ES2959382T3

ES2959382T3 - Células deficientes en HLA de clase II y células deficientes en HLA de clase I capaces de expresar proteínas HLA de clase II, y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2959382T3
Application number: ES13714128T
Authority: ES
Inventors: David Russell; Roli K Hirata
Original assignee: University of Washington Center for Commercialization
Current assignee: University of Washington Center for Commercialization
Priority date: 2012-04-17
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2024-02-26
Anticipated expiration: 2033-03-15
Also published as: AU2013249820C1; EP4253409A3; AU2013249820A1; JP2019068856A; JP2022162047A; CA3085032A1; PT2838548T; EP2838548A1; HUE063231T2; US20150056225A1; PL2838548T3; EP4253409A2; CA2870571A1; US20190365876A1; FI2838548T3; JP7130571B2; EP2838548B1; AU2013249820B2; WO2013158292A1; JP2015514421A

Abstract

La invención proporciona células de primate aisladas, preferiblemente células humanas, que comprenden una alteración genéticamente modificada en un gen relacionado con el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase II, que da como resultado una deficiencia en la expresión y función del MHC de clase II. Esta invención también proporciona células aisladas que comprenden además una alteración genéticamente modificada en un gen de microglobulina beta-2 (B2M), que da como resultado una deficiencia de HLA clase I/clase II. También se proporciona el método para usar las células para trasplantes y tratar una enfermedad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Células deficientes en HLA de clase II y células deficientes en HLA de clase I capaces de expresar proteínas HLA de clase II, y usos de las mismas

Referencia cruzada

La presente solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de patente de Estados Unidos n.° de serie 61/625314 presentada el 17 de abril de 2012.

Declaración de derechos gubernamentales

La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno con los números de subvención R01GM086497 y R01DK55759 otorgados por el National Institutes of Health. El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.

Antecedentes de la invención

Las células madre pluripotentes humanas tienen el potencial de tratar enfermedades que afectan a casi todos los sistemas de órganos. Sin embargo, el uso clínico de células madre pluripotentes humanas y sus derivados tiene una limitación importante: el rechazo de las células trasplantadas por parte del receptor debido a diferencias en el complejo principal de histocompatibilidad.

El complejo principal de histocompatibilidad (MHC, del inglésmajor histocompatibility complex)es una molécula multicomponente de la superficie celular que se encuentra en todos los vertebrados y que media en las interacciones de los leucocitos con otros leucocitos u otras células. La familia de genes del MHC se divide en tres grupos: clase I, clase II y clase III. En los seres humanos, el MHC se conoce como antígeno leucocitario humano (HLA, del ingléshuman leukocyte antigen).Las moléculas HLA de clase II (HLA-II) son proteínas transmembrana que solo se encuentran en las células presentadoras de antígenos (APC, del inglésantigen-presenting cells)profesionales, incluidos macrófagos, células dendríticas y linfocitos B. Además, un órgano sólido a veces puede expresar genes HLA de clase II que participan en el rechazo inmunitario. La proteína HLA de clase I (HLA-I) se expresa en todas las células nucleadas y consiste en una cadena pesada HLA de clase I (o cadena a) y microglobulina p<2>(B2M, del inglés¡5-2 microglobulin).La proteína HLA de clase I presenta péptidos en la superficie celular a los linfocitos T citotóxicos CD8+. Hasta la fecha se han identificado seis cadenas a de HLA de clase I, incluyendo tres cadenas a clásicas (HLA-A, HLA-B y HLA-C) y tres no clásicas (HLA-E, HLA-F y HLA-G). La especificidad para la unión a péptidos en la hendidura de unión a péptidos de la molécula HLA de clase I está determinada por la cadena a. El reconocimiento por parte de los linfocitos T CD8+ de los péptidos presentados por la molécula HLA de clase I media la inmunidad celular.

Tanto las moléculas HLA de clase II como las de clase I son heterodímeros. Las moléculas de clase I consisten en una cadena alfa (o cadena pesada) y una microglobulina p<2>(B2M), mientras que las moléculas de clase II consisten en dos subunidades homólogas: la subunidad alfa y la subunidad beta.

Las moléculas o proteínas HLA de clase II (HLA-II) presentan en la superficie celular antígenos peptídicos de proteínas extracelulares, incluidas proteínas de un patógeno extracelular, mientras que las proteínas HLA de clase I presentan péptidos de proteínas o patógenos intracelulares. Las proteínas HLA de clase I<i>cargadas en la superficie celular interactúan con los linfocitos T auxiliares CD4+. La interacción conduce al reclutamiento de fagocitos, inflamación local y/o respuestas humorales a través de la activación de linfocitos B. Hasta la fecha se han identificado varios loci del genHLAde clase II, incluyendoHLA-DM (HLA-DMAyHLA-DMBque codifican la cadena a de HLA-DM y la cadena p de HLA-DM, respectivamente),HLA-DO (HLA-DOAyHLA-DOBque codifican la cadena a de HLA-DO y la cadena p de HLA-DO, respectivamente),HLA-DP (HLA-DPAyHLA-DPBque codifican la cadena a de HLA-DP y la cadena p de HLA-DP, respectivamente),HLA-DQ (HLA-DQAyHLA-DQBque codifican la cadena a de HLA-DQ y la cadena p de HLA-DQ, respectivamente) yHLA-DR (HLA-DRAyHLA-DRBque codifican la cadena a de HLA-DR y cadena p de HLA-DQ, respectivamente).

