ＥＩＥＫＰＳ（配列番号２７）、ＥＩＥＫＰＣ（配列番号８）、または配列番号４４を含む、または前記配列から本質的になる、または前記配列からなるポリペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、代替Ｃ末端領域がＥＩＤＫ（配列番号２９）を含み、特定実施形態では、代替Ｃ末端領域がＥＩＤＫＰＣＱ（配列番号３１）またはＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号３０）のどちらかである。
一定の実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、代替Ｎ末端領域配列と代替Ｃ末端領域配列との両方を有する１０Ｆｎ３ドメインを含む。
本明細書において、アミノ酸１〜１０１（配列番号１）を含む特定のライブラリーデザインを含む分子に言及する場合、それは、アミノ酸１〜９４（配列番号６）を含み、７つのＮ末端アミノ酸を含まず、かつ／またはＣ末端アミノ酸を含まない同じ分子も、ここに包含されると理解される。
Ｄ．新規なループとスキャフォールドとの組み合わせを有するタンパク質
本明細書に記載する「パッチライブラリー」は、スキャフォールドタンパク質の表面上の領域を多様化したライブラリーを指す。多様化する残基は、タンパク質の表面に１つのスポットを選び、次に、何らかの距離（例えば８Å）内の全ての表面およびループ残基を同定し、形状、配列、結合性（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）、保存（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）などを調整することによって決定することができる。例えば、スキャフォールドの「サウスウエスト（ＳｏｕｔｈＷｅｓｔ）」部分を中心とするパッチライブラリーを作成するために、ＳＷ側面のほぼ中心にあるＡｓｐ６７（ＥＦループ中の最後のアミノ酸）を選択した。次に、Ａｓｐ６７から８Å以内の距離にある全ての残基を同定し、疎水性コア残基を、多様化する残基のリストから取り除くことで、Ｇ３７〜Ｇ４１、Ｋ６３〜Ｄ６７、Ｔ６９、およびＮ９１から始まるＣ末端配列（配列番号１または６を有する野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインの配列に従って番号を付与した残基位置）を含む、合計１４個のランダム化するアミノ酸を得る。次に、例えばＣＤループの長さを変えること（形状をより大きく変動させるため）またはＮ末端領域の配列を修飾もしくは伸長することなどといった、多様化のさらなる手段を、スキャフォールドデザインに組み込むことができる。代表的なパッチライブラリーを作成するために変異させうるアミノ酸残基の例を、図２Ａ〜Ｆおよび９Ａ〜Ｃに掲載する。代表的パッチライブラリーを作成するためにターゲットにすることができる異なる界面をいくつか図解した１０Ｆｎ３ドメインペプチドの三次元構造を図３Ａ〜Ｆに示す。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインポリペプチド中のアミノ酸が、ループの定義に関してではなく、１０Ｆｎ３構造の表面上のそれらの物理的場所に関して、多様化される。いくつかの実施形態では、ループとストランドの両方にまたがることができる、またはもっぱらストランド残基上にあることができる、一般に連続した表面を形成するように選択された、１０〜３０アミノ酸またはそれ以上の「パッチ」を多様化することができる。
１．ノースポールループおよびサウスポールループが修飾されている結合物質
いくつかの実施形態では、ここに提供するポリペプチドが、（ｉ）野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループとの比較で、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループから選択される少なくとも１つのノースポールループのアミノ酸配列中の修飾と、（ｉｉ）野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループとの比較で、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループから選択される少なくとも１つのサウスポールループのアミノ酸配列中の修飾とを有する、１０Ｆｎ３ドメインを含む。修飾されたノースポールループおよびサウスポールループは同じターゲットへの結合に寄与する。修飾ノースポールループと修飾サウスポールループのさまざまな組み合わせが考えられる。例えば１０Ｆｎ３は、１つの修飾ノースポールループと１つの修飾サウスポール、１つの修飾ノースポールループと２つの修飾サウスポールループ、２つの修飾ノースポールループと１つの修飾サウスポールループ、２つの修飾ノースポールループと２つの修飾サウスポールループ、３つの修飾ノースポールループと１つの修飾サウスポールループを含むことなどができ、ここでは、修飾ループのそれぞれが同じターゲットへの結合に寄与する。修飾することができるノースポールループとサウスポールループとの例示的組み合わせには、例えばＣＤループ（サウスポール）とＦＧループ（ノースポール）、ＣＤループ（サウスポール）とＤＥループ（ノースポール）、ＥＦループ（サウスポール）とＦＧループ（ノースポール）、ＡＢループ（サウスポール）とＦＧループ（ノースポール）、またはＤＥループ（ノースポール）とＥＦループ（サウスポール）などがある。もう一つの例示的なループの組み合わせは、ＣＤループ（サウスポール）、ＤＥループ（ノースポール）、およびＥＦループ（サウスポール）である。さらにもう一つの例示的なループの組み合わせは、ＤＥループ（ノースポール）と、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループ（サウスポール）の１つ以上とである。修飾ループは、ループ全体にわたって配列修飾を有してもよいし、ループの一部分だけに配列修飾を有してもよい。加えて、修飾ループの１つ以上は、野生型配列の対応するループの長さとの比較で、ループの長さが変動するように、挿入または欠失を有しうる。一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメイン中のさらなる領域も（すなわち、ノースポールループおよびサウスポールループに加えて）、例えばβストランド、Ｎ末端および／またはＣ末端領域も、野生型１０Ｆｎ３ドメインとの比較で配列を修飾することができ、そのような追加の修飾もターゲットへの結合に寄与しうる。
少なくとも１つのノースポールループと少なくとも１つのサウスポールループとが修飾されている例示的な１０Ｆｎ３デザインには、例えば図９Ａに示すＷＳ１、ＷＳ２、ＷＳ３、ＷＳ２’、フロント（Ｆｒｏｎｔ）１、フロント２、バック（Ｂａｃｋ）１、バック２、ＷＳ−ＬＩ１、サウスフロント、およびＡＧストランドデザイン、ならびに図２Ｃ〜２Ｅに示すウエストサイド、サウスフロントおよびＡＧストランドデザインが含まれる。
２．ループおよびスキャフォールド領域修飾を有する結合物質
ループ修飾とスキャフォールド修飾との新規組み合わせを有する１０Ｆｎ３ドメインも、ここに提供する。特に本願は、（ｉ）ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、またはＦＧの少なくとも１つのアミノ酸配列中の修飾と、（ｉｉ）少なくとも１つのスキャフォールド領域のアミノ酸配列中の修飾（すなわち、少なくとも１つのβストランド、Ｎ末端領域、および／またはＣ末端領域中の修飾）とを含み、修飾ループと修飾スキャフォールド領域とがどちらも同じターゲットへの結合に寄与する、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドを提供する。例示的実施形態では、スキャフォールド領域修飾がループ領域中の修飾に隣接して配置される。例えば、ＡＢループが修飾されている場合、スキャフォールド変異は、１０Ｆｎ３ドメインの直線的配列においてＡＢループに隣接するβストランドＡおよび／またはβストランドＢ中に配置される傾向を持ちうる。別の実施形態では、修飾のクラスターを、１０Ｆｎ３ドメインの直線的配列において互いに隣接するループ領域およびスキャフォールド領域中に、一緒に見出すことができる。例えば、ループ修飾とスキャフォールド修飾とをどちらも有する１０Ｆｎ３結合物質は、１０Ｆｎ３ドメインの直線的配列において互いに隣接する以下の組み合わせのループ領域とスキャフォールド領域とに、アミノ酸修飾のクラスターを有しうる：βストランド／ループ／βストランド、ループ／βストランド／ループ、ループ／βストランド／ループ／βストランド、末端領域／βストランド／ループ、またはループ／βストランド／末端領域など。例えば、ループ修飾とスキャフォールド修飾との新規な組み合わせを有する１０Ｆｎ３ドメインは、２０連続アミノ酸のストレッチにおいてそのアミノ酸のうちの少なくとも１５個が野生型との比較で修飾されているように、修飾のクラスターを有しうる。別の実施形態では、連続ストレッチにおいて、２０残基のうちの少なくとも１７残基、２０残基のうちの少なくとも１８残基、２５残基のうちの少なくとも１７残基、２５残基のうちの少なくとも２０残基、または３０残基のうちの少なくとも２５残基が、対応するアミノ酸のストレッチにおける野生型１０Ｆｎ３ドメイン配列との比較で修飾されている。一定の実施形態では、所与の１０Ｆｎ３ドメインが、無修飾（すなわち野生型）配列のストレッチによって分離された、２つまたは３つの修飾クラスターを有しうる。修飾されるどの所与の領域（すなわちループ、βストランドまたは末端領域）についても、その領域の全部または一部分だけを、野生型配列との比較で、修飾することができる。βストランド領域を修飾する場合、好ましくは、疎水性コア残基は無修飾（すなわち、野生型）のままにしておき、βストランド中の非コア残基の１つ以上を修飾する。ループ、βストランドまたは末端領域の好適な修飾には、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
少なくとも１つのループ領域と少なくとも１つのスキャフォールド領域とが修飾されている例示的な１０Ｆｎ３デザインには、例えば、図９Ａに示すＷＳ１、フロント１、フロント２、バック１、バック２、ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、サウスフロント、ＡＧストランドおよびサウスウエストデザイン、図９Ｂに示すＮＷ３デザイン、図９Ｃに示すＮＰ１、ＮＥ１、ＮＰ４−５、ＮＰ６−１およびＮＷ２デザイン、および図２Ａ〜２Ｆに示すデザインが含まれる。
３．「ウエストサイド」結合物質
いくつかの実施形態において、本願は、分子の「ウエストサイド」（図３Ｃ参照）に沿った結合面を有する１０Ｆｎ３ドメインを提供し、これを「ウエストサイド結合物質」または「ＷＳ結合物質」という。本明細書に記載するＷＳ結合物質は、配列番号１または６に示す対応するＣＤおよびＦＧループ配列と比較して、修飾されたＣＤループおよび修飾されたＦＧループを有する１０Ｆｎ３ドメインを含む。ＣＤループとＦＧループはどちらも同じターゲットへの結合に寄与する。一定の実施形態において、ＷＳ結合物質は、１０Ｆｎ３ドメイン内の１つ以上の領域に追加の修飾を含みうる。例えば、ＷＳ結合物質は、ＣＤおよび／またはＦＧループに隣接するβストランド領域の１つ以上に、スキャフォールド修飾を含みうる。特に、ＷＳ結合物質は、βストランドＣ、βストランドＤ、βストランドＦ、および／またはβストランドＧの１つ以上に配列修飾を含みうる。例示的スキャフォールド修飾には、配列番号１または６のアミノ酸位置：３３、３５、４９、６９、７１、７３、８９および／または９１に対応する１つ以上のスキャフォールド領域位置における修飾が含まれる。ＷＳ結合物質は、ＢＣループ、特にＢＣループのＣ末端側部分にも、修飾を含みうる。ある実施形態では、ＢＣループの最後の２残基（すなわち、野生型１０Ｆｎ３ドメイン中のアミノ酸３０および３１に対応する残基）が、野生型配列との比較で、修飾されている。追加のループ修飾およびスキャフォールド修飾の全部または一部が、修飾ＣＤループおよび修飾ＦＧループと共に、ターゲットへの結合に寄与する。好ましくは、疎水性コア残基は、野生型配列との比較で、無修飾である。
一定の実施形態では、ＷＳ結合物質が、約３〜１１、４〜９または５残基長であるＣＤループ；約１〜１０残基長、例えば６または５残基長であるＦＧループ；約６〜１４、８〜１１、または９残基長であるＣストランド；および／または約９〜１１または１０残基長であるＦストランドを有する。βストランドＣの位置３１、３３、３５および３７〜３９を、野生型配列との比較で、改変することができる。βストランドＣの位置３２、３４および３６は疎水性残基であることができる。βストランドＦの位置６７、６９、７１および７３を、野生型配列との比較で、改変することができる。βストランドＦの位置６８、７０、および７２は疎水性残基であることができる。ＷＳ結合物質は、配列番号１または６の位置３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および／または３９、例えば位置３１、３３、３５、３７、３８および／または３９、例えば位置３１および／または３３にアミノ酸置換を含みうる。ＷＳ結合物質は、配列番号１または６の位置４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０および／または５１、例えば位置４４、４５、４７および／または４９にアミノ酸置換を含みうる。ＷＳ結合物質は、配列番号１または６の位置４０、４１、４２、４３、４４および／または４５にアミノ酸置換を含みうる。ＷＳ結合物質は、配列番号１または６の位置６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５および／または７６、例えば位置６７、６９、７１、７３および／または７６、あるいは位置７１、７３、７５および／または７６にアミノ酸置換を含みうる。ＷＳ結合物質は、配列番号１または６の位置７６、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４、８５および／または８６、例えば位置８４および／または８５にアミノ酸置換を含みうる。ＷＳ結合物質は、配列番号１または６の位置８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３および／または９４にアミノ酸置換を含みうる。ＷＳ結合物質は、配列番号１または６の位置３１、３３、４７、４９、７３および／または７５にアミノ酸置換を含みうる。ＷＳ結合物質は、変異した４〜９個の、例えば非野生型アミノ酸を含むループＣ；変異した５〜６個の、例えば非野生型アミノ酸を含むＦＧループを含むことができ、この場合、アミノ酸３１、３３、３５、３７〜３９、６７、６９、７１、７３および７６は野生型でない。「野生型でない」アミノ酸とは、野生型ヒト１０Ｆｎ３分子（例えば配列番号１または６を持つもの）中の同じ位置に見出されるものとは異なるアミノ酸である。
例示的な１０Ｆｎ３ ＷＳ結合物質デザインには、例えば、図９Ａに示すＷＳ１、ＷＳ２、ＷＳ３、ＷＳ２’、およびＷＳ−ＬＩ１デザイン、ならびに図２Ｃに示すデザイン（またはそのアミノ酸１〜９４）が含まれる。アミノ酸１〜１０１を含む１０Ｆｎ３配列に基づく特定のデザインを有する１０Ｆｎ３分子に言及する場合、その説明は、末端に「ＤＫ」を含まず、かつ／またはＮ末端の７アミノ酸を含まず、示した配列のアミノ酸１〜９４に対応する分子を包含するものとする。あるいは、示したデザインがアミノ酸１〜９４を含む場合、その説明は、配列「ＤＫ」を欠いていてもよい、Ｎ末端の７アミノ酸を持つ同じデザインを包含するものとする。行いうる他の修飾は本明細書に記載する。
例示的なＷＳ結合物質デザインを図１２に掲載する。例えばＷＳ３は、ループＣＤおよびＦＧの長さが修飾されうる、またＤ６７も修飾されうる、ＷＳ１に相当する。ＷＳ３デザインを有する分子の例は、配列番号４９を有するＰＸＲ結合物質である。ＷＳ１、ＷＳ２、ＷＳ３、ＷＳ２’、ＷＳ−ＬＩ１、およびＷＳ４の変異体には、位置３０、３１、３３、３５、３７、３８、４６、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５、７６、８４、８５、８６、８７、８９または９１に野生型アミノ酸または変異アミノ酸を有するものが含まれる。例えば、ＷＳ結合物質デザインは、ＣＤループのアミノ酸３９〜４５に１つ以上のアミノ酸修飾とループＦＧ中のアミノ酸７７〜８３に１つ以上のアミノ酸修飾とを含むことができ（ＷＳ−ＬＩ１デザイン）、このデザインを有する１０Ｆｎ３分子は、ターゲット分子に特異的に結合する（また場合によってはＲＧＤ配列を含まない）。ＷＳ結合物質デザインは、ＷＳ−ＬＩ１のデザインと、ループまたはストランドに多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０または２５個の追加アミノ酸修飾とを含みうる。例えば、ＷＳ結合物質デザインは、ＷＳ−ＬＩ１のデザインと、アミノ酸位置３７、３８、４６、４７、７５、７６、および８５〜８８などのアミノ酸位置に、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０または２５個の追加アミノ酸修飾とを含みうる。含めることができる他のアミノ酸修飾は、位置３０、３１、３３、３５、４９、５０、６７、６９、７１、７３、８９および９１におけるものである。例示的なＷＳデザインはＷＳ７のアミノ酸配列（図１２）を含むことができ、ここでは、ループの長さが野生型１０Ｆｎ３分子のものとは異なりうると共に、各変異位置（ボールド体および下線付き）を、他の任意のアミノ酸に修飾するか、または一定の例では、そのようなデザインを有する１０Ｆｎ３分子がターゲット分子に特異的に結合するという条件で、無修飾のままにしておくことができる（また場合によってはＲＧＤ部位を含まない）。一定の実施形態では、１０Ｆｎ３分子がＷＳ７のアミノ酸配列を含み、ここでは、ループＣＤおよびＦＧの長さを変異させることができ、この場合、他のアミノ酸は変異させなくてもよく、正確にまたは多くとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０または２５個の、可変と表示したアミノ酸残基（下線付きおよびボールド体のもの）が実際には変化せず、野生型ヒト１０Ｆｎ３分子中の同じ位置にあるものに対応するアミノ酸、すなわち野生型アミノ酸（配列番号１または６）である。例えば、ＷＳ７におけるアミノ酸３０、３１、３３、３５、３６、３７、４７、４９、５０、６７、６９、７１、７３、７５および８７の１つ以上は、そのＷＳ結合物質がそのターゲットに特異的に結合するという条件で、野生型アミノ酸でありうる。一定の実施形態では、ＷＳ７デザインを有するＷＳ結合物質が、表示したもの以外のアミノ酸修飾を一切含まない。一定の実施形態では、ＷＳ７デザインを有するＷＳ結合物質が、表示したものに加えて、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０または２５個のアミノ酸修飾を含む。
本明細書に記載のＷＳ結合物質デザインのいずれか１つを含むライブラリーも提供する。例示的ライブラリーは、変異したＣＤおよびＦＧループを有し、さらに位置３０、３１、３３、４７および４９に非野生型アミノ酸を含むＷＳ結合物質を含む、ライブラリーである。例示的ライブラリーは、変異したＦＧループを有し、さらに位置３０、３１、３３、４７および４９に非野生型アミノ酸を含む、ライブラリーである。
一定の実施形態では、デザイン配列の少なくともまたは多くとも１０、２０、３０、４０、５０、または６０個のアミノ酸を変異させない（例えば置換によって変異させない）。例えば、以下のアミノ酸の１つ以上を、野生型ヒト１０Ｆｎ３分子からのアミノ酸のまま保持する：位置１〜２９、３２、３４、３６、４８、５１〜６６、６８、７０、７２、８８、９０および９２〜１０１のアミノ酸。
治療ターゲットに特異的に結合するＷＳ結合物質の例は実施例に記載するが、これには例えば、配列番号３〜５、４５〜４９、６２〜６３、６６、および７２のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。
いくつかの実施形態では、ＷＳ結合物質が、ＷＳ１、ＷＳ２、ＷＳ３、ＷＳ２’、ＷＳ−ＬＩ１、ＷＳ４、ＷＳ５、ＷＳ６またはＷＳ７のアミノ酸配列（またはそのアミノ酸１〜９４）を含み、ループおよび／またはストランド中に多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の追加の置換、付加または欠失を含む。一定の実施形態では、ＷＳ結合物質が、ＷＳ１、ＷＳ２、ＷＳ３、ＷＳ２’、ＷＳ−ＬＩ１、ＷＳ４、ＷＳ５、ＷＳ６またはＷＳ７のアミノ酸配列（またはそのアミノ酸１〜９４）を含み、他のアミノ酸修飾を伴わない。ＷＳ１、ＷＳ２、ＷＳ３、ＷＳ２’、ＷＳ−ＬＩ１、ＷＳ４、ＷＳ５、ＷＳ６またはＷＳ７のアミノ酸配列（またはそのアミノ酸１〜９４）を含むＷＳ結合物質は、変異位置に任意のアミノ酸を含むことができ、いくつかの例では、野生型１０Ｆｎ３分子のアミノ酸も含むことができる。一定の実施形態では、ＷＳ１、ＷＳ２、ＷＳ３、ＷＳ２’、ＷＳ−ＬＩ１、ＷＳ４、ＷＳ５、ＷＳ６またはＷＳ７のアミノ酸配列（またはそのアミノ酸１〜９４）を含むＷＳ結合物質が、変異箇所と表示した位置（下線付きおよびボールド体のもの）のそれぞれに、非野生型アミノ酸を含む。
４．「フロント」結合物質
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドは、ＣＤループ、ＤＥループ、そして場合によってはＥＦループに修飾を有する１０Ｆｎ３ドメインを含み、ループ修飾は全てターゲット結合に寄与する。これらのポリペプチドを本明細書では「フロント結合物質」と呼ぶ。フロント結合物質はさらに、１つ以上のスキャフォールド領域、特に修飾ループ領域の側面に位置するまたは修飾ループ領域に隣接するスキャフォールド領域にも、修飾を含みうる。例えば、フロント結合物質は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドの配列との比較で、βストランドＣ、βストランドＤ，および／またはβストランドＥの１つ以上にスキャフォールド修飾を含みうる。好ましくは、疎水性コア残基は、野生型配列との比較で、無修飾である。フロント結合物質中に存在しうる例示的スキャフォールド修飾には、配列番号１または６のアミノ酸位置３６、４９、５８および／または６０に対応する１つ以上の位置における修飾が含まれる。そのようなスキャフォールド修飾は、修飾ループと共に、ターゲットへの結合に寄与しうる。一定の実施形態では、フロント結合物質が、１０Ｆｎ３ドメインの数個のループ領域とストランド領域とにまたがる修飾のクラスターを含みうる。特に、フロント結合物質は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の残基３６〜６６に対応するアミノ酸間の３１残基のうちの、少なくとも１５、２０、２４、２５、または２７残基に、修飾を含みうる。ループ修飾および／またはストランド修飾は、アミノ酸の置換、欠失および／もしくは挿入、またはそれらの組み合わせを含みうる。例示的実施形態では、ＣＤループが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＣＤループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている。例示的１０Ｆｎ３フロント結合物質デザインには、例えば図９Ａに示すフロント１デザインおよびフロント２デザインが含まれる。
５．「バック」結合物質
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドは、ＥＦおよびＦＧループに修飾を有する１０Ｆｎ３ドメインを含み、それらのループ修飾は同じターゲットへの結合に寄与する。これらのポリペプチドを本明細書では「バック結合物質」と呼ぶ。バック結合物質は、他のループ領域および／またはスキャフォールド領域に追加の修飾を含みうる。例えば、バック結合物質は、ＡＢループの少なくとも一部分、好ましくはＡＢループのＮ末端側部分に、修飾を含有しうる。例示的実施形態では、ＡＢループの最初の２アミノ酸（すなわち、野生型１０Ｆｎ３ドメインのアミノ酸残基１４および１５に対応するもの）が、野生型配列との比較で、修飾されている。一定の実施形態では、バック結合物質が、１つ以上のスキャフォールド修飾、特に修飾ループ領域に隣接する１つ以上のスキャフォールド領域中の修飾も含有しうる。例えば、バック結合物質は、βストランドＡ、βストランドＧ、Ｎ末端領域、および／またはＣ末端領域の１つに、１つ以上の修飾を含有しうる。好ましくは、疎水性コア残基は、野生型配列との比較で、無修飾である。例示的スキャフォールド修飾には、配列番号１または６のアミノ酸位置１〜７、９〜１３、８９、９１、９３および／または９４に対応する１つ以上の位置における修飾が含まれる。追加のループ修飾および／またはスキャフォールド修飾の１つ以上は、修飾ＥＦおよびＦＧループと共に、ターゲットへの結合に寄与しうる。好適なループ領域および／またはスキャフォールド領域の修飾には、アミノ酸の置換、欠失および／もしくは挿入、またはそれらの組み合わせが含まれる。一定の実施形態では、ＦＧループのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている。
一定の実施形態において、バック結合物質は、１０Ｆｎ３ドメイン中の数個の領域の連続スパンにわたって、修飾アミノ酸残基のクラスターを含みうる。例えば、１０Ｆｎ３ドメインの最初の１５アミノ酸残基のうちの少なくとも１４残基は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）中の対応する残基との比較で、修飾されていてもよく、かつ／または野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の残基８０〜９７（または９４）に対応するアミノ酸間の１８残基のうちの少なくとも１５残基は、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されていてもよい。
例示的１０Ｆｎ３バック結合物質デザインには、例えば図９Ａに示すバック１デザインおよびバック２デザインが含まれる。
６．「サウスポール」結合物質
一定の実施形態において、本願は、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型配列の対応する領域の配列との比較で、βストランドＡ、ループＡＢ、βストランドＢ、ループＣＤ、βストランドＥ、ループＥＦ、およびβストランドＦのアミノ酸配列に修飾を含むポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドを本明細書では「サウスポール結合物質」または「ＳＰ結合物質」と呼ぶ。修飾ループと修飾ストランドは同じターゲットへの結合に寄与する。ＣＤループのアミノ酸配列は、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＣＤループとの比較で、長さが延長されていてもよいし、または長さが短縮されていてもよい。サウスポール結合物質は、野生型配列の対応する領域の配列との比較で、βストランドＧおよび／またはＣ末端領域に追加の修飾を含みうる。例示的実施形態において、サウスポール結合物質は、野生型配列の位置１１、１２、１９、６０、６１、６９、９１、９３および９５〜９７に対応するアミノ酸に、１つ以上の修飾を含みうる。例示的１０Ｆｎ３サウスポール結合物質デザインには、例えば、図９Ａに示すＳＰ１、ＳＰ２およびＳＰ３デザインが含まれる。
７．「ノースウエスト」結合物質
