JP2019511200A - ヒトインターロイキン−2に対する免疫刺激性ヒト化モノクローナル抗体及びその融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
表1は、本発明の実施形態に記載の抗IL−2抗体の概要である。
表2は、本発明の実施形態に記載のIL−2ムテインの概要である。
表3は、プロロイキン(登録商標)/NARA1−Fab複合体の構造統計を表す。
表4は、本発明の実施形態に記載のエピトープ及びパラトープの概要である。
表5は、本発明の実施形態に記載の可変重領域の概要である。
表6は、本発明の実施形態に記載の可変軽領域の概要である。
表7は、いくつかの実施形態に記載の抗体のpIデータを含む。
表8は、可変領域及び可変生殖系列領域の比較を含む。
表9は、本発明の実施形態に記載の構造改良された可変領域を含む。
表10は、本発明の実施形態に記載の可変軽鎖及び可変重鎖に関する情報を含む。
表11は、本発明の実施形態に記載の軽鎖CDRを含む。
表12は、本発明の実施形態に記載の重鎖CDRを含む。
表13は、本発明の実施形態に記載の最適化された可変軽鎖及び可変重鎖を含む。
表14は、VH変異配列の概要である。
表15は、VK変異配列の概要である。
表16は、プラスミド配列の概要である。
表17は、本発明の実施形態に記載の親和性成熟抗体の概要である。
表18は、第1セットの抗体の配列概要である
表19は、実施例に記載のELISA値の概要である。
表20は、実施例に記載のEC50値の概要である。
表21は、本発明の実施形態に記載の親和性成熟抗体のサブセットである。
表22は、表21に記載の抗体のサブセットの配列概要である。
表23は、結合親和性データを示す。
表24は、CD8+T細胞増殖データを示す。
表25は、CD8+T及びNK細胞増殖データを示す。
表26及び表27は、細胞数データを示す。
表28は、本発明の実施形態に記載のリンカー配列の概要である。
表29は、本発明の実施形態に記載の融合タンパク質の概要である。
表30は、CD8+T及びNK細胞増殖データを表す。
表31は、CD8+T、NK及びTreg細胞数データを表す。
表32及び表33は、細胞数データを示す。
表34は、細胞数データの比を示す。
表35及び表36は、融合タンパク質の軽鎖配列を示す。
表37は、融合タンパク質の概要である。
表38は、細胞数データを示す。
表39及び表40は、実施例に記載のEC50値を示す。
表41は、本発明の実施に有用な配列を含む配列表である。
本開示は、ヒトIL−2に結合し、このサイトカインのインビボ機能に影響を及ぼす抗体及びその断片に関する。
抗IL−2抗体
他の抗体発現系も当該分野で公知である。
IL−2変異体
本開示の医薬組成物は、併用療法で、すなわち他の薬剤と併用療法で投与することもできる。例えば、併用療法は、少なくとも1つの他の抗炎症剤又は別の化学療法剤と組み合わせた本開示に記載のIL−2抗体又はその断片を含み得る。併用療法で使用することができる治療薬の例は、以下の併用療法の項で詳述される。
本発明の抗体は、IL−2依存性病態生理を伴う障害の診断及び治療を含む多くのインビトロ及びインビボの診断的及び治療的有用性を有する。例えば、これらの分子は、IL−2依存性病態生理を伴う様々な障害を治療、予防及び診断するために、培養液中の、インビトロ又はエクスビボの、又は例えばインビボなどのヒト被験体の細胞に投与することができる。
特定の実施形態では、神経芽細胞腫は、ALK転位又は転座、例えばALK融合、例えばEML4−ALK融合を有する、あるいは有するとして同定される。
本明細書に開示される方法及び組成物は、前述の癌に関連する転移性病変を治療するために有用である。
本開示の抗体又はその抗原結合部分は、単独の活性成分として、又は例えばアジュバントとして併用して、又は例えば、上述の疾患の治療又は予防のための免疫調節剤又は細胞傷害性又は抗癌剤などの他の薬物と組み合わせて、投与することができる。
一実施形態では、組み合わせはSTINGアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、組み合わせは、例えば、本明細書に記載の癌、例えば、固形腫瘍(例えば、乳癌、扁平上皮癌、メラノーマ、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、軟部組織肉腫、メラノーマ、乳癌、食道癌、頭頸部癌、子宮内膜癌 、子宮頸癌、又は基底細胞癌)、例えば血液悪性腫瘍(例えば白血病(例えば慢性リンパ性白血病(CLL)又はリンパ腫(境界域B細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫など)))などの癌を治療するために使用される。
一実施形態では、組み合わせは、抗PD−1又は抗PD−1リガンド(PD−L1)抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせは、例えば固形腫瘍(例えば乳癌、扁平上皮癌、メラノーマ、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、軟部組織肉腫、メラノーマ、乳癌、食道癌、頭頸部癌、子宮内膜癌 、子宮頸癌、又は基底細胞癌)、例えば血液悪性腫瘍(例えば白血病(例えば慢性リンパ性白血病(CLL)又はリンパ腫(境界域B細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫など)))など、例えば本明細書に記載の癌を治療するために使用される。
(a)それぞれ米国特許出願公開第2015/0210769号の表1に開示される、配列番号4のVHCDR1アミノ酸配列、配列番号5のVHCDR2アミノ酸配列、及び配列番号3のVHCDR3を含む重鎖可変領域(VH);及び配列番号13のVLCDR1アミノ酸配列、配列番号14のVLCDR2アミノ酸配列、及び配列番号33のVLCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL);
一実施形態では、PD−1の阻害剤は、例えば、米国特許第8354509号及びPCT国際公開WO2009/114335に開示されたペムブロリズマブであり、本明細書に開示された配列を有する(又はそれと実質的に同一又は類似の配列、例えば少なくとも指定された配列と85%、90%、95%同一又はそれ以上の同一性の配列)。
