JP7315256B2

JP7315256B2 - エンドセリン受容体ａ活性調節抗体

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Publication number: JP7315256B2
Application number: JP2021532324A
Authority: JP
Inventors: テクジョン，サン; ギュユ，ヨン; ジュ，マン－ソク; ナ，ジョン－ヒョン; ジェキム，ヨン; アン，ヘ－ミ; ジュンコ，ビョン; キュイ，ウォン
Original assignee: ヘッジホッグ，インコーポレイテッド
Priority date: 2018-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2023-07-26
Anticipated expiration: 2039-12-05
Also published as: US20220153831A1; WO2020116963A1; JP2022511876A

Description

本発明は、ＥＴ_Ａ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＡ）に対する結合力が増大してＥＴ－１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１）及びＥＴ_Ａ間結合を効果的に抑制し、ＥＴ_Ａの活性を調節する抗体に関する。

ＧＰＣＲ（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、７個の膜透過部位を有する多重膜透過タンパク質であり、細胞外の信号を細胞内に伝達してＧ－タンパク質異型三量体を活性化させることにより、信号伝達物質に対する反応だけでなく感覚などの生理学上の必須の役割を果たす。また、ＧＰＣＲは、細胞の成長、増殖、移動、集団化、死滅などの主要生物学的現象を最も上位段階で直接調節する他、癌、心血管疾患などのような疾病とも直接に関連しているので、主要薬物標的物質として注目されている。

ＥＴ_Ａ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＡ）は、正常人において主に血管平滑筋に発現し、リガンドであるＥＴ－１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１）の結合による細胞内信号伝達過程を通じて血管収縮作用を起こすものと知られている。したがって、エンドセリン受容体拮抗剤（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）であるボセンタン（Ｂｏｓｅｎｔａｎ）のような薬物が高血圧治療剤として用いられてきた（Ｎａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗｓｄｒｕｇｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１１，Ｖｏｌ．１０，４７）。近年、多くの基礎生物学及び臨床学的研究により、ＥＴ_Ａが膀胱癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、横紋筋肉腫、膠芽細胞腫などの様々な癌で過発現し、癌細胞の増殖、移動、侵入、転移、血管新生成などの主要癌進行過程に直接関与して患者の生存率を下げることが報告され、主要抗癌標的物質として注目されている（Ｎａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗｃａｎｃｅｒ，２０１３，Ｖｏｌ．１３，６３７）。

抗体薬物は、低分子合成医薬品に比べて高い特異性、低い副作用、高い血中半減期、Ｆｃ領域による欠陥細胞死滅作用機序（ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ）などの長所にもかかわらず、既存のＥＴ_Ａを標的する薬物はボセンタン（Ｂｏｓｅｎｔａｎ）、ジボテンタン（Ｚｉｂｏｔｅｎｔａｎ）、アトラセンタン（Ａｔｒａｓｅｎｔａｎ）などの低分子化合物であり、未だ抗体薬物は報告されたことがなく、ＧＰＣＲ全体に拡大しても販売許可された抗体薬物はごく稀であり、ＣＣＲ４を標的するＫｙｏｗａＨａｋｋｏＫｉｒｉｎ社のポテリジオ（モガムリズマブ）が日本で承認され、２０１８年５月にはアムジェンで開発されたＣＧＲＰ受容体を標的にするエイモビグ（エレヌマブ）が、ＧＰＣＲ標的抗体としては初めてＵＳＦＤＡ承認を受けた。そこで、ＥＴ_Ａに特異的に結合し、その活性を調節する新規抗体の発掘の必要性が台頭した。また、ＧＰＣＲ標的の新規抗体薬物を開発するためには、まず、抗原の細胞外部位（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎ，ＥＣＤ）に特異的に結合しなければならないが、ＧＰＣＲの全表面積において細胞外部位が占める比率は約１０％前後と非常に制限的であるため、用いられている既存の抗体発掘戦略では限界がある。

上記の背景技術として説明された事項は、本発明の背景に対する理解を増進させるためのものに過ぎず、当該技術分野における通常の知識を有する者に既に知られた従来技術に該当することを認めるものと理解してはならないだろう。

本発明者らは、ＥＴ_Ａに特異的に結合して信号伝達過程を阻害する新規抗体を発掘しようと鋭意努力した。その結果、本発明者らは、ＥＴ_Ａが安定発現した細胞株におけるＥＴ－１信号伝達を効率的に抑制する抗体を発見し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、エンドセリン受容体Ａ（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＡ）又はその細胞外部位（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎ）を抗原として認識してそれに特異的に結合する単一クローン抗体又はその断片を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記単一クローン抗体又はその断片をコードする核酸分子を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記核酸分子を含むベクターを提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記ベクターを含む宿主細胞を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記単一クローン抗体、核酸分子又はベクターを含む、癌又は高血圧の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、薬剤学的有効量の前記単一クローン抗体、核酸分子又はベクターを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む、癌又は高血圧の治療方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、癌又は高血圧の治療用薬剤学的組成物の製造のための前記単一クローン抗体又はその断片、核酸分子、又はベクターの用途を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記単一クローン抗体又はその断片を処理する段階を含む、サンプル中に含まれたエンドセリン受容体Ａ（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＡ）の定量方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、エンドセリン受容体Ａ（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＡ）の過発現による疾患の診断のための情報を提供する方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記単一クローン抗体又はその断片を含む、エンドセリン受容体Ａ（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＡ）定量キットを提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面からより明確になる。

本発明の一態様によれば、本発明は、エンドセリン受容体Ａ（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＡ）又はその細胞外部位（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎ）を抗原として認識してそれに特異的に結合する単一クローン抗体又はその断片を提供する。

前記エンドセリン受容体Ａは、リガンドであるＥＴ－１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１）の結合による細胞内信号伝達過程を担当し、高血圧治療剤及び主要抗癌標的物質として脚光を浴びているが、既存にＥＴ_Ａを標的する薬物は、ボセンタン（Ｂｏｓｅｎｔａｎ）、ジボテンタン（Ｚｉｂｏｔｅｎｔａｎ）、アトラセンタン（Ａｔｒａｓｅｎｔａｎ）などの低分子化合物であり、未だ、エンドセリン受容体Ａの細胞外部位を抗原として認識する単一クローン抗体薬物は報告されたことがない。

本明細書に開示の用語「抗原」とは、任意の天然又は合成免疫原性物質、例えば、タンパク質、ペプチド又はハプテンのことを指す。抗原は、ＥＴ_Ａ又はその断片（例えば、細胞外部位（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎ））であってよい。

本明細書に開示の「エピトープ」は当業界の用語であり、抗体が特異的に結合可能な抗原の局所領域のことを指す。例えば、エピトープは、ポリペプチドの隣接アミノ酸であってもよく（線形又は隣接エピトープ）、或いは、エピトープは、ポリペプチド又はポリペプチドの２つ以上の非隣接領域から共に合わせられてもよい（立体構造的、非線形、不連続、又は非隣接エピトープ）。隣接アミノ酸から形成されたエピトープは、常時ではないが、典型的に変性溶媒に露出時に保持されるのに対し、３次フォールディングによって形成されたエピトープは、典型的に変性溶媒への処理時に喪失される。エピトープは典型的に、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は２０個アミノ酸を独特の空間的立体構造で含む。与えられた抗体によってエピトープが結合する方式を決定するための方法（すなわち、エピトープマッピング）は、当業界によく公知されており、例えば、免疫ブロッティング及び免疫沈殿分析を含み、本明細書では、重複又は隣接ペプチド（例えば、ＥＴ_Ａから）が、与えられた抗体（例えば、抗ＥＴ_Ａ抗体）との反応性に対して試験される。エピトープの空間的立体構造を決定する方法は、当業界の技術及び本明細書に提示されたもの、例えば、ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴及びＦＩＤＸ－ＭＳを含む（例えば、ＥｐｉｔｏｐｅＭａｐｐｉｎｇＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）参照）。

