EA010374B1 - Полипептиды с повышенной экспрессией - Google Patents

Abstract

Предлагается составной полипептид, содержащий исходный полипептид и домен, усиливающий экспрессию, (EED); упомянутый EED содержит первый и второй аминокислотные остатки цистеина Cys1 и Cys2, причем Cys1 располагается ближе к N-концу молекулы составного полипептида, чем Cys2, a Cys1 и Cys2 разделены полипептидным линкером, который свободен от цистеина и пролина; определяет длину, достаточную для того, чтобы позволить Cys1 и Cys2 образовать внутримолекулярную дисульфидную связь друг с другом; имеет гибкую полипептидную конформацию, по существу, свободную от вторичной полипептидной структуры в водном растворе; причем по крайней мере один из остатков Cys1 и Cys2 дериватизируется с помощью дериватизирующего компонента.

Description

Данное изобретение относится к молекулам полипептидов, которые подвергаются модификации с целью улучшения их экспрессионных характеристик. Модифицированные молекулы полипептидов приобретают более высокие показатели экспрессии, чем соответствующие им партнеры, т.е. молекулы полипептидов, которые не модифицированы (на уровне нуклеиновой кислоты). Данное изобретение, кроме того, относится к композициям, содержащим такие полипептиды. Наконец, в данном изобретении предлагается способ получения модифицированных молекул полипептидов, упомянутых выше. Во всем последующем описании при упоминании составных полипептидов подразумеваются как полипептид сам по себе, так и при необходимости соответствующая последовательность нуклеиновых кислот, что будет понятно читателю, сведущему в данной области. То же самое относится к исходному полипептиду и домену, повышающему экспрессию.

Экспрессия рекомбинантных полипептидов в системах микробных хозяев является эффективным способом получения больших количеств желаемого полипептида. Когда получаемый полипептид предназначен для применения в качестве диагностического и/или терапевтического средства, часто необходима дальнейшая модификация экспрессируемого полипептида. Например, полипептид, предназначенный для применения в качестве диагностического средства, должен быть модифицирован таким образом, чтобы он мог связываться на твердой основе. Альтернативно, может возникнуть необходимость связывания полипептида с агентом, позволяющим его визуализацию каким-либо известным способом получения изображения. Полипептид, предназначенный для введения пациенту в процессе лечения, необходимо модифицировать для того, чтобы изменить его жизненные свойства, например его фармакокинетические свойства.

Дериватизация (получение производных) полипептида, полученного путем рекомбинирования, наиболее часто выполняется с помощью химической реакции между химическим веществом (дериватизирующим компонентом) и реакционноспособной боковой группой одной или нескольких аминокислот, содержащихся в данном полипептиде. В результате появляется ковалентная связь дериватизирующего компонента с полипептидом, причем местоположение и валентность такой связи(ей) обусловлены соответствующим местоположением и количеством реакционноспособных аминокислот в полипептиде. Это значит, что в полипептиде с множеством реакционноспособных аминокислот химическая связь дериватизирующего компонента с полипептидом будет происходить много раз с местоположениями по всему объему полипептида, соответствующими местоположениям реакционноспособных аминокислот.

Для этих целей может быть желательной многовалентная сайт-неспецифичная связь дериватизирующих компонентов с полипептидом, но чаще это нежелательно. Например, в процедуре диагноза для точного количественного выражения измерений может быть важным ограничить количество процессов дериватизации на молекулу полипептида до одного. Подобным образом, успешное терапевтическое применение полипептида ίη νίνο часто зависит от способности практикующего врача точно прогнозировать и регулировать биологическую активность этого полипептида. В такой ситуации изменения, вызываемые нерегулируемой и сайт-неспецифичной дериватизацией применяемого полипептида, могут, понятно, оказаться несовместимыми с намеченным курсом лечения. Вдобавок, сайт-неспецифичная связь терапевтического или диагностического полипептида с дериватизирующим компонентом может привести к снижению необходимой активности полипептида. Это может произойти, например, в случае, когда полипептид с одноцепочным антителом дериватизируется сайт-неспецифично таким образом, что участок связывания антигена пространственно и/или электростатически предотвращается от связывания с антигеном или уменьшается его активность связывания. В таком случае желательный терапевтический или диагностический эффект одноцепочного антитела может быть уничтожен или, по меньшей мере, ослаблен.

Кроме того, часто возникает необходимость выполнения рекомбинантных полипептидов таким образом, чтобы дериватизация была возможна только на предопределенных участках или только на одном заранее определенном участке молекулы полипептида. Валентность связи можно выбрать путем регулирования количества реакционноспособных аминокислот в полипептиде, а желаемая активность полипептида и/или химические характеристики можно модулировать путем планирования мест расположения таких связей с тем, чтобы не нарушить физически взаимодействие полипептида с другими молекулами в окружающей среде.

Одной из аминокислот, полезных в этом отношении, является цистеин. Значимость его в стабилизации белковой структуры путем образования дисульфидных связей обусловливается тем, что цистеин обычно встречается в полипептидах только в определенных местоположениях. Путем введения одного цистеина в мягкую (Ьешдп) область полипептида, что не требуется для непосредственного достижения необходимой активности полипептида, можно использовать преимущество реакционноспособной сульфгидрильной боковой цепочки в качестве естественной точки привязки необходимой дериватизации без значительного влияния на активность исходного полипептида или с таким влиянием (Уо1ке1 Т. е1 а1. (2004) ВюсЫш. Βίορίίδ. Ас1а, 1663, 158-66).

Однако введение дополнительных остатков цистеина в полипептиды с целью дериватизации имеет определенные недостатки. Часто исходный полипептид уже имеет остатки цистеина в своей аминокислотной последовательности для стабилизации структуры. Добавочный цистеин, введенный с целью дериватизации полипептида с помощью дериватизирующего компонента, в этом случае может образовать

- 1 010374 нежелательные дисульфидные связи с такими уже имеющимися в наличии остатками цистеина, разрушая структуру полипептида, необходимую для желаемой активности.

Даже если исходный полипептид сам по себе в своей аминокислотной последовательности не содержит никаких остатков цистеина, введение остатков цистеина может, тем не менее, привести к проблемам. Вслед за экспрессией в организме хозяина полипептиды, содержащие аминокислотный остаток цистеина, могут образовать друг с другом полипептидные димеры посредством межмолекулярных дисульфидных связей между триольными (т.е. сульфгидрильными) группами двух остатков цистеина в соответствующих полипептидах (Л1ЬгесЬ1 Н., с1 а1. (2004) Вюсоищд. СЬет. 15, 16-26; О1а15сп Т., с1 а1. (2004), Рто1еш Епд Бек. 8е1. 17, 21-7). Эта опасность особенно велика при использовании прокариотных экспрессионных систем для получения полипептида. Это происходит потому, что в таких системах белки постепенно переносятся в периплазматическое пространство микробного хозяина, где преобладают окислительные условия. В то время как такие окислительные условия обязательны для образования необходимых дисульфидных связей, стабилизирующих структуру зарождающейся полипептидной цепочки, они также содействуют образованию нежелательных межмолекулярных дисульфидных связей между свободными остатками цистеина, представляющих собой пункты последующей дериватизации в двух соответствующих полипептидах.

Вышеуказанными источниками не ограничиваются сведения об экспрессии в прокариотах. В Био е1 а1. (1997), 1. ВюсЬет. 121, 831-4 описаны эксперименты по сравнению количества экспрессируемого дрожжами мономерного и димерного (т.е. имеющего межмолекулярные дисульфидные связи) полипептида 8сРу в зависимости от того, содержит ли этот полипептид 5сЕу один или два остатка цистеина на С-конце. Установлено, что ксЕу с одиночным остатком цистеина на С-конце более подходит для существования в виде димера, а ксЕу с двумя остатками цистеина на С-конце - в виде мономера. Из этой публикации также ясно, что общее количество экспрессируемого полипептида остается почти одинаковым безотносительно к распределению изоформ. Вдобавок, обнаружено, что структура двух остатков цистеина (которая проявляет тенденцию к образованию межмолекулярной дисульфидной связи) проявляет только слабую интенсивность сцепления.

При экспрессировании полипептидов, предназначенных для терапевтического применения, часто оказывается важным исходя из гомогенности продукта вырабатывать мономерную, а не димерную изоформу. Кроме того, предшествующий уровень знания, представленный в вышеупомянутой публикации Био е1 а1., обеспечивает исследователя, интересующегося экспрессией мономерного полипептида, дериватизируемого цистеином, определенными средствами для достижения этой цели. Однако из предшествующего уровня знания не известно средства, пригодного для экспрессирования мономерной изоформы в приемлемом количестве и с приемлемой эффективностью связывания. Таким образом, целью данного изобретения является разработка структуры ДНК, позволяющей высокопроизводительную экспрессию соответствующего полипептида, проявляющего приемлемую эффективность связывания, при которой (экспрессии) данный полипептид преимущественно получается в виде мономерного полипептида.

Изобретение достигает этой цели путем обеспечения нуклеиновой кислоты, кодирующей так называемый составной полипептид в соответствии с данным изобретением, как описано в его формуле. Нуклеиновая кислота, если она экспрессирована соответствующим образом, обеспечивает составной полипептид, причем упомянутый составной полипептид содержит исходный полипептид и домен, повышающий экспрессию (ЕЕБ), упомянутый ЕЕБ содержит первый и второй аминокислотные остатки цистеина Сук1 и Сук2 соответственно, Сук1 располагается ближе к Ν-концу молекулы рекомбинантного полипептида, чем Сук2, и Сук1 и Сук2 разделяются полипептидным линкером. Упомянутый линкер свободен от цистеина и пролина;

определяет длину, достаточную для того, чтобы позволить Сук1 и Сук2 образовывать внутримолекулярную дисульфидную связь друг с другом, и имеет гибкую полипептидную конформацию, по существу, свободную от вторичной полипептидной структуры в водном растворе, и по крайней мере один из Сук1 и Сук2 дериватизируется с помощью дериватизирующего компонента.

