JP7313730B2 - エンドセリン受容体ａ結合力が向上した抗体 - Google Patents

エンドセリン受容体ａ結合力が向上した抗体 Download PDF

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Description

本発明は、抗体医薬に関し、ヒトエンドセリン受容体活性制御抗体に関する。
ＧＰＣＲ（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、７個の膜透過部位（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）を有する膜タンパク質であり、細胞外リガンド結合によりＧ－タンパク質の結合が解離し、これによって細胞内信号伝達過程を活性化させ、信号伝達物質に対する反応の他、認知と感覚などの生理学的に非常に重要な役割を担う。ＧＰＣＲは、細胞の成長、増殖、移動、死滅などを調節するだけでなく、癌、心血管疾患などの数多くの疾病とも直接関連していることから、薬物標的物質として脚光を浴びており、現在、市販中の新薬標的生体物質の３０～５０％を占めている。
ＥＴＡ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ Ａ）は、正常人において主に血管平滑筋に発現し、リガンドであるＥＴ－１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１）の結合による細胞内信号伝達過程を通じて血管収縮作用を起こすものと知られている。したがって、エンドセリン受容体拮抗剤（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）であるボセンタン（Ｂｏｓｅｎｔａｎ）のような薬物が高血圧治療剤として用いられてきた（Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１１，Ｖｏｌ．１０，４７）。近年、多くの基礎生物学及び臨床学的研究により、ＥＴＡが膀胱癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、横紋筋肉腫、膠芽細胞腫などの様々な癌で過発現し、癌細胞の増殖、移動、侵入、転移、血管新生成などの主要癌進行過程に直接関与して患者の生存率を下げることが報告され、主要抗癌標的物質として注目されている（Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗ ｃａｎｃｅｒ，２０１３，Ｖｏｌ．１３，６３７）。
抗体薬物は、低分子合成医薬品に比べて高い特異性、低い副作用、高い血中半減期、Ｆｃ領域による欠陥細胞死滅作用機序（ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ）などの長所にもかかわらず、既存のＥＴＡを標的する薬物はボセンタン（Ｂｏｓｅｎｔａｎ）、ジボテンタン（Ｚｉｂｏｔｅｎｔａｎ）、アトラセンタン（Ａｔｒａｓｅｎｔａｎ）などの低分子化合物であり、未だ抗体薬物は報告されたことがなく、ＧＰＣＲ全体に拡大しても販売許可された抗体薬物はごく稀であり、ＣＣＲ４を標的するＫｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｉｒｉｎ社のポテリジオ（モガムリズマブ）が日本で承認され、２０１８年５月にはアムジェンで開発されたＣＧＲＰ受容体を標的にするエイモビグ（エレヌマブ）が、ＧＰＣＲ標的抗体としては初めてＵＳ ＦＤＡ承認を受けた。そこで、ＥＴＡに特異的に結合し、その活性を調節する新規抗体の発掘の必要性が台頭した。
上記の背景技術として説明された事項は、本発明の背景に対する理解を増進させるためのものに過ぎず、当該技術分野における通常の知識を有する者に既に知られた従来技術に該当することを認めるものと理解してはならないだろう。
本発明者らは、既存に発掘したエンドセリン受容体Ａに特異的結合力を有する抗体の抗原結合部位配列は保持する上に、フレームワーク領域エンジニアリングによって親和度及び生産性が著しく改善される抗体を開発しようと鋭意努力した。その結果、本発明者らは、ＥＴＡの安定発現した細胞株におけるＥＴ－１信号伝達を効率的に抑制する抗体を発見し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、エンドセリン受容体Ａ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ Ａ）に特異的に結合する単一クローン抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸分子を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記核酸分子を含むベクターを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記ベクターを含む宿主細胞を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体、核酸分子又はベクターを含む組成物を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、下記する発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面から、より明確になる。
本発明の一態様によれば、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、エンドセリン受容体Ａ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ Ａ）に特異的に結合する単一クローン抗体又はその抗原結合断片を提供する。
前記エンドセリン受容体Ａは、リガンドであるＥＴ－１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１）の結合による細胞内信号伝達過程を担当し、高血圧治療剤及び主要抗癌剤の標的物質として脚光を浴びているが、既存にＥＴＡを標的する薬物は、ボセンタン（Ｂｏｓｅｎｔａｎ）、ジボテンタン（Ｚｉｂｏｔｅｎｔａｎ）、アトラセンタン（Ａｔｒａｓｅｎｔａｎ）などの低分子化合物であり、未だ、エンドセリン受容体Ａ又はその細胞外部位を抗原として認識する単一クローン抗体薬物は報告されたことがない。
本明細書において、用語「エピトープ」とは、抗体又はその抗原結合断片が特異的に結合できる抗原の局所化した（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）部位を意味する。例えば、抗原であるポリペプチド中の連続したアミノ酸がエピトープになってよく、ポリペプチドにおいて３次構造上の折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）によって不連続の２又はそれ以上の部位が共にエピトープになってもよい。エピトープは、抗原の独特の３次元構造において連続又は不連続のアミノ酸を、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、又は少なくとも１５個含むことができる。本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＧＰＣＲ（例えば、エンドセリン受容体Ａ）又はその細胞外部位を抗原として認識してそれに特異的に結合するが、ＧＰＣＲの細胞外部位は１個のＮ－ｔｅｒｍと３個のＥＣＬ（ＥＣＬ１、ＥＣＬ２及びＥＣＬ３）を含むところ、前記Ｎ－ｔｅｒｍ、ＥＣＬ１、ＥＣＬ２及びＥＣＬ３からなる群から選ばれる１つ以上の細胞外部位をエピトープにして特異的に結合することができ、前記エピトープは１つ又はそれ以上のアミノ酸を含むことができる。
与えられた抗体が結合するエピトープを決定する方法（例えば、エピトープマッピング）には、抗体に対する反応性テストを用いた免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）及び免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）試験などの種々の方法がある。エピトープの３次元空間構造を決定する方法は、Ｘ線結晶学（ｘ－ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）、２次元核磁気共鳴法（２－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）及びＨＤＸ－ＭＳなどの様々な方法を用いて行うことができる（Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６））。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片が結合できるエピトープは、ＮＭＲ分光学、Ｘ線回折結晶学、ＥＬＩＳＡ分析、ＨＤＸ－ＭＳ（ｈｙｄｒｏｇｅｎ／ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、アレイベースのオリゴ－ペプチドスキャニング（ａｒｒａｙ－ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ａｓｓａｙｓ）、及び／又は突然変異誘発マッピング（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｍａｐｐｉｎｇ）によって決定されてよい（Ｇｉｅｇｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５０（Ｐｔ ４）：３３９－３５０；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９９０）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８９：１－２３；Ｃｈａｙｅｎ ＮＥ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：１２６９－１２７４；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９７６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５１：６３００－６３０３）。
本明細書において、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子のいずれかの類型の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＹ）でよく、いずれか下位類型の抗体（例えば、ヒトにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４；及び、マウスにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３）であってもよい。免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）は、様々なアロタイプ（ａｌｌｏｔｙｐｅ）が存在してよく、本明細書において用語「抗体」とは、一般に知られたアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）及びアロタイプ（ａｌｌｏｔｙｐｅ）を含む。また、本明細書において用語「抗体」とは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４であるか、そのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）類型でよい（例えば、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のハイブリッド）。