一実施形態では、この組み合わせは、TIM−3阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、この組み合わせは、例えば本明細書に記載の癌、例えば固形腫瘍(例えば乳癌、扁平上皮細胞癌、メラノーマ、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、子宮体癌、子宮頸癌、又は基底細胞癌)、例えば血液悪性腫瘍(例えば白血病(例えば慢性リンパ球性白血病(CLL)、又はリンパ腫(例えば、辺縁帯B細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫))などの癌を治療するために使用される。
特定の実施形態では、抗TIM−3抗体分子は、軽鎖CDRにおける置換、例えば、軽鎖のCDR1、CDR2及び/又はCDR3における1つ又は複数の置換を含む。
(a)米国特許出願公開第2015/0218274号の表1〜4にそれぞれ開示される、配列番号9から選択されるVHCDR1アミノ酸配列;配列番号10のVHCDR2アミノ酸配列;及び配列番号5のVHCDR3アミノ酸配列;を含む重鎖可変領域(VH)、かつ、配列番号12のVLCDR1アミノ酸配列、配列番号13のVLCDR2アミノ酸配列、配列番号14のVLCDR3アミノ酸配列からなる軽鎖可変領域(VL);
(i)米国特許出願公開第2015/0259420号の表1にそれぞれ開示される、配列番号1、配列番号4又は配列番号286から選択されるVHCDR1アミノ酸配列;配列番号2のVHCDR2アミノ酸配列;及び配列番号3のVHCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);、かつ、
(i)米国特許出願公開第2015/0259420号の表1にそれぞれ開示される、配列番号1、配列番号4又は配列番号286から選択されるVHCDR1アミノ酸配列;配列番号5のVHCDR2アミノ酸配列、及び配列番号3のVHCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH);かつ、
(ii)米国特許出願公開第2015/0259420号の表1にそれぞれ開示される、配列番号13のVLCDR1アミノ酸配列、配列番号14のVLCDR2アミノ酸配列、配列番号15のVLCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含む。
一実施形態では、組み合わせは、CTLA−4阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、この組み合わせは、癌、例えば本明細書に記載の癌、例えば固形腫瘍(例えば、乳癌、扁平上皮癌、メラノーマ、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、軟部組織肉腫、メラノーマ、乳癌、食道癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、又は基底細胞癌)、例えば血液悪性腫瘍(例えば白血病(例えば慢性リンパ球性白血病(CLL)、又はリンパ腫(例えば、辺縁帯B細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫)))を治療するために使用される。
一実施形態では、組み合わせは、アゴニスト又はアンタゴニストなどのGITRモジュレーターを含む。一実施形態では、GITRモジュレーターはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、組み合わせは、癌、例えば、本明細書に記載の癌、例えば、固形腫瘍(例えば乳癌、扁平上皮癌、メラノーマ、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、軟部組織肉腫、メラノーマ、乳癌、食道癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、又は基底細胞癌)、例えば血液悪性腫瘍(例えば白血病(例えば慢性リンパ球性白血病(CLL)、又はリンパ腫(例えば、辺縁帯B細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫)))を治療するために使用される。
実施例1:マウス抗ヒトIL−2抗体NARA1の作製とスクリーニング
参照抗体、指定されたNARA1を、当業者に周知の方法に従って、誘導し、単離し、構造的に特徴付けした。
(1)材料と方法
プロロイキン(登録商標)(アルデスロイキン)として当業者に一般的に知られ、抗体NARA1のFab断片に結合する、ヒトインターロイキン2変異体(配列番号110)の複雑な構造を決定した。得られたプロロイキン(登録商標)上の残基の番号付けは、wtIL−2の番号付けに従って与えられる。
タンパク質溶液をリザーバ緩衝液と1:1で混合して、0.4μlの総容量とした。実験をPhoenixロボティックシステム(Art Robbins Instruments)を用いて設定し、19oCでRockImagerホテル(Formulatrix)に保存され、自動的に画像化した。20%w/vポリエチレングリコール3350及び0.2M硝酸ナトリウムの条件下で、スクリーニングの4日後に結晶を回収した。結晶を、10%グリセロールを含むリザーバ緩衝液で低温保護し、データ収集の前に液体窒素中でフラッシュ凍結した。回折データを、0.99998ÅのX線放射波長を使用するPilatus画素検出器を備えたビームラインPX−IIのSwiss Light Source(Villigen、スイス)で収集した。
プロロイキン(登録商標)/NARA1−Fab複合体は、単位格子寸法a=201.8Å、b=36.2Å、c=88.7Å、α=90°、β=102.9°、γ=90°を有する空間群C121において〜1.95Åで解析された。構造の詳細な統計情報については、表3を参照。各非対称単位には、一つの複合分子が存在する。
図1は、実施例1で得られたプロロイキン(登録商標)/Fab−NARA1複合体の三次元構造の概要を提供する。NARA1のFab断片の軽鎖をA、NARA1のFab断片の重鎖をBとして示し、NARA1−Fabによって認識されるエピトープ残基をD、プロロイキン(登録商標)をCと示し、変異C145Sを示す。
