POLIPEPTIDOS DE EXPRESIÓN MEJORADA Campo de la Invención La invención se refiere a moléculas de polipéptidos que han sido modificadas para mejorar sus características de expresión. Las moléculas de polipéptidos modificadas son expresadas con rendimientos me ores/más elevados que sus socios correspondientes, es decir, las moléculas de polipéptidos que no han sido modificadas (al nivel del ácido nucleico) . La invención se refiere además a las composiciones que comprenden tales polipéptidos. Finalmente, la invención proporciona un método para preparar las moléculas de polipéptidos modificadas mencionadas previamente. De principio a fin de la siguiente descripción, la mención de un polipéptido (compuesto) se va a entender que implica tanto el polipéptido per se como, en donde sea apropiado, la secuencia de ácidos nucleicos correspondiente, como será apreciado por el lector con experiencia. Lo mismo aplica para los polipéptidos (deseados) y el dominio de mejoramiento de la expresión (EED (por sus siglas en inglés)). Antecedentes de la Invención La expresión de los polipéptidos recombinantes en los sistemas hospederos microbianos es una manera efectiva de producir grandes cantidades de un polipéptido deseado. Cuando el polipéptido producido está propuesto para su uso como un agente de diagnóstico y/o terapéutico, la modificación Rßf .178390 adicional del polipéptido como se expresó frecuentemente es necesaria. Por ejemplo, un polipéptido propuesto para su uso como un agente de diagnóstico podría necesitar que se modifique de tal modo que pueda aglutinarse a un soporte sólido. Alternativamente, el polipéptido puede ser necesario que se una a un agente que le permita ser visualizado por un cierto método de formación de imágenes. Un polipéptido propuesto para la administración a un paciente como parte del curso de una terapia puede ser necesario que sea modificado para modular sus propiedades in vivo, por ejemplo sus propiedades farmacocinéticas . La derivación de un polipéptido producido recombinantemente es efectuada frecuentemente en su mayoría por la reacción química entre una substancia química ("la porción de derivación" ) y un grupo lateral reactivo de uno o más de los aminoácidos comprendidos dentro del polipéptido. El resultado es una unión covalente de la porción de derivación al polipéptido, en donde la localización y la valencia de tal (es) unión (es) está(n) dictada (s) por la localización respectiva y el número de aminoácidos reactivos dentro del polipéptido. Esto significa que en un polipéptido con aminoácidos reactivos múltiples, la unión química de una porción de derivación con el polipéptido ocurrirá muchas veces en las localizaciones de principio a fin del polipéptido que corresponde a las localizaciones de los aminoácidos reactivos . Para algunos propósitos, tal unión no específica para el sitio, multivalente, de porciones de derivación a un polipéptido puede ser deseable, pero muy frecuentemente no lo es. Por ejemplo, en un procedimiento de diagnóstico, puede ser importante para la cuantificación exacta de las mediciones limitar el número de derivaciones por molécula del polipéptido a una de ellas. De manera semejante, el uso terapéutico exitoso de un polipéptido in vivo frecuentemente se articula con la capacidad del especialista médico para predecir y controlar de manera precisa la actividad biológica de este polipéptido. En tal situación, las variaciones que resultan de la derivación no controlada y no específica para el sitio del polipéptido utilizado pueden ser inconsistentes entendiblemente con el curso propuesto de la terapia. Además,' una unión no específica para el sitio de un polipéptido terapéutico o de diagnóstico con una porción de derivación puede conducir a una alteración de la actividad deseada del polipéptido. Este puede ser por ejemplo el caso cuando un polipéptido del anticuerpo de una sola cadena es derivado de un modo no específico para el sitio de tal modo que el sitio de aglutinación del antígeno sea prevenido estérica y/o electrostáticamente que se aglutine al antígeno o que sea reducido en su actividad de aglutinación. En tal caso, el efecto de diagnóstico o terapéutico deseado del anticuerpo de una sola cadena puede ser anulado o al menos atenuado. Frecuentemente es deseable entonces, diseñar polipéptidos recombinantes de tal modo que la derivación sea posible solamente en localizaciones predefinidas, o solamente en una localización predefinida en la molécula del polipéptido. La valencia de la unión puede ser sintonizada controlando el número de aminoácidos reactivos en el polipéptido, y la actividad del polipéptido deseado y/o las características químicas deseadas pueden ser moduladas planeando la localización de tales uniones para no alterar físicamente la interacción del polipéptido con otras moléculas en el medio ambiente. Un aminoácido que ha probado que va a ser útil a este respecto es la cisteína. A causa de su importancia en la estabilización de la estructura de la proteína por medio de la formación de enlaces de disulfuro, la cisteína normalmente está presente en los polipéptidos solamente en localizaciones definidas. Incorporando una cisteína única en una región "benigna" del polipéptido no requerida directamente para la actividad del polipéptido deseado, se puede aprovechar la ventaja de la cadena lateral de sulfhidrilo reactiva de la cisteína como un punto de anclaje natural para una derivación deseada, sin, o sin afectar significativamente la actividad del polipéptido deseado (Volkel T., et al. (2004) Biochim Biophys Acta 1663, 158-66).
Sin embargo, la incorporación de los residuos de cisteína adicionales en los polipéptidos para los propósitos de derivación abarca ciertas desventajas. Frecuentemente, el polipéptido deseado ya tendrá residuos de cisteína en su secuencia de aminoácidos para los propósitos de estabilización estructural. Una cisteína adicional incorporada para el propósito de la derivación del polipéptido con una porción de derivación puede introducir en este caso enlaces de disulfuro indeseables con tales cisteínas ya presentes, alterando severamente la estructura del polipéptido necesaria para una actividad deseada. Aún si el polipéptido deseado no contiene por sí mismo algún residuo de cisteína en su secuencia de aminoácidos, la incorporación de un residuo de cisteína único todavía puede conducir a problemas. Después de la expresión en un organismo hospedero, los polipéptidos que contienen un residuo de aminoácidos de cisteína diseñado pueden formar dímeros de polipéptidos entre sí por medio de los enlaces de disulfuro intermoleculares entre los grupos de tiol (es decir de sulfhidrilo) de los dos residuos de cisteína en los polipéptidos respectivos (Albrecht H., et al (2004) Bioconjug Chem 15, 16-26; Olafsen T., et al. (2004) Protein Eng Des Sel 17, 21-7). Este peligro es particularmente grande cuando se utilizan sistemas de expresión procariótica para producir el polipéptido. Esto es a causa de que en tales sistemas, las proteínas son transportadas gradualmente hacia el espacio periplásmico del elemento hospedero microbiano, en donde prevalecen las condiciones oxidantes . Aunque tales condiciones oxidantes son esenciales para la formación de enlaces de disulfuro estabilizantes de la estructura, deseables, en la cadena de polipéptido naciente, los mismos también promueven la formación de enlaces de disulfuro intermoleculares indeseables entre los residuos de cisteína libre propuestos como los últimos puntos de derivación en dos polipéptidos respectivos. Los asuntos anteriores no están limitados a la expresión en procariotas. En Luo et al. (1997) J Biochem 121, 831-4, los experimentos fueron descritos comparando la cantidad del polipéptido de scFv monomérico y dimérico (es decir enlazado por medio de un enlace de disulfuro intermolecular) expresado en la levadura, dependiendo de que si este polipéptido de scFv comprendió uno o dos residuos de cisteína C-terminales . Se encontró que scFv con un residuo de cisteína C-terminal único fue más probable que exista en la forma dimérica, mientras que scFv con dos residuos de cisteína C-terminales fue más probable que exista en la forma monomérica. También es evidente de esta publicación que la cantidad total del polipéptido expresado permanece exactamente idéntica, sin importar la distribución de la isoforma. Adicionalmente, se reveló que la estructura que tiene dos residuos de cisteína (lo cual exhibe una tendencia a formar un enlace de disulfuro intramolecular) exhibe solamente una actividad de aglutinación escasa. Especialmente cuando se expresan polipéptidos propuestos para uso terapéutico, frecuentemente es importante por razones de homogeneidad del producto producir la isoforma monomérica en lugar de la isoforma dimérica. El arte previo, incluido por la publicación mencionada anteriormente de Luo et al., entonces, proporciona al lector interesado en la expresión del polipéptido monomérico que se puede derivar en la cisteína, con ciertas herramientas para lograr este fin. Sin embargo, el arte previo no proporciona una herramienta adecuada para expresar la isoforma (monomérica) en cantidades aceptables y con la actividad de aglutinación aceptable. Por consiguiente, fue un objeto de la presente invención desarrollar una construcción de ADN que permita una expresión de alto rendimiento del polipéptido correspondiente que exhiba una actividad de aglutinación aceptable, en donde el polipéptido es obtenido predominantemente como un polipéptido monomérico. Breve Descripción de la Invención Los inventores han resuelto este objeto proporcionando un ácido nucleico que codifica un así llamado polipéptido compuesto de acuerdo con la presente invención, como se definió en las reivindicaciones. El ácido nucleico, si es expresado apropiadamente, proporciona un polipéptido compuesto, el polipéptido compuesto comprende un polipéptido deseado y un dominio mejorador de la expresión ("EED"), el EED comprende primer y segundo residuos de aminoácidos de cisteína Cysl y Cys2, respectivamente, Cysl está localizada más cerca a la terminación N de la molécula de polipéptido recombinante que Cys2, en donde Cysl y Cys2 están separadas por un enlazador del polipéptido, el enlazador: • está libre de cisteína y prolina; • define una longitud suficiente para permitir que
Cysl y Cys2 se unan en un enlace de disulfuro intramolecular entre sí; y • tiene una conformación de polipéptido flexible esencialmente libre de la estructura del polipéptido secundario en la solución acuosa, en donde al menos uno de Cysl y Cys2 es derivado con una porción de derivación. Incorporando no uno sino dos residuos de cisteína Cysl y Cys2 en el EED y por la sintonización de la longitud y la especificación de la naturaleza de la secuencia enlazadora del polipéptido colocada entre los mismos, se promueve la formación de un enlace de disulfuro intramolecular entre Cysl y Cys2, de tal modo que se forme un enlace de disulfuro, volviendo incapaces a Cysl y Cys2 para participar en la unión por puentes de disulfuro ínter- o intramoleculares no deseados como se describió anteriormente. En un sentido, cada uno de Cysl y Cys2 llega a ser el grupo protector del otro respectivo. Cuando un bucle de disulfuro intramolecular ha sido formado entre Cysl y Cys2, Cys2 puede ser observado como la porción de derivación de Cysl. Por el contrario, Cysl puede ser observado como la porción de derivación de Cys2. Los polipéptidos compuestos que han sido diseñados, al nivel del ácido nucleico, para contener dos residuos de cisteína como se describió anteriormente, tienen la ventaja de que llevan puntos de anclaje químicos para derivaciones posteriores (es decir la post-expresión y aislamiento) . Al mismo tiempo, el peligro de formación de los enlaces de disulfuro intermoleculares no deseados es reducido drásticamente, porque tal peligro podría surgir en este caso principalmente de otros residuos de cisteína presentes en el polipéptido deseado para la estabilización del disulfuro
