ES2949317T3 - Anticuerpo monoclonal antiAggrus, dominio en Aggrus que es necesario para la unión a CLEC-2 y método para la detección del inhibidor de unión de Aggrus-CLEC-2 - Google Patents

Abstract

Se buscó un nuevo dominio en Aggrus que esté implicado en la unión a CLEC-2 y se obtuvo un anticuerpo monoclonal capaz de reconocer el dominio. Se encuentra claramente que un dominio PLAG4 recién descubierto es importante para la unión a CLEC-2, y se produce un anticuerpo monoclonal capaz de reconocer el dominio. Es posible proporcionar un nuevo inhibidor de la unión de Aggrus-CLEC-2, un nuevo inhibidor de la agregación plaquetaria y un nuevo inhibidor de la metástasis del cáncer utilizando el anticuerpo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo monoclonal antiAggrus, dominio en Aggrus que es necesario para la unión a CLEC-2 y método para la detección del inhibidor de unión de Aggrus-CLEC-2

Campo técnico

La presente invención se refiere a una región de Aggrus implicada en la unión a CLEC-2 y a anticuerpos que reconocen la región. La presente invención también se refiere a un inhibidor de unión de Aggrus-CLEC-2 que contiene un péptido que comprende la región de Aggrus, o un anticuerpo monoclonal, y una composición farmacéutica que comprende el mismo. La presente invención se refiere además a un método para detectar un fármaco usando la unión a la región como índice.

Antecedentes de la técnica

El cáncer es una enfermedad caracterizada porque las células crecen desordenadamente. Un factor importante al determinar la tasa de mortalidad del cáncer es el crecimiento de una lesión metastásica en lugar del crecimiento de una lesión primaria donde el cáncer se ha desarrollado inicialmente. Según los informes, la tasa de supervivencia real a los 5 años de pacientes diagnosticados con cáncer metastásico es de un 20 % o menos. La prevención de la metástasis del cáncer es un gran desafío clínico.

Se ha aceptado clínicamente desde hace mucho tiempo que la agregación plaquetaria dependiente de células cancerosas está implicada en la metástasis hematógena del cáncer. El grupo del autor de la presente invención ha establecido una línea celular de cáncer altamente metastásico que muestra actividad inductora de la agregación plaquetaria e identificó un factor inductor de la agregación plaquetaria, Aggrus, expresado en la superficie de la membrana celular de la línea celular de cáncer altamente metastásico (publicación de patente 1 y publicación 1 que no es patente).

El factor promotor de la agregación plaquetaria Aggrus (también conocido como podoplanina, gp44, T ía ) es una proteína transmembranaria de tipo I y se sabe que se sobreexpresa en diferentes tipos de cáncer, incluyendo carcinoma epidermoide, mesotelioma, sarcoma de Kaposi, tumor testicular, tumor cerebral y cáncer de vejiga (publicaciones 2 a 13 que no son patente).

Recientemente, el receptor similar a lectina de tipo C (CLEC-2) expresado en plaquetas se ha identificado como uno de los receptores equivalentes de Aggrus (publicación 14 que no es patente). Se sabe que la unión de CLEC-2 a Aggrus expresado en células tumorales activa señales de agregación plaquetaria en la plaqueta incluso en ausencia de componentes plasmáticos para inducir la agregación plaquetaria. En otras palabras, se considera que una sustancia que inhibe la unión entre Aggrus y CLEC-2 inhibe la agregación plaquetaria e inhibe la metástasis del cáncer. Por tanto, se espera que la sustancia que inhibe la unión entre Aggrus y CLEC-2 se aplique al tratamiento del cáncer o la trombosis. En realidad, los autores de la presente invención divulgan que anticuerpos monoclonales o compuestos de bajo peso molecular contra Aggrus que inhiben la interacción entre Aggrus y CLEC-2 pueden inhibir la agregación plaquetaria o la metástasis del cáncer (publicaciones de patente 2 y 3 y publicación 15 que no es patente).

Los anticuerpos monoclonales pueden unirse específicamente a los antígenos de superficie celular y, de este modo, pueden provocar una respuesta inmunológica contra las células diana. Mediante el uso de esta reacción, muchos anticuerpos monoclonales se usan en el tratamiento del cáncer o en el tratamiento de enfermedades inmunológicas. Los anticuerpos monoclonales presentan un efecto terapéutico mediante tres modos de acción típicos: neutralización, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

Los autores de la presente invención han revelado previamente que todos los anticuerpos monoclonales antiAggrus P2-0, MS-1, MS-3 y MS-4 producidos por hibridomas establecidos son anticuerpos neutralizantes que inhiben la unión de Aggrus-CLEC-2 y presentan efectos de inhibición de la agregación plaquetaria, inhibición de la metástasis del cáncer e inhibición del crecimiento tumoral de una manera independiente de la actividad de ADCC (publicación de patente 2).

Entre estos cuatro anticuerpos, tanto los anticuerpos P2-0 como MS-1 que tienen una alta actividad de inhibición de la unión de Aggrus-CLEC-2 son anticuerpos que reconocen los aminoácidos intrarregionales de un dominio PLAG (dominio estimulante de la agregación plaquetaria) como epítopo. El dominio PLAG es una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia de consenso EDXXVTPG conservada entre especies, incluyendo seres humanos, ratones y ratas. El dominio PLAG es una secuencia de aminoácidos que contiene tres repeticiones en tándem del dominio PLAG (PLAG1 a PLAG3) en regiones proximales y, en el caso de Aggrus humano, está ubicado en una región de las posiciones 29 a 54 de la secuencia de aminoácidos.

Se sabe que el dominio PLAG está presente de forma extracelular y está implicado en la actividad de agregación plaquetaria. Los resultados del análisis de estructuras cocristalinas sobre Aggrus y CLEC-2 muestran que el ácido glutámico en la posición 47 y el ácido aspártico en la posición 48, así como el ácido siálico fijado a la treonina en la posición 52 en Aggrus, se une a cuatro residuos de arginina presentes en una región de las posiciones 107 a 157 de CLEC-2 (publicación 16 que no es patente). Los anticuerpos P2-0 y MS-1 desarrollados por los autores de la presente invención también reconocen, como epítopo, una región de las posiciones 45 a 49 de la secuencia de aminoácidos de Aggrus, que solapa con la región de unión a CLEC-2 de Aggrus. Los anticuerpos MS-3 y MS-4 reconocen, como epítopo, una región de las posiciones 54 a 61 de la secuencia de aminoácidos de Aggrus, que está ubicada próxima a la región de unión a CLEC-2 de Aggrus.

El documento WO 2015/053381 A1 divulga diversos anticuerpos antipodoplanina que pueden usarse como fármacos y reactivos, de modo que los anticuerpos antipodoplanina o fragmentos de unión a antígeno de los mismos tienen un epítopo en cualquiera de las siguientes regiones en la secuencia de aminoácidos de la podoplanina.

Oki, H. et al., 2015, Monoclon. Antib. Immunodiagn. Immunother., vol. 34, n.° 1, pág. 174-180 muestran el desarrollo y la caracterización de un MAb antipodoplanina novedoso, LpMab-7, que es más sensible que NZ-1 en inmunohistoquímica.

Oki, H. et al., 2015, Monoclon. Antib. Immunodiagn. Immunother., vol. 34, n.° 1, pág. 44-50 muestran la producción y caracterización de un anticuerpo monoclonal antipodoplanina novedoso, Lpmab-3, cuyo epítopo es un glucopéptido sialilado de podoplanina.

Kato, Y. et al., 2014, Cancer Res., vol. 74, n.° 19 presentan un mAb antipodoplanina específico de cáncer novedoso, LpMab-2, que no reaccionó con podoplanina deficiente de ácido siálico y podoplanina deficiente de O-glucano, que se expresaron en células Lec2 y Lec8, respectivamente. Nakazawa, Y. et al., 2011, Cancer Sci., vol. 102, n.° 11, pág.

2051-2057 muestran el establecimiento de dos mAb de ratón antiAggrus humano, P2-0 y HAG-3. El análisis de sus epítopos reveló que P2-0 reconocía la conformación cerca del sitio bioactivo de O-glucosilación en el residuo Thr(52), de modo que HAG-3 reconoció el lado aminoterminal a una corta distancia de la conformación reconocida por P2-0.

Ogasawara, S. et al., 2008, Hybridoma, vol. 27, n.° 4, pág. 259-267 investigaron cinco anticuerpos antipodoplanina (NZ-1, D2-40, AB3, 18H5 y un anticuerpo policlonal de conejo) usando ELISA, inmunoelectrotransferencia y citometría de flujo con péptidos de podoplanina sintetizados y mutantes por deleción de podoplanina recombinante.

Listado de citas

Bibliografía de patentes

Publicación de patente 1: Patente japonesa abierta a inspección pública n.° 2004-350677

Publicación de patente 2: Publicación internacional n.° WO 2012/128082

Publicación de patente 3: Patente japonesa abierta a inspección pública n.° 2013-71916

Bibliografía que no es de patentes

Publicación 1 que no es patente: Kato Y. et al., 2003, J. Biol. Chem., vol. 278, pág. 51599-51605 Publicación 2 que no es patente: Kato, Y. et al., 2005, Tumour. Biol. vol. 26, pág. 195-200

Publicación 3 que no es patente: Martin-Villar, E. et al., 2005, Int. J. Cancer, vol. 113, pág. 899-910 Publicación 4 que no es patente: Yuan P. et al., 2006, Cancer, vol. 107, pág. 563-569

Publicación 5 que no es patente: Wicki, A. et al., 2006, Cancer Cell, vol. 9, pág. 261-272

Publicación 6 que no es patente: Kimura, N. y Kimura, I., 2005, Pathol. Int., vol. 55, pág. 83-86

Publicación 7 que no es patente: Fukunaga, M., 2005, Histopathology, vol. 46, pág. 396-402

Publicación 8 que no es patente: Kato, Y. et al., 2004, Oncogene, vol. 23, pág. 8552-8556

Publicación 9 que no es patente: Mishima, K. et al., 2006, Acta Neuropathol., vol. 111, pág. 563-568 Publicación 10 que no es patente: Mishima, K. et al., 2006, Acta Neuropathol., vol. 111, pág. 483-488 Publicación 11 que no es patente: Yuan, P. et al., 2006, Cancer, vol. 107, pág. 563-569

Publicación 12 que no es patente: Kunita, A. et al., 2007, Am. J. Pathol., vol. 170, pág. 1337-1347 Publicación 13 que no es patente: Takagi, S. et al., 2014, Int. J. Cancer, vol. 134, pág. 2605-2614 Publicación 14 que no es patente: Suzuki-Inoue, K. et al. 2007, J. Biol. Chem., vol. 282, pág. 25993-26001 Publicación 15 que no es patente: Fujita N. y Takagi, S., 2012, J. Biochem., vol. 152, pág. 407-413 Publicación 16 que no es patente: Nagae, M. et al., 2014, Structure, vol. 22, pág. 1711-1721

Publicación 17 que no es patente: Morrison, S.L. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, pág. 6851-6855 Publicación 18 que no es patente: Jones, P.T. et al., 1986, Nature, vol. 321, pág. 522-525

Publicación 19 que no es patente: Amano, K. et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 105, pág. 3232-3237 Publicación 20 que no es patente: Takagi, S. et al., 2013, PLoS One vol. 8, e73609

Sumario de la invención

Problema técnico

Sin embargo, como se indica a continuación, se ha revelado que incluso un mutante de sustitución de alanina del ácido aspártico en la posición 48 de Aggrus, que es una posición implicada en la unión a CLEC-2 como resultado del análisis de estructuras cocristalinas con CLEC-2, también se une a CLEC-2. En cuanto a la agregación plaquetaria inducida por el mutante de sustitución de alanina del ácido aspártico en la posición 48 de Aggrus, también se ha confirmado que este mutante de Aggrus provoca en definitiva la agregación plaquetaria, aunque el tiempo de inicio de la agregación plaquetaria se retarda.

Los autores de la presente invención divulgan anticuerpos monoclonales o compuestos de bajo peso molecular contra Aggrus que inhiben la interacción entre Aggrus y CLEC-2, pueden inhibir la agregación plaquetaria y, además, puede inhibir la metástasis del cáncer (publicaciones de patente 2 y 3). Dichos anticuerpos monoclonales o compuestos de bajo peso molecular fueron eficaces para retardar el tiempo de inicio de la agregación plaquetaria, pero no pudieron inhibir por completo la agregación plaquetaria inducida por Aggrus. Esto sugiere la posibilidad de que el sitio de unión a CLEC-2 de Aggrus también esté presente en una región distinta de los dominios PLAG conocidos.

Un objetivo de la presente invención es buscar un dominio novedoso de Aggrus implicado en la unión a CLEC-2 y obtener anticuerpos monoclonales que se unan al dominio. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para detectar un compuesto que inhiba el crecimiento del cáncer y la metástasis o la agregación plaquetaria buscando un compuesto que se una al dominio.

Solución al problema

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales que reconocen una región de Aggrus, hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales, una región de Aggrus necesaria para la unión a CLEC-2, un inhibidor de la unión de Aggrus-CLEC-2, una composición farmacéutica, un reactivo de prueba y un método para detectar un inhibidor de la unión de Aggrus-CLEC-2 como se indica a continuación.

(1) Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una región de Aggrus que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3 (RIEDL), y que tiene una constante de disociación (KD) para Aggrus de <3 * 10-10 M, o un fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo, en donde dicho fragmento funcional se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')₂, un anticuerpo monocatenario (scFv) y un fragmento V estabilizado con disulfuro (dsFv), inhibiendo dicho anticuerpo monoclonal y dicho fragmento funcional del mismo la interacción entre Aggrus y CLEC-2.

(2) El anticuerpo monoclonal o el fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo de acuerdo con (1), en donde el anticuerpo monoclonal de acuerdo con (1) se puede obtener usando una secuencia de aminoácidos que consiste en una región de un residuo de treonina en la posición 76 a un residuo de treonina en la posición 89 como inmunógeno.

(3) El anticuerpo monoclonal o el fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo de acuerdo con (1), en donde el anticuerpo monoclonal es quimérico o está humanizado.

(4) Un inhibidor de la unión de Aggrus-CLEC-2 que comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (3).

(5) El inhibidor de la unión de Aggrus-CLEC-2 de acuerdo con (4), que comprende además al menos un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo presente en la región representada por SEQ ID NO: 2 (GAEDDVVTPGTSEDRYK), anticuerpo quimérico del mismo, anticuerpo humanizado del mismo y/o fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo, en donde dicho fragmento funcional se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')₂, un anticuerpo monocatenario (scFv) y un fragmento V estabilizado con disulfuro (dsFv).

(6) Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la trombosis, la progresión del cáncer o metástasis, o la inflamación, que comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (3).

(7) La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con (6), que comprende además al menos un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo presente en la región representada por SEQ ID NO: 2 (GAEDDVVTPGTSEDRYK), anticuerpo quimérico del mismo, anticuerpo humanizado del mismo y/o fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo.

(8) Un reactivo de prueba para la detección de la expresión de Aggrus, que comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (3).