特定の具体例において、抗体が結合するエピトープは、例えば、ＮＭＲ分光学、ｘ線回折結晶学研究、ＥＬＩＳＡ分析、質量分析法と結合した水素／重水素交換（例えば、液体クロマトグラフィー電気噴霧質量分析法）、アレイベースのオリゴペプチドスキャニング分析及び／又は突然変異誘発マッピング（例えば、部位指定突然変異誘発マッピング）によって決定することができる。ｘ線結晶学の場合、当業界に公知の方法のいずれかを用いて結晶化が達成できる（例えば、ＧｉｅｇｅＲｅｔａｌ，（１９９４）ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ５０（Ｐｔ４）：３３９－３５０；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎＡ（１９９０）ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ１８９：１－２３；ＣｈａｙｅｎＥ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ５：１２６９－１２７４；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎＡ（１９７６）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２５１：６３００－６３０３参照）。抗体：抗原結晶は、周知のｘ線回折技術を用いて研究でき、Ｘ－ＰＬＯＲ（ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９２，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．から配布；例えば、ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ（１９８５）ｖｏｌｕｍｅｓ１１４＆１１５，ｅｄｓＷｙｃｋｏｆｆＨＷｅｔａｌ；Ｕ．Ｓ．２００４／００１４１９４参照）、及びＢＵＳＴＥＲ（ＢｒｉｃｏｇｎｅＧ（１９９３）ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ４９（Ｐｔ１）：３７－６０；ＢｒｉｃｏｇｎｅＧ（１９９７）ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ２７６Ａ：３６１－４２３，ｅｄＣａｒｔｅｒＣＷ；ＲｏｖｅｒｓｉＰｅｔａｌ，（２０００）ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ５６（Ｐｔ１０）：１３１６－１３２３）のようなコンピュータソフトウェアを用いて確認することができる。突然変異誘発マッピング研究は、当業界に公知の任意の方法を用いて行うことができる。アラニンスキャニング突然変異誘発技術を含む突然変異誘発技術に関する内容は、例えば、ＣｈａｍｐｅＭｅｔａｌ，（１９９５）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７０：１３８８－１３９４及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍＢＣ＆ＷｅｌｌｓＪＡ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０８１－１０８５を参照する。

用語「エピトープマッピング」とは、抗体－抗原認識のための分子決定基を確認する過程を指す。

２つ以上の抗体と関連して用語「同一のエピトープに結合する」とは、与えられた方法によって決定されたとき、抗体がアミノ酸残基の同じセグメントに結合するということを意味する。抗体が本明細書に提示の抗体と「ＥＴ_Ａ上の同一のエピトープ」に結合するか否かを決定する技術は、例えば、エピトープマッピング方法、例えば、当該エピトープの原子分解能を提供する抗原：抗体複合体結晶に対するｘ線分析及び水素／重水素交換質量分析法（ＨＤＸ－ＭＳ）を含む。他の方法は、抗原断片又は抗原の突然変異された変異型に対する抗体の結合をモニターし、この場合、抗原配列内でアミノ酸残基の変形による結合の喪失が、エピトープ成分の印として主に考慮される。また、エピトープマッピングのためのコンピュータ組合せ方式の方法が用いられてもよい。それらの方法は、組合せ方式ファージディスプレイペプチドライブラリーから特定の短いペプチドを親和性分離できる関心抗体の能力に依存する。同一のＶＨ及びＶＬ、又は同一のＣＤＲ１、２及び３配列を有する抗体は、同一のエピトープに結合すると予想される。

「標的との結合に対して他の抗体と競争する」抗体は、残りの抗体と標的との結合を抑制する（部分的に又は完全に）抗体のことを指す。２つの抗体が標的との結合に対して相互に競合するか否か、すなわち、一つの抗体が他の抗体と標的との結合を抑制するか否か及びその程度は、公知の競合実験を用いて決定することができる。特定の具体例において、抗体は他の抗体と標的の結合に対して競合し、他の抗体と標的との結合を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％抑制する。抑制又は競合のレベルは、抗体が「遮断抗体」（すなわち、先に標的と共にインキュベーションされる冷蔵抗体）であるか否かによって互いに異なり得る。競合分析は、例えば、ＥｄＨａｒｌｏｗａｎｄＤａｖｉｄＬａｎｅ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂＰｒｏｔｏｃ；２００６；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ４２７７又はＥｄＨａｒｌｏｗａｎｄＤａｖｉｄＬａｎｅ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳＡ１９９９“ＵｓｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”の第１１章に開示のとおりに行うことができる。競合抗体は、同一のエピトープ、重複エピトープ又は隣接エピトープ（例えば、立体障害によって証明されたとおり）に結合する。

他の競合結合分析は、固体相直接又は間接放射性免疫分析（ＲＩＡ）、固体相直接又は間接酵素免疫分析（ＥＩＡ）、サンドウィッチ競合分析（Ｓｔａｈｌｉｅｔａｌ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ９：２４２（１９８３）参照）；固体相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄｅｔａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４（１９８６）参照）；固体相直接標識分析、固体相直接標識サンドウィッチ分析（ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ（１９８８）参照）；Ｉ－１２５標識を使用する固体相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１）：７（１９８８）参照）；固体相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇｅｔａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６：５４６（１９９０）参照）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒｅｔａｌ，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７（１９９０）参照）を含む。

「二重特異的」又は「二重機能性」抗体とは、２つの異なる重鎖／軽鎖対と２つの異なる結合部位を持つ人工ハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’断片の結合を含む様々な方法によって生成することができる（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５－３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙｅｔａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７－１５５３（１９９２）参照）。

本明細書に提示の「単一クローン抗体」とは、特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和性を示す抗体、又は全ての抗体が特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和性を示す抗体の組合せのことを指す。したがって、用語「ヒト単一クローン抗体」とは、単一結合特異性を示し、ヒトジャームライン免疫グロブリン配列から由来した可変領域及び選択的な定常領域を持つ抗体又は抗体組成物のことを指す。一具体例において、ヒト単一クローン抗体は、不滅化された細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを持つ遺伝子導入非ヒト動物、例えば、遺伝子導入マウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成される。

本明細書に提示の「組換えヒト抗体」とは、組換え手段によって製造、発現、生成又は分離された全てのヒト抗体を含み、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に対して遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）又は染色体導入（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えば、マウス）又はそれから製造されたハイブリドーマから分離された抗体、（ｂ）抗体を発現させるように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから分離された抗体、（ｃ）組換え、組合せ方式のヒト抗体ライブラリーから分離された抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列と他のＤＮＡ配列のスプライシングを伴う任意の他の手段によって製造、発現、生成又は分離された抗体がある。このような組換えヒト抗体は可変及び定常領域を含み、それらはジャームライン遺伝子によって暗号化された特定のヒトジャームライン免疫グロブリン配列を用いるが、例えば、抗体成熟化中に起きる、後続再配列及び突然変異を含む。当業界に公知のとおり（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ（２００５）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１１７－１１２５参照）、可変領域は抗原結合ドメインを含有し、外来抗原に特異的な抗体を形成するように再配列した様々な遺伝子によって暗号化される。再配列に加えて、可変領域は外来抗原に対する抗体の親和性を増加させるために多数の単一アミノ酸変化によってさらに変形されてもよい（体細胞突然変異又は超突然変異）。定常領域は、抗原に対する追加の反応において変化するだろう（すなわち、アイソタイプスイッチ）。したがって、抗原に反応して軽鎖及び重鎖免疫グロブリンポリペプチドを暗号化する再配列がなされ、体細胞突然変異された核酸分子は、親核酸分子と配列同一性を有することはできないが、その代わり、実質的に同一又は類似になるであろう（すなわち、少なくとも８０％同一性を有する）。

「ヒト」抗体（ＨｕＭＡｂ）とは、フレームワークとＣＤＲ領域が両方ともヒトジャームライングロブリン配列から由来した可変領域を持つ抗体のことを指す。また、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域も同様にヒトジャームライン免疫グロブリン配列から由来する。本明細書に開示の抗体は、ヒトジャームライン免疫グロブリン配列によって暗号化されないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、試験管内無作為又は部位特異的突然変異誘発によって又は生体内体細胞突然変異によって導入された突然変異）。しかし、本明細書に開示の「ヒト抗体」とは、マウスのような他の哺乳類種のジャームラインから由来したＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上にグラフトされた抗体を含むことはない。用語「ヒト」抗体及び「完全ヒト」抗体は、同じ意味で使われる。

「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外にあるアミノ酸の一部、大部分又は全部が、ヒト免疫グロブリンから由来した相応するアミノ酸に置換された抗体のことを指す。抗体のヒト化形態の一具体例において、ＣＤＲドメイン外にあるアミノ酸の一部、大部分又は全部が、ヒト免疫グロブリンからのアミノ酸に置換され、一つ以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、大部分又は全部はそのまま維持される。アミノ酸の小さい追加、欠失、挿入、置換又は変形は、抗体が特定抗原に結合する能力を失わない限り、許容されてよい。「ヒト化」抗体は、親抗体と類似の抗原特異性を保有する。

「キメラ抗体」とは、可変領域が一つの種から由来し、定常領域が他の種から由来した抗体、例えば、可変領域がマウス抗体から由来し、定常領域がヒト抗体から由来した抗体のことを指す。

