ES2943147T3 - Construcciones de anticuerpos para FLT3 y CD3 - Google Patents

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Abstract

La presente descripción se refiere a una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a FLT3 humano en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humano en la superficie de una célula T. Además, la divulgación proporciona un polinucleótido que codifica la construcción de anticuerpo, un vector que comprende dicho polinucleótido y una célula huésped transformada o transfectada con dicho polinucleótido o vector. Además, la divulgación proporciona un proceso para la producción de la construcción de anticuerpos de la divulgación, un uso médico de dicha construcción de anticuerpos y un kit que comprende dicha construcción de anticuerpos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Construcciones de anticuerpos para FLT3 y CD3
La presente invención se refiere a una construcción de anticuerpo al menos biespecífica que comprende un primer dominio de unión que se une a FLT3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T. Además, la invención proporciona un polinucleótido que codifica la construcción de anticuerpo, un vector que comprende dicho polinucleótido y una célula huésped transformada o transfectada con dicho polinucleótido o vector. Además, la invención proporciona un procedimiento para la producción de la construcción de anticuerpo de la invención, un uso médico de dicha construcción de anticuerpo y un kit que comprende dicha construcción de anticuerpo.
INTRODUCCIÓN
La leucemia mieloide aguda (AML) es una neoplasia maligna hematológica heterogénea que es el tipo más común de leucemia aguda diagnosticada en adultos. La AML representa aproximadamente un tercio de todas las leucemias con una estimación de 14.500 nuevos casos informados en 2013 solo en los Estados Unidos y bajas tasas de supervivencia general. Ha habido poca mejora en el patrón de atención para los pacientes con AML durante los últimos treinta años. Sin embargo, recientes avances en biología molecular y celular han revolucionado nuestra comprensión de la hematopoyesis humana, tanto en estados normales como enfermos. Varios jugadores clave implicados en la patogénesis de la enfermedad han sido identificados y pueden ser interrogados como dianas accionables. Un gen "conductor" activante de este tipo que muta con mayor frecuencia en aproximadamente el 30 % de la AML es FLT3.
La tirosina quinasa 3 similar a Fms (FLT3), también conocida como quinasa de hígado fetal 2 (FLK-2), la quinasa de células madre humanas 1 (SCK-1) o Agrupación de antígeno de diferenciación (CD135) es un receptor tirosina quinasa hematopoyético que fue clonado por dos grupos independientes en la década de 1990. El gen FLT3, ubicado en el cromosoma 13q12 en seres humanos, codifica un receptor de Clase III de la proteína tirosina quinasa que comparte homología con otros miembros de la familia de Clase III, incluyendo el receptor del factor de células madre (c-KIT), el receptor del factor estimulante de colonias de macrófagos (FMS) y el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR).
Tras la unión con el ligando FLT3, el receptor FLT3 sufre homodimerización, permitiendo con ello la autofosforilación de residuos de tirosina específicos en el dominio de yuxtamembrana y la activación aguas abajo a través de las vías PI3K/Akt, MAPK y STAT5. FLT3 por lo tanto juega un papel crucial en el control de la proliferación, supervivencia y diferenciación de células hematopoyéticas normales.
FLT3 humana se expresa en células madre hematopoyéticas (HSC) CD34+CD38-, así como en un subconjunto de células precursoras dendríticas. La expresión de FLT3 también se puede detectar en células progenitoras multipotentes tales como el Progenitor Mieloide Común CD34+CD38+CD45RACD123low, Progenitores de Monocitos de Granulocitos (GMP) CD34+CD38+CD45RA+CD123low y células Progenitoras Linfoides Comunes (CLP) CD34+CD38+CD10+CD19-. Curiosamente, la expresión de f LT3 está casi ausente en las células Progenitoras de Megacariocitos Eritrocitos (MEP) CD34+CD38-CD45RA-CD123-. La expresión de FLT3 está confinada, por lo tanto, principalmente a las células progenitoras mieloides y linfoides tempranas con alguna expresión en las células más maduras de linaje monocítico. Este patrón de expresión limitada de FLT3 contrasta notablemente con el del ligando de FLT3, que se expresa en la mayoría de los tejidos hematopoyéticos y en la próstata, riñón, pulmón, colon y corazón. Estos patrones de expresión variados, tales que la expresión de FLT3 es la etapa limitante de la velocidad para determinar la especificidad del tejido de las vías de señalización de FLT3.
La mutación de FLT3 más común en la AML es la duplicación en tándem interna de FLT3 (FLT3-ITD) que se encuentra en el 20 al 38 % de los pacientes con AML citogenéticamente normal. Las FLT3-ITDs se forman cuando una parte de la secuencia codificante del dominio de la yuxtamembrana se duplica y se inserta en una orientación de cabeza a cola. Mutaciones FLT3 no han sido identificadas en pacientes con leucemia linfoide crónica (CLL), linfoma no Hodgkin y mieloma múltiple, lo que sugiere una fuerte especificidad de la enfermedad para la AML. La activación de FLT3 mutante se observa generalmente en todos los subtipos de FAB, sin embargo, aumenta significativamente en pacientes con AML con FAB M5 (leucemia monocítica), mientras que los subtipos de FAB M2 y M6 (leucemia granulocítica o leucemia eritroide) se asocian con una frecuencia significativamente menor con la activación de FLT3, en línea con los patrones de expresión normal de FLT3. Un pequeño porcentaje de pacientes con AML (5-7 %) presenta mutaciones de un solo aminoácido en el dominio de tirosina quinasa de FLT3 (FLT3 TKD), más comúnmente en D835 o en algunos casos en T842 o I836, mientras que incluso menos pacientes (~1 %) albergan mutaciones en el dominio de yuxtamembrana de FLT3 que implican los residuos 579, 590, 591 y 594. Los pacientes con AML FLT3-ITD mutante tiene una forma agresiva de enfermedad caracterizada por una recaída temprana y una supervivencia deficiente, mientras que, en general, la supervivencia y la supervivencia libre de eventos no están significativamente influenciadas por la presencia de mutaciones FLT3-TKD. Además, los pacientes con AML con mutación FLT3-ITD con mutaciones concurrentes en TET2 o DNMT3A tienen un perfil de riesgo general desfavorable en comparación con pacientes con AML mutante FLT3-ITD con TET2 o DNMT3A de tipo salvaje, lo que subraya la heterogeneidad clínica y biológica de la AML.
Tanto las mutaciones FLT3-ITD como FLT3 TKD inducen la activación independiente del ligando de FLT3 que conduce a la activación aguas abajo de la vía Ras/MAPK y de las vías PI3K/Akt. Sin embargo, las vías de señalización aguas abajo asociadas con cualquiera de las mutaciones difieren principalmente en la activación preferencial de STAT5 por FLT3-ITD, conduciendo con ello a un aumento potencial de proliferación y a una regulación aberrante de las vías de reparación del ADN.
Independientemente del estado de mutación de FLT3, la fosforilación de FLT3 es evidente en más de dos tercios de los pacientes con AML y FLT3 se expresa en > 80 % de los blastos de AML y en - 90 % de todos los pacientes con AML, lo que la convierte en una diana terapéutica atractiva asociada con la patogénesis de la enfermedad en una muestra de gran tamaño. Varios inhibidores de molécula pequeña han surgido como opciones terapéuticas atractivas para pacientes con AML con mutaciones FLT3. La primera generación de inhibidores de la tirosina quinasa (TKI) FLT3 se caracterizó por la falta de selectividad, potencia y propiedades farmacocinéticas desfavorables. Se han desarrollado agentes más nuevos y más selectivos para combatir este problema; sin embargo, su eficacia se ha visto limitada por la aparición de una resistencia secundaria.
Varios TKIs FLT3 tempranos incluían midostaurina (PKC412), lestaurtinib (CEP-701), sunitinib (SUI1248) y sorafinib (BAY 43-9006) entre otros. Tasas de respuesta en Fase I y Fase II con estos agentes dirigidos a multiquinasas en pacientes con AML recidivante o refractaria es limitada, presumiblemente debido a su incapacidad para lograr una inhibición efectiva de FLT3 sin toxicidades limitantes de la dosis. Quizartinib (AC220) se ha desarrollado como un TKI FLT3 de segunda generación con alta selectividad para FLT3 de tipo salvaje y FLT3-ITD y ha demostrado beneficio especialmente en el entorno peri-trasplante en una cohorte más joven de pacientes. Sin embargo, mutaciones secundarias en FLT3 identificadas en pacientes en recaída que recibieron quizartinib acentuan la necesidad de desarrollar mejores estrategias terapéuticas para pacientes con AML, al tiempo que destaca la validez de FLT3 como una diana terapéutica.
Se han testado varios agentes fijados como objetivo en pacientes con AML con enfermedad de novo, recidivante/refractaria o secundaria. El silenciamiento epigenético de genes supresores de tumores juega un papel importante en la patogénesis de la enfermedad de AML e inhibidores de la ADN metiltransferasa (DNMT) tales como azacitadina y decitabina han logrado un cierto éxito clínico. Además, la identificación reciente de mutaciones que afectan a las modificaciones postraduccionales de las histonas (p. ej., mutaciones EZH2 y ASXL1) o la metilación del ADN (p. ej., DNMT3A, TET2, IDH1/2) en un subconjunto de pacientes con AML ha conducido al desarrollo de una diversidad de opciones terapéuticas que incluyen inhibidores de EZH2, DOT1L, IDH1/2 junto con inhibidores de HDAC y proteasoma. Sin embargo, estudios preclínicos de muchos de estos compuestos en células de AML sugieren que estos inhibidores pueden estar alterando el fenotipo y la expresión génica característicos de la diferenciación hematopoyética en lugar de provocar una citotoxicidad directa de los blastos de AML. Por lo tanto, sigue existiendo una fuerte necesidad médica insatisfecha de identificar nuevos objetivos/modalidades para combatir la AML y provocar una lisis fijada como objetivo de células blásticas de AML. Otros candidatos terapéuticos para la AML incluyen inhibidores de la quinasa Aurora, incluyendo AMG 900 e inhibidores de quinasas tipo polo que juegan un papel importante en la progresión del ciclo celular.
El tratamiento estándar para los pacientes con AML ha seguido siendo la quimioterapia con trasplante de células madre cuando es factible. Sin embargo, la aparición de casos recidivantes/refractarios en la gran mayoría de los pacientes tratados justifica modalidades de tratamientos terapéuticos adicionales. La identificación y descripción de varios antígenos específicos para la leucemia junto con una comprensión más clara de los efectos inmuno mediados de injerto contra leucemia han allanado el camino para el desarrollo de estrategias inmunomoduladoras para combatir neoplasias malignas hematológicas, revisado en varios artículos.
Gemtuzumab ozogamicina (GO) es un conjugado de anticuerpo y fármaco dirigido contra CD33, un marcador de superficie de células mieloides ubicuas. GO se retiró del mercado después de ensayos aleatorios que no mostraron mejoras en los resultados con terapia de GO. Sin embargo, existe la necesidad de una re-evaluación de GO en AML y se han iniciado varios ensayos para evaluar la eficacia y toxicidad de GO de manera exhaustiva. Otros agentes biológicos contra la AML incluyen lintuzumab (SGN-33), un anticuerpo monoclonal anti-CD33 humanizado en forma no conjugada o conjugada con bismuto radiactivo y SL-401, compuesto por IL-3 humana acoplada con una carga útil de toxina diftérica contra el receptor de IL-3 que se sobre-expresa en la mayoría de los blastos de AML. Anticuerpos monoclonales de próxima generación que fijan como objetivo tanto al antígeno asociado al tumor como a las células T citolíticas efectoras incluyen AMG 330 (un acoplador de células T biespecífico o molécula BiTE que fija como objetivo a CD33) y MGD006, una molécula de re-fijación de objetivo de doble afinidad que se une a CD123 y CD3.
El éxito reciente de las células T receptoras de antígenos quiméricos en la CLL refractaria y la leucemia linfoblástica aguda (ALL) ha allanado el camino para el desarrollo de células CAR-T específicas para mieloides, incluyendo terapias con CD123 CAR-T y CD33 CAR-T. También se han invertido varios esfuerzos en la generación de vacunas de células dendríticas, así como vacunas combinadas con inhibidores del bloqueo de puntos de control con el fin de mejorar los resultados.
También se han generado anticuerpos terapéuticos contra FLT3. M. Hofmann et al. 2012 (Leukemia, vol. 26, n° 6, páginas 1228-1237) brinda información respecto a la generación, selección y caracterización preclínica de anticuerpos FLT3 optimizados para Fc, tales como 4G8 y BV10 para el tratamiento de la leucemia mieloide. M. Durben et al. 2015 (Molecular Therapy, vol. 23, n i 4, páginas 648-655) se refiere a la caracterización de un anticuerpo biespecífico FLT3 x CD3 que contiene el anticuerpo anti-FLT34G8 o BV10 y, p. ej., el anticuerpo anti-CD3 UCHT-1 para el tratamiento de la leucemia.
Se supone que la terapia con anticuerpos es más eficaz con una baja probabilidad de desarrollo de mecanismos de resistencia secundaria, ya que el anticuerpo se dirige contra el dominio extracelular de FLT3, que es menos propenso a mutaciones que el dominio quinasa intracelular. El anticuerpo Imclone, IMC-EB10, se evaluó en pacientes con AML recidivante en un estudio de Fase I, sin embargo, el estudio se terminó debido a la falta de eficacia (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00887926). Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad apremiante de evaluar los anticuerpos monoclonales de segunda generación, incluyendo los anticuerpos biespecíficos para el tratamiento de la AML.
Ya que sigue existiendo la necesidad de tener disponibles opciones adicionales para el tratamiento de enfermedades hematológicas relacionadas con la expresión de FLT3, se proporcionan por la presente medios y métodos para la solución de este problema en forma de una construcción de anticuerpo biespecífico que tiene un dominio de unión dirigido a FLT3 en la superficie de células diana tumorales y un segundo dominio de unión dirigido a CD3 en la superficie de células T.
La presente divulgación proporciona una construcción de anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une a FLT3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a la CD3 humana en la superficie de una célula T, en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de FLT3 que está comprendido dentro de la región extracelular de FLT3 como se muestra en SEQ ID NOs: 801-804. En un primer aspecto, la presente invención proporciona una construcción de anticuerpo que comprende un primer dominio de unión que se une a FLT3 humana en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de unión que se une a CD3 humana en la superficie de una célula T, en donde el primer dominio de unión se une a un epítopo de FLT3 que está comprendido dentro de la región como se muestra en SEQ ID NO: 819, en donde dicha construcción de anticuerpo es al menos biespecífica.
Debe tenerse en cuenta que, como se utiliza en esta memoria, las formas en singular "un", "una" y "el", “la” incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un reactivo" incluye uno o más de dichos reactivos diferentes y la referencia al "método" incluye una referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos en la técnica que podrían modificarse o sustituirse por los métodos descritos en esta memoria.
A menos que se indique lo contrario, la expresión “al menos” que precede a una serie de elementos debe entenderse que se refiere a cada uno de los elementos de la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar, utilizando únicamente una experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita en esta memoria.
El término "y/o" siempre que se utilice en esta memoria incluye el significado de "y", "o" y "todos o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término".
El término "aproximadamente" o "alrededor", tal como se utiliza en esta memoria significa dentro de ± 20%, preferiblemente dentro de ± 15%, más preferiblemente dentro de ± 10% y lo más preferiblemente dentro de ± 5% de un valor o intervalo dado.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprenden" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapa. Cuando se utiliza en esta memoria, la expresión "que comprende" puede sustituirse con la expresión "que contiene" o "que incluye" o, a veces, cuando se utiliza en esta memoria, con la expresión "que tiene".
Cuando se utiliza en esta memoria, "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se utiliza en esta memoria, "que consiste esencialmente en" no excluye materiales o etapas que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación.
En cada caso en esta memoria, cualquiera de las expresiones "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" puede reemplazarse por cualquiera de las otras dos expresiones.
La expresión "construcción de anticuerpo" se refiere a una molécula en la que la estructura y/o función se basa(n) en la estructura y/o función de un anticuerpo, por ejemplo, de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o entera. Por lo tanto, una construcción de anticuerpo es capaz de unirse a su diana o antígeno específico. Además, una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención comprende los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo que permiten la unión de la diana. Este requisito mínimo puede definirse, p. ej., por la presencia de al menos tres CDRs de la cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y/o las tres CDRs de la cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH), preferiblemente de todas las seis CDRs. Los anticuerpos en los que se basan las construcciones de acuerdo con la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, recombinantes, quiméricos, desinmunizados, humanizados y humanos.
Dentro de la definición de "construcciones de anticuerpos" de acuerdo con la invención se encuentran los anticuerpos de longitud completa o enteros que también incluyen anticuerpos de camélidos y otros anticuerpos de inmunoglobulina generados por métodos o procedimientos biotecnológicos o de modificación de proteínas. Estos anticuerpos de longitud completa pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, recombinantes, quiméricos, desinmunizados, humanizados y humanos. También dentro de la definición de "construcciones de anticuerpos" están los fragmentos de anticuerpos de longitud completa, tales como VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 o "r IgG" ("medio anticuerpo"). Las construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención también pueden ser fragmentos modificados de anticuerpos, también denominados variantes de anticuerpos, tales como scFv, di-scFv o bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-cremallera, scFab, Fab2, Fab3, diacuerpos, diacuerpos de cadena sencilla, diacuerpos en tándem (Tandab), di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem, "minicuerpos" ejemplificados por una estructura que es la siguiente: (v H-VL-Ch 3)2, (scFv-CH3)2 , ((scFv)2-CH3 CH3), ((scFv)2-CH3) o (scFv-CH3-scFv)2 , multicuerpos tales como triacuerpos o tetracuerpos, y anticuerpos de un solo dominio, tales como nanocuerpos o anticuerpos de un solo dominio variable que comprenden simplemente un dominio variable, que puede ser VHH, VH o Vl , que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones o dominios V.
Un dominio de unión puede comprender típicamente una región variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo; sin embargo, no tiene por qué comprender ambos. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones VH y a menudo conservan alguna función de unión a antígeno del dominio de unión a antígeno intacto. Ejemplos adicionales para el formato de fragmentos de anticuerpos, variantes de anticuerpos o dominios de unión incluyen (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; (2) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región de bisagra; (3) un fragmento Fd que tiene los dos dominios VH y CH1; (4) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (5) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que tiene un dominio VH; (6) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, y (7) un Fv de cadena sencilla (scFv), siendo este último preferido (por ejemplo, derivado de una colección de scFV). Ejemplos de realizaciones de construcciones de anticuerpos de acuerdo con la invención se describen, p. ej., en los documentos WO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014/0302037, W O2014/144722, WO 2014/151910 y WO 2015/048272.
Además, la definición de la expresión "construcción de anticuerpo" incluye construcciones monovalentes, bivalentes y polivalentes / multivalentes y, por lo tanto, construcciones monoespecíficas, que se unen específicamente a una sola estructura antigénica, así como construcciones biespecíficas y poliespecíficas / multiespecíficas, que se unen específicamente a más de una estructura antigénica, p. ej., dos, tres o más, a través de distintos dominios de unión. Además, la definición de la expresión "construcción de anticuerpo" incluye moléculas que consisten en una sola cadena polipeptídica, así como moléculas que consisten en más de una cadena polipeptídica, cuyas cadenas pueden ser idénticas (homodímeros, homotrímeros u homo-oligómeros) o diferentes (heterodímero, heterotrímero o heterooligómero). Ejemplos de los anticuerpos arriba identificados y variantes o derivados de los mismos se describen, inter alia en Harlow y Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) y Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann y Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2a ed. 2010 y Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.
Las construcciones de anticuerpos de la presente invención son preferiblemente "construcciones de anticuerpos generadas in vitro". Esta expresión se refiere a una construcción de anticuerpo de acuerdo con la definición anterior, en que toda o parte de la región variable (p. ej., al menos una CDR) se genera en una selección de células no inmunes, p. ej., una presentación de fagos in vitro, chip de proteína o cualquier otro método en el que se puede testar la capacidad de las secuencias candidatas de unirse a un antígeno. Por lo tanto, esta expresión excluye preferiblemente las secuencias generadas únicamente por transposición genómica en una célula inmune en un animal. Un "anticuerpo recombinante" es un anticuerpo elaborado mediante el uso de tecnología de ADN recombinante o ingeniería genética.
La expresión "anticuerpo monoclonal" (mAb) o construcción de anticuerpo monoclonal, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales y/o post-modificaciones de traducción (p. ej., isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico o determinante en el antígeno, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (o epítopos). Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque son sintetizados por el cultivo de hibridoma y, por tanto, no están contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo por método particular alguno.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede utilizarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar se pueden producir mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975), o se pueden producir mediante métodos de ADN recombinante (véase, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 4.816.567). Ejemplos de técnicas adicionales para producir anticuerpos monoclonales humanos incluyen la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técnica del hibridoma EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77- 96).
A continuación, los hibridomas se pueden rastrear utilizando métodos estándares, tales como el ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) y el análisis de resonancia de plasmones superficial (BIACORE™), para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno específico. Puede utilizarse cualquier forma del antígeno relevante como inmunógeno, p. ej., antígeno recombinante, formas que se producen de forma natural, cualquier variante o fragmento del mismo, así como un péptido antigénico del mismo. La resonancia de plasmones superficiales, tal como se emplea en el sistema BIAcore puede utilizarse para aumentar la eficacia de los anticuerpos de fago que se unen a un epítopo de un antígeno diana, tal como FLT3 o CD3 épsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).
Otro método ejemplar para preparar anticuerpos monoclonales incluye el rastreo de colecciones de expresión de proteínas, p. ej., colecciones de presentación de fagos o presentación de ribosomas. La presentación de fagos se describe, por ejemplo, en Ladner et al., Patente de EE.UU. N° 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).
Además del uso de colecciones de presentación, el antígeno relevante puede utilizarse para inmunizar un animal no humano, p. ej., un roedor (tal como un ratón, hámster, conejo o rata). En una realización, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible modificar cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los loci de Ig humana (inmunoglobulina). Utilizando la tecnología de hibridomas, pueden producirse y seleccionarse anticuerpos monoclonales específicos para antígeno derivados de los genes con la especificidad deseada. Véase, p. ej., XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21, documentos US 2003-0070185, WO 96/34096 y WO 96/33735.
También puede obtenerse un anticuerpo monoclonal de un animal no humano y luego modificarse, p. ej., humanizarse, desinmunizarse, volverse quimérico, etc., utilizando técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Ejemplos de construcciones de anticuerpos modificados incluyen variantes humanizadas de anticuerpos no humanos, anticuerpos "madurados por afinidad" (véase, p. ej., Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) y Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)) y mutantes de anticuerpos con función o funciones efectoras alteradas (véase, p. ej., Patente de EE.UU. 5.648.260, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit. y Little (2009), loc. cit.).
En inmunología, la maduración por afinidad es el proceso mediante el cual las células B producen anticuerpos con mayor afinidad por el antígeno durante el curso de una respuesta inmune. Con exposiciones repetidas al mismo antígeno, un huésped producirá anticuerpos de afinidades sucesivamente mayores. Al igual que el prototipo natural, la maduración por afinidad in vitro se basa en los principios de mutación y selección. La maduración por afinidad in vitro se ha utilizado con éxito para optimizar anticuerpos, construcciones de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Las mutaciones aleatorias dentro de las CDRs se introducen utilizando radiación, mutágenos químicos o PCR propensa a errores. Además, la diversidad genética se puede incrementar mediante la transposición de la cadena. Dos o tres rondas de mutación y selección utilizando métodos de presentación tales como la presentación de fagos generalmente dan como resultado fragmentos de anticuerpos con afinidades en el intervalo nanomolar bajo.
Un tipo preferido de variación por sustitución de aminoácidos de las construcciones de anticuerpos implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (p. ej., un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la o las variantes resultantes seleccionadas para un desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo'parental a partir del cual se generan. Una forma conveniente de generar variantes de sustitución de este tipo implica la maduración por afinidad utilizando presentación de fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (p. ej., 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de anticuerpos así generadas se presentan de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos en forma de fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada una de las partículas. Las variantes presentadas en fagos se rastrean luego para determinar su actividad biológica (p. ej., afinidad de unión) tal como se describe en esta memoria. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para la modificación, se puede realizar una mutagénesis de exploración de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión del antígeno. Alternativa, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el dominio de unión y, p. ej., la FLT3 humana. Residuos de contacto de este tipo y residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en esta memoria. Una vez que se generan variantes de este tipo, el panel de variantes se somete a rastreo tal como se describe en esta memoria y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para su posterior desarrollo.
Los anticuerpos monoclonales y las construcciones de anticuerpos de la presente invención incluyen específicamente anticuerpos «quiméricos» (inmunoglobulinas) en las que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la o las cadenas es/son idénticas u homólogas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que ya que exhiben la actividad biológica deseada (Patente de EE.UU. N° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en esta memoria incluyen anticuerpos "primitizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (p. ej., mono del Viejo Mundo, simio, etc.) y secuencias de región constante humana. Se ha descrito una diversidad de enfoques para preparar anticuerpos quiméricos. Véase, p. ej., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América 81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., Patente de EE.UU. N° 4.816.567; Boss et al., Patente de EE.UU. N° 4.816.397; Tanaguchi et al., documentos EP 0171496; EP 0173494; y GB 2177096.
Un anticuerpo, construcción de anticuerpo, fragmento de anticuerpo o variante de anticuerpo también puede modificarse mediante deleción específica de epítopos de células T humanas (un método denominado "desinmunización") mediante los métodos descritos, por ejemplo, en los documentos WO 98/52976 o WO 00/34317. Brevemente, los dominios variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo pueden analizarse en busca de péptidos que se unen a MHC de clase II; estos péptidos representan epítopos de células T potenciales (como se define en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de epítopos de células T potenciales, se puede aplicar un enfoque de modelado informático denominado "enhebrado de péptidos" y, además, se puede buscar en una base de datos de péptidos de unión a MHC de clase II humanos los motivos presentes en las secuencias VH y VL, como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos principales de DR del MHC de clase II y, por tanto, constituyen epítopos potenciales de células T. Los epítopos de células T potenciales detectados pueden eliminarse sustituyendo pequeños números de residuos de aminoácidos en los dominios variables, o preferiblemente, mediante sustituciones de un solo aminoácido. Típicamente, se realizan sustituciones conservadoras. A menudo, pero no exclusivamente, se puede utilizar un aminoácido común a una posición en las secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana. Las secuencias de la línea germinal humana se describen, p. ej. en Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol.
16 (5): 237-242; y Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14:4628- 4638. El directorio V BASE proporciona un directorio completo de secuencias de regiones variables de inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido). Estas secuencias se pueden utilizar como una fuente de secuencia humana, p. ej., para regiones marco y CDRs. También se pueden utilizar regiones de armazón humano consenso, por ejemplo, como se describe en la Patente de EE.UU. N° 6.300.064.
Los anticuerpos, construcciones de anticuerpos, variantes o fragmentos de los mismos "humanizados" (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) son anticuerpos o inmunoglobulinas de secuencias principalmente humanas, que contienen (a) secuencia(s) mínima(s) derivada(s) de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable (también CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (p. ej., roedor) (anticuerpo donante), tales como ratón, rata, hámster o conejo que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, residuos de la región marco (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, "anticuerpos humanizados", tal como se utiliza en esta memoria, también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
Pueden generarse anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos reemplazando secuencias del dominio variable Fv que no están directamente implicadas en la unión de antígenos con secuencias equivalentes de dominios variables Fv humanos. Morrison (1985) Science 229: 1202-1207 proporciona métodos ejemplares para generar anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos; por Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214; y por los documentos US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; y US 6.407.213. Esos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican todo o parte de los dominios variables Fv de inmunoglobulina de al menos uno de una cadena pesada o ligera. Dichos ácidos nucleicos pueden obtenerse de un hibridoma que produzca un anticuerpo contra una diana predeterminada, tal como se describió arriba, así como de otras fuentes. El ADN recombinante que codifica la molécula de anticuerpo humanizado puede luego clonarse en un vector de expresión apropiado.
Anticuerpos humanizados también se pueden producir utilizando animales transgénicos, tales como ratones, que expresan genes de cadena pesada y ligera humana, pero que son incapaces de expresar los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endógena de ratón. Winter describe un método de injerto de CDR ejemplar que puede utilizarse para preparar los anticuerpos humanizados descritos en esta memoria (Patente de EE.UU. N° 5.225.539). Todas las CDRs de un anticuerpo humano particular pueden reemplazarse por al menos una parte de una CDR no humana, o solo algunas de las CDRs pueden reemplazarse por CDRs no humanas. Solo es necesario reemplazar el número de CDRs requeridas para la unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.
Un anticuerpo humanizado puede optimizarse mediante la introducción de sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia consenso, sustituciones de la línea germinal y/o mutaciones inversas. Moléculas de inmunoglobulina alteradas de este tipo se pueden preparar mediante cualquiera de varias técnicas conocidas en la técnica (p. ej., Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América, 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982, y documento EP 239400).
La expresión "anticuerpo humano", "construcción de anticuerpo humano" y "dominio de unión humano" incluye anticuerpos, construcciones de anticuerpos y dominios de unión que tienen regiones de anticuerpos, tales como regiones o dominios variables y constantes que corresponden sustancialmente a secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, los descritos por Kabat et al. (1991) (loc. cit.).). Los anticuerpos, las construcciones de anticuerpos o los dominios de unión humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p. ej. mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDRs y, en particular, en CDR3. Los anticuerpos, las construcciones de anticuerpos o los dominios de unión humanos pueden tener al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones reemplazadas por un residuo de aminoácido que no está codificado por la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana. La definición de anticuerpos humanos, construcciones de anticuerpos y dominios de unión, tal como se utiliza en esta memoria también contempla anticuerpos completamente humanos, que incluyen solo secuencias humanas de anticuerpos alteradas no artificialmente y/o genéticamente, ya que se pueden derivar utilizando tecnologías o sistemas tales como el Xenomouse.
En algunas realizaciones, las construcciones de anticuerpos de la invención son construcciones de anticuerpos "aisladas" o "sustancialmente puras". "Aislado" o "sustancialmente puro", cuando se utiliza para describir las construcciones de anticuerpos descritas en esta memoria, significa una construcción de anticuerpos que ha sido identificada, separada y/o recuperada de un componente de su entorno de producción. Preferiblemente, la construcción de anticuerpo está libre o sustancialmente libre de asociación con todos los demás componentes de su entorno de producción. Los componentes contaminantes de su entorno de producción, tales como el resultante de células transfectadas recombinantes, son materiales que típicamente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. Las construcciones de anticuerpos pueden, p. ej., constituir al menos aproximadamente el 5%, o al menos aproximadamente el 50% en peso de la proteína total en una muestra dada. Se entiende que la proteína aislada puede constituir del 5% al 99,9% en peso del contenido total de proteína, dependiendo de las circunstancias. El polipéptido se puede preparar a una concentración significativamente mayor mediante el uso de un promotor inducible o un promotor de alta expresión, de modo que se produzca a niveles de concentración incrementados. La definición incluye la producción de una construcción de anticuerpo en una amplia diversidad de organismos y/o células huésped que se conocen en la técnica. En realizaciones preferidas, la construcción de anticuerpo se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. Sin embargo, normalmente se preparará una construcción de anticuerpo aislado mediante al menos una etapa de purificación.
La expresión "dominio de unión" caracteriza en relación con la presente invención un dominio que (específicamente) se une a / interactúa con / reconoce un epítopo diana dado o un sitio diana dado en las moléculas diana (antígenos), aquí: FLT3 y CD3, respectivamente. La estructura y función del primer dominio de unión (que reconoce a FLT3), y preferiblemente también la estructura y/o función del segundo dominio de unión (que reconoce a CD3), se basa(n) en la estructura y/o función de un anticuerpo, p. ej., de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o entera. De acuerdo con la invención, el primer dominio de unión se caracteriza por la presencia de tres CDRs de la cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y Cd R3 de la región VL) y/o tres CDRs de la cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). El segundo dominio de unión preferiblemente también comprende los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo que permiten la unión de la diana. Más preferiblemente, el segundo dominio de unión comprende al menos tres CDRs de la cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y/o tres CDRs de la cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). Se prevé que el primer y/o segundo dominio de unión se produzca o se pueda obtener mediante métodos de rastreo de fagotecas o presentación de fagos en lugar de injertar secuencias de CDR de un anticuerpo (monoclonal) preexistente en un armazón.
De acuerdo con la presente invención, los dominios de unión están en forma de uno o más polipéptidos. Dichos polipéptidos pueden incluir partes proteicas y partes no proteicas (p. ej., enlazadores químicos o agentes reticulantes químicos tales como glutaraldehído). Las proteínas (incluidos fragmentos de las mismas, preferiblemente fragmentos biológicamente activos, y péptidos, que habitualmente tienen menos de 30 aminoácidos) comprenden dos o más aminoácidos acoplados entre sí mediante un enlace peptídico covalente (dando como resultado una cadena de aminoácidos). El término "polipéptido", tal como se utiliza en esta memoria, describe un grupo de moléculas, que habitualmente consiste en más de 30 aminoácidos. Los polipéptidos pueden formar, además, multímeros tales como dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir, que consisten en más de una molécula de polipéptido. Las moléculas de polipéptido que forman este tipo de dímeros, trímeros, etc. pueden ser idénticas o no idénticas. Las correspondientes estructuras de orden superior de multímeros de este tipo se denominan, en consecuencia, homodímeros o heterodímeros, homotrímeros o heterotrímeros, etc. Un ejemplo de un heteromultímero es una molécula de anticuerpo que, en su forma que aparece en la naturaleza, consiste en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas. Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" también se refieren a péptidos / polipéptidos / proteínas modificados de forma natural, en donde la modificación se efectúa, p. ej., mediante modificaciones postraduccionales, tales como glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Un "péptido", "polipéptido" o "proteína" cuando se le alude en esta memoria también puede modificarse químicamente, tal como pegilarse. Modificaciones de este tipo son bien conocidas en la técnica y se describen más adelante en esta memoria.
Preferiblemente, el dominio de unión que se une a FLT3 y/o el dominio de unión que se une a CD3 son dominios de unión humanos. Los anticuerpos y las construcciones de anticuerpos que comprenden al menos un dominio de unión humano evitan algunos de los problemas asociados con los anticuerpos o las construcciones de anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes no humanas tales como de roedores (p. ej., murino, rata, hámster o conejo). La presencia de proteínas de este tipo derivadas de roedores puede conducir al rápido aclaramiento de los anticuerpos o construcciones de anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo o la construcción de anticuerpos por parte de un paciente. Para evitar el uso de anticuerpos o construcciones de anticuerpos derivados de roedores, se pueden generar anticuerpos / construcciones de anticuerpos humanos o completamente humanos mediante la introducción de la función de anticuerpos humanos en un roedor, de modo que el roedor produzca anticuerpos completamente humanos.
La capacidad de clonar y reconstruir loci humanos del tamaño de una megabase en YACs e introducirlos en la línea germinal del ratón proporciona un enfoque poderoso para dilucidar los componentes funcionales de loci muy grandes o mapeados de forma burda, así como para generar modelos útiles de enfermedades humanas. Además, el uso de una tecnología de este tipo para la sustitución de loci de ratón con sus equivalentes humanos podría proporcionar conocimientos únicos sobre la expresión y regulación de productos génicos humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas y su participación en la inducción y progresión de enfermedades.
Una aplicación práctica importante de una estrategia de este tipo es la "humanización" del sistema inmune humoral del ratón. La introducción de loci de inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los que los genes de Ig endógenos han sido inactivados ofrece la oportunidad de estudiar los mecanismos subyacentes a la expresión programada y al ensamblaje de anticuerpos, así como su papel en el desarrollo de las células B. Además, dicha estrategia podría proporcionar una fuente ideal para la producción de anticuerpos monoclonales (mAbs) completamente humanos - un hito importante para cumplir la promesa de la terapia con anticuerpos en enfermedades humanas. Se espera que los anticuerpos o las construcciones de anticuerpos completamente humanos minimicen las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a los mAbs de ratón o derivatizados de ratón y, por lo tanto, aumenten la eficacia y seguridad de las construcciones de anticuerpos/anticuerpos administradas. Se puede esperar que el uso de anticuerpos o construcciones de anticuerpos completamente humanos proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación, autoinmunidad y cáncer, que requieren administraciones repetidas de compuestos.
Un enfoque hacia este objetivo fue diseñar cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los loci de Ig humana en previsión de que este tipo de ratones producirían un gran repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de anticuerpos de ratón. Los grandes fragmentos de Ig humana preservarían la gran diversidad genética variable, así como la regulación adecuada de la producción y expresión de anticuerpos. Al explotar la maquinaria del ratón para la diversificación y selección de anticuerpos y la falta de tolerancia inmunológica a las proteínas humanas, el repertorio de anticuerpos humanos reproducidos en estas cepas de ratón debería producir anticuerpos de alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluidos los antígenos humanos. Utilizando la tecnología de hibridomas, se podrían producir y seleccionar fácilmente mAbs humanos específicos para antígenos con la especificidad deseada. Esta estrategia general se demostró en relación con la generación de las primeras cepas de ratón XenoMouse (véase Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)). Las cepas de XenoMouse se modificaron con cromosomas artificiales de levadura (YACs) que contenían fragmentos de configuración de la línea germinal de un tamaño de 245 kb y 190 kb del locus de la cadena pesada humana y del locus de la cadena ligera kappa, respectivamente, que contenían secuencias de la región central variable y constante. Los YACs que contienen Ig humana demostraron ser compatibles con el sistema de ratón tanto para el reordenamiento como para la expresión de anticuerpos y eran capaces de sustituir los genes de Ig de ratón inactivados. Esto se demostró por su capacidad para inducir el desarrollo de células B, para producir un repertorio humano de tipo adulto de anticuerpos completamente humanos y para generar mAbs humanos específicos para antígenos. Estos resultados también sugirieron que la introducción de porciones más grandes de los loci de Ig humana que contienen un mayor número de genes V, elementos reguladores adicionales y regiones constantes de Ig humana podría recapitular sustancialmente el repertorio completo que es característico de la respuesta humoral humana a la infección y la inmunización. El trabajo de Green et al. se amplió recientemente a la introducción de más de aproximadamente el 80% del repertorio de anticuerpos humanos mediante la introducción de fragmentos YAC de configuración de línea germinal de tamaño megabase de los loci de cadena pesada humana y loci de cadena ligera kappa, respectivamente. Véase, Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).
La producción de los ratones XenoMouse se comenta y describe adicionalmente en la patente de EE.UU. N° 6.673.986, las Pat. de EE.UU. N° 6.162.963; 6.150.584; 6.114.598; 6.075.181 y 5.939.598, así como las solicitudes de patente de EE.UU. subyacentes y las Patentes japonesas N°s 3068 180 B2, 3068 506 B2 y 3068 507 B2. Véase también Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), documentos EP 0463 151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310 y WO 03/47336.
En un enfoque alternativo, otros, incluido GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque de "minilocus". En el enfoque de minilocus, se imita un locus de Ig exógeno mediante la inclusión de trozos (genes individuales) del locus de Ig. Por lo tanto, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu y una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) se transforman en una construcción para la inserción en un animal. Este enfoque se describe en la Pat. de EE.UU. N° 5.545.807 expedida a Surani et al. y las Pat. de EE.UU. N° 5.545.806; 5.625.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; 5.770.429; 5.789.650; 5.814.318; 5.877.397; 5.874.299; y 6.255.458 cada una expedida a Lonberg y Kay, Pat, de EE.UU. 5.591.669 y 6.023.010 expedida a Krimpenfort y Berns, Pat. de EE.UU. N° 5.612.205; 5.721.367; y 5.789.215 expedida a Berns et al., y la Pat. de EE.UU. N° 5.643.763 expedida a Choi y Dunn. Este enfoque se describe con más detalle en GenPharm International Pat. de EE.UU. N°s 5.569.825, 5.789.650, 5.545.806, 5.661.016, 5.814.318 y 5.364.079, así como las solicitudes de patente de EE.UU. subyacentes. Véanse también los documentos EP 0 546 073 B1, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884 y la Pat de EE.UU. N° 5.981.175. Véanse, además, Taylor et al. (1992), Chen et al. (1993), Tuaillon et al. (1993), Choi et al. (1993), Lonberg et al. (1994), Taylor et al. (1994) y Tuaillon et al. (1995), Fishwild et al. (1996).
Kirin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los que, a través de la fusión de microcélulas, se han introducido grandes trozos de cromosomas o cromosomas completos. Véanse las Solicitudes de Patente Europea N°s 773288 y 843961. Xenerex Biosciences está desarrollando una tecnología para la generación potencial de anticuerpos humanos. En esta tecnología, los ratones SCID se reconstituyen con células linfáticas humanas, p. ej., células B y/o T. Luego, los ratones son inmunizados con un antígeno y pueden generar una respuesta inmune contra el antígeno. Véanse las Pat. de EE.UU. N° 5.476.996; 5.698.767; y 5.958.765.
Las respuestas de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) han conducido a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o humanizados de otro modo. Sin embargo, se espera que se observen determinadas respuestas de anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA), particularmente en las utilizaciones crónicas o multidosis del anticuerpo. Por lo tanto, sería deseable proporcionar construcciones de anticuerpos que comprendan un dominio de unión humano contra FLT3 y un dominio de unión humano contra CD3 con el fin de viciar preocupaciones y/o efectos de la respuesta de HAMA o HACA.
Las expresiones "(específicamente) se une a", “(específicamente) reconoce", "se dirige (específicamente) a" y "(específicamente) reacciona con” significan de acuerdo con esta invención que un dominio de unión interactúa o interactúa específicamente con un epítopo dado un sitio diana dado en las moléculas diana (antígenos), aquí: FLT3 y CD3, respectivamente.
El término "epítopo" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicamente un dominio de unión, tal como un anticuerpo o inmunoglobulina, o un derivado, fragmento o variante de un anticuerpo o una inmunoglobulina. Un "epítopo" es antigénico y, por lo tanto, al término epítopo se le alude a veces también en esta memoria como "estructura antigénica" o "determinante antigénico". Por lo tanto, el dominio de unión es un "sitio de interacción con el antígeno". También se entiende que dicha unión/interacción define un "reconocimiento específico".
"Epítopos" pueden formarse tanto por aminoácidos contiguos como por aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína. Un "epítopo lineal" es un epítopo en el que una secuencia primaria de aminoácidos comprende el epítopo reconocido. Un epítopo lineal incluye típicamente al menos 3 o al menos 4, y más habitualmente, al menos 5 o al menos 6 o al menos 7, por ejemplo, aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos en una secuencia única.
Un "epítopo conformacional", en contraste con un epítopo lineal, es un epítopo en el que la secuencia primaria de los aminoácidos que comprende el epítopo no es el único componente definitorio del epítopo reconocido (p. ej., un epítopo en el que la secuencia primaria de aminoácidos es no necesariamente reconocido por el dominio de unión). Típicamente, un epítopo conformacional comprende un mayor número de aminoácidos con relación a un epítopo lineal. Con respecto al reconocimiento de epítopos conformacionales, el dominio de unión reconoce una estructura tridimensional del antígeno, preferiblemente un péptido o proteína o fragmento del mismo (en el contexto de la presente invención, la estructura antigénica para uno de los dominios de unión está comprendida dentro de la proteína FLT3). Por ejemplo, cuando una molécula de proteína se pliega para formar una estructura tridimensional, determinados aminoácidos y/o la cadena principal polipeptídica que forma el epítopo conformacional se yuxtaponen, permitiendo que el anticuerpo reconozca el epítopo. Métodos para determinar la conformación de epítopos incluyen, pero no se limitan a, cristalografía de rayos X, espectroscopía de resonancia magnética nuclear bidimensional (2D-RMN) y espectroscopía de marcación de espín dirigida al sitio y resonancia paramagnética electrónica (EPR).
En lo que sigue se describe un método para el mapeo de epítopos: Cuando una región (un tramo de aminoácidos contiguo) en la proteína FLT3 humana se intercambia / reemplaza por su región correspondiente de un antígeno FLT3 no humano y no primate (p. ej., FLT3 de ratón, pero también podrían concebirse otros, tales como pollo, rata, hámster, conejo, etc.), se espera que ocurra una disminución en la unión del dominio de unión, a menos que el dominio de unión sea de reacción cruzada para la FLT3 no humana, no de primates utilizada. Preferiblemente, dicha disminución es de al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50%; más preferiblemente al menos 60%, 70% u 80%, y lo más preferiblemente 90%, 95% o incluso 100% en comparación con la unión a la región respectiva en la proteína FLT3 humana, por lo que la unión a la región respectiva en la proteína humana, por lo que la unión a la región respectiva en la proteína FLT3 h u m a n a s e e s ta b le c e e n 100 % . S e p re v é q u e la s q u im e ra s F L T 3 h u m a n a / F L T 3 n o h u m a n a m e n c io n a d a s a n te r io rm e n te s e e x p re s e n e n c é lu la s C H O . T a m b ié n s e p re v é q u e la s q u im e ra s F L T 3 h u m a n a / F L T 3 n o h u m a n a se fu s io n e n c o n un d o m in io t ra n s m e m b ra n a y /o d o m in io c ito p lá s m ic o d e u n a p ro te ín a u n id a a m e m b ra n a d ife re n te , ta l c o m o E p C A M , v é a n s e lo s E je m p lo s 1 y 2.