Путем введения в ЕЕБ не одного, а двух цистеиновых остатков Сук1 и Сук2 и посредством регулирования длины и точного определения природы полипептидной линкерной последовательности, располагаемой между ними, чтобы способствовать образованию внутримолекулярной дисульфидной связи между Сук1 и Сук2, такая дисульфидная связь образуется, делая Сук1 и Сук2 неспособными соучаствовать в нежелательных межмолекулярных или внутримолекулярных дисульфидных перемычках, как описано выше. В известном смысле, каждый из Сук1 и Сук2 становится соответствующей защитной группой другого. Когда внутримолекулярный дисульфидный контур между Сук1 и Сук2 выполнен, Сук2 можно рассматривать как дериватизирующий компонент для Сук1. Наоборот, Сук1 можно рассматривать как дериватизирующий компонент для Сук2.

Составные полипептиды, созданные на уровне нуклеиновых кислот и содержащие два цистеиновых остатка, как описано выше, обладают тем преимуществом, что имеют химические точки привязки для последующей (т.е. производимой после экспрессирования и выделения) дериватизации. В то же самое время резко уменьшается опасность образования нежелательных межмолекулярных дисульфидных свя

- 2 010374 зей; по существу, опасность в этом случае возникает, главным образом, со стороны других цистеиновых остатков, присутствующих в исходном полипептиде с целью дисульфидной стабилизации полипептидной структуры. Такие дисульфидные связи обычно образуются в окислительной среде во время и/или вслед за трансляцией, когда образующийся полипептид постепенно растет. По существу, любая свободная сульфгидрильная группа цистеина, необходимого для стабилизации полипептидной структуры, обычно относительно быстро находит своего дисульфидного партнера и таким образом ограждается от дальнейших нежелательных реакций. Введение линкера, оптимизированного по длине, химическим и пространственным свойствами, чтобы позволить Сук1 и Сук2 образовать взаимную дисульфидную связь, гарантирует, что Сук1 и Сук2 будут реагировать только друг с другом и не будут реагировать с пространственно отдаленным остатком цистеина в полипептиде, который необходим для стабилизации полипептидной структуры, но который еще не реагировал с предназначенным для него дополняющим цистеиновым остатком. Короче, линкер гарантирует, что Сук1 и Сук2 всегда будут ближе друг к другу, чем любой из них к любому другому цистеиновому остатку в полипептиде.

После экспрессирования и выделения такой составной полипептид, выказывающий дисульфидную связь между Сук1 и Сук2, может быть подвергнут воздействию восстановительных условий для ослабления факторов, достаточных для разрыва (только) дисульфидной связи между Сук1 и Сук2. Вслед за этим можно выполнять дериватизацию Сук1 и/или Сук2 с применением дериватизирующих компонентов иных, чем соответствующие другие Сук1 или Сук2.

Вдобавок к преимуществу, заключающемуся в получении дериватизированного полипептида (который может быть повторно дериватизирован после выделения) без указанных выше недостатков, также было неожиданно установлено, что полипептиды, построенные с включением ΕΕΌ (т.е. составные полипептиды в пределах смысла данного изобретения), проявляют более высокий уровень полной экспрессии из-за соответствующих нуклеиновых кислот по сравнению с полипептидами, которые не содержат ΕΕΌ. В то время как в составном полипептиде по данному изобретению можно ожидать меньшего содержания нежелательного димера, чем в полипептиде без ΕΕΌ, совершенной неожиданностью, основанной на данных предшествующего знания (например, публикации Ьио с1 а1., цитированной выше) является то, что общая экспрессия получаемого в итоге полипептида с приемлемой активностью связей в соответствии с данным изобретением может быть повышена путем введения ΕΕ. Кроме того, составной полипептид по данному изобретению можно получать с более высоким выходом по сравнению с исходным полипептидом без ΕΕΌ, причем отношение мономерного составного полипептида к димерному составному полипептиду повышается по сравнению с отношением, наблюдаемым при получении полипептида с недостатком ΕΕΌ. Таким образом, мономерный полипептид не только предпочтителен димерному полипептиду, но общее большее количество полипептида результируется во много большем (более чем 5-кратном) количестве мономерного полипептида, который затем при необходимости можно повторно дериватизировать.

Не ограничиваясь теорией, изобретатели полагают, что наблюдаемое неожиданное повышение общего количества экспрессированного полипептида происходит, по крайней мере, частично, вследствие тенденции Сук1 и Сук2 в ΕΕΌ образовывать дисульфидную связь друг с другом. Объяснению такого положения поможет рассмотрение того, что случается во время последующей экспрессии двух идентичных полипептидов, не содержащих ΕΕΌ, как описано выше. Для предварительного обсуждения эти идентичные полипептиды поименованы как РР1 и РР2, и каждый из них содержит один и тот же полипептид, а также С-конец только с одним остатком цистеина (т.е. ни РР1, ни РР2 не содержат ΕΕΌ). Цифры 1 и 2 обозначают здесь не различные виды полипептидов, но скорее временной порядок, в котором идентичные полипептиды экспрессируются.

Допустим теперь, что РР1 экспрессируется раньше РР2, и он (РР1) постепенно переносится в окислительную клеточную окружающую среду в направлении Ν^-С, означая, что аминокислотное окончание этого полипептида будет первым концом, возникающим в упомянутой окислительной среде. Возникающий таким образом остаток цистеина в исходном полипептиде, который будет соучаствовать в стабилизирующей структуру дисульфидной связи, вынужден только ожидать своего партнера - цистеиновый остаток, причем последний находится ближе к С-концу полипептида, чтобы появиться в окислительной окружающей среде для образования упомянутой дисульфидной связи. Этот процесс продолжается непрерывно до тех пор, пока не образуются дисульфидные связи, необходимые для структурной стабилизации в исходном полипептиде. Когда компонент РР1 исходного полипептида возникнет полностью (и надлежащим образом сложится), появится С-концевая часть РР1 только с одним остатком цистеина. Однако здесь не существует цистеина-партнера, с которым этот одиночный цистеин может реагировать для образования дисульфидной связи; таким образом, этот единичный остаток цистеина остается без пары. Когда РР1 полностью выделится, полипептидная часть РР1 надлежащим образом складывается и стабилизируется дисульфидом, а С-концевая часть молекулы несет единичный цистеиновый остаток с реакционноспособной сульфгидрильной группой.

Допустим теперь, что РР2 начинает экспрессироваться в ту же самую окружающую среду, в которой находится завершенный РР1, при этом первоначально возникнет Ν-конец РР2. Первый цистеиновый остаток в полипептидной части РР2 возникает, но еще не может образовать планируемую структуроста

- 3 010374 билизирующую дисульфидную связь, поскольку его цистеиновый реакционноспособный партнер в полипептидной части РР2 еще не возник. Однако единичный непарный цистеиновый остаток в полипептидной части РР2 может реагировать с единичным непарным цистеиновым остатком в С-концевой части уже завершенного РР1. Таким образом, между первым остатком цистеина в полипептидной части РР2 и непарным цистеиновым остатком в С-концевой части РР1 образуется нежелательная дисульфидная связь. При таком развитии событий второй цистеиновый остаток в полипептидной части РР2 будет реагировать с непарным цистеиновым остатком в С-концевой части РР2 или другим цистеиновым остатком в полипептидной части РР2. Любым путем множество дисульфидных связей с большой степенью вероятности возникнет в неправильно построенном комплексе лишенного биологической активности исходного полипептида.

Такой неправильно построенный полипептид, вероятно, может быть распознан как таковой и подвергнут деградации с помощью внутриклеточной протеиназы, уменьшив тем самым общее количество полипептида. В случае, когда такой неправильно построенный полипептид деградирует таким способом недостаточно интенсивно, он, возможно, существует в виде нерастворимой совокупности с другими неправильно сформированными полипептидами этого типа и может быть удален из правильно построенного полипептида путем обычных процедур выделения полипептида. В любом случае полипептид, построенный неправильно, будет обладать тенденцией уменьшения количества правильно построенного полипептида, получаемого в конечном итоге с помощью обычных процедур выделения полипептида.

Наоборот, составной полипептид в соответствии с данным изобретением содержит не только два цистеиновых остатка (Су§1 и Су§2) в ΕΕΌ, но также и линкер, расположенный между ними, причем этот линкер оптимизирован с целью образования дисульфидной связи между Су§1 и Су§2. В свете вышеприведенных соображений, касающихся РР1 и РР2, и допуская теперь, что РР1 и РР2 являются составными полипептидами, предлагаемыми в данном изобретении (т.е. каждый из них содержит ΕΕΌ), становится ясно, что ни Су§1, ни Су§2 в каждом из ΕΕΌ не остается непарным, поскольку Су§1 и Су§2 в соответствующем ΕΕΌ образовывают дисульфидную связь друг с другом. Неправильно построенные полипептиды устраняются, в результате чего продукты не деградируют под воздействием внутриклеточной протеиназы и/или не образуют агрегатов. В конечном итоге, количество экспрессируемого и выделяемого составного полипептида значительно возрастает.

Короче, экспрессия составного полипептида, предлагаемого в данном изобретении, результируется в увеличении соотношения мономер: димер в полипептиде. В то же время уровни получаемого полипептида - безотносительно к его изоформам - также возрастают по сравнению с полипептидом без ΕΕΌ, как описано выше. Чистым результатом является то, что очень малое количество димерного и/или мультимерного полипептида и значительно большее количество мономерного полипептида получается с помощью составного полипептида, содержащего ΕΕΌ, как описано выше, по сравнению с полипептидом, в котором ΕΕΌ отсутствует.

В пределах смысла данного изобретения следует понимать термины Ν-конец и С-конец так, как это принято в биохимии: Ν-конец полипептида является концом полипептидной цепи в аминогруппе, а С-конец полипептида является концом полипептидной цепи в карбоксильной группе. Тот факт, что Су§1 располагается ближе к Ν-концу, чем Су§2, определяет ориентацию Су§1 и Су§2 относительно друг друга в полипептидной цепи. Таким путем также определяется ориентация ΕΕΌ, в котором находятся Су§1 и Су§2.