本明細書において、用語「単一クローン抗体」又は「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、特定エピトープに対する単一結合特異性（ｓｉｎｇｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）及び親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を示す抗体を意味する。
本明細書において、前記単一クローン抗体はその断片を含む意味で使われ、前記断片は、好ましくは、抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を意味する。前記断片は、当業界に知られた様々な方法を用いて作製できる。例えば、パパイン（Ｆａｂ断片の生産）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２）のような酵素を用いた免疫グロブリン分子のタンパク質分解性切断（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ）により、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を作製することができる。
本明細書において、用語「断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ）、又はモノマーのＶＨ（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）又はＶＬ（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を含むｓｄＡｂであり得、当該断片については当業界によく知られている。
ＶＨ領域、又は一つ又はそれ以上のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）は、重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）を形成するために定常ドメインに連結されてよい。また、ＶＬ領域、又は一つ又はそれ以上のＣＤＲは、軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）を形成するために定常ドメインに連結されてよい。全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）重鎖及び全長軽鎖とが結合して全長抗体を構成する。
本明細書において、用語「組換えヒト抗体」とは、組換え手段によって製造、発現、生成又は分離された全てのヒト抗体を含み、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に対して遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）又は染色体導入（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えば、マウス）又はそれから製造されたハイブリドーマから分離された抗体、（ｂ）抗体を発現させるように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから分離された抗体、（ｃ）組換え、組合せ方式のヒト抗体ライブラリーから分離された抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列と他のＤＮＡ配列のスプライシングを伴う任意の他の手段によって製造、発現、生成又は分離された抗体がある。このような組換えヒト抗体は可変及び定常領域を含み、それらはジャームライン遺伝子によって暗号化された特定のヒトジャームライン免疫グロブリン配列を用いるが、例えば、抗体成熟化中に起きる、後続再配列及び突然変異を含む。当業界に公知のとおり（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１１７－１１２５参照）、可変領域は抗原結合ドメインを含有し、外来抗原に特異的な抗体を形成するように再配列した様々な遺伝子によって暗号化される。再配列に加えて、可変領域は外来抗原に対する抗体の親和性を増加させるために多数の単一アミノ酸の置換によってさらに変形されてもよい。したがって、抗原に反応して軽鎖及び重鎖免疫グロブリンポリペプチドを暗号化する再配列がなされ、体細胞突然変異された核酸分子は、親核酸分子と配列同一性を有することはできないが、その代わり、実質的に同一又は類似になるであろう（すなわち、少なくとも８０％同一性を有する）。
「ヒト」抗体（ＨｕＭＡｂ）とは、フレームワーク領域とＣＤＲ領域が両方ともヒトジャームライングロブリン配列から由来した可変領域を持つ抗体のことを指す。また、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域も同様にヒトジャームライン免疫グロブリン配列から由来する。本明細書に開示の抗体は、ヒトジャームライン免疫グロブリン配列によって暗号化されないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、試験管内無作為又は部位特異的突然変異誘発によって又は生体内体細胞突然変異によって導入された突然変異）。しかし、本明細書に開示の「ヒト抗体」とは、マウスのような他の哺乳類種のジャームラインから由来したＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上にグラフトされた抗体を含むことはない。用語「ヒト」抗体及び「完全ヒト」抗体は、同じ意味で使われる。
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外にあるアミノ酸の一部、大部分又は全部が、ヒト免疫グロブリンから由来した相応するアミノ酸に置換された抗体のことを指す。抗体のヒト化形態の一具体例において、ＣＤＲドメイン外にあるアミノ酸の一部、大部分又は全部が、ヒト免疫グロブリンからのアミノ酸に置換され、一つ以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、大部分又は全部はそのまま維持される。アミノ酸の小さい追加、欠失、挿入、置換又は変形は、抗体が特定抗原に結合する能力を失わない限り、許容されてよい。「ヒト化」抗体は、親抗体と類似の抗原特異性を保有する。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域は、３個のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２及びＶＨ－ＣＤＲ３）を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域は、配列目録第２５配列のＶＨ－ＣＤＲ１及び配列目録第２６配列のＶＨ－ＣＤＲ２を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域は、配列目録第３０配列のＶＨ－ＣＤＲ３、又は配列目録第３０配列において４番目、７番目、９番目及び１２番目のアミノ酸からなる群から選ばれる位置に突然変異を含む配列のＶＨ－ＣＤＲ３を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域のＶＨ－ＣＤＲ３は、配列目録第３０配列において４番目のアミノ酸がＰ（プロリン）に；７番目のアミノ酸がＬ（ロイシン）に；９番目のアミノ酸がＶ（バリン）に；又は１２番目のアミノ酸がＥ（グルタメート）に；置換された突然変異を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域のＶＨ－ＣＤＲ３は、配列目録第３０配列、配列目録第３１配列、配列目録第３２配列、配列目録第３３配列及び配列目録第３４配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列である。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域は、３個のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２及びＶＬ－ＣＤＲ３）を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域は、配列目録第２７配列のＶＬ－ＣＤＲ１、配列目録第２８配列のＶＬ－ＣＤＲ２及び配列目録第２９配列のＶＬ－ＣＤＲ３を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域は、４個のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：ＶＨ－ＦＲ１、ＶＨ－ＦＲ２、ＶＨ－ＦＲ３及びＶＨ－ＦＲ４）を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域内のフレームワーク領域及びＣＤＲの配列は、ＶＨ－ＦＲ１／ＶＨ－ＣＤＲ１／ＶＨ－ＦＲ２／ＶＨ－ＣＤＲ２／ＶＨ－ＦＲ３／ＶＨ－ＣＤＲ３／ＶＨ－ＦＲ４である。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域は、配列目録第１配列；又は配列目録第１配列において１６番目及び２４番目のアミノ酸からなる群から選ばれる１以上の位置に突然変異を含む配列；の重鎖可変領域フレームワーク領域１（ＶＨ－ＦＲ１）を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域のＶＨ－ＦＲ１は、配列目録第１配列において１６番目のアミノ酸がＲ（アルギニン）に；又は２４番目のアミノ酸がＶ（バリン）；に置換された突然変異を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域のＶＨ－ＦＲ１は、配列目録第１配列、配列目録第２配列及び配列目録第３配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列である。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域は、配列目録第４配列；又は配列目録第４配列において１番目、２番目、４番目、１６番目及び１７番目のアミノ酸からなる群から選ばれる１以上の位置に突然変異を含む配列；の重鎖可変領域フレームワーク領域２（ＶＨ－ＦＲ２）を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域のＶＨ－ＦＲ２は、配列目録第４配列において１番目のアミノ酸がＭ（メチオニン）に；２番目のアミノ酸がＮ（アスパラギン）に；４番目のアミノ酸がＩ（イソロイシン）に；１６番目のアミノ酸がＳ（セリン）又はＧ（グリシン）に；及び１７番目のアミノ酸がＡ（アラニン）、Ｗ（トリプトファン）又はＳ（セリン）に；置換された突然変異からなる群から選ばれる１以上の突然変異を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域のＶＨ－ＦＲ２は、配列目録第４配列、配列目録第５配列、配列目録第６配列及び配列目録第７配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列である。