(deseable) de la estructura del polipéptido. Tales enlaces de disulfuro normalmente se forman en un medio ambiente oxidante durante y/o después de la traducción cuando el polipéptido naciente crece gradualmente. Como tal, cualquier grupo sulfhidrilo libre de una cisteína necesaria para la estabilización de la estructura del polipéptido normalmente encuentra su socio de disulfuro de manera relativamente rápida y por consiguiente es bloqueado así de reacciones indeseables adicionales . La incorporación de un enlazador optimizado en su longitud, propiedades químicas y estéricas para permitir que Cysl y Cys2 formen un enlace de disulfuro mutuo, asegura que Cysl y Cys2 reaccionarán solamente entre sí y no con un residuo de cisteína espacialmente distante en el polipéptido que es necesario para la estabilización de la estructura del polipéptido, pero que todavía no ha reaccionado con su residuo de cisteína de la contraparte propuesta. En resumen, el enlazador asegura que Cysl y Cys2 siempre estarán más cercanos entre sí que cualquiera de Cysl o Cys2 con respecto a cualquier otro residuo de cisteína en el polipéptido. Una vez expresado y aislado, tal polipéptido compuesto que exhibe un enlace de disulfuro entre Cysl y Cys2 puede ser expuesto a condiciones reductoras suficientes para abrir (solamente) el enlace de disulfuro entre Cysl y Cys2. Después de esto, la derivación de Cysl y/o Cys2 con porciones de derivación diferentes de otros Cysl o Cys2 respectivos puede ser efectuada. Además de la ventaja de obtener un polipéptido derivado (el cual puede ser derivado una vez más después del aislamiento) sin las desventajas descritas anteriormente, también se ha encontrado sorprendentemente que los polipéptidos que han sido diseñados para comprender un EED
(es decir, los polipéptidos compuestos dentro del significado de la invención) también exhiben niveles más elevados de la expresión total a partir de sus ácidos nucleicos correspondientes cuando se compara con los polipéptidos que no comprenden un EED. Aunque el polipéptido compuesto de acuerdo con la invención puede ser esperado para conducir a un dímero indeseable menor que un polipéptido sin el EED, es completamente inesperado con base en la enseñanza en el arte previo (por ejemplo, la publicación de Luo et al., citada anteriormente) que la expresión total del polipéptido total con actividad de aglutinación aceptable podría ser incrementada por la incorporación del EED de acuerdo con la presente invención. El polipéptido compuesto de la invención, entonces, puede ser producido con un rendimiento total más elevado cuando se compara con el polipéptido deseado sin EED, en donde la relación del polipéptido compuesto monomérico relacionado con el polipéptido compuesto dimérico es incrementada con relación a la relación observada en la producción del polipéptido deseado que carece de un EED. De esta manera, el polipéptido monomérico no solamente es favorecido sobre el polipéptido dimérico, sino que la cantidad más elevada total del polipéptido conduce a un polipéptido monomérico mucho mayor (arriba de 5 veces mayor) que puede ser (re-) derivado entonces cuando sea necesario. Sin que esté limitado por la teoría, los inventores creen que el incremento sorprendente en el polipéptido expresado total observado se debe al menos en parte a que Cysl y Cys2 son propensos, dentro de EED, a formar un enlace de disulfuro entre sí. Para explicar porque esto se cree que va a ser así, es útil considerar lo que sucede durante la expresión subsiguiente de dos polipéptidos idénticos que no comprenden un EED como se definió anteriormente. Para los propósitos de la descripción precedente, estos polipéptidos idénticos serán referidos como PPl y PP2 , y cada uno comprende el mismo polipéptido deseado así como una porción C-terminal para el mismo con solamente un residuo de cisteína (es decir, ninguno de PPl o PP2 comprende un EED como se definió anteriormente) . Los descriptores 1 y 2 denotan, entonces, identidades de polipéptidos no diferentes, sino en lugar de esto, el orden cronológico en los cuales los polipéptidos idénticos son expresados. Considerando ahora que PPl es expresado antes de
PP2, (PPl) será transportado gradualmente hacia un medio ambiente celular oxidante en la dirección N —> C, significando que la terminación de amino - aquella del polipéptido deseado - será el primer extremo para surgir hacia el medio ambiente oxidante. Surgiendo de esta manera, un residuo de cisteína dentro del polipéptido deseado que participará en un enlace de disulfuro estabilizante de la estructura solamente necesitará esperar a su residuo de cisteína asociado, este último está localizado más hacia el extremo C-terminal del polipéptido deseado - para surgir hacia el medio ambiente oxidante para que se forme el enlace de disulfuro. Este proceso continúa cuando el polipéptido deseado continúa surgiendo, hasta que todos los enlaces de disulfuro necesarios para la estabilización estructural dentro del polipéptido deseado han sido formados. Una vez que el componente del polipéptido deseado de PPl ha surgido completamente (y plegado apropiadamente) , surge la porción C-terminal de PPl con solamente un residuo de cisteína. Sin embargo aquí, no existe una cisteína asociada con la cual esta cisteína única pueda reaccionar para formar un enlace de disulfuro, de modo que este residuo de cisteína único permanezca sin agruparse en parejas. Una vez que el PPl terminado ha sido liberado, entonces, la porción del polipéptido deseado de PPl es plegada apropiadamente y estabilizada con el disulfuro, y la porción C-terminal de la molécula soporta un residuo de cisteína con un grupo sulfhidrilo reactivo. Considerando ahora que PP2 empieza a ser expresado en el mismo medio ambiente en el cual radica el PPl completo, el extremo N-terminal de PP2 surgirá primero. El primer residuo de cisteína dentro de la porción del polipéptido deseado de PP2 surge pero todavía no puede formar el enlace de disulfuro estabilizante de la estructura propuesta, puesto que su socio de la reacción de cisteína dentro de la porción del polipéptido deseado de PP2 todavía no ha surgido. Sin embargo, el residuo de cisteína no agrupado en parejas, único, dentro de la porción del polipéptido deseado de PP2 puede reaccionar con el residuo de cisteína no agrupado en parejas, único, en la porción C-terminal del PPl que ya ha sido complementado. De esta manera, un enlace de disulfuro no deseado es formado entre el primer residuo de cisteína dentro de la porción del polipéptido deseado de PP2 y el residuo de cisteína no agrupado en parejas en la porción C-terminal de PPl. En tal escenario, el segundo residuo de cisteína en la porción del polipéptido deseado de PP2 reaccionará con el residuo de cisteína no agrupado en parejas en la porción C-terminal de PP2 , u otro residuo de cisteína dentro de la porción del polipéptido deseado de PP2. De cualquier manera, el arreglo de los enlaces de disulfuro resultantes conducirá muy probablemente a un complejo de polipéptidos ensamblado desprovisto inapropiadamente, o substancialmente desprovisto de la actividad biológica del polipéptido deseado. Tal polipéptido ensamblado inapropiadamente es probable que sea reconocido como tal y degradado por las proteinasas intracelulares, reduciendo así la cantidad del polipéptido total obtenido. En el caso de que tal polipéptido ensamblado inapropiadamente no sea degradado activamente de esta manera, es probable que exista como un agregado insoluble con otros polipéptidos malformados de este tipo y podría ser removido del polipéptido ensamblado apropiadamente en el transcurso de los procedimientos de aislamiento de los polipéptidos estándares. En cualquier caso, el polipéptido que es ensamblado inapropiadamente de esta manera podría tender a reducir la cantidad del polipéptido ensamblado apropiadamente obtenido finalmente en los procedimientos de aislamiento de polipéptidos estándares. En contraste, un polipéptido compuesto de acuerdo con la invención comprende no solamente dos residuos de cisteína (Cysl y Cys2) en un EED, sino también un enlazador colocado entre los mismos, el enlazador que ha sido optimizado para promover la formación del enlace de disulfuro entre Cysl y Cys2. En vista de las consideraciones anteriores con respecto a PPl y PP2 , y suponiendo ahora que PPl y PP2 son polipéptidos compuestos de acuerdo con la invención (es decir los mismos comprenden cada uno un EED) , es claro que ninguno de Cysl ni Cys2 en cada uno de los EEDs respectivos permanecerá sin agruparse en parejas, puesto que Cysl y Cys2 dentro de un EED respectivo habrán formado un enlace de disulfuro entre sí. Los polipéptidos ensamblados inapropiadamente son evitados, teniendo el efecto de que los productos no son degradados por las proteinasas intracelulares y/o no forman agregados. Como resultado, la cantidad del polipéptido compuesto expresado y aislado es aumentada ampliamente. En resumen, entonces, la expresión del polipéptido compuesto de acuerdo con la invención conduce a un incremento en la proporción del monómero : dímero del polipéptido. Al mismo tiempo, los niveles del polipéptido total obtenido -sin considerar de la isoforma del polipéptido - también son incrementados con relación a un polipéptido que carece del EED como se definió anteriormente. El resultado neto es que una cantidad muy pequeña del polipéptido dimérico y/o multimérico y una cantidad ampliamente más grande del polipéptido monomérico es obtenida con un polipéptido compuesto que comprende el EED como se describió anteriormente que es observado por los polipéptidos deseados comparativos en los cuales un EED como se definió anteriormente está faltando. Dentro del significado de la presente invención, "terminación N" y "terminación C" van a ser entendidas de acuerdo con la convención establecida en bioquímica. La terminación N de un polipéptido es el extremo de la cadena del polipéptido que finaliza en un grupo amino, mientras que la terminación C de un polipéptido es el extremo de la cadena de polipéptido que termina en un grupo carboxilo. El hecho de que Cysl esté localizado más cercano a la terminación N que Cys2 establece la orientación de Cysl y Cys2 de manera relacionada entre sí dentro de la cadena del polipéptido. Por esto, la orientación de EED en la cual Cysl y Cys2 están comprendidas, también es establecida.
