KR20070042967A - 발현 증강된 폴리펩티드 - Google Patents

Abstract

복합 폴리펩티드에 있어서, 상기 복합 폴리펩티드는 원하는 폴리펩티드와 발현 증강 도메인(expression enhancing domain:"EED")을 포함하고, 상기 EED는 제1 및 제2 시스테인 아미노산 잔기 Cys1 및 Cys2 각각을 포함하며, Cys1은 Cys2보다 상기 복합 폴리펩티드 분자의 N-말단에 더 가깝게 위치하며, 상기 Cys1 및 Cys2는 폴리펩티드 링커에 의하여 분리되며, 상기 링커는 - 시스테인 및 프롤린이 없고; - Cys1 및 Cys2가 서로 분자내 디설피드 결합에 참여할 수 있도록 충분한 길이를 정의하고; - 수용액에서 제2 폴리펩티드 구조가 실질적으로 없는 유연한 폴리펩티드 배좌를 가지며, 여기서 Cys1 및 Cys2의 적어도 어느 하나는 유도체화 성분에 의하여 유도체화된다.

복합폴리펩티드, 발현, EED, 시스테인아미노산, 폴리펩티드링커, 디설피드결합, 유도체화

Description

발현 증강된 폴리펩티드 {Expression-enhanced polypeptides}

본 발명은 발현특성을 개선하기 위하여 변성된 폴리펩티드 분자들(polypeptide molecules)에 관한 것이다. 상기 변성 폴리펩티드 분자들은 이들의 대응하는 결합 파트너, 즉 (핵산 수준으로) 변성되지 않은 폴리펩티드 분자들보다 더 양호한/높은 수율로 발현된다. 또한, 본 발명은 이러한 폴리펩티드들을 포함하는 조성들에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 앞서 언급한 변성 폴리펩티드 분자들을 제작하는 방법에 관한 것이다. 숙련된 자라면 응당 이하의 기재에 의하여 (복합(composite)) 폴리펩티드에 관한 언급은 그 자체가 상기 폴리펩티드 및 적절하게 상기 대응하는 핵산배열을 암시하는 것임을 이해할 것이다. 이는 (원하는) 폴리펩티드((desired) polypeptide)와 발현 증강 도메인(Expression-Enhancing Domain: EED)도 마찬가지이다.

미생물 숙주계에서의 재조합 폴리펩티드 발현은 원하는 폴리펩티드를 대량으로 제조하는 효과적인 방법이다. 제조된 폴리펩티드를 진단제 및/또는 치료제로 사용할 경우, 폴리펩티드를 발현되도록 하는 추가적인 변성은 종종 필수적이다. 예를 들어, 진단제로의 사용목적인 폴리펩티드는 고체 지지체에 결합하도록 변성될 필요가 있다. 또는, 상기 폴리펩티드는 소정의 화상처리방법에 의하여 시각화될 수 있 도록 소정의 약제와 결합시킬 필요가 있다. 치료과정의 일부로서 환자에게 주입될 목적의 폴리펩티드는 생체 내 특성, 예를 들어 그 약물동태 특성을 조절하기 위하여 변성될 필요가 있다.

재조합 제조된 폴리펩티드의 유도체화는 화학물질("유도체화 성분(derivatization moiety)")과 상기 폴리펩티드 내에 포함된 하나 이상의 아미노산의 활성측기(reactive side group) 간의 화학반응에 의하여 대부분 달성된다. 그 결과는 상기 폴리펩티드에 대한 상기 유도체화 성분의 공유결합인데, 여기서 이러한 결합(들)의 위치(location) 및 결합가(valency)는 상기 폴리펩티드 내의 활성 아미노산들(reactive amino acids)의 각 위치 및 숫자에 의하여 결정된다. 이는 다수의 활성 아미노산을 지닌 폴리펩티드 내에서 상기 폴리펩티드와 유도체화 성분의 화학결합이 상기 활성 아미노산의 위치에 대응하여 상기 폴리펩티드 전체에 걸쳐 다수 회 일어난다는 것을 의미한다.

일부 목적에서는 하나의 폴리펩티드에 대한 유도체화 성분의 이러한 다가 불특정 사이트 결합(multivalent, site-non specific coupling)이 바람직할 수는 있으나, 대부분은 그렇지 않다. 예를 들어, 진단과정에 있어서는 폴리펩티드 분자 당 유도체화 수를 하나로 제한하는 것이 측정값의 정확한 정량화를 위하여 중요할 수 있다. 이와 유사하게, 생체 내 폴리펩티드의 성공적인 치료용도의 사용은 이러한 폴리펩티드의 생물학적 활성을 정확하게 예견하여 제어할 수 있는 의료 종사자의 능력에 종종 달려있다. 이러한 상황에서 사용된 폴리펩티드의 제어되지 않은 사이트-비특이적 유도체화로부터 발생하는 변화는 당연히 의도된 치료과정과 불일치할 수 있다. 더구나, 유도체화 성분과 치료용 또는 진단용 폴리펩티드의 사이트-비특이적 결합으로 인하여 폴리펩티드의 원하는 활성에 손상을 가져올 수 있다. 즉, 이는 예를 들어 단일쇄 항체 폴리펩티드(a single chain antibody polypeptide)가 불특정 사이트 형태로 유도체화됨으로써 상기 항원결합 사이트가 입체적 및/또는 정전기적으로 항원으로의 결합을 방해받거나 또는 그 결합활성이 감소되는 경우이다. 이러한 경우, 상기 단일쇄 항원의 원하는 치료효과 또는 진단효과는 없거나 또는 적어도 약화될 수 있다.

따라서, 유도체화가 상기 폴리펩티드 분자 내에서 예정된 위치들 또는 단 하나의 예정된 위치에서만 가능하도록 재조합 폴리펩티드를 설계하는 것이 종종 바람직하다. 상기 결합가는 상기 폴리펩티드 내에의 활성 아미노산의 수를 조절함으로써 조절될 수 있고, 상기 원하는 폴리펩티드 활성 및/또는 화학적 특성은 이러한 결합이 폴리펩티드의 주위 다른 분자들과의 상호작용을 물리적으로 손상하지 않도록 결합 위치를 설계함으로써 조절될 수 있다.

이러한 점에서 유용하다고 증명된 바 있는 한 아미노산이 시스테인(cysteine)이다. 디설피드 결합(disulfide bond)의 형성을 통해 단백질 구조를 안정시키는 중요성 때문에, 일반적으로 시스테인은 폴리펩티드 내에서 정해진 위치에서만 나타난다. 원하는 폴리펩티드 활성을 위해 직접적으로는 요구되지 않는 상기 폴리펩티드의 "양성(benign)" 영역에 단일의 시스테인을 결합시킴으로써 시스테인의 활성 설프하이드릴 측쇄(reactive sulfhydryl side chain)를 원하는 폴리펩티드 활성에 영향을 크게 미치지않거나 또는 전혀 미침이 없이 원하는 유도체화를 위 한 자연적 정착지점(anchor point)으로 이용할 수 있다(Volkel T., et al. (2004) Biochim Biophys Acta 1663, 158-66).

그러나, 유도체화를 위한 목적으로 폴리펩티드 내로 부가적인 시스테인을 편입(incorporation)하는 것은 특정한 손실을 수반한다. 종종, 상기 원하는 폴리펩티드는 구조적 안정화를 위하여 이미 자체의 아미노산 배열 내에 시스테인 잔기들(cystein residues)을 가지고 있을 것이다. 이 경우, 유도체화 성분으로 폴리펩티드를 유도체화할 목적으로 부가의 시스테인을 편입한다면, 이렇게 이미 존재하는 시스테인들과 바람직하지 않은 디설피드 결합들(disulfide linkages)을 개시하여 원하는 활성을 위해 필수적인 폴리펩티드 구조를 심하게 교란시킬 수 있다.

비록 상기 원하는 폴리펩티드가 자신의 아미노산 배열 내에 어떠한 시스테인도 함유하고 있지 않다 하더라도, 단일의 시스테인 잔기를 편입하는 것은 여전히 문제를 야기할 수 있다. 숙주생물 내 발현에 뒤이어, 설계된 시스테인 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드들은 각각의 폴리펩티드들 내의 2개 시스테인 잔기의 티올(thiol; 즉, 설프하이드릴)기들 간의 분자간 디설피드 결합들(intermolecular disulfide bonds)을 통하여 서로 폴리펩티드 이량체들(polypeptide dimers)을 형성할 수 있다(Albrecht H., et al. (2004) Bioconjug Chem 15, 16-26; Olafsen T., et al. (2004) Protein Eng Des Sel 17, 21-7). 이러한 위험은 폴리펩티드를 제조하기 위하여 원핵생물 발현계(prokaryotic expression systems)를 사용하는 경우 특히 크다. 왜냐면, 이들 계에서는 단백질이 미생물 숙주의 세포주변강(periplasmatic space)으로 수송되며, 여기서 산화적 조건(oxidative conditions)이 우세해진다. 이러한 산화적 조건은 미완성 폴리펩티드쇄(nascent polypeptide chain)에서의 바람직하고 구조 안정적인 디설피드 결합들의 형성에는 필수적인 반면, 2개의 각기 폴리펩티드들에서의 추후 유도체화 지점들(later derivatization points)로 의도된 유리 시스테인 잔기들간에 바람직하지 않은 분자간 디설피드 결합들의 형성을 촉진한다.

이는 원핵생물에서의 발현에만 한정되지 않는다. Luo et al. (1997) J Biochem 121, 831-4 논문에는 scFv 폴리펩티드가 C-말단(C-terminal) 시스테인 잔기를 하나 또는 2개 포함하는지의 여부에 따라 효모-발현 단량체 scFv 폴리펩티드(yeast-expressed monomeric scFv polypeptide)와 효모-발현 이량체 scFv 폴리펩티드(yeast-expressed dimeric scFv polypeptide: 즉, 하나의 분자간 디설피드 결합을 통하여 결합되는)의 양을 비교하는 실험들이 기술되었다. 2개의 C-말단 시스테인 잔기를 지닌 scFv는 단량체 형태로 존재하기가 더 쉬운 반면에, 하나의 C-말단 시스테인 잔기를 지닌 scFv는 이량체 형태로 존재하기가 더 쉽다는 것이 발견되었다. 또한, 이 논문에 의하면, 발현된 폴리펩티드의 전체량은 아이소폼 분포(isoform distribution)에 관계없이 동일하게 잔존한다는 것이 명백하다. 더구나, 2개 시스테인 잔기(분자내 디설피드 결합을 형성하는 경향을 나타내는)를 가지는 구조는 불량한 결합활성을 나타낸다는 점이 밝혀졌다.

특히, 치료용도로 폴리펩티드를 발현시키는 경우에는 종종 생산물 균일성을 위하여 이량체 아이소폼보다는 단일체 아이소폼을 제조하는 것이 중요하다. 이에 따라, 선행기술, 즉 Luo et al.의 상기 논문은 시스테인에서 유도체화될 수 있는 단량체 폴리펩티드를 발현시키는데 관심있는 연구자에게 이러한 목적을 달성할 수 있는 특정한 수단들을 제공한다. 그러나, 상기 선행기술에서는 상기 (단량체) 아이소폼을 만족할만한 양으로, 그리고 만족할만한 결합활성을 지니도록 발현시키기에 적합한 수단은 제공하지 않는다.

따라서, 본 발명의 목적은 만족할만한 결합활성을 나타내는 폴리펩티드의 고수율 발현이 가능하고 상기 폴리펩티드는 주로 단량체 폴리펩티드로서 획득되는 DNA 구조체를 개발하는 것이다.

