CN112175085B

CN112175085B - 抗gpc3抗体及其用途

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Publication number: CN112175085B
Application number: CN202010535225.2A
Authority: CN
Inventors: 罗文新; 胡耀凯; 刘雪; 陈思远; 向新楚; 唐济贤; 夏宁邵
Original assignee: Yang Sheng Tang Co Ltd; Xiamen University
Current assignee: Yang Sheng Tang Co Ltd; Xiamen University
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2040-06-12
Also published as: CN112175085A

Abstract

本发明涉及免疫学及肿瘤学领域，具体而言涉及抗GPC3的抗体或其抗原结合片段，编码它们的核酸分子，制备它们的方法。本发明的抗GPC3抗体或其抗原结合片段对GPC3阳性肿瘤细胞具有提高的特异性和亲和力。因此，本发明进一步涉及包含所述抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物，其展示出在癌症部位近红外荧光成像和光热治疗的能力。本发明的抗体及免疫缀合物可用于许多目的，例如作为肝癌诊断的显像试剂、肝癌手术中的手术导航试剂和肝癌光热治疗试剂等，在肝癌靶向治疗及诊断领域展现出巨大潜力。

Description

抗GPC3抗体及其用途

技术领域

本发明涉及免疫学及肿瘤学领域，具体而言涉及抗GPC3的抗体或其抗原结合片段以及包含其的免疫缀合物。本发明还涉及这些抗体及免疫缀合物用于预防和/或治疗肿瘤(例如表达GPC3的肿瘤)、检测和/或示踪肿瘤(例如表达GPC3的肿瘤)的用途。

背景技术

恶性肿瘤已经成为当今世界最严重的公共卫生问题，而肝癌一直是患病人数最多、致死率最高的恶性肿瘤之一。传统的诊断和筛查肝癌手段主要是影像学检查和血清标志物检测，但由于肝癌的基因组不稳定及高度异质性导致其一直缺乏有效的早期诊断方法，以至于大多数患者被确诊时已经是肝癌晚期。肝癌早期治疗多采用手术治疗，晚期肿瘤多采取放化疗、免疫治疗等的综合性治疗，近期疗效虽有所提高，但远期疗效仍不理想，因此，寻找治疗肝癌更加有效的新策略已成为当前的研究热点。

GPC3(Glypican-3)属于硫酸乙酰肝素(HS)蛋白聚糖家族中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族。该蛋白聚糖家族有GPC1-6共六种亚型，都有以下相似之处，包括通过糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)锚定在细胞膜表面，具有14个模式保守的半胱氨酸残基，HS侧链的插入点为靠近C末端的最后50个氨基酸(FILMUS J,SELLECK SB.Glypicans:proteoglycans with a surprise[J].J Clin Invest,2001,108(4):497-501)，GPC3的主要功能包括调节Wnt、Hedgehog、FGF和BMP的发育信号通路(FILMUS J,CAPURRO M,RAST J.Glypicans[J].Genome Biol,2008,9(5):224)。人类GPC3基因位于X染色体(Xp26)上，编码一个含有580个氨基酸的70KD核心蛋白，可以通过形成异源二聚体的形式通过GPI锚定与细胞膜的胞外质表面结合。在普通成年人组织中，GPC3在成人卵巢、乳腺、间皮瘤、肺和肾脏中均有表达(FILMUS J.Glypicans in growth control and cancer[J].Glycobiology,2001,11(3):19R-23R)。GPC3可由类弗林转化酶在Arg358和Ser359之间的位置进行内蛋白水解裂解，生成一个30KD的C端亚基和一个40KD的N端亚基，其中包含两个HS侧链(CAPURRO M I,SHI W,SANDAL S,et al.Processing by convertases is notrequired for glypican-3-induced stimulation of hepatocellular carcinomagrowth[J].J Biol Chem,2005,280(50):41201-6)，这些亚基仍然通过一个或多个二硫键相互连接(YOSHITAKA H,KIYOTAKA W,AKIRA W,et al.Identification of soluble NH2-terminal fragment of glypican-3as a serological marker for early-stagehepatocellular carcinoma[J].2004,64(7):2418-23)。在健康成人肝脏中未检测到GPC3表达(HARUYAMA Y,KATAOKA H.Glypican-3is a prognostic factor and animmunotherapeutic target in hepatocellular carcinoma[J].World JGastroenterol,2016,22(1):275-83)，但是肝细胞癌病患血清和肿瘤组织中的GPC3基因和蛋白的表达水平均高于健康或非恶性肝脏(CAPURRO M,WANLESS I R,SHERMAN M,etal.Glypican-3:a novel serum and histochemical marker for hepatocellularcarcinoma[J].Gastroenterology,2003,125(1):89-97)，GPC3因此展现出作为肝细胞癌高度特异性的诊断标志和治疗靶标的潜力，被作为肝细胞癌(HCC)高度特异性的诊断标志和理想的治疗靶标。

然而，目前靶向GPC3开发的免疫疗法效果并不令人满意。在目前的研发中，进展领先的人源化抗体RO5137382(GC33)在临床二期阶段中并未显示出临床治疗效果，参见临床研究NCT01507168。因此，仍然需要开发新的GPC3抗体，以实现对肝癌的诊断和治疗。

发明内容

在本申请中，发明人开发了具有优良性质的抗GPC3单克隆抗体，其对GPC3阳性肿瘤细胞具有提高的特异性和亲和力。在此基础上，发明人进一步构建获得了包含所述抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物，其展示出在癌症部位近红外荧光成像和光热治疗的能力。因此，本发明的抗GPC3抗体及免疫缀合物在肝癌靶向治疗及诊断领域展现出巨大潜力，可用于许多目的，例如作为肝癌的治疗剂、肝癌诊断的显像试剂、肝癌手术中的手术导航试剂和肝癌光热治疗试剂等。

本发明的抗体

因此，在一个方面，本发明提供了能够特异性结合GPC3的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：

(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:6，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，

(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:8，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和

(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:10，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

和/或

(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：

(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:13，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，

(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:15，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和

(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:17，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。

在某些实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(1)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：6的VH CDR1，序列为SEQ ID NO：8的VH CDR2，序列为SEQ ID NO：10的VH CDR3；和/或，

(2)包含如下3个CDR的重链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：13的VL CDR1，序列为SEQ ID NO：15的VL CDR2，序列为SEQ ID NO：17的VL CDR3。

在另一方面，本发明还提供了能够特异性结合GPC3的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)如SEQ ID NO:3所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；

和/或，

(b)如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。

在某些实施方案中，所述重链可变区(VH)中含有的3个CDR和/或所述轻链可变区(VL)中含有的3个CDR由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义。

在某些实施方案中，本发明任一方面所述的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于哺乳动物(例如，鼠或人)免疫球蛋白的构架区(FR)。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含来源于鼠免疫球蛋白的重链可变区(VH)构架区(FR)，和/或所述抗体或其抗原结合片段的VL包含来源于鼠免疫球蛋白的轻链可变区(VL)构架区(FR)。

在某些实例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:5所示的VH FR1、如SEQ ID NO:7所示的VH FR2、如SEQ ID NO:9所示的VH FR3、和如SEQ IDNO:11所示的VH FR4。

在某些实例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:12所示的VL FR1、如SEQ ID NO:14所示的VL FR2、如SEQ ID NO:16所示的VL FR3、和如SEQID NO:18所示的VL FR4。

在另一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含来源于人免疫球蛋白的重链可变区(VH)构架区(FR)，和/或所述抗体或其抗原结合片段的VL包含来源于人免疫球蛋白的轻链可变区(VL)构架区(FR)。在此类实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区FR和/或轻链可变区FR可以包含一个或多个非人源(例如，鼠源)氨基酸残基，例如所述重链构架区FR和/或轻链构架区FR可以包含一或多个氨基酸回复突变，在这些回复突变中有相应的鼠源氨基酸残基。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含人免疫球蛋白的框架区(例如，人胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的框架区)，所述框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至鼠源残基的回复突变。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：人重链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，和/或人轻链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：3所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO：3所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NO：3所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

和

(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：

(iv)SEQ ID NO：4所示的序列；

(v)与SEQ ID NO：4所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(vi)与SEQ ID NO：4所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

在某些实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:3所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:4所示的序列的VL。

在某些实施方案中，本发明任一方面所述的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于哺乳动物(例如，鼠或人)免疫球蛋白的恒定区序列或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加。在某些实施方案中，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的保守置换。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含鼠免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和/或，

所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含鼠免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。