В пределах смысла этого варианта осуществления изобретения полипептидный линкер с гибкой полипептидной структурой является полипептидным линкером, имеющим при каждой ковалентной связи в полипептидной цепи степень свободы вращения, достаточную для приведения полипептидного линкера в состояние неограниченного в значительной степени (т.е. ограниченного только его длиной) изменения формы, которую он может принимать в трехмерном пространстве. Можно представить в воображении полипептидный линкер, закрепленный за один конец в воображаемой точке в трехмерном пространстве и определяющий сферу вокруг этой точки с радиусом, соответствующим длине полностью растянутого полипептидного линкера, если этот линкер имеет гибкую полипептидную структуру, периферический конец этого линкера (т. е. свободный, незакрепленный конец) должен обладать способностью перемещаться одинаково легко в любую точку трехмерного пространства, расположенную на упомянутой сфере или в ее пределах. Эта модель приводит к выводу, что такой полипептидный линкер с гибкой полипептидной структурой должен также быть по существу, свободен от вторичной полипептидной структуры, например растяжений альфа-спирали или бета-пластины. Любое предрасположение полипептидного линкера к идее вторичной структуры полипептида будет неизбежно ограничивать степень пространственной свободы, присущей свободному концу линкера, сдерживая достижение этим концом точек в пределах вышеописанной сферы. Эта гибкость позволяет линкеру сдваиваться, вследствие чего Су§1 и Су§2 могут образовывать внутримолекулярную дисульфидную связь.

Нежелательная вторичная структура может быть упорядоченной (как в случае альфа-спирали или бета-пластины, упомянутых выше) или может быть беспорядочной, как можно ожидать, если, скажем, в последовательности линкера присутствовал остаток пролина (кольцо, заключенное в пролин, известно как вызывающее изгибы полипептидной основы). Не ограничиваясь теорией, изобретатели предположи

- 4 010374 ли, что эта гибкость линкера между Сук1 и Сук2 является главным детерминантом образования дисульфидной связи между этими двумя остатками цистеина и что эффективное образование дисульфидного соединения связывается с заметным усилением общей наблюдаемой экспрессии полипептида (смотри приведенные выше рассуждения). По этому соображению важно устранить включение аминокислот, например пролина, в последовательность линкера, поскольку такое включение ограничивает свободное перемещение линкера, необходимое для перемещения Сук1 и Сук2 вблизи друг от друга, чтобы образовать желаемую дисульфидную связь. Аминокислотные остатки, наличие которых допускается в линкере в соответствии с данным изобретением, могут содержать (но не ограничиваться) С1у, А1а, Уа1, Ьеи, 11е, 8ег, ТЬг, Ме1. Туг, Аки и С1и.

В пределах смысла данного изобретения под термином дериватизация следует понимать ситуацию, при которой один или оба аминокислотных остатка Сук1 и Сук2 вступают в реакцию с дериватизирующим компонентом. Дериватизирующий компонент может быть, например, соединением, содержащим малеимидную группу (имид малеиновой кислоты), в частности молекулу РЕС (полиэтиленгликоль), содержащую малеимидную группу. В этом частном иллюстративном неограничивающем случае результирующий дериватизируемый Сук1 и/или Сук2 будет дериватизирован с помощью молекулы РЕС через ковалентную связь 8-С, возникающую в результате нуклеотидного разрушения атомом серы в Су 51 и/или Сук2 с одним из атомов ненасыщенного углерода в малеимидном кольце. Другим примером дериватизирующего компонента может быть молекула, которая сама по себе содержит сульфгидрильную группу, так что результирующий дериватизированный Сук1 и/или Сук2 будет дериватизирован с помощью этой молекулы через ковалентную, т.е. дисульфидную связь 8-8. В пределах смысла термина дериватизация находится тот факт, что Сук1 и/или Сук2 может реагировать с другим цистеиновым остатком в той же самой или другой полипептидной цепочке. Специфически образование желаемой внутримолекулярной дисульфидной перемычки между Сук1 и Сук2, как описано выше, следует понимать в данном изобретении как выпадение в пределах смысла термина дериватизация; в этом случае Сук1 будет дериватизирован с помощью Сук2 и наоборот. В общем, с точки зрения Сук1 понятие дериватизация охватывает все действия, при которых Су 51 участвует в ковалентной химической реакции с веществами иными, чем оно само (например, с Сук2). Подобным образом понятие дериватизация покрывает все действия, при которых Сук2 участвует в ковалентной химической реакции с веществами иными, чем оно само (например, с Сук1).

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения по меньшей мере 75% аминокислотных остатков в линкере выбираются из С1у, А1а, Уа1, Ьеи, 11е, 8ег, ТЬг, Меб Туг, Акп и С1п.

Наиболее предпочтительными являются С1у, 8ег, А1а и ТЬг. Эти аминокислоты либо незаряжены, либо хорошо или умеренно хорошо растворимы в воде, либо и то, и другое.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения составной полипептид является одноцепочным полипептидом; это значит, что все аминокислоты присутствуют в одиночной полипептидной цепочке с пептидными связями. Преимущество этого варианта заключается в том, что может быть достигнуто очень эффективное продуцирование желаемого одноцепочного полипептидного продукта, поскольку надлежащая конформация продукта будет зависеть только от создания необходимых вторичной и третичной полипептидных структур; четвертичную полипептидную структуру, в которой отдельные полипептиды, проявляющие признаки третичной структуры, связываются межмолекулярно, нет необходимости рассматривать, когда экспрессируемый составной полипептид является одноцепочным составным полипептидом.

В соответствии со следующим вариантом осуществления данного изобретения ЕЕЭ может располагаться на С- или Ν-конце составного полипептида. Каждое местоположение влечет за собой определенные преимущества, описанные выше, главным образом, наблюдаемое повышение общего количества экспрессированного составного полипептида. Расположенный на С-конце ЕЕЭ будет экспрессирован последним, т.е. после исходного полипептида, с тем результатом, что любые дисульфидные связи в этом полипептиде будут иметь время для формирования как необходимые для стабилизации белка до синтеза ЕЕЭ. Это означает, что когда ЕЕЭ будет полностью синтезирован, желаемая дисульфидная связь между Су51 и Сук2 в ЕЕЭ будет последней по времени образования дисульфидной связью и что структура исходного полипептида будет уже стабилизирована с помощью внутренних дисульфидных связей. Следовательно, сводится к минимуму опасность образования нежелательных дисульфидных связей между Су51 или Сук2 в части ЕЕЭ составного полипептида и другими остатками цистеина в исходном полипептиде.

Расположение ЕЕЭ на Ν-конце составного полипептида имеет следствием то, что нуклеиновая кислота, кодирующая ЕЕЭ, будет транслироваться до нуклеиновой кислоты, кодирующей исходный полипептид. Это означает, что дисульфидная связь между Сук1 и Сук2 в ЕЕЭ может образоваться до трансляции любого другого цистеинового остатка в исходном полипептиде. Здесь снова оказывается минимальной опасность нежелательной дисульфидной связи между Сук1 и Сук2 в части ЕЕЭ составного полипептида и остатком цистеина в исходном полипептиде.

- 5 010374

Следовательно, расположение ΕΕΌ на Ν- или С-конце составного полипептида может определяться соображениями того, где следует привязать дериватизирующие компоненты к ΕΕΌ, чтобы создать наименьшую вероятность нарушения биологической активности исходного полипептида. Этим путем достигается высокая степень экспериментальной гибкости; экспериментатор имеет возможность выбора местоположения ΕΕΌ, которое позволит исходному полипептиду проявить наивысшую активность в конечном дериватизированном составном состоянии без потери преимуществ, обусловленных наличием ΕΕΌ.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения ΕΕΌ составного полипептида имеет вид

-Сук1 -(Хаа)п-Сук2-(Рго)т, где η является любым целым числом от 2 до 20;

т является 0 или 1;

Хаа допускается в каждом положении, будучи любой из встречающихся в природе аминокислот, причем по меньшей мере 75%, даже лучше 80 или 90% остатков Хаа выбираются из С1у, А1а, Уа1, Ьеу, 11е, 8ег, ТЬг, Ме1. Туг, Акп и С1п.

В предпочтительном варианте осуществления все Хаа являются С1у, 8ег, А1а или ТЬг. При допущении переменного η в диапазоне от 2, предпочтительно от 3, до 20 линкер между Сук1 и Сук2 остается достаточно коротким, чтобы способствовать образованию дисульфидной связи между Сук1 и Сук2, но достаточно длинным, чтобы складываться вдвойне. Обнаружено, что для создания дисульфидных связей между Сук1 и Сук2 эффективна длина линкера 4-5, причем для этой цели наиболее предпочтителен линкер длиной в 4 аминокислоты. Обнаружено, что для этой цели из перечисленных выше в этом абзаце аминокислот наиболее подходят О1у и 8ег как по отдельности, так и в смеси. Без ограничения теорией изобретатели предполагают это на основании того факта, что О1у является как химически нейтральной, так и слабой, вследствие чего уменьшается склонность линкера к участию в нежелательных химических реакциях при сохранении максимальной степени беспрепятственной пространственной гибкости. Предполагается, что аминокислота 8ег благодаря ее гидроксильной группе адекватной степени гидрофильности может помочь предохранению слишком гидрофобного линкера от вовлечения в нежелательные гидрофобные взаимодействия с гидрофобными зонами исходного полипептида. Следует заметить, что в случае, когда ΕΕΌ располагается на Ν-конце составного полипептида, равенство т нулю может быть преимуществом.

Данный вариант исполнения изобретения также позволяет связывать пептидом остаток Рго с Сук2 на С-конце последнего, хотя присутствие Рго и не требуется (т.е. переменное т может также равняться нулю). Наличие Рго обнаружено в некоторых случаях при дальнейшем возрастающем количестве производимой экспрессии составного полипептида. Без ограничения теорией изобретатели полагают, что это является следствием способности пролина ингибировать деградацию протеиназы составного полипептида из С-конца последнего.

В особо предпочтительном варианте данного изобретения п=4, а (Хаа)4 представляет собой (О1у)4, (О1у)38ег, (О1у)28егО1у, О1у8ег(О1у)2 или О1у(8ег)3. В другом особо предпочтительном варианте данного изобретения п=5, а (Хаа)5 представляет собой (О1у)5, (О1у)48ег, (О1у)38егО1у, (О1у)28ег(О1у)2, О1у8ег(О1у)3 или 8ег(О1у)4. Особые преимущества использования О1у и 8ег в линкере ΕΕΌ как по отдельности, так и вместе приведены выше. Как отмечено выше, длина линкера в 4 аминокислоты вызывает наиболее эффективное образование дисульфидного пептидного контура между Сук1 и Сук2.

В следующем примере осуществления данного изобретения ΕΕΌ присутствует в виде (Н18)_)-Су81-(Хаа)п-Су82-(Рго)т или Су81-(Хаа)п-Су82-(Н18)_)-(Рго)т, где.) - любое целое число от 2 до 15;

Хаа, п и т определены выше.

