BR112021003436A2

BR112021003436A2 - células nk criopreservadas pré-carregadas com uma construção de anticorpo

Info

Publication number: BR112021003436A2
Application number: BR112021003436-6A
Authority: BR
Inventors: Uwe Reusch; Joachim Koch; Martin Treder; Holger J. DULAT
Original assignee: Affimed Gmbh
Priority date: 2018-08-27
Filing date: 2019-08-26
Publication date: 2021-05-18
Also published as: IL281007A; SG11202101708PA; EP3843757B1; AU2019327155A1; ZA202101008B; US20210169936A1; EP3843757A1; MX2021002332A; CA3109732A1; KR20210052494A; JP2021534779A; CN112789050A; WO2020043670A1

Abstract

CÉLULAS NK CRIOPRESERVADAS PRÉ-CARREGADAS COM UMA CONSTRUÇÃO DE ANTICORPO. O pedido descreve células NK humanas isoladas em um estado criopreservado, pré-carregadas antes do congelamento com uma construção de anticorpo, a construção de anticorpo compreendendo pelo menos um primeiro domínio de ligação que se liga a um antígeno receptor de célula NK na superfície celular de uma célula efetora imunológica e um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno de superfície celular na superfície celular de uma célula alvo, um método para preparação de células NK humanas pré-carregadas criopreservadas e composições farmacêuticas compreendendo células NK humanas que foram reconstituídas a partir de células NK humanas em um estado criopreservado.

Description

1 / 95 CÉLULAS NK CRIOPRESERVADAS PRÉ-CARREGADAS COM UMA

CONSTRUÇÃO DE ANTICORPO Campo da invenção:

[001] A presente invenção provê células NK humanas isoladas em um estado criopreservado, que foram pré-carregadas antes do congelamento com uma construção de anticorpo, a construção de anticorpo compreendendo pelo menos um primeiro domínio de ligação que se liga a um antígeno de receptor na superfície celular de uma célula efetora imunológica, especialmente um que é expresso em células NK, e um segundo domínio de ligação que liga à superfície celular um antígeno na superfície celular de uma célula-alvo. Fundamentos da invenção:

[002] Células exterminadoras naturais (NK) são potentes células efetoras imunes citotóxicas do sistema imunológico inato. Elas são capazes de reconhecer e destruir células tumorais assim como células que foram infectadas por vírus ou bactérias. As células NK podem induzir uma resposta imunológica independente de antígeno contra células malignas. Ademais, além das células NK existem outras células efetoras imunológicas, por exemplo, monócitos, macrófagos, neutrófilos, etc., que são capazes de exterminar células tumorais ou células infectadas por vírus ou bactérias. Em geral, isso é entendido como a imunidade inata.

[003] Um crescente número de relatórios científicos e estudos clínicos mostrou efeitos antitumorais promissores e potentes ao se usar imunoterapia baseada em células NK. Atualmente, estão sendo investigadas várias abordagens com o objetivo de intensificar o número e a função das células NK. Uma das ditas abordagens utiliza construções de anticorpo biespecíficas ou multiespecíficas com o objetivo de intensificar a especificidade das células NK endógenas reticulando-as com as respectivas células-alvo. A fim de utilizar tais sinergias, o uso de terapia celular adotiva em combinação com terapia baseada em anticorpo foi combinado em várias indicações. Várias fontes de células NK

2 / 95 para transferência adotiva estão sob avaliação e incluem células NK haploidênticas alogênicas que sofreram ativação ou expansão de curto ou longo prazo, células NK de cordão umbilical, que também são expandidas/ativadas sob condições definidas, linhagens celulares NK ou células NK derivadas/diferenciadas de células-tronco. Todas as fontes também podem teoricamente ser usadas para gerar células CAR-NK, que são derivadas de um novo tipo de modificação genética com lentivírus ou retrovírus para produzir células NK específicas a antígeno estáveis. Os primeiros exemplos incluem uma abordagem de célula CD19-CAR-NK que está atualmente sendo testada em pacientes com NHL.

[004] No entanto, ao se combinar construções de anticorpo com qualquer uma das fontes supracitadas de células NK para transferência adotiva, é sempre necessário preparar as células no ponto de uso, isto é, no hospital em que a terapia é aplicada ao respectivo paciente, e, subsequentemente, coadministrar ao dito paciente a dose exigida das respectivas construções de anticorpo. Além do fato de que isso pode ser um problema logístico para a maioria dos hospitais, também vale observar que todos os pacotes de trabalho exigidos para a preparação das células para administração precisam ser realizados de acordo com protocolos estritamente controlados a fim de excluir qualquer problema evitável que aumente tal risco.

[005] Consequentemente, há a necessidade de meios e métodos para simplificar tal terapia a fim de permitir a aplicabilidade para um grupo maior de pacientes, especialmente em hospitais ou centros médicos não especializados. As figuras mostram:

[006] Figura 1: Ensaio de citotoxicidade por liberação de calceína de 4 h em células-alvo células NK MM.1S (A) ou DK-MG (B) como células efetoras na razão E:T indicada que foram pré-carregadas com 10 µg/mL dos anticorpos indicados e lavadas (c/) ou não lavadas (s/) antes de um ciclo de

3 / 95 congelamento/descongelamento. Como controle, as mesmas células NK não foram pré-carregadas, mas lavadas e submetidas a um ciclo de congelamento/descongelamento e o anticorpo indicado foi adicionado ao ensaio de citotoxicidade (fresco; diamantes cinza sólidos).

[007] Figura 2: Ligação de diferentes anticorpos anti-CD16 a variantes de antígeno CD16 revestidas analisada no ELISA. As placas de 96 poços do ELISA foram revestidas com variantes de antígeno recombinantes mostradas na legenda do painel A. Diferentes anticorpos mostrados em (A)-(D) foram diluídos e incubados em série nas placas na faixa de concentração indicada. Os anticorpos ligados foram detectados com anti-His-HRP em (A)- (C), ou proteína L-HRP. As reações de substrato TMB foram medidas a 450 nm (Ext (450 nm)). As curvas de ligação foram ajustadas usando-se o modelo de curva logístico de quatro parâmetros (4PL) log(agonista) vs. resposta - inclinação variável no Graphpad Prism.

[008] Figura 3: Reatividade de diferentes anticorpos scFv anti-CD16 ou scFv ou mAbs de controle com variantes de antígeno CD16 recombinantes ou um antígeno EGFR de controle expresso em células CHO com um domínio transmembranar (TM) de EGFR ou âncora de GPI.

[009] Figura 4: Alinhamento de sequências de domínios extracelulares de CD16A humano e de cinomológo e variantes de CD16B humanas usados como antígenos recombinantes em experimentos resumidos na Tabela 3. As variações na sequência do ECD do CD16A de cinomológo estão destacadas em cinza. Foi usada a ferramenta de alinhamento de múltiplas sequências CLUSTAL O (1.2.4) para o alinhamento.

[0010] Figura 5: Ligação de diferentes anticorpos anti-CD16 a variantes de antígeno CD16 após a separação por meio de SDS-PAGE e Western blot. 2µg de proteína de antígeno recombinante foram carregados por coluna, separados por meio de SDS-PAGE, transferidos para membranas de PVDF e incubados com os anticorpos primários e secundários indicados. Os

4 / 95 sinais do desenvolvimento colorimétrico com substrato DAB mostram reconhecimento distinto de variantes de antígeno CD16A e CD16B.

[0011] Figura 6: Competição de ligação de diferentes anticorpos scFv anti-CD16 com mAb 3G8 a CD16A no ELISA. As placas revestidas com antígeno CD16A (48R, 158V)-mFc.67 foram incubadas com uma mistura de 1nM de mAb 3G8 e diluições em série de diferentes scFvs anti-CD16 na faixa de concentração indicada. 3G8 ligado a CD16A foi detectado com IgG(H+L)- HRPO de cabra anti-camundongo. As reações de substrato TMB foram medidas a 450 nm (Ext (450 nm)). As curvas de ligação foram ajustadas usando-se o modelo de curva logístico de quatro parâmetros (4PL) log(agonista) vs. resposta - inclinação variável no Graphpad Prism.

[0012] Figura 7: Titulação do scFv_CD16-1 contendo os domínios Fv humanos do CD16-1 (A) clone, do scFv_CD16-2 contendo os domínios Fv anti-CD16 humanos do CD16-2 (B) clone e do scFv_3G8, contendo os domínios Fv murinos do mAb 3G8 (C) em células NK humanas primárias a 37°C na presença ou ausência de 10 mg/mL de IgG humana policlonal.

[0013] Figura 8: Ensaio de citotoxicidade por liberação de calceína de 4 h em células-alvo células NK COLO 205 (A) ou KARPAS-299 (B) como células efetoras na razão E:T indicada que foram pré-carregadas com 10 µg/mL dos anticorpos indicados e congeladas a -80°C. Como controle, alíquotas das mesmas células NK não foram pré-carregadas (sem anticorpo) porém também submetidas a um ciclo de congelamento/descongelamento, e os anticorpos indicados (scFv-IgAb_75 EpCAM/NKG2D ou TandAb CD30/CD16A) foram adicionados frescos em uma concentração de 10 µg/mL ao ensaio de citotoxicidade. A média e o SD dos valores de lise em duplicata estão esquematizados. Exp. nº: RBL 1464. Definições

[0014] O termo “construção de anticorpo” refere-se a uma molécula em que a estrutura e/ou função são baseadas na estrutura e/ou função de um

5 / 95 anticorpo, por exemplo, de uma molécula de imunoglobulina completa ou inteira e/ou são tiradas dos domínios de cadeia pesada variável (VH) e/ou de cadeia leve variável (VL) de um anticorpo ou fragmento do mesmo. Uma construção de anticorpo é, portanto, capaz de se ligar ao seu alvo ou antígeno específico. Ademais, o domínio de ligação de uma construção de anticorpo definido no contexto da invenção compreende os requisitos estruturais mínimos de um anticorpo que permitem a ligação do alvo. Esse requisito mínimo pode, por exemplo, ser definido pela presença de pelo menos as três CDRs de cadeia leve (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da região de VL) e/ou as três CDRs de cadeia pesada (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da região de VH), preferivelmente de todas as seis CDRs. Uma abordagem alternativa para definir os requisitos estruturais mínimos de um anticorpo é a definição do epítopo do anticorpo dentro da estrutura do alvo específico, respectivamente, o domínio de proteína da proteína-alvo que compõe a região de epítopo (agrupamento de epítopos) ou por referência a um anticorpo específico que compete com o epítopo do anticorpo definido. Os anticorpos nos quais as construções definidas no contexto da invenção são baseadas incluem, por exemplo, anticorpos monoclonais, recombinantes, quiméricos, desimunizados, humanizados e humanos.

[0015] O domínio de ligação de uma construção de anticorpo definida no contexto da invenção pode compreender, por exemplo, os grupos de CDRs referidos acima. Preferivelmente, essas CDRs são compreendidas no arcabouço de uma região variável de cadeia leve (VL) de anticorpo e de uma região variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo; no entanto, não precisa compreender ambas. Os fragmentos de Fd, por exemplo, têm duas regiões de VH e muitas vezes retêm alguma função de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno intacto. Exemplos adicionais do formato de fragmentos de anticorpo, variantes de anticorpo ou domínios de ligação incluem (1 ) um fragmento de Fab, um fragmento monovalente com os domínios VL, VH, CL

6 / 95 e CH1; (2) um fragmento de F(ab')2, um fragmento bivalente com dois fragmentos de Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (3) um fragmento de Fd com os dois domínios VH e CH1; (4) um fragmento de Fv com os domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (5) um fragmento de dAb (Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546), que tem um domínio de VH; (6) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR), e (7) um Fv de cadeia única (scFv), este sendo preferido (por exemplo, derivado de uma biblioteca de scFV).

[0016] Além disso, dentro da definição de “domínio de ligação” ou “domínio que liga” estão os fragmentos de anticorpos completos, tais como VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 ou “r IgG” (“meio anticorpo”). Construções de anticorpo como definidas no contexto da invenção podem também compreender fragmentos modificados de anticorpos, também chamados de variantes de anticorpo, tais como scFv, di-scFv ou bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-zipper, scFab, Fab2, Fab3, diacorpos, diacorpos de cadeia única, diacorpos em tandem (Tandab's), di-scFv em tandem, tri-scFv em tandem, “multicorpos” tais como triacorpos ou tetracorpos, e anticorpos de domínio único tais como nanocorpos ou anticorpos de domínio único variável que compreendem meramente um domínio variável, que pode ser VHH, VH ou VL, que se ligam especificamente a um antígeno ou epítopo independentemente de outras regiões ou domínios V.

[0017] Como usados no presente documento, os termos “Fv de cadeia única”, “anticorpos de cadeia única” ou “scFv” referem-se a fragmentos de anticorpo de cadeia polipeptídica única que compreendem as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, mas não possuem as regiões constantes. No geral, um anticorpo de cadeia única compreende adicionalmente um linker de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que possibilita que ele forme a estrutura desejada que permitiria a ligação a antígeno. Os anticorpos de cadeia única são discutidos em detalhes por Plueckthun em The Pharmacology of

7 / 95 Monoclonal Antibodies, vol. 1 13, ed. de Rosenburg e Moore. Springer-Verlag, Nova Iorque, pág. 269-315 (1994). Conhecem-se vários métodos para gerar anticorpos de cadeia única, incluindo os descritos nas patentes norte- americanas nº 4.694.778 e 5.260.203; na publicação de pedido de patente internacional nº WO 88/01649; Bird (1988) Science 242:423-442; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:5879-5883; Ward et al. (1989) Nature 334:54454; Skerra et al. (1988) Science 242:1038- 1041. Em modalidades específicas, os anticorpos de cadeia única também podem ser biespecíficos, multiespecíficos, humanos e/ou humanizados e/ou sintéticos.

[0018] Ademais, a definição da locução “construção de anticorpo” inclui construções monovalentes, bivalentes e polivalentes/multivalentes e, logo, construções biespecíficas, especificamente ligadas a somente duas estruturas antigênicas, assim como construções poliespecíficas/multiespecíficas, que ligam especificamente mais de duas estruturas antigênicas, por exemplo, três, quatro ou mais, através de domínios de ligação distintos. Ademais, a definição da locução “construção de anticorpo” inclui moléculas que consistem em somente uma cadeia polipeptídica assim como moléculas que consistem em mais de uma cadeia polipeptídica, cadeias essas que podem ser idênticas (homodímeros, homotrímeros ou homo- oligômeros) ou diferentes (heterodímero, heterotrímero ou hetero-oligômero). Exemplos dos anticorpos identificados acima e variantes ou derivados dos mesmos são descritos inter alia em Harlow e Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) e Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann e Dubel, Antibody Engineering, Springer, 2ª ed. 2010 e Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.

[0019] O termo “valente” denota a presença de um determinado número de domínios de ligação a antígeno na proteína de ligação a antígeno. Uma IgG natural tem dois domínios de ligação a antígeno e é bivalente. As

8 / 95 proteínas de ligação a antígeno como definidas no contexto da invenção são pelo menos trivalentes. Exemplos de proteína de ligação a antígeno tetravalentes, pentavalentes e hexavalentes são descritos no presente documento.

[0020] O termo “biespecífico(a)” como usado no presente documento se refere a uma construção de anticorpo que é “pelo menos biespecífica”, isto é, compreende pelo menos um primeiro domínio de ligação e um segundo domínio de ligação, em que o primeiro domínio de ligação se liga a um antígeno ou alvo (aqui: receptor de célula NK, por exemplo, CD16a), e o segundo domínio de ligação se liga a outro antígeno ou alvo (aqui: o antígeno-alvo de superfície celular) Consequentemente, as construções de anticorpo como definidas no contexto da invenção compreendem especificidades para pelo menos dois antígenos ou alvos diferentes. Por exemplo, o primeiro domínio realmente se liga de preferência a um epítopo extracelular de um receptor de célula NK de uma ou mais das espécies selecionadas dentre humana, espécie Macaca e espécie de roedor.

[0021] A locução “receptor de célula NK” como usada no contexto da invenção define proteínas e complexos de proteína na superfície de células NK. Assim, a locução define moléculas de superfície celular, que são características a células NK, mas não são necessariamente expressas exclusivamente na superfície das células NK como também em outras células, tais como macrófagos ou células T. Exemplos de receptores de células NK compreendem, porém sem limitação, CD16a, CD16b, NKp46 e NKG2D.

[0022] “CD16A” se refere ao receptor de ativação CD16A, também conhecido como FcγRIIIA, expresso na superfície celular de células NK. CD16A é um receptor de ativação que aciona a atividade citotóxica das células NK. A afinidade dos anticorpos para o CD16A se correlaciona diretamente com a sua capacidade de acionar a ativação de células NK, assim, uma maior afinidade com relação ao CD16A reduz a dose de anticorpo exigida para a

9 / 95 ativação. O local de ligação a antígeno da proteína de ligação a antígeno se liga ao CD16A, mas não ao CD16B. Por exemplo, um local de ligação a antígeno que compreende domínios variáveis de cadeia pesada (VH) e leve (VL) ligados ao CD16A, mas não ligados ao CD16B, pode ser provido por um local de ligação a antígeno que especificamente se liga a um epítopo do CD16A que compreende resíduos de aminoácido da sequência de C-terminal SFFPPGYQ (SEQ ID nº:172) e/ou resíduos G130 e/ou Y141 do CD16A (SEQ ID nº:23)) que não estão presentes no CD16B.

[0023] “CD16B” se refere ao receptor CD16B, também conhecido como FcγRIIIB, expresso em neutrófilos e eosinófilos. O receptor é ancorado por glicosilfosfatidilinositol (GPI) e entende-se que não aciona qualquer espécie de atividade citotóxica das células imunes CD16B positivo.

[0024] “NKp46” se refere a um receptor ativador de citotoxicidade que pode contribuir para a eficiência aumentada de células exterminadoras naturais (NK) ativadas para mediar a lise de célula tumoral. Ele também é conhecido como NCR1 ou CD335.

[0025] “NKG2D” se refere a um receptor ativador e coestimulador envolvido na imunovigilância mediante a ligação a vários ligantes celulares induzíveis por estresse exibidos na superfície de células tumorais autólogas e células infectadas por vírus. Provê respostas imunológicas estimuladoras e coestimuladoras inatas em células exterminadoras (NK) ativadas, levando à atividade citotóxica. Age como um receptor coestimulador para receptor de células T (TCR) em respostas imunológicas adaptativas mediadas por células T CD8(+) amplificando a ativação de células T. Estimula a eliminação mediada por perforina de células tumorais que expressam ligantes. Ele também é conhecido como Receptor K1, KLRK1 ou CD314 semelhante a lectina de célula exterminadora.

[0026] A locução “antígeno-alvo de superfície celular” se refere a uma estrutura antigênica expressa por uma célula e que está presente na superfície

10 / 95 celular de modo que seja acessível para uma construção de anticorpo como descrita no presente documento. Ele pode ser uma proteína, preferivelmente a porção extracelular de uma proteína, um peptídeo que se apresenta na superfície celular em um contexto de MHC (incluindo HLA-A2, HLA-A11, HLA-A24, HLA-B44, HLA-C4) ou uma estrutura de carboidrato, preferivelmente uma estrutura de carboidrato de uma proteína, tal como uma glicoproteína. Ele é preferivelmente um antígeno associado a tumor ou restrito a tumor.

[0027] A locução “construção de anticorpo biespecífica” como definida no contexto da invenção também abrange construções de anticorpo multiespecíficas tais como construções de anticorpo triespecíficas, estas incluindo três domínios de ligação, ou construções com mais de três especificidades (por exemplo, quatro, cinco...). Exemplos de construções de anticorpo biespecíficas ou multiespecíficas são providos, por exemplo, nos documentos WO 2006/125668, WO 2015/158636, WO 2017/064221, PCT/EP2019/056516, PCT/IB2019/ 053040 e Ellwanger et a. (MAbs. julho de 2019;11(5):899-918).

[0028] Visto que as construções de anticorpo como definidas no contexto da invenção são (pelo menos) biespecíficas, elas não ocorrem naturalmente e são marcadamente diferentes de produtos de ocorrência natural. Uma construção de anticorpo ou imunoglobulina “biespecífica” é, portanto, um anticorpo ou imunoglobulina híbridos artificiais com pelo menos dois lados de ligação distintos com diferentes especificidades. As construções de anticorpo biespecíficas podem ser produzidas por uma variedade de métodos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos de Fab'. Consultar, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315- 321 (1990).

[0029] Os pelo menos dois domínios de ligação e os domínios variáveis (VH/VL) da construção de anticorpo da presente invenção podem compreender ou não linkers de peptídeo (peptídeos espaçadores). A locução “linker de peptídeo” compreende de acordo com a presente invenção uma sequência de

11 / 95 aminoácidos por meio da qual as sequências de aminoácidos de um domínio (variável e/ou de ligação) e outro domínio (variável e/ou de ligação) da construção de anticorpo definida no presente documento são ligadas entre si. Os linkers de peptídeo podem também ser usados para fundir o terceiro domínio aos outros domínios da construção de anticorpo definida no presente documento. Uma característica técnica essencial de tal linker de peptídeo é que ele não compreende qualquer atividade de polimerização.

[0030] As construções de anticorpo como definidas no contexto da invenção são preferivelmente “construções de anticorpo geradas in vitro”. Essa locução se refere a uma construção de anticorpo de acordo com a definição acima em que toda ou parte da região variável (por exemplo, pelo menos uma CDR) é gerada em uma seleção de células não imunes, por exemplo, uma exibição de fagos in vitro, chip de proteína ou qualquer outro método no qual sequências candidatas possam ser testadas quanto à sua capacidade de se ligar a um antígeno. Assim, essa locução preferivelmente exclui sequências geradas unicamente por rearranjo genômico em uma célula imune em um animal. Um “anticorpo recombinante” é um anticorpo feito através do uso de tecnologia de DNA recombinante ou engenharia genética.

[0031] A locução “anticorpo monoclonal” (mAb) ou construção de anticorpo monoclonal como usada no presente documento se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto por possíveis mutações de ocorrência natural e/ou modificações pós tradução (por exemplo, isomerizações, amidações) que podem estar presentes em pequenas quantidades. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um lado ou determinante antigênico único no antígeno, em contraste com preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que normalmente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (ou epítopos). Além de sua

12 / 95 especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que são sintetizados pela cultura de hibridoma, portanto, não contaminados por outras imunoglobulinas. O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método particular.

[0032] Para a preparação de anticorpos monoclonais, pode-se usar qualquer técnica que proveja anticorpos produzidos por culturas de linhagem celular contínua. Por exemplo, anticorpos monoclonais a serem usados podem ser feitos pelo método de hibridoma descrito pela primeira vez por Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante (consultar, por exemplo, a patente norte-americana nº

4.816.567). Exemplos de técnicas adicionais para produzir anticorpos monoclonais humanos incluem a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de célula B humano (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) e a técnica de hibridoma EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96).

[0033] Os hibridomas podem então ser triados usando métodos padrão, tais como ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (ELISA) e análise de ressonância de plasmônio de superfície (BIACORE™), para identificar um ou mais hibridomas que produzam um anticorpo que especificamente se liga a um antígeno específico. Qualquer forma do antígeno relevante pode ser usada como o imunógeno, por exemplo, antígeno recombinante, formas de ocorrência natural, quaisquer variantes ou fragmentos do mesmo, assim como um peptídeo antigênico do mesmo. A ressonância de plasmônio de superfície como empregada no sistema BIAcore pode ser usada para aumentar a eficiência dos anticorpos em fagos que se ligam a um epítopo de um antígeno-alvo de superfície celular, (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Outro método

13 / 95 exemplificativo para produzir anticorpos monoclonais inclui triar bibliotecas de expressão de proteína, por exemplo, bibliotecas de exibição de fago ou de exibição de ribossomo. A exibição de fago é descrita, por exemplo, em Ladner et al., patente norte-americana nº 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315- 1317, Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 -597 (1991).