図2は、エピトープ残基のさらなる分析を提供する。X軸は、配列番号110に記載のアミノ酸配列と番号付けとを列挙する。Y軸の上側は、プロロイキン(登録商標)からの対応する残基から4Å以内にあるNARA1−Fabの総原子数を示し、Y軸の下側は、NARA1−Fabに結合した後の減少した溶媒接近可能領域(Å2)を示す。
図4は、IL−2/CD25/CD122/CD132四次複合体とのプロロイキン(登録商標)/NARA1−Fab複合体のオーバーレイを示す。四次複合体構造は、PDBに登録の「2B5I」から用い、淡いシアンの画像DはwthIL−2、赤色の画像BはCD122、青色の画像CはCD132、及び緑色の表面AはCD25を表す。プロロイキン(登録商標)/NARA1−Fab複合体構造において、wthIL−2でオーバーレイされたシアンの画像Dはプロロイキン(登録商標)を表し、マゼンタの画像Eは重鎖を表し、黄色の画像Fは軽鎖を示す。
ヒトCDR移植アクセプターフレームワークの結合特性を実質的に保持及び/又は向上させる、ヒトのアクセプターフレームワークの選択、逆変異、及び変異を含む抗ヒトIL−2マウス抗体NARA1のヒト化が記載される。
特定のアミノ酸配列モチーフは、グリコシル化(すなわちNxS/T、P以外の任意のx)、遊離システインの酸化、脱アミド化(例えばNG)又は異性化(例えばDG)のような翻訳後改変(PTM)を受けることが知られる。CDR領域に存在する場合、これらのモチーフは、産物の均一性を高めるために、部位特異的変異誘発によって理想的に除去される。
ホモサピエンスのコドン最適化を含み、ヒト化VL及びVHドメインをコードするDNA配列をGeneArt(Life Technologies Inc.Regensburg、Germany)で注文した。GeneArt由来ベクターから、哺乳類細胞における分泌に適した発現ベクターへカットアンドペーストすることにより、VL及びVHドメインをコードする配列をサブクローニングした。重鎖及び軽鎖を個々の発現ベクターにクローニングして、共トランスフェクション(co−transfection)を可能にした。発現ベクターの要素は、プロモーター(サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサープロモーター)、分泌を促進するシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、原核生物におけるエピソーム複製及び複製を可能にする要素(例えば、SV40起源及びColE1又は当技術分野で公知の他のもの)及び選択(アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー)を可能にする要素を含む。
SV40ラージT抗原(HEK293−T ATCC11268)を恒常的に発現するヒト胚性腎臓細胞は、ヒト化及び/又は最適化されたIgGタンパク質の一過性発現のための好ましい宿主細胞系の一つである。トランスフェクションは、トランスフェクション試薬としてPEI(ポリエチレンイミン、MW25.000 linear、Polysciences、USA Cat.No.23966)を用いて行う。PEIストック溶液は、900mlの細胞培養グレードの水に室温(RT)で1gのPEIを注意深く溶解することによって調製される。PEIの溶解を促進するために、溶液にHClをpH3〜5に添加することにより酸性化し、続いてNaOHで最終的に7.05のpHに中和する。最後に、容量を1Lに調整し、溶液を0.22μmフィルターで濾過し、分取し、さらに使用するまで−80℃で凍結する。解凍後、分取は、−20℃で3回まで再凍結を行うことができるが、−20℃で長期間保存してはいけない。HEK 293T細胞は、細胞のトランスフェクション及び増殖のためのノバルティス独自の無血清培地、及び生産/供給培地としてのExCell VPRO無血清培地(SAFC Biosciences,USA,Cat.No.24561C)を用いて培養する。一過性トランスフェクションのために調製された細胞は、懸濁培養において培養される。小規模(<5L)のトランスフェクションのために、細胞を、5%CO2の加湿インキュベーター内で、オービタルシェーカー(100〜120rpm)上でコーニングシェイクフラスコ(Corning、Tewksbury、MA)で増殖する(シードフラスコ)。種培養物中の細胞は指数増殖期(細胞密度は5x105と3x106/mLの間)に維持されなくてはならなく、かつ、トランスフェクションのため>90%の生存率を示されなければならない。この範囲外の細胞密度は、希釈後のラグ期又はトランスフェクション効率の低下のいずれかをもたらす。小規模(<5L)トランスフェクションのために、細胞の分取では、種培養液から取り出し、ノバルティス無血清培地で最終体積の36%中に1.4x106細胞/mLに調整する。DNA溶液(1Lトランスフェクションにおいて、溶液1:0.5mgの重鎖発現プラスミド及び0.5mgの軽鎖発現プラスミド)を、最終培養体積の7%中に1mg/L(最終体積)へDNAを希釈することによって調製し、続いて穏やかな混合する。細菌汚染を防ぐために、この溶液を0.22μmフィルター(例えば、Millipore Stericup)を用いて濾過する。その後、3mg/L(最終体積)のPEI溶液を、また最終培養体積の7%中で希釈し、穏やかに混合する(溶液2)。両方の溶液を室温(RT)で5〜10分間インキュベートする。その後、溶液2を穏やかに混合しながら溶液1に加え、室温でさらに5〜15分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を細胞に添加し、細胞の培養を4〜6時間続ける。最後に、総生産体積の残りの50%は、ExCell(登録商標)VPRO無血清培地を添加することによって達成される。トランスフェクション後11日間細胞培養を継続する。4℃で20分間、4500rpmの遠心分離(Heraeus(登録商標)、Multifuge 3S−R、Thermo Scientific、Rockford、IL)により培養物を回収する。回収された細胞上清を、ステリックアップフィルター(0.22μm)で滅菌濾過し、さらなる処理が行われるまで4℃で保存する。
実施例2の結晶構造NARA1/hIL−2の結果を用いて、ヒト化設計を改良した。
同一性は、実施例3の最初のヒト化配列と最も近い生殖系列との間で計算された。これとは別に、等電点(pI)を重鎖及び軽鎖について計算した。
結果を表7及び以下に示す.