いくつかの実施形態において、本願は、配列番号１または６に示す対応するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列と比較して修飾されたＢＣ、ＤＥおよびＦＧループと、βストランドＣ、βストランドＤ、βストランドＦおよびβストランドＧストランド残基の１つ以上の追加の修飾とを有する、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドを提供する。βストランド領域修飾とループ領域の修飾は共にターゲットへの結合に寄与する。これらのタンパク質を本明細書では「ノースウエスト結合物質」または「ＮＷ結合物質」と呼ぶ。例示的実施形態では、ＮＷ結合物質が、配列番号１または６のスキャフォールド領域位置Ｒ３３、Ｔ４９、Ｙ７３およびＳ８９に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたはその組み合わせに、１つ以上のスキャフォールド修飾を含む。ループ領域およびスキャフォールド領域中の好適な修飾には、アミノ酸の置換、欠失および／もしくは挿入、またはそれらの組み合わせが含まれる。一定の実施形態において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの１つ以上は、野生型配列との比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されているか、またはその組み合わせである。ある実施形態において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのそれぞれは、野生型配列（例えば配列番号１または６）との比較で、長さが延長されているか、長さが短縮されているか、またはその組み合わせである。一定の実施形態では、ＢＣループの一部分だけ、特にＣ末端側部分だけが、野生型配列との比較で、修飾されている。例えば、ＢＣループは、野生型ＢＣループのアミノ酸２７〜３１に対応するアミノ酸残基だけが修飾されていて、ＢＣループの残りの部分（すなわち、野生型ループの残基２３〜２６に対応する部分）が無修飾のままであってもよい。
例示的１０Ｆｎ３ ＮＷ結合物質デザインには、例えば図９Ｂに示すＮＷ３デザイン、図９Ｃに示すＮＷ２デザイン、および図２Ａに示すデザインなどがある。ＮＷ結合物質のモデルを図３Ａに図示する。
８．「ノースイースト」結合物質
いくつかの実施形態において、本願は、修飾ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループと、Ｎ末端領域、βストランドＡ、βストランドＢおよび／またはβストランドＥのいずれか１つまたはその組み合わせに１つ以上の追加の修飾とを有する、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドを提供する。これらのタンパク質を本明細書では「ノースイースト結合物質」または「ＮＥ結合物質」と呼ぶ。例示的実施形態において、ＮＥ結合物質は、野生型配列（配列番号１または６）のスキャフォールド領域位置１〜７、Ｅ９、Ｌ１９、Ｓ２１および／またはＴ５８に対応するアミノ酸のいずれか１つまたはその組み合わせが修飾されている。修飾ループ領域および修飾スキャフォールド領域の組み合わせがターゲットへの結合に寄与する。例示的１０Ｆｎ３ ＮＥ結合物質デザインには、例えば図９Ｃに示すＮＥ１デザインおよび図２Ｂに示すデザインなどがある。ＮＥ結合物質のモデルを図３Ｂに図示する。
９．「サウスフロント」結合物質
いくつかの実施形態において、本願は、ＡＢ、ＣＤ、ＤＥおよびＥＦループの１つ以上の中の修飾と、βストランドＢ、βストランドＤおよび／またはβストランドＥの１つ以上における追加の修飾とを有する、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドを提供する。これらのタンパク質を本明細書では「サウスフロント結合物質」と呼ぶ。修飾ループ残基と修飾ストランド残基の組み合わせが、ターゲットへの結合に寄与する。例示的実施形態において、サウスフロント結合物質は、配列番号１または６のスキャフォールド領域位置Ｌ１９、Ｔ４９、Ｔ５８、Ｓ６０、および／またはＧ６１に対応する１つ以上のアミノ酸位置および／または配列番号１または６のループ領域位置Ｔ１４〜Ｓ１７、Ｐ５１、Ｔ５６、Ｇ４０〜Ｅ４７、および／またはＫ６３〜Ｇ６５に対応する１つ以上のアミノ酸位置が、修飾されうる。例示的実施形態において、サウスフロント結合物質は、野生型配列の残基１８および２０に対応するアミノ酸間のＡＢループおよび／またはＣＤループにおいて、長さが延長されているか、または長さが短縮されていてもよい。例示的１０Ｆｎ３サウスフロント結合物質デザインには、例えば図９Ａに示すサウスフロントデザインおよび図２Ｄに示すデザインなどがある。サウスフロント結合物質のモデルを図３Ｄに図示する。
１０．「ＡＧ」結合物質
いくつかの実施形態において、本願は、配列番号１または６の対応するストランドと比較して修飾されたβストランドＡおよびβストランドＧを有する１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドを提供する。これらのタンパク質を本明細書では「ＡＧ結合物質」または「ＡＧストランド」結合物質という。一定の実施形態では、ＡＧストランド結合物質が、１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端およびＣ末端部分に修飾のクラスターを含み、一方、１０Ｆｎ３の中央部分は無修飾のままである。例えば、ＡＧストランド結合物質は、１０Ｆｎ３ドメインの最初の１９アミノ酸（すなわち、配列番号１または６のアミノ酸位置１〜１９に対応するもの）のうちの１９アミノ酸中１６アミノ酸における修飾、および１０Ｆｎ３ドメインの最後の１８アミノ酸（すなわち、配列番号１のアミノ酸位置８４〜１０１に対応するもの）のうちの１８アミノ酸中１３〜１７アミノ酸または１０Ｆｎ３ドメインの最後の２２アミノ酸（すなわち、配列番号１のアミノ酸位置８０〜１０１に対応するもの）のうちの２２アミノ酸中１４〜１８アミノ酸における修飾を含みうる。例示的実施形態において、ＡＧ結合物質は、配列番号１の位置１〜７、９、１１〜１７、１９、８４〜８９および９１〜９７に対応する１つ以上の位置に修飾を含みうる。好ましくは、ＡＧ結合物質中の修飾領域は、同じターゲットへの結合に寄与する。例示的１０Ｆｎ３ ＡＧ結合物質デザインには、例えば図９Ａに示すＡＧストランドデザインおよび図２Ｅに示すデザインなどがある。ＡＧ結合物質のモデルを図３Ｅに図示する。
１１．「サウスウエスト」結合物質
いくつかの実施形態において、本願は、修飾されたＣＤおよびＥＦループと、配列番号１の位置６９または９１〜９７に対応する残基のいずれか１つまたはその組み合わせにおける追加の修飾とを有する、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドを提供する。これらのタンパク質を本明細書では「サウスウエスト結合物質」または「ＳＷ結合物質」と呼ぶ。修飾ループ領域と修飾スキャフォールド領域は、ターゲットへの結合に寄与する。例示的１０Ｆｎ３ ＳＷ結合物質デザインには、例えば図９Ａに示すサウスウエストデザインおよび図２Ｆに示すデザインなどがある。ＳＷ結合物質のモデルを図３Ｆに図示する。
Ｅ．低減した免疫原性を有するタンパク質
いくつかの実施形態において、ここに提供するポリペプチドは、低減した免疫原性と関連付けられる。実施例で述べるように、１０Ｆｎ３ドメインのＢＣループ付近の領域は、免疫原性ホットスポットであると思われる。そこで本願は、低減した免疫原性を有する２タイプの１０Ｆｎ３デザインを提供する。最初のタイプのデザインでは、宿主（例えばヒト）免疫応答が１０Ｆｎ３ドメインのＢＣ領域を自己と認識し、それによって免疫応答を回避する可能性が高くなるように、ＢＣループが全面的または少なくとも部分的に無修飾である。第２のタイプのデザインでは、ＢＣ領域が宿主ＨＬＡ受容体にそれほど強固に結合せず、それによって１０Ｆｎ３結合物質のＢＣ領域の潜在的免疫原性が減少するように、１０Ｆｎ３ドメインのＢＣ領域中の強いＨＬＡ結合アンカーが除去または破壊される。これらの１０Ｆｎ３デザインを以下にさらに説明する。
一定の実施形態において、本願は、１０Ｆｎ３ドメインを含む、低減した免疫原性を有するポリペプチドであって、ＢＣループ全体が野生型のまま残されているポリペプチドを提供する。好ましくは、そのようなポリペプチドは、ＢＣループ中に修飾を持つ等価なポリペプチドと比較して低い免疫原性を有する。野生型ＢＣループを持つポリペプチドは、１０Ｆｎ３ドメインのうち、ターゲット結合に関与する他の領域に、修飾を有する。好ましくは、ＢＣループ外の修飾は、宿主において１０Ｆｎ３ドメインに対する強い免疫応答につながらない。ＢＣループ全体が野生型のまま残されている１０Ｆｎ３結合物質の例には、例えば、本明細書に記載のＷＳ結合物質、フロント結合物質、バック結合物質、サウスポール結合物質、サウスフロント結合物質、ＡＧ結合物質およびサウスウエスト結合物質などがある。ＢＣループが野生型配列との比較で無修飾である１０Ｆｎ３デザインの特定例には、例えば図９Ａに示すＷＳ２、ＷＳ３、フロント１、フロント２、バック１、バック２、ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＬＩ−３（ａ）、ＷＳ−ＬＩ１、ＬＵ−Ｓ９、サウスフロント、ＡＧストランドおよびサウスウエストデザイン、ならびに図２Ｄ〜２Ｆに示すデザインなどがある。野生型ＢＣループを有する１０Ｆｎ３結合物質デザインでは、βストランドＢおよび／またはβストランドＣの全部または一部も、特にβストランドＢおよび／またはβストランドＣのうち、ＢＣループに隣接している部分（すなわち、βストランドＢのＣ末端側部分および／またはβストランドＣのＮ末端側部分）は、野生型配列との比較で無修飾のまま残されていることが望ましいであろう。例示的実施形態において、野生型ＢＣループおよび低減した免疫原性を有する１０Ｆｎ３ドメインは、ＣＤループよりＮ末端側にある１０Ｆｎ３ドメインの部分には、どんな修飾も有さないであろう。すなわち、Ｎ末端領域、βストランドＡ、ＡＢループ、βストランドＢ、ＢＣループおよびβストランドＣは全て、野生型配列との比較で、修飾されずに残されている。
一定の実施形態において、本願は、１０Ｆｎ３ドメインを含む、低減した免疫原性を有するポリペプチドであって、ＢＣループの一部分が野生型のまま残されているポリペプチドを提供する。好ましくは、そのようなポリペプチドは、ＢＣループのより大きな部分に修飾を持つ等価なポリペプチドと比較して、低い免疫原性を有する。例示的実施形態では、ＢＣループのＮ末端側部分が、野生型のまま残されている。例えば、ＢＣループの最初の１、２、３、４、５、または６残基を野生型のまま残し、一方、ＢＣループの残りのＣ末端側残基を修飾することができる。ＢＣループのＮ末端側領域の少なくとも一部分が野生型である１０Ｆｎ３デザインでは、βストランドＢおよび／またはβストランドＣの全部または一部分も、特にβストランドＢおよび／またはβストランドＣのうち、ＢＣループに隣接している部分（すなわち、βストランドＢのＣ末端側部分および／またはβストランドＣのＮ末端側部分）は、野生型配列との比較で無修飾のまま残すことが望ましいだろう。例示的実施形態において、ＢＣループのＮ末端側部分に野生型配列を有し、かつ低減した免疫原性を有する１０Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端領域、βストランドＡ、ＡＢループ、およびβストランドＢには、いかなる修飾も有さないであろう。ＢＣループの一部分が野生型である１０Ｆｎ３デザインでは、ＢＣループの修飾部分が、１０Ｆｎ３ドメインの他の領域中の修飾と共に、ターゲット結合に寄与しうる。ＢＣループのＮ末端側部分が野生型のまま残されている１０Ｆｎ３結合物質の例には、例えば図９Ｂに示す１０Ｆｎ３デザイン、図９Ａに示すＷＳ１デザイン、および図２Ｃに示す１０Ｆｎ３デザインなどがある。
一定の実施形態において、本願は、１０Ｆｎ３ドメインを含む、低減した免疫原性を有するポリペプチドであって、βストランドＢ／ＢＣループ／βストランドＣの領域中の強いＨＬＡアンカー（「ＢＣアンカー」）が除去または破壊されている（例えば野生型配列と比較して、１つ以上のＨＬＡ受容体に対する結合アフィニティが低減するような形で修飾されている）ポリペプチドを提供する。例えば、ＢＣアンカーは、配列番号１または６の位置Ｌ１９、Ｓ２１、Ｒ３３および／またはＴ３５に対応する１つ以上の位置において１０Ｆｎ３ドメインを修飾することによって、除去または破壊することができる。ＢＣアンカーが除去または破壊されていれば、ＢＣ領域の潜在的免疫原性を著しく増加させずに、ＢＣループの配列を修飾することが可能である。したがって、多くのそのような１０Ｆｎ３デザインは、βストランドＢおよび／またはβストランドＣ中の修飾に加えて、ＢＣループにも修飾を有する。ＢＣループは、場合によっては１０Ｆｎ３ドメインの他の領域中の修飾との組み合わせで、ターゲット結合に寄与しうる。βストランドＢおよび／またはβストランドＣ中の修飾は、ターゲット結合に寄与する場合もしない場合もある。ＢＣアンカーが除去または破壊された１０Ｆｎ３結合物質の例には、例えば図９Ｃに示す１０Ｆｎ３デザインおよび図２Ｂに示す１０Ｆｎ３デザインなどがある。
一定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドが、配列番号６１を有するポリペプチドと比較して低減した免疫原性を有し、例えばポリペプチドの免疫原性は、配列番号６１を有するポリペプチドの免疫原性より低い。
本明細書に記載のポリペプチドの免疫原性は、例えば以下の方法の１つ以上によって評価することができる：ヒト白血球抗原（「ＨＬＡ」）結合、（例えば、Ｅｐｉｍａｔｒｉｘプログラムによる）ＨＬＡ結合のインシリコ予測、ヒトＴ細胞のインビトロ活性化、インビボ動物免疫応答、または潜在的免疫原性を評価するための他の方法。
一定の実施形態では、ＨＬＡ結合実験によって免疫原性を評価することができる。好ましくは、ここに提供するポリペプチドは、１つ以上のＨＬＡ受容体に、等価なＨＬＡ受容体と野生型１０Ｆｎ３ドメインとの間の結合に関するＩＣ５０と等しいかそれ未満のＩＣ５０で結合する。例えば、ここに提供するポリペプチドは、ＨＬＡ受容体に、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、１５０μＭまたは２００μＭより大きいＩＣ５０で結合しうる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、１０μＭ〜１ｍＭ、１００μＭ〜１ｍＭまたは５００μＭ〜１ｍＭのＩＣ５０で、ＨＬＡ受容体に結合しうる。ポリペプチド／ＨＬＡ ＩＣ５０結合を評価するために使用されるＨＬＡアレルは、ＤＲＢ＊０１０１、ＤＲＢ＊０３０１、ＤＲＢ＊０４０１、ＤＲＢ＊０７０１および／またはＤＲＢ＊１５０１の１つ以上でありうる。
いくつかの実施形態では、ＥｐｉＭａｔｒｉｘなどのインシリコ解析によって免疫原性を評価することができる。特定実施形態では、ここに提供するポリペプチドは、野生型１０Ｆｎ３ドメインに関連付けられるスコアと等しいかそれ未満のＥｐｉＭａｔｒｉｘ「Ｚ」スケールスコアに関連付けられる。一定の実施形態では、ここに提供するポリペプチドは、野生型１０Ｆｎ３ドメインに関連付けられるスコアの２００％以下のＥｐｉＭａｔｒｉｘ「Ｚ」スケールスコアに関連付けられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ「Ｚ」スケールで１．６４未満のＥｐｉＭａｔｒｉｘスコアと関連付けられる（Ａｎ Ｚ；２００９；Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；ニュージャージー；４２８〜４２９ページ）。
いくつかの実施形態では、インビボ動物免疫応答実験によって免疫原性を評価することができる。例えば、ここに提供するポリペプチドをマウスまたはサルなどの動物に注射し、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ免疫応答を測定することができる。好ましくは、本明細書に記載のポリペプチドが、野生型１０Ｆｎ３ドメインを注射したマウスまたはサルで観察されるＩｇＧまたはＩｇＭ免疫応答よりも２００％、１００％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％または１％を越えて高くないＩｇＧまたはＩｇＭ免疫応答を呈する。
本願は、ここに提供するポリペプチドのライブラリーおよびそのライブラリーから所望のターゲットに対する結合物質を選択する方法も提供する。ＢＣ領域に関連する潜在的免疫原性が回避されるようにデザインされていないライブラリーと比較して、ここに提供するライブラリーからは、許容することができる免疫原性特徴を持つターゲット結合分子が単離される可能性が高いであろう。これらのライブラリーは、ポリペプチド候補を脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅ）するためおよび非免疫原性ポリペプチド分子が同定される可能性を増加させるために必要な努力の量を低減するのに役立つ。
Ｆ．多価タンパク質
一定の実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、２つ以上の１０Ｆｎ３ドメインを含む多価タンパク質である。例えば、多価フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、共有結合によって結合した２個、３個またはそれ以上の１０Ｆｎ３ドメインを含みうる。例示的実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、２つの１０Ｆｎ３ドメインを含む二重特異性または二量体型タンパク質である。一定の実施形態では、多価フィブロネクチンベースタンパク質スキャフォールドが、第１ターゲット分子に結合する第１の１０Ｆｎ３ドメインと、第２ターゲット分子に結合する第２の１０Ｆｎ３ドメインとを含む。第１ターゲット分子と第２ターゲット分子は同じターゲット分子または異なるターゲット分子でありうる。第１ターゲット分子と第２ターゲット分子とが同じである場合、第１および第２の１０Ｆｎ３ドメインは、同じターゲットの異なるエピトープに結合しうる。また、第１ターゲット分子と第２ターゲット分子とが同じである場合、ターゲット結合に関連する１０Ｆｎ３ドメイン中の修飾の領域は、同じであっても異なってもよい。さらにまた、第１および第２の１０Ｆｎ３ドメインは、同じまたは異なるスキャフォールドデザインに基づきうる。例えば、多価フィブロネクチンベースタンパク質スキャフォールドは、２つの１０Ｆｎ３ドメインを含み、どちらの１０Ｆｎ３も本明細書に記載の同じ非従来型スキャフォールドデザインに基づくか、または１０Ｆｎ３ドメインの一方が第１タイプの非従来型スキャフォールドデザインに基づき、かつもう一つの１０Ｆｎ３ドメインが第２タイプの非従来型スキャフォールドデザインに基づくか、または１０Ｆｎ３ドメインの一方が非従来型スキャフォールドデザインに基づき、かつもう一つが従来型のスキャフォールドデザイン（すなわち、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが修飾される）に基づくことができる。
例示的実施形態では、多価フィブロネクチンベースタンパク質スキャフォールドの各１０Ｆｎ３ドメインが、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭまたはそれ以下を下回るＫｄで、所望のターゲットに結合する。いくつかの実施形態では、多価フィブロネクチンベースタンパク質スキャフォールドの各１０Ｆｎ３ドメインが、１ｐＭ〜１μＭ、１００ｐＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、または１ｎＭ〜１００ｎＭのＫｄで、所望のターゲットに結合する。例示的実施形態では、多価フィブロネクチンベースタンパク質スキャフォールドの各１０Ｆｎ３ドメインが、野生型１０Ｆｎ３ドメイン、特に野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインが結合しないターゲットを、特異的に結合する。
多価フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質中の１０Ｆｎ３ドメインは、ポリペプチドリンカーによってつなぐことができる。例示的ポリペプチドリンカーとして、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２個のアミノ酸を有するポリペプチドが挙げられる。１０Ｆｎ３ドメインを接合するのに好適なリンカーは、別々のドメインが互いに独立して折り畳まれて、ターゲット分子への高アフィニティ結合を許す三次元構造を形成することを可能にするものである。好適なリンカーの具体例には、グリシン−セリン系リンカー、グリシン−プロリン系リンカー、プロリン−アラニン系リンカー、ならびに配列番号３２のアミノ酸配列を有するリンカーなどがある。いくつかの実施形態では、リンカーが、グリシン−セリン系リンカーである。これらのリンカーは、グリシン残基とセリン残基を含み、８〜５０、１０〜３０、および１０〜２０アミノ酸長でありうる。そのようなリンカーの例として配列番号３９〜４３が挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーがグリシン−プロリン系リンカーである。これらのリンカーはグリシン残基とプロリン残基とを含み、３〜３０、１０〜３０、および３〜２０アミノ酸長でありうる。そのようなリンカーの例として配列番号３３〜３５が挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーがプロリン−アラニン系リンカーである。これらのリンカーはプロリン残基とアラニン残基とを含み、３〜３０、１０〜３０、３〜２０および６〜１８アミノ酸長であることができる。そのようなリンカーの例として配列番号３６〜３８が挙げられる。例示的実施形態では、リンカーがＡｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＫ）ペアを一切含有しない。
薬物動態成分
一態様において、本願は、薬物動態（ＰＫ）成分をさらに含むフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を提供する。薬物動態には、例えば対象による吸収、分布、代謝、および排除などといった化合物の性質が包含される。改良された薬物動態は、認知された治療ニーズに応じて評価することができる。多くの場合、バイオアベイラビリティーを増加させること、および／または、例えば投与後の血清中でタンパク質が利用可能な状態を保つ時間を増加させることなどによって投与間隔を増加させることが望ましい。場合によっては、タンパク質の血清中濃度の経時的な持続性を改良すること（例えば投与直後と次の投与の直前におけるタンパク質の血清中濃度の差を減少させること）が望ましい。フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、哺乳動物（例えばマウス、ラット、またはヒト）におけるそのポリペプチドのクリアランス率を無修飾ポリペプチドと比較して３分の１未満に低減する成分に取付けることができる。改良された薬物動態の他の尺度として、血清中半減期を挙げることもでき、これはα相とβ相に分割されることが多い。適当な成分を付加することにより、一方または両方の相を有意に改良することができる。ＰＫ成分とは、生物学的活性分子に融合した時に、その生物学的活性分子の薬物動態特性に影響を及ぼす、任意のタンパク質、ペプチド、または成分を指す。
血液からのタンパク質のクリアランスを遅くする傾向を持つＰＫ成分には、ポリオキシアルキレン成分、例えばポリエチレングリコール、糖類（例えばシアル酸）、および忍容性の高いタンパク質成分（例えばＦｃ、Ｆｃフラグメント、トランスフェリン、または血清アルブミン）などがある。フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、米国特許出願公開第２００７００４８２８２号に記載されているように、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント（一部分）もしくは変異体に融合することができる。いくつかの実施形態では、ＰＫ成分が、血清アルブミン結合タンパク質、例えば米国公開第２００７／０１７８０８２号および同第２００７／０２６９４２２号に記載のものである。いくつかの実施形態では、ＰＫ成分が血清免疫グロブリン結合タンパク質、例えば米国公開第２００７／０１７８０８２号に記載されているものである。
いくつかの実施形態では、非タンパク質性ポリマーを含むＰＫ成分に、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を取り付けることができる。いくつかの実施形態では、ポリマーが、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に記載のポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。例示的実施形態では、ポリマーがＰＥＧ成分である。
ＰＥＧは周知の水溶性ポリマーであり、これは市販されているか、または当技術分野で周知の方法に従って、エチレングリコールの開環重合によって製造することができる（ＳａｎｄｌｅｒおよびＫａｒｏ「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク， 第３巻１３８〜１６１頁）。「ＰＥＧ」という用語は、サイズまたはＰＥＧの末端における修飾とは無関係に、任意のポリエチレングリコール分子を包含するために広く使用され、式：Ｘ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（１）［式中、ｎは２０〜２３００であり、ＸはＨまたは末端修飾、例えばＣ１−４アルキルである］によって表すことができる。ある実施形態において、本発明のＰＥＧは、一端がヒドロキシまたはメトキシで終わる。すなわち、ＸはＨまたはＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。ＰＥＧは、結合反応に必要な、またはその分子の化学合成の結果として生じる、またはその分子のパーツ間の距離を最適にするためのスペーサーである、さらなる化学基を含有することができる。また、そのようなＰＥＧは、互いに連結された１つ以上のＰＥＧ側鎖からなることができる。２つ以上のＰＥＧ鎖を持つＰＥＧは、分枝型ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧと呼ばれる。分岐ＰＥＧは、例えばグリセロール、ペンタエリトリトール、およびソルビトールを含むさまざまなポリオールへのポリエチレンオキシドの付加によって調製することができる。例えば４分枝型分岐ＰＥＧはペンタエリトリトールとエチレンオキシドから調製することができる。分岐ＰＥＧは例えば欧州特許出願公開第４７３０８４号Ａおよび米国特許第５，９３２，４６２号に記載されている。ＰＥＧの一形態として、リジンの１級アミノ基を介して連結された２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）が挙げられる（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ６ （１９９５） ６２−６９）。
ペプチドまたはタンパク質へのＰＥＧのコンジュゲーションでは、一般に、ＰＥＧの活性化と、活性化されたＰＥＧ中間体のターゲットタンパク質／ペプチドへの直接的カップリング、またはリンカーへのカップリング（このリンカーは、次に活性化されて、ターゲットタンパク質／ペプチドにカップリングされる）とが行われる（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５２， ３５７１ （１９７７）およびＪ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５２， ３５８２ （１９７７）、「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｊ． Ｍ． Ｈａｒｒｉｓ編）（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ： ニューヨーク， １９９２）の第２１章および第２２章（Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．およびＨａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．）を参照されたい）。ＰＥＧ分子を含有するフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質はコンジュゲートタンパク質とも呼ばれ、これに対して、ＰＥＧ分子が取付けられていないタンパク質を非コンジュゲート型と呼ぶことができることに留意されたい。