本明細書に開示の用語「交差反応する」とは、本明細書に提示された抗体が異なる種からのＥＴ_Ａに結合する能力をいう。例えば、ヒトＥＴ_Ａに結合する抗体はまた、ＥＴ_Ａの他の種（例えば、マウスＥＴ_Ａ）にも結合可能である。交差反応性は、結合分析（例えば、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ）で精製された抗原との特異的反応性を検出することによって、又はＥＴ_Ａを生理的に発現させる細胞に対する結合又は他の機能的相互作用を検出することによって測定することができる。交差反応性を決定する方法は、本明細書に提示された標準結合分析、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００ＳＰＲ機器（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いたＢＩＡＣＯＲＥ表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）分析、又は流細胞計数技術を含む。

本発明の抗体又はその断片は、ＧＰＣＲ（例えば、エンドセリン受容体Ａ）の細胞外部位を抗原として認識してそれに特異的に結合するが、ＧＰＣＲの細胞外部位は、１個のＮ－ｔｅｒｍと３個のＥＣＬ（ＥＣＬ１、ＥＣＬ２及びＥＣＬ３）を含むところ、前記Ｎ－ｔｅｒｍ、ＥＣＬ１、ＥＣＬ２及びＥＣＬ３からなる群から選ばれる１つ以上の細胞外部位をエピトープとして特異的に結合でき、前記エピトープは１つ又はそれ以上のアミノ酸を含むことができる。

本発明の好ましい具現例によれば、前記エンドセリン受容体Ａは、配列目録第６８配列のアミノ酸配列を含むものである。

本発明の好ましい具現例によれば、前記細胞外部位は、配列目録第６９配列のＮ－ｔｅｒｍ部位、配列目録第７０配列のＥＣＬ１、配列目録第７１配列のＥＣＬ２及び配列目録第７２配列のＥＣＬ３からなる群から選ばれる１つ又はそれ以上の部位である。

本明細書において、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子のいずれかの類型の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＹ）でよく、いずれか下位類型の抗体（例えば、ヒトにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４；及び、マウスにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３）であってもよい。免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）は、様々なアロタイプ（ａｌｌｏｔｙｐｅ）が存在してよく、本明細書において用語「抗体」とは、一般に知られたアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）及びアロタイプ（ａｌｌｏｔｙｐｅ）を含む。また、本明細書において用語「抗体」とは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４であるか、そのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）類型でよい（例えば、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のハイブリッド）。

本明細書において、用語「単一クローン抗体」又は「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、特定エピトープに対する単一結合特異性（ｓｉｎｇｌｅｂｉｎｄｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）及び親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を示す抗体を意味する。

本明細書において、用語「断片」とは、抗原に特異的に結合する能力を保有している抗体の一つ以上の断片のことを指す。このような「断片」は、例えば、約８～約１５００個アミノ酸長、好適には約８～約７４５個アミノ酸長、好適には約８～約３００個、例えば、約８～約２００個アミノ酸長、又は約１０～約５０個又は１００個アミノ酸長である。抗体の抗原－結合機能は、全長抗体の断片によってなされることが明らかにされた。抗体、例えば、本明細書に開示の抗ＥＴ_Ａの「抗原－結合断片」という用語に含まれた結合断片の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインで構成された１価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片、ヒンジ領域で二硫化物ブリッジによって連結された２個のＦａｂ断片を含む２価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成されたＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の一つの腕のＶＬ及びＶＨドメイン、及び二硫化物－連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）で構成されたＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインで構成されたｄＡｂ断片（Ｗａｒｄｅｔａｌ，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４－５４６）及び（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、又は（ｖｉｉ）合成リンカーによって選択的に連結可能な２つ以上の分離されたＣＤＲの組合せを含む。また、Ｆｖ断片、ＶＬ及びＶＨのうち２個のドメインは別の遺伝子によってコードされるが、組換え方法を用いて、ＶＬとＶＨ領域が対をなして１価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））を形成した単一タンパク質鎖をなさせ得る合成リンカーによってつながり得る（Ｂｉｒｄｅｔａｌ，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎｅｔａｌ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３参照）。このような単鎖抗体も同様、抗体の「抗原－結合断片」に含まれるように意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知された従来の技術によって得られ、断片は、無損傷抗体と同じ方式で有用性に対してスクリーニングされる。抗原－結合断片は、組換えＤＮＡ技術、又は無損傷免疫グロブリンの酵素又は化学的切断によって生成されてよい。

ＶＨドメイン、又は１つ又はそれ以上のＣＤＲは、重鎖（ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ）を形成するために定常ドメインに連結されてよい。また、ＶＬドメイン、又は１つ又はそれ以上のＣＤＲは、軽鎖（ｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ）を形成するために定常ドメインに連結されてよい。全長（ｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈ）重鎖及び全長軽鎖が結合して全長抗体を構成する。

本明細書において用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は同じ意味で使われる。可変領域とは、典型的に抗体の一部分、一般的に軽鎖又は重鎖の一部分、典型的に成熟した重鎖において約アミノ末端１１０～１２０個アミノ酸及び成熟した軽鎖において約９０～１１５個アミノ酸のことを指し、これらは、抗体ごとに広範囲に配列が異なり、特定抗体の特定抗原に対する結合及び特異性を特化する。配列の可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域に集中され（重鎖：ＨＣＤＲ１、２及び３、軽鎖：ＬＣＤＲ１、２及び３）、可変ドメインにおいてより高度に保存された領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。

軽鎖及び重鎖のＣＤＲは、抗体と抗原の相互作用及び特異性を主に担当する。特定の具体例において、可変領域はヒト可変領域である。特定の具体例において、可変領域は齧歯類又はネズミ科の（ｍｕｒｉｎｅ）ＣＤＲとヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。特定の具体例において、可変領域は、霊長類（例えば、非ヒト霊長類）可変領域である。特定の具体例において、可変領域は、齧歯類又はネズミ科のＣＤＲと霊長類（例えば、非ヒト霊長類）フレームワーク領域（ＦＲ）を含む。

本明細書において用語「重鎖」とは、抗体と共に使用される場合、任意の異なるタイプ、例えば、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、アルファ（α）、デルタ（δ）、エプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びミュー（μ）のことを指すことができ、これらはそれぞれ、ＩｇＧのサブクラス、例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む抗体のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの類型を発生させる。

本明細書に提示の用語「軽鎖」とは、抗体と共に使用される場合、任意の異なるタイプ、例えば、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）又はラムダ（λ）のことを指すことができる。軽鎖アミノ酸配列は、当業界によく公知されている。特定の具体例において、軽鎖は、ヒト軽鎖である。

用語「ＶＬ」及び「ＶＬドメイン」は、互換して使用され、抗体の軽鎖可変領域のことを指す。

用語「ＶＨ」及び「ＶＨドメイン」は、互換して使用され、抗体の重鎖可変領域のことを指す。

本明細書において用語「定常領域」又は「定常ドメイン」は、同じ意味で使われてよい。定常領域は、抗体部分、例えば、抗体と抗原の結合には直接伴わないが、Ｆｃ受容体との相互作用のような様々なエフェクター機能を示し得る軽鎖及び／又は重鎖のカルボキシ末端部分である。免疫グロブリン分子の定常領域は一般に、免疫グロブリン可変ドメインに比べてより保存されたアミノ酸配列を有する。

「Ｆｃ領域」（断片結晶化可能な領域）、「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ」は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）上に位置したＦｃ受容体又は古典的補体システムの第１成分（Ｃｌｑ）との結合を含む、免疫グロブリンと宿主組織又は因子の結合を媒介する抗体の重鎖のＣ末端領域のことを指す。したがって、Ｆｃ領域は、第１定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１又はＣＬ）を除く抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第２（ＣＨ２）及び第３（ＣＨ３）定常ドメインから由来した、２つの同じタンパク質断片を含む；ＩｇＭ及びＩｇＥＦｃ領域は、各ポリペプチド鎖において３個の重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２～４）を含む。ＩｇＧの場合、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３、そしてＣγ１とＣγ２間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は可変的でよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は一般に、位置Ｃ２２６又はＰ２３０にあるアミノ酸残基（又は、これら２つのアミノ酸間のアミノ酸）から重鎖のカルボキシ末端まで伸びるものと定義され、ここでナンバリングは、Ｋａｂａｔに提示されたＥＵインデックスに従う。ヒトＩｇＧＦｃ領域のＣＨ２ドメインは、凡そアミノ酸２３１から凡そアミノ酸３４０まで延長され、ＣＨ３ドメインはＦｃ領域においてＣｍドメインのＣ末端側に位置するが、すなわち、ＩｇＧの凡そアミノ酸３４１から凡そアミノ酸４４７まで延長される。本明細書に提示のＦｃ領域は、任意のアロタイプ変異体を含む自生配列Ｆｃ又は変異体Ｆｃ（例えば、非自然発生Ｆｃ）でよい。また、Ｆｃは、「Ｆｃ融合タンパク質」（例えば、抗体又は免疫接合体）ともいう「Ｆｃ領域を含む結合タンパク質」のようなＦｃ含有タンパク質ポリペプチドでよい。
「自生配列Ｆｃ領域」又は「自生配列Ｆｃ」は、自然から発見されたＦｃ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む。自生配列ヒトＦｃ領域は、自生配列ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域；自生配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；自生配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び自生配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域だけでなく、それらの自然的に発生した変異体を含む。自生配列Ｆｃは、Ｆｅｓの様々なアロタイプを含む（例えば、Ｊｅｆｆｅｒｉｓｅｔａｌ，（２００９）ｍＡｂｓ１：１；ＶｉｄａｒｓｓｏｎＧ．ｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ．５：５２０）。