[0034] Além do uso de bibliotecas de exibição, o antígeno relevante pode ser usado para imunizar um animal não humano, por exemplo, um roedor (tal como um camundongo, um hamster, um coelho ou um rato). Em uma modalidade, o animal não humano inclui pelo menos uma parte de um gene de imunoglobulina humana. Por exemplo, é possível engenheirar cepas de camundongo deficientes na produção de anticorpos de camundongo com fragmentos grandes dos loci de Ig (imunoglobulina) humana. Usando a tecnologia de hibridoma, podem ser produzidos e selecionados anticorpos monoclonais específicos a antígeno derivados dos genes com a especificidade desejada. Consultar, por exemplo, XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096, e WO 96/33735.

[0035] Um anticorpo monoclonal pode também ser obtido de um animal não humano e, então, modificado, por exemplo, humanizado, desimunizado, tornado quimérico etc., usando técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica. Exemplos de construções de anticorpo modificadas incluem variantes humanizadas de anticorpos não humanos, anticorpos com “com afinidade maturada” (consultar, por exemplo, Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) e Lowman et al., Biochemistry 30, 10832- 10837 (1991 )) e mutantes de anticorpo com função(ões) efetora(s) alterada(s) (consultar, por exemplo, a patente norte-americana 5.648.260, Kontermann e Dubel (2010), loc. cit. e Little (2009), loc. cit).

[0036] Em imunologia, a maturação de afinidade é o processo pelo qual as células B produzem anticorpos com afinidade aumentada para antígeno

14 / 95 durante uma resposta imunológica. Com exposições repetidas ao mesmo antígeno, um hospedeiro produzirá anticorpos de afinidades sucessivamente maiores. Assim como o protótipo natural, a maturação de afinidade in vitro é baseada nos princípios da mutação e seleção. A maturação de afinidade in vitro foi usada com sucesso para otimizar anticorpos, construções de anticorpo e fragmentos de anticorpo. Mutações aleatórias dentro das CDRs são introduzidas usando radiação, mutágenos químicos ou PCR com propensão a erro. Além disso, a diversidade genética pode ser aumentada por embaralhamento (shuffling) de cadeia. Duas ou três rodadas de mutação e seleção usando os métodos de exibição tais como a exibição de fago normalmente resultam em fragmentos de anticorpo com afinidades na faixa nanomolar baixa.

[0037] Um tipo preferencial de uma variação de substituição de aminoácidos das construções de anticorpo envolve substituir um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Em geral, a(s) variante(s) resultante(s) para desenvolvimento adicional terá(ão) propriedades biológicas melhoradas em relação ao anticorpo parental do qual elas são geradas. Um modo conveniente de gerar tais variantes de substituição envolve maturação de afinidade usando exibição de fago. Brevemente, vários lados de região hipervariável (por exemplo, 6 a 7 lados) são mutados para gerar todas as substituições de aminoácidos possíveis em cada lado. As variantes de anticorpo assim geradas são exibidas de maneira monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusões ao produto de gene III do M13 empacotado dentro de cada partícula. As variantes exibidas em fago são então triadas quanto à sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) como revelado no presente documento. A fim de identificar os lados candidatos de região hipervariável para modificação, pode ser realizada mutagênese por varredura de alanina para identificar resíduos de região hipervariável que contribuam significativamente

15 / 95 à ligação a antígeno. Alternativa ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo antígeno-anticorpo para identificar os pontos de contato entre o domínio de ligação e, por exemplo, o antígeno-alvo de superfície celular humano. Tais resíduos de contato e resíduos adjacentes são candidatos a substituição de acordo com as técnicas elaboradas no presente documento. Uma vez que tais variantes são geradas, o painel de variantes é submetido a triagem como descrito no presente documento e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

[0038] Os anticorpos monoclonais e construções de anticorpo da presente invenção especificamente incluem anticorpos “quiméricos” (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (patente norte-americana nº 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 81 : 6851 -6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse no presente documento incluem anticorpos “primitizados” que compreendem sequências de ligação a antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, macaco do velho mundo, antropoide, etc.) e sequências de região constante humana. Uma variedade de abordagens para produzir anticorpos quiméricos foi descrita. Consultar, por exemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81 :6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., patente norte-americana nº 4,816,567; Boss et al., patente norte- americana nº 4,816,397; Tanaguchi et al., EP 0171496; EP 0173494; e GB

2177096.

16 / 95

[0039] Um anticorpo, uma construção de anticorpo, um fragmento de anticorpo ou uma variante de anticorpo também podem ser modificados por deleção específica de epítopos de células T humanas (um método chamado de “desimunização”) pelos métodos revelados, por exemplo, nos documentos WO 98/52976 ou WO 00/34317. Brevemente, os domínios variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo podem ser analisados quanto a peptídeos que se ligam a MHC classe II; esses peptídeos representam potenciais epítopos de células T (como definido nos documentos WO 98/52976 e WO 00/34317). Para a detecção de potenciais epítopos de células T, pode ser aplicada uma abordagem de modelagem computadorizada denominada “enovelamento de peptídeo” (threading) e, além disso, um banco de dados de peptídeos de ligação de MHC classe II humano pode ser pesquisado em busca de motivos presentes nas sequências VH e VL, como descrito nos documentos WO 98/52976 e WO 00/34317. Esses motivos se ligam a qualquer um dos 18 alótipos DR de MHC principal classe II e, assim, constituem potenciais epítopos de células T. Os potenciais epítopos de células T detectados podem ser eliminados substituindo- se pequenas quantidades de resíduos de aminoácidos nos domínios variáveis ou, preferivelmente, por substituições de um único aminoácido. Normalmente, são feitas substituições conservadoras. Muitas vezes, embora não exclusivamente, pode-se usar um aminoácido comum a uma posição em sequências de anticorpos de linhagem germinativa humana. Sequências de linhagem germinativa humana são reveladas, por exemplo, em Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; e Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14:4628- 4638. O diretório V BASE provê um diretório abrangente de sequências de região variável de imunoglobulina humana (compiladas por Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Essas sequências podem ser usadas como uma fonte de sequência humana, por exemplo, para regiões de arcabouço e CDRs. As regiões de arcabouço humanas consenso

17 / 95 também podem ser usadas, por exemplo, como descrito na patente norte- americana nº 6.300.064.

[0040] Anticorpos “humanizados”, construções de anticorpo, variantes ou fragmentos dos mesmos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação a antígeno de anticorpos) são anticorpos ou imunoglobulinas de sequências em sua maioria humanas, que contêm (uma) sequência(s) mínima(s) derivada(s) de imunoglobulina não humana. Na maior parte das vezes, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nas quais resíduos de uma região hipervariável (também CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (por exemplo, roedor) (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, hamster ou coelho, com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos de região de arcabouço (FR) Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Ademais, “anticorpos humanizados” como usados no presente documento podem também compreender resíduos que não sejam encontrados nem no anticorpo recipiente nem no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar e otimizar ainda mais o desempenho dos anticorpos. O anticorpo humanizado pode compreender também pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), normalmente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, consultar Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593- 596 (1992).

[0041] Anticorpos humanizados ou fragmentos dos mesmos podem ser gerados substituindo-se as sequências do domínio variável Fv que não estejam diretamente envolvidas na ligação a antígeno por sequências equivalentes de domínios variáveis Fv humanos. Métodos exemplificativos para gerar anticorpos humanizados ou fragmentos dos mesmos são providos por Morrison (1985) Science 229:1202-1207; por Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; e

18 / 95 pelos documentos US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; e US 6.407.213. Esses métodos incluem isolar, manipular e expressar as sequências de ácidos nucleicos que codificam todos ou parte dos domínios variáveis Fv de imunoglobulina de pelo menos uma dentre uma cadeia pesada ou leve. Tais ácidos nucleicos podem ser obtidos a partir de um hibridoma que produza um anticorpo contra um alvo predeterminado, como descrito acima, assim como a partir de outras fontes. O DNA recombinante que codifica a molécula de anticorpo humanizado pode então ser clonado em um vetor de expressão apropriado.

[0042] Anticorpos humanizados podem também ser produzidos usando-se animais transgênicos tais como camundongos que expressam genes humanos de cadeia pesada e leve, mas são incapazes de expressar os genes endógenos de cadeia pesada e leve de imunoglobulina de camundongo. Winter descreve um método de enxerto de CDR exemplificativo que pode ser usado para preparar os anticorpos humanizados descritos no presente documento (patente norte-americana nº 5.225.539). Todas as CDRs de um anticorpo humano particular podem ser substituídas por pelo menos uma porção de uma CDR não humana, ou somente algumas das CDRs podem ser substituídas por CDRs não humanas. É apenas necessário substituir o número de CDRs exigido para a ligação do anticorpo humanizado a um antígeno predeterminado.

[0043] Um anticorpo humanizado pode ser otimizado pela introdução de substituições conservadoras, substituições de sequência consenso, substituições de linhagem germinativa e/ou retromutações. Tais moléculas de imunoglobulina alteradas podem ser produzidas por qualquer uma das várias técnicas conhecidas na técnica (por exemplo, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3- 16, 1982, e EP 239 400).

[0044] As locuções “anticorpo humano”, “construção de anticorpo humano” e “domínio de ligação humano” incluem anticorpos, construções de

19 / 95 anticorpo e domínios de ligação com regiões de anticorpo tais como regiões constantes e variáveis que correspondem substancialmente a sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, as descritas por Kabat et al. (1991) (loc. cit.). Os anticorpos humanos, construções de anticorpo ou domínios de ligação como definidos no contexto da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica a lado in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e, em particular, na CDR3. Os anticorpos humanos, construções de anticorpo ou domínios de ligação podem ter pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou mais posições substituídas por um resíduo de aminoácido que não seja codificado pela sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. A definição de anticorpos humanos, construções de anticorpo e domínios de ligação como usados no presente documento, no entanto, também contempla “anticorpos totalmente humanos”, que incluem somente sequências humanas não alteradas artificialmente e/ou geneticamente de anticorpos visto que essas podem ser derivadas usando-se tecnologias ou sistemas tais como o Xenomouse. Preferivelmente, um “anticorpo totalmente humano” não inclui resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana.

[0045] Em algumas modalidades, as construções de anticorpo definidas no presente documento são construções de anticorpo “isoladas” ou “substancialmente puras”. “Isolada(s)” ou “substancialmente pura(s)”, quando usados para descrever as construções de anticorpo reveladas no presente documento, significam uma construção de anticorpo que foi identificada, separada e/ou recuperada de um componente de seu ambiente de produção. Preferivelmente, a construção de anticorpo é livre ou substancialmente livre de associação com todos os outros componentes de seu ambiente de produção. Os

20 / 95 componentes contaminantes de seu ambiente de produção, tais como os resultantes de células transfectadas recombinantes, são materiais que normalmente interfeririam nos usos diagnósticos ou terapêuticos do polipeptídeo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. As construções de anticorpo podem, por exemplo, constituir pelo menos cerca de 5%, ou pelo menos cerca de 50%, em peso da proteína total em uma determinada amostra. Entende-se que a proteína isolada pode constituir de 5% a 99,9% em peso do teor total de proteína, dependendo das circunstâncias. O polipeptídeo pode ser feito em uma concentração significativamente mais alta através do uso de um promotor induzível ou promotor de alta expressão, de modo que ele seja feito em níveis aumentados de concentração. A definição inclui a produção de uma construção de anticorpo em uma ampla variedade de organismos e/ou células hospedeiras que são conhecidos na técnica. Em modalidades preferenciais, a construção de anticorpo será purificada (1) a um grau suficiente para se obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou sequência de aminoácidos interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (2) à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras usando coloração de azul de Coomassie ou, preferivelmente, de prata. Normalmente, no entanto, uma construção de anticorpo isolada será preparada por pelo menos uma etapa de purificação.

[0046] A locução “domínio de ligação” caracteriza, em conexão com a presente invenção, um domínio que (especificamente) se liga a/interage com/reconhece um determinado epítopo-alvo ou um determinado lado-alvo nas moléculas-alvo (antígenos), por exemplo, um antígeno de receptor de célula NK, por exemplo, CD16, e um antígeno-alvo de superfície celular, respectivamente. A estrutura e função do primeiro domínio de ligação (que reconhece, por exemplo, o CD16) e, preferivelmente, também a estrutura e/ou função do segundo domínio de ligação (que reconhece o antígeno-alvo de superfície celular) são baseadas na estrutura e/ou função de um anticorpo, por

21 / 95 exemplo, de uma molécula de imunoglobulina completa ou inteira e/ou são retiradas dos domínios de cadeia pesada variável (VH) e/ou de cadeia leve variável (VL) de um anticorpo ou fragmento do mesmo. Preferivelmente, o primeiro domínio de ligação é distinguido pela presença de três CDRs de cadeia leve (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da região de VL) e/ou três CDRs (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da região de VH). O segundo domínio de ligação preferivelmente também compreende os requisitos estruturais mínimos de um anticorpo que permitem a ligação a alvo. Mais preferivelmente, o segundo domínio de ligação compreende pelo menos três CDRs de cadeia leve (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da região de VL) e/ou três CDRs de cadeia pesada (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3 da região de VH). É concebido que o primeiro e/ou o segundo domínio de ligação são produzidos ou obteníveis por métodos de exibição de fago ou de triagem de biblioteca em vez de por enxerto de sequências de CDR de um anticorpo (monoclonal) pré-existente em uma matriz.

[0047] De acordo com a presente invenção, os domínios de ligação são na forma de um ou mais polipeptídeos. Tais polipeptídeos podem incluir partes proteináceas e partes não proteináceas (por exemplo, linkers químicos ou agentes de reticulação químicos tais como glutaraldeído). As proteínas (incluindo fragmentos das mesmas, preferivelmente fragmentos biologicamente ativos, e peptídeos, normalmente com menos de 30 aminoácidos) compreendem dois ou mais aminoácidos acoplados entre si por meio de uma ligação de peptídeo covalente (resultando em uma cadeia de aminoácidos).

[0048] O termo “polipeptídeo” como usado no presente documento descreve um grupo de moléculas, que normalmente consistem em mais de 30 aminoácidos. Os polipeptídeos podem ainda formar multímeros tais como dímeros, trímeros e oligômeros, isto é, que consistem em mais de uma molécula de polipeptídeo. As moléculas de polipeptídeo que formam tais dímeros,

22 / 95 trímeros, etc., podem ser idênticas ou não idênticas. As estruturas de ordem mais alta correspondentes de tais multímeros são, consequentemente, denominadas homodímeros ou heterodímeros, homotrímeros ou heterotrímeros, etc. Um exemplo de um heteromultímero é uma molécula de anticorpo, que, em sua forma de ocorrência natural, consiste em duas cadeias polipeptídicas leves idênticas e cadeias polipeptídicas pesadas idênticas. Os termos “peptídeo”, “polipeptídeo” e “proteína” também se referem a peptídeos/polipeptídeos/proteínas modificados naturalmente em que a modificação é afetada, por exemplo, por modificações pós-tradução tais como glicosilação, acetilação, fosforilação e similares. Um “peptídeo”, “polipeptídeo” ou “proteína” quando referidos no presente documento podem também ser quimicamente modificados, tal como peguilados. Tais modificações são bem conhecidas na técnica e descritas abaixo no presente documento.

[0049] Preferivelmente, o domínio de ligação que se liga ao antígeno de receptor de célula NK, por exemplo, CD16 e/ou o domínio de ligação que se liga ao antígeno-alvo de superfície celular são domínios de ligação humanos. Anticorpos e construções de anticorpo que compreendem pelo menos um domínio de ligação humano evitam alguns dos problemas associados a anticorpos ou construções de anticorpo que possuem regiões variáveis e/ou constantes não humanas, tais como de roedor (por exemplo, murinas, de rato, hamster ou coelho). A presença de tais proteínas derivadas de roedor pode levar à rápida remoção dos anticorpos ou construções de anticorpo ou pode levar à geração de uma resposta imunológica contra o anticorpo ou construção de anticorpo por parte de um paciente. A fim de evitar o uso de anticorpos ou construções de anticorpo derivados de roedor, anticorpos/construções de anticorpo humanos ou totalmente humanos podem ser gerados através da introdução de função de anticorpo humano em um roedor de modo que o roedor produza anticorpos totalmente humanos.

23 / 95

[0050] A capacidade de clonar e reconstruir loci humanos de megabases de tamanho em YACs e de os introduzir na linhagem germinativa de camundongo provê uma abordagem poderosa para elucidar os componentes funcionais de loci bem grandes ou de mapeamento bruto assim como gerar modelos úteis de doença humana. Ademais, o uso de tal tecnologia para a substituição de loci de camundongo pelos seus equivalentes humanos pode prover compreensões únicas acerca da expressão e regulação de produtos de gene humano durante o desenvolvimento, da sua comunicação com outros sistemas e do seu envolvimento na indução e progressão de doenças.

[0051] Uma aplicação prática importante de uma estratégia como essa é a “humanização” do sistema imunológico humoral dos camundongos. A introdução de loci de imunoglobulina (Ig) humana em camundongos nos quais os genes de Ig endógenos foram inativados oferece a oportunidade de estudar os mecanismos subjacentes à expressão e montagem programadas de anticorpos assim como o seu papel no desenvolvimento de células B. Ademais, uma estratégia como essa pode prover uma fonte ideal para a produção de anticorpos monoclonais (mAbs) totalmente humanos - um importante marco em direção à realização da promessa de terapia de anticorpo em doenças humanas. Espera-se que anticorpos ou construções de anticorpo totalmente humanos minimizem as respostas imunogênicas e alérgicas intrínsecas a mAbs de camundongo ou derivados de camundongo e, assim, aumentem a eficácia e a segurança dos anticorpos/construções de anticorpo administrados. Pode-se esperar que o uso de anticorpos ou construções de anticorpo totalmente humanos proveja uma vantagem substancial no tratamento de doenças humanas crônicas e recorrentes, tais como inflamação, autoimunidade e câncer, que exigem repetidas administrações de composto.

[0052] Uma abordagem em direção a esse objetivo era engenheirar cepas de camundongo deficientes na produção de anticorpos de camundongos com fragmentos grandes dos loci de Ig humana na expectativa de que tais

24 / 95 camundongos produzissem um grande repertório de anticorpos humanos na ausência de anticorpos de camundongo.

Os fragmentos grandes de Ig humana preservariam a grande diversidade de genes variáveis assim como a regulação adequada da produção e expressão de anticorpos.

Explorando-se o maquinário de camundongos para a diversificação e seleção de anticorpos e a falta de tolerância imunológica a proteínas humanas, o repertório de anticorpo humano reproduzido nessas cepas de camundongo deve render anticorpos de alta afinidade contra qualquer antígeno de interesse, incluindo antígenos humanos.

Usando a tecnologia de hibridoma, mAbs humanos específicos a antígeno com a especificidade desejada poderiam ser prontamente produzidos e selecionados.

Essa estratégia geral foi demonstrada em conexão com a geração das primeiras cepas de camundongo XenoMouse (consultar Green et al.

Nature Genetics 7:13- 21 (1994)). As cepas XenoMouse foram engenheiradas com cromossomos artificiais de levedura (YACs) contendo fragmentos de configuração de linhagem germinativa com 245 kb e 190 kb de tamanho do locus de cadeia pesada e do locus de cadeia leve kappa humanos, respectivamente, que continham sequências de região variável e constante de núcleo.

A Ig humana contendo YACs se provou compatível com o sistema de camundongo tanto para o rearranjo quanto para a expressão de anticorpos e foi capaz de substituir os genes de Ig de camundongo inativados.

Isso foi demonstrado por sua capacidade de induzir o desenvolvimento de células B, de produzir repertório humano semelhante a adulto de anticorpos totalmente humanos e de gerar mAbs humanos específicos a antígeno.

Esses resultados também sugeriram que a introdução de porções maiores dos loci de Ig humana contendo números maiores de genes V, elementos regulatórios adicionais e regiões constantes de Ig humana pode recapitular substancialmente o repertório total que é característico da resposta humoral humana a infecção e imunização.

A obra de Green et al. foi recentemente estendida à introdução de mais que aproximadamente 80% do repertório de anticorpo humano através da

25 / 95 introdução de fragmentos de YAC de configuração de linhagem germinativa de megabases de tamanho dos loci de cadeia pesada humanos e dos loci de cadeia leve kappa, respectivamente. Consultar Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) e o pedido de patente norte-americano de nº de série 08/759.620.

[0053] A produção dos camundongos XenoMouse é adicionalmente discutida e delineada nos pedidos de patente norte-americanos de nº de série 07/466.008, nº de série 07/610.515, nº de série 07/919.297, nº de série 07/922.649, nº de série 08/031.801, nº de série 08/1 12.848, nº de série 08/234.145, nº de série 08/376.279, nº de série 08/430.938, nº de série 08/464.584, nº de série 08/464.582, nº de série 08/463.191, nº de série 08/462.837, nº de série 08/486.853, nº de série 08/486.857, nº de série 08/486.859, nº de série 08/462.513, nº de série 08/724.752 e nº de série 08/759.620; e as patentes norte-americanas nº 6.162.963; 6.150.584; 6.1

14.598; 6.075.181 e 5.939.598 e as patentes japonesas nº 3 068 180 B2, 3 068 506 B2 e 3 068 507 B2. Consultar também Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) e Green e Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), EP 0 463 151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310 e WO 03/47336.

[0054] Em uma abordagem alternativa, outros, incluindo GenPharm International, Inc., utilizaram uma abordagem de “minilocus”. Na abordagem de minilocus, um locus de Ig exógeno é imitado através da inclusão de peças (genes individuais) do locus de Ig. Assim, um ou mais genes de VH, um ou mais genes de DH, um ou mais genes de JH, uma região constante mu e uma segunda região constante (preferivelmente uma região constante gama) são formados como uma construção para inserção em um animal. Essa abordagem é descrita na patente norte-americana nº 5.545.807 de Surani et al. e na patente norte-americana nº 5.545.806; 5.625.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016;

5.770.429; 5.789.650; 5.814.318; 5.877.397; 5.874.299; e 6.255.458, todas de

26 / 95 Lonberg e Kay, nas patentes norte-americanas nº 5.591.669 e 6.023.010 de Krimpenfort e Berns, nas patentes norte-americanas nº 5.612.205; 5.721.367; e

5.789.215 de Berns et al., e na patente norte-americana nº 5.643.763 de Choi e Dunn, e nos pedidos de patente norte-americanos da GenPharm International nº de série 07/574.748, nº de série 07/575.962, nº de série 07/810.279, nº de série 07/853.408, nº de série 07/904.068, nº de série 07/990.860, nº de série 08/053.131, nº de série 08/096.762, nº de série 08/155.301, nº de série 08/161.739, nº de série 08/165.699, nº de série 08/209,741. Consultar também EP 0 546 073 B1, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, e WO 98/24884 e a patente norte-americana n° 5.981.175. Consultar ainda Taylor et al. (1992), Chen et al. (1993), Tuaillon et al. (1993), Choi et al. (1993), Lonberg et al. (1994), Taylor et al. (1994), e Tuaillon et al. (1995), Fishwild et al. (1996).