(9) Un método para detectar un inhibidor de la unión entre CLEC-2 y Aggrus, que comprende

seleccionar un compuesto que inhiba la unión de CLEC-2 a un epítopo de Aggrus representado por SEQ ID NO: 3 (RIEDL).

Efectos ventajosos de la invención

Los autores de la presente invención encontraron un dominio PLAG novedoso necesario para la unión de Aggrus a CLEC-2 y, de este modo, pudieron obtener anticuerpos monoclonales novedosos que se unían a la región. Los anticuerpos monoclonales que se unen a la región inhiben fuertemente la unión de Aggrus a CLEC-2 y, por lo tanto, se espera que sean eficaces para el tratamiento del cáncer o la trombosis. Además, también puede detectarse un agente antineoplásico dirigido al dominio PLAG novedoso.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1A] La figura 1A es un diagrama que muestra los resultados del examen de los sitios de reconocimiento de anticuerpos neutralizantes usando mutantes de Aggrus.

[Figura 1B] La figura 1B es un diagrama que muestra dominios PLAG conocidos en la secuencia de aminoácidos de Aggrus humano.

[Figura 2A] La figura 2A es un diagrama que muestra los niveles de expresión y las capacidades de unión a la proteína CLEC-2 de Aggrus natural (WT - wild-type) y proteínas mutantes de Aggrus en células CHO transfectadas.

[Figura 2B] La figura 2B es un diagrama que muestra el efecto de una mutación aminoacídica en la posición 48 (D48A) sobre la agregación plaquetaria.

[Figura 3A] La figura 3A es un diagrama que muestra la homología de las secuencias de aminoácidos de Aggrus de mamíferos.

[Figura 3B] La figura 3B es un diagrama que muestra la secuencia de consenso de los dominios PLAG.

[Figura 4A] La figura 4A es un diagrama que muestra los niveles de expresión proteínica de mutantes de Aggrus.

[Figura 4B] La figura 4B es un diagrama que muestra los niveles de expresión y las capacidades de unión a la proteína CLEC-2 de Aggrus natural y proteínas mutantes de Aggrus en células CHO transfectadas.

[Figura 4C] La figura 4C es un diagrama que muestra el efecto de una mutación aminoacídica en la posición 48 (D48A), una mutación aminoacídica en la posición 82 (D82A) y una doble mutación aminoacídica en las posiciones 48 y 82 (D48A/D82A) sobre la agregación plaquetaria.

[Figura 4D] La figura 4D es un diagrama que muestra esquemáticamente los mutantes de deleción del dominio PLAG.

[Figura 4E] La figura 4E es un diagrama que muestra los niveles de expresión y las capacidades de unión a la proteína CLEC-2 de proteínas mutantes por deleción de Aggrus en células CHO transfectadas.

[Figura 5A] La figura 5A es un diagrama que muestra cuantitativamente los niveles de expresión y las capacidades de unión a la proteína CLEC-2 de Aggrus natural y proteínas mutantes puntuales de Aggrus en células CHO transfectadas.

[Figura 5B] La figura 5B es un diagrama que muestra cuantitativamente los niveles de expresión y las capacidades de unión a la proteína CLEC-2 de Aggrus natural y proteínas mutantes por deleción de Aggrus en células CHO transfectadas.

[Figura 5C] La figura 5C es un diagrama que muestra el efecto de una mutación aminoacídica en la posición 48 (D48A), una mutación aminoacídica en la posición 82 (D82A) y una doble mutación aminoacídica en las posiciones 48 y 82 (D48A/D82A) sobre la agregación plaquetaria.

[Figuras 6A y 6B] Cada una de las figuras 6A y 6B es un diagrama que muestra los niveles de expresión y las capacidades de unión a la proteína CLEC-2 de Aggrus natural y las proteínas Aggrus que albergan mutaciones en el ácido glutámico en la posición 81, el ácido aspártico en la posición 82 y la treonina en la posición 85 de un dominio PLAG4 (EDXXTS).

[Figura 7A] La figura 7A es un diagrama que muestra el análisis de epítopos de anticuerpos monoclonales antiAggrus.

[Figura 7B] La figura 7B es un diagrama que muestra la reactividad de anticuerpos antiAggrus con la proteína Aggrus expresada en mamíferos.

[Figura 7C] La figura 7C es un diagrama que muestra la reactividad de anticuerpos monoclonales antiAggrus con células que expresan Aggrus de forma endógena.

[Figuras 8A y 8B] Cada una de las figuras 8A y 8B es un diagrama que muestra el estudio sobre los sitios de reconocimiento de los anticuerpos PG4D1 y PG4D2.

[Figura 8C] La figura 8C es un diagrama que muestra el estudio sobre la reactividad del anticuerpo PG4D1 con la proteína Aggrus inmovilizada en chip sensor.

[Figura 8D] La figura 8D es un diagrama que muestra el estudio sobre la reactividad del anticuerpo PG4D2 con la proteína Aggrus inmovilizada en chip sensor.

[Figuras 9A y 9B] Cada una de las figuras 9A y 9B es un diagrama que muestra la inhibición de la unión de Aggrus-CLEC-2 por anticuerpos monoclonales antiAggrus.

[Figura 10A] La figura 10A es un diagrama que muestra la inhibición de la unión de CLEC-2 recombinante a células que expresan Aggrus por anticuerpos monoclonales antiAggrus.

[Figura 10B] La figura 10B es un diagrama que muestra que anticuerpos que reconocen respectivamente los dominios PLAG3 y PLAG4 no interfieren entre sí al unirse a Aggrus.

[Figura 10C] La figura 10C es un diagrama que muestra que la unión entre Aggrus y CLEC-2 se inhibe completamente mediante el uso combinado de un anticuerpo monoclonal antiAggrus que reconoce el dominio PLAG4 y un anticuerpo monoclonal antiAggrus que reconoce el dominio PLAG3.

[Figura 11A] La figura 11A es un diagrama que muestra la inhibición de la unión de CLEC-2 recombinante a Aggrus por un anticuerpo monoclonal antiAggrus que reconoce el dominio PLAG4.

[Figura 11B] La figura 11B es un diagrama que muestra la inhibición de la agregación plaquetaria por un anticuerpo monoclonal antiAggrus que reconoce el dominio PLAG4.

[Figura 12A] La figura 12A es un diagrama que muestra la inhibición de la agregación plaquetaria por anticuerpos monoclonales antiAggrus que reconocen el dominio PLAG4 y un anticuerpo monoclonal antiAggrus que reconoce el dominio PLAG3.

[Figura 12B] La figura 12B es un diagrama que muestra la inhibición de la agregación plaquetaria inducida por células que expresan Aggrus mediante el uso combinado de un anticuerpo monoclonal antiAggrus que reconoce el dominio PLAG4 y un anticuerpo monoclonal antiAggrus que reconoce el dominio PLAG3.

[Figuras 13A y 13B] Cada una de las figuras 13A y 13B es un diagrama que muestra la inhibición de la metástasis hematógena en el pulmón por anticuerpos monoclonales antiAggrus que reconocen el dominio PLAG4.

[Figuras 14A y 14B] Cada una de las figuras 14A y 14B es un diagrama que muestra la inhibición de la metástasis hematógena en el pulmón por anticuerpos monoclonales antiAggrus que reconocen el dominio PLAG4 y un anticuerpo monoclonal antiAggrus que reconoce el dominio PLAG3.

[Figura 15] La figura 15 es un diagrama que muestra la inhibición de la metástasis hematógena de células LC-SCC-015 al pulmón por el anticuerpo PG4D2.

[Figura 16] La figura 16 es un diagrama que muestra el efecto inhibidor de un anticuerpo monoclonal antiAggrus que reconoce el dominio PLAG4 sobre el crecimiento tumoral de células PC-10 de carcinoma epidermoide de pulmón.

[Figura 17A] La figura 17A es un diagrama que muestra la unión del anticuerpo PG4D2 quimérico a células que expresan Aggrus.

[Figura 17B] La figura 17B es un diagrama que muestra la inhibición de la unión de CLEC-2 recombinante a Aggrus por el anticuerpo PG4D2 quimérico.

[Figura 18A] La figura 18A muestra imágenes de tinción HE de cortes de osteosarcoma.

[Figura 18B] La figura 18B es un diagrama que muestra que el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 reconocen el osteosarcoma con más sensibilidad que un anticuerpo D2-40.

Descripción de algunas realizaciones

El anticuerpo monoclonal antiAggrus o el fragmento funcional de la presente invención se refiere a un anticuerpo que reconoce, como epítopo, una región solapante con un dominio PLAG4 de Aggrus recién encontrado, y el fragmento funcional se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene sustancialmente la misma especificidad antigénica que la del anticuerpo original, en donde dicho fragmento funcional se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')₂, un anticuerpo monocatenario (scFv) y un fragmento V estabilizado con disulfuro (dsFv).

Ejemplos preferidos del anticuerpo monoclonal contra Aggrus de la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas depositados el 14 de julio de 2015 con los números de depósito NITE BP03041 y NITE BP-03042 en el Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación, Depositario de Microorganismos de Patente (NITE-NPMD (n.° 122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba 292-0818, Japón)). También se prefieren como anticuerpo monoclonal antiAggrus de la presente invención otros anticuerpos que poseen una especificidad de unión equivalente a estos anticuerpos monoclonales.

En la presente invención, el anticuerpo monoclonal incluye no solo anticuerpos producidos por hibridomas obtenidos, sino también anticuerpos generales cuya seguridad está garantizada cuando se administran a seres humanos, tal como un anticuerpo quimérico de tipo humano (en lo sucesivo en el presente documento, también denominado anticuerpo quimérico) preparado mediante el uso de una técnica de recombinación génica, o un anticuerpo injertado con CDR (región determinante de la complementariedad) de tipo humano (en lo sucesivo en el presente documento, también denominado anticuerpo humanizado).

El anticuerpo quimérico de tipo humano se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables de anticuerpo (en lo sucesivo en el presente documento, también denominadas regiones V) derivadas de un anticuerpo animal no humano y regiones constantes (en lo sucesivo en el presente documento, también denominadas regiones C) derivadas de un anticuerpo humano (publicación 17 que no es patente). El anticuerpo injertado con CDR de tipo humano es un anticuerpo en el que las secuencias de aminoácidos de las CDR en las regiones V de un anticuerpo animal no humano se injertan en posiciones apropiadas de un anticuerpo humano (publicación 18 que no es patente). El anticuerpo quimérico o el anticuerpo humanizado, cuando se administra a seres humanos, tiene menos reacciones adversas y mantiene su efecto terapéutico durante un periodo más largo, en comparación con anticuerpos animales no humanos. Asimismo, el anticuerpo quimérico o el anticuerpo humanizado puede prepararse como una molécula en diferentes formas mediante el uso de técnicas de recombinación genética. Puede usarse un método conocido en la técnica como método para preparar el anticuerpo quimérico o el anticuerpo humanizado a partir del anticuerpo monoclonal.

El fragmento funcional del anticuerpo incluye fragmentos funcionales de anticuerpo tales como Fab, Fab', F(ab')₂, un anticuerpo monocatenario (scFv) y un fragmento V estabilizado con disulfuro (dsFv). El fragmento funcional del anticuerpo puede obtenerse mediante un método conocido en la técnica tal como digestión con una enzima como pepsina o papaína.

En un aspecto alternativo, la presente invención puede proporcionar una composición farmacéutica para su uso como inhibidor de la unión de Aggrus-CLEC-2, un inhibidor de la agregación plaquetaria o un agente antineoplásico, que comprende el anticuerpo monoclonal o el fragmento del mismo. El inhibidor de la agregación plaquetaria puede usarse para tratar la trombosis, por ejemplo, infarto cerebral o infarto de miocardio. El agente antineoplásico puede usarse no solo como inhibidor de la metástasis del cáncer, sino también para inhibir la progresión del cáncer o la inflamación provocada por el cáncer. Se puede esperar que la composición farmacéutica actúe preferentemente sobre el cáncer o tumor que previamente se ha confirmado que sobreexpresa la molécula Aggrus, es decir, carcinoma epidermoide, fibrosarcoma, mesotelioma, sarcoma de Kaposi, tumor testicular, tumor cerebral o cáncer de vejiga.

En el caso de un fármaco peptídico o de anticuerpo, por ejemplo, en general se usa una inyección que es una formulación parenteral como el tipo de forma farmacéutica de la composición farmacéutica de la presente invención. Como alternativa, por ejemplo, un compuesto obtenido mediante cribado puede administrarse no solo como una inyección, sino también como una formulación oral o parenteral. Ejemplos de la formulación oral incluyen comprimidos, polvos, píldoras, polvos finos, gránulos, cápsulas blandas o duras, formulaciones recubiertas de película, microesferas, formulaciones sublinguales y pastas. Ejemplos de la formulación parenteral pueden incluir inyecciones, así como supositorios, formulaciones percutáneas, pomadas y soluciones para uso externo. Sin embargo, la composición farmacéutica de la presente invención no está limitada por las formas farmacéuticas enumeradas en el presente documento, y los expertos en la materia pueden seleccionar apropiadamente la forma farmacéutica óptima de acuerdo con la vía de administración y el destinatario. En el caso de utilizar el anticuerpo antiAggrus de la presente invención como principio activo, la preparación puede contener de un 0,1 a un 99,9 % en peso del anticuerpo antiAggrus.

La dosis del principio activo en el fármaco puede determinarse convenientemente como la dosis óptima de acuerdo con el destinatario, el órgano diana, los síntomas y el método de administración. En el caso de administración oral, en general se administra a un paciente de 0,1 μg a 1000 mg, preferentemente de 1,0 μg a 100 mg, más preferiblemente de 1,0 mg a 50 mg, al día. En el caso de administración parenteral, la dosis individual difiere de acuerdo con el destinatario, el órgano diana, los síntomas, el método de administración, etc. Por ejemplo, en forma de una inyección, en general se administra a un paciente por inyección intravenosa de aproximadamente 0,01 a 30 mg, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 20 mg, más preferiblemente de 0,1 a 10 mg al día. Sin embargo, la dosis puede determinarse finalmente a criterio del médico teniendo en cuenta la edad, el peso corporal, los síntomas, etc. del paciente.

Se ha revelado que el uso combinado de un anticuerpo que reconoce el dominio PLAG4 y un anticuerpo que reconoce una región sobre PLAG2 y PLAG3 inhibe casi por completo la unión entre Aggrus y CLEC-2. Por tanto, se puede esperar que el uso combinado de estos anticuerpos que reconocen las dos regiones implicadas en la unión de Aggrus a CLEC-2 produzca una agregación plaquetaria o un efecto inhibidor de la metástasis del cáncer más fuerte.