在另一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和/或，

所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。

在某些实施方案中，所述抗原结合片段选自scFv、di-scFv、(scFv)₂、Fab、Fab’、(Fab’)₂、Fv、或二硫键稳定的Fv(dsFv)。

在某些实施方案中，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在某些实施方案中，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

在某些实施方案中，所述抗体为IgG抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体)。

本发明的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对GPC3的结合。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。

因此，在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测标记，例如酶、放射性核素、荧光染料、化学发光物质或生物素。本发明所述的可检测标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，

)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。教导该标记物的使用的专利包括，但不限于，美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；及4,366,241(全部通过引用并入本文)。如上所述的可检测标记可通过本领域已知的方法检测。例如，放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。

在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段连接有近红外荧光染料，例如吲哚菁绿或Cy5.5。

抗体的制备

本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。

本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto etal.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inHudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如，Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)₂片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外，Fv、Fab或F(ab’)₂片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。

在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含如上所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。在某些实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的抗体或其抗原结合片段。

在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO(例如CHO-K1、CHO-S、CHODG44)。

在另一个方面，提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。

免疫缀合物

本发明的抗体或其抗原结合片段可以与另外的活性剂连接以形成免疫缀合物。由于免疫缀合物具有选择性递送一种或多种活性剂至靶组织(如表达GPC3的肿瘤)的能力，因此，免疫缀合物可以提高本发明的抗体或其抗原结合片段在治疗肿瘤中的治疗效力，或者实现肿瘤示踪或光热治疗等。

因此，在另一个方面，本发明提供了免疫缀合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的另外的活性剂。

I.肿瘤示踪剂

本发明的抗体或其抗原结合片段可与示踪剂连接，从而实现对GPC3阳性肿瘤的体内成像。

因此，在一些实施方案中，所述另外的活性剂是可检测标记。

用于本发明的免疫缀合物的可检测标记包括可以通过任何现有检测手段检测的任何标记。检测手段包括但不限于如肉眼、光学检测设备(如光学显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、体内成像仪器)、X-射线设备(如平片(plain)X-射线设备、CT(计算机断层扫描)设备)、MRI(磁共振成像)设备、核医学设备(如闪烁扫描设备、PET(正子发射断层扫描)设备、SPECT(单光子发射计算机断层扫描)设备)、超声设备和温度记录设备。适于每种检测方式的标记为本领域技术人员已知，及在如Lecchi et al.，Q J Nucl Med Mol Imaging.2007；51(2)：111-26中描述。

适于通过肉眼和光学检测仪器检测的标记包括如各种荧光标记和发光标记。可以使用的具体的荧光标记包括但不限于如Cy^TM系列(如Cy^TM2、3、5、5.5、7)、DyLight^TM系列(如DyLight^TM 405、488、549、594、633、649、680、750、800)、Alexa Fluor^(R)系列(如Alexa Fluor^(R)405、488、549、594、633、647、680、750)、HiLyte Fluor^TM系列(如HiLyte Fluor^TM 488、555、647、680、750)、ATTO系列(如ATTO 488、550、633、647N、655、740)、FAM、FITC、德克萨斯红、GFP、RFP和Qdot。在本发明中，适于体内成像的荧光标记是例如发射活体高度透过性的且对自体荧光如近红外线波长的荧光不敏感的波长的荧光的那些标记，或者呈现出强荧光强度的那些标记。这样的荧光标记包括但不限于如七甲川菁荧光染料、Cy^TM系列、DyLight^TM系列、Alexa Fluor^(R)系列、HiLyte Fluor^TM系列、ATTO系列、德克萨斯红、GFP、RFP、Qdot及其衍生物。

适于通过X-射线检测设备检测的标记包括如各种造影剂。可以使用的特定造影剂包括但不限于如碘原子、碘离子及含碘化合物。

适于通过MRI设备检测的标记包括如各种金属原子及含有所述金属原子的化合物，如所述金属原子的复合物。特别可以使用但不限于如钆(gadolinium)(III)(钆(III))、钇-88(<88>Y)、铟-111(<111>In)、这样的金属原子与配体的复合物、超顺磁性氧化铁(SPIO)以及氧化锰(MnO)，其中所述配体如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、(1，2-乙二基二硝基)四乙酸(EDTA)、乙二胺、2，2′-联吡啶(bipy)、1，10-菲罗啉(phen)、1，2-双(二苯基膦基)乙烷(DPPE)、2，4-戊二酮(acac)和草酸酯(ox)。

适于通过核医学设备检测的标记包括各种放射性同位素及含有所述放射性同位素的化合物，如所述放射性同位素的复合物。可以使用的放射性同位素包括但不限于如锝-99m(^99mTc)、铟-111(¹¹¹In)、碘-123(¹²³I)、碘-124(¹²³I)，碘-125(¹²⁵I)、碘-131(¹³¹I)、铊-201(²⁰¹Tl)、碳-11(¹¹C)、氮-13(¹³N)、氧-15(¹⁵O)、氟-18(¹⁸F)、铜-64(⁶⁴Cu)、镓-67(⁶⁷Ga)、氪-81m(^81mKr)、氙-133(¹³³Xe)、锶-89(⁸⁹Sr)和钇-90(⁹⁰Y)。含有放射性同位素的化合物包括但不限于如¹²³I-IMP、^99mTc-HMPAO、^99mTc-ECD、^99mTc-MDP、^99mTc-tetrofosmin、^99mTc-MIBI、^99mTcO4-、^99mTc-MAA、^99mTc-MAG3、^99mTc-DTPA、^99mTc-DMSA和¹⁸F-FDG1。用于本发明免疫缀合物的放射性核素将依赖于该免疫缀合物的具体应用。例如，就体内成像应用而言，¹¹C、¹³C、¹⁸F、¹⁹F、¹²⁰I、¹²³I、¹³¹I、⁷⁵Br或者⁷⁶Br一般将是最有用的。

适于通过可以使用的超声检查设备检测的标记包括但不限于如纳米粒子和脂质体。

在某些实例性实施方案中，所述可检测标记是近红外荧光染料(如吲哚菁绿)。在此类实施方案中，本发明的免疫缀合物可用于近红外荧光成像。

在某些实例性实施方案中，所述可检测标记是放射性核素。在此类实施方案中，本发明的免疫缀合物可用于磁共振光谱(MRS)或者成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)等允许检测放射性标记的任意方法。例如，用¹⁹F或者¹³C标记可用于MRS/MRI；用¹⁸F、¹¹C、⁷⁵Br、⁷⁶Br或者¹²⁰I标记可用于PET；用¹²³I和¹³¹I标记可用于SPECT。

II.抗体-药物偶联物(ADC)及光热治疗剂

本发明的抗体或其抗原结合片段还可与治疗剂连接，以提高本发明的抗体或其抗原结合片段在治疗肿瘤中的治疗效力，或者实现肿瘤部位的光热治疗。

因此，在另一些实施方案中，所述另外的活性剂是治疗剂。

在某些实施方案中，所述治疗剂是光热治疗试剂(例如近红外荧光染料，如吲哚菁绿)。

在某些实施方案中，所述治疗剂是细胞毒剂或抗癌剂，例如索拉菲尼。在此类实施方案中，所述免疫缀合物是抗体-药物偶联物(ADC)。

在本发明中，所述细胞毒剂包括对细胞有害(例如杀伤细胞，和/或抑制或防止细胞的功能)的任何试剂。

在某些实施方案中，所述细胞毒剂选自毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素)、烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂，及其任意组合。

可用于本发明的免疫缀合物的烷化剂的实例包括但不限于氮芥类(如双氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺等)、乙烯亚胺类(如塞替哌等)、硫酸酯及多元醇类(如白消安、二溴甘露醇)、亚硝基脲类(如卡莫司汀、洛莫司汀等)、铂类抗肿瘤剂(如顺铂、奥沙利铂、卡铂等)等。

可用于本发明的免疫缀合物的有丝分裂抑制剂的实例包括但不限于美登素类(例如美登素、美登醇、美登醇的C-3酯等)、紫杉烷类(例如多西他赛、紫杉醇或纳米颗粒紫杉醇等)、长春花生物碱类(例如硫酸长春地辛、长春新碱、长春花碱或长春瑞滨等)。

可用于本发明的免疫缀合物的抗肿瘤抗生素的实例包括但不限于放线菌素、蒽环类抗生素(例如柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星等)、卡利奇霉素、倍癌霉素等。