使用するＰＥＧのサイズは、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の使用目的を含む、いくつかの因子に依存するであろう。体内、血中、血液以外の細胞外液または組織における半減期を増加させるには、ＰＥＧは大きい方が好ましい。インビボ細胞活性のためには、約１０〜６０ｋＤａの範囲のＰＥＧが、約１００ｋＤａ未満、より好ましくは約６０ｋＤａ未満のＰＥＧと共に好ましいが、約１００ｋＤａより大きいサイズも同様に使用することができる。インビボイメージング応用には、より迅速な分布とより短い半減期が可能になるように、大きいＰＥＧほどには半減期を増加させない小さいＰＥＧ（一般に約２０ｋＤａ未満のもの）を使用することができる。フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質へのコンジュゲーションには、例えば約１，０００ダルトン（Ｄａ）から１００，０００Ｄａまで（ｎは２０〜２３００である）の、さまざまな分子質量型のＰＥＧを選択することができる。ＰＥＧ中の繰返し単位の数「ｎ」はダルトンで記載される分子質量の概略値になる。活性化されたリンカー上のＰＥＧの総分子質量が医薬的使用にとって適切であることが好ましい。したがってある実施形態では、ＰＥＧ分子の分子質量が１００，０００Ｄａを超えない。例えば、３つのＰＥＧ分子がリンカーに取付けられ、各ＰＥＧ分子が１２，０００Ｄａ（各ｎが約２７０）という同じ分子質量を持つならば、リンカー上のＰＥＧの合計分子質量は約３６，０００Ｄａ（ｎが合計約８２０）である。リンカーに取付けられるＰＥＧの分子質量は異なっていてもよく、例えばリンカー上の３分子のうち、２つのＰＥＧ分子がそれぞれ５，０００Ｄａ（各ｎが約１１０）であり、１つのＰＥＧ分子が１２，０００Ｄａ（ｎが約２７０）であることもできる。いくつかの実施形態では、１つのＰＥＧ成分がフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ成分が約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ＫＤａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ成分が約４０ＫＤａである。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、１つ、２つまたはそれ以上のＰＥＧ成分を含有する。ある実施形態では、タンパク質の表面にあり、かつ／またはターゲットリガンドと接触する表面から離れているアミノ酸残基に、ＰＥＧ成分が結合される。ある実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質中のＰＥＧの総分子質量または合計分子質量が、約３，０００Ｄａ〜６０，０００Ｄａ、または約１０，０００Ｄａ〜３６，０００Ｄａである。ある実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質中のＰＥＧが実質的に線状の直鎖ＰＥＧである。
当業者は、例えばＰＥＧ化されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を治療的に使用する方法、所望の投薬量、循環時間、タンパク質分解に対する耐性、免疫原性、および他の考慮すべき事項に基づいて、ＰＥＧの適切な分子質量を選択することができる。ＰＥＧおよびタンパク質の性質を強化するためのその使用に関する議論については、Ｎ． Ｖ． Ｋａｔｒｅ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １０： ９１−１１４ （１９９３）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、式：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲ［式中、ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯ（すなわちカルボニル）は結合ポリペプチドのアミノ基の一つとアミド結合を形成する；Ｒは低級アルキルである；ｘは２または３である；ｍは約４５０〜約９５０である；そしてｎおよびｍは、コンジュゲートから結合ポリペプチドを差し引いたものの分子量が約１０〜約４０ｋＤａになるように選択される］の１つのポリ（エチレングリコール）基に共有結合で連結される。ある実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質のリジンのε−アミノ基が、利用可能な（遊離）アミノ基である。
ある具体的実施形態では、ＰＥＧの炭酸エステルを使って、ＰＥＧ−フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質コンジュゲートを形成させる。ＰＥＧとの反応では、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）を使って活性な混合ＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネートを形成させ、次にそれをリンカーの求核基またはフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質のアミノ基と反応させることができる（米国特許第５，２８１，６９８号および米国特許第５，９３２，４６２号）。類似するタイプの反応で、１，１’−（ジベンゾトリアゾリル）カーボネートおよびジ−（２−ピリジル）カーボネートをＰＥＧと反応させて、それぞれＰＥＧ−ベンゾトリアゾリルおよびＰＥＧ−ピリジル混合カーボネートを形成させることもできる（米国特許第５，３８２，６５７号）。
フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質のＰＥＧ化は、最新技術の方法に従って、例えばフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質と求電子的に活性なＰＥＧ（供給業者：Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ．， 米国、ワールドワイドウェブでは、ｓｈｅａｒｗａｔｅｒｃｏｒｐ．ｃｏｍ）との反応によって行うことができる。本発明の好ましいＰＥＧ試薬は、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオネート（ＰＥＧ−ＳＰＡ）、ブタノエート（ＰＥＧ−ＳＢＡ）、ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネートまたは分岐Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、例えばｍＰＥＧ２−ＮＨＳ（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ６ （１９９５） ６２−６９）である。そのような方法を使って、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質のリジンのε−アミノ基またはフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質のＮ末端アミノ基を、ＰＥＧ化することができる。
もう一つの実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質上のスルフヒドリル基にＰＥＧ分子をカップリングすることができる（Ｓａｒｔｏｒｅ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２７， ４５ （１９９１）；Ｍｏｒｐｕｒｇｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎ． Ｃｈｅｍ．， ７， ３６３−３６８ （１９９６）；Ｇｏｏｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９０） ８， ３４３；米国特許第５，７６６，８９７号）。米国特許第６，６１０，２８１号および同第５，７６６，８９７号には、スルフヒドリル基とカップリングすることができる典型的な反応性ＰＥＧ種が記載されている。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、部位特異的ＰＥＧ化によって、特にシステイン成分へのＰＥＧのコンジュゲーションによって、生産される。一定の実施形態では、Ｃｙｓ残基が、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質のＮ末端、Ｎ末端と最もＮ末端側のβまたはβ様ストランドの間、Ｃ末端、またはＣ末端と最もＣ末端側のβまたはβ様ストランドの間に位置しうる。Ｃｙｓ残基は、他の位置、特にターゲット結合に参加しないループのいずれか、または多価フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の２つの結合ドメインの間にあってもよい。ＰＥＧ成分は、アミンへのコンジュゲーションによる方法など、他の化学反応によって取付けることもできる。
ＰＥＧ分子がフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質上のシステイン残基にコンジュゲートされるいくつかの実施形態では、システイン残基がそのフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質にとってネイティブであるが、別の実施形態では、１つ以上のシステイン残基がフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質中に工学的に導入される。フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質をコードする配列中に変異を導入して、システイン残基を生成させることができる。これは、例えば１つ以上のアミノ酸残基をシステインに変異させることなどによって達成できるかもしれない。システイン残基へと変異させるのに好ましいアミノ酸には、セリン、スレオニン、アラニンおよび他の親水性残基がある。好ましくは、システインに変異させるべき残基は、表面露出残基である。一次配列またはタンパク質に基づいて残基の表面露出性を予測するためのアルゴリズムは、当技術分野ではよく知られている。あるいは、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質をデザインする際の基礎となった第１０ｆｎ３ドメインフレームワークの結晶構造が解かれており（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３６（４）： １０７９−９２ （１９９４）参照）、それゆえに表面露出残基が同定されていることから、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質のアミノ酸配列を比較することによって、表面残基を予測することもできる。ある実施形態では、システイン残基が、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端またはその近くに導入されるか、ループ領域内に導入される。システイン残基のＰＥＧ化は、例えばＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−ヨードアセトアミド、またはＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィドを使って行うことができる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、Ｎ末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合で取り付けられたＰＥＧ分子を含む。部位特異的なＮ末端の還元的アミノ化はＰｅｐｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ． （２００１） ＪＰＥＴ， ２９７， １０５９および米国特許第５，８２４，７８４号に記載されている。他の利用可能な求核性アミノ基を利用してタンパク質の還元的アミノ化を行うためのＰＥＧ−アルデヒドの使用は、米国特許第４，００２，５３１号、Ｗｉｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５４， １２５７９、およびＣｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５， １３３に記載されている。
もう一つの実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、リンカーに共有結合で取付けられた１つ以上のＰＥＧ分子を含み、そのリンカーが、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質のＮ末端にあるアミノ酸残基のαアミノ基に取付けられる。そのようなアプローチは米国特許出願公開第２００２／００４４９２１号およびＰＣＴ公開ＷＯ９４／０１４５１に開示されている。
ある実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質がＣ末端でＰＥＧ化される。具体的な一実施形態では、Ｃ末端アジド−メチオニンを導入してから、シュタウディンガー反応でメチル−ＰＥＧ−トリアリールホスフィン化合物をコンジュゲートすることによって、タンパク質がＣ末端でＰＥＧ化される。このＣ末端コンジュゲーション法はＣａｚａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．「Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ Ｍｕｔａｎｔ ｗｉｔｈ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｌｌ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ． ２００４；１５（５）：１００５−１００９に記載されている。
例示的実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、本明細書でさらに説明するようにＣ末端テール領域でＰＥＧ化される。例示的実施形態では、Ｃ末端がＣｙｓ残基を含有し、それがＰＥＧ成分の取り付け部位として使用される。例示的Ｃ末端テールには、例えば配列番号２３、２４または３１のいずれか１つを有するポリペプチドなどがある。
ＰＥＧ化されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を精製するには、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（例えばゲル濾過）およびイオン交換クロマトグラフィーなどといった、当技術分野で知られる通常の分離および精製技法を使用することができる。生成物はＳＤＳ−ＰＡＧＥを使って分離することもできる。分離することができる生成物には、モノ−、ジ−、トリ−、ポリ−ＰＥＧ化された、およびＰＥＧ化されていない、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質、ならびに遊離ＰＥＧが含まれる。モノＰＥＧコンジュゲートのパーセンテージは、組成物中のモノＰＥＧのパーセンテージが増加するように、溶出ピーク付近の幅広い画分をプールすることによって制御することができる。約９０％のモノＰＥＧコンジュゲートが、収量と活性のバランスがよい値に相当する。例えば少なくとも９２パーセントまたは少なくとも９６パーセントのコンジュゲートがモノＰＥＧ種であるような組成物が望ましいであろう。本発明の一実施形態では、モノＰＥＧコンジュゲートのパーセンテージが９０パーセント〜９６パーセントである。
本発明のある実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質中のＰＥＧが、ヒドロキシルアミンアッセイを使った場合に、例えば４５０ｍＭヒドロキシルアミン（ｐＨ６．５）、室温で、８〜１６時間にわたって、ＰＥＧ化されたアミノ酸残基から加水分解されず、したがって安定である。ある実施形態では、８０％を上回る組成物が、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が、安定なモノＰＥＧ−フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質である。
もう一つの実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、好ましくは、無修飾タンパク質に関連する生化学的活性の少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を保持するであろう。ある実施形態では、生物学的活性とは、Ｋｄ、ｋｏｎまたはｋｏｆｆによって評価される、１つ以上のターゲット分子に結合するその能力を指す。ある具体的実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、ＰＥＧ化されていないフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質と比較して、１つ以上のターゲット分子への結合の増加を示す。
ＰＥＧ修飾されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の血清クリアランス率は、無修飾のフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質のクリアランス率と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、さらには９０％減少しうる。ＰＥＧ修飾されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、無修飾のフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の半減期と比較して増加した半減期（ｔ１／２）を有しうる。ＰＥＧ修飾されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の半減期は、無修飾のフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の半減期と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％または５００％、さらには１０００％増加しうる。いくつかの実施形態では、タンパク質半減期がインビトロで、例えば緩衝塩類溶液中で、または血清中で、決定される。別の実施形態では、タンパク質半減期がインビボ半減期、例えば動物の血清または他の体液におけるフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の半減期である。
核酸−タンパク質融合技術
一態様において、本願は、ヒトターゲット、例えばＴＮＦ−α、ＤＬＬ４、ＩＬ−１７、ＰＸＲまたは他のタンパク質に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を提供する。特異的結合特性を持つＦｎ３ドメインを素早く作製して試験するための一方法は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙの一社、Ａｄｎｅｘｕｓの核酸−タンパク質融合技術である。核酸−タンパク質融合物（ＲＮＡ−およびＤＮＡ−タンパク質融合物）を活用するＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）と名付けられたそのようなインビトロ発現およびタグ付け技術を使って、新規ポリペプチドと、タンパク質への結合にとって最も重要なアミノ酸モチーフとを同定することができる。核酸−タンパク質融合技術は、タンパク質と、それをコードする遺伝情報とを、共有結合的にカップリングする技術である。ＲＮＡ−タンパク質融合技術およびフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質ライブラリースクリーニング法の詳細な説明については、引用により本明細書に組み込まれるＳｚｏｓｔａｋらの米国特許第６，２５８，５５８号；同第６，２６１，８０４号；同第６，２１４，５５３号；同第６，２８１，３４４号；同第６，２０７，４４６号；同第６，５１８，０１８号；ＰＣＴ公開ＷＯ００／３４７８４；ＷＯ０１／６４９４２；ＷＯ０２／０３２９２５；ならびにＲｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：１２２９７−１２３０２， １９９７を参照されたい。
ベクターおよびポリヌクレオチド実施形態
本明細書に開示するさまざまなフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質のいずれかをコードする核酸は、化学的、酵素的または組換え的に合成することができる。細胞における発現が改良されるようにコドン使用頻度を選択することができる。そのようなコドン使用頻度は選択した細胞タイプに依存するであろう。大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞に特化したコドン使用頻度パターンが開発されている。例えば次の文献を参照されたい：Ｍａｙｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２００３ Ｊａｎ ２１；１００（２）：４３８−４２；Ｓｉｎｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ． ２００２ Ｏｃｔ；２６（１）：９６−１０５；Ｃｏｎｎｅｌｌ ＮＤ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００１ Ｏｃｔ；１２（５）：４４６−９；Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ． １９９６ Ｓｅｐ；６０（３）：５１２−３８；およびＳｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ． １９９１ Ｏｃｔ；７（７）：６５７−７８。
核酸操作の一般技法は、例えば、引用により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第１〜３巻（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， 第２版， １９８９）またはＦ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：ニューヨーク， １９８７）とその定期改訂版に記載されている。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳動物遺伝子、ウイルス遺伝子または昆虫遺伝子に由来する適切な転写または翻訳調整要素に作動的に連結される。そのような調整要素には、転写プロモーター、転写を制御するための随意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。さらに、宿主内で複製する能力（これは通常、複製起点によって付与される）および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子も組み込まれる。
本明細書に記載するフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、直接的に組換え生産できるだけでなく、異種ポリペプチド（好ましくはシグナル配列、または成熟タンパク質もしくは成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチド）との融合ポリペプチドとして組換え生産することもできる。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわちシグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。ネイティブシグナル配列を認識せずプロセシングしない原核宿主細胞の場合は、シグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼリーダー、ペニシリナーゼリーダー、ｌｐｐリーダー、または耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列で置換する。酵母での分泌には、ネイティブシグナル配列を、例えば酵母インベルターゼリーダー、ａ因子リーダー（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー、またはＰＣＴ公開ＷＯ９０／１３６４６に記載のシグナルなどで置換することができる。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルを利用することができる。そのような前駆体領域のＤＮＡは、タンパク質をコードするＤＮＡに読み枠を合わせてライゲートすることができる。
発現ベクターとクローニングベクターはどちらも、１つ以上の選択した宿主細胞内でそのベクターが複製することを可能にする核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターでは、この配列が、宿主染色体ＤＮＡとは独立してベクターが複製することを可能にするものであり、複製起点または自立複製配列を含む。そのような配列は、さまざまな細菌、酵母、およびウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は大半のグラム陰性細菌に適し、２μプラスミド起点は酵母に適し、さまざまなウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞中のクローニングベクターに役立つ。一般に複製起点コンポーネントは、哺乳動物細胞発現ベクターには必要ない（ＳＶ４０起点が典型的に使用されうるのは、それが初期プロモーターを含有しているという理由でしかない）。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有しうる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンなどに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性の欠陥を補うタンパク質、または（ｃ）天然培地からは取得できない不可欠な栄養素を供給するタンパク質（例えばバチルスの場合はＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）をコードする。
酵母での使用に適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２８２：３９ （１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母突然変異体、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１用の選択マーカーになる。Ｊｏｎｅｓ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ８５：１２ （１９７７）。この場合、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１欠陥の存在は、トリプトファン非存在下での成長によって形質転換を検出するための有効な環境になる。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を保持する既知のプラスミドによって補完される。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、かつフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質をコードする核酸に作動的に連結される、プロモーターを含有する。原核宿主で使用するのに適したプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターなどがある。しかし他の既知細菌プロモーターも適切である。細菌系で使用されるプロモーターは、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質をコードするＤＮＡに作動的に連結されたシャイン・ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有するであろう。
