JP7122361B2 - 抗Aggrusモノクローナル抗体、CLEC-2との結合に必要なAggrusの領域、及びAggrus-CLEC‐2結合阻害剤のスクリーニング方法 - Google Patents
抗Aggrusモノクローナル抗体、CLEC-2との結合に必要なAggrusの領域、及びAggrus-CLEC‐2結合阻害剤のスクリーニング方法 Download PDFInfo
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Description
(2)受託番号NITE BP-03041(PG4D1)、又はNITE BP-03042(PG4D2)のハイブリドーマにより産生される、(1)記載のモノクローナル抗体、又はその機能的断片からなるフラグメント。
(3)キメラ化又はヒト化された(1)記載のモノクローナル抗体、又はその機能的断片からなるフラグメント。
(4)受託番号NITE BP-03041、又はNITE BP-03042のハイブリドーマ。
(5)(1)~(3)のいずれか1項記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含むAggrus-CLEC‐2結合阻害剤。
(6)さらに配列番号2(GAEDDVVTPGTSEDRYK)により表される領域に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体、そのキメラ化抗体、そのヒト化抗体、及び/又はその機能的断片からなるフラグメントを少なくとも1つ含むことを特徴とする(5)記載のAggrus-CLEC‐2結合阻害剤。
(7)前記配列番号2の領域に存在するエピトープを認識する前記モノクローナル抗体が、P2-0、MS-1、MS-3、及び/又はMS-4であることを特徴とする(6)記載のAggrus-CLEC‐2結合阻害剤。
(8)(1)~(3)のいずれか1項記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含む血小板凝集抑制、血栓抑制、がん進展・転移抑制、抗炎症のための医薬組成物。
(9)さらに配列番号2(GAEDDVVTPGTSEDRYK)により表される領域に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体、そのキメラ化抗体、そのヒト化抗体、及び/又はその機能的断片からなるフラグメントを少なくとも1つ含むことを特徴とする(8)記載の医薬組成物。
(10)前記配列番号2の領域に存在するエピトープを認識する前記モノクローナル抗体が、P2-0、MS-1、MS-3、及び/又はMS-4であることを特徴とする(9)記載の医薬組成物。
(11)(1)~(3)のいずれか1項記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片からなるフラグメントを含むAggrus発現を検出するための検査用試薬。
(12)CLEC‐2の結合に必要なPLAG4ドメインと重複するAggrusの領域であって、配列番号1(GIRIEDLPT)により表されることを特徴とする領域。
(13)(12)記載のCLEC‐2の結合に必要なPLAG4ドメインと重複するAggrusの領域であって、前記アミノ酸配列が配列番号3(RIEDL)により表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする領域。
(14)(12)、又は(13)の領域を含むペプチドからなるAggrus-CLEC‐2結合阻害剤。
(15)(12)、又は(13)の領域を含むペプチドを有効成分とする血小板凝集抑制、血栓抑制、がん進展・転移抑制、抗炎症のための医薬組成物。
(16)CLEC‐2とAggrusの結合阻害剤のスクリーニング方法であって、配列番号1(GIRIEDLPT)により表されるアミノ酸配列のうち少なくとも5残基の配列からなるAggrusエピトープへの結合を指標とすることを特徴とする阻害剤スクリーニング方法。
(17)(16)記載のスクリーニング方法であって、配列番号3(RIEDL)により表されるアミノ酸配列への結合を指標とすることを特徴とする阻害剤スクリーニング方法。
(18)CLEC‐2とAggrusの結合阻害剤のスクリーニング方法であって、配列番号4(EDXXTS)により表されるアミノ酸配列への結合を指標とすることを特徴とする阻害剤スクリーニング方法。
以下、実施例を示しながら、本発明を詳細に説明する。
本発明者らはすでに、CLEC‐2との結合を阻害し、血小板凝集抑制作用、及びがん転移抑制作用のある抗Aggrusモノクローナル抗体を開示している(特許文献2、非特許文献20)。これらモノクローナル抗体のエピトープは、PLAG2、PLAG3ドメインにわたる領域を認識する抗体であった。
(1)CLEC‐2結合におけるAggrusの48番目のアスパラギン酸の役割検討