Las proteínas HLA de clase I y/o de clase II de una fuente alogénica constituyen un antígeno extraño en el contexto de un trasplante. El reconocimiento de proteínas HLA de clase I y/o de clase II no propias es un obstáculo importante en el uso de células pluripotentes para trasplantes o terapias de reemplazo. Peijnenburget al., Immunogenetics,51, 42-49 (1999) se refiere a la expresión defectuosa del MHC de clase II en un paciente con deficiencia del MHC de clase II provocada por una nueva eliminación de un sitio donante de corte y empalme en el gen transactivador del MHC de clase II. Van Eggermondet al., Molecular Immunology,45, 2920-2928 (2008) se refiere al silenciamiento transcripcional de RFXAP en la deficiencia del MHC de clase II. Hirataet al., The Journal of Gene Medicine,13, 436 (2011) se refiere a una inactivación de microglobulina p<2>en una célula madre embrionaria humana mediante manipulación genética dirigida mediada por AAV. Madsenet al., Proceedings of the National Academy of Sciences,96, 10338-10343 (1999) se refiere a ratones que carecen de todos los genesMHCde clase II convencionales. El documento WO 2012/145384 se refiere a células de primate aisladas que comprenden una alteración genomanipulada en el gen de la microglobulina p<2>(B2M), lo que da como resultado una deficiencia en la expresión y la función del MHC de clase I. Suárez-Álvarezet al.,PLOS One, 5, e10192 se refiere a los mecanismos epigenéticos que regulan el MHC y las moléculas de procesamiento de antígenos en células madre pluripotentes inducidas y embrionarias humanas. El documento WO 1995/017911 se refiere a la inactivación de un gen de la microglobulina p<2>para reducir y eliminar la expresión de antígenos del MHC de clase I funcionales. El documento WO 1992/009688 se refiere a un método para producir tejidos que sean heterocigotos u homocigotos para una alteración de la microglobulina p<2>.

Por lo tanto, aunque las preparaciones individualizadas de células madre o los bancos de células madre con diversidad de HLA pueden abordar el problema actual del trasplante, necesitan que se caractericen múltiples estirpes celulares, se diferencien en productos celulares terapéuticos y se aprueben para su administración humana. Este proceso lento, técnicamente difícil y costosas es un factor importante que impide que las terapias basadas en células madre entren en ensayos clínicos. Por lo tanto, existe una necesidad de terapias basadas en células más eficaces y menos costosas que no se vean obstaculizadas por el rechazo.

Sumario de la invención

La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas. En un primer aspecto, la presente invención proporciona células aisladas que comprenden una alteración genomanipulada en todas las copias de un gen relacionado con el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase II, en donde la célula es una célula humana, en donde:

a) el gen relacionado con HLA de clase II se selecciona del grupo que consiste en proteína que contiene anquirina asociada al factor regulador X (SEQ ID NO: 24 a 27), factor regulador 5 (SEQ ID NO: 28 a 31), proteína asociada al factor regulador X (SEQ ID NO: 32 a 33), transactivador de clase II (<s>E<q>ID NO: 34 a 35); y b) la célula comprende además uno o más polinucleótidos, y en donde el uno o más polinucleótidos es capaz de codificar una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I, en donde la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I comprende al menos una parte de la B2M (SEQ ID NO: 2) unida covalentemente a al menos una parte de una cadena a de HLA de clase I seleccionada del grupo que consiste en HLA-E (SEQ ID NO: 10), HLA-F (SEQ ID NO: 12) y HLA-G (SEQ ID NO: 14); y

c) la célula comprende además una alteración genomanipulada en el gen de la microglobulina p<2>,B2M,(SEQ ID NO: 1); y

d) en donde la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I es capaz de desempeñar una función de HLA de clase I normal con respecto a la formación de una estructura secundaria adecuada del heterodímero en la superficie celular, la presentación de péptidos en la hendidura de unión a péptidos y la participación de los receptores inhibidores en la superficie de las células NK; y

e) en donde se excluyen células madre embrionarias humanas.

En una realización, la célula comprende alteraciones genomanipuladas en al menos dos, al menos tres o los cuatro genes relacionados con HLA de clase II. En una realización adicional, el gen relacionado con HLA de clase II es una proteína que contiene anquirina asociada al factor regulador X(RFXANK).En otra realización, la célula comprende además uno o más genes inmunomoduladores recombinantes, cada uno de ellos capaz de expresar un polipéptido inmunomodulador en la célula humana. En una realización adicional, el uno o más genes inmunomoduladores comprenden un polinucleótido capaz de codificar una proteína HLA II. En otra realización, el uno o más genes inmunomoduladores comprenden un polinucleótido capaz de codificar una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II.

En el presente documento se divulgan, pero no se reivindican, células aisladas que comprenden (a) una alteración genomanipulada en un gen de la microglobulina p<2>(B2M); y (b) uno o más polinucleótidos capaces de codificar una proteína HLA de clase II o una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II; en donde la célula es una célula de primate.

En una realización del primer aspecto, la célula comprende alteraciones genomanipuladas de todas las copias del genB2M.En una realización adicional, el genHLA IIcodifica una proteína HLA seleccionada del grupo que consiste en una cadena a de HLA-DM, una cadena p de HLA-DM, una cadena a de HLA-DO, una cadena p de HLA-DO, una cadena a de HLA-DP, una cadena p de HLA-DP, una cadena a de HLA-DQ, una cadena p de HLA-DQ, una cadena a de HLA-DR y una cadena p de H<l>A-DR.