발명자들은 본 발명에 의하여 청구범위에 정의된 바와 같은 이른바 복합 폴리펩티드(composite polypeptide)를 인코딩(encoding)하는 핵산을 제공함으로써 이 목적을 달성하였다. 상기 핵산은 적절하게 발현되는 경우 복합 폴리펩티드를 제공하며, 상기 복합 폴리펩티드는 하나의 원하는 폴리펩티드(desired polypeptide)와 발현 증강 도메인(expression enhancing domain: "EED")을 포함하고, 상기 EED는 각각 제1, 제2 시스테인 아미노산 잔기인 Cys1 및 Cys2를 포함하고, Cys1은 재조합 폴리펩티드 분자의 N-말단(N-terminus)에 Cys2보다 더 가깝게 위치되고, Cys2는 하나의 폴리펩티드 링커(linker)에 의하여 분리된다. 상기 링커는

·시스테인 및 프롤린(proline)이 없고;

·Cys1 및 Cys2가 상호의 분자내 디설피드 결합 내에 관계될 수 있도록 충분한 길이를 정의하며;

·수용액에서 제2 폴리펩티드 구조가 실질적으로 없는 유연한 폴리펩티드 배좌(flexible polypeptide conformation)를 가지며, 여기서 Cys1 및 Cys2의 적어도 어느 하나는 유도체화 성분(derivatization moiety)에 의하여 유도체화된다.

Cys1과 Cys2 간의 분자내 디설피드 결합의 형성을 촉진하기 위하여 상기 EED 내로 하나가 아닌 2개의 시스테인 잔기 Cys1 및 Cys2를 편입(incorporation)하고 이들 간에 배설된 폴리펩티드 링커 배열의 길이를 조절하며 그 성질을 특정함으로써, 이러한 디설피드 결합은 앞서 기술한 바와 같이 원하지 않는 분자간 또는 분자내 디설피드 브리지(bridge)에 참여할 수 없는 Cys1 및 Cys2를 제공하며 형성된다. 어떤 의미에서는 Cys1 및 Cys2 각각은 다른 것의 보호기(protective group)으로 되는 것이다. 하나의 분자내 디설피드 루프(loop)가 Cys1과 Cys2 간에 형성되었다면, Cys2는 Cys1의 유도체화 성분으로 보일 수 있다. 역으로, Cys1은 Cys2의 유도체화 성분으로 보일 수 있다.

앞서 기술한 바와 같이 2개의 시스테인 잔기를 함유하기 위하여 핵산 수준에서 설계된 복합 폴리펩티드들은 추후(즉, 발현후 및 분리후) 유도체화를 위한 화학적 정착지점들을 지탱한다는 이점을 가진다. 동시에, 원하지 않는 분자간 디설피드 결합들의 형성 위험이 크게 감소한다. 왜냐면, 이 경우 이러한 위험은 폴리펩티드 구조의 (바람직한) 디설피드 안정화를 위한 원하는 폴리펩티드에 존재하는 다른 시스테인 잔기들로부터 주로 발생되기 때문이다. 이러한 디설피드 결합들은 미완성 폴리펩티드가 점차 성장함에 따라 번역(trnaslation) 동안 및/또는 번역 뒤에 산화적 환경에서 보통 형성된다. 그래서, 폴리펩티드 구조의 안정화에 필요한 시스테인의 어떠한 유리 설프하이드릴 기라도 자신의 디설피드 파트너가 비교적 빠르다는 것을 발견하며 이에 따라 더 이상의 원하지 않는 반응들로부터 차단된다. Cys1과 Cys2가 상호 디설피드 결합을 형성할 수 있도록 하기 위하여 길이, 화학적 및 입체적 특성에서 최적화된 링커를 편입함으로써, 확실하게 Cys1과 Cys2는 단지 서로만 반응할 뿐이고, 폴리펩티드 구조의 안정화에 필요하지만 아직 자신의 의도된 상대방 시스테인 잔기와는 반응하지 않은, 폴리펩티드에서 공간적으로 떨어진 시스테인 잔기와는 반응하지 않게 된다. 간단히 말하면, 상기 링커로 말미암아 Cys1과 Cys2는 이중 어느 하나와 폴리펩티드 내의 다른 어떤 시스테인 잔기와의 거리보다도 서로에 대해 더 가까이 있게 된다.

일단 발현되고 분리되면, Cys1과 Cys2 간에 디설피드 결합을 나타내는 이러한 복합 폴리펩티드는 Cys1 및 Cys2 사이의 디설피드 결합(만)을 개방하는데 충분한 환원성 조건(reducing conditions)에 노출될 수 있다. 이후, 각각 다른 Cys1 또는 Cys2 이외의 유도체화 성분들로 Cys1 및/또는 Cys2의 유도체화가 수행될 수 있다.

놀랍게도, 앞서 기술한 손실 없이 유도체화된 폴리펩티드(분리 후에 재유도체화(rederivatize)될 수 있는)를 획득한다는 이점 이외에도, EED를 포함하도록 설계된 폴리펩티드(즉, 본 발명의 의미 내에서의 복합 폴리펩티드)가 EED를 포함하지 않는 폴리펩티드와 비교할 때 그 대응하는 핵산으로부터의 전체 발현이 더 높은 수준을 나타낸다는 점이 발견되었다. 본 발명에 의한 복합 폴리펩티드는 상기 EED가 없는 폴리펩티드보다 더 적은 원하지 않는 이량체를 초래한다고 예상될 수 있겠으나, 만족할만한 결합활성을 지니는 전체 폴리펩티드의 전체 발현이 본 발명에 의한 상기 EED의 편입에 의하여 증가된다는 사실은 종래기술의 교시(예를 들면, 앞서 인용한 Luo 등의 논문)에 기초할 때 도저히 예상할 수 없는 것이다. 따라서, 본 발명의 복합 폴리펩티드는 EED가 없는 원하는 폴리펩티드와 비교할 때 전체적으로 높은 수율로 제조될 수 있으며, 여기서 이량체 복합 폴리펩티드에 대한 단량체 복합 폴리펩티드 비율은 EED가 결핍된 원하는 폴리펩티드의 제조에 있어서 나타나는 비율과 비교할때 증가된다. 이렇게 단량체 폴리펩티드는 이량체 폴리펩티드에 비해 선호될뿐만 아니라, 전체적으로 더 높은 폴리펩티드의 양으로 인해 필요한 만큼 바로 (재)유도체화될 수 있는 훨씬 많은(5배 이상) 단량체 폴리펩티드를 초래한다.

이론에 얽매임이 없이 본 발명자들은 관찰된 전체 발현된 폴리펩티드의 놀라운 증가는 적어도 부분적으로는 EED 내에서 Cys1과 Cys2가 상호 디설피드 결합을 형성하려는 경향에 기인한다고 생각한다. 왜 그러는지를 설명하자면, 앞서 정의한 바의 EED를 포함하지 않는 2개 동일한 폴리펩티드의 차후 발현 도중에 어떤 일이 발생하는지를 생각한다면 도움이 될 수 있다. 앞선 기술의 목적에 따라 이들 동일한 폴리펩티드는 PP1 및 PP2라고 하고, 이들 각각은 상기 동일한 원하는 폴리펩티드뿐만 아니라 단 하나의 시스테인 잔기만을 지닌 그의 일부 C-말단을 포함한다(즉, PP1 및 PP2는 앞서 정의한 바의 EED를 포함하지 않는다). 이때, 상기 번호 1, 2는 다른 폴리펩티드라는 것을 나타내는 것이 아니라 동일한 폴리펩티드들이 발현되는 시계열 순서를 나타낸다.

PP1이 PP2 이전에 발현된다면, PP1은 N→C 방향으로 산화적 세포환경으로 점차적으로 이송될 것이며, 이는 아미노 말단(상기 원하는 폴리펩티드 말단)이 상기 산화적 환경으로 출현하는 최초의 종단(end)으로 된다는 것을 의미한다. 이러한 방식으로 출현하면서, 구조-안정화 디설피드 결합(structure-stabilizing disulfide bond)에 참여할 상기 원하는 폴리펩티드 내의 시스테인 잔기는 단순히 그 파트너 시스테인 잔기를 기다리기만 하면 되며, 상기 파트너 시스테인 잔기는 상기 원하는 폴리펩티드(상기 디설피드 결합이 형성되도록 상기 산화적 환경으로 출현하는)의 상기 C-말단 끝(end)을 더욱 향하여 위치된다. 이러한 과정은 상기 원하는 폴리펩티드 내의 구조 안정화에 필수적인 모든 디설피드 결합이 형성될 때까지 상기 원하는 폴리펩티드가 연속적으로 출현함에 따라 지속된다. 일단 PP1의 원하는 폴리펩티드 요소가 완전히 출현하면(그리고 적절히 접히면), 단 하나의 시스테인 잔기를 지니는 PP1의 C-말단 부분이 나타난다. 그러나, 여기서는 이 단일(single)의 시스테인이 함께 반응하여 디설피드 결합을 형성할 파트너 시스테인이 존재하지 않아 이 단일의 시스테인은 짝지워지지 않은 채로 존재한다. 일단 상기 완료된 PP1이 방출되면, PP1의 상기 원하는 폴리펩티드 부분이 적절하게 접히고 디설피드 안정화(disulfide-stabilized)되며, 상기 분자의 C-말단 부분은 하나의 활성 설프하이드릴기(reactive sulfhydryl group)를 지닌 하나의 시스테인 잔기를 가진다.

PP2가 상기 완성된 PP1이 정주하는 동일한 환경에서 발현되기 시작한다면, PP2의 N-말단(N-terminal) 끝이 처음 출현할 것이다. PP2의 원하는 폴리펩티드 부분 내의 제1 시스테인 잔기는 출현하지만, PP2의 상기 원하는 폴리펩티드 부분 내의 그 시스테인 반응 파트너가 아직 출현하지 않았으므로, 아직 의도된 구조 안정화 디설피드 결합을 형성할 수는 없다. 그러나, PP2의 상기 원하는 폴리펩티드 부분 내의 상기 단일이고 짝지워지지 않은 시스테인 잔기는 상기 이미 완성된 PP1의 상기 C-말단부분 내의 상기 단일이고 짝지워지지 않은 시스테인 잔기와 반응할 수 있다. 이와 같이, PP2의 상기 원하는 폴리펩티드 부분 내의 제1 시스테인 잔기와 PP1의 상기 C-말단부분 내의 짝지워지지 않은 시스테인 잔기 간에 원하지 않는 디설피드 결합이 형성된다. 이러한 시나리오라면, PP2의 상기 원하는 폴리펩티드 부분 내의 제2 시스테인 잔기는 PP2의 상기 C-말단 부분 내의 짝지워지지 않은 시스테인 잔기, 또는 PP2의 상기 원하는 폴리펩티드 부분 내의 다른 시스테인 잔기와 반응할 것이다. 어느 쪽이든 간에, 초래되는 디설피드 결합들의 배열은 부적절하게 조립된 폴리펩티드 복합 결함 또는 상기 원하는 폴리펩티드의 생물학적 활성의 실질적인 결함을 야기할 가능성이 매우 크다.

이렇게 부적절하게 조립된 폴리펩티드는 그렇게 인식되어 세포내 프로테인아제(intracellular proteinase)에 의하여 분해되기 쉽고, 따라서 획득되는 전체 폴리펩티드 양을 감소시킨다. 이렇게 부적절하게 조립된 폴리펩티드가 이러한 방식으로 활발히 분해되지 않는 경우에는 이러한 방식으로 기형화된 다른 폴리펩티드들과의 불용성 응집체로서 존재하기 쉬워 표준적인 폴리펩티드 분리절차 과정에서 적절하게 조립된 폴리펩티드로부터 제거될 것이다. 어떤 경우라도, 이렇게 부적절하게 조립된 폴리펩티드는 표준 폴리펩티드 분리절차에서 최종 획득되는 적절히 조립된 폴리펩티드 양을 저하시킬 수 있다.

이에 반해, 본 발명에 의한 복합 폴리펩티드는 하나의 EED에서 2개의 시스테인 잔기(Cys1 및 Cys2)뿐만 아니라 이들 간에 배설된 하나의 링커를 포함하며, 상기 링커는 Cys1과 Cys2 간의 디설피드 결합 형성을 촉진하도록 최적화된다. PP1과 PP2에 관해 앞서 설명한 바를 감안하여 PP1과 PP2가 본 발명에 의한 복합 폴리펩티드들이라고 가정한다면(즉, 이들 각각은 하나의 EED를 포함한다), 각각의 EED에서의 Cys1 및 Cys2 모두 짝지워지지 않은 채로 남아있게 된다. 왜냐면, 각각의 EED 에서 Cys1 및 Cys2는 상호간에 하나의 디설피드 결합을 가질 것이기 때문이다. 부적절하게 조립된 폴리펩티드가 회피되므로, 생성물이 세포내 프로테인아제에 의하여 분해되거나 및/또는 응집체를 형성하지 않는 효과가 있게 된다. 그 결과, 발현되고 분리된 복합 폴리펩티드 양은 크게 증가된다.