定常領域は、一つ以上のエフェクター機能を除去するために、例えば組換え技術によって操作されてよい。「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体又はリガンドの相互作用、又はその結果である生化学的事件のことを指す。例示的な「エフェクター機能」は、Ｃｌｑ結合、補体依存的細胞毒性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、ＦｃγＲ－媒介エフェクター機能、例えばＡＤＣＣ及び抗体依存的細胞媒介貪食作用（ＡＤＣＰ）及び細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節を含む。このようなエフェクター機能は一般に、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされ得るＦｃ領域を必要とする。したがって、用語「Ｆｃ機能のない定常領域」は、Ｆｃ領域によって媒介された一つ以上のエフェクター機能が減少したり又は初めからない定常領域を含む。

抗体のエフェクター機能は、異なる接近法によって減少又は回避することができる。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域を欠如した抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、又はモノマーＶＨ又はＶＬドメインで構成されたｓｄＡｂのような）によって減少又は回避できる。または、Ｆｃ領域において特定残基に結合した糖を除去して、いわゆる非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体を生成することができ、これによって、Ｆｃ領域の他の価値ある属性（例えば、延長された半減期及びヘテロダイマー化）は維持したままで抗体のエフェクター機能を減少させることができる。非グリコシル化抗体は、例えば、糖の付着した残基の欠失又は変更、酵素的糖除去、グリコシル化抑制剤の存在下に培養された細胞において抗体の生成、又はタンパク質をグリコシル化できない細胞（例えば、バクテリア宿主細胞）において抗体の発現によって生成することができる。他の接近法は、減少したエフェクター機能を持つＩｇＧサブクラスからＦｃ領域を利用することであり、例えば、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３よりも低いレベルのＦｃエフェクター機能の有することを特徴とする。Ｆｃ部分のＣＨ２ドメインにおいてヒンジ領域に最も近くにある残基が抗体のエフェクター機能を担当し、それは先天的免疫系のエフェクター細胞上のＣｌｑ（補体）及びＩｇＧ－Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）に対して相当重なった結合部位を有する（ＶｉｄａｒｓｓｏｎＧ．ｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ．５：５２０）。したがって、Ｆｃエフェクター機能が減少した又は無い抗体は、例えば、ＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ２ドメインとＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃ領域、又はＩｇＧ２からのヒンジ領域とＩｇＧ４からのＣＨ２領域を含むキメラＦｃ領域（例えば、ＬａｕＣ．ｅｔａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１：４７６９－４７７７（２０１３）参照）、又は変更されたＦｃエフェクター機能、例えば減少した又は無いＦｃ機能をもたらす突然変異を持つＦｃ領域を生成することによって作製できる。突然変異を持つかかるＦｃ領域は、当業界に公知である（例えば、大韓民国特許公開第１０－２０１８－０１１２９０４号公報参照）。

「ヒンジ」、「ヒンジドメイン」、「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインを連結する重鎖定常領域のドメインをいい、ヒンジの上部、中央及び下部の部分を含む（Ｒｏｕｘｅｔａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８１６１：４０８３）。ヒンジは、抗体の結合領域とエフェクター領域の間に様々なレベルのフレキシビリティを提供し、また、両重鎖定常領域の間に分子間二硫化物結合のための部位を提供する。本明細書に提示のヒンジは、全てのＩｇＧアイソタイプに対してＧｌｕ２１６から始まってＧｌｙ２３７で終わる（Ｒｏｕｘｅｔａｌ，１９９８ＪＩｍｍｕｎｏｌ１６１：４０８３）。野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４ヒンジの配列は、当業界に公知されている（例えば、ＫａｂａｔＥＡｅｔａｌ，（１９９１）ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１－３２４２；ＶｉｄａｒｓｓｏｎＧ．ｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ．５：５２０（オンライン公開２０１４－１０－２０）参照）。

用語「ＣＨ１ドメイン」とは、重鎖定常ドメインのヒンジと可変ドメインを連結する重鎖定常領域のことを指す。本明細書に提示のＣＨ１ドメインは、Ａ１１８から始まってＶ２１５で終わる。用語「ＣＨ１ドメイン」は、野生型ＣＨ１ドメインだけでなく、自然的に存在するその変異体を含む（例えば、アロタイプ）。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＣＨ１ドメイン配列（野生型及びアロタイプを含む。）は、当業界に公知である（例えば、ＫａｂａｔＥＡｅｔａｌ，（１９９１）同上及びＶｉｄａｒｓｓｏｎＧ．ｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ．５：５２０（オンライン公開２０１４－１０－２０）参照）。

用語“ＣＨ２ドメイン”は、重鎖定常ドメインのＣＨ３ドメインとヒンジを連結する重鎖定常領域のことを指す。本明細書に提示のＣＨ２ドメインは、Ｐ２３８から始まってＫ３４０で終わる。用語“ＣＨ２ドメイン”は、野生型ＣＨ２ドメインだけでなく、自然的に存在するその変異体を含む（例えば、アロタイプ）。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン配列（野生型及びアロタイプを含む。）は、当業界に公知である（例えば、ＫａｂａｔＥＡｅｔａｌ，（１９９１）同上及びＶｉｄａｒｓｓｏｎＧ．ｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ．５：５２０（オンライン公開２０１４－１０－２０）参照）。例示的なＣＨ２ドメインは、抗体の生物学的活性、例えば、半減期及び／又は減少したＦｃエフェクター機能を変形するドメインを持つＣＨ２ドメインを含む（米国特許公開第２０１２０１００１４０号参照）。

用語「ＣＨ３ドメイン」とは、重鎖定常ドメインのＣＨ２ドメインに向けてＣ末端である重鎖定常領域のことを指す。本明細書に提示のＣＨ３ドメインは、Ｇ３４１から始まってＫ４４７で終わる。用語「ＣＨ３ドメイン」は、野生型ＣＨ３ドメインだけでなく、自然的に存在するその変異体を含む（例えば、アロタイプ）。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＣＨ３ドメイン配列（野生型及びアロタイプを含む。）は、当業界に公知である（例えば、ＫａｂａｔＥＡｅｔａｌ，（１９９１）同上及びＶｉｄａｒｓｓｏｎＧ．ｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ．５：５２０（オンライン公開２０１４－１０－２０）参照）。例示的なＣＨ３ドメインは、抗体の生物学的活性、例えば、半減期を変形するドメインを持つＣＨ３ドメインを含む（米国特許公開第２０１２０１００１４０号参照）。

本明細書に提示の「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によって暗号化される抗体類型（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ及びＩｇＥ抗体）をいう。

「アロタイプ」とは、特定のアイソタイプグループ内で自然的に発生する、いくつかのアミノ酸に差異がある変異体のことを指す（例えば、Ｊｅｆｆｅｒｉｓｅｔａｌ，（２００９）ｍＡｂｓ１：１）。本明細書に開示の抗体は、任意のアロタイプを有することができる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のアロタイプは、当業界に公知である（例えば、ＫａｂａｔＥＡｅｔａｌ，（１９９１）同上；ＶｉｄａｒｓｓｏｎＧ．ｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ．５：５２０（オンライン公開２０１４－１０－２０）；及びＬｅｆｒａｎｃＭＰ，ｍＡｂｓ１：４，１－７（２００９）参照）。

語句「抗原を認識する抗体」及び「抗原に対して特異的な抗体」は、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と互換して本明細書で使用される。

本明細書において「分離された抗体」とは、異なる抗原特異性を持つ他の抗体が実質的にない抗体のことを指す（例えば、ＥＴ_Ａに特異的に結合する分離された抗体は、ＥＴ_Ａ以外の他の抗原に特異的に結合する抗体が実質的にない）。しかし、ＥＴ_Ａのエピトープに特異的に結合する分離された抗体は、異なる種からの他のＥＴ_Ａタンパク質に対して交差反応性を有する。

本明細書に開示の用語「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、「特異的結合」、「選択的結合」及び「選択的に結合する」とは、抗体と関連して類似の用語であり、抗原（例えば、エピトープ又は免疫複合体）に結合する分子（例えば、抗体）をいい、このような結合は、当業者に理解されるとおりである。