En otra realización, la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II comprende al menos una parte de una cadena a del genHLAde clase II unida covalentemente a al menos una parte de una cadena p del genHLAde clase II, en donde el genHLAde clase II se selecciona del grupo que consiste enHLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-DMyHLA-DO.En una realización adicional, la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II comprende una pluralidad de proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II diferentes. En otra realización, la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II comprende al menos una parte de la cadena a de HLA-DQ y al menos una parte de la cadena p de HLA-DQ. En aún una realización adicional, la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II comprende al menos una parte del alelo de cadena a de HLA-DQ HLA-DQA1*01 y al menos una parte del alelo de la cadena p de HLA-DQ HLA-DQB1*02.

En una realización adicional del aspecto de las células de la invención, la proteína HLA o la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II presenta un primer antígeno peptídico diana en la superficie celular. En una de dichas realizaciones, el primer antígeno peptídico diana está unido covalentemente a la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II.

La célula comprende además un polinucleótido capaz de codificar una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I, que comprende al menos una parte de B2M (SEQ ID NO: 2) unida covalentemente a al menos una parte de una cadena a de HLA de clase I seleccionada del grupo que consiste en HLA-E (SEQ ID NO: 10), HLA-F (SEQ ID NO: 12) y HLA-G (SEQ ID NO: 14), en donde la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I es capaz de desempeñar la función de HLA de clase I normal con respecto a la formación de una estructura secundaria adecuada del heterodímero en la superficie celular, la presentación de péptidos en la hendidura de unión a péptidos y la participación de los receptores inhibidores en la superficie de las células NK. En otra realización, la célula expresa además un segundo antígeno peptídico diana que se presenta mediante la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I en la superficie celular. Por ejemplo, el segundo antígeno peptídico diana puede estar unido covalentemente a la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I.

En otra realización del aspecto de las células de la invención, la célula comprende además uno o más genes recombinantes capaces de codificar un producto génico suicida. Por ejemplo, el producto génico suicida puede comprender una proteína seleccionada del grupo que consiste en timidina cinasa y una proteína de señalización apoptótica.

Las células de la invención pueden tener un cariotipo normal y pueden ser células no transformadas. Las células pueden ser células madre, tales como células madre hematopoyéticas, células madre embrionarias (en donde no se reivindican células madre embrionarias humanas), células madre pluripotentes, células madre pluripotentes inducidas, células madre del hígado, células madre neuronales, células madre pancreáticas o células madre mesenquimatosas. La célula madre puede diferenciarse, tales como células dendríticas, células de islote pancreático, células hepáticas, miocitos, queratinocitos, células neuronales, células hematopoyéticas, linfocitos, glóbulos rojos, plaquetas, células muscular esquelética, células oculares, células mesenquimatosas, fibroblastos, células pulmonares, células del tubo gastrointestinal (GI), células vasculares, células endocrinas, adipocitos o cardiomiocitos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona vacunas que comprenden la célula de una cualquiera de las realizaciones o combinaciones de realizaciones de las células de la presente invención que incluyen al menos un antígeno peptídico diana en la superficie celular, en donde la vacuna es capaz de provocar en un primate una respuesta inmunitaria específica para el antígeno (o antígenos) peptídico diana.

En un aspecto adicional, la invención proporciona la célula de la presente invención para su uso en trasplante en un paciente que lo necesita, en donde el uso comprende la etapa de administrar al paciente una cantidad eficaz de la célula o vacuna de cualquier realización o combinación de realizaciones de las células de la invención. En una de dichas realizaciones, el paciente puede ser inmunocompetente. En otra realización, la célula o vacuna puede comprender una célula diferenciada.

Descripción de las figuras

En lafigura 1se muestra la estructura de dos vectores ilustrativos de virus adenoasociados (AAV, del inglésadeno-associated virus)dirigidos a genes, diseñados para insertar un genTKNeo(AAV-RFXANK-ETKNpA) oHyTK(AAV-RFXANK-HyTK) controlado por un promotor EFIalfa (EF) en el exón 3 del genRFXANK,que también se muestra debajo de los vectores. La selección de células infectadas por vectores con G418 o higromicina (Higro) permite aislar las células diana de los vectores TKNeo o HyTK, respectivamente. La expresión posterior de la recombinasa Cre y la selección con ganciclovir (GCV) permiten aislar clones que han eliminado los genesTKNeooHyTK,dejando dos alelos de RFXANK inactivados con codones de parada en los 3 marcos de lectura, un sitio loxP y un sitio de poliadenilación (StopX3-loxP-pA). LoxP es el sitio de recombinación de la recombinasa Cre. ITR (del inglésinverted terminal repeat)es una repetición terminal invertida vectorial. Se podrían diseñar vectores similares para dirigirse a otros genes.

Figura 2 (A)Representación esquemática de la estrategia de direccionamiento para la infección de células madre embrionarias humanas con la construcción AAV-RFXANK-ETKNpA.(B)Fotografía de gel teñido que muestra productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) obtenidos después de la infección de células madre embrionarias humanas con AAV-RFXANK-ETKNpA y PCR utilizando un cebador directo homólogo a la secuencia de neomicina del casete de selección y un cebador inverso homólogo al genRFXANKque estaba fuera del brazo de homología de direccionamiento, como lo indican las flechas de arriba.

Descripción detallada de la invención

En la presente solicitud, a menos que se indique de otro modo, las técnicas utilizadas se pueden encontrar en cualquiera de varias referencias bien conocidas, tales como:Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Sambrook,et al.,1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press),Gene Expression Technology(Methods in Enzymology, vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein Purification" enMethods inEnzymology(M. P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.);PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Innis,et al.1990. Academic Press, San Diego, CA),Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2 a ed.(R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. Nueva York, NY),Gene Transfer and Expression Protocols,págs. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N. J.) y el catálogo de Ambion de 1998 (Ambion, Austin, TX).