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域は、配列目録第８配列；又は配列目録第８配列において１番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、１２番目、１４番目、１６番目、１７番目、１９番目、２０番目及び２１番目のアミノ酸からなる群から選ばれる１以上の位置に突然変異を含む配列；の重鎖可変領域フレームワーク領域３（ＶＨ－ＦＲ３）を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域のＶＨ－ＦＲ３は、配列目録第８配列において１番目のアミノ酸がＤ（アスパルテート）、Ｔ（トレオニン）又はＮ（アスパラギン）に；４番目のアミノ酸がＡ（アラニン）に；５番目のアミノ酸がＤ（アスパルテート）に；６番目のアミノ酸がＦ（フェニルアラニン）に；７番目のアミノ酸がＥ（グルタメート）に；８番目のアミノ酸がＲ（アルギニン）に；１２番目のアミノ酸がＦ（フェニルアラニン）に；１４番目のアミノ酸がＲ（アルギニン）又はＬ（ロイシン）に；１６番目のアミノ酸がＮ（アスパラギン）又はＤ（アスパルテート）に；１７番目のアミノ酸がＡ（アラニン）に；１９番目のアミノ酸がＳ（セリン）に、２０番目のアミノ酸がＳ（セリン）に；及び２１番目のアミノ酸がＬ（ロイシン）又はＦ（フェニルアラニン）に；置換された突然変異からなる群から選ばれる１以上の突然変異を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域のＶＨ－ＦＲ３は、配列目録第８配列、配列目録第９配列、配列目録第１０配列及び配列目録第１１配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列である。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における重鎖可変領域は、配列目録第１２配列の重鎖可変領域フレームワーク領域４（ＶＨ－ＦＲ４）を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域は、４個のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：ＶＬ－ＦＲ１、ＶＬ－ＦＲ２、ＶＬ－ＦＲ３及びＶＬ－ＦＲ４）を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域内のフレームワーク領域及びＣＤＲの配列は、ＶＬ－ＦＲ１／ＶＬ－ＣＤＲ１／ＶＬ－ＦＲ２／ＶＬ－ＣＤＲ２／ＶＬ－ＦＲ３／ＶＬ－ＣＤＲ３／ＶＬ－ＦＲ４である。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域は、配列目録第１３配列；又は配列目録第１３配列において４番目及び２４番目のアミノ酸からなる群から選ばれる１以上の位置に突然変異を含む配列；の軽鎖可変領域フレームワーク領域１（ＶＬ－ＦＲ１）を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＶＬ－ＦＲ１は、配列目録第１３配列において４番目のアミノ酸がＬ（ロイシン）に；又は２４番目のアミノ酸がＳ（セリン）に；置換された突然変異を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＶＬ－ＦＲ１は、配列目録第１３配列、配列目録第１４配列及び配列目録第１５配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列である。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における軽鎖可変領域は、配列目録第１６配列；又は配列目録第１６配列において１番目、２番目及び１４番目のアミノ酸からなる群から選ばれる１以上の位置に突然変異を含む配列；の軽鎖可変領域フレームワーク領域２（ＶＬ－ＦＲ２）を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＶＬ－ＦＲ２は、配列目録第１６配列において１番目のアミノ酸がＬ（ロイシン）又はＭ（メチオニン）に；２番目のアミノ酸がＮ（アスパラギン）に；及び１４番目のアミノ酸がＶ（バリン）に；置換された突然変異からなる群から選ばれる１以上の突然変異を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＶＬ－ＦＲ２は、配列目録第１６配列、配列目録第１７配列、配列目録第１８配列及び配列目録第１９配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列である。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における軽鎖可変領域は、配列目録第２０配列；又は配列目録第２０配列において１番目、３番目、１４番目及び３１番目のアミノ酸からなる群から選ばれる１以上の位置に突然変異を含む配列；の軽鎖可変領域フレームワーク領域３（ＶＬ－ＦＲ３）を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＶＬ－ＦＲ３は、配列目録第２０配列において１番目のアミノ酸がＴ（トレオニン）、Ｓ（セリン）又はＹ（チロシン）に；３番目のアミノ酸がＱ（グルタミン）、Ｈ（ヒスチジン）又はＥ（グルタメート）に；１４番目のアミノ酸がＧ（グリシン）に；及び３１番目のアミノ酸がＶ（バリン）に；置換された突然変異からなる群から選ばれる１以上の突然変異を含む。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＶＬ－ＦＲ３は、配列目録第２０配列、配列目録第２１配列、配列目録第２２配列及び配列目録第２３配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列である。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片における軽鎖可変領域は、配列目録第２４配列の軽鎖可変領域フレームワーク領域４（ＶＬ－ＦＲ４）を含む。
本発明の他の態様によれば、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、又は該ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明の核酸分子は、単離したものであるか、組み換えられたものでよく、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡ及びＲＮＡの他、対応する相補性配列も含まれる。「単離した核酸」とは、天然生成源泉から単離した核酸の場合、核酸の単離した個体のゲノムに存在する周辺遺伝配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的に又は化学的に合成された核酸、例えばＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドの場合、このような手順から生成された核酸が、単離した核酸分子と理解されてよい。単離した核酸分子は、別個の断片の形態又はより大きい核酸構築物の成分としての核酸分子を示す。核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置されるとき、「作動可能に連結」される。例えば、前配列又は分泌リーダ（ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡは、ポリペプチドが分泌される前の形態である前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現するとき、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーは、ポリペプチド配列の転写に影響を与えるとき、コーディング配列に作動可能に連結され、又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されるとき、コーディング配列に作動可能に連結される。一般に「作動可能に連結された」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接して位置することを意味し、分泌リーダの場合、隣接して同じリーディングフレーム内に存在するものを意味する。しかし、エンハンサーは隣接して位置する必要はない。連結は、便利な制限酵素部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを通常の方法によって用いる。
本明細書において用語「ベクター」とは、核酸配列を複製可能な細胞への導入のために核酸配列を挿入できる伝達体を意味する。核酸配列は、外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）でよい。ベクターとしては、プラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、バクテリオファージ）を挙げることができるが、これに制限されない。当業者は、標準的な組換え技術によってベクターを構築できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＮＹ，１９９４等）。
本明細書において用語「発現ベクター」とは、転写される遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むベクターを意味する。一部の場合には、その後、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。発現ベクターには様々な調節配列を含むことができる。転写及び翻訳を調節する調節配列と共に、ベクター及び発現ベクターには他の機能も提供する核酸配列も含むことができる。
本明細書において用語「宿主細胞」とは、真核生物及び原核生物を含み、前記ベクターを複製できるか、或いはベクターによってコードされる遺伝子を発現できる、任意の形質転換可能な生物を意味する。宿主細胞は、前記ベクターによって形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）又は形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）され得るが、これは、外生の核酸分子が宿主細胞内に伝達又は導入される過程を意味する。