[0055] Kirin também demonstrou a geração de anticorpos humanos de camundongos nos quais, através da fusão de microcélulas, foram introduzidos pedaços grandes de cromossomos, ou cromossomos inteiros. Consultar os pedidos de patente europeus nº 773 288 e 843 961. A Xenerex Biosciences está desenvolvendo uma tecnologia para a potencial geração de anticorpos humanos. Nessa tecnologia, camundongos SCID são reconstituídos com células linfáticas humanas, por exemplo, células B e/ou T. Os camundongos são então imunizados com um antígeno e podem gerar uma resposta imunológica contra o antígeno. Consultar as patentes norte-americanas nº

5.476.996; 5.698.767; e 5.958.765.

[0056] As respostas de anticorpos humanos anticamundongo (HAMA) levaram a indústria a preparar anticorpos quiméricos ou de outro modo humanizados. É esperado, no entanto, que certas respostas de anticorpos humanos antiquiméricos (HACA) sejam observadas, particularmente em utilizações crônicas ou multidose do anticorpo. Assim, seria desejável prover

27 / 95 construções de anticorpo compreendendo um domínio de ligação humano contra o antígeno-alvo de superfície celular e um domínio de ligação humano contra CD16 a fim de anular preocupações e/ou efeitos da resposta HAMA ou HACA.

[0057] As locuções “(especificamente) se liga a”, “(especificamente) reconhece”, “é (especificamente) direcionado(a) a” e “(especificamente) reage com” significam de acordo com esta invenção que um domínio de ligação interage ou especificamente interage com um determinado epítopo ou um determinado lado-alvo nas moléculas-alvo (antígenos), aqui: o receptor de célula NK, por exemplo, CD16a, e o antígeno-alvo de superfície celular, respectivamente.

[0058] O termo “epítopo” se refere a um lado em um antígeno ao qual especificamente se liga um domínio de ligação, tal como um anticorpo ou imunoglobulina, ou um derivado, fragmento ou variante de um anticorpo ou uma imunoglobulina. Um “epítopo” é antigênico e, assim, o termo epítopo é ás vezes também referido no presente documento como “estrutura antigênica” ou “determinante antigênico”. Assim, o domínio de ligação é um “lado de interação com antígeno”. A dita ligação/interação também é entendida como definindo um “reconhecimento específico”.

[0059] “Epítopos” podem ser formados por aminoácidos contíguos ou por aminoácidos não contíguos justapostos por dobramento terciário de uma proteína. Um “epítopo linear” é um epítopo em que uma sequência primária de aminoácidos compreende o epítopo reconhecido. Um epítopo linear tipicamente inclui pelo menos 3 ou pelo menos 4 e, mais normalmente, pelo menos 5 ou pelo menos 6 ou pelo menos 7, por exemplo, cerca de 8 a cerca de 10 aminoácidos em uma sequência única.

[0060] Um “epítopo conformacional”, diferentemente de um epítopo linear, é um epítopo em que a sequência primária dos aminoácidos que compreendem o epítopo não é o único componente definidor do epítopo

28 / 95 reconhecido (por exemplo, um epítopo em que a sequência primária de aminoácidos não é necessariamente reconhecida pelo domínio de ligação). Tipicamente, um epítopo conformacional compreende um número aumentado de aminoácidos em relação a um epítopo linear. No que se refere ao reconhecimento de epítopos conformacionais, o domínio de ligação reconhece uma estrutura tridimensional do antígeno, preferivelmente um peptídeo ou proteína ou fragmento da mesma (no contexto da presente invenção, a estrutura antigênica de um dos domínios de ligação é compreendida dentro da proteína de antígeno-alvo de superfície celular). Por exemplo, quando uma molécula de proteína dobra para formar uma estrutura tridimensional, certos aminoácidos e/ou a cadeia principal de polipeptídeo que formam o epítopo conformacional se tornam justapostos, possibilitando que o anticorpo reconheça o epítopo. Os métodos para determinar a conformação dos epítopos incluem, porém sem limitação, cristalografia de raios X, espectroscopia por ressonância magnética nuclear bidimensional (2D-NMR) e marcação de spin sítio-dirigida e espectroscopia por ressonância paramagnética eletrônica (EPR).

[0061] A interação entre o domínio de ligação e o epítopo ou a região que compreende o epítopo sugere que um domínio de ligação exibe uma afinidade considerável para o epítopo/a região que compreende o epítopo em uma proteína ou antígeno particular (aqui: o receptor de célula NK, por exemplo, CD16a, e o antígeno-alvo de superfície celular, respectivamente) e, em geral, não exibe reatividade significativa com proteínas ou antígenos que não o receptor de célula NK, por exemplo, CD16a, e o antígeno-alvo de superfície celular. “Afinidade considerável” inclui a ligação com uma afinidade de cerca de 106 M (KD) ou mais forte. Preferivelmente, a ligação é considerada específica quando a afinidade de ligação é cerca de 10-12 a 10-8 M, 10-12 a 10-9 M, 10-12 a 10-10 M, 10-11 a 10-8 M, preferivelmente de cerca de 10-11 a 10-9 M. Pode-se testar prontamente se um domínio de ligação reage especificamente ou se liga a um alvo comparando-se, inter alia, a reação do dito

29 / 95 domínio de ligação a uma proteína-alvo ou antígeno-alvo com a reação do dito domínio de ligação a proteínas ou antígenos que não o receptor de célula NK, por exemplo, CD16a, e o antígeno-alvo de superfície celular. Preferivelmente, um domínio de ligação como definido no contexto da invenção não essencial ou substancialmente se liga a proteínas ou antígenos que não o receptor de célula NK, por exemplo, CD16a, e o antígeno-alvo de superfície celular (isto é, o primeiro domínio de ligação não é capaz de se ligar a proteínas que não o receptor de célula NK, por exemplo, CD16a, e o segundo domínio de ligação não é capaz de se ligar a proteínas que não o antígeno-alvo de superfície celular).

[0062] A locução “não essencialmente/substancialmente se liga” ou “não é capaz de se ligar” significa que um domínio de ligação da presente invenção não se liga a uma proteína ou antígeno que não o receptor de célula NK, por exemplo, CD16a, e o antígeno-alvo de superfície celular, isto é, não mostra reatividade de mais do que 30%, preferivelmente não mais do que 20%, mais preferivelmente não mais do que 10%, de maneira particularmente preferível, não mais do que 9%, 8%, 7%, 6% ou 5% com proteínas ou antígenos que não o receptor de célula NK, por exemplo, CD16a, e o antígeno-alvo de superfície celular, de modo que a ligação ao receptor de célula NK, por exemplo, CD16a, e o antígeno-alvo de superfície celular, respectivamente, é configurada para ser 100%.

[0063] Acredita-se que a ligação específica é afetada por motivos específicos na sequência de aminoácidos do domínio de ligação e do antígeno. Assim, a ligação é alcançada como resultado de suas estruturas primárias, secundárias e/ou terciárias assim como o resultado de modificações secundárias das ditas estruturas. A interação específica do lado de interação com antígeno com seu antígeno específico pode resultar em uma ligação simples do dito lado ao antígeno. Ademais, a interação específica do lado de interação com antígeno com seu antígeno específico pode alternativa ou adicionalmente resultar na

30 / 95 iniciação de um sinal, por exemplo, devido à indução de uma mudança da conformação do antígeno, uma oligomerização do antígeno, etc.

[0064] O termo “variável” se refere às porções dos domínios de anticorpo ou imunoglobulina que exibem variabilidade em sua sequência e que estão envolvidas na determinação da especificidade e afinidade de ligação de um anticorpo particular (isto é, o(s) “domínio(s) variável(is)”). O pareamento entre uma cadeia pesada variável (VH) e uma cadeia leve variável (VL) forma um lado único de ligação a antígeno.

[0065] A variabilidade não é uniformemente distribuída por todos os domínios variáveis dos anticorpos; ela é concentrada em subdomínios de cada uma das regiões variáveis de cadeia pesada e leve. Esses subdomínios são chamados de “regiões hipervariáveis” ou “regiões determinantes de complementaridade” (CDRs). As porções mais conservadas (isto é, não hipervariáveis) dos domínios variáveis são chamadas de as regiões de “arcabouço” (FRM ou FR) e proveem uma matriz para as seis CDRs em espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação a antígeno. Os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de ocorrência natural compreendem, cada um, quatro regiões FRM (FR1, FR2, FR3 e FR4), adotando em grande parte uma configuração de folha β, conectados por três regiões hipervariáveis, que formam laços que conectam a, e em alguns formam parte da, estrutura de folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pela FRM e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do lado de ligação a antígeno (consultar Kabat et al., loc. cit.).

[0066] O termo “CDR”, e seu plural “CDRs”, se refere à região determinante de complementaridade da qual três compõem o caráter de ligação de uma região variável de cadeia leve (CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3) e três compõem o caráter de ligação de uma região variável de cadeia pesada (CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3). As CDRs contêm a maior parte dos resíduos

31 / 95 responsáveis por interações específicas do anticorpo com o antígeno e, logo, contribuem para a atividade funcional de uma molécula de anticorpo: elas são os principais determinantes da especificidade antigênica.

[0067] As definições exatas dos limites e comprimentos da CDR estão sujeitas a diferentes sistemas de classificação e numeração. As CDRs podem, portanto, ser chamadas por Kabat, Chothia, de contato ou quaisquer outras definições de limite, incluindo o sistema de numeração descrito no presente documento. Apesar dos limites diferentes, cada um desses sistemas tem algum grau de sobreposição no que constitui as chamadas “regiões hipervariáveis” dentro das sequências variáveis. As definições de CDR de acordo com esses sistemas podem, portanto, diferir quanto ao comprimento e às áreas de limite com relação à região de arcabouço adjacente. Consultar, por exemplo, Kabat (uma abordagem com base na variabilidade de sequências entre espécies), Chothia (uma abordagem com base nos estudos cristalográficos de complexos antígeno-anticorpo), e/ou MacCallum (Kabat et al., loc. cit; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901 -917; e MacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Um outro padrão para caracterizar o lado de ligação a antígeno é a definição de AbM usada pelo software de modelagem de anticorpo AbM da Oxford Molecular. Consultar, por exemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. e Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). Na medida em que duas técnicas de identificação de resíduo definem regiões de sobreposição, porém não regiões idênticas, elas podem ser combinadas para definir uma CDR híbrida. No entanto, é preferida a numeração de acordo com o chamado sistema de Kabat.

[0068] Tipicamente, CDRs formam uma estrutura de laço que pode ser classificada como uma estrutura canônica. A locução “estrutura canônica” se refere à conformação de cadeia principal que é adotada pelos laços de ligação a antígeno (CDR). A partir de estudos estruturais comparativos, constatou-se

32 / 95 que cinco dos seis laços de ligação a antígeno não têm mais que um repertório limitado de conformações disponíveis. Cada estrutura canônica pode ser distinguida pelos ângulos de torção da cadeia principal de polipeptídeo. Laços correspondentes entre anticorpos podem, portanto, ter estruturas tridimensionais bastante similares, apesar da alta variabilidade de sequência de aminoácidos na maior parte dos laços (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Ademais, existe uma relação entre a estrutura de laço adotada e as sequências de aminoácidos que a circundam. A conformação de uma classe canônica particular é determinada pelo comprimento do laço e dos resíduos de aminoácido que residem em posições fundamentais dentro do laço, assim como dentro do arcabouço conservado (isto é, fora do laço). A atribuição a uma classe canônica particular, portanto, pode ser feita com base na presença desses resíduos de aminoácido fundamentais.

[0069] A locução “estrutura canônica” pode também incluir considerações quanto à sequência linear do anticorpo, por exemplo, como catalogado por Kabat (Kabat et al., loc. cit.). O esquema (sistema) de numeração de Kabat é um padrão amplamente adotado para a numeração dos resíduos de aminoácido de um domínio variável de anticorpo de maneira consistente e é o esquema preferido na presente invenção como também mencionado em outra parte do presente documento. Considerações estruturais adicionais também podem ser usadas para determinar a estrutura canônica de um anticorpo. Por exemplo, essas diferenças não totalmente refletidas pela numeração de Kabat podem ser descritas pelo sistema de numeração de Chothia et al. e/ou reveladas por outras técnicas, por exemplo, cristalografia e modelagem computadorizada bidimensional ou tridimensional. Consequentemente, uma determinada sequência de anticorpos pode ser colocada em uma classe canônica que permita, entre outras coisas, identificar sequências de chassi adequadas (por exemplo, com base em um desejo de

33 / 95 incluir uma variedade de estruturas canônicas em uma biblioteca). A numeração de Kabat de sequências de aminoácidos de anticorpos e considerações estruturais como descrito por Chothia et al., loc. cit. e suas implicações para a interpretação de aspectos canônicos da estrutura de anticorpo são descritas na literatura. As estruturas subunitárias e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas na técnica. Para uma análise da estrutura de anticorpos, consultar Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ed. Harlow et al., 1988. Uma referência global em imunoinformática é o banco de dados de estrutura tridimensional (3D) do IMGT (international ImMunoGenetics information system - sistema internacional de informação em IMunoGenéTica) (Ehrenmann et al., 2010, Nucleic Acids Res., 38, D301-307). Os dados estruturais do IMGT/3Dstructure-DB são extraídos do Protein Data Bank (PDB) e anotados de acordo com os conceitos de classificação do IMGT, usando ferramentas internas. Assim, o IMGT/3Dstructure-DB provê os genes e alelos mais próximos que são expressos nas sequências de aminoácidos das estruturas 3D, alinhando essas sequências com o diretório de referência de domínio do IMGT. O diretório contém, para os receptores de antígeno, sequências de aminoácidos dos domínios codificados pelos genes constantes e a tradução dos genes variáveis e de junção de linhagem germinativa. As regiões CDR de nossas sequências de aminoácidos foram preferivelmente determinadas usando-se o banco de dados IMGT/3Dstructure.

[0070] A CDR3 da cadeia leve e, particularmente, a CDR3 da cadeia pesada podem constituir os determinantes mais importantes na ligação a antígeno dentro das regiões variáveis de cadeia leve e pesada. Em algumas construções de anticorpo, a CDR3 de cadeia pesada parece constituir a principal área de contato entre o antígeno e o anticorpo. Esquemas de seleção in vitro nos quais somente a CDR3 é variada podem ser usados para variar as propriedades de ligação de um anticorpo ou determinar quais resíduos

34 / 95 contribuem para a ligação de um antígeno. Logo, a CDR3 é tipicamente a maior fonte de diversidade molecular dentro do lado de ligação a anticorpo. H3, por exemplo, pode ser tão curto quanto dois resíduos de aminoácido ou maior do que 26 aminoácidos.

[0071] Em um anticorpo ou imunoglobulina completo clássico, cada cadeia leve (L) é ligada a uma cadeia pesada (H) por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H são ligadas entre si por uma ou mais ligações de dissulfeto dependendo do isótipo de cadeia H. O domínio CH mais próximo da VH é normalmente designado CH1. Os domínios constantes (“C”) não estão diretamente envolvidos na ligação a antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como citotoxicidade dependente de anticorpo mediada por célula e ativação de complemento. A região Fc de um anticorpo fica compreendida dentro dos domínios constantes de cadeia pesada e é, por exemplo, capaz de interagir com os receptores de Fc localizados na superfície celular.

[0072] A sequência de genes de anticorpo após a montagem e mutação somática é altamente variada, e se estima que esses genes variados codifiquem 1010 moléculas de anticorpo diferentes (Immunoglobulin Genes, 2ª ed., ed. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Consequentemente, o sistema imunológico provê um repertório de imunoglobulinas. O termo “repertório” se refere a pelo menos uma sequência de nucleotídeos derivada total ou parcialmente de pelo menos uma sequência que codifica pelo menos uma imunoglobulina. A(s) sequência(s) pode(m) ser gerada(s) por rearranjo in vivo dos segmentos V, D e J de cadeias pesadas e dos segmentos V e J de cadeias leves. Alternativamente, a(s) sequência(s) pode(m) ser gerada(s) a partir de uma célula em resposta à qual ocorra rearranjo, por exemplo, estimulação in vitro. Alternativamente, parte ou toda(s) a(s) sequência(s) pode(m) ser obtida(s) por processamento (splicing) de DNA, síntese de nucleotídeo, mutagênese e outros métodos, consultar, por exemplo, a patente

35 / 95 norte-americana 5.565.332. Um repertório pode incluir somente uma sequência ou pode incluir uma pluralidade de sequências, incluindo aquelas em uma coleção geneticamente diversa.

[0073] A construção de anticorpo definida no contexto da invenção pode também compreender domínios adicionais, que são úteis, por exemplo, no isolamento da molécula ou se relacionam a um perfil farmacocinético adaptado da molécula. Os domínios úteis para o isolamento de uma construção de anticorpo podem ser selecionados dentre motivos peptídicos ou porções secundariamente introduzidas, que podem ser capturados em um método de isolamento, por exemplo, uma coluna de isolamento. Modalidades não limitantes de tais domínios adicionais compreendem motivos peptídicos conhecidos como etiqueta Myc, etiqueta HAT, etiqueta HA, etiqueta TAP, etiqueta GST, domínio de ligação à quitina (etiqueta CBD), domínio de ligação à maltose (etiqueta MBP), etiqueta Flag, etiqueta Strep e variantes da mesma (por exemplo, etiqueta Strepll) e etiqueta His. Todas as construções de anticorpo descritas no presente documento distinguidas pelas CDRs identificadas podem compreender um domínio de etiqueta His, que é em geral conhecido como uma repetição de resíduos de His consecutivos na sequência de aminoácidos de uma molécula, preferivelmente de cinco e, mais preferivelmente, de seis resíduos de His (hexa-histidina). A etiqueta His pode se localizar, por exemplo, no N-terminal ou C-terminal da construção de anticorpo, preferivelmente se localiza no C-terminal. O mais preferivelmente, uma etiqueta de hexa-histidina (HHHHHH) (SEQ ID nº:25) é ligada por meio de uma ligação peptídica ao C-terminal da construção de anticorpo de acordo com a invenção. Adicionalmente, um sistema conjugado de PLGA-PEG-PLGA pode ser combinado com uma etiqueta de poli-histidina para uma aplicação com liberação sustentada e perfil farmacocinético melhorado.

[0074] Modificações na sequência de aminoácidos das construções de anticorpo descritas no presente documento também são contempladas. Por

36 / 95 exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas da construção de anticorpo. As variantes de sequência de aminoácidos das construções de anticorpo são preparadas introduzindo-se mudanças nucleotídicas apropriadas no ácido nucleico das construções de anticorpo, ou por síntese peptídica. Todas as modificações de sequência de aminoácidos descritas abaixo devem resultar em uma construção de anticorpo que ainda retenha a atividade biológica desejada (ligação ao receptor de célula NK, por exemplo, CD16a, e ao antígeno-alvo de superfície celular) da molécula parental não modificada.

[0075] O termo “aminoácido” ou “resíduo de aminoácido” tipicamente se refere a um aminoácido que tem sua definição reconhecida pela técnica tal como um aminoácido selecionado do grupo que consiste em: alanina (Ala ou A); arginina (Arg ou R); asparagina (Asn ou N); ácido aspártico (Asp ou D); cisteína (Cys ou C); glutamina (Gin ou Q); ácido glutâmico (Glu ou E); glicina (Gli ou G); histidina (His ou H); isoleucina (He ou I): leucina (Leu ou L); lisina (Lis ou K); metionina (Met ou M); fenilalanina (Phe ou F); prolina (Pro ou P); serina (Ser ou S); treonina (Thr ou T); triptofano (Trp ou W); tirosina (Tir ou i); e valina (Val ou V), embora aminoácidos modificados, sintéticos ou raros possam ser usados conforme desejado. Em geral, aminoácidos podem ser agrupados como tendo uma cadeia lateral não polar (por exemplo, Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); uma cadeia lateral de carga negativa (por exemplo, Asp, Glu); uma cadeia lateral de carga positiva (por exemplo, Arg, His, Lys); ou uma cadeia lateral polar sem carga (por exemplo, Asn, Cys, Gin, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, e Tyr).

[0076] As modificações de aminoácido incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos das construções de anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As mudanças de

37 / 95 aminoácido também podem alterar os processos pós-tradução das construções de anticorpo, tal como mudar o número ou a posição dos locais de glicosilação.

[0077] Por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 aminoácidos podem ser inseridos, substituídos ou deletados em cada uma das CDRs (claro, dependendo de seu comprimento), enquanto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 25 aminoácidos podem ser inseridos, substituídos ou deletados em cada uma das FRs. Preferivelmente, inserções de sequência de aminoácidos na construção de anticorpo incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila variando de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, assim como inserções intrasequência de um único ou múltiplos resíduos de aminoácido. Modificações correspondentes também podem ser realizadas dentro de um terceiro domínio da construção de anticorpo definida no contexto da invenção. Uma variante de inserção da construção de anticorpo definida no contexto da invenção inclui a fusão ao N-terminal ou ao C-terminal da construção de anticorpo de uma enzima ou a fusão a um polipeptídeo.

[0078] Os locais de maior interesse para mutagênese substitucional incluem (porém sem limitação) as CDRs da cadeia pesada e/ou leve, em particular as regiões hipervariáveis, porém alterações de FR na cadeia pesada e/ou leve também são contempladas. As substituições são preferivelmente substituições conservadoras como descrito no presente documento. Preferivelmente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 aminoácidos podem ser substituídos em uma CDR, enquanto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou 25 aminoácidos podem ser substituídos nas regiões de arcabouço (FRs), dependendo do comprimento da CDR ou FR. Por exemplo, se uma sequência de CDR abranger 6 aminoácidos, concebe-se que um, dois ou três desses aminoácidos são substituídos. Similarmente, se uma sequência de CDR abranger 15 aminoácidos, concebe-se que um, dois, três, quatro, cinco ou seis desses aminoácidos são substituídos.

38 / 95

[0079] Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiões das construções de anticorpo que são localizações preferidas para mutagênese é chamado de “mutagênese por varredura de alanina” como descrito por Cunningham e Wells em Science, 244: 1081 -1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos-alvo dentro da construção de anticorpo são identificados (por exemplo, resíduos com carga tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituídos por um aminoácido com carga neutra ou negativa (o mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com o epítopo.

[0080] Essas localizações de aminoácido que demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refinadas pela introdução de variantes adicionais ou outras variantes nos, ou para os, locais de substituição. Assim, embora o local ou região para a introdução de uma variação de sequência de aminoácidos seja predeterminado, a natureza da mutação em si precisa não ser predeterminada. Por exemplo, para analisar ou otimizar o desempenho de uma mutação em um determinado local, a mutagênese por varredura de alanina ou aleatória pode ser realizada em um códon-alvo ou região-alvo, e as variantes de construção de anticorpo expressas são triadas quanto à combinação ótima da atividade desejada. As técnicas para produzir mutações de substituição em locais predeterminados no DNA com uma sequência conhecida são bem conhecidas, por exemplo, mutagênese de primer M13 e mutagênese por PCR. A triagem dos mutantes é feita usando-se ensaios de atividades de ligação a antígeno, tais como a ligação do receptor de célula NK, por exemplo, CD16a, e antígeno-alvo de superfície celular.

[0081] Em geral, se os aminoácidos forem substituídos em uma ou mais ou todas as CDRs da cadeia pesada e/ou leve, é preferível que a sequência “substituída” então obtida seja pelo menos 60% ou 65%, mais preferivelmente 70% ou 75%, ainda mais preferivelmente 80% ou 85% e, de maneira particularmente preferível, 90% ou 95% idêntica à sequência de CDR

39 / 95 “original”. Isso significa que depende do comprimento da CDR em que grau ela é idêntica à sequência “substituída”. Por exemplo, uma CDR com 5 aminoácidos é preferivelmente 80% idêntica à sua sequência substituída para ter pelo menos um aminoácido substituído. Consequentemente, as CDRs da construção de anticorpo podem ter diferentes graus de identidade com suas sequências substituídas, por exemplo, a CDRL1 pode ter 80%, enquanto a CDRL3 pode ter 90%.