真核生物用のプロモーター配列は知られている。事実上全ての真核遺伝子が、転写が開始される部位の約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有している。多くの遺伝子の転写開始点の７０〜８０塩基上流に見出されるもう一つの配列はＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであることができる。ほとんどの真核遺伝子の３’端には、コード配列の３’端にポリＡテールを付加するためのシグナルになりうるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て、真核発現ベクター中に適切に挿入される。
酵母宿主での使用に適したプロモーター配列の例として、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーターが挙げられる。
転写が成長条件によって制御されるという追加の利点を有する誘導性プロモーターである、他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトース資化およびガラクトース資化を担う酵素のプロモーター領域である。酵母発現における使用に適したベクターおよびプロモーターは、ＥＰ特許公開番号７３，６５７に、さらに記載されている。酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に有利に使用される。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、当該プロモーターが宿主細胞系と適合するという条件で、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターなどから得られるプロモーター、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターなどによって制御することができる。
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターはＳＶ４０制限フラグメントとして都合よく入手することができ、このフラグメントはＳＶ４０ウイルス複製起点も含有している。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして都合よく入手することができる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の変形が米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下で行われるマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関するＲｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８−６０１ （１９８２）も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列をプロモーターとして使用することもできる。
フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより、多くの場合、増加する。現在では、哺乳動物遺伝子に由来するエンハンサー配列が数多く知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）。しかし典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。複製起点の後期側（ｂｐ１００−２７０）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーなどが、その例である。真核プロモーターを活性化するための強化エレメントに関するＹａｎｉｖ， Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７−１８ （１９８２）も参照されたい。エンハンサーはポリペプチドコード配列の５’側または３’側の位置でベクター中に接合することができるが、好ましくはプロモーターより５’側の部位にエンハンサーを配置する。
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物に由来する有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有するであろう。そのような配列は、一般に、真核細胞またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域から、また時には３’非翻訳領域から、入手することができる。これらの領域は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分に、ポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。有用な転写終結コンポーネントの一つは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびそこに開示されている発現ベクターを参照されたい。
組換えＤＮＡは、タンパク質の精製に役立ちうる任意のタイプのタンパク質タグ配列も含むことができる。タンパク質タグの例には、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグなどがあるが、これらに限るわけではない。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは、「Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ニューヨーク， １９８５）に見出すことができ、この文献の関連する開示は、引用により本明細書に組み込まれる。
当業者には明白であるだろうが、発現コンストラクトは宿主細胞に適した方法を使って宿主細胞中に導入される。宿主細胞中に核酸を導入するための方法は、例えば限定するわけではないが、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント；リポフェクション；および感染（ベクターが感染性物質である場合）など、当技術分野では種々知られている。
好適な宿主細胞には、原核生物、酵母、哺乳動物細胞、または細菌細胞が含まれる。好適な細菌にはグラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス属が含まれる。酵母、好ましくはサッカロミセス属のもの、例えばＳ．セレビシェ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もポリペプチドの生産に使用することができる。さまざまな哺乳動物細胞培養系または昆虫細胞培養系も、組換えタンパク質を発現させるために使用することができる。昆虫細胞中で異種タンパク質を生産するためのバキュロウイルス系は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓによって概説されている（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：４７， １９８８）。好適な哺乳動物宿主細胞株の例には、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３Ｔ、およびＢＨＫ細胞株などがある。精製されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、適切な宿主／ベクター系を培養して組換えタンパク質を発現させることによって調製される。多くの応用では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質のサイズが小さいことから、大腸菌における発現が、好ましい発現方法になるであろう。次にフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を培養培地または細胞抽出物から精製する。
タンパク質生産
タンパク質生産のために、本明細書に記載の発現またはクローニングベクターで宿主細胞を形質転換し、プロモーターを誘導するため、または形質転換体を選択するため、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するための変更を適宜加えた従来の栄養培地で培養する。
フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を生産するために使用される宿主細胞は、さまざまな培地で培養することができる。市販の培地、例えばハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ））、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ））は、宿主細胞を培養するのに適している。加えて、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． ５８：４４ （１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：２５５ （１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；もしくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載の培地はいずれも、宿主細胞のための培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれにも、ホルモンおよび／または他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（ゲンタマイシン（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標））薬）、微量元素（通常はマイクロモル濃度域の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは等価なエネルギー源を、必要に応じて補足することができる。他の必要な補助剤はいずれも、当業者には知られているであろう適当な濃度で含めることができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択した宿主細胞で過去に使用されたものであり、当業者には明白であるだろう。
本明細書に開示するフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、無細胞細胞翻訳系を使って生産することもできる。そのような目的には、インビトロ転写によるｍＲＮＡの生産が可能になり、利用する特定無細胞系（真核無細胞翻訳系、例えば哺乳動物もしくは酵母無細胞翻訳系、または原核無細胞翻訳系、例えば細菌無細胞翻訳系）におけるそのｍＲＮＡの無細胞翻訳が可能になるように、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質をコードする核酸を修飾しなければならない。
フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は化学合成によって（例えば「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第２版（１９８４， Ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， イリノイ州ロックフォード）に記載の方法によって）生産することもできる。フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の修飾も化学合成によって行うことができる。
本明細書に開示するフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、タンパク質化学の分野で広く知られているタンパク質の単離／精製方法によって精製することができる。非限定的な例として、抽出、再結晶、塩析（例えば硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムによるもの）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動、向流分配法またはこれらの任意の組合せが挙げられる。精製後に、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を、当技術分野で知られているさまざまな方法のいずれか、例えば限定するわけではないが、濾過および透析などによって、異なるバッファーに交換し、かつ／または濃縮することができる。
精製されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の純度は、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％である。純度の正確な数値とは関わりなく、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、医薬製品としての使用にとって、十分に純粋である。
例示的用途
一態様において、本願は、検出可能成分で標識されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を提供する。フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、さまざまな診断的応用に使用することができる。検出可能成分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する能力を有するものならなんでもよい。例えば検出可能成分は、放射性同位体、例えばＨ３、Ｃ１４、Ｃ１３、Ｐ３２、Ｓ３５、またはＩ１３１；蛍光もしくは化学発光化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン；または酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくはセイヨウワサビペルオキシダーゼであることができる。
当技術分野において知られている、タンパク質を検出可能成分にコンジュゲートするための方法は、Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５ （１９６２）；Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４ （１９７４）；Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ４０：２１９ （１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ， Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ３０：４０７ （１９８２）に記載されている方法を含めて、どれでも使用することができる。インビトロ法には、タンパク質と適合するケミストリー、例えばＣｙｓおよびＬｙｓなどといった特別なアミノ酸のケミストリーなど、当技術分野において周知のコンジュゲーションケミストリーが含まれる。検出可能成分をフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質に連結するには、連結基または反応性基が使用される。適切な連結基は当技術分野では周知であり、これにはジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基が含まれる。好ましい連結基は、その応用に依存して、ジスルフィド基およびチオエーテル基である。Ｃｙｓアミノ酸を持たないポリペプチドの場合、コンジュゲーションのための場を作り出すと同時にタンパク質の活性も許容されうるような場所に、Ｃｙｓを工学的に導入することができる。
検出可能成分と連結されたフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、インビトロまたはインビボイメージングに役立つ。ポリペプチドを放射性不透過剤または放射性同位体に連結し、対象に（好ましくは血流中に）投与し、対象における標識タンパク質の存在と場所をアッセイすることができる。このイメージング技法は、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、がんと関連するターゲットに結合する場合に、例えば悪性疾患の病期分類と処置に役立つ。フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、核磁気共鳴であれ、放射線法であれ、当技術分野で知られる他の検出手段であれ、宿主内で検出可能な任意の部分で標識することができる。
フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、アフィニティ精製剤としても役立つ。このプロセスでは、セファデックス樹脂またはろ紙などの適切な支持体上に、当技術分野で周知の方法を使って、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を固定化する。
フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなど、既知の任意のアッセイ方法で使用することができる（Ｚｏｌａ「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」１４７−１５８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８７））。
一定の態様において、本開示は、試料中のターゲット分子を検出するための方法を提供する。方法は、試料を本明細書に記載のフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質と接触させること（ここで、前記接触は、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質−ターゲット複合体の形成が可能な条件下で行われる）、および前記複合体を検出することによって、前記試料中の前記ターゲットを検出することを含みうる。検出は、例えばラジオグラフィー、免疫学的アッセイ、蛍光検出、質量分析、または表面プラズモン共鳴など、当技術分野で知られる任意の技法を使って行うことができる。試料は多くの場合、生物学的試料、例えば生検材料、特にフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質ががんに関連するターゲットに結合する場合には、腫瘍の生検材料、腫瘍と疑われる組織の生検材料であるだろう。試料はヒトまたは他の哺乳動物に由来しうる。フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、放射性成分、蛍光成分、発色成分、化学発光成分、またはハプテン成分などの標識成分で標識することができる。フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は固形支持体上に固定化することができる。
一態様において、本願は、障害の処置に有用なフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を提供する。処置しうる疾患または障害は、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の結合特異性によって決まるであろう。本明細書に記載するとおり、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、任意の目的のターゲットに結合するようにデザインすることができる。例示的ターゲットには、例えばＴＮＦ−α、ＤＬＬ４、ＩＬ−１７およびＰＸＲなどがある。単なる一例として、ＴＮＦ−αに結合するフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、および喘息などの自己疾患免疫障害を処置するために使用することができ；ＩＬ−１７に結合するフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、喘息を処置するために使用することができ；ＤＬＬ４に結合するフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、望ましくない血管新生と関連する過剰増殖性障害または疾患、例えばがんまたは腫瘍を処置するために使用することができる。
本願は、対象にフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を投与するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、対象がヒトである。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が、哺乳動物、特にヒトに対して、医薬上許容される。「医薬上許容される」組成物とは、動物に投与しても重大で有害な医学的結果をもたらさない組成物を指す。医薬上許容される組成物の例として、インテグリン結合ドメイン（ＲＧＤ）を欠く１０Ｆｎ３ドメインを含む組成物、および本質的にエンドトキシンフリーまたはパイロジェンフリーであるか、エンドトキシンレベルまたはパイロジェンレベルが極めて低い組成物が挙げられる。
製剤および投与
本願はさらに、本明細書に記載のフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を含む医薬上許容される組成物であって、本質的にエンドトキシンフリーおよび／またはパイロジェンフリーである組成物を提供する。
フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を含む治療用製剤は、望ましい純度を有する記載のタンパク質を、随意の生理的に許容できる担体、賦形剤または安定剤（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１６版， Ｏｓｏｌ， Ａ．編（１９８０））と混合することにより、水溶液、凍結乾燥製剤または他の乾燥製剤の形で、貯蔵用に調製される。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、使用する投薬量および濃度で、受容者にとって無毒であり、これには、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストランを含む、単糖類、二糖類、および他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ （商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ （商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤が含まれる。
本明細書に記載の製剤は、処置される特定の適応症のために、必要に応じて、２つ以上の活性化合物、好ましくは互いに有害な影響を及ぼさない補完的活性を持つものも含有しうる。そのような分子は、意図する目的に有効な量で組み合わされて、適切に存在する。
フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、例えばコアセルベーション技法または界面重合などによって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンに封入することもできる。そのような技法は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１６版（Ｏｌｓｏ， Ａ．編 （１９８０））に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は滅菌状態でなければならない。これは滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。
徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の好適な例として、本明細書に記載のフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、そのマトリックスが造形品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態をとるものが挙げられる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸などがある。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日以上にわたる分子の放出を可能にするが、一定のヒドロゲルは、それより短い期間でタンパク質を放出する。封入されたタンパク質が体内に長期間とどまる場合、それらは３７℃で水分に曝露された結果として、変性または凝集して、生物学的活性の喪失および免疫原性が変化する可能性をもたらしうる。関与する機序に応じて安定化のために合理的戦略を考案することができる。例えば、凝集機序がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが見出された場合は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、含水量を制御すること、適当な添加剤を使用すること、および特殊なポリマーマトリックス組成物を開発することによって、安定化を達成することができる。
各フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の投薬量がタンパク質の実体に依存することは当業者には理解されるであろうが、好ましい投薬量は約１０ｍｇ／平方メートル〜約２０００ｍｇ／平方メートル、より好ましくは約５０ｍｇ／平方メートル〜約１０００ｍｇ／平方メートルの範囲におよびうる。
治療的応用の場合、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、医薬上許容される剤形で、対象に投与される。それらは、ボーラスとして静脈内投与するか、ある期間にわたって持続注入によって投与するか、筋肉内、皮下、関節内、滑液包内、髄腔内、経口、局所外用、または吸入経路によって投与することができる。全身性治療効果だけでなく、局所的治療効果を発揮するように、タンパク質を、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内、または病変周囲経路で投与することもできる。適切な医薬上許容される担体、希釈剤、および賦形剤は周知であり、当業者は、臨床状況から正当であると考えられるとおりに、それらを決定することができる。好適な担体、希釈剤および／または賦形剤の例には、以下に挙げるものが含まれる：（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するダルベッコのリン酸緩衝食塩水、ｐＨ約７．４、（２）０．９％食塩水（０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロース。本発明の方法はインビトロ、インビボ、またはエクスビボで実施することができる。
フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質と１つ以上の追加治療剤との投与は、同時投与されるか、逐次的に投与されるかを問わず、治療的応用に関して上述したように行うことができる。同時投与用の適切な医薬上許容される担体、希釈剤、および賦形剤が、同時投与されるその特定治療剤の実体に依存することは、当業者には理解されるであろう。