Como se menciona anteriormente, los autores de la presente invención ya han obtenido anticuerpos monoclonales que reconocen, como epítopo, una región de las posiciones 45 a 61 (SEQ ID NO: 2) de Aggrus, que es una región que comprende PLAG2 y PLAG3 de Aggrus. Específicamente, estos anticuerpos monoclonales son anticuerpos P2-0 y MS-1 que reconocen una región de las posiciones 45 a 49 de Aggrus, un anticuerpo MS-3 que reconoce una región de las posiciones 53 a 58, y un anticuerpo MS-4 que reconoce una región de las posiciones 53 a 61. Los autores de la presente invención ya han divulgado que un anticuerpo quimérico P2-0 posee un efecto inhibidor de la metástasis del cáncer en un sistema experimental que utiliza modelos de ratón (publicación de patente 2). En el caso de utilizar clínicamente un anticuerpo monoclonal que reconozca esta región, puede usarse un anticuerpo quimérico o humanizado. Se puede esperar que el uso del anticuerpo de la presente invención en combinación con al menos uno cualquiera de estos anticuerpos monoclonales produzca un mayor efecto. Cuando estos dos anticuerpos usados en combinación se usan como anticuerpos quiméricos o anticuerpos humanizados y se aplican al tratamiento de la trombosis o el cáncer, se puede esperar un efecto más fuerte.

El anticuerpo de la presente invención que reconoce a Aggrus puede usarse en un cribado de cáncer. Ya se sabe que la expresión de Aggrus está implicada en la metástasis hematógena del cáncer. Por tanto, la predicción del pronóstico puede llevarse a cabo detectando la expresión de Aggrus en tejidos cancerosos o células cancerosas que circulan en la sangre usando el anticuerpo de la presente invención. La expresión de Aggrus en tejidos cancerosos o células cancerosas puede confirmarse mediante el uso de un método de ensayo inmunológico conocido en la técnica, tal como ELISA o FACS, usando el anticuerpo de la presente invención. Además, se puede esperar que un fármaco que contenga el anticuerpo de la presente invención como principio activo tenga un efecto terapéutico sobre el cáncer que expresa Aggrus.

El método de detección de la presente invención tiene como objetivo buscar una sustancia que inhiba la unión entre Aggrus y CLEC-2 y proporcionar un compuesto que inhiba la agregación plaquetaria o la metástasis del cáncer. El método de detección de la presente invención puede realizarse, por ejemplo, como sigue: se hace una búsqueda de un compuesto que interactúe con la secuencia de aminoácidos recién identificada de Aggrus implicada en la unión a CLEC-2 de acuerdo con la presente invención usando una matriz de compuestos o una colección de compuestos. Para la detección usando la región de Aggrus implicada en la unión a CLEC-2, se usa una secuencia reconocida por el anticuerpo de la presente invención de RIEDL (SEQ ID NO: 3), una región contra la que se ha obtenido un anticuerpo que presenta una alta avidez. Dado que la región de Aggrus implicada en la unión a CLEC-2 es una región corta, puede usarse un péptido sintético, o puede expresarse un recombinante que comprenda la región en E. coli, células animales, o similares y usarse.

Como descubrieron e informaron los autores de la presente invención, una región sobre los dominios PLAG2 y PLAG3 (aminoácidos 45 a 61) de Aggrus también está implicada en la interacción de Aggrus con CLEC-2 (publicaciones de patente 2 y 3). Por tanto, un Aggrus recombinante que se una, solo en la región de unión a CLEC-2 recién descubierta de acuerdo con la presente invención, a CLEC-2 mediante la deleción o mutación de este sitio, puede expresarse en E. coli, células animales, o similares y usarse.

Como alternativa, este sitio puede estar enmascarado a través de la reacción de Aggrus natural expresado en E. coli, células animales o similares con el anticuerpo P2-0, MS-1, MS-3 o MS-4 para que el Aggrus resultante se una, solo en la región de unión a CLEC-2 recién descubierta de acuerdo con la presente invención, a CLEC-2. El péptido o el recombinante unido con compuesto puede detectarse usando el anticuerpo monoclonal antiAggrus de la presente invención. El método descrito anteriormente se proporciona con fines ilustrativos. El método de detección de la presente invención no se limita a ello, y se puede aplicar cualquier método de detección conocido en la técnica a ello, normalmente.

Asimismo, la región (epítopo) reconocida por el anticuerpo de la presente invención puede sintetizarse con glucosilación y administrarse y, de este modo, puede esperarse que inhiba de forma competitiva la unión de Aggrus a CLEC-2. Por consiguiente, un péptido que comprenda la región reconocida por el anticuerpo puede glucosilarse y usarse como inhibidor de la unión entre Aggrus y CLEC-2. Esto permite que el propio péptido se use como inhibidor de la agregación plaquetaria o inhibidor de la metástasis del cáncer. La glucosilación puede realizarse mediante el uso de un método conocido en la técnica tal como la unión de una cadena glucídica de tipo humana usando levadura (publicación 19 que no es patente).

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en detalle con referencia a los ejemplos.

Ejemplo 1

Examen del sitio de reconocimiento del anticuerpo neutralizante presentado

Los autores de la presente invención ya han divulgado anticuerpos monoclonales antiAggrus que inhiben la unión a CLEC-2 y tienen un efecto inhibidor de la agregación plaquetaria y un efecto inhibidor de la metástasis del cáncer (publicación de patente 2 y publicación 20 que no es patente). Estos anticuerpos monoclonales eran anticuerpos que reconocían una región sobre los dominios PLAG2 y PLAG3 como epítopo.

En primer lugar, se examinaron los sitios de reconocimiento de estos anticuerpos neutralizantes. Se transfectaron células de ovario de hámster chino (CHO) con plásmidos proporcionados a continuación para expresar Aggrus humano o un mutante de Aggrus. El gen de Aggrus humano usado fue ADNc de Aggrus natural (n.° de GenBank AB127958.1) y se amplificó por PCR de acuerdo con un método de rutina y se clonó usando pcDNA3 (fabricado por Life Technologies Corp.) como vector.

Las siguientes construcciones se usaron en el estudio sobre los sitios de reconocimiento de los anticuerpos neutralizantes. Un vector pcDNA3 vacío (simulado), un plásmido que contenía ADNc de Aggrus humano natural (Aggrus-WT), un plásmido que contenía ADNc de Aggrus que codifica un mutante que contiene alanina remplazada en la glicina de la posición 45 (Aggrus-G45A), un plásmido que contenía ADNc de Aggrus que codifica un mutante que contiene alanina remplazada en el ácido aspártico de la posición 48 (Aggrus-D48A) y un plásmido que contenía ADNc de Aggrus que codifica un mutante que contiene alanina remplazada en el ácido aspártico de la posición 49 (Aggrus-D49A) se construyeron y se transfectaron células CHO con cada plásmido para expresar de manera estable la proteína. En lo sucesivo en el presente documento, las células CHO transfectadas con estos plásmidos se denominan CHO/simulado, CHO/Aggrus-WT, CHO/Aggrus-G45A, CHO/Aggrus-D48A, CHO/Aggrus-D49A, respectivamente.

Se preparó un lisado celular de cada célula y se sometió a análisis por inmunoelectrotransferencia usando cuatro anticuerpos monoclonales antiAggrus D2-40, MS-1, P2-0 y NZ-1. El anticuerpo D2-40 (fabricado por AbD Serotec) es un anticuerpo monoclonal de ratón que carece de actividad neutralizante de Aggrus, y el anticuerpo MS-1 y el anticuerpo P2-0 son anticuerpos monoclonales de ratón que tienen actividad neutralizante, que se han desarrollado por los autores de la presente invención. El anticuerpo NZ-1 (fabricado por AngioBio) es un anticuerpo monoclonal de rata que tiene actividad neutralizante de Aggrus. Los resultados se muestran en la figura 1A.

El anticuerpo D2-40 que carece de actividad neutralizante de Aggrus reconoce todas las proteínas Aggrus naturales y con sustitución de un aminoácido en los transfectantes. Específicamente, se observaron señales en las células distintas de CHO/simulado. Asimismo, se confirmó que Aggrus natural y los mutantes de Aggrus presentaban niveles de expresión proteínica casi iguales. Como también es evidente a partir de los resultados del análisis de inmunoelectrotransferencia (figura 1A) usando un anticuerpo que reconoce la a-tubulina, los niveles de proteína en los lisados celulares fueron los mismos.

El anticuerpo MS-1 y el anticuerpo P2-0 reconocieron Aggrus natural, pero reconocieron débilmente las proteínas Aggrus con sustitución de un aminoácido Aggrus-G45A, Aggrus-D48A y Aggrus-D49A, lo que demuestra que estos sitios aminoacídicos son esenciales para el reconocimiento de los anticuerpos. Particularmente, tanto el anticuerpo P2-0 como el anticuerpo MS-1 no pueden reconocer a Aggrus-D48A que alberga la sustitución de ácido aspártico en la posición 48 por alanina. Esto sugirió que el ácido aspártico en la posición 48 en el dominio PLAG es importante para el reconocimiento por parte de los anticuerpos.

El anticuerpo monoclonal de rata NZ-1 que tiene actividad neutralizante de Aggrus también reconoció débilmente las proteínas Aggrus con sustitución de un aminoácido. Esto sugirió que la región mutada de las posiciones 45 a 49 de Aggrus, es decir, el sitio sobre PLAG2 y PLAG3 (véase la figura 1B), es importante para ejercer actividad neutralizante.

Ejemplo 2

Estudio sobre el sitio de Aggrus implicado en la interacción con CLEC-2 e inducción de la agregación plaquetaria

(1) Estudio sobre la función del ácido aspártico de la posición 48 de Aggrus en la unión a CLEC-2

Se transfectaron células CHO con plásmidos que contenían ADNc de Aggrus humano o ADNc mutante del mismo, y se estudió la función del ácido aspártico de la posición 48. La línea celular CHO/Aggrus-WT que expresa Aggrus natural y la línea celular CHO/Aggrus-D48A de CHO de que expresa mutante preparadas como se describe anteriormente, CHO/Aggrus-D48E que alberga la sustitución de ácido aspártico en la posición 48 por ácido glutámico y CHO/Aggrus-D48N que alberga la sustitución de ácido aspártico en la posición 48 por asparagina se usaron y se estudió su reactividad con CLEC-2 recombinante mediante FACS.

En primer lugar, se estudiaron los niveles de expresión de Aggrus en los transfectantes CHO/Aggrus-WT, CHO/Aggrus-D48E, CHO/Aggrus-D48N y CHO/Aggrus-D48A. Específicamente, cada uno de estos transfectantes se recuperó de un recipiente de cultivo, se lavó con PBS y luego se ajustó a una densidad celular de 1,5 * 105 células/ml. Se les añadió el anticuerpo D2-40 y se hizo reaccionar en hielo durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron con PBS y se les añadió un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con Alexa 488 (fabricado por Life Technologies Corp.) como anticuerpo secundario y se hizo reaccionar adicionalmente en hielo durante 30 minutos. Para finalizar, las células se lavaron con PBS tres veces, seguido de análisis usando Cytomics FC500 (fabricado por Beckman Coulter, Inc.) (paneles de la izquierda de la figura 2A, áreas vacías). Como controles, se usa un anticuerpo de ratón de control (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC) en lugar del anticuerpo D2-40 con cada célula y se muestran realizando la misma operación que anteriormente (paneles de la izquierda de la figura 2A, áreas rellenas).

La reactividad con CLEC-2 se estudió como sigue: cada uno de los transfectantes se ajustó a una densidad celular de 1,5 * 105 células/ml de la misma manera que anteriormente. Una proteína CLEC-2 recombinante marcada con (His)io (rCLEC-2; fabricada por R&D Systems, Inc.) se le añadió y se hizo reaccionar en hielo durante 30 minutos. Después del lavado con PBS, se le añadió un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia (fabricado por Qiagen Inc.) que reconoce la marca His y se hizo reaccionar adicionalmente en hielo durante 30 minutos. La proteína recombinante CLEC-2 marcada con (His)i0 se purificó de células de mamífero y se modificó con una cadena glucídica. Las células se lavaron con PBS tres veces, seguido de análisis usando Cytomics FC500 de la misma manera que anteriormente (paneles de la derecha de la figura 2A, áreas vacías). Los resultados de añadir PBS solo en lugar de proteína recombinante CLEC-2 marcada con (His)i0 y realizar la misma operación que anteriormente se muestran como controles (paneles de la derecha de la figura 2A, áreas rellenas).

La expresión de Aggrus y las proteínas mutantes de Aggrus se muestran en los paneles de la izquierda de la figura 2A, y la unión a CLEC-2 se muestra en los paneles de la derecha de la figura 2A. Las áreas vacías de los paneles de la izquierda de la figura 2A representan los resultados de teñir Aggrus natural o los mutantes de Aggrus con el anticuerpo D2-40. Las áreas rellenas representan los resultados obtenidos usando el anticuerpo de ratón de control. La intensidad de la fluorescencia fue casi igual entre las posiciones de los picos de las áreas vacías de los paneles de la izquierda de la figura 2A, lo que confirma que los niveles de expresión de las proteínas Aggrus en la superficie celular de estos transfectantes son casi iguales.

Los paneles de la derecha de la figura 2A muestran el análisis sobre si CLEC-2 recombinante se uniría a las células que expresan Aggrus natural o con sustitución de un aminoácido. Como se menciona anteriormente, las áreas vacías representan los resultados de detectar CLEC-2 recombinante unido con Aggrus natural o los mutantes de Aggrus expresados en la superficie de células CHO usando el anticuerpo anti-His. Las áreas rellenas representan los resultados de control obtenidos al añadir PBS solo en lugar de la proteína CLEC-2.

CLEC-2 se une al mutante D48E que alberga la sustitución de ácido aspártico de la posición 48 por ácido glutámico, que también es un aminoácido ácido (CHO/Aggrus-D48E), de forma similar a la forma natural (CHO/Aggrus-WT). Sin embargo, se observó una reducción en la intensidad de unión de CLEC-2 en el mutante D48N (CHO/Aggrus-D48N) o D48A (CHO/Aggrus-D48A) que albergaba la sustitución por un aminoácido neutro. Sin embargo, se encontró que CLEC-2 se unía a todos los mutantes hasta cierto punto sin perder completamente la unión.

(2) Estudio sobre el función del ácido aspártico de la posición 48 de Aggrus en la agregación plaquetaria

Como se menciona anteriormente, CLEC-2 es un receptor en las plaquetas que se une a Aggrus. Aggrus se une a CLEC-2 en las plaquetas para transducir de este modo señales que inducen la agregación plaquetaria. Se supuso que el mutante D48a (CHO/Aggrus-D48A) que se unía más débilmente a CLEC-2 tenía una actividad inductora de la agregación plaquetaria más débil. Por lo tanto, esto se confirmó mediante una prueba de agregación plaquetaria. Específicamente, el análisis se realizó con MCM HEMA TRACER 313M (fabricado por MC Medical, Inc.). Este método de análisis es un método de análisis de la agregación plaquetaria in vitro mediante el control de la transmisión de luz usando plaquetas de ratón lavadas.