CHO細胞に、ヒトAggrus及びその変異体cDNAを組み込んだプラスミドを導入して、48番目のアスパラギン酸の役割の検討を行った。上記で作製した野生型Aggrus発現細胞株CHO/Aggrus-WT及びその変異体発現CHO細胞株CHO/AggrusD48A、及び48番目のアスパラギン酸をグルタミン酸に置換したCHO/Aggrus-D48E、アスパラギンに置換したCHO/Aggrus-D48Nを用い、FACS法によりCLEC‐2との反応性を検討した。
上述のようにCLEC‐2は、Aggrusと結合する血小板上のレセプターである。Aggrusは血小板上のCLEC‐2と結合することで血小板凝集誘導シグナルを伝達する。CLEC‐2との結合が弱くなったD48A変異体(CHO/Aggrus-D48A)は血小板凝集誘導活性が弱くなることが予想されたため、血小板凝集抑制試験で確認した。具体的には、MCM HEMA TRACER 313M(エム・シー・メディカル社製)を用いて分析を行った。該分析法は光透過率のモニタリングによるマウス洗浄血小板を用いたin vitro血小板凝集分析法である。
哺乳類の系統樹(図3A下パネル)から、ヒト(Homo sapiens、配列番号5)、ボノボ(Pan paniscus、配列番号6)、アカゲザル(Macaca mulatta、配列番号7)、ブタ(Sus scrofa、配列番号8)、マッコウクジラ(Physeter catodon、配列番号9)、ウシ(Bos Taurus、配列番号10)、イヌ(Canis lupus familiaris、配列番号11)、コウモリ(Myotis
brandtii、配列番号12)、ラット(Rattus norvengicus、配列番号13)、マウス(Mus musculus、配列番号14)のAggrusタンパク質のアミノ酸配列の相同性を検討した。
(1)樹立したAggrus変異体の発現量検討
新規のPLAGドメインであると推定されたPLAG4ドメイン内にアミノ酸変異を有するPLAG4変異体をCHO細胞に遺伝子導入した。具体的には、pcDNA3ベクターにPLAG4領域内のアミノ酸である82番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したヒトAggrus cDNAを組み込んだプラスミド(Aggrus-D82A)、48番目のアスパラギン酸と82番目のアスパラギン酸を共にアラニンに置換したヒトAggrus cDNAを組み込んだプラスミド(Aggrus-D48A/D82A)をCHO細胞に導入し、タンパク質を安定的に発現させた。各プラスミドを導入したCHO細胞は以下、CHO/Aggrus-D82A、CHO/Aggrus-D48A/D82Aという。
これらCHOの遺伝子安定発現株を用いて、実施例2と同様に、FACS法によりAggrus発現量の確認とCLEC‐2との反応性を検討した。図4B左パネルは、図2Aと同様に、白抜きの山がD2-40抗体を反応させて野生型Aggrus、又はAggrus変異体を染色した結果を、黒く塗りつぶした山は、D2-40抗体の代わりにコントロールマウス抗体(シグマ社製)を反応させた結果を示している。図4B(左パネル)に示すように、Aggrusタンパク質の各遺伝子導入株における細胞膜上での発現レベルがほぼ一致していることが、各パネルの白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度がほぼ同じであることからも確認された。
PLAG4ドメインがCLEC‐2との結合に重要な役割を担っていることが明らかになったことから、次にPLAG4ドメインの血小板凝集における役割を検討した。上述のように、Aggrusは血小板上のCLEC‐2と結合することで血小板凝集誘導シグナルを伝達する。PLAG4ドメイン内のアミノ酸変異が血小板凝集を抑制するか、実施例2に記載の血小板凝集抑制試験によって、Aggrus依存的な血小板凝集の誘導活性を検討した。結果を図4Cに示す。
(1)PLAG3とPLAG4のCLEC‐2との結合における役割検討
Aggrus発現量とCLEC‐2との反応性を定量的に解析した。具体的には、実施例4(図4B参照)で行ったFACS法を用いたAggrus発現量の確認とCLEC‐2との反応性の検討を3回繰り返して行い平均化した。CHO/Aggrus-WTの白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度の平均値を1とした時の、Aggrus変異体タンパク質の発現量をグラフに示す。Aggrus野生型の発現量と比較した統計解析の結果、Aggrus変異体タンパク質(D48A、D82A、D48A/D82A)の発現量に有意差はつかず(nsと表記)、発現量がほぼ揃っていることが示された(図5A、左パネル)。また、CLEC‐2との反応性を示す白抜きの山で示す頂点の位置の蛍光強度の平均値を1とした時のAggrus変異体タンパク質のCLEC‐2との反応性をグラフに示した。Aggrus野生型のCLEC‐2との反応性を1とすると、Aggrus変異体タンパク質(D48A、D82A、D48A/D82A)のCLEC‐2との反応性は有意に減少(**,P<0.01;***,P<0.001)していることが示され(図5A、右パネル)、実施例4の結果が再現された。