可用于本发明的免疫缀合物的抗代谢物的实例包括但不限于叶酸拮抗剂(例如甲氨蝶呤等)、嘧啶拮抗剂(例如5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、卡培他滨、吉西他滨等)、嘌呤拮抗剂(例如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤等)、腺苷脱氨酶抑制剂(例如克拉屈滨、氟达拉滨、奈拉滨、喷司他丁等)。

可用于本发明的免疫缀合物的拓扑异构酶抑制剂的实例包括但不限于(喜树碱类及其衍生物(例如伊立替康、托泊替康等)、安吖啶、道诺霉素、阿霉素、表鬼臼毒素类、玫瑰树碱类、表柔比星、依托泊苷、丙亚胺、替尼泊苷等。

可用于本发明的免疫缀合物的酪氨酸激酶抑制剂的实例包括但不限于阿西替尼、博舒替尼、西地尼布、达沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、来妥替尼、尼洛替尼、司马沙尼、舒尼替尼、凡德他尼等。

可用于本发明的免疫缀合物的放射性核素剂的实例包括但不限于于I¹³¹、In¹¹¹、Y⁹⁰、Lu¹⁷⁷等。

在某些实例性实施方案中，所述治疗剂选自铂类抗肿瘤剂、蒽环类抗生素、紫杉烷类化合物、核苷类似物、喜树碱类化合物，及其类似物或同系物，及其任意组合。

在某些实例性实施方案中，所述治疗剂是用于治疗肝癌的抗癌剂，例如索拉菲尼。

在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段任选地通过接头与上述可检测标记或治疗剂缀合。

在本发明中，使用本领域现有的接头技术可以将可检测标记或治疗剂(例如细胞毒剂)偶联至本发明的抗体或其抗原结合片段。已经用于将细胞毒剂偶联至抗体的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。可以选择例如易于在溶酶体隔室内被低pH切割或易于被蛋白酶(例如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶，如组织蛋白酶，诸如组织蛋白酶B、C、D)切割的接头。

关于细胞毒剂的类型、接头及将治疗剂偶联至抗体的方法的进一步讨论还可参见Saito，G.等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等人(2003)CancerImmunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.and Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.and Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。

在某些实例性实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段与吲哚菁绿通过NHS酯连接。在此类实施方案中，本发明的免疫缀合物可以作为近红外荧光肿瘤示踪剂，和/或肿瘤的光热治疗剂。

嵌合抗原受体(CAR)

本发明的抗体或其抗原结合片段可用于构建嵌合抗原受体(CAR)，本发明CAR的特征包括非MHC限制的GPC3识别能力，其赋予表达该CAR的免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞)不依赖于抗原加工及提呈而识别表达GPC3的细胞的能力。

因此，在另一方面，本发明还提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是单链抗体(例如，scFv、di-scFv或(scFv)₂。在某些实例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是scFv。

在某些实施方案中，本发明的CAR包含胞外抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域以及胞内信号传导结构域，其中所述胞外抗原结合结构域包含本发明的抗体或其抗原结合片段。

本发明的CAR中所包含的胞外抗原结合结构域赋予所述CAR识别GPC3的能力。

在某些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域包括但不限于骆驼Ig、IgNAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'₂片段、F(ab)'₃片段、Fv、单链抗体(例如scFv、di-scFv、(scFv)₂)、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是单链抗体。在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是scFv。

本发明的CAR所包含的跨膜结构域可以是本领域已知的任何蛋白结构，只要其能够在细胞膜(特别是真核细胞膜)中热力学稳定。适用于本发明的CAR的跨膜结构域可衍生自天然来源。在此类实施方案中，所述跨膜结构域可衍生自任何膜结合的或跨膜的蛋白质。或者，所述跨膜结构域可为合成的非天然存在的蛋白质区段，例如主要包含疏水残基例如亮氨酸和缬氨酸的蛋白质区段。

在某些实施方案中，所述跨膜结构域是选自下列蛋白的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD137、CD152和CD154及其任意组合。

本发明的嵌合抗原受体所包含间隔结构域位于胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间。

在某些实施方案中，所述间隔结构域包含免疫球蛋白(例如IgG1或IgG4)的CH2和CH3区。在此类实施方案中，不受特定理论的约束，认为CH2和CH3使所述CAR的抗原结合结构域从表达CAR的细胞的细胞膜延伸出去，并且可更精确地模拟天然TCR的大小和结构域结构。

在某些实施方案中，所述间隔结构域包含铰链结构域。铰链结构域可以是通常在蛋白质的两个结构域之间发现的氨基酸区段，其可以允许蛋白质具有柔性并且允许一个或两个结构域相对于彼此的运动。因此，所述铰链结构域可以是任何氨基酸序列，只要其能够提供胞外抗原结合结构域的这种柔性以及其相对于跨膜结构域的这种运动性。

在某些实施方案中，所述铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链区或其部分。在某些实施方案中，所述铰链结构域包含CD8α的铰链区或其部分，例如含有CD8α的铰链区的至少15个(例如20、25、30、35或40个)连续氨基酸的片段。

本发明的CAR中所包含的胞内信号传导结构域参与将有效的抗原受体结合(本发明的CAR与GPC3的结合)的信号传导进免疫效应细胞内部，激活表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能，或增强表达CAR的免疫效应细胞的至少一种细胞因子的分泌(例如IL-2，IFN-γ)。

在某些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。

在本发明中，所述初级信号传导结构域可以是包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的任何胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，所述初级信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。在某些实施方案中，所述初级信号传导结构域包含选自下列的蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。

在本发明中，所述共刺激信号传导结构域可以是来自共刺激分子的胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域包含选自下列的蛋白的胞内信号传导结构域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD270(HVEM)、或DAP10。

嵌合抗原受体的制备

生成嵌合抗原受体以及包含该嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如T细胞)的方法是本领域已知的，可包括用至少一种编码CAR的多核苷酸转染细胞，并在细胞中表达多核苷酸。例如，可将编码本发明的CAR的核酸分子包含于表达载体(例如，慢病毒载体)中，所述表达载体能够在宿主细胞例如T细胞中表达，以制造所述CAR。

因此，在另一方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的嵌合抗原受体的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。

在某些实施方案中，所述载体选自DNA载体，RNA载体，质粒，转座子载体，CRISPR/Cas9载体，病毒载体。

在某些实施方案中，所述载体是表达载体。

在某些实施方案中，所述载体是游离型载体。

在某些实施方案中，所述载体是病毒载体。

在某些示例性实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。

在某些实施方案中，所述载体是游离型或非整合病毒载体，例如整合缺陷型逆转录病毒或慢病毒。

在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。

可以通过各种合适的方式将如上所述的载体引入宿主细胞，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、电穿孔、TALEN方法、ZFN方法、非病毒载体介导的转染(例如脂质体)或病毒载体介导的转染(如慢病毒感染，逆转录病毒感染，腺病毒感染)，以及其他用于转移入宿主细胞的物理、化学或生物学手段，如转座子技术，CRISPR-Cas9等技术。

在某些实施方案中，所述宿主细胞表达本发明的嵌合抗原受体。

在某些实施方案中，所述宿主细胞选自哺乳动物(如人)的免疫细胞。在某些实施方案中，所述免疫细胞来源于患者或健康供体。在某些实施方案中，所述免疫细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。在某些实施方案中，所述宿主细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。

在另一方面，本发明还提供了制备表达本发明嵌合抗原受体的细胞的方法，其包括：(1)提供宿主细胞；(2)将如上所述的分离的核酸分子或载体引入宿主细胞。所述分离的核酸分子或载体包含编码本发明的嵌合抗原受体的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述宿主细胞选自免疫细胞，例如T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞及其任意组合。在某些实施方案中，所述免疫细胞选自T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及这些细胞的任意组合。

在某些实施方案中，在步骤(1)中，所述宿主细胞经过预处理；所述预处理包括免疫细胞的分选、激活和/或增殖。

在某些实施方案中，在步骤(2)中，将核酸分子或载体通过病毒感染引入宿主细胞。在某些实施方案中，在步骤(2)中将核酸分子或载体通过非病毒载体转染的方式引入宿主细胞，如通过转座子的载体系统、CRISPR/Cas9载体、TALEN方法、ZFN方法、电穿孔方法、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或显微注射等方法。

药物组合物

在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、分离的核酸分子、载体或宿主细胞(例如表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞)，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含本发明的抗体或其抗原结合片段、或免疫缀合物。

在另一些实施方案中，本发明的药物组合物包含分离的核酸分子、载体或宿主细胞，所述核酸分子、载体包含编码本发明的嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述宿主细胞表达所述嵌合抗原受体。