E n un m é to d o a lte rn a t iv o o a d ic io n a l p a ra e l m a p e o d e e p í to p o s , s e p u e d e n g e n e ra r v a r ia s v e rs io n e s t r u n c a d a s d e l d o m in io e x tra c e lu la r d e F L T 3 h u m a n a c o n e l f in d e d e te rm in a r u n a re g ió n e s p e c íf ic a q u e s e a re c o n o c id a p o r un d o m in io d e u n ió n . E n e s ta s v e rs io n e s tru n c a d a s , lo s d ife re n te s d o m in io s / s u b -d o m in io s o re g io n e s F L T 3 e x tra c e lu la re s s e s u p r im e n g ra d u a lm e n te , c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N. L a s v e rs io n e s d e F L T 3 tru n c a d a s q u e se g e n e ra ro n y u t i l iz a ro n en e l c o n te x to d e la p re s e n te in v e n c ió n se re p re s e n ta n e n se p re v é q u e la s v e rs io n e s F L T 3 tru n c a d a s se p u e d a n e x p re s a r e n c é lu la s C H O . T a m b ié n se p re v é q u e la s v e rs io n e s F L T 3 tru n c a d a s p u e d a n fu s io n a rs e c o n un d o m in io d e tra n s m e m b ra n a y /o d o m in io c ito p lá s m ic o d e u n a p ro te ín a u n id a a m e m b ra n a d ife re n te , ta l c o m o E p C A M . T a m b ié n s e p re v é q u e la s v e rs io n e s d e F L T 3 tru n c a d a s p u e d a n a b a rc a r un d o m in io d e p é p tid o s e ñ a l e n su e x tre m o N, p o r e je m p lo , un p é p tid o s e ñ a l d e r iv a d o d e l p é p tid o s e ñ a l d e la c a d e n a p e s a d a d e Ig G d e ra tó n . A d e m á s , s e p re v é q u e la s v e rs io n e s d e F L T 3 t ru n c a d a s p u e d a n a b a rc a r un d o m in io v 5 en su e x tre m o N (s ig u ie n d o a l p é p tid o s e ñ a l) q u e p e rm ite v e r i f ic a r su c o r re c ta e x p re s ió n e n la s u p e r f ic ie d e la c é lu la . S e e s p e ra q u e s e p ro d u z c a u n a d is m in u c ió n o u n a p é rd id a d e u n ió n c o n a q u e lla s v e rs io n e s d e F L T 3 tru n c a d a s q u e y a n o a b a rc a n la re g ió n F L T 3 q u e e s re c o n o c id a p o r e l d o m in io d e u n ió n . L a d is m in u c ió n d e la u n ió n e s p re fe r ib le m e n te d e a l m e n o s 10 % , 20 % , 30 % , 40 % , 50 % ; m á s p re fe r ib le m e n te d e a l m e n o s 60 % , 70 % , 80 % y lo m á s p re fe r ib le m e n te d e 90 % , 95 % o in c lu s o 100 % , p o r lo q u e la u n ió n a la p ro te ín a F L T 3 h u m a n a c o m p le ta (o su re g ió n o d o m in io e x t ra c e lu la r ) s e e s ta b le c e e n 100 % , v é a s e e l E je m p lo 3.
U n m é to d o a d ic io n a l p a ra d e te rm in a r la c o n tr ib u c ió n d e un re s id u o e s p e c íf ic o d e un a n tíg e n o d ia n a a l re c o n o c im ie n to p o r u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o o d o m in io d e u n ió n e s e l e s c a n e o d e a la n in a (v é a s e , p. e j., M o rr is o n K L & W e is s G A . C u r O p in C h e m B io l. ju n io d e 2001 ; 5 (3 ) :302 -7 ) , en q u e c a d a u n o d e lo s re s id u o s a a n a liz a r s e re e m p la z a p o r a la n in a , p. e j., m e d ia n te m u ta g é n e s is d ir ig id a a l s it io . L a a la n in a s e u t iliz a d e b id o a su g ru p o fu n c io n a l m e t ilo no v o lu m in o s o y q u ím ic a m e n te in e r te q u e , n o o b s ta n te , im ita la s re fe re n c ia s d e e s tru c tu ra s e c u n d a r ia q u e p o s e e n m u c h o s d e lo s o tro s a m in o á c id o s . A v e c e s , s e p u e d e n u t il iz a r a m in o á c id o s v o lu m in o s o s , ta le s c o m o v a lin a o le u c in a , e n los c a s o s e n lo s q u e s e d e s e e la c o n s e rv a c ió n d e l ta m a ñ o d e lo s re s id u o s m u ta d o s . E l e s c a n e o d e a la n in a e s u n a te c n o lo g ía m a d u ra q u e h a s id o u t il iz a d a d u ra n te un la rg o p e río d o d e t ie m p o .
L a in te ra c c ió n e n tre e l d o m in io d e u n ió n y e l e p íto p o o la re g ió n q u e c o m p re n d e el e p íto p o im p lic a q u e un d o m in io d e u n ió n e x h ib a u n a a f in id a d a p re c ia b le p o r e l e p íto p o / la re g ió n q u e c o m p re n d e e l e p íto p o e n u n a p ro te ín a o a n tíg e n o p a r t ic u la r (a q u í: F L T 3 y C D 3 , re s p e c t iv a m e n te ) y, e n g e n e ra l, n o e x h ib a u n a re a c t iv id a d s ig n if ic a t iv a c o n p ro te ín a s o a n t íg e n o s d is t in to s d e F L T 3 o C D 3. "A f in id a d a p re c ia b le " in c lu y e la u n ió n co n u n a a f in id a d d e a p ro x im a d a m e n te 10 -6 M (K D ) o m a y o r. P re fe r ib le m e n te , la u n ió n s e c o n s id e ra e s p e c íf ic a c u a n d o la a f in id a d d e u n ió n e s d e a p ro x im a d a m e n te 10 -12 a 10 -8 M, 10 -12 a 10 -9 M , 10 -12 a 10 -10 M , 10 -11 a 10 -8 M , p re fe r ib le m e n te d e a p ro x im a d a m e n te 10 -11 a 10 -9 M . El q u e un d o m in io d e u n ió n re a c c io n e e s p e c íf ic a m e n te o s e u n a a u n a d ia n a se p u e d e te s ta r fá c ilm e n te , in te r alia, c o m p a ra n d o la re a c c ió n d e d ic h o d o m in io d e u n ió n co n u n a p ro te ín a o a n tíg e n o d ia n a c o n la re a c c ió n d e d ic h o d o m in io d e u n ió n co n p ro te ín a s o a n tíg e n o s d is t in to s d e F L T 3 o C D 3. P re fe r ib le m e n te , un d o m in io d e u n ió n d e la in v e n c ió n no s e u n e e s e n c ia l o s u s ta n c ia lm e n te a p ro te ín a s o a n tíg e n o s d is t in to s d e F L T 3 o C D 3 (es decir, e l p r im e r d o m in io d e u n ió n n o e s c a p a z d e u n irs e a p ro te ín a s d is t in ta s d e F L T 3 y e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n n o e s c a p a z d e u n irs e a p ro te ín a s d is t in ta s d e C D 3 ).
L a e x p re s ió n "n o se u n e e s e n c ia lm e n te / s u s ta n c ia lm e n te " o "n o e s c a p a z d e u n irs e " s ig n if ic a q u e un d o m in io d e u n ió n d e la p re s e n te in v e n c ió n n o se u n e a u n a p ro te ín a o a n tíg e n o d is t in to d e F L T 3 o C D 3 , es decir, n o m u e s tra u n a re a c t iv id a d d e m á s d e l 30 % , p re fe r ib le m e n te n o m á s d e l 20 % , m á s p re fe r ib le m e n te n o m á s d e l 10 % , d e m a n e ra p a r t ic u la rm e n te p re fe r id a n o m á s d e l 9 % , 8 % , 7 % , 6 % o 5 % co n p ro te ín a s o a n tíg e n o s d is t in to s d e F L T 3 o C D 3 , p o r lo q u e la u n ió n a F L T 3 o C D 3 , re s p e c t iv a m e n te , s e e s ta b le c e e n 100 % .
S e c re e q u e la u n ió n e s p e c íf ic a s e e fe c tú a m e d ia n te m o t iv o s e s p e c íf ic o s e n la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e l d o m in io d e u n ió n y e l a n tíg e n o . P o r lo ta n to , la u n ió n s e c o n s ig u e c o m o re s u lta d o d e su e s tru c tu ra p r im a r ia , s e c u n d a r ia y /o te rc ia r ia , a s í c o m o c o m o re s u lta d o d e m o d if ic a c io n e s s e c u n d a r ia s d e d ic h a s e s tru c tu ra s . L a in te ra c c ió n e s p e c íf ic a de l s it io d e in te ra c c ió n d e l a n tíg e n o c o n su a n tíg e n o e s p e c íf ic o p u e d e re s u lta r e n u n a s im p le u n ió n d e d ic h o s it io al a n tíg e n o . A d e m á s , la in te ra c c ió n e s p e c íf ic a d e l s it io d e in te ra c c ió n d e l a n tíg e n o c o n su a n tíg e n o e s p e c íf ic o p u e d e d a r c o m o re s u lta d o , a lte rn a t iv a o a d ic io n a lm e n te , e l in ic io d e u n a s e ñ a l, p. e j., d e b id o a la in d u c c ió n d e un c a m b io d e la c o n fo rm a c ió n d e l a n tíg e n o , u n a o l ig o m e r iz a c ió n d e l a n tíg e n o , e tc .
L a p re s e n te d iv u lg a c ió n p ro p o rc io n a ta m b ié n u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o q u e c o m p re n d e un p r im e r d o m in io d e u n ió n q u e se u n e a F L T 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la d ia n a y un s e g u n d o d o m in io d e u n ió n q u e s e u n e a C D 3 h u m a n a en la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T , e n d o n d e e l p r im e r d o m in io d e u n ió n s e u n e a u n e p íto p o d e F L T 3 q u e e s tá c o m p re n d id o d e n tro d e la re g ió n d e la F L T 3 h u m a n a q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia c o m o s e m u e s tra en S E Q iD N O : 814 (a g ru p a c ió n 1) o S E Q ID N O : 816 (a g ru p a c ió n 3).
P re fe r ib le m e n te , e l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o d e la in v e n c ió n c o m p re n d e u n a re g ió n V H q u e c o m p re n d e C D R -H 1 , C D R -H 2 y C D R -H 3 y u n a re g ió n V L q u e c o m p re n d e C D R -L 1 , C D R -L 2 y C D R -L 3 s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n :
SEQ ID NOs: 151-156, SEQ ID NOs: 161-166, SEQ ID NOs: 171-176, SEQ ID NOs: 181-186, SEQ ID NOs: 191-196, SEQ ID NOs: 201-206, SEQ ID NOs: 211-216, SEQ ID NOs: 221-226,
SEQ ID NOs: 231-236, SEQ ID NOs: 241-246, SEQ ID NOs: 251-256, SEQ ID NOs: 261-266,
SEQ ID NOs: 271-276, SEQ ID NOs: 281-286, SEQ ID NOs: 291-296, SEQ ID NOs: 301-306
SEQ ID NOs: 311-316, SEQ ID NOs: 321-326, SEQ ID NOs: 331-336, SEQ ID NOs: 341-346,
SEQ ID NOs: 351-356, SEQ ID NOs: 361-366, SEQ ID NOs: 371-376, SEQ ID NOs: 381-386
SEQ ID NOs: 391-396, SEQ ID NOs: 401-406, SEQ ID NOs: 411-416, SEQ ID NOs: 421-426,
SEQ ID NOs: 431-436, SEQ ID NOs: 441-446, SEQ ID NOs: 451-456, SEQ ID NOs: 461-466,
SEQ ID NOs: 471-476, SEQ ID NOs: 481-486, SEQ ID NOs: 491-496, SEQ ID NOs: 501-506
SEQ ID NOs: 511-516, SEQ ID NOs: 521-526, SEQ ID NOs: 531-536, SEQ ID NOs: 541-546,
SEQ ID NOs: 551-556, SEQ ID NOs: 561-566, SEQ ID NOs: 571-576, SEQ ID NOs: 581-586
SEQ ID NOs: 591-596, SEQ ID NOs: 601-606, SEQ ID NOs: 611-616, SEQ ID NOs: 621-626,
SEQ ID NOs: 631-636, SEQ ID NOs: 641-646, SEQ ID NOs: 651-656, SEQ ID NOs: 661-666,
SEQ ID NOs: 691-696, SEQ ID NOs: 701-706, SEQ ID NOs: 711-716, SEQ ID NOs: 721-726,
SEQ ID NOs: 731-736, SEQ ID NOs: 741-746 y SEQ ID NOs: 791-796.
El término "variable" se refiere a las porciones de los dominios de anticuerpo o de inmunoglobulina que exhiben variabilidad en su secuencia y que están implicadas en la determinación de la especificidad y afinidad de unión de un anticuerpo particular (es decir, el "dominio o dominios variables"). El emparejamiento de una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) juntas forma un único sitio de unión al antígeno.
La variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos; se concentra en sub-dominios de cada una de las regiones variables de la cadena pesada y ligera. Estos sub-dominios se denominan "regiones hipervariables" o "regiones determinantes de la complementariedad" (CDRs). Las porciones más conservadas (es decir, no hipervariables) de los dominios variables se denominan regiones "marco" (FRM o FR) y proporcionan un armazón para las seis CDRs en el espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas que se producen de forma natural comprenden cada uno cuatro regiones FRM (FR1, FR2, FR3 y FR4), que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de la lámina p. Las regiones hipervariables en cada una de las cadenas se mantienen juntas en estrecha proximidad por el FRM y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno (véase Kabat et al., loc. cit.).
Los términos "CDR", y su plural "CDRs", se refieren a la región determinante de la complementariedad, de las cuales tres constituyen el carácter de unión de una región variable de la cadena ligera (CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3) y tres componen el carácter de unión de una región variable de la cadena pesada (CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3). Las CDRs contienen la mayoría de los residuos responsables de las interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno y, por lo tanto, contribuyen en la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: son los principales determinantes de la especificidad del antígeno.
Los límites y las longitudes de la definición exacta de CDR están sujetos a diferentes sistemas de clasificación y numeración. Por lo tanto, Kabat, Chothia, contacto o cualquier otra definición de límites pueden hacer referencia a las CDRs, incluyendo el sistema de numeración descrito en esta memoria. A pesar de los diferentes límites, cada uno de estos sistemas tiene cierto grado de solapamiento en lo que constituye las denominadas "regiones hipervariables" dentro de las secuencias variables. Por tanto, las definiciones de CDR de acuerdo con estos sistemas pueden diferir en longitud y áreas límites con respecto a la región de marco adyacente. Véase, por ejemplo, Kabat (un enfoque basado en la variabilidad de secuencia entre especies), Chothia (un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo) y/o MacCallum (Kabat et al., loc. cit.; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; y MacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Aún otro patrón más para caracterizar el sitio de unión al antígeno es la definición de AbM utilizada por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase, p. ej., Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. En: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. y Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). En la medida en que dos técnicas de identificación de residuos definan regiones de solapamiento, pero no regiones idénticas, se pueden combinar para definir una CDR híbrida. Sin embargo, se prefiere la numeración de acuerdo con el denominado sistema Kabat.
S E Q ID N O s: 151 -156 , S E Q ID N O s: 161 -166 , S E Q ID N O s: 171 -176 , S E Q ID N O s: 181 -186 , S E Q ID N O s: 191 -196 ,
S E Q ID N O s: 201 -206 , S E Q ID N O s: 211 -216 , S E Q ID N O s: 221 -226 , S E Q ID N O s: 231 -236 , S E Q ID N O s: 241 -246 ,
S E Q ID N O s: 251 -256 , S E Q ID N O s: 261 -266 , S E Q ID N O s: 271 -276 , S E Q ID N O s: 281 -286 , S E Q ID N O s: 291 -296 ,
S E Q ID N O s: 301 -306 , S E Q ID N O s: 311 -316 , S E Q ID N O s: 321 -326 , S E Q ID N O s: 331 -336 , S E Q ID N O s: 341 -346 ,
S E Q ID N O s: 351 -356 , S E Q ID N O s: 361 -366 , S E Q ID N O s: 371 -376 , S E Q ID N O s: 381 -386 , S E Q ID N O s: 391 -396 ,
S E Q ID N O s: 401 -406 , S E Q ID N O s: 411 -416 , S E Q ID N O s: 421 -426 , S E Q ID N O s: 431 -436 , S E Q ID N O s: 441 -446 ,
S E Q ID N O s: 451 -456 , S E Q ID N O s: 461 -466 , S E Q ID N O s: 471 -476 , S E Q ID N O s: 481 -486 , S E Q ID N O s: 491 -496 ,
S E Q ID N O s: 501 -506 , S E Q ID N O s: 511 -516 , S E Q ID N O s: 521 -526 , S E Q ID N O s: 531 -536 , S E Q ID N O s: 541 -546 ,
S E Q ID N O s: 551 -556 , S E Q ID N O s: 561 -566 , S E Q ID N O s: 571 -576 , S E Q ID N O s: 581 -586 , S E Q ID N O s: 591 -596 ,
S E Q ID N O s: 601 -606 , S E Q ID N O s: 611 -616 , S E Q ID N O s: 621 -626 , S E Q ID N O s: 631 -636 , S E Q ID N O s: 641 -646 ,
S E Q ID N O s: 651 -656 , S E Q ID N O s: 661 -666 , S E Q ID N O s: 691 -696 , S E Q ID N O s: 701 -706 , S E Q ID N O s: 711 -716 ,
S E Q ID N O s: 721 -726 , S E Q ID N O s: 731 -736 , S E Q ID N O s: 741 -746 y S E Q ID N O s¡: 791 -796.
S e p u e d e m e d ir s i u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s e u n e o n o a l m is m o e p íto p o d e F L T 3 q u e o tra c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d a d a , p. e j., m e d ia n te m a p e o d e e p íto p o s co n m o lé c u la s d ia n a q u im é r ic a s o t ru n c a d a s , p. e j., c o m o se d e s c r ib e a rr ib a en e s ta m e m o r ia y e n lo s E je m p lo s a d ju n to s .
U n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o p re fe r id a d e a c u e rd o c o n la in v e n c ió n ta m b ié n s e p u e d e d e f in ir c o m o u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o q u e c o m p re n d e un p r im e r d o m in io d e u n ió n (p re fe r ib le m e n te h u m a n o ) q u e s e u n e a F L T 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la d ia n a y un s e g u n d o d o m in io d e u n ió n q u e s e u n e a C D 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T, e n d o n d e e l p r im e r d o m in io d e u n ió n c o m p ite p o r la u n ió n c o n un a n t ic u e rp o s e le c c io n a d o d e l g ru p o q u e c o n s is te e n F L-1 a F L -52 , F L -55 a F L -60 y F L -65 , es decir, un a n t ic u e rp o q u e c o m p re n d e u n a re g ió n V H q u e c o m p re n d e C D R -H 1 , C D R -H 2 y C D R -H 3 y u n a re g ió n V L q u e c o m p re n d e C D R -L 1 , C D R -L 2 y C D R -L 3 s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n lo s a rr ib a d e s c r ito s .
E l q u e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o c o m p ita o n o p o r la u n ió n c o n o tra c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d a d a , s e p u e d e m e d ir e n un e n s a y o d e c o m p e te n c ia ta l c o m o un E L IS A c o m p e t it iv o o un e n s a y o d e c o m p e te n c ia b a s a d o e n c é lu la s . T a m b ié n s e p u e d e n u t il iz a r m ic ro p a r tíc u la s (p e r la s ) a c o p la d a s a a v id in a . D e m a n e ra s im ila r a u n a p la c a E L IS A re c u b ie r ta d e a v id in a , c u a n d o s e h a c e re a c c io n a r c o n u n a p ro te ín a b io t in ila d a , c a d a u n a d e e s ta s p e r la s s e p u e d e u t i l iz a r c o m o un s u s tra to s o b re e l c u a l s e p u e d e re a liz a r un e n s a y o . E l a n tíg e n o s e re c u b re s o b re u n a p e r la y lu e g o se re c u b re c o n e l p r im e r a n t ic u e rp o . S e a ñ a d e e l s e g u n d o a n t ic u e rp o y s e d e te rm in a c u a lq u ie r u n ió n a d ic io n a l. P o s ib le s m e d io s d e le c tu ra in c lu y e n la c ito m e tr ía d e f lu jo .
E n u n a re a liz a c ió n , e l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n c o m p re n d e u n a re g ió n V H s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s re p re s e n ta d a s e n S E Q ID N O : 157 , S E Q ID N O : 167 , S E Q ID N O : 177 , S E Q ID N O : 187 , S E Q ID N O : 197 , S E Q ID N O : 207 , S E Q ID N O : 217 , S E Q ID N O : 227 , S E Q ID N O : 237 , S E Q ID N O : 247 , S E Q ID N O : 257 , S E Q ID N O : 267 , S E Q ID N O : 277 , S E Q ID N O : 287 , S E Q ID N O : 297 , S E Q ID N O : 307 , S E Q ID N O : 317 , S E Q ID N O : 327 , S E Q ID N O : 337 , S E Q ID N O : 347 , S E Q ID N O : 357 , S E Q ID N O : 367 , S E Q ID N O : 377 , S E Q ID N O : 387 , S E Q ID N O : 397 , S E Q ID N O : 407 , S E Q ID N O : 417 , S E Q ID N O : 427 , S E Q ID N O : 437 , S E Q ID N O : 447 , S E Q ID N O : 457 , S E Q ID N O : 467 , S E Q ID N O : 477 , S E Q ID N O : 487 , S E Q ID N O : 497 , S E Q ID N O : 507 , S E Q ID N O : 517 , S E Q ID N O : 527 , S E Q ID N O : 537 , S E Q ID N O : 547 , S E Q ID N O : 557 , S E Q ID N O : 567 , S E Q ID N O : 577 , S E Q ID N O : 587 , S E Q ID N O : 597 , S E Q ID N O : 607 , S E Q ID N O : 617 , S E Q ID N O : 627 , S E Q ID N O : 637 , S E Q ID N O : 647 , S E Q ID N O : 657 , S E Q ID N O : 667 , S E Q ID N O : 697 , S E Q ID N O : 707 , S E Q ID N O : 717 , S E Q ID N O : 727 , S E Q ID N O : 737 , S E Q ID N O : 747 y S E Q ID N O : 797.
E n u n a re a liz a c ió n a d ic io n a l, e l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n c o m p re n d e u n a re g ió n V L s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s re p re s e n ta d a s e n S E Q ID N O : 158 , S E Q ID N O : 168 , S E Q ID N O : 178 , S E Q ID N O : 188 , S E Q ID N O : 198 , S E Q ID N O : 208 , S E Q ID N O : 218 , S E Q ID N O : 228 , S E Q ID N O : 238 , S E Q ID N O : 248 , S E Q ID N O : 258 , S E Q ID N O : 268 , S E Q ID N O : 278 , S E Q ID N O : 288 , S E Q ID N O : 298 , S E Q ID N O : 308 , S E Q ID N O : 318 , S E Q ID N O : 328 , S E Q ID N O : 338 , S E Q ID N O : 348 , S E Q ID N O : 358 , S E Q ID N O : 368 , S E Q ID N O : 378 , S E Q ID N O : 388 , S E Q ID N O : 398 , S E Q ID N O : 408 , S E Q ID N O : 418 , S E Q ID N O : 428 , S E Q ID N O : 438 , S E Q ID N O : 448 , S E Q ID N O : 458 , S E Q ID N O : 468 , S E Q ID N O : 478 , S E Q ID N O : 488 , S E Q ID N O : 498 , S E Q ID N O : 508 , S E Q ID N O : 518 , S E Q ID N O : 528 , S E Q ID N O : 538 , S E Q ID N O : 548 , S E Q ID N O : 558 , S E Q ID N O : 568 , S E Q ID N O : 578 , S E Q ID N O : 588 , S E Q ID N O : 598 , S E Q ID N O : 608 , S E Q ID N O : 618 , S E Q ID N O : 628 , S E Q ID N O : 638 , S E Q ID N O : 648 , S E Q ID N O : 658 , S E Q ID N O : 668 , S E Q ID N O : 698 , S E Q ID N O : 708 , S E Q ID N O : 718 , S E Q ID N O : 728 , S E Q ID N O : 738 , S E Q ID N O : 748 y S E Q ID N O : 798.
E n o tra re a liz a c ió n , e l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n c o m p re n d e u n a re g ió n V H y u n a re g ió n V L s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n p a re s d e u n a re g ió n V H y u n a re g ió n V L c o m o se re p re s e n ta e n la s S E Q ID N O : 157 158 , ‘ S E Q ID N O : 167 168 , S E Q ID N O : 177 178 , S E Q ID N O : 187 188 , S E Q ID N O : 197 198 , S E Q ID N O : 207 208 , S E Q ID N O : 217 218 , S E Q ID N O : 227 228 , S E Q ID N O : 237 238 , S E Q ID N O : 247 248 , S E Q ID N O : 257 258 , S E Q ID N O : 267 268 , S E Q ID N O : 277 278 , S E Q ID N O : 287 288 , S E Q ID N O : 297 298 , S E Q ID N O : 307 308 , S E Q ID N O : 317 318 , S E Q ID N O : 327 328 , S E Q ID N O : 337 338 , S E Q ID N O : 347 348 , S E Q ID N O : 357 358 , S E Q ID N O : 367 368 , S E Q ID N O : 377 378 , S E Q ID N O : 387 388 , S E Q ID N O : 397 398. , S E Q ID N O : 407 408 , S E Q ID N O : 417 418 , S E Q ID N O : 427 428 , S E Q ID N O : 437 438 , S E Q ID N O : 447 448 , S E Q ID N O : 457 458 , S E Q ID N O : 467 468 , S E Q ID N O : 477 478 , S E Q ID N O : 487 488 , S E Q ID N O : 497 498 , S E Q ID N O : 507 508 , S E Q ID N O : 517 518 , S E Q ID N O : 527 528 , S E Q ID N O : 537 538 , S E Q ID N O : 547 548 , S E Q ID N O : 557 558 , S E Q ID N O : 567 568 , S E Q ID N O : 577 578 , S E Q ID N O : 587 588 , S E Q ID N O : 597 598 , S E Q ID N O : 607 608 , S E Q ID N O : 617 618 , S E Q ID N O : 627 628 , S E Q ID N O : 637 638 , S E Q ID N O : 647 648 , S E Q ID N O : 657 658 , S E Q ID N O : 667 668 , S E Q ID N O : 697 698 , S E Q ID N O : 707 708 , S E Q ID N O : 717 718 , S E Q ID N O : 727 728 , S E Q ID N O : 737 738 , S E Q ID N O : 747 748 y S E Q ID N O : 797 798.
E n a ú n u n a re a liz a c ió n a d ic io n a l, e l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n c o m p re n d e un p o lip é p tid o s e le c c io n a d o d e l g ru p o q u e c o n s is te e n lo s re p re s e n ta d o s e n S E Q ID N O : 159 , S E Q ID N O : 169 , S E Q ID N O : 179 , S E Q ID N O : 189 , S E Q ID N O : 199 , S E Q ID N O : 209 , S E Q ID N O : 219 y S E Q ID N O : 229 , S E Q ID N O : 239 , S E Q ID N O : 249 y S E Q ID N O : 259 , S E Q ID N O : 269 , S E Q ID N O : 279 y S E Q ID N O : 289 , S E Q ID N O : 299 , S E Q ID N O : 309 , S E Q ID N O : 319 y S E Q ID N O : 329 , S E Q ID N O : 339 , S E Q ID N O : 349 y S E Q ID N O : 359 , S E Q ID N O : 369 , S E Q ID N O : 379 y S E Q ID N O : 389 , S E Q ID N O : 399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 y S E Q ID N O : 459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O : 519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 y S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 y S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799.
L o s p r im e ro s d o m in io s d e u n ió n a n te r io re s (q u e e s tá n e s p e c if ic a d o s p o r s u s C D R s , re g ió n V H y re g ió n V L y c o m b in a c io n e s d e lo s m is m o s ) s e c a ra c te r iz a n c o m o d o m in io s d e u n ió n q u e s e u n e n a un e p íto p o F L T 3 q u e e s tá c o m p re n d id o d e n tro d e la re g ió n c o m o s e re p re s e n ta en S E Q ID N O : 819.
E l té rm in o "b ie s p e c íf ic o " , ta l c o m o s e u t iliz a e n e s ta m e m o r ia , s e re f ie re a u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o q u e e s "a l m e n o s b ie s p e c íf ic a " , es decir, c o m p re n d e a l m e n o s un p r im e r d o m in io d e u n ió n y un s e g u n d o d o m in io d e u n ió n , e n e l q u e e l p r im e r d o m in io d e u n ió n se u n e a un a n tíg e n o o d ia n a (a q u í: F L T 3 ), y e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n s e u n e a o tro a n tíg e n o o d ia n a (a q u í: C D 3 ). P o r c o n s ig u ie n te , la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s d e a c u e rd o co n la in v e n c ió n c o m p re n d e n e s p e c if ic id a d e s p a ra a l m e n o s d o s a n tíg e n o s o d ia n a s d ife re n te s . L a e x p re s ió n " c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s " d e la in v e n c ió n ta m b ié n a b a rc a c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s m u lt ie s p e c íf ic o s , ta le s c o m o c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s tr ie s p e c íf ic o s , la s ú lt im a s in c lu y e n t re s d o m in io s d e u n ió n , o c o n s tru c c io n e s q u e t ie n e n m á s d e t re s (p o r e je m p lo , c u a tro , c in c o ... ) e s p e c if ic id a d e s .
D a d o q u e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s d e a c u e rd o co n la in v e n c ió n s o n (a l m e n o s ) b ie s p e c íf ic a s , n o se p ro d u c e n d e fo rm a n a tu ra l y s o n m a rc a d a m e n te d ife re n te s d e lo s p ro d u c to s q u e s e p ro d u c e n d e fo rm a n a tu ra l. U n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o o in m u n o g lo b u lin a "b ie s p e c í f ic o " es , p o r lo ta n to , un a n t ic u e rp o h íb r id o a r t if ic ia l o in m u n o g lo b u lin a q u e t ie n e a l m e n o s d o s s it io s d e u n ió n d is t in to s c o n d ife re n te s e s p e c if ic id a d e s . C o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s s e p u e d e n p ro d u c ir m e d ia n te u n a d iv e rs id a d d e m é to d o s q u e in c lu y e n la fu s ió n d e h ib r id o m a s o e l e n la c e d e fra g m e n to s F a b '. V é a s e , p. e j., S o n g s iv ila i y L a c h m a n n , C lin . E xp . Im m u n o l. 79 :315 -321 (1990 ).
L o s a l m e n o s d o s d o m in io s d e u n ió n y lo s d o m in io s v a r ia b le s d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la p re s e n te in v e n c ió n p u e d e n c o m p re n d e r o n o e n la z a d o re s p e p tíd ic o s (p é p t id o s e s p a c ia d o re s ) . L a e x p re s ió n " e n la z a d o r p e p tíd ic o " c o m p re n d e , d e a c u e rd o co n la p re s e n te in v e n c ió n , u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s m e d ia n te la c u a l la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e un d o m in io (v a r ia b le y /o d e u n ió n ) y o tro d o m in io ( v a r ia b le y /o d e u n ió n ) d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la in v e n c ió n e s tá n e n la z a d o s e n tre sí. U n a c a ra c te r ís t ic a té c n ic a e s e n c ia l d e un e n la z a d o r p e p tíd ic o d e e s te t ip o e s q u e no c o m p re n d e a c t iv id a d d e p o lim e r iz a c ió n a lg u n a . E n tre los e n la z a d o re s p e p tíd ic o s a d e c u a d o s se e n c u e n tra n lo s d e s c r ito s en la s P a te n te s d e E E .U U . 4.751.180 y 4.935.233 o e l d o c u m e n to W O 88 /09344. L o s e n la z a d o re s p e p tíd ic o s ta m b ié n s e p u e d e n u t il iz a r p a ra f i ja r o tro s d o m in io s o m ó d u lo s o re g io n e s ( ta le s c o m o d o m in io s q u e e x t ie n d e n la s e m iv id a ) a la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n .
E n e l c a s o d e q u e s e u t ilic e un e n la z a d o r , e s te e n la z a d o r e s p re fe r ib le m e n te d e u n a lo n g itu d y s e c u e n c ia s u f ic ie n te s p a ra a s e g u ra r q u e c a d a u n o d e lo s d o m in io s p r im e ro y s e g u n d o p u e d a n , in d e p e n d ie n te m e n te u n o d e o tro , c o n s e rv a r s u s e s p e c if ic id a d e s d e u n ió n d ife re n c ia le s . P a ra lo s e n la z a d o re s p e p tíd ic o s q u e c o n e c ta n lo s a l m e n o s d o s d o m in io s d e u n ió n (o d o s d o m in io s v a r ia b le s ) en la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la in v e n c ió n , s e p re f ie re n a q u e llo s e n la z a d o re s p e p tíd ic o s q u e c o m p re n d e n s o lo un p e q u e ñ o n ú m e ro d e re s id u o s d e a m in o á c id o s , p. ej. 12 re s id u o s d e a m in o á c id o s o m e n o s . P o r lo ta n to , se p re f ie re n e n la z a d o re s p e p tíd ic o s d e 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 re s id u o s d e a m in o á c id o s . U n e n la z a d o r p e p tíd ic o c o n te m p la d o c o n m e n o s d e 5 a m in o á c id o s c o m p re n d e 4, 3, 2 o u n o o m á s a m in o á c id o s , e n d o n d e s e p re f ie re n e n la z a d o re s r ic o s e n G ly . U n a m in o á c id o "ú n ic o " p a r t ic u la rm e n te p re fe r id o e n el c o n te x to d e d ic h o " e n la z a d o r p e p tíd ic o " e s G ly . P o r c o n s ig u ie n te , d ic h o e n la z a d o r p e p tíd ic o p u e d e c o n s is t ir e n un s o lo a m in o á c id o G ly . O tra re a liz a c ió n p re fe r id a d e un e n la z a d o r p e p tíd ic o se c a ra c te r iz a p o r la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s m a y o r ía d e la s in v e s t ig a c io n e s s o b re a n t ic u e rp o s d e d o m in io ú n ic o s e b a s a n a c tu a lm e n te e n d o m in io s v a r ia b le s d e c a d e n a p e s a d a , ta m b ié n s e h a d e m o s tra d o q u e lo s n a n o c u e rp o s d e r iv a d o s d e c a d e n a s lig e ra s s e u n e n e s p e c íf ic a m e n te a e p íto p o s d ia n a . E je m p lo s d e a n t ic u e rp o s d e d o m in io ú n ic o s e d e n o m in a n s d A b , n a n o c u e rp o s o a n t ic u e rp o s d e d o m in io v a r ia b le ú n ic o .
U n (m A b d e d o m in io ú n ic o ) 2 es, p o r lo ta n to , u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l c o m p u e s ta p o r (a l m e n o s ) d o s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s d e d o m in io ú n ic o , q u e se s e le c c io n a n in d iv id u a lm e n te d e l g ru p o q u e c o m p re n d e V H , V L , V hH y V nar. E l e n la z a d o r e s tá p re fe r ib le m e n te e n fo rm a d e un e n la z a d o r p e p tíd ic o . D e fo rm a s im ila r , un "m A b d e d o m in io ú n ic o s c F v " e s u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l c o m p u e s to p o r a l m e n o s un a n t ic u e rp o d e d o m in io ú n ic o c o m o s e d e s c r ib e a rr ib a y u n a m o lé c u la d e s c F v c o m o s e d e s c r ib e a rr ib a . D e n u e v o , e l e n la z a d o r e s tá p re fe r ib le m e n te e n fo rm a d e un e n la z a d o r p e p tíd ic o .
L a p re s e n te in v e n c ió n p ro p o rc io n a u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o q u e c o m p re n d e un p r im e r d o m in io d e u n ió n q u e se u n e a F L T 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la d ia n a y un s e g u n d o d o m in io d e u n ió n q u e s e u n e a C D 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T, e n d o n d e e l p r im e r d o m in io d e u n ió n s e u n e a un e p íto p o d e F L T 3 q u e e s tá c o m p re n d id o d e n tro d e la re g ió n c o m o s e re p re s e n ta e n S E Q ID N O : 819 (a g ru p a c ió n 1), e n d o n d e d ic h a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o e s a l m e n o s b ie s p e c íf ic a .
P o r c o n s ig u ie n te , e n un a s p e c to a d ic io n a l d e la in v e n c ió n e l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o c o m p re n d e u n a re g ió n V H q u e c o m p re n d e C D R -H 1 , C D R -H 2 y C D R -H 3 y u n a re g ió n V L q u e c o m p re n d e C D R -L 1 , C D R -L 2 y C D R -L 3 s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en:
S E Q ID N O s: 151 -156 , S E Q ID N O s: 161 -166 , S E Q ID N O s: 171 -176 , S E Q ID N O s: 181 -186 , S E Q ID N O s: 191 -196 ,
S E Q ID N O s: 201 -206 , S E Q ID N O s: 211 -216 , S E Q ID N O s: 221 -226 , S E Q ID N O s: 231 -236 , S E Q ID N O s: 241 -246 ,
S E Q ID N O s: 251 -256 , S E Q ID N O s: 261 -266 , S E Q ID N O s: 271 -276 , S E Q ID N O s: 281 -286 , S E Q ID N O s: 291 -296 ,
S E Q ID N O s: 301 -306 , S E Q ID N O s: 311 -316 , S E Q ID N O s: 321 -326 , S E Q ID N O s: 331 -336 , S E Q ID N O s: 341 -346 ,
S E Q ID N O s: 351 -356 , S E Q ID N O s: 361 -366 , S E Q ID N O s: 371 -376 , S E Q ID N O s: 381 -386 , S E Q ID N O s: 391 -396 ,
S E Q ID N O s: 401 -406 , S E Q ID N O s: 411 -416 , S E Q ID N O s: 421 -426 , S E Q ID N O s: 431 -436 , S E Q ID N O s: 441 -446 ,
S E Q ID N O s: 451 -456 , S E Q ID N O s: 461 -466 , S E Q ID N O s: 471 -476 , S E Q ID N O s: 481 -486 , S E Q ID N O s: 491 -496 ,
S E Q ID N O s: 501 -506 , S E Q ID N O s: 511 -516 , S E Q ID N O s: 521 -526 , S E Q ID N O s: 531 -536 , S E Q ID N O s: 541 -546 ,
S E Q ID N O s: 551 -556 , S E Q ID N O s: 561 -566 , S E Q ID N O s: 571 -576 , S E Q ID N O s: 581 -586 , S E Q ID N O s: 591 -596 ,
S E Q ID N O s: 601 -606 , S E Q ID N O s: 611 -616 , S E Q ID N O s: 621 -626 , S E Q ID N O s: 631 -636 , S E Q ID N O s: 641 -646 ,
S E Q ID N O s: 651 -656 , S E Q ID N O s: 661 -666 , S E Q ID N O s: 691 -696 , S E Q ID N O s: 701 -706 , S E Q ID N O s: 711 -716 ,
S E Q ID N O s: 721 -726 , S E Q ID N O s: 731 -736 , S E Q ID N O s: 741 -746 , S E Q ID N O s: 791 -796.
E n u n a re a liz a c ió n , e l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n c o m p re n d e u n a re g ió n V H s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s re p re s e n ta d a s e n S E Q ID N O : 157 , S E Q ID N O : 167 , S E Q ID N O : 177 , S E Q ID N O : 187 , S E Q ID N O : 197 , S E Q ID N O : 207 , S E Q ID N O : 217 , S E Q ID N O : 227 , S E Q ID N O : 237 , S E Q ID N O : 247 , S E Q ID N O : 257 , S E Q ID N O : 267 , S E Q ID N O : 277 , S E Q ID N O : 287 , S E Q ID N O : 297 , S E Q ID N O : 307 , S E Q ID N O : 317 , S E Q ID N O : 327 , S E Q ID N O : 337 , S E Q ID N O : 347 , S E Q ID N O : 357 , S E Q ID N O : 367 , S E Q ID N O : 377 , S E Q ID N O : 387 , S E Q ID N O : 397 , S E Q ID N O : 407 , S E Q ID N O : 417 , S E Q ID N O : 427 , S E Q ID N O : 437 , S E Q ID N O : 447 , S E Q ID N O : 457 , S E Q ID N O : 467 , S E Q ID N O : 477 , S E Q ID N O : 487 , S E Q ID N O : 497 , S E Q ID N O : 507 , S E Q ID N O : 517 , S E Q ID N O : 527 , S E Q ID N O : 537 , S E Q ID N O : 547 , S E Q ID N O : 557 , S E Q ID N O : 567 , S E Q ID N O : 577 , S E Q ID N O : 587 , S E Q ID N O : 597 , S E Q ID N O : 607 , S E Q ID N O : 617 , S E Q ID N O : 627 , S E Q ID N O : 637 , S E Q ID N O : 647 , S E Q ID N O : 657 , S E Q ID N O : 667 , S E Q ID N O : 697 , S E Q ID N O : 707 , S E Q ID N O : 717 , S E Q ID N O : 727 , S E Q ID N O : 737 , S E Q ID N O : 747 y S E Q ID N O : 797.
E n u n a re a liz a c ió n a d ic io n a l, e l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n c o m p re n d e u n a re g ió n V L s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s re p re s e n ta d a s e n S E Q ID N O : 158 , S E Q ID N O : 168 , S E Q ID N O : 178 , S E Q ID N O : 188 , S E Q ID N O : 198 , S E Q ID N O : 208 , S E Q ID N O : 218 , S E Q ID N O : 228 , S E Q ID N O : 238 , S E Q ID N O : 248 , S E Q ID N O : 258 , S E Q ID N O : 268 , S E Q ID N O : 278 , S E Q ID N O : 288 , S E Q ID N O : 298 , S E Q ID N O : 308 , S E Q ID N O : 318 , S E Q ID N O : 328 , S E Q ID N O : 338 , S E Q ID N O : 348 , S E Q ID N O : 358 , S E Q ID N O : 368 , S E Q ID N O : 378 , S E Q ID N O : 388 , S E Q ID N O : 398 , S E Q ID N O : 408 , S E Q ID N O : 418 , S E Q ID N O : 428 , S E Q ID N O : 438 , S E Q ID N O : 448 , S E Q ID N O : 458 , S E Q ID N O : 468 , S E Q ID N O : 478 , S E Q ID N O : 488 , S E Q ID N O : 498 , S E Q ID N O : 508 , S E Q ID N O : 518 , S E Q ID N O : 528 , S E Q ID N O : 538 , S E Q ID N O : 548 , S E Q ID N O : 558 , S E Q ID N O : 568 , S E Q ID N O : 578 , S E Q ID N O : 588 , S E Q ID N O : 598 , S E Q ID N O : 608 , S E Q ID N O : 618 , S E Q ID N O : 628 , S E Q ID N O : 638 , S E Q ID N O : 648 , S E Q ID N O : 658 , S E Q ID N O : 668 , S E Q ID N O : 698 , S E Q ID N O : 708 , S E Q ID N O : 718 , S E Q ID N O : 728 , S E Q ID N O : 738 , S E Q ID N O : 748 y S E Q ID N O : 798.
E n o tra re a liz a c ió n , e l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n c o m p re n d e u n a re g ió n V H y u n a re g ió n V L s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n p a re s d e u n a re g ió n V H y u n a re g ió n V L c o m o se re p re s e n ta e n la s S E Q ID N O : 157 158 , ‘ S E Q ID N O : 167 168 , S E Q ID N O : 177 178 , S E Q ID N O : 187 188 , S E Q ID N O : 197 198 , S E Q ID N O : 207 208 , S E Q ID N O : 217 218 , S E Q ID N O : 227 228 , S E Q ID N O : 237 238 , S E Q ID N O : 247 248 , S E Q ID N O : 257 258 , S E Q ID N O : 267 268 , S E Q ID N O : 277 278 , S E Q ID N O : 287 288 , S E Q ID N O : 297 298 , S E Q ID N O : 307 308 , S E Q ID N O : 317 318 , S E Q ID N O : 327 328 , S E Q ID N O : 337 338 , S E Q ID N O : 347 348 , S E Q ID N O : 357 358 , S E Q ID N O : 367 368 , S E Q ID N O : 377 378 , S E Q ID N O : 387 388 , S E Q ID N O : 397 398. , S E Q ID N O : 407 408 , S E Q ID N O : 417 418 , S E Q ID N O : 427 428 , S E Q ID N O : 437 438 , S E Q ID N O : 447 448 , S E Q ID N O : 457 458 , S E Q ID N O : 467 468 , S E Q ID N O : 477 478 , S E Q ID N O : 487 488 , S E Q ID N O : 497 498 , S E Q ID N O : 507 508 , S E Q ID N O : 517 518 , S E Q ID N O : 527 528 , S E Q ID N O : 537 538 , S E Q ID N O : 547 548 , S E Q ID N O : 557 558 , S E Q ID N O : 567 568 , S E Q ID N O : 577 578 , S E Q ID N O : 587 588 , S E Q ID N O : 597 598 , S E Q ID N O : 607 608 , S E Q ID N O : 617 618 , S E Q ID N O : 627 628 , S E Q ID N O : 637 638 , S E Q ID N O : 647 648 , S E Q ID N O : 657 658 , S E Q ID N O : 667 668 , S E Q ID N O : 697 698 , S E Q ID N O : 707 708 , S E Q ID N O : 717 718 , S E Q ID N O : 727 728 , S E Q ID N O : 737 738 , S E Q ID N O : 747 748 y S E Q ID N O : 797 798.
E n u n a re a liz a c ió n a d ic io n a l, e l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n c o m p re n d e un p o lip é p tid o s e le c c io n a d o d e l g ru p o q u e c o n s is te e n lo s re p re s e n ta d o s e n S E Q ID N O : 159 , S E Q ID N O : 169 , S E Q ID N O : 179 , S E Q ID N O : 189 , S E Q ID N O : 199 , S E Q ID N O : 209 , S E Q ID N O : 219 y S E Q ID N O : 229 , S E Q ID N O : 239 , S E Q ID N O : 249 , S E Q ID N O : 259 , S E Q ID N O : 269 , S E Q ID N O : 279 y S E Q ID N O : 289 , S E Q ID N O : 299 , S E Q ID N O : 309 , S E Q ID N O : 319 , S E Q ID N O : 329 , S E Q ID N O : 339 , S E Q ID N O : 349 , S E Q ID N O : 359 , S E Q ID N O : 369 , S E Q ID N O : 379 y S E Q ID N O : 389 , S E Q ID N O : 399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 , S E Q ID N O : 459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O : 519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 , S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 , S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID
N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799.
T a m b ié n e s tá p re v is to q u e la p re s e n te d iv u lg a c ió n p ro p o rc io n e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o q u e c o m p re n d e un p r im e r d o m in io d e u n ió n q u e se u n e a F L T 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la d ia n a y un s e g u n d o d o m in io d e u n ió n q u e s e u n e a C D 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T , e n d o n d e el p r im e r d o m in io d e u n ió n se u n e a un e p íto p o d e F L T 3 q u e e s tá c o m p re n d id o d e n tro d e la re g ió n c o m o s e re p re s e n ta e n S E Q ID N O : 821 (a g ru p a c ió n 3).
D e a c u e rd o c o n la p re s e n te d iv u lg a c ió n , e l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o c o m p re n d e u n a re g ió n V H q u e c o m p re n d e C D R -H 1 , C D R -H 2 y C D R -H 3 y u n a re g ió n V L q u e c o m p re n d e C D R -L 1 , C D R -L 2 y C D R -L 3 c o m o s ig u e : S E Q ID N O s : 671 -676 , S E Q ID N O s : 681 -686 , S E Q ID N O s : 751 -756 , S E Q ID N O s : 761 -766 , S E Q ID N O s : 771 -776 y S E Q ID N O s : 781 -786.
E l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e s c r ita e n e s ta m e m o r ia c o m p re n d e u n a re g ió n V H re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 677 , S E Q ID N O : 687 , S E Q ID N O : 757 , S E Q ID N O : 767 , S E Q ID N O : 777 y S E Q ID N O : 787.