Como se muestra en la figura 2B, no se observó actividad de inducción de la agregación plaquetaria en las células CHO/simulado, mientras que la agregación comenzó aproximadamente 6 minutos después de mezclar la plaqueta con CHO/Aggrus-WT que expresaba Aggrus natural. Por otra parte, cuando CHO/Aggrus-D48A que tenía una intensidad de unión debilitada a CLEC-2 se mezclaba con la plaqueta, la agregación se observaba solo aproximadamente 14 minutos después. Por tanto, el inicio de la agregación plaquetaria se retardaba aproximadamente 8 minutos. Este resultado respalda los resultados de la figura 2A que muestra la intensidad de unión debilitada a CLEC-2 y también sugiere la posibilidad de que: un sitio distinto del dominio PLAG3 previamente identificado esté implicado en la unión a CLEC-2; y la agregación plaquetaria se induzca por la unión a CLEC-2 mediante el sitio.

Ejemplo 3

Hallazgo de un dominio PLAG4 novedoso implicado en la unión a CLEC-2

Se estudió la homología de las secuencias de aminoácidos de proteínas Aggrus de ser humano (Homo sapiens, SEQ ID NO: 5), bonobo (Pan paniscus, SEQ ID NO: 6), macaco de la India (Macaca mulata, SEQ iD NO: 7), cerdo (Sus scrofa, s Eq ID NO: 8), cachalote (Physeter catodon, SEQ ID NO: 9), bovino (Bos taurus, SEQ ID NO: 10), perro (Canis lupus familiaris, SEQ ID NO: 11), murciélago (Myotis brandtii, SEQ ID NO: 12), rata (Rattus norvegicus, Se Q ID NO: 13) y ratón (Mus musculus, SEQ ID NO: 14) a partir de un árbol filogenético de mamíferos (panel inferior de la figura 3A).

La figura 3A muestra la alineación de regiones altamente homólogas de las proteínas Aggrus de estos animales. Las secuencias de las proteínas Aggrus de los animales se basan en las secuencias de los números de acceso a GenBank mostrados por debajo de la figura 3A. Como resultado, se encontró un dominio PLAG4 altamente conservado en mamíferos, que es análogo a los dominios PLAG 1 a 3 presentados previamente (figura 3A). La figura 3B muestra la secuencia de consenso (SEQ ID NO: 15) del dominio PLAG y las secuencias de PLAG1 a PLAG4 (SEQ ID NO: 16 a 19). Una secuencia ED altamente conservada de ácido glutámico seguida de ácido aspártico, supuestamente implicada en la unión a CLEC-2, y la treonina T que sirve como sitio de glucosilación, estaban conservadas en PLAG4 humano. Sin embargo, se encontró que el número de aminoácidos entre la secuencia ED y T era de 2 aminoácidos, 3 aminoácidos no identificados previamente, en el dominio PLAG4.

Ejemplo 4

Estudio sobre la función del dominio PLAG4 novedoso en la interacción con CLEC-2 y la capacidad de inducir la agregación plaquetaria

(1) Estudio sobre el nivel de expresión del mutante de Aggrus establecido

Se transfectaron células CHO con genes de mutantes de PLAG4 que albergaban una mutación aminoacídica en el dominio PLAG4 que se suponía que era un dominio PLAG novedoso. Específicamente, se transfectaron células CHO con un plásmido preparado al integrar un vector pcDNA3 con ADNc de Aggrus humano que codifica un mutante que contiene alanina remplazada en el ácido aspártico de la posición 82, que es un aminoácido en la región PLAG4 (Aggrus-D82A) o un plásmido preparado al integrar un vector pcDNA3 con ADNc de Aggrus humano que codifica un mutante que contiene alanina remplazada tanto en el ácido aspártico de la posición 48 como en el ácido aspártico de la posición 82 (Aggrus-D48A/D82A), para expresar de forma estable la proteína. En lo sucesivo en el presente documento, las células CHO transfectadas con estos plásmidos se denominan CHO/Aggrus-D82A y CHO/Aggrus-D48A/D82A, respectivamente.

Se preparó un lisado celular a partir de cada una de las líneas celular CHO/simulado, CHO/Aggrus-WT, CHO/Aggrus-D48a , CHO/Aggrus-D82A y CHO/Aggrus-D48A/D82A. Cada lisado celular se usó en análisis de inmunoelectrotransferencia usando el anticuerpo D2-40. Como resultado, la expresión de las proteínas Aggrus naturales y mutantes en los transfectantes se observó en células distintas de CHO/simulado, mientras que se confirmó que sus niveles de expresión eran casi iguales (figura 4A).

(2) Estudio sobre las funciones de PLAG3 y PLAG4 en la unión a CLEC-2

Estas líneas de CHO que expresan los genes de manera estable se usaron en FACS de la misma manera que en el ejemplo 2 para confirmar los niveles de expresión de Aggrus y la reactividad a CLEC-2 recombinante. En los paneles de la izquierda de la figura 4B, las áreas vacías representan los resultados de la tinción de Aggrus natural o los mutantes de Aggrus a través de la reacción con el anticuerpo D2-40, y las áreas rellenas representan los resultados de hacer reaccionar un anticuerpo de ratón de control (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC) en lugar del anticuerpo D2-40, como en la figura 2A. Como se muestra en la figura 4B (paneles de la izquierda), se confirmó que los niveles de expresión de las proteínas Aggrus en las membranas celulares de estos transfectantes eran casi iguales, también porque la intensidad de la fluorescencia era casi igual entre las posiciones de los picos de las áreas vacías de los paneles de la izquierda de la figura 4B.

Los paneles de la derecha de la figura 4B muestran el análisis sobre su unión a CLEC-2 por FACS de la misma manera que en el ejemplo 2. Las áreas vacías representan los resultados de la detección de CLEC-2 recombinante marcado con (His)10 unido con Aggrus natural o los mutantes de Aggrus expresados en la superficie celular de CHO usando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia que reconoce la marca de His. Las áreas rellenas representan los resultados de añadir un anticuerpo de ratón de control en lugar de la proteína CLEC-2 recombinante marcada con (His)10 y realizar la misma operación que anteriormente.

Se encontró que la unión de CLEC-2 al mutante D82A-Aggrus que alberga la sustitución del ácido aspártico en la posición 82 por alanina (CHO/Aggrus-D82A) es más débil que la unión al mutante D48A-Aggrus que alberga la sustitución del ácido aspártico en la posición 48 por alanina (CHO/Aggrus-D48A) (paneles de la derecha de la figura 4B). Se encontró que el mutante doble D48A/D82A que alberga la sustitución tanto del ácido aspártico en la posición 48 como del ácido aspártico en la posición 82 por alanina (CHO/Aggrus-D48A/D82A) no se unía a CLEC-2. Estos resultados no solo sugieren que el dominio PLAG4 recién encontrado en Aggrus desempeña una función importante en la unión a CLEC-2, junto con el dominio PLAG3, sino que sugieren que PLAG4 desempeña una función más dominante en la unión a CLEC-2 que PLAG3.

(3) Estudio sobre las funciones de PLAG3 y PLAG4 en la agregación plaquetaria

Se encontró que el dominio PLAG4 desempeña una función importante en la unión a CLEC-2. Por lo tanto, a continuación se estudió la función del dominio PLAG4 en la agregación plaquetaria. Como se menciona anteriormente, Aggrus se une a CLEC-2 en las plaquetas para transducir de este modo señales que inducen la agregación plaquetaria. Se estudió si una mutación aminoacídica en el dominio PLAG4 inhibiría la agregación plaquetaria sobre la base de la actividad inductora de la agregación plaquetaria dependiente de Aggrus mediante la prueba de inhibición de la agregación plaquetaria descrita en el ejemplo 2. Los resultados se muestran en la figura 4C.

Se estudió la capacidad de las células que expresan cada mutante de agregar plaquetas de la misma manera que en el ejemplo 2 usando las células que expresan mutantes CHO/Aggrus-D48A, CHO/Aggrus-D82A y CHO/Aggrus-D48A/D82A. La actividad inductora de la agregación plaquetaria de cada célula que expresa un mutante fue proporcional a la intensidad de unión a CLEC-2. Se encontró que el mutante D82A tiene una actividad inductora de la agregación plaquetaria más débil que la del mutante D48A, mientras que el mutante doble D48A/D82A no presenta actividad inductora de la agregación plaquetaria (figura 4C). Esto demostró que el PLAG4 identificado novedoso desempeña una función dominante en la agregación plaquetaria dependiente de Aggrus.

Para confirmar la importancia del dominio PLAG4, se transfectaron células CHO con genes de mutantes que carecían respectivamente de los dominios PLAG1, PLAG3 y PLAG4. Específicamente, se transfectaron células CHO con un plásmido preparado al integrar un vector pcDNA3 con ADNc de Aggrus humano que codifica un mutante que carece de los aminoácidos de las posiciones 29 a 34 en la región PLAG1 (Aggrus-A29-34), un plásmido preparado al integrar un vector pcDNA3 con ADNc de Aggrus humano que codifica un mutante que carece de los aminoácidos de las posiciones 47 a 52 en la región PLAG3 (Aggrus-A47-52), un plásmido preparado al integrar un vector pcDNA3 con ADNc de Aggrus humano que codifica un mutante que carece de los aminoácidos de las posiciones 81 a 85 en el región PLAG4 (Aggrus-A81-85) o un plásmido preparado al integrar un vector pcDNA3 con ADNc de Aggrus humano que codifica un mutante que carece de los aminoácidos tanto de las posiciones 47 a 52 en la región PLAG3 como de las posiciones 81 a 85 en la región PLAG4 (Aggrus-A47-52/A81-85), para expresar de manera estable la proteína (véase la figura 4D). En lo sucesivo en el presente documento, las células CHO transfectadas con estos plásmidos se denominan CHO/Aggrus-A29-34, CHO/Aggrus-A47-52, CHO/Aggrus-A81-85 y CHO/Aggrus-A47-52/A81-85, respectivamente.

Las líneas celulares que expresan mutantes CHO/Aggrus-A29-34, CHO/Aggrus-A47-52, CHO/Aggrus-A81-85 y CHO/Aggrus-A47-52/A81-85 se usaron en FACS de la misma manera que en el ejemplo 2 para confirmar los niveles de expresión de Aggrus y la reactividad con CLEC-2 (figura 4E). En este estudio, se usó un anticuerpo FL-162 disponible en el mercado (fabricado por Santa Cruz Biotechnology, Inc.) en lugar del anticuerpo D2-40 para examinar los niveles de expresión de Aggrus. Asimismo, se usó un anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con Alexa 488 (fabricado por Life Technologies Corp.) como anticuerpo secundario (paneles de la izquierda de la figura 4E). Como controles, se usa un anticuerpo de conejo de control (fabricado por Santa Cruz Biotechnology, Inc.) en lugar del anticuerpo FL-162 con cada célula y se muestran realizando la misma operación que anteriormente. Las áreas vacías representan los resultados de teñir los mutantes de Aggrus con deleción del dominio PLAG a través de la reacción con el anticuerpo FL-162, y las áreas rellenas representan los resultados de hacer reaccionar el anticuerpo de conejo de control en lugar del anticuerpo FL-162. Como se muestra en la figura 4E (paneles de la izquierda), se confirmó que los niveles de expresión de las proteínas Aggrus en la superficie celular de estos transfectantes eran casi iguales, también porque la intensidad de la fluorescencia era casi igual entre las posiciones de los picos de las áreas vacías de los paneles.

Los paneles de la derecha de la figura 4E muestran el análisis sobre la unión a CLEC-2 por FACS de la misma manera que en el ejemplo 2. Las áreas vacías representan los resultados de detectar CLEC-2 recombinante marcado con (His)io unido con los mutantes de Aggrus con deleción del dominio PLAG expresados en la superficie celular de CHO usando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia que reconoce la marca de His. Las áreas rellenas representan los resultados de añadir PBS en lugar de proteína CLEC-2 recombinante marcada con (His)10 y realizar la misma operación que anteriormente.

Como en los datos sobre los mutantes puntuales mostrados en la figura 4B, en cuanto a la interacción con CLEC-2, se encontró que la unión de CLEC-2 al mutante con deleción del dominio PLAG4 (CHO/Aggrus-A81-85) era más débil que la unión al mutante con deleción del dominio PLAG3 (CHO/Aggrus-A47-52). Se encontró que el mutante doble que carece tanto del dominio PLAG3 como del dominio P^lA^g 4 (CHO/Aggrus-A47-52/A81-85) no se unía a CLEC-2.

Estos resultados no solo sugieren que el dominio PLAG4 recién encontrado en Aggrus desempeña una función importante en la unión a CLEC-2, junto con el dominio PLAG3, sino que vuelven a confirmar que PLAG4 desempeña una función más dominante en la unión a CLEC-2 que PLAG3.

Ejemplo 5

Análisis cuantitativo sobre la función del dominio PLAG4 novedoso en la interacción con CLEC-2 y la capacidad de inducir la agregación plaquetaria

(1) Estudio sobre las funciones de PLAG3 y PLAG4 en la unión a CLEC-2

Se analizaron cuantitativamente los niveles de expresión de Aggrus y la reactividad con CLEC-2. Específicamente, la confirmación de los niveles de expresión de Aggrus y la reactividad con CLEC-2 realizada por FACS en el ejemplo 4 (véase la figura 4B) se realizaron tres veces de forma repetitiva y se promediaron. Cuando el promedio de la intensidad de fluorescencia en la posición de pico de las áreas vacías de CHo/Aggrus-WT se definió como 1, los niveles de expresión de las proteínas mutantes de Aggrus se muestran en un gráfico. Como resultado del análisis estadístico, no se obtuvo una diferencia significativa (indicada por ns) en los niveles de expresión de las proteínas mutantes de Aggrus (D48A, D82A y D48A/D82A) en comparación con el nivel de expresión de Aggrus natural, lo que muestra que los niveles de expresión eran casi iguales (paneles de la izquierda de la figura 5A). Cuando el promedio de la intensidad de fluorescencia en la posición de pico de un área vacía que muestra la reactividad con CLEC-2 se definió como 1, la reactividad de las proteínas mutantes de Aggrus con CLEC-2 se muestra en un gráfico. Se encontró que la reactividad de las proteínas mutantes de Aggrus (D48A, D82A y D48A/D82A) con CLEC-2 disminuyó significativamente (**, p <0,01; ***, p <0,001) en comparación con la reactividad de Aggrus natural con CLEC-2 definido como 1 (paneles de la derecha de la figura 5A). Por tanto, se reprodujeron los resultados del ejemplo 4.

Los mutantes por deleción de Aggrus también se analizaron cuantitativamente en cuanto a sus niveles de expresión de Aggrus y su reactividad con CLEC-2 de la misma forma que anteriormente (figura 5B). La confirmación de los niveles de expresión de Aggrus y la reactividad con CLEC-2 realizada por FACS en el ejemplo 4 (véase la figura 4E) se realizaron tres veces de forma repetitiva y se promediaron. Cuando el promedio de la intensidad de fluorescencia en la posición de pico de las áreas vacías de CHO/Aggrus-WT se definió como 1, los niveles de expresión de las proteínas mutantes por deleción de Aggrus se muestran en forma de gráfico. Como resultado del análisis estadístico, no se obtuvo una diferencia significativa (indicada por ns) en los niveles de expresión de las proteínas mutantes por deleción de Aggrus (A29-34, A47-52, A81-85 y A47-52/A81-85) en comparación con el nivel de expresión de Aggrus natural, lo que muestra que los niveles de expresión eran casi iguales (paneles de la izquierda de la figura 5B). Por otra parte, se confirmó que la reactividad con CLEC-2 estaba significativamente disminuida en los mutantes por deleción. Cuando el promedio de la intensidad de fluorescencia en la posición de pico de un área vacía que muestra la reactividad con CLEC-2 se definió como 1, la reactividad de las proteínas mutantes de Aggrus con CLEC-2 se muestra en un gráfico en los paneles de la derecha de la figura 4E. Se encontró que la reactividad de las proteínas mutantes por deleción de Aggrus (A29-34, A47-52, A81-85 y A47-52/A81-85) con CLEC-2 disminuyó significativamente (**, p <0,01) excepto para el caso de A29-34, en comparación con la reactividad de Aggrus natural con CLEC-2 definido como 1 (paneles de la derecha de la figura 5B). Por tanto, se reprodujeron los resultados del ejemplo 4.