抗体は、典型的に、１０^－５～１０^－１１Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）によって反映された、高い親和性で同族抗原に特異的に結合する。約１０^－４Ｍを超える任意のＫ_Ｄは、一般に、非特異的結合を示すものと見なされる。本明細書に提示の、抗原に“特異的に結合する”抗体は、高い親和性で抗原及び実質的に同じ抗原に結合するが、関連のない抗原には高い親和性で結合しない抗体をいい、高い親和性とは、例えば、決められた抗原を用いて免疫分析技術によって決定されたとき、１０^－７Ｍ以下、好ましくは１０^－８Ｍ以下、より好ましくは１０^－９Ｍ以下、及び最も好ましくは１０^－８Ｍ～１０^－１０Ｍ以下のＫ_Ｄを有することを意味する。

本発明の好ましい具現例によれば、前記単一クローン抗体又はその断片は、重鎖可変領域に、配列目録第３８配列のＣＤＲ１、配列目録第３９配列のＣＤＲ２を含み、軽鎖可変領域に、配列目録第４０配列のＣＤＲ１、配列目録第４１配列のＣＤＲ２及び配列目録第４２配列のＣＤＲ３を含む。

本発明の好ましい具現例によれば、前記単一クローン抗体又はその断片の重鎖可変領域におけるＣＤＲ３は、配列目録第４３配列のアミノ酸配列である。

本発明の好ましい具現例によれば、前記単一クローン抗体又はその断片の重鎖可変領域におけるＣＤＲ３は、配列目録第４３配列から４番目、７番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目及び１４番目のアミノ酸からなる群から選ばれる位置に突然変異を含むものである。

本発明の好ましい具現例によれば、前記重鎖可変領域におけるＣＤＲ３は、配列目録第４３配列から４番目のアミノ酸がＰ（バリン）に；７番目のアミノ酸がＬ（ロイシン）に；９番目のアミノ酸がＶ（バリン）に；１０番目のアミノ酸がＩ（イソロイシン）又はＨ（ヒスチジン）に；１１番目のアミノ酸がＦ（フェニルアラニン）又はＱ（グルタミン）に；１２番目のアミノ酸がＥ（グルタメート）に；１３番目のアミノ酸がＮ（アスパラギン）又はＣ（システイン）に；又は１４番目のアミノ酸がＬ（ロイシン）に置換された突然変異を含むものである。

本発明の好ましい具現例によれば、前記重鎖可変領域におけるＣＤＲ３は、配列目録第４４配列、配列目録第４５配列、配列目録第４６配列、配列目録第４７配列、配列目録第４８配列、配列目録第４９配列、配列目録第５０配列、配列目録第５１配列、配列目録第５２配列、配列目録第５３配列及び配列目録第５４配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列である。

本発明の好ましい具現例によれば、前記軽鎖可変領域は、配列目録第５５配列のアミノ酸配列を含むものである。

本発明の好ましい具現例によれば、前記重鎖可変領域は、配列目録第５６配列、配列目録第５７配列、配列目録第５８配列、配列目録第５９配列、配列目録第６０配列、配列目録第６１配列、配列目録第６２配列、配列目録第６３配列、配列目録第６４配列、配列目録第６５配列、配列目録第６６配列及び配列目録第６７配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むものである。

本発明の他の態様によれば、本発明は、前記単一クローン抗体又はその断片をコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター又は該ベクターを含む宿主細胞を提供する。

本発明の核酸分子は、単離したものであるか、組み換えられたものでよく、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡ及びＲＮＡの他、対応する相補性配列も含まれる。「単離した核酸」とは、天然生成源泉から単離した核酸の場合、核酸の単離した個体のゲノムに存在する周辺遺伝配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的に又は化学的に合成された核酸、例えばＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドの場合、このような手順から生成された核酸が、単離した核酸分子と理解されてよい。単離した核酸分子は、別個の断片の形態又はより大きい核酸構築物の成分としての核酸分子を示す。核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置されるとき、「作動可能に連結」される。例えば、前配列又は分泌リーダ（ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡは、ポリペプチドが分泌される前の形態である前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現するとき、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーは、ポリペプチド配列の転写に影響を与えるとき、コーディング配列に作動可能に連結され、又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されるとき、コーディング配列に作動可能に連結される。一般に「作動可能に連結された」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接して位置することを意味し、分泌リーダの場合、隣接して同じリーディングフレーム内に存在するものを意味する。しかし、エンハンサーは隣接して位置する必要はない。連結は、便利な制限酵素部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを通常の方法によって用いる。

本明細書において用語「ベクター」とは、核酸配列を複製可能な細胞への導入のために核酸配列を挿入できる伝達体を意味する。核酸配列は、外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）でよい。ベクターとしては、プラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、バクテリオファージ）を挙げることができるが、これに制限されない。当業者は、標準的な組換え技術によってベクターを構築できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及びＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，Ｉｎ：ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＮＹ，１９９４等）。

本明細書において用語「発現ベクター」とは、転写される遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むベクターを意味する。一部の場合には、その後、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。発現ベクターには様々な調節配列を含むことができる。転写及び翻訳を調節する調節配列と共に、ベクター及び発現ベクターには他の機能も提供する核酸配列も含むことができる。

本明細書において用語「宿主細胞」とは、真核生物及び原核生物を含み、前記ベクターを複製できるか、或いはベクターによってコードされる遺伝子を発現できる、任意の形質転換可能な生物を意味する。宿主細胞は、前記ベクターによって形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）又は形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）され得るが、これは、外生の核酸分子が宿主細胞内に伝達又は導入される過程を意味する。

本発明の宿主細胞は、好ましくは、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などを挙げることができるが、これに制限されるものではない。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記抗体又はその断片、前記核酸分子又は前記ベクターを含む組成物を提供する。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組成物は、高血圧又は癌の予防又は治療用薬剤学的組成物である。

本発明の薬剤学的組成物は、（ａ）前記単一クローン抗体又はその断片、前記核酸分子又は前記核酸分子を含むベクター；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含むことができる。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、薬剤学的有効量の前記単一クローン抗体又はその断片、核酸分子又はベクターを対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む癌又は高血圧の治療方法を提供する。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、癌又は高血圧の治療用薬剤学的組成物の製造のための前記単一クローン抗体又はその断片、核酸分子又はベクターの用途を提供する。

本明細書において「投与する」とは、当業者に公知の様々な方法及び送達システムのいずれかを用いて、対象に、治療剤又は治療剤を含む組成物を物理的に導入することをいう。本明細書に提示された抗体のための好ましい投与経路は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊椎、又は他の非経口投与経路、例えば、注射や注入による経路を含む。本明細書に開示の「非経口投与」とは、腸及び局所投与以外の投与方式、一般に注射によることを意味し、限定されないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、脊椎腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、血内、経気管、皮下、皮膚下、関節内、嚢下、蜘蛛膜下、脊椎内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入、並びに生体内電気穿孔を含む。また、本明細書に提示された抗体は、非－非経口経路、例えば局所、上皮又は粘膜投与経路を通じて、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下又は局所経路によって投与されてもよい。投与はまた、例えば、１回、複数回、及び／又は１回以上の延長された期間にわたって行うことができる。

本明細書に開示の用語「治療する」及び「治療」は、疾患に関連した症状、合併症、状態又は生化学的指標の進行、発生、深刻度又は再発の逆転、軽減、緩和、阻害又は遅延や予防の目的下に対象に対して行われた、又は対象に活性剤を投与する任意の種類の介入や過程をいう。治療は、疾患を持つ対象又は疾患を持っていない対象（例えば、予防のために）に対して行うことができる。

本発明が予防又は治療しようとする癌の種類は制限されず、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）及び急性リンパ球白血病（ａｃｕｔｅｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性非リンパ球白血病（ａｃｕｔｅｎｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａｓ）、慢性リンパ球白血病（ｃｈｒｏｎｉｃｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性骨髄白血病（ｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓＤｉｓｅａｓｅ）、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓｌｙｍｐｈｏｍａｓ）及び多発骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅｍｙｅｌｏｍａ）などのようなリンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎｔｕｍｏｒｓ）、膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、横紋筋肉腫（Ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）、網膜芽細胞腫（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）、ウィルムス腫瘍（ＷｉｌｍｓＴｕｍｏｒ）、骨腫瘍（ｂｏｎｅｔｕｍｏｒｓ）及び軟部組織肉腫（ｓｏｆｔ－ｔｉｓｓｕｅｓａｒｃｏｍａｓ）などのような小児固形腫瘍（ｃｈｉｌｄｈｏｏｄｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒｓ）、肺癌（ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ）、尿路癌（ｕｒｉｎａｒｙｃａｎｃｅｒｓ）、子宮癌（ｕｔｅｒｉｎｅｃａｎｃｅｒｓ）、口腔癌（ｏｒａｌｃａｎｃｅｒｓ）、膵癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）及びその他皮膚癌（ｓｋｉｎｃａｎｃｅｒｓ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（ｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎｔｕｍｏｒｓ）、肝癌（ｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｇｅａｌｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄｃａｎｃｅｒ）、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｎｃｅｒ）及び精巣癌（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｃａｎｃｅｒ）などのような成人の通常の固形腫瘍（ｃｏｍｍｏｎｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒｓ）を含め、多数の癌を治療するように投与できる。