E l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e s c r ita e n e s ta m e m o r ia c o m p re n d e u n a re g ió n V L re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 678 , S E Q ID N O : 688 , S E Q ID N O : 758 , S E Q ID N O : 768 , S E Q ID N O : 778 y S E Q ID N O : 788.
E l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e s c r ita en e s ta m e m o r ia c o m p re n d e u n a re g ió n V H y u n a re g ió n V L s e le c c io n a d o d e l g ru p o q u e c o n s ta d e p a re s d e u n a re g ió n V H y u n a re g ió n V L c o m o s e m u e s tra en S E Q ID N O : 677 678 , S E Q ID N O : 687 688 , S E Q ID N O : 757 758 , S E Q ID N O : 767 768 , S E Q ID N O : 777 778 y S E Q ID N O : 787 788.
E l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e s c r ito en e s ta m e m o r ia c o m p re n d e un p o lip é p tid o s e le c c io n a d o d e l g ru p o q u e c o n s is te e n lo s re p re s e n ta d o s e n S E Q ID N O : 679 y S E Q ID N O : 689 , S E Q iD N O : 759 , S E Q ID N O : 769 , S E Q ID N O : 779 y S E Q ID N O : 789.
O tra c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o c o n la p re s e n te d iv u lg a c ió n ta m b ié n s e p u e d e d e f in ir c o m o u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o q u e c o m p re n d e un p r im e r d o m in io d e u n ió n (p re fe r ib le m e n te h u m a n o ) q u e se u n e a F L T 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la d ia n a y un s e g u n d o d o m in io d e u n ió n q u e s e u n e a C D 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T , e n d o n d e e l p r im e r d o m in io d e u n ió n c o m p ite p o r la u n ió n co n un a n t ic u e rp o s e le c c io n a d o d e l g ru p o q u e c o n s is te e n F L-1 a F L -53 , F L -55 a F L -60 y F L -65 , es decir, un a n t ic u e rp o q u e c o m p re n d e u n a re g ió n V H q u e c o m p re n d e C D R -H 1 , C D R -H 2 y C D R -H 3 y u n a re g ió n V L q u e c o m p re n d e C D R -L 1 , C D R -L 2 y C D R -L 3 s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n lo s a rr ib a d e s c r ito s .
L a s c é lu la s T o l in fo c ito s T s o n un t ip o d e lin fo c ito (e n s í m is m o un t ip o d e g ló b u lo b la n c o ) q u e d e s e m p e ñ a un p a p e l c e n tra l e n la in m u n id a d m e d ia d a p o r c é lu la s . E x is te n v a r io s s u b c o n ju n to s d e c é lu la s T, c a d a u n o c o n u n a fu n c ió n d is t in ta . L a s c é lu la s T s e p u e d e n d is t in g u ir d e o tro s lin fo c ito s , ta le s c o m o la s c é lu la s B y la s c é lu la s N K , p o r la p re s e n c ia d e un re c e p to r d e c é lu la s T (T C R ) e n la s u p e r f ic ie d e la c é lu la . E l T C R e s re s p o n s a b le d e re c o n o c e r a n tíg e n o s u n id o s p re fe r ib le m e n te < 200 pM , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 150 pM , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 100 pM , y lo m á s p re fe r ib le m e n te < 50 pM , o in fe r io r . C u a n d o s e u t iliz a u n a lín e a d e c é lu la s T d e m a c a c o ta l c o m o L n P x 4119 c o m o c é lu la s e fe c to ra s , y u n a lín e a c e lu la r t ra n s fe c ta d a co n F L T 3 d e m a c a c o , ta l c o m o c é lu la s C H O , s e u t iliz a c o m o lín e a c e lu la r d ia n a , e l v a lo r d e C E 50 d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o F L T 3 x C D 3 e s p re fe r ib le m e n te < 2000 pM o < 1500 pM , m á s p re fe r ib le m e n te < 1000 pM o < 500 pM , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 300 pM o < 250 pM , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 100 pM , y lo m á s p re fe r ib le m e n te < 50 pM .
P re fe r ib le m e n te , la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 d e la p re s e n te in v e n c ió n n o in d u c e n / m e d ia n e n la lis is o n o in d u c e n / m e d ia n e s e n c ia lm e n te e n la lis is d e c é lu la s F L T 3 n e g a t iv a s ta le s c o m o c é lu la s C H O . L a e x p re s ió n "n o in d u c e n la lis is " , " e s e n c ia lm e n te n o in d u c e n la lis is " , "n o m e d ia n en la lis is " o "e s e n c ia lm e n te no m e d ia n en la lis is " s ig n if ic a q u e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la p re s e n te in v e n c ió n n o in d u c e n i m e d ia e n la lis is d e m á s d e l 30 % , p re fe r ib le m e n te n o m á s d e l 20 % , m á s p re fe r ib le m e n te n o m á s d e l 10 % , d e m a n e ra p a r t ic u la rm e n te p re fe r id a n o m á s d e l 9 % , 8 % , 7 % , 6 % o 5 % d e c é lu la s n e g a t iv a s p a ra F L T 3 , p o r lo q u e la lis is d e u n a lín e a c e lu la r S H P -77 d e c a rc in o m a d e p u lm ó n h u m a n o F L T 3 p o s it iv a (v é a s e a r r ib a ) s e e s ta b le c e e n 100 % . E s to g e n e ra lm e n te se a p lic a a c o n c e n tra c io n e s d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e h a s ta 500 nM . L a p e rs o n a e x p e r ta s a b e c ó m o m e d ir en la lis is c e lu la r s in m á s p re á m b u lo s . A d e m á s , la p re s e n te m e m o r ia d e s c r ip t iv a e n s e ñ a in s tru c c io n e s e s p e c íf ic a s s o b re c ó m o m e d ir la lis is c e lu la r.
A la d ife re n c ia e n la a c t iv id a d c ito tó x ic a e n tre la is o fo rm a m o n o m é r ic a y la d im é r ic a d e c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 in d iv id u a l s e la a lu d e c o m o "b re c h a d e p o te n c ia " . E s ta b re c h a d e p o te n c ia s e p u e d e c a lc u la r, p. e j., c o m o la re la c ió n e n tre los v a lo re s d e C E 50 d e la fo rm a m o n o m é r ic a y d im é r ic a d e la m o lé c u la , v é a s e e l E je m p lo 17. B re c h a s d e p o te n c ia d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 d e la p re s e n te in v e n c ió n so n p re fe r ib le m e n te < 5, m á s p re fe r ib le m e n te < 4 , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 3, in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 2 y lo m á s p re fe r ib le m e n te < 1.
E l p r im e r y /o e l s e g u n d o (o c u a lq u ie r o tro ) d o m in io (s ) d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la in v e n c ió n e s /s o n p re fe r ib le m e n te , e s p e c ie s c ru z a d a s e s p e c íf ic a s p a ra m ie m b ro s d e l o rd e n d e m a m ífe ro s d e p r im a te s . D o m in io s d e u n ió n a C D 3 e s p e c íf ic o s e n tre e s p e c ie s s e d e s c r ib e n , p o r e je m p lo , e n e l d o c u m e n to W O 2008 /119567. D e a c u e rd o c o n u n a re a liz a c ió n , e l p r im e r y /o e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n , a d e m á s d e u n irs e a F L T 3 h u m a n a y C D 3 h u m a n a , re s p e c t iv a m e n te , ta m b ié n s e u n irá a F L T 3 / C D 3 d e p r im a te s in c lu y e n d o (p e ro n o lim ita d o a ) p r im a te s d e l n u e v o m u n d o ( ta le s c o m o C a llith rix ja c c h u s , S a g u in u s O ed ipu s o S a im irí s c iu re u s ) , p r im a te s d e l v ie jo m u n d o ( ta le s c o m o b a b u in o s y m a c a c o s ) , g ib o n e s , o ra n g u ta n e s y h o m ín id o s n o h u m a n o s . E s tá p re v is to q u e e l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la in v e n c ió n q u e s e u n e a FLT3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la d ia n a ta m b ié n s e u n e a l m e n o s u n a FLT3 d e m a c a c o , y /o a l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n q u e s e u n e a C D 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T ta m b ié n s e u n e a l m e n o s a C D 3 d e m a c a c o . U n m a c a c o p re fe r id o e s M a ca ca fasc icu la ris . T a m b ié n e s tá p re v is to M aca ca m u la ta (R h e s u s ) .
E n un a s p e c to d e la in v e n c ió n , e l p r im e r d o m in io d e u n ió n s e u n e a F L T 3 h u m a n a y s e u n e , a d e m á s , a F L T 3 d e m a c a c o , ta l c o m o F L T 3 d e M aca ca fasc icu la ris , y m á s p re fe r ib le m e n te , a F L T 3 d e m a c a c o e x p re s a d a e n la s u p e r f ic ie d e c é lu la s d e m a c a c o . U n a F L T 3 p re fe r id a d e M a ca ca fa sc icu la r is s e re p re s e n ta e n S E Q ID N O : 802. La a f in id a d d e l p r im e r d o m in io d e u n ió n p o r la F L T 3 d e m a c a c o e s p re fe r ib le m e n te < 15 nM , m á s p re fe r ib le m e n te < 10 nM , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 5 nM , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 1 nM , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 0 ,5 nM , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 0,1 nM y lo m á s p re fe r ib le m e n te < 0 ,05 nM o in c lu s o < 0 ,01 nM .
P re fe r ib le m e n te , la b re c h a d e a f in id a d d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s d e a c u e rd o c o n la in v e n c ió n p a ra u n irs e a F L T 3 d e m a c a c o f re n te a F L T 3 h u m a n a [m a F L T 3 :h u F L T 3 ] (s e g ú n s e d e te rm in a , p. ej., m e d ia n te a n á lis is B ia C o re o S c a tc h a rd ) e s < 100 , p re fe r ib le m e n te < 20 , m á s p re fe r ib le m e n te < 15, a d e m á s p re fe r ib le m e n te < 10, in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 8, m á s p re fe r ib le m e n te < 6 y lo m á s p re fe r ib le m e n te < 2. In te rv a lo s p re fe r id o s p a ra la b re c h a d e a f in id a d d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s d e a c u e rd o co n la in v e n c ió n p a ra u n ir F L T 3 d e m a c a c o a F L T 3 h u m a n a e s tá n e n tre 0,1 y 20 , m á s p re fe r ib le m e n te e n tre 0 ,2 y 10, in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te e n tre 0 ,3 y 6, in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te e n tre 0 ,5 y 3 o e n tre 0 ,5 y 2 ,5 , y lo m á s p re fe r ib le m e n te e n tre 0 ,5 y 2 o e n tre 0.6 y 2. V é a s e e l E je m p lo 5.
E n u n a re a liz a c ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la in v e n c ió n , e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n s e u n e a C D 3 é p s ilo n h u m a n a y a C D 3 é p s ilo n d e C a llith rix ja c c h u s , S a g u in u s O e d ip u s o S a im iri sc iu reus . P re fe r ib le m e n te , e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n se u n e a un e p íto p o e x tra c e lu la r d e e s ta s c a d e n a s d e C D 3 é p s ilo n . T a m b ié n e s tá p re v is to q u e e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n s e u n a a un e p íto p o e x tra c e lu la r d e la c a d e n a C D 3 é p s ilo n h u m a n a y d e M acaca . El e p íto p o m á s p re fe r id o d e C D 3 é p s ilo n e s tá c o m p re n d id o d e n tro d e lo s re s id u o s d e a m in o á c id o s 1 -27 d e l d o m in io e x t ra c e lu la r d e C D 3 é p s ilo n h u m a n a . In c lu s o m á s e s p e c íf ic a m e n te , e l e p íto p o c o m p re n d e a l m e n o s la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s G ln -A s p -G ly -A s n -G lu . C a llith r ix ja c c h u s y S a g u inus o e d ip u s s o n a m b o s p r im a te s d e l n u e v o m u n d o p e r te n e c ie n te s a la fa m il ia C a llitr ich id ae , m ie n tra s q u e S a im iri s c iu re u s e s un p r im a te d e l n u e v o m u n d o p e r te n e c ie n te a la fa m il ia d e C ebidae .
S e p re f ie re p a r t ic u la rm e n te p a ra la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la p re s e n te in v e n c ió n q u e e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n q u e s e u n e a C D 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T c o m p re n d a u n a re g ió n V L q u e c o m p re n d e C D R -L 1 , C D R -L 2 y C D R -L 3 s e le c c io n a d a s de:
(a ) C D R -L 1 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 27 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 , C D R -L 2 c o m o se m u e s tra e n S E Q ID N O : 28 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y C D R -L 3 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 29 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
(b ) C D R -L 1 c o m o se m u e s tra e n S E Q ID N O : 117 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 , C D R -L 2 c o m o se m u e s tra e n S E Q ID N O : 118 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y C D R -L 3 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 119 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ; y
(c ) C D R -L 1 c o m o s e m u e s tra en S E Q ID N O : 153 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 , C D R -L 2 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 154 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y C D R -L 3 c o m o se m u e s tra e n S E Q ID N O : 155 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567.
E n u n a re a liz a c ió n a lte rn a t iv a m e n te p re fe r id a d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la p re s e n te in v e n c ió n , e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n q u e s e u n e a C D 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T c o m p re n d e u n a re g ió n V H q u e c o m p re n d e C D R -H 1, C D R -H 2 y C D R -H 3 s e le c c io n a d a s de :
(a ) C D R -H 1 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 12 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 , C D R -H 2 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 13 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y C D R -H 3 c o m o s e m u e s tra en S E Q ID N O : 14 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
(b ) C D R -H 1 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 30 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 , C D R -H 2 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 31 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y C D R -H 3 c o m o s e m u e s tra en S E Q ID N O : 32 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
(c ) C D R -H 1 c o m o s e m u e s tra en S E Q ID N O : 48 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 , C D R -H 2 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 49 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y C D R -H 3 c o m o s e m u e s tra en S E Q ID N O : 50 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
(d ) C D R -H 1 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 66 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 , C D R -H 2 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 67 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y C D R -H 3 c o m o s e m u e s tra en S E Q ID N O : 68 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
(e ) C D R -H 1 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 84 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 , C D R -H 2 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 85 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y C D R -H 3 c o m o s e m u e s tra en S E Q ID N O : 86 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
( f) C D R -H 1 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 102 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 , C D R -H 2 c o m o se m u e s tra e n S E Q ID N O : 103 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y C D R -H 3 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 104 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
(g ) C D R -H 1 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 120 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 , C D R -H 2 c o m o se m u e s tra e n S E Q ID N O : 121 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y C D R -H 3 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 122 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
(h ) C D R -H 1 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 138 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 , C D R -H 2 c o m o se m u e s tra e n S E Q ID N O : 139 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y C D R -H 3 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 140 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
( i) C D R -H 1 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 156 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 , C D R -H 2 c o m o se m u e s tra e n S E Q ID N O : 157 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y C D R -H 3 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 158 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ; y
( j) C D R -H 1 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 174 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 , C D R -H 2 c o m o se m u e s tra e n S E Q ID N O : 175 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y C D R -H 3 c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 176 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567.
S e p re f ie re a d e m á s p a ra la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la p re s e n te in v e n c ió n q u e e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n q u e s e u n e a l C D 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T c o m p re n d a u n a re g ió n V L s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n u n a re g ió n V L c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 18, S E Q ID N O : 27 , S E Q ID N O : 36 , S E Q ID N O : 45 , S E Q ID N O : 54 , S E Q ID N O : 63 , S E Q ID N O : 72 , S E Q ID N O : 81 , S E Q ID N O : 90 , S E Q ID N O : 99 y S E Q ID N O : 102 (v é a s e ta m b ié n S E Q ID N O : 35 , 39 , 125 , 129 , 161 o 165 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ) .
A lte rn a tiv a m e n te , s e p re f ie re q u e e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n q u e s e u n e a C D 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T c o m p re n d a u n a re g ió n V H s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n u n a re g ió n V H c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 17, S E Q ID N O : 26 , S E Q ID N O : 35 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 53 , S E Q ID N O : 62 , S E Q ID N O : 71 , S E Q ID N O : 80 , S E Q ID N O : 89 , S E Q ID N O : 98 y S E Q ID N O : 101 (v é a n s e ta m b ié n S E Q ID N O : 15, 19, 33 , 37 , 51 , 55, 69 , 73 , 87 , 91 , 105 , 109 , 123 , 127 , 141 , 145 , 159 , 163 , 177 o 181 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ) .
M á s p re fe r ib le m e n te , la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la p re s e n te in v e n c ió n s e c a ra c te r iz a p o r e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n q u e s e u n e a l C D 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T q u e c o m p re n d a u n a re g ió n V L y u n a re g ió n V H s e le c c io n a d a s d e l g ru p o q u e c o n s is te e n :
(a ) u n a re g ió n V L c o m o se m u e s tra e n S E Q ID N O : 17 o 21 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y u n a re g ió n V H c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 15 o 19 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
(b ) u n a re g ió n V L c o m o se m u e s tra e n S E Q ID N O : 35 o 39 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y u n a re g ió n V H c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 33 o 37 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
(c ) u n a re g ió n V L c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 53 o 57 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y u n a re g ió n V H c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 51 o 55 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
(d ) u n a re g ió n V L c o m o se m u e s tra e n S E Q ID N O : 71 o 75 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y u n a re g ió n V H c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 69 o 73 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
(e ) u n a re g ió n V L c o m o se m u e s tra e n S E Q ID N O : 89 o 93 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y u n a re g ió n V H c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 87 o 91 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
( f) u n a re g ió n V L c o m o se m u e s tra e n S E Q ID N O : 107 o 111 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y u n a re g ió n V h c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 105 o 109 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
(g ) u n a re g ió n V L c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 125 o 129 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y u n a re g ió n V H c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 123 o 127 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
(h ) u n a re g ió n V L c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 143 o 147 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y u n a re g ió n V H c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 141 o 145 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ;
( i) u n a re g ió n V L c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 161 o 165 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y u n a re g ió n V h c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 159 o 163 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ; y
( j) u n a re g ió n V L c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 179 o 183 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 y u n a re g ió n V h c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 177 o 181 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567.
T a m b ié n s e p re f ie re e n re la c ió n c o n la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la p re s e n te in v e n c ió n un s e g u n d o d o m in io d e u n ió n q u e s e u n e a C D 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T q u e c o m p re n d a u n a re g ió n V L c o m o s e m u e s tra en S E Q iD N O : 102 y u n a re g ió n V H c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 101.
D e a c u e rd o c o n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la p re s e n te in v e n c ió n , lo s d o m in io s d e u n ió n y, e n p a rt ic u la r , e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n (q u e s e u n e a C D 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T ) t ie n e n e l s ig u ie n te fo rm a to : lo s p a re s d e re g io n e s V H y re g io n e s V L t ie n e n e l fo rm a to d e un a n t ic u e rp o d e c a d e n a s e n c il la (s c F v ) . L a s re g io n e s V H y V L e s tá n d is p u e s ta s e n e l o rd e n V H -V L o V L -V H . S e p re f ie re q u e la re g ió n V H se c o lo q u e e n e l e x tre m o N d e u n a s e c u e n c ia d e e n la z a d o r , y q u e la re g ió n V L s e c o lo q u e e n e l e x tre m o C d e la s e c u e n c ia d e e n la z a d o r .
U n a re a liz a c ió n p re fe r id a d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la p re s e n te in v e n c ió n a rr ib a d e s c r ita s e c a ra c te r iz a p o r e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n q u e se u n e a C D 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T q u e c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en S E Q ID N O : 19, S E Q ID N O : 28 , S E Q iD N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 (v é a n s e ta m b ié n S E Q ID N O : 23 , 25 , 41 , 43 , 59 , 61 , 77 , 79 , 95 , 97 , 113 , 115 , 131 , 133 , 149 , 151 , 167 , 169 , 185 o 187 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ) .
T a m b ié n se p re v é q u e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n te n g a , a d e m á s d e su fu n c ió n d e u n irs e a las m o lé c u la s d ia n a F L T 3 y C D 3 , u n a fu n c ió n a d ic io n a l. E n e s te fo rm a to , la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s e s u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s tr ifu n c io n a l o m u lt i fu n c io n a l q u e s e f ija c o m o o b je t iv o a la s c é lu la s d ia n a m e d ia n te la u n ió n a F L T 3 , m e d ia n d o e n la a c t iv id a d d e la s c é lu la s T c ito tó x ic a s a t ra v é s d e la u n ió n d e C D 3 y p ro p o rc io n a n d o u n a fu n c ió n a d ic io n a l, ta l c o m o un d o m in io c o n s ta n te F c c o m p le ta m e n te fu n c io n a l q u e m e d ia en la c ito to x ic id a d c e lu la r d e p e n d ie n te d e a n t ic u e rp o s , a t ra v é s d e l re c lu ta m ie n to d e c é lu la s e fe c to ra s ta le s c o m o la s c é lu la s N K , un m a rc a d o r ( f lu o re s c e n te , e tc .), un a g e n te te ra p é u t ic o ta l c o m o u n a to x in a o un ra d io n u c le id o , y /o m e d io s p a ra p o te n c ia r la s e m iv id a e n s u e ro , e tc .
E je m p lo s d e m e d io s p a ra p ro lo n g a r la s e m iv id a en s u e ro d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s d e la in v e n c ió n in c lu y e n p é p tid o s , p ro te ín a s o d o m in io s d e p ro te ín a s , q u e e s tá n fu s io n a d o s o f i ja d o s d e o tra m a n e ra a la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s . E l g ru p o d e p é p tid o s , p ro te ín a s o d o m in io s d e p ro te ín a s in c lu y e p é p tid o s q u e s e u n e n a o tra s p ro te ín a s c o n un p e rfil fa rm a c o c in é t ic o p re fe r id o e n e l c u e rp o h u m a n o , ta l c o m o la a lb ú m in a s é r ic a (v é a s e e l d o c u m e n to W O 2009 /127691 ) . U n c o n c e p to a lte rn a t iv o d e p é p tid o s d e e s te t ip o q u e p ro lo n g a n la s e m iv id a in c lu y e p é p tid o s q u e s e u n e n a l re c e p to r d e F c n e o n a ta l (F c R n , v é a s e e l d o c u m e n to W O 2007 /098420 ) , q u e ta m b ié n s e p u e d e n u t il iz a r e n las c o n s tru c c io n e s d e la p re s e n te in v e n c ió n . E l c o n c e p to d e f i ja r d o m in io s m á s g ra n d e s d e p ro te ín a s o p ro te ín a s c o m p le ta s in c lu y e , p. e j., la fu s ió n d e a lb ú m in a d e s u e ro h u m a n o , v a r ia n te s o m u ta n te s d e a lb ú m in a d e s u e ro h u m a n o ( v é a n s e lo s d o c u m e n to s W O 2011 /051489 , W O 2012 /059486 , W O 2012 /150319 , W O 2013 /135896 , W O 2014 /072481 , W O 2013 /075066 ) o d o m in io s d e lo s m is m o s , a s í c o m o la fu s ió n d e la re g ió n c o n s ta n te d e in m u n o g lo b u lin a s (d o m in io s F c ) y v a r ia n te s d e la s m is m a s . V a r ia n te s d e d o m in io s F c d e e s te t ip o p u e d e n o p t im iz a rs e / m o d if ic a rs e c o n e l f in d e p e rm it ir e l a p a re a m ie n to d e s e a d o d e d ím e ro s o m u ltím e ro s , p a ra a b o lir la u n ió n a l re c e p to r F c (p . e j., e l re c e p to r F c y ) o p o r o tra s ra z o n e s . U n c o n c e p to a d ic io n a l c o n o c id o e n la té c n ic a p a ra p ro lo n g a r la s e m iv id a d e p e q u e ñ o s c o m p u e s to s p ro te ic o s e n e l c u e rp o h u m a n o e s la p e g ila c ió n d e e s o s c o m p u e s to s , ta le s c o m o la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la p re s e n te in v e n c ió n .
E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a , la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e a c u e rd o co n la in v e n c ió n se d e s c r ib e c o m o s ig u e :
(a ) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
159 , S E Q ID N O : 169 , S E Q ID N O : 179 , S E Q ID N O : 189 , S E Q ID N O : 199 , S E Q ID N O : 209 , S E Q ID N O : 219 y S E Q ID N O : 229 , S E Q ID N O : 239 , S E Q ID N O : 249 y S E Q ID N O : 259 , S E Q ID N O : 269 , S E Q ID N O : 279 y S E Q ID N O : 289 , S E Q ID N O : 299 , S E Q ID N O : 309 , S E Q ID N O : 319 y S E Q ID N O : 329 , S E Q ID N O : 339 , S E Q ID N O : 349 y S E Q ID N O : 359 , S E Q ID N O : 369 , S E Q ID N O : 379 y S E Q ID N O : 389 , S E Q ID N O : 399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 y S E Q ID N O : 459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O : 519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 y S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 y S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1 -9 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ; y
• o p c io n a lm e n te , u n a e t iq u e ta H is , ta l c o m o la re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 10;
(b ) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
159 , S E Q ID N O : 169 , S E Q ID N O : 179 , S E Q ID N O : 189 , S E Q ID N O : 199 , S E Q ID N O : 209 , S E Q ID N O : 219 y S E Q ID N O : 229 , S E Q ID N O : 239 , S E Q ID N O : 249 y S E Q ID N O : 259 , S E Q ID N O : 269 , S E Q ID N O : 279 y S E Q ID N O : 289 , S E Q ID N O : 299 , S E Q ID N O : 309 , S E Q ID N O : 319 y S E Q ID N O : 329 , S E Q ID N O : 339 , S E Q ID N O : 349 y S E Q ID N O : 359 , S E Q ID N O : 369 , S E Q ID N O : 379 y S E Q ID N O : 389 , S E Q ID N O :
399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 y S E Q ID N O : 459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O : 519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 y S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 y S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en S E Q ID N O s : 1 -9 ;
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ;
• o p c io n a lm e n te , un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1-9 ;
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s :
104 -134 ; y
• o p c io n a lm e n te , u n a e t iq u e ta H is , ta l c o m o la re p re s e n ta d a en S E Q ID N O : 10;
(c ) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , en e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s Q R F V T G H F G G L X 1 P A N G (S E Q ID N O : 135 ), en d o n d e X 1 e s Y o H; y
Figure imgf000024_0001
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1 -9 ;
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ;
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s Q R F V T G H F G G L H P A N G (S E Q ID N O : 137 ) o Q R F C T G H F G G L H P C N G (S E Q ID N O : 139 ); y
• o p c io n a lm e n te , u n a e t iq u e ta H is , ta l c o m o la re p re s e n ta d a en S E Q ID N O : 10;
(d ) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
17, S E Q ID N O : 26 , S E Q ID N O : 35 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 53 , S E Q ID N O : 62 , S E Q ID N O : 71 , S E Q ID N O : 80 , S E Q ID N O : 89 , S E Q ID N O : 98 Y S E Q ID N O : 101 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 8;
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
158 , S E Q ID N O : 168 , S E Q ID N O : 178 , S E Q ID N O : 188 , S E Q ID N O : 198 , S E Q ID N O : 208 , S E Q ID N O : 218 , S E Q ID N O : 228 , S E Q ID N O : 238 , S E Q ID N O : 248 , S E Q ID N O : 258 , S E Q ID N O : 268 , S E Q ID N O : 278 , S E Q ID N O : 288 , S E Q ID N O : 298 , S E Q ID N O : 308 , S E Q ID N O : 318 , S E Q ID N O : 328 , S E Q ID N O : 338 , S E Q ID N O : 348 , S E Q ID N O : 358 , S E Q ID N O : 368 , S E Q ID N O : 378 , S E Q ID N O : 388 , S E Q ID N O : 398 , S E Q ID N O : 408 , S E Q ID N O : 418 , S E Q ID N O : 428 , S E Q ID N O : 438 , S E Q ID N O : 448 , S E Q ID N O : 458 , S E Q ID N O : 468 , S E Q ID N O : 478 , S E Q ID N O : 488 , S E Q ID N O : 498 , S E Q ID N O : 508 , S E Q ID N O : 518 , S E Q ID N O : 528 , S E Q ID N O : 538 , S E Q ID N O : 548 , S E Q ID N O : 558 , S E Q ID N O : 568 , S E Q ID N O : 578 , S E Q ID N O : 588 , S E Q ID N O : 598 , S E Q ID N O : 608 , S E Q ID N O : 618 , S E Q ID N O : 628 , S E Q ID N O : 638 , S E Q ID N O : 648 , S E Q ID N O : 658 , S E Q ID N O : 668 , S E Q ID N O : 698 , S E Q ID N O : 708 , S E Q ID N O : 718 , S E Q ID N O : 728 , S E Q ID N O : 738 , S E Q ID N O : 748 y S E Q ID N O : 798 , y un re s id u o d e s e r in a e n e l e x tre m o C;
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 140 , y un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , en e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O 157 , S E Q ID N O : 167 , S E Q ID N O 177 S E Q ID N O 187, S E Q ID N O : 197 , S E Q ID N O : 207 , S E Q ID N O 217 , S E Q ID N O : 227 , S E Q ID N O : 237 , S E Q ID N O : 247 , S E Q ID N O : 257 , S E Q ID N O : 267 , S E Q ID N O 277 , S E Q ID N O : 287 , S E Q ID N O : 297 , S E Q ID N O : 307 , S E Q ID N O : 317 , S E Q ID N O : 327 , S E Q ID N O 337 , S E Q ID N O : 347 , S E Q ID N O : 357 , S E Q ID N O : 367 , S E Q ID N O : 377 , S E Q ID N O : 387 , S E Q ID N O 397 , S E Q ID N O : 407 , S E Q ID N O 417 S E Q ID N O : 427 , S E Q ID N O : 437 , S E Q ID N O : 447 , S E Q ID N O 457 , S E Q ID N O : 467 , S E Q ID N O : 477 , S E Q ID N O : 487 , S E Q ID N O : 497 , S E Q ID N O : 507 , S E Q ID N O 517 , S E Q ID N O : 527 , S E Q ID N O : 537 , S E Q ID N O : 547 , S E Q ID N O : 557 , S E Q ID N O : 567 , S E Q ID N O 577 , S E Q ID N O : 587 , S E Q ID N O : 597 , S E Q ID N O : 607 , S E Q ID N O : 617 , S E Q ID N O : 627 , S E Q ID N O 637 , S E Q ID N O : 647 , S E Q ID N O : 657 , S E Q ID N O : 667 , S E Q ID N O : 697 , S E Q ID N O : 707 , S E Q ID N O 717 , S E Q ID N O : 727 , S E Q ID N O : 737 , S E Q ID N O : 747 y S E Q ID N O : 797 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 8;
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
18, S E Q ID N O : 27 , S E Q ID N O : 36 , S E Q ID N O : 45 , S E Q ID N O : 54 , S E Q ID N O : 63 , S E Q ID N O : 72 , S E Q ID N O : 81 , S E Q ID N O : 90 , S E Q ID N O : 99 y S E Q ID N O : 102 , y un re s id u o d e s e r in a en e l e x tre m o C ; y • un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 141 ;
(e ) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
17, S E Q ID N O : 26 , S E Q ID N O : 35 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 53 , S E Q ID N O : 62 , S E Q ID N O : 71 , S E Q ID N O : 80 , S E Q ID N O : 89 , S E Q ID N O : 98 y S E Q ID N O : 101 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 8;
un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O : 158 , S E Q ID N O : 168 , S E Q ID N O 178 S E Q ID N O 188 , S E Q ID N O 198 , S E Q ID N O : 208 , S E Q ID N O : 218 , S E Q ID N O : 228 , S E Q ID N O : 238 , S E Q ID N O : 248 , S E Q ID N O : 258 , S E Q ID N O : 268 , S E Q ID N O : 278 , S E Q ID N O : 288 , S E Q ID N O : 298 , S E Q ID N O : 308 , S E Q ID N O 318 , S E Q ID N O : 328 , S E Q ID N O : 338 , S E Q ID N O : 348 , S E Q ID N O : 358 , S E Q ID N O : 368 , S E Q ID N O : 378 , S E Q ID N O : 388 , S E Q ID N O : 398 , S E Q ID N O : 408 , S E Q ID N O 418 S E Q ID N O : 428 , S E Q ID N O : 438 , S E Q ID N O : 448 , S E Q ID N O : 458 , S E Q ID N O : 468 , S E Q ID N O : 478 , S E Q ID N O : 488 , S E Q ID N O : 498 , S E Q ID N O : 508 , S E Q ID N O : 518 , S E Q ID N O : 528 , S E Q ID N O : 538 , S E Q ID N O : 548 , S E Q ID N O : 558 , S E Q ID N O : 568 , S E Q ID N O : 578 , S E Q ID N O : 588 , S E Q ID N O : 598 , S E Q ID N O : 608 , S E Q ID N O 618 , S E Q ID N O : 628 , S E Q ID N O : 638 , S E Q ID N O : 648 , S E Q ID N O : 658 , S E Q ID N O : 668 , S E Q ID N O : 698 , S E Q ID N O : 708 , S E Q ID N O : 718 , S E Q ID N O : 728 , S E Q ID N O : 738 , S E Q ID N O : 748 y S E Q ID N O : 798 ;
un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 142 ; y un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , en e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O : 157 , S E Q ID N O : 167 , S E Q ID N O 177 S E Q ID N O 187 , S E Q ID N O 197 , S E Q ID N O : 207 , S E Q ID N O : 217 , S E Q ID N O : 227 , S E Q ID N O : 237 , S E Q ID N O : 247 , S E Q ID N O : 257 , S E Q ID N O : 267 , S E Q ID N O : 277 , S E Q ID N O : 287 , S E Q ID N O : 297 , S E Q ID N O : 307 , S E Q ID N O 317 , S E Q ID N O : 327 , S E Q ID N O : 337 , S E Q ID N O : 347 , S E Q ID N O : 357 , S E Q ID N O : 367 , S E Q ID N O : 377 , S E Q ID N O : 387 , S E Q ID N O : 397 , S E Q ID N O : 407 , S E Q ID N O 417 S E Q ID N O : 427 , S E Q ID N O : 437 , S E Q ID N O : 447 , S E Q ID N O : 457 , S E Q ID N O : 467 , S E Q ID N O : 477 , S E Q ID N O : 487 , S E Q ID N O : 497 , S E Q ID N O : 507 , S E Q ID N O : 517 , S E Q ID N O : 527 , S E Q ID N O : 537 , S E Q ID N O : 547 , S E Q ID N O : 557 , S E Q ID N O : 567 , S E Q ID N O : 577 , S E Q ID N O : 587 , S E Q ID N O : 597 , S E Q ID N O : 607 , S E Q ID N O 617 , S E Q ID N O : 627 , S E Q ID N O : 637 , S E Q ID N O : 647 , S E Q ID N O : 657 , S E Q ID N O : 667 , S E Q ID N O : 697 , S E Q ID N O : 707 , S E Q ID N O : 717 , S E Q ID N O : 727 , S E Q ID N O : 737 , S E Q ID N O : 747 y S E Q ID N O : 797 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 8;
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
18, S E Q ID N O : 27 , S E Q ID N O : 36 , S E Q ID N O : 45 , S E Q ID N O : 54 , S E Q ID N O : 63 , S E Q ID N O : 72 , S E Q ID N O : 81 , S E Q ID N O : 90 , S E Q ID N O : 99 y S E Q ID N O : 102 s e g u id o d e un re s id u o d e s e r in a en e l e x tre m o C; [C D 3 V L ]
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 143 ;
( f) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
159 , S E Q ID N O : 169 , S E Q ID N O : 179 , S E Q ID N O : 189 , S E Q ID N O : 199 , S E Q ID N O : 209 , S E Q ID N O : 219 y S E Q ID N O : 229 , S E Q ID N O : 239 , S E Q ID N O : 249 y S E Q ID N O : 259 , S E Q ID N O : 269 , S E Q ID N O : 279 y S E Q ID N O : 289 , S E Q ID N O : 299 , S E Q ID N O : 309 , S E Q ID N O : 319 y S E Q ID N O : 329 , S E Q ID N O : 339 , S E Q ID N O : 349 y S E Q ID N O : 359 , S E Q ID N O : 369 , S E Q ID N O : 379 y S E Q ID N O : 389 , S E Q ID N O :
399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 y S E Q ID N O : 459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O : 519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 y S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 y S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1 -9 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 144 ; y un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 145 ;
(g ) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
Figure imgf000026_0001
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 146 ; y un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , en e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a en S E Q ID N O : 147 ;
(h ) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
Figure imgf000026_0002
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 148 ; y
un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 149 ; o
( i) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
Figure imgf000026_0003
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1 -9 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O : 19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 150.
( j) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
159 , S E Q ID N O : 169 , S E Q ID N O : 179 , S E Q ID N O : 189 , S E Q ID N O : 199 , S E Q ID N O : 209 , S E Q ID N O : 219 y S E Q ID N O : 229 , S E Q ID N O : 239 , S E Q ID N O : 249 y S E Q ID N O : 259 , S E Q ID N O : 269 , S E Q ID N O : 279 y S E Q ID N O : 289 , S E Q ID N O : 299 , S E Q ID N O : 309 , S E Q ID N O : 319 y S E Q ID N O : 329 , S E Q ID N O : 339 , S E Q ID N O : 349 y S E Q ID N O : 359 , S E Q ID N O : 369 , S E Q ID N O : 379 y S E Q ID N O : 389 , S E Q ID N O :
399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 y S E Q ID N O : 459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O : 519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 y S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 y S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1 -9 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
S E Q ID N O : 19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1 -9 ; y
• e l te r c e r d o m in io q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 843 -850.
E n un a s p e c to p re fe r id o d e la d iv u lg a c ió n , la u n ió n d e l p r im e r d o m in io d e u n ió n a FLT3 h u m a n a s e re d u c e p o r el lig a n d o d e F L T 3 e n < 25 % , p re fe r ib le m e n te < 20 % , m á s p re fe r ib le m e n te < 15 % , a d e m á s , p re fe r ib le m e n te < 10 % , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 8 % , m á s p re fe r ib le m e n te < 6 % y lo m á s p re fe r ib le m e n te < 2% .
C o m o s e d e s c r ib e e n d e ta l le e n e l E je m p lo 18, s e h a e n c o n tra d o , s o rp re n d e n te m e n te q u e c o n s tru c c io n e s q u e c o m p re n d e n F L -53 , F L -54 , F L -61 , F -62 , f L -63 y F L -64 , la s c u a le s s e u n e n to d a s a la a g ru p a c ió n 3 d e l e p íto p o d e F L T 3 , to d a v ía m o s tra b a n u n a s e ñ a l d e u n ió n p o r e n c im a d e l u m b ra l d e s c r ito e n e l E je m p lo 18, a u n q u e e s o s a g lu t in a n te s t ie n e n un e p íto p o e n la re g ió n d e s c r ita p a ra la in te ra c c ió n d e l lig a n d o d e F L T 3 co n F L T 3.
A d e m á s , a la v is ta d e la in te ra c c ió n d e l lig a n d o d e F L T 3 c o n la re g ió n d e la a g ru p a c ió n 3 d e l e p íto p o , s e a s u m ió , q u e e l a g lu t in a n te p a ra u n a a g ru p a c ió n d e l e p íto p o m á s d is ta n te , ta l c o m o la a g ru p a c ió n 1 d e F L T 3 n o s e v e r ía im p a c ta d a p o r la c o m p e te n c ia co n e l lig a n d o d e F L T 3. S in e m b a rg o , h u b o un n ú m e ro s ig n if ic a t iv o d e a g lu t in a n te s q u e no c a lif ic a b a n p a ra e l u m b ra l d e l 75 % . L o s a g lu t in a n te s F L-1 a F L -53 , F L -55 a F L -60 y F L -65 e s ta b a n en e l g ru p o d e a g lu t in a n te s n o s e n s ib le s p a ra la c o m p e te n c ia c o n e l lig a n d o d e F L T 3.
C o m o s e d e s c r ib ió a rr ib a , v a r ia s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s p re fe r id a s d e la in v e n c ió n s e m o d if ic a n m e d ia n te fu s ió n c o n o tro re s to , ta l c o m o a lb ú m in a o v a r ia n te s d e a lb ú m in a . S i e s ta s c o n s tru c c io n e s d e fu s ió n s e c a ra c te r iz a n p o r s u s p ro p ie d a d e s , e n p a rt ic u la r , s u a f in id a d p o r la d ia n a o a c t iv id a d c ito tó x ic a , la p e rs o n a e x p e r ta s a b rá q u e se p u e d e e s p e ra r q u e c o n s tru c c io n e s d e fu s ió n s im ila re s o c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s n o m o d if ic a d o s te n g a n p ro p ie d a d e s s im ila re s (o in c lu s o m e jo re s ) . P o r e je m p lo , s i u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o fu s io n a d o c o n a lb ú m in a t ie n e u n a a c t iv id a d c ito tó x ic a a p re c ia b le o d e s e a b le o a f in id a d p o r la d ia n a , s e p u e d e e s p e ra r q u e s e o b s e rv e la m is m a / s im ila r o in c lu s o u n a m a y o r a c t iv id a d c ito tó x ic a / a f in id a d p o r la d ia n a p a ra la c o n s tru c c ió n s in a lb ú m in a .
D e a c u e rd o c o n o tra re a liz a c ió n p re fe r id a , la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o d e la in v e n c ió n c o m p re n d e (a d e m á s d e lo s d o s d o m in io s d e u n ió n ) un te rc e r d o m in io q u e c o m p re n d e d o s m o n ó m e ro s p o lip e p tíd ic o s , c a d a u n o d e lo s c u a le s c o m p re n d e u n a b is a g ra , un d o m in io C H 2 y un d o m in io C H 3 , en d o n d e d ic h o s d o s p o lip é p tid o s (o m o n ó m e ro s p o lip e p tíd ic o s ) e s tá n fu s io n a d o s e n tre s í m e d ia n te un e n la z a d o r p e p tíd ic o . P re fe r ib le m e n te , d ic h o te rc e r d o m in io c o m p re n d e e n un o rd e n N - a C - te rm in a l: b is a g ra -C H 2 -C H 3 -e n la z a d o r -b is a g ra -C H 2 -C H 3. L a s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s p re fe r id a s p a ra d ic h o te rc e r d o m in io se re p re s e n ta n e n la s S E Q ID N O s : 843 -850. C a d a u n o d e d ic h o s d o s m o n ó m e ro s p o lip e p tíd ic o s t ie n e p re fe r ib le m e n te u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e se s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 835 -842 , o q u e e s a l m e n o s un 90 % id é n tic a a e s a s s e c u e n c ia s . E n o tra re a liz a c ió n p re fe r id a , e l p r im e r y s e g u n d o d o m in io s d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o d e la in v e n c ió n s e fu s io n a n al te rc e r d o m in io m e d ia n te un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e s e s e le c c io n a , p o r e je m p lo , d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1, 2 , 3, 4 , 5, 6, 7, 8 y 9.
E n lín e a c o n la p re s e n te in v e n c ió n , u n a « b is a g ra » e s u n a re g ió n d e b is a g ra d e IgG . E s ta re g ió n se p u e d e id e n t if ic a r p o r a n a lo g ía u t i l iz a n d o la n u m e ra c ió n d e K a b a t, v é a n s e la s p o s ic io n e s 223 -243 d e K a b a t. E n lín e a c o n lo a n te r io r , el re q u is ito m ín im o p a ra u n a "b is a g ra " so n lo s re s id u o s d e a m in o á c id o s c o r re s p o n d ie n te s a l t ra m o d e s e c u e n c ia d e Ig G i d e D 231 a P 243 d e a c u e rd o c o n la n u m e ra c ió n d e K a b a t. L o s té rm in o s C H 2 y C H 3 se re f ie re n a la s re g io n e s c o n s ta n te s 2 y 3 d e la c a d e n a p e s a d a d e in m u n o g lo b u lin a . E s ta s re g io n e s ta m b ié n p u e d e n id e n t if ic a rs e p o r a n a lo g ía u t i l iz a n d o la n u m e ra c ió n d e K a b a t, v é a n s e la s p o s ic io n e s d e K a b a t 244 -360 p a ra c H 2 y la s p o s ic io n e s d e K a b a t 361 ­ 478 p a ra C H 3. S e e n t ie n d e q u e e x is te a lg u n a v a r ia c ió n e n tre la s in m u n o g lo b u lin a s en té rm in o s d e su re g ió n F c d e Ig G 1 , re g ió n F c d e Ig G 2 , re g ió n F c d e IgG3, re g ió n F c d e IgG4, re g ió n F c d e IgM , re g ió n F c d e IgA , re g ió n F c d e IgD y re g ió n F c d e Ig E (v é a s e , p. e j., P a d la n , M o le c u la r Im m u n o lo g y , 31 (3 ) , 169 -217 (1993 )) . L a e x p re s ió n m o n ó m e ro F c se re f ie re a la s d o s ú lt im a s re g io n e s c o n s ta n te s d e la c a d e n a p e s a d a d e IgA , Ig D e IgG , y a la s ú lt im a s t re s re g io n e s c o n s ta n te s d e la c a d e n a p e s a d a d e Ig E e IgM . E l m o n ó m e ro F c ta m b ié n p u e d e in c lu ir la b is a g ra N - te rm in a l f le x ib le c o n re s p e c to a e s to s d o m in io s . P a ra Ig A e Ig M , e l m o n ó m e ro F c p u e d e in c lu ir la c a d e n a J. P a ra IgG , la p o rc ió n F c c o m p re n d e lo s d o m in io s d e in m u n o g lo b u lin a C H 2 y C H 3 y la b is a g ra e n tre lo s d o s p r im e ro s d o m in io s y C H 2. A u n q u e lo s lím ite s d e la p o rc ió n F c d e u n a in m u n o g lo b u lin a p u e d e n v a r ia r , un e je m p lo d e u n a p o rc ió n F c d e c a d e n a p e s a d a d e Ig G h u m a n a q u e c o m p re n d e u n a b is a g ra fu n c io n a l, d o m in io C H 2 y C H 3 p u e d e d e fin irs e , p. e j., p a ra c o m p re n d e r lo s re s id u o s D 231 (d e l d o m in io b is a g ra ) a P 476 (d e l e x tre m o C d e l d o m in io C H 3 ), o D 231 a L 476 , re s p e c t iv a m e n te , p a ra IgG4, e n d o n d e la n u m e ra c ió n e s d e a c u e rd o co n K a b a t.
P o r lo ta n to , la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la in v e n c ió n p u e d e c o m p re n d e r e n un o rd e n N - a C - te rm in a l:
(a ) e l p r im e r d o m in io d e u n ió n ;
(b ) un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1 -9 ;
(c ) e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n ;
(d ) un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1, 2, 4 , 5, 6 , 8 y 9;
(e ) e l p r im e r m o n ó m e ro p o lip e p tíd ic o d e l te r c e r d o m in io (q u e c o m p re n d e u n a b is a g ra , un d o m in io C H 2 y un d o m in io C H 3 );
( f) un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 852 , 853 , 854 y 855 ; y
(g ) e l p r im e r m o n ó m e ro p o lip e p tíd ic o d e l te r c e r d o m in io (q u e c o m p re n d e u n a b is a g ra , un d o m in io C H 2 y un d o m in io C H 3 ).