Dentro del significado de esta modalidad de la invención, un enlazador del polipéptido con una "conformación del polipéptido flexible" es un enlazador del polipéptido que tiene en cada enlace covalente dentro de la cadena del polipéptido grados suficientes de libertad giratoria para hacer que el enlazador del polipéptido como un todo, sea ampliamente no restringido, es decir, restringido solamente por su longitud, en las conformaciones que el mismo puede asumir dentro del espacio tridimensional. Como tal, la formación de la imagen de un enlazador del polipéptido anclado en un extremo en un punto imaginario en el espacio tridimensional y que define una esfera alrededor de este punto con un radio que corresponde a la longitud del enlazador del polipéptido extendido totalmente, si el enlazador del polipéptido tiene una "conformación del polipéptido flexible", el extremo distal de este enlazador del polipéptido (es decir el extremo no anclado, libre) debe ser capaz de tocar cualquier punto en el espacio tridimensional localizado sobre o dentro de la esfera con igual facilidad. Este modelo ocasiona el corolario de que tal enlazador del polipéptido con una "conformación del polipéptido flexible" también debe estar "esencialmente libre de la estructura del polipéptido secundario", por ejemplo de extensiones de la hélice alfa o la hoja beta. Cualquier predisposición del enlazador del polipéptido hacia una porción de la estructura secundaria del polipéptido necesariamente limitará el grado de libertad espacial empleada por el extremo libre del enlazador, por lo cual restringe este extremo con respecto a los puntos que el mismo sea capaz de alcanzar dentro de la esfera definida anteriormente. Esta flexibilidad contribuye a la capacidad del enlazador para doblarse hacia atrás sobre sí mismo, por lo cual permite que Cysl y Cys2 formen un enlace de disulfuro intramolecular . La estructura secundaria indeseable puede ser ordenada (como en el caso de la hélice alfa o la hoja beta descritas anteriormente) o puede ser desordenada, como podría ser esperado si, digamos, un residuo de prolina tuviera que existir en la secuencia del enlazador (el anillo restringido en la prolina se sabe que provoca bucles en el soporte del polipéptido) . Sin que esté limitada por la teoría, los inventores creen que esta flexibilidad intrínseca del enlazador entre Cysl y Cys2 es un determinante principal para asegurar la formación de un enlace de disulfuro entre estos dos residuos de cisteína, y que la formación eficiente del enlace de disulfuro está enlazada a la mejora marcada de la expresión del polipéptido total observada (véanse las razones como se describieron anteriormente) . Por esta razón es importante evitar incluir aminoácidos tales como prolina en la secuencia del enlazador, puesto que tal incorporación restringe el movimiento libre del enlazador necesario para permitir que Cysl y Cys2 migren en proximidad uno hacia el otro de tal modo que se formen el enlace de disulfuro deseado. Los residuos de aminoácidos que son permitidos en el enlazador de acuerdo con la presente invención comprenden, pero no están limitados a, Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser, Thr, Met, Tyr, Asn, Gln. Dentro del significado de la presente invención, el término "derivado" se va a entender que describe una situación en la cual uno o ambos de los residuos de aminoácidos Cysl y Cys2 se han introducido en la reacción con una "porción de derivación" . Una porción de derivación puede ser por ejemplo un compuesto que comprende un grupo maleimida, por ejemplo una molécula de PEG que comprende un grupo maleimida. En este caso no limitativo, ejemplar, particular, el Cysl y/o Cys2 derivado, resultante, habrá sido derivado con una molécula de PEG por medio de un enlace de S-C covalente que resulta del ataque nucleofílico por el átomo de azufre en Cysl y/o Cys2 con uno de los átomos de carbono insaturados dentro del anillo de maleimida. Como otro ejemplo, una "porción de derivación" también puede ser una molécula que comprende por sí misma un grupo sulfhidrilo, de modo que el Cysl y/o el Cys2 derivados, resultantes, habrán sido derivados con esta molécula por medio de un enlace S-S covalente, es decir, el enlace de disulfuro. Está dentro del significado de "derivado" que Cysl y/o Cys2 puedan reaccionar con otro residuo de cisteína en la misma cadena de polipéptidos o en otra. Específicamente, la formación del puente de disulfuro intramolecular deseable entre Cysl y Cys2 como se describió anteriormente, se va a entender que está considerada dentro del significado de "derivado" en la presente invención; en este caso, Cysl habrá sido derivado por Cys2, y viceversa. En general, entonces, desde el punto de vista de Cysl, "derivado" cubre todos los escenarios en los cuales Cysl ha participado en una reacción química covalente con una especie diferente de sí mismo (por ejemplo con Cys2) . De manera semejante, "derivado" también cubre todos los escenarios en los cuales Cys2 ha participado en una reacción química covalente con una especie diferente de sí mismo (por ejemplo con Cysl) . De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, al menos 75 % de los residuos de aminoácidos en el enlazador son seleccionados de Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser, Thr, Met, Tyr, Asn, y Gln. Son más preferidos Gly, Ser, Ala y Thr. Estos aminoácidos son ya sea descargados, son muy solubles o razonablemente solubles en agua, o son ambos. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el polipéptido compuesto es un polipéptido de cadena única, significando que todos los aminoácidos están presentes en una cadena del polipéptido unida al péptido, única. Esta modalidad tiene la ventaja de que la producción de un producto de polipéptido de una sola cadena, deseado, pueda ser lograda muy eficientemente, puesto que la conformación apropiada del producto dependerá del establecimiento solamente de las estructuras de los polipéptidos secundarios y terciarios necesarios; la estructura del polipéptido cuaternario, en la cual los polipéptidos separados que exhiben una cierta intermolecularidad asociada con la estructura terciaria, no necesita ser considerada cuando el polipéptido compuesto expresado es un polipéptido compuesto de una sola cadena. De acuerdo con una modalidad adicional de la invención, el EED puede ser localizado en el extremo C-terminal o el extremo N-terminal del polipéptido compuesto. Cada localización abarca las ventajas propuestas descritas aquí posteriormente, especialmente el incremento observado en la cantidad total del polipéptido compuesto expresado. Un EED localizado C-terminalmente será expresado al último, es decir, después que el polipéptido deseado, con el efecto de que cualesquiera enlaces de disulfuro necesarios dentro del polipéptido deseado tendrán tiempo para formar cuando sea necesario la estabilización de la proteína previa a la traducción del EED. Esto significa que cuando EED es traducido totalmente, el enlace de disulfuro deseado entre Cysl y Cys2 dentro de EED será el último enlace de disulfuro que se va a formar, y que la estructura del polipéptido deseado ya habrá sido estabilizada por cualesquiera enlaces de disulfuro internos. El peligro de la formación de enlaces de disulfuro indeseables entre Cysl o Cys2 en la porción de EED del polipéptido compuesto y otro residuo de cisteína dentro del polipéptido deseado por lo tanto es mínimo. La colocación del EED en el extremo N-terminal del polipéptido compuesto tiene el efecto de que el ácido nucleico que codifica el EED será traducido antes que el ácido nucleico codifique el polipéptido deseado. Esto significa que un enlace de disulfuro entre Cysl y Cys2 dentro de EED es probable que se forme antes que cualquier otro residuo de cisteína dentro del polipéptido deseado sea traducido. Nuevamente aquí, el peligro de que un enlace de disulfuro indeseable se forme entre Cysl o Cys2 en la porción de EED del polipéptido compuesto y un residuo de cisteína dentro del polipéptido deseado, es mínimo. La localización del EED en el extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido compuesto puede ser determinada por lo tanto por consideraciones de en donde las porciones de derivación que van a ser unidas al EED podría ser menos probable que alteren la actividad biológica del polipéptido deseado. De esta manera, un alto grado de flexibilidad experimental es logrado; el experimentador tiene el privilegio de elegir la localización de EED que permitirá la actividad más elevada del polipéptido deseado en el polipéptido compuesto derivado final, sin que se tengan que sacrificar las ventajas conferidas por la presencia del EED, estas ventajas han sido explicadas anteriormente. De acuerdo con una modalidad de la invención, el EED del polipéptido compuesto es de la forma: -Cysl- (Xaa) n-Cys2-(Pro)m; en donde n es cualquier número entero desde 2 hasta 20; m es 0 (cero) o 1; y en donde Xaa se permite en cada posición que sea cualquiera de los aminoácidos que están presentes de manera natural, en donde preferentemente al menos 75 %, aún mejor al menos 80 o 90 % de los residuos de Xaa son seleccionados de Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser, Thr, Met, Tyr, Asn, y Gln. En una modalidad preferida, todas las Xaa son Gly, Ser, Ala, o Thr. Permitiendo que la variable n varíe desde 2, preferentemente 3, hasta 20, el enlazador entre Cysl y Cys2 permanece lo suficientemente corto para promover la formación de un enlace de disulfuro entre Cysl y