따라서 정리하면, 본 발명에 의한 복합 폴리펩티드의 발현은 폴리펩티드의 단량체:이량체 비율의 증가를 초래한다. 동시에, 획득된 전체 폴리펩티드(상기 폴리펩티드의 아이소폼(isoform)과 관계없이)의 수준 또한 앞서 정의된 상기 EED가 없는 폴리펩티드와 비교하여 증가된다. 최종 결론으로서, 앞서 정의된 EED가 결핍된 상대적 원하는 폴리펩티드에서 관찰되는 것보다도, 앞서 설명하였듯이 상기 EED를 포함하는 복합 폴리펩티드로써 이량체 및/또는 다량체 폴리펩티드의 매우 작은 양과 단량체 폴리펩티드의 매우 더 큰 양이 획득된다.

본 발명의 의미 내에서, "N-말단" 및 "C-말단"은 생화학 분야의 확립된 협정에 따라 이해되어야 한다: 폴리펩티드의 N-말단은 아미노기로 끝나는 폴리펩티드쇄의 종단인 반면, 폴리펩티드의 C-말단은 카르복실기로 끝나는 폴리펩티드쇄의 종단이다. Cys1이 Cys2보다 N-말단에 더 가깝게 위치한다는 사실로 인해 상기 폴리펩티드쇄 내에서 Cys1 및 Cys2의 서로에 대한 위치가 정해진다. 이에 의하여, Cys1 및 Cys2가 포함되는 EED의 위치 또한 정해진다.

본 발명의 이러한 구현예의 의미에 있어서, "유연한 폴리펩티드 배좌(flexible polypeptide conformation)"를 지닌 폴리펩티드 링커는 이것이 3차원 공간 내에서 취할 수 있는 배좌들(conformations)에 있어서 상기 폴리펩티드 링커로 하여금 상기 폴리펩티드쇄 내의 각 공유결합에서 전체적으로 대부분 제한받지 않도록, 다시 말하면 그 길이에만 제한받도록 하는데 충분한 회전 자유도를 갖는 폴리펩티드 링커이다. 따라서, 3차원 공간에서 한 가상점에서 한 종단에 고정된 폴리펩티드 링커를 가상하고 이 점을 중심으로 충분히 신장된 폴리펩티드 링커의 길이에 대응되는 직경으로 구를 정의하면, 상기 폴리펩티드 링커가 "유연한 폴리펩티드 배좌"를 가지는 경우, 이러한 폴리펩티드 링커의 선단(즉, 자유롭고 고정되지 않은 종단)은 반드시 상기 구 상에 또는 상기 구 내부에 위치된 3차원 공간의 어느 지점이라도 마찬가지로 용이하게 접촉할 수 있어야 한다. 이 모델로부터 "유연한 폴리펩티드 배좌"를 가지는 이러한 폴리펩티드 링커는 반드시 예를 들어 알파-헬릭스(alpha-helix) 또는 베타-시트(beta-sheet)의 스트레치(stretches)의 "제2의 폴리펩티드 구조가 실질적으로 없어야"한다는 추론이 가능하다. 폴리펩티드 제2 구조의 기조를 향한 폴리펩티드 링커의 성향이라면 상기 링커의 자유 종단에 의하여 향유되었던 공간적 자유도를 반드시 제한하려하므로, 이로써 이 종단이 앞서 정의된 구 내부에서 닿을 수 있는 지점들에 대하여 이 종단을 억제하게 된다. 이러한 유연성 덕분에 상기 링커는 자신에 대해 두 겹으로 접을 수 있으며, 이로써 Cys1 및 Cys2가 분자내 디설피드 결합을 형성할 수 있게 한다.

바람직하지않은 제2 구조는 질서화(ordered)될 수 있거나(앞서 기술한 바와 같은 알파-헬릭스 또는 베타-시트의 경우와 같이) 또는 만약 예를 들어 프롤린 잔기가 링커 배열 내에 존재한다면(프롤린에서 상기 억제된 고리는 폴리펩티드 기재에서 킹크(kinks)를 일으킨다고 알려져 있다) 예상할 수 있는 바와 같이 무질서화(disordered)될 수 있다. 이론에 구속되지 않고 발명자들은 Cys1 및 Cys2 간 상기 링커의 내재된 유연성이 이들 두 시스테인 잔기들 간의 디설피드 결합의 형성을 확보하는데 있어서 주된 결정요소라고 생각하며, 또한 효율적인 디설피드 결합 형성은 관찰되는 전체 폴리펩티드 발현의 현저한 증진에 연관된다고 생각한다(앞서 기술한 이유들을 참조). 이러한 이유로 인하여 상기 링커의 배열에 프롤린과 같은 아미노산을 포함하는 것을 회피하는 것이 중요하다. 왜냐면, 이러한 편입으로 인하여, 원하는 디설피드 결합이 형성되도록 Cys1 및 Cys2가 서로의 영역으로 이주할 수 있도록 하는데 필수적인 상기 링커의 자유로운 이동이 제한받기 때문이다. 본 발명에 의하면, 상기 링커에 허용되는 아미노산 잔기들은 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Met, Tyr, Asn, Gln을 포함하며 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 의미 내에서, "유도체화된(derivatized)"은 Cys1 및 Cys2의 어느 하나 또는 모두가 "유도체화 성분(derivatization moiety)"과의 반응에 들어간 상황을 나타내는 것으로 이해하여야 한다. 유도체화 성분은 예를 들어 말레이미드기(maleimide group)를 포함하는 화합물, 예를 들어 말레이드기를 포함하는 PEG 분자로 될 수 있다. 이렇게 특히 전형적이고 비제한적인 경우, 초래되는 유도체화된 Cys1 및/또는 Cys2는 상기 말레이드 고리 내의 불포화된 탄소 원자들 중의 하나와 함께 Cys1 및/또는 Cys2의 황 원자에 의한 구핵 공격(nucleophilic attack)으로 초래된 공유 S-C 결합(covalent S-C bond)을 통하여 PEG 분자로써 유도체화될 것이다. 다른 예로서, "유도체화 성분"은 또한 자신이 설프하이드릴기를 포함하는 분자로 될 수 있고, 이로써 초래되는 유도체화된 Cys1 및/또는 Cys2는 공유 S-S 결합(covalent S-S bond), 즉 디설피드 결합을 통하여 이 분자로써 유도체화될 것이다. Cys1 및/또는 Cys2가 동일 또는 다른 폴리펩티드쇄에서 다른 시스테인 잔기와 반응할 수 있다는 것은 "유도체화된"의 의미 내에 있다. 특히, 상술한 바와 같이 Cys1 및 Cys2 간의 원하는 분자내 디설피드 브리지의 형성은 본 발명에서의 "유도체화된"의 의미 내에 해당되는 것으로 이해하여야 한다; 이 경우, Cys1는 Cys2에 의하여 유도체화될 것이며, 역으로도 마찬가지이다. 따라서, 일반적으로 Cys1의 견지에서는 "유도체화된"은 Cys1이 자신 이외의 종(species: 예를 들어, Cys2)과의 공유결합 화학반응에 참여한 모든 시나리오를 포함한다. 마찬가지로, "유도체화된"은 또한 Cys2가 자신 이외의 종(예를 들어, Cys1)과의 공유결합 화학반응에 참여한 모든 시나리오를 포함한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 의하면, 상기 링커에서 아미노산 잔기의 적어도 75%가 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Met, Tyr, Asn, and Gln에서 선택된다.

가장 바람직하기로는 Gly, Ser, Ala 및 Thr이다. 이들 아미노산은 대전되지 않거나 및/또는 물에 잘 용해될 수 있거나 또는 꽤 잘 용해될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 의하면, 상기 복합 폴리펩티드는 단일쇄(single chain) 폴리펩티드이며, 이는 모든 아미노산들이 단일의 펩티드 결합된 폴리펩티드쇄에 있다는 것을 의미한다. 본 구현예는 하나의 원하는 단일쇄 폴리펩티드 생성물의 제조가 매우 효율적으로 달성될 수 있다는 이점을 가진다. 왜냐면, 적절한 생성물 배좌(product conformation)는 단지 필수적인 제2 및 제3 폴리펩티드 구조들만의 설립에 좌우될 것이기 때문이다; 특정한 제3 구조를 나타내는 각각의 폴리펩티드가 분자간 결합하는 제4 폴리펩티드 구조는 상기 발현된 복합 폴레펩티드가 단일쇄 복합 폴리펩티드일 때 고려될 필요가 없다.

본 발명의 다른 일 구현예에 의하면, 상기 EED는 상기 복합 폴리펩티드의 C-말단 끝 또는 N-말단 끝에 위치할 수 있다. 각 위치는 상술한 의도된 이점들, 특히 발현된 복합 폴리펩티드의 관찰된 전체 양의 증가를 수반한다. C-말단에 위치된 EED는 마지막에, 즉 상기 원하는 폴리펩티드 뒤를 이어 발현될 것이며, 상기 EED의 번역(translation)에 앞서 단백질 안정화에 필수적인 것으로서 상기 원하는 폴리펩티드 내의 필수적인 모든 디설피드 결합이 형성될 시간을 가지는 효과를 가진다. 이는 상기 EED가 완전히 번역될 때, 상기 EED 내부의 Cys1 및 Cys2 간의 상기 원하는 디설피드 결합이 형성될 가장 마지막 디설피드 결합일 것이며, 상기 원하는 폴리펩티드의 구조는 이미 어떤 내부 디설피드 결합들에 의해서라도 안정화되었을 것이라는 사실을 의미한다. 따라서, 상기 복합 폴리펩티드의 EED 부분에서 Cys1 또는 Cys2와 상기 바람직한 폴리펩티드 내의 다른 시스테인 잔기 간의 바람직하지 않은 디설피드 결합들 형성의 위험성은 최소화된다.

상기 EED를 상기 복합 폴리펩티드의 N-말단 끝에 위치시킴으로써 상기 EED를 인코딩하는 핵산이 상기 핵산이 상기 원하는 폴리펩티드를 인코딩하기 이전에 번역될 것이라는 효과가 있다. 이는 상기 EED 내부의 Cys1 및 Cys2 간의 디설피드 결합이 상기 원하는 폴리펩티드 내의 다른 모든 시스테인 잔기가 번역되기 이전에 형성될 것이라는 사실을 의미한다. 다시 말하면, 여기서 상기 복합 폴리펩티드의 EED 부분의 Cys1 또는 Cys2와 상기 원하는 폴리펩티드 내의 시스테인 잔기 간에 형성되는 바람직하지 않은 디설피드 결합의 위험성이 최소화된다.