T a m b ié n s e p re f ie re q u e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n c o m p re n d a e n un o rd e n N - a C - te rm in a l:
• e l p r im e r d o m in io d e u n ió n q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en S E Q ID N O : 159 , S E Q ID N O : 169 , S E Q ID N O : 179 , S E Q ID N O : 189 , S E Q ID N O : 199 , S E Q ID N O : 209 , S E Q ID N O : 219 y S E Q ID N O : 229 , S E Q ID N O : 239 , S E Q ID N O : 249 y S E Q ID N O : 259 , S E Q ID N O : 269 , S E Q ID N O : 279 y S E Q ID N O : 289 , S E Q ID N O : 299 , S E Q ID N O : 309 , S E Q ID N O : 319 y S E Q ID N O : 329 , S E Q ID N O : 339 , S E Q ID N O : 349 y S E Q ID N O : 359 , S E Q ID N O : 369 , S E Q ID N O : 379 y S E Q ID N O : 389 , S E Q ID N O : 399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 y S E Q ID N O : 459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O : 519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 y S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 y S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1 -9 ;
• e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O : 19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 (v é a n s e ta m b ié n S E Q ID N O s : 23 , 25 , 41 ,43 , 59 , 61 , 77 , 79 , 95 , 97 , 113 , 115 , 131 , 133 , 149 , 151 , 167 , 169 , 185 o 187 d e l d o c u m e n to W O 2008 /119567 ) ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1, 2, 4 , 5, 6 , 8 y 9; y
• e l te rc e r d o m in io d e u n ió n q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en S E Q ID N O s : 843 -850.
P o r lo ta n to , e n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a , la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la p re s e n te in v e n c ió n c o m p re n d e o c o n s is te e n un p o lip é p tid o re p re s e n ta d o en S E Q ID N O s : 856 a 871.
E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n , la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o c o m p re n d e o c o n s is te e n un p o lip é p tid o c o m o s e re p re s e n ta e n S E Q ID N O : 856 , 858 , 860 , 862 , 864 , 866 , 868 y 870.
E n u n a re a liz a c ió n a lte rn a t iv a m e n te p re fe r id a d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n , la c o n s tru c c ió n de a n t ic u e rp o c o m p re n d e o c o n s is te e n un p o lip é p tid o c o m o s e re p re s e n ta e n S E Q ID N O : 857 , 859 , 861 , 863 , 865 , 867 , 869 y 871.
E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a d e la in v e n c ió n , la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o c o m p re n d e o c o n s is te e n un p o lip é p tid o c o m o s e re p re s e n ta e n S E Q ID N O : 858 , 859 , 862 , 863 , 864 y 865.
M o d if ic a c io n e s c o v a le n te s d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s ta m b ié n s e in c lu y e n d e n tro d e l a lc a n c e d e e s ta in v e n c ió n y, en g e n e ra l, p e ro n o s ie m p re , s e re a liz a n d e fo rm a p o s tra d u c c io n a l. P o r e je m p lo , v a r io s t ip o s d e m o d if ic a c io n e s c o v a le n te s d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o se in tro d u c e n en la m o lé c u la h a c ie n d o re a c c io n a r re s id u o s d e a m in o á c id o s e s p e c íf ic o s d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o c o n un a g e n te d e r iv a t iz a n te o rg á n ic o q u e e s c a p a z d e re a c c io n a r c o n c a d e n a s la te ra le s s e le c c io n a d a s o lo s re s id u o s N - o C - te rm in a le s .
L o s re s id u o s d e c is te in ilo s e h a c e n re a c c io n a r m á s c o m ú n m e n te co n a -h a lo a c e ta to s (y a m in a s c o r re s p o n d ie n te s ) , ta le s c o m o á c id o c lo ro a c é t ic o o c lo ro a c e ta m id a , p a ra d a r d e r iv a d o s d e c a rb o x im e t ilo o c a rb o x ia m id o m e tilo . R e s id u o s d e c is te in ilo ta m b ié n s e d e r iv a t iz a n p o r re a c c ió n co n b ro m o tr if lu o ro a c e to n a , á c id o a -b ro m o -p -(5 - im id o z o il)p ro p ió n ic o , fo s fa to d e c lo ro a c e t ilo , N -a lq u ilm a le im id a s , d is u lfu ro d e 3 -n it ro -2 -p ir id i lo , 2 -p ir id il d is u lfu ro d e m e tilo , p -c lo ro m e rc u r ib e n z o a to , 2 -c lo ro m e rc u r i-4 -n it ro fe n o l o c lo ro -7 -n itro b e n z o -2 -o x a -1 ,3 -d ia z o l.
R e s id u o s d e h is t id ilo s e d e r iv a t iz a n p o r re a c c ió n c o n p iro c a rb o n a to d e d ie t i lo a pH 5 ,5 -7 ,0 , y a q u e e s te a g e n te es re la t iv a m e n te e s p e c íf ic o p a ra la c a d e n a la te ra l d e h is t id ilo . T a m b ié n e s ú til b ro m u ro d e p a ra b ro m o fe n a c ilo ; la re a c c ió n s e re a liz a p re fe r ib le m e n te en c a c o d ila to d e s o d io 0,1 M a p H 6 ,0. R e s id u o s d e lis in ilo y a m in o te rm in a le s s e h a c e n re a c c io n a r c o n a n h íd r id o s s u c c ín ic o s u o tro s a n h íd r id o s d e á c id o c a rb o x í lic o . L a d e r iv a t iz a c ió n c o n e s to s a g e n te s t ie n e e l e fe c to d e in v e r t ir la c a rg a d e lo s re s id u o s d e lis in ilo . O tro s re a c tiv o s a d e c u a d o s p a ra d e r iv a t iz a r re s id u o s q u e c o n t ie n e n a lfa -a m in o in c lu y e n im id o é s te re s , ta le s c o m o p ic o lin im id a to d e m e tilo ; fo s fa to d e p ir id o x a l; p ir id o x a l; c lo ro b o ro h id ru ro ; á c id o tr in i t ro b e n c e n o s u lfó n ic o ; O -m e t il is o u re a ; 2 ,4 -p e n ta n o d io n a ; y re a c c ió n c a ta liz a d a p o r t r a n s a m in a s a s c o n g lio x ila to .
R e s id u o s d e a rg in ilo s e m o d if ic a n p o r re a c c ió n c o n u n o o v a r io s re a c t iv o s c o n v e n c io n a le s , e n tre e llo s fe n ilg lio x a l, 2 ,3 -b u ta n o d io n a , 1 ,2 -c ic lo h e x a n o d io n a y n in h id r in a . L a d e r iv a t iz a c ió n d e re s id u o s d e a rg in in a re q u ie re q u e la re a c c ió n se re a lic e en c o n d ic io n e s a lc a lin a s d e b id o a l a lto p K a d e l g ru p o fu n c io n a l g u a n id in a . A d e m á s , e s to s re a c t iv o s p u e d e n re a c c io n a r c o n lo s g ru p o s d e lis in a , a s í c o m o c o n e l g ru p o é p s ilo n -a m in o d e la a rg in in a .
L a m o d if ic a c ió n e s p e c íf ic a d e re s id u o s d e t iro s i lo se p u e d e re a liz a r , co n p a r t ic u la r in te ré s , e n la in tro d u c c ió n d e m a rc a d o re s e s p e c tra le s e n re s id u o s d e t iro s i lo m e d ia n te re a c c ió n co n c o m p u e s to s a ro m á tic o s d e d ia z o n io o te t ra n it ro m e ta n o . M á s c o m ú n m e n te , s e u t iliz a n N -a c e t il im id iz o l y te tra n it ro m e ta n o p a ra fo rm a r e s p e c ie s d e O -a c e til t ir o s i lo y d e r iv a d o s 3 -n itro , re s p e c t iv a m e n te . R e s id u o s d e t iro s i lo se y o d a n u t il iz a n d o 125I o 131I p a ra p re p a ra r p ro te ín a s m a rc a d a s p a ra u s o en ra d io in m u n o e n s a y o , s ie n d o a d e c u a d o el m é to d o d e c lo ra m in a T a rr ib a d e s c r ito .
L o s g ru p o s la te ra le s c a rb o x ilo (a s p a r t i lo o g lu ta m ilo ) s e m o d if ic a n s e le c t iv a m e n te p o r re a c c ió n co n c a rb o d iim id a s (R '-N = C = N - R '), e n q u e R y R ' s o n g ru p o s a lq u ilo o p c io n a lm e n te d ife re n te s , ta le s c o m o 1 -c ic lo h e x i l-3 -(2 -m o r fo l in i l- 4 -e t i l) c a rb o d iim id a o 1 -e t i l- 3 -(4 -a z o n ia -4 ,4 -d im e ti lp e n t i l) c a rb o d iim id a . A d e m á s , lo s re s id u o s d e a s p a r t i lo y g lu ta m ilo se c o n v ie r te n e n re s id u o s d e a s p a ra g in ilo y g lu ta m in ilo p o r re a c c ió n c o n io n e s a m o n io .
L a d e r iv a t iz a c ió n co n a g e n te s b ifu n c io n a le s e s ú til p a ra re t ic u la r la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s d e la p re s e n te in v e n c ió n c o n u n a m a tr iz o s u p e r f ic ie d e s o p o r te in s o lu b le en a g u a p a ra u s o en u n a d iv e rs id a d d e m é to d o s . A g e n te s d e re t ic u la c ió n c o m ú n m e n te u t il iz a d o s in c lu y e n , p. e j., 1 ,1 -b is (d ia z o a c e t il) -2 - fe n ile ta n o , g lu ta ra ld e h íd o , é s te re s d e N -h id ro x is u c c in im id a , p o r e je m p lo , é s te re s c o n á c id o 4 -a z id o s a lic í l ic o , im id o é s te re s h o m o b ifu n c io n a le s , in c lu y e n d o é s te re s d e d is u c c in im id i lo ta le s c o m o 3 ,3 '-d it io b is (p ro p io n a to d e s u c c in im id ilo ) y m a le im id a s b ifu n c io n a le s , ta le s c o m o b is -N -m a le im id o -1 ,8 -o c ta n o . A g e n te s d e r iv a t iz a n te s ta le s c o m o 3 -[(p -a z id o fe n il)d i t io ]p ro p io im id a to d e m e tilo p ro d u c e n c o m p u e s to s in te rm e d io s fo to a c t iv a b le s q u e s o n c a p a c e s d e fo rm a r re t ic u la c io n e s e n p re s e n c ia d e luz. A lte rn a tiv a m e n te , la s m a tr ic e s re a c t iv a s in s o lu b le s e n a g u a , ta le s c o m o h id ra to s d e c a rb o n o a c t iv a d o s co n b ro m u ro d e c ia n ó g e n o y lo s s u s tra to s re a c t iv o s c o m o s e d e s c r ib e e n la s P a t. d e E E .U U . N °s 3.969.287 ; 3.691.016 ; 4.195.128 ; 4.247.642 ; 4.229.537 ; y 4.330.440 s e e m p le a n p a ra la in m o v iliz a c ió n d e p ro te ín a s .
R e s id u o s d e g lu ta m in ilo y a s p a ra g in ilo se d e s a m id a n c o n fre c u e n c ia a lo s c o r re s p o n d ie n te s re s id u o s d e g lu ta m ilo y a s p a rt ilo , re s p e c t iv a m e n te . A lte rn a tiv a m e n te , e s to s re s id u o s s e d e s a m id a n e n c o n d ic io n e s lig e ra m e n te á c id a s .
O tra s m o d if ic a c io n e s in c lu y e n la h id ro x ila c ió n d e p ro lin a y lis in a , la fo s fo r ila c ió n d e g ru p o s h id ro x ilo d e re s id u o s s e r ilo o t re o n ilo , la m u t ila c ió n d e lo s g ru p o s a -a m in o d e la s c a d e n a s la te ra le s d e lis in a , a rg in in a e h is t id in a (T .E . C re ig h to n , P ro te in s : S tru c tu re a n d M o le c u la r P ro p e rt ie s , W . H. F re e m a n & C o ., S a n F ra n c is c o , 1983 , pp . 79 -86 ) , la a c e t ila c ió n d e la a m in a N - te rm in a l y la a m id a c ió n d e c u a lq u ie r g ru p o c a rb o x ilo C - te rm in a l.
O tro t ip o d e m o d if ic a c ió n c o v a le n te d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s in c lu id a s d e n tro d e l a lc a n c e d e e s ta in v e n c ió n c o m p re n d e a lte ra r e l p a tró n d e g lic o s ila c ió n d e la p ro te ín a . C o m o s e c o n o c e e n la té c n ic a , lo s p a tro n e s d e g lic o s ila c ió n p u e d e n d e p e n d e r ta n to d e la s e c u e n c ia d e la p ro te ín a (p. e j., la p re s e n c ia o a u s e n c ia d e re s id u o s d e a m in o á c id o s d e g lic o s ila c ió n p a rt ic u la re s , c o m e n ta d o s m á s a d e la n te ) c o m o d e la c é lu la u o rg a n is m o h u é s p e d e n e l q u e s e p ro d u c e la p ro te ín a . S is te m a s d e e x p re s ió n p a r t ic u la re s s e c o m e n ta n m á s a d e la n te .
L a g lic o s ila c ió n d e p o lip é p tid o s e s tá t íp ic a m e n te e n la z a d a a N o a O . E n la z a d a a N s e re f ie re a la f i ja c ió n d e l re s to h id ra to d e c a rb o n o a la c a d e n a la te ra l d e un re s id u o d e a s p a ra g in a . L a s s e c u e n c ia s d e tr ip é p t id o s a s p a ra g in a -X -s e r in a y a s p a ra g in a -X - t re o n in a , e n q u e X e s c u a lq u ie r a m in o á c id o e x c e p to p ro lin a , s o n la s s e c u e n c ia s d e re c o n o c im ie n to p a ra la f i ja c ió n e n z im á t ic a d e l re s to d e h id ra to d e c a rb o n o a la c a d e n a la te ra l d e a s p a ra g in a . P o r lo ta n to , la p re s e n c ia d e c u a lq u ie ra d e e s ta s s e c u e n c ia s d e tr ip é p t id o s e n un p o lip é p tid o c re a un s it io d e g l ic o s ila c ió n p o te n c ia l. La g lic o s ila c ió n e n la z a d a a O s e re f ie re a la f i ja c ió n d e u n o d e lo s a z ú c a re s N -a c e t ilg a la c to s a m in a , g a la c to s a o x ilo s a , a un h id ro x ia m in o á c id o , lo m á s c o m ú n m e n te s e r in a o tre o n in a , a u n q u e ta m b ié n s e p u e d e u t i l iz a r 5 -h id ro x ip ro lin a o 5 -h id ro x il is in a .
L a a d ic ió n d e s it io s d e g lic o s ila c ió n a la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s e lo g ra c o n v e n ie n te m e n te a lte ra n d o la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e m a n e ra q u e c o n te n g a u n a o m á s d e la s s e c u e n c ia s d e t r ip é p t id o s a rr ib a d e s c r ita s (p a ra lo s s it io s d e g lic o s ila c ió n e n la z a d o s a N). L a a lte ra c ió n ta m b ié n p u e d e re a liz a rs e m e d ia n te la a d ic ió n o s u s t itu c ió n d e u n o o m á s re s id u o s d e s e r in a o t re o n in a a la s e c u e n c ia d e p a rt id a (p a ra lo s s it io s d e g l ic o s ila c ió n e n la z a d o s a O ). P a ra m a y o r fa c il id a d , la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s e a lte ra p re fe r ib le m e n te m e d ia n te c a m b io s a l n iv e l d e A D N , p a r t ic u la rm e n te m u ta n d o e l A D N q u e c o d if ic a e l p o lip é p tid o e n b a s e s p re s e le c c io n a d a s d e m o d o q u e s e g e n e re n c o d o n e s q u e s e t ra d u c irá n e n lo s a m in o á c id o s d e s e a d o s .
O tro m e d io d e a u m e n ta r e l n ú m e ro d e re s to s d e h id ra to s d e c a rb o n o e n la c o n s tru c c ió n d e l a n t ic u e rp o e s m e d ia n te el a c o p la m ie n to q u ím ic o o e n z im á t ic o d e g lic ó s id o s a la p ro te ín a . E s to s p ro c e d im ie n to s so n v e n ta jo s o s p o rq u e no re q u ie re n la p ro d u c c ió n d e la p ro te ín a e n u n a c é lu la h u é s p e d q u e t ie n e c a p a c id a d e s d e g lic o s ila c ió n p a ra la g lic o s ila c ió n e n la z a d a a N y O . D e p e n d ie n d o d e l m o d o d e a c o p la m ie n to u t iliz a d o , e l o lo s a z ú c a re s p u e d e n u n irs e a (a ) a rg in in a e h is t id in a , (b ) g ru p o s c a rb o x ilo lib re s , (c ) g ru p o s s u lfh id r ilo l ib re s ta le s c o m o lo s d e c is te ín a , (d ) g ru p o s h id ro x ilo lib re s ta le s c o m o lo s d e s e r in a , t re o n in a o h id ro x ip ro lin a , (e ) re s id u o s a ro m á tic o s ta le s c o m o lo s d e fe n ila la n in a , t ir o s in a o t r ip tó fa n o , o ( f) e l g ru p o a m id a d e g lu ta m in a . E s to s m é to d o s s e d e s c r ib e n e n e l d o c u m e n to W O 87 /05330 , y e n A p lin y W r is to n , 1 9 8 1 , C R C C rit. R e v . B io c h e m ., pp . 259 -306.
L a e l im in a c ió n d e re s to s d e h id ra to s d e c a rb o n o p re s e n te s e n la c o n s tru c c ió n d e l a n t ic u e rp o d e p a rt id a s e p u e d e re a liz a r d e fo rm a q u ím ic a o e n z im á t ic a . L a d e s g lic o s ila c ió n q u ím ic a re q u ie re la e x p o s ic ió n d e la p ro te ín a a l c o m p u e s to á c id o tr i f lu o ro m e ta n o s u lfó n ic o o un c o m p u e s to e q u iv a le n te . E s te t ra ta m ie n to d a c o m o re s u lta d o la e s c is ió n d e la m a y o r ía o d e to d o s lo s a z ú c a re s e x c e p to e l a z ú c a r d e e n la c e (N -a c e t i lg lu c o s a m in a o N -a c e t ilg a la c to s a m in a ) , m ie n tra s q u e d e ja in ta c to e l p o lip é p tid o . L a d e s g lic o s ila c ió n q u ím ic a e s tá d e s c r ita p o r H a k im u d d in e t a l., 1987 , A rc h . B io c h e m . B io p h y s . 259 :52 y p o r E d g e e t a l., 1981 , A n a l. B io c h e m . 118 :131. L a e s c is ió n e n z im á t ic a d e re s to s d e h id ra to s d e c a rb o n o e n p o lip é p tid o s se p u e d e lo g ra r m e d ia n te e l u s o d e u n a d iv e rs id a d d e e n d o - y e x o -g lic o s id a s a s ta l c o m o se d e s c r ib e p o r T h o ta k u ra e t a l., 1987 , M e th . E n z y m o l. 138 : 350. L a g l ic o s ila c ió n e n s it io s p o te n c ia le s d e g lic o s ila c ió n se p u e d e p re v e n ir m e d ia n te e l u so d e l c o m p u e s to tu n ic a m ic in a c o m o s e d e s c r ib e p o r D u s k in e t a l., 1982 , J. B io l. C h e m .
257 :3105. L a tu n ic a m ic in a b lo q u e a la fo rm a c ió n d e e n la c e s p ro te ín a -N -g lic ó s id o .
T a m b ié n se c o n te m p la n e n e s ta m e m o r ia o tra s m o d if ic a c io n e s d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o . P o r e je m p lo , o tro t ip o d e m o d if ic a c ió n c o v a le n te d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o c o m p re n d e e n la z a r la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o a d iv e rs o s p o lím e ro s no p ro te ic o s , q u e in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a d iv e rs o s p o lio le s , ta le s c o m o p o lie t i le n g lic o l, p o lip ro p ile n g lic o l, p o lio x ia lq u ile n o s o c o p o lím e ro s d e p o lie t i le n g lic o l y p o lip ro p ile n g lic o l, d e la m a n e ra re c o g id a e n las P a te n te s d e E E .U U . N °s 4.640.835 ; 4.496.689 ; 4.301.144 ; 4.670.417 ; 4.791.192 o 4.179.337. A d e m á s , c o m o se c o n o c e e n la té c n ic a , s e p u e d e n re a liz a r s u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s e n d iv e rs a s p o s ic io n e s d e n tro d e la c o n s tru c c ió n d e l a n t ic u e rp o , p. e j., c o n e l fin d e fa c i l i ta r la a d ic ió n d e p o lím e ro s ta le s c o m o P E G .
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la m o d if ic a c ió n c o v a le n te d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s d e la in v e n c ió n c o m p re n d e la a d ic ió n d e u n o o m á s m a rc a d o re s . E l g ru p o d e m a rc a je s e p u e d e a c o p la r a la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o v ía b ra z o s e s p a c ia d o re s d e d iv e rs a s lo n g itu d e s p a ra re d u c ir e l im p e d im e n to e s té r ic o p o te n c ia l. S e c o n o c e n e n la té c n ic a d iv e rs o s m é to d o s p a ra m a rc a r p ro te ín a s y s e p u e d e n u t iliz a r . E l té rm in o "m a rc a d o r " o la e x p re s ió n "g ru p o d e m a rc a je " s e re f ie re a c u a lq u ie r m a rc a d o r d e te c ta b le . E n g e n e ra l, lo s m a rc a d o re s s e c la s if ic a n e n u n a d iv e rs id a d d e c la s e s , d e p e n d ie n d o d e l e n s a y o e n e l q u e s e h a n d e d e te c ta r - lo s s ig u ie n te s e je m p lo s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a:
a ) m a rc a d o re s is o tó p ic o s , q u e p u e d e n s e r is ó to p o s ra d ia c t iv o s o p e s a d o s , ta le s c o m o ra d io is ó to p o s o ra d io n u c le id o s (p. ej., 3H, 14C, 15N, 35S, 89Z r, 90Y, 99T c , 111In, 125I, 131I)
b ) m a rc a d o re s m a g n é t ic o s (p. ej., p a r t íc u la s m a g n é t ic a s )
c ) re s to s a c t iv o s re d o x
d ) c o lo ra n te s ó p t ic o s ( in c lu y e n d o , p e ro no lim ita d o s a c ro m ó fo ro s , fó s fo ro s y f lu o ró fo ro s ) , ta le s c o m o g ru p o s f lu o re s c e n te s (p. ej., F IT C , ro d a m in a , fó s fo ro s d e la n tá n id o s ) , g ru p o s q u im io lu m in is c e n te s y f lu o ró fo ro s q u e p u e d e n s e r d e " m o lé c u la p e q u e ñ a " f lu o re s c e n te s o p ro te ic o s f lu o re s c e n te s
e ) g ru p o s e n z im á t ic o s (p. ej., p e ro x id a s a d e rá b a n o p ic a n te , p -g a la c to s id a s a , lu c ife ra s a , fo s fa ta s a a lc a lin a )
f) g ru p o s b io t in i la d o s
g ) e p íto p o s d e p o lip é p tid o s p re d e te rm in a d o s re c o n o c id o s p o r un in fo rm a d o r s e c u n d a r io (p. ej., s e c u e n c ia s d e p a re s d e c re m a lle ra d e le u c in a , s it io s d e u n ió n p a ra a n t ic u e rp o s s e c u n d a r io s , d o m in io s d e u n ió n a m e ta le s , e t iq u e ta s d e e p íto p o , e tc .)
P o r “ m a rc a d o r f lu o re s c e n te ” se e n t ie n d e c u a lq u ie r m o lé c u la q u e p u e d a d e te c ta rs e vía s u s p ro p ie d a d e s f lu o re s c e n te s in h e re n te s . M a rc a d o re s f lu o re s c e n te s a d e c u a d o s in c lu y e n , p e ro n o se lim ita n a f lu o re s c e ín a , ro d a m in a , te t ra m e t ilro d a m in a , e o s in a , e r itro s in a , c u m a r in a , m e t ilc u m a r in a s , p ire n o , v e rd e m a la q u ita , e s t i lb e n o , A m a r i l lo L u c ife r, A z u l C a s c a d a J , R o jo T e x a s , IA E D A N S , E D A N S , B O D IP Y F L, L C R o jo 640 , C y 5, C y 5.5 , L C R o jo 705 , O re g o n v e rd e , lo s c o lo ra n te s A le x a -F lu o r (A le x a F lu o r 350 , A le x a F lu o r 430 , A le x a F lu o r 488 , A le x a F lu o r 546 , A le x a F lu o r 568 , A le x a F lu o r 594 , A le x a F lu o r 633 ,
A le x a F lu o r 660 , A le x a F lu o r 680 ), A z u l C a s c a d a , A m a r i l lo C a s c a d a y R - f ic o e r it r in a (P E ) (M o le c u la r P ro b e s , E u g e n e , O R ), F IT C , R o d a m in a , y R o jo T e x a s (P ie rc e , R o c k fo rd , IL), C y5 , C y 5.5 , C y 7 (A m e rs h a m L ife S c ie n c e , P it ts b u rg h , P A ). C o lo ra n te s ó p t ic o s a d e c u a d o s , in c lu y e n d o lo s f lu o ró fo ro s , s e d e s c r ib e n en M o le c u la r P ro b e s H a n d b o o k d e R ic h a rd P. H a u g la n d .
M a rc a d o re s f lu o re s c e n te s p ro te ic o s a d e c u a d o s ta m b ié n in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a p ro te ín a v e rd e f lu o re s c e n te , q u e in c lu y e u n a e s p e c ie R e n illa , P t i lo s a rc u s o A e q u o re a d e G F P (C h a lf ie e t a l., 1994 , S c ie n c e 263 :802 -805 ) , E G F P (C lo n te c h L a b o ra to r ie s , Inc ., N ú m e ro d e A c c e s o a G e n b a n k U 55762 ) , p ro te ín a f lu o re s c e n te a z u l (B F P , Q u a n tu m B io te c h n o lo g ie s , Inc. 1801 d e M a is o n n e u v e B lvd . W e s t, 8 a P la n ta , M o n tre a l, Q u e b e c , C a n a d á H 3 H 1 J9 ; S ta u b e r, 1998 , B io te c h n iq u e s 24 :462 -471 ; H e im e t a l., 1996 , C u rr. B io l. 6 :178 -182 ) , p ro te ín a f lu o re s c e n te a m a r il la m e jo ra d a (E Y F P , C lo n te c h L a b o ra to r ie s , In c .), lu c ife ra s a ( Ic h ik i e t a l., 1993 , J. Im m u n o l. 150 :5408 -5417 ) , p g a la c to s id a s a (N o la n e t a l., 1988 , P ro c . N a tl. A c a d . S c i. E s ta d o s U n id o s d e A m é r ic a 85 :2603 -2607 ) y R e n illa (d o c u m e n to s W O 92 /15673 , W O 95 /07463 , W O 98 /14605 , W O 98 /26277 , W O 99 /49019 , P a te n te s d e E E .U U . N °s 5.292.658 ; 5.418.155 ; 5.683.888 ; 5.741.668 ; 5.777.079 ; 5.804.387 ; 5.874.304 ; 5.876.995 ; 5.925.558 ).
L o s d o m in io s d e c re m a lle ra d e le u c in a s o n p é p tid o s q u e fo m e n ta n la o lig o m e r iz a c ió n d e la s p ro te ín a s e n la s q u e se e n c u e n tra n . L a s c re m a lle ra s d e le u c in a se id e n t if ic a ro n o r ig in a lm e n te e n v a r ia s p ro te ín a s d e u n ió n a l A D N (L a n d s c h u lz e t a l., 1988 , S c ie n c e 240 :1759 ) , y d e s d e e n to n c e s s e h a n e n c o n tra d o e n u n a d iv e rs id a d d e p ro te ín a s d ife re n te s . E n tre la s c re m a lle ra s d e le u c in a c o n o c id a s s e e n c u e n tra n p é p tid o s q u e s e p ro d u c e n d e fo rm a n a tu ra l y d e r iv a d o s d e los m is m o s q u e d im e r iz a n o t r im e r iz a n . E n la s o lic itu d P C T w O 94 /10308 s e d e s c r ib e n e je m p lo s d e d o m in io s d e c re m a lle ra d e le u c in a a d e c u a d o s p a ra p ro d u c ir p ro te ín a s o lig o m é r ic a s s o lu b le s , y la c re m a lle ra d e le u c in a d e r iv a d a d e la p ro te ín a te n s io a c t iv a p u lm o n a r D (S P D ) d e s c r ita e n H o p p e e t a l., 1994 , F E B S L e tte rs 344 :191. E l u s o d e u n a c re m a lle ra d e le u c in a m o d if ic a d a q u e p e rm ite la t r im e r iz a c ió n e s ta b le d e u n a p ro te ín a h e te ró lo g a c o n d e n s a d a a la m is m a s e d e s c r ib e e n F a n s lo w e t a l., 1994 , S e m in . Im m u n o l. 6 :267 -78. E n un e n fo q u e , la s p ro te ín a s d e fu s ió n re c o m b in a n te s q u e c o m p re n d e n un f ra g m e n to d e a n t ic u e rp o F L T 3 o d e r iv a d o c o n d e n s a d o a un p é p tid o d e c re m a lle ra d e le u c in a s e e x p re s a n e n c é lu la s h u é s p e d a d e c u a d a s , y lo s f ra g m e n to s d e a n t ic u e rp o F L T 3 o lig o m é r ic o s s o lu b le s o d e r iv a d o s q u e se fo rm a n s e re c u p e ra n d e l s o b re n a d a n te d e l c u lt iv o .
L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n ta m b ié n p u e d e c o m p re n d e r d o m in io s a d ic io n a le s , q u e s o n , p. e j., ú tile s e n e l a is la m ie n to d e la m o lé c u la o s e re la c io n a n co n un p e rf il fa rm a c o c in é t ic o a d a p ta d o d e la m o lé c u la . D o m in io s d e a y u d a p a ra e l a is la m ie n to d e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o p u e d e n s e le c c io n a rs e d e m o t iv o s p e p tíd ic o s o re s to s in tro d u c id o s d e fo rm a s e c u n d a r ia , q u e p u e d e n c a p tu ra rs e e n un m é to d o d e a is la m ie n to , p. e j., u n a c o lu m n a de a is la m ie n to . R e a liz a c io n e s no lim ita n te s d e d o m in io s a d ic io n a le s d e e s te t ip o c o m p re n d e n m o t iv o s p e p tíd ic o s c o n o c id o s c o m o e t iq u e ta M yc , e t iq u e ta H A T , e t iq u e ta H A , e t iq u e ta T A P , e t iq u e ta G S T , d o m in io d e u n ió n a q u it in a (e t iq u e ta C B D ), p ro te ín a d e u n ió n a m a lto s a (e t iq u e ta M B P ), e t iq u e ta F la g , e t iq u e ta S tre p y v a r ia n te s d e la s m is m a s (p . e j., e t iq u e ta S tre p ll) y e t iq u e ta H is . S e p re f ie re q u e to d a s la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s d e s c r ita s e n e s ta m e m o r ia c a ra c te r iz a d a s p o r la s C D R s id e n t if ic a d a s c o m p re n d a n un d o m in io d e e t iq u e ta H is , q u e g e n e ra lm e n te se c o n o c e c o m o u n a re p e t ic ió n d e re s id u o s d e H is c o n s e c u t iv o s e n la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e u n a m o lé c u la , p re fe r ib le m e n te d e c in c o y m á s p re fe r ib le m e n te d e s e is re s id u o s H is (h e x a -h is t id in a ) . L a e t iq u e ta H is p u e d e u b ic a rs e , p. e j., en e l e x tre m o N o C d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o , p re fe r ib le m e n te e s tá u b ic a d a e n e l e x tre m o C . L o m á s p re fe r ib le m e n te , u n a e t iq u e ta d e h e x a -h is t id in a (H H H H H H ) (S E Q ID N O : 10 ) s e e n la z a m e d ia n te un e n la c e p e p tíd ic o a l e x tre m o C d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o co n la in v e n c ió n .
E l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la p re s e n te in v e n c ió n s e u n e a F L T 3 h u m a n o e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la d ia n a . S e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s p re fe r id a s d e F L T 3 h u m a n a e s tá n re p re s e n ta d a s p o r S E Q ID N O s : 801 , 803 , 804 y 805. S e e n t ie n d e q u e la e x p re s ió n “ e n la s u p e r f ic ie ” , e n e l c o n te x to d e la p re s e n te in v e n c ió n , s ig n if ic a q u e e l d o m in io d e u n ió n s e u n e e s p e c íf ic a m e n te a un e p íto p o c o m p re n d id o d e n tro d e l d o m in io e x t ra c e lu la r d e F L T 3 (E C D F L T 3 , v é a s e S E Q ID N O : 813 ), e s p e c íf ic a m e n te c o m p re n d id a d e n tro d e la re g ió n c o m o s e m u e s tra en S E Q ID N O : 819. P o r lo ta n to , e l p r im e r d o m in io d e u n ió n d e a c u e rd o co n la in v e n c ió n s e u n e p re fe r ib le m e n te a F L T 3 c u a n d o s e e x p re s a m e d ia n te c é lu la s o lín e a s c e lu la re s q u e se e x p re s a n d e fo rm a n a tu ra l, y /o m e d ia n te c é lu la s o lín e a s c e lu la re s t ra n s fo rm a d a s o t r a n s fe c ta d a s (e s ta b le m e n te / t ra n s ito r ia m e n te ) co n F L T 3. E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a , el p r im e r d o m in io d e u n ió n ta m b ié n se u n e a F L T 3 c u a n d o F L T 3 s e u t iliz a c o m o u n a m o lé c u la « d ia n a » o « lig a n d o » en un e n s a y o d e u n ió n in v itro ta l c o m o B IA c o re o S c a tc h a rd . L a " c é lu la d ia n a " p u e d e s e r c u a lq u ie r c é lu la p ro c a r io ta o e u c a r io ta q u e e x p re s e F L T 3 e n su s u p e rf ic ie ; p re fe r ib le m e n te , la c é lu la d ia n a e s u n a c é lu la q u e fo rm a p a rte d e l c u e rp o h u m a n o o a n im a l, ta l c o m o u n a c é lu la d e c á n c e r d e o v a r io , c é lu la d e c á n c e r p a n c re á t ic o , c é lu la d e m e s o te lio m a , c é lu la d e c á n c e r d e p u lm ó n , c é lu la d e c á n c e r g á s tr ic o y c é lu la d e c á n c e r d e m a m a tr ip le n e g a tiv o .
L a e x p re s ió n "E C D F L T 3 " s e re f ie re a u n a fo rm a d e D L L 3 q u e e s tá e s e n c ia lm e n te lib re d e d o m in io s t ra n s m e m b ra n a y c ito p la s m á t ic o d e F L T 3. E l e x p e r to e n la m a te r ia e n te n d e rá q u e e l d o m in io t ra n s m e m b ra n a id e n t if ic a d o p a ra el p o lip é p tid o F L T 3 d e la p re s e n te in v e n c ió n s e id e n t if ic a d e a c u e rd o c o n lo s c r ite r io s e m p le a d o s ru t in a r ia m e n te e n la té c n ic a p a ra id e n t if ic a r e s e t ip o d e d o m in io h id ró fo b o . L o s lím ite s e x a c to s d e un d o m in io t ra n s m e m b ra n a p u e d e n v a r ia r , p e ro lo m á s p ro b a b le e n n o m á s d e a p ro x im a d a m e n te 5 a m in o á c id o s e n c u a lq u ie r e x tre m o d e l d o m in io e s p e c íf ic a m e n te m e n c io n a d o e n e s ta m e m o r ia . U n E C D F L T 3 h u m a n o p re fe r id o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 813.
L a a f in id a d d e l p r im e r d o m in io d e u n ió n p a ra F L T 3 h u m a n a e s p re fe r ib le m e n te < 20 nM , m á s p re fe r ib le m e n te < 10 nM , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 5 nM , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 2 nM , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 1 nM , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 0 ,6 nM , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 0 ,5 nM , y lo m á s p re fe r ib le m e n te < 0 ,4 nM . L a a f in id a d s e p u e d e m e d ir , p o r e je m p lo , en un e n s a y o B IA c o re o e n un e n s a y o S c a tc h a rd , p. ej., c o m o se d e s c r ib e e n los E je m p lo s . L a p e rs o n a e x p e r ta ta m b ié n c o n o c e b ie n o tro s m é to d o s p a ra d e te rm in a r la a fin id a d .
T a m b ié n s e c o n te m p la n m o d if ic a c io n e s e n la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s d e s c r ita s e n e s ta m e m o r ia . P o r e je m p lo , p u e d e s e r d e s e a b le m e jo ra r la a f in id a d d e u n ió n y /u o tra s p ro p ie d a d e s b io ló g ic a s d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o . V a r ia n te s d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s s e p re p a ra n in t ro d u c ie n d o c a m b io s d e n u c le ó tid o s a p ro p ia d o s e n e l á c id o n u c le ic o d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s o m e d ia n te s ín te s is d e p é p tid o s . T o d a s la s m o d if ic a c io n e s d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e s c r ita s m á s a d e la n te d e b e r ía n d a r c o m o re s u lta d o u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o q u e a ú n c o n s e rv e la a c t iv id a d b io ló g ic a d e s e a d a (u n ió n a F L T 3 y a C D 3 ) d e la m o lé c u la p a re n ta l n o m o d if ic a d a .
E l té rm in o " a m in o á c id o " o la e x p re s ió n " re s id u o d e a m in o á c id o " se re f ie re t íp ic a m e n te a un a m in o á c id o q u e t ie n e su d e f in ic ió n re c o n o c id a e n la té c n ic a , ta l c o m o un a m in o á c id o s e le c c io n a d o d e l g ru p o q u e c o n s is te en : a la n in a (A la o A ); a rg in in a (A rg o R ); a s p a ra g in a (A s n o N ); á c id o a s p á r t ic o (A s p o D); c is te ín a (C y s o C ); g lu ta m in a (G ln o Q ); á c id o g lu tá m ic o (G lu o E); g lic in a (G ly o G ); h is t id in a (H is o H ); is o le u c in a (H e o I): le u c in a (L e u o L); lis in a (L y s o K); m e t io n in a (M e t o M ); fe n ila la n in a (P h e o F ); p ro lin a (P ro o P); s e r in a (S e r o S ); t re o n in a (T h r o T ); t r ip tó fa n o (T rp o W ); t ir o s in a (T y r o Y ); y v a lin a (V a l o V ), a u n q u e se p u e d e n u t il iz a r a m in o á c id o s m o d if ic a d o s , s in té t ic o s o ra ro s s e g ú n se d e s e e . G e n e ra lm e n te , lo s a m in o á c id o s s e p u e d e n a g ru p a r p o r te n e r u n a c a d e n a la te ra l a p o la r (p . e j., A la , C ys , H e , L e u , M et, P h e , P ro , V a l) ; u n a c a d e n a la te ra l c a rg a d a n e g a t iv a m e n te (p. e j., A s p , G lu ); u n a c a d e n a la te ra l c a rg a d a p o s it iv a m e n te (p . e j., A rg , H is , L ys ); o u n a c a d e n a la te ra l p o la r no c a rg a d a (p . e j., A s n , C ys , G ln , G ly , H is , M e t, P h e , S e r, T h r, T rp y T y r) .
M o d if ic a c io n e s d e a m in o á c id o s in c lu y e n , p o r e je m p lo , d e le c io n e s y /o in s e rc io n e s y /o s u s t itu c io n e s d e re s id u o s d e n tro d e la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n tic u e rp o s . S e re a liz a c u a lq u ie r c o m b in a c ió n d e d e le c ió n , in s e rc ió n y s u s t itu c ió n p a ra l le g a r a la c o n s tru c c ió n f in a l, c o n la c o n d ic ió n d e q u e la c o n s tru c c ió n f in a l p o s e a las c a ra c te r ís t ic a s d e s e a d a s . L o s c a m b io s d e a m in o á c id o s ta m b ié n p u e d e n a lte ra r p ro c e s o s p o s tra d u c c io n a le s d e las c o n s tru c c io n e s d e a n tic u e rp o s , ta le s c o m o c a m b ia r e l n ú m e ro o la p o s ic ió n d e lo s s it io s d e g lic o s ila c ió n .
P o r e je m p lo , s e p u e d e n in s e r ta r o e lim in a r 1, 2, 3, 4, 5 o 6 a m in o á c id o s e n c a d a u n a d e la s C D R s (p o r s u p u e s to , d e p e n d ie n d o d e su lo n g itu d ) , m ie n tra s q u e 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 a m in o á c id o s se p u e d e n in s e r ta r o e lim in a r en c a d a u n a d e las F R s . P re fe r ib le m e n te , la s in s e rc io n e s d e s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s in c lu y e n fu s io n e s a m in o - y /o c a rb o x ilo - te rm in a le s q u e v a r ía n e n lo n g itu d d e s d e 1 ,2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 re s id u o s a p o lip é p tid o s q u e c o n t ie n e n c ie n o m á s re s id u o s , a s í c o m o in s e rc io n e s in tra -s e c u e n c ia d e re s id u o s d e a m in o á c id o s ú n ic o s o m ú ltip le s . U n a v a r ia n te d e in s e rc ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n in c lu y e la fu s ió n a l e x tre m o N o a l e x tre m o C d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e u n a e n z im a o la fu s ió n a un p o lip é p tid o q u e a u m e n ta la s e m iv id a e n s u e ro d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o .
L o s s it io s d e m a y o r in te ré s p a ra la m u ta g é n e s is p o r s u s t itu c ió n in c lu y e n la s C D R s d e la c a d e n a p e s a d a y /o lig e ra , en p a r t ic u la r la s re g io n e s h ip e rv a r ia b le s , p e ro ta m b ié n s e c o n te m p la n a lte ra c io n e s d e la F R e n la c a d e n a p e s a d a y /o lig e ra . L a s s u s t itu c io n e s s o n p re fe r ib le m e n te s u s t itu c io n e s c o n s e rv a t iv a s ta l c o m o s e d e s c r ib e en e s ta m e m o ria . P re fe r ib le m e n te , 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9 o 10 a m in o á c id o s p u e d e n e s ta r s u s t itu id o s e n u n a C D R , m ie n tra s q u e 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 a m in o á c id o s p u e d e n e s ta r s u s t itu id o s e n la s re g io n e s m a rc o (F R s ) , d e p e n d ie n d o d e la lo n g itu d d e la C D R o F R . P o r e je m p lo , s i u n a s e c u e n c ia d e C D R c o m p re n d e 6 a m in o á c id o s , s e p re v é q u e u no , d o s o t re s d e e s to s a m in o á c id o s e s té n s u s t itu id o s . D e m a n e ra s im ila r, s i u n a s e c u e n c ia d e C D R c o m p re n d e 15 a m in o á c id o s , s e p re v é q u e u n o , d o s , t re s , c u a tro , c in c o o s e is d e e s to s a m in o á c id o s e s té n s u s t itu id o s .
U n m é to d o ú til p a ra la id e n t if ic a c ió n d e d e te rm in a d o s re s id u o s o re g io n e s d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s q u e s o n u b ic a c io n e s p re fe r id a s p a ra la m u ta g é n e s is s e d e n o m in a " m u ta g é n e s is d e b a rr id o d e a la n in a " c o m o s e d e s c r ib e p o r C u n n in g h a m y W e lls e n S c ie n c e , 244 : 1081 -1085 (1989 ) . A q u í, s e id e n t if ic a un re s id u o o g ru p o d e re s id u o s d ia n a d e n tro d e la c o n s tru c c ió n d e l a n t ic u e rp o (p. e j., re s id u o s c a rg a d o s , ta le s c o m o a rg , a sp , h is , ly s y g lu ) y s e re e m p la z a p o r un a m in o á c id o n e u tro o c a rg a d o n e g a t iv a m e n te ( lo m á s p re fe r ib le m e n te a la n in a o p o lia la n in a ) p a ra a fe c ta r a la in te ra c c ió n d e lo s a m in o á c id o s c o n e l e p íto p o .
E s a s u b ic a c io n e s d e a m in o á c id o s q u e d e m u e s tra n s e n s ib il id a d fu n c io n a l a la s s u s t itu c io n e s se re f in a n lu e g o in tro d u c ie n d o v a r ia n te s a d ic io n a le s u o tra s e n , o p a ra lo s s it io s d e s u s t itu c ió n . P o r lo ta n to , a u n q u e e l s it io o la re g ió n p a ra in t ro d u c ir u n a v a r ia c ió n d e s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e s tá p re d e te rm in a d a , la n a tu ra le z a d e la m u ta c ió n p e r se n o n e c e s ita e s ta r p re d e te rm in a d a . P o r e je m p lo , p a ra a n a liz a r u o p t im iz a r e l re n d im ie n to d e u n a m u ta c ió n e n un s it io d a d o , s e p u e d e re a liz a r un b a rr id o d e a la n in a o u n a m u ta g é n e s is a le a to r ia e n un c o d ó n o re g ió n d ia n a , y la s v a r ia n te s d e c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s e x p re s a d a s se ra s tre a n e n c u a n to a la c o m b in a c ió n ó p t im a d e a c t iv id a d d e s e a d a . T é c n ic a s p a ra re a liz a r m u ta c io n e s d e s u s t itu c ió n en s it io s p re d e te rm in a d o s d e l A D N q u e t ie n e n u n a s e c u e n c ia c o n o c id a so n b ie n c o n o c id a s , p o r e je m p lo , m u ta g é n e s is d e l c e b a d o r M 13 y m u ta g é n e s is p o r P C R . E l ra s tre o d e los m u ta n te s s e re a liz a u t i l iz a n d o e n s a y o s d e a c t iv id a d e s d e u n ió n a a n tíg e n o s , ta le s c o m o la u n ió n d e F L T 3 o C D 3.