Como se utilizan en el presente documento, las formas en singular "un", "uno", "una", "el" y "la" incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. "Y", como se utiliza en el presente documento, se utiliza indistintamente con "o", a menos que se indique expresamente otra cosa.

Todas las realizaciones de cualquier aspecto de la invención se pueden utilizar en combinación, a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona células aisladas que comprenden una alteración genomanipulada en todas las copias de un gen relacionado con el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase II, en donde la célula es una célula humana, en donde: a) el gen relacionado con HLA de clase II se selecciona del grupo que consiste en proteína que contiene anquirina asociada al factor regulador X (SEQ ID NO: 24 a 27), factor regulador 5 (SEQ ID NO: 28 a 31), proteína asociada al factor regulador X (SEQ ID NO: 32 a 33), transactivador de clase II (SEQ ID NO: 34 a 35); y

b) la célula comprende además uno o más polinucleótidos, y en donde el uno o más polinucleótidos es capaz de codificar una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I, en donde la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I comprende al menos una parte de la B2M (SEQ ID NO: 2) unida covalentemente a al menos una parte de una cadena a de HLA de clase I seleccionada del grupo que consiste en HLA-E (SEQ ID NO: 10), HLA-F (SEQ ID NO: 12) y HLA-G (SEQ ID NO: 14); y

c) la célula comprende además una alteración genomanipulada en el gen de la microglobulina p<2>(B2M)(SEQ ID NO: 1); y

e) en donde se excluyen células madre embrionarias humanas.

Los genes relacionados con HLA de clase II tal como se utilizan en la presente solicitud se refieren en términos generales a genes que codifican proteínas implicadas en las respuestas inmunitarias mediadas por HLA de clase II. Por lo tanto, los genes relacionados con HLA de clase II abarcan genes que codifican las moléculas de HLA de clase II tales como HLA-DM (SEQ ID NO: 48 y 50), HLA-DO (SEQ ID NO: 52 y 54), HLA-DP (SEQ ID NO: 36 y 38), HLA-DQ (SEQ ID NO: 40 y 42) y HLA-DR (SEQ ID NO: 44 y 46). Las secuencias de genes/proteínas de<h>L<a>de clase II ilustrativas se pueden encontrar en la base de datos disponible públicamente con los números de base de datos de GenBank o IMGT/HLA NM_033554.3 (SEQ ID NO: 36 y 37) para HLA-DPA, HLA00514 (SEQ ID NO: 38 y 39) para HLA-DPB, HLA00601 (SEQ ID NO: 40 y 41) para HLA-DQA, HLA00622 (SEQ ID NO: 42 y 43) para HLA-DQB, NM_019111 (SEQ ID NO: 44 y 45) para HLA-DRA, HLA00664 (SEQ ID NO: 46 y 47) para HLA-DRB, NM_006120 (SEQ ID NO: 48 y 49) para HLA-DMA, NM_002118 (SEQ ID NO: 50 y 51) para HLA-DMB, NM_002119 (SEQ ID NO: 52 y 53) para HLA-DOA y NM_002120 (SEQ ID NO: 54 y 55) para HLA-DOB.

Además, los genes relacionados con HLA de clase II también incluyen genes que codifican proteínas reguladoras de HLA de clase II que regulan la expresión de moléculas de HLA de clase II, incluidos, sin limitación, la proteína que contiene anquirina asociada al factor regulador X(RFXANK),factor regulador 5(RFX5),proteína asociada al factor regulador X(RFXAP)y transactivador de clase II(CIITA).Por ejemplo, la proteína que contiene anquirina asociada al factor regulador X(RFXANK)junto con la proteína asociada al factor regulador X y el factor regulador 5 forman un complejo que se une al motivo de la caja X de los promotores del genHLAde clase II y activa la transcripción de los genesHLAde clase II. Las secuencias de genes ilustrativos relacionados con HLA de clase II que regulan la expresión de moléculas HLA de clase II se pueden encontrar en una base de datos disponible públicamente con los números de referencia de GenBank NM_134440.1 (SEQ ID NO: 24 y 25) y NM_003721.2 (SEQ ID NO: 26 y 27) para RFXANK, NM_000449.3 (SEQ ID NO: 28 y 29) y NM_001025603.1 (SEQ ID NO: 30 y 31) para RFX5, NM_000538.3 (SEQ ID NO: 32 y 33) para RFXAP y NM_000246.3 (SEQ ID NO: 34 y 35) para CIITA.

En determinadas realizaciones, la célula de la presente invención comprende una pluralidad de alteraciones genomanipuladas en una pluralidad de genes relacionados con HLA de clase II.

El gen relacionado con HLA de clase II se selecciona del grupo que consiste en la proteína que contiene anquirina asociada al factor regulador X(RFXANK),factor regulador 5(RFX5),proteína asociada al factor regulador X(RFXAP)y transactivador de clase II(CIITA).En determinadas realizaciones particulares, la célula comprende al menos una alteración genomanipulada en al menos dos, al menos tres o todos los genes relacionados con HLA de clase II seleccionados del grupo que consiste en la proteína que contiene anquirina asociada al factor regulador X(RFXANK),factor regulador 5(RFX5),proteína asociada al factor regulador X(RFXAP)y transactivador de clase II(CIITA).Cualquier combinación de estos cuatro genes relacionados con HLA de clase II como diana para la alteración genética para crear células deficientes en HLA de clase II está dentro del alcance de la invención.