Cys2, todavía lo suficientemente largo para permitir que el enlazador se doble sobre sí mismo para poder realizar esta acción. Las longitudes del enlazador de 4-5 se ha encontrado que promueven los enlaces de disulfuro entre Cysl y Cys2 de manera especialmente eficiente, con una longitud del enlazador de 4 aminoácidos que es preferida especialmente para este propósito. De los aminoácidos listados anteriormente en este párrafo, Gly y Ser, ambos solos o en mezclas, se ha encontrado que van a ser especialmente adecuados para este propósito. Sin que estén limitados por la teoría, los inventores creen que esto se debe al hecho de que Gly es tanto pequeño como químicamente neutro, por lo cual se reduce la propensión del enlazador a participar en reacciones químicas indeseables mientras que se retiene un grado máximo de flexibilidad estérica no impedida. El aminoácido Ser se cree que confiere, por medio de su grupo hidróxilo, una medida adecuada de hidrofilicidad que puede ayudar a prevenir que un enlazador que es demasiado hidrofóbico se una en interacciones hidrofóbicas indeseables con las regiones hidrofóbicas del polipéptido deseado. Se debe señalar que en el caso de que EED esté localizado en el extremo N-terminal del polipéptido compuesto, puede ser ventajoso que m sea 0 (cero) . La presente modalidad de la invención también permite que un residuo de Pro sea unido por medio de un péptido a Cys2 en el extremo C posterior, aunque la presencia de Pro no es un requerimiento (es decir la variable m también puede ser igual a cero) . La provisión de Pro se ha encontrado que incrementa adicionalmente los rendimientos de la expresión del polipéptido compuesto en algunas circunstancias. Sin que estén limitados por la teoría, los inventores creen que esto se debe a la capacidad de la prolina para inhibir la degradación de la proteinasa del polipéptido compuesto desde el extremo C-terminal posterior. En una modalidad preferida especialmente de la invención, n=4 y (Xaa) 4 es (Gly) 4, (Gly)3Ser, (Gly) 2SerGly, GlySer(Gly)2 o Gly (Ser) 3. En otra modalidad preferida especialmente de la invención, n=5 y (Xaa) 5 es (Gly) 5, (Gly)4Ser, (Gly) 3SerGly, (Gly) 2Ser (Gly) 2 , GlySer(Gly)3 o Ser (Gly) 4. Las ventajas, especiales de usar Gly y Ser, ambos solos o conjuntamente, en el enlazador del EED se han descrito anteriormente. Como se mencionó anteriormente, una longitud del enlazador de 4 aminoácidos en total se encontró que conduce a la formación más eficiente de un bucle del péptido de disulfuro entre Cysl y Cys2. En una modalidad adicional de la invención, el EED es de la forma (His) j-Cysl- (Xaa)n-Cys2- (Pro)m o Cysl-(Xaa)n-Cys2- (His) J- (Pro)m en donde j es cualquier número entero desde 2 hasta 15, y en donde Xaa, n y m son como se definieron anteriormente. La incorporación en el EED de una secuencia de poli-His ("His-tag") con respecto al lado N de Cysl o al lado C de Cys2 involucra varias ventajas. En primer lugar, como se muestra en el arte (Porath, J., et al. (1975) Nature 258, 598-9; Sulkowski , E. (1985) Trends in Biotech 3, 1-12), una His-tag puede ser una herramienta invaluable en el aislamiento de un polipéptido expresado por medio de una columna de níquel inmovilizada así como en la detección subsiguiente del polipéptido. Pero quizás es más ventajoso para el polipéptido compuesto de la presente invención el efecto especial que His-tag tiene sobre la formación deseada del enlace de disulfuro entre Cysl y Cys2, y por consiguiente sobre la cantidad total del polipéptido compuesto obtenido en la expresión. Este efecto es especialmente pronunciado cuando el EED está localizado C-terminal con respecto al polipéptido deseado con la His-tag N-terminal de Cysl; o cuando el EED está localizado N-terminal con respecto al polipéptido deseado con la His-tag C-terminal de Cys2 - en cada caso la His-tag está localizada en la interfaz del EED y el polipéptido deseado. Sin que estén limitados por la teoría, los inventores creen que este efecto especial puede ser explicado como sigue: la histidina típicamente lleva una carga positiva, de modo que los residuos de histidina individuales en una porción de histidina repetitiva tiendan a ser repelidos electrostáticamente entre sí, conduciendo a una cadena de polipéptidos extendida en la región de los residuos de histidina. Colocando esta porción de histidina dentro del EED en la interfaz entre el polipéptido deseado y el EED, estos dos componentes del polipéptido compuesto llegan a ser extendidos alejándose entre sí cuando la longitud del His-tag lo permite. Esto tiene el efecto de reducir la probabilidad de las interacciones indeseables entre la porción del EED que comprende Cysl y Cys2 por una parte, y el polipéptido deseado por otra parte. Al mismo tiempo, separando físicamente el EED del polipéptido deseado, la probabilidad de que Cysl y Cys2 formarán un enlace de disulfuro entre sí es incrementada. Esto es a causa de que Cysl y Cys2 existen en este escenario en un aislamiento físico mayor o menor del resto del polipéptido compuesto naciente; en la ausencia de cualesquiera otros grupos sulfhidrilo que compiten con Cysl o Cys2 para la formación de un enlace de disulfuro, un enlace de disulfuro es más probable que se forme del modo deseado entre los grupos de sulfhidrilo respectivos sobre Cysl y Cys2. En una modalidad preferida especialmente de la invención, J = 6, es decir el EED es de la forma (His)6-Cysl- (Xaa)n-Cys2- (Pro)m o Cysl- (Xaa)n-Cys2- (His) 6- (Pro)m, en donde Xaa, n y m son como se definieron anteriormente. De acuerdo con una modalidad adicional de la invención, el Cysl y/o Cys2 derivados eson el producto de reacción del (de los) residuo (s) de Cysl y/o Cys2 con una porción de derivación que comprende, por ejemplo, un grupo de maleimida, un grupo sulfhidrilo, o un grupo de disulfuro de piridilo. Todos estos grupos químicos reaccionan covalentemente con el sulfhidrilo. La ventaja de esta modalidad de la presente invención es que la mayoría de las porciones de derivación que podrían ser de interés para su uso en la derivación del polipéptido compuesto están disponibles en una forma funcionalizada con uno de los grupos anteriores. Como tal, el polipéptido compuesto de la invención puede ser derivado con una amplia variedad de varios reactivos para varios propósitos terapéuticos y/o de diagnóstico. De los grupos mencionados anteriormente, un grupo maleimida es preferido especialmente. El grupo maleimida reacciona casi completamente con el sulfhidrilo bajo condiciones suaves de reacción que probablemente podrían no dañar el polipéptido deseado en el polipéptido compuesto, y conduce a un enlace químico covalente robusto entre el átomo de azufre de la cisteína y uno de los dos átomos de carbono insaturados en el anillo del grupo maleimido. En una modalidad preferida especialmente de la invención, la porción de derivación que comprende un grupo maleimida es elegida de PEG-maleimida ("PEG-MAL"), un marcador fluorescente funcionalizado con maleimida, un marcador de detección del ensayo funcionalizado con maleimida, un trazador radioactivo funcionalizado con maleimida, un reticulador de la proteína funcionalizado con maleimida, un agente quimioterapéutico funcionalizado con maleimida o una toxina funcionalizada con maleimida, por ejemplo una inmunotoxina funcionalizada con maleimida. Los ejemplos adecuados de PEG-MAL son metoxi PEG-MAL de 5 kD; metoxi PEG-MAL de 20 kD; metoxi (PEG)2-MAL de 40 kD; metoxi PEG(MAL)2 de 5 kD; metoxi PEG(MAL)2 de 20 kD; metoxi PEG (MAL) 2 de 40 kD; o cualquier combinación de los mismos. Cualquiera de estos reactivos puede ser utilizado como porciones de derivación para conferir las ventajas conocidas de la PEGilación, incluyendo el incremento de la vida media del suero y la reducción de la inmunogenicidad, del polipéptido compuesto de la invención. Los ejemplos adecuados de un marcador de fluorescencia funcionalizado con maleimida son biotina-maleimida y digoxigenina-maleimida. Un ejemplo adecuado de un trazador radioactivo funcionalizado con maleimida es DTPA-maleimida. Un ejemplo adecuado de un reticulador funcionalizado con maleimida es una especie de reticulación de N-hidroxisuccinimidil-maleimida que reacciona por medio de su porción de N-hidroxisuccinimidilo con un grupo amino libre de otras especies químicas que van a ser unidas, y por medio de su porción de maleimida con al menos uno de Cysl y Cys2 sobre el polipéptido compuesto de la invención. Las especies de reticulación pueden ser utilizadas ventajosamente para efectuar, por medio de su porción de N-hidroxisuccinimidilo, por ejemplo una glicosilación, una sililación o una pectinilación del polipéptido compuesto de la invención. De acuerdo con una modalidad adicional de la invención, Cysl y/o Cys2 son derivados con una porción de derivación que comprende un grupo sulfhidrilo, en particular en donde la porción de derivación es Cys2 unida a Cysl por un enlace de disulfuro. El escenario en el cual Cysl forma un enlace de disulfuro con Cys2 es descrito anteriormente. Un ejemplo adicional de una derivación de Cysl o Cys2 con una porción de derivación que comprende un grupo sulfhidrilo es cuando la porción de derivación es un polipéptido o proteína diferente del polipéptido compuesto de la invención, y la derivación es efectuada por la formación de un enlace de disulfuro entre, por un lado, Cysl y/o Cys2 del polipéptido compuesto de la invención y, por el otro lado, con un residuo de Cys del otro polipéptido o proteína. Una posibilidad adicional de una porción de derivación