G e n e ra lm e n te , s i lo s a m in o á c id o s e s tá n s u s t itu id o s e n u n a o m á s o e n to d a s la s C D R s d e la c a d e n a p e s a d a y /o lig e ra , s e p re f ie re q u e la s e c u e n c ia " s u s ti tu id a " o b te n id a s e a e n to n c e s a l m e n o s 60 % o 65 % , m á s p re fe r ib le m e n te 70 % o 75 % , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te 80 % u 85 % , y d e m a n e ra p a r t ic u la rm e n te p re fe r id a 90 % o 95 % id é n tic a a la s e c u e n c ia d e C D R "o r ig in a l" . E s to s ig n if ic a q u e d e p e n d e d e la lo n g itu d d e la c D r h a s ta q u é p u n to e s id é n tic a a la s e c u e n c ia "s u s titu id a " . P o r e je m p lo , u n a c D r q u e t ie n e 5 a m in o á c id o s e s p re fe r ib le m e n te un 80 % id é n t ic a a su s e c u e n c ia s u s t itu id a c o n e l fin d e te n e r a l m e n o s un a m in o á c id o s u s t itu id o . P o r c o n s ig u ie n te , la s C D R s d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o p u e d e n te n e r d ife re n te s g ra d o s d e id e n tid a d c o n s u s s e c u e n c ia s s u s t itu id a s , p. e j., C D R L 1 p u e d e te n e r u n 80 % , m ie n tra s q u e C D R L 3 p u e d e te n e r un 90 % .
S u s t itu c io n e s (o re e m p la z o s ) p re fe r id a s so n s u s t itu c io n e s c o n s e rv a d o ra s . S in e m b a rg o , s e p re v é c u a lq u ie r s u s t itu c ió n ( in c lu id a la s u s t itu c ió n n o c o n s e rv a d o ra o u n a o m á s d e la s " s u s ti tu c io n e s e je m p la re s " e n u m e ra d a s e n la T a b la 1, q u e f ig u ra m á s a d e la n te ) s ie m p re q u e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o c o n s e rv e su c a p a c id a d p a ra u n irs e a F L T 3 a t ra v é s d e l p r im e r d o m in io d e u n ió n y a C D 3 o C D 3 é p s ilo n a t ra v é s d e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n y /o s u s C D R s t ie n e n u n a id e n t id a d c o n la s e c u e n c ia e n to n c e s s u s t itu id a (a l m e n o s 60 % o 65 % , m á s p re fe r ib le m e n te 70 % o 75 % , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te 80 % u 85 % , y d e m a n e ra p a r t ic u la rm e n te p re fe r id a 90 % o 95 % id é n t ic a a la s e c u e n c ia C D R "o r ig in a l" ) .
L a s s u s t itu c io n e s c o n s e rv a d o ra s s e m u e s tra n e n la T a b la 1 b a jo e l e n c a b e z a d o d e " s u s ti tu c io n e s p re fe r id a s " . S i s u s t itu c io n e s d e e s te t ip o d a n c o m o re s u lta d o un c a m b io e n la a c t iv id a d b io ló g ic a , e n to n c e s p u e d e n in tro d u c irs e c a m b io s m á s s u s ta n c ia le s , d e n o m in a d o s " s u s ti tu c io n e s e je m p la re s " e n la T a b la 1, o c o m o s e d e s c r ib e m á s a d e la n te e n re fe re n c ia a c la s e s d e a m in o á c id o s , y lo s p ro d u c to s p u e d e n s e le c c io n a rs e p a ra u n a c a ra c te r ís t ic a d e s e a d a .
T a b la 1: S u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
M o d if ic a c io n e s s u s ta n c ia le s en la s p ro p ie d a d e s b io ló g ic a s d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la p re s e n te in v e n c ió n s e lo g ra n s e le c c io n a n d o s u s t itu c io n e s q u e d if ie re n s ig n if ic a t iv a m e n te e n su e fe c to s o b re e l m a n te n im ie n to d e (a ) la e s t ru c tu ra d e la c a d e n a p r in c ip a l p o lip e p tíd ic a e n la z o n a d e la s u s t itu c ió n , p o r e je m p lo , c o m o u n a lá m in a o c o n fo rm a c ió n h e lic o id a l, (b ) la c a rg a o h id ro fo b ic id a d d e la m o lé c u la e n e l s it io d ia n a , o (c ) la m a y o r p a r te d e la c a d e n a la te ra l. L o s re s id u o s q u e se p ro d u c e n d e fo rm a n a tu ra l s e d iv id e n e n g ru p o s b a s á n d o s e en la s p ro p ie d a d e s c o m u n e s d e la c a d e n a la te ra l: (1 ) h id ró fo b o s : n o r le u c in a , m e t, a la , v a l, le u , ile ; (2 ) h id ró f ilo s n e u tro s : c y s , se r, th r; (3 ) d e c a rá c te r á c id o : a s p , g lu ; (4 ) d e c a rá c te r b á s ic o : a sn , g in , h is , lys , a rg ; (5 ) re s id u o s q u e in f lu y e n e n la o r ie n ta c ió n d e la c a d e n a : g ly , p ro ; y (6 ) a ro m á tic o s : trp , ty r , ph e .
S u s t itu c io n e s n o c o n s e rv a d o ra s im p lic a rá n e l in te rc a m b io d e un m ie m b ro d e u n a d e e s ta s c la s e s p o r o tra c la s e . C u a lq u ie r re s id u o d e c is te ín a q u e n o e s té im p lic a d o en e l m a n te n im ie n to d e la c o n fo rm a c ió n a d e c u a d a d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o p u e d e s u s t itu irs e , g e n e ra lm e n te c o n s e r in a , p a ra m e jo ra r la e s ta b il id a d o x id a t iv a d e la m o lé c u la y p re v e n ir la re t ic u la c ió n a b e rra n te . A la in v e rs a , s e p u e d e n a ñ a d ir e n la c e (s ) d e c is te ín a a l a n t ic u e rp o p a ra m e jo ra r s u e s ta b il id a d (p a r t ic u la rm e n te e n lo s c a s o s e n lo s q u e e l a n t ic u e rp o s e a un f ra g m e n to d e a n t ic u e rp o , ta l c o m o un f ra g m e n to Fv).
P a ra la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s , la id e n tid a d y /o s im ilitu d d e s e c u e n c ia s e d e te rm in a u t il iz a n d o té c n ic a s e s tá n d a re s c o n o c id a s e n la té c n ic a , q u e in c lu y e n , p e ro n o se lim ita n a, e l a lg o r itm o d e id e n t id a d d e s e c u e n c ia lo c a l d e S m ith y W a te rm a n , 1981 , A d v . A p p l. M a th . 2 : 482 , e l a lg o r itm o d e a lin e a c ió n d e id e n tid a d d e s e c u e n c ia d e N e e d le m a n y W u n s c h , 1970 , J . M o l. B io l. 48 :443 , e l m é to d o d e b ú s q u e d a d e s im ilitu d e s d e P e a rs o n y L ip m a n , 1988 , P ro c . N a t. A c a d . S c i. E s ta d o s U n id o s d e A m é r ic a 85 : 2444 , im p le m e n ta c io n e s c o m p u ta r iz a d a s d e e s to s a lg o r itm o s (G A P , B E S T F IT , F A S T A y T F A S T A e n e l P a q u e te d e S o ftw a re d e W is c o n s in G e n e t ic s , G e n e t ic s C o m p u te r G ro u p , 575 S c ie n c e D r iv e , M a d is o n , W is .) , e l p ro g ra m a d e s e c u e n c ia B e s t F it d e s c r ito p o r D e v e re u x e t a l., 1984 , N u c l. A c id R es.
12 :387 -395 , p re fe r ib le m e n te u t il iz a n d o la c o n f ig u ra c ió n p re d e te rm in a d a o m e d ia n te in s p e c c ió n . P re fe r ib le m e n te , F a s tD B c a lc u la e l p o rc e n ta je d e id e n tid a d e n b a s e a lo s s ig u ie n te s p a rá m e tro s : p e n a liz a c ió n p o r d e s a ju s te d e 1; p e n a liz a c ió n p o r h u e c o d e 1; p e n a liz a c ió n p o r ta m a ñ o d e h u e c o d e 0 ,33 ; y p e n a liz a c ió n d e u n ió n d e 30 , "C u r re n t M e th o d s in S e q u e n c e C o m p a r is o n a n d A n a ly s is , " M a c ro m o le c u le S e q u e n c in g a n d S y n th e s is , S e le c te d M e th o d s a n d A p p lic a t io n s , p p 127 -149 (1988 ), A la n R. L is s , Inc.
U n e je m p lo d e a lg o r itm o ú til e s P IL E U P . P IL E U P c re a un a lin e a m ie n to d e s e c u e n c ia m ú lt ip le a p a r t ir d e un g ru p o d e s e c u e n c ia s re la c io n a d a s u t il iz a n d o a lin e a m ie n to s p ro g re s iv o s p o r p a re s . T a m b ié n p u e d e t r a z a r un á rb o l q u e m u e s tre la s re la c io n e s d e a g ru p a m ie n to u t i l iz a d a s p a ra c re a r e l a lin e a m ie n to . P IL E U P u tiliz a u n a s im p lif ic a c ió n d e l m é to d o d e a lin e a m ie n to p ro g re s iv o d e F e n g y D o o lit t le , 1987 , J. M o l. E vo l. 35 :351 -360 ; e l m é to d o e s s im ila r a l d e s c r ito p o r H ig g in s y S h a rp , 1989 , C A B IO S 5 :151 -153. P a rá m e tro s ú t ile s d e P IL E U P q u e in c lu y e n u n p e s o d e h u e c o p re d e te rm in a d o d e 3 ,00 , un p e s o d e lo n g itu d d e h u e c o p re d e te rm in a d o d e 0 ,10 y h u e c o s f in a le s p o n d e ra d o s .
O tro e je m p lo d e un a lg o r itm o ú til e s e l a lg o r itm o B L A S T , d e s c r ito e n : A lts c h u l e t a l., 1990 , J. M o l. B io l. 215 :403 -410 ; A lts c h u l e t a l., 1997 , N u c le ic A c id s R e s . 25 :3389 -3402 ; y K a r in e t a l., 1993 , P ro c . N a tl. A c a d . S c i. E s ta d o s U n id o s d e A m é r ic a 90 :5873 - 5787. U n p ro g ra m a B L A S T p a r t ic u la rm e n te ú til e s e l p ro g ra m a W U -B L A S T -2 q u e s e o b tu v o d e A lts c h u l e t a l., 1996 , M e th o d s in E n z y m o lo g y 266 :460 -480. W U -B L A S T -2 u t iliz a v a r io s p a rá m e tro s d e b ú s q u e d a , la m a y o r ía d e lo s c u a le s se e s ta b le c e n e n lo s v a lo re s p re d e te rm in a d o s . L o s p a rá m e tro s a ju s ta b le s s e e s ta b le c e n co n lo s s ig u ie n te s v a lo re s : in te rv a lo d e s o la p a m ie n to = 1, fra c c ió n d e s o la p a m ie n to = 0 ,125 , u m b ra l d e p a la b ra (T ) = II. L o s p a rá m e tro s H S P S y H S P S 2 s o n v a lo re s d in á m ic o s y s o n e s ta b le c id o s p o r e l p ro p io p ro g ra m a d e p e n d ie n d o d e la c o m p o s ic ió n d e la s e c u e n c ia p a r t ic u la r y la c o m p o s ic ió n d e la b a s e d e d a to s p a r t ic u la r c o n tra la c u a l se b u s c a la s e c u e n c ia d e in te ré s ; s in e m b a rg o , lo s v a lo re s p u e d e n a ju s ta rs e p a ra a u m e n ta r la s e n s ib il id a d .
U n a lg o r itm o ú til a d ic io n a l e s B L A S T c o n h u e c o s d e a c u e rd o c o n lo in fo rm a d o p o r A lts c h u l e t a l., 1993 , N u c l. A c id s R e s . 25 :3389 -3402. B L A S T co n h u e c o s u t iliz a p u n tu a c io n e s d e s u s t itu c ió n B L O S U M -62 ; p a rá m e tro d e u m b ra l T e s ta b le c id o e n 9; e l m é to d o d e d o s a c ie r to s p a ra a c t iv a r e x te n s io n e s s in h u e c o s , c o b ra lo n g itu d e s d e h u e c o d e k a un c o s te d e 10 k ; X u s e e s ta b le c e e n 16 y X g s e e s ta b le c e e n 40 p a ra la fa s e d e b ú s q u e d a d e la b a s e d e d a to s y e n 67 p a ra la fa s e d e s a lid a d e los a lg o r itm o s . L o s a l in e a m ie n to s c o n h u e c o s s e a c t iv a n m e d ia n te u n a p u n tu a c ió n c o r re s p o n d ie n te a a p ro x im a d a m e n te 22 b its .
G e n e ra lm e n te , la h o m o lo g ía , s im ilitu d o id e n tid a d d e a m in o á c id o s e n tre la s C D R s v a r ia n te s in d iv id u a le s s o n a l m e n o s e l 60 % d e la s s e c u e n c ia s re p re s e n ta d a s e n e s ta m e m o r ia , y m á s t íp ic a m e n te c o n h o m o lo g ía s o id e n t id a d e s p re fe r ib le m e n te c re c ie n te s d e a l m e n o s 65 % o 70 % , m á s p re fe r ib le m e n te a l m e n o s 75 % u 80 % , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te a l m e n o s 85 % , 90 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % , 99 % y c a s i 100 % . D e m a n e ra s im ila r , e l " p o rc e n ta je (% ) d e id e n t id a d d e s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o " c o n re s p e c to a la s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o d e la s p ro te ín a s d e u n ió n id e n t if ic a d a s e n e s ta m e m o r ia s e d e fin e c o m o el p o rc e n ta je d e re s id u o s d e n u c le ó tid o s en u n a s e c u e n c ia c a n d id a ta q u e s o n id é n t ic o s a lo s re s id u o s d e n u c le ó tid o s e n la s e c u e n c ia c o d if ic a n te d e la c o n s tru c c ió n d e l a n t ic u e rp o . U n m é to d o e s p e c íf ic o u t iliz a e l m ó d u lo B L A S T N d e W U -B L A S T -2 c o n f ig u ra d o c o n lo s p a rá m e tro s p re d e te rm in a d o s , c o n e l in te rv a lo d e s o la p a m ie n to y la f ra c c ió n d e s o la p a m ie n to c o n f ig u ra d o s e n 1 y 0 ,125 , re s p e c t iv a m e n te .
G e n e ra lm e n te , la h o m o lo g ía , s im ilitu d o id e n tid a d d e la s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o e n tre la s s e c u e n c ia s d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a n C D R s v a r ia n te s in d iv id u a le s y la s s e c u e n c ia s d e n u c le ó tid o s re p re s e n ta d a s e n e s ta m e m o r ia s o n a l m e n o s d e l 60 % , y m á s t íp ic a m e n te c o n h o m o lo g ía s o id e n t id a d e s p re fe r ib le m e n te c re c ie n te s d e a l m e n o s 65 % , 70 % , 75 % , 80 % , 81 % , 82 % , 83 % , 84 % , 85 % , 86 % , 87 % , 88 % , 89 % , 90 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % , o 99 % y c a s i 100 % . P o r lo ta n to , u n a "C D R v a r ia n te " e s u n a c o n la h o m o lo g ía , s im ilitu d o id e n t id a d e s p e c if ic a d a s c o n la C D R o r ig in a l d e la in v e n c ió n , y c o m p a r te la fu n c ió n b io ló g ic a , q u e in c lu y e , p e ro n o s e lim ita a 60 % , 65 % , 70 % , 75 % , 80 % , 81 % , 82 % , 83 % , 84 % , 85 % , 86 % , 87 % , 88 % , 89 % , 90 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % , o 99 % d e la e s p e c if ic id a d y /o a c t iv id a d d e la C D R p a re n ta l.
E n u n a re a liz a c ió n , e l p o rc e n ta je d e id e n tid a d co n la lín e a g e rm in a l h u m a n a d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s d e a c u e rd o c o n la in v e n c ió n e s > 70 % o > 75 % , m á s p re fe r ib le m e n te > 80 % o > 85 % , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te > 90 % y lo m á s p re fe r ib le m e n te > 91 % , > 92 % , > 93 % , > 94 % , > 95 % o in c lu s o > 96 % . V é a s e e l E je m p lo 8. S e c re e q u e la id e n t id a d c o n lo s p ro d u c to s g é n ic o s d e la lín e a g e rm in a l d e a n t ic u e rp o s h u m a n o s e s u n a c a ra c te r ís t ic a im p o r ta n te p a ra re d u c ir e l r ie s g o d e q u e la s p ro te ín a s te ra p é u t ic a s p ro v o q u e n u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia c o n tra e l fá rm a c o e n el p a c ie n te d u ra n te e l t ra ta m ie n to . H w a n g y F o o te ( " Im m u n o g e n ic ity o f e n g in e e re d a n tib o d ie s " ; M e th o d s 36 (2005 ) 3 -10 ) d e m u e s tra n q u e la re d u c c ió n d e p o rc io n e s n o h u m a n a s d e c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s fa rm a c o ló g ic o s c o n d u c e a u n a d is m in u c ió n d e l r ie s g o d e in d u c ir a n t ic u e rp o s a n t i- fá rm a c o s e n lo s p a c ie n te s d u ra n te e l t ra ta m ie n to . A l c o m p a ra r un n ú m e ro e x h a u s t iv o d e fá rm a c o s d e a n t ic u e rp o s e v a lu a d o s c lín ic a m e n te y lo s d a to s d e in m u n o g e n ic id a d re s p e c tiv o s , s e m u e s tra la te n d e n c ia d e q u e la h u m a n iz a c ió n d e la s re g io n e s V d e lo s a n t ic u e rp o s h a g a q u e la p ro te ín a s e a m e n o s in m u n o g é n ic a (p ro m e d io d e l 5 ,1 % d e lo s p a c ie n te s ) q u e lo s a n t ic u e rp o s q u e lle v a n re g io n e s V n o h u m a n a s no a lte ra d a s (p ro m e d io 23 ,59 % d e lo s p a c ie n te s ) . P o r lo ta n to , e s d e s e a b le un m a y o r g ra d o d e id e n t id a d c o n las s e c u e n c ia s h u m a n a s p a ra la s te ra p ia s c o n p ro te ín a s b a s a d a s e n la re g ió n V e n fo rm a d e c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s . P a ra e s te p ro p ó s ito d e d e te rm in a r la id e n t id a d d e la lín e a g e rm in a l, la s re g io n e s V d e V L p u e d e n a lin e a rs e c o n la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e lo s s e g m e n to s V y J d e la lín e a g e rm in a l h u m a n a (h t tp :/ /v b a s e .m rc -c p e .c a m .a c .u k /) u t i l iz a n d o e l s o f tw a re V e c to r N T I y la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s c a lc u la d a d iv id ie n d o lo s re s id u o s d e a m in o á c id o s id é n t ic o s p o r e l n ú m e ro to ta l d e re s id u o s d e a m in o á c id o s d e la V L e n p o rc e n ta je . L o m is m o p u e d e s e r p a ra lo s s e g m e n to s V H ( h t tp : / /v b a s e .m rc -c p e .c a m .a c .u k /) c o n la e x c e p c ió n d e q u e la C D R 3 d e V H p u e d e s e r e x c lu id a d e b id o a su a lta d iv e rs id a d y a la fa lta d e p a r t ic ip a n te s e n e l a lin e a m ie n to d e C D R 3 d e V H d e la lín e a g e rm in a l h u m a n a e x is te n te . A c o n t in u a c ió n , p u e d e n u t il iz a rs e té c n ic a s re c o m b in a n te s p a ra a u m e n ta r la id e n tid a d d e s e c u e n c ia co n g e n e s d e la lín e a g e rm in a l d e a n t ic u e rp o s h u m a n o s .
E n u n a re a liz a c ió n a d ic io n a l, la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s d e la p re s e n te in v e n c ió n e x h ib e n a lto s re n d im ie n to s d e m o n ó m e ro s en c o n d ic io n e s d e e s c a la d e in v e s t ig a c ió n e s tá n d a r , p. ej., e n un p ro c e s o d e p u r if ic a c ió n e s tá n d a r d e d o s e ta p a s . P re fe r ib le m e n te , e l re n d im ie n to d e m o n ó m e ro d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s d e a c u e rd o c o n la in v e n c ió n e s > 0 ,25 m g /L d e s o b re n a d a n te , m á s p re fe r ib le m e n te > 0 ,5 m g /L , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te > 1 m g /L y lo m á s p re fe r ib le m e n te > 3 m g /L d e s o b re n a d a n te .
n o s e u n a n e s e n c ia lm e n te a ) lo s p a rá lo g o s d e F L T 3 d e m a c a c o / c y n o K IT v i , C S F 1 R v i , P D G F R A y /o N T M v 3. V é a s e e l E je m p lo 7.
T a m b ié n s e p re v é q u e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 d e la in v e n c ió n te n g a n u n a tu rb id e z (m e d id a p o r D O 340 d e s p u é s d e la c o n c e n tra c ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s m o n o m é r ic o s p u r if ic a d o s a 2 ,5 m g /m l e in c u b a c ió n d u ra n te la n o c h e ) d e < 0 ,2 , p re fe r ib le m e n te d e < 0 ,15 , m á s p re fe r ib le m e n te d e < 0 ,12 , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te d e < 0,1 y lo m á s p re fe r ib le m e n te d e < 0 ,08. V é a s e e l E je m p lo 14.
E n u n a re a liz a c ió n a d ic io n a l, la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o c o n la in v e n c ió n e s e s ta b le a pH á c id o . C u a n to m á s to le ra n te s e c o m p o r te la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s a u n pH n o f is io ló g ic o , ta l c o m o pH 5 ,5 (u n pH q u e se re q u ie re p a ra e je c u ta r , p. e j., u n a c ro m a to g ra f ía d e in te rc a m b io c a t ió n ic o ) , m a y o r s e rá la re c u p e ra c ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s e lu id a d e u n a c o lu m n a d e in te rc a m b io ió n ic o e n re la c ió n c o n la c a n t id a d to ta l d e p ro te ín a c a rg a d a . L a re c u p e ra c ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e u n a c o lu m n a d e in te rc a m b io ió n ic o (p. ej.,, c a t ió n ic o ) a pH 5 ,5 e s p re fe r ib le m e n te > 30 % , m á s p re fe r ib le m e n te > 40 % , m á s p re fe r ib le m e n te > 50 % , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te > 60 % , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te > 70 % , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te > 80 % , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te > 90 % , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te > 95 % y lo m á s p re fe r ib le m e n te > 99 % . V é a s e e l E je m p lo 15.
A d e m á s , s e p re v é q u e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s d e la p re s e n te in v e n c ió n e x h ib a n e f ic a c ia te ra p é u t ic a o a c t iv id a d a n t itu m o ra l. E s to p u e d e , p. ej., s e r e v a lu a d o en un e s tu d io ta l c o m o se d e s c r ib e e n e l s ig u ie n te e je m p lo d e un m o d e lo d e x e n o in je r to d e tu m o r h u m a n o e n e s ta d io a v a n z a d o :
E l d ía 1 d e l e s tu d io , 5 x 106 c é lu la s d e u n a lín e a c e lu la r d e c á n c e r F L T 3 p o s it iv a h u m a n a (p. e j., O V C A R -8 ) se in y e c ta ro n p o r v ía s u b c u tá n e a e n e l f la n c o d o rs a l d e re c h a d e ra to n e s N O D /S C ID h e m b ra s . C u a n d o e l v o lu m e n m e d io d e l tu m o r a lc a n z a a p ro x im a d a m e n te 100 m m 3, s e tra s p la n ta n c é lu la s T p o s it iv a s p a ra C D 3 h u m a n a s e x p a n d id a s in v it ro a lo s ra to n e s m e d ia n te in y e c c ió n d e a p ro x im a d a m e n te 2 x 107 c é lu la s e n la c a v id a d p e r ito n e a l d e lo s a n im a le s . L o s ra to n e s d e l g ru p o d e c o n tro l d e v e h íc u lo 1 no re c ib e n c é lu la s e fe c to ra s y s e u t iliz a n c o m o un c o n tro l no t ra s p la n ta d o p a ra c o m p a ra r c o n e l g ru p o d e c o n tro l d e v e h íc u lo 2 (q u e re c ib e n c é lu la s e fe c to ra s ) p a ra v ig i la r e l im p a c to d e la s c é lu la s T s o la s s o b re e l c re c im ie n to d e l tu m o r . E l t ra ta m ie n to c o n a n t ic u e rp o s c o m ie n z a c u a n d o e l v o lu m e n m e d io d e l tu m o r a lc a n z a a p ro x im a d a m e n te 200 m m 3. E l ta m a ñ o m e d io d e l tu m o r d e c a d a u n o d e lo s g ru p o s d e tra ta m ie n to e l d ía d e in ic io d e l t ra ta m ie n to no d e b e r ía s e r e s ta d ís t ic a m e n te d ife re n te d e c u a lq u ie r o tro g ru p o (a n á lis is d e v a r ia n z a ) . L o s ra to n e s s e t ra ta n co n 0 ,5 m g /k g /d ía d e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o F L T 3 x C D 3 m e d ia n te in y e c c ió n d e b o lo in tra v e n o s a d u ra n te a p ro x im a d a m e n te 15 a 20 d ía s . L o s tu m o re s se m id e n co n un c a lib re d u ra n te e l e s tu d io y s e e v a lú a e l p ro g re s o m e d ia n te la c o m p a ra c ió n e n tre g ru p o s d e lo s v o lú m e n e s d e lo s tu m o re s (T V ). L a in h ib ic ió n d e l c re c im ie n to d e l tu m o r T /C [% ] s e d e te rm in a c a lc u la n d o T V c o m o T /C % = 100 x (T V m e d ia n a de l g ru p o a n a liz a d o ) / (T V m e d ia n a d e l g ru p o d e c o n tro l 2).
L a p e rs o n a e x p e r ta s a b e c ó m o m o d if ic a r o a d a p ta r d e te rm in a d o s p a rá m e tro s d e e s te e s tu d io , ta l c o m o e l n ú m e ro d e c é lu la s tu m o ra le s in y e c ta d a s , e l s it io d e in y e c c ió n , e l n ú m e ro d e c é lu la s T h u m a n a s tra s p la n ta d a s , la c a n t id a d d e c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s q u e s e a d m in is tra rá n y lo s p la z o s , s in d e ja r d e l le g a r a un re s u lta d o s ig n if ic a t iv o y re p ro d u c ib le . P re fe r ib le m e n te , la in h ib ic ió n d e l c re c im ie n to d e l tu m o r T /C [% ] e s < 70 o < 60 , m á s p re fe r ib le m e n te < 50 o < 40 , in c lu s o m á s p re fe r ib le m e n te < 30 o < 20 y lo m á s p re fe r ib le m e n te < 10 o < 5 o in c lu s o < 2 ,5.
L a in v e n c ió n p ro p o rc io n a , a d e m á s , un p o lin u c le ó t id o /u n a m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n .
U n p o lin u c le ó t id o e s un b io p o lím e ro c o m p u e s to p o r 13 o m á s m o n ó m e ro s d e n u c le ó tid o s u n id o s c o v a le n te m e n te en u n a c a d e n a . E l A D N ( ta l c o m o A D N c ) y e l A R N ( ta l c o m o A R N m ) s o n e je m p lo s d e p o lin u c le ó t id o s c o n u n a fu n c ió n b io ló g ic a d is t in ta . L o s n u c le ó tid o s s o n m o lé c u la s o rg á n ic a s q u e s irv e n c o m o m o n ó m e ro s o s u b u n id a d e s d e m o lé c u la s d e á c id o n u c le ic o , ta le s c o m o A D N o A R N . L a m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o o p o lin u c le ó t id o p u e d e s e r d e d o b le c a d e n a y d e c a d e n a s e n c illa , lin e a l y c irc u la r . P re fe r ib le m e n te e s tá c o m p re n d id a e n un v e c to r q u e p re fe r ib le m e n te e s tá c o m p re n d id o e n u n a c é lu la h u é s p e d . D ic h a c é lu la h u é s p e d e s c a p a z , p. ej., d e s p u é s d e la t r a n s fo rm a c ió n o t ra n s fe c c ió n co n e l v e c to r o e l p o lin u c le ó t id o d e la in v e n c ió n , d e e x p re s a r la c o n s tru c c ió n d e lo s a n tic u e rp o s . P a ra e se p ro p ó s ito , e l p o lin u c le ó t id o o la m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o s e e n la z a n o p e ra t iv a m e n te c o n s e c u e n c ia s d e c o n tro l.
E l c ó d ig o g e n é t ic o e s e l c o n ju n to d e re g la s m e d ia n te la s c u a le s la in fo rm a c ió n c o d if ic a d a d e n tro d e l m a te r ia l g e n é t ic o (á c id o s n u c le ic o s ) s e tra d u c e e n p ro te ín a s . L a d e s c o d if ic a c ió n b io ló g ic a en la s c é lu la s v iv a s s e lo g ra m e d ia n te e l r ib o s o m a q u e e n la z a lo s a m in o á c id o s en un o rd e n e s p e c if ic a d o p o r e l A R N m , u t il iz a n d o m o lé c u la s d e A R N t p a ra lle v a r a m in o á c id o s y le e r lo s t re s n u c le ó tid o s d e l A R N m a la ve z . E l c ó d ig o d e f in e c ó m o la s s e c u e n c ia s d e e s to s t r ip le te s d e n u c le ó tid o s , d e n o m in a d o s c o d o n e s , e s p e c if ic a n q u é a m in o á c id o s e a ñ a d irá n a c o n t in u a c ió n d u ra n te la s ín te s is d e p ro te ín a s . C o n a lg u n a s e x c e p c io n e s , un c o d ó n d e t re s n u c le ó tid o s e n u n a s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o e s p e c if ic a un s o lo a m in o á c id o . D e b id o a q u e la g ra n m a y o r ía d e g e n e s so n c o d if ic a d o s c o n e x a c ta m e n te e l m is m o c ó d ig o , a e s te c ó d ig o p a r t ic u la r s e le a lu d e a m e n u d o c o m o c ó d ig o g e n é t ic o c a n ó n ic o o e s tá n d a r . S i b ie n e l c ó d ig o g e n é t ic o d e te rm in a la s e c u e n c ia d e p ro te ín a s p a ra u n a re g ió n c o d if ic a n te d a d a , o tra s re g io n e s g e n ó m ic a s p u e d e n in f lu ir e n c u á n d o y d ó n d e s e p ro d u c e n e s ta s p ro te ín a s .
A d e m á s , la in v e n c ió n p ro p o rc io n a un v e c to r q u e c o m p re n d e un p o lin u c le ó t id o / m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o d e la in v e n c ió n .
U n v e c to r e s u n a m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o q u e s e u t iliz a c o m o un v e h íc u lo p a ra tr a n s fe r ir m a te r ia l g e n é t ic o (e x tra ñ o ) a u n a c é lu la . E l té rm in o "v e c to r " a b a rc a , p e ro no s e lim ita a - p lá s m id o s , v iru s , c ó s m id o s y c ro m o s o m a s a r t if ic ia le s . En g e n e ra l, lo s v e c to re s m o d if ic a d o s c o m p re n d e n un o r ig e n d e re p lic a c ió n , un s it io d e c lo n a c ió n m ú lt ip le y un m a rc a d o r s e le c c io n a b le . E l v e c to r e n s í m is m o e s g e n e ra lm e n te u n a s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s , h a b itu a lm e n te u n a s e c u e n c ia de A D N , q u e c o m p re n d e u n a in s e rc ió n ( t ra n s g é n ) y u n a s e c u e n c ia m á s g ra n d e q u e s irv e c o m o la " c o lu m n a v e r te b ra l" de l v e c to r . L o s v e c to re s m o d e rn o s p u e d e n a b a rc a r c a ra c te r ís t ic a s a d ic io n a le s a d e m á s d e la in s e rc ió n d e l tra n s g é n y u n a c o lu m n a v e r te b ra l: p ro m o to r , m a rc a d o r g e n é tic o , re s is te n c ia a a n t ib ió t ic o s , g e n in fo rm a d o r, s e c u e n c ia d e f i ja c ió n d e o b je t iv o , e t iq u e ta d e p u r if ic a c ió n d e p ro te ín a s . L o s v e c to re s d e n o m in a d o s v e c to re s d e e x p re s ió n ( c o n s tru c c io n e s de e x p re s ió n ) so n e s p e c íf ic a m e n te p a ra la e x p re s ió n d e l tra n s g é n e n la c é lu la d ia n a y g e n e ra lm e n te t ie n e n s e c u e n c ia s d e c o n tro l.
L a e x p re s ió n " s e c u e n c ia s d e c o n tro l" s e re f ie re a s e c u e n c ia s d e A D N n e c e s a r ia s p a ra la e x p re s ió n d e u n a s e c u e n c ia c o d if ic a n te e n la z a d a o p e ra t iv a m e n te e n un o rg a n is m o h u é s p e d p a rt ic u la r . L a s s e c u e n c ia s d e c o n tro l q u e so n a d e c u a d a s p a ra p ro c a r io ta s , p o r e je m p lo , in c lu y e n u n p ro m o to r , o p c io n a lm e n te u n a s e c u e n c ia d e o p e ra d o r y un s it io d e u n ió n a l r ib o s o m a . S e s a b e q u e la s c é lu la s e u c a r io ta s u t iliz a n p ro m o to re s , s e ñ a le s d e p o lia d e n ila c ió n y p o te n c ia d o re s .
U n á c id o n u c le ic o e s tá "o p e ra t iv a m e n te e n la z a d o " c u a n d o e s tá c o lo c a d o e n u n a re la c ió n fu n c io n a l c o n o tra s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o . P o r e je m p lo , e l A D N d e u n a p re s e c u e n c ia o c o n d u c to r s e c re to r e s tá o p e ra t iv a m e n te e n la z a d o a l A D N d e un p o lip é p tid o s i s e e x p re s a c o m o u n a p re p ro te ín a q u e p a rt ic ip a e n la s e c re c ió n d e l p o lip é p tid o ; un p ro m o to r o p o te n c ia d o r e s tá o p e ra t iv a m e n te e n la z a d o a u n a s e c u e n c ia c o d if ic a n te s i a fe c ta a la t ra n s c r ip c ió n d e la s e c u e n c ia ; o un s it io d e u n ió n a l r ib o s o m a e s tá o p e ra t iv a m e n te e n la z a d o a u n a s e c u e n c ia c o d if ic a n te s i e s tá s itu a d o p a ra fa c i l i ta r la t ra d u c c ió n . G e n e ra lm e n te , "o p e ra t iv a m e n te e n la z a d o " s ig n if ic a q u e la s s e c u e n c ia s d e A D N q u e se e n la z a n so n c o n t ig u a s y, e n e l c a s o d e un c o n d u c to r s e c re to r , s o n c o n t ig u a s y e s tá n e n fa s e d e le c tu ra . S in e m b a rg o , los p o te n c ia d o re s no t ie n e n p o r q u é s e r c o n tig u o s . L a v in c u la c ió n s e lo g ra m e d ia n te lig a m ie n to e n s it io s d e re s tr ic c ió n c o n v e n ie n te s . S i n o e x is te e s te t ip o d e s it io s , lo s a d a p ta d o re s o e n la z a d o re s d e o l ig o n u c le ó t id o s s in té t ic o s s e u t iliz a n d e a c u e rd o co n la p rá c t ic a c o n v e n c io n a l.
L a " t ra n s fe c c ió n " e s e l p ro c e s o d e in tro d u c ir d e l ib e ra d a m e n te m o lé c u la s d e á c id o n u c le ic o o p o lin u c le ó t id o s ( in c lu y e n d o lo s v e c to re s ) en c é lu la s d ia n a . El té rm in o s e u t iliz a p r in c ip a lm e n te p a ra m é to d o s n o v ira le s e n c é lu la s e u c a r io ta s . L a tra n s d u c c ió n se u t iliz a a m e n u d o p a ra d e s c r ib ir la t r a n s fe re n c ia m e d ia d a p o r v iru s d e m o lé c u la s d e á c id o n u c le ic o o p o lin u c le ó t id o s . La tra n s fe c c ió n d e c é lu la s a n im a le s im p lic a t íp ic a m e n te la a p e r tu ra d e p o ro s tr a n s ito r io s o "a g u je ro s " e n la m e m b ra n a c e lu la r , p a ra p e rm it ir la a b s o rc ió n d e m a te r ia l. L a t ra n s fe c c ió n s e p u e d e lle v a r a c a b o u t il iz a n d o fo s fa to d e c a lc io , p o r e le c tro p o ra c ió n , p o r e x p r im id o c e lu la r o m e z c la n d o un líp id o c a t ió n ic o c o n el m a te r ia l p a ra p ro d u c ir lip o s o m a s , q u e s e fu s io n a n c o n la m e m b ra n a c e lu la r y d e p o s ita n su c a rg a e n e l in te rio r .
E l té rm in o " tra n s fo rm a c ió n " se u t iliz a p a ra d e s c r ib ir la t ra n s fe re n c ia n o v ira l d e m o lé c u la s d e á c id o n u c le ic o o p o lin u c le ó t id o s ( in c lu y e n d o v e c to re s ) a b a c te r ia s , y ta m b ié n a c é lu la s e u c a r io ta s n o a n im a le s , in c lu y e n d o c é lu la s v e g e ta le s . L a t r a n s fo rm a c ió n es, p o r lo ta n to , la a lte ra c ió n g e n é t ic a d e u n a c é lu la e u c a r io ta b a c te r ia n a o no a n im a l re s u lta n te d e la c a p ta c ió n d ire c ta a t ra v é s d e la o las m e m b ra n a s c e lu la re s d e su e n to rn o y la in c o rp o ra c ió n p o s te r io r d e m a te r ia l g e n é t ic o e x ó g e n o (m o lé c u la s d e á c id o n u c le ic o ) . L a t r a n s fo rm a c ió n s e p u e d e e fe c tu a r p o r m e d io s a r t if ic ia le s . P a ra q u e o c u rra la t ra n s fo rm a c ió n , la s c é lu la s o b a c te r ia s d e b e n e s ta r e n un e s ta d o d e c o m p e te n c ia , lo q u e p o d ría o c u r r ir c o m o u n a re s p u e s ta lim ita d a e n e l t ie m p o a c o n d ic io n e s d e l e n to rn o ta le s c o m o la in a n ic ió n y la d e n s id a d c e lu la r.
A d e m á s , la in v e n c ió n p ro p o rc io n a u n a c é lu la h u é s p e d tra n s fo rm a d a o tra n s fe c ta d a c o n la m o lé c u la d e p o lin u c le ó t id o /á c id o n u c le ic o o c o n e l v e c to r d e la in v e n c ió n .
T a l c o m o s e u t iliz a e n e s ta m e m o r ia , la e x p re s ió n " c é lu la h u é s p e d " o " c é lu la re c e p to ra " p re te n d e in c lu ir c u a lq u ie r c é lu la in d iv id u a l o c u lt iv o c e lu la r q u e p u e d a o p u e d a n s e r o h a y a o h a y a n s id o re c e p to ra s d e v e c to re s , m o lé c u la s d e á c id o n u c le ic o e x ó g e n a s y p o lin u c le ó t id o s q u e c o d if ic a n la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la p re s e n te in v e n c ió n ; y /o re c e p to re s d e la p ro p ia c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o . La in tro d u c c ió n d e l m a te r ia l re s p e c t iv o e n la c é lu la s e lle v a a c a b o m e d ia n te tra n s fo rm a c ió n , t ra n s fe c c ió n y s im ila re s . L a e x p re s ió n « c é lu la h u é s p e d » ta m b ié n p re te n d e in c lu ir la p ro g e n ie o la p ro g e n ie p o te n c ia l d e u n a s o la c é lu la . D e b id o a q u e d e te rm in a d a s m o d if ic a c io n e s p u e d e n p ro d u c irs e en las g e n e ra c io n e s s u c e s iv a s d e b id o a u n a m u ta c ió n n a tu ra l, a c c id e n ta l o d e lib e ra d a o d e b id o a in f lu e n c ia s a m b ie n ta le s , d ic h a p ro g e n ie p u e d e , d e h e c h o , n o s e r c o m p le ta m e n te id é n tic a (e n m o r fo lo g ía o e n c o m p le m e n to d e A D N g e n ó m ic o o to ta l) a la c é lu la p a re n ta l, p e ro to d a v ía e s tá in c lu id o d e n tro d e l a lc a n c e d e l té rm in o c o m o s e u t iliz a en e s ta m e m o r ia . C é lu la s h u é s p e d a d e c u a d a s in c lu y e n c é lu la s p ro c a r io ta s o e u c a r io ta s y ta m b ié n in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a b a c te r ia s , c é lu la s d e le v a d u ra s , c é lu la s d e h o n g o s , c é lu la s v e g e ta le s y c é lu la s a n im a le s , ta le s c o m o c é lu la s d e in s e c to s y c é lu la s d e m a m ífe ro s , p. e j., ra to n e s , ra ta s , m a c a c o s o s e re s h u m a n o s .
L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la in v e n c ió n s e p u e d e p ro d u c ir e n b a c te r ia s . D e s p u é s d e la e x p re s ió n , la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n se a ís la d e la p a s ta d e c é lu la s d e E. c o li e n u n a fra c c ió n s o lu b le y s e p u e d e p u r if ic a r m e d ia n te , p. e j., c ro m a to g ra f ía d e a f in id a d y /o e x c lu s ió n p o r ta m a ñ o . La p u r if ic a c ió n f in a l s e p u e d e l le v a r a c a b o d e fo rm a s im ila r a l p ro c e d im ie n to p a ra p u r if ic a r e l a n t ic u e rp o e x p re s a d o , p. ej., e n c é lu la s C H O .
A d e m á s d e lo s p ro c a r io ta s , m ic ro b io s e u c a r io ta s , ta le s c o m o h o n g o s f i la m e n to s o s o le v a d u ra s s o n h u é s p e d e s d e c lo n a c ió n o e x p re s ió n a d e c u a d o s p a ra la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la in v e n c ió n . S a cch a ro m yce s ce rev is iae , o le v a d u ra d e p a n a d e r ía c o m ú n , e s e l m á s c o m ú n m e n te u t il iz a d o e n tre lo s m ic ro o rg a n is m o s h u é s p e d e s e u c a r io ta s in fe r io re s . S in e m b a rg o , un c ie r to n ú m e ro d e o tro s g é n e ro s , e s p e c ie s y c e p a s e s tá n c o m ú n m e n te d is p o n ib le s y so n ú t ile s en e s ta m e m o r ia , ta le s c o m o S ch izo sa cch a ro m yce s pom be , h u é s p e d e s d e K lu y v e ro m y c e s , ta le s c o m o K. lactis , K. fra g ilis (A T C C 12424 ), K. b u lg a ricu s (A T C C 16045 ), K. w icke ra m ii (A T C C 24178 ) , K. w a ltii (A T C C 56500 ) , K d ro s o p h ila ru m (A T C C 36906 ), K. the rm o to le rans , y K. m a rx ia n u s ; y a r ro w ia (d o c u m e n to E P 402 226 ); P ich ia p a s to r is ( d o c u m e n to E P 183 070 ); C a n d id a ; T rich o d e rm a re e s ia (d o c u m e n to E P 244 234 ); N e u ro sp o ra c rassa ; S c h w a n n io m y c e s , ta le s c o m o S ch w a n n io m yce s o c c id e n ta lis ; y h o n g o s f i la m e n to s o s , ta le s c o m o N e u ro s p o ra , P e n ic il l iu m , T o ly p o c la d iu m , y h u é s p e d e s d e A s p e rg il lu s , ta le s c o m o A. n id u la n s y A. n iger.
C é lu la s h u é s p e d e s a d e c u a d a s p a ra la e x p re s ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s g lic o s ila d o s d e la in v e n c ió n se d e r iv a n d e o rg a n is m o s m u lt ic e lu la re s . E je m p lo s d e c é lu la s d e in v e r te b ra d o s in c lu y e n c é lu la s v e g e ta le s y d e in s e c to s . S e h a n id e n t if ic a d o n u m e ro s a s c e p a s y v a r ia n te s d e b a c u lo v ira le s y la s c o r re s p o n d ie n te s c é lu la s h u é s p e d e s de in s e c to s p e rm is iv a s d e h u é s p e d e s , ta le s c o m o S p o d o p te ra fru g ip e rd a (o ru g a ), A e d e s a e g y p ti (m o s q u ito ) , A e d e s a lb o p ic tu s (m o s q u ito ) , D ro so p h ila m e la n o g a s te r (m o s c a d e la f ru ta ) y B o m b y x m ori. U n a d iv e rs id a d d e c e p a s v ira le s p a ra t ra n s fe c c ió n e s tá n d is p o n ib le s p ú b lic a m e n te , p. ej., la v a r ia n te L-1 d e A u to g ra p h a c a lifo rn ic a N P V y la c e p a B m -5 d e B o m b y x m o r i N P V , y v iru s d e e s te t ip o s e p u e d e n u t il iz a r p a r t ic u la rm e n te p a ra la t ra n s fe c c ió n d e c é lu la s d e S p o d o p te ra frug ipe rda .
T a m b ié n s e p u e d e n u t il iz a r c o m o h u é s p e d e s c u lt iv o s d e c é lu la s v e g e ta le s d e a lg o d ó n , m a íz , p a ta ta , so ja , p e tu n ia , to m a te , A ra b id o p s is y ta b a c o . L o s e x p e r to s e n la té c n ic a c o n o c e n v e c to re s d e c lo n a c ió n y e x p re s ió n ú t ile s en la p ro d u c c ió n d e p ro te ín a s e n c u lt iv o s d e c é lu la s v e g e ta le s . V é a s e , p. ej. H ia tt e t a l., N a tu re (1989 ) 342 : 76 -78 , O w e n e t a l. (1992 ) B io /T e c h n o lo g y 10: 790 -794 , A r ts a e n k o e t a l. (1995 ) T h e P la n t J 8: 745 -750 , y F e c k e r e t a l. (1996 ) P la n t M o l B io l 32 : 979 -986.
S in e m b a rg o , e l in te ré s h a s id o m a y o r e n c é lu la s d e v e r te b ra d o s y la p ro p a g a c ió n d e c é lu la s d e v e r te b ra d o s e n c u lt iv o ( c u lt iv o d e te j id o s ) se ha c o n v e r t id o e n u n p ro c e s o d e ru tin a . E je m p lo s d e lín e a s c e lu la re s h u é s p e d e s d e m a m ífe ro s ú t ile s so n la lín e a C V 1 d e r iñ ó n d e m o n o tra n s fo rm a d a p o r S V 40 (C O S -7 , A T C C C R L 1651 ); lín e a d e r iñ ó n e m b r io n a r io h u m a n o (293 o c é lu la s 293 s u b c lo n a d a s p a ra c re c im ie n to en c u lt iv o en s u s p e n s ió n , G ra h a m e t a l., J. G e n V iro l. 36 : 59 (1977 )) ; c é lu la s d e r iñ ó n d e c r ía d e h á m s te r (B H K , A T C C C C L 10); c é lu la s d e o v a r io d e h á m s te r c h in o /-D H F R (C H O , U r la u b e t a l., P ro c . N a tl. A c a d . S c i. E s ta d o s U n id o s d e A m é r ic a 77 : 4216 (1980 ) ) ; c é lu la s d e s e r to li d e ra tó n (T M 4 , M a th e r, B io l. R e p ro d . 23 : 243 -251 (1980 )) ; c é lu la s d e r iñ ó n d e m o n o (C V I A t C C C c L 70 ); c é lu la s d e r iñ ó n d e m o n o v e rd e a fr ic a n o (V E R O -76 , A T C C C R L 1587 ); c é lu la s d e c a rc in o m a d e c u e llo u te r in o h u m a n o (H E L A , A T C C C C L 2 ); c é lu la s re n a le s c a n in a s (M D C K , A T C C C C L 34 ); c é lu la s d e h íg a d o d e ra ta b ú fa lo (B R L 3A , A T C C C R L 1442 ); c é lu la s d e p u lm ó n h u m a n o (W 138 , A T C C C C L 75 ); c é lu la s d e h íg a d o h u m a n o (H e p G 2 , 1413 8065 ); tu m o r m a m a r io d e ra tó n (M M T 060562 , A T C C C C L 5 1); c é lu la s T R I (M a th e r e t a l., A n n a ls N. Y A c a d . S c i. (1982 ) 383 : 44 -68 ) ; c é lu la s M R C 5; c é lu la s F S 4 ; y u n a lín e a d e h e p a to m a h u m a n o (H e p G 2 ).