따라서, 상기 복합 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에의 상기 EED 위치는 어디에서 상기 유도체화 성분이 상기 EED에 결합되면 상기 원하는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 최소한으로 교란시킬 것인지를 고려하여 결정될 수 있다. 이러한 방법으로 높은 수준의 실험적 유연성이 달성된다; 실험자는 EED의 존재로써 부여받은 이점들을 희생함이 없이 최종적으로 유도체화된 복합 폴리펩티드에서 최고의 활성을 갖는 원하는 폴리펩티드를 가능하게 할 EED의 위치를 선정하기만 하면 되는 사치를 누리게 된다. 이들 이점은 앞서 설명하였다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 의하면, 상기 복합 폴리펩티드의 EED는 다음의 형태이다:

-Cys1-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m

이때, n은 2-20의 정수; m은 0 또는 1; 그리고, 여기서 Xaa는 어떠한 위치에서도 자연적으로 발생하는 아미노산이며, 여기서 바람직하게는 Xaa 잔기의 적어도 75%, 더 바람직하게는 Xaa 잔기의 적어도 80% 또는 90%가 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Met, Tyr, Asn 및 Gln에서 선택된다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 모든 Xaa는 Gly, Ser, Ala 또는 Thr로 된다. 상기 변수 n을 2부터, 바람직하게는 3부터 20까지의 범위로 함으로써, Cys1 및 Cys2 간의 링커는 Cys1 및 Cys2 간의 디설피드 결합의 형성을 촉진할 만큼 충분하게 길이가 짧지만 아직 상기 링커로 하여금 그 자체 상에 두 겹으로 접을 수 있을 만큼 충분히 길이가 길게 잔존한다. 4-5의 상기 링커 길이는 특히 효율적으로 Cys1 및 Cys2 간의 디설피드 결합을 촉진하는 것이 발견되었고, 4 아미노산 링커 길이는 이 목적에 특히 바람직하다. 본 절에 앞서 기술된 아미노산들 중에서 Gly 및 Ser은 단독 및 혼합으로 이 목적에 특히 적합하다. 이론에 구속되지 않고 본 발명자들은 이것이 Gly가 화학적으로 중성이고 작아서 방해받지 않은 입체적 유연성을 최대수준으로 지니면서도 상기 링커가 바람직하지않은 화학반응들에 참여하는 성향을 감소시키는 사실 때문이라고 생각한다. 상기 아미노산 Ser은 그 하이드록실기(hydroxyl group)를 통하여 적당량의 친수성(hydrophilicity)을 부여하여 이로써 너무 소수성(hydrophobic)인 링커가 상기 원하는 폴리펩티드의 소수성 영역들과 바람직하지 않은 소수성 상호작용에 연관되지 않도록 막는 것을 돕는다고 생각된다. 상기 EED가 상기 복합 폴리펩티드의 상기 N-말단 끝에 위치하는 경우에는 m이 0으로 되는 것이 유리할 수 있다는 것을 주목해야 한다.

또한, 본 발명의 본 구현예에 의하면, Pro의 존재가 요구사항이 아님에도 불구하고(즉, 변수 m 또한 0으로 될 수 있다), Pro 잔기가 Cys2에 이의 C-종단에서 펩티드 결합될 수 있다. Pro의 공급에 의하여 어떤 환경에서는 상기 복합 폴리펩티드의 발현수율을 더 증가시킨다는 것이 발견되었다. 이론에 구속되지 아니하고 발명자들은 이것이 후자의 C-말단 끝으로부터 상기 복합 폴리펩티드의 프로테인아제 저하를 금지하는 프롤린의 능력 때문이라고 생각한다.

본 발명의 특히 바람직한 구현예에 있어서, n＝4이고 (Xaa)4는 (Gly)4, (Gly)3Ser, (Gly)2SerGly, GlySer(Gly)2 또는 Gly(Ser)3이다. 본 발명의 다른 특히 바람직한 구현예에 있어서는, n＝5이고 (Xaa)5는 (Gly)5, (Gly)4Ser, (Gly)3SerGly, (Gly)2Ser(Gly)2, GlySer(Gly)3 또는 Ser(Gly)4이다. 상기 EED의 링커에 있어서 Gly 및 Ser을 단독 및 혼합으로 사용하는 것의 특별한 이점은 앞서 설명한 바 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 4 아미노산 링커 길이는 Cys1 및 Cys2 간의 디설피드 펩티드 루프를 가장 효율적으로 형성시킴이 발견되었다.

또한, 본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 EED는 다음의 형태이다:

(His)j-Cys1-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m 또는 Cys1-(Xaa)n-Cys2-(His)j-(Pro)m

이때, j는 2-15의 정수이고, Xaa, n 및 m은 앞서 정의한 바와 같다. 상기 EED에 poly-His 배열("His-태그")을 Cys1의 N-측 또는 Cys2의 C-측에 편입하는 것은 여러 이점이 있다. 먼저, 종래기술(Porath, J., et al. (1975) Nature 258, 598-9; Sulkowski, E. (1985) Trends in Biotech 3, 1-12)에 알려져 있듯이, His-태그는 폴리펩티드의 차후 검출뿐만 아니라 고정화 니켈 칼럼(immobilized nickel column)을 통해 발현된 폴리펩티드의 분리에 있어서 매우 귀중한 도구이다. 그러나, 아마도 본 발명의 상기 복합 폴리펩티드를 위한 더 큰 이점은 His-태그는 Cys1 및 Cys2 간 원하는 디설피드 결합의 형성에 대한 특별한 효과이고 그리하여 발현으로 얻어지는 복합 폴리펩티드의 전체 량에 대한 특별한 효과이다. 이러한 효과는 상기 EED가 Cys1의 His-태그 N-말단과 함께 상기 원하는 폴리펩티드에 C-말단 위치된 경우, 또는 상기 EED가 Cys2의 His-태그 C-말단과 함께 상기 원하는 폴리펩티드에 N-말단 위치된 경우 (이들 각 경우에서 상기 His-태그는 상기 EED와 상기 원하는 폴리펩티드의 계면에 위치된다)에 특히 나타난다. 이론에 구속됨이 없이 본 발명자들은 이러한 특별한 효과가 다음과 같이 설명될 수 있다고 생각된다: 히스티딘(histidine)은 일반적으로 양의 전하를 띄므로, 반복하는 히스티딘 모티프(histidine motif)에서의 각 히스티딘 잔기들은 정전기적으로 서로 반발되는 경향이 있게 되고, 따라서 상기 히스티딘 잔기들 영역에서 신장된 폴리펩티드쇄로 이어진다. 상기 EED 내의 이러한 히스티딘 모티프를 상기 원하는 폴리펩티드와 상기 EED 간의 계면에 위치시키면, 상기 복합 폴리펩티드의 이들 두 요소는 His-태그의 길이가 허락하는 한 가능한 멀리 서로로부터 신장된다. 이는 한편으로 Cys1 및 Cys2를 포함하는 상기 EED 일부와 다른 한편으로 상기 원하는 폴리펩티드 간의 원하지 않는 상호작용 가능성을 감소시키는 효과를 가진다. 동시에, 상기 EED를 상기 원하는 폴리펩티드로부터 물리적으로 떼어놓음으로써 Cys1 및 Cys2가 서로와 디설피드 결합을 형성할 가능성이 증가된다. 왜냐면, 이 시나리오에서 Cys1 및 Cys2는 초기 복합 폴리펩티드의 그 밖의 나머지로부터 다소간 격리되어 존재하고, 디설피드 결합을 형성하는데 Cys1 또는 Cys2와 경쟁하는 다른 모든 설프하이드릴기들이 존재하지 않으므로, 디설피드 결합은 Cys1 및 Cys2 상의 각 설프하이드릴기들 간에 원하는 형태로 더 잘 형성될 수 있기 때문이다.

본 발명의 특히 바람직한 구현예에 의하면, j＝6, 즉 상기 EED는 다음의 형태이다:

(His)6-Cys1-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m 또는 Cys1-(Xaa)n-Cys2-(His)6-(Pro)m

이때, Xaa, n 및 m은 앞서 정의한 바와 같다.

본 발명의 다른 일 구현예에 의하면, 상기 유도체화된 Cys1 및/또는 Cys2는 Cys1 및/또는 Cys2 잔기(들)과 소정의 유도체화 성분의 반응생성물이며, 상기 유도체화 성분은 예를 들어 말레이미드기(maleimide group), 설프하이드릴기(sulfhydryl group) 또는 피리딜 디설피드기(pyridyl disulfide group)를 포함한다. 이들 모든 화학기들은 설프하이드릴과 공유결합 반응한다. 본 발명의 이러한 구현예의 이점은 상기 복합 폴리펩티드를 유도체화하는데 사용할 관심이 있는 유도체화 성분들 대부분이 상기 기들 중의 어느 하나로 기능화된(functionalized) 형태로 이용가능하다는 점이다. 그러므로, 본 발명의 복합 폴리펩티드는 다양한 치료 및/또는 진단 목적용의 광범위하게 다양한 시약들로 유도체화될 수 있다. 상술한 기들 중에서, 말레이미드기가 특히 바람직하다. 상기 말레이미드기는 상기 복합 폴리펩티드에서의 원하는 폴리펩티드를 손상시키지않을 법한 온화한 반응조건에서 설프하이드릴과 거의 완벽하게 반응하며, 시스테인의 황 원자와 상기 말레이미드기 고리에서의 2개 불포화된 탄소 원자들 중의 어느 하나 간에 튼튼한 공유화학결합을 초래한다.

본 발명의 특히 바람직한 일 구현예에 있어서, 말레이미드기를 포함하는 유도체화 성분은 PEG-말레이미드("PEG-MAL"), 말레이미드-기능화 형광 마커( maleimide-functionalized fluorescence marker), 말레이미드-기능화 분석 검출 마커(maleimide-functionalized assay detection marker), 말레이미드-기능화 방사성 트레이서(maleimide-functionalized radioactive tracer), 말레이미드-기능화 단백질 가교제(maleimide-functionalized protein crosslinker), 말레이미드-기능화 화학요법제(maleimide-functionalized chemotherapeutic agent) 또는 말레이미드-기능화 독소(maleimide-functionalized toxin), 예를 들어 말레이미드-기능화 면역독소(maleimide-functionalized immunotoxin) 중에서 선택된다. PEG-MAL의 적절한 예는 메톡시 PEG-MAL 5 kD, 메톡시 PEG-MAL 20 kD, 메톡시 (PEG)2-MAL 40 kD, 메톡시 PEG(MAL)2 5 kD, 메톡시 PEG(MAL)2 20 kD, 메톡시 PEG(MAL)2 40 kD 또는 이들의 혼합물이다. 이들 시약 모두는 혈청 반감기(serum half time)를 증가시키고 면역원성(immunogenicity)을 감소시키는, 본 발명의 복합 폴리펩티드의 PEG화(PEGylation)의 알려진 이점을 부여한다. 말레이미드-기능화 형광 마커의 적절한 예는 비오틴-말레이미드(biotin-maleimide)와 디곡시제닌-말레이미드(digoxygenin-maleimide)이다. 말레이미드-기능화 방사성 트레이서의 적절한 예는 DTPA-말레이미드이다. 말레이미드-기능화 가교제의 적절한 예는 N-하이드록시석시니미딜-말레이미드 가교종들(N-hydroxysuccinimidyl-maleimide crosslinking species)이며, 이는 그 N-하이드록시석시니미딜 부분을 통하여 결합될 다른 화학 종의 유리 아미노기(free amino group)와 반응하고 그 말레이미드 부분을 통하여 본 발명의 복합 폴리펩티드의 Cys1 및 Cys2의 적어도 어느 하나와 반응한다. 상기 가교종들은 그 N-하이드록시석시니미딜 부분을 통하여 본 발명의 복합 폴리펩티드의 예를 들어 글리코실화(glycosylation), 시릴화(silylation) 또는 펙티닐화(pectinylation)를 초래하는데 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 일 구현예에 의하면, Cys1 및/또는 Cys2는 설프하이드릴기를 포함하는 유도체화 성분에 의하여 유도체화되며, 특히 여기서 상기 유도체화 성분은 디설피드 결합에 의하여 Cys1에 결합된 Cys2이다. Cys1이 Cys2와의 디설피드 결합을 형성하는 시나리오는 상술하였다. 설프하이드릴기를 포함하는 유도체화 성분으로 Cys1 또는 Cys2을 유도체화하는 예는 상기 유도체화 성분이 본 발명의 복합 폴리펩티드 이외의 다른 폴리펩티드 또는 단백질인 경우이며, 상기 유도체화는 일측 상의 본 발명의 복합 폴리펩티드의 Cys1 및/또는 Cys2와 다른 일측 상의 다른 폴리펩티드 또는 단백질의 Cys 잔기 간의 디설피드 결합의 형성으로 달성된다. 추가적으로 가능한 설프하이드릴기를 포함하는 유도체화 성분은 5-티오-2-니트로벤조산(5-thio-2-nitrobenzoic acid:“TNB-티올(TNB-thiol)”)기를 포함하는 유도체화 성분이다.