本発明の宿主細胞は、好ましくは、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などを挙げることができるが、これに制限されるものではない。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片、前記核酸分子又は前記ベクターを含む組成物を提供する。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組成物は、高血圧又は癌の予防又は治療用薬剤学的組成物である。
本発明の薬剤学的組成物は、（ａ）前記抗体又はその抗原結合断片、前記核酸分子又は前記核酸分子を含むベクター；及び、（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含むことができる。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記薬剤学的組成物を投与する段階を含む、高血圧又は癌の予防又は治療方法を提供する。
本発明が予防又は治療しようとする癌の種類は制限されず、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）及び急性リンパ球白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性非リンパ球白血病（ａｃｕｔｅ ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）、慢性リンパ球白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性骨髄白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）及び多発骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ）などのようなリンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ）、膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、横紋筋肉腫（Ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）、網膜芽細胞腫（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）、ウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ Ｔｕｍｏｒ）、骨腫瘍（ｂｏｎｅ ｔｕｍｏｒｓ）及び軟部組織肉腫（ｓｏｆｔ－ｔｉｓｓｕｅ ｓａｒｃｏｍａｓ）などのような小児固形腫瘍（ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、尿路癌（ｕｒｉｎａｒｙ ｃａｎｃｅｒｓ）、子宮癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃａｎｃｅｒｓ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒｓ）、膵癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）及びその他皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒｓ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）及び精巣癌（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ）などのような成人の通常の固形腫瘍（ｃｏｍｍｏｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ）を含め、多数の癌を治療するように投与できる。
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に一般に用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他にも、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、好ましくは、非経口投与であり、例えば、静脈内注入、局所注入及び腹腔注入などで投与できる。
本発明の薬剤学的組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、熟練した通常の医師は、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇである。
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されてもよく、或いは多回容量容器内に内入して製造されてもよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、或いはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態でよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
本発明の薬剤学的組成物は、単独の療法で用いられてもよく、或いは、他の通常の化学療法又は放射療法と共に用いられてもよいが、このような併用療法を施す場合には、より効果的に癌治療ができる。本発明の組成物と併用可能な化学療法剤は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、トランスプラチン（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）及びメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などを含む。本発明の組成物と共に利用可能な放射療法は、Ｘ線照射及びγ線照射などである。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を処理する段階を含む、サンプル中に含まれたエンドセリン受容体Ａ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ Ａ）の定量方法を提供する。
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、エンドセリン受容体Ａに特異的に結合することから、サンプル中に含まれたエンドセリン受容体Ａの量を正確に測定可能である。
本発明のさらに他の態様によれば、下記の段階を含む、エンドセリン受容体Ａ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ Ａ）の過発現による疾患の診断のための情報を提供する方法を提供する：
（ａ）被検者から体外に分離されたサンプルを取得する段階；
（ｂ）前記抗体又はその抗原結合断片を前記サンプルに処理する段階；及び
（ｃ）前記被検者のサンプル中に含まれたエンドセリン受容体Ａの発現量が正常群サンプル中に含まれたエンドセリン受容体Ａの発現量よりも高いか否か確認する段階。
エンドセリン受容体Ａは、リガンドであるＥＴ－１の結合によって血管収縮作用をし（Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１１，Ｖｏｌ．１０，４７）；膀胱癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、横紋筋肉腫、膠芽細胞腫などの様々な癌で過発現し、癌細胞の増殖、移動、侵入、転移、血管新生成などの主要癌進行過程に直接関与（Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗ ｃａｎｃｅｒ，２０１３，Ｖｏｌ．１３，６３７）するので、前記エンドセリン受容体Ａの発現量を正常人のそれと比較することによって、エンドセリン受容体Ａの過発現による疾患の診断のための情報を提供することができる。
本発明の好ましい具現例によれば、前記エンドセリン受容体Ａの過発現による疾患は、癌又は高血圧である。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を含むエンドセリン受容体Ａ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ Ａ）定量キットを提供する。
本発明の定量キットは、抗原抗体結合反応を用いて前記抗体に対する抗原を分析することによってエンドセリン受容体Ａ量を定量でき、前記抗原抗体結合反応は、通常のＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｎｏａｓｓａｙ）、サンドウィッチ測定法（Ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）、免疫ブロット分析（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）及び免疫組織化学染色方法（Ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）からなる群から選ばれることが好ましいが、これに制限されない。
抗原－抗体結合反応のための固定体としては、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、ポリビニル（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）樹脂又はポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート（Ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）及びガラスでできたスライドグラス（Ｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ）からなる群から選ばれるものを用いることができるが、これに制限されない。
前記２次抗体は、発色反応をする通常の発色剤で標識されることが好ましく、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリ性リン酸分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（Ｃｏｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、ＦＩＴＣ（Ｐｏｌｙ Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＲＩＴＣ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｂ－ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）などの蛍光物質（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及び色素（Ｄｙｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つの標識体を用いることができる。発色を誘導する基質は、発色反応をする標識体に応じて使用することが好ましく、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ［２，２’－ａｚｉｎｏ－ｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］及びＯＰＤ（ｏｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つを使用することが好ましいが、これに制限されない。