本明細書において、前記単一クローン抗体又はその断片、前記核酸分子又は該核酸分子を含むベクター、又はこれを含む薬剤学的組成物を投与しようとする対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば哺乳類及び非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両棲類、爬虫類などを含む。

本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に一般に用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他にも、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、好ましくは、非経口投与であり、例えば、静脈内注入、局所注入及び腹腔注入などで投与できる。

本発明の薬剤学的組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、熟練した通常の医師は、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇである。

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されてもよく、或いは多回容量容器内に内入して製造されてもよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、或いはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態でよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

本発明の薬剤学的組成物は、単独の療法で用いられてもよく、或いは、他の通常の化学療法又は放射療法と共に用いられてもよいが、このような併用療法を施す場合には、より効果的に癌治療ができる。本発明の組成物と併用可能な化学療法剤は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、トランスプラチン（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）及びメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などを含む。本発明の組成物と共に利用可能な放射療法は、Ｘ線照射及びγ線照射などである。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記単一クローン抗体又はその断片を処理する段階を含む、サンプル中に含まれたエンドセリン受容体Ａ（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＡ）の定量方法を提供する。

本発明の抗体又はその断片は、エンドセリン受容体Ａに特異的に結合するので、これを用いれば、サンプル中に含まれたエンドセリン受容体Ａの量を正確に測定することができる。

本発明のさらに他の態様によれば、下記の段階を含むエンドセリン受容体Ａ（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＡ）の過発現による疾患の診断のための情報を提供する方法を提供する：
（ａ）被検者から体外に分離されたサンプルを取得する段階；
（ｂ）前記単一クローン抗体又はその断片を前記サンプルに処理する段階；及び
（ｃ）前記被検者のサンプル中に含まれたエンドセリン受容体Ａの発現量が、正常群サンプル中に含まれたエンドセリン受容体Ａの発現量よりも高いか否か確認する段階。

エンドセリン受容体Ａは、リガンドであるＥＴ－１の結合によって血管収縮作用をし（Ｎａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗｓｄｒｕｇｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１１，Ｖｏｌ．１０，４７）；膀胱癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌、横紋筋肉腫、膠芽細胞腫などの様々な癌で過発現し、癌細胞の増殖、移動、侵入、転移、血管新生成などの主要癌進行過程に直接関与（Ｎａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗｃａｎｃｅｒ，２０１３，Ｖｏｌ．１３，６３７）するので、前記エンドセリン受容体Ａの発現量を正常人のそれと比較することによって、エンドセリン受容体Ａの過発現による疾患の診断のための情報を提供することができる。

本発明の好ましい具現例によれば、前記エンドセリン受容体Ａの過発現による疾患は、癌又は高血圧である。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記単一クローン抗体又はその断片を含むエンドセリン受容体Ａ（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＡ）定量キットを提供する。

本発明の定量キットは、抗原抗体結合反応を用いて前記抗体に対する抗原を分析することによってエンドセリン受容体Ａ量を定量でき、前記抗原抗体結合反応は、通常のＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｎｏａｓｓａｙ）、サンドウィッチ測定法（Ｓａｎｄｗｉｃｈａｓｓａｙ）、ポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）、免疫ブロット分析（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔａｓｓａｙ）及び免疫組織化学染色方法（Ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇ）からなる群から選ばれることが好ましいが、これに制限されない。

抗原－抗体結合反応のための固定体としては、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、ポリビニル（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）樹脂又はポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート（Ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）及びガラスでできたスライドグラス（Ｓｌｉｄｅｇｌａｓｓ）からなる群から選ばれるものを用いることができるが、これに制限されない。

前記２次抗体は、発色反応をする通常の発色剤で標識されることが好ましく、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリ性リン酸分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（Ｃｏｌｏｉｄｇｏｌｄ）、ＦＩＴＣ（ＰｏｌｙＬ－ｌｙｓｉｎｅ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＲＩＴＣ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｂ－ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）などの蛍光物質（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及び色素（Ｄｙｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つの標識体を用いることができる。発色を誘導する基質は、発色反応をする標識体に応じて使用することが好ましく、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ［２，２’－ａｚｉｎｏ－ｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）］及びＯＰＤ（ｏｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つを使用することが好ましいが、これに制限されない。

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ｉ）本発明は、エンドセリン受容体Ａの細胞外部位を抗原として認識してそれに特異的に結合する単一クローン抗体又はその断片を提供する。

（ｉｉ）また、本発明は、前記単一クローン抗体又はその断片、前記核酸分子又は前記ベクターを含む癌又は高血圧の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。

（ｉｉｉ）本発明の単一クローン抗体は、エンドセリン受容体Ａの信号伝達過程を抑制する機能を示し、この機能を用いて、エンドセリン受容体Ａが関与する高血圧又は癌に対する治療剤として有用に活用することができる。

親和度成熟バクテリオファージ抗体ライブラリーの構築された結果を示す。ＥＴ_Ａに選択的結合する発掘抗体の配列を示す。発現したＩｇＧの構造を示す。動物細胞で発現した発掘抗体の精製結果を示す。２００ｎＭの発掘抗体濃度でＥＴ_Ａが発現した動物細胞ＣＨＯ－Ｋ１細胞に１０ｎＭのＥＴ－１によって誘発された信号伝達の阻害能を示すグラフである。２００ｎＭの発掘抗体濃度でＥＴ_Ａが過発現した大腸癌細胞株であるＨＴ－２９細胞に１０ｎＭのＥＴ－１によって誘発された信号伝達の阻害能を示すグラフである。２５ｎＭ、２００ｎＭの発掘抗体濃度でＥＴ_Ａが過発現した大腸癌細胞株であるＨＣＴ－１１６細胞に１０ｎＭのＥＴ－１によって誘発された信号伝達の阻害能を示すグラフである。リード（Ｌｅａｄ）抗体５種に対する活性型ヒトＥＴ_ＡとネズミＥＴ_Ａ間の交差結合能を示すグラフである。ＥＴ_Ａ過発現大腸癌細胞株であるＨＣＴ－１１６に発掘抗体の大腸癌細胞増殖抑制効果を示すグラフである。ＥＴ_Ａ過発現大腸癌細胞株であるＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６に対するＬｅａｄ抗体５種の大腸癌細胞増殖抑制効果を示すグラフである。大腸癌細胞株ＨＴ－２９から作製された異種移植モデルに対するリード抗体５種の大腸癌成長抑制効果を示すグラフである。リード抗体５種のＳＥＣ（Ｓｉｚｅ－ＥｘｃｌｕｓｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）－ＨＰＬＣの分析結果を示す。リード抗体５種の糖鎖構造分析の結果を示す。リード抗体５種の重さ分析結果を示す。リード抗体５種の熱安定性分析結果を示す。発掘抗体処理によるＥＴＡ信号伝達過程の産物であるＥＲＫ、ＡＫＴのレベル減少を示す結果である。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないということが、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