본 발명의 다른 일 구현예에 의하면, Cys1 및 Cys2는 유도체화 성분들로 유도체화된다. 이는 본 발명의 복합 폴리펩티드 분자당 2개의 유도체화 성분들로 귀결된다. 이러한 유도체화는 화상화 시약(imaging reagent)으로 의도된 복합 폴리펩티드를 유도체화하는 경우 특히 유리할 수 있다. 왜냐면, 복합 폴리펩티드 당 2중 유도체화(double-derivatization)는 분자당 단 하나의 유도체화 성분으로 유도체화된 복합 폴리펩티드를 사용하여 생기는 강도의 2배만큼 화상화 신호를 초래하기 때문이다. 또한, 복합 폴리펩티드당 2중 유도체화는 상기 복합 폴리펩티드가 치료제용으로 의도되는 특정한 상황에서 유리하다고 생각된다. 예를 들어, 만약 치료투여 이전에 상기 복합 폴리펩티드를 PEG화하기를 원하고 40 kD의 PEG에 기인한 전체 분자량을 원한다면, 40 kD PEG-MAL의 일 분자로 Cys1 또는 Cys2에서만 유도체화하는 것보다는 20 kD PEG-MAL의 2개 각 분자들로 Cys1 및 Cys2에서 상기 복합 폴리펩티드를 유도체화하는 것이 더욱 유리할 것이다. 일반적으로 Cys1 및 Cys2 각각의 유도체화는 본 발명의 복합 폴리펩티드를 몰 과잉(molar excess)의 유도체화 성분과 반응시킴으로써 달성될 수 있다.

다른 구현예에 의하면, Cys1 또는 Cys2가 제1 유도체화 성분으로 유도체화되는 반면, 각각 다른 Cys2 및 Cys1은 제2 유도체화 성분으로 유도체화되며, 이때 제2 유도체화는 그것이 결합되는 Cys 잔기를 차단/방어하는 것 이외의 어떠한 기능성도 나타내지 아니한다. 앞서 기술한 시나리오와는 역으로, 본 발명의 복합 폴리펩티드를 단 한번만 유도체화는 것이 때로는 유리하거나 필수적일 수 있다. 예를 들어, 상기 복합 폴리펩티드 내의 원하는 폴리펩티드의 생물학적 활성과 측정된 신호 간에 1:1 상관관계가 필요한 상황에서 진단시약으로서 상기 복합 폴리펩티드를 사용하는 경우가 그렇다. 비슷한 시나리오가 예를 들어 본 발명의 복합 폴리펩티드를 단 하나의 위치에서만 PEG화하는 것이 바람직하거나 또는 필수적인 경우에서 생각될 수 있다. 이러한 경우, 상기 복합 폴리펩티드는 Cys1 및 Cys2 간에 존재하는 디설피드 결합을 환원시키지만 나중의 구조를 안정화하기 위하여 원하는 폴리펩티드의 구조 전체에 존재하는 기타 다른 디설피드 결합들은 환원시키지 않도록 하는데 충분한 온화한 환원성 조건하에서 유리하게 배양될 수 있다. 온화한 조건하에서의 이러한 선택적 환원은 일반적으로 가능할 것이다. 왜냐면, 폴리펩티드 구조의 안정화에 관련된 디설피드 결합들은 이 폴리펩티드 구조 내에 보통 파묻힐 것이고 이에 따라 용액 내 환원제가 접근하기가 어려운 반면, 더 많이 노출되어 있는 C-말단 EED는 일반적으로 더 접근하기가 쉽기 때문이다. 상기 EED 내의 디설피드 결합을 개방하는데 뒤이어 본 발명의 복합 폴리펩티드는 상기 원하는 제1 유도체화 성분과 반응할 수 있게 되며, 이로써 제1 유도체화 성분의 몰량이 본 발명의 복합 폴리펩티드의 몰량과 동일하거나 또는 약간 작게 된다. 사용되는 제1 유도체화 성분에 따라 정밀한 화학양론적인 비율 조절이 필수적일 수 있으나, 이러한 조절은 숙련된 종사자의 전문지식 범위 내에 충분히 있는 것이다.

Cys1 또는 Cys2를 제1 유도체화 성분으로 반응시킨 후에 상기 단일 유도체화된 복합 폴리펩티드는 표준기술에 의하여 격리될 수 있고 제2 유도체화 성분으로 더 반응될 수 있다. 제2 유도체화 성분의 기능은 상기 EED 내의 상기 유도체화되지 않은 시스테인의 남아있는 유리 설프하이드릴기(free sulfhydryl group)를 비활성화하는 것이다. 이 반응은 상기 제2 유도체화 성분이 확실하게 효과적이도록 복합 폴리펩티드에 대해 몰 과잉의 제2 유도체화 성분에서 수행되는 것이 유리하다. 여기서, 제2 유도체화 성분은 상기 EED 내의 남아있는 유리 시스테인 잔기와 공유결합하는 모든 성분으로 될 수 있고, 상기 제1 유도체화 성분과 관련하여 언급된 결합하는 모든 화학물질로 될 수 있다. 제2 유도체화 성분의 기능은 상기 EED 내의 남아있는 시스테인 잔기가 영구적으로 비활성적이 되게 하는 것이므로, 상기 제2 유도체화 성분은 상기 원하는 폴리펩티드의 의도된 활성이나, 상기 EED 내의 다른 시스테인 잔기에 연결된 제1 유도체화 성분의 의도된 활성을 방해해서는 안 된다. 이러한 이유로, 상기 제2 유도체화 성분은 화학적 및 정전기적으로 비활성이고 가능한 작아야한다. 특히 바람직한 제2 유도체화 성분은 에틸-말레이미드(ethyl-maleimide)이다. 이러한 제2 유도체화 성분은 상기 EED 내의 남아있는 시스테인 잔기의 유리 설프하이드릴기와 반응하여 앞서 이미 설명한 바의 공유 C-S 결합을 형성한다.

본 발명의 다른 일 구현예에 의하면, 상기 원하는 폴리펩티드는 적당한 발현이 요망되는 폴리펩티드로 될 수 있다. 이는 등전점(isoelectric points), 초기 아미노산배열(primary amino acid sequence), 또는 예를 들어 글리코실화(glycosylation)나 인산화(phosphorylation)와 같은 원하는 번역후 수정(posttranslational modifications)에 관계없이 다양한 크기(즉, 분자량)의 모든 단백질 및 폴리펩티드 분자들을 포함한다. 상기 원하는 폴리펩티드는 수용체, 리간드 또는 결합분자로 유리하게 될 수 있다. 이는 원핵생물이나 진핵생물에서 발현될 수 있고 그 자체가 천연물 유래나 재조합물 유래일 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 일 구현예에 의하면, 상기 원하는 폴리펩티드는 폴리펩티드 구조의 안정화에 요구되는 짝수의 시스테인 잔기들을 포함한다. 이는 보통 상기 원하는 폴리펩티드가 단일쇄 폴리펩티드(즉, 발현 후 다쇄 폴리펩티드 생성물을 형성하기 위하여 다른 폴리펩티드쇄와 반응하지 않는)인 경우이다. 왜냐면, 폴리펩티드 구조를 안정화하는데 요구되는 각 디설피드 결합은 2개의 시스테인 잔기가 존재할 것을 요하기 때문이다.

본 발명의 특히 바람직한 일 구현예에 의하면, 상기 원하는 폴리펩티드는 항체 형태의 결합분자이다. 본 발명의 본 구현예에서 "항체"의 의미에는 단일쇄 단일특이성(monospecific) 항체 및 2중특이성(bispecific) 항체뿐만 아니라, 면역글로불린 분자(여기서, 이의 각 구성 폴리펩티드쇄를 그 자체의 EED로 발현하는 것이 유리하다) 또는 디아바디(diabody: 여기서, 2개의 scFv 분자들은 그 자체의 하나의 EED와 함께 머리부터 꼬리까지(head-to-tail)를 선형적으로 쌍합하여 2개의 상이한 항원들을 결합할 수 있는 분자종(molecular species)을 형성한다)와 같은 복수 폴리펩티드쇄를 포함하는 항체가 이에 내포된다. 이러한 면역글로불린 분자들은 단일특이성(즉, 상기 면역글로불린의 2개 결합 아암(binding arm) 각각이 상기 동일한 항원에 결합하는), 또는 하이브리드-하이브리도마(hybrid-hybridoma)로부터 획득되는 2중특이성 면역글로불린과 같은 2중특이성(즉, 상기 면역글로불린의 2개 결합 아암 각각이 다른 항원들에 결합하는)일 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 원하는 폴리펩티드는 단일특이성 단일쇄 항체(monospecific single chain antibody)이다. 본 발명의 의미 내에서, "단일특이성 단일쇄 항체"라는 용어는 적어도 하나의 항체 가변영역을 포함하는 단일 폴리펩티드쇄로 이해될 수 있다. 이러한 적어도 하나의 항체 가변영역은 천연적, 예를 들어 천연 유래의 항체 라이브러리(antibody library)에 존재할 수 있거나, 또는 이것이 천연적으로 또는 천연으로부터 유도된 요소들을 포함하나 이들 요소는 천연적으로 존재하지 않는 조합들로 존재한다는 점에서 인공적일 수 있다. 또는, 단일특이성 단일쇄 항체는 천연요소 및 인공요소 모두를 포함할 수 있다. 특히 "단일특이성 단일쇄 항체"인 용어의 의미에 해당되는 것으로는 단일 도메인 항체, scFv 분자뿐만 아니라 이들의 인간화(humanized) 및/또는 탈면역화(deimmunized) 변이체들이다.

본 발명의 다른 특히 바람직한 구현예에 의하면, 상기 원하는 폴리펩티드는 2중특이성 단일쇄 항체일 수 있다. 본 발명의 의미 내에 있어서, "2중특이성 단일쇄 항체"인 용어는 단일 폴리펩티드쇄 상에 존재하는 상술한 바와 같은 2개의 단일특이성 단일쇄 항체들로서 이해될 수 있으며, 바람직하게는 적절한 폴리펩티드 스페이서 배열(polypeptide spacer sequence)에 의하여 서로 분리된다. 이러한 스페이서의 예는 유럽특허공보 EP 623679 B1호와 미국특허공보 US 5,258,498호에서 찾을 수 있다. 이리하여, 상기 복합 폴리펩티드는 유도체화된 2중특이성 항체를 유리하게 대표할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 2중특이성 단일쇄 항체는 특히 이펙터 항원(effector antigen)에 결합하는 제1 단일특이성 단일쇄 항체(제1 결합부분)과 특히 타깃 항원(target antigen)에 결합하는 제2 단일특이성 단일쇄 항체(제2 결합부분)을 포함한다. 이러한 일반적 구조의 이점은 상기 원하는 폴리펩티드가 특히 그 제1 결합부분으로 이펙터 항원에 결합할 수 있고 이로써 상기 결합된 이펙터 항원은 예를 들어 활성화된다. 이때, 이러한 이펙터 항원에 의하여 촉발된 생물학적 활성은 상기 타깃 항원을 지니는 세포로 유도되는데, 이에는 특히 상기 2중특이성 단일쇄 항체의 상기 제2 부분이 결합한다. 여기서, 상기 용어 "제1" 및 "제2"는 상기 폴리펩티드의 N-말단이나 C-말단에 대한 항체부분의 위치에 관하여 한정하는 것임을 내포하지 않는다. 따라서, 특히 상기 이펙터 항원에 결합하는 상기 제1 결합부분이 어떤 원하는 폴리펩티드의 N-말단 끝이나 C-말단 끝을 향하여 위치될 수 있는 상기 원하는 폴리펩티드를 상기 복합 폴리펩티드가 포함하는 것은 본 발명의 본 구현예의 범주 내에 든다.