実施例2の結晶構造NARA1/hIL−2の結果を使用して、CDRにおける特定のアミノ酸残基をさらなる構造最適化のために同定した。特に、LCDR1ではいわゆるDG部位が同定され、並びにHCDR3では別のDG部位が同定された。驚くべきことに、これらの部位におけるいくつかの変異はヒトIL−2に対する親和性を劇的に低下させるが、他の変異は親和性にほとんど又は全く影響を及ぼさない。
ヒト化NARA1(104348_VH5D98E_VK1D28Q)は、酵母表面上のFabとして親VH(配列番号49)及びVK(配列番号70)をクローニング及び発現することから始まる複数の段階に基づく、親和性成熟プロセスの出発点として用いられ、かつ、ビオチン化プロロイキン(登録商標)の最適かつ準最適な結合濃度決定に用いられた。
要するに、ELISAプレート(Maxisorp 96ウェルブラックマイクロタイタープレート)を4℃で100μL/ウェルのプロロイキン(登録商標)(5μg/ml PBS)で一晩被覆した。プレート洗浄器(BioTek)を使用して、ELISAプレートをTBST(1×TBS/0.05%Tween 20)で1回洗浄した。350μl/ウェルのブロッキング緩衝液(0.22μmで濾過したTBS/1Xカゼイン(Vector laboratories 10X solution#SP−5020))を添加することによってプレートをブロックし、穏やかに攪拌しながら室温で2時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去した後、プレート洗浄機を用いてプレートをTBSTで1回洗浄した。上清をブロッキング緩衝液中で1:2に希釈し、50μlをELISAプレートの指定のウェルに移した。各試料は3つのELISAプレート上に存在した。3つのプレートを穏やかに撹拌しながら室温でインキュベートした。2時間のインキュベーション後、100μl/ウェル検出抗体(TBST/ヤギポリクローナルHRP結合抗ヒトFab2;Dianova/Jackson ImmunResearch、カタログ番号109−036−006)を添加する前にプレートの1つをTBSTで3回洗浄した。検出抗体を添加する前に、他の2枚のプレートを毎時3回で4時間又は毎時3回で12時間、TBSTで洗浄した。緩やかに撹拌しながら室温で1時間インキュベートした後、ウェルを洗浄緩衝液で3回洗浄し、100μl/ウェルのBM ChemiLuminesence ELISA基質(POD)(Roche Diagnostics#11582950001)を添加する前に、プレートを、ペーパータオルを何枚も重ねた上で軽くたたいて乾燥させた。発光シグナルは、暗所で5分間インキュベートした後に測定した。35抗体のELISA値を表19に示す。すべてのELISA値は、2回の測定に基づく平均値である。
1.酵素免疫測定法(ELISA)
・anti−IL−2(NARA1)−mIgG2a:8.7mg/ml,150kDa,58.00μM
・anti−IL−2−hsIgG1 104340 (キメラNARA1抗体):4.25mg/ml,150kDa,28.33μM
・anti−IL−2−hsIgG1 104343:3.69mg/ml,150kDa,24.60μM
・anti−IL−2−hsIgG1 104347:4.03mg/ml,150kDa,26.87μM
・anti−IL−2−hsIgG1 104348:2.71mg/ml,150kDa,18.07μM
・anti−IL−2−hsIgG1 104349:3.29mg/ml,150kDa,21.93μM
抗原
・IL−2(プロロイキン(登録商標)):1.00mg/ml,15.33kDa,65.24μM
・IL−2(WT):0.15mg/ml,15.55kDa,9.65μM
検出抗体
・MSDスルホ標識ヤギ抗ヒト抗体、Meso Scale Discovery、カタログ番号R32AJ−5
・MSDスルホ標識ヤギ抗マウス抗体、Jackson IR、カタログ番号115−005−071
計測器とソフトウェア
・Discovery Workbenchソフトウェアによって制御されるMSD SECTOR Imager 6000
・XLfitによるデータ処理、MS Excelアドインソフトウェア
アッセイプレート
・SECTOR Imager 6000用標準384ウェルプレート、Meso Scale Discovery Cat#L21XA
・ポリプロピレン384ウェルプレート、Greiner Cat#781280
試薬
・ウシ血清アルブミン(BSA)、VWRカタログ番号422351S
・リン酸緩衝食塩水(PBS)10x、Teknova Cat#P0195
・MSDリードバッファT 4x、Meso Scale Discovery Cat#R92TC−1
・トリス緩衝食塩水(TBS)20x、Teknova Cat#T1680
・Tween−20, VWR Cat#437082Q
緩衝液
・ブロッキング緩衝液:1×PBS+5%(w/v)BSA
・コーティング緩衝液:1×PBS
・試料緩衝液:1xPBS+0.5%(w/v)BSA+0.02%(v/v)Tween−20
・洗浄緩衝液:1xTBS+0.05%(v/v)Tween−20
・リードバッファ:1xMSD リードバッファ
試料緩衝液で抗原の22系列2倍希釈液を調製した。一定濃度の抗体を添加した。
抗原及び抗体濃度を以下に示す。60μlの各抗原:抗体混合物の体積を、384ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレート(PP MTP)に二重に分配した。試料緩衝液は陰性対照として、及び陽性対照のような抗原を含まない試料(Bmax)として、用いた。プレートを密封し、室温(RT)で一晩(o/n)インキュベートした。384ウェル標準MSDアレイプレートを、2μg/mlのIL−2でo/nでコーティングした。洗浄緩衝液で3回洗浄した後、プレートを50μl/ウェルのブロッキング緩衝液でRTにて1時間ブロックした。洗浄後、30μl/ウェルの量の抗原:抗体混合物をPP MTPから被覆MSDプレートに移し、RTで20分間インキュベートした。さらなる洗浄ステップの後、30μlの試料緩衝液中の検出抗体(1:2000に希釈)を各ウェルに添加し、室温で30分間インキュベートした。MSDプレートを洗浄し、35μl/ウェルのリードバッファを添加し、5分間インキュベートした。ECLシグナルは、MSD SECTOR Imager 6000で測定した。
SETの結果を表23に示す。試験したすべての抗IL−2抗体は、低pM範囲(IL−2重量は示さず)でIL−2タンパク質と同様の親和性を示した。