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ｉ）本発明は、エンドセリン受容体Ａに対する結合力が向上した抗体又はその抗原結合断片を提供する。
（ｉｉ）また、本発明は、生産性の向上した、エンドセリン受容体Ａに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
（ｉｉｉ）本発明で発掘した抗体は、従来の抗体と比較して抗原に対する結合力及び生産性が画期的に改善され、エンドセリン受容体Ａ関連疾患の治療及び診断用抗体として有用に用いることができる。
作製された動物細胞用発現ベクターを示す。 フレームワーク領域エンジニアリングによって作製された４種の抗体のアミノ酸配列を示す。 フレームワーク領域エンジニアリングによって作製された４種の抗体の、動物細胞における精製分析結果を示す。 フレームワーク領域エンジニアリングによってトラスツズマブフレームワーク配列を有するエンドセリン受容体Ａに選択的結合をするＭＪ－Ｆ１抗体の、動物細胞における抗体生産収率分析結果を示す。 ヒトエンドセリン受容体Ａに対するフレームワーク領域エンジニアリングによって作製された４種の抗体の、抗原－抗体間ＥＬＩＳＡ分析結果を示す。 フレームワーク領域エンジニアリングによってトラスツズマブフレームワーク配列を有する５種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体の、動物細胞における抗体生産分析結果を示す。 トラスツズマブフレームワーク配列を有する５種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体の、抗原－抗体間ＥＬＩＳＡ分析結果を示す。 トラスツズマブフレームワーク配列を有する５種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体を用いたｐＨ依存的ヒトＦｃＲｎとのＥＬＩＳＡ分析結果を示す（図８のａ）：ｐＨ７．４、図８のｂ）：ｐＨ６．０）。 トラスツズマブフレームワーク配列を有する５種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体を用いたヒトＦｃγＲＩＩａ変異体とのＥＬＩＳＡ分析結果を示す（図９のａ）：ＦｃγＲＩＩａ－１３１Ｒ、図９のｂ）：ＦｃγＲＩＩａ－１３１Ｈ、図９のｃ）：ＦｃγＲＩＩａ－１５８Ｖ、図９のｄ）：ＦｃγＲＩＩａ－１５８Ｆ）。 トラスツズマブフレームワーク配列を有する５種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体を用いたヒトＣ１ｑとのＥＬＩＳＡ分析結果を示す。 トラスツズマブフレームワーク配列を有する４種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体を用いた大腸癌細胞株ＨＴ－２９（図１１のａ））、ＨＣＴ－１１６（図１１のｂ））に対する細胞増殖抑制効能分析結果を示す。 トラスツズマブフレームワーク配列を有する４種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体を大腸癌異種移植モデルに投与した抗癌有効性分析結果（図１２のａ））、投与された大腸癌異種移植モデルから摘出した大腸癌組織分析結果を示す（図１２のｂ））。 トラスツズマブフレームワーク配列を有する４種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体を用いた膵癌細胞株ＡｓＰＣ－１（図１３のａ））、Ｐａｎｃ－１（図１３のｂ））に対する細胞増殖抑制効能分析結果を示す。 トラスツズマブフレームワーク配列を有する４種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体を用いた胃癌細胞株ＳＮＵ－２１６（図１４のａ））、ＳＮＵ－６６８（図１４のｂ））に対する細胞増殖抑制効能分析結果を示す。 トラスツズマブフレームワーク配列を有する４種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析結果を示す。 トラスツズマブフレームワーク配列を有する４種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体の糖鎖構造分析結果を示す。 トラスツズマブフレームワーク配列を有する４種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体のＲＰ－ＨＰＬＣ分析結果を示す。 トラスツズマブフレームワーク配列を有する４種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体の熱的安定性試験分析結果を示す（図１８Ａ：ＭＪ－Ｆ１－ＷＴ、図１８Ｂ：ＭＪ－Ｆ１－ｐＦｃ２９、図１８Ｃ：ＧＧ１２－ｐＦｃ２９、図１８Ｄ：ＦＧ１２－ｐＦｃ２９）。 トラスツズマブフレームワーク配列を有する４種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体の熱的安定性試験分析結果を示す（図１８Ａ：ＭＪ－Ｆ１－ＷＴ、図１８Ｂ：ＭＪ－Ｆ１－ｐＦｃ２９、図１８Ｃ：ＧＧ１２－ｐＦｃ２９、図１８Ｄ：ＦＧ１２－ｐＦｃ２９）。 トラスツズマブフレームワーク配列を有する４種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体の熱的安定性試験分析結果を示す（図１８Ａ：ＭＪ－Ｆ１－ＷＴ、図１８Ｂ：ＭＪ－Ｆ１－ｐＦｃ２９、図１８Ｃ：ＧＧ１２－ｐＦｃ２９、図１８Ｄ：ＦＧ１２－ｐＦｃ２９）。 トラスツズマブフレームワーク配列を有する４種のヒトエンドセリン受容体Ａに選択的結合をする抗体の熱的安定性試験分析結果を示す（図１８Ａ：ＭＪ－Ｆ１－ＷＴ、図１８Ｂ：ＭＪ－Ｆ１－ｐＦｃ２９、図１８Ｃ：ＧＧ１２－ｐＦｃ２９、図１８Ｄ：ＦＧ１２－ｐＦｃ２９）。 大韓民国特許出願番号第１０－２０１７－００７５１２９号に記載された抗体の２００ｎＭ濃度においてＥＴＡが過発現した大腸癌細胞株であるＨＴ－２９細胞に、１０ｎＭのＥＴ－１によって誘発された信号伝達の阻害能を示すグラフである。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないということが、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
［実施例］
＜実施例１＞エンドセリン受容体Ａ特異的結合抗体のＣＤＲｓ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）配列を用いた抗体フレームワーク領域エンジニアリング
先に特許出願（韓国出願番号：第１０－２０１７－００７５１２９号）したＥＴＡ特異的結合抗体（ＡＧ８、ＥＦ１２、ＧＧ１２、ＦＧ１２、ＡＢ９）（図１９）の配列に基づき、抗体安定性及び生産性の向上のために、様々な抗体医薬品フレームワーク領域配列と前記抗体ＣＤＲ配列との最適組合せで構成された抗体を作製しようとした。そのために、抗原－抗体結合において重要な役割を担うものと知られた前記抗体の可変領域における重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）と軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）のＣＤＲｓ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）に、４種の治療用抗体（トラスツズマブ、ベバシズマブ、オマリズマブ、アダリムマブ）のフレームワーク領域を、ＰＣＲ手法でオーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）させた。増幅された４種の可変領域重鎖と４種の可変領域軽鎖の遺伝子をＸｂａＩ／ＢｓｓＨＩＩ制限酵素で処理し、同じ制限酵素で切断された動物細胞用発現ベクター（ｐＭＡＺ）に挿入した（図１）。接合された抗体発現ベクターを大腸菌Ｊｕｄｅ１（Ｆ－ ｍｃｒＡ △（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ） φ８０ｌａｃＺ△Ｍ１５ △ｌａｃＸ７４ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ａｒａＤ１３９ △（ａｒａ， ｌｅｕ）７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ λ－ ｒｐｓＬ ｎｕｐＧ）に形質転換し、サンガーシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いて作製された発現ベクターのＤＮＡ配列を検証した。作製された４種の抗体（ＭＪ－Ｆ１、ＭＪ－Ｆ２、ＭＪ－Ｆ３、ＭＪ－Ｆ４）配列を図２に示した。
＜実施例２＞フレームワーク領域エンジニアリングの完了した４種の抗体の動物細胞における発現及び精製
大腸菌形質転換によって増幅して回収した発現ベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ），Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）が含まれている１５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液を用いて、Ｅｘｐｉ２９３細胞において臨時発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のために遺伝子移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）において３７℃の温度で７日間培養した。発現した細胞培養液を６，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、上澄液を取って０．２２μｍフィルターで濾過した。濾過した上澄液は４℃で１６時間ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ａｍｉｃｏｇｅｎ、韓国）レジン１ｍｌに結合誘導した。結合したレジンは１０ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）のＰＢＳ溶液で洗浄後に、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．７）溶液で溶出した後、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和させた。ＰＢＳにバッファー置換（ｂｕｆｆｅｒ ｃｈａｎｇｅ）した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより還元条件と非還元条件でそれぞれ精製された４種の抗体の軽鎖と重鎖のサイズ及び純度を分析した（図３）。ＡＧ８と４種の製造された抗体（ＭＪ－Ｆ１、ＭＪ－Ｆ２、ＭＪ－Ｆ３、ＭＪ－Ｆ４）の精製後抗体収率を比較分析し、そのうち、ＭＪ－Ｆ１ではＡＧ８抗体に比べて１５倍増加した収率が得られた（図４）。