[0082] As substituições preferidas são substituições conservadoras. No entanto, qualquer substituição (incluindo substituição não conservadora ou uma ou mais das “substituições exemplificativas” listadas na Tabela 3, abaixo) é concebida desde que a construção de anticorpo retenha sua capacidade de se ligar ao receptor de célula NK, por exemplo, CD16a por meio do primeiro domínio e ao antígeno-alvo de superfície celular por meio do segundo domínio e/ou suas CDRs tenham uma identidade à sequência então substituída (pelo menos 60% ou 65%, mais preferivelmente 70% ou 75%, ainda mais preferivelmente 80% ou 85% e, com particular preferência, 90% ou 95% idênticas à sequência de CDR “original”).

[0083] As substituições conservadoras são mostrados na Tabela 1 sob o título “substituições preferidas”. Se tais substituições resultarem em uma mudança da atividade biológica, então mais mudanças substanciais, denominadas “substituições exemplificativas” na Tabela 1, ou como adicionalmente descrito abaixo em referência às classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos, triados em busca de uma característica desejada.

40 / 95 Tabela 1: Substituições de aminoácidos Original Substituições exemplificativas Substituição preferida Ala (A) val, leu, ile val Arg (R) lys, gln, asn lys Asn (N) gln, his, asp, lys, arg gln Asp (D) glu, asn glu Cys (C) ser, ala ser Gln (Q) asn, glu asn Glu (E) asp, gln asp Gly (G) ala ala His (H) asn, gln, lys, arg arg Ile(I) leu, val, met, ala, phe leu Leu (L) norleucina, ile, val, met, ala lie Lys (K) arg, gln, asn arg Met (M) leu, phe, ile leu Phe (F) leu, val, ile, ala, tyr tyr Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr, phe tyr Tyr (Y) trp, phe, thr, ser phe Val (V) ile, leu, met, phe, ala leu

[0084] Modificações substanciais nas propriedades biológicas da construção de anticorpo da presente invenção são efetuadas selecionando-se substituições que diferem significativamente em seu efeito na manutenção (a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no local-alvo, ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base em propriedades de cadeia lateral comuns: (1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr, asn, gin; (3) ácido: asp, glu; (4) básico: his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromático: trp, tyr, phe.

[0085] Substituições não conservadoras implicam trocar um membro de uma dessas classes por outra classe. Qualquer resíduo de cisteína não

41 / 95 envolvido na manutenção da conformação adequada da construção de anticorpo pode ser substituído, em geral por serina, para melhorar a estabilidade oxidante da molécula e impedir a reticulação aberrante. Inversamente, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para melhorar sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo for um fragmento de anticorpo tal como um fragmento de FV).

[0086] Para sequências de aminoácidos, a identidade e/ou similaridade de sequências são determinadas pelo uso de técnicas padrão conhecidas na técnica, incluindo, porém sem limitação, o algoritmo de identidade de sequência local de Smith e Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, o algoritmo de alinhamento de identidade de sequência de Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, o método de busca por similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), o programa de sequência Best Fit descrito por Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395, preferivelmente usando as configurações padrão, ou por inspeção. Preferivelmente, o percentual de identidade é calculado por FastDB com base nos seguintes parâmetros: penalidade de não correspondência de 1; penalidade de gap de 1; penalidade de tamanho de gap de 0,33; e penalidade de união de 30, “Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,” Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pág. 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

[0087] Um exemplo de um algoritmo útil é o PILEUP. O PILEUP cria um alinhamento de múltiplas sequências de um grupo de sequências relacionadas usando alinhamentos progressivos em par. Ele também pode representar graficamente uma árvore mostrando as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. O PILEUP usa uma simplificação do método

42 / 95 de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351- 360; o método é similar ao descrito por Higgins e Sharp, 1989, CABIOS 5:151 -153. Parâmetros úteis do PILEUP incluindo um peso de gap padrão de 3,00, um peso de comprimento de gap padrão de 0,10 e gaps de extremidade pesados.

[0088] Outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito em: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389- 3402; e Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787. Um programa BLAST particularmente útil é o programa WU-BLAST-2 que foi obtido de Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. O WU-BLAST-2 usa vários parâmetros de busca, a maior parte dos quais é configurada nos valores padrão. Os parâmetros ajustáveis são configurados com os seguintes valores: alcance de sobreposição = 1, fração de sobreposição = 0,125, limiar de palavra (T) = II. Os parâmetros HSP S e HSP S2 são valores dinâmicos e são estabelecidos pelo próprio programa dependendo da composição da sequência particular e da composição do banco de dados particular no qual a sequência de interesse está sendo buscada; no entanto, os valores podem ser ajustados para aumentar a sensibilidade.

[0089] Um algoritmo útil adicional é o Gapped BLAST como relatado por Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. O Gapped BLAST usa escores de substituição BLOSUM-62; o parâmetro de limiar T é configurado em 9; o método de dois hits para acionar extensões sem gaps cobra a comprimentos de gap de k um custo de 10+k; Xu configurado em 16, e Xg configurado em 40 para o estágio de busca em banco de dados e em 67 para o estágio de saída dos algoritmos. Os alinhamentos com gaps são acionados por um escore correspondente a cerca de 22 bits.

[0090] Em geral, a homologia, similaridade ou identidade de aminoácido entre CDRs ou sequências de VH/VL variantes individuais são pelo menos 60% em relação às sequências retratadas no presente documento e,

43 / 95 mais tipicamente, com homologias ou identidades preferivelmente crescentes de pelo menos 65% ou 70%, mais preferivelmente pelo menos 75% ou 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e quase 100%. De maneira similar, “percentual (%) de identidade de sequência de ácidos nucleicos” em relação à sequência de ácidos nucleicos das proteínas de ligação identificadas no presente documento é definido como a porcentagem de resíduos de nucleotídeo em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de nucleotídeo na sequência de codificação da construção de anticorpo. Um método específico utiliza o módulo BLASTN do WU-BLAST-2 configurado nos parâmetros padrão, com alcance de sobreposição e fração de sobreposição configurados em 1 e 0,125, respectivamente.

[0091] Em geral, a homologia, similaridade ou identidade de ácido nucleico entre as sequências de nucleotídeo que codificam CDRs ou sequências de VH/VL variantes individuais e as sequências de nucleotídeos retratadas no presente documento são pelo menos 60% e, mais tipicamente, com homologias ou identidades preferivelmente crescentes de pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% e quase 100%. Assim, uma “CDR variante” ou uma “região de VH/VL variante” é uma com a homologia, similaridade ou identidade especificadas em relação à CDR/VH/VL parental definida no contexto da invenção e compartilha função biológica, incluindo, porém sem limitação, pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% da especificidade e/ou atividade da CDR ou VH/VL parental.

[0092] Em uma modalidade, a porcentagem de identidade à linhagem germinativa humana das construções de anticorpo de acordo com a invenção é ≥ 70% ou ≥ 75%, mais preferivelmente y ≥ 80% ou ≥ 85%, ainda mais

44 / 95 preferivelmente ≥ 90% e, o mais preferivelmente, ≥ 91%, ≥92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95% ou mesmo ≥ 96%. A identidade a produtos de gene de linhagem germinativa de anticorpo humano é considerada uma característica importante para reduzir o risco das proteínas terapêuticas de provocar uma resposta imunológica contra o fármaco no paciente durante o tratamento. Hwang & Foote (“Immunogenicity of engineered antibodies”; Methods 36 (2005) 3-10) demonstram que a redução de porções não humanas das construções de anticorpo de fármacos leva a uma diminuição do risco de induzir anticorpos antifármaco nos pacientes durante o tratamento. Comparando-se um número exaustivo de fármacos de anticorpos avaliados clinicamente e os respectivos dados de imunogenicidade, apresenta-se a tendência de que a humanização das regiões V dos anticorpos torna a proteína menos imunogênica (média de 5,1% de pacientes) do que os anticorpos que carregam regiões V não humanas inalteradas (média de 23,59% de pacientes). Um grau mais alto de identidade às sequências humanas é, logo, desejável para a terapêutica de proteína baseada em região V na forma de construções de anticorpo. Para essa finalidade de determinar a identidade de linhagem germinativa, as regiões V de VL podem ser alinhadas com as sequências de aminoácidos de segmentos V e segmentos J de linhagem germinativa humana (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) usando o software Vector NTI e a sequência de aminoácidos pode ser calculada dividindo-se os resíduos de aminoácido idênticos pelo número total de resíduos de aminoácido da VL em percentual. O mesmo pode ser o caso para os segmentos de VH (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) com a exceção de que a CDR3 de VH pode ser excluída devido à sua alta diversidade e falta de parceiros existentes de alinhamento de CDR3 de VH de linhagem germinativa humana. As técnicas recombinantes podem então ser usadas para aumentar a identidade de sequência a genes de linhagem germinativa de anticorpo humano.

[0093] O termo “célula de mieloma” é uma célula plasmática maligna (cancerosa) que surge de uma célula plasmática na medula óssea por

45 / 95 transformação neoplásica. Em mieloma, células plasmáticas malignas produzem grandes quantidades de anticorpos anormais que não têm a capacidade de combater infecções. Esses anticorpos anormais são a chamada proteína monoclonal, ou proteína M, que funciona como um marcador tumoral para o mieloma. A célula de mieloma tem o fenótipo CD19- /CD38+/CD138+/BCMA+. Logo, CD38, CD138 e BCMA representam antígenos expressos em uma célula de mieloma. Também incluídos estão os fenótipos malignos na linhagem de células B que são positivos para CD19/CD20/CD22/BCMA e outros antígenos (esses devem incluir fenótipos que não sejam classicamente entendidos como células plasmáticas, porém podem ser evoluções de células B de memória ou a linhagem celular pré- plasma).

[0094] O termo “EGFR” se refere ao receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR; ErbB-1; HER1 em seres humanos, incluindo todas as isoformas ou variantes descritas com ativação, mutações e implicadas em processos patofisiológicos. O local de ligação a antígeno do EGFR reconhece um epítopo no domínio extracelular do EGFR. Em certas modalidades, o local de ligação a antígeno se liga especificamente a EGFR humano e de cinomológo. O receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) é um membro da família HER de tirosina quinases receptoras e consiste em quatro membros: EGFR (ErbB1/HER1), HER2/neu (ErbB2), HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4). A estimulação do receptor através de ligação de ligante (por exemplo, EGF, TGFa, HB-EGF, neuregulinas, betacelulina, anfirregulina) ativa a tirosina quinase receptora intrínseca no domínio intracelular através de fosforilação de tirosina e promove a homodimericação ou heterodimerização do receptor com membros da família HER. Essas fosfotirosinas intracelulares servem como locais de acoplamento para várias proteínas ou enzimas adaptadoras incluindo SHC, GRB2, PLCg e PI(3)K/Akt, que simultaneamente iniciam muitas cascatas de sinalização que influenciam a proliferação celular, a angiogênese,

46 / 95 a resistência à apoptose, a invasão e a metástase.

[0095] MFI define a intensidade de fluorescência média. Descrição detalhada da invenção:

[0096] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção provê células NK humanas isoladas em um estado criopreservado, pré-carregadas antes do congelamento com uma construção de anticorpo, a construção de anticorpo compreendendo pelo menos um primeiro domínio de ligação que se liga a um antígeno de receptor de célula NK na superfície celular de uma célula efetora imunológica, e um segundo domínio de ligação que liga à superfície celular um antígeno na superfície celular de uma célula-alvo.

[0097] Ademais, em outro aspecto, a presente invenção provê um método para reconstituir/preparar tais células NK humanas viáveis pré- carregadas com tal construção de anticorpo a partir de um estado criopreservado.

[0098] Hoje em dia, os produtos de prateleira (alogênicos) estão bem atrás das abordagens individualizadas (autólogas). Embora a transferência celular autóloga seja clinicamente validada, a fabricação de produtos celulares precisa ser estabelecida para cada paciente. A produção individualizada requer de 7 a 14 dias para isolamento, expansão e preparação celular, muito embora se esteja atrás de diferentes estratégias para otimização. Uma limitação é que, para alguns pacientes, a expansão autóloga de suas células imunes não rende números suficientes de células. Além disso, as células efetoras imunes de um paciente com câncer foram descritas como sendo funcionalmente prejudicadas devido à imunossupressão e aos fenótipos alterados. Logo, a variabilidade entre pacientes influencia negativamente tanto a fabricação individualizada quanto a eficácia clínica.

[0099] Ao contrário de abordagens autólogas, produtos de prateleira alogênicos oferecem vantagens exclusivas: tais produtos podem ser imediatamente aplicados ao paciente, isto é, imediatamente após o

47 / 95 descongelamento, o que reduz drasticamente o tempo da cadeia de suprimentos/logística e aumenta a disponibilidade do produto para além de um hospital centralizado. Podem-se fabricar lotes grandes de células efetoras imunes alogênicas em um local de produção centralizado, o que não só reduz os custos de fabricação, como também aumenta a homogeneidade do produto de célula efetora imune, possibilitando padrões regulatórios de alta qualidade. Tais instalações centralizadas podem também possibilitar a seleção de doadores saudáveis adequados para se usar a população de células efetoras mais funcional no processo de fabricação.

[00100] Como já declarado acima, a presente invenção provê em uma primeira modalidade células NK humanas isoladas em um estado criopreservado, pré-carregadas antes do congelamento com uma construção de anticorpo, a construção de anticorpo compreendendo pelo menos um primeiro domínio de ligação que se liga a um antígeno de receptor de célula NK na superfície celular de uma célula efetora imunológica, e um segundo domínio de ligação que liga à superfície celular um antígeno na superfície celular de uma célula-alvo que pode ser derivada de qualquer uma das fontes acima.

[00101] As células NK usadas no contexto da invenção são, por exemplo, isoladas da célula mononuclear de sangue periférico (PBMC) de doadores saudáveis distinguidos por vários fenótipos (por exemplo, células NK100 de memória adaptativa), isoladas do cordão umbilical ou tecido placentário, células NK derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (derivadas de iPSC) (por exemplo FT500 ou FT516) ou linhagens celulares NK. Exemplos de linhagens celulares NK compreendem, porém sem limitação, as células de linhagens celulares NK-92 (ATCC® CRL-2407™), as células NK-YS (Tsuchiyama et al. 1998, Blood), ou as células NK-YT (Teshigawara et al. 1985, J Immunol). Além disso, dentro do grupo de células NK adequadas estão as células NK de receptor de antígeno quimérico (CAR) que podem ser derivadas de qualquer uma das fontes acima.

48 / 95

[00102] O termo “iPSC” define no contexto da invenção células-tronco pluripotentes induzidas que podem ser usadas para criar tipos celulares diferenciados e especializados (por exemplo, células NK) utilizando princípios de engenharia genética, tratamentos definidos com moléculas pequenas e expansão de células.

[00103] Em algumas modalidades da invenção, é necessário expandir e/ou ativar as células NK antes da etapa de pré-carregar as células com a dita construção de anticorpo. Os protocolos para tal expansão são conhecidos na técnica, por exemplo, em WO2017/042393, WO2015/132415, US20110014162, US20120308986A1, US9062287B2, US8026097B2, US9260696B2; US20170119865.

[00104] Em conformidade com a invenção, as células NK podem ser cultivadas antes da incubação com a construção de anticorpo. Tal etapa de cultura celular pode ser necessária para expandir e/ou ativar as respectivas células. Os protocolos de expansão típicos podem compreender uma seleção de célula CD34+, uma depleção de célula CD3+ e uma incubação com células alimentadoras que carregam 4-1BBL e/ou IL-21 transmembranar e, opcionalmente, estimulação adicional com citoquinas linfoproliferativas tais como IL-2. Em certas modalidades, um lote de células NK pré-carregadas com a construção de anticorpo compreende 106 e 1012 células. O número de células pré-incubadas, que podem ser administradas a um paciente, pode ser em uma faixa de 1x105 a 1x108 células NK por kg de peso corporal.

[00105] No contexto da invenção, “células em um estado criopreservado” são células que foram preservadas por resfriamento a uma temperatura abaixo de zero (graus Celsius). Células criopreservadas podem ou não ser preservadas na presença de um agente crioprotetor. Um agente crioprotetor, tal como DMSO, glicerol, etilenoglicol ou propilenoglicol, é uma substância que protege as células de danos associados com armazenamento a temperatura abaixo de zero e/ou congelamento, por exemplo, danos a

49 / 95 membrana celular devido à formação de cristais de gelo.

[00106] A locução “pré-carregado(a) antes do congelamento” se refere a uma pré-incubação das células antes do congelamento a temperatura abaixo de zero com a construção de anticorpo identificada.

[00107] Vale observar que o primeiro domínio de ligação da construção de anticorpo descrita, em que um antígeno de receptor de célula NK na superfície celular de uma célula efetora imunológica se liga a esse receptor de certa forma, isso permite a manutenção da ligação na superfície celular mesmo durante e após essa célula estar no estado criopreservado. Como demonstrado no exemplo 1 anexo, construções de anticorpo com um primeiro domínio de ligação específico para CD16 (a ou b) se ligam a um epítopo específico diferente do domínio de ligação de IgG do FcRγIII. Presume-se que a ligação a tal epítopo específico permite a manutenção da ligação mesmo durante o processo de resfriamento das células NK de acordo com um aspecto da invenção a uma temperatura abaixo de zero e da subsequente reconstituição das células para administração a um indivíduo em necessidade das mesmas. Também existem epítopos similares em outros antígenos de receptor de célula NK na superfície celular de células efetoras imunológicas, por exemplo, NKp46 ou NKG2D.

[00108] De acordo com uma modalidade da invenção, as células NK humanas isoladas foram isoladas de tecido de cordão umbilical ou PBMC de doadores saudáveis.

[00109] Além disso, em uma modalidade, as células NK humanas isoladas de acordo com um aspecto da invenção foram conservadas em uma criossolução. Uma criossolução no contexto da invenção compreende pelo menos um meio de cultura celular basal e um agente crioprotetor. Ademais, uma criossolução pode compreender adicionalmente uma solução isotônica tal como Plasma-lyte e/ou albumina sérica.

[00110] Exemplos não limitantes de agentes crioprotetores foram

50 / 95 providos acima no presente documento. Certas modalidades de agentes crioprotetores no contexto da invenção são DMSO e glicerol. A concentração do agente crioprotetor pode ser na faixa de 1% a 30% (v/v), em certas modalidades na faixa de 5% a 25% (v/v), em outras modalidades na faixa de 10% a 25% (v/v), em ainda algumas modalidades é uma concentração de 20% (v/v). A locução “meio de cultura celular basal” se refere no contexto da invenção a meios de cultura celular líquidos, que são adequados para a cultura celular de células mamíferas. Exemplos de tais “meios de cultura celular basal” são conhecidos na técnica. A concentração da solução isotônica pode ser na faixa de 1% a 60% (v/v), em algumas modalidades na faixa de 10% a 50% (v/v), em outras modalidades na faixa de 20% a 45% (v/v) e, em uma modalidade, em uma concentração de 40% (v/v). A albumina sérica pode ser uma albumina sérica humana ou bovina (fetal) (preferivelmente humana), que foi isolada de doadores ou produzida recombinantemente. A concentração da albumina na criossolução pode ser na faixa de 1% a 40% (v/v), em algumas modalidades na faixa de 5% a 25% (v/v), em ainda algumas modalidades na faixa de 10% a 20% (v/v). Um exemplo de uma criossolução (meio de congelamento) pode compreender meio basal, 40% de Plasma-lyte, albumina sérica humana (HSA) e 10% de sulfóxido de dimetila (DMSO). Alternativamente, soro fetal bovino (FBS) ou glicerol podem ser usados para substituir HSA e/ou DMSO, respectivamente. O crioprotetor mais comumente usado é o DMSO. Por alguns motivos, o DSMO pode ser substituído por compostos alternativos tais como glicerol, etilenoglicol ou propilenoglicol.

[00111] De acordo com certas modalidades, as células NK de um aspecto da invenção foram pré-carregadas em uma solução que compreende a construção de anticorpo em uma concentração de pelo menos 5 nM. Em certas modalidades, a concentração é de pelo menos 10 nM, ademais, em certas modalidades a concentração é de pelo menos 25 nM, também em certas modalidades a concentração é de pelo menos 50 nM, em certas modalidades a

51 / 95 concentração é de pelo menos 75 nM, 90 nM, 100 nM, 125 nM ou 150 nM.

[00112] O antígeno de receptor de célula NK ao qual o primeiro domínio de ligação da construção de anticorpo se liga na superfície das células NK humanas de acordo com um aspecto da invenção é selecionado do grupo que consiste em CD16a, CD16b, NKp46, NKG2D e CD16a + CD16b.

[00113] Certas modalidades de receptores de célula NK foram definidas acima no presente documento. O primeiro domínio de ligação da construção de anticorpo mencionada se liga, assim, ou especificamente a CD16a, CD16b ou a CD16a e CD16b. Ademais, o primeiro domínio de ligação pode se ligar especificamente a NKp46 ou NKG2D.

[00114] O antígeno de superfície celular na superfície celular de uma célula-alvo à qual o segundo domínio de ligação da construção de anticorpo se liga é selecionado do grupo que consiste em CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD123, CLL1, BCMA, FCRH5, EGFR, EGFRvIII, HER2, GD2.

[00115] Esses antígenos de superfície celular na superfície das células- alvo são conectados a entidades de doença específicas. O CD30 é um antígeno de superfície celular característico de células malignas no linfoma de Hodgkin. CD19, CD20, CD22, CD70, CD74 e CD79b são antígenos de superfície celular característicos de células malignas em linfomas não Hodgkin (linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma folicular (FL), linfomas de células T (tanto periféricos quanto cutâneos, incluindo micoses fungoides transformadas TMF/síndrome de Sézary SS e linfoma anaplásico de grandes células (ALCL)). CD52, CD33, CD123, CLL1 são antígenos de superfície celular característicos de células malignas em leucemias (leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML)). O BCMA e o FCRH5 são antígenos de superfície celular característicos de células malignas no mieloma múltiplo. EGFR, HER2, GD2 são antígenos de superfície celular característicos de

52 / 95 cânceres sólidos (câncer de mama triplo-negativo (TNBC), câncer de mama BC, câncer colorretal (CRC), carcinoma de pulmão de não pequenas células (NSCLC), carcinoma de pequenas células (SCLC também conhecido como “câncer de pulmão de pequenas células” ou “carcinoma de células em grão de aveia”), câncer da próstata (PC), glioblastoma (também conhecido como glioblastoma multiforme (GBM)).