凍結乾燥されるのではなく水性剤形で存在する場合、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は典型的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化されるであろう（ただしこれらの範囲を超えて広く変動することができる）。疾患を処置する場合、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の適当な投薬量は、処置される疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、過去の治療の経過、患者の病歴およびフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質に対する応答、ならびに担当医の裁量に依存するであろう。フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、一度に、または一連の処置で、患者に適切に投与される。
フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、タンパク質と目的の化合物との構造を生成させるための結晶化シャペロンとして使用することもできる。例えば、ヒトプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）に特異的に結合するフィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質は、化合物とＰＸＲ、例えばＰＸＲのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）との結晶化を容易にするための結晶化シャペロンとして使用することができる。ヒトＰＸＲに結合する１０Ｆｎ３分子を本明細書にいくつか記載する。
ＰＸＲ活性化は、いくつかの薬物代謝酵素、例えばシトクロムＰ４５０酵素やＭＤＲ１の細胞レベルをアップレギュレートする。ＣＹＰ酵素の発現量の増加は、薬物の薬物動態を改変し、治療効力の喪失および毒性の増加を含む危険な薬物−薬物相互作用につながる場合がある。後期段階での臨床的失敗と新薬の市場投入に関連する高コストとを避けるために、多くの医薬会社は、ＰＸＲを活性化する化合物を早期検出するためのスクリーニングアッセイを採用している。加えて、潜在的ＰＸＲ活性を予測するために、ＰＸＲの既知の結晶構造を使ったインシリコスクリーニングが使用されることも増えている。ＰＸＲの大きくフレキシブルなリガンド結合ポケットと、ＰＸＲのリガンド結合キャビティ内で異なる場所に複数の配向で結合するというこれらの化合物の潜在能力とが、信頼できるＰＸＲ活性の予測を複雑にしている。これは、意図した治療ターゲットに対して望ましい効力、選択性およびバイオアベイラビリティを有するが、既知のＰＸＲライアビリティ（ＰＸＲ ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）を持つ、より先端的な化合物／ケモタイプには、特に当てはまる。これらの制約があることから、正確な結合相互作用を規定するために、そして一次ターゲットに対する活性を維持したままＰＸＲ結合に関係する決定的な相互作用を妨害することができる特異的修飾を提案するために、共結晶構造が必要とされることが多い。例えば一定の実施形態において、試験剤とＰＸＲとの相互作用を分析するための方法は、（ｉ）ＰＸＲまたはそのリガンド結合ドメイン；（ｉｉ）試験剤および（ｉｉｉ）ＰＸＲ（例えばＰＸＲ ＬＢＤ）に特異的に結合する１０Ｆｎ３タンパク質を、結晶化に適した条件下で一緒にインキュベートすることを含む。ＰＸＲ ＬＢＤに特異的に結合する例示的１０Ｆｎ３タンパク質は、配列番号４８、４９および６２〜６９および７２の１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を含む。一定の実施形態では、ＰＸＲ ＬＢＤに特異的に結合する１０Ｆｎ３タンパク質が、配列番号４８、４９および６２〜６９および７２のいずれか１つと、多くとも１、２、３、５、１０、１５、２０または２５アミノ酸の変化、例えば置換（保存的置換など）、付加または欠失で異なるアミノ酸配列を含む。本方法は、さらに、結晶化を誘発すること、試験剤のどの部分（または原子）がＰＸＲ（一般的にはＰＸＲのリガンド結合ドメイン）と相互作用するかを決定すること、そして場合によっては、もはやＰＸＲとは相互作用しないように、または相互作用時のアフィニティが低くなるように試験剤を修飾することを含みうる。
配列
野生型１０Ｆｎ３配列：
ＷＴ１０Ｆｎ３ドメイン
Figure 2015504038
 （配列番号１）
ＷＴ１０Ｆｎ３ドメインコア配列バージョン１
Figure 2015504038
 （配列番号２）
Ｄ８０Ｅ置換を持つＷＴ１０Ｆｎ３ドメイン
Figure 2015504038
 （配列番号５９）
ＷＴ１０Ｆｎ３ドメインコア配列バージョン２
Figure 2015504038
 （配列番号６０）
ＷＴ１０Ｆｎ３ドメインコア配列バージョン３
Figure 2015504038
 （配列番号２２）
ＷＴ１０Ｆｎ３ドメインコア配列バージョン４
Figure 2015504038
 （配列番号６）
ＤＬＬ４結合性ＷＳ−ＬＩ１結合物質：
Figure 2015504038
 （配列番号３）
Figure 2015504038
 （配列番号４）
Figure 2015504038
 （配列番号５）
例示的Ｎ末端伸長部配列：
ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号９）
ＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号１０）
ＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号１１）
ＸｎＳＤＶＰＲＤＬ［配列中、ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１である場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２である場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである］（配列番号１６）
ＸｎＤＶＰＲＤＬ［配列中、ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１である場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２である場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである］（配列番号１７）
ＸｎＶＰＲＤＬ［配列中、ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１である場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２である場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである］（配列番号１８）
ＸｎＰＲＤＬ［配列中、ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１である場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２である場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである］（配列番号１９）
ＸｎＲＤＬ［配列中、ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１である場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２である場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである］（配列番号２０）
ＸｎＤＬ［配列中、ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１である場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２である場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである］（配列番号２１）
ＭＡＳＴＳＧ（配列番号５０）
例示的Ｃ末端テール配列：
ＥＩＥＫ（配列番号７）
ＥＩＥＫＰＣ（配列番号８）
ＥＧＳＧＣ（配列番号２３）
ＥＩＥＫＰＣＱ（配列番号２４）
ＥＩＥＫＰＳＱ（配列番号２５）
ＥＩＥＫＰ（配列番号２６）
ＥＩＥＫＰＳ（配列番号２７）
ＥＧＳＧＳ（配列番号２８）
ＥＩＤＫ（配列番号２９）
ＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号３０）
ＥＩＤＫＰＣＱ（配列番号３１）
例示的リンカー配列：
ＰＳＴＳＴＳＴ（配列番号３２）
ＧＰＧ（配列番号３３）
ＧＰＧＰＧＰＧ（配列番号３４）
ＧＰＧＰＧＰＧＰＧＰＧ（配列番号３５）
ＰＡＰＡＰＡ（配列番号３６）
ＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡ（配列番号３７）
ＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡ（配列番号３８）
ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号３９）
ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号４０）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号４３）
６×Ｈｉｓタグ：
ＨＨＨＨＨＨ（配列番号４４）
ＩＬ−１７結合性ＷＳ−ＬＩ１結合物質：
Figure 2015504038
 （配列番号４５）
Figure 2015504038
 （配列番号４６）
Figure 2015504038
 （配列番号４７）
ＰＸＲ結合性ＷＳ１結合物質：
Figure 2015504038
 （配列番号４８）
Figure 2015504038
 （配列番号４９）
図４の１０Ｆｎ３ループおよびスキャフォールド領域ペプチド
ＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧ（配列番号５８）
ＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫ（配列番号５１）
ＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号５２）
ＭＧＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳ（配列番号５３）
ＰＨＦＰＴＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳ（配列番号５４）
実施例２のＢＣループ配列
ＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧ（配列番号５５）
ＰＴＳＬＬＩＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲＹＹＲＩＴＹＧ（配列番号５６）
ＰＴＳＬＬＩＳＷＲＨＰＨＦＰＴＲＹＹＲＩＴＹＧ（配列番号５７）
修飾ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを持つＩＧＦ−１Ｒ結合性１０Ｆｎ３ドメイン
Figure 2015504038
 （配列番号６１）
ＰＸＲ結合性１０Ｆｎ３分子：
図１０のアドネクチン１〜８のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７０、７１、６２、６３、７２、１３、１４および１５に対応する。６×Ｈｉｓテール（配列番号４４）を持たない図１０のアドネクチン１〜８のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６４、６５、４８、４９、６６、６７、６８および６９に相当する。
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、これらの実施例は例示に過ぎず、本発明を限定しようとするものではない。本発明をその具体的実施形態に関して詳細に説明したが、その要旨と範囲から逸脱することなく、それらにさまざまな変化および変更を加えうることは、当業者には明らかであるだろう。
実施例１．フィブロネクチンベーススキャフォールドタンパク質の発現と精製
選択した結合物質をＰＥＴ９ｄベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３ ｐｌｙｓＳ細胞に形質転換した。形質転換細胞を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒｏｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）を含有する５ｍｌのＬＢ培地に、２４ウェルフォーマットで摂取し、３７℃で終夜成長させた（接種物培養）。２００μｌの接種物培養を吸引して、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する５ｍｌ（２４ウェルフォーマット）のＴＢ終夜発現培地（ＴＢ−Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉａ）（自己誘導）に移すことにより、生産培養を樹立した。培養物を３７℃で４時間成長させた時点で、温度を１８℃に下げて、２０時間成長させた。４℃における２７５０ｇで１０分間の遠心分離によって、培養物を収穫した。
細胞ペレット（２４ウェルフォーマット）を、４５０μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル−ＥＤＴＡフリー（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭイミダゾール、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、３０μｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅ、２μｇ／ｍｌアプロチニン（ａｐｒｏｔｏｎｉｎ）、ｐＨ８．０）に再懸濁し、室温で１〜３時間振とうすることによって、溶解した。溶解物を清澄化し、９６ウェル１．２ｍｌキャチプレートを装着した９６ウェルＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｄ Ｕｎｉｆｌｉｔｅｒに移すことによって９６ウェルフォーマットに移し替え、陽圧によって濾過した。清澄化した溶解物を、平衡化緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で平衡化しておいた９６ウェルＨｉｓＰｕｒコバルトプレート（Ｃｏｂａｌｔ Ｐｌａｔｅ）に移し、５分間インキュベートした。未結合材料を陽圧によって除去した。０．３ｍｌ／ウェルの洗浄緩衝液＃１（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を使って樹脂を２回洗浄し、各洗浄液は陽圧によって除去した。溶出に先立って、各ウェルを５０μｌの溶出緩衝液（ＰＢＳ＋２０ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、５分間インキュベートし、この洗浄液を陽圧によって捨てた。さらに１００μｌの溶出緩衝液を各ウェルに適用することによってタンパク質を溶出させた。室温で３０分後に、プレートを２００ｇで５分間遠心分離し、溶出したタンパク質を、溶出前に溶出キャッチプレートの底に加えられた５μｌの０．５Ｍ ＭｇＣｌ２が入っている９６ウェルキャッチプレートに収集した。溶出したタンパク質を、総タンパク質アッセイを使ってＳＧＥをタンパク質標準として定量した。ＳＧＥは、ＦＧループ中のＲＧＤ配列がＳＧＥに変化している野生型１０Ｆｎ３ドメインである。
実施例２．１０Ｆｎ３ドメインポリペプチドの免疫原性の特徴づけ
適応免疫応答は、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって内部に取り込まれたタンパク質のプロセシングおよび消化で開始される。ＡＰＣは、内部に取り込まれたタンパク質を短いペプチドに切り取り、そのペプチドをその表面ＭＨＣクラスＩＩ分子上にディスプレイする。ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド結合部位はコッペパンのように長くて細く、そのペプチドを長く伸びた形式で保持し、一次結合部位には９アミノ酸分の余地がある（そして一般的にはペプチドのどちらの側の短いテールにも対応できる）。ペプチド結合の決定においては、ＭＨＣ結合部位内の一定のポケットが支配的である。これらのポケットは、アンカリングされる９マーペプチドの部分におけるアミノ酸位置１、４、６、および９に対応する。これら４つの位置のそれぞれに好ましい側鎖を有するペプチドは一般にＨＬＡ（ＭＨＣクラスＩＩ分子）によく結合するであろう。
位置１は、ペプチドとＨＬＡ分子との間の結合に関与する最も重要な「アンカー残基」であると考えられている。位置１は一般的には疎水性側鎖を好むので、ＨＬＡに高頻度に結合する９マーはＶ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、またはＷで始まる。他の位置ははるかに可変であり、異なるＨＬＡアレルは各部位に異なるアミノ酸のセットを好む。本明細書に記載のポリペプチドの免疫原性を、インビトロ法とインシリコ法の両方を使って評価した。
Ａ−ヒト白血球抗原（「ＨＬＡ」）結合のインビトロ決定
この実験では、野生型または改変型１０Ｆｎ３ドメイン配列の異なる領域に対応する合成ペプチドをＨＬＡ結合アッセイで評価した。類似するＨＬＡ結合アッセイがＲｅｉｊｏｎｅｎ Ｈ， Ｋｗｏｋ ＷＷ「Ｕｓｅ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ ｉｎ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９（３）：２８２−８ （２００３）に記載されている。ＨＬＡ結合アッセイで試験した各実験ペプチドは、各ループのＮ末端側およびＣ末端側に隣接する追加のアミノ酸を有する野生型１０Ｆｎ３ドメインノースポールループ（ＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ）ペプチドセグメント（配列番号５８、５１および５２）、ＢＣループのＮ末端側に位置する野生型１０Ｆｎ３ドメイン由来のスキャフォールド領域（配列番号５３）またはＢＣループ（配列番号５４）のＣ末端側に位置する改変型１０Ｆｎ３ドメイン由来のスキャフォールド領域ペプチドセグメントのいずれかであった。実験ペプチドを、アッセイにおいて所望する濃度の５０倍の濃度で、１００％ＤＭＳＯに溶媒和させた。次に、ペプチド反応緩衝液に希釈し、１２８μＭから２μＭまで連続的にタイトレートした。
ＨＬＡ結合アッセイでは、５つの異なるＨＬＡアレル分子のそれぞれ（ＤＲＢ＊０１０１；ＤＲＢ＊０３０１；ＤＲＢ＊０４０１；ＤＲＢ＊０７０１またはＤＲＢ＊１５０１アレルのいずれか）を、９６ウェルプレートのウェルに、非標識実験ペプチドおよびユーロピウム標識対照（競合物質）ペプチドと共に、個別に投入した。その結合混合物を、定常平衡状態に到達するようにウェル中で２４時間インキュベートした。次に、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上に、ＨＬＡ分子複合体を捕捉した。結合したＨＬＡ−標識対照ペプチドを、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ３（商標）ユニット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により、時間分解蛍光法で測定し、６１５ｎｍで評価した。実験ペプチドの結合を、標識対照ペプチドの阻害百分率（１００×実験蛍光／対照蛍光）として表した。各濃度における標識対照ペプチドの阻害パーセントから、試験した５つのアレルに対し、各実験ペプチドについて、ＩＣ５０曲線を導き出した。これらの実験の結果を図４に図解する。
図４に示すように、ＢＣループペプチドは、試験した５つのアレルのうちの４つに高いアフィニティで結合することが観察され、これがタンパク質内の免疫優性配列であることが示唆された。対照的に、ＤＥループおよびＦＧループに対応する合成ペプチドは、全般に、結合するＨＬＡアレルが少なく、アフィニティも低かった。それゆえに、ＤＥループとＦＧループは、野生型１０Ｆｎ３タンパク質内の免疫優性配列ではないと予測される。
図４に示すとおり、配列番号５３のスキャフォールド領域ペプチドは、５つのＨＬＡアレルに高いアフィニティで結合し、一方、配列番号５４のスキャフォールド領域ペプチドは、４つのＨＬＡアレルに高いアフィニティで結合することが見いだされた。これらの結果は、１０Ｆｎ３ドメインのＢＣループに隣接するスキャフォールド領域が免疫優性領域であることを示唆している。図４に示す配列番号５３および５４の配列の下線部分は、これらの配列の免疫優性部分であると予測される。
免疫優性ループであることがわかったＢＣループを、同じＨＬＡ結合アッセイを使ってさらに評価した。具体的には、アッセイを使って３つのＢＣループ配列変異体ペプチド（配列番号５５〜５７）を調べ、試験したＨＬＡアレルには、ほとんど同一の強い結合パターンを示すことを見いだした。配列番号５５のペプチド配列はヒト野生型配列であり、配列番号５６および５７は、２つの異なるターゲットに結合するように工学的に改変された１０Ｆｎ３ドメイン由来のＢＣループ領域である。類似する結合パターンが共有のモチーフを反映するのだと仮定して、潜在的アンカー残基の同定を助けるために、配列をアラインメントした。試験した異なるＢＣループ配列の潜在的位置１残基に下線を付す：
Figure 2015504038
これら３つのペプチドの共通配列部分は、可変ＢＣループに先行するβストランドＢと、ＢＣループに続くβストランドＣである。これらの部分はそれぞれ数個の疎水性残基（潜在的位置１アンカー）を有するが、βストランドＣ中のそれには、少なくとも８つのさらなる残基が後続しておらず、それゆえにＭＨＣ結合のアンカー残基にはなりえない。可変ＢＣループ中の疎水性残基は、これら３つのペプチドでは異なる位置にあるため、共通のβストランドＣ残基を持つ単一の９マー位置をＢＣループ中にアンカリングすることができる可能性は低い。それゆえにこれらの結果は、βストランドＢがペプチドアンカーをデザインするのに役立つはずであることを示唆している。
最も可能性の高いアンカー残基の位置は、「ＬＬＩ」（配列番号１の位置１８〜２０）であると思われる。これらは、ＢＣループ残基に先行する固定されたβストランドＢ残基のストレッチを含むからである。例えば最初のＬから始まる９マーがペプチドをアンカリングしているのだとすると、４番目の位置は常にＳになり、これは多くのＨＬＡアレルへの結合にとって好ましい。
多くの完全ヒト配列がＭＨＣによってディスプレイされるものの、免疫系はそれらを「自己」と認識し、免疫応答を開始しないことに留意すべきである。さらに、１０Ｆｎ３に関して同一の配列を有するカニクイザルでは、さまざまな異なる１０Ｆｎ３ポリペプチドの投与時に免疫応答が生成するが、野生型１０Ｆｎ３の投与時には免疫応答が生じない。これは、カニクイザルがヒト野生型１０Ｆｎ３配列を、免疫応答を開始する必要のない「自己」タンパク質と認識することを示している。
Ｂ−ＨＬＡ結合のインシリコ予測
ＨＬＡ結合は、例えばＥｐｉＭａｔｒｉｘを使って、インシリコで予測することができる。ＥｐｉＭａｔｒｉｘは、ＥｐｉＶａｘによって開発されたプロプライエタリーコンピュータアルゴリズムであり、推定ＨＬＡ結合モチーフの存在についてタンパク質配列をスクリーニングするために使用される。インプット配列は、オーバーラップする９マーフレームに解剖され、ここでは、各フレームが最後のフレームと８アミノ酸分オーバーラップする。次に、その結果生じたフレームのそれぞれを、８つの共通するクラスＩＩ ＨＬＡアレル（ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１３０１，、およびＤＲＢ１＊１５０１）のパネルに対して、予測される結合アフィニティについてスコア化する。生スコアは、大量のランダム生成ペプチド試料のスコアに対して標準化される。その結果生じる「Ｚ」スコアが報告される。１．６４を超えるＥｐｉＭａｔｒｉｘ Ｚ−スコアを持つ９マーペプチドはいずれも、推定ＨＬＡ結合モチーフとみなす。
ＥｐｉＭａｔｒｉｘアルゴリズムを使って、配列番号６１に示すアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３ポリペプチドからペプチドエピトープが予測された。結果は、１０Ｆｎ３ポリペプチドのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが、それぞれ２１．３、０．９および１．１のＺスコアを有することを示した。
上記のインビトロおよびインシリコＨＬＡ結合結果は、βストランドＢ／ＢＣループセグメントがＨＬＡ結合のための「ホットスポット」でありうることを示唆している。βストランドＢ／ＢＣループセグメントは、ＢＣループ配列中の少なくとも一部の変異体はＨＬＡへの結合にほとんど相違を生じないような形で、βストランドＢ中のアミノ酸によってＭＨＣ分子に強くアンカリングされうる。強いアンカーは、このセグメントの脱免疫化を困難にしうる。しかし、ストレッチ全体が野生型配列である場合、これは、免疫系によって自己と認識され、免疫応答を開始しないはずである。それゆえに、１０Ｆｎ３ドメインポリペプチドライブラリーは、ＢＣループを野生型のまま残すことによって、または最低限、Ｌ１８、Ｌ１９、またはＩ２０でアンカリングされる任意の９マーペプチドが野生型のままであるように、配列番号１または６のＤ２３からＴ２８までの残基を野生型のまま残すことによって、低下した免疫原性を有するようにデザインすることができる。ＢＣループの全てまたは実質的部分が野生型のままであるライブラリーの例を図９Ａに示す。ＢＣループのＮ末端側領域のさまざまな部分が野生型のまま残されているライブラリーの例を図９Ｂに示す。配列番号１のＤ２３〜Ｔ２８に対応する残基が野生型のまま残されている１０Ｆｎ３結合物質の具体例を実施例３で述べる。あるいは、ＢＣループが修飾される場合、低減した免疫原性は、この領域中の強いアンカーを破壊することによって、すなわちＢＣループ中の修飾に加えて、βストランドＢにも修飾を加えることによって、達成しうる。アンカーが除去されたライブラリーの例として、位置Ｌ１９および／またはＳ２１が多様化されることで、ライブラリーのメンバーがアンカー残基を欠く可能性が増加しているライブラリーが挙げられる。アンカー残基が除去されたライブラリーの例を図９Ｃに示す。
実施例３．ウエストサイド結合物質の生成
修飾１０Ｆｎ３ドメインを含むウエストサイド（「ＷＳ」）結合物質ポリペプチドのライブラリーを、ｍＲＮＡディスプレイ法（Ｘｕ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２００２ Ａｕｇ；９（８）：９３３−４２）を使って、ターゲットとしてのマウスＩＬ−１７、マウスＤＬＬ４またはヒトＰＸＲへの結合についてスクリーニングした。ＢＣループ配列が野生型のまま残されるように、ＷＳ結合物質をデザインした。ＷＳ１ライブラリーデザイン（図９Ａ参照）を使って、ターゲットヒトＰＸＲへの結合物質を同定し、ＷＳ−ＬＩ１ライブラリーデザイン（図９Ａ参照）を使って、ターゲットマウスＩＬ１７またはマウスＤＬＬ４への結合物質を同定した。ターゲット結合をｑＰＣＲによってモニタリングし、特異的結合シグナルが観察された場合は、集団をクローニングし、大腸菌で発現させた。
実施例４．マウスＤＬＬ４に結合する能力を有するＷＳ−ＬＩ１結合物質によるＤＬＬ４とＮｏｔｃｈ１との相互作用の妨害
ＤＬＬ４はＮｏｔｃｈ１タンパク質のリガンドである。ＷＳ−ＬＩ１デザインを有する１０Ｆｎ３ポリペプチドの、Ｎｏｔｃｈ１とマウスＤＬＬ４との間の相互作用を妨害する能力を、競合Ｂｉａｃｏｒｅ実験を使って評価した。およそ４５００ＲＵのＮｏｔｃｈ１−ＦｃをＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に固定化した。２μＭのＷＳ−ＬＩ１結合物質を、ポリペプチドを加えていない対照と共に、ＨＢＳＰ緩衝液および５ｍＭ ＣａＣｌ２中で、２０ｎＭマウスＤＬＬ４と平衡化した。各試料をチップ上に流し、マウスＤＬＬ４の結合を、ＷＳ−ＬＩ１ポリペプチドを添加していない対照と比較した。したがって、シグナルの減少は、Ｎｏｔｃｈ１：マウスＤＬＬ４相互作用の阻害に対応した。各試料ラン間に、ＨＢＳＰ（ｐＨ７．４）および５０ｍＭ ＥＤＴＡでの３０秒間の洗浄を２回行うことで、チップを再生した。この実験の結果を図５に示す。配列番号３および４の配列を有するポリペプチドは、それぞれＮｏｔｃｈ１とマウスＤＬＬ４との間の相互作用の１００％競合をもたらすことがわかった。配列番号５の配列を有するポリペプチドは、Ｎｏｔｃｈ１とマウスＤＬＬ４との間の相互作用の７５％競合を誘発することができた。