次に、CHO/mock、CHO/Aggrus-WT、CHO/Aggrus-D48A、CHO/Aggrus-D82A、CHO/Aggrus-D48A/D82A変異体発現細胞を用い、実施例2と同様にして各変異体発現細胞の血小板凝集能を検討した。各変異体発現細胞の血小板凝集誘導活性は、CLEC‐2との結合力に比例し、D82A変異体はD48A変異体よりも血小板凝集誘導活性が弱いという図4Cの再現性が確認された。さらに、D48A/D82A二重変異体発現細胞はCHO/mockと同様に血小板凝集誘導活性を示さないことが明らかとなった(図5C)。よって、新規に同定したPLAG4は、Aggrus依存的な血小板凝集に主要な役割を果たしていることが再確認された。
新規に同定したPLAG4ドメインには、PLAG3ドメインに類似したEDXXTモチーフが存在する。PLAG4ドメイン中の81番目のグルタミン酸(E)、82番目のアスパラギン酸(D)、85番目のスレオニン(T)(図6B(右パネル、下線を引いたアミノ酸))のCLEC‐2との結合への直接的な関与を解析した。pcDNA3ベクターに81番目のグルタミン酸をアラニンに置換したヒトAggrus cDNAを組み込んだプラスミドを導入したCHO細胞(CHO/Aggrus-E81A)、82番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したヒトAggrus cDNAを組み込んだプラスミドを導入したCHO細胞(CHO/Aggrus-D82A)、85番目のスレオニンをアラニンに置換したヒトAggrus cDNAを組み込んだプラスミドを導入したCHO細胞(CHO/Aggrus-T85A)を用いてFACSにより解析した。なお、コントロールとして、野生型ヒトAggrus cDNAを組み込んだプラスミドを導入したCHO細胞(CHO/AggrusーWT)、および、PLAG3ドメイン中の47番目のグルタミン酸、48番目のアスパラギン酸、52番目のスレオニン(図6A(右パネル、下線を引いたアミノ酸))を各々アラニンに置換したヒトAggrus cDNAを組み込んだプラスミドを導入したCHO細胞(CHO/Aggrus-E47A、CHO/Aggrus-D48A、CHO/Aggrus-T52A)も作製し、同様に解析した。
以下のようにして、PLAG4ドメインを認識する抗ヒトAggrusモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製した。
ヒトAggrus cDNAの76番目のスレオニン残基から89番目のスレオニン残基(配列:Thr Gly Ile Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Ser Glu Ser Thr)までの部位を12回または40回繰り返したものをpGEX-6P3ベクター(GE Healthcare社製)にクローニングし、GSTタグ付きの免疫原を得た。このプラスミドで大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、発現されたGSTタグ融合組換えタンパク質をGlutathione Sepharoseにて精製した。
6週齢の雌性BALB/cマウス(日本チャールズリバーより購入)に、得られた免疫原100μg/匹とTiterMax Gold(TiterMax USA社製)の混和溶液を頸部皮下投与した。追加免疫のために、隔週で免疫原100μg/匹を腹腔内に計9回投与した。また、一部の感作においては、雌性BDF-1マウス(日本クレアより購入)の尾根部に2回投与する方法で検討した。
常法に従って、免疫したマウスより脾臓細胞または腸骨リンパ節細胞を採取し、ポリエチレングリコール4000を用いて、マウスミエローマ細胞株P3U1と融合させた。ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含むエスクローン クローニングメディュウム(エーディア株式会社製)中で培養することで、融合したハイブリドーマを増殖させ、PLAG4ドメイン領域に対する抗体を産生するPG4D1とPG4D2を含む複数個のハイブリドーマを樹立させることに成功した。腸骨リンパ節細胞からは、6G42A4と9D62D6を含む複数個のハイブリドーマを樹立させることに成功した。
(1)エピトープの探索