E n u n a re a liz a c ió n a d ic io n a l, la in v e n c ió n p ro p o rc io n a un p ro c e d im ie n to p a ra la p ro d u c c ió n d e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n , c o m p re n d ie n d o d ic h o p ro c e d im ie n to c u lt iv a r u n a c é lu la h u é s p e d d e la in v e n c ió n b a jo c o n d ic io n e s q u e p e rm ita n la e x p re s ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n y re c u p e ra r la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o p ro d u c id a a p a r t ir d e l c u lt iv o .
T a l c o m o s e u t iliz a e n e s ta m e m o r ia , e l té rm in o "c u lt iv o " se re f ie re a l m a n te n im ie n to , d ife re n c ia c ió n , c re c im ie n to , p ro li fe ra c ió n y /o p ro p a g a c ió n in v itro d e c é lu la s b a jo c o n d ic io n e s a d e c u a d a s e n un m e d io . E l té rm in o "e x p re s ió n " in c lu y e c u a lq u ie r e ta p a im p lic a d a e n la p ro d u c c ió n d e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n q u e in c lu y e , p e ro n o s e lim ita a t ra n s c r ip c ió n , m o d if ic a c ió n p o s tra n s c r ip c io n a l, tra d u c c ió n , m o d if ic a c ió n p o s tra d u c c io n a l y s e c re c ió n .
C u a n d o s e u t iliz a n té c n ic a s re c o m b in a n te s , la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s se p u e d e p ro d u c ir in t ra c e lu la rm e n te , e n e l e s p a c io p e r ip lá s m ic o o s e p u e d e s e c re ta r d ire c ta m e n te a l m e d io . S i la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s e p ro d u c e in t ra c e lu la rm e n te , c o m o p r im e ra e ta p a , lo s d e s e c h o s e n p a rtíc u la s , y a s e a n c é lu la s h u é s p e d o f r a g m e n to s lis a d o s , se e lim in a n , p o r e je m p lo , m e d ia n te c e n tr ifu g a c ió n o u ltra f i lt ra c ió n . C a r te r e t a l., B io /T e c h n o lo g y 10: 163 -167 (1992 ) d e s c r ib e n un p ro c e s o p a ra a is la r a n t ic u e rp o s q u e s o n s e c re ta d o s a l e s p a c io p e r ip lá s m ic o d e E. coli. B re v e m e n te , la p a s ta c e lu la r s e d e s c o n g e la e n p re s e n c ia d e a c e ta to d e s o d io (p H 3 ,5 ), E D T A y f lu o ru ro d e fe n ilm e t i ls u lfo n ilo (P M S F ) d u ra n te a p ro x im a d a m e n te 30 m in . L o s d e s e c h o s c e lu la re s s e p u e d e n e lim in a r m e d ia n te c e n tr ifu g a c ió n . C u a n d o el a n t ic u e rp o se s e c re ta a l m e d io , lo s s o b re n a d a n te s d e s is te m a s d e e x p re s ió n d e e s te t ip o s e c o n c e n tra n g e n e ra lm e n te p r im e ro u t il iz a n d o un f ilt ro d e c o n c e n tra c ió n d e p ro te ín a s d is p o n ib le c o m e rc ia lm e n te , p o r e je m p lo , u n a u n id a d d e u lt ra f i lt ra c ió n A m ic o n o M ill ip o re P e llic o n . S e p u e d e in c lu ir un in h ib id o r d e p ro te a s a ta l c o m o P M S F e n c u a lq u ie ra d e la s e ta p a s a n te r io re s p a ra in h ib ir la p ro te ó lis is y s e p u e d e n in c lu ir a n t ib ió t ic o s p a ra p re v e n ir e l c re c im ie n to de c o n ta m in a n te s a d v e n t ic io s .
L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n , p re p a ra d a a p a r t ir d e la s c é lu la s h u é s p e d e s s e p u e d e re c u p e ra r o p u r if ic a r u t iliz a n d o , p o r e je m p lo , c ro m a to g ra f ía d e h id ro x ia p a t ito , e le c tro fo re s is e n g e l, d iá lis is y c ro m a to g ra f ía d e a fin id a d . O tra s té c n ic a s p a ra la p u r if ic a c ió n d e p ro te ín a s , ta le s c o m o e l f ra c c io n a m ie n to e n u n a c o lu m n a d e in te rc a m b io ió n ic o , p re c ip ita c ió n c o n e ta n o l, H P L C d e fa s e in v e rs a , c ro m a to g ra f ía e n s í lic e , c ro m a to g ra fía e n h e p a r in a S E P H A R O S E ™ , c ro m a to g ra f ía e n u n a re s in a d e in te rc a m b io a n ió n ic o o c a t ió n ic o ( ta l c o m o u n a c o lu m n a d e á c id o p o lia s p á r t ic o ) , c ro m a to g ra f ía -e n fo q u e , S D S -P A G E y p re c ip ita c ió n c o n s u lfa to d e a m o n io ta m b ié n e s tá n d is p o n ib le s d e p e n d ie n d o d e l a n t ic u e rp o q u e s e h a d e re c u p e ra r . E n lo s c a s o s e n lo s q u e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n c o m p re n d e u n d o m in io C H 3 , la re s in a B a k e rb o n d A B X (J .T . B a k e r, P h ill ip s b u rg , N J ) e s ú til p a ra la p u r if ic a c ió n .
L a c ro m a to g ra f ía d e a f in id a d e s u n a té c n ic a d e p u r if ic a c ió n p re fe r id a . L a m a tr iz a la q u e e s tá f i ja d o e l lig a n d o d e a f in id a d s u e le s e r a g a ro s a , p e ro h a y o tra s m a tr ic e s d is p o n ib le s . M a tr ic e s m e c á n ic a m e n te e s ta b le s , ta le s c o m o el v id r io d e p o ro s c o n tro la d o o e l p o li (e s t ire n d iv in i l) b e n c e n o , p e rm ite n c a u d a le s m á s rá p id o s y t ie m p o s d e p ro c e s a m ie n to m á s c o r to s q u e lo s q u e se p u e d e n lo g ra r c o n a g a ro s a .
A d e m á s , la in v e n c ió n p ro p o rc io n a u n a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a q u e c o m p re n d e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n o u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o p ro d u c id a d e a c u e rd o co n e l p ro c e d im ie n to d e la in v e n c ió n . S e p re f ie re p a ra la c o m p o s ic ió n fa rm a c é u t ic a d e la in v e n c ió n q u e la h o m o g e n e id a d d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s e a > 80 % , m á s p re fe r ib le m e n te > 81 % ,> 82 % , > 83 % , > 84 % o > 85 % , m á s p re fe r ib le m e n te > 86 % , > 87 % , > 88 % , > 89 % o > 90 % , a ú n m á s p re fe r ib le m e n te > 91 % , > 92 % , > 93 % , > 94 % o > 95 % y lo m á s p re fe r ib le m e n te > 96 % , > 97 % , > 98 % o > 99 % .
T a l c o m o s e u t iliz a e n e s ta m e m o r ia , la e x p re s ió n " c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a " se re f ie re a u n a c o m p o s ic ió n q u e es a d e c u a d a p a ra la a d m in is tra c ió n a un p a c ie n te , p re fe r ib le m e n te un p a c ie n te h u m a n o . L a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a p a r t ic u la rm e n te p re fe r id a d e e s ta in v e n c ió n c o m p re n d e u n a o u n a p lu ra lid a d d e la o la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s d e la in v e n c ió n , p re fe r ib le m e n te en u n a c a n t id a d te ra p é u t ic a m e n te e f ic a z . P re fe r ib le m e n te , la c o m p o s ic ió n fa rm a c é u t ic a c o m p re n d e , a d e m á s , fo rm u la c io n e s a d e c u a d a s d e u n o o m á s s o p o r te s , e s ta b il iz a d o re s , e x c ip ie n te s , d ilu y e n te s , s o lu b il iz a n te s , te n s io a c t iv o s , e m u ls io n a n te s , c o n s e rv a n te s y /o a d y u v a n te s ( fa rm a c é u t ic a m e n te e f ic a c e s ). C o n s t itu y e n te s a c e p ta b le s d e la c o m p o s ic ió n s o n p re fe r ib le m e n te n o tó x ic o s p a ra lo s re c e p to re s a la s d o s if ic a c io n e s y c o n c e n tra c io n e s e m p le a d a s . L a s c o m p o s ic io n e s fa rm a c é u tic a s d e la in v e n c ió n in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a c o m p o s ic io n e s líq u id a s , c o n g e la d a s y l io f iliz a d a s .
L a s c o m p o s ic io n e s d e la in v e n c ió n p u e d e n c o m p re n d e r un s o p o r te fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le . E n g e n e ra l, ta l c o m o s e u t iliz a e n e s ta m e m o r ia , " s o p o r te fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le " s ig n if ic a to d a s y c a d a u n a d e la s s o lu c io n e s a c u o s a s y n o a c u o s a s , s o lu c io n e s e s té r ile s , d is o lv e n te s , ta m p o n e s , p. e j., s o lu c ió n s a lin a ta m p o n a d a c o n fo s fa to (P B S ), a g u a , s u s p e n s io n e s , e m u ls io n e s , ta le s c o m o e m u ls io n e s d e a c e ite /a g u a , d iv e rs o s t ip o s d e a g e n te s h u m e c ta n te s , l ip o s o m a s , m e d io s d e d is p e rs ió n y re c u b r im ie n to s , q u e so n c o m p a t ib le s c o n la a d m in is t ra c ió n fa rm a c é u tic a , en p a r t ic u la r c o n la a d m in is tra c ió n p a re n te ra l. E l u so d e m e d io s y a g e n te s d e e s te t ip o e n c o m p o s ic io n e s fa rm a c é u tic a s e s b ie n c o n o c id o e n la té c n ic a , y la s c o m p o s ic io n e s q u e c o m p re n d e n s o p o r te s d e e s te t ip o s e p u e d e n fo rm u la r m e d ia n te m é to d o s c o n v e n c io n a le s b ie n c o n o c id o s .
D e te rm in a d a s re a liz a c io n e s p ro p o rc io n a n c o m p o s ic io n e s fa rm a c é u t ic a s q u e c o m p re n d e n la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n y, a d e m á s , u n o o m á s e x c ip ie n te s , ta le s c o m o lo s d e s c r ito s i lu s tra t iv a m e n te e n e s ta s e c c ió n y e n o tra s p a rte s d e e s ta m e m o r ia . L o s e x c ip ie n te s s e p u e d e n u t il iz a r e n la in v e n c ió n a e s te re s p e c to p a ra u n a a m p lia d iv e rs id a d d e p ro p ó s ito s , ta le s c o m o a ju s ta r la s p ro p ie d a d e s f ís ic a s , q u ím ic a s o b io ló g ic a s d e la s fo rm u la c io n e s , ta le s c o m o el a ju s te d e la v is c o s id a d , y /o lo s p ro c e d im ie n to s d e la in v e n c ió n p a ra m e jo ra r la e fe c t iv id a d y /o e s ta b il iz a r fo rm u la c io n e s d e e s te t ip o y p ro c e d im ie n to s c o n tra la d e g ra d a c ió n y e l d e te r io ro d e b id o , p o r e je m p lo , a la s te n s io n e s q u e s e p ro d u c e n d u ra n te la fa b r ic a c ió n , e l t ra n s p o r te , e l a lm a c e n a m ie n to , la p re p a ra c ió n p re v ia a l u so , la a d m in is t ra c ió n y p o s te r io rm e n te .
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , la c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a p u e d e c o n te n e r m a te r ia le s d e fo rm u la c ió n c o n el p ro p ó s ito d e m o d if ic a r , m a n te n e r o p re s e rv a r , p. ej., e l pH , la o s m o la r id a d , v is c o s id a d , c la r id a d , e l c o lo r, la is o to n ic id a d , e l o lo r, la e s te r il id a d , e s ta b il id a d , v e lo c id a d d e d is o lu c ió n o lib e ra c ió n , a d s o rc ió n o p e n e tra c ió n d e la c o m p o s ic ió n (v é a s e R E M IN G T O N 'S P H A R M A C E U T IC A L S C IE N C E S , 18 a E d ic ió n , (A .R . G e n rm o , e d .), 1990 , M a c k P u b lis h in g C o m p a n y ) . E n re a liz a c io n e s d e e s te t ip o , m a te r ia le s d e fo rm u la c ió n a d e c u a d o s p u e d e n in c lu ir , p e ro n o s e lim ita n a:
• a m in o á c id o s , ta le s c o m o g lic in a , a la n in a , g lu ta m in a , a s p a ra g in a , t re o n in a , p ro lin a , 2 - fe n ila la n in a , in c lu y e n d o a m in o á c id o s c a rg a d o s , p re fe r ib le m e n te lis in a , a c e ta to d e lis in a , a rg in in a , g lu ta m a to y /o h is t id in a
• a g e n te s a n t im ic ro b ia n o s , ta le s c o m o a g e n te s a n t ib a c te r ia n o s y a n t ifú n g ic o s
• a n t io x id a n te s , ta le s c o m o á c id o a s c ó rb ic o , m e tio n in a , s u lf ito d e s o d io o h id ró g e n o -s u lf ito d e s o d io ;
• ta m p o n e s , s is te m a s ta m p ó n y a g e n te s ta m p o n a d o re s q u e se u t iliz a n p a ra m a n te n e r la c o m p o s ic ió n a pH f is io ló g ic o o a un pH l ig e ra m e n te m á s b a jo , t íp ic a m e n te d e n tro d e un in te rv a lo d e pH d e a p ro x im a d a m e n te 5 a a p ro x im a d a m e n te 8 o 9; e je m p lo s d e ta m p o n e s s o n b o ra to , b ic a rb o n a to , T r is -H C l, c itra to s , fo s fa to s u o tro s á c id o s o rg á n ic o s , s u c c in a to , fo s fa to , h is t id in a y a c e ta to ; p o r e je m p lo , ta m p ó n T r is d e a p ro x im a d a m e n te pH 7 ,0 -8 ,5 , o ta m p ó n a c e ta to d e a p ro x im a d a m e n te pH 4 ,0 -5 ,5 ;
d is o lv e n te s no a c u o s o s , ta le s c o m o p ro p ile n g lic o l, p o lie t i le n g lic o l, a c e ite s v e g e ta le s , ta le s c o m o a c e ite de o liv a y é s te re s o rg á n ic o s in y e c ta b le s , ta le s c o m o o le a to d e e tilo ;
s o p o r te s a c u o s o s , in c lu y e n d o a g u a , s o lu c io n e s , e m u ls io n e s o s u s p e n s io n e s a lc o h ó lic a s /a c u o s a s , in c lu y e n d o m e d io s s a lin o s y ta m p o n a d o s ;
p o lím e ro s b io d e g ra d a b le s , ta le s c o m o p o lié s te re s ;
a g e n te s c o n fe r id o re s d e c o n s is te n c ia , ta le s c o m o m a n ito l o g lic in a ;
a g e n te s q u e la n te s , ta le s c o m o á c id o e t i le n d ia m in o te t ra a c é t ic o (E D T A );
a g e n te s is o tó n ic o s y re ta rd a d o re s d e la a b s o rc ió n ;
a g e n te s c o m p le ja n te s , ta le s c o m o c a fe ín a , p o liv in ilp ir ro lid o n a , b e ta -c ic lo d e x tr in a o h id ro x ip ro p il-b e ta -c ic lo d e x tr in a ) ;
c a rg a s ;
m o n o s a c á r id o s ; d is a c á r id o s ; y o tro s h id ra to s d e c a rb o n o ( ta le s c o m o g lu c o s a , m a n o s a o d e x tr in a s ) ; los h id ra to s d e c a rb o n o p u e d e n s e r a z ú c a re s n o re d u c to re s , p re fe r ib le m e n te tre h a lo s a , s a c a ro s a , o c ta s u lfa to , s o rb ito l o x ilito l;
p ro te ín a s (d e b a jo p e s o m o le c u la r ) , p o lip é p tid o s o s o p o r te s p ro te ic o s , ta le s c o m o a lb ú m in a d e s u e ro h u m a n o o b o v in o , g e la t in a o in m u n o g lo b u lin a s , p re fe r ib le m e n te d e o r ig e n h u m a n o ;
a g e n te s c o lo ra n te s y a ro m a tiz a n te s ;
a g e n te s re d u c to re s q u e c o n t ie n e n a z u fre , ta le s c o m o g lu ta tió n , á c id o t ió c t ic o , t io g lic o la to d e s o d io , t io g lic e ro l, [a lfa ] -m o n o t io g lic e ro l y t io s u lfa to d e s o d io ;
a g e n te s d ilu y e n te s ;
a g e n te s e m u ls io n a n te s ;
p o lím e ro s h id ro f í l ic o s ( ta le s c o m o p o liv in ilp ir ro lid o n a ) ;
c o n tra io n e s fo rm a d o re s d e s a le s , ta l c o m o s o d io ;
c o n s e rv a n te s , ta le s c o m o a g e n te s a n t im ic ro b ia n o s , a n t io x id a n te s , a g e n te s q u e la n te s , g a s e s in e r te s y s im ila re s ; e je m p lo s so n : c lo ru ro d e b e n z a lc o n io , á c id o b e n z o ic o , á c id o s a lic í l ic o , t im e ro s a l, a lc o h o l fe n e tí l ic o , m e t ilp a ra b e n o , p ro p ilp a ra b e n o , c lo rh e x id in a , á c id o s ó rb ic o o p e ró x id o d e h id ró g e n o );
c o m p le jo s m e tá lic o s , ta le s c o m o c o m p le jo s d e Z n -p ro te ín a ;
d is o lv e n te s y c o -d is o lv e n te s ( ta le s c o m o g lic e ro l, p ro p ile n g lic o l o p o lie t i le n g lic o l) ;
a z ú c a re s y a lc o h o le s d e a z ú c a r, ta le s c o m o tre h a lo s a , s a c a ro s a , o c ta s u lfa to , m a n ito l, s o rb ito l o x ilito l e s ta q u io s a , m a n o s a , s o rb o s a , x ilo s a , r ib o s a , m io in is ito s a , g a la c to s a , la c t ito l, r ib ito l, m io in is ito l, g a la c t ito l, g lic e ro l, c ic lito le s (p. e j., in o s ito l) , p o lie t i le n g lic o l; y a lc o h o le s d e a z ú c a r p o lih íd r ic o s ;
a g e n te s d e s u s p e n s ió n ;
te n s io a c t iv o s o a g e n te s h u m e c ta n te s , ta le s c o m o p lu ro n ic s , P E G , é s te re s d e s o rb itá n , p o lis o rb a to s , ta le s c o m o p o lis o rb a to 20 , p o lis o rb a to , t r itó n , t ro m e ta m in a , le c it in a , c o le s te ro l, t i lo x a p a l; lo s te n s io a c t iv o s p u e d e n s e r d e te rg e n te s , p re fe r ib le m e n te c o n un p e s o m o le c u la r d e > 1 ,2 K D y /o un p o lié te r, p re fe r ib le m e n te co n un p e s o m o le c u la r d e > 3 K D ; e je m p lo s n o l im ita n te s d e d e te rg e n te s p re fe r id o s so n T w e e n 20 , T w e e n 40 , T w e e n 60 , T w e e n 80 y T w e e n 85 ; e je m p lo s n o l im ita n te s d e p o lié te re s p re fe r id o s s o n P E G 3000 , P E G 3350 , P E G 4000 y P E G 5000 ;
a g e n te s p o te n c ia d o re s d e la e s ta b il id a d , ta le s c o m o s a c a ro s a o s o rb ito l;
a g e n te s p o te n c ia d o re s d e la to n ic id a d , ta le s c o m o h a lu ro s d e m e ta le s a lc a lin o s , p re fe r ib le m e n te c lo ru ro d e s o d io o p o ta s io , m a n ito l, s o rb ito l;
v e h íc u lo s d e s u m in is tro p a re n te ra l, in c lu y e n d o s o lu c ió n d e c lo ru ro d e s o d io , d e x tro s a d e R in g e r, d e x tro s a y c lo ru ro s ó d ic o , la c ta to d e R in g e r o a c e ite s f ijo s ;
v e h íc u lo s d e s u m in is tro in tra v e n o s o q u e in c lu y e n re p o n e d o re s d e f lu id o s y n u tr ie n te s , re p o n e d o re s d e e le c tro lito s ( ta le s c o m o lo s q u e s e b a s a n e n d e x tro s a d e R in g e r) .
U n a re a liz a c ió n p ro p o rc io n a la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n o la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o p ro d u c id a d e a c u e rd o c o n e l p ro c e d im ie n to d e la in v e n c ió n p a ra u so e n la p re v e n c ió n o e l t ra ta m ie n to d e u n a e n fe rm e d a d c a n c e ro s a h e m a to ló g ic a o d e u n a e n fe rm e d a d c a n c e ro s a m e ta s tá s ic a .
L a s fo rm u la c io n e s d e s c r ita s e n e s ta m e m o r ia so n ú t ile s c o m o c o m p o s ic io n e s fa rm a c é u tic a s e n e l t ra ta m ie n to , la m e jo r ía y /o p re v e n c ió n d e la a fe c c ió n m é d ic a p a to ló g ic a ta l c o m o s e d e s c r ib e e n e s ta m e m o r ia e n un p a c ie n te q u e lo n e c e s ite . E l té rm in o " tra ta m ie n to " se re f ie re ta n to a l t ra ta m ie n to te ra p é u t ic o c o m o a la s m e d id a s p ro f ilá c t ic a s o p re v e n t iv a s . T ra ta m ie n to in c lu y e la a p lic a c ió n o a d m in is tra c ió n d e la fo rm u la c ió n a l c u e rp o , un te j id o a is la d o o u n a c é lu la d e un p a c ie n te q u e t ie n e u n a e n fe rm e d a d /tra s to rn o , un s ín to m a d e u n a e n fe rm e d a d / t ra s to rn o o u n a p re d is p o s ic ió n a u n a e n fe rm e d a d /tra s to rn o , c o n e l p ro p ó s ito d e c u ra r , s a n a r, a liv ia r , m it ig a r , a lte ra r , re m e d ia r , p a lia r, m e jo ra r o a fe c ta r la e n fe rm e d a d , e l s ín to m a d e la e n fe rm e d a d o la p re d is p o s ic ió n a la e n fe rm e d a d .
E l té rm in o "m e jo ra " , ta l c o m o s e u t iliz a e n e s ta m e m o r ia , s e re f ie re a c u a lq u ie r m e jo ra d e l e s ta d o p a to ló g ic o d e un p a c ie n te q u e t ie n e un tu m o r o c á n c e r o un c á n c e r m e ta s tá s ic o ta l c o m o s e e s p e c if ic a m á s a d e la n te e n e s ta m e m o r ia , m e d ia n te la a d m in is t ra c ió n d e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o c o n la in v e n c ió n a u n s u je to q u e lo n e c e s ite . U n a m e jo ra d e e s te t ip o ta m b ié n p u e d e v e rs e c o m o u n a ra le n t iz a c ió n o d e te n c ió n d e la p ro g re s ió n d e l tu m o r o c á n c e r o c á n c e r m e ta s tá s ic o d e l p a c ie n te . E l té rm in o "p re v e n c ió n " , ta l c o m o se u t iliz a en e s ta m e m o r ia , s ig n if ic a e v ita r la a p a r ic ió n o re a p a r ic ió n d e un p a c ie n te q u e t ie n e un tu m o r o c á n c e r o un c á n c e r m e ta s tá s ic o c o m o s e e s p e c if ic a m á s a d e la n te e n e s ta m e m o r ia , m e d ia n te la a d m in is tra c ió n d e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o co n la in v e n c ió n a un s u je to en n e c e s id a d d e la m is m a .
E l té rm in o "e n fe rm e d a d " s e re f ie re a c u a lq u ie r a fe c c ió n q u e s e b e n e f ic ia r ía d e l t ra ta m ie n to c o n la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o o la c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a d e s c r ita en e s ta m e m o r ia . E s to in c lu y e t ra s to rn o s o e n fe rm e d a d e s c ró n ic o s y a g u d o s , in c lu y e n d o a q u e lla s a fe c c io n e s p a to ló g ic a s q u e p re d is p o n e n a l m a m ífe ro a la e n fe rm e d a d e n c u e s tió n .
U n a "n e o p la s ia " e s un c re c im ie n to a n o rm a l d e te j id o q u e , p o r lo g e n e ra l, p e ro no s ie m p re , fo rm a u n a m a s a . C u a n d o ta m b ié n fo rm a u n a m a s a , s e la a lu d e c o m ú n m e n te c o m o un " tu m o r" . L a s n e o p la s ia s o tu m o re s p u e d e n s e r b e n ig n o s , p o te n c ia lm e n te m a lig n o s (p re c a n c e ro s o s ) o m a lig n o s . L a s n e o p la s ia s m a lig n a s s e d e n o m in a n c o m ú n m e n te c á n c e r. P o r lo g e n e ra l, in v a d e n y d e s tru y e n e l te jid o c ir c u n d a n te y p u e d e n fo rm a r m e tá s ta s is , e s d e c ir , s e d is e m in a n a o tra s p a rte s , te jid o s u ó rg a n o s d e l c u e rp o . P o r lo ta n to , la e x p re s ió n " c á n c e r m e ta s tá s ic o " a b a rc a m e tá s ta s is a o tro s te jid o s u ó rg a n o s d is t in to s d e l tu m o r o r ig in a l. L o s lin fo m a s y la s le u c e m ia s s o n n e o p la s ia s lin fo id e s . P a ra lo s f in e s d e la p re s e n te in v e n c ió n , ta m b ié n e s tá n a b a rc a d o s p o r lo s té rm in o s " tu m o r" o "c á n c e r " .
E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a d e la in v e n c ió n , la e n fe rm e d a d c a n c e ro s a h e m a to ló g ic a e s A M L y la e n fe rm e d a d c a n c e ro s a m e ta s tá s ic a se p u e d e d e r iv a r d e la a n te r io r .
E n fe rm e d a d e s tu m o ra le s o c a n c e ro s a s p re fe r id a s e n re la c ió n c o n e s ta in v e n c ió n s e s e le c c io n a n d e un g ru p o q u e c o n s is te en c á n c e r d e m a m a , c a rc in o id e , c á n c e r c e rv ic a l, c á n c e r c o lo r re c ta l, c á n c e r e n d o m e tr ia l, c á n c e r g á s tr ic o , c á n c e r d e c a b e z a y c u e llo , m e s o te lio m a , c á n c e r d e h íg a d o , c á n c e r d e p u lm ó n , c á n c e r d e o v a r io , c á n c e r d e p á n c re a s , c á n c e r d e p ró s ta ta , c á n c e r d e p ie l, c á n c e r re n a l y c á n c e r d e e s tó m a g o . M á s p re fe r ib le m e n te , la e n fe rm e d a d tu m o ra l o c a n c e ro s a , q u e e s p re fe r ib le m e n te u n a e n fe rm e d a d d e u n tu m o r s ó lid o , s e p u e d e s e le c c io n a r d e l g ru p o q u e c o n s is te e n c á n c e r d e o v a r io , c á n c e r d e p á n c re a s , m e s o te lio m a , c á n c e r d e p u lm ó n , c á n c e r g á s tr ic o y c á n c e r d e m a m a tr ip le n e g a tiv o . L a e n fe rm e d a d d e l c á n c e r m e ta s tá s ic o s e p u e d e d e r iv a r d e c u a lq u ie ra d e lo s a n te r io re s .
L a s e x p re s io n e s " s u je to q u e lo n e c e s ita " o "q u e n e c e s ita t ra ta m ie n to " in c lu y e n a q u e llo s q u e y a p a d e c e n e l t ra s to rn o , a s í c o m o a q u e llo s e n lo s q u e se d e b e p re v e n ir e l t ra s to rn o . E l s u je to n e c e s ita d o o "p a c ie n te " in c lu y e s u je to s h u m a n o s y o tro s m a m ífe ro s q u e re c ib e n t ra ta m ie n to p ro f ilá c t ic o o te ra p é u t ic o .
L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la in v e n c ió n se d is e ñ a rá g e n e ra lm e n te p a ra v ía s y m é to d o s d e a d m in is tra c ió n e s p e c íf ic o s , p a ra d o s if ic a c io n e s y f re c u e n c ia s d e a d m in is tra c ió n e s p e c íf ic a s , p a ra t ra ta m ie n to s e s p e c íf ic o s d e e n fe rm e d a d e s e s p e c íf ic a s , c o n in te rv a lo s d e b io d is p o n ib il id a d y p e rs is te n c ia , e n tre o tra s c o s a s . L o s m a te r ia le s d e la c o m p o s ic ió n s e fo rm u la n p re fe r ib le m e n te e n c o n c e n tra c io n e s q u e s o n a c e p ta b le s p a ra e l lu g a r d e a d m in is tra c ió n .
P o r lo ta n to , la s fo rm u la c io n e s y c o m p o s ic io n e s p u e d e n d is e ñ a rs e d e a c u e rd o c o n la in v e n c ió n p a ra s u m in is tro m e d ia n te c u a lq u ie r v ía d e a d m in is tra c ió n a d e c u a d a . En e l c o n te x to d e la p re s e n te in v e n c ió n , la s v ía s d e a d m in is tra c ió n in c lu y e n , p e ro no se lim ita n a
• v ía s tó p ic a s ( ta le s c o m o e p ic u tá n e a , in h a la to r ia , n a s a l, o ftá lm ic a , a u r ic u la r /a u ra l, v a g in a l, m u c o s a l) ;
• v ía s e n te ra le s ( ta le s c o m o o ra l, g a s tro in te s t in a l, s u b lin g u a l, s u b la b ia l, b u c a l, re c ta l) ; y
• v ía s p a re n te ra le s ( ta le s c o m o in tra v e n o s a , in tra a r te r ia l, in tra ó s e a , in tra m u s c u la r , in tra c e re b ra l, in tra c e re b ro v e n tr ic u la r , e p id u ra l, in tra te c a l, s u b c u tá n e a , in tra p e r ito n e a l, e x tra -a m n ió t ic a , in tra a r t ic u la r , in tra c a rd ía c a , in tra d é rm ic a , in tra le s io n a l, in tra u te r in a , in tra v e s ic a l, in tra v ítre a , tra n s d é rm ic a , in tra c o s a l, in tra s in o v ia l, in tra lu m in a l) .
L a s c o m p o s ic io n e s fa rm a c é u t ic a s y la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e e s ta in v e n c ió n so n p a r t ic u la rm e n te ú t ile s p a ra la a d m in is t ra c ió n p a re n te ra l, p. e j., s u m in is tro s u b c u tá n e o o in tra v e n o s o , p o r e je m p lo , m e d ia n te in y e c c ió n , ta l c o m o U n a c a n t id a d te ra p é u t ic a m e n te e f ic a z d e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n p re fe r ib le m e n te d a c o m o re s u lta d o u n a d is m in u c ió n d e la g ra v e d a d d e lo s s ín to m a s d e la e n fe rm e d a d , un a u m e n to d e la f re c u e n c ia o d u ra c ió n d e lo s p e r ío d o s s in s ín to m a s d e la e n fe rm e d a d o u n a p re v e n c ió n d e l d e te r io ro o d is c a p a c id a d d e b id o s a la a f l ic c ió n d e la e n fe rm e d a d . P a ra e l t ra ta m ie n to d e tu m o re s q u e e x p re s a n F L T 3 , u n a c a n tid a d te ra p é u t ic a m e n te e f ic a z d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n , p. e j., u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o a n t i-F L T 3 /a n t i-C D 3 , in h ib e p re fe r ib le m e n te e l c re c im ie n to c e lu la r o e l c re c im ie n to d e l tu m o r en a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te un 20 % , a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te un 40 % , a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te un 50 % , a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te un 60 % , a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te u n 70 % , a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te un 80 % o a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te un 90 % c o n re la c ió n a lo s p a c ie n te s n o t ra ta d o s . L a c a p a c id a d d e un c o m p u e s to d e in h ib ir e l c re c im ie n to d e l tu m o r p u e d e e v a lu a rs e e n un m o d e lo a n im a l p re d ic t iv o d e la e f ic a c ia en tu m o re s h u m a n o s .
L a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a s e p u e d e a d m in is t r a r c o m o un ú n ic o a g e n te te ra p é u t ic o o e n c o m b in a c ió n c o n te ra p ia s a d ic io n a le s ta le s c o m o te ra p ia s c o n tra e l c á n c e r s e g ú n s e a n e c e s a r io , p. e j., o tro s fá rm a c o s p ro te ic o s y n o p ro te ic o s . E s to s fá rm a c o s p u e d e n a d m in is tra rs e s im u ltá n e a m e n te co n la c o m p o s ic ió n q u e c o m p re n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n c o m o s e d e fin e e n e s ta m e m o r ia o p o r s e p a ra d o a n te s o d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n d e d ic h a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o e n in te rv a lo s y d o s is d e f in id o s o p o r tu n a m e n te .
L a e x p re s ió n "d o s is e f ic a z y n o tó x ic a " , ta l c o m o s e u t iliz a en e s ta m e m o r ia , s e re f ie re a u n a d o s is to le ra b le d e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n q u e e s lo s u f ic ie n te m e n te a lta c o m o p a ra p ro v o c a r e l a g o ta m ie n to d e las c é lu la s p a to ló g ic a s , la e lim in a c ió n d e l tu m o r , la re d u c c ió n d e l tu m o r o la e s ta b il iz a c ió n d e la e n fe rm e d a d s in o e s e n c ia lm e n te s in e fe c to s tó x ic o s im p o r ta n te s . D o s is e f ic a c e s y n o tó x ic a s d e e s te t ip o p u e d e n d e te rm in a rs e , p. e j., m e d ia n te e s tu d io s d e a u m e n to d e la d o s is d e s c r ito s en la té c n ic a y d e b e n e s ta r p o r d e b a jo d e la d o s is q u e in d u c e e fe c to s s e c u n d a r io s a d v e rs o s g ra v e s ( to x ic id a d lim ita n te d e la d o s is , D L T ).
E l té rm in o " to x ic id a d " , ta l c o m o s e u t iliz a en e s ta m e m o r ia , s e re f ie re a los e fe c to s tó x ic o s d e un fá rm a c o q u e se m a n if ie s ta n e n e v e n to s a d v e rs o s o e v e n to s a d v e rs o s g ra v e s . E s to s e v e n to s s e c u n d a r io s p u e d e n re fe r irs e a u n a fa lta d e to le ra b il id a d d e l fá rm a c o e n g e n e ra l y /o u n a a u s e n c ia d e to le ra n c ia lo c a l d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n . L a to x ic id a d ta m b ié n p o d ría in c lu ir e fe c to s te ra to g é n ic o s o c a n c e r íg e n o s p ro v o c a d o s p o r e l fá rm a c o .
E l té rm in o "s e g u r id a d " , la e x p re s ió n "s e g u r id a d in v ivo" o e l té rm in o " to le ra b il id a d " , ta l c o m o s e u t iliz a e n e s ta m e m o r ia d e f in e la a d m in is tra c ió n d e un fá rm a c o s in in d u c ir e v e n to s a d v e rs o s g ra v e s d ire c ta m e n te d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n ( to le ra n c ia lo c a l) y d u ra n te un p e r ío d o m á s la rg o d e a p lic a c ió n d e l fá rm a c o . "S e g u r id a d " , " s e g u r id a d in v ivo " o " to le ra b il id a d " p u e d e n e v a lu a rs e , p. e j., a in te rv a lo s re g u la re s d u ra n te e l t ra ta m ie n to y e l p e r ío d o d e s e g u im ie n to . L a s m e d ic io n e s in c lu y e n e v a lu a c ió n c lín ic a , p. e j., m a n ife s ta c io n e s o rg á n ic a s y ra s tre o d e a n o m a lía s d e la b o ra to r io . S e p u e d e l le v a r a c a b o u n a e v a lu a c ió n c lín ic a y d e s v ia c io n e s d e los h a lla z g o s n o rm a le s s e p u e d e n re g is t ra r /c o d if ic a r d e a c u e rd o c o n lo s e s tá n d a re s N C I-C T C y /o M e d D R A . L a s m a n ife s ta c io n e s d e ó rg a n o s p u e d e n in c lu ir c r ite r io s ta le s c o m o a le rg ia / in m u n o lo g ía , s a n g re /m é d u la ó s e a , a r r itm ia c a rd ía c a , c o a g u la c ió n y s im ila re s , c o m o s e re c o g e , p. e j., en lo s C r ite r io s d e T e rm in o lo g ía C o m ú n p a ra e v e n to s a d v e rs o s v 3.0 (C T C A E ).
P a rá m e tro s d e la b o ra to r io q u e p u e d e n te s ta rs e in c lu y e n , p o r e je m p lo , h e m a to lo g ía , q u ím ic a c lín ic a , p e rf il d e c o a g u la c ió n y a n á lis is d e o r in a y e x a m e n d e o tro s f lu id o s c o rp o ra le s , ta le s c o m o s u e ro , p la s m a , líq u id o lin fo id e o c e fa lo r ra q u íd e o , líq u id o y s im ila re s . P o r lo ta n to , la s e g u r id a d p u e d e e v a lu a rs e , p. e j., m e d ia n te e x a m e n fís ic o , té c n ic a s d e fo rm a c ió n d e im á g e n e s (e s d e c ir , u ltra s o n id o s , ra y o s X , to m o g ra fía s c o m p u ta r iz a d a s , fo rm a c ió n d e Im á g e n e s p o r R e s o n a n c ia M a g n é t ic a (M R I) , o tra s m e d id a s c o n d is p o s it iv o s té c n ic o s (e s d e c ir , e le c tro c a rd io g ra m a ) , s ig n o s v ita le s , m id ie n d o p a rá m e tro s d e la b o ra to r io y re g is tra n d o e fe c to s a d v e rs o s . P o r e je m p lo , e v e n to s a d v e rs o s e n p r im a te s no c h im p a n c é s e n lo s u s o s y m é to d o s d e a c u e rd o co n la in v e n c ió n p u e d e n e x a m in a rs e m e d ia n te m é to d o s h is to p a to ló g ic o s y /o h is to q u ím ic o s .
A lo s té rm in o s y e x p re s io n e s d e a r r ib a ta m b ié n s e le s a lu d e , p. ej., e n la e v a lu a c ió n p re c lín ic a d e la s e g u r id a d d e p ro d u c to s fa rm a c é u tic o s d e r iv a d o s d e la b io te c n o lo g ía S 6 ; D ire c tr iz T r ip a r t i ta A rm o n iz a d a d e la IC H ; R e u n ió n d e l C o m ité D ire c t iv o d e la IC H e l 16 d e ju l io d e 1997.
E n u n a re a liz a c ió n a d ic io n a l, la in v e n c ió n p ro p o rc io n a un k it q u e c o m p re n d e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s d e la in v e n c ió n , u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s p ro d u c id a d e a c u e rd o c o n e l p ro c e d im ie n to d e la in v e n c ió n , un p o lip é p tid o d e la in v e n c ió n , un v e c to r d e la in v e n c ió n y /o u n a c é lu la h u é s p e d d e la in v e n c ió n .
E n e l c o n te x to d e la p re s e n te in v e n c ió n , e l té rm in o " k i t ' s ig n if ic a d o s o m á s c o m p o n e n te s - u n o d e los c u a le s c o r re s p o n d e a la c o n s tru c c ió n d e l a n t ic u e rp o , la c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a , e l v e c to r o la c é lu la h u é s p e d d e la in v e n c ió n - e m p a q u e ta d o s ju n to s e n un e n v a s e , re c ip ie n te o d e o tro m o d o . P o r lo ta n to , u n k it p u e d e d e s c r ib irs e c o m o un c o n ju n to d e p ro d u c to s y /o u te n s il io s q u e so n s u f ic ie n te s p a ra lo g ra r un d e te rm in a d o o b je t iv o , q u e p u e d e n c o m e rc ia liz a rs e c o m o u n a s o la u n id a d .
E l k it p u e d e c o m p re n d e r u n o o m á s re c ip ie n te s ( ta le s c o m o v ia le s , a m p o lla s , e n v a s e s , je r in g a s , b o te lla s , b o ls a s ) de c u a lq u ie r fo rm a , ta m a ñ o y m a te r ia l a p ro p ia d o s (p re fe r ib le m e n te im p e rm e a b le a l a g u a , p. ej. p lá s t ic o o v id r io ) q u e c o n t ie n e n la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o o la c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a d e la p re s e n te in v e n c ió n e n u n a d o s if ic a c ió n a p ro p ia d a p a ra la a d m in is t ra c ió n (v é a s e a rr ib a ) . E l k it p u e d e c o n te n e r a d ic io n a lm e n te in s tru c c io n e s d e u so (p. ej., en fo rm a d e un fo lle to o m a n u a l d e in s tru c c io n e s ) , m e d io s p a ra a d m in is t r a r la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la p re s e n te in v e n c ió n , ta l c o m o u n a je r in g a , b o m b a , in fu s o r o s im ila re s , m e d io s p a ra re c o n s t itu ir la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n y /o m e d io s p a ra d i lu ir la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n .
L a in v e n c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a k its p a ra u n a u n id a d d e a d m in is tra c ió n d e d o s is ú n ic a . E l k it d e la in v e n c ió n ta m b ié n p u e d e c o n te n e r un p r im e r re c e p to r q u e c o m p re n d e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s e c a / lio f i l iz a d a y un s e g u n d o re c e p to r q u e c o m p re n d e u n a fo rm u la c ió n a c u o s a . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s d e e s ta in v e n c ió n , s e p ro p o rc io n a n k its q u e c o n t ie n e n je r in g a s p re c a rg a d a s d e u n a s o la c á m a ra y d e m ú lt ip le s c á m a ra s (p. ej. je r in g a s líq u id a s y l io je r in g a s ) .
Las Figuras muestran:
Figura 1:
(a ) E s tru c tu ra e s q u e m á t ic a d e la p ro te ín a F L T 3 m o n o m é r ic a y (b ) e s t ru c tu ra c r is ta l in a d e l h o m o d ím e ro F L T 3 q u e in te ra c tú a co n h o m o d ím e ro F L T 3 L G .
Figura 2:
E s tru c tu ra e s q u e m á t ic a d e m o lé c u la s q u im é r ic a s F L T 3 d e s e r h u m a n o /ra tó n u t iliz a d a s p a ra la c a ra c te r iz a c ió n d e l a g lu t in a n te d e la a g ru p a c ió n d e e p íto p o s .
Figura 3:
E s tru c tu ra e s q u e m á tic a d e la s c o n s tru c c io n e s F L T 3 tru n c a d a s u t il iz a d a s p a ra la c a ra c te r iz a c ió n d e l a g lu t in a n te d e la a g ru p a c ió n d e e p íto p o s .
Figura 4:
E n s a y o p a ra a n a liz a r la c o m p e te n c ia d e l a g lu t in a n te d e F L T 3 d e la in v e n c ió n c o n e l l ig a n d o d e F L T 3 p a ra la u n ió n d e F L T 3. S e in c u b a ro n c é lu la s C H O -F L T 3 h u m a n a s c o n o s in 10 m g /m l d e lig a n d o d e F L T 3 d u ra n te 30 m in (s in e ta p a d e la v a d o ). S e a ñ a d ie ro n p re p a ra c io n e s p e r ip lá s m ic a s d e s c F v y se in c u b a ro n d u ra n te 30 m in . L a d e te c c ió n se re a liz ó u t i l iz a n d o a n t i-F L A G d e ra tó n a n t i- ra tó n d e c a b ra c o n ju g a d o co n P E y la m e d ia n a d e f lu o re s c e n c ia d e te c ta d a p o r F A C S (m e d ia n a (+ lig a n d o ) / m e d ia n a (s in lig a n d o ) * 100 % ).
Figura 5:
A n á lis is d e u n ió n F A C S d e c o n s tru c c io n e s d e c a d e n a s e n c il la b ie s p e c íf ic a s e s p e c íf ic a s p a ra e s p e c ie s c ru z a d a s d e s ig n a d a s a c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s co n la F L T 3 h u m a n a , lín e a d e c é lu la s T C D 3 h u m a n a s H P B a L L , c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s co n F L T 3 d e c y n o m o lg u s y u n a lín e a d e c é lu la s T C D 3 d e m a c a c o L n P x 4119. La lín e a ro ja re p re s e n ta c é lu la s in c u b a d a s c o n 2 p g /m l d e p ro te ín a m o n o m é r ic a p u r if ic a d a q u e s e in c u b a n p o s te r io rm e n te co n el a n t ic u e rp o a n t i- I2 C d e ra tó n y e l a n t ic u e rp o d e d e te c c ió n Ig G a n t i- ra tó n d e c a b ra m a rc a d a c o n P e . L a lín e a n e g ra de l h is to g ra m a re f le ja e l c o n tro l n e g a tiv o : c é lu la s in c u b a d a s ú n ic a m e n te c o n e l a n t ic u e rp o a n ti- I2 C , a s í c o m o e l a n t ic u e rp o d e d e te c c ió n m a rc a d o c o n P E (v é a s e e l e je m p lo 6).
Figura 6:
A c t iv id a d c ito tó x ic a in d u c id a p o r c o n s tru c c io n e s d e c a d e n a s e n c il la e s p e c íf ic a s p a ra e s p e c ie s c ru z a d a s d e s ig n a d a s re d ir ig id a s a P B M C s h u m a n a s n o e s t im u la d a s , a g o ta d a s en C D 56 , c o m o c é lu la s e fe c to ra s y c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s c o n F L T 3 h u m a n a c o m o c é lu la s d ia n a . (E je m p lo 9).