PBMC由来CD8 T細胞増殖アッセイにおいて、ヒト化抗IL−2抗体の活性をNARA1と比較した。
バフィーコートからFicoll後に陰性の磁気分離によって単離したヒトCD8 T細胞を、5%ヒト血清を補充した完全RPMI培地に100000細胞/ウェルに播種した。抗IL−2抗体単独(0.5μg/ml)又はIL−2(プロロイキン(登録商標);0.1μg/ml)+抗IL−2抗体(0.5μg/ml)を2:1のモル比で用いて37℃で48時間刺激した。細胞は、最後の16時間、3 H−チミジンでパルスし、回収し、そしてβ−カウンターで増殖を測定した。実験は3回実施し、抗体単独のカウントは非刺激細胞のバックグラウンドシグナルレベルと同等であった。
CD8+T細胞、CD4+T細胞、及びNK細胞の数を、以下に記載するように、IL−2/抗IL−2mAb複合体を投与したWT C57BL/6マウスで測定した。並行して、ブロモデオキシウリジン(BrdU)を用いてCD8+T細胞及びNK細胞の増殖レベルを評価した。
次の抗体を用いた:104340(キメラNARA1抗体)、104343,104347,104348,104349,104341。
プロロイキン(登録商標)IL−2を使用した。
この実験は二重に行った;初回はヒト化104341を含まなかった。
マウスは、1.5μg(低用量;LD)又は20μg(高用量;HD)のhIL−2、又はhIL−2/モノクローナル抗体(それぞれ1.5μg及び15μgであり、1:1のモル比に相当する)の4回の連続注射を受けた。最後の注射の日、飲料水中に0.8mg/mlの5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdU)を24時間与えた。
翌日、マウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節(LN)をフローサイトメトリーによって分析した。これを行うために、標準の手順に従ってLN及び脾臓の単細胞懸濁液を調製し、2%ウシ胎児血清(FCS)、2mM EDTA及び蛍光色素結合抗体のPBSを用いてフローサイトメトリー分析のために2*106個の細胞を染色した(下記参照)。2つの異なる染色を行った:最初の染色は、CD4+CD25+フォークヘッドボックスP3(FoxP3)+T調節細胞を同定及び定量するために行った。この目的のために、FoxP3染色緩衝液を使用し、サプライヤーの推奨(eBiosciences、00−5523−00)に従って、次のマーカー:CD25、CD8a、CD4、CD3、FoxP3へる蛍光色素結合抗体を使用して、単一細胞懸濁液を染色した。
細胞数データの結果を表26及び表27に示す。
実施例2の結晶構造NARA1/hIL−2の結果を用いて、NARA1重鎖及び軽鎖N末端領域をhIL−2に連結する方法が特定されている。
複合体NARA1/hIL−2の構造は、IL−2のNARA1抗体の重鎖又は軽鎖への包埋を誘導するために使用されている。抗体のLCDR1及び残基K96とN97の間のhIL−2ヘリックスB及びヘリックスCを連結する領域は、さらなる工学のために使用される領域として見なすことができる。LCDR1は、Y27dとD28との間、及びG29とD30との間で開かれ、Kabatの定義に従って番号付けされた。hIL−2はK96とN97の間で開かれた。図9参照。
いくつかのIL−2/抗IL−2 mAb融合タンパク質の活性を、ヒトPBMC由来CD8 T細胞及びNK細胞における7日間の増殖アッセイで評価した。
IL−2/抗IL−2 mAb複合体のインビボでの効果を評価するために、2つの実験的アプローチを行った。最初の実験では、以下に記載するとおり、IL−2/抗IL−2 mAb複合体の2回の注射を受けたWT C57BL/6マウスにおいて、CD8+T細胞、CD4+T細胞、及びNK細胞の数を決定した。第2の実験では、IL−2/抗IL−2mAb複合体の単回注射後に、BrdUを用いてCD8+T細胞、CD4+T細胞及びNK細胞の増殖レベルを評価した。
以下の抗体を用いた:NARA1,104348,106260,108923,108924,108925,108926,108929及び108930。
細胞数データの結果を表32及び表33に示す。
ヒトIL−2(pORF−hIL−2 プラスミド、Invivogen、porf−hIL−2)及びNARA1の軽鎖をコードするDNA配列をカットアンドペーストによりサブクローニングし、標準的なクローニング技術(フュージョンポリメラーゼ、Finnzymes、F−530S、を用いたPCR増幅/アセンブリ)を用いて、プライマー内に目的のリンカー(例えば、表35、表36、及び表37に示す15,20又は25アミノ酸リンカー)を付加する。得られたPCR産物を、哺乳類細胞における分泌に適した発現ベクターに切断してペーストで挿入した。hIL−2に融合したNARA1の重鎖及びNARA1の軽鎖を、個々の発現ベクターにクローニングして、同時トランスフェクションを可能にした。発現ベクターの要素は、プロモーター(サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサープロモーター)、分泌を促進するシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、原核生物におけるエピソーム複製及び複製を可能にする要素(例えば、V40オリジン及びColE1又は当技術分野で公知の他のもの)及び選択(アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー)を可能にする要素を含む。