En determinadas otras realizaciones, la célula comprende al menos una alteración genomanipulada de genes relacionados con HLA de clase II seleccionados del grupo que consiste enHLA-DPA(cadena a) (SEQ ID NO: 36 y 37),HLA-DPB(cadena P) (SEQ ID NO: 38 y 39),HLA-DQA(SEQ ID NO: 40 y 41),HLA-DQB(SEQ ID NO: 42 y 43),HLA-DRA(SEQ ID NO: 44 y 45),HLA-DRB(SEQ ID NO: 46-47),HLA-DMA(SEQ ID NO: 48 y 49),HLA-DMB(SEQ ID NO: 50 y 51),HLA-DOA(SEQ ID NO: 52 y 53) yHLA-DOB(SEQ ID NO: 54 y 55).

Las alteraciones genomanipuladas incluyen, sin limitación, eliminaciones, inserciones, sustituciones y truncamientos de un gen diana relacionado con HLA de clase II que dan como resultado la ausencia de expresión del gen diana o la expresión de una proteína truncada o mutada sin función o con una función muy reducida en comparación con la proteína de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, la alteración genomanipulada de un gen relacionado con HLA de clase II conduce a la expresión de una proteína truncada relacionada con HLA de clase II. En determinadas realizaciones particulares, el gen relacionado con HLA de clase II esRFXANK(SEQ ID NO: 24 a 27). En algunas otras realizaciones particulares, el gen relacionado con HLA se selecciona del grupo que consiste enHLA-DPA(cadena a)(SEQ ID NO: 36 y 37),HLA-DPB(cadena P) (SEQ ID NO: 38 y 39),HLA-DQA(SEQ ID NO: 40 y 41),HLA-DQB(SEQ ID NO: 42 y 43),HLA-DRA(SEQ ID NO: 44 y 45),HLA-DRB(SEQ ID NO: 46-47),HLA-DMA(SEQ ID NO: 48 y 49),HLA-DMB(SEQ ID NO: 50 y 51),HLA-DOA(SEQ ID NO: 52 y 53) yHLA-DOB(SEQ ID NO: 54 y 55). En determinadas realizaciones adicionales, la célula comprende alteraciones genomanipuladas en todas las copias del gen relacionado con HLA de clase II.

La invención proporciona células deficientes en HLA de clase I y HLA de clase II. La célula humana comprende una alteración genomanipulada en un gen relacionado con HLA de clase II y comprende además una alteración genomanipulada en el gen de la microglobulina p<2>(B2M)(SEQ ID NO: 1). En otras realizaciones particulares, la célula comprende además alteraciones genomanipuladas de todas las copias del genB2M(SEQ ID NO: 1). En determinadas realizaciones, las alteraciones genéticas en el genB2M(SEQ ID NO: 1) dan como resultado una expresión defectuosa o nula de la proteína B2M (SEQ ID NO: 2). En otras realizaciones particulares, la célula comprende además alteraciones genomanipuladas de todas las copias del genB2M.En determinadas realizaciones, las alteraciones genéticas en el genB2Mdan como resultado una expresión defectuosa o nula de la proteína B2M. Dado que B2M es un componente común de todas las proteínas HLA de clase I, las alteraciones impiden la expresión de todas las proteínas HLA de clase I naturales en la superficie celular. Por lo tanto, en este aspecto de la invención se proporciona una célula deficiente en HLA de clase I/clase II. La secuencia codificante deb 2mse muestra en la SEQ ID NO: 1 (Número de referencia de GenBank NM_004048) y la secuencia de la proteína B2M se muestra en la SEQ ID NO: 2. Puede haber muchos polimorfismos mononucleotídico (SNP, del ingléssingle nucleotide polymorphisms)en el gen; como entenderán los expertos en la materia, las células humanas y los métodos de la invención son aplicables a cualquiera de dichos genesB2My SNP.

Se puede utilizar cualquier técnica adecuada para introducir una alteración genomanipulada (en un gen relacionado con HLA de clase II, en el genB2Mo en cualquier otro gen adecuado); a lo largo de la solicitud se divulgan técnicas ilustrativas para alteraciones genéticas y están dentro del nivel de experiencia en la materia según las enseñanzas del presente documento y las enseñanzas conocidas en la materia. Se pueden encontrar otras técnicas ilustrativas, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US2008/0219956, publicada el 11 de septiembre de 2008. Estas técnicas pueden incluir opcionalmente etapas para eliminar secuencias de ADN no humano de las células después de la alteración de un gen relacionado con HLA de clase II y opcionalmente la alteración del genB2M.

Una de dichas técnicas emplea un vector dirigido a genes de virus adenoasociados, que incluye opcionalmente eliminar el transgén utilizado para el direccionamiento mediante técnicas, tales como las que se describen a continuación, o eliminar el transgén utilizado para el direccionamiento mediante recombinación loxP mediada por Cre u otras técnicas de recombinación adecuadas.VéaseKhanet al.2011, Protocol, 6:482-501. También se divulgan en el presente documento vectores de direccionamiento ilustrativos y diagramas vectoriales ilustrativos. Está dentro del nivel de los expertos en la materia, basado en las enseñanzas del presente documento y conocidas en la materia, utilizar una variedad de técnicas para producir células HLA de clase II, preferentemente humanas, de la invención.

En determinadas realizaciones, el genoma celular de células deficientes en HLA de clase II puede comprender no más de 100, no más de 50 o no más de 30 nucleótidos de secuencias de ADN no humano. En determinadas otras realizaciones, el genoma celular puede comprender 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 nucleótidos de secuencias de ADN no humano. Una estrategia ilustrativa para alterar genéticamente el genRFXANKse muestra en la figura 1. Las secuencias de ADN no humano se pueden eliminar mediante una segunda ronda de direccionamiento para eliminar los transgenesHyTKoTKNeoen los primeros vectores o mediante la recombinación loxP mediada por Cre.