＜実施例３＞細胞外部領域に露出されたエンドセリン受容体Ａ抗原領域と製造された抗体との結合力分析
ＡＧ８抗体と製造された４種の抗体（ＭＪ－Ｆ１、ＭＪ－Ｆ２、ＭＪ－Ｆ３、ＭＪ－Ｆ４）のエンドセリン受容体結合力は、ＥＬＩＳＡで分析した。ヒトＧαｉ３を０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．６）バッファー溶液で希釈し、５μｇ／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間結合させた。４％脱脂乳含有のＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有のＰＢＳ）溶液にｗ／ｖ ５％となるように入れた後、それぞれの９６ウェルプレートを１時間常温でブロッキングした。上の溶液を捨てた後、１５０μｌ／ｗｅｌｌずつ、ｔｗｅｅｎ２０が０．０５％含まれたＰＢＳ溶液で４回洗浄した後、大腸菌で発現精製し、サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）で再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）されたエンドセリン受容体を５μｇ／ｍｌ結合させることにより、細胞外部領域が選択的に露出されるように抗原を固定化させた。動物細胞で発現精製されたＡＧ８と４種の製造された抗体（ＭＪ－Ｆ１、ＭＪ－Ｆ２、ＭＪ－Ｆ３、ＭＪ－Ｆ４）を、４倍段階希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）し、５０μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ウェルプレートに１時間常温で結合させた。その後、１５０μｌ／ｗｅｌｌずつＰＢＳＴ ０．０５％溶液で４回洗浄した後、ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰコンジュゲートをＰＢＳに１：５，０００の比率に希釈し、それぞれの９６ウェルプレートに１時間常温で結合させた。上の溶液を捨てた後、１５０μｌ／ｗｅｌｌずつＰＢＳＴ ０．０５％溶液で４回洗浄した後、５０μｌ／ｗｅｌｌずつＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で反応を進行し、２０分後に４Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応終結させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡシグナル分析の結果、対照群であるトラスツズマブ抗体、ＭＪ－Ｆ３、ＭＪ－Ｆ４の結合力は非常に低いため測定されなかったのに対し、ＭＪ－Ｆ２は１３２．８ｎＭ、ＭＪ－Ｆ１の可視的な平衡解離定数は１．４１ｎＭと、先行特許で発掘されたＡＧ８抗体に比べて約１９倍（２６．１／１．４１）向上した結果を示した（図５、表１）。

ヒトエンドセリン受容体Ａに対する作製された４種の抗体の抗原－抗体間ＥＬＩＳＡ分析における抗原－抗体の計算された平衡解離定数
＜実施例４＞トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体の動物細胞における発現及び精製
大腸菌形質転換により増幅して回収した発現ベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）が含まれている１５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液を用いて、Ｅｘｐｉ２９３細胞で臨時発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）のために遺伝子移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）において３７℃の温度で７日間培養した。発現した細胞培養液を６，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、上澄液を取って０．２２μｍフィルターで濾過した。濾過した上澄液は４゜Ｃで１６時間ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ａｍｉｃｏｇｅｎ、韓国）レジン１ｍｌに結合誘導した。結合したレジンは、１０ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）のＰＢＳ溶液で洗浄後に、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．７）溶液で溶出した後、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和させた。ＰＢＳにバッファーー置換した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより還元条件と非還元条件でそれぞれ精製されたトラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体（Ｆｃ領域は野生型又は配列目録第３５配列のＦｃ変異体であるＰＦｃ２９を利用）（ＭＪＦ１－ＷＴ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９）の軽鎖と重鎖のサイズ及び純度を分析した。トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体（ＭＪＦ１－ＷＴ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９）は、精製後にＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって確認した（図６）。
＜実施例５＞エンドセリン受容体Ａ抗原領域とトラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体の結合力分析
実施例１から選ばれた、トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされて製造された５種の抗体（ＭＪＦ１－ＷＴ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９、ＥＦ１２－ｐＦｃ２９）のエンドセリン受容体結合力は、ＥＬＩＳＡで分析した。ヒトＧαｉ３を０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．６）バッファー溶液で希釈し、５μｇ／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間結合させた。４％脱脂乳含有のＰＢＳ溶液にｗ／ｖ ５％となるように入れた後、それぞれの９６ウェルプレートを１時間常温でブロッキングした。上の溶液を捨てた後、１５０μｌ／ｗｅｌｌずつＰＢＳＴ（０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有のＰＢＳ）溶液で４回洗浄後に大腸菌で発現精製し、サルコシルで再構成されたエンドセリン受容体を５μｇ／ｍｌを結合させることにより、細胞外部領域が選択的に露出されるように抗原を固定化させた。動物細胞で発現精製された５種の抗体を４倍段階希釈し、５０μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ウェルプレートに１時間常温で結合させた。その後、１５０μｌ／ｗｅｌｌずつＰＢＳＴ ０．５％溶液で４回洗浄した後、ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰコンジュゲートをＰＢＳに１：５，０００の比率に希釈し、それぞれの９６ウェルプレートに１時間常温で結合させた。上の溶液を捨てた後、１５０μｌ／ｗｅｌｌずつＰＢＳＴ ０．５％溶液で４回洗浄した後、５０μｌ／ｗｅｌｌずつＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で反応を進行し、２０分後に４Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応終結させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡシグナル分析の結果、対照群であるトラスツズマブ抗体の結合力は非常に低いため測定されなかったのに対し、ＭＪＦ１－ＷＴは０．４８７３ｎＭ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９は０．３６３７ｎＭ、ＡＢ９－ｐＦｃ２９は０．７７０６ｎＭ、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９は０．４８０９ｎＭ、ＥＦ１２－ｐＦｃ２９は０．６０４４ｎＭ、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９は０．２８７５ｎＭと測定された（図７、表２）。

前記フレームワーク配列を有する６種のＥＬＩＳＡ分析においてエンドセリン受容体Ａ抗原－抗体間計算された平衡解離定数
＜実施例６＞トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体とｐＨ依存的ＦｃＲｎとの結合力分析
実施例１から選ばれた、トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされて製造された５種の抗体（ＭＪＦ１－ＷＴ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９、ＥＦ１２－ｐＦｃ２９）のヒトＦｃＲｎに対する結合力は、ＥＬＩＳＡで分析した。トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされて製造された５種の抗体を０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．６）バッファー溶液で希釈し、４μｇ／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間結合させた。４％脱脂乳含有のＰＢＳ溶液にｗ／ｖ ５％となるように入れた後、それぞれの９６ウェルプレートを１時間常温でブロッキングした。上の溶液を捨てた後、１５０μｌ／ｗｅｌｌずつＰＢＳＴ（０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有のＰＢＳ）溶液で４回洗浄した後、ヒトＦｃＲｎとＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（ＧＳＴ）が融合されたタンパク質を４倍段階希釈し、５０μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ウェルプレートにそれぞれｐＨ７．４とｐＨ６．０条件で１時間常温で結合させた。その後、１５０μｌ／ｗｅｌｌずつＰＢＳＴ ０．５％溶液で４回洗浄した後、抗Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ－ＨＲＰコンジュゲートをＰＢＳＴに１：５，０００の比率に希釈し、それぞれの９６ウェルプレートに１時間常温で結合させた。上の溶液を捨てた後、１５０μｌ／ｗｅｌｌずつＰＢＳＴ ０．５％溶液で４回洗浄した後、５０μｌ／ｗｅｌｌずつＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で反応を進行し、２０分後に４Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応終結させ、４５０ｎｍで吸光度を測定し、図８のような結果を得た。ＥＬＩＳＡシグナル分析の結果、動物細胞で発現精製された５種の抗体は、ｐＨ依存的ヒトＦｃＲｎ結合が、血中半減期において優れているトラスツズマブ対照群抗体と非常に類似していることを確認した（図８）。