実施例
＜実施例１＞ＥＴ_Ａ特異的結合抗体クローン配列（ＡＧ８）を用いたバクテリオファージ抗体ライブラリーの構築
発掘されたＥＴ_Ａ特異的結合抗体（ＡＧ８、韓国特許登録番号第１０－２０１４３８３号）配列に基づいて、既存ターゲット抗原に対する結合力と効能が向上した抗体発掘のためのライブラリーを作製するために、抗原－抗体結合において重要な役割を担うものと知られたＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓ）のうち、抗体の重鎖（Ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ）のＣＤＲ３番目の配列区間における１３個のアミノ酸配列を無作為に全アミノ酸２０種が置換されるように縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ）ＮＮＫコドンを用いた親和度成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）ライブラリーを作製した。ＰＣＲ技法を用いた抗体ライブラリー作製のためのＤＮＡプライマーの設計とＤＮＡ遺伝配列増幅及びライブラリー構築は、ＭａｎｆｒｅｄＴＲｅｅｔｚ＆Ｊｏｓｅ’ ＤａｎｉｅｌＣａｒｂａｌｌｅｉｒａ論文（ＭａｎｆｒｅｄＴＲｅｅｔｚ＆Ｊｏｓｅ’ ＤａｎｉｅｌＣａｒｂａｌｌｅｉｒａ，Ｉｔｅｒａｔｉｖｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＩＳＭ）ｆｏｒｒａｐｉｄｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｎｚｙｍｅｓ，ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，２（４）、８９１－９０３．）とＦｒａｎｃｅｓＨ．Ａｒｎｏｌｄ＆ＧｅｏｒｇｅＧｅｏｒｇｉｏｕの著書（ＤｉｒｅｃｔｅｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎＬｉｂｒａｒｙＣｒｅａｔｉｏｎ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａｐｒｅｓｓ，２０１０）を参照した。より詳細には、既存の先行特許出願ＡＧ８遺伝配列において抗体の構造をなす重鎖フレームワークとＣＤＲ１及びＣＤＲ２区間の遺伝子配列、軽鎖（Ｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ）のフレームワークとＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は保存し、重鎖のＣＤＲ３配列だけを無作為に２０余種のアミノ酸が置換されるようにプライマーを作製し、遺伝子増幅、クローニング技法などを用いて親和度成熟抗体ライブラリープラスミドＤＮＡを作製した。その後、ＥＴ_Ａに選択的結合力を示す抗体を、ファージディスプレイ技術を用いて選別するために、大腸菌ＥＲ２７３８に、作製された親和度成熟抗体ライブラリーのプラスミドＤＮＡを形質転換して親和度成熟バクテリオファージ抗体ライブラリーを構築し、作製された抗体ライブラリーから無作為に選択されたクローンの遺伝配列分析結果を図１に示した。

ライブラリー作製に用いられた縮重（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ）ＮＮＫプライマー配列（‘５－＞３’）

無作為選択による作製されたライブラリーの配列分析（アミノ酸配列）

無作為選択による作製されたライブラリーの配列分析（ヌクレオチド配列）
＜実施例２＞発掘されたＥＴ_Ａ特異的抗体の全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）ＩｇＧ形態への転換、動物細胞における発現及び精製
作製された抗体ライブラリーを用いてＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒｐｈａｇｅ）によってライブラリーを用いたファージを生成後に、磁性を用いたバイオパンニングの方法によって細胞外膜に選択的な抗体を発掘してその遺伝子配列を分析し、結果を図２に示した。発掘抗体の動物細胞発現、精製及び安定化のための免疫グロブリン（ＩｇＧ）形態への転換は、Ｍａｚｏｒ，Ｙの論文（Ｍａｚｏｒ，Ｙ．，Ｂａｒｎｅａ，Ｉ．，Ｋｅｙｄａｒ，Ｉ．，＆Ｂｅｎｈａｒ，Ｉ．（２００７）。ＡｎｔｉｂｏｄｙｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎｓｔｕｄｉｅｄｕｓｉｎｇａｎｏｖｅｌＩｇＧｂｉｎｄｉｎｇｔｏｘｉｎｆｕｓｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，３２１（１－２），４１－５９．）を参照して発現ベクターを準備し、動物細胞内で発現及び精製した。この時に形成された抗体の構造は、図３に示した。動物細胞で発現させ、親和度クロマトグラフィーを用いて高純度に精製したタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果は、図４に示した。

ＥＴ_Ａによる細胞信号伝達阻害能を示す５種の抗体ｓｃＦｖ配列（アミノ酸配列）

ＥＴ_Ａによる細胞信号伝達阻害能を示す５種の抗体ｓｃＦｖ配列（ヌクレオチド配列）

発掘された抗体の重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列と軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列

発掘された抗体の重鎖のＣＤＲ３配列（ＨＣＤＲ３）

発掘された抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列

発掘された抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）配列
＜実施例３＞ヒト由来ＥＴ_Ａ発現動物細胞を用いた発掘されたＥＴ_Ａ特異的抗体の信号伝達過程阻害能確認
Ｆｕｒａ－２－ＡＭ蛍光染料（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を用いた細胞質内Ｃａ^２＋濃度測定によってＥＴ_ＡのＥＴ－１による信号伝達過程を測定するために、１０^５個のＥＴ_Ａ発現動物細胞株（ＥＴ_ＡｅｘｐｒｅｓｓｅｄＣＨＯ－Ｋ１ｓｔａｂｌｅｃｅｌｌｌｉｎｅ，ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）に、５μＭのＦｕｒａ－２－ＡＭ蛍光染料と図５で精製された抗体を濃度別に処理した後、１０ｎＭのＥＴ－１で信号伝達過程を誘発し、蛍光分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ，ＵＳＡ）を用いて励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）波長３４０ｎｍ、３８０ｎｍによる５１０ｎｍ放出（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）波長において蛍光の比（Ｅｍｉｓｓｉｏｎｂｙ３４０ｎｍｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／Ｅｍｉｓｓｉｏｎｂｙ３８０ｎｍｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）を測定することによって、細胞質内Ｃａ^２＋濃度を分析し、図５に示すように、発掘抗体の、細胞内ＥＴ_Ａの信号伝達過程における阻害能効率を導出した。

＜実施例４＞発掘されたＥＴ_Ａ特異的抗体の大腸癌細胞におけるＥＴ_Ａ信号伝達阻害確認及び５種のリード（Ｌｅａｄ）抗体選定
大腸癌細胞株であるＨＴ－２９とＨＣＴ－１１６を韓国細胞株銀行（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）から受けて使用し、発掘抗体のＨＴ－２９大腸癌細胞におけるＥＴ_Ａ信号伝達過程阻害能確認は、実施例３と同じ方法を用いて図６のような結果を導出し、ＨＣＴ－１１６大腸癌細胞におけるＥＴ_Ａ信号伝達過程阻害能確認は、実施例３と同じ条件で発掘抗体をそれぞれ２５ｎＭ、２００ｎＭで処理して図７のような結果を導出し、発掘抗体のＥＴ_Ａの信号伝達過程阻害能を確認した。図６及び図７に示すように、発掘された抗体はＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６大腸癌細胞株においてＥＴ－１によるＥＴ_Ａの信号伝達過程を阻害する拮抗効果（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｅｆｆｅｃｔ）を示すことを確認した。上の図５、図６及び図７に示した結果のように、ヒト由来ＥＴ_Ａ発現細胞と過発現癌細胞であるＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６において共通にＥＴ_Ａ活性による信号伝達過程を阻害する効能を示す４種の抗体（ＧＧ１２、ＡＢ９、ＥＦ１２及びＦＧ１２）を最終的に検証及び発掘して確保した。

＜実施例５＞５種リード抗体のヒト／ネズミＥＴ_Ａ間交差結合能確認
リード抗体（ＡＧ８、ＡＢ９、ＥＦ１２、ＦＧ１２及びＧＧ１２）の医薬品開発のために適切な動物モデルを選定するために、他の種のＥＴ_Ａの細胞外部位配列をヒトＥＴ_Ａの細胞外部位と比較分析した。分析の結果、ネズミのＥＴ_Ａは、細胞外部位であるＮ末端、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｏｐ１、２、３の各領域のアミノ酸一致率は、平均して約８０％以上であると分析された。分析された結果に基づき、既存の特許（韓国特許登録番号第１０－２０１４３８３号）に記述したように、ネズミＥＴ_Ａ配列を発現ベクターでクローニングし、大腸菌条件下で活性型ネズミＥＴＡを発現精製し、ＥＬＩＳＡ技法を用いて発掘抗体のヒト／ネズミＥＴ_Ａにおける交差結合能を実験し、結果を図８に示した。図８に見られるように、発掘された抗体は、活性型ヒトＥＴ_Ａで有する結合能を活性型ネズミＥＴＡにおいても非常に類似に有することを確認した。

＜実施例６＞発掘されたリード抗体５種の大腸癌細胞における増殖抑制効能確認
大腸癌細胞研究においてＨＴ－２９細胞株と共に多く使用されているＨＣＴ－１１６細胞株において、ＥＴ－１が存在する条件でも発掘抗体の大腸癌細胞増殖力抑制効能があるか確認した。ＣｙＱＵＡＮＴＮＦ蛍光染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて細胞内ＤＮＡ量の測定を行って細胞の増殖度を確認した。ＨＣＴ－１１６細胞株に、精製された発掘抗体を濃度別に処理し、３７℃細胞培養器で１時間共に培養させた後、接種して７２時間後にＣｙＱＵＡＮＴＮＦ蛍光染料を処理し、蛍光分光光度計（ＴＥＣＡＮ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて励起波長４８５ｎｍによる放出蛍光の比（Ｅｍｉｓｓｉｏｎｂｙ４８５ｎｍｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）を測定することによって細胞内ＤＮＡ量を測定し、発掘抗体がＥＴ_Ａ細胞外部位に結合して大腸癌細胞の増殖力を抑制できるか否かを確認し、図９のような結果を導出した。図９に見られるように、本願発明の抗体は、ＨＣＴ－１１６大腸癌細胞株においてＥＴ－１によるＥＴ_Ａの増殖力増加を阻害する効果を示している。この結果から、本願発明の抗体は、大腸癌細胞の増殖を効果的に阻害する活性があることを確認した。ＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６大腸癌細胞株において、リード抗体５種の大腸癌細胞増殖抑制の確認には上述（実施例６）と同じ方法を用い、図１０のような結果を導出した。図１０に見られるように、本願発明のリード抗体５種は、ＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６大腸癌細胞株の増殖を効果的に阻害する効果を示している。この結果から、本願発明のリード抗体５種は、大腸癌細胞の増殖を効果的に阻害する活性があることを確認した。