que comprende un grupo sulfhidrilo es una porción de derivación que comprende un grupo del ácido 5-tio-2-nitrobenzoico ( "TNB-tiol" ) . De acuerdo con una modalidad adicional de la invención, tanto Cysl como Cys2 son derivados con porciones de derivación. Esto conduce a dos porciones de derivación por molécula del polipéptido compuesto de la invención. Tal derivación podría ser especialmente ventajosa cuando se deriva un polipéptido compuesto propuesto para su uso como un reactivo formador de imágenes. Esto es a causa de que la doble derivación por polipéptido compuesto podría conducir a una señal de formación de la imagen dos veces tan intensa como podría resultar utilizando un polipéptido compuesto derivado con solamente una porción de derivación por molécula. La doble derivación por polipéptido compuesto también está contemplada porque es ventajosa bajo ciertas circunstancias en las cuales el polipéptido compuesto está propuesto para su uso como un agente terapéutico. Por ejemplo, si se desea PEGilar el polipéptido compuesto previo a la administración terapéutica y un peso molecular total debido a PEG de 40 kD es deseable, se puede probar de manera más ventajosa derivar el polipéptido compuesto en Cysl y Cys2 con dos moléculas respectivas de 20 kD PEG-MAL que derivar solamente en Cysl o Cys2 con una molécula de 40 kD PEG-MAL. En general, la derivación en cada uno de Cysl y Cys2 puede ser efectuada haciendo reaccionar el polipéptido compuesto de la invención con un exceso molar de la porción de derivación. De acuerdo con una modalidad adicional, ya sea Cysl o Cys2 son derivados con una primera porción de derivación, aunque el otro respectivo de Cys2 y Cysl, respectivamente, es derivado con una segunda porción de derivación, en donde la segunda derivación no exhibe ninguna funcionalidad diferente a aquella de bloquear/proteger el residuo de Cys al cual el mismo está unido. Contrario al escenario descrito anteriormente, algunas veces puede ser necesario o ventajoso derivar el polipéptido compuesto de la invención solamente una vez, por ejemplo, cuando se utiliza el polipéptido compuesto como un reactivo de diagnóstico en una situación en donde una correlación 1:1 es necesaria entre la actividad biológica del polipéptido deseado dentro del polipéptido compuesto y la señal medida. Se pueden contemplar escenarios semejantes en los cuales, digamos, podría ser deseable o necesario PEGilar un polipéptido compuesto de la invención en solamente una posición. En tales casos, el polipéptido compuesto puede ser incubado ventajosamente bajo condiciones reductoras suaves, suficientes para reducir el enlace de disulfuro existente entre Cysl y Cys2, pero no algunos otros enlaces de disulfuro existentes de principio a fin de la estructura del polipéptido deseado para estabilizar la estructura posterior. Tal reducción selectiva bajo condiciones suaves típicamente será posible, puesto que los enlaces de disulfuro involucrados en la estabilización de la estructura del polipéptido normalmente serán intercalados dentro de esta estructura del polipéptido y por lo tanto serán escasamente accesibles por los agentes de reducción en solución, en donde más esté expuesto, el EED C-terminal generalmente será más accesible. Después de la abertura del enlace de disulfuro dentro del EED, el polipéptido compuesto de la invención se puede hacer reaccionar entonces con la primera porción de derivación deseada de tal modo que la cantidad molar de la primera porción de derivación sea igual a o ligeramente menor que la cantidad molar del polipéptido compuesto de la invención. El ajuste estequiométrico preciso de esta relación puede ser necesario dependiendo de la primera porción de derivación utilizada, pero tal ajuste radica bien dentro del ámbito del experto practicante. Después de la reacción de ya sea Cysl o Cys2 con la primera porción de derivación, el polipéptido compuesto derivado de manera única puede ser aislado por técnicas estándares y sometido ventajosamente a una reacción adicional con una segunda porción de derivación. La función de la segunda porción de derivación es desactivar el grupo sulfhidrilo libre restante del residuo de cisteína no derivado dentro de EED. Para asegurar que la reacción con la segunda porción de derivación sea eficiente, esta reacción debe ser efectuada ventajosamente en un exceso molar de la segunda porción de derivación con respecto al polipéptido compuesto. En este sentido, una segunda porción de derivación puede ser cualquier porción que reaccionará covalentemente con el resto del residuo de cisteína libre dentro del EED, y puede emplear cualquiera de las químicas de unión mencionadas anteriormente en el contexto de la primera porción de derivación. Puesto que la función de la segunda porción de derivación es solamente hacer no reactivo al residuo de cisteína restante dentro del EED de manera permanente, la segunda porción de derivación no debe interferir con la actividad propuesta del polipéptido deseado o la primera porción de derivación conectada al otro residuo de cisteína en el EED. Por esta razón, la segunda porción de derivación debe ser inerte química y electrostáticamente y tan pequeña como sea posible. Una segunda porción de derivación preferida especialmente es la etil-maleimida. Esta segunda porción de derivación reaccionará con el grupo sulfhidrilo libre del residuo de cisteína restante en el EED para formar un enlace de C-S covalente en la materia ya descrita anteriormente. De acuerdo con una modalidad adicional de la invención, el polipéptido deseado puede ser cualquier polipéptido para el cual la expresión adecuada sea deseable. Esto incluye todas las moléculas de proteína y polipéptido de varios tamaños (es decir, pesos moleculares) , sin importar los puntos isoeléctricos, secuencia de aminoácidos primarios o modificaciones post-traduccionales tales como por ejemplo glicosilación o fosforilación. El polipéptido deseado puede ser ventajosamente un receptor, un ligando o una molécula de aglutinación. El mismo puede ser expresado en los procariotas o en eucariotas, y por sí mismo puede ser de origen natural o recombinante . De acuerdo con una modalidad preferida especialmente de la invención, el polipéptido deseado tiene un número uniforme de residuos de cisteína requeridos para la estabilización de la estructura del polipéptido. Este normalmente será el caso, especialmente cuando el polipéptido deseado es un polipéptido de una sola cadena (es decir, no interactuará con cualquier otra cadena de polipéptidos después de la expresión para formar un producto de polipéptidos de cadenas múltiples) , puesto que cada enlace de disulfuro requerido para la estabilización de la estructura del polipéptido requiere que dos residuos de cisteína estén presentes . De acuerdo con una modalidad preferida especialmente de la invención, el polipéptido deseado es una molécula de aglutinación en la forma de un anticuerpo. Abarcados dentro del significado de "anticuerpo" dentro de esta modalidad de la invención están los anticuerpos mono- y bi-específicos de una sola cadena, así como los anticuerpos que comprenden cadenas de polipéptidos múltiples, tales como las moléculas de inmunoglobulinas (en las cuales puede ser ventajoso expresar cada cadena de polipéptidos constituyentes de las mismas con un EED de su propia especie) o "diabodies" (en los cuales dos moléculas de scFv, cada una con un EED de su misma naturaleza, asociadas linealmente cabeza con cola para formar una especie molecular capaz de aglutinarse a dos antígenos distintos). Tales moléculas de inmunoglobulina pueden ser ya sea monoespecíficas (es decir cada uno de los dos brazos de la inmunoglobulina se aglutinan al mismo antígeno) o bioespecíficas (es decir, cada uno de los dos brazos de la inmunoglobulina se aglutinan a diferentes antígenos) , por ejemplo tales inmunoglobulinas bioespecíficas como las que podrían ser obtenidas de un híbrido-hibridoma. En una modalidad preferida especialmente de la invención, el polipéptido deseado es un anticuerpo de una sola cadena, monoespecífico. Dentro del significado de la presente invención, el término "anticuerpo de una sola cadena, monoespecífico" puede ser entendido como una sola cadena de polipéptidos que comprende al menos una región variable de anticuerpos. Esta región variable del anticuerpo al menos puede estar presente de manera natural, por ejemplo en una biblioteca de anticuerpos de origen natural, o puede ser sintética porque la misma comprende los elementos encontrados en o derivados de la naturaleza, pero estos elementos están presentes en combinaciones no presentes tales como en la naturaleza. Alternativamente, un anticuerpo de una sola cadena, monoespecífico, puede comprender elementos tanto sintéticos como naturales. Estando considerados específicamente dentro del significado del término "anticuerpo de una sola cadena, monoespecífico" , están los anticuerpos de un solo dominio, las moléculas de scFv, así como variantes humanizadas y/o no humanizadas de las mismas. De acuerdo con una modalidad preferida especialmente, adicional, de la invención, el polipéptido deseado puede ser un anticuerpo de una sola cadena, bioespecífico. Dentro del significado de la presente invención, el término "anticuerpo de una sola cadena, bioespecífico" puede ser entendido como dos anticuerpos de una sola cadena, monoespecíficos, como se describe anteriormente, existiendo sobre una sola cadena del polipéptido, y preferentemente separados uno del otro por una secuencia espaciadora de