Введение в ΕΕΌ последовательности поли-Нщ (Нщ-оконечность) на Ν-стороне Сук1 или С-стороне Сук>2 влечет за собой некоторые преимущества. Во-первых, уже известно (РогаНт 1. е1 а1. (1975), №11иге 258, 598-9; 8и1ко\\'5к| Ε. (1985), Тгепбк ш Вю1есБ 3, 1-12), что Нщ-оконечность может быть бесценным инструментом при выделении экспрессированного полипептида с помощью иммобилизированной никелевой колонки, а также при последующем выявлении полипептида. Но, вероятно, более полезным для составного полипептида по данному изобретению является особое воздействие, которое Н18-оконечность оказывает на образование дисульфидной связи между Сук1 и Сук2 и тем самым на общее количество составного полипептида, получаемого при экспрессии. Это воздействие особенно ясно выражается, когда ΕΕΌ располагается на С-конце исходного полипептида с Нщ-оконечностью на Ν-конце Сук1; или когда ΕΕΌ располагается на Ν-конце исходного полипептида с Нщ-оконечностью на С-конце Сук2 - в каждом случае Нщ-оконечность располагается на поверхности раздела ΕΕΌ и исходного полипептида. Без ограничения теорией изобретатели полагают, что это особое воздействие можно объяснить следующим образом: гистидин обычно несет положительный заряд, поэтому отдельные остатки гистидина в повторяющемся гистидиновом лейтмотиве имеют тенденцию отталкиваться друг от друга, что приводит к растяжению полипептидной цепочки в области гистидиновых остатков. Путем размещения этого гистидинового лейтмотива в пределах ΕΕΌ на поверхности раздела между исходным полипеп- 6 010374 тидом и ΕΕΌ эти два компонента составного полипептида оказываются оттянутыми настолько далеко друг от друга, насколько позволяет длина Ηίδ-оконечности. Это является следствием уменьшение вероятности нежелательных взаимодействий между частью ΕΕΌ, содержащей Су51 и Су52, с одной стороны, и исходным полипептидом - с другой. В то же время при физическом отделении ΕΕΌ от исходного полипептида возрастает вероятность образования дисульфидной связи между Су51 и Су52. Это происходит потому, что Су51 и Су52 существуют в этом плане в большей или меньшей физической изоляции от образующегося составного полипептида; в отсутствие любых других сульфгидрильных групп, конкурирующих с Су51 или Су52 при образовании дисульфидной связи, более вероятно, что эта связь образуется в желаемой форме между соответствующими сульфгидрильными группами на Су51 и Су52.

В особенно предпочтительном варианте осуществления данного изобретения _)=6, т.е. ΕΕΌ находится в виде (Н15)6-Су51 -(Хаа)и-Су82-(Рто)т или Су51 -(Хаа)и-Су82-(Нщ)6-(Рго)т, где Хаа, т и η определены выше.

В следующем варианте осуществления данного изобретения дериватизированные Су51 и/или Су52 являются продуктами реакции остатка (остатков) Су 51 и/или Су52 с дериватизирующим компонентом, содержащим, например, малеимидную группу, сульфгидрильную группу или пиридилдисульфидную группу. Все эти химические группы ковалентно реагируют с сульфгидрилом. Преимущество этого варианта осуществления данного изобретения состоит в том, что большинство дериватизирующих компонентов, которые выгодны в использовании для дериватизации составного полипептида, пригодны в виде, функционализированном с одной из этих групп. По существу, составной полипептид, предлагаемый в данном изобретении, можно дериватизировать с помощью широкого разнообразия различных реагентов для различных терапевтических и диагностических целей. Среди указанных выше групп особенно предпочтительна малеимидная группа. Малеимидная группа реагирует почти полностью с сульфгидрилом при умеренных условиях реакции, которые не приносят вред исходному полипептиду в составном полипептиде; в результате создается сильная ковалентная химическая связь между атомом серы цистеина и одним из двух атомов ненасыщенного углерода в кольце малеимидной группы.

В особо предпочтительном варианте осуществления данного изобретения дериватизирующий компонент, содержащий малеимидную группу, выбирают из полиэтиленгликольмалеимида (ΡΕΟ-ΜΑΕ), малеимид-функционализированного флуоресцентного маркера, малеимид-функционализированного маркера аналитического обнаружения, малеимид-функционализированного радиоактивного индикатора, малеимид-функционализированного белкового сшивающего агента, малеимид-функционализированного хемотерапевтического агента или малеимид-функционализированного токсина, например малеимидфункционализированного иммунотоксина. Соответствующими примерами ΡΕΟ-ΜΑΕ являются метоксиΡΕ6-ΜΆΕ 5 кДа, метокси-РНС-МЛЬ 20 кДа, метокси-(ΡΕС)2-ΜΑ^ 40 кДа, метокси-ΡΕС-(ΜΑ^)2 5 кДа, метокси-РНС/МЛСк 20 кДа, метокси-ΡΕС-(ΜΑ^)2 40 кДа или любая их комбинация. Любой из этих реагентов может использоваться в качестве дериватизирующего компонента, внося известные преимущества полиэтиленгликолизации, включая увеличение периода полувыведения сыворотки и снижение иммуногенности составного полипептида, предлагаемого в данном изобретении. Соответствующими примерами малеимид-функционализированного флуоресцентного маркера являются биотин-малеимид и диоксигенин-малеимид. Соответствующими примерами малеимид-функционализированного радиоактивного индикатора является ΌΤΡΑ-малеимид [ΌΤΡΑ - диэтилентриаминпентауксусная кислота, примеч. перев.]. Соответствующим примером малеимид-функционализированного сшивающего агента является Ν-гидроксисукцинимидилмалеимидное сшивающее вещество, которое реагирует своей гидроксисукциимидильной частью со свободной аминогруппой другого химического вещества для спаривания, а своей малеимидной частью по меньшей мере с одним из Су51 и Су52 на составном полипептиде, предлагаемом в данном изобретении. Сшивающее вещество может преимущественно использоваться, чтобы производить своей Ν-гидроксисукцинимидильной частью, например, гликосилирование, силилирование или пектинилирование составного полипептида, предлагаемого в данном изобретении.

В соответствии со следующим вариантом осуществления данного изобретения Су51 и Су52 дериватизируют компонентом, содержащим сульфгидрильную группу; в частности, упомянутым дериватизирующим компонентом является Су52, соединенный с Су51 дисульфидной связью. Процесс, в котором Су51 образует дисульфидную связь с Су52, описан выше. Примером дериватизации Су51 и Су52 с помощью дериватизирующего компонента, содержащего сульфгидрильную группу, является следующее: дериватизирующий компонент является полипептидом или белком, иным, чем составной полипептид по данному изобретению, а дериватизация выполняется путем образования дисульфидной связи, с одной стороны, между Су51 и/или Су52 составного полипептида, предлагаемого в данном изобретении, а с другой стороны - остатком Су 5 другого полипептида или белка. Дополнительным вариантом дериватизирующего компонента, содержащего сульфгидрильную группу, является компонент, содержащий 5-тиол-2-нитробензойнокислотную группу (ΤΝΒ-Ιΐιίοΐ).

В соответствии со следующим вариантом осуществления данного изобретения как Су51, так и Су52 дериватизируют с помощью дериватизирующих компонентов. Это приводит к двум дериватизирующим компонентам на молекулу предлагаемого составного полипептида. Такая дериватизация обладает осо

- 7 010374 быми преимуществами, когда ей подвергают составной полипептид, предназначенный для использования в качестве визуализирующего реактива. Это является следствием того, что двойная дериватизация на молекулу составного полипептида должна приводить к удвоенному сигналу визуализации с такой же интенсивностью, как и в результате использования составного полипептида, дериватизированного только одним компонентом на молекулу. Двойная дериватизация также обладает преимуществами при некоторых условиях, когда составной полипептид предназначен для использования в качестве терапевтического средства. Например, если желательно перед лечебным приемом полиэтиленгликолизировать составной полипептид и общая молекулярная масса РЕС должна составлять 40 кДа, лучше всего дериватизировать Сук1 и Сук2 составного полипептида с помощью двух молекул РЕС-МЛЬ по 20 кДа, чем Сук1 или Сук2 с помощью только одной молекулы РКС-МЛЬ 40 кДа. В общем, дериватизацию на Сук1 и Сук2 можно выполнить путем реагирования составного полипептида, предлагаемого в данном изобретении, с молярным избытком дериватизирующего компонента.

В соответствии со следующим вариантом осуществления данного изобретения либо Сук1, либо Сук2 дериватизируют с помощью первого дериватизирующего компонента, а соответствующие другие Сук2 и Сук1 дериватизируют с помощью второго дериватизирующего компонента, причем вторая дериватизация не проявляет какой-либо иной функциональности, кроме блокады/защиты остатка Сук, с которым она связана. Следовательно, в описанном выше процессе иногда может быть выгодным или необходимым дериватизировать составной полипептид, предлагаемый в данном изобретении, только единожды, например когда составной полипептид используется в качестве диагностического реактива в той ситуации, когда между биологической активностью исходного полипептида в составном полипептиде и измеряемым сигналом необходима корреляция 1:1. Можно представить себе подобный процесс, в котором, скажем, желательно или необходимо полиэтиленгликолизировать составной полипептид, предлагаемый в данном изобретении, лишь на одной позиции. В таких случаях составной полипептид может быть инкубирован при умеренных условиях восстановления, чтобы восстановить дисульфидную связь, существующую между Сук1 и Сук2, но не любые другие дисульфидные связи, существующие по всей структуре исходного полипептида, чтобы стабилизировать структуру последнего. Такое избирательное восстановление при умеренных условиях, как правило, бывает возможным, поскольку дисульфидные связи, участвующие в стабилизации структуры полипептида, обычно скрыты в этой структуре и, следовательно, труднодоступны для восстановительных агентов в растворе, тогда как незащищенный ЕЕЭ на С-конце более доступен. Вслед за разрывом дисульфидной связи в ЕЕЭ составной полипептид, предлагаемый в данном изобретении, может затем реагировать с первым дериватизирующим компонентом таким образом, что молярная концентрация первого дериватизирующего компонента будет равной или несколько меньшей, чем молярная концентрация предлагаемого составного полипептида. Точное стехиометрическое корректирование этого соотношения может оказаться необходимым в зависимости от используемого первого дериватизирующего компонента, но такое корректирование хорошо укладывается в пределы компетенции квалифицированных практикующих врачей.