＜実施例７＞トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体とヒトＦｃγＲＩＩａ変異体との結合力分析
実施例１から選ばれた、トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされて製造された４種の抗体（ＭＪＦ１－ＷＴ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９）と、ヒトＦｃγＲＩＩａ変異体（ＦｃγＲＩＩａ－１３１Ｒ、ＦｃγＲＩＩａ－１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩａ－１５８Ｖ、ＦｃγＲＩＩａ－１５８Ｆ）との結合力は、ＥＬＩＳＡで分析した。トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされて製造された４種の抗体を０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．６）バッファー溶液で希釈し、４μｇ／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間結合させた。４％脱脂乳含有のＰＢＳ溶液にｗ／ｖ ５％となるように入れた後、それぞれの９６ウェルプレートを１時間常温でブロッキングした。上の溶液を捨てた後、１５０μｌ／ｗｅｌｌずつＰＢＳＴ（０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有のＰＢＳ）溶液で４回洗浄した後、ヒトＦｃγＲＩＩａ変異体の融合されたＧＳＴタンパク質を４倍段階希釈し、５０μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ウェルプレートに条件で１時間常温で結合させた。その後、１５０μｌ／ｗｅｌｌずつＰＢＳＴ ０．５％溶液で４回洗浄した後、抗ＧＳＴ－ＨＲＰコンジュゲートをＰＢＳＴに１：５，０００の比率に希釈し、それぞれの９６ウェルプレートに１時間常温で結合させた。上の溶液を捨てた後、１５０μｌ／ｗｅｌｌずつＰＢＳＴ ０．５％溶液で４回洗浄した後、５０μｌ／ｗｅｌｌずつＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で反応を進行し、２０分後に４Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応終結させ、４５０ｎｍで吸光度を測定し、図９のような結果を得た。ＥＬＩＳＡシグナル分析の結果、動物細胞で発現精製された４種の抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩａ変異体との結合がトラスツズマブ対照群抗体と非常に類似していることを確認した（図９）。
＜実施例８＞トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体とヒトＣ１ｑとの結合力分析
実施例１から選ばれた、トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされて製造された４種の抗体（ＭＪＦ１－ＷＴ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９）とヒトＣ１ｑとの結合力は、ＥＬＩＳＡで分析した。トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされて製造された４種の抗体を０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．６）バッファー溶液で希釈し、４μｇ／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に４℃で１６時間結合させた。４％脱脂乳含有のＰＢＳ溶液にｗ／ｖ ５％となるように入れた後、それぞれの９６ウェルプレートを１時間常温でブロッキングした。上の溶液を捨てた後、１５０μｌ／ｗｅｌｌずつＰＢＳＴ（０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有のＰＢＳ）溶液で４回洗浄した後、ヒトＣ１ｑを４倍段階希釈し、５０μｌ／ｗｅｌｌずつ９６ウェルプレートに条件で１時間常温で結合させた。その後、１５０μｌ／ｗｅｌｌずつＰＢＳＴ ０．５％溶液で４回洗浄した後、抗ヒトＣ１ｑ－ＨＲＰコンジュゲートをＰＢＳＴに１：４００の比率に希釈し、それぞれの９６ウェルプレートに１時間常温で結合させた。上の溶液を捨てた後、１５０μｌ／ｗｅｌｌずつＰＢＳＴ ０．５％溶液で４回洗浄した後、５０μｌ／ｗｅｌｌずつＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で反応を進行し、２０分後に４Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応終結させ、４５０ｎｍで吸光度を測定し、図１０のような結果を得た。ＥＬＩＳＡシグナル分析の結果、動物細胞で発現精製された４種の抗体は、ヒトＣ１ｑとの結合が、トラスツズマブ対照群抗体と非常に類似していることを確認した（図１０）。
＜実施例９＞トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体の大腸癌細胞における増殖抑制効能確認
大腸癌細胞の研究で多く使用されているＨＴ－２９とＨＣＴ－１１６細胞株においてフレームワーク領域エンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体の大腸癌細胞増殖力抑制効能があるかどうかを調べた。ＣｙＱＵＡＮＴ ＮＦ蛍光染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて細胞中のＤＮＡ量を測定し、細胞の増殖度を確認した。
ＨＴ－２９とＨＣＴ－１１６細胞株に、トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ ４種の抗体（ＭＪＦ１－ＷＴ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９）をそれぞれ処理し、３７℃細胞培養器で１時間共に培養させた後、接種して７２時間後にＣｙＱＵＡＮＴ ＮＦ蛍光染料を処理し、蛍光分光光度計（ＴＥＣＡＮ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、細胞中に存在するＤＮＡレベルに従う励起波長４８５ｎｍによる放出蛍光の比（Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｂｙ ４８５ｎｍ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）を測定することにより、フレームワーク領域エンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体が大腸癌細胞の増殖力を抑制することを確認した（図１１）。図１１に見られるように、本願発明の抗体がＨＴ－２９とＨＣＴ－１１６大腸癌細胞株の増殖を効果的に阻害する効果を確認した。
＜実施例１０＞大腸癌動物モデルにおいてトラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体の抗癌有効性確認
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを使用し、横腹に大腸癌ＨＴ－２９細胞株を、１匹につき２×１０６細胞数となるようにＰＢＳ１００μｌの量に合わせて皮下注射した（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデルを作り、注射して５日後から本願発明の発掘抗体を、２００μｇの濃度で２日間隔で、生成された大腸癌組織に直接注射し、抗癌有効性検証のための実験を行い、注射して２１日後に大腸癌組織を剥がし、図１２のような結果を導出した。ビークル対照群は、ＰＢＳ単独で抗体の量と同量を注射したグループである。
図１２に見られるように、本願発明のトラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ ４種の抗体（ＭＪＦ１－ＷＴ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９）が、ＨＴ－２９大腸癌細胞株の異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデルにおいて大腸癌の成長を阻害する効果を確認した。この結果から、本願発明のトラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ ４種の抗体は、動物モデルにおいても大腸癌細胞の増殖を効果的に阻害する活性を確認し、治療剤として効能があることを確認した。
＜実施例１１＞トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体の膵癌細胞における増殖抑制効能確認
膵癌細胞研究で多用されているＡｓＰＣ－１とＰａｎｃ－１細胞株において、フレームワーク領域エンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体（ＭＪＦ１－ＷＴ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９）の癌細胞増殖抑制効能を確認するために、実施例９のような方法を用いて図１３のような結果を導出した。
図１３に見られるように、本願発明のフレームワーク領域エンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体（ＭＪＦ１－ＷＴ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９）は、膵癌細胞株においても癌細胞の増殖を効果的に阻害する効果を確認した。この結果から、本願発明のフレームワーク領域エンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体（ＭＪＦ１－ＷＴ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９）は、膵癌細胞の増殖を効果的に阻害する活性があることを確認した。
＜実施例１２＞トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体の胃癌細胞における増殖抑制効能確認