En determinadas otras realizaciones, las células deficientes en HLA de clase II o HLA de clase I/clase II comprenden además uno o más genes inmunomoduladores recombinantes. Los genes inmunomoduladores adecuados incluyen, sin limitación, un gen que codifica una proteína vírica que inhibe la presentación de antígenos, un gen de microARN, un gen que codifica una proteína HLA de clase II o un gen que codifica una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II (SC, del ingléssingle chain).La expresiones "proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II", "molécula de fusión monocatenaria HLA de clase II" o "antígeno de fusión monocatenario HLA de clase II" se refieren a una proteína de fusión que comprende al menos una parte de la cadena a de HLA de clase II unida covalentemente, directamente o a través de una secuencia enlazadora, a al menos una parte de una cadena p de HLA de clase II o una cadena a o p de clase II unida a un antígeno peptídico, o cadenas a y p de clase II unidas también enlazadas a un antígeno peptídico. Por otro lado, las expresiones "proteína HLA de clase II", "molécula HLA de clase II" o "antígeno HLA de clase II" se refieren a un heterodímero asociado no covalentemente de una cadena a de HLA de clase II y una cadena p de HLA expresada en la superficie de una célula de tipo silvestre. En realizaciones en donde el gen codifica una proteína HLA de clase II (a diferencia de una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II), el gen está bajo el control de un promotor que no participa en la expresión normal de clase II en la célula. En una realización, el gen se expresa de manera episómica; en otra realización, el gen se integra en el genoma de la célula. En cualquier realización, el gen está unido operativamente(es decir,bajo control transcripcional) a un promotor que no participa en la expresión normal de clase II en la célula. Puede utilizarse cualquier promotor adecuado, según lo determine un experto en la materia en función del diseño y uso específicos previstos de las construcciones y células.

En el presente documento se divulgan, pero no se reivindican, células aisladas que comprenden (a) una alteración genomanipulada en un gen de la microglobulina p<2>(B2M); y (b) uno o más polinucleótidos capaces de codificar una proteína HLA II (cadenas a o p) o una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II; en donde la célula es una célula de primate. Estas células son células deficientes en HLA de clase I.

Como células donantes universales se pueden utilizar células deficientes en HLA de clase II, células deficientes en HLA de clase I o células deficientes en HLA de clase I/clase II. En determinadas realizaciones particulares, las células deficientes en HLA de clase II o células deficientes en HLA de clase I/clase II de la invención son células hematopoyéticas o células dendríticas para su uso en trasplantes. Además, las células de órganos sólidos a veces pueden expresar genesHLAde clase II que participan en el rechazo inmunitario. Por lo tanto, en determinadas realizaciones ventajosas, la invención proporciona células deficientes en HLA de clase II o HLA de clase I/clase II de la invención para su uso en trasplantes para el tratamiento de enfermedades o lesiones asociadas con órganos sólidos.

En determinadas realizaciones particulares de cualquiera de las células de la presente invención, las cadenas a y p de HLA se seleccionan del grupo que consiste en las cadenas a y p de HLA-DM, HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ y<h>L<a>-DO. Las cadenas a y p pueden ser del mismo genHLAde clase II, pero no tienen por qué serlo. Por ejemplo, una proteína HLA de clase II o una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II puede comprender al menos una parte de una cadena a de HLA-DQ y al menos una parte de una cadena p de HLA-DQ (también denominada construcción dimérica). También se contemplan proteínas HLA de clase II y proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II que comprenden alelos de HLA de clase II con emparejamientos erróneos. En determinadas realizaciones particulares, una proteína HLA de clase II o una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II puede comprender al menos una parte del alelo de la cadena a de HLA-DQ HLA-DQA1*01 (SEQ ID NO, 41) y al menos una parte del alelo de la cadena p de HLA-DQ HLA-DQB1*02 (SEQ ID NO, 43). En determinadas realizaciones preferidas, la secuencia líder (o péptido señal) de la segunda parte de la proteína de fusión se elimina en la construcción de fusión. Por ejemplo, en una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II que comprende al menos una parte de HLA-DQA1 *o1 (SEQ ID NO, 41) en el extremo N unido covalentemente a al menos una parte de HLA-DQB 1 *02 (SEQ ID NO, 43) en el extremo C, la secuencia líder HLA-DQA1*01 (SEQ ID NO, 41) se deja y la secuencia líder HLA-DQB1*02 (SEQ ID NO, 43) se elimina de la construcción. En determinadas otras realizaciones, la célula expresa además al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro o más proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II diferentes. En determinadas realizaciones particulares, la proteína HLA de clase II o la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II también comprende un primer antígeno peptídico diana que ocupa el sitio de unión peptídica de la proteína HLA de clase II o de la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II, en donde el antígeno peptídico está unido covalentemente a la proteína HLA de clase II o a la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II (también denominada construcción trimérica). En determinadas otras realizaciones, el antígeno peptídico unido covalentemente se escinde mediante un sitio de escisión de proteasa incorporado, y el antígeno peptídico escindido puede unirse al sitio de unión peptídica de la proteína de fusión monocatenaria HLA-II para su presentación.