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、IgGタンパク質の一過性発現のための好ましい宿主細胞系の1つである。トランスフェクションは、トランスフェクション試薬としてPEI(ポリエチレンイミン、MW 25.000 linear、Polysciences、USA Cat.No.23966)を用いて行う。PEIストック溶液は、900mlの細胞培養グレードの水に室温(RT)で1gのPEIを注意深く溶解することによって調製される。PEIの溶解を促進するために、溶液を、HClをpH3−5に添加することで酸性化し、続いてNaOHで中和して最終pHを7にする。最後に、容量を1Lに調整し、溶液を0.22μmフィルターで濾過し、分注し、さらに使用するまで−80℃で凍結する。CHO細胞は、補助剤としてヒポキサンチンナトリウム及びチミジン(HT、41065012、Invitrogen)、L−グルタミン(17−605C、Lonza)及び抗生物質−抗真菌剤(15240062、ThermoFisher)を用いたPower CHO−2D培地及びProCHO−4培地(増殖及びトランスフェクションのための無血清培地、それぞれ12−770Q及び12−029Q Lonza)を使用して培養される。一過性トランスフェクションのために調製された細胞は、150rpmでシェーカー上の懸濁培養において培養される。種培養物中の細胞は、指数関数的増殖期(1.5x105と3x106/mLの間の細胞密度)で維持されるべきであり、トランスフェクションのために> 98%の生存率を示すべきである。この範囲外の細胞密度は、希釈後にラグ期又はトランスフェクション効率の低下のいずれかをもたらす。トランスフェクションのために、細胞の分注は、種培養液から取り出され、Power CHO−4無血清培地で最終容量の50%で2x106細胞/mLに調整される。150mM NaCl溶液中でDNAを希釈することにより、DNA溶液(IL−2に融合された重鎖及び軽鎖の1:1モル比に調整された、全DNA=100mlスケールについて125μg)を調製する。次に、PEI溶液(100mlスケールで0.5ml)をDNA溶液に加える。混合物を撹拌し、室温で10〜12分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を細胞に添加し、細胞の培養を3〜4時間続ける。最後に、総生産量の残りの50%を、Power CHO−2D無血清培地を添加することによって得る。トランスフェクション後4〜6日間細胞培養を続ける。4℃にて4700rpmで45分間の遠心分離により培養物を回収する(Heraeus(登録商標)、Multifuge 3S−R、Thermo Scientific、Rockford、IL)。回収された細胞上清を、ステリックアップフィルター(0.22μm)で滅菌濾過し、2.5mM ETDA及びアジ化ナトリウム(0.01%)と共に4℃でさらなる処理まで保存する。
以下に記載するとおり、L15、L20、L25、又はIL−2/NARA1を投与されたWT C57BL/6マウスにおいて、CD8+T細胞、CD4+T細胞、及びNK細胞の百分率及び数を決定した。並行して、ブロモデオキシウリジン(BrdU)を用いてCD8+ T細胞及びNK細胞の増殖レベルを評価した。
次の抗体及び融合タンパク質を使用した:NARA1、L15、L20及びL25。
細胞数データの結果を表38に示す。
ヒトIL−2に応答するCTLL−2ネズミ細胞系を用いた細胞増殖アッセイにおいて、NARA1系融合タンパク質の活性をNARA1及びIL−2単独と比較した。
本発明を実施するための有用なアミノ酸及びヌクレオチド配列を表41に示す。本出願の本文全体にわたって、明細書の記載(例えば表41)と配列表との間に相違がある場合、明細書の記載が優先する。
Claims (31)
- 配列番号109に記載のヒトIL−2に結合する単離された抗体又はその抗原結合部分であって、前記抗体又はその抗原結合部分は、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む軽鎖可変領域と、HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含む重鎖可変領域とを含み、LCDR1は配列番号122を含み、LCDR2は配列番号123を含み、LCDR3は配列番号21を含み、HCDR1は配列番号119を含み、HCDR2は配列番号120を含み、HCDR3は配列番号121を含む、前記抗体又はその抗原結合部分。
- 前記抗体又はその抗原結合部分が、
配列番号19、配列番号31、配列番号69、配列番号72、配列番号86及び配列番号90からなる群から選択されるLCDR1;
配列番号20及び配列番号32からなる群から選択されるLCDR2;
配列番号21に記載されているとおりのLCDR3
を含む軽鎖可変領域;と
配列番号4及び配列番号13からなる群から選択されるHCDR1;
配列番号2及び配列番号12からなる群から選択されるHCDR2;
配列番号3、配列番号36、配列番号39、配列番号42、及び配列番号45からなる群から選択されるHCDR3を含む重可変領域;と
を含む、請求項1に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。 - LCDR1、LCDR2及びLCDR3はそれぞれ配列番号19、20及び21であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号4、2及び3である、又は、
LCDR1、LCDR2及びLCDR3はそれぞれ配列番号31、32及び21であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号4、2及び3である、又は
LCDR1、LCDR2及びLCDR3はそれぞれ配列番号19、20及び21であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号13、12及び3である、又は
LCDR1、LCDR2及びLCDR3はそれぞれ配列番号31、32及び21であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号13、12及び3である、又は
LCDR1、LCDR2及びLCDR3はそれぞれ配列番号69、20及び21であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号4、2及び3である、又は
LCDR1、LCDR2及びLCDR3はそれぞれ配列番号31、32及び21であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号4、2及び3である、又は
LCDR1、LCDR2及びLCDR3はそれぞれ配列番号69、20及び21であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号4、2及び3である、又は
LCDR1、LCDR2及びLCDR3はそれぞれ配列番号19、20及び21であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号4、2及び36である、又は
LCDR1、LCDR2及びLCDR3はそれぞれ配列番号69、20及び21であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号4、2及び36である、又は