Вслед за реакцией либо Сук1, либо Сук2 с первым дериватизирующим компонентом единожды дериватизируемый составной полипептид может быть выделен обычными способами и подвергнут следующей реакции со вторым дериватизирующим компонентом. Роль второго дериватизирующего компонента заключается в деактивации остаточной свободной сульфгидрильной группы недериватизированного цистеинового остатка в ЕЕЭ. Для гарантии того, что реакция со вторым дериватизирующим компонентом будет эффективной, эта реакция должна преимущественно выполняться с молярным избытком второго дериватизирующего компонента относительно составного полипептида. В этом смысле второй дериватизирующий компонент может быть любым компонентом, который ковалентно реагирует со свободным цистеиновым остатком в ЕЕЭ и может служить любым из химических соединений, указанных выше в контексте первого дериватизирующего компонента. Поскольку функция второго дериватизирующего компонента состоит всего лишь в том, чтобы сделать остаток цистеина в ЕЕЭ химически инертным, второй дериватизирующий компонент не должен быть помехой ожидаемой активности исходного полипептида или первого дериватизирующего компонента, соединенного с другим цистеиновым остатком в ЕЕЭ. С этой целью второй дериватизирующий компонент должен быть химически и электростатически инертным и настолько слабым, насколько возможно. Особо предпочтительным вторым дериватизирующим компонентом является этилмалеимид. Этот второй дериватизирующий компонент будет реагировать со свободной сульфгидрильной группой цистеинового остатка в ЕЕЭ, чтобы образовать уже описанную ковалентную С-8-связь.

В соответствии со следующим вариантом осуществления данного изобретения исходный полипептид может быть любым полипептидом, для которого желательна соответствующая экспрессия. Сюда включаются все молекулы белка и полипептида различных размеров (т.е. молекулярной массы), независимо от изоэлектрических точек, последовательностей первичных аминокислот или желаемых посттрансляционных модификаций, таких как гликосилирование или фосфорилирование. Исходный полипептид может быть преимущественно рецепторной, лигандной или соединительной молекулой. Он может быть экспрессирован в прокариоты или эукариоты и может быть сам по себе природного или рекомбинантного происхождения.

- 8 010374

В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения исходный полипептид имеет четное количество цистеиновых остатков, необходимых для стабилизации структуры полипептида. Это является нормальным в случае, когда исходный полипептид существует в виде одноцепочного полипептида (т.е. не будет взаимодействовать в последующей экспрессии с любой другой полипептидной цепочкой, чтобы образовать многоцепочный полипептид), поскольку каждая дисульфидная связь, необходимая для стабилизации структуры полипептида, требует присутствия двух цистеиновых остатков.

В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения исходный полипептид является соединительной молекулой в виде антитела. Понятие антитело в этом варианте осуществления данного изобретения означает одноцепочные моно- и биспецифичные антитела, а также антитела, содержащие множественные полипептидные цепочки, такие как молекулы иммуноглобулина (в которых может быть выгодно экспрессировать каждую его составляющую полипептидную цепочку с помощью своего собственного ΕΕΌ или диатела (ФаЬоФек)), в которых две молекулы ксЕу, каждая со своим собственным ΕΕΌ, связываются линейно голова к хвосту, образуя молекулярную разновидность, способную связывать два различных антигена. Такие молекулы иммуноглобулина могут быть либо моноспецифичными (т. е. каждый из двух связывающих отростков иммуноглобулина присоединяется к одному и тому же антигену), либо биспецифичными (т.е. два связывающих отростка иммуноглобулина присоединяются к разным антигенам); такие биспецифичные иммуноглобулины получают, например, из гибрид-гибридомы.

В особо предпочтительном варианте осуществления данного изобретения исходный полипептид является моноспецифичным одноцепочным антителом. В пределах смысла данного изобретения термин моноспецифичное одноцепочное антитело можно понимать как одинарную цепочку полипептида, содержащую по крайней мере один вариабельный участок антитела. Этот один вариабельный участок антитела может быть представлен в природе, например в библиотеке антител природного происхождения, либо может быть синтезирован, при этом он будет содержать элементы, обнаруженные в природе или полученные из природных источников, но эти элементы будут присутствовать в сочетаниях, не встречающихся в природе. Альтернативно, моноспецифичное одноцепочное антитело может содержать как природные, так и синтезированные элементы. Точно попадают в пределы смысла термина моноспецифичное одноцепочное антитело однодоменные антитела, молекулы ксЕу, а также смягченные и/или деиммунизированные их варианты.

В соответствии со следующим особенно предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения исходный полипептид может быть биспецифичным одноцепочным антителом. В пределах смысла данного изобретения термин биспецифичное одноцепочное антитело следует понимать как два описанных выше моноспецифичных одноцепочных антитела, существующих в одинарной полипептидной цепочке и предпочтительно отделенных друг от друга соответствующей полипептидной разделительной последовательностью. Примеры таких спейсеров можно найти в ВР 623679 В1 и И8 5258498. По существу, составной полипептид может преимущественно представлять собой дериватизированное биспецифичное антитело.

В соответствии со следующим вариантом осуществления данного изобретения биспецифичное одноцепочное антитело содержит первое моноспецифичное одноцепочное антитело (первую связывающую часть), специфично связывающееся с антигеном-эффектором, и второе моноспецифичное одноцепочное антитело (вторую связывающую часть), специфично связывающееся с антигеном-мишенью. Эта основная конструкция имеет то преимущество, что исходный полипептид может специфично связываться своей первой связывающей частью с антигеном-эффектором таким образом, что связанный антигенэффектор, например, становится активированным. Биологическая активность, возбуждаемая этим антигеном-эффектором, затем может быть направлена, например, на клетку, несущую антиген-мишень, с которым связывается вторая часть биспецифичного одноцепочного антитела. Здесь следует понять, что термины первый и второй не подразумевают ограничения, касающегося расположения частей антитела относительно Ν- или С-конца полипептида. Следовательно, в пределах объема этого варианта осуществления изобретения составной полипептид содержит исходный полипептид, в котором первая связывающая часть, специфичная к антиген-эффектору, может располагаться в направлении Ν- или С-конца исходного полипептида.

В особо предпочтительном варианте осуществления данного изобретения антиген-эффектор выбирают из антигена СЭ3. антигена СЭ64. антигена СЭ89 и антигена ΝΚΟ2Ό. В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения антиген-мишень выбирают из ΕρСΑΜ, ССР5, СЭ19, ΗΕΚ-2 пей, ΗΕΚ-3, ΗΕΚ-4, Ε6ΕΒ, Р8МА, СΕΑ, МПС-1 (муцин), МИС2, МИС3, МИС4, МИС5АС, МИС5В, МИС7, ЙСС, ЬеМк-У, СЭ20, СЭ33, СЭ30, ганглиозида 6Ό3, 9-0-ацетил-СЭ3, СМ2, С1оЬо Η, фукозила СМ1, Ро1у 8А, ΟΌ2, карбоангидразы IX (М№СА IX), СЭ44у6, 81111 (8ошс Веб^еНой), ^ие-1, Р1а§ша Се11 Апйдеп, (мембранно-связанного) Ι§Ε, МС8Р (Ме1апота Сйгопбгойш 8ийа1е Рго!еод1усап), ССК.8, предшественника ΤΝΡ-α, 8ΤΕЛР, мезотелина, антигена А33, Р8СА (Рго81а1е 81ет Се11 Апбдеп), Ьу-6; десмоглеина 4, Ε-сабйегш пеоерйоре, Ее1а1 АсеИ1сйо1ше Йесер1ог, СЭ25, маркера СА19-9, маркера СА-125 и М18 (Мие11ейап 1пЫЬйогу 8иЬйапсе), РесерЮг 1уре II, §Тп (сиалилированного антигена Тп;

- 9 010374

ΤΑΟ-72), ΕΑΡ (ИЬгоЫак! ΛοΙίναΙίοη ЛпНдсп). эндосиалина, ΕΟΕΒνΙΙΙ, ЬО, δΑδ и СЭ63. Здесь все перечисленные антигены (как антигены-эффекторы, так и антигены-мишени) могут быть человеческими антигенами.

В самом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения антиген-мишень является человеческим антигеном СЭ19, а антиген-эффектор является человеческим антигеном СЭ3. По существу, этот вариант придает дериватизированному составному полипептиду способность направлять цитотоксичный потенциал Т-клеток против лимфоцитов В, несущих антиген СП 19. Такое лекарственное средство имеет высокий потенциал как терапевтический агент при лечении злокачественного развития В-клеток. В результате представляет большой интерес дериватизация такого составного полипептида в его ΕΕΌ с помощью одной или нескольких молекул полиэтиленгликоля (ΡΕΟ), чтобы увеличить период полувыведения сыворотки с одновременным уменьшением иммуногенности составного полипептида.

В другом самом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения антиген-мишень является человеческим антигеном ΕρСΑΜ, а антиген-эффектор является человеческим антигеном 0Ό3. По существу, этот вариант придает дериватизированному составному полипептиду способность направлять цитотоксичный потенциал Т-клеток против клеток, несущих антиген ΕρСΑΜ. Антиген ΕρСΑΜ экспрессируется во многих человеческих злокачественных клетках; следовательно, такой дериватизированный составной полипептид имеет высокий потенциал для лечения широкого разнообразия злокачественных опухолей человека. Как и при составном полипептиде анти-СП3ханти-СП19, описанном выше, представляет большой интерес дериватизация такого составного полипептида в его ΕΕΌ одной или несколькими молекулами ΡΕΟ.

Дополнительный аспект данного изобретения относится к композиции, содержащей любой из вышеописанных составных полипептидов и приемлемый в фармакологии носитель.

В дополнительном аспекте изобретения предлагается способ получения составного полипептида, в котором составной полипептид содержит исходный полипептид и экспрессируется с более высоким выходом, чем исходный полипептид; упомянутый способ содержит:

Α) обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей исходный полипептид;

B) введение в любой конец нуклеотидной последовательности, кодирующей исходный полипептид, нуклеотидной последовательности, кодирующей домен, усиливающий экспрессию (ΕΕΌ), причем упомянутая нуклеотидная последовательность, кодирующая ΕΕΌ, содержит кодоны для первого и второго цистеиновых аминокислотных остатков Су§1 и Су§2 соответственно, при этом кодон для Су§1 располагается ближе к 5'-концу нуклеотидной последовательности, чем кодон для Су§2, в которой кодоны для Су§1 и Су§2 разделяются нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептидный линкер, причем упомянутый линкер свободен от цистеина и определяет длину, достаточную для того, чтобы позволить Су§1 и Су§2 вступать во внутримолекулярную дисульфидную связь друг с другом;

C) трансфекция нуклеотидной последовательности из этапа В в систему экспрессии хозяина в соответствующем векторе;

Ό) инкубирование системы экспрессии хозяина при соответствующих условиях, чтобы иметь результатом экспрессию нуклеотидной последовательности из этапа В;

Ε) выделение полипептида, экспрессированного на этапе Ό, чтобы получить составной полипептид.