Por lo tanto, las células deficientes en HLA de clase II o HLA de clase I/clase II de la invención también abarcan células que tienen alteraciones genomanipuladas en todas las copias de un genHLAde clase II(por ejemplo,alteraciones en todas las copias de la cadena a y/o p de HLA-DQ), en donde un alelo HLA de clase II está diseñado genéticamente para expresar, en lugar de la proteína HLA de clase II de tipo silvestre, una proteína HLA de clase II de interés o una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II(es decir,inserción génica dirigido genéticamente en un alelo HLA-II). Tomando HLA-DQ como ejemplo, en determinadas realizaciones, las célulasHLA-DQ'1'expresan la proteína HLA-DQ solo en el contexto de una proteína HLA-DQ de fusión monocatenaria a partir de un locus genéticoHLA-DQ.En determinadas realizaciones ventajosas, la expresión de la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II está regulada por la secuencia reguladoraHLA-DQendógena situada en el locusHLA-DQ.

En realizaciones relacionadas, las células deficientes en HLA de clase II o HLA de clase I/clase II de la invención abarcan además células que tienen alteraciones genomanipuladas en todas las copias de un determinado genHLA-II,en donde todos los alelos del genHLA-IIespecífico están genomanipulados para expresar, en lugar de la proteína HLA-II de tipo silvestre, proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II(es decir,inserciones genéticamente dirigidas en todos los alelos HLA-II). Las células deficientes en HLA de clase II o HLA de clase I/clase II con dichas alteraciones genéticas expresan una proteína HLA-II particular sólo en el contexto de proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II a partir de los loci genéticos de todos los alelos del genHLA-IIparticular.

Las proteínas HLA de clase II y las proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II que comprenden variantes de secuencia y fragmentos de cadenas a y cadenas p de HLA de clase II están contempladas en la presente invención, en donde dichas proteínas HLA de clase II o construcciones de fusión monocatenarias poseen, no obstante, funciones HLA de clase II normales,por ejemplo,formación de una estructura secundaria adecuada del heterodímero en la superficie celular, presentación de péptidos en el sitio de unión a péptido, interacción con los linfocitos T auxiliares CD4+ y desencadenado de respuestas inmunitarias mediadas por HLA de clase II. En determinadas realizaciones, las variantes comparten al menos un 75 %, un 78 %, un 80 %, un 81 %, un 85 %, un 88 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o la homología de secuencia completa con las secuencias de cadena a o p del HLA de clase II de origen natural, en donde las variantes poseen funciones HLA de clase II normales. En determinadas otras realizaciones, las variantes comparten al menos un 75 %, un 80 %, un 81 %, un 85 %, un 88 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o la homología de secuencia completa con las secuencias de las cadenas a o p de HLA de clase II como se muestra en las SEQ ID NO: 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 y 55.

Además, las células deficientes en HLA de clase II o HLA de clase I/clase II de la invención pueden genomanipularse para expresar de forma recombinante una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I en un acervo genético B2M-/-. No obstante, las células deficientes en HLA de clase I/clase II que expresan de forma recombinante una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I son deficientes en la función B2M normal porque las células no expresan la proteína B2M de tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) que puede formar una heterodímero asociado no covalentemente con cualquier cadena a de HLA de clase I en la superficie celular.

La expresiones "proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I", "molécula de fusión monocatenaria HLA de clase I" o "antígeno de fusión monocatenario HLA de clase I" se refieren a una proteína de fusión que comprende al menos una parte de la proteína B2M unida covalentemente, directamente o a través de una secuencia enlazadora, a al menos una parte de una cadena a de HLA-I. Por otro lado, las expresiones "proteína HLA de clase I", "molécula HLA de clase I" o "antígeno HLA de clase I" se refieren a un heterodímero asociado no covalentemente de B2M y una cadena a de HLA expresada en la superficie de una célula de tipo silvestre.

Como se utilizan en el presente documento, la expresión "cadena a de HLA de clase I" o "cadena pesada de HLA-I" se refiere a la cadena a del heterodímero de HLA de clase I. La cadena pesada de HLA de clase I incluye, sin limitación, cadenas a de HLA de clase I HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E,<h>L<a>-F y HLA-G. Se proporcionan secuencias representativas de ADN y proteínas para HLA-A (N.° de GenBank K02883.1, SEQ ID NO: 3; N.° de UniProt P01892, SEQ ID NO: 4), HLA-B (NM_005514, SEQ ID NO: 5; NP_005505; SEQ ID NO: 6), HLA-C (NM_002117, SEQ ID NO: 7; NP_002108, SEQ ID NO: 8), HLA-E (NM_005516, SEQ ID NO: 9; NP_005507, SEQ ID NO: 10), HLA-F (NM_018950, SEQ ID NO: 11; NP_061823, SEQ ID NO: 12) y HLA-G (NM_002127, SEQ ID NO: 13; NP_002118, SEQ ID NO: 14).

Además, aunque se sabe que la expresión "proteína/molécula HLA de clase I o II" se refiere a la proteína/molécula MHC de clase I o II en seres humanos, los términos HLA y MHC a veces se utilizan indistintamente en esta solicitud: por ejemplo, la expresión proteína HLA de clase I o HLA de clase II también se puede utilizar para referirse al equivalente en primates de la proteína HLA de clase I o la proteína HLA de clase II, respectivamente, en un primate. Un experto en la materia podrá discernir el significado del término basándose en el contenido.