実施例５．マウスＤＬＬ４に結合する能力を有するＷＳ−ＬＩ１結合物質のサイズ排除クロマトグラフィー分析
サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、実施例４で観察された競合結果が試験したＷＳ−ＬＩ１結合物質の単量体型によるものであることを証明した。配列番号３または４のいずれかのアミノ酸配列を有するＷＳ−ＬＩ１結合物質が主として単量体型であったのに対し、配列番号５のアミノ酸配列を有するＷＳ−ＬＩ１結合物質は、単量体型タンパク質と凝集タンパク質との混合物を含有していた。この実験の結果を図６に示すが、これは実施例４で試験したＷＳ−ＬＩ１結合物質が単量体型分子種として作用していたことを表し、これらの結合物質が、安定で、よく折り畳まれたポリペプチドとして存在することを示唆している。
実施例６．マウスＤＤＬ４に結合する能力を有するＷＳ−ＬＩ１結合物質の安定性
実施例４で述べたポリペプチドの安定性を、熱シフト蛍光ベースアッセイ（ＴＳＦ）によって評価した。配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドは５９℃で転移を起こした。配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドは４９℃で転移を起こした。配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドでは転移は観察されなかった。
実施例７．マウスＩＬ−１７に結合する能力を有するＷＳ−ＬＩ１結合物質によるマウスＩＬ−１７とマウスＩＬ−１７ＲＡとの間の相互作用の妨害
ＩＬ−１７はＩＬ−１７受容体Ａタンパク質ＩＬ−１７ＲＡのリガンドである。ＷＳ−ＬＩ１デザインを有する１０Ｆｎ３ドメインの、マウスＩＬ−１７とマウスＩＬ−１７ＲＡとの間の相互作用を妨害する能力を、競合Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ実験を使って評価した。ストレプトアビジンドナービーズ、抗ヒトＩｇＧアクセプタービーズ、１．５ｎＭマウスＩＬ−１７ＲＡ−Ｆｃおよび２．５ｎＭビオチン化マウスＩＬ−１７を、製造者の指示に従って合わせることで、ロバストなＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎシグナルを得た。配列番号４５、４６または４７のいずれかの配列を有するポリペプチドを、１μＭの濃度で混合物に加えた時にこのシグナルを阻害するそれぞれの能力について評価した。配列番号４５の配列を有するポリペプチドはＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎシグナルの８３％阻害を引き起こし、配列番号４６の配列を有するポリペプチドはＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎシグナルの９４％阻害を引き起こし、配列番号４７の配列を有するポリペプチドはＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎシグナルの８１％阻害を引き起こした。これらの結果は、ＩＬ−１７に結合してマウスＩＬ−１７とその受容体との間の相互作用を効果的に阻害する能力を有する１０Ｆｎ３ドメインを、ＷＳ−ＬＩ１ライブラリーデザインがもたらすことを実証している。
実施例８．マウスＩＬ−１７に結合する能力を有するＷＳ−ＬＩ１結合物質のサイズ排除クロマトグラフィー分析
サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、実施例７で観察された競合結果が試験したＷＳ−ＬＩ１結合物質の単量体型によるものであることを証明した。配列番号４５、４６または４７のいずれかを有するＷＳ−ＬＩ１結合物質は主として単量体型であった。この実験の結果を図７に示すが、これは実施例７で試験したＷＳ−ＬＩ１結合物質が単量体型分子種として作用していたことを表し、結合物質が、安定で、よく折り畳まれたポリペプチドとして存在することを示唆している。
実施例９．マウスＩＬ−１７に結合する能力を有するＷＳ−ＬＩ１結合物質の安定性
実施例７で述べたポリペプチドの安定性を、ＴＳＦによって評価した。配列番号４５のアミノ酸配列を有するポリペプチドは５１℃で転移を起こした。配列番号４６のアミノ酸配列を有するポリペプチドは６０℃で転移を起こした。配列番号４７のアミノ酸配列を有するポリペプチドでは転移は観察されなかった。
実施例１０．ヒトＰＸＲに結合する能力を有するＷＳ１結合物質の結合特性の特徴づけ
ＰＸＲに結合する能力を有するＷＳ１結合物質を、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイとＧＳＴタグ付きＰＸＲとを使って特徴づけた。１４０００ＲＵの抗ＧＳＴ抗体をＢｉａｃｏｒｅチップ上に固定化し、チップ上に５０ｎＭ溶液を５μＬ／分の速度で３分間流すことによって、ＧＳＴ−ＰＸＲを捕捉した。ＷＳ１結合物質を０．５〜２μＭの濃度でチップ上に流し、ＰＸＲを欠く対照との比較で、結合を観察した。各ランの間に、１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）による各３０秒間で２回の洗浄を使って、チップをストリッピングし、新鮮なＧＳＴ−ＰＸＲを捕捉した。これらの条件下で、配列番号４８のアミノ酸配列を有するＷＳ１結合物質は１４６ＲＵがＧＳＴ−ＰＸＲに結合し、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＷＳ１結合物質は８１ＲＵがＧＳＴ−ＰＸＲに結合した。これらの結果は、配列番号４８または４９のどちらかのアミノ酸配列を有するＷＳ１結合物質が、ＧＳＴ−ＰＸＲに結合する能力を有することを実証している。
実施例１１．ヒトＰＸＲに結合する能力を有するＷＳ１結合物質のサイズ排除クロマトグラフィー分析
サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、実施例１０で観察された結合結果が試験したＷＳ１結合物質の単量体型によるものであることを証明した。配列番号４８または４９のどちらかのアミノ酸配列を有するＷＳ１結合物質は主として単量体型であった。この実験の結果を図８に示すが、これは実施例１０で試験したＷＳ１結合物質が単量体型分子種として作用していたことを表し、結合物質が、安定で、よく折り畳まれたポリペプチドとして存在することを示唆している。
実施例１２．ヒトＰＸＲへの１０Ｆｎ３ポリペプチド結合の配列および結合特性
この実施例では、ヒトＰＸＲリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合するさらに６つの１０Ｆｎ３ポリペプチドを記載する。これらの６つのポリペプチドおよび実施例１０に記載した２つのポリペプチド（配列番号４８および４９を有するもの）の結合特性も提供する。
さまざまなライブラリーをスクリーニングすることによって、図１０に示すアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３ポリペプチドが同定された。例えばアドネクチン−１はＮＰ１ライブラリーから単離された（図９Ｃ参照）。１０Ｆｎ３ポリペプチドを次のように合成した。１０Ｆｎ３ポリペプチドをコードする核酸をｐＥＴ９Ｄベクターにクローニングし、次に大腸菌中、２０℃で発現させた。Ｎｉ−アガロースアフィニティークロマトグラフィーを使って溶解物を一段階で精製した。
１０Ｆｎ３ポリペプチドのＫＤ値は、抗ＧＳＴ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が固定化されたチップに捕捉されているヒトＰＸＲ−ＧＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に、一連の濃度の１０Ｆｎ３ポリペプチドを注入することにより、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００計器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法で決定した。速度論的サイクル間のチップ表面の再生は、１０ｍＭグリシン（ｐＨ２）を使って行った。どちらの速度論的パラメータも、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ソフトウェアを使って計算した。結果を表１に示す。
［表１］ヒトＰＸＲに対するアドネクチン１〜８の結合特性
Figure 2015504038
アドネクチン−１は、ヒトＰＸＲと小分子との共結晶化シャペロンとして効果的に使用され、ＰＸＲのリガンド結合ドメインに結合することが示された。Ｘ線データは、小分子とＰＸＲリガンド結合ドメインとの間の相互作用に関する情報を与えた。
実施例１３．ＦＧループ中のＲＧＤの欠如は、フィブロネクチンおよびビトロネクチンへの１０Ｆｎ３ポリペプチドの結合を妨げる
組換えヒトインテグリンαＶβ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を４０μｇ／ｍＬになるように酢酸緩衝液ｐＨ５．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に希釈してから、標準的なアミンカップリング技法を使ってＣＭ７チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定化した。５００ｎＭフィブロネクチン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、インディアナ州インディアナポリス）およびビトロネクチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）ならびに５μＭの非結合性対照１０Ｆｎ３分子（配列番号６からなり、Ｎ末端にＭＧが追加されていて、ＲＧＤをＲＧＥに変化させる単一アミノ酸置換を持つ）または標的１０Ｆｎ３分子（ＲＧＤモチーフを含有しない変異ＦＧループを有するもの）のどちらかを、固定化インテグリンの上に流した。結合ＲＵを試料注入の最後に収集した。結果は、ＦＧループ中のＲＧＤの欠如が、フィブロネクチンおよびビトロネクチンへの１０Ｆｎ３分子の結合の消失をもたらすことを示している。
実施例１４．さまざまなライブラリーから得られる分子の特徴
この実施例では、１１個の異なるライブラリーから得られる分子のさまざまな特徴を示す。以下のライブラリーを作成した。
・ＬＩ−１ライブラリー：これは、ライブラリーＬＩ−１（ａ）、ＬＩ−１（ｂ）およびＬＩ−１（ｃ）の混合物であって、図９Ｂに掲載するアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３分子を含む。下線を付したアミノ酸残基は、置換によって任意のアミノ酸に変異させたアミノ酸残基である。下線を付した残基は野生型残基であってもよい；
・ＬＩ−３ライブラリー：これは、図９Ｂ（「ＬＩ−３（ｂ）」）に掲載するアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３分子を含む。ここでは、囲み枠付きのアミノ酸残基を、任意のアミノ酸への置換または欠失または付加によって変異させた。囲み枠付きの残基は野生型残基であってもよい；
・ＷＳ−ＬＩ１ライブラリー：これは、図９Ａに示すアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３分子を含む。ここでは、囲み枠付きのアミノ酸残基を、任意のアミノ酸への置換または欠失または付加によって変異させた。囲み枠付きの残基は野生型残基であってもよい；
・ＬＩ−Ｓ９ライブラリー：これは、図９Ａに示すアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３分子を含む。ここでは、囲み枠付きの残基はアミノ酸の置換、付加または欠失によって変異させ、下線付きの残基は置換によって変異させた。反転表示した残基はＥに変化させる。囲み枠付きまたは下線付きの残基は野生型残基であってもよい；
・ＬＩ−Ｓ８ライブラリー：これは、図９Ａに示すアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３ｎ３分子を含む。ここでは、囲み枠付きの残基を置換、付加または欠失によって変異させた。反転表示した残基をＥに変化させる。囲み枠付きの残基は野生型残基であってもよい；
・ＮＰ４＿ＦＧライブラリー：これは、図９Ｃに示すアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３分子を含む。ここでは、囲み枠付きの残基をアミノ酸の置換、付加または欠失によって変異させ、下線付きの残基を置換によって変異させた。囲み枠付きまたは下線付きの残基は野生型残基であってもよい。このライブラリーは、ＦＧ、ＦおよびＧ中の残基だけを変異させたＮＰ４ライブラリーに相当する；
・ＷＳ２’＿ＣＤライブラリー：これは、図９Ａに示すアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３分子を含む。ここでは、囲み枠付きの残基を、アミノ酸の置換、付加または欠失によって変異させ、下線付きの残基を置換によって変異させた。囲み枠付きまたは下線付きの残基は野生型残基であってもよい。このライブラリーは、ＣＤ、ＣおよびＤ中の残基だけを変異させたＷＳ２’ライブラリーに相当する；
・ＮＰ１’ライブラリー：これは、図９Ｃに示すアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３分子を含む。ここでは、囲み枠付きの残基を、アミノ酸の置換、付加または欠失によって変異させ、下線付きの残基を置換によって変異させた。囲み枠付きまたは下線付きの残基は野生型残基であってもよい；
・ＮＰ４ライブラリー：これは、図９Ｃに示すアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３分子を含む。ここでは、囲み枠付きの残基をアミノ酸の置換、付加または欠失によって変異させ、下線付きの残基を置換によって変異させた。囲み枠付きまたは下線付きの残基は野生型残基であってもよい；および
・ＷＳ２’ライブラリー：これは、図９Ａに示すアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３分子を含む。囲み枠付きの残基をアミノ酸の置換、付加または欠失によって変異させ、下線付きの残基を置換によって変異させた。囲み枠付きまたは下線付きの残基は野生型残基であってもよい。
各ライブラリーからのクローンを発現させ、精製した。その結果生じた１０Ｆｎ３分子を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸに、製造者の推奨に従って低分子量タンパク質ラダーと共にかけた。同じくＬａｂＣｈｉｐ ＧＸにかけたＳＧＥの標準曲線から、１０Ｆｎ３分子の濃度を推定した。標準曲線の濃度より高い濃度を持つ試料は、曲線外高値（ｏｆｆ−ｃｕｒｖｅ−ｈｉｇｈ）（ＯＣＨ）と分類した。各ライブラリーについて、ＯＣＨウェルのパーセントおよび平均濃度を決定した。結果は、ＯＣＨウェルの分率および測定可能な試料の平均濃度が類似するパターンに従うことを示している。
各ライブラリーからの１０Ｆｎ３分子の耐凝集性も試験した。各ライブラリーから１９〜２００個のクローンを、凝集および保持時間について、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、製造者の推奨に従ってアッセイした。各クローンについてＳＥＣクロマトグラムを積分し、１７ｋＤａ標準の時間と１．３ｋＤａ標準の時間との間に溶出したピークについて評価した。この保持時間ウインドウ内に９０％を上回る面積を有するクローンには１のＳＥＣスコアを、５０％〜９０％には２のスコアを、５％〜５０％には３のスコアを、そして５％未満には４のスコアを与えた。ＳＥＣスコア１または２の分率は耐凝集性の尺度であり、分率ＳＥＣ４はＳＥＣスクリーニングに対する負荷の尺度である。結果は、ＳＥＣ１または２の分率およびＳＥＣ４の分率が、ほぼ逆のパターンに従うことを示している。
各ライブラリーからのクローンのターゲット結合をＥＬＩＳＡによって決定した。クローンの標的であるタンパク質をＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに２．５μｇ／ｍＬでコーティングした。プレートをカゼイン（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３７５３２）でブロッキングしてから、１０Ｆｎ３分子と共にインキュベートした。結合したクローンは、Ｈｉｓタグにより、ＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃ｍＡｂ０５０Ｈ）を使って検出した。ヒットを、ブランクウェルの２倍を上回るシグナルを与えるものとして決定した。ヒットの分率はスクリーニングに対する負荷の尺度である。全てのライブラリーに少なくとも予想される数のヒットがあった。
各ライブラリーのメンバーが結合するエピトープが、複数存在するかどうかも決定した。ここでは、３つのターゲットについて、実施例７において言及した競合Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイを行った。これらのターゲットについて、証明済みのターゲット結合物質にとっての競合物質と非競合物質とが存在することにより、複数エピトープのカバーが立証された。マルチドメインターゲットの１つについては、個々のサブドメインの組換えバージョンによるＥＬＩＳＡを使って、複数エピトープの結合が実証された。複数のエピトープが見つかるターゲットの分率は、ライブラリー中に多様な生物学的活性が見つかる確率の尺度である。異なるライブラリーによる複数のターゲットに対する複数エピトープカバーという結果は、ブロッキングの多様性を示す。
引用による組込み
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Claims (226)

  1. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、（ｉ）野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）の対応するループとの比較で、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループから選択される少なくとも１つのノースポールループのアミノ酸配列中の修飾と、（ｉｉ）野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループとの比較で、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループから選択される少なくとも１つのサウスポールループのアミノ酸配列中の修飾とを含み、前記少なくとも１つの修飾ノースポールループおよび前記少なくとも１つの修飾サウスポールループが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
  2. ノースポールループの少なくとも１つまたはサウスポールループの少なくとも１つが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. ＢＣループの少なくとも一部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. ＢＣループの最初の３残基が野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループ中の対応する残基と同じである、請求項３に記載のポリペプチド。
  5. ＢＣループの最初の４残基が野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループ中の対応する残基と同じである、請求項３に記載のポリペプチド。
  6. ＢＣループの最初の５残基が野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループ中の対応する残基と同じである、請求項３に記載のポリペプチド。
  7. ＢＣループが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のポリペプチド。
  8. ＢＣループ中に追加の修飾を有する等価なポリペプチドと比較して、低減した免疫原性を有する、請求項３〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. ＦＧループがＲＧＤインテグリン結合部位を含有しない、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. 少なくとも１つのβストランドのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドのアミノ酸配列との比較で、修飾されている、請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチド。
  11. 修飾βストランドが、１０Ｆｎ３ドメインの直線的配列において、修飾ループの一つに隣接して位置する、請求項１０に記載のポリペプチド。
  12. 修飾βストランドが、１０Ｆｎ３ドメインの直線的配列において、修飾ノースポールループと修飾サウスポールループとの間に位置する、請求項１０に記載のポリペプチド。
  13. 修飾ノースポールループ、修飾βストランド、および修飾サウスポールループが、１０Ｆｎ３ドメインの直線的配列において、互いに隣接して位置する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  14. 修飾βストランドがターゲットへの結合に寄与する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  15. 疎水性コア残基が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）との比較で、修飾されていない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  16. 修飾ループの少なくとも１つのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されたものである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  17. 修飾ループの少なくとも１つのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列との比較で、長さが短縮されたものである、
    請求項１〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  18. Ｃ末端テールのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＣ末端テールのアミノ酸配列との比較で、修飾されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  19. 最初の７アミノ酸残基のアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の最初の７アミノ酸残基のアミノ酸配列との比較で、修飾されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  20. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）との比較で、Ｎ末端から１〜７アミノ酸が切断されているか、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）との比較で、Ｃ末端から１〜９アミノ酸が切断されているか、またはその両方である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  21. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％の同一性を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  22. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％の同一性を有する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  23. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、１０Ｆｎ３ドメインが、（ｉ）野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）の対応するループとの比較で、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループから選択される少なくとも１つのノースポールループのアミノ酸配列中の修飾と、（ｉｉ）野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループとの比較で、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループから選択される少なくとも１つのサウスポールループのアミノ酸配列中の修飾とを含む、ライブラリー。
  24. それぞれが異なる１０Ｆｎ３ドメイン配列を含む少なくとも１０５個のポリペプチドを含む、請求項２３に記載のライブラリー。
  25. ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項２３または２４に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
  26. 請求項２５に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
  27. ５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する、請求項２６に記載の単離されたポリペプチド。
  28. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、（ｉ）野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループとの比較で、ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、またはＦＧの少なくとも１つのアミノ酸配列中の修飾と、（ｉｉ）野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドとの比較で、少なくとも１つのβストランドのアミノ酸配列中の修飾とを含み、前記少なくとも１つの修飾ループおよび前記少なくとも１つの修飾βストランドが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
  29. 修飾βストランドが、１０Ｆｎ３ドメインの直線的配列において、修飾ループに隣接している、請求項２８に記載のポリペプチド。
  30. 少なくとも２つのβストランドが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドとの比較で、修飾されたアミノ酸配列を有する、請求項２８または２９に記載のポリペプチド。
  31. 修飾βストランドが、１０Ｆｎ３ドメインの直線的配列において、修飾ループの両側に隣接する、請求項３０に記載のポリペプチド。
  32. 両方の修飾βストランドがターゲットへの結合に寄与する、請求項３０または３１に記載のポリペプチド。