본 발명의 특히 바람직한 구현예에 있어서, 상기 이펙터 항원은 CD3 항원, CD64 항원, CD89 항원 및 NKG2D 항원에서 선택된다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기 타깃 항원은 EpCAM, CCR5, CD19, HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (뮤신(mucin)), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, hCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, 강글리오시드(ganglioside) GD3, 9-O-아세틸-GD3, GM2, 글로보(Globo) H, 푸코실(fucosyl) GM1, Poly SA, GD2, 카르보안하이드라아제(Carboanhydrase) IX (MN/CA IX), CD44v6, 음향 고슴도치(Sonic Hedgehog: Shh), Wue-1, 혈장세포 항원(Plasma Cell Antigen), (세포막 결합(membrane-bound)) IgE, 흑색종 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸(Melanoma Chondroitin Sulfate Proteoglycan: MCSP), CCR8, TNF-알파 전구체, STEAP, 메조텔린(mesothelin), A33 항원, 전립선 줄기세포 항원(Prostate Stem Cell Antigen: PSCA), Ly-6; 데스모글레인(desmoglein) 4, E-카드헤린 네오에피토프(cadherin neoepitope), 태아 아세틸콜린 수용체(Fetal Acetylcholine Receptor), CD25, CA19-9 마커(marker), CA-125 마커 및 뮐러관 억제물질(Muellerian Inhibitory Substance: MIS) 수용체 타입 II, sTn (시알화(sialylated) Tn 항원; TAG-72), FAP (피브로블라스트 활성화 항원(fibroblast activation antigen)), 엔도시아린(endosialin), EGFRvIII, LG, SAS 및 CD63에서 선택된다. 여기서, 상기 모든 항원(이펙터 항원 및 타깃 항원 모두)은 인간 항원(human antigen)일 수 있다.

본 발명의 매우 바람직한 구현예에 있어서, 상기 타깃 항원은 상기 인간 CD19 항원인 반면, 상기 이펙터 항원은 상기 인간 CD3 항원이다. 이리하여, 본 구현예는 세포장해성 T세포(cytotoxic T cell)의 세포독성 가능성을 CD19 항원을 지니는 B림프구로 지향시킬 수 있는 유도체화된 복합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 투약은 B세포 악성종양의 치료에 치료제로서 큰 가능성을 가진다. 그 결과, 혈청 반감기를 증가시키면서 동시에 복합 폴리펩티드의 면역원성을 감소시키기 위하여 이러한 복합 폴리펩티드를 그 EED 내에서 하나 이상의 PEG 분자들로 유도체화하는 것이 큰 관심사이다.

본 발명의 다른 매우 바람직한 구현예에 있어서, 상기 이펙터 항원은 인간 CD3 항원인 반면, 상기 타깃 항원은 EpCAM 항원이다. 이리하여, 본 구현예는 상기 세포장해성 T세포의 세포독성 가능성을 상기 EpCAM 항원을 지닌 세포들로 향하게 할 수 있는 유도체화된 복합 폴리펩티드를 제공한다. 상기 EpCAM 항원은 많은 인간 악성종양 세포들에서 발현된다; 따라서, 이렇게 유도체화된 복합 폴리펩티드는 광범위한 인간의 암치료에 큰 가능성을 가진다. 상술한 바 있는 항-CD3x항-CD19 복합 폴리펩티드와 마찬가지로, 이러한 항-CD3x항-EpCAM 복합 폴리펩티드를 그 EED 내에서 하나 이상의 PEG 분자들로 유도체화하는 것 또한 큰 관심사이다.

본 발명의 다른 관점은 상술한 복합 폴리펩티드들과 제약학적으로 허용될 수 있는 담체(carrier)를 포함하는 조성에 관한 것이다.

다른 관점에 있어서, 본 발명은 복합 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 복합 폴리펩티드는 원하는 폴리펩티드를 포함하며 상기 원하는 폴리펩티드보다 더 높은 수율로 발현된다. 상기 방법은

a) 상기 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 제공하는 단계와;

b) 상기 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 배열의 어느 한 종단 상에 발현 증강 도메인(expression enhancing domain:“EED”)을 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 편입하고, 상기 EED를 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 배열은 제1 및 제2 시스테인 아미노산 잔기들 Cys1 및 Cys2에 대한 코돈들(codons)을 포함하며, Cys1에 대한 상기 코돈은 Cys2에 대한 상기 코돈보다 상기 뉴클레오티드 배열의 5'-종단에 더 가깝게 위치되고, 이때 Cys1 및 Cys2에 대한 상기 코돈들은 폴리펩티드 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 배열에 의하여 분리되고, 상기 링커는 시스테인이 없고; Cys1 및 Cys2가 서로 분자내 디설피드 결합에 참여할 수 있게 할 만큼 충분한 길이를 정의하는 단계와;

c) 단계 (b)로부터의 상기 뉴클레오티드 배열을 적절한 벡터의 숙주 발현계로 이입하는 단계와;

d) 단계 (b)로부터의 상기 뉴클레오티드 배열의 발현을 초래하는데 적합한 조건하에 상기 숙주 발현계를 배양하는 단계와;

e) 단계 (d)에서 발현된 상기 폴리펩티드를 격리하여 상기 복합 폴리펩티드를 획득하는 단계를 포함한다.

본 발명의 본 관점에서 바람직한 구현예는 단계 (e)에서 획득된 상기 복합 폴리펩티드를 Cys1 및/또는 Cys2에서 유도체화하는 단계를 더 포함한다. 이러한 유도체화는 상술한 바와 같이, 즉 환원성 조건(예를 들어, 디티오트레이톨(dithiothreitol) 또는 DTT를 사용) 하에서 Cys1 및 Cys2 간의 분자내 디설피드 결합(유도체화로 보이는 이러한 분자내 디설피드 결합 자체)을 환원시키고, 이후 상기 환원된 생성물과, Cys1 및 Cys2의 티올기들의 적어도 어느 하나와 반응하는 화학기를 지닌 다른 유도체화 성분과의 반응을 통하여 수행될 수 있다.

본 발명은 다음의 제한되지않은 도면들과 실시예들에 의하여 더욱 상세하게 기술된다.

도 1은 Cys1 및 Cys2에 따른 항원-특이적 ELISA.

도 2는 하나의 C-말단 시스테인 잔기와 4-글리신 링커에 의하여 분리된 2개의 C-말단 시스테인 잔기들에 의한 발현 수율 측정값으로서의 항원-특이적 ELISA.

도 3은 하나의 C-말단 시스테인 잔기와 4-글리신 링커에 의하여 분리된 2개의 C-말단 시스테인 잔기들에 의한 발현 수율 측정값으로서의 웨스턴 블로트(Western blot) 결과.

도 4는 본 발명에 의한 복합 폴리펩티드로부터의 용출(elution) 프로파일과 단 하나의 C-말단 시스테인 잔기를 지닌 폴리펩티드로부터의 용출 프로파일을 나타내는 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography) 결과.

도 5는 겔 여과 크로마토그래피로 획득된 단일체 및 이량체 scFv 종들의 SDS-PAGE; 비환원성 조건 하의 겔 결과(좌측) 및 환원성 조건 하의 결과(우측)이 나타나있음.

도 6은 20kD PEG-말레이미드와의 반응 전후의 하나의 C-말단 시스테인 잔기를 지닌 scFv와 2개의 C-말단 시스테인 잔기를 지닌 scFv의 SDS-PAGE.

이하, 제한되지 않은 실시예들을 통하여 더 상세히 본 발명을 기술한다.

실시예 1: C-말단 ( His )6- Cys -( Gly )4- Cys - Pro 태그를 지닌 scFv 의 클로닝 및 발현 (즉, 상기 정의된 EED 를 지닌 scFv )

scFv 분자, 즉 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain) 항체 가변영역들과 이들 간에 배설된 (Gly4Ser)3 폴리펩티드 링커를 일체화한 폴리펩티드가 본 발명의 개념을 증명하기 위한 모델 분자로 사용되었다. 이러한 scFv는 특히 소정의 항원(이하 "항원")에 결합한다. C-말단 (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro 태그를 지닌 scFv가 VL-특이적 프라이머와 PCR-반응에 의하여 구성된 반면, 상기 scFv 뉴클레오티드 배열은 (His)6-Cys-(Gly)x-Cys-Pro 모티프의 각 개별적 뉴클레오티드 배열들에 의해 각각 신장되었다(A: TGCGGTGGCTGCCCGTAA, B: GCGGTGGCGGTTGCCCGTAA, C: TGCGGTGGCGGTGGCTGCCCGTAA, D: TGCGGTGGCGGTGGCTGCCCGTAA). 이는 4개의 별개인 scFv를 인코딩하는 4개의 뉴클레오티드 배열을 산출하였고, 각각 가변 길이의 글리신 링커들에 의하여 분리된 2개의 시스테인 잔기들을 가지는 C-말단 태그를 지녔다. 상기 His-태그는 추후 검출단계 및 정제단계에서 사용되었다. 결과적인 VL 단편들은 제한 효소 인식부위(restriction enzyme recognition site) SalI 및 NotI(PCR에 의해서 도입됨)를 통하여 주변세포질 발현(periplasmic expression)을 위한 pelB 리더 배열 뒤에 대응하는 VH를 함유하는 pBADpelB(Invitrogen 벡터 pBADMycA-His로부터 유도된)로 서브클로닝되었다. 열쇼크 수용 E.coli XL1Blue로 형질전환 후, 단일 클론은 선택배지(LB 50㎍/㎖ 카르베니실린(Carbenicillin))에 배양되었고 상기 플라스미드는 표준 프로토콜에 따라 준비되었다. 삽입단편을 배열결정함(Sequiserve, Munich)으로써 성공적인 클로닝임이 확인되었다.

E.coli BL21DE3는 하나 또는 2개의 C-말단 Cys 잔기들을 지닌 각 scFv에 대해 코딩하는 발현 플라스미드로 형질전환되었고 선택 한천 상에서 성장되었다. 하나의 콜로니는 37℃에서 하룻밤 동안 5㎖ LB 50g/㎖ 카르베니실린을 배양하는데 사용되었다. 생산 배양을 위하여 2 l 진탕 플라스크 내에서 20mM MgCl2와 50㎍/㎖ 카르베니실린을 함유하는 500㎖ SB 증식 배지가 하룻밤 배양된 박테리아 현탁액으로 접종되었고 OD600에서 0.6-0.8의 광학밀도까지 37℃에서 더 배양되었다. L-아라비노스(L-arabinose)를 첨가함으로써 0.2%의 최종농도와 30℃로의 온도 저하로까지 단백질 생산이 유도되었다. 30℃에서의 4시간 생성기 이후, 상기 박테리아는 수집되어 40㎖ PBS에서 재차 현탁되었다. 4회의 -70℃에서의 동결 및 37℃에서의 해동을 거쳐 상기 외막은 열쇼크에 의해 파괴되었고 상기 scFv 단편들을 포함한 상기 가용성 주변세포질 단백질들이 상기 액체 내로 방출되었다. 원심에 의한 무손상 세포(intact cells) 및 세포 파쇄물(cell debris)의 제거 후, 상청액(supernatant)이 ELISA 분석에 사용되었다.

주변세포질 표본의 ELISA 분석은 단백질L(PBS에서 2㎍/㎖)로 코팅된 ELISA 플레이트(Nunc MaxiSorp)를 사용하여 수행되었다. 코팅은 4℃에서 하룻밤 수행되었 다. PBS 0.05% 투윈(Tween)으로 세척 후, 상기 플레이트는 실온에서 1시간 동안 3% BSA를 함유하는 100㎕ PBS로 차단되었다. 세척 후, 50㎕ 주변세포질이 첨가되어 연속하여 1:3으로 희석되었고 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 부가적인 세척단계 후, 단백질L에 결합된 scFv의 검출이 특히 스트렙타비딘(streptavidin)-HRP(Dako, 1% BSA를 함유하는 PBS에서 1㎍/㎖)에 의하여 검출된 50㎕ 항원-비오틴(PBS 1% BSA를 함유하는 1.5㎍/㎖)을 사용함으로써 수행되었다. 상기 신호는 15-30분간 100㎕ ABTS(2,2'-Azino-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate (6)] diammonium salt)-기질용액을 첨가하여 검출되었다. OD값들은 405nm 파장에서 ELISA 해독기로 측정되었다. 그 결과를 도 1에 나타내며, 여기서 "HCP", "CH2GlyCP", "HC3GlyCP", "HC4GlyCP" 및 "HC5GlyCP"은 각각 (His)6-Cys-Pro, (His)6-Cys-(Gly)2-Cys-Pro, (His)6-Cys-(Gly)3-Cys-Pro, (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro 및 (His)6-Cys-(Gly)5-Cys-Pro를 함유하는 C-말단을 지닌 scFv 분자들을 가리킨다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 항원에 결합하는 scFv의 최고 수율은 상기 2개의 C-말단 시스테인들 간의 링커로서 사용된 4개의 글리신을 지닌 구축물에서 관찰되었다.