在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。

在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂是抗癌剂，例如化学治疗剂、免疫检查点抑制剂或特异性靶向肿瘤细胞的其他抗体。

本发明所述的化学治疗剂是指在肿瘤的治疗中具有治疗作用的任何化学试剂。在一些实施方案中，化学治疗剂是用于治疗肝癌例如HCC，或另一肿瘤例如卵巢癌或黑色素瘤的化学试剂。本领域技术人员可容易地鉴定可使用的化学治疗剂。

在某些实施方案中，所述抗癌剂可以选自烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂(例如吉西他滨、5-氟尿嘧啶、紫杉烷、顺铂等)、抗血管生成剂、细胞因子(例如GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21等)、分子靶向药物(例如，CD20抗体如利妥昔单抗、Her2抗体如曲妥珠单抗、VEGF抗体如贝伐珠单抗、EGFR抗体如西妥昔单抗等)、免疫检查点抑制剂(例如，PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG-3抗体等)等。

在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、分离的核酸分子、载体或宿主细胞(例如表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞)与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、分离的核酸分子、载体或宿主细胞与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。

本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

在某些示例性实施方案中，所述药物组合物包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

此外，本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、分离的核酸分子、载体或宿主细胞(例如表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞)可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于施用。

本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、分离的核酸分子、载体或宿主细胞(例如表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞)、或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、分离的核酸分子、载体或宿主细胞(例如表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞)、或药物组合物通过静脉注射或推注给予。

本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、分离的核酸分子、载体或宿主细胞(例如表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞)。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、分离的核酸分子、载体或宿主细胞(例如表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞)的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

试剂盒

在另一方面，本发明提供了试剂盒，其含有本发明的抗体或其抗原结合片段，免疫缀合物，分离的核酸分子，载体，或宿主细胞。

在一些实施方案中，所述试剂盒含有本发明的抗体或其抗原结合片段，或免疫缀合物。在某些实施方案中，所述试剂盒可以用于诊断受试者(例如人)是否患有肿瘤或者用于肿瘤示踪。在某些实施方案中，所述肿瘤是表达GPC3的肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤选自肝癌(例如肝细胞癌(HCC))、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌或卵巢透明细胞癌。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测标记。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述第二抗体还包括可检测标记。所述可检测标记可以是可通过现有检测手段(例如，荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学等)检测的任何物质。

在某些实施方案中，当用于诊断受试者(例如人)是否患有肿瘤时，所述可检测标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。

在某些实施方案中，当用于肿瘤示踪时，所述可检测标记优选是可用于体内成像的示踪剂，例如近红外荧光染料或放射性核素。

在另一些实施方案中，所述试剂盒含有本发明的分离的核酸分子或载体，所述分离的核酸分子包含编码本发明嵌合抗原受体的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述试剂盒可用于制备特异性结合GPC3的嵌合抗原受体，或用于制备表达所述嵌合抗原受体的细胞(例如免疫细胞)。

肿瘤治疗

在另一方面，本发明提供了用于在受试者(例如人)中预防和/治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、嵌合抗原受体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或本发明的免疫缀合物或药物组合物。在此类实施方案中，所述免疫缀合物包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的治疗剂。

在某些实施方案中，所述肿瘤是表达GPC3的肿瘤。

在某些实施方案中，所述肿瘤选自肝癌(例如肝细胞癌(HCC))、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌或卵巢透明细胞癌。

在某些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段或免疫缀合物。

在某些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的光热治疗试剂(例如，近红外荧光染料，如吲哚菁绿)。在此类实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段通过靶向性将与之连接的光热治疗试剂富集于肿瘤组织附近，在外部光源(一般是近红外光)的照射下，光能转化为热能，从而杀死肿瘤细胞。因此，在某些实施方案中，所述方法还包括使用外部光源(例如近红外激光)照射所述受试者的肿瘤部位的步骤。

在某些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的表达本发明CAR的宿主细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是免疫细胞(例如人免疫细胞)。在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(1)提供所述受试者所需的免疫细胞(例如T淋巴细胞)；(2)将包含编码本发明嵌合抗原受体的多核苷酸导入步骤(1)所述的免疫细胞，以获得表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞；(3)将步骤(2)中获得的免疫细胞施用至所述受试者以进行治疗。

在某些实施方案中，将本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、药物组合物、嵌合抗原受体或表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞(例如免疫细胞)与另外的抗癌剂联合使用。这种另外的抗癌剂可以是已知用于肿瘤的任何治疗剂，例如化学治疗剂、免疫检查点抑制剂或特异性靶向肿瘤细胞的其他抗体。这种另外的抗癌剂可以在施用所述抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、药物组合物、嵌合抗原受体或表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞(例如免疫细胞)之前、同时或之后施用。

在某些实施方案中，将本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、药物组合物、嵌合抗原受体或表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞(例如免疫细胞)与额外的疗法组合施用。这种额外的疗法可以是已知用于肿瘤的任何疗法，例如手术、化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗、激素治疗、基因治疗或姑息治疗。这种额外的疗法可以在施用本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、药物组合物、嵌合抗原受体或表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞(例如免疫细胞)之前、同时或之后施用。

在某些实施方案中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。在某些实施方案中，所述受试者患有表达GPC3的肿瘤，例如肝癌(如HCC)。

在另一方面，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合片段，或免疫缀合物，或分离的核酸分子，或载体，或宿主细胞，或药物组合物，在制备用于在受试者(例如人)中预防和/治疗肿瘤的药物中的用途。

肿瘤检测

在另一个方面，本发明提供了检测GPC3蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括：(1)将所述样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；(2)检测所述抗体或其抗原结合片段与GPC3之间复合物的形成或检测所述复合物的量。所述复合物的形成表明存在GPC3或表达GPC3的细胞。

在某些实施方案中，所述样品是细胞样品，即包含细胞(例如肿瘤细胞)的样品。在此类实施方案中，优选地，所述复合物是由所述抗体、抗原结合片段或缀合物与所述样品中的细胞所表达的GPC3之间形成的。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还带有可检测标记。在另一些实施方案中，在步骤(2)中，使用带有可检测标记的试剂来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。

所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。

在另一方面，本发明提供了用于诊断受试者(例如人)是否患有肿瘤的方法，其包括：使用本发明的抗体或其抗原结合片段检测GPC3在来自所述受试者的样品中的量。

在某些实施方案中，所述肿瘤是表达GPC3的肿瘤。

在某些实施方案中，所述方法还包括：将所述GPC3在来自所述受试者的样品中的量与参考值进行比较的步骤。

所述参考值是指GPC3在来自已知不具有表达GPC3的肿瘤的受试者的样品中的水平(也称作“阴性参考值”)，或者是指GPC3在已知患有表达GPC3的肿瘤的受试者的样品中的水平(也称作“阳性参考值”)。例如，如果所述GPC3在来自所述受试者的样品中的量与阴性参考值相似(或者无显著差异)，则指示所述受试者未患有表达GPC3的肿瘤，以及如果所述GPC3在来自所述受试者的样品中的量相对于阴性参考值升高时，则指示所述受试者患有表达GPC3的肿瘤。此外，如果所述GPC3在来自所述受试者的样品中的量与阳性参考值相似(或者无显著差异)，则指示所述受试者患有表达GPC3的肿瘤。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还带有可检测标记。在另一些实施方案中，使用带有可检测标记的试剂来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方案中，所述样品可以选自血液样品或组织样品(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片或细针抽吸组织)。

在某些实施方案中，所述方法还包括给被诊断为患有表达GPC3的肿瘤的受试者施用靶向GPC3的免疫疗法，例如施用本发明的抗体或其抗原结合片段，或免疫缀合物，或表达本发明CAR的宿主细胞。

在某些实施方案中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。

在另一方面，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合片段，或免疫缀合物，或分离的核酸分子，或载体，或宿主细胞，或药物组合物，在制备用于诊断受试者(例如人)是否患有肿瘤的试剂中的用途。

肿瘤示踪/成像

在另一方面，本发明提供了使肿瘤成像的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、或免疫缀合物或包含所述抗体或其抗原结合片段或所述免疫缀合物的药物组合物。在此类实施方案中，所述免疫缀合物包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的可检测标记；所述抗体或其抗原结合片段带有可检测标记。

在某些实施方案中，所述肿瘤是表达GPC3的肿瘤。

在某些实施方案中，所述方法还包括：检测所施用的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物或药物组合物中包含的所述可检测标记的步骤。本领域技术人员熟知如何根据所施用的可检测标记来选择合适的检测方式。