Figura 7:
U n ió n d e re a c c ió n c ru z a d a a C D 3 , F L T 3 y s u s is o fo rm a s ). 5 p g /m l d e p ro te ín a B iT E : 4 °C 60 m in ; 2 p g /m l d e A b a n ti-I2 C 3 E 5.A 5 : 4 °C 30 m in ; a n t i- ra tó n -P E d e c a b ra 1 :100 : 4 °C 30 m in .
Figura 8:
S in u n ió n a P a rá lo g o s y C H O n o tra n s fe c ta d o s . 5 p g /m l d e p ro te ín a B iT E : 4 °C 60 m in ; 2 p g /m l d e A b a n t i- I2 C 3 E 5.A 5 : 4 °C 30 m in ; a n t i- ra tó n -P E d e c a b ra 1 :100 : 4 °C 30 m in .
Figura 9:
M a p e o d e a g ru p a c io n e s d e e p íto p o s - A g ru p a c ió n E1
Figura 10:
L a s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s F L T 3 s c F c s o n a c t iv a s u t i l iz a n d o P B M C h u m a n a s n o e s t im u la d a s c o n tra c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s c o n F L T 3 h u m a n a en a u s e n c ia y p re s e n c ia d e F L T 3 L G ( l ig a n d o d e F L T 3 ).
Ejemplos:
L o s s ig u ie n te s E je m p lo s ilu s tra n la in v e n c ió n . E s to s E je m p lo s n o d e b e n in te rp re ta rs e c o m o l im ita n te s d e l a lc a n c e d e e s ta in v e n c ió n . L a p re s e n te in v e n c ió n e s tá lim ita d a ú n ic a m e n te p o r la s re iv in d ic a c io n e s .
Ejemplo 1
Generación de células CHO que expresan FLT3 de tipo salvaje y quimérica
E l a n tíg e n o d e F L T 3 s e p u e d e s u b d iv id ir e n s e is d ife re n te s s u b -d o m in io s o re g io n e s q u e se d e fin e n , a lo s e fe c to s d e lo s E je m p lo s 1 y 2. L a s e c u e n c ia d e a a d e e s o s c in c o s u b -d o m in io s s e m u e s tra e n S E Q ID N O s : 814 -818.
S e g e n e ra ro n la s s ig u ie n te s m o lé c u la s ; v é a s e ta m b ié n la F ig u ra 1:
• hu Isp V 5 x F lt3 -E 1 m u x E p C -p E F D H F R S E Q ID N O : 827
• hu Isp V 5 x F lt3 -E 2 m u x E p C -p E F D H F R S E Q ID N O : 828
• hu Isp V 5 x F lt3 -E 3 m u x E p C -p E F D H F R S E Q ID N O : 829
• hu Isp V 5 x F lt3 -E 3 A m u x E p C -p E F D H F R S E Q ID N O : 830
• hu Isp V 5 x F lt3 -E 3 B m u x E p C -p E F D H F R S E Q ID N O : 831
• hu Isp V 5 x F lt3 -E 4 m u x E p C -p E F D H F R S E Q ID N O : 832
• hu Isp V 5 x F lt3 -E 5 m u x E p C -p E F D H F R S E Q ID N O : 833
• hu Isp V 5 x F lt3 -E 6 m u x E p C -p E F D H F R S E Q ID N O : 834
• E D C m u r in a d e hu Isp F L T 3 - c o m p le ta
• E D C h u m a n a d e hu Isp F L T 3 - c o m p le ta
• F L T 3 h u m a n a d e lo n g itu d c o m p le ta S E Q ID N O : 801
• F L T 3 d e c in o d e lo n g itu d c o m p le ta S E Q ID N O : 802
P a ra la g e n e ra c ió n d e c é lu la s C H O /H E K q u e e x p re s a n e l D o m in io E x tra C e lu la r (E C D ) d e F L T 3 h u m a n o , m u r in o y q u im é r ic o , la s re s p e c t iv a s s e c u e n c ia s c o d if ic a n te s p a ra F L T 3 h u m a n a , F L T 3 m u r in a y la s o c h o v e rs io n e s d e F L T 3 h u m a n a /m u r in a q u im é r ic a s (v é a s e a r r ib a ) s e c lo n a ro n e n un p lá s m id o d e s ig n a d o p E F -D H F R (p E F -D H F R s e d e s c r ib e e n R a u m e t a l. C a n c e r Im m u n o l Im m u n o th e r 50 (2001 ) 141 -150 ). P a ra la e x p re s ió n e n la s u p e r f ic ie c e lu la r d e F L T 3 h u m a n a y m u r in a se u t iliz ó e l p é p tid o s e ñ a l o r ig in a l. T o d o s lo s p ro c e s o s d e c lo n a c ió n se lle v a ro n a c a b o d e a c u e rd o c o n p ro to c o lo s e s tá n d a re s (S a m b ro o k , M o le c u la r C lo n in g ; A L a b o ra to ry M a n u a l, 3 a e d ic ió n , C o ld S p r in g H a rb o r L a b o ra to ry P re s s , C o ld S p r in g H a rb o r, N u e v a Y o rk (2001 )) . P a ra c a d a u n a d e la s c o n s tru c c io n e s s e tra n s fe c tó un p lá s m id o c o r re s p o n d ie n te e n c é lu la s C H O d e f ic ie n te s e n D H F R p a ra la e x p re s ió n e u c a r ió t ic a , ta l c o m o d e s c r ib e p o r K a u fm a n R .J . (1990 ) M e th o d s E n z y m o l. 185 , 537 -566.
L a e x p re s ió n d e F L T 3 h u m a n a , q u im é r ic a y m u r in a e n c é lu la s C H O s e v e r i f ic ó e n un e n s a y o F A C S .
Ejemplo 2
Mapeo de epítopos de construcciones de anticuerpo anti-FLT3
C é lu la s t r a n s fe c ta d a s c o n F L T 3 h u m a n a m u r in a y c o n la s m o lé c u la s d e F L T 3 h u m a n a tru n c a d a s (v é a s e e l E je m p lo 1) s e t iñ e ro n c o n e x tra c to p e r ip lá s m ic o b ru to y s in d i lu ir q u e c o n te n ía c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s F L T 3 x C D 3 b ie s p e c íf ic o s (c o n e l d o m in io d e u n ió n a C D 3 d e n o m in a d o I2 C ) c o n d e n s a d o a u n a a lb ú m in a h u m a n a (v a r ia n te 1), en P B S /F C S a l 1 ,5 % . L a s m o lé c u la s u n id a s s e d e te c ta ro n c o n un a n t ic u e rp o d e d o m in io d e u n ió n a n t i-C D 3 m o n o c lo n a l d e ra tó n in te rn o (50 p l) s e g u id o d e u n a Ig G a n t i- ra tó n F c -g a m m a -P E (1 :100 , 50 pl; J a c k s o n Im m u n o re s e a rc h n ° 115 ­ 116 -071 ). T o d o s los a n t ic u e rp o s s e d i lu y e ro n e n P B S /F C S a l 1 ,5 % . C o m o c o n tro l n e g a tiv o , la s c é lu la s s e in c u b a ro n c o n P B S /F C S a l 2 % en lu g a r d e l e x tra c to p e r ip lá s m ic o . L a s m u e s tra s s e m id ie ro n m e d ia n te c ito m e tr ía d e flu jo . L a s re g io n e s q u e fu e ro n re c o n o c id a s p o r lo s re s p e c t iv o s d o m in io s d e u n ió n d e F L T 3 s e in d ic a n e n la ta b la d e s e c u e n c ia s (T a b la 2 ). La p é rd id a d e la s e ñ a l F A C S e n la s c o n s tru c c io n e s d e F L T 3 q u im é r ic a s re s p e c t iv a s q u e c o m p re n d e n la a g ru p a c ió n d e l e p íto p o m u r in o se le y ó p a ra la re le v a n c ia d e la a g ru p a c ió n re s p e c t iv a p a ra la u n ió n . L o s re s u lta d o s re s p e c t iv o s e n la ta b la 2 e s tá n e n lín e a c o n lo s re s u lta d o s d e a c u e rd o co n e l E je m p lo 3.
Ejemplo 3
Generación de células CHO que expresan FLT3 de tipo salvaje y truncada
E l d o m in io e x t ra c e lu la r d e l a n t íg e n o d e F L T 3 s e p u e d e s u b d iv id ir e n d ife re n te s s u b -d o m in io s o re g io n e s , re s p e c t iv a m e n te a g ru p a c io n e s d e e p íto p o s E1 a E 6 q u e s e d e fin e n , p o r la s s ig u ie n te s p o s ic io n e s d e a m in o á c id o s : E1 a a 27 -79 S E Q ID N O : 819
E 2 D1 a a 79 -167 S E Q ID N O : 820
E 3 D 2 a a 168 -244 S E Q ID N O : 821
E 3 A D 2 A a a 168 -206 S E Q ID N O : 822
E 3 B D 2 B a a 207 -244 S E Q ID N O : 823
E 4 D 3 a a 245 -345 S E Q ID N O : 824
E 5 D 4 a a 346 -434 S E Q ID N O : 825
E 6 D 5 a a 435 -543 S E Q ID N O : 826
P a ra la c o n s tru c c ió n d e la s m o lé c u la s F L T 3 tru n c a d a s u t il iz a d a s p a ra e l m a p e o d e e p íto p o s (v é a s e la f ig u ra 3), las s e c u e n c ia s d e la s re s p e c t iv a s s ie te re g io n e s h u m a n a s , a s í c o m o la s c in c o c o m b in a c io n e s d e d o s re g io n e s h u m a n a s v e c in a s (v é a s e a r r ib a ) fu e ro n re e m p la z a d a s p o r la s re g io n e s c o r re s p o n d ie n te s d e F L T 3 m u r in a . A d e m á s , s e c o n d e n s ó u n a e t iq u e ta V 5 (G K P IP N P L L G L D S T ) a t ra v é s d e un e n la z a d o r "G G G G S " a l e x tre m o C d e la s m o lé c u la s q u im é r ic a s . L a s s e c u e n c ia s d e m o lé c u la s q u im é r ic a s f in a le s s e m u e s tra n e n S E Q ID N O s : 827 -834. A d e m á s , s e c o n s tru y e ro n F L T 3 h u m a n a d e lo n g itu d c o m p le ta (S E Q ID N O : 801 ) y F L T 3 d e c y n o d e lo n g itu d c o m p le ta (S E Q ID N O : 802 ), a m b a s c o n u n a e t iq u e ta V 5 (G K P IP N P L L G L D S T ) c o n d e n s a d a a t ra v é s d e un e n la z a d o r "G G G G S " a su e x tre m o C.
P a ra la g e n e ra c ió n d e c é lu la s C H O d h fr q u e e x p re s a n la s c o n s tru c c io n e s a n te r io re s , la s s e c u e n c ia s c o d if ic a n te s re s p e c t iv a s fu e ro n c lo n a d a s e n un p lá s m id o d e s ig n a d o p E F -D H F R (p E F -D H F R s e d e s c r ib e en R a u m e t a l. C a n c e r Im m u n o l Im m u n o th e r 50 (2001 ) 141 -150 ). T a m b ié n s e g e n e ra ro n c é lu la s C H O tra n s fe c ta d a s c o n F L T 3 h u m a n a , p e ro s in la e t iq u e ta V 5. T o d o s lo s p ro c e d im ie n to s d e c lo n a c ió n s e lle v a ro n a c a b o d e a c u e rd o c o n lo s p ro to c o lo s e s tá n d a r (S a m b ro o k , M o le c u la r C lo n in g ; A L a b o ra to ry M a n u a l, 3 a e d ic ió n , C o ld S p r in g H a rb o r L a b o ra to ry P re s s , C o ld S p r in g H a rb o r , N u e v a Y o rk (2001 ) ) . P a ra c a d a u n a d e la s c o n s tru c c io n e s , un c o r re s p o n d ie n te p lá s m id o s e t ra n s fe c tó en c é lu la s C H O d e f ic ie n te s e n D H F R p a ra la e x p re s ió n e u c a r ió t ic a , c o m o s e d e s c r ib e p o r K a u fm a n R .J . (1990 ) M e th o d s E n z y m o l. 185 , 537 -566. L a e x p re s ió n d e la s c o n s tru c c io n e s e n la s c é lu la s C H O se v e r i f ic ó u t i l iz a n d o un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l Ig G 2 a a n t i-v 5 ta g d e ra tó n (1 p g /m l; A b D S e ro te c , n ° M C A 1360 ). E l a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l u n id o fu e d e te c ta d o c o n un Ig G F c -g a m m a -P E a n t i- ra tó n . C o m o c o n tro l n e g a tiv o , la s c é lu la s s e in c u b a ro n c o n a n t ic u e rp o d e c o n tro l d e is o t ip o en lu g a r d e l p r im e r a n t ic u e rp o . L a s m u e s tra s s e m id ie ro n p o r c ito m e tr ía d e flu jo .
L o s re s u lta d o s d e e s te a n á lis is se m u e s tra n p a ra e l a g lu t in a n te d e F L T 3 d e s c r ito e n la T a b la 2. E s o s re s u lta d o s e s tá n e n c o n s o n a n c ia co n e l a n á lis is d e m a p e o d e e p íto p o s d e a c u e rd o c o n e l E je m p lo 2.
T a b la 2: M a p e o d e l e p íto p o
Figure imgf000052_0001
Ejemplo 4
Determinación basada en Biacore de la afinidad de los anticuerpos por FLT3 humana y de cynomolgus L o s e x p e r im e n to s d e a n á lis is d e B ia c o re se re a liz a ro n u t il iz a n d o p ro te ín a s d e fu s ió n F L T 3 -E C D re c o m b in a n te s h u m a n a s /d e c y n o c o n a lb ú m in a p a ra d e te rm in a r la u n ió n a la d ia n a d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s .
E n d e ta lle , c h ip s s e n s o re s C M 5 (G E H e a lth c a re ) s e in m o v iliz a ro n c o n a p ro x im a d a m e n te 600 -800 R U d e l re s p e c t iv o a n tíg e n o re c o m b in a n te u t i l iz a n d o ta m p ó n a c e ta to pH 4 ,5 d e a c u e rd o c o n e l m a n u a l d e l fa b r ic a n te . L a s m u e s tra s de c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 s e c a rg a ro n e n u n a s e r ie d e d ilu c io n e s d e la s s ig u ie n te s c o n c e n tra c io n e s : 50 nM , 25 nM , 12 ,5 nM , 6 ,25 nM y 3 ,13 nM d ilu id o s e n ta m p ó n d e d e s a rro llo H B S -E P (G E H e a lth c a re ) . E l c a u d a l fu e d e 30 p l/m in d u ra n te 3 m in , lu e g o s e a p lic ó ta m p ó n d e d e s a rro llo H B S E P d u ra n te 8 m in a 20 m in n u e v a m e n te a un c a u d a l d e 30 p l/m l. S e re a liz ó la re g e n e ra c ió n d e l c h ip u t i l iz a n d o u n a s o lu c ió n d e g lic in a 10 m M , N a C l 10 m M , pH 1 ,5. L o s c o n ju n to s d e d a to s s e a n a liz a ro n u t il iz a n d o e l s o f tw a re B ia E v a l. E n g e n e ra l s e re a liz a ro n d o s e x p e r im e n to s in d e p e n d ie n te s . A d e m á s , la u n ió n d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s a C D 3 h u m a n a y C D 3 d e m a c a c o s e c o n f irm ó e n un e n s a y o d e B ia c o re .
Ejemplo 5
Análisis basado en Scatchard de la afinidad de la construcción de anticuerpos biespecíficos FLT3xCD3 por FLT3 humana y de macaco en células positivas para el antígeno diana y determinación de la brecha de afinidad entre especies
L a s a f in id a d e s d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 c o n la s c é lu la s C H O tra n s fe c ta d a s co n F L T 3 h u m a n a o d e m a c a c o ta m b ié n s e d e te rm in a ro n m e d ia n te a n á lis is d e S c a tc h a rd c o m o e l m é to d o m á s f ia b le p a ra m e d ir lo s p o s ib le s h u e c o s d e a f in id a d e n tre F L T 3 h u m a n a y d e m a c a c o . P a ra e l a n á lis is d e S c a tc h a rd , s e re a liz a n e x p e r im e n to s d e u n ió n p o r s a tu ra c ió n u t il iz a n d o un s is te m a d e d e te c c ió n m o n o v a le n te p a ra d e te rm in a r c o n p re c is ió n la u n ió n m o n o v a le n te d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 a la lín e a c e lu la r re s p e c tiv a .
2 x 104 c é lu la s d e la lín e a c e lu la r re s p e c t iv a ( lín e a c e lu la r C H O q u e e x p re s a d e fo rm a re c o m b in a n te F L T 3 h u m a n a , la lín e a c e lu la r C H O q u e e x p re s a n d e fo rm a re c o m b in a n te F L T 3 d e m a c a c o ) s e in c u b a ro n c a d a u n a c o n 50 p l d e u n a s e r ie d e d ilu c ió n tr ip le te (d o c e d ilu c io n e s a ra z ó n d e 1 :2 ) d e la re s p e c t iv a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o F L T 3 x C D 3 (h a s ta q u e s e a lc a n z a la s a tu ra c ió n ) c o m e n z a n d o a 10 -20 nM , s e g u id o d e 16 h d e in c u b a c ió n a 4 °C b a jo a g ita c ió n y u n a e ta p a d e la v a d o re s id u a l. L u e g o , la s c é lu la s s e in c u b a ro n d u ra n te o tra h o ra c o n 30 p l d e u n a s o lu c ió n d e c o n ju g a d o C D 3 x A L E X A 488. D e s p u é s d e u n a e ta p a d e la v a d o , la s c é lu la s s e re s u s p e n d ie ro n en 150 p l d e ta m p ó n F A C S q u e c o n te n ía fo rm a ld e h íd o a l 3 ,5 % , s e in c u b a ro n d u ra n te 15 m in a d ic io n a le s , se c e n tr ifu g a ro n , se re s u s p e n d ie ro n en ta m p ó n F A C S y s e a n a liz a ro n u t il iz a n d o u n a m á q u in a F A C S C a n to ll y e l s o f tw a re F A C S D iva . L o s d a to s s e g e n e ra ro n a p a r t ir d e d o s c o n ju n to s in d e p e n d ie n te s d e e x p e r im e n to s , c a d a u n o d e lo s c u a le s u t iliz ó tr ip l ic a d o s . S e c a lc u ló e l a n á lis is d e S c a tc h a rd re s p e c t iv o p a ra e x tra p o la r la u n ió n m á x im a (B m á x ). S e d e te rm in a ro n las c o n c e n tra c io n e s d e c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 a la u n ió n s e m i-m á x im a re f le ja n d o las re s p e c t iv a s K d s . L o s v a lo re s d e las m e d ic io n e s p o r t r ip l ic a d o s e re p re s e n ta ro n c o m o c u rv a s h ip e rb ó lic a s y c o m o c u rv a s e n fo rm a d e S p a ra d e m o s tra r lo s in te rv a lo s d e c o n c e n tra c io n e s a d e c u a d o s d e s d e la u n ió n m ín im a h a s ta la ó p tim a .
Ejemplo 6
Unión biespecífica y reactividad cruzada entre especies
P a ra la c o n f irm a c ió n d e la u n ió n a F L T 3 y C D 3 h u m a n a s y a F L T 3 y C D 3 d e c y n o , s e te s ta ro n la s c o n s tru c c io n e s de a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s d e la in v e n c ió n m e d ia n te c ito m e tr ía d e f lu jo u t i l iz a n d o
• c é lu la s C H O tra n s fe c ta d a s co n F L T 3 h u m a n a (S E Q ID N O : 801 ) c o n is o fo rm a s d e F L T 3 h u m a n a ( is o fo rm a F L T 3 h u m a n a (T 227 M ), v é a s e S E Q ID N O : 803 e is o fo rm a F L T 3 -IT D h u m a n a , v é a s e S E Q ID N O : 804 ) y co n F L T 3 d e m a c a c o (S E Q ID N O : 802 ), re s p e c t iv a m e n te ,
• la s lín e a s c e lu la re s E O L -1 , M O L M -13 y M V 4 -11 d e A M L h u m a n a s F L T 3 p o s it iv a s (p e ro ta m b ié n so n c o n c e b ib le s o tra s lín e a s c e lu la re s h u m a n a s F L T 3 p o s it iv a s ) , •
• lín e a c e lu la r d e le u c e m ia d e c é lu la s T h u m a n a s q u e e x p re s a n C D 3 H P B -a ll (D S M Z , B ra u n s c h w e ig , A C C 483 ) , y
• lín e a d e c é lu la s T q u e e x p re s a n C D 3 d e c y n o m o lg u s L n P x 4119
P a ra la c ito m e tr ía d e f lu jo , se in c u b a ro n 200.000 c é lu la s d e la s lín e a s c e lu la re s re s p e c t iv a s d u ra n te 60 m in a 4 °C co n 50 p l d e c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o p u r if ic a d o a u n a c o n c e n tra c ió n d e 5 p g /m l. L a s c é lu la s se la v a ro n d o s v e c e s e n P B S /F C S a l 2 % y lu e g o s e in c u b a ro n c o n un a n t ic u e rp o d e ra tó n in te rn o (2 p g /m l) e s p e c íf ic o p a ra la p a rte d e u n ió n a C D 3 d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s d u ra n te 30 m in a 4 °C . D e s p u é s d e l la v a d o , se d e te c ta ro n a n t ic u e rp o s d e ra tó n u n id o s co n un F c y -P E a n t i- ra tó n d e c a b ra (1 :100 ) d u ra n te 30 m in a 4 °C . L a s m u e s tra s s e m id ie ro n m e d ia n te c ito m e tr ía d e f lu jo . S e u t il iz a ro n c é lu la s C H O n o tra n s fe c ta d a s c o m o c o n tro l n e g a tiv o .
T a b la 3a : A f in id a d e s d e d o m in io s d e u n ió n d e F L T 3
Figure imgf000054_0001
T a b la 3b : A f in id a d e s d e d o m in io s d e u n ió n d e C D 3
Figure imgf000054_0002
Figure imgf000054_0003
Ejemplo 7
Confirmación de la ausencia de unión a parálogos humanos
L o s p a rá lo g o s F L T 3 h u m a n o s K IT v1 (S E Q ID N O : 805 ), C S F 1 R v1 (S E Q ID N O : 806 ), P D G F R A (S E Q ID N O : 807 ), y N T M v 3 (S E Q ID N O : 808 ) s e t ra n s fe c ta ro n d e fo rm a e s ta b le e n c é lu la s C H O . L a s s e c u e n c ia s d e lo s p a rá lo g o s c o m o s e u t iliz a n e n e l p re s e n te E je m p lo se id e n t if ic a n e n e l lis ta d o d e s e c u e n c ia s .
T a b la 4 a : Id e n tid a d d e lo s p a rá lo g o s c o n F L T 3 a lo la rg o d e la lo n g itu d c o m p le ta d e la s e c u e n c ia d e p ro te ín a
Figure imgf000055_0002
T a b la 4 b : Id e n tid a d d e lo s p a rá lo g o s c o n F L T 3 a lo la rg o d e l E C D d e la s e c u e n c ia d e p ro te ín a
Figure imgf000055_0003
L a e x p re s ió n d e p ro te ín a s s e c o n f irm ó e n a n á lis is F A C S c o n a n t ic u e rp o s e s p e c íf ic o s . E l e n s a y o d e c ito m e tr ía d e f lu jo s e lle v ó a c a b o c o m o s e d e s c r ib e en e l E je m p lo 6.
Ejemplo 7
Identidad con la línea germinal humana
C o n e l f in d e a n a liz a r la id e n t id a d /s im ilitu d d e la s e c u e n c ia d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s c o n lo s g e n e s d e la lín e a g e rm in a l d e l a n t ic u e rp o h u m a n o , los d o m in io s d e u n ió n d e F L T 3 s e a lin e a ro n c o m o s ig u e : s e a lin e ó la V L c o m p le ta , in c lu y e n d o to d a s la s C D R s ; s e a lin e ó la V H c o m p le ta , in c lu y e n d o la s C D R s 1 y 2, p e ro e x c e p to q u e la C D R 3 s e a lin e ó c o n tra lo s g e n e s d e la lín e a g e rm in a l d e a n t ic u e rp o s h u m a n o s (V b a s e ). S e p u e d e n e n c o n tra r m á s d e ta l le s e n la m e m o r ia d e s c r ip t iv a d e e s ta s o lic itu d .
Ejemplo 9
Actividad citotóxica
L a p o te n c ia d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 d e la in v e n c ió n p a ra re d ir ig ir la s c é lu la s T e fe c to ra s c o n tra la s c é lu la s d ia n a q u e e x p re s a n F L T 3 se a n a liz ó e n c in c o e n s a y o s d e c ito to x ic id a d in vitro:
• S e m id ió la p o te n c ia d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 p a ra re d ir ig ir c é lu la s T e fe c to ra s c D 8 h u m a n a s e s t im u la d a s c o n tra c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s co n F L T 3 h u m a n a s e n un e n s a y o d e lib e ra c ió n d e c ro m o 51 d e 18 h o ra s .
• S e m id ió la p o te n c ia d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 p a ra re d ir ig ir c é lu la s T e fe c to ra s C D 8 h u m a n a s e s t im u la d a s c o n tra la s lín e a s c e lu la re s E O L -1 , M O L M -13 y M V 4 -11 d e A M L h u m a n a s p o s it iv a s p a ra F L T 3 (p e ro ta m b ié n s o n c o n c e b ib le s o tra s lín e a s c e lu la re s h u m a n a s p o s it iv a s p a ra F L T 3 ) e n un e n s a y o d e lib e ra c ió n d e c ro m o 51 d e 18 h o ra s .
• S e m id ió la p o te n c ia d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 p a ra re d ir ig ir la s c é lu la s T e n P B M C h u m a n a s n o e s t im u la d a s c o n tra c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s c o n F L T 3 h u m a n a s e n un e n s a y o d e c ito to x ic id a d b a s a d o e n F A C S d e 48 h o ra s .
C é lu la s e fe c to ra s : P B M C (C D 14 - /C D 56 - ) h u m a n a n o e s t im u la d a . C é lu la s d ia n a : E O L -1. R e la c ió n c é lu la e fe c to ra a d ia n a (E :T ): 10 :1. P ro te ín a B ite c o m o s e in d ic a
Figure imgf000055_0001
C é lu la s e fe c to ra s : P B M C (C D 14 - /C D 56 - ) h u m a n a n o e s t im u la d a . C é lu la s d ia n a : M V 4 -11. R e la c ió n c é lu la e fe c to ra a d ia n a (E :T ) : 10 -1. P ro te ín a B ite c o m o s e in d ic a
Figure imgf000056_0001
S e m id ió la p o te n c ia d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 p a ra re d ir ig ir la s c é lu la s T e n P B M C h u m a n a s n o e s t im u la d a s c o n tra la s lín e a s c e lu la re s E O L -1 , M O L M -13 y M V 4 -11 d e A M L h u m a n a s p o s it iv a s p a ra F L T 3 (p e ro ta m b ié n s o n c o n c e b ib le s o tra s lín e a s c e lu la re s h u m a n a s p o s it iv a s p a ra F L T 3 ) e n un e n s a y o d e c ito to x ic id a d b a s a d o e n F A C S d e 48 h o ra s .
P a ra c o n f irm a r q u e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s D L L 3 x C D 3 d e re a c c ió n c ru z a d a so n c a p a c e s d e re d ir ig ir las c é lu la s T d e m a c a c o c o n tra la s c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s c o n D L L 3 d e m a c a c o , se re a liz ó un e n s a y o d e c ito to x ic id a d b a s a d o en F A C S d e 48 h o ra s c o n u n a lín e a d e c é lu la s T d e m a c a c o c o m o c é lu la s T e fe c to ra s .
C é lu la s e fe c to ra s : P B M C (C D 14 - /C D 56 - ) h u m a n a n o e s t im u la d a . C é lu la s d ia n a : c é lu la s C H O tra n s fe c ta d a s c o n m a c F L T 3. R e la c ió n c é lu la e fe c to ra a d ia n a (E :T ) : 10 :1. P ro te ín a B ite c o m o s e in d ic a
Figure imgf000056_0002
S e m id ió la p o te n c ia d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 p a ra re d ir ig ir la s c é lu la s T e n c é lu la s C H O tra n s fe c ta d a s c o n F L T 3 e n P B M C h u m a n a s n o e s t im u la d a s e n a u s e n c ia y p re s e n c ia d e lig a n d o d e F L T 3 e n un e n s a y o d e c ito to x ic id a d b a s a d o e n F A C S d e 48 h o ra s . C é lu la s e fe c to ra s : P B M C (C D 14 - /C D 56 - ) h u m a n a n o e s t im u la d a . C é lu la s d ia n a : c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s c o n hu F L T 3. R e la c ió n c é lu la e fe c to ra a d ia n a (E :T ): 10 :1. P ro te ín a B ite c o m o se in d ic a
Figure imgf000056_0003
E je m p lo 10.1
E n s a y o d e l ib e r a c ió n d e c r o m o c o n c é lu la s T h u m a n a s e s t im u la d a s
Se obtuvieron células T estimuladas enriquecidas con células T CD8+ como se describe en lo que sigue. Se revistió una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) con un anticuerpo específico anti-CD3 disponible comercialmente (OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 pg/ml durante 1 hora a 37°C. La proteína no unida se eliminó mediante una etapa de lavado con PBS. 3 - 5 x107 PBMC humana se añadieron a la placa de Petri recubierta previamente en 120 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10% / IL-220 U/ml (Proleukin®, Chiron) y se estimularon durante 2 días. Al tercer día, las células se recogieron y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 hasta una concentración final de 20 U/ml y las células se cultivaron de nuevo durante un día en el mismo medio de cultivo celular que antes. Los linfocitos T CD8+ citotóxicos (CTLs) se enriquecieron mediante el agotamiento de las células T CD4+ y las células NK CD56+ utilizando Dynal-Beads de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las células diana CHO transfectadas con FLT3 de cyno o FLT3 humana se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 30 *541Cr en un volumen final de 100 pl de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente, las células diana marcadas se lavaron 3 veces con 5 ml de RPMI y luego se utilizaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 200 pl de RPMI complementado con una relación E:T de 10:1. Se utilizó una concentración inicial de 0,01 - 1 pg/ml de construcción de anticuerpo biespecífico purificado y diluciones triples de la misma. El tiempo de incubación del ensayo fue de 18 horas. La citotoxicidad se determinó como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante con relación a la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las mediciones se realizaron por cuadriplicado. La medición de la actividad de cromo en los sobrenadantes se realizó en un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los resultados se llevó a cabo con Prism 5 para Windows (versión 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.). Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis a partir de las curvas de respuesta a la dosis sigmoidea se utilizaron para comparar la actividad citotóxica.
E je m p lo 10.2
P o te n c ia d e r e d i r ig i r c é lu la s T e fe c to r a s h u m a n a s e s t im u la d a s c o n t r a c é lu la s C H O t r a n s fe c ta d a s c o n F L T 3 h u m a n a
La actividad citotóxica de las construcciones de anticuerpos biespecíficos FLT3xCD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 (51Cr) utilizando células c H o transfectadas con FLT3 humana como células diana, y células T CD8+ humanas estimuladas como células efectoras. El experimento se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 10.1.
E je m p lo 10.3
P o te n c ia d e r e d i r ig i r c é lu la s T e fe c to r a s h u m a n a s e s t im u la d a s c o n t r a u n a lín e a c e lu la r d e F L T 3 p o s i t iv a
La actividad citotóxica de construcciones de anticuerpos biespecíficos FLT3xCD3 se analizó en un ensayo de citotoxicidad de liberación de cromo 51 (51Cr) utilizando las líneas celulares EOL-1, MOLM-13 y MV4-11 de AML humanas positivas para FLT3 como fuente de células diana y células T CD8+ humanas estimuladas como células efectoras. El ensayo se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 10.1.
E je m p lo 10.4
E n s a y o d e c i t o t o x ic id a d b a s a d o e n F A C S c o n P B M C h u m a n a s n o e s t im u la d a s
A is la m ie n t o d e c é lu la s e fe c to r a s
Se prepararon células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) humana mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll a partir de preparaciones de linfocitos enriquecidos (capas leucocitarias), un producto secundario de los bancos de sangre que recogen sangre para transfusiones. Las capas leucocitarias fueron suministradas por un banco de sangre local y las PBMC se prepararon el mismo día de la extracción de sangre. Después de la centrifugación de densidad Ficoll y extensos lavados con PBS de Dulbecco (Gibco), los eritrocitos restantes se eliminaron de las PBMC por medio de incubación con tampón de lisis de eritrocitos ( n H 4CI 155 mM, KHCO3 10 mM, EDTA 100 mM). Las plaquetas se eliminaron mediante el sobrenadante tras la centrifugación de PBMC a 100 x g. Los linfocitos restantes abarcan principalmente linfocitos B y T, células NK y monocitos. PBMC se mantuvieron en cultivo a 37°C/5% de CO2 en medio R p MI (Gibco) con FCS al 10% (Gibco).
A g o t a m ie n t o d e c é lu la s C D 14 y C D 56
P a ra e l a g o ta m ie n to d e c é lu la s C D 14 , se u t il iz a ro n m ic ro p e r la s C D 14 h u m a n a s (M ilte n y B io te c , M A C S , n° 130 -050 ­ 201 ), p a ra e l a g o ta m ie n to d e m ic ro p e r la s C D 56 h u m a n a s d e c é lu la s N K (M A C S , n ° 130 -050 -401 ) . S e c o n ta ro n la s P B M C y s e c e n tr ifu g a ro n d u ra n te 10 m in a te m p e ra tu ra a m b ie n te co n 300 x g. E l s o b re n a d a n te s e d e s e c h ó y el s e d im e n to d e c é lu la s s e re s u s p e n d ió e n ta m p ó n d e a is la m ie n to M A C S [80 p L /107 c é lu la s ; P B S ( In v it ro g e n , n ° 20012 ­ 043 ), F B S a l 0 ,5 % (v /v ) (G ib c o , n ° 10270 -106 ), E D T A 2 m M (S ig m a -A ld r ic h , n ° E -6511 ) ]. S e a ñ a d ie ro n m ic ro p e r la s C D 14 y m ic ro p e r la s C D 56 (20 p L /107c é lu la s ) y se in c u b a ro n d u ra n te 15 m in a 4 - 8 °C . L a s c é lu la s s e la v a ro n co n ta m p ó n d e a is la m ie n to M A C S (1 -2 m L /107 c é lu la s ) . D e s p u é s d e la c e n tr ifu g a c ió n (v é a s e a rr ib a ) , e l s o b re n a d a n te se d e s e c h ó y la s c é lu la s s e re s u s p e n d ie ro n e n ta m p ó n d e a is la m ie n to M A C S (500 p L /108 c é lu la s ) . A c o n tin u a c ió n , se a is la ro n c é lu la s n e g a t iv a s p a ra C D 14 /C D 56 u t il iz a n d o C o lu m n a s L S (M ilte n y i B io te c , n ° 130 -042 -401 ) . S e c u lt iv a ro n c é lu la s P B M C s in C D 14 /C D 56 e n m e d io c o m p le to R P M I, e s d e c ir , R P M I1640 (B io c h ro m a G , n ° F G 1215 ) c o m p le m e n ta d o c o n F B S a l 10 % (B io c h ro m A G , n ° S 0115 ), 1 x a m in o á c id o s n o e s e n c ia le s (B io c h ro m A G , n° K 0293 ), ta m p ó n H e p e s 10 m M (B io c h ro m A G , n° L 1613 ), p iru v a to d e s o d io 1 m M (B io c h ro m A G , n° L 0473 ) y 100 U /m L d e p e n ic i l in a /e s tre p to m ic in a (B io c h ro m A G , n° A 2213 ) a 37 °C e n u n a in c u b a d o ra h a s ta q u e s e n e c e s ite .
M a r c a je d e c é lu la s d ia n a
P a ra e l a n á lis is d e la lis is c e lu la r en e n s a y o s d e c ito m e tr ía d e f lu jo s e u t iliz ó e l c o lo ra n te d e m e m b ra n a f lu o re s c e n te D iO C 18 (D iO ) (M o le c u la r P ro b e s , n ° V 22886 ) p a ra m a rc a r c é lu la s C H O tra n s fe c ta d a s c o n F L T 3 h u m a n a o F L T 3 d e m a c a c o c o m o c é lu la s d ia n a y d is t in g u ir la s d e la s c é lu la s e fe c to ra s . B re v e m e n te , s e re c o g ie ro n la s c é lu la s , s e la v a ro n u n a v e z c o n P B S y s e a ju s tó a 106 c é lu la s /m L e n P B S q u e c o n t ie n e F B S a l 2 % (v /v ) y e l c o lo ra n te d e m e m b ra n a D iO (5 p L /106 c é lu la s ) . D e s p u é s d e la in c u b a c ió n d u ra n te 3 m in a 37 °C , la s c é lu la s s e la v a ro n d o s v e c e s e n m e d io R P M I c o m p le to y e l n ú m e ro d e c é lu la s s e a ju s tó a 1 ,25 x 105 c é lu la s /m L . L a v ita lid a d d e la s c é lu la s s e d e te rm in ó u t iliz a n d o u n a s o lu c ió n d e E o s in a G is o tó n ic a a l 0 ,5 % (v /v ) (R o th , n ° 45380 ) .
A n á l is is b a s a d o e n c i t o m e t r í a d e f lu jo
E s te e n s a y o s e d is e ñ ó p a ra c u a n t i f ic a r la lis is d e c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s c o n F L T 3 d e c y n o o h u m a n a s en p re s e n c ia d e d ilu c io n e s e n s e r ie d e c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s d e F L T 3. S e m e z c la ro n v o lú m e n e s ig u a le s d e c é lu la s d ia n a m a rc a d a s co n D iO y c é lu la s e fe c to ra s (e s d e c ir , P B M C s in c é lu la s C D 14 ), d a n d o c o m o re s u lta d o u n a re la c ió n d e c é lu la s E :T d e 10 :1. S e tra n s f ir ie ro n 160 p l d e e s ta s u s p e n s ió n a c a d a u n o d e lo s p o c il lo s d e u n a p la c a de 96 p o c illo s . S e a ñ a d ie ro n 40 p L d e d ilu c io n e s e n s e r ie d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s D L L 3 x C D 3 y un c o n tro l n e g a t iv o b ie s p e c íf ic o (u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o b a s a d o e n c D 3 q u e re c o n o c e un a n tíg e n o d ia n a ir re le v a n te ) o m e d io c o m p le to R P M I c o m o un c o n tro l n e g a t iv o a d ic io n a l. L a re a c c ió n c ito tó x ic a m e d ia d a p o r a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s p ro s ig u ió d u ra n te 48 h o ra s e n u n a in c u b a d o ra h u m id if ic a d a c o n 7 % d e C O 2. L u e g o , las c é lu la s s e t ra n s f ir ie ro n a u n a n u e v a p la c a d e 96 p o c il lo s y s e v ig iló la p é rd id a d e in te g r id a d d e la m e m b ra n a d e la c é lu la d ia n a a ñ a d ie n d o y o d u ro d e p ro p id io (P I) a u n a c o n c e n tra c ió n f in a l d e 1 p g /m L . E l PI e s un c o lo ra n te im p e rm e a b le a la m e m b ra n a q u e n o rm a lm e n te se e x c lu y e d e la s c é lu la s v ia b le s , m ie n tra s q u e la s c é lu la s m u e r ta s lo a b s o rb e n y se v u e lv e n id e n t if ic a b le s p o r e m is ió n f lu o re s c e n te .
L a s m u e s tra s s e m id ie ro n m e d ia n te c ito m e tr ía d e f lu jo e n un in s tru m e n to F A C S C a n to II y s e a n a liz a ro n c o n e l s o f tw a re F A C S D iv a (a m b o s d e B e c to n D ic k in s o n ) . L a s c é lu la s d ia n a s e id e n t if ic a ro n c o m o c é lu la s p o s it iv a s p a ra D iO . L a s c é lu la s d ia n a P I n e g a t iv a s se c la s if ic a ro n c o m o c é lu la s d ia n a v iv a s . E l p o rc e n ta je d e c ito to x ic id a d s e c a lc u ló d e a c u e rd o c o n la s ig u ie n te fó rm u la :
Citotoxicidad [%)= "céUJ'as diana muertas x10Q
"células diana
n = n ú m e ro d e e v e n to s
U til iz a n d o e l s o f tw a re G ra p h P a d P r is m 5 (G ra p h P a d S o ftw a re , S a n D ie g o ), s e re p re s e n tó g rá f ic a m e n te e l p o rc e n ta je d e c ito to x ic id a d f re n te a la s c o n c e n tra c io n e s d e c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s c o r re s p o n d ie n te s . L a s c u rv a s d e re s p u e s ta a la d o s is s e a n a liz a ro n c o n lo s c u a tro m o d e lo s d e re g re s ió n lo g ís t ic a p a ra m é tr ic a p a ra la e v a lu a c ió n d e la s c u rv a s d e re s p u e s ta a la d o s is s ig m o id e a c o n p e n d ie n te d e c o lin a f ija y se c a lc u la ro n lo s v a lo re s d e C E 50.
E je m p lo 10.5
P o te n c ia d e r e d i r ig i r P B M C h u m a n a s n o e s t im u la d a s c o n t r a c é lu la s C H O t r a n s fe c ta d a s c o n F L T 3 h u m a n a
L a a c t iv id a d c ito tó x ic a d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 se a n a liz ó e n un e n s a y o d e c ito to x ic id a d b a s a d o e n F A C S , u t i l iz a n d o c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s c o n F L T 3 h u m a n a c o m o c é lu la s d ia n a , y P B M C h u m a n a s n o e s t im u la d a s c o m o c é lu la s e fe c to ra s . E l e n s a y o s e lle v ó a c a b o ta l c o m o s e d e s c r ib e e n e l E je m p lo 8.4 a n te r io r .
E je m p lo 10.6
P o te n c ia d e r e d i r ig i r P B M C h u m a n a s n o e s t im u la d a s c o n t r a u n a lín e a c e lu la r d e c a r c in o m a d e o v a r io h u m a n o p o s i t i v a p a ra F L T 3
L a a c t iv id a d c ito tó x ic a d e c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 s e a n a liz ó a d ic io n a lm e n te e n un e n s a y o d e c ito to x ic id a d b a s a d o e n F A C S u t il iz a n d o lín e a s c e lu la re s E O L -1 , M O L M -13 y M V 4 -11 d e A M L h u m a n a s p o s it iv a s p a ra F L T 3 c o m o fu e n te d e c é lu la s d ia n a y P B M C h u m a n a s no e s t im u la d a s c o m o c é lu la s e fe c to ra s . E l e n s a y o s e lle v ó a c a b o ta l c o m o s e d e s c r ib e en e l E je m p lo 8.4 a n te r io r .
E je m p lo 10.7
P o te n c ia d e r e d i r ig i r c é lu la s T d e m a c a c o c o n t r a c é lu la s C H O q u e e x p r e s a n F L T 3 d e m a c a c o
F in a lm e n te , s e a n a liz ó la a c t iv id a d c ito tó x ic a d e c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 e n un e n s a y o d e c ito to x ic id a d b a s a d o e n F A C S , u t i l iz a n d o c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s co n F L T 3 d e m a c a c o (c y n o ) c o m o c é lu la s d ia n a , y la lín e a d e c é lu la s T d e m a c a c o 4119 L n P x (K n a p p e e t a l. B lo o d 95 :3256 -61 (2000 ) ) c o m o fu e n te d e c é lu la s e fe c to ra s . E l m a rc a je d e c é lu la s d ia n a d e c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s c o n F L T 3 d e m a c a c o y e l a n á lis is b a s a d o en c ito m e tr ía d e f lu jo d e la a c t iv id a d c ito tó x ic a s e re a liz ó c o m o s e d e s c r ib ió a rr ib a .
E je m p lo 11
C o n v e r s ió n d e m o n ó m e r o a d ím e r o d e s p u é s d e ( i) t r e s c ic lo s d e c o n g e la c ió n /d e s c o n g e la c ió n y ( i i ) 7 d ía s d e in c u b a c ió n a 250 p g /m l
L a c o n s tru c c ió n m o n o m é r ic a d e a n t ic u e rp o F L T 3 x C D 3 b ie s p e c íf ic o s e s o m e tió a d ife re n te s c o n d ic io n e s d e e s tré s s e g u id a s d e S E C d e a lto re n d im ie n to p a ra d e te rm in a r e l p o rc e n ta je d e c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o in ic ia lm e n te m o n o m é r ic o , q u e s e h a b ía c o n v e r t id o e n u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d im é r ic o .
( i) S e a ju s ta ro n 25 pg d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o m o n o m é r ic o a u n a c o n c e n tra c ió n d e 250 p g /m l co n ta m p ó n d e fo rm u la c ió n g e n é r ic o y lu e g o se c o n g e la ro n a -80 °C d u ra n te 30 m in s e g u id o d e d e s c o n g e la c ió n d u ra n te 30 m in a te m p e ra tu ra a m b ie n te . D e s p u é s d e t re s c ic lo s d e c o n g e la c ió n /d e s c o n g e la c ió n , s e d e te rm in ó e l c o n te n id o d e d ím e ro m e d ia n te H P -S E C .
( ii) S e a ju s ta ro n 25 pg d e c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o m o n o m é r ic o a u n a c o n c e n tra c ió n d e 250 p g /m l co n ta m p ó n d e fo rm u la c ió n g e n é r ic o s e g u id o d e in c u b a c ió n a 37 °C d u ra n te 7 d ía s . E l c o n te n id o d e d ím e ro s e d e te rm in ó m e d ia n te H P -S E C .
S e c o n e c tó u n a c o lu m n a S E C T S K G e l G 3000 S W X L d e a lta re s o lu c ió n (T o s o h , T o k io -J a p ó n ) a un P u r if ic a d o r Á k ta 10 F P L C (G E L ife s c ie n c e s ) e q u ip a d o c o n un m u e s tre a d o r a u to m á t ic o A 905. E l e q u ilib r io d e la c o lu m n a y e l ta m p ó n d e d e s a rro llo c o n s is t ie ro n e n K H 2 P O 4 100 m M - N a 2 S O 4 200 m M a ju s ta d o a pH 6 ,6. S e a p lic ó la s o lu c ió n d e a n t ic u e rp o (25 pg d e p ro te ín a ) a la c o lu m n a e q u ilib ra d a y s e lle v ó a c a b o la e lu c ió n a un c a u d a l d e 0 ,75 m l/m in a u n a p re s ió n m á x im a d e 7 M pa . T o d o e l c ic lo s e v ig iló a u n a a b s o rb a n c ia ó p t ic a d e 280 , 254 y 210 nm . E l a n á lis is s e re a liz ó m e d ia n te la in te g ra c ió n d e p ic o s d e la s e ñ a l d e 210 n m re g is tra d a e n la h o ja d e e v a lu a c ió n d e e je c u c ió n d e l s o f tw a re Á k ta U n ic o rn . E l c o n te n id o d e d ím e ro s e c a lc u ló d iv id ie n d o e l á re a d e l p ic o d e d ím e ro p o r e l á re a to ta l d e l p ic o d e m o n ó m e ro m á s p ic o d e d ím e ro .