polipéptidos adecuada. Los ejemplos de tales espaciadores pueden ser encontrados por ejemplo en EP 623679 Bl y US 5,258,498. Como tal, el polipéptido compuesto puede representar ventajosamente un anticuerpo bioespecífico derivado. De acuerdo con una modalidad adicional de la invención, el anticuerpo de una sola cadena, bioespecífico, comprende un primer anticuerpo de una sola cadena monoespecífico (la primera porción de aglutinación) que se aglutina específicamente a un antígeno efector y un segundo anticuerpo de una sola cadena, monoespecífico (segunda porción de aglutinación) que se aglutina específicamente a un antígeno objetivo. Esta construcción general tiene la ventaja de que el polipéptido deseado puede aglutinarse específicamente con su primera porción de aglutinación a un antígeno efector de tal modo que el antígeno efector unido por ejemplo, llega a ser activado. La actividad biológica desencadenada por este antígeno efector puede ser dirigida entonces a, por ejemplo, una célula que lleva el antígeno objetivo, a la cual la segunda porción del anticuerpo de una sola cadena, bioespecífico, se une específicamente. Aquí, se va a entender que los términos "primero" y "segundo" no implican restricción con respecto a la localización de las porciones del anticuerpo con relación a la terminación N o la terminación C del polipéptido. Por lo tanto, dentro del ámbito de esta modalidad de la invención está que el polipéptido compuesto comprende un polipéptido deseado en el cual la primera porción de aglutinación que se aglutina específicamente al antígeno efector puede estar localizada hacia el extremo de la terminal C o la terminal N del polipéptido deseado. En una modalidad preferida especialmente de la invención, el antígeno efector es elegido del antígeno CD3 , el antígeno CD64, el antígeno CD89 y el antígeno NKG2D. En otra modalidad preferida de la invención, el antígeno objetivo es elegido de EpCAM, CCR5, CD19, HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (mucina), MUC2 , MUC3 , MUC4 , MUC5AC, MUC5B, MUC7 , hCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, gangliósido GD3 , 9-0-Acetil-GD3 , GM2 , Globo H, fucosil GMl , Poli SA, GD2, carboanhidrasa IX (MN/CA IX), CD44v6, Sonic Hedgehog (Shh) , Wue-1, el antígeno de la célula del plasma, igE (unido a la membrana) , proteoglicano de sulfato de condroitina del melanoma (MCSP) , CCR8, el precursor de TNF-alfa, STEAP, mesotelina, el antígeno A33, el antígeno de las células madre de la próstata (PSCA), Ly-6; desmogleina 4, neoepítope de E-caderina, receptor de acetilcolina fetal, CD25, el marcador CA19-9, el marcador CA-125 y el tipo II del receptor de la substancia inhibidora de Muellerian (MIS) , sTn (antígeno de Tn sialilado; TAG-72), FAP (antígeno de activación de los fibroblastos), endosialina, EGFRvIII, LG, SAS y CD63. Aquí, la totalidad de los antígenos anteriores (los antígenos tanto efectores como objetivos) pueden ser antígenos humanos . En una modalidad muy preferida de la invención, el antígeno objetivo es el antígeno de CD19 humano, mientras que el antígeno efector es el antígeno CD3 humano. Como tal, esta modalidad proporciona un polipéptido compuesto derivado capaz de dirigir el potencial citotóxico de las células T citotóxicas contra los linfocitos B que llevan el antígeno CD19. Tal medicación tiene un gran potencial como un agente terapéutico en el tratamiento de las malignidades de la célula B. Como resultado, es de gran interés derivar tal polipéptido compuesto en su EED con una o más moléculas PEG para incrementar la vida media del suero mientras que simultáneamente se reduce la inmunogenicidad del polipéptido compuesto. En otra modalidad muy preferida de la invención, el antígeno objetivo es el antígeno EpCAM humano, mientras que el antígeno efector es el antígeno CD3 humano. Como tal, esta modalidad proporciona un polipéptido compuesto derivado capaz de dirigir el potencial citotóxico de las células T citotóxicas contra las células que llevan el antígeno EpCAM. El antígeno de EpCAM es expresado en muchas células malignas humanas; tal polipéptido compuesto derivado por lo tanto tiene un gran potencial en el tratamiento de un espectro amplio de los cánceres humanos. Como con el polipéptido compuesto anti-CD3xanti-CDl9 descrito anteriormente, también es de gran interés derivar tal polipéptido compuesto de anti-CD3xanti-EpCAM en su EED con una o más moléculas de PEG. Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición que comprende cualquiera de los polipéptidos compuestos descritos anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método de producción de un polipéptido compuesto, en donde el polipéptido compuesto comprende un polipéptido deseado y es expresado en un rendimiento más elevado que el polipéptido deseado, el método comprende: a) proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido deseado; b) incorporar sobre cualquier extremo de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido deseado una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio mejorador de la expresión ("EED") que codifica la secuencia de nucleótidos que codifica el EED que comprende los codones para el primer y segundo residuos de aminoácidos de cisteína Cysl y Cys2, respectivamente, el codón para Cysl está localizado más cercano al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que el codón para Cys2, en donde los codones para Cysl y Cys2 están separados por una secuencia de nucleótidos que codifica un enlazador del polipéptido, el enlazador está libre de cisteína; y define una longitud suficiente para permitir que Cysl y Cys2 se acoplen en un enlace de disulfuro intramolecular entre sí; c) transfectar la secuencia de nucleótidos desde la etapa (b) en un sistema de expresión hospedero en un vector adecuado; d) incubar el sistema de expresión hospedero bajo condiciones adecuadas para conducir a la expresión de la secuencia de nucleótidos de la etapa (b) ; e) aislar el polipéptido expresado en la etapa (d) para obtener el polipéptido compuesto. Una modalidad preferida de este aspecto de la invención comprende la etapa adicional de derivar el polipéptido compuesto obtenido en la etapa (e) en Cysl y/o Cys2. Tal derivación puede ser efectuada como se describió anteriormente, especialmente por la reducción del enlace de disulfuro intramolecular entre Cysl y Cys2 (este enlace de disulfuro intramolecular por sí mismo es observado como una derivación) bajo las condiciones reductoras (por ejemplo utilizando ditiotreitol, o DTT), seguida por la reacción del producto reducido con otra porción de derivación que lleva un grupo químico que reacciona con al menos uno de los grupos libres de tiol de Cysl y Cys2. La invención será descrita ahora con mayor detalle por medio de las siguientes figuras y ejemplos no limitativos . Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es un ensayo de ELISA específico para el antígeno que depende de la longitud del enlazador entre Cysl y Cys2. La figura 2 es un ensayo de ELISA específico para el antígeno cuyos resultados son una medida de los rendimientos de la expresión con un residuo de cisteína C-terminal, y con dos residuos de cisteína C-terminales separados por un enlazador de 4-glicina. La figura 3 es un ensayo de Western blot cuyos resultados son una medida de los rendimientos de la expresión con un residuo de cisteína C-terminal, y con dos residuos de cisteína C-terminal separados por un enlazador de 4-glicina. La figura 4 es una cromatografía por filtración en gel cuyos resultados muestran un perfil de elución desde un polipéptido compuesto de acuerdo con la invención y un perfil de elución desde un polipéptido con solamente un residuo de cisteína C-terminal. La figura 5 muestra el ensayo de SDS-PAGE de las especies de scFv del monómero y del dímero obtenidas por cromatografía de filtración en gel; los resultados del gel bajo condiciones no reductoras (izquierda) y reductoras (derecha) son mostrados. La figura 6 muestra un ensayo de SDS-PAGE de scFv con uno y dos residuos de cisteína C-terminales, antes y después de la reacción con PEG-maleimida de 20 kD. Descripción Detallada de la Invención La invención será descrita ahora con detalle adicional por medio de los siguientes ejemplos no limitativos . Ejemplos Ejemplo 1: Clonación y expresión de scFv con una etiqueta (His) 6-Cys- (Gly) 4-Cys-Pro C-terminal (es decir scFv con un EED como se definió anteriormente) Una molécula de scFv, es decir un polipéptido que unifica las regiones variables de anticuerpos de cadena ligera y pesada y un enlazador del polipéptido (Gly4Ser)3 colocado entre las mismas, fue utilizada como una molécula modelo para demostrar el concepto de la invención. Este scFv se aglutina específicamente a un antígeno predeterminado, referido subsiguientemente como el "antígeno" . Un scFv con una etiqueta (His) 6-Cys- (Gly) 4-Cys-Pro C-terminal fue construido por una reacción de PCR con los cebadores específicos para VL, mientras que la secuencia de nucleótidos de scFv fue extendida independientemente con cada una de las secuencias de nucleótidos respectivas de la porción (His) 6-Cys- (Gly)x-Cys-Pro (A: TGCGGTGGCTGCCCGTAA, B: GCGGTGGCGGTTGCCCGTAA, C: TGCGGTGGCGGTGGCTGCCCGTAA, D: TGCGGTGGCGGTGGCTGCCCGTAA) . Esto produjo cuatro secuencias de nucleótidos que codifican 4 scFvs separados, cada uno con una etiqueta C-terminal que tiene dos residuos de cisteína separados por enlazadores de glicina de longitud variable. La His-Tag fue empleada en las etapas de purificación y detección posteriores. Los fragmentos