Предпочтительный вариант осуществления этого аспекта изобретения содержит дополнительный этап дериватизации составного полипептида, полученного на этапе Ε, на Су§1 и/или Су§2. Такую дериватизацию можно выполнять, как описано выше, а именно путем восстановления внутримолекулярной дисульфидной связи между Су§ 1 и Су§2 (эта внутримолекулярная дисульфидная связь сама по себе выглядит как дериватизация) при условиях восстановления (например, используя дитиотреитол или ΌΤΤ) вслед за реакцией восстановления продукта с другим дериватизирующим компонентом, несущим химическую группу, которая реагирует по крайней мере с одной из свободных тиоловых групп Су§1 и Су§2.

Данное изобретение будет описано теперь более подробно с помощью следующих неограничивающих чертежей и примеров.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Результаты антиген-специфичного иммуноферментного анализа (ИФА) в зависимости от длины линкера между Су§1 и Су§2.

Фиг. 2. Результаты антиген-специфичного ИФА как измерение выходов экспрессии с помощью одного С-концевого цистеинового и двух С-концевых цистеиновых остатков, разделенных 4-глициновым линкером.

Фиг. 3. Результаты вестерн-блоттинга как измерение выхода экспрессии с помощью одного С-концевого цистеинового остатка и двух С-концевых цистеиновых остатков, разделенных 4-глициновым линкером.

Фиг. 4. Результаты гель-фильтрационной хроматографии, показывающие профиль элюирования составного полипептида в соответствии с данным изобретением и профиль элюирования полипептида только с одним С-концевым цистеиновым остатком.

Фиг. 5. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (δΌδ-ΡΑΟΕ) мономерного и димерного видов ^Εν; результаты получены с помощью гель

- 10 010374 фильтрационной хроматографии и показаны при невосстановительных (слева) и восстановительных (справа) условиях.

Фиг. 6. 8Ό8-ΡΑΟΕ 8сЕу с одним и двумя С-концевыми цистеиновыми остатками до и после реакции с 20 кДа ΡΕΟ-малеимида.

Изобретение будет теперь описано в дальнейших подробностях с помощью следующих неограничивающих примеров.

Примеры

Пример 1. Клонирование и экспрессия 8сЕу с С-концевой оконечностью (Н18)6-Су8-(О1у)4-Су8-Рто (т.е. 8сЕу с ΕΕΌ, как указывалось выше).

В качестве образцовой молекулы для демонстрации данного изобретения использовали молекулу 8сЕу. т.е. полипептида, объединяющего вариабельные участки антител с тяжелой и легкой цепочкой и полипептидный линкер, расположенный между ними. Эта 8сЕу специфично связывается с заранее определенным антигеном, далее называемым антиген. Молекула 8сЕу с С-концевой оконечностью (Н18)6-Су8-(О1у)4-Су8-Рто сконструирована с помощью реакции синтеза цепи (РСК) со специфическими затравками УЪ, а нуклеотидная последовательность независимо расширялась с помощью каждой из соответствующих нуклеотидных последовательностей по основной схеме (Н18)6-Су8-(О1у)х-Су8-Рто (А:Т0666Т66СТ6ССС0ТАА, В:6С66Т66С66ТТ6ССС0ТАА,

С:Т6С66Т66С66Т66СТ6ССС0ТАА, И:Т6С66Т66С66Т66СТ6ССС0ТАА). Это четыре выходные нуклеотидные последовательности, кодирующие четыре отдельные 8сЕу. каждая из которых снабжена С-концевой оконечностью, имеющей два цистеиновых остатка, разделенных глициновыми линкерами переменной длины. НЕ-оконечность использовали на поздних этапах обнаружения и очистки. Результирующие УЪ-фрагменты субклонировали с помощью сайтов, узнаваемых рестрикционными энзимами 8а11 и ΝοίΙ (вводимых с помощью РСК) в рВАИре1В (извлекаемого из вектора рВАИМуеА - Н18 из 1пуЦгщсп). содержащего соответствующий УН после ведущей последовательности ре1В для экспрессии периплазмы. После преобразования в компетентные к температурному шоку Εχοΐί ХЫ В1ие одиночный клон культивировали в элективных средах (ЬВ 50 мг/мл карбенициллина) и обычными способами получали плазмиду. Успешное клонирование подтверждали определением последовательности аминокислот вставки (8ес.|Ш8ег\'е. Мишей).

Εχο1ί ВЙ-ЗЮй.! трансформировали с помощью кодирования экспрессионной плазмидой для соответствующей 8сЕу с одним или двумя концевыми остатками Суз и выращивали на селективном агаре. Одну колонию использовали для окулирования 5 мл ЬВ 50 г/мл карбенициллина на протяжении ночи при 37°С. Для получения культуры 500 мл 8В питательной среды, содержащей 20 мМ МдС1₂ и 50 мг/мл карбенициллина в 2 встряхиваемых колбах, инокулировали бактерийной взвесью культуры, ранее инокулированной на протяжении ночи, и затем инкубировали при 37°С до оптической плотности ОИ600 0,6-0,8. Продуцирование вызывали путем добавления Ь-арабинозы до конечной концентрации 0,2% и уменьшения температуры до 30°С. После четырехчасовой фазы продуцирования при 30°С бактерии собирали и ресуспендировали в 40 мл фосфатно-солевого буферного раствора (РВ8). Через четыре периода замораживания при -70°С и отогревания при 37°С внешняя мембрана разрушалась температурным шоком и растворенные белки периплазмы, включая фрагменты 8сЕу. выпускались в жидкую среду. После устранения путем центрифугирования целых клеток и клеточных обломков надосадочную жидкость использовали для иммуноферментного анализа (ИФА).

ИФА периплазматического препарата выполняли, используя ИФА-пластинку (Мше Мах18огр), покрытую Рто1ешЕ (2 мг/мл в РВ8). Покрытие выполняли с ночной выдержкой при 4°С. После промывки РВ8 0,05% Т\гееп пластинку блокировали 100 мл РВ8, содержащего 3% альбумина бычьей сыворотки (В8А) в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки добавляли 50 мл периплазмы, разбавляли постепенно до 1:3 и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После дополнительного этапа промывки специфично выполняли обнаружение 8сЕу. связанной с Рто1е1иЕ, используя 50 мл АпЦдеп-ВюЕп (1,5 мг/мл содержания РВ8, 1% В8А), обнаруживаемого с помощью стрептавидинпероксидазы хрена (Иако, 1 мг/мл в РВ8, содержащий 1% В8А). Сигнал обнаруживали с помощью добавления 100 мл раствора АВТ8 (2,2'-азино-ди[3-этилбензтиазолин-сульфонат(6)]диаммониевая соль) в течение 15-30 мин. Величины оптической плотности измеряли на считывающем устройстве ИФА при длине волны 405 нм. Результаты показаны на фиг. 1, где НСР, СН2С1уСР, НС3О1уСР, НС4О1уСР и НС5О1уСР соответственно относятся к молекулам 8сЕу с С-концевыми оконечностями, содержащими (Н18)6-Су8-Рто, (Н18)6-Су8-(О1у)2-Су8-Рго, (Н18)6-Су8-(О1у)3-Су8-Рго, (Н18)6-Су8-(О1у)4-Су8-Рго, (Н18)6Су8-(О1у)5-Су8-Рто. Как можно видеть на фиг. 1, наибольшая степень связывания 8сЕу с антигеном наблюдалась для конструкций с четырьмя глицинами, используемыми в качестве линкера между двумя С-концевыми остатками цистеина.

Пример 2. Подтверждение более высокого выхода белка 8сЕу с оконечностью (Н18)6-Су8-(О1у)4Суз-Рго (т.е. с ΕΕΌ, как описано выше) по сравнению с 8сЕу с оконечностью (Н18)6-Су8-Рго (т.е. без ΕΕΌ, как описано выше).

Сравнивали уровни экспрессии белка 8сЕу, расширенной с помощью оконечности (Н18)6-Су8(О1у)4-Су8-Рто (т.е. 8сЕу с ΕΕΌ, как описано выше, обозначенной как 4О1у на фиг. 2), и 8сЕу, расши

- 11 010374 ренной с помощью С-концевой оконечности (Н1к)6-Сук-Рго (т.е. кеРу без ΕΕΌ, как описано выше, обозначенной как НСР на фиг. 2). Обе конструкции анализировали на малой шкале, используя штамм Ε.οοίί ΒΕ21ΌΕ3. В каждом случае 10 различных колоний инокулировали в 5 мл 8 В/20 мМ МдС1₂/50 мг/мл карбенициллина в течение 4 ч при 37°С во встряхиваемом инкубаторе. Опять-таки продуцирование белка инициировали с помощью добавления к клеточным культурам 0,2% Ь-арабинозы и понижением температуры до 30°С. После ночного индукционного периода клетки собирали, ресуспендировали в мл РВ8 и выделяли периплазматическую фракцию методом замораживания/отогревания, после чего проводили антиген-специфичный ИФА, как описано в примере 1. Результаты этого анализа показаны на фиг. 2. Результаты ИФА ясно показывают значительно увеличенный выход кеРу с оконечностью (Н1к)6-Сук-(О1у)4-Сук-Рго(4О1у) в сырой периплазме по сравнению с кеРу, содержащей С-концевую (Н1к)6-Сук-Рго, но не содержащей второй цистеиновый остаток. Ясно, кроме того, что способность образования регулируемой внутримолекулярной дисульфидной связи между двумя цистеиновыми остатками в С-концевой оконечности (т.е. ΕΕΌ, как указано выше) имеет решающее значение для достижения наблюдаемого повышенного продуцирования.