胃癌細胞研究で多用されているＳＮＵ－２１６とＳＮＵ－６６８細胞株において、フレームワーク領域エンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体（ＭＪＦ１－ＷＴ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９）の癌細胞増殖抑制効能を確認するために、実施例９のような方法を用いて図１４のような結果を導出した。
図１４に見られるように、本願発明のフレームワーク領域エンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体（ＭＪＦ１－ＷＴ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９）は、胃癌細胞株においても癌細胞の増殖を効果的に阻害する効果を確認した。この結果から、本願発明のフレームワーク領域エンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体（ＭＪＦ１－ＷＴ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９）は、胃癌細胞の増殖を効果的に阻害する活性があることを確認した。
＜実施例１３＞トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体の物性及び特性確認
トラスツズマブフレームワーク領域でエンジニアリングされた抗ＥＴＡ抗体（ＭＪＦ１－ＷＴ、ＭＪＦ１－ｐＦｃ２９、ＧＧ１２－ｐＦｃ２９、ＦＧ１２－ｐＦｃ２９）及び対照群抗体トラスツズマブをＳＥＣ－ＨＰＬＣで分離した結果、図１５のように、凝集した％が１０％以下と示されたことを確認した。図１６に見られるように、糖鎖の構造を分析した結果、発掘された抗体の糖鎖構造は、ヒトＩｇＧ標準に比べて大差がなかった。図１７は、ＲＰ－ＨＰＬＣで不純物の有無を判断した結果であり、３種の抗体において不純物が８％以下と現れた。発掘された抗体の熱的安定性試験（ｎａｎｏＤＳＣ）では、抗体のＴｍ値が７０℃以上であることを確認した（図１８）。
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい具現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びその等価物によって定義されるといえよう。

Claims (23)

  1. 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、エンドセリン受容体Ａ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ Ａ）に特異的に結合する単一クローン抗体又はその抗原結合断片であって、
    （ａ）前記重鎖可変領域は、配列目録第２５配列のＶＨ－ＣＤＲ１及び配列目録第２６配列のＶＨ－ＣＤＲ２を含み；
    （ｂ）前記軽鎖可変領域は、配列目録第２７配列のＶＬ－ＣＤＲ１、配列目録第２８配列のＶＬ－ＣＤＲ２及び配列目録第２９配列のＶＬ－ＣＤＲ３を含み；及び
    （ｃ）前記重鎖可変領域は、配列目録第３１配列、配列目録第３２配列、配列目録第３３配列及び配列目録第３４配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列のＶＨ－ＣＤＲ３を含むことを特徴とする、単一クローン抗体又はその抗原結合断片。
  2. 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、エンドセリン受容体Ａ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ Ａ）に特異的に結合する単一クローン抗体又はその抗原結合断片であって、
    （ａ）前記重鎖可変領域は、配列目録第２５配列のＶＨ－ＣＤＲ１及び配列目録第２６配列のＶＨ－ＣＤＲ２を含み；
    （ｂ）前記軽鎖可変領域は、配列目録第２７配列のＶＬ－ＣＤＲ１、配列目録第２８配列のＶＬ－ＣＤＲ２及び配列目録第２９配列のＶＬ－ＣＤＲ３を含み；及び
    （ｃ）前記重鎖可変領域は、配列目録第３０配列、配列目録第３１配列、配列目録第３２配列、配列目録第３３配列及び配列目録第３４配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列のＶＨ－ＣＤＲ３を含み、
    前記重鎖可変領域は、配列目録第１配列のフレームワーク領域１（ＶＨ－ＦＲ１）、配列目録第４配列のフレームワーク領域２（ＶＨ－ＦＲ２）、配列目録第８配列のフレームワーク領域３（ＶＨ－ＦＲ３）、及び配列目録第１２配列のフレームワーク領域４（ＶＨ－ＦＲ４）を含み、
    前記軽鎖可変領域は、配列目録第１３配列のフレームワーク領域１（ＶＬ－ＦＲ１）、配列目録第１６配列のフレームワーク領域２（ＶＬ－ＦＲ２）、配列目録第２０配列のフレームワーク領域３（ＶＬ－ＦＲ３）、及び配列目録第２４配列のフレームワーク領域４（ＶＬ－ＦＲ４）を含むことを特徴とする、単一クローン抗体又はその抗原結合断片。
  3. 前記重鎖可変領域は、配列目録第１配列；又は配列目録第１配列において１６番目及び２４番目のアミノ酸からなる群から選ばれる１以上の位置に突然変異を含む配列；の重鎖可変領域フレームワーク領域１（ＶＨ－ＦＲ１）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその抗原結合断片。
  4. 前記重鎖可変領域のＶＨ－ＦＲ１は、配列目録第１配列において１６番目のアミノ酸がＲ（アルギニン）に；又は２４番目のアミノ酸がＶ（バリン）；に置換された突然変異を含むことを特徴とする、請求項３に記載の単一クローン抗体又はその抗原結合断片。
  5. 前記重鎖可変領域のＶＨ－ＦＲ１は、配列目録第１配列、配列目録第２配列及び配列目録第３配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項３に記載の単一クローン抗体又はその抗原結合断片。
  6. 前記重鎖可変領域は、配列目録第４配列、配列目録第５配列、配列目録第６配列及び配列目録第７配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列の重鎖可変領域フレームワーク領域２（ＶＨ－ＦＲ２）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその抗原結合断片。
  7. 前記重鎖可変領域は、配列目録第８配列、配列目録第９配列、配列目録第１０配列及び配列目録第１１配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列の重鎖可変領域フレームワーク領域３（ＶＨ－ＦＲ３）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその抗原結合断片。
  8. 前記重鎖可変領域は、配列目録第１２配列の重鎖可変領域フレームワーク領域４（ＶＨ－ＦＲ４）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその抗原結合断片。
  9. 前記軽鎖可変領域は、配列目録第１３配列；又は配列目録第１３配列において４番目及び２４番目のアミノ酸からなる群から選ばれる１以上の位置に突然変異を含む配列；の軽鎖可変領域フレームワーク領域１（ＶＬ－ＦＲ１）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその抗原結合断片。
  10. 前記軽鎖可変領域のＶＬ－ＦＲ１は、配列目録第１３配列において４番目のアミノ酸がＬ（ロイシン）に；又は２４番目のアミノ酸がＳ（セリン）に；置換された突然変異を含むことを特徴とする、請求項９に記載の単一クローン抗体又はその抗原結合断片。
  11. 前記軽鎖可変領域のＶＬ－ＦＲ１は、配列目録第１３配列、配列目録第１４配列及び配列目録第１５配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項９に記載の単一クローン抗体又はその抗原結合断片。
  12. 前記軽鎖可変領域は、配列目録第１６配列、配列目録第１７配列、配列目録第１８配列及び配列目録第１９配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列の軽鎖可変領域フレームワーク領域２（ＶＬ－ＦＲ２）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその抗原結合断片。
  13. 前記軽鎖可変領域は、配列目録第２０配列、配列目録第２１配列、配列目録第２２配列及び配列目録第２３配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列の軽鎖可変領域フレームワーク領域３（ＶＬ－ＦＲ３）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその抗原結合断片。
  14. 前記軽鎖可変領域は、配列目録第２４配列の軽鎖可変領域フレームワーク領域４（ＶＬ－ＦＲ４）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその抗原結合断片。
  15. 請求項１又は２の単一クローン抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸分子。
  16. 請求項１５の核酸分子を含むベクター。
  17. 請求項１６のベクターを含む、宿主細胞。
  18. 請求項１又は２の単一クローン抗体又はその抗原結合断片、請求項１５の核酸分子又は請求項１６のベクターを含む、癌の予防又は治療用薬剤学的組成物。
  19. 請求項１又は２の単一クローン抗体又はその抗原結合断片、請求項１５の核酸分子又は請求項１６のベクターを含む、高血圧の予防又は治療用薬剤学的組成物。
  20. 請求項１又は２の単一クローン抗体又はその抗原結合断片を処理する段階を含む、サンプル中に含まれたエンドセリン受容体Ａ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ Ａ）の定量方法。
  21. 下記の段階を含む、エンドセリン受容体Ａ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
    ｔｙｐｅ Ａ）の過発現による疾患の診断のための情報を提供する方法：
    （ａ）被検者から体外に分離されたサンプルを取得する段階；
    （ｂ）請求項１又は２の単一クローン抗体又はその抗原結合断片を前記サンプルに処理する段階；及び
    （ｃ）前記被検者のサンプル中に含まれたエンドセリン受容体Ａの発現量が、正常群サンプル中に含まれたエンドセリン受容体Ａの発現量よりも高いかどうか確認する段階。
  22. 前記エンドセリン受容体Ａの過発現による疾患は癌又は高血圧であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
  23. 請求項１又は２の単一クローン抗体又はその抗原結合断片を含む、エンドセリン受容体Ａ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ Ａ）定量キット。
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