de VL resultantes fueron subclonados por medio de los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción Salí y Notl (introducidos por PCR) en pBADpelB (derivado del vector pBADMycA-His de Invitrogen) que contiene el VH correspondiente debajo de una secuencia delantera de pelB para la expresión periplásmica. Después de la transformación en XLlBlue de E. coli competente en el choque térmico, un clon único fue cultivado en el medio selectivo (LB 50 µg/ml de carbenicilina) y el plásmido fue preparado de acuerdo con los protocolos estándares. La clonación exitosa fue confirmada por secuenciación del inserto (Sequiserve, Munich) . BL21DE3 de E. coli fueron transformados con el plásmido de expresión que codifica para el scFv respectivo con uno o dos residuos Cys C-terminales y se hicieron crecer sobre agar selectivo. Una colonia fue utilizada para inocular 5 ml de LB, 50 g/ml de carbenicilina durante la noche a 37 °C. Para la producción del cultivo, 500 ml del medio de crecimiento SB que contiene 20 mM de MgCl2 y 50 µg/ml de carbenicilina en frascos para agitador de 2 1 fueron inoculados con la suspensión bacteriana del cultivo toda la noche y se incubó adicionalmente a 37 °C hasta una densidad óptica a OD600 de 0.6-0.8. La producción de proteínas fue inducida agregando L-arabinosa hasta una concentración final de 0.2 % y la reducción de la temperatura hasta 30 °C. Después de una fase de producción de cuatro horas a 30 °C, las bacterias fueron colectadas y resuspendidas en 40 ml de PBS. Por medio de cuatro rondas de congelamiento a -70 °C y descongelamiento a 37 °C, la membrana exterior fue destruida por choque de temperatura y las proteínas periplásmicas solubles incluyendo los fragmentos de scFv fueron liberadas hacia el líquido. Después de la eliminación de las células intactas y los desechos celulares por centrifugación, el sobrenadante fue utilizado para el análisis de ELISA. El análisis de ELISA de la preparación periplásmica fue llevado a cabo utilizando una placa de ELISA (Nunc MaxiSorp) recubierta con ProteiñL (2 µg/ml en PBS) . El recubrimiento fue efectuado toda la noche a 4 °C. Después del lavado con PBS 0.05 % Tween, la placa fue bloqueada con 100 µl de PBS que contiene 3 % de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se agregaron 50 µl de periplasma, se diluyeron en serie 1:3 y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de una etapa de lavado adicional, la detección de scFv unido a ProteinL fue llevada a cabo específicamente utilizando 50 µl del antígeno-biotina (1.5 µg/ml que contiene PBS 1 % BSA) detectado por estreptavidina-HRP (Dako, 1 µg/ml en PBS que contiene 1 % de BSA) . La señal fue detectada agregando 100 µl ABTS (sulfonato de 2, 2 ' -azino-di [3-etilbenzotiazolina (6)] en la forma de la sal de diamonio) -solución del substrato durante 15-30 minutos. Los valores de OD fueron medidos sobre un lector de ELISA a una longitud de onda de 405 nm. Los resultados son mostrados en la figura 1, en la cual "HCP", "CH2GlyCP", "HC3GlyCP" , "HC4GlyCP" y "HC5GlyCP" respectivamente se refieren a moléculas de scFv con etiquetas C-terminales que contienen (His) 6-Cys-Pro, (His) 6-Cys- (Gly) 2-Cys-Pro, (His) 6-Cys- (Gly) 3-Cys-Pro, (His) 6-Cys- (Gly) 4-Cys-Pro y (His) 6-Cys- (Gly) 5-Cys-Pro. Como se puede observar en la figura 1, el rendimiento más elevado de scFv que se aglutina al antígeno fue observado para la construcción con cuatro glicinas utilizadas como el enlazador entre las dos cisteínas C-terminales . Ejemplo 2: Confirmación del rendimiento de proteína más elevado de scFv con la etiqueta de (His) 6-Cys- (Gly) 4-Cys-Pro (es decir un EED, como se definió anteriormente) cuando se compara con el scFv con la etiqueta de (His) 6-Cys-Pro (es decir sin un EED como se definió anteriormente) Los niveles de expresión de la proteína del scFv extendido con la etiqueta de (His) 6-Cys- (Gly) 4-Cys-Pro (es decir scFv con el EED como se definió anteriormente, referido como "4Gly" en la figura 2) y el scFv extendido con la etiqueta (His) 6-Cys-Pro C-terminal (es decir scFv sin el EED como se definió anteriormente, referido como "HCP" en la figura 2) fueron comparados. Ambas construcciones fueron analizadas a escala pequeña utilizando la cepa BL21DE3 de E.coli. En cada caso, 10 diferentes colonias fueron inoculadas en 5 ml de SB/20 mM MgC12/50 µg/ml de carbenicilina durante cuatro horas a 37 °C en un incubador de agitación. Nuevamente la producción de proteína fue iniciada por la adición de L-arabinosa al 0.2 % a los cultivos de la célula y una reducción de la temperatura a 30 °C. Después de un período de inducción toda la noche, las células fueron colectadas, resuspendidas en 1 ml de PBS y la fracción periplásmica fue aislada por el método de congelamiento/descongelamiento y se analizó en un ensayo de ELISA específico para el antígeno como se describió en el ejemplo 1. Los resultados de este análisis se muestran en la figura 2. Los resultados de ELISA muestran claramente el rendimiento incrementado significativamente de scFv con la etiqueta (His) 6-Cys- (Gly) 4-Cys-Pro ("4Gly") en el periplasma sin refinar cuando se compara con las especies de scFv que contienen una porción (His) 6-Cys-Pro C-terminal, pero que carecen de un segundo residuo de cisteína. Claramente, entonces, la capacidad para formar un enlace de disulfuro intramolecular, controlado, entre los dos residuos de cisteína en la etiqueta C-terminal (es decir el EED como se definió anteriormente) es de importancia crucial para lograr los rendimientos de producción mejorados observados. Las fracciones periplásmicas fueron analizadas adicionalmente por SDS-PAGE no reductor seguido por las técnicas de Western blot de acuerdo con los protocolos estándares. La detección del scFv etiquetado con His fue efectuada utilizando un anticuerpo anti-penta His, Qiagen (1 µg/ml en PBS que contiene 0.1 % de BSA) detectado con un anticuerpo de anti-ratón, de cabra, conjugado con fosfatasa alcalina, Sigma (1 µg/ml en PBS que contiene 0.1 % de BSA). El ensayo blot de la proteína fue desarrollado agregando la solución del substrato de BCIP/NBT (Sigma, B-1911) . Los resultados son mostrados en la figura 3. Las fajas 1 y 2 del ensayo de Western blot mostrado en la figura 3, muestran bandas de scFv con (His)6-Pro en el extremo C-terminal. La intensidad de las bandas de scFv en el ensayo Western blot - y por lo tanto la cantidad del polipéptido total expresado - se observa que se reduce drásticamente en las fajas 3 y 4, correspondiendo a scFv con
(His) 6-Cys-Pro en el extremo C-terminal del polipéptido. Las fajas 5 y 6, que corresponden a scFv con (His) 6-Cys- (Gly) 4-Cys-Pro en el extremo C-terminal del polipéptido, muestran una intensidad de la banda que es comparable una vez más con la intensidad observada en las fajas 1 y 2. Esto demuestra claramente que la pérdida en la expresión de la proteína sufrida agregando un solo residuo de cisteína al extremo C-terminal del polipéptido de scFv (fajas 3 y 4) fue obtenida nuevamente agregando un segundo residuo de cisteína, separado del primer residuo de cisteína por un enlazador del polipéptido que permite la formación del enlace de disulfuro entre los dos residuos de cisteína (fajas 5 y 6) . Tomados conjuntamente, los resultados de los ensayos de ELISA (figura 2) y de Western Blot (figura 3) muestran claramente el rendimiento de proteína más elevado/scFv de la construcción de scFv con dos residuos de cisteína C-terminales cuando se compara con la construcción scFv con solamente una cisteína C-terminal. Ejemplo 3: Purificación de scFv con la etiqueta (His)6-Cys-(Gly) 4-Cys-Pro (es decir el EED, como se definió anteriormente) BL21DE3 de E.coli fue transformado con el plásmido de la expresión y se hizo crecer sobre el agar selectivo. Una colonia única fue utilizada para inocular 5 ml de LB, 50 µg/ml de carbenicilina toda la noche a 37 °C. Para la producción del cultivo, 500 ml de SB/20 mM MgCl2/50 µg/ml de carbenicilina en recipientes de agitación de 2 1 fueron inoculados con la suspensión bacteriana del cultivo toda la noche y se hicieron crecer a 37 °C hasta una densidad óptica a OD600 de 0.6-0.8. La producción de proteína fue inducida agregando L-arabinosa a una concentración final de 0.2 % y la reducción de la temperatura a 30 °C. Después de una fase de producción toda la noche a 30 °C, las bacterias fueron colectadas y resuspendidas en 40 ml de PBS. La membrana externa fue destruida por el choque térmico y las proteínas periplásmicas solubles incluyendo el fragmento de scFv fueron liberadas hacia el líquido. Después de la eliminación de las células intactas y los desechos celulares por centrifugación, el sobrenadante fue purificado adicionalmente. Las moléculas de SCA fueron purificadas inicialmente por una columna de afinidad IMAC que interactúa con el His-Tag C-terminal. Esto fue efectuado utilizando una columna de superflu o Ni-NTA Qiagen de acuerdo con el protocolo provisto por el fabricante. La columna fue equilibrada con fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0.4 M, pH 7.2 y la preparación periplásmica
(40 ml) fue aplicada a la columna a una velocidad de flujo de
2 ml/min. Después de esto, la columna fue lavada con 5 volúmenes de la columna del amortiguador de equilibrio que contiene imidazol 0.025 M para remover la muestra no unida. La elución fue llevada a cabo utilizando el amortiguador de equilibrio que contiene 0.5 M de imidazol en 5 volúmenes de la columna. Las fracciones de proteína eluida fueron agrupadas para las etapas de purificación adicionales.