(2) Estudio sobre las funciones de PLAG3 y PLAG4 en la agregación plaquetaria

A continuación, se estudió la capacidad de las células que expresan cada mutante de agregar plaquetas de la misma manera que en el ejemplo 2 usando CHO/simulado, CHO/Aggrus-WT, y las células que expresan mutantes CHO/Aggrus-D48A, CHO/Aggrus-D82A y CHO/Aggrus-D48A/D82A. Se confirmó la reproducibilidad de la figura 4C, que muestra que: la actividad inductora de la agregación plaquetaria de cada célula que expresa un mutante es proporcional a la intensidad de unión a CLEC-2; y el mutante D82A tiene una actividad inductora de la agregación plaquetaria más débil que la del mutante D48A. Se encontró además que las células que expresan el mutante doble D48A/D82A no presentan actividad inductora de la agregación plaquetaria, como en CHO/simulado (figura 5C). Esto volvió a confirmar que el PLAG4 identificado novedoso desempeña una función dominante en la agregación plaquetaria dependiente de Aggrus.

Ejemplo 6

Implicación de E81, D82 y T85 en el dominio PLAG4 en la unión a CLEC-2

El dominio PLAG4 identificado novedoso contiene un motivo EDXXT análogo al dominio PLAG3. El ácido glutámico (E) en la posición 81, el ácido aspártico (D) en la posición 82 y la treonina (T) en la posición 85 (figura 6B (paneles de la derecha; aminoácidos subrayados)) en el dominio PLAG4 se analizaron para determinar su implicación directa en la unión a CLEC-2. Células CHO transfectadas con un plásmido preparado al integrar un vector pcDNA3 con ADNc de Aggrus humano que codifica un mutante que contiene alanina remplazada en el ácido glutámico de la posición 81 (CHO/Aggrus-E81A), células CHO transfectadas con un plásmido preparado al integrar un vector pcDNA3 con ADNc de Aggrus humano que codifica un mutante que contiene alanina remplazada en el ácido aspártico de la posición 82 (CHO/Aggrus-D82A) y células CHO transfectadas con un plásmido preparado al integrar un vector pcDNA3 con ADNc de Aggrus humano que codifica un mutante que contiene alanina remplazada en la treonina de la posición 85 (CHO/Aggrus-T85A) se usaron en el análisis por FACS. Células CHO transfectadas con un plásmido que contiene ADNc de Aggrus humano natural (CHO/Aggrus-WT) y células CHO transfectadas con un plásmido que contiene ADNc de Aggrus humano que codifica cada mutante que contiene alanina remplazada en el ácido glutámico de la posición 47, ácido aspártico en la posición 48 o treonina en la posición 52 (figura 6A (paneles de la derecha; aminoácidos subrayados)) en el dominio PLAG3 (CHO/Aggrus-E47A, CHO/Aggrus-D48A y CHO/Aggrus-T52A) también se prepararon como controles y se analizaron de la misma manera que anteriormente.

Las células CHO que expresan Aggrus natural o mutante se usaron en FACS de la misma manera que en el ejemplo 2 para confirmar los niveles de expresión de Aggrus y la reactividad con CLEC-2. Como en la figura 2, las áreas vacías representan los resultados de la tinción de Aggrus natural o los mutantes de Aggrus a través de la reacción con el anticuerpo D2-40, y las áreas rellenas representan los resultados de hacer reaccionar un anticuerpo de ratón de control (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC) en lugar del anticuerpo D2-40. Como se muestra en las figuras 6A (paneles de la izquierda) y 6B (paneles de la izquierda), se confirmó que los niveles de expresión de las proteínas Aggrus en la superficie celular de estos transfectantes eran casi iguales, también porque la intensidad de la fluorescencia era casi igual entre las posiciones de los picos de las áreas vacías de los paneles.

Las figuras 6A (paneles de la derecha) y 6B (paneles de la derecha) muestran el análisis sobre la unión de cada mutante a CLEC-2 recombinante por FAC^s de la misma manera que en el ejemplo 2. Las áreas vacías representan los resultados de la detección de CLEC-2 recombinante marcado con (His)™ unido con Aggrus natural o los mutantes de Aggrus expresados en la superficie celular de CHO usando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia que reconoce la marca de His. Las áreas rellenas representan los resultados de añadir el anticuerpo de ratón de control en lugar de la proteína CLEC-2 recombinante marcada con (His)10 y realizar la misma operación que anteriormente.

En cuanto a la interacción con CLEC-2, la unión de CLEC-2 a los mutantes de Aggrus humano que albergan la sustitución de ácido glutámico en la posición 47, ácido aspártico en la posición 48 o treonina en la posición 52 en el dominio PLAG3 por alanina se atenuó a los mismos niveles, en comparación con la forma natural. Por tanto, se confirmó que estos tres aminoácidos estaban implicados en la unión a CLEC-2 (paneles de la derecha de la figura 6A). Se encontró además que la unión a CLEC-2 de los mutantes de Aggrus humano que albergan la sustitución de cada uno de sus sitios homólogos de ácido glutámico en la posición 81, ácido aspártico en la posición 82 y treonina en la posición 85 en el dominio PLAG4 por alanina se atenuó a los mismos niveles, en comparación con la forma natural y Aggrus humano que alberga la sustitución de ácido glutámico en la posición 47, ácido aspártico en la posición 48 o treonina en la posición 52 en el dominio PLAG3 por alanina (paneles de la derecha de la figura 6B).

Estos resultados muestran que el ácido glutámico en la posición 81, el ácido aspártico en la posición 82 y la treonina en la posición 85 en el dominio PLAG4 recién encontrado en Aggrus están implicados en la unión a CLEC-2, como con el ácido glutámico en la posición 47, el ácido aspártico en la posición 48 y la treonina en la posición 52 en el dominio PLAG3. Asimismo, se encontró que EDXXTS (dominio PLAG4) representado por SEQ ID NO: 4 desempeña una función importante en la unión a CLEC-2.

Ejemplo 7

Preparación de hibridoma que produce anticuerpo monoclonal antiAggrus humano que reconoce el dominio PLAG4 novedoso

Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales antiAggrus humano que reconocen el dominio PLAG4 se prepararon como sigue.

(1) Inmunógeno

Un sitio que codifica la región de ADNc de Aggrus humano desde un residuo de treonina en la posición 76 hasta un residuo de treonina en la posición 89 (secuencia: Thr Gly Ile Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Ser Glu Ser Thr) se conectó en tándem 12 o 40 veces y se clonó en un vector pGEX-6P-3 (fabricado por GE Healthcare Japan Corp.), y se obtuvo un inmunógeno marcado con GST. Se transformó E. coli BL21 (DE3) con este plásmido, y se purificó una proteína recombinante expresada de este modo fusionada a la marca GST con glutatión Sepharose.

(2) Sensibilización

Se administró por vía subcutánea una solución mixta del inmunógeno obtenido a 100|μg/ratón y TiterMax Gold (fabricado por TiterMax USA, Inc.) en el cuello de ratones BALB/c hembra de 6 semanas de edad (adquiridos de Charles River Laboratories Japan, Inc.). Para el refuerzo, el inmunógeno se administró por vía intraperitoneal a 100 μg/ratón un total de 9 veces en semanas alternas. Asimismo, se examinó cierta sensibilización mediante un método de administración del inmunógeno dos veces a la raíz de la cola de ratones BDF-1 hembra (adquiridos de CLEA Japan Inc.).

(3) Establecimiento de hibridoma

De acuerdo con un método de rutina, se recogieron esplenocitos o células de ganglio linfático ilíaco de los ratones inmunizados y se fusionaron con una línea celular de mieloma de ratón P3U1 usando polietilenglicol 4000. Se permitió que los hibridomas fusionados crecieran mediante cultivo en medio de clonación S-Clone (fabricado por ElDlA Co., Ltd) que contenía hipoxantina, aminopterina y timidina para establecer con éxito una pluralidad de hibridomas, que incluyeran PG4D1 y PG4D2, que produjeran anticuerpos contra el dominio PLAG4. Se establecieron con éxito una pluralidad de hibridomas que incluyen 6G42A4 y 9D62D6 a partir de las células de los ganglios linfáticos ilíacos.

Ejemplo 8

Análisis sobre las propiedades del anticuerpo monoclonal antiAggrus humano que reconoce el dominio PLAG4 novedoso

(1) Búsqueda de epítopos

El ADNc de Aggrus humano que carece de 24 aminoácidos aminoterminales, incluyendo un péptido señal, se clonó en un vector pGEX-6P-3 para preparar un vector de expresión de proteína Aggrus natural marcada con GST. En lo sucesivo en el presente documento, la proteína recombinante expresada se denomina AN24-WT. Asimismo, los conjuntos de codones correspondientes a los aminoácidos inmunógenos en las posiciones 76 a 89 se sustituyeron uno por uno por codones que codificaban alanina usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (fabricado por Agilent Technologies, Inc.) para preparar vectores de expresión de Aggrus mutante de alanina. En lo sucesivo en el presente documento, un mutante recombinante preparado por, por ejemplo, la mutación de un aminoácido treonina (T) en la posición 76 a alanina (A) se denomina AN24-T76A.

E. coli, BL21 (DE3), se transformó con cada plásmido preparado y se cultivó. Se usaron homogeneizados de E. coli como muestras para examinar la reactividad de MS-1, PG4D1, ^p G4D2, 6G42A4, 9D62D6 y un anticuerpo anti-GST (alfa-GST) (fabricado por Abcam μlc) con las proteínas de Aggrus humano recombinantes por inmunoelectrotransferencia. Como resultado, como se muestra en la figura 7A, el anticuerpo MS-1 y el anticuerpo anti-GST reconocieron todas las proteínas Aggrus, incluyendo los mutantes, mientras que el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 presentaron solo una baja reactividad con los mutantes de Aggrus que albergaban la sustitución de cada uno de los 5 aminoácidos desde la arginina en la posición 79 hasta la leucina en la posición 83 por alanina. El anticuerpo 6G42A4 y el anticuerpo 9D62D6 presentaron solo una baja reactividad con los mutantes de Aggrus que albergaban la sustitución de cada uno de los 7 aminoácidos desde la glicina en la posición 77 hasta la leucina en la posición 83 por alanina, excepto por el mutante de Aggrus que albergaba la sustitución de isoleucina en la posición 80 por alanina. Se encontró que la capacidad de reconocimiento del anticuerpo 9D62D6 se atenuaba cuando la prolina en la posición 84 se sustituía por alanina.

Por consiguiente, como se muestra en la fila inferior de la figura 7A, la región reconocida por los anticuerpos preparados era un resto peptídico de las posiciones 77 a 84 (secuencia: Gly Ile Arg Ile Glu Asp Leu Pro) indicado por los caracteres vacíos, y el epítopo más pequeño reconocido por el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 fue un resto peptídico de las posiciones 79 a 83 (secuencia: Arg Ile Glu Asp Leu), lo que demuestra que estos restos peptídicos solapan parcialmente con el dominio PLAG4 novedoso (secuencia de las posiciones 81 a 85 (en la figura 7A, la secuencia enmarcada por la línea de puntos: Glu Asp Leu Pro Thr) que tiene homología con el dominio PLAG mostrado en la figura 3B.

(2) Estudio sobre la reactividad con la proteína Aggrus expresada en células de mamífero

A diferencia de Aggrus expresado en E. coli, se sabe que Aggrus humano expresado en células de mamífero está glucosilado en muchos sitios. La reactividad del anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 desarrollados novedosos con Aggrus humano expresado en células de mamífero se estudió usando un aparato de análisis de resonancia de plasmones superficiales Biacore X100 (fabricado por GE Healthcare Japan Corp.). Una proteína Aggrus recombinante disponible en el mercado (proteína marcada con Fc de IgG1 humana; fabricada por R&D Systems, Inc.) purificada a partir de células de mamíferos se inmovilizó mediante el método de acoplamiento de amina en un chip sensor CM5 recubierto con carboximetil dextrano para obtener una cantidad inmovilizada correspondiente a 520 UR (para ensayo sobre el anticuerpo PG4D1) o 600 UR (para ensayo sobre el anticuerpo PG4D2).

El ensayo se realizó llenando el canal de flujo con un tampón HBS-EP+ (fabricado por GE Healthcare Japan Corp.) en condiciones que implican 25 °C y un caudal de 30 μl/min. Específicamente, el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 se diluyeron cada uno en 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM y 100 nM, y se hicieron fluir en el chip sensor CM5 con proteína Aggrus inmovilizada durante 60 segundos mientras se observaba la reacción de unión. Posteriormente, se hizo fluir un tampón HBS-EP+ durante 120 segundos mientras se observaba la reacción de disociación. Los datos obtenidos por el ensayo se muestran en la figura 7B.

Todos los anticuerpos desarrollados reconocieron y se unieron a la proteína Aggrus (constante de velocidad de asociación (ka) = 3 * 104). Además, no se observó sustancialmente reacción de disociación al hacer fluir tampón HBS-EP+ para el lavado, y la constante de velocidad de disociación (kd) fue igual o inferior al límite de medición del Biacore X100 usado, es decir, kd<10'5. Por consiguiente, las constantes de disociación (Kd) del anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 fueron <3 * 10-10 M, lo que demuestra que estos anticuerpos presentan una capacidad de unión muy fuerte.

(3) Capacidad de reconocer células que expresan Aggrus de forma endógena

El anticuerpo MS-1 rara vez puede reconocer células de la línea celular de carcinoma epidermoide de vejiga humana UM-UC-5, células de la línea celular de fibrosarcoma humano HT1080, etc. que expresan Aggrus de forma endógena a nivel de ARNm. Por lo tanto, el tipo de cáncer diana a tratar con el anticuerpo MS-1 está limitado. Se examinó el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 recién desarrollados para determinar si podían reconocer Aggrus expresado de forma endógena en la superficie de células UM-UC-5 o células HT1080, que no puede reconocerlo el anticuerpo MS-1. Se realizó análisis por FACS usando células UM-UC-5 y HT1080 como células diana, anticuerpos PG4D1 y PG4D2 como anticuerpos primarios, y un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con Alexa 488 como anticuerpo secundario. Como resultado, se confirmó que el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 podían reconocer tanto las células UM-UC-5 como las HT1080, que no puede reconocerlas el anticuerpo MS-1 (figura 7C).