[00116] Em uma modalidade das células NK humanas de acordo com um aspecto da invenção, a construção de anticorpo compreende no primeiro domínio de ligação três CDRs de cadeia pesada e três CDRs de cadeia leve selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma CDR-H1 como retratada na SEQ ID nº: 29, uma CDR-H2 como retratada na SEQ ID nº: 30, uma CDR-H3 como retratada na SEQ ID nº: 31, uma CDR-L1 como retratada na SEQ ID nº: 32, uma CDR-L2 como retratada na SEQ ID nº: 33, uma CDR-L3 como retratada na SEQ ID nº: 34; (b) uma CDR-H1 como retratada na SEQ ID nº: 40, uma CDR-H2 como retratada na SEQ ID nº: 41, uma CDR-H3 como retratada na SEQ ID nº: 42, uma CDR-L1 como retratada na SEQ ID nº: 43, uma CDR-L2 como retratada na SEQ ID nº: 44, uma CDR-L3 como retratada na SEQ ID nº: 45; (c) uma CDR-H1 como retratada na SEQ ID nº: 51, uma CDR-H2 como retratada na SEQ ID nº: 52, uma CDR-H3 como retratada na SEQ ID nº: 53, uma CDR-L1 como retratada na SEQ ID nº: 54, uma CDR-L2 como retratada na SEQ ID nº: 55, uma CDR-L3 como retratada na SEQ ID nº: 56; (d) uma CDR-H1 como retratada na SEQ ID nº: 62, uma CDR-H2 como retratada na SEQ ID nº: 63, uma CDR-H3 como retratada na SEQ ID nº: 64, uma CDR-L1 como retratada na SEQ ID nº: 65, uma CDR-L2 como retratada na SEQ ID nº: 66, uma CDR-L3 como retratada na SEQ ID

53 / 95 nº: 67; (e) uma CDR-H1 como retratada na SEQ ID nº: 73, uma CDR-H2 como retratada na SEQ ID nº: 74, uma CDR-H3 como retratada na SEQ ID nº: 75, uma CDR-L1 como retratada na SEQ ID nº: 76, uma CDR-L2 como retratada na SEQ ID nº: 77, uma CDR-L3 como retratada na SEQ ID nº: 78; (f) uma CDR-H1 como retratada na SEQ ID nº: 84, uma CDR-H2 como retratada na SEQ ID nº: 85, uma CDR-H3 como retratada na SEQ ID nº: 86, uma CDR-L1 como retratada na SEQ ID nº: 87, uma CDR-L2 como retratada na SEQ ID nº: 88, uma CDR-L3 como retratada na SEQ ID nº: 89; e (g) uma CDR-H1 como retratada na SEQ ID nº: 95, uma CDR-H2 como retratada na SEQ ID nº: 96, uma CDR-H3 como retratada na SEQ ID nº: 97, uma CDR-L1 como retratada na SEQ ID nº: 98, uma CDR-L2 como retratada na SEQ ID nº: 99, uma CDR-L3 como retratada na SEQ ID nº: 100.

[00117] Além disso, em uma modalidade das células NK humanas isoladas de acordo com um aspecto da invenção, a construção de anticorpo compreende no primeiro domínio de ligação pares de cadeias de VH e VL com uma sequência como retratada nos pares de sequências selecionados do grupo que consiste em SEQ ID nº: 35 e SEQ ID nº: 36, SEQ ID nº: 46 e SEQ ID nº: 47, SEQ ID nº: 57 e SEQ ID nº: 58, SEQ ID nº: 68 e SEQ ID nº: 69, SEQ ID nº: 79 e SEQ ID nº: 80, SEQ ID nº: 90 e SEQ ID nº: 91 e SEQ ID nº: 101 e SEQ ID nº: 102.

[00118] Em uma modalidade das células NK humanas isoladas de acordo com um aspecto da invenção, a construção de anticorpo compreende no segundo domínio de ligação três CDRs de cadeia pesada e três CDRs de cadeia leve selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma CDR-H1 como retratada na SEQ ID nº: 106, uma

54 / 95 CDR-H2 como retratada na SEQ ID nº: 107, uma CDR-H3 como retratada na SEQ ID nº: 108, uma CDR-L1 como retratada na SEQ ID nº: 109, uma CDR-L2 como retratada na SEQ ID nº: 110, uma CDR-L3 como retratada na SEQ ID nº: 111; (b) uma CDR-H1 como retratada na SEQ ID nº: 106, uma CDR-H2 como retratada na SEQ ID nº: 107, uma CDR-H3 como retratada na SEQ ID nº: 108, uma CDR-L1 como retratada na SEQ ID nº: 109, uma CDR-L2 como retratada na SEQ ID nº: 110, uma CDR-L3 como retratada na SEQ ID nº: 111; e (c) uma CDR-H1 como retratada na SEQ ID nº: 117, uma CDR-H2 como retratada na SEQ ID nº: 118, uma CDR-H3 como retratada na SEQ ID nº: 119, uma CDR-L1 como retratada na SEQ ID nº: 120, uma CDR-L2 como retratada na SEQ ID nº: 121, uma CDR-L3 como retratada na SEQ ID nº: 122.

[00119] Além disso, em uma modalidade das células NK humanas isoladas de acordo com um aspecto da invenção, a construção de anticorpo compreende no segundo domínio de ligação pares de cadeias de VH e VL com uma sequência como retratada nos pares de sequências selecionados do grupo que consiste em SEQ ID nº: 112 e SEQ ID nº: 113, SEQ ID nº: 123 e SEQ ID nº: 124 e SEQ ID nº: 134 e SEQ ID nº: 135.

[00120] Em uma modalidade da célula NK humana isolada de acordo com um aspecto da invenção, a construção de anticorpo compreende uma sequência de proteínas como retratada nas SEQ ID nº: 161 a 171.

[00121] Em uma modalidade alternativa, a invenção provê um método para a preparação de células NK humanas pré-carregadas criopreservadas em um estado criopreservado, o método compreendendo incubar células NK com uma construção de anticorpo, a construção de anticorpo compreendendo pelo menos um primeiro domínio de ligação que se liga a um antígeno de receptor de célula NK na superfície celular

55 / 95 de uma célula efetora imunológica, e um segundo domínio de ligação que liga à superfície celular um antígeno na superfície celular de uma célula-alvo; e congelar as células NK.

[00122] Ademais, a invenção provê tal método, em que as células NK são isoladas de tecido de cordão umbilical, iPSC ou PBMC de doadores saudáveis.

[00123] Como descrito acima, as células NK mencionadas no método de acordo com um aspecto da invenção foram pré-carregadas em uma solução que compreende a construção de anticorpo em uma concentração de pelo menos 5 nM. Em certas modalidades, a concentração é de pelo menos 10 nM, em algumas modalidades é em uma concentração de pelo menos 25 nM, de pelo menos 50 nM, ou de pelo menos 75 nM. Em certas modalidades a concentração é de pelo menos 90 nM, 100 nM, 125 nM ou 150 nM.

[00124] Em uma modalidade do método de acordo com um aspecto da invenção, o antígeno de receptor de célula NK ao qual o primeiro domínio de ligação da construção de anticorpo se liga é selecionado do grupo que consiste em CD16a, CD16b, NKp46, NKG2D e CD16a + CD16b.

[00125] Além disso, de acordo com certas modalidades, o antígeno de superfície celular na superfície celular de uma célula-alvo à qual o segundo domínio de ligação da construção de anticorpo se liga é selecionado do grupo que consiste em CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD123, CLL1, BCMA, FCRH5, EGFR, HER2, GD2.

[00126] Em conformidade com o método de acordo com um aspecto da invenção para a preparação de células NK humanas pré-carregadas criopreservadas, a etapa de congelamento das células NK é realizada com o uso de um meio de congelamento/criossolução. Certas composições e compostos de um meio de congelamento/criossolução em conformidade com a invenção foram descritos acima no presente documento.

[00127] Em certas modalidades desse método, as células NK são

56 / 95 isoladas do tecido de cordão umbilical, iPSC ou PBMC de doadores saudáveis.

[00128] Também é concebido para esse método em um aspecto da invenção que as células NK tenham sido pré-carregadas em uma solução que compreende a construção de anticorpo em uma concentração de pelo menos 5 nM.

[00129] Ademais, está em conformidade com a invenção o fato de o antígeno de receptor de célula NK ao qual o primeiro domínio de ligação da construção de anticorpo se liga ser selecionado do grupo que consiste em CD16a, CD16b, NKp46, NKG2D e CD16a + CD16b.

[00130] Também concebido para esse método em um aspecto da invenção é o fato de o antígeno de superfície celular na superfície celular de uma célula-alvo à qual o segundo domínio de ligação da construção de anticorpo se liga ser selecionado do grupo que consiste em CD19, CD22, CD30, CD33, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD123, CLL1, BCMA, FCRH5, EGFR, HER2, GD2.

[00131] De acordo com uma modalidade desse método em um aspecto da invenção, a etapa de congelamento das células NK é realizada com o uso de um meio de congelamento que contém pelo menos um meio de cultura celular basal e um agente crioprotetor.

[00132] Em um aspecto do método da invenção, a construção de anticorpo usada no método é uma das construções de anticorpo descritas acima no presente documento. Em certas modalidades do método da invenção, a dita construção de anticorpo compreende uma sequência de proteínas como retratada nas SEQ ID nº: 161 a 171.

[00133] Em uma modalidade alternativa, a invenção provê um método para reconstituir/preparar células NK humanas pré-carregadas viáveis a partir de células NK de acordo com um aspecto da invenção em um estado criopreservado descrito acima no presente documento ou preparadas de acordo com um método de acordo com um aspecto da invenção para a preparação de

57 / 95 células NK humanas pré-carregadas criopresevadas em um estado criopreservado para a administração das ditas células a um indivíduo em necessidade das mesmas, o método compreendendo a etapa de reconstituir/preparar as células para administração a um paciente por descongelamento.

[00134] O descongelamento de células congeladas pode ser efetuado de acordo com métodos bem conhecidos. Os procedimentos gerais de descongelamento envolvem rapidamente transferir as células congeladas a um banho-maria de 37°C e prover uma leve agitação até as células NK ativadas serem completamente descongeladas. Após o descongelamento, as células NK descongeladas podem ser preparadas para administração em um paciente pela adição, preferivelmente em gotas, de carreadores farmaceuticamente aceitáveis à temperatura ambiente, por exemplo, para diluir a concentração do meio de congelamento e/ou lavar as células NK anteriormente ativadas. Como demonstrado no presente documento, as populações celulares da presente invenção retêm seu estado ativado em combinação com a construção de anticorpo após tal preservação. A preparação das células para administração após a preservação depende do método de preservação. Por exemplo, as células podem ser preparadas para administração após a preservação por cultura celular e/ou refrigeração através de uma ou mais das seguintes opções: lavagem das células, ressuspensão das células em um carreador farmaceuticamente aceitável e/ou contenção das células em um dispositivo de dispensação adequado, por exemplo, uma seringa. Em uma modalidade, as células são preparadas para administração após a criopreservação por descongelamento, por exemplo, por agitação leve em um banho-maria a 37°C e então contenção das células em um dispositivo de dispensação adequado, por exemplo, uma seringa. Essas populações celulares descongeladas podem ser surpreendentemente empregadas na clínica quase imediatamente conforme a necessidade, por exemplo, sem reativação ou outra manipulação extensa e/ou demorada.

58 / 95

[00135] Consequentemente, embora desnecessário, as células preparadas para administração após a criopreservação podem ser adicionalmente preparadas pela adição, preferivelmente em gotas, de um carreador farmaceuticamente aceitável à temperatura ambiente para, por exemplo, diluir a concentração e/ou lavar das células o meio de congelamento. Em uma modalidade, o carreador farmaceuticamente aceitável é substancialmente livre de um agente ativador.

[00136] Em uma modalidade alternativa adicional, a invenção provê uma composição farmacêutica que compreende células NK humanas que foram reconstituídas a partir de células NK humanas em um estado criopreservado de acordo com a invenção ou preparadas por um método de acordo com a invenção.

[00137] Certas modalidades proveem composições farmacêuticas que compreendem as células NK pré-carregadas definidas no contexto da invenção e ainda um ou mais excipientes tais como os descritos ilustrativamente nesta seção e em outra parte no presente documento. Os excipientes podem ser usados na invenção nesse quesito para uma ampla variedade de fins, tais como ajustar as propriedades físicas, químicas ou biológicas das formulações, tal como o ajuste de viscosidade, e/ou processos de um aspecto da invenção para melhorar a eficácia e/ou estabilizar tais formulações e processos contra degradação e apodrecimento devido, por exemplo, a tensões que ocorram durante a fabricação, envio, armazenamento, preparação pré-uso, administração e posteriormente.

[00138] Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação com o fim de modificar, manter ou preservar, por exemplo, o pH, a osmolaridade, a viscosidade, a clareza, a cor, a isotonicidade, o odor, a esterilidade, a estabilidade, a taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração da composição (consultar REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18ª edição, (A.R. Genrmo, ed.), 1990,

59 / 95

Mack Publishing Company). Em tais modalidades, materiais de formulação adequados podem incluir, porém sem limitação: aminoácidos tais como glicina, alanina, glutamina, asparagina, treonina, prolina, 2-fenilalanina, incluindo aminoácidos com carga, preferivelmente lisina, acetato de lisina, arginina, glutamato e/ou histidina antimicrobianos tais como agentes antibacterianos e antifúngicos antioxidantes tais como ácido ascórbico, metionina, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio; tampões, sistemas tampão e agentes tampão que são usados para manter a composição em um pH fisiológico ou em um pH ligeiramente mais baixo; exemplos de tampões são borato, bicarbonato, Tris-HCI, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos, succinato, fosfato e histidina; por exemplo, tampão Tris de cerca de pH 7,0-8,5; solventes não aquosos tais como propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais tais como azeite e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila; carreadores aquosos incluindo água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo meios salinos e de tampão; polímeros biodegradáveis tais como poliésteres; agentes avolumadores tais como manitol ou glicina; agentes quelantes tais como ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA); agentes isotônicos e retardantes de absorção; agentes complexantes tais como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina) cargas; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos (tais

60 / 95 como glicose, manose ou dextrinas); os carboidratos podem ser açúcares não redutores, preferivelmente trealose, sacarose, octassulfato, sorbitol ou xilitol; proteínas (de baixo peso molecular), polipeptídeos ou carreadores proteináceos tais como albumina sérica humana ou bovina, gelatina ou imunoglobulinas, preferivelmente de origem humana; agentes colorantes e saborizantes; agentes redutores contendo enxofre, tais como glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol e tiossulfato de sódio agentes de diluição; agentes emulsificantes; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona) contraíons formadores de sal tais como sódio; preservantes tais como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e similares; os exemplos são: cloreto de benzalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metiparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); complexos metálicos tais como complexos Zn-proteína; solventes e cossolventes (tais como glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol); açúcares e álcoois de açúcar, tais como trealose, sacarose, octassulfato, manitol, sorbitol ou xilitol estaquiose, manose, sorbose, xilose, ribose, mioinisitose, galactose, lactitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol, ciclitóis (por exemplo, inositol), polietilenoglicol; e álcoois de açúcar poli- hídricos; agentes de suspensão; tensoativos ou agentes umectantes tais como plurônicos, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos tais como polissorbato 20, polissorbato, tríton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapol; os tensoativos podem ser

61 / 95 detergentes, preferivelmente com um peso molecular de >1,2 KD e/ou um poliéter, preferivelmente com um peso molecular de >3 KD; exemplos não limitantes de detergentes preferidos são Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 e Tween 85; exemplos não limitantes de poliéteres preferidos são PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 e PEG 5000; agentes intensificadores de estabilidade tais como sacarose ou sorbitol; agentes intensificadores de tonicidade tais como haletos de metal alcalino, preferivelmente cloreto de sódio ou de potássio, sorbitol de manitol; veículos de dispensação parenterais incluindo solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, cloreto de dextrose e sódio, óleos de Ringer lactados e fixos; veículos de dispensação intravenosos incluindo restauradores de fluido e nutriente, restauradores de eletrólito (tais como os à base de dextrose de Ringer).

[00139] É evidente aos versados na técnica que os diferentes constituintes da composição farmacêutica (por exemplo, os listados acima) podem ter diferentes efeitos, por exemplo, e o aminoácido pode agir como um tampão, um estabilizante e/ou um antioxidante; o manitol pode agir como um agente avolumador e/ou um agente intensificador de tonicidade; o cloreto de sódio pode agir como um veículo de dispensação e/ou agente intensificador de tonicidade; etc.

[00140] Em certas modalidades, a composição farmacêutica ótima será determinada por uma pessoa versada na técnica dependendo, por exemplo, da rota de administração pretendida, do formato de dispensação e da dosagem desejada. Consultar, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. Por exemplo, um veículo ou carreador adequado podem ser água para injeção, solução salina fisiológica ou líquido cefalorraquidiano

62 / 95 artificial, possivelmente suplementados com outros materiais comuns em composições para administração parenteral. Solução salina com tampão neutro ou solução salina misturada com albumina sérica são outros exemplos de veículos.

[00141] Em uma modalidade da composição farmacêutica de acordo com um aspecto da invenção, a composição é administrada a um paciente intravenosamente.

[00142] Os métodos e protocolos para a administração intravenosa (iv) de composições farmacêuticas descritas no presente documento são bem conhecidos na técnica.

[00143] Em um aspecto da composição farmacêutica da invenção, a dita composição farmacêutica é usada na prevenção, tratamento ou melhoria de uma doença selecionada dentre uma doença proliferativa, uma doença tumoral, ou um distúrbio imunológico. Preferivelmente, a doença tumoral é uma doença maligna, de preferência câncer.

[00144] Em uma modalidade da composição farmacêutica da invenção, a doença maligna identificada é selecionada do grupo que consiste em linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, leucemia, mieloma múltiplo e tumores sólidos.

[00145] Além disso, em uma modalidade, a invenção provê um método para o tratamento ou melhoria de uma doença, o método compreendendo a etapa de administrar a um indivíduo em necessidade das mesmas células NK humanas pré-carregadas que foram reconstituídas a partir de células NK humanas em um estado criopreservado de acordo com a invenção ou preparadas por um método de acordo com os aspectos da invenção para reconstituir/preparar células NK humanas pré-carregadas viáveis a partir de um estado criopreservado.

[00146] Em conformidade com um aspecto do método para o tratamento ou melhoria de uma doença da invenção, as células NK humanas pré-

63 / 95 carregadas são administradas a um paciente intravenosamente.

[00147] Em uma modalidade do dito método para o tratamento ou melhoria de uma doença, o indivíduo sofre de uma doença proliferativa, uma doença tumoral, ou um distúrbio imunológico.

[00148] É preferível que a dita doença tumoral seja uma doença maligna, de preferência câncer.

[00149] Em uma modalidade do dito método para o tratamento ou melhoria de uma doença, a dita doença maligna é selecionada do grupo que consiste em linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, leucemia, mieloma múltiplo e tumores sólidos.

[00150] Deve-se observar que, como usado no presente documento, as formas singulares “um(a)”, “o” e “a” incluem referências de plural a não ser que o contexto claramente indique o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “um reagente” inclui um ou mais de tais diferentes reagentes e a referência a “o método” inclui referência a etapas e métodos equivalentes conhecidos pelos versados na técnica que poderiam ser modificados ou substituídos pelos métodos descritos no presente documento.

[00151] A não ser que indicado em contrário, o termo “pelo menos” precedendo uma série de elementos deve ser entendido como se referindo a cada elemento na série. Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de averiguar usando não mais que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descritas no presente documento. Tais equivalentes são destinados a ser abrangidos pela presente invenção.

[00152] Os termos “e/ou” onde quer que seja usado no presente documento incluem o significado de “e”, “ou” e “toda e qualquer combinação dos elementos conectados pelos ditos termos”.

[00153] Os termos “cerca de” ou “aproximadamente” como usados no presente documento significam dentro de 20%, preferivelmente dentro de 10%

64 / 95 e, ainda mais preferivelmente, dentro de 5% de um determinado valor ou faixa. Eles incluem, no entanto, também o número concreto, por exemplo, cerca de 20 inclui 20.

[00154] Os termos “menos do que” ou “maior do que” incluem o número concreto. Por exemplo, menos do que 20 significa menos ou igual a. Similarmente, mais ou maior do que significa mais ou igual a, ou maior ou igual a, respectivamente.

[00155] Em todo este relatório descritivo e nas reivindicações que se seguem, a não ser que o contexto exija o contrário, as palavras “compreendem” e variações tais como “compreende” e “compreendendo” serão entendidas como sugerindo a inclusão de um número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas declarados, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas. Quando usado no presente documento, o termo “compreendendo” pode ser substituído pelo termo “contendo” ou “incluindo” ou às vezes quando usado no presente documento pelos termos “tendo” ou “com”.

[00156] Quando usado no presente documento “que consiste(m) em” exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificados no elemento em reivindicação. Quando usado no presente documento, “que consiste essencialmente em” não exclui materiais ou etapas que não afetem materialmente as características básicas e novas da reivindicação.

[00157] Em cada ocorrência no presente documento, qualquer uma das locuções “que compreende”, “que consiste essencialmente em” e “que consiste em” pode ser substituída por qualquer uma das outras duas locuções.

[00158] Deve-se entender que esta invenção não é limitada à metodologia, protocolos, material, reagentes e substâncias, etc., particulares descritos no presente documento e, assim sendo, pode variar. A terminologia usada no presente documento tem apenas a finalidade de descrever modalidades particulares e não é destinada a limitar o escopo da presente

65 / 95 invenção, que é definido unicamente pelas reivindicações.

[00159] Todas as publicações e patentes citadas em todo o texto deste relatório descritivo (incluindo todas as patentes, pedidos de patente, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções, etc.), tanto supra quanto infra, são incorporadas ao presente documento em sua totalidade a título de referência. Nada no presente documento deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem o direito de preceder tal revelação em virtude de invenção anterior. Na medida em que o material incorporado por referência contradiga ou seja inconsistente com este relatório descritivo, o relatório descritivo suplantará qualquer material do tipo.

[00160] Exemplos de construções de anticorpo que podem ser usadas de acordo com esta invenção são descritos em MAbs. julho de 2019;11(5):899-

918.

[00161] Um melhor entendimento da presente invenção e de suas vantagens será obtido a partir dos exemplos a seguir, oferecidos somente para fins ilustrativos. Os exemplos não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de maneira alguma. Exemplo 1: Avaliação da citotoxicidade mediada por anticorpo por parte das células NK após o pré-carregamento e congelamento/descongelamento Cultura de linhagens celulares

[00162] A MM.1S (ATCC, cat.: CRL2974) e as células DK-MG (DSMZ, cat.: ACC277) foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS inativado por aquecimento, 2 mM de L-glutamina e 100 IU/mL de penicilina G sódica e 100 µg/mL de sulfato de estreptomicina. Todas as linhagens celulares foram cultivadas sob condições padrão e subcultivadas como recomendado pelo fornecedor a 37°C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2.Isolamento de PBMC de camadas leucoplaquetárias e enriquecimento de células NK humanas

[00163] As PBMCs foram isoladas das camadas leucoplaquetárias

66 / 95 (German Red Cross, Mannheim, Germany) por meio de centrifugação em gradiente de densidade. As amostras de camadas leucoplaquetárias foram diluídas com um volume de duas a três vezes de PBS (Invitrogen, cat.: 14190- 169), colocadas em camadas sobre uma almofada do Lymphoprep (Stem Cell Technologies, cat.: 07861) e centrifugadas a 800 x g por 25 min. à temperatura ambiente sem freio. As PBMCs localizadas na interface foram coletadas e lavadas 3 vezes com PBS antes de serem cultivadas em meio RPMI 1640 completo (meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS inativado por aquecimento, 2 mM de L-glutamina e 100 IU/mL de penicilina G sódica e 100 µg/mL de sulfato de estreptomicina (todos os componentes da Invitrogen)) durante a noite sem estimulação. Para o enriquecimento de células NK, as PBMCs foram colhidas de culturas da noite anterior e usadas para uma rodada de seleção negativa usando o kit EasySep™ Human NK Cell Enrichment (Stem Cell Technologies, cat.: 17055) para o isolamento imunomagnético de células NK humanas intocadas e o ímã Big Easy EasySep™ Magnet (Stem Cell Technologies, cat.: 18001) de acordo com as instruções do fabricante. Pré-carregamento de células NK e congelamento/descongelamento

[00164] Alíquotas de células NK humanas primárias enriquecidas foram ressuspensas em meio RPMI 1640 completo contendo 10 µg/mL das construções de anticorpo indicadas em um volume total de 0,5 mL e incubadas por 30 min. à temperatura ambiente. Como indicado, metade das alíquotas foi lavada duas vezes com 5 mL de meio RPMI 1640 completo e então ressuspensa em 0,5 mL de meio RPMI 1640 completo, e a segunda metade das alíquotas não foi lavada antes de ser adicionado FCS suplementado com 20% de DMSO (Sigma). As suspensões de células foram então transferidas a criotubos de 2 mL (Greiner bio-one) e congeladas a -80°C em um criorrecipiente de 1°C de congelamento (Nalgene) por mais de 12 h.