＜実施例７＞発掘されたリード抗体５種の大腸癌動物モデルでの抗癌有効性確認
ＢＡＬＢ／ヌードマウスを用いて腹部（ｆｌａｎｋｓｒｅｇｉｏｎ）に大腸癌ＨＴ－２９細胞株を皮下注射した（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデルを作り、本願発明のリード抗体５種を２５μｇ注射して抗癌有効性検証のための実験を進行し、図１１のような結果を導出した。図１１に見られるように、本願発明のリード抗体５種は、ＨＴ－２９大腸癌細胞株の異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデルにおいて大腸癌の成長を阻害する効果を示している。この結果から、本願発明のリード抗体５種は、大腸癌細胞の増殖を動物モデルにおいても効果的に阻害する活性があり、治療剤として効能があることを確認した。

＜実施例８＞発掘されたリード抗体５種の大腸癌動物モデルでの抗癌有効性確認
図１２に見られるように、５種の発掘抗体は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣで分離した結果、凝集された％が１０％以下と示されたことを確認した。図１３に見られるように、糖鎖の構造を分析した結果、発掘された抗体の糖鎖構造は、ヒトＩｇＧ標準と大差がなかった。図１４は、発掘された抗体のサイズが理論値と一致するかを分析したものであり、凡そ５Ｄａ内で配列と同じ結果を示した。熱安定性を確認するために、５種の発掘抗体をｐＨ４～８の緩衝溶液（緩衝溶液として、酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅ）、クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ）、リン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、ＭＥＳ、コハク酸塩（Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、ＨＥＰＥＳ、トリス（Ｔｒｉｓ）、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、ＰＢＳを使用する。）で緩衝溶液置換（ｂｕｆｆｅｒｅｘｃｈａｎｇｅ）を行った。緩衝溶液置換後、抗体の濃度は１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、濃縮された発掘抗体に、タンパク質の構造変化が予測できる蛍光である１０００Ｘｐｒｏｔｅｉｎｔｈｅｒｍａｌｓｈｉｆｔ^ＴＭ染料（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を最終濃度１Ｘに希釈されるように入れた。ＶｉｉＡ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、マニュアル（ＰｒｏｔｅｉｎＴｈｅｒｍａｌ^ＴＭＳｔｕｄｉｅｓ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にしたがって熱安定性分析を行った。ｐＨによる熱安定性分析結果は、図１５に示した。

＜実施例９＞発掘されたリード抗体５種の大腸癌細胞でのＥＴ_Ａ信号伝達阻害機序確認
発掘抗体のＨＣＴ－１１６大腸癌細胞におけるＥＴ_Ａ信号伝達過程阻害能の確認は、ＥＴ_Ａ信号伝達過程の最終活性産物であるＥＲＫとＡＫＴタンパク質のリン酸化を免疫ブロッティング（Ｉｍｍｕｎｉｂｌｏｔａｓｓａｙ）方法を用いて確認し、図１６のような結果を導出した。図１６に見られるように、本願発明の抗体は、ＨＣＴ－１１６大腸癌細胞株においてＥＴ－１によるＥＴ_Ａ信号伝達過程の最終活性産物であるＥＲＫとＡＫＴタンパク質のリン酸化を阻害する拮抗（ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）効果を示している。このことから、発掘抗体はＥＴ_Ａの信号伝達過程を効果的に抑制する活性があることを確認した。

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい具現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びその等価物によって定義されるといえよう。

Claims

エンドセリン受容体Ａ（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＡ）の細胞外部位を抗原として認識してそれに特異的に結合する単一クローン抗体又はその抗原－結合断片であって、
前記単一クローン抗体又はその抗原－結合断片は、重鎖可変領域に、配列番号３８の配列のＣＤＲ１、配列番号３９の配列のＣＤＲ２を含み、軽鎖可変領域に、配列番号４０の配列のＣＤＲ１、配列番号４１の配列のＣＤＲ２及び配列番号４２の配列のＣＤＲ３を含み、
前記単一クローン抗体又はその抗原－結合断片の重鎖可変領域におけるＣＤＲ３は、配列番号４３の配列であるか、配列番号４３の配列から４番目のアミノ酸がＰ（プロリン）に；７番目のアミノ酸がＬ（ロイシン）に；９番目のアミノ酸がＶ（バリン）に；１０番目のアミノ酸がＩ（イソロイシン）又はＨ（ヒスチジン）に；１１番目のアミノ酸がＦ（フェニルアラニン）又はＱ（グルタミン）に；１２番目のアミノ酸がＥ（グルタメート）に；１３番目のアミノ酸がＮ（アスパラギン）又はＣ（システイン）に；又は１４番目のアミノ酸がＬ（ロイシン）に置換された突然変異を含むことを特徴とする、単一クローン抗体又はその抗原－結合断片。
前記重鎖可変領域におけるＣＤＲ３は、配列番号４４の配列、配列番号４５の配列、配列番号４６の配列、配列番号４７の配列、配列番号４８の配列、配列番号４９の配列、配列番号５０の配列、配列番号５１の配列、配列番号５２の配列、配列番号５３の配列及び配列番号５４の配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその抗原－結合断片。
前記軽鎖可変領域は、配列番号５５の配列のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその抗原－結合断片。
前記重鎖可変領域は、配列番号５６の配列、配列番号５７の配列、配列番号５８の配列、配列番号５９の配列、配列番号６０の配列、配列番号６１の配列、配列番号６２の配列、配列番号６３の配列、配列番号６４の配列、配列番号６５の配列、配列番号６６の配列及び配列番号６７の配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその抗原－結合断片。
前記エンドセリン受容体Ａは、配列番号６８の配列のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその抗原－結合断片。
前記細胞外部位は、配列番号６９の配列のＮ－ｔｅｒｍ部位、配列番号７０の配列のＥＣＬ１、配列番号７１の配列のＥＣＬ２及び配列番号７２の配列のＥＣＬ３からなる群から選ばれる１つ又はそれ以上の部位であることを特徴とする、請求項１に記載の単一クローン抗体又はその抗原－結合断片。
請求項１の単一クローン抗体又はその抗原－結合断片をコードする核酸分子。
請求項７の核酸分子を含むベクター。
請求項８のベクターを含む宿主細胞。
請求項１の単一クローン抗体又はその抗原－結合断片、請求項７の核酸分子、又は請求項８のベクターを含む、癌の予防又は治療用薬剤学的組成物。
請求項１の単一クローン抗体又はその抗原－結合断片、請求項７の核酸分子、又は請求項８のベクターを含む高血圧の予防又は治療用薬剤学的組成物。
薬剤学的有効量の請求項１の単一クローン抗体又はその抗原－結合断片、請求項７の核酸分子又は請求項８のベクターを非ヒト動物である対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む、癌又は高血圧の治療方法。
癌又は高血圧の治療用薬剤学的組成物の製造のための請求項１の単一クローン抗体又はその抗原－結合断片、請求項７の核酸分子、又は請求項８のベクターの使用。
（ａ）被検者から体外に分離されたサンプルを取得する段階；及び
（ｂ）請求項１の単一クローン抗体又はその抗原－結合断片を前記サンプルに接種する段階を含む、サンプル中に含まれたエンドセリン受容体Ａ（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＡ）の定量方法。
下記の段階を含むエンドセリン受容体Ａ（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＡ）の過発現による疾患の診断のための情報を提供する方法：
（ａ）被検者から体外に分離されたサンプルを取得する段階；
（ｂ）請求項１の単一クローン抗体又はその抗原－結合断片を前記サンプルに接種する段階；及び
（ｃ）前記被検者のサンプル中に含まれたエンドセリン受容体Ａの発現量が正常群サンプル中に含まれたエンドセリン受容体Ａの発現量よりも高いか否か確認する段階。
前記エンドセリン受容体Ａの過発現による疾患は、癌又は高血圧であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
請求項１の単一クローン抗体又はその抗原－結合断片を含むエンドセリン受容体Ａ（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＡ）定量キット。