ヒトAggrus cDNAからシグナルペプチド部位を含むアミノ末端24アミノ酸を除去したものをpGEX-6P-3ベクターへクローニングしてGSTタグ付きの野生型Aggrusタンパク質発現ベクターを作製した。以下、発現した組換えタンパク質をΔN24-WTという。また、免疫原である76から89番目のアミノ酸に相当するコドンをQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technology社製)を用いて1ヶ所ずつアラニンをコードするコドンへと置換し、アラニン変異型Aggrus発現ベクターを作製した。以下、組換え変異体は、例えば76番目のアミノ酸であるスレオニン(T)をアラニン(A)に変異させたものであれば、ΔN24-T76Aのように表記する。
哺乳類細胞で発現しているヒトAggrusは、大腸菌に発現させたAggrusとは異なり、多数の糖鎖が付加されていることが知られている。新規に創製されたPG4D1抗体とPG4D2抗体の哺乳類細胞で発現しているヒトAggrusへの反応性を、表面プラズモン共鳴解析装置Biacore X100(GE Healthcare社製)を用いて検討した。カルボキシメチルデキストランコート処理が施されたセンサーチップCM5上にアミンカップリング法にて哺乳動物細胞から市販の精製組換えAggrusタンパク質(ヒトIgG1 Fcタグ付きのタンパク質:R&D Systems社製)を固定化し、520RU(PG4D1抗体のアッセイ用)あるいは600RU(PG4D2抗体のアッセイ用)相当の固定化量を得た。
MS-1抗体は、mRNAレベルでのAggrus発現が認められるヒト膀胱扁平上皮がん細胞株UM-UC-5細胞やヒト線維肉腫細胞株HT1080細胞などをほとんど認識できない。そのため、MS-1抗体で治療対象となるがんの種類は限定的である。新たに創製したPG4D1抗体とPG4D2抗体を用い、MS-1抗体が認識できないUM-UC-5細胞、HT1080細胞表面に発現しているAggrusを認識できるか検討を行った。UM-UC-5細胞、HT1080細胞を、PG4D1抗体とPG4D2抗体を一次抗体として用い、二次抗体としてAlexa488標識された抗マウスIgG抗体を用いFACSにより解析した。その結果、PG4D1抗体、PG4D2抗体は、MS-1抗体では認識することのできなかったUM-UC-5細胞、HT1080細胞をも認識できることが確認された(図7C)。
実施例8(図7A参照)では、大腸菌に発現させたヒトAggrusタンパク質に対する反応性を検討した。その結果、図7Aの下段に示すように、PG4D1抗体とPG4D2抗体の認識する領域は、白抜き文字で示した77番目から84番目までのペプチド部分(配列:Gly Ile Arg Ile Glu Asp Leu Pro)であることが示されていた。そこで、哺乳類細胞に発現させた糖鎖を含むAggrusに対する認識能とその認識部位を確認するために、CHO細胞に導入したAggrus野生型、Aggrus変異体タンパク質、Aggrus欠失変異体タンパク質の細胞溶解液をサンプルとして用い、ウェスタンブロット法により、PG4D1抗体、PG4D2抗体の反応性を検討した。
(1)アルファスクリーン法による検討
非放射性のホモジニアス近接アッセイであるアルファスクリーン(登録商標)法を用いて、本発明で得られたモノクローナル抗体PG4D1、PG4D2のAggrusとCLEC‐2との結合に対する阻害効果を解析した。
PG4D1抗体、PG4D2抗体によるAggrusとCLEC‐2の結合阻害をFACSにより解析した。CHO/Aggrus-WT細胞と、組換えCLEC‐2(rCLEC‐2)との結合を抗Aggrusモノクローナル抗体が阻害するか解析を行った。検出は組換えCLEC‐2のHisタグを認識する抗体を用いて行っている。
(1)CLEC‐2との結合の抑制
Aggrusは血小板上のCLEC‐2と結合することで血小板凝集誘導シグナルを伝達する。PG4D1抗体あるいはPG4D2抗体が認識するPLAG4ドメインがCLEC‐2との結合ならびに血小板凝集に直接的に関与していることを解析した。pcDNA3ベクターにPLAG3ドメイン内の48番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したヒトAggrus cDNAを組み込んだプラスミドを導入したCHO細胞(CHO/Aggrus-D48A)を用いて検討した。Aggrus-D48Aを発現する変異体を用いることによって、AggrusのPLAG3ドメインのCLEC‐2に対する結合の関与を考慮する必要がなく、PLAG4ドメインとCLEC‐2との結合を評価することができる。PLAG4ドメインがCLEC‐2とAggrusとの結合に直接的に関与しているかFACSにより解析した。