Ejemplo 9

Estudio sobre el sitio de reconocimiento del anticuerpo monoclonal antiAggrus humano que reconoce el dominio PLAG4 novedosos y reactividad del mismo

En el ejemplo 8 (véase la figura 7A), se examinó la reactividad con la proteína Aggrus humana expresada en E. coli. Como resultado, como se muestra en la fila inferior de la figura 7A, se encontró que la región reconocida por el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 era un resto peptídico de las posiciones 77 a 84 (secuencia: Gly Ile Arg Ile Glu Asp Leu Pro) indicado por los caracteres vacíos. Por consiguiente, para confirmar la capacidad de reconocer Aggrus glucosilado expresado en células de mamífero, y un sitio de reconocimiento del mismo, se usaron lisados celulares de células c Ho transfectadas con un plásmido preparado al integrar un vector pcDNA3 con ADNc de Aggrus humano natural, mutantes de deleción de Aggrus o mutantes puntuales de Aggrus como muestras para estudiar la reactividad del anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 mediante inmunoelectrotransferencia.

Como resultado, como se muestra en la figura 8A, se confirmó que el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 no reconocen el mutante de Aggrus que carece de 5 aminoácidos en las posiciones 81 a 85 correspondientes al dominio PLAG4. Como se muestra en la figura 8B, el anticuerpo PG4D1 no reconoció el mutante D82A-Aggrus que albergaba la sustitución del ácido aspártico en la posición 82 en el dominio PLAG4 por alanina, mientras que se confirmó que el anticuerpo PG4D2 reconoce débilmente el mutante D82A-Aggrus. Esto es coherente con el hecho mostrado en la figura 7A de que, como resultado de investigar la reactividad con la proteína Aggrus humana expresada en E. coli, el anticuerpo PG4D2 reconocía débilmente el mutante D82A-Aggrus. Como también es evidente a partir de los resultados del análisis de inmunoelectrotransferencia (figura 8A y 8B) usando un anticuerpo que reconoce la a-tubulina, las concentraciones de proteína en los lisados de células sometidos a electroforesis fueron las mismas.

En el ejemplo 8 (véase la figura 7B), no se examinó si la unión era o no era específica. Por lo tanto, la reactividad del anticuerpo PG4D1 (subclase: IgG1 de ratón) y el anticuerpo PG4D2 (subclase: IgG2a de ratón) con Aggrus humano se examinó usando un aparato de análisis de resonancia de plasmones superficiales Biacore X100 (fabricado por GE Healthcare Japan Corp.), así como IgG1 de ratón de control (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC) e IgG2a de ratón de control (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC) a comparar comparado con los mismos (figuras 8C y 8D). Específicamente, una proteína Aggrus recombinante purificada disponible en el mercado (proteína marcada con Fc de IgG1 humana; fabricada por R&D Systems, Inc.) se inmovilizó mediante el método de acoplamiento de amina en un chip sensor CM5 recubierto con carboximetil dextrano para obtener una cantidad inmovilizada correspondiente a 562,2 UR (para ensayo sobre el anticuerpo PG4D1). El ensayo se realizó llenando el canal de flujo con un tampón HBS-EP+ (fabricado por GE Healthcare Japan Corp.) en condiciones que implican 25 °C y un caudal de 30 μl/min. Específicamente, la IgG1 de ratón de control (IgG1 de control) se diluyó en 3,7 nM, 11,1 nM, 33,3 nM, 100 nM y 300 nM, y se hicieron fluir en el chip sensor CM5 con proteína Aggrus inmovilizada durante 60 segundos mientras se observaba la reacción de unión. Posteriormente, se hizo fluir un tampón HBS-EP+ durante 1800 segundos mientras se observaba la reacción de disociación. Posteriormente, el anticuerpo PG4D1 se hizo fluir en las mismas condiciones usando el mismo chip sensor CM5 que anteriormente mientras se observaba la reacción de unión. Los datos obtenidos por el ensayo se muestran en la figura 8C.

A continuación, la IgG2a de ratón de control (IgG2a de control) y posteriormente el anticuerpo PG4D2 se hicieron fluir en las mismas condiciones que anteriormente en un chip sensor CM5 que tenía una cantidad inmovilizada correspondiente a 562,6 UR (para ensayo sobre el anticuerpo PG4D2) mientras se observaba la reacción de unión. Los datos obtenidos por el ensayo se muestran en la figura 8d .

Se confirmó que tanto la IgG1 de ratón de control como la IgG2a de ratón de control no se unían al chip sensor con Aggrus inmovilizado, mientras se confirmó que tanto el anticuerpo PG4D1 como el anticuerpo PG4D2 presentaban una fuerte unión, como en el ejemplo 8 (véase la figura 7B), lo que demuestra que la unión del anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 al chip sensor con Aggrus inmovilizado no es una unión inespecífica. En este ensayo, las constantes de disociación (K^d ) del anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 fueron <3 * 10-10 M, como en el ejemplo 8 (véase la figura 7B), lo que demuestra que estos anticuerpos presentan una unión muy fuerte.

Ejemplo 10

Inhibición de la unión entre Aggrus y CLEC-2 por los anticuerpos PG4D1 y PG4D2

(1) Estudio por método AlphaScreen

Los anticuerpos monoclonales PG4D1 y PG4D2 obtenidos por la presente invención se analizaron en cuanto a sus efectos inhibidores sobre la unión entre Aggrus y CLEC-2 mediante el uso del método de ensayo de proximidad homogénea no radiactiva AlphaScreen(R).

Se distribuyeron 1 ng de una proteína Aggrus recombinante purificada (proteína marcada con Fc de IgG1 humana, fabricada por R&D Systems, Inc.) y 30 ng de una proteína CLEC-2 recombinante purificada (proteína marcada con (His)io; rCLEC-2, fabricada por R&D Systems, Inc.) en placas de 96 pocillos, y se les añadieron IgG1 de ratón de control (fabricada por Sigma-Aldrich Co. LLC), IgG2a de ratón de control (fabricada por Sigma-Aldrich Co. LLC), y los anticuerpos MS-1, PG4D1, PG4D2, 6G42A4 y 9D62D6 de modo que sus concentraciones finales fueran de 12,5 μg/ml a 5 ng/ml. Después de la adición, los anticuerpos se hicieron reaccionar a 26 °C durante 1 hora. A continuación, se les añadieron microesferas donadoras AlphaScreen de quelato de níquel y microesferas aceptadoras AlphaLISA de proteína A diluidas con tampón universal AlphaLISA y se hicieron reaccionar adicionalmente a 26 °C durante 1 hora, seguido de excitación con láser que tenía una longitud de onda de 680 nm usando Envision (fabricado por PerkinElmer, Inc.).

Mediante la excitación, las microesferas donadoras convierten el oxígeno en un estado singulete, y este oxígeno en un estado singulete activa los materiales fluorescentes contenidos en las microesferas aceptadoras situadas en las proximidades de las mismas para emitir de este modo una señal de fluorescencia de 615 nm. Específicamente, la señal de fluorescencia se emite, con la condición que la proteína CLEC-2 marcada con His unida con las microesferas donadoras AlphaScreen de quelato de níquel y la proteína Aggrus recombinante marcada con Fc unida con microesferas aceptadoras AlphaLISA de proteína A estén ubicadas próximas entre sí. Por tanto, esta señal de fluorescencia puede cuantificarse para cuantificar de este modo el estado de unión entre Aggrus y CLEC-2.

Cuando la intensidad de la señal de fluorescencia sin la adición de anticuerpos se definía como 100 %, se confirmaba que todo el anticuerpo PG4D1, anticuerpo PG4D2 y anticuerpo MS-1 añadido, como se muestra en la figura 9A, inhibía la unión de Aggrus a CLEC-2 de una manera dependiente de la concentración. Particularmente, se encontró que el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 tenían una actividad inhibidora más fuerte que la del anticuerpo MS-1. Aunque la actividad de inhibición de la unión entre Aggrus y CLEC-2 también se observó en los anticuerpos 6G42A4 y 9D62D6, el efecto fue más débil que el del anticuerpo MS-1 (figura 9B).

Este resultado muestra que el resto peptídico de las posiciones 77 a 84, que es una región reconocida como epítopo por los anticuerpos, es importante para la unión de Aggrus a CLEC-2. Asimismo, es evidente a partir del análisis del ejemplo 6 que usa los mutantes puntuales, que la treonina en la posición 85 es importante para la unión de Aggrus a CLEC-2. Por tanto, se concluyó que la secuencia de aminoácidos de las posiciones 77 a 85 (SEQ ID NO: 1: GIRIEDLPT) es una secuencia importante para la unión de Aggrus a CLEC-2.

La región representada por SEQ ID NO: 1 es una región necesaria para la unión de Aggrus a CLEC-2, y la región de SEQ ID NO: 3 (RIEDL) reconocida por el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 se considera que es una región de núcleo del mismo. Por tanto, puede sintetizarse y administrarse un péptido que comprende la región de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 para inhibir de este modo la unión entre CLEC-2 y Aggrus e inhibir la unión entre CLEC-2 y Aggrus. Si puede inhibirse la unión entre CLEC-2 y Aggrus, puede inhibirse la agregación plaquetaria y puede inhibirse la progresión del cáncer y la metástasis. Por lo tanto, se obtiene una composición farmacéutica que contiene la región como principio activo.

El péptido necesario para la inhibición competitiva puede ser cualquier péptido que comprenda la región de SEQ ID NO: 1 o 3. Se prefiere que el péptido no sea muy grande, teniendo en cuenta la síntesis o el efecto del péptido. Específicamente, se prefiere un péptido que comprenda la región de SEQ ID NO: 1 o 3 y que tenga una secuencia peptídica más larga en aproximadamente varios aminoácidos a varias decenas de aminoácidos que la región, y la propia secuencia peptídica de SEQ ID NO: 1 o 3 es más preferida.

(2) Estudio por FACS

La inhibición de la unión entre Aggrus y CLEC-2 por el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 se analizó por FACS. El análisis se realizó sobre si los anticuerpos monoclonales anti-Aggrus inhibirían la unión de células CHO/Aggrus-WT a CLEC-2 recombinante (rCLEC-2). La detección se realizó usando un anticuerpo que reconoce una marca de His en CLEC-2 recombinante.

Específicamente, las células CHO/Aggrus-WT se recuperaron de un recipiente de cultivo, se lavaron con PBS y luego se ajustaron a una densidad celular de 1,5 * 105 células/ml. A 100 μl de la solución de reacción, se añadió IgG de ratón de control (100 μg/ml; una muestra sin rCLEC-2 o de rCLEC-2 solo), el anticuerpo PG4D1 (100 μg/ml; muestra de PG4D1 rCLEC-2), el anticuerpo PG4D2 (100μg/ml: muestra de PG4D2 rCLEC-2) o el anticuerpo MS-1 (100 μg/ml; muestra de MS-1 rCLEC-2) y se hizo reaccionar en hielo durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron con PBS y luego se añadió a las muestras 0,4 μg/ml de proteína CLEC-2 recombinante (rCLEC-2) marcada con (His)10 purificada de células de mamífero, excepto para sin rCLEC-2, y se hizo reaccionar en hielo durante 30 minutos. Después del lavado con PBS, se le añadió un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia que reconoce la marca His y se hizo reaccionar adicionalmente en hielo durante 30 minutos. Para finalizar, las células se lavaron con PBS tres veces, seguido de análisis usando Cytomics FC500. Como resultado, como se muestra en la figura 10A, el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 inhibieron la unión de rCLEC-2 a las células que expresan Aggrus, como con el anticuerpo MS-1, aunque se confirmó el gran desplazamiento de los picos hacia la izquierda porque su actividad inhibitoria era más fuerte que la del anticuerpo MS-1.

El anticuerpo MS-1 reconoce una región sobre los dominios PLAG2 y PLAG3 (véase la figura 1), mientras que el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 reconocen una región sobre el dominio PLAG4 y sus cercanías (véase la figura 7). Por consiguiente, se examinó el cambio en la capacidad del anticuerpo MS-1 de reconocer Aggrus tras la unión del anticuerpo PG4D1 o el anticuerpo PG4D2 a Aggrus. Se preparó un anticuerpo MS-1 marcado con DyLight594 y un anticuerpo PG4D2 marcado con DyLight594. Específicamente, el anticuerpo MS-1 y el anticuerpo PG4D2 se marcaron con fluorescencia usando el kit de marcaje de anticuerpos a microescala DyLight594 (fabricado por Life Technologies Corp.) de acuerdo con las instrucciones.

La línea celular CHO/Aggrus-WT se recuperó de un recipiente de cultivo, se lavó con PBS y luego se ajustó a una densidad celular de 1,5 * 105 células/ml. Se le añadió el anticuerpo MS-1 marcado con DyLight594 o el anticuerpo PG4D2 marcado con DyLight594 y se hizo reaccionar en hielo durante 30 minutos. Para algunas muestras, se añadió un anticuerpo MS-1 o un anticuerpo PG4D2 no marcado al añadir el anticuerpo marcado con DyLight594. A continuación, las células se lavaron con PBS tres veces, seguido de análisis usando Cytomics FC500. Las áreas rellenas representan los resultados de hacer reaccionar un anticuerpo de ratón de control no marcado (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC) en lugar del anticuerpo marcado con fluorescencia con las células y realizar la misma operación que anteriormente.

Como se muestra en la figura 10B (paneles superiores), los picos de las áreas vacías se desplazaron hacia la derecha con respecto a las áreas rellenas, porque el anticuerpo MS-1 y el anticuerpo PG4D2 estaban suficientemente marcados con DyLight594. La reactividad del anticuerpo MS-1 marcado con DyLight594 con las células CHO/Aggrus-WT se inhibió en presencia del anticuerpo MS-1 no marcado de una manera dependiente de la concentración del anticuerpo MS-1 no marcado (panel central izquierdo de la figura 10B), pero no se inhibió en presencia del anticuerpo PG4D2 no marcado (panel inferior izquierdo de la figura 10B). La reactividad del anticuerpo PG4D2 marcado con DyLight594 con las células CHO/Aggrus-WT se inhibió en presencia del anticuerpo PG4D2 no marcado de una manera dependiente de la concentración del anticuerpo PG4D2 no marcado (panel inferior derecho de la figura 10B), pero no se inhibió en presencia del anticuerpo MS-1 no marcado (panel central derecho de la figura 10B). Esto sugirió que el anticuerpo MS-1 y el anticuerpo PG4D2 reconocen los dominios PLAG3 y PLAG4, respectivamente, y de este modo inhiben la unión entre Aggrus y CLEC-2, y en otras palabras, los dominios PLAG3 y PLAG4 están implicados de forma independiente en la unión a CLEC-2.