在某些实例性实施方案中，向有此需要的受试者施用有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的近红外荧光染料(例如吲哚菁绿)，并且通过近红外荧光成像仪进行检测。

在某些实施方案中，所述使肿瘤成像的方法可用于检测肿瘤。在此类实施方案中，所述方法还包括：检测所述可检测标记，并获得所述可检测标记的信号强度和/或信号分布。在某些实施方案中，所述方法进一步包括：将信号强度和/或信号分布与参考信号强度和/或参考信号分布进行对比。

所述信号强度是指从所述可检测标记发出的各种信号的强度或者相似测量值，如荧光信号、发光信号、磁性信号和放射性信号，且一般通过适当的检测方式测量，具体实例已经在上文论述。信号强度可以是得自整个对象的那些信号，或者是得自对象的指定部位或者区域的那些信号。信号强度也可以是测量的部位的面积或者体积的平均值或者整合值。在信号强度随着时间改变的情况中，本发明方法的信号强度可以是指定时间点的信号强度，或者可以是指定时期内的整合信号强度。

所述信号分布是指对象内所述标记发出的信号的位置信息，其可以是二维或者三维的。通过该信号分布与器官的解剖学相关位置或者与组织的结构信息(如CT图像、MRI图像或者超声图像)的匹配，可以鉴别信号从哪个组织发出。在信号分布随着时间而改变的情况中，本发明的方法的信号分布可以是在特定时间点的信号分布，或者可以是指定时期内的整合信号分布。

在本发明的方法中，可以评估信号强度与信号分布的组合。同时评估信号的强度和位置使得可以更精确地确定。

所述参考信号强度和/或参考的信号分布是指在已知不具有表达GPC3的肿瘤并施用了上述带有可检测标记的所述抗体或其抗原结合片段、或免疫缀合物(肿瘤示踪剂)的受试者中测量的该可检测标记的信号强度和/或信号分布(也称作“阴性信号强度和/或阴性信号分布”)，或者在已知患有表达GPC3的肿瘤并施用了上述带有可检测标记的所述抗体或其抗原结合片段、或免疫缀合物(肿瘤示踪剂)的受试者中测量的该可检测标记的信号强度和/或信号分布(也称作“阳性信号强度和/或阳性信号分布”)。例如，如果在检测受试者中检测的标记的信号强度和/或信号分布与阴性信号强度和/或阴性信号分布相似(或者无显著差异)，则指示所述受试者未患有表达GPC3的肿瘤，以及如果所述受试者的信号强度显著高于阴性信号强度和/或如果所述受试者的信号分布显著大于阴性信号分布，则指示所述受试者患有表达GPC3的肿瘤。此外，如果在检测受试者中检测的标记的信号强度和/或信号分布与阳性信号强度和/或阳性信号分布相似(或者无显著差异)，则指示所述受试者患有表达GPC3的肿瘤。

在另一方面，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合片段，或免疫缀合物，或包含所述抗体或其抗原结合片段或免疫缀合物的药物组合物，用于制备肿瘤示踪剂的用途。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学实验室等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各V_H和V_L由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。

如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。

在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat编号系统确定。

如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。

术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fd、Fv、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(single domain antibody)、嵌合抗体、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、、probody和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。

如本文中所使用的，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域。优选地，“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。

如本文中所使用的，术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)₂片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)₂片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。

如本文中所使用的，术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。

如本文中所使用的，术语“Fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。

如本文中所使用的，术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-VL-接头-VH-COOH或NH₂-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)₄的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在本发明的某些实施方案中，scFv可形成di-scFv，其指的是两个或两个以上单个scFv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中，scFv可形成(scFv)₂，其指的是两个或两个以上单个scFv并联而形成抗体。

上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”、“单抗”、“mAb”具有相同的含义且可互换使用可互换，其是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。此外，修饰语“单克隆”仅表明该抗体的特征为从高度同源的抗体群中获得，不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。

本发明的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备，例如杂交瘤技术(参见，例如Kohler等人.Nature,256:495,1975)，重组DNA技术(参见，例如美国专利申请4,816,567)，或噬菌体抗体库技术(参见，例如Clackson等.Nature352：624-628,1991，或Marks等.J.Mol.Biol.222：581-597,1991)。

抗体可通过公知的技术，例如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析进行纯化。随后或作为替代，可将特异性抗原(该抗体识别的靶分子)或其抗原表位固定在柱上，并通过免疫亲合层析法来纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化可参考例如D.Wilkinson(TheScientist,published by The Scient ist,Inc.,Philadelphia Pa.,Vol.14,No.8(Apr.17,2000),pp.25-28)。

如本文中所使用的，术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4,816,567to Cabilly et al.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:68516855(1984))。例如，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链可变区来自第二抗体(例如人抗体)。

如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。在某些实施方案中，人源化抗体的CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。

本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以根据上述制备的鼠单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。

为制备嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠免疫球蛋白可变区连接至人免疫球蛋白恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。例如，将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区的另一DNA分子以获得全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是通常优选为IgG1或IgG4恒定区。例如，将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子以获得全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但通常优选为κ恒定区。

为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539；Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370；以及Lo,Benny,K.C.,editor,in Antibody Engineering:Methodsand Protocols,volume 248,Humana Press,New Jersey,2004)。或者，还可以利用转基因动物，其能够在免疫后不产生内源性免疫球蛋白、并且能够产生完整人抗体库。例如，已有报道在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失可以完全抑制了内源性抗体产生，然后将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到所述种系突变小鼠中将导致该小鼠在遇到抗原刺激时产生人抗体(参见例如，Jakobovits等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551；Jakobovits等，1993，Nature362：255-258；Bruggermann等，1993，Year inImmunology 7：33；和Duchosal等，1992，Nature 355：258)。上述转基因动物的非限制性实例包括，HuMAb小鼠(Medarex,Inc.)，其含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微型基因座(miniloci)，加之使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859)；或携带人重链转基因和人轻链转染色体的“KM小鼠^TM”(参见专利申请WO02/43478)。其他抗体人源化改造的方法还包括噬菌体展示技术(Hoogenboom等，1991，J.Mol.Biol.227：381；Marks等，J.Mol.Biol.1991，222：581-597；Vaughan等，1996，Nature Biotech 14：309)。

如本文中所使用的，术语“胚系抗体基因(germline antibody gene)”或“胚系抗体基因片段(germline antibody gene segment)”是指，存在于生物体的基因组中的编码免疫球蛋白的序列，其没有经历过能够导致表达特异性免疫球蛋白的遗传学重排及突变的成熟过程。在本发明中，表述“重链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白重链的胚系抗体基因或基因片段，其包括V基因(variable)、D基因(diversity)、J基因(joining)和C基因(constant)；类似地，表述“轻链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白轻链的胚系抗体基因或基因片段，其包括V基因(variable)、J基因(joining)和C基因(constant)。在本发明中，由所述胚系抗体基因或胚系抗体基因片段所编码的氨基酸序列也称为“胚系序列(germlinesequence)”。胚系抗体基因或胚系抗体基因片段及其相应的胚系序列是本领域技术人员熟知的，并且可从专业数据库(例如，IMGT、UNSWIg、NCBI或VBASE2)获得或查询。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(K_D)表示。在本发明中，术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于约10^-9M，例如小于约10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定，例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。

如本文中所使用的，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指包含至少一个细胞外抗原结合结构域，间隔结构域，跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文也称为“胞内信号传导结构域”)的重组多肽构建体，其将针对目的抗原(例如GPC3)的基于抗体的特异性与免疫效应细胞活化胞内结构域组合以展现针对表达该目的抗原(例如GPC3)细胞的特异性免疫活性。在本发明中，表述“表达CAR的宿主细胞/免疫细胞”是指表达CAR并且具有由该CAR的靶向结构域决定的抗原特异性的宿主细胞/免疫细胞。制造CAR(例如，用于癌症治疗)的方法是本领域已知的，可参见例如，Park等人,TrendsBiotechnol.,29:550-557,2011；Grupp等人,NEnglJMed.,368:1509-1518,2013；Han等人,J.HematolOncol.,6:47,2013；PCT专利公开文本WO2012/079000、WO2013/059593；和美国专利公开文本2012/0213783，其全部通过引用整体并入本文。

如本文中所使用的，术语“胞外抗原结合结构域”与“胞外配体结合结构域”可以互换使用，是指能够特异性结合目的抗原或受体的多肽。该结构域将能够与细胞表面分子相互作用。例如，可以选择胞外抗原结合结构域来识别作为与特定疾病状态相关的靶细胞细胞表面标志物的抗原。