  33. 少なくとも２つのループが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループとの比較で、修飾されたアミノ酸配列を有する、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  34. 少なくとも１つの修飾ループが、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループから選択されるノースポールループであり、少なくとも１つの修飾ループが、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループから選択されるサウスポールループである、請求項３３に記載のポリペプチド。
  35. 両方の修飾ループがターゲットへの結合に寄与する、請求項３３または３４に記載のポリペプチド。
  36. ノースポールループの少なくとも１つまたはサウスポールループの少なくとも１つが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列を有する請求項２８〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  37. ＢＣループの少なくとも一部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  38. ＢＣループの最初の３残基が野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループ中の対応する残基と同じである、請求項３７に記載のポリペプチド。
  39. ＢＣループの最初の４残基が野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループ中の対応する残基と同じである、請求項３７に記載のポリペプチド。
  40. ＢＣループの最初の５残基が野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループ中の対応する残基と同じである、請求項３７に記載のポリペプチド。
  41. ＢＣループが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項３７に記載のポリペプチド。
  42. ＢＣループ中に追加の修飾を有する等価なポリペプチドと比較して、低減した免疫原性を有する、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  43. ＦＧループがＲＧＤインテグリン結合部位を含有しない、請求項２８〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  44. 疎水性コア残基が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）との比較で、修飾されていない、請求項２８〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  45. 少なくとも１つの修飾ループのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されたものである、請求項２８〜４４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  46. 少なくとも１つの修飾ループのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列との比較で、長さが短縮されたものである、請求項２８〜４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  47. Ｃ末端テールのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＣ末端テールのアミノ酸配列との比較で、修飾されている、請求項２８〜４６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  48. 最初の７アミノ酸残基のアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の最初の７アミノ酸残基のアミノ酸配列との比較で、修飾されている、請求項２８〜４７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  49. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）との比較で、Ｎ末端から１〜７アミノ酸が切断されているか、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）との比較で、Ｃ末端から１〜９アミノ酸が切断されているか、またはその両方である、請求項２８〜４６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  50. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％の同一性を有する、請求項２８〜４９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  51. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％の同一性を有する、請求項２８〜５０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  52. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、１０Ｆｎ３ドメインが、（ｉ）野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）の対応するループとの比較で、ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、またはＦＧの少なくとも１つのアミノ酸配列中の修飾と、（ｉｉ）野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドとの比較で、少なくとも１つのβストランドのアミノ酸配列中の修飾とを含む、ライブラリー。
  53. それぞれが異なる１０Ｆｎ３ドメイン配列を含む少なくとも１０５個のポリペプチドを含む、請求項５２に記載のライブラリー。
  54. ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項５２または５３に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
  55. 請求項５４に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
  56. ５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する、請求項５５に記載の単離されたポリペプチド。
  57. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列との比較で、ＣＤおよびＦＧループのアミノ酸配列に修飾を含み、ＣＤループおよびＦＧループが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
  58. ＣＤループの１１アミノ酸のうちの少なくとも４アミノ酸が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＣＤループの配列との比較で、修飾されている、請求項５７に記載のポリペプチド。
  59. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基４６または４７に対応するＣＤループの１つ以上のアミノ酸残基が、その位置における野生型アミノ酸と同じである、請求項５７または５８に記載のポリペプチド。
  60. ＦＧループの１３アミノ酸のうちの少なくとも１１アミノ酸が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループの配列との比較で、修飾されている、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  61. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基７５または８７に対応するＦＧループの１つ以上のアミノ酸残基が、その位置における野生型アミノ酸と同じである、請求項６０に記載のポリペプチド。
  62. ＣＤループ、ＦＧループ、またはその両方のアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されている、請求項５７〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  63. ＣＤループ、ＦＧループ、またはその両方のアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列との比較で、長さが短縮されている、請求項５７〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  64. ＣＤループおよびＦＧループの少なくとも１つのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループとの比較で、長さが延長されており、かつＣＤループおよびＦＧループの少なくとも１つのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループとの比較で、長さが短縮されている、請求項５７〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  65. βストランドＣおよびβストランドＤのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドの配列との比較で、修飾されている、請求項５７〜６４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  66. ＢＣループの少なくとも一部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループの配列との比較で、修飾されている、請求項５７〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  67. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基３０および３１に対応するＢＣループの１つ以上のアミノ酸残基が、その位置における野生型アミノ酸との比較で、修飾されている、請求項６６に記載のポリペプチド。
  68. βストランドＦおよびβストランドＧのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドの配列との比較で、修飾されている、請求項５７〜６７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  69. 修飾βストランドの１つ以上がターゲットへの結合に寄与する、請求項５７〜６８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  70. 修飾βストランドの全てがターゲットへの結合に寄与する、請求項６９に記載のポリペプチド。
  71. ＡＢ、ＤＥおよびＥＦループの１つ以上が野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項５７〜７０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  72. 疎水性コア残基が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）との比較で、修飾されていない、請求項５７〜７１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  73. ＢＣループの少なくとも一部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項５７〜７２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  74. ＢＣループの最初の３残基が野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループ中の対応する残基と同じである、請求項７３に記載のポリペプチド。
  75. ＢＣループの最初の４残基が野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループ中の対応する残基と同じである、請求項７３に記載のポリペプチド。
  76. ＢＣループの最初の５残基が野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループ中の対応する残基と同じである、請求項７３に記載のポリペプチド。
  77. ＢＣループの最初の６残基が野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループ中の対応する残基と同じである、請求項７３に記載のポリペプチド。
  78. ＢＣループが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループのアミノ酸配列を有する、請求項７３に記載のポリペプチド。
  79. ＢＣループ中に追加の修飾を有する等価なポリペプチドと比較して、低減した免疫原性を有する、請求項７３〜７８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  80. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列との比較で、ＣＤおよびＦＧループのアミノ酸配列に修飾を含む、ライブラリー。
  81. それぞれが異なる１０Ｆｎ３ドメイン配列を含む少なくとも１０５個のポリペプチドを含む、請求項８０に記載のライブラリー。
  82. ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項８０または８１に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
  83. 請求項８０に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
  84. ５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する、請求項８３に記載の単離されたポリペプチド。
  85. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列との比較で、ＣＤおよびＤＥループのアミノ酸配列に修飾を含み、ＣＤループおよびＤＥループが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
  86. ＥＦループのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＥＦループの配列との比較で、修飾されていて、ＥＦループがターゲットへの結合に寄与する、請求項８５に記載のポリペプチド。
  87. βストランドＣ、βストランドＤ、およびβストランドＦの１つ以上のアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドの配列との比較で、修飾されている、請求項８５または８６に記載のポリペプチド。
  88. 修飾βストランドの１つ以上がターゲットへの結合に寄与する、請求項８７に記載のポリペプチド。
  89. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の残基３６〜６６に対応するアミノ酸間の３１残基のうちの少なくとも２４残基が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項８５〜８８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  90. ＣＤループが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＣＤループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項８５〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  91. 疎水性コア残基が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）との比較で、修飾されていない、請求項８５〜９０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  92. ＦＧループがＲＧＤインテグリン結合部位を含有しない、請求項８５〜９１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  93. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列との比較で、ＣＤおよびＤＥループのアミノ酸配列に修飾を含む、ライブラリー。
  94. それぞれが異なる１０Ｆｎ３ドメイン配列を含む少なくとも１０５個のポリペプチドを含む、請求項９３に記載のライブラリー。
  95. ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項９３または９４に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
  96. 請求項９５に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
  97. ５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する、請求項９６に記載の単離されたポリペプチド。
  98. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）の対応するループの配列との比較で、ＥＦおよびＦＧループのアミノ酸配列に修飾を含み、ＥＦループおよびＦＧループが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
  99. ＡＢループのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＡＢループの配列との比較で、修飾されていて、ＡＢループがターゲットへの結合に寄与する、
    請求項９８に記載のポリペプチド。
  100. βストランドＡおよびβストランドＧの１つ以上のアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドの配列との比較で、修飾されている、請求項９８または９９に記載のポリペプチド。
  101. 修飾βストランドの１つ以上がターゲットへの結合に寄与する、請求項１００に記載のポリペプチド。
  102. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）の最初の７アミノ酸のアミノ酸配列または残基９３〜９７に対応するアミノ酸のアミノ酸配列が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項９８〜１０１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  103. 追加の修飾アミノ酸がターゲットへの結合に寄与する、請求項１０２に記載のポリペプチド。
  104. １０Ｆｎ３ドメインの最初の１５アミノ酸残基のうちの少なくとも１４アミノ酸残基が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項９８〜１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  105. ＥＦループのアミノ酸残基の５つのうちの少なくとも４つが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項９８〜１０４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  106. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）の残基８０〜９７に対応するアミノ酸間の１８残基のうちの少なくとも１５残基が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項９８〜１０５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  107. ＦＧループのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項９８〜１０６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  108. 疎水性コア残基が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）との比較で、修飾されていない、請求項９８〜１０７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  109. ＦＧループがＲＧＤインテグリン結合部位を含有しない、請求項９８〜１０８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  110. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列との比較で、ＥＦおよびＦＧループのアミノ酸配列に修飾を含む、ライブラリー。
  111. それぞれが異なる１０Ｆｎ３ドメイン配列を含む少なくとも１０５個のポリペプチドを含む、請求項１１０に記載のライブラリー。
  112. ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項１１０または１１１に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
  113. 請求項１１２に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
  114. ５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する、請求項１１３に記載の単離されたポリペプチド。
  115. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列との比較で、ＡＢおよびＦＧループのアミノ酸配列に修飾を含み、ＡＢループおよびＦＧループが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
  116. １０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドおよびループの配列との比較で、βストランドＡ、ループＡＢ、βストランドＢ、ループＦＧ、およびβストランドＧのアミノ酸配列に修飾を含み、修飾ループおよび修飾ストランドが同じターゲットへの結合に寄与する、請求項１１５に記載のポリペプチド。
  117. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）の最初の７アミノ酸のアミノ酸配列または残基９３〜９７に対応するアミノ酸のアミノ酸配列が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項１１５または１１６に記載のポリペプチド。
  118. 追加の修飾アミノ酸がターゲットへの結合に寄与する、請求項１１７に記載のポリペプチド。
  119. ＡＢループのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＡＢループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項１１５〜１１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  120. ＡＢループが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基１５および１８に対応するアミノ酸残基間に挿入または欠失を含有する、請求項１１５〜１１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  121. ＦＧループのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項１１５〜１２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  122. ＦＧループのうちの、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループのアミノ酸残基８４〜８７に対応する部分が、野生型ＣＤループの同じ部分との比較で、修飾されたアミノ酸配列を有する、請求項１１５〜１２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  123. ＦＧループが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基８３および８８に対応するアミノ酸残基間に、挿入または欠失を含有する、請求項１１５〜１２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  124. βストランドＢが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基１８および２０に対応するアミノ酸残基間に、挿入または欠失を含有する、請求項１１５〜１２３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  125. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の残基１〜１９に対応するアミノ酸間の１９残基のうち少なくとも１６残基が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項１１５〜１２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  126. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）の残基８４〜９７に対応するアミノ酸間の１４残基のうちの少なくとも１３残基が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項１１５〜１２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  127. ＢＣ、ＣＤ、ＤＥまたはＥＦループの１つ以上が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列を有する、請求項１１５〜１２６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  128. 疎水性コア残基が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）との比較で、修飾されていない、請求項１１５〜１２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  129. ＦＧループがＲＧＤインテグリン結合部位を含有しない、請求項１１５〜１２８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  130. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列との比較で、ＡＢおよびＦＧループのアミノ酸配列に修飾を含む、ライブラリー。
  131. それぞれが異なる１０Ｆｎ３ドメイン配列を含む少なくとも１０５個のポリペプチドを含む、請求項１３０に記載のライブラリー。