次に、血小板凝集抑制試験でPLAG4ドメインのCLEC‐2に対する結合を確認した。具体的には、MCM HEMA TRACER 313を用いた光透過率のモニタリングによるマウス洗浄血小板を用いたin vitro血小板凝集分析を行なった。図11Bに示すように、CHO/Aggrus-D48A細胞は血小板凝集を誘導するが、50ng/mLのPG4D2抗体を添加しておくと血小板凝集が起こらなくなることが観察された(図11B)。また、ここでは示さないがPG4D1抗体を事前に添加しておいても、ほぼ同様な血小板凝集阻害効果が確認された。よって、PG4D1抗体あるいはPG4D2抗体が認識するPLAG4ドメインが血小板凝集に直接的に関与していること、さらに新たに創製された抗体はPLAG4ドメインに結合してそのドメインを覆うことで血小板凝集を阻害する中和抗体であることが明らかとなった。
ヒトAggrusを発現しているCHO細胞をヌードマウスの尾静脈より導入すると、約20日後に肺転移結節を形成することが知られている。また、本発明者らは、Aggrus依存的な肺転移はMS-1抗体により抑制されることをすでに開示している(特許文献2)。そこで、細胞移植1日前に、本発明の抗Aggrus抗体を投与することにより、Aggrus依存的な血行性転移を阻害するか解析した。
本発明者らが樹立したヒト肺扁平上皮がん細胞株LC-SCC-015を、5週齢の雄性CB-17 SCIDマウス(チャールズリバージャパンより購入)に各群3匹移植して行った。具体的には、腫瘍細胞であるLC-SCC-015細胞移植1日前に、マウス尾静脈より、30μg/マウスの用量でコントロールマウスIgG2a(Mouse IgG2a、シグマ社製)、PG4D2抗体を投与した。翌日、LC-SCC-015細胞を培養容器から回収し、PBSで洗浄した後に2.5×106cells/mlの細胞密度に調製し、100μL/マウスで尾静脈より移植した。31日後に肺を摘出し、ピクリン酸を用いた染色後に肺表面の転移結節数のカウントを行った(図15)。PG4D2抗体を腫瘍移植前日に投与すると、コントロールマウスIgG2a抗体投与群と比較しても有意に肺転移を抑制することが確認された(*, P<0.05)。
ヒト肺扁平上皮がん細胞株PC-10を、5週齢の雄性NOD SCIDマウス(NOD.CB17-Prkdcscid/J;チャールズリバージャパンより購入)に各群4または5匹に移植した。PC-10細胞移植後11日後の腫瘍体積がほぼ80 mm3前後となった時点で、各群の腫瘍体積の平均がほぼ均等となるようにマウスを振り分けた。その後、マウス尾静脈より、コントロールマウスIgG2a(Control IgG2a、シグマ社製)を200 μg/mouse(n=5)、PG4D2抗体を100 μg/mouse(n=4)、MS-1抗体を100 μg/mouse(n=5)、PG4D2抗体とMS-1抗体を各100 μgで合計200 μg/mouse(n=4)の用量で投与した。抗体投与開始日を0日とし、その後の3、7、10、14、17、21、24日に同量の抗体投与を行った。
PG4D2抗体の抗原認識部位を遺伝子クローニングし、ヒトIgG4のFc部位をコードする遺伝子と連結することでIgG4タイプのヒト‐マウスキメラ化PG4D2抗体(Ch.PG4D2-IgG4SP)を、ヒトIgG1のFc部位をコードする遺伝子と連結することでIgG1タイプのヒト‐マウスキメラ化PG4D2抗体(Ch.PG4D2-IgG1)を作製した。
US Biomax社より、Bone and cartilage malignant tumor tissue microarray, containing 4 cases of malignant tumor (2 each of chondrosarcoma, osteosarcoma and Ewing’s sarcoma), quadruple cores per case(製品番号T264a)を購入し、常法に従いHE染色を行った(図18A)。
NITE BP-03041
NITE BP-03042
Claims (4)
- CLEC‐2とAggrusの結合阻害剤のスクリーニング方法であって、
配列番号1(GIRIEDLPT)、又は配列番号20(EDLPTS)により表されるアミノ酸配列からなるAggrus配列への結合を指標とすることを特徴とする阻害剤スクリーニング方法。 - 請求項1記載のスクリーニング方法であって、
配列番号1で表される配列のうち配列番号3(RIEDL)により表されるアミノ酸配列への結合を指標とすることを特徴とする阻害剤スクリーニング方法。 - 配列番号21(GIRIEDLP)により表されるアミノ酸配列からなるAggrusの領域に結合し、
Aggrus-CLEC-2結合阻害活性を有する抗ヒトAggrusモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片からなるフラグメント。 - 配列番号1の配列のうち、GIRIEDLに結合し、
Aggrus-CLEC-2結合阻害活性を有する抗ヒトAggrusモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片からなるフラグメント。
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