如本文中所使用的，术语“胞内信号传导结构域”是指传导效应信号功能信号并引导细胞进行专门的功能的蛋白质部分。因此，胞内信号传导结构域具有激活表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能的能力。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。

如本文中所使用的，术语“初级信号传导结构域”是指能够以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化的蛋白质部分。以刺激方式作用的初级信号传导结构域通常含有已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的信号传导基序。含有特别用于本发明中的初级信号传导结构域的ITAM的非限制性实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。

如本文中所使用的，术语“共刺激信号传导结构域”是指共刺激分子的胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体以外的在结合到抗原后提供T淋巴细胞的高效活化和功能所需的第二信号的细胞表面分子。所述共刺激分子的非限制性实例包括CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)CD270(HVEM)、CD278(ICOS)、DAP10。

如本文中使用的，术语“免疫细胞”是指涉及免疫反应例如涉及促进免疫效应子功能的细胞。免疫细胞的实例包括T细胞(例如α/βT细胞和γ/δT细胞)、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓来源巨噬细胞。

本发明所述的免疫细胞可以是自身的/自体的(“自我”)或非自身的(“非自我”，例如同种异体的、同基因的或异基因的)。如本文中使用的，“自身的”是指来自同一受试者的细胞；“同种异体的”是指与比较细胞遗传不同的同一物种的细胞；“同基因的”是指与比较细胞遗传相同的来自不同受试者的细胞；“异基因的”是指与比较细胞来自不同物种的细胞。在优选实施例中，本发明的细胞是同种异体的。

可用于本文所述的CAR的示例性免疫细胞包括T淋巴细胞。术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公知的并且意图包括胸腺细胞、未成熟的T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化的T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助(Th)细胞，例如T辅助1(Th1)或T辅助2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助T细胞(HTL；CD4T细胞)CD4T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8T细胞)、CD4CD8T细胞、CD4CD8T细胞或任何其它T细胞子组。在某些实施方案中，T细胞可以包括原初T细胞和记忆T细胞。

如本文中所使用的，术语“分离的”是指，经人工手段从天然状态下获得。如果自然界中出现某一种“被分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变或从天然环境下离分出该物质，或二者情况均有发生。比如，对于某一活体动物体内天然存在的某种未被分离的多聚核苷酸或多肽而言，从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为“分离的”。术语“分离的”不排除人工或合成的物质的存在，也不排除不影响物质活性的其它不纯物质的存在。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。此外，如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。

如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，肿瘤)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。

如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

发明的有益效果

本发明的抗GPC3的抗体对GPC3阳性肿瘤细胞具有提高的特异性和亲和力。因此，本发明的抗体具有用于预防和治疗GPC3阳性肿瘤(特别是肝癌)的潜力。此外，包含本发明抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物展示出在癌症部位近红外荧光成像和光热治疗的能力，可作为肝癌诊断的显像试剂、肝癌手术中的手术导航试剂和肝癌光热治疗试剂等，在肝癌靶向治疗领域展现出巨大潜力。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1A显示了GPC3-C抗原设计和涉及的表达过程模式图。

图1B显示了GPC3-C抗原性质分析。

图2示意性展示了评价抗体对GPC3-C抗原结合活性的检测方法的作用模式图。其中，A：ELISA法检测抗体与人GPC3-C抗原之间反应性的作用模式图；B：FACS法检测抗体与细胞表面所表达的人GPC3之间反应性的作用模式图。

图3显示了1B11及mGC33与GPC3-C抗原结合能力的反应曲线。

图4显示了1B11与Huh7细胞的结合能力的反应曲线。

图5显示了1B11与不同细胞结合能力的反应曲线。

图6显示了1B11抗体偶联药物和GPC3-C结合活性的Western Blot鉴定。

图7显示了1B11抗体偶联药物在人肝癌皮下瘤小鼠模型上的肝癌示踪作用

图8显示了1B11抗体偶联药物在人肝癌皮下瘤小鼠模型上的肝癌治疗作用。

图9显示了1B11抗体偶联药物在人肝癌皮下瘤小鼠模型上的安全性评估。

序列信息

本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

实施例1：抗人GPC3单克隆抗体的产生

本实施例通过杂交瘤融合技术产生抗人GPC3单克隆抗体，并利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)筛选具有高结合活性的单克隆抗体。

(1.1)抗原蛋白的构建

GPC3-C设计及表达流程如图1所示：将人GPC3(NCBI参考序列号：NM_004484.2)的C端(359-563位)的基因片段插入杆状病毒转染载体pAc-GP67-A构建重组载体，将重组载体与杆状病毒衣壳蛋白DNA共转染昆虫细胞sf9，收集、纯化培养上清中的重组杆状病毒，再利用重组病毒感染细胞进而表达GPC3-C蛋白，使用GE公司的常压镍柱进行纯化，150mM的咪唑浓度进行蛋白洗脱，产物使用PBS透析过夜。

(1.2)抗原免疫及细胞融合

将200ug GPC3-C蛋白于等体积的弗氏佐剂混合乳化均匀后，经肌肉注射8周龄的BALB/c小鼠(上海灵畅生物科技有限公司)。第2周和第4周再以相同剂量进行免疫加强，1周后采集血清利用ELISA法检测多抗血清效价，然后选择效价高的小鼠进行脾脏免疫，注射200ug抗原。三天后，使用标准技术(Gefter M L,Margulies D H,et al.A simple methodfor polyethylene glycol-promoted hybridization of mouse myeloma cells[J].Somatic Cell Genet,1977,3:231-236)进行细胞融合及筛选。

(1.3)单克隆化及抗体表达纯化

取出抗体阳性孔细胞，用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔，培养7-14天后选择只有一个集落生长的孔，检测培养液抗体与GPC3-C蛋白的结合活性。将抗体阳性孔细胞扩大培养并建成克隆株。

在

620HSF无血清培养基(Sigma公司，货号14621C)中培养产生鼠类单克隆抗体的杂交瘤细胞5至7天。3000rpm离心20min去除细胞碎片，上清以0.22μm的一次性滤器去除颗粒物后进行亲和层析纯化，IgG抗体用Protein A层析介质(GE Healthcare，货号17-1279-03)纯化，均严格按照产品说明书的指引在

explorer液相色谱纯化系统上完成。纯化后抗体纯度均在95％以上，抗体浓度藉由Bradford法测定。

(1.4)参比抗体mGC33的构建与表达

以mGC33为参比抗体，其序列可参见Nakano K等人.Generation of a humanizedanti-glypican 3antibody by CDR grafting and stability optimization.AnticancerDrugs.2010Nov；21(10):907-16，并且mGC33的VH和VL区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。将编码mGC33的序列构建到PTT5载体上，获得PTT5-mGC33表达质粒。转染293T细胞，培养7至14天，收集细胞上清，用Protein A层析介质(GE Healthcare，货号17-1279-03)纯化，均严格按照产品说明书的指引在

(1.5)ELISA法检测GPC3抗体与GPC3-C蛋白的反应性

ELISA法检测GPC3-C抗体结合活性的原理图如图2A所示。

将GPC3-C蛋白用CB稀释，以100 ng/孔包被于辐照过的聚苯乙烯96孔板中，封闭液进行封闭后，抽干并于4℃保存备用。将稀释后的免疫血清或融合的杂交骨髓瘤细胞培养液上清加入已包被的板中，37℃反应1 h，洗板5次，甩干，加入HRP标记的二抗，37℃反应0.5h，洗板5次，甩干。加入化学发光显色底物，立即置于化学发光仪(安图实验仪器公司，PHOMO)中进行数据读取。凡OD值大于阴性对照2倍以上者，初步判定为阳性克隆。利用PRISM7软件(GraphPad公司)计算半最大效应浓度，即EC₅₀。