  132. ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項１３０または１３１に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
  133. 請求項１３２に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
  134. ５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する、請求項１３３に記載の単離されたポリペプチド。
  135. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドおよびループの配列との比較で、ループＣＤ、ループＥＦ、βストランドＦ、およびβストランドＧのアミノ酸配列に修飾を含み、修飾ループおよび修飾ストランドが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
  136. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）の残基９３〜９７に対応するアミノ酸のアミノ酸配列が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項１３５に記載のポリペプチド。
  137. 追加の修飾アミノ酸が、ターゲットへの結合に寄与する、請求項１３６に記載のポリペプチド。
  138. ＣＤループのうちの、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＣＤループのアミノ酸残基３７〜４５に対応する部分が、野生型ＣＤループの同じ部分との比較で、修飾アミノ酸配列を有する、請求項１３５〜１３７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  139. ＣＤループのうちの、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＣＤループのアミノ酸残基３７〜４５に対応する部分が、野生型ＣＤループの同じ部分との比較で、挿入または欠失を含有する、請求項１３５〜１３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  140. ＥＦループのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＥＦループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項１３５〜１３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  141. βストランドＦが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基６８および７０に対応するアミノ酸残基間に挿入または欠失を含有する、請求項１３５〜１４０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  142. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）のアミノ酸残基９１〜９７の配列に対応するアミノ酸配列が、野生型配列の同じ部分との比較で、修飾アミノ酸配列を有する、請求項１３５〜１４１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  143. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）のアミノ酸残基９０および９８に対応するアミノ酸残基間に挿入または欠失を含む、請求項１３５〜１４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  144. ＡＢ、ＢＣまたはＤＥループの１つ以上が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列を有する、請求項１３５〜１４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  145. 疎水性コア残基が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）との比較で、修飾されていない、請求項１３５〜１４４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  146. ＦＧループがＲＧＤインテグリン結合部位を含有しない、請求項１３５〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  147. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドおよびループの配列との比較で、ループＣＤ、ループＥＦ、βストランドＦ、およびβストランドＧのアミノ酸配列に修飾を含む、ライブラリー。
  148. それぞれが異なる１０Ｆｎ３ドメイン配列を含む少なくとも１０５個のポリペプチドを含む、請求項１４７に記載のライブラリー。
  149. ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項１４７または１４８に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
  150. 請求項１４９に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
  151. ５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する、請求項１５０に記載の単離されたポリペプチド。
  152. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドおよびループの配列との比較で、βストランドＡ、ループＡＢ、βストランドＢ、ループＣＤ、βストランドＥ、ループＥＦ、およびβストランドＦのアミノ酸配列に修飾を含み、修飾ループおよび修飾ストランドが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
  153. ＣＤループのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＣＤループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項１５２に記載のポリペプチド。
  154. βストランドＧのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のβストランドＧの配列との比較で、修飾されている、請求項１５２または１５３に記載のポリペプチド。
  155. Ｃ末端テールのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）のＣ末端テールのアミノ酸配列との比較で、修飾されている、請求項１５２〜１５４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  156. 疎水性コア残基が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）との比較で、修飾されていない、請求項１５２〜１５５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  157. ＦＧループがＲＧＤインテグリン結合部位を含有しない、請求項１５２〜１５６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  158. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドおよびループの配列との比較で、βストランドＡ、ループＡＢ、βストランドＢ、ループＣＤ、βストランドＥ、ループＥＦ、およびβストランドＦのアミノ酸配列に修飾を含む、ライブラリー。
  159. それぞれが異なる１０Ｆｎ３ドメイン配列を含む少なくとも１０５個のポリペプチドを含む、請求項１５８に記載のライブラリー。
  160. ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項１５８または１５９に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
  161. 請求項１６０に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
  162. ５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する、請求項１６１に記載の単離されたポリペプチド。
  163. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドおよびループの配列との比較で、ループＡＢ、βストランドＢ、ループＣＤ、βストランドＤ、ループＤＥ、βストランドＥ、およびループＥＦのアミノ酸配列に修飾を含み、修飾ループおよび修飾ストランドが同じターゲットへの結合に寄与する、ポリペプチド。
  164. ＡＢループのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＡＢループとの比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項１６３に記載のポリペプチド。
  165. ＣＤループのうちの、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＣＤループのアミノ酸残基４０〜４７に対応する部分が、野生型ＣＤループの同じ部分との比較で、修飾アミノ酸配列を有する、請求項１６３または１６４に記載のポリペプチド。
  166. ＣＤループのうちの、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＣＤループのアミノ酸残基４０〜４７に対応する部分が、野生型ＣＤループの同じ部分との比較で、挿入または欠失を含有する、請求項１６３〜１６５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  167. βストランドＢが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基１８および２０に対応するアミノ酸残基間に、挿入または欠失を含有する、請求項１６３〜１６６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  168. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の残基１４〜１９に対応するアミノ酸の６残基のうちの少なくとも５残基が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項１６３〜１６７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  169. 野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の残基４０〜６６に対応するアミノ酸間の２７残基のうちの少なくとも１８残基が、野生型配列中の対応する残基との比較で、修飾されたものである、請求項１６３〜１６８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  170. ＢＣループが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列を有する、請求項１６３〜１６９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  171. 疎水性コア残基が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）との比較で、修飾されていない、請求項１６３〜１７０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  172. ＦＧループがＲＧＤインテグリン結合部位を含有しない、請求項１６３〜１７１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  173. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドおよびループの配列との比較で、ループＡＢ、βストランドＢ、ループＣＤ、βストランドＤ、ループＤＥ、βストランドＥ、およびループＥＦのアミノ酸配列に修飾を含む、ライブラリー。
  174. それぞれが異なる１０Ｆｎ３ドメイン配列を含む少なくとも１０５個のポリペプチドを含む、請求項１７３に記載のライブラリー。
  175. ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項１７３または１７４に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
  176. 請求項１７５に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
  177. ５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する、請求項１７６に記載の単離されたポリペプチド。
  178. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のループＦＧのアミノ酸残基７７〜８３の配列との比較で、ＦＧループに配列修飾を含み、１０Ｆｎ３が５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する、ポリペプチド。
  179. ＦＧループのうちの、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基７７〜８３に対応する部分が、野生型ＦＧループのアミノ酸残基７７〜８３の配列との比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項１７８に記載のポリペプチド。
  180. ＦＧループが単独で、ターゲットへの結合を媒介する、請求項１７８または１７９に記載のポリペプチド。
  181. ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥまたはＥＦループの１つ以上が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列を有する、請求項１７８〜１８０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  182. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のループＦＧのアミノ酸残基７７〜８３の配列との比較で、ＦＧループに配列修飾を含む、ライブラリー。
  183. それぞれが異なる１０Ｆｎ３ドメイン配列を含む少なくとも１０５個のポリペプチドを含む、請求項１８２に記載のライブラリー。
  184. ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項１８２または１８３に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
  185. 請求項１８４に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
  186. ５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する、請求項２００に記載の単離されたポリペプチド。
  187. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列との比較で、ＢＣループの一部分およびＦＧループの一部分に配列修飾を含み、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ＢＣループとの比較で修飾されているＢＣループの割合が大きい等価な１０Ｆｎ３ドメインと比較して、低減した免疫原性を有する、ポリペプチド。
  188. ＢＣループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループの残基２８および２９に対応する、請求項１８７に記載のポリペプチド。
  189. ＢＣループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループの残基２７〜２９に対応する、請求項１８７に記載のポリペプチド。
  190. ＢＣループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループの残基２４〜２９に対応する、請求項１８７に記載のポリペプチド。
  191. ＦＧループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループの残基７７〜８３に対応する、請求項１８７〜１９０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  192. ＦＧループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループの残基７７〜８２に対応する、請求項１８７〜１９０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  193. ＦＧループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループの残基７７〜８６に対応する、請求項１８７〜１９０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  194. ＦＧループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループの残基７７〜７９に対応する、請求項１８７〜１９０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  195. ＦＧループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループの対応する部分との比較で、挿入または欠失を有する、請求項１９１〜１９４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  196. ＢＣループおよびＦＧループがターゲットへの結合に寄与する、請求項１８７〜１９５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  197. １０Ｆｎ３ドメインがさらに、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＤＥループの配列との比較で、ＤＥループの一部分に配列修飾を含む、請求項１８７〜１９６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  198. ＤＥループのうちの修飾されている部分が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＤＥループの残基５２および５３に対応する、請求項１９７に記載のポリペプチド。
  199. １０Ｆｎ３ドメインが、野生型ＢＣループ中の対応する部分との比較でアミノ酸残基２３〜２７の１つ以上に修飾をさらに含む等価な１０Ｆｎ３ドメインと比較して、低減した免疫原性を有する、請求項１８７〜１９８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  200. １０Ｆｎ３ドメインが５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する、請求項１８７〜１９９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  201. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列との比較で、ＢＣループの一部分およびＦＧループの一部分に配列修飾を含む、ライブラリー。
  202. それぞれが異なる１０Ｆｎ３ドメイン配列を含む少なくとも１０５個のポリペプチドを含む、請求項２０１に記載のライブラリー。
  203. ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項２０１または２０２に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
  204. ターゲットに結合しかつ低減した免疫原性を有するポリペプチドを同定する可能性を増加させるための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項２０１または２０２に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
  205. 請求項２０３または２０４に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
  206. ５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する、請求項２０５に記載の単離されたポリペプチド。
  207. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループおよびβストランドの配列との比較で、ＢＣループとβストランドＢまたはβストランドＣの少なくとも１つとに配列修飾を含み、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型との比較でβストランドＢまたはβストランドＣの少なくとも１つに配列修飾を有さない等価な１０Ｆｎ３ドメインと比較して、低減した免疫原性を有する、ポリペプチド。
  208. ＢＣループのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項２０７に記載のポリペプチド。
  209. １０Ｆｎ３ドメインがさらに、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の最初の７アミノ酸残基のアミノ酸配列と比較して、最初の７アミノ酸残基のアミノ酸配列に修飾を含む、請求項２０７または２０８に記載のポリペプチド。
  210. １０Ｆｎ３ドメインがさらに、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループの配列との比較で、ＤＥループ、ＦＧループ、またはその両方に修飾を含む、請求項２０７〜２０９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  211. ＤＥループのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＤＥループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項２１０に記載のポリペプチド。
  212. ＦＧループのアミノ酸配列が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＦＧループのアミノ酸配列との比較で、長さが延長されているか、または長さが短縮されている、請求項２１０または２１１に記載のポリペプチド。
  213. １０Ｆｎ３ドメインがＤＥループに配列修飾を含み、さらに、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドの配列との比較で、βストランドＤ、βストランドＥ、またはその両方に配列修飾を含む、請求項２１０〜２１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  214. １０Ｆｎ３ドメインがＦＧループに配列修飾を含み、さらに、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するβストランドの配列との比較で、βストランドＦ、βストランドＧ、またはその両方に配列修飾を含む、請求項２１０〜２１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  215. ＢＣループのうちの、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のＢＣループのアミノ酸残基２７〜３１に対応する部分が、野生型ＢＣループの同じ部分との比較で、修飾アミノ酸配列を有する、請求項２０７〜２１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  216. ＢＣループが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基２６および３２に対応するアミノ酸残基間に、挿入または欠失を含有する、請求項２０７〜２１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  217. βストランドＤが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基４８および５０に対応するアミノ酸残基間に、挿入または欠失を含有する、請求項２０７〜２１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  218. βストランドＦが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基７２および７４に対応するアミノ酸残基間に、挿入または欠失を含有する、請求項２０７〜２１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  219. βストランドＧが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）のアミノ酸残基８８および９０に対応するアミノ酸残基間に、挿入または欠失を含有する、請求項２０７〜２１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  220. 疎水性コア残基が、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）との比較で、修飾されていない、請求項２０７〜２１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  221. ヒトフィブロネクチン３型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含む複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１または６）の対応するループおよびβストランドの配列との比較で、ＢＣループとβストランドＢまたはβストランドＣの少なくとも１つとに配列修飾を含む、ライブラリー。
  222. それぞれが異なる１０Ｆｎ３ドメイン配列を含む少なくとも１０５個のポリペプチドを含む、請求項２２１に記載のライブラリー。
  223. ターゲットに結合するポリペプチドを同定するための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項２２１または２２２に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
  224. ターゲットに結合しかつ低減した免疫原性を有するポリペプチドを同定する可能性を増加させるための方法であって、ターゲットに結合するポリペプチドを同定するために請求項２２１または２２２に記載のライブラリーをスクリーニングすることを含む方法。
  225. 請求項２２３または２２４に記載の方法によって同定される単離されたポリペプチド。
  226. ５００ｎＭ未満のＫｄでターゲットに結合する、請求項２２３に記載の単離されたポリペプチド。
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