실시예 2: ( His )6- Cys - Pro 태그(즉, 앞서 정의된 EED 가 없는)를 지닌 scFv 와 비교하여 ( His )6- Cys -( Gly )4- Cys - Pro 태그(즉, 앞서 정의된 EED )를 지닌 scFv 의 더 높은 단백질 수율의 검증

(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro 태그(즉, 앞서 정의된 EED를 지닌 scFv: 도 2의 "4Gly")로 신장된 scFv와 (His)6-Cys-Pro C-말단 태그(즉, 앞서 정의된 EED가 없는 scFv: 도 2의 "HCP")로 신장된 scFv의 단백질 발현 수준이 비교되었다. 2개 구축물 은 E.coli 균주 BL21DE3를 사용하여 소규모로 분석되었다. 각각의 경우마다 10개의 다른 콜로니들이 진탕 배양기 내에서 37℃에서 4시간 동안 5㎖ SB/20mM MgCl2/50㎍/㎖ 카르베니실린으로 배양되었다. 0.2% L-아라비노스를 세포 배양액에 첨가하고 온도를 30℃로 저하시켜 단백질 생산이 다시 개시되었다. 하룻밤 유도기 후에 세포들이 수집되어 1㎖ PBS에서 재차 현탁되었고 주변세포질 단편이 실시예 1에 기술한 바와 같이 동결/해동 방법으로 격리되어 항원-특이적 ELISA로 분석되었다. 이러한 분석 결과를 도 2에 나타낸다. ELISA 결과는 C-말단 (His)6-Cys-Pro 모티프를 함유하나 제2 시스테인 잔기가 결핍된 scFv종들에 비교하여 조(crude) 주변세포질에서 (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro 태그("4Gly")를 지닌 scFv의 매우 증가된 수율을 명백하게 보여준다. 따라서, 분명하게도 C-말단 태그(즉, 앞서 정의된 EED)에서 2개 시스테인 잔기들 간의 제어되는 세포내 디설피드 결합을 형성하는 능력이 관찰된바 같이 증진된 제조 수율을 달성하는데 중요한 점이다.

또한, 상기 주변세포질 단편들은 비환원성 SDS-PAGE로 분석한 후, 표준 프로토콜에 의한 웨스턴 블로트(Western blot) 기술로 분석되었다. His 태그를 지닌 scFv의 검출은 알칼리성 포스파타아제 접합 산양항마우스 항체(alkaline phosphatase-conjugated goat anti-mouse antibody) Sigma(0.1% BSA를 함유하는 PBS에서 1㎍/㎖)로 검출된 항펜타 His 항체, Qiagen(0.1% BSA를 함유하는 PBS에서 1㎍/㎖)을 사용하여 달성되었다. 상기 단백질 블로트는 BCIP/NBT 기질용액(Sigma, B-1911)을 첨가하여 현상되었다. 이 결과를 도 3에 나타낸다.

도 3의 각 레인 1, 2는 C-말단 끝에서 (His)6-Pro를 지닌 scFv의 밴드를 나 타낸다. 웨스턴 블로트에서 scFv 밴드들의 강도(즉, 전체 발현된 폴리펩티드 양)는 상기 폴리펩티드의 C-말단 끝에서 (His)6-Cys-Pro를 지닌 scFv에 대응하여 레인 3, 4에서 크게 감소함이 나타난다. 상기 폴리펩티드의 C-말단 끝에서(His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro를 지닌 scFv에 대응하는 레인 5, 6은 다시 한번 레인 1, 2에 필적할만한 밴드 강도를 나타낸다. 이는 scFv 폴리펩티드의 C-말단 끝에 단일 시스테인 잔기를 첨가하여 손상되었던 단백질 발현(레인 3, 4)에서의 손실이 제2 시스테인 잔기를 첨가함으로써 상기 2개의 시스테인 잔기들 간의 디설피드 결합 형성을 가능하게 하는 폴리펩티드 링커에 의하여 상기 제1 시스테인 잔기로부터 분리되어(레인 5, 6) 회복된 것을 명백하게 입증한다.

종합하면, ELISA(도 2) 및 웨스턴 블로트(도 3)의 분석결과는 단 하나의 C-말단 시스테인을 지닌 scFv 구축물과 비교하여 2개의 C-말단 시스테인 잔기들을 지닌 scFv 구축물의 더욱 높은 단백질/scFv 수율을 명백하게 나타낸다.

실시예 3: ( His )6- Cys -( Gly )4- Cys - Pro 태그(즉, 앞서 정의한 바와 같이 EED )를 지닌 scFv 의 정제

E. coli BL21DE3이 상기 발현 플라스미드와 함께 형질전환되어 선택 한천 상에서 성장되었다. 단일의 콜로니는 37℃에서 하룻밤 동안 5㎖ LB 50㎍/㎖ 카르베니실린을 배양하는데 사용되었다. 생산 배양을 위하여 2 l 진탕 플라스크 내에서 500㎖ SB/20mM MgCl2/50㎍/㎖ 카르베니실린이 하룻밤 배양된 박테리아 현탁액으로 접종되었고 OD600에서 0.6-0.8의 광학밀도까지 37℃에서 배양되었다. 단백질 생산은L-아라비노스를 첨가함에 의하여 0.2%의 최종농도와 30℃로의 온도 저하로까지 유 도되었다. 하룻밤 동안 30℃에서의 생성기 이후, 상기 박테리아는 수집되어 40㎖ PBS에서 재차 현탁되었다. 상기 외막은 온도쇼크에 의해 파괴되었고 상기 scFv 단편을 포함한 상기 가용성 주변세포질 단백질들이 상기 액체 내로 방출되었다. 원심에 의한 무손상 세포 및 세포 파쇄물의 제거 후, 상청액이 더 정제되었다.

SCA 분자들은 상기 C-말단 His-태그와 상호작용하는 IMAC 친화성 칼럼(affinity column)에 의하여 초기 정체되었다. 이는 제작자에 의하여 제공된 프로토콜에 따른 Qiagen Ni-NTA superflow column을 사용하여 수행되었다. 상기 칼럼은 20mM 인산나트륨 0.4M NaCl, pH 7.2로 평형화되었고 상기 주변세포질 표본(40㎖)가 상기 칼럼에 2㎖/min의 유속으로 가해졌다. 그 후 상기 칼럼은 0.025M 이미다졸을 함유하는 평형화 완충액 5칼럼 부피로 세척되어 결합되지 않은 샘플을 제거하였다. 용출은 0.5M 이미다졸을 함유하는 평형화 완충액 5칼럼 부피를 사용하여 수행되었다. 용출된 단백질 단편들은 추후 정제단계들을 위하여 병합(pooled)하였다.

분자량의 분리, 즉 다량체, 이량체 및 단량체 단편들로의 분리를 달성하기 위하여 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)가 PBS(Gibco)에 의하여 평형화된 superdex S75 prep grade column 상에서 수행되었다. 280nm 광흡수(유속 1㎖/min)의 연속측정에 의하여 관찰된 용출된 단백질은 표준 SDS-PAGE에 따랐다. 그 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4는 2개의 그래프 A 및 B를 나타내는데, 하나는 더 낮은 것(그래프 A)으로서 C-말단 (His)6-Cys-Pro 모티프를 지닌 scFv의 용출 그래프이며, 하나는 더 높은 것(그래프 B)으로서 C-말단 (His)6-Cys-(Gly)4- Cys-Pro 모티프(즉, 앞서 정의한 바와 같은 상기 EED를 지닌 scFv)를 지닌 scFv의 용출 그래프이다. 명백하게 알 수 있듯이, 제2 시스테인 잔기를 디설피드 루프의 형성을 위하여 제1 시스테인 잔기로부터 적절히 분리되어 scFv의 C-말단부분에 편입시킴으로써 더 높은 단량체:이량체 산출비뿐만 아니라, 단량체 또는 이량체 아이소폼과 관계없이 더 높은 전체 단백질 수율을 가져오게 된다.

이 명백한 광학적 분석은 아이소폼 농도 계산에 의하여 입증된다. 상기 단백질 농도는 AUC값(UNICORN 소프트웨어에 의하여 결정)과 배열-특이적 흡광계수(sequence-specific extinction coefficient)을 사용하여 계산되었다. 상기 얻은 농도값들은 표 1에 정리한다:

표 1

C-말단 부분의 아미노산 배열	폴리펩티드 아이소폼	계산 농도값 (㎍/㎖)	샘플 부피 (㎖)	아이소폼 당 전체 단백질(㎍)	전체 단백질 (㎍)
HHHHHHCP	단량체	14.2	6	85.2	276.6
HHHHHHCP	이량체	31.9	6	191.4
HHHHHHCGGGGCP	단량체	69	8	552	775.2
HHHHHHCGGGGCP	이량체	27.9	8	223.2

상기 표로부터 다음과 같은 설명이 가능하다. 먼저, 그 C-말단 부분에 단일의 시스테인 잔기를 지니는 scFv의 단량체:이량체 비율은 대략 1:2.25이다. 상기 scFv의 C-말단 부분에 제2 시스테인을 첨가하고 상기 제1 및 제2 시스테인 잔기들 간에 적절한 링커를 배설함으로써, 세포내 디설피드 결합이 촉진되고 획득된 scFv의 단량체:이량체의 비율은 대략 5.5배 증가되어 대략 1:0.4로 된다. 폴리펩티드 아이소폼과 관계없이 전체 폴리펩티드 수율 관점에서 볼 때, 단일 시스테인 잔기를 지닌 scFv에 대한 276.6㎍에서 2개의 시스테인 잔기들을 지닌 scFv에 대한 775.2㎍ 으로의 수율 증가는 전체 단백질 발현의 대략 280% 또는 거의 3배 정도의 증가를 나타내는 것이다.

비환원성 조건과 환원성 조건 하에서 SDS-PAGE에 의한 겔 여과된 단량체 및 이량체 단편의 분석(도 5)은 그 C-말단 부분에 단일 시스테인을 지닌 scFv의 이량체 단편의 약 80%가 디설피드 결합에 의하여 가교된 이량체인 반면(도 5, 비환원성 겔, 레인 2), 그 C-말단 부분에 2개 시스테인 잔기들을 지닌 scFv의 이량체 단편은 상기 2개 C-말단 시스테인 잔기들간의 디설피드 루프의 형성으로 인하여 주로 단량체로서 존재한다(도 5, 비환원성 겔, 레인 4). 단량체로의 상기 이량체 산해(disaggregation: 도 5, 비환원성 겔, 레인 4)는 응집(aggregation)이 단백질-단백질 상호작용에 의해서만 발생되었고 디설피드 가교에 기인하지않았다는 것을 나타낸다. 도 5의 레인 1, 3(환원성 조건 및 비환원성 조건)은 대응되는 단일체 단편들을 나타낸다.

동일한 샘플들이 환원성 겔(도 5) 상에서 제조되었다. (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro 태그가 없는 scFv에 관하여 레인 2는 비환원성 겔에 존재하는 이량체는 모두 사실 2개의 각 폴리펩티드 분자들에서 시스테인 잔기들간의 원하지 않는 디설피드 결합들의 형성에 기인하였다는 것을 나타낸다. (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro 태그(레인 2)를 지닌 scFv의 이량체의 잔여 최소량도 마찬가지이다. 상기 환원성 겔 내부의 환원성 조건들은 이들 디설피드 결합들을 개방하는데 충분하므로, 관찰된 유일한 밴드는 상기 scFv 내의 시스테인 잔기가 다른 어떤 시스테인 잔기와 디설피드 결합들을 형성할 수 없는 scFv 폴리펩티드의 단일체 종들로 된다.