Si el anticuerpo MS-1 y el anticuerpo PG4D2 reconocen los dominios PLAG3 y PLAG4, respectivamente, e inhiben la unión a CLEC-2, se consideró la posibilidad de que el uso combinado del anticuerpo MS-1 y el anticuerpo PG4D2 pudiera inhibir completamente la unión entre Aggrus y CLEC-2. Por consiguiente, para examinar la posibilidad, se analizó la unión entre Aggrus y CLEC-2 por FACS usando el anticuerpo MS-1 solo y el anticuerpo MS-1 en combinación con el anticuerpo PG4D2. El análisis se realizó sobre si el anticuerpo MS-1 y el anticuerpo PG4D2 inhibirían la unión de células CHO/Aggrus-WT a CLEC-2 recombinante (rCLEC-2). La detección se realizó usando un anticuerpo que reconoce una marca de His en CLEC-2 recombinante (figura 10C).

Específicamente, las células CHO/Aggrus-WT se recuperaron de un recipiente de cultivo, se lavaron con PBS y luego se ajustaron a una densidad celular de 1,5 * 105 células/ml. A 100 μl de la solución de reacción, se añadió IgG de ratón de control (100 |μg/ml; una muestra sin rCLEC-2 o de rCLEC-2 solo), el anticuerpo PG4D2 (100 |μg/ml: muestra de PG4D2 rCLEC-2) o la combinación del anticuerpo PG4D2 y el anticuerpo MS-1 (100 μg/m l cada uno: muestra de PG4D2 MS-1 rCLEC-2) y se hizo reaccionar en hielo durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron con PBS y luego se añadió a las muestras 0,4 μg/m l de proteína CLEC-2 recombinante (rCLEC-2) marcada con (His)™ purificada de células de mamífero, excepto para sin rCLEC-2, y se hizo reaccionar en hielo durante 30 minutos. Después del lavado con PBS, se le añadió un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia que reconoce la marca His y se hizo reaccionar adicionalmente en hielo durante 30 minutos. Para finalizar, las células se lavaron con PBS tres veces, seguido de análisis usando Cytomics FC500. Como resultado, como se muestra en la figura 10C, el uso combinado del anticuerpo PG4D2 y el anticuerpo MS-1 inhibió la unión de rCLEC-2 más fuertemente que el anticuerpo PG4D2 solo, ya que el pico está muy desplazado hacia la izquierda.

Estos resultados demostraron que: el dominio PLAG4 reconocido por el anticuerpo PG4D1 o el anticuerpo PG4D2 está implicado en la unión a CLEC-2 independientemente del dominio PLAG3; y la inhibición más fuerte de la unión a CLEC-2 se observa mediante el uso combinado de un anticuerpo que reconoce el dominio PLAG4 y un anticuerpo que reconoce el dominio PLAG3.

Ejemplo 11

Análisis sobre la inhibición de la unión a CLEC-2 y la inhibición de la agregación plaquetaria por los anticuerpos PG4D1 y PG4D2 usando un mutante de Aggrus

(1) Inhibición de la unión a CLEC-2

Aggrus se une a CLEC-2 en las plaquetas para transducir de este modo señales que inducen la agregación plaquetaria. Se examinó el dominio PLAG4 reconocido por el anticuerpo PG4D1 o el anticuerpo PG4D2 en cuanto a su implicación directa en la unión a CLEC-2 y la agregación plaquetaria. El estudio se realizó utilizando células CHO transfectadas con un plásmido preparado al integrar un vector pcDNA3 con ADNc de Aggrus humano que codifica un mutante que contiene alanina remplazada en el ácido aspártico de la posición 48 en el dominio PLAG3 (CHO/Aggrus-D48A). El uso del mutante Aggrus-D48A expresado elimina la implicación del dominio PLAG3 de Aggrus en la unión a CLEC-2 y permite la evaluación de la unión del dominio PLAG4 a CLEC-2. Se analizó la implicación directa del dominio PLAG4 en la unión de Aggrus a CLEC-2 por FACS.

Las células CHO/Aggrus-D48A se recuperaron de un recipiente de cultivo, se lavaron con PBS y luego se ajustaron a una densidad celular de 1,5 * 105 células/ml. A 100 j l de la solución de reacción, se añadió PBS (muestra sin rCLEC-2 o de añadir nada de anticuerpo), concentraciones variables del anticuerpo PG4D1 (panel de la izquierda de la figura 11A) o concentraciones variables del anticuerpo PG4D2 (panel de la derecha de la figura 11A) y se hizo reaccionar en hielo durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron con PBS y se añadió a las muestras 0,4 μg/m l de proteína CLEC-2 recombinante (rCLEC-2) marcada con (His)™ purificada de células de mamífero, excepto para sin rCLEC-2, y se hizo reaccionar en hielo durante 30 minutos. Después del lavado con PBS, se le añadió un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia que reconoce la marca His y se hizo reaccionar adicionalmente en hielo durante 30 minutos. Para finalizar, las células se lavaron con PBS tres veces, seguido de análisis usando Cytomics FC500. Como se muestra en la figura 11A, se encontró que la unión de rCLEC-2 a las células que expresan Aggrus se inhibía mediante la adición del anticuerpo PG4D1 o el anticuerpo PG4D2 de forma dependiente de la concentración, y se inhibía casi por completo mediante la adición a una concentración de 100 μg/ml. Estos resultados demostraron que el dominio PLAG4 reconocido por el anticuerpo PG4D1 o el anticuerpo PG4D2 está directamente implicado en la unión a CLEC-2.

(2) Inhibición de la agregación plaquetaria

A continuación, se confirmó la unión del dominio PLAG4 a CLEC-2 mediante una prueba de inhibición de la agregación plaquetaria. Específicamente, se realizó análisis de la agregación plaquetaria in vitro usando plaquetas de ratón lavadas mediante el control de la transmisión de luz usando MCM HEMA TRACER 313M. Como se muestra en la figura 11B, las células CHO/Aggrus-D48A indujeron la agregación plaquetaria, mientras se observó que la adición de 50 ng/ml de anticuerpo PG4D2 evitaba la agregación plaquetaria (figura 11B). Se confirmó casi el mismo efecto inhibidor de la agregación plaquetaria incluso cuando se añadía de antemano el anticuerpo PG4D1 (no mostrado). Estos resultados demostraron que: el dominio PLAG4 reconocido por el anticuerpo PG4D1 o el anticuerpo PG4D2 está directamente implicado en la agregación plaquetaria; y los anticuerpos recién desarrollados son anticuerpos neutralizantes que inhiben la agregación plaquetaria al enmascarar el dominio PLAG4 mediante la unión al dominio.

Se examinó la diferencia entre el anticuerpo PG4D1 o el anticuerpo PG4D2 que reconoce el dominio PLAG4 y el anticuerpo MS-1 que reconoce el dominio PLAG3, y un efecto conseguido mediante el uso combinado del anticuerpo PG4D2 y el anticuerpo MS-1 mediante la prueba de inhibición de la agregación plaquetaria. El análisis de agregación plaquetaria in vitro se realizó de la misma manera que anteriormente usando células CHO/Aggrus-WT. Como se muestra en la figura 12A, las células CHO/Aggrus-WT indujeron la agregación plaquetaria, mientras se observó que el tiempo de inicio de la agregación plaquetaria se retardó mediante la adición de 10 μg/m l de anticuerpo MS-1, anticuerpo PG4D1 o anticuerpo PG4D2 en comparación con la adición de un anticuerpo de control (IgG de control) (figura 12A). Se encontró que la actividad inhibidora de la agregación plaquetaria del anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 era más fuerte que la del anticuerpo MS-1 y, por lo tanto, retardaba el tiempo de inicio de la agregación.

Se confirmó además que la agregación plaquetaria dependiente de las células CHO/Aggrus-WT se inhibía casi por completo mediante el uso combinado de 10 μg/m l de anticuerpo MS-1 y 10|μg/ml de anticuerpo PG4D2 en comparación con la adición del anticuerpo PG4D2 solo (figura 12B). Estos resultados demostraron que tanto el dominio PLAG4 reconocido por el anticuerpo PG4D1 o el anticuerpo PG4D2 como el dominio PLAG3 reconocido por el anticuerpo MS-1 están implicados en la agregación plaquetaria.

Ejemplo 12

Inhibición de metástasis hematógena al pulmón mediante anticuerpos PG4D1 y PG4D2

Se sabe que los nódulos metastásicos del pulmón se forman aproximadamente 20 días después de la inyección intravenosa de células CHO que expresan Aggrus humano en ratones atímicos. Los autores de la presente invención ya han divulgado que la metástasis pulmonar dependiente de Aggrus se inhibe por el anticuerpo MS-1 (publicación de patente 2). Por consiguiente, se analizó si la metástasis hematógena dependiente de Aggrus se inhibiría mediante la administración del anticuerpo anti-Aggrus de la presente invención 1 día antes del trasplante de las células.

El análisis se realizó usando ratones atímicos BALB/c-nu hembra de 6 semanas de edad (adquiridos de Charles River Laboratories Japan, Inc.). Un día antes del trasplante de las células CHO/Aggrus-WT (células tumorales), se administró un anticuerpo de ratón de control (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC), anticuerpo MS-1, anticuerpo PG4D1 o anticuerpo PG4D2 a una dosis de 10 μg/ratón desde las venas de la cola de los ratones. Al día siguiente, las células CHO/Aggrus-WT se recuperaron de un recipiente de cultivo, se lavaron con PBS, luego se ajustaron a una densidad celular de 2,5 * 106 células/ml, y se trasplantaron por vía intravenosa a 100 jl/ratón. Como se muestra en la figura 13, la formación de metástasis pulmonar de las células CHO/Aggrus-WT se inhibió de forma destacable mediante la administración del anticuerpo PG4D1 o el anticuerpo PG4D2 el día anterior a la inoculación del tumor, como con la administración del anticuerpo MS-1 el día antes de la inoculación del tumor. Por tanto, se encontró que el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 no solo tienen actividad neutralizante de Aggrus, sino que también inhiben fuertemente la metástasis hematógena dependiente de Aggrus.

Se realizó un estudio similar usando un anticuerpo de control de isotipo coincidente que tenía una subclase idéntica a la de cada anticuerpo. Este estudio se realizó usando 8 ratones atímicos BALB/c-nu hembra de 5 semanas de edad por grupo (adquiridos de Charles River Laboratories Japan, Inc.). Un día antes del trasplante de las células CHO/Aggrus-WT (células tumorales), se administró IgG1 de ratón de control (IgG1 de control, fabricada por Sigma-Aldrich Co. LLC), IgG2a de ratón de control (IgG2a de control, fabricada por Sigma-Aldrich Co. LLC), anticuerpo PG4D1, anticuerpo PG4D2 o anticuerpo MS-1 a una dosis de 10 μg/ratón desde las venas de la cola de los ratones. Al día siguiente, las células CHO/Aggrus-WT se recuperaron de un recipiente de cultivo, se lavaron con PBS, luego se ajustaron a una densidad celular de 2,5 * 106 células/ml, y se trasplantaron por vía intravenosa a 100 jl/ratón. Después de 19 días, sus pulmones se recolectaron y analizaron. Como se muestra en la figura 14A, se tomaron fotografías después de la tinción usando ácido pícrico para visualizar los focos metastásicos. Además, se contó el número de focos metastásicos en la superficie pulmonar (figura 14B). Se confirmó que la metástasis pulmonar de las células CHO/Aggrus-WT se inhibía significativamente (**, p <0,01) mediante la administración de anticuerpo PG4D1 o anticuerpo PG4D2 el día anterior a la inoculación del tumor, como con el anticuerpo MS-1, en comparación con cada grupo de administración de anticuerpo de control de isotipo coincidente.

Por tanto, se encontró que el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 no solo tenían actividad de neutralización de la agregación plaquetaria dependiente de Aggrus, sino que inhibían fuertemente la metástasis hematógena dependiente de Aggrus. Se ha informado de que la agregación plaquetaria está implicada en la formación de nichos metastásicos (formación de microambientes metastásicos) de células cancerosas. A partir de esto, se considera que el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 son eficaces para inhibir la formación de nichos asociada con la metástasis. Además, también se ha mostrado la implicación de las plaquetas en el crecimiento tumoral en focos primarios. Por lo tanto, también se sugiere que el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 ejercen un efecto inhibidor de la metástasis al inhibir el crecimiento de cáncer metastásico en un órgano metastásico.

Ejemplo 13

Demostración del efecto de la inhibición de la metástasis pulmonar de células LC-SCC-015 mediante el anticuerpo PG4D2 que reconoce el dominio PLAG4

La línea celular de carcinoma epidermoide de pulmón humano LC-SCC-015 establecida por los autores de la presente invención se trasplantó a ratones SCID CB-17 macho de 5 semanas de edad (adquiridos de Charles River Laboratories Japan, Inc.) (3 ratones por grupo). Específicamente, un día antes del trasplante de las células LC-SCC-015 (células tumorales), se administró por vía intravenosa IgG2a de ratón de control (IgG2a de ratón, fabricada por Sigma-Aldrich Co. LLC) o anticuerpo PG4D2 a una dosis de 30 μg/ratón. Al día siguiente, las células LC-SCC-015 se recuperaron de un recipiente de cultivo, se lavaron con PBS, luego se ajustaron a una densidad celular de 2,5 * 106 células/ml, y se trasplantaron a 100 μl/ratón desde las venas de la cola. Después de 31 días, sus pulmones se recolectaron y se tiñeron usando ácido pícrico para visualizar los focos metastásicos, y luego se contó el número de focos metastásicos en la superficie pulmonar (figura 15). Se confirmó que la metástasis pulmonar se inhibía significativamente (*, p <0,05) mediante la administración de anticuerpo PG4D2 el día anterior a la inoculación del tumor, incluso cuando se compara con el grupo de administración de anticuerpo IgG2a de ratón de control.

El anticuerpo PG4D2 no solo tuvo actividad neutralizante de la agregación plaquetaria dependiente de Aggrus, sino que también se confirmó la implicación de la agregación plaquetaria dependiente de Aggrus en la metástasis pulmonar hematógena para la metástasis pulmonar de la línea celular de carcinoma epidermoide de pulmón humano establecida LC-SCC-015. Se encontró que el anticuerpo PG4D2 inhibía la metástasis pulmonar de las células LC-SCC-015 al inhibir fuertemente la metástasis hematógena dependiente de Aggrus.

Se ha informado de que la agregación plaquetaria está implicada en la formación de nichos metastásicos (formación de microambientes metastásicos) de células cancerosas. A partir de esto, se considera que el anticuerpo PG4D2 también es eficaz para inhibir la formación de nichos asociada con la metástasis. Además, también se ha mostrado la implicación de las plaquetas en el crecimiento tumoral en focos primarios. Por lo tanto, también se sugiere que el anticuerpo PG4D2 ejerce un efecto inhibidor de la metástasis al inhibir el crecimiento del cáncer metastásico en un órgano metastásico.