Далее проводили анализ периплазматических фракций с помощью невосстанавливающего 8^8-РΑ^Ε, следуя за вестерн-блоттингом в соответствии с обычной процедурой. Обнаружение кеРу с Н1к-оконечностью выполняли, используя аи11-реи1а Ηίκ-антитело, 01адсп (1 мг/мл в РВ8, содержащем 0,1% В8А), обнаруживаемый с помощью щелочного соединенного с фосфатазой антитела козы к мышиному, 8щша (1 мг/мл в РВ8, содержащем 0,1% В8А). Белковое пятно развивали путем добавления основного раствора ВС1Р/ИВТ (81дта, В-1911). Результаты показаны на фиг. 3.

Зоны 1 и 2 на фиг. 3, определенные вестерн-блоттингом, показывают полосы кеРу с (Н1к)6-Рго на С-конце. В зонах 3 и 4, соответствующих кеРу с (Н1к)6-Сук-Рго на С-конце полипептида в интенсивности полос кеРу в вестерн-блоттинге и, следовательно, в общем количестве экспрессированного полипептида, прослеживается крутой спад. Зоны 5 и 6, соответствующие кеРу с (Н1к)6-Сук-(О1у)4-Сук-Рто на С-конце полипептида, показывают интенсивность полос, которая сравнима с интенсивностью, видимой в зонах 1 и 2. Это ясно говорит о том, что потеря экспрессии белка, испытываемая при добавлении одного цистеинового остатка к С-концу полипептида кеРу (зоны 3 и 4), восстанавливается путем добавления второго цистеинового остатка, отделенного от первого цистеинового остатка полипептидным линкером, позволяющим образование дисульфидной связи между двумя цистеиновыми остатками (зоны 5 и 6).

В совокупности результаты ИФА (фиг. 2) и вестерн-блоттинга (фиг. 3) показывают более высокий выход белка/кеРу при конструкции кеРу с двумя С-концевыми цистеиновыми остатками по сравнению с конструкцией кеРу с одним С-концевым остатком цистеина.

Пример 3. Очистка кеРу с оконечностью (Н1к)6-Сук-(О1у)4-Сук-Рто (т.е. ΕΕΌ, как описано выше).

Б^ой ВБ21ЭБ3 трансформировали с помощью экспрессионной плазмиды и выращивали на селективном агаре. Одну колонию использовали для инокулирования 5 мл ЬВ 50 мг/мл карбенициллина в течение ночи при 37°С. Для продуцирования культуры 50 мл 8В/20 мМ МдС1₂/50 мг/мл карбенициллина в встряхиваемых колбах инокулировали бактерийной взвесью, ранее инокулированной на протяжении ночи, и выращивали при 37°С до оптической плотности ΟΌ600 0,6-0,8. Продуцирование белка вызывали путем добавления Ь-арабинозы до конечной концентрации 0,2% и уменьшения температуры до 30°С. После ночной фазы продуцирования при 30°С бактерии собирали и ресуспендировали в 40 мл РВ8. Внешнюю мембрану разрушали температурным шоком и растворенные белки периплазмы, включая кеРу-фрагмент, выпускали в жидкую среду. После устранения путем центрифугирования целых клеток и клеточных обломков надосадочную жидкость подвергали дополнительной очистке.

8СА-молекулы первоначально очищали с помощью колонки для проведения хроматографии по сродству 1МАС, воздействующей на С-концевую Н1к-оконечность. Это выполняли, используя колонку О|адеп Νί-ΝΤΑ в соответствии с методикой, представленной изготовителем. Колонку уравновешивали 20 мМ фосфата натрия 0,4 М №С1, рН 7,2, и загружали в колонку периплазматический препарат (40 мл) со скоростью подачи 2 мл/мин. Затем колонку промывали 5 объемами колонки уравновешивающего буферного раствора, содержащего 0,025 М имидазола, чтобы удалить несвязанную пробу. Элюирование выполнялось с помощью уравновешивающего буферного раствора, содержащего 0,5 М имидазола в 5 объемах колонки. Элюированные фракции белка объединяли для дальнейших этапов очистки.

Для того чтобы достичь разделения молекулярной массы, т.е. разделения на мультимерную, димерную и мономерную фракции, выполняли гель-фильтрационную хроматографию на колонке 8ирегбех 875, уравновешиваемой РВ8. Элюированный белок, отслеживаемый путем непрерывного измерения поглощения света 280 нм (скорость потока 1 мл/мин), подвергали обычному 8^8-РΑ^Ε. Результаты показаны на фиг. 4. На фиг. 4 показаны два профиля элюирования А и В, причем более низкий (профиль А) является профилем элюирования ксБу с С-концевым (Н1к)6-Сук-Рго, а более высокий (профиль В) является профилем элюирования ксБу с С-концевым (Н1к)6-Сук-(О1у)4-Сук-Рто (т.е. кеРу с ΕΕΌ, как описано выше). Как можно видеть, введение второго цистеинового остатка в С-концевую часть ксБу при адекватном отделении ее от первого цистеинового остатка для образования дисульфидного контура приводит не только к более высокому соотношению мономер: димер, но и к более высокому выходу всего белка безотносительно к мономерной или димерной изоформе.

- 12 010374

Этот оптический анализ подтверждается концентрациями изоформ. Концентрации белка вычисляли, используя значения АИС (определяемые программным обеспечением υΝΚΌΡΝ) и специфичного для последовательностей коэффициента поглощения. Полученные величины концентраций сведены в таблицу________________________________________________________________________

Аминокислотная последовательность С-концевой части	Изоформа полипептида	Вычисленная концентрация, мг/мл	Объем пробы, мл	Общее количество белка на изоформу, мг	Общее количество белка, мг
ННННННСР	Мономер	14,2	6	85,2	276,6
ННННННСР	Димер	31,9	6	191,4
ННННННСООООСР	Мономер	69	8	552	775,2
ННННННСООООСР	Димер	27,9	8	223,2

Из таблицы можно сделать следующие выводы. Во-первых, соотношение мономер:димер для 5сР\ с одиночным цистеиновым остатком в ее С-концевой части составляет около 1:2,25. Путем добавления второго цистеинового остатка в С-концевую часть 5сН и размещения соответствующего линкера между первым и вторым цистеиновыми остатками стимулируется внутримолекулярная дисульфидная связь, а соотношение мономер:димер полученной βοΕν возрастает приблизительно в 5,5 раза до 1:0,4. С точки зрения полного выхода полипептида безотносительно к его изоформе возрастание выхода от 276,6 мкг для δοΡν с одиночным цистеиновым остатком до 775,2 для βοΕν с двумя цистеиновыми остатками представляет собой повышение экспрессии всего белка на 280% или почти в 3 раза.

Анализ гель-фильтрованной мономерной и димерной фракции с помощью δϋδ-РАСЕ при невосстановительных и восстановительных условиях (фиг. 5) ясно показал, что приблизительно 80% димерной фракции δοΕν с одиночным цистеиновым остатком в ее С-концевой части являются димерными, сшитыми с помощью дисульфидной связи (фиг. 5, невосстанавливающий гель, зона 2), тогда как димерная фракция κεΕν с двумя цистеиновыми остатками в ее С-концевой части существует в основном как мономер вследствие образования дисульфидного контура между двумя С-концевыми цистеиновыми остатками (фиг. 5, невосстанавливающий гель, зона 4). Димерная дисагрегация в мономере (фиг. 5, невосстанавливающий гель, зона 4) является показателем того, что агрегация происходила только путем взаимодействия белок-белок, а не вследствие дисульфидного сшивания. Зоны 1 и 3 на фиг. 5 (восстановительные и невосстановительные условия) показывают соответствующие мономерные фракции.

Те же самые пробы были также испытаны с восстанавливающим гелем (фиг. 5). Относительно βοΕν без оконечности (Н18)6-Су8-(С1у)4-Су8-Рго зоны 2 показывают, что любой димер, присутствующий в невосстанавливающем геле, фактически возник вследствие образования нежелательных дисульфидных связей между цистеиновыми остатками в двух соответствующих полипептидных молекулах. То же самое справедливо для остаточного минимального количества димера βοΕν с оконечностью (Н18)6-Су8-(С1у)4Суз-Рго (зона 4). Условия восстановления в восстанавливающем геле достаточны для разрыва этих дисульфидных связей таким образом, чтобы только наблюдаемые полосы являлись мономерными видами полипептида βοΕν, в которых отсутствует цистеиновый остаток βοΕν, способный образовать дисульфидные связи с любым другим остатком цистеина.

Пример 4. Побочное полиэтиленгликолирование βοΕν с С-концевой оконечностью (Н18)6-Су8(С1у)4-Суз-Рго и без нее.

Результат полиэтиленгликолирования при свободных остатках цистеина должен выразиться в стабильном гомогенном конъюганте βοΕν-ΡΕΟ. Два белковых раствора, содержащих, соответственно, очищенную зсЕу с С-концевой оконечностью (Н18)6-Су8-(С1у)4-Су8-Рго и βοΕν с С-концевой оконечностью (Н18)6-Су8-Рго инкубировали ЭТТ при конечной концентрации 2 мМ в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы восстановить терминальную дисульфидную связь, результируюгцуюся в двух свободных сульфгидрильных группах.

Затем выполняли гелевую фильтрацию (8ср11ас1с.\ С25М, Ашегзйаш) каждого полипептида отдельно, чтобы удалить остаточный ЭТТ. используя в качестве буфера сополимер стирола и бутадиена (РВ8). К первой половине каждой пробы полипептида добавляли гпРЕС-малеимид ν\¥ 20 кДа (811саг\\а1сг. 2О2МОРО1) при 10-кратном молярном избытке молекул РЕС. Термин итРЕС имеет здесь известное значение, а именно метоксиполиэтиленгликоль. Другую половину каждой пробы полипептида инкубировали с помощью 10 -кратного молярного избытка этилмалеимида (81дша, Е-1271) как контрольную.

Каждую реакцию проводили в течение 2 ч с перемешиванием при комнатной температуре. Все пробы анализировали с помощью 8Э8-РАСЕ при невосстанавливающих условиях и окрашивали серебром в соответствии с обычной методикой (Ιηνίίτο^εη, каталог № ЬС 6100). Результаты показаны на фиг. 6.