LCDR1、LCDR2及びLCDR3はそれぞれ配列番号19、20、21であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号4、2及び36である、又は、
LCDR1、LCDR2及びLCDR3はそれぞれ配列番号69、20、21であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号4、2及び36である、
請求項1又は2に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。 - 重鎖可変(VH)領域及び軽鎖可変(VL)領域が、アミノ酸配列:
VL、配列番号25;VH、配列番号7、又は
VL、配列番号27;VH、配列番号7、又は
VL、配列番号34;VH、配列番号7、又は
VL、配列番号25;VH、配列番号15、又は
VL、配列番号27;VH、配列番号15、又は
VL、配列番号34;VH、配列番号15、又は
VL、配列番号25;VH、配列番号17、又は
VL、配列番号27;VH、配列番号17、又は
VL、配列番号34;VH、配列番号17、又は
VL、配列番号70;VH、配列番号7、又は
VL、配列番号25;VH、配列番号37、又は
VL、配列番号70;VH、配列番号37、又は
VL、配列番号79;VH、配列番号7、又は
VL、配列番号27;VH、配列番号37、又は
VL、配列番号79;VH、配列番号37、又は
VL、配列番号70;VH、配列番号17、又は
VL、配列番号25;VH、配列番号49、又は
VL、配列番号70;VH、配列番号49、又は
VL、配列番号79;VH、配列番号17、又は
VL、配列番号27;VH、配列番号49、又は
VL、配列番号79:VH、配列番号49
と少なくとも95%の同一性を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。 - 重鎖可変(VH)領域及び軽鎖可変(VL)領域が、アミノ酸配列:
VL、配列番号25;VH、配列番号7、又は
VL、配列番号27;VH、配列番号7、又は
VL、配列番号34;VH、配列番号7、又は
VL、配列番号25;VH、配列番号15、又は
VL、配列番号27;VH、配列番号15、又は
VL、配列番号34;VH、配列番号15、又は
VL、配列番号25;VH、配列番号17、又は
VL、配列番号27;VH、配列番号17、又は
VL、配列番号34;VH、配列番号17、又は
VL、配列番号70;VH、配列番号7、又は
VL、配列番号25;VH、配列番号37、又は
VL、配列番号70;VH、配列番号37、又は
VL、配列番号79;VH、配列番号7、又は
VL、配列番号27;VH、配列番号37、又は
VL、配列番号79;VH、配列番号37、又は
VL、配列番号70;VH、配列番号17、又は
VL、配列番号25;VH、配列番号49、又は
VL、配列番号70;VH、配列番号49、又は
VL、配列番号79;VH、配列番号17、又は
VL、配列番号27;VH、配列番号49、又は
VL、配列番号79;VH、配列番号49
を有する、請求項4に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。 - 配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103及び配列番号105からなる群より選択されるFcドメインを含む、請求項1〜5のいずれかに記載の単離された抗体。
- 配列番号93、配列番号101、配列番号103又は配列番号105に記載のFcドメインを含む、請求項6に記載の単離された抗体。
- 配列番号124に記載の軽鎖及び配列番号126に記載の重鎖を含み、又は配列番号128に記載の軽鎖及び配列番号130に記載の重鎖を含む、請求項7に記載の単離された抗体。
- アミノ酸K52、P54、K55、T57、R58、T61、F62、K63、Q94及びK96を含むヒトインターロイキン−2(hIL−2)エピトープに結合する、請求項1〜8のいずれかに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
- 抗体又はその抗原結合性断片が、アミノ酸K52、P54、K55、T57、R58、T61、F62、K63、Q94及びK96に特異的に結合する、請求項9に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
- エピトープが、アミノ酸N50、N53、N91、L92、A93及びN97のいずれか1つ以上をさらに含む、請求項10に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
- 抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸N50、K52、N53、P54、K55、T57、R58、T61、F62、K63、N91、L92、A93、Q94、K96及びN97に特異的に結合する、請求項11に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
- 配列番号109に記載のヒトIL−2に結合する単離された抗体又はその抗原結合部分であって、前記抗体又はその抗原結合部分が、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を順次含む軽鎖可変領域と、HCDR1、HCDR2及びHCDR3を順次含む重鎖可変領域とを含み、
LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号231、232及び233であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3は、それぞれ配列番号181、182及び183であり、又は
LCDR1、LCDR2及びLCDR3はそれぞれ配列番号279、280及び281であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号213、214及び215であり、又は
LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号231、232及び233であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号213、214及び215であり、又は
LCDR1、LCDR2及びLCDR3はそれぞれ配列番号263、264及び265であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号213、214及び215であり、又は