Ejemplo 14

Examen del efecto de la inhibición del crecimiento de tumor PC-10 mediante el anticuerpo PG4D2 que reconoce el dominio PLAG4

Una línea celular de carcinoma epidermoide de pulmón humano PC-10 se trasplantó por vía subcutánea en ratones SCID NOD macho de 5 semanas de edad (NOD.CB17-Prkdcscid/J; adquiridos de Charles River Laboratories Japan, Inc.) (4 o 5 ratones por grupo). Cuando los volúmenes de los tumores alcanzaron aproximadamente 80 mm311 días después del trasplante de las células PC-10, los ratones se agruparon de modo que los volúmenes de los tumores estaban casi igualados los grupos. A continuación, se administró por vía intravenosa IgG2a de ratón de control (IgG2a de control, fabricada por Sigma-Aldrich Co. LLC) a una dosis de 200 μg/ratón (n = 5), anticuerpo PG4D2 a una dosis de 100 μg/ratón (n = 4), anticuerpo MS-1 a una dosis de 100 μg/ratón (n = 5) o la combinación de anticuerpo PG4D2 y anticuerpo MS-1 a una dosis total de 200 μg (100 μg cada uno)/ratón (n = 4). Cuando el día de inicio de la administración de anticuerpo se definió como 0 días, se administró la misma cantidad que anteriormente del anticuerpo 3, 7, 10, 14, 17, 21 y 24 días después.

Como se muestra en la figura 16, el crecimiento del tumor se inhibió en el grupo de administración de anticuerpo PG4D2 o anticuerpo MS-1 en comparación con el grupo de administración de anticuerpo de ratón de control. La misma tendencia se obtuvo en el caso del tratamiento combinado con anticuerpo PG4D2 y anticuerpo MS-1. Se observó una ligera potenciación del efecto inhibidor del tumor en el uso combinado. Aunque se observó regresión completa del tumor en un ratón de cada uno de los grupos de administración de anticuerpo PG4D2 (el grupo que recibió el anticuerpo PG4D2 solo y el grupo que recibió el anticuerpo PG4D2 y el anticuerpo MS-1 en combinación), estos ratones se excluyeron del cálculo de los promedios de los volúmenes de los tumorales teniendo en cuenta la posibilidad de la especificidad de las células PC-10 o la diferencia entre los ratones individuales. Sin embargo, debido a que la regresión del tumor se observó solo en los grupos de administración de anticuerpo PG4D2, existe la posibilidad de que el anticuerpo PG4D2 tenga un fuerte efecto antitumoral diferente al del anticuerpo MS-1.

En este estudio, se usaron ratones SCID NOD, que son ratones con inmunodeficiencia combinada grave. Los ratones atímicos usados en el ejemplo 12 o los ratones SCID usados en el ejemplo 13 son ratones deficientes de linfocitos T y linfocitos B, mientras que los ratones SCID NOD no solo son deficientes de linfocitos T y linfocitos B, sino que tienen actividad NK reducida. Por tanto, se considera que los efectos antitumorales de los anticuerpos neutralizantes de Aggrus observados en el experimento del ejemplo 14 usando ratones SCID NOD no dependen ni de la actividad ADCC ni de la actividad CDC de los anticuerpos. Se sugirió que los anticuerpos que reconocen el dominio PLAG3 o PLAG4, usados aquí, neutralizan la actividad inductora de la agregación plaquetaria de Aggrus y, de este modo, inhiben la liberación de diferentes factores de crecimiento desde las plaquetas, provocando en consecuencia la inhibición del crecimiento. Por consiguiente, se sugirió que el anticuerpo PG4D2 inhibe el crecimiento tumoral en focos primarios al agotar indirectamente los factores de crecimiento, no destruyendo directamente las células PC-10. Por lo tanto, se encontró que el anticuerpo que reconoce el dominio PLAG4 no solo inhibe la metástasis hematógena como se muestra en los ejemplos 12 y 13, sino que inhibe el crecimiento tumoral en focos primarios.

Ejemplo 15

Estudio sobre la actividad neutralizante de Aggrus del anticuerpo PG4D2 quimérico humano-de ratón

Se clonó un gen que codifica el sitio de reconocimiento antigénico del anticuerpo PG4D2 y se unió a un gen que codifica el sitio Fc de IgG4 humana para preparar un anticuerpo PG4D2 quimérico humano-de ratón de tipo IgG4 (Ch.PG4D2-IgG4SP). Asimismo, el gen clonado se unió a un gen que codifica el sitio Fc de IgG1 humana para preparar un anticuerpo PG4D2 quimérico humano-de ratón de tipo IgG1 (Ch.PG4D2-IgG1).

La figura 17A muestra los resultados del examen de la reactividad de cada anticuerpo que reconoce a Aggrus de la misma forma que en el ejemplo 2 usando células CHO/Aggrus-WT. El panel de la izquierda muestra los resultados de hacer reaccionar las células CHO/Aggrus-WT con el anticuerpo de ratón no quimérico PG4D2 a las concentraciones mostradas en el dibujo y lavar las células con PBS, seguido de reacción con anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con Alexa 488 (anti-IgG de ratón-Alexa488) como anticuerpo secundario. El panel central muestra los resultados de hacer reaccionar las células CHO/Aggrus-WT con el anticuerpo PG4D2 quimérico humano-de ratón de tipo IgG4 (Ch.PG4D2-IgG4SP) a las concentraciones mostradas en el dibujo, y lavar las células con PBS, seguido de reacción con anticuerpo anti-IgG humana marcado con Alexa 488 (anti-IgG humana-Alexa488) como anticuerpo secundario. El panel de la derecha muestra los resultados de hacer reaccionar las células CHO/Aggrus-WT con el anticuerpo PG4D2 quimérico humano-de ratón de tipo IgG1 (Ch.PG4D2-IgG1) a las concentraciones mostradas en el dibujo, y lavar las células con PBS, seguido de reacción con anticuerpo anti-IgG humana marcada con Alexa 488 como anticuerpo secundario. Se confirmó que los anticuerpos quiméricos Ch.PG4D2-IgG4SP y Ch.PG4D2-IgG1 mostraban reactividad con Aggrus.

La figura 17B muestra los resultados de analizar la inhibición de la unión de Aggrus a CLEC-2 por FACS de la misma forma que en el ejemplo 10. El ensayo se realizó usando el anticuerpo de ratón no quimérico, anticuerpo PG4D2 (panel superior de la figura 17B), el anticuerpo PG4D2 quimérico humano-de ratón de tipo IgG4 (Ch.PG4D2-IgG4SP) (panel inferior izquierdo de la figura 17B) y el anticuerpo PG4D2 quimérico humano-de ratón de tipo IgG1 (Ch.PG4D2-IgG1) (panel inferior derecho de la figura 17B). En cada ensayo, se usó un anticuerpo de la misma especie y subclase que el anticuerpo de control. Específicamente, se usó IgG2a de ratón de control (fabricada por Sigma-Aldrich Co. LLC), IgG4 humana de control (fabricada por Sigma-Aldrich Co. LLC) e IgG1 humana de control (fabricada por Sigma-Aldrich Co. LLC).

Como resultado, el anticuerpo PG4D2 quimérico humano-de ratón de tipo IgG4 (Ch.PG4D2-IgG4SP) presentó actividad neutralizante de Aggrus casi equivalente a la del anticuerpo de ratón no quimérico original, anticuerpo PG4D2, mientras que el anticuerpo PG4D2 quimérico humano-de ratón de tipo IgG1 (Ch.PG4D2-IgG1) tenía una actividad neutralizante de Aggrus más débil. Por lo tanto, aunque la cantidad necesaria del anticuerpo Ch.PG4D2-IgG1 para inhibir la unión a CLEC-2 fue mayor que la del anticuerpo PG4D2 original, 60 μg/ml de Ch.PG4D2-IgG1 fueron suficientes para que la reacción inhibiera la unión de Aggrus a rCLEC-2.

Ejemplo 16

Inmunotinción usando un corte de tejido de osteosarcoma y usando anticuerpo PG4D1 y anticuerpo PG4D2

Se adquirió una micromatriz de tejido de tumor maligno de hueso y cartílago, que contiene 4 casos de tumor maligno (2 de cada uno de condrosarcoma, osteosarcoma y sarcoma de Ewing), núcleos cuádruples por caso (producto n.° T264a) de US Biomax, Inc., y se realizó tinción HE de acuerdo con un método de rutina (figura 18A).

En esta matriz de tejido, se localizan cuatro cortes por caso de dos cada una de las muestras de tejido de condrosarcoma, osteosarcoma y sarcoma de Ewing, y feocromocitoma como marcador hístico, y puede analizarse la expresión de proteínas en tejidos tumorales de pacientes que difieren en el estadio de la enfermedad mediante inmunotinción. Se usaron dos casos de osteosarcoma montados en este portaobjetos para estudiar la capacidad de D2-40, PG4D1 y PG4D2 de reconocer el osteosarcoma mediante inmunotinción.

La inmunotinción se realizó mediante el siguiente método usando un anticuerpo monoclonal D2-40 (Dako; producto n.° M3619, anticuerpo monoclonal de ratón antipodoplanina), anticuerpo PG4D1 (5 mg/ml) o anticuerpo PG4D2 (5 mg/ml) como anticuerpo primario. Específicamente, el portaobjetos se desparafinó, después se lavó con agua, se sumergió en peróxido de hidrógeno a 0,30 en agua/metanol a temperatura ambiente durante 10 minutos y se lavó con PBS durante 5 minutos tres veces repetitivas. A continuación, el portaobjetos se sumergió en Blocking One P (fabricado por Nacalai Tesque, Inc., n.° 05999-84) a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego se lavó con PBS durante 5 minutos. En el caso de usar el anticuerpo D2-40 como anticuerpo primario, este anticuerpo entonces se diluyó 1/100 con PBS y se incubó a 4 °C durante 16 horas. En el caso de usar el anticuerpo PG4D1 o PG4D2 como anticuerpo primario, este anticuerpo se diluyó 1/1000 con PBS (concentración final de anticuerpo: 5 μg/ml) y se incubó a 4 °C durante 16 horas. Para el anticuerpo D2-40, fue difícil calcular su cantidad en una escala de gramos porque se usó un sobrenadante de cultivo. Por lo tanto, como se indica a continuación, las concentraciones de anticuerpo se seleccionaron para la tinción de modo que el grado de tinción de un tejido de control fuera equivalente entre todos los anticuerpos. Después de lavar tres veces repetitivas con PBS durante 5 minutos, se le hizo reaccionar One-Step Polymer-HRP (fabricado por BioGenex Laboratories, Inc., n.° HK595-50K) como anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de lavar tres veces repetitivas con PBS durante 5 minutos, se reveló el color durante 5 minutos usando DAB (nombre comercial: Super Sensitive DAB (listo para usar), fabricado por BioGenex Laboratories, Inc., n.° HK542-XAK). Después de lavar con agua, los núcleos se tiñeron con contraste sumergiéndolos en una solución de hematoxilina de Mayer (fabricada por Muto Pure Chemicals Co., Ltd., n.° 3000-2) durante 1 minuto, seguido de lavado con agua, deshidratación, limpieza y montaje de acuerdo con los métodos de rutina.

Como se menciona anteriormente, los tejidos tumorales de dos casos de osteosarcoma se montan en el portaobjetos T264a que sirve como matriz de tejido. Los tejidos tumorales de A3 y A6 mostrados en la figura 18A se obtienen del primer caso de osteosarcoma (hombre de 10 años de edad) y los tejidos tumorales de B1 y B4 se obtienen del segundo caso de osteosarcoma (mujer de 21 años de edad). Como se muestra en la figura 18B, en condiciones de comparación donde el grado de tinción del tejido tumoral de control (feocromocitoma) colocado en D7 era casi igual entre los anticuerpos, el grado de inmunotinción usando anticuerpo PG4D1 o anticuerpo PG4D2 fue mayor que el grado de tinción con anticuerpo D2-40, lo que demuestra que el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 tienen una mayor capacidad de reconocer el osteosarcoma que el anticuerpo D2-40. Esto sugiere que estos anticuerpos son útiles como fármacos que inhiben el crecimiento o la metástasis de al menos el osteosarcoma.

La expresión de Aggrus puede confirmarse a nivel de ARNm, pero es posible que no se detecte usando un anticuerpo. Por tanto, ha habido preocupaciones sobre la aplicación terapéutica limitada de anticuerpos contra Aggrus. Por ejemplo, los autores de la presente invención mostraron que el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 reconocen las células de la línea celular de carcinoma epidermoide de vejiga humana UM-UC-5 o las células de la línea celular de fibrosarcoma humano HT1080, que no pueden reconocerse por el anticuerpo MS-1 (figura 7C). Aunque se desconoce el mecanismo por el que Aggrus puede o no puede reconocerse dependiendo del tipo de cáncer, se considera que el anticuerpo PG4D1 y el anticuerpo PG4D2 pueden aplicarse al tratamiento de al menos el osteosarcoma que se muestra aquí, así como el carcinoma epidermoide de vejiga, fibrosarcoma y carcinoma epidermoide de pulmón para los que se probó la unión en los sistemas experimentales usando líneas celulares.

Como describe anteriormente, un anticuerpo antiAggrus que se une a la región representada por SEQ ID NO: 1 inhibe la unión de Aggrus a CLEC-2 y, de este modo, inhibe la agregación plaquetaria e inhibe la progresión del cáncer o la metástasis. Además, un fármaco que inhiba la unión a CLEC-2 puede detectarse usando la unión de esta región a CLEC-2 como índice.

N.° de depósito

NITE BP-03041

NITE BP-03042

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo, que se une específicamente a una región de Aggrus que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3 (RIEDL), y que tiene una constante de disociación (K_D) para Aggrus de <3 * 10-10 M, medida por BIACORE en donde dicho fragmento funcional se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')₂, un anticuerpo monocatenario (scFv) y un fragmento V estabilizado con disulfuro (dsFv), inhibiendo dicho anticuerpo monoclonal y dicho fragmento funcional del mismo la interacción entre Aggrus y CLEC-2.

2. El anticuerpo monoclonal o el fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 se puede obtener usando una secuencia de aminoácidos que consiste en una región desde un residuo de treonina en la posición 76 hasta un residuo de treonina en la posición 89 como inmunógeno.

3. El anticuerpo monoclonal o el fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo monoclonal es quimérico o está humanizado.

4. Un inhibidor de la unión de Aggrus-CLEC-2 que comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. El inhibidor de unión de Aggrus-CLEC-2 de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende además al menos un anticuerpo monoclonal o un fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo, que reconoce un epítopo presente en la región representada por SEQ ID NO: 2 (GAEDDVVTPGTSEDRYK), anticuerpo quimérico del mismo, anticuerpo humanizado del mismo, en donde dicho fragmento funcional se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')₂, un anticuerpo monocatenario (scFv) y un fragmento V estabilizado con disulfuro (dsFv).

6. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la trombosis, progresión del cáncer, metástasis del cáncer o inflamación, que comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende además al menos un anticuerpo monoclonal o un fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo, que reconoce un epítopo presente en la región representada por SEQ ID NO: 2 (GAEDDVVTPGTSEDRYK), anticuerpo quimérico del mismo, anticuerpo humanizado del mismo.

8. Un reactivo de prueba para la detección de la expresión de Aggrus, que comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento que consiste en un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

9. Un método para detectar un inhibidor de la unión entre CLEC-2 y Aggrus, que comprende

seleccionar un compuesto que inhiba la unión de CLEC-2 a un epítopo de Aggrus representado por SEQ ID NO: 3 (RIEDL).