结果如图3所示，结果显示，筛选得到的阳性克隆1B11对GPC3-C蛋白的亲和力优于参比抗体mGC33。

表2：抗人GPC3抗体结合活性测定结果

抗体	EC<sub>50</sub>(ng/mL)
		1B11	9.732
mGC33	13.04

实施例2：抗人GPC3抗体的性质鉴定

(2.1)ELISA法检测1B11及mGC33抗体对GPC3阳性的人肝癌细胞Huh7的结合活性

ELISA法检测1B11及参比抗体mGC33对GPC3阳性的人肝癌细胞Huh7的结合活性的原理图如图2A所示。

将Huh7细胞消化、重悬、计数，按每孔1x10⁴个接种于96孔细胞板上，培养过夜使细胞贴壁完全。小心弃去培养基，PBS润洗5次后，加入10％甲醛固定细胞15 min，弃甲醛溶液后再用PBS润洗五次。将稀释成不同梯度的1B11及mGC33抗体加入已包被的板中，待其充分反应后，将未结合的游离蛋白或抗体洗去，加入HRP标记的二抗，将未结合的酶标抗体洗去后，最终加入化学发光显色底物，立即置于化学发光仪(安图实验仪器公司，PHOMO)中进行数据读取。

结果如图4所示，结果显示，1B11对GPC3阳性肝癌细胞的结合显著优于参比抗体mGC33。

(2.2)FACS法检测GPC3抗体结合活性

FACS法检测GPC3抗体结合活性的原理图如图2B所示。

将待检测的人正常肝细胞LO2、肺癌细胞S1、文献报道GPC3阴性的人肝癌细胞SK-Hep-1、SNU-475、Bel-7402、文献报道GPC3阳性的人肝癌细胞Hep3B、Huh7、C3A、HepG2细胞消化，并吹散制成单细胞悬液，离心后用含3％胎牛血清的PBS重悬。细胞悬液经200目的筛网过滤供检测使用，每份细胞样品收集约1×10⁵个细胞。将待检抗体稀释成1ug/mL与上述细胞进行孵育，用Alexa

488标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Invitrogen公司，货号A-11001)及利用流式细胞术在流式细胞仪(BD公司，FACS Aria II)检测1B11及mGC33抗体的结合活性。横坐标表示检测细胞的荧光值。

流式检测结果如图5所示，结果显示，参比抗体mGC33能够结合GPC3阳性肝癌细胞Hep3B、Huh7、C3A、HepG2，且与GPC3阴性细胞LO2、SK-Hep-1无结合，但是，mGC33与GPC3阴性细胞SNU-475、Bel-7402、S1存在结合；相比之下，1B11与所有所检测的GPC3阴性细胞LO2、SK-Hep-1、SNU-475、Bel-7402、S1均无结合，同时能够高效结合所有所检测的GPC3阳性肝癌细胞Hep3B、Huh7、C3A、HepG2。上述结果表明，本发明的1B11比参比抗体mGC33在识别GPC3阳性肝癌细胞方面具有更高的GPC3特异性。

实施例3：1B11单抗的序列分析

抗体，即免疫球蛋白，一般是四聚体糖基化蛋白，由两条约25kD的轻链(LC，lightchain)和两条约50kD的重链(HC，heavy chain)组成。抗体轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成，抗体重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。VH和VL由四个具有相对保守序列的骨架区(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)和三个超变区，称为互补决定区(CDR，分别为CDR1、CDR2和CDR3)组成。

表4：1B11 VH和VL区以及CDR区的氨基酸序列

1B11	序列
		VH	SEQ ID NO:3
VL	SEQ ID NO:4
		VH FR1	SEQ ID NO:5
VH CDR1	SEQ ID NO:6
		VH FR2	SEQ ID NO:7
VH CDR2	SEQ ID NO:8
		VH FR3	SEQ ID NO:9
VH CDR3	SEQ ID NO:10
		VH FR4	SEQ ID NO:11
VL FR1	SEQ ID NO:12
		VL CDR1	SEQ ID NO:13
VL FR2	SEQ ID NO:14
		VL CDR2	SEQ ID NO:15
VL FR3	SEQ ID NO:16
		VL CDR3	SEQ ID NO:17
VL FR4	SEQ ID NO:18

实施例4：1B11-ICG抗体偶联药物的构建和鉴定

吲哚菁绿(Indocyanine green,ICG)是近红外荧光造影剂七甲川菁染料中的一种，其已被FDA批准用于临床的近红外成像剂，被广泛应用于视网膜和脉络膜可视化、脑血管造影、肝功能评估等研究，在人类中安全使用已有50多年的历史。ICG具备毒副作用小、半衰期短、信噪比低、无肝肠循环、肝癌细胞截留、不从肾脏等其他肝外器官排泄、不被肝外组织所吸收及光动力杀伤潜力的特点，在临床应用上具有广阔前景，但是ICG也存在特异性低、穿透力差的缺点，从而限制了它在诊断和治疗中的使用。

使用100KD超滤离心管(Millipore)浓缩1B11抗体，使其浓度达到2mg。将其与ICG-NHS ester(西安瑞禧生物科技)混合，在室温共孵育60min以达到连接效果。将产物使用碳酸氢钠缓冲液透析过夜，使用Zeba^TM脱盐离心柱(Thermo)，通过高效树脂介质完成缓冲液置换，去除原有缓冲液中的游离ICG，得到1B11-ICG。取5μg GPC3-C蛋白进行还原性SDS-PAGE，电泳后使用电转仪转膜，用封闭液37℃封闭1h后加入1B11抗体或1B11-ICG，37℃孵育1h后，PBST洗涤3次，每次间隔5min，加入羊抗鼠IgG(HRP)(Invitrogen)二抗，37℃孵育0.5h后用PBST洗涤3次，每次间隔5min，最后显色并拍照。图6的实验结果表明，1B11-ICG抗体偶联药物仍与1B11一样具有对GPC3-C抗原的结合能力。

实施例5：1B11抗体偶联药物在人肝癌皮下瘤小鼠模型上的应用

(5.1)人肝癌皮下瘤小鼠模型构建

选取4周龄的Balb/C裸鼠作为实验动物，于右后侧腿外侧皮下接种100μL的1x10⁷HepG2细胞悬液。确保水和饲料充足于P2级别鼠房中饲养，监测肿瘤大小。

(5.2)1B11抗体偶联药物在在人肝癌皮下瘤小鼠模型上的肝癌示踪作用评估

选取瘤体积达到80mm³的人肝癌皮下瘤小鼠，在避光条件下经尾静脉分组分别注射100μL的1B11抗体偶联药物、游离ICG和PBS作为对照。于6h、24h时间点使用小动物活体成像系统IVIS lumina II(Caliper)分别进行活体成像(激发波长为745nm)，监测、记录的ICG荧光成像结果。图7的实验结果表明，1B11-ICG对肿瘤部位具有非常好的靶向性，能够准确定位到右后侧腿的皮下瘤处。且在游离ICG逐渐被代谢后，1B11-ICG组在肿瘤部位仍有很好的富集未出现明显衰减，而肝脏部位的荧光信号随着时间推移逐渐降低。

(5.3)1B11抗体偶联药物在在人肝癌皮下瘤小鼠模型上的肝癌治疗作用评估

选取瘤体积达到80mm³的人肝癌皮下瘤小鼠，避光条件下经尾静脉分组分别1B11-ICG、及游离ICG，和PBS作为对照(注射剂量：3mg/kg，以ICG定量)。尾静脉注射6h后以1.0W/cm²功率的808nm激光照射小鼠肿瘤部位6min，每隔两天测量一次，持续检测肿瘤体积到第16天。图8的实验结果表明，PBS组对肿瘤的生长无任何抑制作用，游离ICG组由于被动富集效应对肿瘤的生长速率存在极低的治疗效果，1B11抗体偶联药物组小鼠的皮下瘤在光照治疗后不仅没有像游离ICG组和PBS组一样继续增长，而是在治疗后开始逐渐减小，并在第15天左右完全被清除。

(5.4)人抗-GPC3抗体1B11抗体偶联药物在在人肝癌皮下瘤小鼠模型上的安全性评估

在步骤(5.3)后，持续检测各组小鼠体重变化，计算体重比＝检测值/原始体重值。图9的实验结果表明，所有组别的裸鼠体重在治疗期间都有略微的增长。人抗-GPC3抗体1B11抗体偶联药物组与空白对照组的数据一致，证明该疗法具有生物安全性。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门大学

养生堂有限公司

<120> 抗GPC3抗体及其用途

<130> IDC190213

<150> CN201910513130.8

<151> 2019-06-14

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mGC33 VH

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mGC33 VL

<400> 2

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VH

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met Asp Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Ala Asn Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Pro Phe Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VL

<400> 4

Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Thr

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Phe Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VH FR1

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala

20

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VH CDR1

<400> 6

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VH FR2

<400> 7

Met Asp Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10 15

Val

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VH CDR2

<400> 8

Ile Asp Pro Glu Thr Ala Asn Thr

1 5

<210> 9

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VH FR3

<400> 9

Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys

1 5 10 15

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp

20 25 30

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VH CDR3

<400> 10

Thr Arg Pro Phe Ser Phe Ala Tyr

1 5

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VH FR4

<400> 11

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 12

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VL FR1

<400> 12

Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Leu Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VL CDR1