E je m p lo 12
T e r m o e s ta b i l id a d
L a te m p e ra tu ra d e a g re g a c ió n d e a n t ic u e rp o s se d e te rm in ó c o m o s ig u e : 40 p l d e s o lu c ió n d e c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s a 250 p g /m l s e t ra n s f ir ie ro n a u n a c u b e ta d e un s o lo u s o y s e c o lo c a ro n e n un d is p o s it iv o W y a t t D y n a m ic L ig h t S c a tte r in g D y n a P ro N a n o s ta r (W y a tt) . L a m u e s tra s e c a lie n ta d e 40 °C a 70 °C a u n a ta s a d e c a le n ta m ie n to d e 0 ,5 ° C /m in co n a d q u is ic ió n c o n s ta n te d e l ra d io m e d id o . E l a u m e n to d e l ra d io q u e in d ic a la fu s ió n d e la p ro te ín a y la a g re g a c ió n s e u t iliz ó p o r e l p a q u e te d e s o ftw a re s u m in is tra d o co n e l d is p o s it iv o D L S p a ra c a lc u la r la te m p e ra tu ra de a g re g a c ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s .
E je m p lo 13
E s ta b i l id a d d e s p u é s d e la in c u b a c ió n d u r a n te 24 h o ra s e n p la s m a h u m a n o
C o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s p u r if ic a d o s s e in c u b a ro n e n u n a re la c ió n d e 1 :5 e n u n a a g ru p a c ió n de p la s m a h u m a n o a 37 °C d u ra n te 96 h o ra s a u n a c o n c e n tra c ió n f in a l d e 2 -20 p g /m l. D e s p u é s d e la in c u b a c ió n co n p la s m a , la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s s e c o m p a ra ro n e n un e n s a y o d e lib e ra c ió n d e c ro m o 51 c o n c é lu la s T C D 8 h u m a n a s e n r iq u e c id a s e s t im u la d a s y c é lu la s C H O tra n s fe c ta d a s co n F L T 3 h u m a n a a u n a c o n c e n tra c ió n in ic ia l d e 0 ,01 -0 ,1 | jg /m l y c o n u n a re la c ió n d e c é lu la e fe c to ra a d ia n a (E :T ) d e 10:1 (e n s a y o c o m o s e d e s c r ib e e n e l E je m p lo 8.1 ). S e in c lu y e ro n c o m o c o n tro le s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s re c ié n d e s c o n g e la d o s , n o in c u b a d o s .
E je m p lo 14
T u r b id e z a u n a c o n c e n t r a c ió n d e a n t ic u e r p o d e 2500 p g /m l
1 m l d e s o lu c ió n d e c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o p u r if ic a d a d e u n a c o n c e n tra c ió n d e 250 jg / m l s e c o n c e n tró m e d ia n te u n id a d e s d e c o n c e n tra c ió n p o r c e n tr ifu g a c ió n a 2500 jg /m l . D e s p u é s d e 16 h d e a lm a c e n a m ie n to a 5 °C , s e d e te rm in ó la tu rb id e z d e la s o lu c ió n d e a n t ic u e rp o m e d ia n te m e d ic ió n d e la a b s o rc ió n ó p t ic a a D O 340 n m f re n te a l ta m p ó n d e fo rm u la c ió n g e n é r ic o .
E je m p lo 15
H o m o g e n e id a d d e p r o te ín a s m e d ia n te c r o m a to g r a f í a d e in t e r c a m b io c a t ió n ic o d e a lta r e s o lu c ió n
L a h o m o g e n e id a d d e la s p ro te ín a s d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s d e la in v e n c ió n s e a n a liz ó m e d ia n te c ro m a to g ra f ía d e in te rc a m b io c a t ió n ic o d e a lta re s o lu c ió n C IE X .
50 j g d e m o n ó m e ro d e c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o se d ilu y e ro n c o n 50 m l d e ta m p ó n d e u n ió n A (d ih id ró g e n o - fo s fa to d e s o d io 20 m M , N a C l 30 m M , o c ta n a to d e s o d io a l 0 ,01 % , pH 5 ,5 ) y s e a p lic a ro n 40 m l d e e s ta s o lu c ió n a u n a c o lu m n a d e 1 m l d e B io P ro S P -F (Y M C , A le m a n ia ) c o n e c ta d a a un d is p o s it iv o Á k ta M ic ro F P L C (G E H e a lth c a re , A le m a n ia ) . D e s p u é s d e la u n ió n d e la m u e s tra , s e lle v ó a c a b o u n a e ta p a d e la v a d o c o n ta m p ó n d e u n ió n a d ic io n a l. P a ra la e lu c ió n d e p ro te ín a s s e a p lic ó un g ra d ie n te d e sa l c re c ie n te lin e a l u t i l iz a n d o ta m p ó n B (d ih id ró g e n o - fo s fa to d e s o d io 20 m M , N a C l 1000 m M , o c ta n a to d e s o d io a l 0 ,01 % , pH 5 ,5 ) h a s ta un 50 % d e ta m p ó n B s o b re 10 v o lú m e n e s d e c o lu m n a . T o d o e l c ic lo s e v ig iló a u n a a b s o rb a n c ia ó p t ic a d e 280 , 254 y 210 nm . E l a n á lis is s e re a liz ó m e d ia n te la in te g ra c ió n d e p ic o s d e la s e ñ a l d e 280 n m re g is tra d a e n la h o ja d e e v a lu a c ió n d e e je c u c ió n d e l s o f tw a re Á k ta U n ic o rn .
E je m p lo 16
H id r o fo b ic id a d d e la s u p e r f ic ie m e d id a p o r H IC B u t i lo
L a h id ro fo b ic id a d d e la s u p e r f ic ie d e la s c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s d e la in v e n c ió n s e te s tó en c ro m a to g ra f ía d e in te ra c c ió n h id ro fó b ic a H IC e n m o d o d e f lu jo c o n tin u o .
50 j g d e m o n ó m e ro d e c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o s e d ilu y e ro n co n ta m p ó n d e fo rm u la c ió n g e n é r ic o h a s ta un v o lu m e n f in a l d e 500 j l (á c id o c ítr ic o 10 m M , lis in a H C l 75 m M , t re h a lo s a a l 4 % , p H 7 ,0 ) y s e a p lic a ro n a u n a c o lu m n a d e b u til s e fa ro s a F F d e 1 m l (G E H e a lth c a re , A le m a n ia ) c o n e c ta d o a un P u r if ic a d o r Á k ta s is te m a F P L C (G E H e a lth c a re , A le m a n ia ) . T o d o e l c ic lo s e v ig iló a u n a a b s o rb a n c ia ó p tic a d e 280 , 254 y 210 nm . E l a n á lis is s e re a liz ó m e d ia n te la in te g ra c ió n d e p ic o s d e la s e ñ a l d e 280 n m re g is tra d a e n la h o ja d e e v a lu a c ió n d e e je c u c ió n d e l s o f tw a re Á k ta U n ic o rn . E l c o m p o r ta m ie n to d e e lu c ió n s e e v a lu ó c o m p a ra n d o e l á re a y la v e lo c id a d d e a u m e n to y d is m in u c ió n d e la s e ñ a l de la p ro te ín a , lo q u e in d ic a la fu e rz a d e in te ra c c ió n d e la fu s ió n d e a lb ú m in a B iT E c o n la m a tr iz .
E je m p lo 17
H u e c o d e p o te n c ia e n t r e la is o fo r m a m o n o m é r ic a y la d im é r ic a d e la s c o n s t r u c c io n e s d e a n t ic u e r p o s b ie s p e c í f ic a s
C o n e l f in d e d e te rm in a r la d ife re n c ia e n la a c t iv id a d c ito tó x ic a e n tre la is o fo rm a m o n o m é r ic a y la d im é r ic a d e las c o n s tru c c io n e s d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s F L T 3 x C D 3 in d iv id u a le s (a la q u e s e a lu d e c o m o h u e c o d e p o te n c ia ) , se lle v ó a c a b o un e n s a y o d e c ito to x ic id a d d e lib e ra c ió n d e c ro m o 51 d e 18 h o ra s c o m o s e d e s c r ib e a rr ib a e n e s ta m e m o r ia (E je m p lo 8.1 ) c o n m o n ó m e ro y d ím e ro d e c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o p u r if ic a d o . L a s c é lu la s e fe c to ra s s e e s t im u la ro n c o n c é lu la s T C D 8 h u m a n a s e n r iq u e c id a s . L a s c é lu la s d ia n a fu e ro n c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s co n hu D L L 3. L a re la c ió n c é lu la e fe c to ra a d ia n a (E :T ) fu e 10 :1. E l h u e c o d e p o te n c ia s e c a lc u ló c o m o la re la c ió n e n tre lo s v a lo re s d e C E 50.
Figure imgf000061_0001
E je m p lo 18
C o m p e te n c ia d e l l ig a n d o d e F L T 3 d e la u n ió n d e l a g lu t in a n te F L T 3 a s u d ia n a
E s te e n s a y o s e lle v ó a c a b o p a ra te s ta r s i e l lig a n d o s o lu b le d e F L T 3 a fe c ta r ía a la u n ió n d e lo s d o m in io s d e u n ió n a n t i-F L T 3 a F L T 3.
P a ra v e r i f ic a r la u n ió n d e l lig a n d o d e F L T 3 h u m a n o a c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s c o n F L T 3 h u m a n a , la s c é lu la s se in c u b a ro n c o n lig a n d o d e F L T 3 h u m a n o d u ra n te 30 m in u to s a 4 °C . E l lig a n d o d e F L T 3 u n id o se d e te c tó c o n un a n t ic u e rp o a n t i-H IS (5 p g /m l; A b D S e ro te c ) s e g u id o d e u n a Ig G F c -g a m m a -P E a n t i- ra tó n (1 :100 ; J a c k s o n Im m u n o re s e a rc h n° 115 -116 -071 ) . C o m o c o n tro l n e g a tiv o s e in c u b a ro n c o n P B S /F C S al 2 % e n lu g a r d e C D 27.
P a ra te s ta r la c o m p e te n c ia / re e m p la z o d e l a g lu t in a n te d e F L T 3 p o r e l lig a n d o d e F L T 3 , c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s co n F L T 3 h u m a n a s e in c u b a ro n c o n o s in lig a n d o d e F L T 3 d u ra n te 30 m in u to s a 4 °C (10 p g / lig a n d o d e F L T 3 ). D e s p u é s , la s c é lu la s n o s e la v a ro n , p e ro s e t iñ e ro n d ire c ta m e n te c o n a g lu t in a n te d e F L T 3 (s c F v ). S e d e te c ta ro n s c F v u n id o s c o n a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l a n t i-F L A G M 2 d e ra tó n (1 p g /m l; S ig m a F 1804 ) s e g u id o d e Ig G F c -g a m m a -P E a n ti- ra tó n (1 :100 ; J a c k s o n Im m u n o re s e a rc h n° 115 -116 -071 ) . C o m o c o n tro l n e g a tiv o , la s c é lu la s s e in c u b a ro n c o n un s c F v in e s p e c íf ic o e n lu g a r d e F L T 3 s c F v . L ig a n d o d e F L T 3 y to d o s lo s a n t ic u e rp o s s e d ilu y e ro n e n P B S c o n F C S a l 2 % .
P a ra la e v a lu a c ió n d e lo s d a to s , la m e d ia n a d e f lu o re s c e n c ia fu e d e te c ta d a p o r F A C S . U n a p é rd id a d e m á s d e l 25 % d e la s e ñ a l c o m o re s u lta d o d e la c o m p e te n c ia c o n e l lig a n d o d e F L T 3 s e e n te n d ió c o m o un im p a c to s ig n if ic a t iv o e n la u n ió n . É s te p u e d e e n te n d e rs e c o m o u n a in te ra c c ió n e s té r ic a s ig n if ic a t iv a p a ra e l m is m o d o m in io d e F L T 3. T o d o s los a g lu t in a n te s p o r e n c im a d e l u m b ra l d e l 75 %
(m e d ia n a [+ lig a n d o ] / m e d ia n a [s in lig a n d o ] * 100 > 75 % )
( lo c u a l e s c ie r to p a ra F L-1 a F L -65 ) s e id e n t if ic a n c o m o n o s e n s ib le s p a ra la c o m p e te n c ia d e l lig a n d o d e F L T 3. E n la b ib lio g ra f ía s e d e s c r ib e q u e la in te ra c c ió n d e lig a n d o d e F L T 3 c o n su re c e p to r t ie n e lu g a r e n la re g ió n c o rre s p o n d ie n te a la a g ru p a c ío n 3 d e l e p íto p o . P o r lo ta n to , s e e s p e ra b a q u e to d o s lo s a g lu t in a n te s id e n t if ic a d o s e n la s e le c c ió n re a liz a d a p o r lo s a u to re s d e la in v e n c ió n fu e ra n e s p e c íf ic o s p a ra la a g ru p a c ió n 3 d e l e p íto p o , a s í c o m o q u e lo s d e las a g ru p a c io n e s 2 y 4 v e c in a s s e v e r ía n s ig n if ic a t iv a m e n te a fe c ta d o s en la s e ñ a l d e la m e d ia n a d e f lu o re s c e n c ia p o r la c o m p e te n c ia c o n e l lig a n d o d e F L T 3. E s ta e x p e c ta t iv a e ra e n g e n e ra l c o rre c ta . S o rp re n d e n te m e n te , F L -53 , F L -54 , F L -61 , F -62 , F L -63 y F L -64 , q u e s e u n e n a la a g ru p a c ió n 3 d e l e p íto p o , to d a v ía m o s tra b a n u n a s e ñ a l p o r e n c im a de l u m b ra l.
A d e m á s , e n v is ta d e la in te ra c c ió n d e l lig a n d o d e F L T 3 c o n la re g ió n d e la a g ru p a c ió n 3 d e l e p íto p o , s e a s u m ió a d e m á s q u e e l a g lu t in a n te p a ra u n a a g ru p a c ió n d e l e p íto p o m á s d is ta n te s , ta l c o m o la a g ru p a c ió n 1 d e F L T 3 , n o se v e r ía a fe c ta d o p o r la c o m p e te n c ia c o n e l lig a n d o d e F L T 3. S in e m b a rg o , h a b ía un n ú m e ro s ig n if ic a t iv o d e a g lu t in a n te s q u e n o c u m p lía n lo s re q u is ito s p a ra e l u m b ra l d e l 75 % . L o s a g lu t in a n te s F L-1 a F L -53 , F L -55 a F L -60 y F L -65 e s ta b a n en e l g ru p o d e a g lu t in a n te s n o s e n s ib le s a la c o m p e te n c ia d e l lig a n d o d e F L T 3.
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
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
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ı33
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Claims (20)

R E IV IN D IC A C IO N E S
1. U n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o q u e c o m p re n d e un p r im e r d o m in io d e u n ió n q u e se u n e a F L T 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la d ia n a y un s e g u n d o d o m in io d e u n ió n q u e s e u n e a C D 3 h u m a n a e n la s u p e r f ic ie d e u n a c é lu la T , e n d o n d e e l p r im e r d o m in io d e u n ió n s e u n e a un e p íto p o d e F L T 3 q u e e s tá c o m p re n d id o d e n tro d e la re g ió n c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 819 , e n d o n d e d ic h a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o e s a l m e n o s b ie s p e c íf ic a .
2. La c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o co n la re iv in d ic a c ió n 1, e n d o n d e el p r im e r d o m in io d e u n ió n se u n e a F L T 3 h u m a n a y d e m a c a c o .
3. L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o c o n la re iv in d ic a c ió n 1 o 2 , e n d o n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o e s tá e n un fo rm a to s e le c c io n a d o d e l g ru p o q u e c o n s is te e n (s c F v ) 2 , m A b d e s c F v d e d o m in io s e n c illo , d ia c u e rp o s y o lig ó m e ro s d e lo s m is m o s .
4. L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o c o n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s p re c e d e n te s , e n d o n d e el p r im e r d o m in io d e u n ió n c o m p re n d e u n a re g ió n V H q u e c o m p re n d e C D R -H 1 , C D R -H 2 y C D R -H 3 y u n a re g ió n V L q u e c o m p re n d e C D R -L 1 , C D R -L 2 y C D R L 3 s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en : S E Q ID N O s : 151 -156 , S E Q ID n O s : 161 -166 , S E Q ID N O s : 171 -176 , S E Q ID N O s : 181 -186 , S E Q ID N O s : 191 -196 , S E Q ID N O s : 201 -206 , S E Q ID N O s : 211 -216 , S E Q ID N O s : 221 -226 , S E Q ID N O s : 231 -236 , S E Q ID N O s : 241 -246 , S E Q ID N O s : 251 -256 , S E Q ID N O s : 261 -266 , S E Q ID N O s : 271 -276 , S E Q ID N O s : 281 -286 , S E Q ID N O s : 291 -296 , S E Q ID N O s : 301 -306 , S E Q ID N O s : 311 -316 , S E Q ID N O s : 321 -326 , S E Q ID N O s : 331 -336 , S E Q ID N O s : 341 -346 , S E Q ID N O s : 351 -356 , S E Q ID N O s : 361 -366 , S E Q ID N O s : 371 -376 , S E Q ID N O s : 381 -386 , S E Q ID N O s : 391 -396 , S E Q ID N O s : 401 -406 , S E Q ID N O s : 411 -416 , S E Q ID N O s : 421 -426 , S E Q ID N O s : 431 -436 , S E Q ID N O s : 441 -446 , S E Q ID N O s : 451 -456 , S E Q ID N O s : 461 -466 , S E Q ID N O s : 471 -476 , S E Q ID N O s : 481 -486 , S E Q ID N O s : 491 -496 , S E Q ID N O s : 501 -506 , S E Q ID N O s : 511 -516 , S E Q ID N O s : 521 -526 , S E Q ID N O s : 531 -536 , S E Q ID N O s : 541 -546 , S E Q ID N O s : 551 -556 , S E Q ID N O s : 561 -566 , S E Q ID N O s : 571 -576 , S E Q ID N O s : 581 -586 , S E Q ID N O s : 591 -596 , S E Q ID N O s : 601 -606 , S E Q ID N O s : 611 -616 , S E Q ID N O s : 621 -626 , S E Q ID N O s : 631 -636 , S E Q ID N O s : 641 -646 , S E Q ID N O s : 651 -656 , S E Q ID N O s : 661 -666 , S E Q ID S E Q ID N O s : 691 -696 , S E Q ID N O s : 701 -706 , S E Q ID N O s : 711 -716 , S E Q ID N O s : 721 -726 , S E Q ID N O s : 731 -736 , S E Q ID N O s : 741 -746 y S E Q ID N O s : 791 -796.
5. L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o c o n la re iv in d ic a c ió n 4, e n d o n d e el p r im e r d o m in io d e u n ió n c o m p re n d e u n a re g ió n V H s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s m o s tra d a s e n S E Q ID N O : 157 , S E Q ID N O : 167 , S E Q ID N O : 177 , S E Q ID N O : 187 , S E Q ID N O : 197 , S E Q ID N O : 207 , S E Q ID N O : 217 , S E Q ID N O : 227 , S E Q ID N O : 237 , S E Q ID N O : 247 , S E Q ID N O : 257 , S E Q ID N O : 267 , S E Q ID N O : 277 , S E Q ID N O : 287 , S E Q ID N O : 297 , S E Q ID N O : 307 , S E Q ID N O : 317 , S E Q ID N O : 327 , S E Q ID N O : 337 , S E Q ID N O : 347 , S E Q ID N O : 357 , S E Q ID N O : 367 , S E Q ID N O : 377 , S E Q ID N O : 387 , S E Q ID N O : 397 , S E Q ID N O : 407 , S E Q ID N O : 417 , S E Q ID N O : 427 , S E Q ID N O : 437 , S E Q ID N O : 447 , S E Q ID N O : 457 , S E Q ID N O : 467 , S E Q ID N O : 477 , S E Q ID N O : 487 , S E Q ID N O : 497 , S E Q ID N O : 507 , S E Q ID N O : 517 , S E Q ID N O : 527 , S E Q ID N O : 537 , S E Q ID N O : 547 , S E Q ID N O : 557 , S E Q ID N O : 567 , S E Q ID N O : 577 , S E Q ID N O : 587 , S E Q ID N O : 597 , S E Q ID N O : 607 , S E Q ID N O : 617 , S E Q ID N O : 627 , S E Q ID N O : 637 , S E Q ID N O : 647 , S E Q ID N O : 657 , S E Q ID N O : 667 , S E Q ID N O : 697 , S E Q ID N O : 707 , S E Q ID N O : 717 , S E Q ID N O : 727 , S E Q ID N O : 737 , S E Q ID N O : 747 y S E Q ID N O : 797.
6. L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o c o n la re iv in d ic a c ió n 4 o 5, en d o n d e el p r im e r d o m in io d e u n ió n c o m p re n d e u n a re g ió n V L s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s m o s tra d a s e n S E Q ID N O : 158 , S E Q ID N O : 168 , S E Q ID N O : 178 , S E Q ID N O : 188 , S E Q ID N O : 198 , S E Q ID N O : 208 , S E Q ID N O : 218 , S E Q ID N O : 228 , S E Q ID N O : 238 , S E Q ID N O : 248 , S E Q ID N O : 258 , S E Q ID N O : 268 , S E Q ID N O : 278 , S E Q ID N O : 288 , S E Q ID N O : 298 , S E Q ID N O : 308 , S E Q ID N O : 318 , S E Q ID N O : 328 , S E Q ID N O : 338 , S E Q ID N O : 348 , S E Q ID N O : 358 , S E Q ID N O : 368 , S E Q ID N O : 378 , S E Q ID N O : 388 , S E Q ID N O : 398 , S E Q ID N O : 408 , S E Q ID N O : 418 , S E Q ID N O : 428 , S E Q ID N O : 438 , S E Q ID N O : 448 , S E Q ID N O : 458 , S E Q ID N O : 468 , S E Q ID N O : 478 , S E Q ID N O : 488 , S E Q ID N O : 498 , S E Q ID N O : 508 , S E Q ID N O : 518 , S E Q ID N O : 528 , S E Q ID N O : 538 , S E Q ID N O : 548 , S E Q ID N O : 558 , S E Q ID N O : 568 , S E Q ID N O : 578 , S E Q ID N O : 588 , S E Q ID N O : 598 , S E Q ID N O : 608 , S E Q ID N O : 618 , S E Q ID N O : 628 , S E Q ID N O : 638 , S E Q ID N O : 648 , S E Q ID N O : 658 , S E Q ID N O : 668 , S E Q ID N O : 698 , S E Q ID N O : 708 , S E Q ID N O : 718 , S E Q ID N O : 728 , S E Q ID N O : 738 , S E Q ID N O : 748 y S E Q ID N O : 798.
7. L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o co n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 4 a 6 , e n d o n d e e l p r im e r d o m in io d e u n ió n c o m p re n d e u n a re g ió n V H y u n a re g ió n V L s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en p a re s d e u n a re g ió n V H y u n a re g ió n V L c o m o se m u e s tra e n S E Q ID N O : 157 158 S E Q ID N O 167 168 S E Q ID N O : 177 178 S E Q ID N O : 187 188 , S E Q ID N O 197 198 , S E Q ID N O : 207 208 , S E Q ID N O : 217 218 , S E Q ID N O : 227 228 S E Q ID N O : 237 238 , S E Q ID N O : 247 248 , S E Q ID N O : 257 258 , S E Q ID N O : 267 268 , S E Q ID N O : 277 278 S E Q ID N O : 287 288 , S E Q ID N O : 297 298 , S E Q ID N O : 307 308 , S E Q ID N O : 317 318 , S E Q ID N O : 327 328 S E Q ID N O : 337 338 , S E Q ID N O : 347 348 , S E Q ID N O : 357 358 , S E Q ID N O : 367 368 , S E Q ID N O : 377 378 S E Q ID N O : 387 388 , S E Q ID N O : 397 398 , S E Q ID N O : 407 408 , S E Q ID N O : 417 418 , S E Q ID N O : 427 428 S E Q ID N O : 437 438 , S E Q ID N O : 447 448 , S E Q ID N O : 457 458 , S E Q ID N O : 467 468 , S E Q ID N O : 477 478 S E Q ID N O : 487 488 , S E Q ID N O : 497 498 , S E Q ID N O : 507 508 , S E Q ID N O : 517 518 , S E Q ID N O : 527 528 S E Q ID N O : 537 538 , S E Q ID N O : 547 548 , S E Q ID N O : 557 558 , S E Q ID N O : 567 568 , S E Q ID N O : 577 578 S E Q ID N O : 587 588 , S E Q ID N O : 597 598 , S E Q ID N O : 607 608 , S E Q ID N O : 617 618 , S E Q ID N O : 627 628 S E Q ID N O : 637 638 , S E Q ID N O : 647 648 , S E Q ID N O : 657 658 , S E Q ID N O : 667 668 , S E Q ID N O : 697 698 S E Q ID N O : 707 708 , S E Q ID N O : 717 718 , S E Q ID N O : 727 728 , S E Q ID N O : 737 738 , S E Q ID N O : 747 748 y S E Q ID N O : 797 798.
8. L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o co n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 4 a 7, e n d o n d e e l p r im e r d o m in io d e u n ió n c o m p re n d e u n p o lip é p tid o s e le c c io n a d o d e l g ru p o q u e c o n s is te en e l m o s tra d o e n S E Q ID N O : 159 , S E Q ID N O : 169 , S E Q ID N O : 179 , S E Q ID N O : 189 , S E Q ID N O : 199 , S E Q ID N O : 209 , S E Q ID N O : 219 y S E Q ID N O : 229 , S E Q ID N O : 239 , S E Q ID N O : 249 y S E Q ID N O : 259 , S E Q ID N O : 269 , S E Q ID N O : 279 y S E Q ID N O : 289 , S E Q ID N O : 299 , S E Q ID N O : 309 , S E Q ID N O : 319 y S E Q ID N O : 329 , S E Q ID N O : 339 , S E Q ID N O : 349 y S E Q ID N O : 359 , S E Q ID N O : 369 , S E Q ID N O : 379 y S E Q ID N O : 389 , S E Q ID N O : 399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 y S E Q ID N O : 459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O : 519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 y S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 y S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799.
9. L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o c o n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 8, en d o n d e e l s e g u n d o d o m in io d e u n ió n s e u n e a C D 3 é p s ilo n h u m a n a y a C D 3 é p s ilo n d e C a llith r ix ja c c h u s , S a g u in u s O ed ip u s o S a im irí sc iu reus.
10. L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o c o n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 9, q u e c o m p re n d e :
(a ) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
159 , S E Q ID N O : 169 , S E Q ID N O : 179 , S E Q ID N O : 189 , S E Q ID N O : 199 , S E Q ID N O : 209 , S E Q ID N O : 219 y S E Q ID N O : 229 , S E Q ID N O : 239 , S E Q ID N O : 249 y S E Q ID N O : 259 , S E Q ID N O : 269 , S E Q ID N O : 279 y S E Q ID N O : 289 , S E Q ID N O : 299 , S E Q ID N O : 309 , S E Q ID N O : 319 y S E Q ID N O : 329 , S E Q ID N O : 339 , S E Q ID N O : 349 y S E Q ID N O : 359 , S E Q ID N O : 369 , S E Q ID N O : 379 y S E Q ID N O : 389 , S E Q ID N O : 399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 y S E Q ID N O : 459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O : 519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 y S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 y S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1 -9 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ; y
• o p c io n a lm e n te , u n a e t iq u e ta H is , ta l c o m o la re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 10;
(b ) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
159 , S E Q ID N O : 169 , S E Q ID N O : 179 , S E Q ID N O : 189 , S E Q ID N O : 199 , S E Q ID N O : 209 , S E Q ID N O : 219 y S E Q ID N O : 229 , S E Q ID N O : 239 , S E Q ID N O : 249 y S E Q ID N O : 259 , S E Q ID N O : 269 , S E Q ID N O : 279 y S E Q ID N O : 289 , S E Q ID N O : 299 , S E Q ID N O : 309 , S E Q ID N O : 319 y S E Q ID N O : 329 , S E Q ID N O : 339 , S E Q ID N O : 349 y S E Q ID N O : 359 , S E Q ID N O : 369 , S E Q ID N O : 379 y S E Q ID N O : 389 , S E Q ID N O :
399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 y S E Q ID N O : 459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O : 519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 y S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 y S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en S E Q ID N O s : 1 -9 ; •
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ;
• o p c io n a lm e n te , un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1-9 ;
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s :
104 -134 ; y
• o p c io n a lm e n te , u n a e t iq u e ta H is , ta l c o m o la re p re s e n ta d a en S E Q ID N O : 10;
(c ) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , en e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s Q R F V T G H F G G L X 1 P A N G (S E Q ID N O : 135 ), en d o n d e X 1 e s Y o H; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
159 , S E Q ID N O : 169 , S E Q ID N O : 179 , S E Q ID N O : 189 , S E Q ID N O : 199 , S E Q ID N O : 209 , S E Q ID N O : 219 y S E Q ID N O : 229 , S E Q ID N O : 239 , S E Q ID N O : 249 y S E Q ID N O : 259 , S E Q ID N O : 269 , S E Q ID N O : 279 y S E Q ID N O : 289 , S E Q ID N O : 299 , S E Q ID N O : 309 , S E Q ID N O : 319 y S E Q ID N O : 329 , S E Q ID N O : 339 , S E Q ID N O : 349 y S E Q ID N O : 359 , S E Q ID N O : 369 , S E Q ID N O : 379 y S E Q ID N O : 389 , S E Q ID N O : 399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 y S E Q ID N O : 459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O : 519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 y S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 y S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1 -9 ;
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ;
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s Q R F V T G H F G G L H P A N G (S E Q ID N O : 137 ) o Q R F C T G H F G G L H P C N G (S E Q ID N O : 139 ); y
• o p c io n a lm e n te , u n a e t iq u e ta H is , ta l c o m o la re p re s e n ta d a en S E Q ID N O : 10;
(d ) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
17, S E Q ID N O : 26 , S E Q ID N O : 35 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 53 , S E Q ID N O : 62 , S E Q ID N O : 71 , S E Q ID N O : 80 , S E Q ID N O : 89 , S E Q ID N O : 98 Y S E Q ID N O : 101 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 8;
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
158 , S E Q ID N O : 168 , S E Q ID N O : 178 , S E Q ID N O : 188 , S E Q ID N O : 198 , S E Q ID N O : 208 , S E Q ID N O : 218 , S E Q ID N O : 228 , S E Q ID N O : 238 , S E Q ID N O : 248 , S E Q ID N O : 258 , S E Q ID N O : 268 , S E Q ID N O : 278 , S E Q ID N O : 288 , S E Q ID N O : 298 , S E Q ID N O : 308 , S E Q ID N O : 318 , S E Q ID N O : 328 , S E Q ID N O : 338 , S E Q ID N O : 348 , S E Q ID N O : 358 , S E Q ID N O : 368 , S E Q ID N O : 378 , S E Q ID N O : 388 , S E Q ID N O : 398 , S E Q ID N O : 408 , S E Q ID N O : 418 , S E Q ID N O : 428 , S E Q ID N O : 438 , S E Q ID N O : 448 , S E Q ID N O : 458 , S E Q ID N O : 468 , S E Q ID N O : 478 , S E Q ID N O : 488 , S E Q ID N O : 498 , S E Q ID N O : 508 , S E Q ID N O : 518 , S E Q ID N O : 528 , S E Q ID N O : 538 , S E Q ID N O : 548 , S E Q ID N O : 558 , S E Q ID N O : 568 , S E Q ID N O : 578 , S E Q ID N O : 588 , S E Q ID N O : 598 , S E Q ID N O : 608 , S E Q ID N O : 618 , S E Q ID N O : 628 , S E Q ID N O : 638 , S E Q ID N O : 648 , S E Q ID N O : 658 , S E Q ID N O : 668 , S E Q ID N O : 698 , S E Q ID N O : 708 , S E Q ID N O : 718 , S E Q ID N O : 728 , S E Q ID N O : 738 , S E Q ID N O : 748 y S E Q ID N O : 798 , y un re s id u o d e s e r in a e n e l e x tre m o C;
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 140 , y un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , en e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N: •
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
157 , S E Q ID N O : 167 , S E Q ID N O : 177 , S E Q ID N O : 187 , S E Q ID N O : 197 , S E Q ID N O : 207 , S E Q ID N O : 217 , S E Q ID N O : 227 , S E Q ID N O : 237 , S E Q ID N O : 247 , S E Q ID N O : 257 , S E Q ID N O : 267 , S E Q ID N O : 277 , S E Q ID N O : 287 , S E Q ID N O : 297 , S E Q ID N O : 307 , S E Q ID N O : 317 , S E Q ID N O : 327 , S E Q ID N O : 337 , S E Q ID N O : 347 , S E Q ID N O : 357 , S E Q ID N O : 367 , S E Q ID N O : 377 , S E Q ID N O : 387 , S E Q ID N O : 397 , S E Q ID N O : 407 , S E Q ID N O : 417 , S E Q ID N O : 427 , S E Q ID N O : 437 , S E Q ID N O : 447 , S E Q ID N O : 457 , S E Q ID N O : 467 , S E Q ID N O : 477 , S E Q ID N O : 487 , S E Q ID N O : 497 , S E Q ID N O : 507 , S E Q ID N O : 517 , S E Q ID N O : 527 , S E Q ID N O : 537 , S E Q ID N O : 547 , S E Q ID N O : 557 , S E Q ID N O : 567 , S E Q ID N O : E Q ID N O :
Figure imgf000149_0001
Q ID N O :
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 8;
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
18, S E Q ID N O : 27 , S E Q ID N O : 36 , S E Q ID N O : 45 , S E Q ID N O : 54 , S E Q ID N O : 63 , S E Q ID N O : 72 , S E Q ID N O : 81 , S E Q ID N O : 90 , S E Q ID N O : 99 y S E Q ID N O : 102 , y un re s id u o d e s e r in a en e l e x tre m o C ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 141 ;
(e ) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
17, S E Q ID N O : 26 , S E Q ID N O : 35 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 53 , S E Q ID N O : 62 , S E Q ID N O : 71 , S E Q ID N O : 80 , S E Q ID N O : 89 , S E Q ID N O : 98 y S E Q ID N O : 101 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 8;
un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
158 , S E Q ID N O : 168 , S E Q ID N O 178 S E Q ID N O 188 , S E Q ID N O 198 , S E Q ID N O : 208 , S E Q ID N O :
218 , S E Q ID N O : 228 , S E Q ID N O : 238 , S E Q ID N O : 248 , S E Q ID N O : 258 , S E Q ID N O : 268 , S E Q ID N O :
278 , S E Q ID N O : 288 , S E Q ID N O : 298 , S E Q ID N O : 308 , S E Q ID N O 318 , S E Q ID N O : 328 , S E Q ID N O :
338 , S E Q ID N O : 348 , S E Q ID N O : 358 , S E Q ID N O : 368 , S E Q ID N O : 378 , S E Q ID N O : 388 , S E Q ID N O :
398 , S E Q ID N O : 408 , S E Q ID N O 418 S E Q ID N O : 428 , S E Q ID N O : 438 , S E Q ID N O : 448 , S E Q ID N O :
458 , S E Q ID N O : 468 , S E Q ID N O : 478 , S E Q ID N O : 488 , S E Q ID N O : 498 , S E Q ID N O : 508 , S E Q ID N O :
518 , S E Q ID N O : 528 , S E Q ID N O : 538 , S E Q ID N O : 548 , S E Q ID N O : 558 , S E Q ID N O : 568 , S E Q ID N O :
578 , S E Q ID N O : 588 , S E Q ID N O : 598 , S E Q ID N O : 608 , S E Q ID N O 618 , S E Q ID N O : 628 , S E Q ID N O :
638 , S E Q ID N O : 648 , S E Q ID N O : 658 , S E Q ID N O : 668 , S E Q ID N O : 698 , S E Q ID N O : 708 , S E Q ID N O :
718 , S E Q ID N O : 728 , S E Q ID N O : 738 , S E Q ID N O : 748 y S E Q ID N O : 798 ;
un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 142 ; y un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , en e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
157 , S E Q ID N O : 167 , S E Q ID N O 177 S E Q ID N O 187 , S E Q ID N O 197 , S E Q ID N O : 207 , S E Q ID N O :
217 , S E Q ID N O : 227 , S E Q ID N O : 237 , S E Q ID N O : 247 , S E Q ID N O : 257 , S E Q ID N O : 267 , S E Q ID N O :
277 , S E Q ID N O : 287 , S E Q ID N O : 297 , S E Q ID N O : 307 , S E Q ID N O 317 , S E Q ID N O : 327 , S E Q ID N O :
337 , S E Q ID N O : 347 , S E Q ID N O : 357 , S E Q ID N O : 367 , S E Q ID N O : 377 , S E Q ID N O : 387 , S E Q ID N O :
397 , S E Q ID N O : 407 , S E Q ID N O 417 S E Q ID N O : 427 , S E Q ID N O : 437 , S E Q ID N O : 447 , S E Q ID N O :
457 , S E Q ID N O : 467 , S E Q ID N O : 477 , S E Q ID N O : 487 , S E Q ID N O : 497 , S E Q ID N O : 507 , S E Q ID N O :
517 , S E Q ID N O : 527 , S E Q ID N O : 537 , S E Q ID N O : 547 , S E Q ID N O : 557 , S E Q ID N O : 567 , S E Q ID N O :
577 , S E Q ID N O : 587 , S E Q ID N O : 597 , S E Q ID N O : 607 , S E Q ID N O 617 , S E Q ID N O : 627 , S E Q ID N O :
637 , S E Q ID N O : 647 , S E Q ID N O : 657 , S E Q ID N O : 667 , S E Q ID N O : 697 , S E Q ID N O : 707 , S E Q ID N O :
717 , S E Q ID N O : 727 , S E Q ID N O : 737 , S E Q ID N O : 747 y S E Q ID N O : 797 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 8;
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
18, S E Q ID N O : 27 , S E Q ID N O : 36 , S E Q ID N O : 45 , S E Q ID N O : 54 , S E Q ID N O : 63 , S E Q ID N O : 72 , S E Q ID N O : 81 , S E Q ID N O : 90 , S E Q ID N O : 99 y S E Q ID N O : 102 s e g u id o d e un re s id u o d e s e r in a en e l e x tre m o C; [C D 3 V L ]
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 143 ;
( f) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
159 , S E Q ID N O : 169 , S E Q ID N O : 179 , S E Q ID N O : 189 , S E Q ID N O : 199 , S E Q ID N O : 209 , S E Q ID N O :
219 y S E Q ID N O : 229 , S E Q ID N O : 239 , S E Q ID N O : 249 y S E Q ID N O : 259 , S E Q ID N O : 269 , S E Q ID N O : 279 y S E Q ID N O : 289 , S E Q ID N O : 299 , S E Q ID N O : 309 , S E Q ID N O : 319 y S E Q ID N O : 329 , S E Q ID N O : 339 , S E Q ID N O : 349 y S E Q ID N O : 359 , S E Q ID N O : 369 , S E Q ID N O : 379 y S E Q ID N O : 389 , S E Q ID N O :
399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 y S E Q ID N O :
459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O :
519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 y S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 y S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1 -9 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 144 ; y un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 145 ;
(g ) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
159 , S E Q ID N O : 169 , S E Q ID N O : 179 , S E Q ID N O : 189 , S E Q ID N O : 199 , S E Q ID N O : 209 , S E Q ID N O : 219 y S E Q ID N O : 229 , S E Q ID N O : 239 , S E Q ID N O : 249 y S E Q ID N O : 259 , S E Q ID N O : 269 , S E Q ID N O : 279 y S E Q ID N O : 289 , S E Q ID N O : 299 , S E Q ID N O : 309 , S E Q ID N O : 319 y S E Q ID N O : 329 , S E Q ID N O : 339 , S E Q ID N O : 349 y S E Q ID N O : 359 , S E Q ID N O : 369 , S E Q ID N O : 379 y S E Q ID N O : 389 , S E Q ID N O :
399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 y S E Q ID N O : 459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O : 519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 y S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 y S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 146 ; y un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , en e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a en S E Q ID N O : 147 ;
(h ) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
159 , S E Q ID N O : 169 , S E Q ID N O : 179 , S E Q ID N O : 189 , S E Q ID N O : 199 , S E Q ID N O : 209 , S E Q ID N O : 219 y S E Q ID N O : 229 , S E Q ID N O : 239 , S E Q ID N O : 249 y S E Q ID N O : 259 , S E Q ID N O : 269 , S E Q ID N O : 279 y S E Q ID N O : 289 , S E Q ID N O : 299 , S E Q ID N O : 309 , S E Q ID N O : 319 y S E Q ID N O : 329 , S E Q ID N O : 339 , S E Q ID N O : 349 y S E Q ID N O : 359 , S E Q ID N O : 369 , S E Q ID N O : 379 y S E Q ID N O : 389 , S E Q ID N O :
399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 y S E Q ID N O : 459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O : 519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 y S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 y S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 148 ; y
un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 149 ; o
( i) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
159 , S E Q ID N O : 169 , S E Q ID N O : 179 , S E Q ID N O : 189 , S E Q ID N O : 199 , S E Q ID N O : 209 , S E Q ID N O : 219 y S E Q ID N O : 229 , S E Q ID N O : 239 , S E Q ID N O : 249 y S E Q ID N O : 259 , S E Q ID N O : 269 , S E Q ID N O : 279 y S E Q ID N O : 289 , S E Q ID N O : 299 , S E Q ID N O : 309 , S E Q ID N O : 319 y S E Q ID N O : 329 , S E Q ID N O : 339 , S E Q ID N O : 349 y S E Q ID N O : 359 , S E Q ID N O : 369 , S E Q ID N O : 379 y S E Q ID N O : 389 , S E Q ID N O : 399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 y S E Q ID N O : 459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O : 519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 y S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 y S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1 -9 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a e n S E Q ID N O : 150.
( j) un p o lip é p tid o q u e c o m p re n d e , e n e l s ig u ie n te o rd e n c o m e n z a n d o d e s d e e l e x tre m o N:
Figure imgf000151_0001
399 , S E Q ID N O : 409 , S E Q ID N O : 419 y S E Q ID N O : 429 , S E Q ID N O : 439 , S E Q ID N O : 449 y S E Q ID N O : 459 , S E Q ID N O : 469 , S E Q ID N O : 479 y S E Q ID N O : 489 , S E Q ID N O : 499 , S E Q ID N O : 509 , S E Q ID N O : 519 y S E Q ID N O : 529 , S E Q ID N O : 539 , S E Q ID N O : 549 y S E Q ID N O : 559 , S E Q ID N O : 569 , S E Q ID N O : 579 y S E Q ID N O : 589 , S E Q ID N O : 599 , S E Q ID N O : 609 , S E Q ID N O : 619 y S E Q ID N O : 629 , S E Q ID N O : 639 , S E Q ID N O : 649 y S E Q ID N O : 659 , S E Q ID N O : 669 , S E Q ID N O : 699 , S E Q ID N O : 709 , S E Q ID N O : 719 y S E Q ID N O : 729 , S E Q ID N O : 739 , S E Q ID N O : 749 y S E Q ID N O : 799 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1 -9 ; y
• un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O :
S E Q ID N O : 19, S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 37 , S E Q ID N O : 46 , S E Q ID N O : 55 , S E Q ID N O : 64 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 82 , S E Q ID N O : 91 , S E Q ID N O : 100 y S E Q ID N O : 103 ;
• un e n la z a d o r p e p tíd ic o q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 1 -9 ; y
• e l te r c e r d o m in io q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O s : 843 -850.
11. L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o c o n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 10, q u e c o m p re n d e o c o n s is te en un p o lip é p tid o c o m o se m u e s tra en u n a c u a lq u ie ra d e S E Q ID N O s : 856 a 871.
12. L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o co n la re iv in d ic a c ió n 1, q u e c o m p re n d e o c o n s is te e n un p o lip é p tid o c o m o s e m u e s tra e n S E Q ID N O : 862.
13. U n p o lin u c le ó t id o q u e c o d if ic a u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o c o m o s e d e f in e e n u n a c u a lq u ie ra d e las re iv in d ic a c io n e s p re c e d e n te s .
14. U n v e c to r q u e c o m p re n d e un p o lin u c le ó t id o c o m o se d e fin e e n la re iv in d ic a c ió n 13.
15. U n a c é lu la h u é s p e d tra n s fo rm a d a o tra n s fe c ta d a co n e l p o lin u c le ó t id o c o m o s e d e fin e e n la re iv in d ic a c ió n 13 o co n e l v e c to r c o m o s e d e fin e en la re iv in d ic a c ió n 14.
16. U n p ro c e d im ie n to p a ra la p ro d u c c ió n d e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o c o n u n a c u a lq u ie ra d e las re iv in d ic a c io n e s 1 a 12, c o m p re n d ie n d o d ic h o p ro c e d im ie n to c u lt iv a r u n a c é lu la h u é s p e d c o m o s e d e fin e e n la re iv in d ic a c ió n 15 b a jo c o n d ic io n e s q u e p e rm ite n la e x p re s ió n d e la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o c o m o s e d e f in e e n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 12, y re c u p e ra r la c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e l c u lt iv o .
17. U n a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a q u e c o m p re n d e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o c o n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 12 o p ro d u c id a d e a c u e rd o co n e l p ro c e d im ie n to d e la re iv in d ic a c ió n 16.
18. L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o c o n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 12 o p ro d u c id a d e a c u e rd o c o n e l p ro c e d im ie n to d e la re iv in d ic a c ió n 16, p a ra u so e n la p re v e n c ió n o e l t ra ta m ie n to d e u n a e n fe rm e d a d c a n c e ro s a h e m a to ló g ic a o u n a e n fe rm e d a d c a n c e ro s a m e ta s tá s ic a .
19. L a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o p a ra u so d e a c u e rd o c o n la re iv in d ic a c ió n 18, e n d o n d e la e n fe rm e d a d c a n c e ro s a h e m a to ló g ic a e s A M L o u n a e n fe rm e d a d c a n c e ro s a m e ta s tá s ic a d e r iv a d a d e c u a lq u ie ra d e la s a n te r io re s .
20. U n k it q u e c o m p re n d e u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o d e a c u e rd o co n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 12, u n a c o n s tru c c ió n d e a n t ic u e rp o p ro d u c id a d e a c u e rd o c o n e l p ro c e d im ie n to d e la re iv in d ic a c ió n 16, un p o lin u c le ó t id o c o m o s e d e fin e e n la re iv in d ic a c ió n 13 y /o u n a c é lu la h u é s p e d c o m o s e d e fin e e n la re iv in d ic a c ió n 15.
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