Para lograr una separación del peso molecular, es decir la separación en las fracciones monoméricas, diméricas y multiméricas, la cromatografía por filtración en un gel fue efectuada sobre una columna grado prep Superdex S75 equilibrada con PBS (Gibco) . La proteína eluida verificada por la medición continua de absorción de la luz de 280 nm (velocidad de flujo de 1 ml/minuto) fue sometida a SDS-PAGE estándar. Los resultados son mostrados en la figura 4. La figura 4 muestra dos perfiles de elución A y B, el perfil inferior (perfil A) es el perfil de elución de scFv con una porción (His) 6-Cys-Pro C-terminal, el perfil más elevado
(perfil B) es el perfil de elución de scFv con una porción
(His) 6-Cys- (Gly) 4-Cys-Pro C-terminal (es decir scFv con el
EED como se definió anteriormente) . Como se observa claramente, la incorporación de un segundo residuo de cisteína en la porción C-terminal del scFv en la separación adecuada del primer residuo de cisteína para la formación de un bucle de disulfuro conduce no solamente a una relación más elevada del producto de monómero : dímero, sino también a un rendimiento de proteína total más elevado sin importar la isoforma de monómero o dímero. Este análisis óptico obvio es corroborado por el cálculo de las concentraciones de la isoforma. Las concentraciones de la proteína fueron calculadas utilizando el valor de AUC (determinado por el software UNICORN) y el coeficiente de extinción específico para la secuencia. Los valores de la concentración obtenidos son resumidos posteriormente en la tabla 1: Tabla 1
De la tabla anterior, se pueden hacer las siguientes deducciones. En primer lugar, la proporción de monómero : dímero para scFv con un residuo de cisteína único en su porción C-terminal es de aproximadamente 1:2.25. Por la adición de una segunda cisteína a la porción C-terminal del scFv y colocando un enlazador adecuado entre el primer y segundo residuos de cisteína, se promueve un enlace de disulfuro intramolecular y la proporción del monómero : dímero del scFv obtenido es incrementada aproximadamente 5.5 veces, hasta 1:0.4. Visto desde el punto de vista del rendimiento del polipéptido total sin tomar en cuenta la isoforma del polipéptido, el incremento en el rendimiento desde 276.6 µg para el scFv con un residuo de cisteína único hasta 775.2 µg para el scFv con dos residuos de cisteína representa un incremento en la expresión de la proteína total de aproximadamente 280 %, o de casi 3 veces. El análisis de la fracción monomérica y dimérica filtrada con un gel por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y no reductoras (figura 5) mostró claramente que aproximadamente 80 % de la fracción dimérica del scFv con un cisteína única en su porción C-terminal es dimérica, reticulada por el enlace de disulfuro (figura 5, gel no reductor, faja 2), mientras que la fracción dimérica del scFv con dos residuos de cisteína en su porción C-terminal existe principalmente como un monómero, debido a la formación de un bucle de disulfuro entre los dos residuos de cisteína C-terminales (figura 5, gel no reductor, faja 4) . La desagregación del dímero en el monómero (figura 5, gel no reductor, faja 4) es una indicación de que la agregación ha ocurrido solamente por la interacción de proteína-proteína y no fue debida a la reticulación del disulfuro. Las fajas 1 y 3 de la figura 5 (condiciones reductoras y no reductoras) muestran las fracciones del monómero correspondientes. Las mismas muestras también fueron corridas sobre un gel reductor (figura 5) . Con respecto al scFv sin la etiqueta de (His) 6-Cys- (Gly) 4-Cys-Pro, las fajas 2 muestran que cualquier dímero presente en el gel no reductor fue debido en efecto a la formación de enlaces de disulfuro no deseados entre los residuos de cisteína en dos moléculas de polipéptidos respectivas. Esto mismo es verdadero para la cantidad mínima residual del dímero del scFv con la etiqueta (His) 6-Cys- (Gly) 4-Cys-Pro (faja 4). Las condiciones reductoras dentro del gel reductor son suficientes para abrir estos enlaces de disulfuro de modo que las únicas bandas observadas son las especies monoméricas del polipéptido de scFv en las cuales ningún residuo de cisteína dentro de los scFvs es capaz de formar enlaces de disulfuro con cualquier otro residuo de cisteína. Ejemplo 4: PEGilación dirigida al sitio de scFvs con y sin la etiqueta de (His) 6-Cys- (Gly) 4-Cys-Pro C-terminal La PEGilación en las cisteínas libres debe conducir a un conjugado de scFv-PEG homogéneo, estable. Dos soluciones de proteína que contienen, respectivamente, el scFv purificado con la etiqueta (His) 6-Cys- (Gly) 4-Cys-Pro C-terminal y scFv con la etiqueta (His) 6-Cys-Pro C-terminal fueron incubadas con DTT a una concentración final de 2 mM durante una hora a temperatura ambiente para reducir el puente de disulfuro terminal, conduciendo a dos grupos de sulfhidrilo libres. La filtración con un gel (Sephadex G25 M, Amersham) de cada polipéptido separadamente para remover el DTT residual fue efectuada entonces utilizando PBS como un amortiguador de la corrida. La mPEG-maleimida MW 20 kD (Shearwater, 2D2M0P01) fue agregada a la primera mitad de cada muestra del polipéptido en un exceso molar de 10 veces de las moléculas de PEG. El término "mPEG" lleva aquí el significado conocido, especialmente "metoxi polietilenglicol". La otra mitad de cada muestra del polipéptido fue incubada con un exceso molar de 10 veces de etilmaleimida (Sigma, E-1271) como un control. Cada reacción se dejó que ocurra durante 2 horas con agitación a temperatura ambiente. Todas las muestras fueron analizadas por SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras y se tiñeron con plata de acuerdo con los protocolos estándares (Invitrogen, Cat. No. LC6100). Los resultados son mostrados en la figura 6. La faja 1 de la figura 6 muestra el scFv con (His) 6-Cys-Pro en su extremo C-terminal. El residuo de cisteína ha sido bloqueado por la reacción con etilmaleimida. La faja 2 de la figura 6 muestra un scFv con (His) 6-Cys- (Gly) 4-Cys-Pro en su extremo C-terminal, en el cual ambos residuos de cisteína han sido bloqueados por la reacción con etilmaleimida. Las intensidades relativas de las bandas en las fajas 1 y 2 (es decir la banda en la faja 2 es mucho más intensa que la banda en la misma posición en la faja 1) es una medida de la eficiencia de expresión mejorada lograda cuando se expresa el scFv con dos residuos de cisteína C-terminales cuando se compara con aquella lograda cuando se expresa el scFv con un solo residuo de cisteína C-terminal.
La faja 3 de la figura 6 muestra el resultado de la unión de un scFv con un residuo de cisteína C-terminal único con PEG-maleimida de 20 kD de peso molecular. Como se puede observar en la porción superior de la faja 3, solamente una banda muy pálida de scFv unido a PEG fue obtenida, la palidez de la cual es probablemente una indicación de los pobres rendimientos de la expresión, y por lo tanto de las cantidades absolutas menores de scFv obtenidas utilizando scFv con solamente un solo residuo de cisteína C-terminal. En contraste intenso, la faja 4 de la figura 6, en la cual el scFv con dos residuos de cisteína C-terminales separados entre sí por un enlazador de 4-glicina se ha hecho reaccionar con PEG de 20 kD, muestra dos bandas distintas. Una banda está en el mismo peso molecular que las especies que no reaccionaron, correspondientes, indicando que la reacción con PEG de 20 kD no procedió hasta su complemento. La otra banda más elevada a un peso molecular más pesado es una indicación de que el PEG de 20 kD ha reaccionado con ambos de los dos residuos de cisteína en la porción C-terminal del scFv, porque es de peso molecular más elevado que el producto de PEGilación del scFv con solamente un residuo de cisteína C-terminal único. Se debe enfatizar que solamente fue posible obtener un material de partida que contiene suficiente cisteína para la reacción de PEGilación subsiguiente por la incorporación de no sólo uno, sino de dos residuos de cisteína en la porción C-terminal del scFv, separados entre sí por un enlazador de 4-glicina. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.