<400> 13

Gln Ser Leu Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VL FR2

<400> 14

Leu Gln Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Phe

<210> 15

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VL CDR2

<400> 15

Lys Val Ser

1

<210> 16

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VL FR3

<400> 16

Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly

20 25 30

Val Tyr Phe Cys

35

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VL CDR3

<400> 17

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Arg Thr

1 5

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B11 VL FR4

<400> 18

Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

1 5 10

Claims

1.能够特异性结合GPC3的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(1)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO：6的VH CDR1，序列为SEQ IDNO：8的VH CDR2，序列为SEQ ID NO：10的VH CDR3；和，

(2)包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO：13的VL CDR1，序列为SEQID NO：15的VL CDR2，序列为SEQ ID NO：17的VL CDR3。

2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：

如SEQ ID NO:3所示的VH和如SEQ ID NO:4所示的VL。

3.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自scFv、di-scFv、(scFv)₂、Fab、Fab’、(Fab’)₂、Fv、或二硫键稳定的Fv(dsFv)；和/或，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。

4.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为IgG抗体。

5.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。

6.免疫缀合物，其包含权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的另外的活性剂。

7.权利要求6所述的免疫缀合物，其中，所述另外的活性剂选自可检测标记。

8.权利要求7所述的免疫缀合物，其中，所述可检测标记为近红外荧光染料或放射性核素。

9.权利要求6所述的免疫缀合物，其中，所述另外的活性剂是吲哚菁绿。

10.权利要求6所述的免疫缀合物，其中，所述另外的活性剂选自治疗剂。

11.权利要求10所述的免疫缀合物，其中，所述治疗剂为细胞毒剂、抗癌剂或光热治疗试剂。

12.权利要求10所述的免疫缀合物，其中，所述另外的活性剂是细胞毒剂或抗癌剂。

13.权利要求10所述的免疫缀合物，其中，所述另外的活性剂是索拉非尼。

14.权利要求10所述的免疫缀合物，其中，所述另外的活性剂是光热治疗试剂。

15.权利要求14所述的免疫缀合物，其中，所述光热治疗剂是近红外荧光染料。

16.权利要求14所述的免疫缀合物，其中，所述光热治疗剂是吲哚菁绿。

17.嵌合抗原受体(CAR)，其包含权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

18.权利要求17所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗体或其抗原结合片段是单链抗体。

19.权利要求18所述的嵌合抗原受体，其中，所述单链抗体是scFv、di-scFv或(scFv)₂。

20.权利要求17所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗体或其抗原结合片段是scFv。

21.分离的核酸分子，其编码权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或者编码权利要求17-20任一项所述的嵌合抗原受体。

22.载体，其包含权利要求21所述的分离的核酸分子。

23.权利要求22所述的载体，其中，所述载体包含编码权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

24.权利要求22所述的载体，其中，所述载体包含编码权利要求17-20任一项所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。

25.宿主细胞，其包含权利要求21所述的分离的核酸分子或权利要求22-24任一项所述的载体。

26.权利要求25所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含编码权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列或包含所述核苷酸序列的载体。

27.权利要求26所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，或哺乳动物细胞。

28.权利要求25所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含编码权利要求17-20任一项所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列或包含所述核苷酸序列的载体。

29.权利要求28所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含免疫细胞。

30.权利要求28所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含人免疫细胞。

31.权利要求29或30所述的宿主细胞，其中，所述免疫细胞为T淋巴细胞。

32.药物组合物，其含有权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求6-16任一项所述的免疫缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

33.权利要求32所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂。

34.权利要求33所述的药物组合物，其中，所述另外的药学活性剂是抗癌剂。

35.权利要求34所述的药物组合物，其中，所述抗癌剂为化学治疗剂、免疫检查点抑制剂或特异性靶向肿瘤细胞的其他抗体。

36.试剂盒，其含有权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求6-16任一项所述的免疫缀合物，或权利要求21所述的分离的核酸分子，或权利要求22-24任一项所述的载体，或权利要求25-31任一项所述的宿主细胞。

37.权利要求36所述的试剂盒，其中，所述试剂盒含有权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求6-16任一项所述的免疫缀合物。

38.权利要求37所述的试剂盒，其中，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测标记。

39.权利要求37所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

40.权利要求39所述的试剂盒，其中，所述第二抗体还包括可检测标记。

41.权利要求36所述的试剂盒，其中，所述试剂盒含有权利要求21所述的分离的核酸分子，或权利要求22-24任一项所述的载体。

42.权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求6-16任一项所述的免疫缀合物、或权利要求32-35任一项所述的药物组合物在制备用于在受试者中预防和/治疗表达GPC3的肿瘤的药物中的用途。

43.权利要求42所述的用途，其中，所述受试者是人。

44.权利要求42所述的用途，其中，所述肿瘤选自肝癌、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌或卵巢透明细胞癌。

45.权利要求42所述的用途，其中，所述肿瘤为肝细胞癌(HCC)。

46.权利要求42所述的用途，其中，所述治疗包括向所述受试者施用有效量的所述免疫缀合物，所述免疫缀合物包含连接于所述抗体或其抗原结合片段的光热治疗试剂。

47.权利要求46所述的用途，其中，所述光热治疗试剂是近红外荧光染料。

48.权利要求47所述的用途，其中，所述近红外荧光染料为吲哚菁绿。

49.权利要求46所述的用途，其中，所述治疗进一步包括使用外部光源对所述受试者的肿瘤部位进行照射。

50.权利要求49所述的用途，其中，所述外部光源为近红外激光。

51.权利要求42所述的用途，其中，所述药物与另外的抗癌剂或抗肿瘤疗法联用。

52.权利要求51所述的用途，其中，所述另外的抗癌剂是化学治疗剂、免疫检查点抑制剂或特异性靶向肿瘤细胞的其他抗体。

53.权利要求51所述的用途，其中，所述另外的抗肿瘤疗法选自手术、化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗、激素治疗、基因治疗或姑息治疗。

54.权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求6-16任一项所述的免疫缀合物、或权利要求32-35任一项所述的药物组合物在制备用于诊断受试者是否患有表达GPC3的肿瘤的试剂中的用途。

55.权利要求54所述的用途，其中，所述受试者为人。

56.权利要求54所述的用途，其中，所述肿瘤选自肝癌、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌或卵巢透明细胞癌。

57.权利要求54所述的用途，其中，所述肿瘤为肝细胞癌(HCC)。

58.权利要求54所述的用途，其中，所述诊断包括：使用权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段检测GPC3在来自所述受试者的样品中的量。

59.权利要求58所述的用途，其中，所述诊断还包括：将所述GPC3在来自所述受试者的样品中的量与参考值进行比较的步骤。

60.权利要求58所述的用途，其中，在所述诊断中，所述抗体或其抗原结合片段还带有可检测标记。

61.权利要求58所述的用途，其中，所述样品可以选自血液样品或组织样品。

62.权利要求61所述的用途，其中，所述组织样品为手术切除的肿瘤组织、活体组织切片或细针抽吸组织。

63.权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求6-16任一项所述的免疫缀合物、或权利要求32-35任一项所述的药物组合物用于制备肿瘤示踪剂的用途；其中，所述肿瘤表达GPC3。

64.权利要求63所述的用途，其中，所述肿瘤选自肝癌、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌或卵巢透明细胞癌。

65.权利要求63所述的用途，其中，所述肿瘤为肝细胞癌(HCC)。

66.权利要求63所述的用途，其中，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测标记。

67.权利要求63所述的用途，其中，所述免疫缀合物包含连接于所述抗体或其抗原结合片段的可检测标记。

68.权利要求66或67所述的用途，其中，所述可检测标记选自近红外荧光染料或放射性核素。

69.权利要求68所述的用途，其中，所述近红外荧光染料为吲哚菁绿。

70.权利要求63所述的用途，其中，所述肿瘤示踪剂用于检测表达GPC3的肿瘤。

71.权利要求70所述的用途，其中，所述检测包括：(1)向有此需要的受试者施用有效量的所述抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物或药物组合物，(2)检测所述可检测标记，并获得所述可检测标记的信号强度和/或信号分布。

72.权利要求71所述的用途，其中，所述检测进一步包括：将所述信号强度和/或信号分布与参考信号强度和/或参考信号分布进行对比。