실시예 4: C-말단 ( His )6- Cys -( Gly )4- Cys - Pro 태그를 지닌 scFv 및 이를 지니지 않은 scFv 의 사이드 지향적 PEG 화( side directed PEGylation )

유리 시스테인들에서의 PEG화는 안정적이고 균일한 scFv-PEG 접합체를 초래하여야 한다. C-말단 (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro 태그를 지닌 정제된 scFv와 C-말단 (His)6-Cys-Pro 태그를 지닌 scFv 각각을 함유하는 2개의 단백질 용액이 상기 말단 디설피드 브리지를 축소하기 위하여 실온에서 1시간 동안 2mM의 최종 농도로 DTT로 배양되었으며, 2개의 유리 설프하이드릴기들로 되었다.

그리고, 잔여하는 DTT를 제거하기 위하여 각 폴리펩티드의 겔 여과(Sephadex G25 M, Amersham)가 러닝(running) 완충액으로서 PBS를 사용하여 수행되었다. 각 폴리펩티드 샘플의 반에 mPEG-말레이미드 MW 20 kD (Shearwater, 2D2M0P01)가 PEG 분자들의 10배 몰과잉으로 첨가되었다. 상기 용어 "mPEG"는 알려진 의미, 즉 "메톡시 폴레에틸렌 글리콜(methoxy polyethylene glycol)"을 내포한다. 각 폴리펩티드 샘플의 다른 반은 조절요소(control)로서 에틸말레이미드(ethylmaleimide: Sigma, E-1271)의 10배 몰과잉으로 배양되었다.

각 반응은 실온에서 2시간 동안 교반하면서 발생시켰다. 모든 샘플은 비환원성 조건들 하에서 SDS-PAGE에 의하여 분석되었고 표준 프로토콜(Invitrogen, Cat. No. LC6100)에 따라 은을 코팅하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.

도 6의 레인 1은 그 C-말단 끝에 (His)6-Cys-Pro를 지닌 scFv를 나타낸다. 상기 시스테인 잔기는 에틸말레이미드와의 반응에 의하여 차단되었다. 도 6의 레인 2는 그 C-말단 끝에 (His)6-Cys-(Gly)4-Cys-Pro를 지닌 scFv를 나타내며, 여기서 시스테인 잔기들 둘 다 에틸말레이미드와의 반응에 의하여 차단되었다. 레인 1, 2에서 밴드들의 상대강도(즉, 레인 2의 밴드가 레인 1의 동일 위치에서의 밴드보다 더 강도가 세다)는 단일의 C-말단 시스테인 잔기를 지닌 scFv를 발현할 때 달성된증강된 발현 효율(enhanced expression efficiency)과 비교하여 2개의 C-말단 시스테인 잔기들을 지닌 scFv를 발현할 때 달성되는 증강된 발현 효율의 측정값이다.

도 6의 레인 3은 단일의 C-말단 시스테인 잔기를 지닌 scFv와 PEG-20kD 분자량의 말레이미드와의 결합(coupling) 결과를 나타낸다. 레인 3의 윗부분에서 볼 수 있듯이, PEG-결합 scFv의 단지 매우 희미한 밴드만이 얻어졌으며 이러한 희미함은 발현 수율이 불량함을 가리킨다. 따라서, 단일의 C-말단 시스테인 잔기만을 지닌 scFv를 사용하면 scFv의 더 작은 절대량이 얻어진다. 매우 대조적으로, 도 6의 레인 4에서는 4-글리신 링커에 의하여 서로 분리된 2개의 C-말단 시스테인 잔기들을 지닌 scFv가 20kD PEG와 반응하였으며 2개의 뚜렷한 밴드들을 나타낸다. 하나의 밴드는 대응하는 미반응종들과 동일한 분자량에 있고 20kD PEG와의 반응이 완료되지 않았음을 나타낸다. 다른 밴드, 즉 더 무거운 분자량에서의 더 높은 밴드는 단일의 C-말단 시스테인 잔기만을 지닌 scFv의 PEG화 생성물보다 더 높은 분자량을 가지므로, 20kD PEG가 상기 scFv의 C-말단 부분에서 상기 2개 시스테인 잔기들 모두와 반응하였음을 나타낸다. 이는 4-글리신 링커에 의하여 서로 분리되고, 하나가 아닌 2개의 시스테인 잔기들을 상기 scFv의 C-말단 부분에 편입시킴으로써만 추후 PEG화 반응을 위해 충분한 시스테인 함유 출발물질을 획득할 수 있었다는 점이 중시되어야 한다.

Claims (22)

1. 복합 폴리펩티드에 있어서,

   상기 복합 폴리펩티드는 원하는 폴리펩티드와 발현 증강 도메인(expression enhancing domain:"EED")을 포함하고, 상기 EED는 제1 및 제2 시스테인 아미노산 잔기 Cys1 및 Cys2 각각을 포함하며, Cys1은 Cys2보다 상기 복합 폴리펩티드 분자의 N-말단에 더 가깝게 위치하며 상기 Cys1 및 Cys2는 폴리펩티드 링커에 의하여 분리되며, 상기 링커는

   ·시스테인 및 프롤린이 없고;

   ·Cys1 및 Cys2가 서로 분자내 디설피드 결합에 참여할 수 있도록 충분한 길이를 정의하고;

   ·수용액에서 제2 폴리펩티드 구조가 실질적으로 없는 유연한 폴리펩티드 배좌를 가지며, 여기서 Cys1 및 Cys2의 적어도 어느 하나는 유도체화 성분에 의하여 유도체화되는 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서,

   상기 링커의 상기 아미노산 잔기들의 적어도 75%는 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Met, Tyr, Asn 및 Gln에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   상기 복합 폴리펩티드는 단일쇄 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
4. 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,

   상기 EED는 상기 복합 폴리펩티드의 C-말단 끝 또는 N-말단 끝에 위치되는 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
5. 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,

   상기 EED는 다음의 형태로 되는 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드:

   -Cys1-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m

   이때,

   ·n은 2 내지 20의 정수이고;

   ·m은 0 또는 1이며;

   ·Xaa는 각 위치에서 Gly, Ala, Thr 또는 Ser로 될 수 있다.
6. 제5항에 있어서,

   n＝4이고 (Xaa)4는 (Gly)4, (Gly)3Ser, (Gly)2SerGly, GlySer(Gly)2 또는 Gly(Ser)3인 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
7. 제5항에 있어서,

   n＝5이고 (Xaa)5는 (Gly)5, (Gly)4Ser, (Gly)3SerGly, (Gly)2Ser(Gly)2, GlySer(Gly)3 또는 Ser(Gly)4인 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
8. 제5항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서,

   상기 EED는 다음의 형태로 되는 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드:

   -His-His-His-His-His-His-Cys1-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m; 또는

   -Cys1-(Xaa)n-Cys2-His-His-His-His-His-His-(Pro)m.
9. 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,

   상기 유도체화된 Cys1 및/또는 Cys2은 말레이미드기, 설프하이드릴기 또는 피리딜 디설피드기를 포함하는 유도체화 성분과 상기 Cys1 및/또는 Cys2 잔기의 반응물인 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
10. 제9항에 있어서,

    말레이미드기를 포함하는 상기 유도체화 성분은 PEG-말레이미드("PEG-MAL"), 말레이미드-기능화 형광 마커, 말레이미드-기능화 분석 검출 마커, 말레이미드-기능화 방사성 트레이서 또는 말레이미드-기능화 단백질 가교제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
11. 제10항에 있어서,

    상기 PEG-MAL은

    ·메톡시 PEG-MAL 5 kD;

    ·메톡시 PEG-MAL 20 kD;

    ·메톡시 (PEG)2-MAL 40 kD;

    ·메톡시 PEG(MAL)2 5 kD;

    ·메톡시 PEG(MAL)2 20 kD;

    ·메톡시 PEG(MAL)2 40 kD 또는

    ·이들의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
12. 제9항에 있어서,

    Cys1 또는 Cys2는 5-티오-2-니트로벤조산("TNB-티올")기 또는 설프하이드릴기를 포함하는 유도체화 성분으로 유도체화되며, 특히 상기 유도체화 성분은 디설피드 결합에 의하여 Cys1에 결합된 Cys2인 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
13. 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,

    Cys1 및 Cys2는 둘 다 유도체화 성분들에 의하여 유도체화되는 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
14. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서,

    Cys1 또는 Cys2의 어느 하나는 제1 유도체화 성분에 의하여 유도체화되는 반면, Cys1 또는 Cys2의 각기 다른 하나는 제2 유도체화 성분에 의하여 유도체화되는 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
15. 제14항에 있어서,

    상기 제2 유도체화 성분은 에틸 말레이미드인 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
16. 전항들 중의 어느 한 항에 있어서,

    상기 원하는 폴리펩티드는 단일특이성 단일쇄 항체 또는 이중특이성 단일쇄 항체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
17. 제16항에 있어서,

    상기 이중특이성 단일쇄 항체는 특히 이펙터 항원에 결합하는 제1 부분과 특히 타깃 항원에 결합하는 제2 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
18. 제17항에 있어서,

    상기 이펙터 항원은 인간 CD3 항원, 인간 CD64 항원, 인간 CD89 항원 및 인간 NKG2D 항원에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
19. 제17항 또는 제18항에 있어서,

    상기 타깃 항원은 EpCAM, CCR5, CD19, HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (뮤신), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, hCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, 강글리오시드 GD3, 9-O-아세틸-GD3, GM2, 글로보 H, 푸코실 GM1, Poly SA, GD2, 카르보안하이드라아제 IX (MN/CA IX), CD44v6, 음향 고슴도치(Shh), Wue-1, 혈장세포 항원, (세포막 결합) IgE, 흑색종 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸(MCSP), CCR8, TNF-알파 전구체, STEAP, 메조텔린, A33 항원, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), Ly-6; 데스모글레인 4, E-카드헤린 네오에피토프, 태아 아세틸콜린 수용체, CD25, CA19-9 마커, CA-125 마커 및 뮐러관 억제물질(MIS) 수용체 타입 II, sTn (시알화 Tn 항원; TAG-72), FAP (피브로블라스트 활성화 항원), 엔도시아린, EGFRvIII, LG, SAS 및 CD63에서 선택되고, 모든 항원은 인간 항원인 것을 특징으로 하는 복합 폴리펩티드.
20. 전항들 중의 어느 한 항에 의한 상기 복합 폴리펩티드와 제약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
21. 제1 내지 제19항 중의 어느 한 항에 의한 상기 복합 폴리펩티드를 제조하는 방법에 있어서,

    상기 복합 폴리펩티드는 원하는 폴리펩티드를 포함하며 상기 원하는 폴리펩 티드보다 더 높은 수율로 발현되고, 상기 방법은

    a) 상기 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 제공하는 단계와;

    b) 상기 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 배열의 어느 한 종단 상에 발현 증강 도메인(EED)을 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 편입하고, 상기 EED를 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 배열은 제1 및 제2 시스테인 아미노산 잔기들 Cys1 및 Cys2에 대한 코돈들을 각각 포함하며, Cys1에 대한 상기 코돈은 Cys2에 대한 상기 코돈보다 상기 뉴클레오티드 배열의 5'-종단에 더 가깝게 위치되고, Cys1 및 Cys2에 대한 상기 코돈들은 폴리펩티드 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 배열에 의하여 분리되고, 상기 링커는 시스테인이 없으며; Cys1 및 Cys2가 서로 분자내 디설피드 결합에 참여할 수 있도록 할 만큼 충분한 길이를 정의하는 단계와;

    c) 단계 (b)로부터의 상기 뉴클레오티드 배열을 적절한 벡터의 숙주 발현계로 이입하는 단계와;

    d) 단계 (b)로부터의 상기 뉴클레오티드 배열의 발현을 초래하는데 적합한 조건하에 상기 숙주 발현계를 배양하는 단계와;

    e) 단계 (d)에서 발현된 상기 폴리펩티드를 격리하여 상기 복합 폴리펩티드를 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제21항에 있어서,

    상기 방법은 단계 (e)에서 획득된 상기 복합 폴리펩티드를 Cys1 및/또는 Cys2에서 유도체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

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