[00165] Ensaios de citotoxicidade por liberação de calceína de 4 h

[00166] Para ensaios de citotoxicidade por liberação de calceína as

67 / 95 células-alvo indicadas foram colhidas de culturas, lavadas com meio RPMI 1640 sem FCS e marcadas com 10 µM de calceína AM (Invitrogen/Molecular Probes, cat.: C3100MP) por 30 min. em meio RPMI sem FCS a 37°C. Após lavagem cuidadosa, as células marcadas foram ressuspensas em meio RPMI 1640 completo a uma densidade de 1x105/mL, e as alíquotas de 1x104 células- alvo foram então semeadas em poços individuais de uma microplaca de fundo arredondado de 96 poços. Em paralelo, as células NK foram descongeladas de -80°C por incubação dos criotubos em um banho-maria de 37°C. Quando os últimos cristais de gelo estavam visíveis, a suspensão de células foi diluída com meio RPMI 1640 completo, centrifugada e lavada uma vez antes de as células serem adicionadas às células-alvo na razão efetor para alvo (E:T) indicada com ou sem a adição de anticorpo fresco como indicado em um volume total de 200 µL em duplicatas. A liberação espontânea foi determinada pela incubação de células-alvo na ausência de células efetoras e sem anticorpos, e a liberação máxima foi induzida pela adição de 1% de tríton x-100 (concentração final, Roth) e também medida em quadruplicata em cada placa.

[00167] Após a centrifugação por 2 min em 200 g, o ensaio foi incubado por 4 h a 37°C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. 100 µL de sobrenadantes de cultura celular foram colhidos de cada poço após uma centrifugação adicional por 5 min em 500 g, e a fluorescência da calceína liberada foi medida em 520 nm usando um leitor multiplaca de fluorescência (Victor 3 ou EnSight, Perkin Elmer). Com base nas contagens medidas, a lise celular específica foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: [fluorescência (amostra) – fluorescência (espontânea)]/[fluorescência (máxima) – fluorescência (espontânea)] x 100%. Fluorescência (espontânea) representa as contagens fluorescentes de células-alvo na ausência de células efetoras e anticorpos e fluorescência (máxima) representa a lise celular total induzida pela adição de tríton X-100. Os valores de lise foram analisados e o desvio médio e padrão foram representados graficamente usando o software

68 / 95 GraphPad Prism (GraphPad Prism versão 7.04 para Windows, GraphPad Software, La Jolla Califórnia, EUA).

[00168] Os resultados são mostrados na figura 1. Exemplo 2: Análise de ligação de anticorpos anti-CD16 a diferentes variantes de antígeno

[00169] FcgRIII (CD16), o receptor de baixa afinidade para a parte Fc da IgG existe em duas isoformas codificadas por dois genes quase idênticos: FCGR3A (CD16A) e FCGR3B (CD16B), resultando na expressão específica a tecido de isoformas ancoradas por membrana alternativas (Ravetch e Perussia, 1989, J Exp Med.): • FcgRIIIA (CD16A) é expresso como uma proteína transmembranar em células NK, macrófagos, e subconjuntos de monócitos e células T • FcgRIIIB (CD16B) é expresso ancorado por glicosilfosfatidilinositol (GPI) por neutrófilos e após estimulação com interferon gama por eosinófilos.

[00170] As variantes alélicas/os polimorfismos de ambos, CD16A e CD16B são bem conhecidos (resumidos na Tabela 2).

[00171] As variantes alotípicas de CD16B diferem em cinco aminoácidos do domínio extracelular (ECD) (Tabela 2). Duas dessas possibilitam glicosilação adicional, resultando em três variantes diferentes dos antígenos de granulócitos de FcγRIIIB ancorado por GPI HNA-1a, -1b e -1c (anteriormente nomeados de NA1, NA2 e SH).

[00172] Existem apenas algumas poucas diferenças nas sequências de aminoácidos dos CD16A e B. As suas diferenças são restritas a dois aminoácidos alternativos no ECD maduro (Tabela 2). As diferenças adicionais residem nos modos divergentes de ancoragem membranar dos CD16A e CD16B. A sequência de propeptídeos no C-terminal do CD16B que é clivada na forma madura ancorada por GPI é altamente homóloga à sequência que

69 / 95 conecta o ECD do CD16A ao seu domínio transmembranar (Tabela 2).

[00173] Tabela 2: Resumo de variações de sequência dos alelos de FcgRIIIA (CD16A) e FcgRIIIB (CD16B). Foram usados números de aminoácidos apresentados na coluna esquerda. A numeração de Uniprot correspondente é mostrada no lado direito para comparação. As posições onde o CD16A difere do CD16B estão destacadas em negrito e sublinhadas. A sequência de propeptídeos que é removida na forma madura do CD16B é mostrada em letras riscadas. Posição do Nº do CD16A CD16B aminoácido aminoácido (Uniprot) 18 R R/S Polimorfismo de CD16B 36 47 S N/S Polimorfismo de CD16B 65 48 R/L/H L Polimorfismo de CD16A 66 60 A A/D Polimorfismo de CD16B 78 64 D D/N Polimorfismo de CD16B 82 88 I I/V Polimorfismo de CD16B 106 129 G D Variação de sequência de CD16A/CD16B 147 140 Y H Variação de sequência de CD16A/CD16B 158 158 V/F V Polimorfismo de CD16A 176 S c/ âncora 182 S Variação de CD16A/CD16B 200 de GPI 183 SFFPPGY SFSPPGYQ Variação de CD16A/CD16B 201 -190ff Q… … Propeptídeo de CD16B clivado -208ff 185 F S Variação de sequência de CD16A/CD16B 203

[00174] O isolamento do anticorpo específico a CD16A “LSIV21” sem ligação com CD16B foi anteriormente descrito (Reusch et al., 2014, MAbs).

[00175] Para investigar qual das variações de sequência de CD16A/CD16B determina o local de ligação para os nossos anticorpos seletivos de CD16A, gerou-se e caracterizou-se um conjunto de variantes de antígeno CD16A e CD16B recombinantes.

[00176] A proteína recombinante do ECD do CD16B (NA1) foi ou

70 / 95 expressa como a forma madura (sem propeptídeo) (CD16Bmat), ou como uma variante contendo a sequência de propeptídeos (CD16Bpr). Além disso, os mutantes do ECD do CD16B nos quais os aminoácidos específicos a CD16B foram substituídos pelos resíduos correspondentes do CD16A foram construídos, expressos e testados em ensaios de ligação: CD16B D129G, CD16BH140Y, CD16BS185F. Todas essas variantes de antígeno foram fundidas por meio de linker de glicina-serina a Fc monomérico solúvel (Ying et al, 2012, J. Biol. Chem.), expressas em CHO e purificadas de sobrenadantes de cultura celular.

[00177] Um anticorpo scFv compreendendo as sequências de cadeia pesada e leve variáveis do anticorpo 3G8 reativo a CD16A e CD16B publicado reconhece todas as variantes de antígeno CD16A e CD16B testadas (Figura 2, Tabela 3). Diferentes anticorpos contendo as sequências de cadeia pesada e leve variáveis do “LSIV21” ou do “P2C47” com afinidade melhorada (na forma de scFv monovalente ou anticorpos diacorpos em tandem biespecíficos tetravalentes com ligação bivalente) reconhecem o CD16A, mas não os antígenos de fusão de ECD maduros ou contendo propeptídeos do CD16B. Se no entanto a histidina (H) na posição 140 no ECD do CD16B era mutada para tirosina (Y) - o aminoácido presente na posição correspondente no CD16A - essa forma mutante do CD16B (CD16BH140Y) foi bem reconhecida pelos anticorpos contendo os domínios variáveis de “LSIV21” ou “P2C47” (Figura 2, Tabela 3).

71 / 95 Tabela 3: Resumo da ligação de diferentes anticorpos anti-CD16 a variantes de antígeno CD16 revestidas analisada no ELISA. Os valores de EC 50 de ligação foram calculados usando-se o modelo de curva logístico de quatro parâmetros (4PL) log(agonista) vs. resposta - inclinação variável no Graphpad Prism. EC50 da ligação [nM] no ELISA antígenos revestidos TandAb TandAb (todos fundidos ao Fc scFv do scFv do EGFR-1/CD16-1 BCMA-1/CD16-2 monomérico) 3G8 CD16-2 (CD16-1) (CD16-2) CD16A(48R, 158V) humano 1,0 1,6 0,6 1,1 CD16Bmat humano 0,9 sem ligação sem ligação sem ligação CD16Bpr humano 0,8 sem ligação sem ligação sem ligação CD16BD129G humano 0,8 sem ligação sem ligação sem ligação CD16BH140Y humano 0,7 1,3 0,5 1,2 CD16BS185F humano 0,7 sem ligação sem ligação sem ligação

[00178] Os anticorpos scFv anti-CD16 de afinidade maturada foram similarmente analisados no ELISA. Os resultados mostram que, exceto pelo “CD16-5” scFv, que mostra uma reatividade cruzada fraca com o CD16B, os outros anticorpos scFv anti-CD16 de afinidade maturada mantêm a propriedade de ligação seletiva a CD16A do anticorpo parental. Eles não se ligam ao CD16B, a não ser que o CD16B contenha o CD16BH140Y de troca de aminoácido descrito anteriormente (Tabela 4). Todos os anticorpos anti-CD16 mostram uma reatividade cruzada muito boa com CD16A de cinomológo (Tabela 4), não obstante o fato de que a sequência do ECD do CD16A de cinomológo difere em um total de 16 aminoácidos do CD16A humano (consultar o alinhamento na Figura 4).

[00179] A importância da tirosina (Y) na posição 140 no ECD do CD16 para reconhecimento específico a CD16A por parte dos nossos anticorpos também foi confirmada usando células CHO recombinantes com expressão transgênica de diferentes variantes de antígeno CD16 na superfície celular. As sequências de ECD foram ou fundidas ao domínio transmembranar do EGFR

72 / 95 humano (Wang et al., 2011, Blood 118(5)1255) ou ancoradas por GPI usando a sequência endógena de CD16B humano com a sequência de propeptídeos completa para processamento e lipidação pós-tradução para ancoragem por GPI.

[00180] O anticorpo scFv compreendendo as sequências de cadeia pesada e leve variáveis do anticorpo 3G8 reativo a CD16A e CD16B publicado reconhece todas as variantes de antígeno CD16A e CD16B expressas na superfície celular (Figura 3), mas não EGFR recombinante expresso como um controle de especificidade. Os anticorpos scFv contendo as sequências de cadeia pesada e leve variáveis do “LSIV21” ou do “P2C47” com afinidade melhorada reconhecem as variantes de CD16A expressas na superfície de células CHO mas não o ECD maduro ou contendo propeptídeo do CD16B(NA1). Se no entanto a histidina (H) na posição 140 no ECD do CD16B ancorado por membrana de CHO era mutada para tirosina (Y) - o aminoácido presente na posição correspondente no CD16A - essa forma mutante do CD16B (CD16BH140Y) foi bem reconhecida pelos anticorpos scFv contendo os domínios variáveis de “LSIV21” ou “P2C47” (Figura 3).

[00181] As variantes dos antígenos CD16A e CD16BH140Y, mas não do antígeno CD16B, também são reconhecidas após SDS-PAGE e Western blot quando as amostras são tratadas sob condições não redutoras, por anticorpos contendo “LSIV21”, “P2C47” ou domínios variáveis com afinidade maturada (Figura 5), enquanto o anticorpo 3G8 reconhece todas as variantes dos antígenos CD16A e CD16B. Quando as amostras são reduzidas antes do carregamento nos géis SDS-PAGE, nenhum sinal é obtido nos Western blots (dados não mostrados), sugerindo uma sequência não linear, mas sim uma estrutura tridimensional como o epítopo de ligação. No caso de reconhecimento por “LSIV21”, “P2C47” ou variantes com afinidade maturada desses anticorpos, a estrutura de epítopo tridimensional é provavelmente determinada pela tirosina na posição 140 do CD16.

73 / 95 Tabela 3: Resumo da ligação de diferentes anticorpos anti-CD16 a variantes de antígeno CD16 revestidas analisada no ELISA. Os valores de EC 50 de ligação foram calculados usando-se o modelo de curva logístico de quatro parâmetros (4PL) log(agonista) vs. resposta - inclinação variável no Graphpad Prism.

EC50 da ligação [nM] no ELISA Antígeno revestido (todos 3G8 CD16-1 CD16-2 CD16-6 CD16-8 CD16-9 CD16-10 CD16-11 CD16-12 CD16-5 CD16-3 fundidos ao Fc de IgG) CD16A(48R, 1,2 14,4 1,5 1,4 1,7 1,8 1,3 2,7 1,4 1,2 1,2 158V) humano CD16A(48R, 7,6 25,7 2,8 0,9 1,5 1,7 1,2 2,8 1,2 0,8 1,2 158F) humano CD16A de 7,5 16,2 2,5 1,0 1,7 1,4 1,2 3,9 1,1 1,4 1,4 cinomologo CD16B(NA1)pr sem sem sem sem sem sem sem sem sem 0,8 24,9 humano ligação ligação ligação ligação ligação ligação ligação ligação ligação CD16BH140Y 0,7 9,5 1,2 1,1 1,5 1,6 1,3 2,0 1,1 1,1 1,3 humano EC50 da ligação [nM] no ELISA Antígeno revestido (todos CD16-13 CD16-14 CD16-15 CD16-16 CD16-4 CD16-17 CD16-18 CD16-19 CD16-20 CD16-21 CD16-7 fundidos ao Fc de IgG) CD16A(48R, 1,6 1,1 1,3 1,4 2,2 6,7 1,2 1,3 1,7 1,1 1,8 158V) humano CD16A(48R, 1,6 1,0 1,1 1,1 2,5 14,5 1,0 1,3 1,8 1,3 2,4 158F) humano CD16A de 1,8 1,1 1,8 1,4 1,4 10,7 1,7 2,1 2,6 1,6 1,6 cinomológo CD16B(NA1)pr sem sem sem sem sem sem sem sem sem sem sem humano ligação ligação ligação ligação ligação ligação ligação ligação ligação ligação ligação CD16BH140Y 1,6 1,2 1,4 1,4 1,7 4,9 1,1 1,1 1,4 1,0 1,7 humano

[00182] O local de ligação de IgG do FcgRIII é uma área de ligação

74 / 95 descontínua na domínio extracelular próximo a membrana do receptor. Os aminoácidos cruciais para a interação de baixa afinidade do FcgRIIIA (CD16A) com a parte Fc da IgG foram anteriormente identificados e descritos (por exemplo, Ahmed et al., 2016). Os resíduos no CD16A envolvidos na interação com o domínio CH2 das porções Fc são K120, Y132, H134, H135 e K161. Embora tenha sido relatado que o anticorpo 3G8 se liga ao CD16A e CD16B e bloqueia a ligação de IgG (Tamm e Schmidt, 1996), não foi observado o bloqueio da ligação dos nossos anticorpos anti-CD16 ao CD16A pelas IgGs. Para corroborar a hipótese de que o local de ligação dos nossos anticorpos específicos anti-CD16A é diferente do local de ligação de IgG no FcgRIIIA, foi realizado um ELISA de competição. Enquanto a ligação do mAb 3G8 ao CD16A é bloqueada com concentrações crescentes de um anticorpo scFv contendo os domínios variáveis do 3G8, os outros anticorpos scFv anti-CD16 não bloqueiam ou deslocam o mAb 3G8 no CD16A e se ligam independentemente (Figura 6). Visto que o local de ligação do 3G8 é conhecido por bloquear a ligação de IgG, conclui-se que o local de ligação dos nossos anticorpos anti-CD16 é distinto do local de ligação de IgG. Análise de ligação no ELISA

[00183] Placas de ELISA de 96 poços (Immuno MaxiSorp; Nunc) foram revestidas durante a noite a 4°C com proteínas de fusão produzidas recombinantemente das variantes de antígeno do domínio extracelular(ECD) do CD16 fundidas ao Fc ou mFc.67 monomérico de IgG1 humana (Ying et al, 2012, J. Biol. Chem.) em 100 mM de tampão de carbonato-bicarbonato em uma concentração de 1,5 ou 3 µg/mL. Após uma etapa de bloqueio com 3% (p/v) de leite em pó desnatado (Merck) dissolvido em PBS, diluições em série dos diferentes anticorpos em PBS contendo 0,3% (p/v) de leite em pó desnatado foram incubadas nas placas por 1,5 h à temperatura ambiente. Após lavar três vezes com 300 µL por poço de PBS contendo 0,1% (v/v) de Tween 20, as placas foram incubadas com anticorpos de detecção por 1 h à temperatura ambiente.

75 / 95 Para a detecção de analitos com etiqueta His, Penta-HIS-HRP (Qiagen) foi usado em uma diluição de 1:3000. Para a detecção de anticorpo TandAb BCMA/CD16 biespecífico tetravalente, T763, um conjugado de proteína L- HRP (Pierce) foi usado em uma diluição de 1:20.000 por 1 hora à temperatura ambiente. Após lavar três vezes com 300 µL por poço de PBS contendo 0,1% (v/v) de Tween 20, as placas foram incubadas com substrato de tetrametilbenzidina (TMB) (Seramun) até o desenvolvimento de cor estar claramente visível. A reação foi interrompida através da adição de 100µL por poço de H2SO4 a 0,5M. A absorbância foi medida em 450 nm usando-se um leitor de placa multilabel (Victor, Perkin Elmer). Os valores de absorbância foram representados graficamente e analisados com o uso de regressão não linear, dose-resposta sigmoidal (inclinação variável), ajuste de mínimos quadrados (ordinários) com o GraphPad Prism versão 6.07 (GraphPad Software, La Jolla Califórnia, EUA). Análise de ligação após SDS-PAGE e Western blot

[00184] As variantes de antígeno CD16 recombinantes (CD16A48R 158V- humano, mFc.67, CD16B(NA1)pr-mFc.67 e huCD16B(NA1)prH140Y- mFc.67 humanos foram diluídos em PBS a 0,5 µg/mL, misturados com um volume igual de tampão de amostra não redutor e 8 µl da mistura foram carregados nos poços dos géis 4-20% Criterion TGX Precast Gels (Biorad). Os géis foram corridos a 300 V em tampão 1x TGS (Biorad) por 22 min. e a proteína total foi imageada com o uso do sistema Biorad Molecular Imager Gel Documentation. A proteína foi transferida por Western blot para as membranas PVDF Midi Membranes (Biorad) usando-se o sistema Trans-Blot Turbo (Biorad). As membranas foram a incubação por 30 min. com 3% (p/v) de leite em pó desnatado (Merck) dissolvido em TBS para bloquear locais de ligação inespecíficos e então incubadas com diluições de anticorpo primário: anticorpos anti-CD16 foram diluídos em TBS contendo 3% (p/v) de leite em pó desnatado a uma concentração de 4 µg/mL e incubados nas membranas por

76 / 95 1 hora à temperatura ambiente. Após lavar com TBST (TBS contendo 0,1% (v/v) de Tween 20) e duas vezes com TBS, as membranas foram incubadas com conjugados de detecção de anticorpo secundário: as membranas incubadas com anticorpos scFv-IgAb contendo anti-CD16A foram incubadas com proteína L- HRP (Pierce), diluída a 1:10.000 em TBS contendo 3% (p/v) de leite em pó desnatado, as membranas incubadas com anticorpos scFv anti-CD16 foram incubadas com anti-Penta-His-HRP (QIAGEN) diluído a 1:3000 em TBS contendo 3% (p/v) de leite em pó desnatado, por 1 hora à temperatura ambiente. Após lavar com TBST e duas vezes com TBS, foi iniciado o desenvolvimento colorimétrico pela adição de uma mistura recém-preparada de 0,66 mg/mL de DAB, 0,02% de CoCl2, 0,015% de H2O2 em TBS e incubado nas membranas até a cor se desenvolver. A reação foi interrompida pela lavagem das membranas em água. As membranas foram secadas e fotografadas. ELISA de competição de CD16A

[00185] Placas de ELISA de 96 poços (Immuno MaxiSorp; Nunc) foram revestidas durante a noite a 4°C com proteínas de fusão produzidas recombinantemente do ECD do CD16A (48R, 158V) fundidas a mFc.67 monomérico (Ying et al, 2012, J. Biol. Chem.) em 100 mM de tampão de carbonato-bicarbonato em uma concentração de 1,5 µg/mL. Após uma etapa de bloqueio com 3% (p/v) de leite em pó desnatado (Merck) dissolvido em PBS, diluições em série dos diferentes anticorpos scFv em PBS contendo 0,3% (p/v) de leite em pó desnatado foram misturadas com 1 nM de mAb 3G8 anti-CD16 (BD Bioscience) e coincubadas nas placas por 1,5 h à temperatura ambiente. Após lavar três vezes com 300 µL por poço de PBS contendo 0,1% (v/v) de Tween 20, as placas foram incubadas com anticorpos de detecção por 1 h à temperatura ambiente. Para a detecção de 3G8 ligado a CD16A, IgG(H+L)- HRPO de cabra anti-camundongo (Dianova 115-035-003) foi usada a uma diluição de 1:10.000. Após lavar três vezes com 300 µL por poço de PBS contendo 0,1% (v/v) de Tween 20, as placas foram incubadas com substrato de

77 / 95 tetrametilbenzidina (TMB) (Seramun) até o desenvolvimento de cor estar claramente visível. A reação foi interrompida através da adição de 100µL por poço de H2SO4 a 0,5M. A absorbância foi medida em 450 nm usando-se um leitor de placa multilabel (Victor, Perkin Elmer). Os valores de absorbância foram representados graficamente e analisados com o uso de regressão não linear, dose-resposta sigmoidal (inclinação variável), ajuste de mínimos quadrados (ordinários) com o GraphPad Prism versão 6.07 (GraphPad Software, La Jolla Califórnia, EUA). Exemplo 3: Ligação de scFv anti-CD16A a células NK humanas primárias a 37°C na presença ou ausência de 10 mg/mL de IgG humana policlonal Métodos: Isolamento de PBMC de camadas leucoplaquetárias e enriquecimento de células NK humanas

[00186] As PBMCs foram isoladas das camadas leucoplaquetárias (German Red Cross, Mannheim, Germany) por meio de centrifugação em gradiente de densidade. As amostras de camadas leucoplaquetárias foram diluídas com um volume de duas a três vezes de PBS (Invitrogen, cat.: 14190- 169), colocadas em camadas sobre uma almofada do Lymphoprep (Stem Cell Technologies, cat.: 07861) e centrifugadas a 800 x g por 25 min. à temperatura ambiente sem freio. As PBMCs localizadas na interface foram coletadas e lavadas 3 vezes com PBS antes de serem cultivadas em meio RPMI 1640 completo (meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS inativado por aquecimento, 2 mM de L-glutamina e 100 IU/mL de penicilina G sódica e 100 µg/mL de sulfato de estreptomicina (todos os componentes da Invitrogen) durante a noite sem estimulação. Para o enriquecimento de células NK, as PBMCs foram colhidas de culturas da noite anterior e usadas para uma rodada de seleção negativa usando o kit EasySep™ Human NK Cell Enrichment (Stem Cell Technologies, cat.: 19955) para o isolamento imunomagnético de células NK humanas intocadas e o ímã Big Easy EasySep™ Magnet (Stem Cell

78 / 95 Technologies, cat.: 18001) de acordo com as instruções do fabricante. Ensaios de ligação celular e análises de citometria de fluxo

[00187] As alíquotas de 0,2-1 x 106 células NK humanas enriquecidas foram incubadas com 100 µL de diluições em série das construções de scFv indicadas em tampão FACS (PBS, Invitrogen, cat.: 14190-169) contendo 2% de FCS inativado por aquecimento (Invitrogen, cat.: 10270-106), 0,1% de azida de sódio (Roth, Karlsruhe, Alemanha, cat.: A1430.0100) na presença de 10 mg/mL de IgG humana policlonal (Gammanorm, Octapharma) ou do tampão correspondente por 45 min. a 37°C. Após repetidas lavagens com tampão FACS, os anticorpos ligados a células foram detectados com 10 µg/mL de mAb anti-His 13/45/31-2 (Dianova, Hamburgo, Alemanha, cat.: DIA910-1MG) seguido de 15 µg/mL de IgG de cabra anti-camundongo conjugada com FITC (Dianova, cat.: 115-095-062). Após a última etapa de coloração, as células foram lavadas novamente e ressuspensas em 0,2 mL de tampão FACS contendo 2 µg/mL de iodeto de propídio (PI) (Sigma, cat.: P4170) a fim de excluir células mortas. A fluorescência de 2-5 x 103 células vivas foi medida usando-se um citômetro de fluxo Millipore Guava EasyCyte (Merck Millipore, Schwalbach, Alemanha) ou o citômetro CytoFlex (Beckman Coulter, Krefeld, Alemanha) e as intensidades médias de fluorescência das amostras celulares foram determinadas. Após subtrair os valores de intensidade de fluorescência das células coloridas somente com os reagentes secundários e terciários, os valores foram usados para análise de regressão não linear usando o software GraphPad Prism (GraphPad Prism versão 7.04 para Windows, GraphPad Software, La Jolla Califórnia, EUA). Para o cálculo de KD, foi usada a equação para ligação em um local (hipérbole). Resultados

[00188] O scFv anti-CD16 contendo os domínios Fv humanos do CD16- 1 clone, o scFv contendo os domínios Fv anti-CD16 humanos do CD16-2 clone, e o scFv_3G8 contendo os domínios Fv murinos do mAb 3G8 (C) foram

79 / 95 titulados em células NK humanas primárias a 37°C na presença ou ausência de 10 mg/mL IgG humana policlonal. Os respectivos resultados são retratados na figura 7. Exemplo 4: Avaliação da citotoxicidade mediada por anticorpo pelas células NK após o pré-carregamento com anticorpos anti-EpCAM e anti- CD30 e congelamento/descongelamento Métodos: Tabela 4: Construções de anticorpo especificidade do domínio do especificidade do domínio do Construção alvo alvo efetor efetor scFv-IgAb_73 EpCAM 42 NKp46 NKp46-2 scFv-IgAb_75 EpCAM 42 NKG2D KYK_2_0 scFv-IgAb_80 EpCAM 42 CD16A P2C-47 anti-EpCAM de IgG EpCAM 42 n.a. n.a.