В зоне 1 фиг. 6 показана βοΕν с (Н18)6-Су8-Рго на С-конце. Остаток цистеина блокировали реакцией с этилмалеимидом. В зоне 2 фиг. 6 показана βοΕν с (Н18)6-Су8-(С1у)4-Су8-Рго на С-конце, где оба остатка цистеина блокированы реакцией с этилмалеимидом. Относительные интенсивности полос в зонах 1 и 2

-13 010374 (т.е. полоса в зоне 2 намного более интенсивна, чем полоса в той же позиции в зоне 1) являются мерой интенсивности повышенной экспрессии, достигаемой экспрессированием 5сБу с двумя С-концевыми цистеиновыми остатками по сравнению с экспрессированием 5сБу с одним С-концевым цистеиновым остатком.

В зоне 3 фиг. 6 показан результат взаимодействия 5сБу с одним С-концевым цистеиновым остатком с РЕС-малеимидом молекулярной массы 20 кДа. Как можно видеть, в верхней части зоны 3 получена только очень слабая полоса, слабость которой является показателем низкого выхода экспрессии и, следовательно, меньшего абсолютного количества 5сР\'. полученного при использовании 5сБу только с одним С-концевым цистеиновым остатком. В виде резкого контраста в зоне 4 на фиг. 6 показаны две отдельные полосы, которые означают, что 5сРу с двумя С-концевыми цистеиновыми остатками, отделенными друг от друга 4-глициновым линкером, реагировала с 20 кДа РЕС. Одна полоса, полученная при той же молекулярной массе, что и соответствующие непрореагировавшие образцы, показывает, что реакция с 20 кДа РЕС не выполнялась. Другая полоса, расположенная выше и полученная при большей молекулярной массе, показывает, что 20 кДа РЕС реагировали с обоими цистеиновыми остатками в С-концевой части 5сРу, и продукт полиэтиленгликолирования 5сРу имеет большую молекулярную массу, чем тот же продукт только с одним С-концевым цистеиновым остатком. Следует подчеркнуть, что можно было получить достаточное количество исходного материала, содержащего цистеин, для последующей реакции полиэтиленгликолирования только путем введения в С-концевую часть 5сРу не одного, но двух цистеиновых остатков, отделенных друг от друга 4-глициновым линкером.

Claims (22)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Составной полипептид, содержащий исходный полипептид и домен, усиливающий экспрессию (ЕЕИ), где упомянутый ЕЕИ содержит такие первый и второй цистеиновые аминокислотные остатки Су§1 и Су§2, что Су§1 располагается ближе к Ν-концу молекулы составного полипептида, чем Су§2, в котором Су§1 и Су§2 разделены полипептидным линкером, причем упомянутый линкер свободен от цистеина и пролина;

   определяет длину, достаточную для того, чтобы позволить Су§1 и Су§2 соединяться внутримолекулярной дисульфидной связью друг с другом;

   имеет гибкую полипептидную конформацию, по существу, свободную от вторичной полипептидной структуры в водном растворе, в котором по крайней мере один из Су§1 и Су §2 дериватизируется с помощью дериватизирующего компонента и в котором исходный полипептид является антителом.
2. 2. Составной полипептид по п.1, в котором по крайней мере 75% аминокислотных остатков в линкере выбирают из С1у, А1а, Уа1, Ьеи, 11е, 8ег, ТЬг, Мек Туг, А§п и С1п.
3. 3. Составной полипептид по п.1 или 2, в котором составной полипептид является одноцепочным полипептидом.
4. 4. Составной полипептид по любому из пп.1-3, в котором ЕЕИ располагается на С- или Ν-конце составного полипептида.
5. 5. Составной полипептид по любому из пп.1-4, в котором ЕЕИ находится в виде

   -Су§1 -(Хаа)п-Су§2-(Рго)т, где п является любым целым числом от 2 до 20;

   т является 0 или 1 и

   Хаа допускается в каждой позиции как С1у, А1а, ТЬг или 8ег.
6. 6. Составной полипептид по п.5, в котором п=4, а (Хаа)4 является (С1у)4, (С1у)38ег, (С1у)28егС1у, С1у8ег(С1у)2 или С1у(8ег)3.
7. 7. Составной полипептид по п.5, в котором п=5, а (Хаа)5 является (С1у)5, (С1у)48ег, (С1у)38егС1у, (С1у)28ег(С1у)2, С1у8ег(С1у)3 или 8ег(С1у)4.
8. 8. Составной полипептид по любому из пп.5-7, в котором ЕЕИ находится в виде -Н18-Н18-Н18-Н18-Н18-Н18-Су81-(Хаа)п-Су82-(Рго)т или -Су81-(Хаа)п-Су82-Н18-Н18-Н18-Н18-Н18-Н18-(Рго)т.
9. 9. Составной полипептид по любому из пп.1-8, в котором дериватизированный Су§1 и/или Су§2 является продуктом реакции остатка/остатков Су§1 и/или Су§2 с дериватизирующим компонентом, содержащим малеимидную группу, сульфгидрильную группу или пиридил-дисульфидную группу.
10. 10. Составной полипептид по п.9, в котором дериватизирующий компонент, содержащий малеимидную группу, выбирают из РЕС-малеимида («РЕС-МАЕ»), малеимид-функционализированного флуоресцентного маркера, малеимид-функционализированного маркера аналитического обнаружения, малеимид-функционализированного радиоактивного индикатора или малеимид-функционализированного белкового сшивателя.
11. 11. Составной полипептид по п.10, в котором РЕС-МАЕ выбирают из метокси-РЕС-МАБ 5 кДа;

    метокси-РЕС-МАБ 20 кДа; метокси-РЕС-МАБ 40 кДа;

    - 14 010374 метокси-РЕС-МАЬ2 5 кДа;

    метокси-РЕС-МАЬ2 20 кДа;

    метокси-РЕС-МАЬ2 40 кДа или их любых сочетаний.
12. 12. Составной полипептид по п.9, в котором Су§1 или Су§2 дериватизируют с помощью дериватизирующего компонента, содержащего 5-тио-2-нитробензойную кислотную («ΤΝΒ-тиол») группу или сульфгидрильную группу, причем, в частности, упомянутый дериватизирующий компонент является Су§2, соединенной с Су§1 дисульфидной связью.
13. 13. Составной полипептид по любому из пп.1-12, в котором как Су§1, так и Су§2 дериватизируют с помощью дериватизирующего компонента.
14. 14. Составной полипептид по любому из пп.1-12, в котором Су§1 или Су§2 дериватизируют с помощью первого дериватизирующего компонента, а соответствующую другую Су§2 или Суз1 соответственно дериватизируют с помощью второго дериватизирующего компонента.
15. 15. Составной полипептид по п.14, в котором второй дериватизирующий компонент является этилмалеимидом.
16. 16. Составной полипептид по любому из пп.1-15, в котором упомянутое антитело выбирают из моноспецифичного одноцепочного антитела или биспецифичного одноцепочного антитела.
17. 17. Составной полипептид по п.16, в котором биспецифичное одноцепочное антитело содержит первую часть, специфично связывающуюся с антигеном-эффектором, и вторую часть, специфично связывающуюся с антигеном-мишенью.
18. 18. Составной полипептид по п.17, в котором антиген-эффектор выбирают из человеческого антигена СЭЗ. человеческого антигена СЭ64. человеческого антигена СЭ89 и человеческого антигена ΝΚΟ2Ό.
19. 19. Составной полипептид по п.17 или 18, в котором антиген-мишень выбирают из ЕрСАМ, ССК5, СЭ19, НЕК-2 пей, НЕК-3, НЕК-4, ЕСЕК, Р8МА, СЕА, МИС-1 (муцин), МИС2, МИСЗ, МИС4, МИС5АС, МИС5В, МИС7, йСС, Ееию-У, СИЗО, ΟΌ33, ΟΌ30, ганглиозида СПЗ, 9-0-ацетила-СПЗ, СМ2, С1оЬо Н, фукозила СМ1, Ро1у 8А, СП2, карбоангидразы IX (М№СА IX), СП44у6, 81111 (8ошс Небдейод), ^ие-1, Р1а§та Се11 Апйдеп, (мембранно-связанного) 1дЕ, МС8Р (Ме1апота Сйгопбгойш 8и11а1е Рго1еод1усап), ССК8, предшественника ΤΝΕ-α, 8ТЕАР, мезотелина, антигена А33, Р8СА (Рго81а1е 81ет Се11 АпИдеп), Ьу-6, десмоглеина 4, Е-сабйепп пеоерйоре, Ее1а1 АсеШсйойпе Кесер1ог, СО25, маркера СА19-9, маркера СА-125 и М18 (Мие11епап 1пй1Ьйогу 8иЬ51апсе) Кесер1ог 1уре II, §Тп (сиалилированного антигена Тп; ТАС-72), ЕАР (Е1ЬгоЬ1а81 Асбуайоп Апбдеп), эндосиалина, ЕСЕКуШ, ЬС, 8А8 и СП63 и в котором все упомянутые антигены являются человеческими антигенами.
20. 20. Композиция, содержащая составной полипептид по любому из предшествующих пунктов и приемлемый в фармакологии носитель.
21. 21. Способ получения составного полипептида по любому из пп.1-19, в котором составной полипептид содержит исходный полипептид и экспрессируется с большим выходом, чем исходный полипептид, причем упомянутый способ содержит:

    А) обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей исходный полипептид;

    Β) введение в любой конец нуклеотидной последовательности, кодирующей исходный полипептид, нуклеотидной последовательности, кодирующей домен, усиливающий экспрессию (ЕЕП), причем упомянутая нуклеотидная последовательность, кодирующая ЕЕП, содержит кодоны для первого и второго цистеиновых аминокислотных остатков Су§1 и Су§2 соответственно, при этом кодон для Су§1 располагается ближе к 5'-концу нуклеотидной последовательности, чем кодон для Су§2, в которой кодоны для Су§1 и Су§2 разделяются нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептидный линкер, причем упомянутый линкер свободен от цистеина и определяет длину, достаточную для того, чтобы позволить Су§1 и Су§2 вступать во внутримолекулярную дисульфидную связь друг с другом;

    С) трансфекция нуклеотидной последовательности из этапа В в систему экспрессии хозяина в соответствующем векторе;

    Ώ) инкубирование системы экспрессии хозяина при соответствующих условиях, чтобы иметь результатом экспрессию нуклеотидной последовательности из этапа В;

    Е) выделение полипептида, экспрессированного на этапе И, чтобы получить составной полипептид.
22. 22. Способ по п.21, содержащий дополнительный этап дериватизации составного полипептида, полученного на этапе Е при Су§1 и/или Су§2.