LCDR1、LCDR2及びLCDR3はそれぞれ配列番号263、264及び265であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3は、それぞれ配列番号149、150及び151であり、又は
LCDR1、LCDR2及びLCDR3はそれぞれ配列番号69、20及び21であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号197、198、及び199であり、又は
LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号231、232及び233であり、かつ、HCDR1、HCDR2及びHCDR3は、それぞれ配列番号197、198、及び199である、
前記抗体又はその抗原結合部分。 - 重鎖可変(VH)領域及び軽鎖可変(VL)領域が、アミノ酸配列:
VL、配列番号243;VH、配列番号193、又は
VL、配列番号391;VH、配列番号225、又は
VL、配列番号243;VH、配列番号225、又は
VL、配列番号275;VH、配列番号225、又は
VL、配列番号275;VH、配列番号161、又は
VL、配列番号70;VH、配列番号209、又は
VL、配列番号243;VH、配列番号209
と少なくとも95%の同一性を有する、請求項13に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。 - 重鎖可変(VH)領域及び軽鎖可変(VL)領域が、アミノ酸配列:
VL、配列番号243;VH、配列番号193、又は
VL、配列番号391;VH、配列番号225、又は
VL、配列番号243;VH、配列番号225、又は
VL、配列番号275;VH、配列番号225、又は
VL、配列番号275;VH、配列番号161、又は
VL、配列番号70;VH、配列番号209、又は
VL、配列番号243;VH、配列番号209
を有する、請求項14に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。 - 配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103及び配列番号105からなる群から選択されるFcドメインを含む、請求項13〜15のいずれか1項に記載の単離された抗体。
- 重鎖領域及び軽鎖領域がアミノ酸配列:
重鎖配列番号195及び軽鎖配列番号245、又は
重鎖配列番号227及び軽鎖配列番号393、又は
重鎖配列番号227及び軽鎖配列番号245、又は
重鎖配列番号227及び軽鎖配列番号277、又は
重鎖配列番号163及び軽鎖配列番号277、又は
重鎖配列番号211及び軽鎖配列番号261、又は
重鎖配列番号211及び軽鎖配列番号277
を有する、請求項15に記載の単離された抗体。 - 請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗体と、任意にヒトIL−2とを含む組成物。
- ヒトIL−2が、配列番号109に記載のヒトIL−2又は配列番号110に記載のアルデスロイキンからなる群から選択される、請求項18に記載の組成物。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗体とヒトIL−2とを含む融合タンパク質。
- 抗体及びヒトIL−2が、配列番号397、配列番号398、配列番号399、配列番号400、配列番号401、配列番号402、配列番号403、配列番号404、配列番号405、配列番号406、配列番号407、配列番号408、配列番号409、配列番号410及び配列番号411からなる群から選択されるリンカー配列によって連結される、請求項20に記載の融合タンパク質。
- リンカー配列が配列番号405又は配列番号407である、請求項21に記載の融合タンパク質。
- 抗体のLCDR1がKabat定義による残基Y27及び残基D30を含み、残基Y27がヒトIL−2の残基N97とGGリンカーで結合され、かつ、残基D30は、ヒトIL−2の残基K96残基と配列番号412に記載のリンカーで結合される、請求項20に記載の融合タンパク質。
- 医薬として使用するための、請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は請求項18〜19のいずれか1項に記載の組成物、又は請求項20〜23のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 医薬品の製造において使用するための、請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は請求項18〜19のいずれか1項に記載の組成物、又は請求項20〜23のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 癌治療に使用するための、請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は請求項18〜19のいずれか1項に記載の組成物、又は請求項20〜23のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗体、又は請求項18〜19のいずれか1項に記載の組成物、又は請求項20〜23のいずれか1項に記載の融合タンパク質を投与することによる、癌を治療する方法。
- 請求項1〜17にいずれか1項に記載の抗体又はその断片、又は請求項20〜23のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードし得る核酸分子を含むベクター。
- 請求項28に記載のベクターを含む、細胞。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載のヒトインターロイキン−2(hIL−2)特異的モノクローナル抗体又はその抗原結合断片、又は請求項20〜23のいずれか1項に記載の融合タンパク質を産生することができる細胞。
- 前記産生された抗体が請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗体又は請求項20〜23のいずれか1項に記載の融合タンパク質であることを特徴とする、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞株。
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