§ TandAb CD30 HRS-3 CD16A LSIV21 § anti-CD30 de IgG CD30 HRS-3 n.a. n.a. § anti-CD30 de IgG CD30 HRS-3 n.a. n.a. com Fc intensif. § para construção, produção e purificação de TandAb CD30/CD16A, anti-CD30 de IgG e anti-CD30 de IgG com Fc intensificado consultar Reusch et al., MAbs. maio-junho de 2014; 6(3):728-39.

Cultura de linhagens celulares

[00189] As células COLO 205 (gentilmente providas pelo Dr. G. Moldenhauer, German Cancer Research Center, Heidelberg, Alemanha) e KARPAS-299 (DSMZ, cat.: ACC31) foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS inativado por aquecimento, 2 mM de L- glutamina e 100 IU/mL de penicilina G sódica e 100 µg/mL de sulfato de estreptomicina. Todas as linhagens celulares foram cultivadas sob condições padrão e subcultivadas como recomendado pelo fornecedor a 37°C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. Isolamento de PBMC de camadas leucoplaquetárias e enriquecimento de

80 / 95 células NK humanas

[00190] As PBMCs foram isoladas das camadas leucoplaquetárias (German Red Cross, Mannheim, Germany) por meio de centrifugação em gradiente de densidade. As amostras de camadas leucoplaquetárias foram diluídas com um volume de duas a três vezes de PBS (Invitrogen, cat.: 14190- 169), colocadas em camadas sobre uma almofada do Lymphoprep (Stem Cell Technologies, cat.: 07861) e centrifugadas a 800 x g por 25 min. à temperatura ambiente sem freio. As PBMCs localizadas na interface foram coletadas e lavadas 3 vezes com PBS antes de serem cultivadas em meio RPMI 1640 completo (meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS inativado por aquecimento, 2 mM de L-glutamina e 100 IU/mL de penicilina G sódica e 100 µg/mL de sulfato de estreptomicina (todos os componentes da Invitrogen)) durante a noite sem estimulação. Para o enriquecimento de células NK, as PBMCs foram colhidas de culturas da noite anterior e usadas para uma rodada de seleção negativa usando o kit EasySep™ Human NK Cell Enrichment (Stem Cell Technologies, cat.: 17055) para o isolamento imunomagnético de células NK humanas intocadas e o ímã Big Easy EasySep™ Magnet (Stem Cell Technologies, cat.: 18001) de acordo com as instruções do fabricante. Pré-carregamento de células NK e congelamento/descongelamento

[00191] Alíquotas de células NK humanas primárias enriquecidas foram ressuspensas em meio RPMI 1640 completo contendo 10 µg/mL das construções de anticorpo indicadas em um volume total de 0,5 mL e incubadas por 30 min. à temperatura ambiente. Após a adição de 0,5 mL de FCS suplementado com 20% de DMSO (Sigma), as suspensões de células foram então transferidas a criotubos de 2 mL (Greiner bio-one) e congeladas a -80°C em um criorrecipiente de 1°C de congelamento (Nalgene) por mais de 12 h.

[00192] Ensaios de citotoxicidade por liberação de calceína de 4 h

[00193] Para ensaios de citotoxicidade por liberação de calceína as células-alvo indicadas foram colhidas de culturas, lavadas com meio RPMI

81 / 95 1640 sem FCS e marcadas com 10 µM de calceína AM (Invitrogen/Molecular Probes, cat.: C3100MP) por 30 min. em meio RPMI sem FCS a 37°C. Após lavagem cuidadosa, as células marcadas foram ressuspensas em meio RPMI 1640 completo a uma densidade de 1x105/mL, e as alíquotas de 1x104 células- alvo foram então semeadas em poços individuais de uma microplaca de fundo arredondado de 96 poços. Em paralelo, as células NK foram descongeladas de -80°C por incubação dos criotubos em um banho-maria de 37°C. Quando os últimos cristais de gelo estavam visíveis, a suspensão de células foi diluída com meio RPMI 1640 completo, centrifugada e lavada uma vez antes de as células serem adicionadas às células-alvo na razão efetor para alvo (E:T) indicada com ou sem a adição de anticorpo fresco como indicado em um volume total de 200 µL em duplicatas. A liberação espontânea foi determinada por incubação de células-alvo na ausência de células efetoras e sem anticorpos, e a liberação máxima foi induzida pela adição de 1% de tríton x-100 (concentração final, Roth) e também medida em quadruplicata em cada placa.

[00194] Após a centrifugação por 2 min em 200 g, o ensaio foi incubado por 4 h a 37°C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. 100 µL de sobrenadantes de cultura celular foram colhidos de cada poço após uma centrifugação adicional por 5 min em 500 g, e a fluorescência da calceína liberada foi medida em 520 nm usando um leitor multiplaca de fluorescência (Victor 3 ou EnSight, Perkin Elmer). Com base nas contagens medidas, a lise celular específica foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: [fluorescência (amostra) – fluorescência (espontânea)]/[fluorescência (máxima) – fluorescência (espontânea)] x 100%. Fluorescência (espontânea) representa as contagens fluorescentes de células-alvo na ausência de células efetoras e anticorpos e fluorescência (máxima) representa a lise celular total induzida pela adição de tríton X-100. Os valores de lise foram analisados e o desvio médio e padrão foram representados graficamente usando o software GraphPad Prism (GraphPad Prism versão 7.04 para Windows, GraphPad

82 / 95 Software, La Jolla Califórnia, EUA). Resultados:

[00195] As células NK humanas primárias que foram pré-carregadas com construções de anticorpo anti-EpCAM, tais como scFv-IgAb_73 EpCAM/NKp46, scFv-IgAb_75 EpCAM/NKG2D, scFv-IgAb_80 EpCAM/CD16A e anti-EpCAM de IgG, induziram a lise específica das células COLO 205 EpCAM-positivas, mas não das células KARPAS-299 EpCAM- negativas. Dentre as construções anti-EpCAM biespecíficas, as células NK pré- carregadas com scFv-IgAb_80 EpCAM/CD16A exibiram a maior eficácia na lise de células COLO 205, e as células NK carregadas com scFv-IgAb_75 EpCAM/NKG2D, a menor eficácia. Nenhuma das preparações de célula NK pré-carregadas com construções de anticorpo anti-CD30 mediou uma lise substancial da COLO 205 (Figura 8A e Tabela 5).

[00196] Em contrapartida, as células NK que foram pré-carregadas com TandAb CD30/CD16A ou anti-CD30 de IgG com Fc intensificado mediaram a lise das células KARPAS-299 CD30-positivas, mas não das células COLO 205 CD30-negativas. As células NK pré-carregadas com anti-CD30 de IgG do tipo selvagem não mediaram a lise da KARPAS-299, sugerindo que esse anti-CD30 de IgG do tipo selvagem se dissociou rápido demais das células NK durante o congelamento, descongelamento e lavagem, e que o número de IgG restante era baixo demais para mediar uma lise substancial das células-alvo (Figura 8B e Tabela 5).

[00197] Curiosamente, as células NK que foram pré-carregadas com 10 µg/mL de scFv-IgAb_75 EpCAM/NKG2D ou TandAb CD30/CD16A, congeladas, descongeladas e lavadas induziram uma lise similar das células COLO 205 ou KARPAS-299, respectivamente, àquela das células NK que não foram pré-carregadas, mas sim suplementadas no ensaio de citotoxicidade com 10 µg/mL de scFv-IgAb_75 EpCAM/NKG2D ou TandAb CD30/CD16A frescos.

83 / 95

[00198] Tabela 5: Eficácia da lise de células-alvo por parte de células NK pré-carregadas e congeladas em uma razão E:T de 5:1 As células NK foram pré-carregadas com 10 µg/mL das construções de anticorpo indicadas ou sem anticorpo (s/ anticorpo) por 30 min. à temperatura ambiente e então congeladas a -80°C. As células NK descongeladas foram lavadas e usadas como células efetoras em um ensaio de citotoxicidade por liberação de calceína de 4 h nas células-alvo COLO 205 ou KARPAS-299. Como controle, scFv- IgAb_75 EpCAM/NKG2D e T116 CD30/CD16A foram adicionados frescos em uma concentração de 10 µg/mL a células NK que não foram pré-carregadas antes do congelamento (s/ anticorpo). A média dos valores de lise em duplicata em uma razão E:T de 5:1 é mostrada. Exp. nº RBL 1464.

Eficácia [%] da lise de células-alvo em uma razão E:T de 5:1 Construção de anticorpo COLO 205 KARPAS-299 scFv-IgAb_73 EpCAM/NKp46 51,7 2,8 scFv-IgAb_75 EpCAM/NKG2D 22,2 4,4 scFv-IgAb_80 EpCAM/CD16A 100,9 1,8 anti-EpCAM de IgG 32,4 2,4 TandAb CD30/CD16A -2,7 86,1 anti-CD30 de IgG -1,9 5,1 anti-CD30 de IgG com Fc intensif. 5,1 43,0 s/ anticorpo 8,2 3,2 s/ anticorpo 33,5 5,7 + scFv-IgAb_75 EpCAM/NKG2D s/ anticorpo 4,9 90,4 + T116 CD30/CD16A

84 / 95 Seq ID Descrição Sequência

NO 1 Linker L1 GGSGGS 2 Linker L2 GGSGGSGGSGGSGGSGGS 3 Linker L3 GGSGGSGGSGGSGGSGGSGGS 4 Linker L4 GGSGGSGGS 5 Conector 1 GGGGS 6 Conector 2 GGGGSGGGGS 7 Conector 3 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 8 Conector 4 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 9 Dobradiça EPKSCDKTHTCPPCP 10 Dobradiça média DKTHTCPPCP 11 Domínio constante da ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT cadeia pesada CH1, CH2 SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD e CHR de IgG1 humana KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV com mutações de TCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL silenciamento TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP

SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 12 Domínio constante da ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT cadeia pesada CH1, CH2 SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD e CHR de IgG1 humana KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV (tipo selvagem) TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL

TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 13 Domínio constante da GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSS cadeia leve lambda PVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGS humana TVEKTVAPTECS 14 Domínio constante da RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL cadeia leve Kappa QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL humano SSPVTKSFNRGEC 15 Domínio constante da APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNW cadeia pesada CH2-CH3 YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS com mutações de NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG silenciamento FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ

QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 16 Domínio constante de APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNW cadeia pesada YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS monomérico CH2-CH3 NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTKPPSRDELTKNQVSLSCLVKG com mutações de FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTVPVLDSDGSFRLASYLTVDKSRWQ silenciamento QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 17 Cadeia de botão: APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNW domínio constante de YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS cadeia pesada CH2-CH3 NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKG com mutações de FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ silenciamento QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 18 Cadeia inteira: domínio APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNW constante da cadeia YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS pesada CH2-CH3 com NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG mutações de FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQ silenciamento QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 19 Domínio constante de ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT cadeia pesada CH1 SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV

DKKV 20 Domínio constante da GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSS cadeia leve lambda PVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGS humana com mutação TVEKTVAPTESS pontual no terminal C

85 / 95 21 Domínio constante da RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL cadeia leve kappa QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL humana com mutação SSPVTKSFNRGES pontual no terminal C 22 Domínio constante de APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW cadeia pesada CH2-CH3 YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS (tipo selvagem) NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG

FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ

QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 23 CD16A Humano GMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHN

ESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLL LQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDF YIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFP

PGYQ 24 CD16A Cinomólogo GMRAEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDRVTLKCQGAYSPEDNSTRWFHN

ESLISSQTSSYFIAAARVNNSGEYRCQTSLSTLSDPVQLEVHIGWLL LQAPRWVFKEEESIHLRCHSWKNTLLHKVTYLQNGKGRKYFHQNSDF YIPKATLKDSGSYFCRGLIGSKNVSSETVNITITQDLAVSSISSFFP

PGYQ 25 Tag his HHHHHH 26 C-Tag EPEA 27 VH HSA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGLEW

IGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYY

CARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSS 28 VL HSA DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSPSVWSNFLSWYQQKPGKAPKL

LIYEASKLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGYS

SISDTTFGGGTKVEIK 29 CDR-H1 CD16A GYTFTSYY (CD16-1) 30 CDR-H2 CD16A INPSGGST (CD16-1) 31 CDR-H3 CD16A ARGSAYYYDFADY (CD16-1) 32 CDR-L1 CD16A NIGSKN (CD16-1) 33 CDR-L2 CD16A QDN (CD16-1) 34 CDR-L3 CD16A QVWDNYSVL (CD16-1) 35 VH CD16A QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW (CD16-1) MGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

YCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS 36 VL CD16A SYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVI (CD16-1) YQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYS

VLFGGGTKLTVL 37 scFv CD16A QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW (CD16-1) MGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

YCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSSYV LTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQD NKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLF

GGGTKLTVLAAAGSHHHHHH 38 Fab VH CD16A QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW (CD16-1) MGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

YCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV

VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 39 Fab VL CD16A SYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVI (CD16-1) YQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYS

VLFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSH RSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

86 / 95 40 CDR-H1 CD16A GYTFTSYY (CD16-2) 41 CDR-H2 CD16A IEPMYGST (CD16-2) 42 CDR-H3 CD16A ARGSAYYYDFADY (CD16-2) 43 CDR-L1 CD16A NIGSKN (CD16-2) 44 CDR-L2 CD16A QDN (CD16-2) 45 CDR-L3 CD16A QVWDNYSVL (CD16-2) 46 VH CD16A QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW (CD16-2) MGAIEPMYGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

YCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS 47 VL CD16A SYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVI (CD16-2) YQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYS

VLFGGGTKLTVL 48 scFv CD16A QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW (CD16-2) MGAIEPMYGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

GGGTKLTVLAAAGSHHHHHH 49 Fab VH CD16A QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW (CD16-2) MGAIEPMYGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 50 Fab VL CD16A SYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVI (CD16-2) YQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYS

VLFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSH

RSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 51 CDR-H1 CD16A GYTFTNYY (CD16-3) 52 CDR-H2 CD16A INPGGGST (CD16-3) 53 CDR-H3 CD16A ARGSAYYYDFADY (CD16-3) 54 CDR-L1 CD16A NIGSQS (CD16-3) 55 CDR-L2 CD16A QDS (CD16-3) 56 CDR-L3 CD16A QVWDNYSVV (CD16-3) 57 VH CD16A (CD16-3) QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTNYYMQWVRQAPGQGLEW

MGVINPGGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

YCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS 58 VL CD16A (CD16-3) SYVLTQPSSVSVAPGQTARITCGGHNIGSQSVHWYQQKPGQAPVLVI

YQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYS

VVFGGGTKLTVL 59 scFv CD16A (CD16-3) QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTNYYMQWVRQAPGQGLEW

MGVINPGGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY YCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSSYV LTQPSSVSVAPGQTARITCGGHNIGSQSVHWYQQKPGQAPVLVIYQD SKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVVF

GGGTKLTVLAAAGSHHHHHH 60 Fab VH CD16A (CD16- QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTNYYMQWVRQAPGQGLEW 3) MGVINPGGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

87 / 95

VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 61 Fab VL CD16A (CD16- SYVLTQPSSVSVAPGQTARITCGGHNIGSQSVHWYQQKPGQAPVLVI 3) YQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYS

VVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSH

RSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 62 CDR-H1 CD16A GYSFSDFY (CD16-4) 63 CDR-H2 CD16A INPGGAST (CD16-4) 64 CDR-H3 CD16A ARGSAYYYDFADY (CD16-4) 65 CDR-L1 CD16A NIGRQS (CD16-4) 66 CDR-L2 CD16A QDS (CD16-4) 67 CDR-L3 CD16A QVWDNYTVV (CD16-4) 68 VH CD16A QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYSFSDFYIQWVRQAPGQGLEW (CD16-4) MGIINPGGASTTYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

YCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS 69 VL CD16A SYVLTQPSSVSVAPGQTARITCGGYNIGRQSVHWYQQKPGQAPVLVI (CD16-4) YQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYT

VVFGGGTKLTVL 70 scFv CD16A QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYSFSDFYIQWVRQAPGQGLEW (CD16-4) MGIINPGGASTTYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

YCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSSYV LTQPSSVSVAPGQTARITCGGYNIGRQSVHWYQQKPGQAPVLVIYQD SKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYTVVF

GGGTKLTVLAAAGSHHHHHH 71 Fab VH CD16A (CD16- QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYSFSDFYIQWVRQAPGQGLEW 4) MGIINPGGASTTYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 72 Fab VL CD16A (CD16- SYVLTQPSSVSVAPGQTARITCGGYNIGRQSVHWYQQKPGQAPVLVI 4) YQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYT

RSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 73 CDR-H1 CD16A (CD16- GYTFSSYY 5) 74 CDR-H2 CD16A (CD16- IEPRGVRI 5) 75 CDR-H3 CD16A (CD16- ARGSAYYYDFADY 5) 76 CDR-L1 CD16A (CD16- NIGSTN 5) 77 CDR-L2 CD16A (CD16- QDS 5) 78 CDR-L3 CD16A (CD16- QVWDNYSVQ 5) 79 VH CD16A (CD16-5) QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFSSYYMHWVRQAPGQGLEW

MGAIEPRGVRISYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

YCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS 80 VL CD16A (CD16-5) SYVLTQPSSVSVAPGQTARITCGGHNIGSTNVHWYQQKPGQAPVLVI

YQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYS VQFGGGTKLTVL

88 / 95 81 scFv CD16A (CD16-5)QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFSSYYMHWVRQAPGQGLEW

MGAIEPRGVRISYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY YCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSSYV LTQPSSVSVAPGQTARITCGGHNIGSTNVHWYQQKPGQAPVLVIYQD SKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVQF

GGGTKLTVLAAAGSHHHHHH 82 Fab VH CD16A (CD16- QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFSSYYMHWVRQAPGQGLEW 5) MGAIEPRGVRISYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 83 Fab VL CD16A (CD16- SYVLTQPSSVSVAPGQTARITCGGHNIGSTNVHWYQQKPGQAPVLVI 5) YQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYS

VQFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSH

RSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 84 CDR-H1 CD16A (CD16- GYTFTNYY 6) 85 CDR-H2 CD16A (CD16- INPSGGVT 6) 86 CDR-H3 CD16A (CD16- ARGSAYYYDFADY 6) 87 CDR-L1 CD16A (CD16- NIGSKS 6) 88 CDR-L2 CD16A (CD16- QDK 6) 89 CDR-L3 CD16A (CD16- QVWDDYIVL 6) 90 VH CD16A (CD16-6) QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTNYYMQWVRQAPGQGLEW

MGIINPSGGVTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

YCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS 91 VL CD16A (CD16-6) SYVLTQPSSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVI

YQDKKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDDYI

VLFGGGTKLTVL 92 scFv CD16A (CD16-6) QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTNYYMQWVRQAPGQGLEW

MGIINPSGGVTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY YCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSSYV LTQPSSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVIYQD KKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDDYIVLF

GGGTKLTVLAAAGSHHHHHH 93 Fab VH CD16A (CD16- QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTNYYMQWVRQAPGQGLEW 6) MGIINPSGGVTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 94 Fab VL CD16A (CD16- SYVLTQPSSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVI 6) YQDKKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDDYI

RSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 95 CDR-H1 CD16A (CD16- GYTFTNYY 7) 96 CDR-H2 CD16A (CD16- IEPDGGRR 7) 97 CDR-H3 CD16A (CD16- ARGSAYYYDFADY 7) 98 CDR-L1 CD16A (CD16- QGVSGD 7) 99 CDR-L2 CD16A (CD16- QAN 7) 100 CDR-L3 CD16A (CD16- QQWDNYSVT 7)

89 / 95 101 VH CD16A (CD16-7) QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEW

MGVIEPDGGRRTYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

YCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS 102 VL CD16A (CD16-7) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRGHQGVSGDVHWYQQKPGQAPRLL

IYQANKRASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWDNY

SVTFGQGTKVEIK 103 scFv CD16A (CD16-7) QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEW

MGVIEPDGGRRTYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY YCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSEIV LTQSPATLSLSPGERATLSCRGHQGVSGDVHWYQQKPGQAPRLLIYQ ANKRASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWDNYSVT

FGQGTKVEIKAAAGSHHHHHH 104 Fab VH CD16A (CD16- QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEW 7) MGVIEPDGGRRTYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY

VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 105 Fab VL CD16A (CD16- EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRGHQGVSGDVHWYQQKPGQAPRLL 7) IYQANKRASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWDNY

SVTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 106 CDR-H1 BCMA GFTFSNYD (BCMA-1) 107 CDR-H2 BCMA ISTRGDIT (BCMA-1) 108 CDR-H3 BCMA ARQDYYTDYMGFAY (BCMA-1) 109 CDR-L1 BCMA EDIYNG (BCMA-1) 110 CDR-L2 BCMA GAS (BCMA-1) 111 CDR-L3 BCMA AGPHKYPLT (BCMA-1) 112 VH BCMA (BCMA-1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMAWVRQAPGKGLEW

VSSISTRGDITSYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY

YCARQDYYTDYMGFAYWGQGTLVTVSS 113 VL BCMA (BCMA-1) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYNGLAWYQQKPGKAPKLL

IYGASSLQDGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDEATYYCAGPHKY

PLTFGGGTKVEIK 114 scFv BCMA (BCMA-1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMAWVRQAPGKGLEW

VSSISTRGDITSYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCARQDYYTDYMGFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYNGLAWYQQKPGKAPKLLIYGAS SLQDGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDEATYYCAGPHKYPLTFG

GGTKVEIKAAAGSHHHHHH 115 Fab VH BCMA (BCMA- EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMAWVRQAPGKGLEW 1) VSSISTRGDITSYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY

YCARQDYYTDYMGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS

VVVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 116 Fab VL BCMA (BCMA- AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYNGLAWYQQKPGKAPKLL 1) IYGASSLQDGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDEATYYCAGPHKY

PLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 117 CDR-H1 BCMA GFTFSNFD (BCMA-2) 118 CDR-H2 BCMA ITTGGGDT (BCMA-2) 119 CDR-H3 BCMA VRHGYYDGYHLFDYWG (BCMA-2)

90 / 95 120 CDR-L1 BCMA QGISNN (BCMA-2) 121 CDR-L2 BCMA YTS (BCMA-2) 122 CDR-L3 BCMA QQFTSLPYT (BCMA-2) 123 VH BCMA (BCMA-2) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFDMAWVRQAPGKGLVW

VSSITTGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTAVY

YCVRHGYYDGYHLFDYWGQGTLVTVSS 124 VL BCMA (BCMA-2) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRANQGISNNLNWYQQKPGKAPKPL

IYYTSNLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQFTSL

PYTFGQGTKLEIK 125 scFv BCMA (BCMA-2) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFDMAWVRQAPGKGLVW

VSSITTGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTAVY YCVRHGYYDGYHLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCRANQGISNNLNWYQQKPGKAPKPLIYYTS NLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQFTSLPYTFG

QGTKLEIKAAAGSHHHHHH 126 Fab VH BCMA (BCMA- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFDMAWVRQAPGKGLVW 2) VSSITTGGGDTYYADSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTAVY

YCVRHGYYDGYHLFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS

VVVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 127 Fab VL BCMA (BCMA- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRANQGISNNLNWYQQKPGKAPKPL 2) IYYTSNLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQFTSL

PYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 128 CDR-H1 EGFR (EGFR- GSVSSGSYY 1) 129 CDR-H2 EGFR (EGFR- IYYSGST 1) 130 CDR-H3 EGFR (EGFR- ARNPISIPAFDI 1) 131 CDR-L1 EGFR (EGFR- NIGSKS 1) 132 CDR-L2 EGFR (EGFR- YDS 1) 133 CDR-L3 EGFR (EGFR- QVWDTSSDHVL 1) 134 VH EGFR (EGFR-1) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGL

EWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAV

YYCARNPISIPAFDIWGQGTMVTVSS 135 VL EGFR (EGFR-1) QPVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVI

YYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSS

DHVLFGGGTKLTVL 136 scFv EGFR (EGFR-1) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGL

EWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAV YYCARNPISIPAFDIWGQGTMVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSQPV LTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYD SDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSSDHV

LFGGGTKLTVLAAAGSHHHHHH 137 Fab VH EGFR (EGFR- QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGL 1) EWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAV

YYCARNPISIPAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV

VVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 138 Fab VL EGFR (EGFR-1) QPVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVI

YYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSS DHVLFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDF YPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWK SHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

91 / 95 139 Complexo de MH CDR- GYMFSTFW H1 (MHC-1) 140 Complexo CDR-H2 IYPGDSNT MHC (MHC-1) 141 Complexo CDR-H3 AKIRDGYSYDAFDL MHC (MHC-1) 142 Complexo de MH CDR- SSDVGGYNY L1 (MHC-1) 143 Complexo de MH CDR- DVS L2 (MHC-1) 144 Complexo de MH CDR- SSYTSSSTLAYV L3 (MHC-1) 145 Complexo VH MHC QVQLVQSGAEAKKPGESLRISCRASGYMFSTFWIGWVRQMPGKGLEW (MHC-1) VASIYPGDSNTIYSPSFQGQVTISADKSINTTYLQWSGLKASDTATY

YCAKIRDGYSYDAFDLWGQGTMVTVSS 146 Complexo VL MHC QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPK (MHC-1) LMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYT

SSSTLAYVFGTGTKLTVL 147 Complexo de MH scFv QVQLVQSGAEAKKPGESLRISCRASGYMFSTFWIGWVRQMPGKGLEW (MHC-1) VASIYPGDSNTIYSPSFQGQVTISADKSINTTYLQWSGLKASDTATY

YCAKIRDGYSYDAFDLWGQGTMVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSQS ALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLM IYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSS

STLAYVFGTGTKLTVLAAAGSHHHHHH 148 Complexo de MH Fab QVQLVQSGAEAKKPGESLRISCRASGYMFSTFWIGWVRQMPGKGLEW VH (MHC-1) VASIYPGDSNTIYSPSFQGQVTISADKSINTTYLQWSGLKASDTATY

YCAKIRDGYSYDAFDLWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS

VVVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 149 Complexo de MH Fab QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPK VL (MHC-1) LMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYT

SSSTLAYVFGTGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCL ISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTP

EQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 150 Complexo de MH CDR- GFTFSSYA H1 (MHC-2) 151 Complexo CDR-H2 ISYDGSNK MHC (MHC-2) 152 Complexo CDR-H3 ARDGGYYHYGLDV MHC (MHC-2) 153 Complexo de MH CDR- KLGDKY L1 (MHC-2) 154 Complexo de MH CDR- QDA L2 (MHC-2) 155 Complexo CDR-L3 QAWDSSTGV MHC (MHC-2) 156 Complexo VH MHC EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEW (MHC-2) VAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRTEDTAVY

YCARDGGYYHYGLDVWGQGTTVTVSS 157 Complexo VL MHC SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQRKPGQSPVLLI (MHC-2) YQDAKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSST

GVFGGGTKLTVL 158 Complexo de MH scFv EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEW (MHC-2) VAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRTEDTAVY

YCARDGGYYHYGLDVWGQGTTVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSSYE LTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQRKPGQSPVLLIYQD AKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTGVF

GGGTKLTVLAAAGSHHHHHH 159 Complexo Fab VH MHC EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEW (MHC-2) VAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRTEDTAVY

YCARDGGYYHYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV

92 / 95

VVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 160 Complexo de MH Fab SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQRKPGQSPVLLI VL (MHC-2) YQDAKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSST

GVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSH

RSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 161 TandAb_680 (EGFR- QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGL A1_T) EWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAV

YYCARNPISIPAFDIWGQGTMVTVSSGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSV APGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL GGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAP GQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS EDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSQPVLTQ PPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSDR PSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSSDHVLFG

GGTKLTVLAAAGSHHHHHH 162 cadeia polipeptídica 1 de QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW scFv-IgAb (EGFR- MGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVY A1_I): YCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG

TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP EFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSQVQLQESGPGL VKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNPISIP AFDIWGQGTMVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSQPVLTQPPSVSVAP GKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERF

SGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTSSDHVLFGGGTKLTVL 163 cadeia polipeptídica 2 de SYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVI scFv-IgAb (EGFR- YQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYS A1_I): VLFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP

GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSH

RSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 164 TandAb (BCMA-A1_T) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMAWVRQAPGKGLEW

VSSISTRGDITSYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCARQDYYTDYMGFAYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSSYVLTQPS SVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTK LTVLGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQA PGQGLEWMGAIEPMYGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSAI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYNGLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQDGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDEATYYCAGPHKYPL

TFGGGTKVEIK 165 cadeia polipeptídica 1 de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMAWVRQAPGKGLEW scFv-IgAb (BCMA- VSSISTRGDITSYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY A1_I): YCARQDYYTDYMGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG

GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQ RPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEAD

93 / 95

YYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSQVQL VQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGAI EPMYGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR

GSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS 166 Cadeia polipeptídica 2 de AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYNGLAWYQQKPGKAPKLL scFv-IgAb (BCMA- IYGASSLQDGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDEATYYCAGPHKY A1_I): PLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP

REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 167 Cadeia polipeptídica 1 de DKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVS KiH-scDb-Fc (BCMA- HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL A1_K): NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN

QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGG SSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLV IYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNY SVLFGGGTKLTVLGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYT FTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGAIEPMYGSTSYAQKFQGRVTMTRDTS TSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGG SGGSGGSGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKN VHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQ AMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLGGSGGSQVQLVQSGAEVKK PGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGAIEPMYGSTSY AQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFA

DYWGQGTLVTVSSAAAGSHHHHHH 168 Cadeia polipeptídica 2 de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMAWVRQAPGKGLEW KiH-scDb-Fc (BCMA- VSSISTRGDITSYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY A1_K): YCARQDYYTDYMGFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAIQMT

QSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYNGLAWYQQKPGKAPKLLIYGAS SLQDGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDEATYYCAGPHKYPLTFG GGTKVEIKDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 169 Db-Fc (CD16-2-BCMA- SYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVI 1) YQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYS

VLFGGGTKLTVLGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTF TSYYMHWVRQAPGQGLEWMGAIEPMYGSTSYAQKFQGRVTMTRDTST STVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGG GGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMAWVRQ APGKGLEWVSSISTRGDITSYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCARQDYYTDYMGFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSAIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYNGLAWYQQKPGKAP KLLIYGASSLQDGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDEATYYCAGP HKYPLTFGGGTKVEIK

94 / 95 170 scDb-mFc (CD16-2- EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMAWVRQAPGKGLEW BCMA-1) VSSISTRGDITSYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY

YCARQDYYTDYMGFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYNGLAWYQQKPGKAPKLLIYGAS SLQDGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDEATYYCAGPHKYPLTFG GGTKVEIKGGGGSGGGGSAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTKPP SRDELTKNQVSLSCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTVPVLDS DGSFRLASYLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGG GGSGGGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRP GQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYY CQVWDNYSVLFGGGTKLTVLGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVS CKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGAIEPMYGSTSYAQKFQGRV TMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTL VTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGG HNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTAT LTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLGGSGGSQVQLVQ SGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGAIEP MYGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGS

AYYYDFADYWGQGTLVTVSS 171 Bi-scFv-Fc (CD16-1- SYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVI EGFR-1) YQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYS

VLFGGGTKLTVLGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKP GESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYA QKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFAD YWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSV SSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNPISIPAFDIWGQGTMVTVSSGGS GGSGGSGGSGGSGGSQPVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSV HWYQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEA

GDEADYYCQVWDTSSDHVLFGGGTKLTVL 172 Sequência C-terminal de SFFPPGYQ CD16A 173 scFv-IgAb_73 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYTISWVRQAPGQGLEW Cadeia polipeptídica 1: MGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVY

YCARGGSSGWWWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRVSENIYSYLAWYQQKQGK SPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQ HHYGTPWTFGGGTKLEIKGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSEVQLQESG PGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITYS GSTSYNPSLESRISITRDTSTNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARGGYY

GSSWGVFAYWGQGTLVTVSA 174 scFv-IgAb_73 QSVLTQPPSASGTPGQRVIISCSGSHSNIGSNNVNWYQQLPGTAPKL Cadeia polipeptídica 2: LIYNNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDESDYFCGTWDD

SLNGPVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS DFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ

WKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 175 scFv-IgAb_75 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYTISWVRQAPGQGLEW Cadeia polipeptídica 1: MGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVY

YCARGGSSGWWWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL

95 / 95

GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPG KAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYC AAWDDSLNGPVFGGGTKLTVLGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSQVQLV ESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIR YDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKD

RGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS 176 scFv-IgAb_75 QSVLTQPPSASGTPGQRVIISCSGSHSNIGSNNVNWYQQLPGTAPKL Cadeia polipeptídica 2: LIYNNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDESDYFCGTWDD

WKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 177 scFv-IgAb_80 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYTISWVRQAPGQGLEW Cadeia polipeptídica 1: MGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVY

YCARGGSSGWWWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQS PVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQV WDNYSVLFGGGTKLTVLGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSQVQLVQSGA EVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGAIEPMYG STSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYY

YDFADYWGQGTLVTVSS 178 scFv-IgAb_80 QSVLTQPPSASGTPGQRVIISCSGSHSNIGSNNVNWYQQLPGTAPKL Cadeia polipeptídica 2: LIYNNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDESDYFCGTWDD

SLNGPVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS DFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ WKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Células NK humanas isoladas em um estado criopreservado, caracterizadas pelo fato de que são pré-carregadas antes do congelamento com uma construção de anticorpo, a construção de anticorpo compreendendo pelo menos um primeiro domínio de ligação que se liga a um antígeno receptor de células NK na superfície celular de uma célula efetora imunológica e um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno de superfície celular na superfície celular de uma célula-alvo.

2. Células NK humanas isoladas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que o primeiro domínio de ligação da construção de anticorpo que se liga a um antígeno receptor de células NK permite a manutenção da ligação na superfície celular durante e após a célula estar no estado criopreservado.

3. Células NK humanas isoladas de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadas pelo fato de que as células NK são isoladas a partir de um cordão umbilical ou tecido da placenta, iPSC ou PBMC de doadores saudáveis.

4. Células NK humanas isoladas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadas pelo fato de que as células NK foram conservadas em solução criogênica.

5. Células NK humanas isoladas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadas pelo fato de que as células NK foram pré-carregadas em uma solução que compreende a construção de anticorpo em uma concentração de pelo menos 5nM.

6. Células NK humanas isoladas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas pelo fato de que o antígeno receptor de célula NK ao qual o primeiro domínio de ligação da construção de anticorpo se liga é selecionado do grupo que consiste em CD16a, CD16b, NKp46, NKG2D e CD16a + CD16b.

7. Células NK humanas isoladas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizadas pelo fato de que o antígeno da superfície celular na superfície celular de uma célula alvo à qual o segundo domínio de ligação da construção de anticorpo se liga é selecionado a partir do grupo que consiste em CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD123, CLL1, BCMA, FCRH5, EGFR, EGFRvIII, HER2 e GD2.

8. Células NK humanas isoladas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizadas pelo fato de que a construção de anticorpo compreende um primeiro domínio de ligação que se liga a CD16a e um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno selecionado do grupo que consiste em CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD123, CLL1, BCMA, FCRH5, EGFR, EGFRvIII HER2 e GD2.

9. Células NK humanas isoladas de acordo com a reivindicação 8, caracterizadas pelo fato de que a construção de anticorpo compreende no primeiro domínio de ligação três CDRs de cadeia pesada e três CDRs de cadeia leve selecionados do grupo que consiste em: (a) um CDR-H1 conforme representado na SEQ ID NO: 29, um CDR-H2 conforme representado na SEQ ID NO: 30, um CDR-H3 conforme representado na SEQ ID NO: 31, um CDR-L1 conforme representado na SEQ ID NO: 32, um CDR-L2 conforme representado na SEQ ID NO: 33, um CDR-L3 conforme representado na SEQ ID NO: 34; (b) um CDR-H1 conforme representado na SEQ ID NO: 40, um CDR-H2 conforme representado na SEQ ID NO: 41, um CDR-H3 conforme representado na SEQ ID NO: 42, um CDR-L1 conforme representado na SEQ ID NO: 43, um CDR-L2 conforme representado na SEQ ID NO: 44, um CDR-L3 conforme representado na SEQ ID NO: 45; (c) um CDR-H1 conforme representado na SEQ ID NO: 51,

um CDR-H2 conforme representado na SEQ ID NO: 52, um CDR-H3 conforme representado na SEQ ID NO: 53, um CDR-L1 conforme representado na SEQ ID NO: 54, um CDR-L2 conforme representado na SEQ ID NO: 55, um CDR-L3 conforme representado na SEQ ID NO: 56; (d) um CDR-H1 conforme representado na SEQ ID NO: 62, um CDR-H2 conforme representado na SEQ ID NO: 63, um CDR-H3 conforme representado na SEQ ID NO: 64, um CDR-L1 conforme representado na SEQ ID NO: 65, um CDR-L2 conforme representado na SEQ ID NO: 66, um CDR-L3 conforme representado na SEQ ID NO: 67; (e) um CDR-H1 conforme representado na SEQ ID NO: 73, um CDR-H2 conforme representado na SEQ ID NO: 74, um CDR-H3 conforme representado na SEQ ID NO: 75, um CDR-L1 conforme representado na SEQ ID NO: 76, um CDR-L2 conforme representado na SEQ ID NO: 77, um CDR-L3 conforme representado na SEQ ID NO: 78; (f) um CDR-H1 conforme representado na SEQ ID NO: 84, um CDR-H2 conforme representado na SEQ ID NO: 85, um CDR-H3 conforme representado na SEQ ID NO: 86, um CDR-L1 conforme representado na SEQ ID NO: 87, um CDR-L2 conforme representado na SEQ ID NO: 88, um CDR-L3 conforme representado na SEQ ID NO: 89; (g) um CDR-H1 conforme representado na SEQ ID NO: 95, um CDR-H2 conforme representado na SEQ ID NO: 96, um CDR-H3 conforme representado na SEQ ID NO: 97, um CDR-L1 conforme representado na SEQ ID NO: 98, um CDR-L2 conforme representado na SEQ ID NO: 99, um CDR-L3 conforme representado na SEQ ID NO: 100;

10. Células NK humanas isoladas de acordo com a reivindicação 9, caracterizadas pelo fato de que a construção de anticorpo compreende no primeiro domínio de ligação pares de cadeias VH e VL tendo uma sequência conforme representado nos pares de sequências selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90 e SEQ ID NO: 91 e SEQ ID NO: 101 e SEQ ID NO: 102.

11. Células NK humanas isoladas de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizadas pelo fato de que a construção de anticorpo compreende no segundo domínio de ligação três CDRs de cadeia pesada e três CDRs de cadeia leve selecionados do grupo que consiste em: (a) um CDR-H1 conforme representado na SEQ ID NO: 106, um CDR-H2 conforme representado na SEQ ID NO: 107, um CDR-H3 conforme representado na SEQ ID NO: 108, um CDR-L1 conforme representado na SEQ ID NO: 109, um CDR-L2 conforme representado na SEQ ID NO: 110, um CDR-L3 conforme representado na SEQ ID NO: 111; (b) um CDR-H1 conforme representado na SEQ ID NO: 128, um CDR-H2 conforme representado na SEQ ID NO: 129, um CDR-H3 conforme representado na SEQ ID NO: 130, um CDR-L1 conforme representado na SEQ ID NO: 131, um CDR-L2 conforme representado na SEQ ID NO: 132, um CDR-L3 conforme representado na SEQ ID NO: 133; e (c) um CDR-H1 conforme representado na SEQ ID NO: 117, um CDR-H2 conforme representado na SEQ ID NO: 118, um CDR-H3 conforme representado na SEQ ID NO: 119, um CDR-L1 conforme representado na SEQ ID NO: 120, um CDR-L2 conforme representado na SEQ ID NO: 121, um CDR-L3 conforme representado na SEQ ID NO: 122.

12. Células NK humanas isoladas de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizadas pelo fato de que a construção de anticorpo compreende no segundo domínio de ligação pares de cadeias VH e VL tendo uma sequência conforme representado nos pares de sequências selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 112 e SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 123 e SEQ ID NO: 124 e SEQ ID NO: 134 e SEQID NO: 135.

13. Células NK humanas isoladas de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizadas pelo fato de que a construção de anticorpo compreende uma sequência de proteínas conforme representado nas SEQ ID NOs: 161-171.

14. Método para preparação de células NK humanas pré- carregadas criopreservadas, o método caracterizado pelo fato de que compreende (i) incubar células NK com uma construção de anticorpo, a construção de anticorpo compreendendo pelo menos um primeiro domínio de ligação que se liga a um antígeno receptor de células NK na superfície celular de uma célula efetora imunológica e um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno de superfície celular na superfície celular de uma célula alvo; e (ii) congelar as células NK.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as células NK são isoladas a partir do tecido do cordão umbilical, iPSC ou PBMC de doadores saudáveis.

16. Método de acordo com a reivindicação 14 e 15, caracterizado pelo fato de que as células NK foram pré-carregadas em uma solução compreendendo a construção de anticorpo em uma concentração de pelo menos 5 nM.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que o antígeno receptor de células NK ao qual o primeiro domínio de ligação da construção de anticorpo se liga é selecionado do grupo que consiste em CD16a, CD16b, NKp46, NKG2D e CD16a + CD16b.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que o antígeno de superfície celular na superfície celular de uma célula alvo para a qual o segundo domínio de ligação da construção de anticorpo se liga é selecionado a partir do grupo que consiste em CD19, CD22, CD30, CD33, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD123, CLL1, BCMA, FCRH5, EGFR, HER2, GD2.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizado pelo fato de que a etapa de congelamento das células NK é realizada usando um meio de congelamento que contém pelo menos um meio de cultura de células basais e agente crioprotetor.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 19, caracterizado pelo fato de que a construção de anticorpo compreende uma sequência de proteínas conforme representado nas SEQ. ID NOs: 161-

171.

21. Método para reconstituir/preparar células NK humanas pré-carregadas viáveis a partir de células NK humanas em um estado criopreservado como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou preparadas por um método como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 20 para a administração das ditas células a um indivíduo em necessidade das mesmas, o método caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de reconstituir/preparar as células para administração a um paciente por descongelamento.

22. Composição farmacêutica para administração venosa, caracterizada pelo fato de que compreende células NK humanas que foram reconstituídas a partir de células NK humanas em um estado criopreservado como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou preparado por um método como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 20 e um ou mais excipientes.

23. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de ser para uso na prevenção, tratamento ou melhora de uma doença selecionada de uma doença proliferativa, uma doença tumoral ou um distúrbio imunológico.

24. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação

23, caracterizada pelo fato de que a dita doença tumoral é uma doença maligna, preferivelmente câncer.

25. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a dita doença maligna é selecionada do grupo que consiste em linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, leucemia, mieloma múltiplo e tumores sólidos.

26. Método para tratamento ou melhoria de uma doença, o método caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administração a um indivíduo em necessidade da mesma de células NK humanas pré- carregadas que foram reconstituídas a partir de células NK humanas em um estado criopreservado como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou preparado por um método como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 20.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as células NK humanas pré-carregadas são administradas a um paciente por via intravenosa.

28. Método de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que o indivíduo sofre de uma doença proliferativa, uma doença tumoral ou um distúrbio imunológico.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a dita doença tumoral é uma doença maligna, preferivelmente câncer.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a dita doença maligna é selecionada do grupo que consiste em linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, leucemia, mieloma múltiplo e tumores sólidos.