Por lo tanto, las células deficientes en HLA de clase I/clase II de la invención también abarcan células que tienen alteraciones genomanipuladas en todas las copias del genB2M,en donde un aleloB2Mestá genomanipulado para expresar, en lugar de la proteína B2M de tipo silvestre, una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I(es decir,inserción genéticamente dirigida en un aleloB2M).Las célulasB2M-/-con dicho acervo genético expresan B2M sólo en el contexto de la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I a partir de un locus genéticoB2M.En determinadas realizaciones ventajosas, la expresión de la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I está regulada por la secuencia reguladora endógena B2M ubicada en el locusB2M.

En realizaciones relacionadas, las células deficientes en HLA de clase I/clase II de la invención abarcan además células que tienen alteraciones genomanipuladas en todas las copias del genB2M, en donde todos los alelosB2Mestán genomanipulados para expresar, en lugar de la proteína B2M de tipo silvestre, proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase I(es decir.,inserción genéticamente dirigida en todos los alelosB2M).Las células deficientes en HLA de clase I/clase II de la invención con dichas alteraciones genéticas expresan B2M sólo en el contexto de proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase I a partir de los loci genéticos de todos los alelos del genB2M.En determinadas realizaciones, las células están genomanipuladas para expresar el mismo tipo de proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I a partir de los loci genéticos de todos los alelos del genB2M;mientras que en otras realizaciones, las células están genomanipuladas para expresar diferentes tipos de proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase I a partir de diferentes loci genéticos del genB2M.

La proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I comprende al menos una parte de B2M (SEQ ID NO: 2) unida covalentemente a al menos una parte de HLA-E (SEQ ID NO: 10), HLA-F (SEQ ID NO: 12) o HLA-G (SEQ ID NO: 14) (también denominado construcción dimérica), en donde la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I es capaz de desempeñar una función de HLA de clase I normal con respecto a la formación de una estructura secundaria adecuada del heterodímero en la superficie celular, presentación de péptidos en la hendidura de unión a péptidos y participación de los receptores inhibidores en la superficie de las células Nk . En determinadas realizaciones preferidas, la cadena a de HLA contenida en la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I no contiene la secuencia líder (o secuencia señal) de la cadena a de HLA de clase I (cadena a de HLA sin líder). En determinadas otras realizaciones, la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I comprende al menos una parte de B2M (SEQ ID NO: 2) unida covalentemente a al menos una parte de HLA-E (SEQ ID NO: 10) o HLA-G (SEQ ID NO: 14 ), en donde la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I es capaz de desempeñar una función de HLA de clase I normal con respecto a la formación de una estructura secundaria adecuada del heterodímero en la superficie celular, presentación de péptidos en la hendidura de unión a péptidos y participación de los receptores inhibidores en la superficie de las células n K. En determinadas realizaciones preferidas, la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I comprende una secuencia líder (o péptido señal) unida covalentemente a al menos una parte de B2M y a al menos una parte de una cadena a de HLA para asegurar el plegamiento adecuado de la fusión monocatenaria en la superficie celular. La secuencia líder puede ser la secuencia líder de la proteína B2M, la secuencia líder de una proteína de cadena a de HLA o la secuencia líder de otras proteínas secretoras. En determinadas realizaciones particulares, la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I comprende una proteína B2M con su secuencia líder eliminada. En algunas otras realizaciones particulares, la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I comprende una proteína de cadena a de HLA con su secuencia líder eliminada. Determinadas cadenas a de HLA de clase I son altamente polimórficas. Como entenderán los expertos en la materia, las células humanas y los métodos de la invención son aplicables a cualquiera de dichas cadenas a de HLA y polimorfismos de las mismas.

La presente invención contempla proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase I que comprenden variantes de secuencia y fragmentos de cadenas a de HLA y/o B2M, en donde dichas construcciones de fusión de monocatenarias poseen, no obstante, funciones HLA de clase I normales,por ejemplo,formación de una estructura secundaria adecuada del heterodímero en la superficie celular, presentación de péptidos en la hendidura de unión a péptidos y participación de los receptores inhibidores en la superficie de las células NK. En determinadas realizaciones, las variantes comparten al menos un 75 %, un 80 %, un 81 %, un 85 %, un 88 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o la homología de secuencia completa con las secuencias de B2M y las cadenas pesadas de HLA de origen natural, en donde las variantes poseen funciones HLA de clase I normales. En determinadas otras realizaciones, las variantes comparten al menos un 75 %, un 80 %, un 81 %, un 85 %, un 88 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o la homología de secuencia completa con las secuencias de las cadenas pesadas de HLA o B2M como se muestra en las SEQ ID NO: 2, 10, 12 o 14.

En determinadas realizaciones particulares, las variantes HLA-A comparten al menos un 85 %, un 88 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o la homología de secuencia completa con la SEQ ID NO: 4. En algunas otras realizaciones particulares, las variantes HLA-B comparten al menos un 81 %, un 83 %, un 85 %, un 88 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o la homología de secuencia completa con la SEQ ID NO: 6. En determinadas realizaciones adicionales, las variantes HLA-C comparten al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o la homología de secuencia completa con la SEQ ID NO: 8. Aún en otras realizaciones, las variantes HLA-E comparten al menos un 97 %, un 98 %, un 99 % o la homología de secuencia completa con la SEQ ID NO: 10. En determinadas realizaciones particulares, las variantes HLA-F comparten al menos un 99 % o la homología de secuencia completa con la SEQ ID NO: 12. En determinadas otras realizaciones, las variantes HLA-G comparten al menos un 98 %, un 99 % o la homología de secuencia completa con la SEQ ID NO: 14.

En determinadas otras realizaciones, la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I comprende B2M de longitud completa (SEQ ID NO: 2) (incluida su secuencia líder) y una cadena a de HLA sin la secuencia líder (cadena a de HLA sin líder); mientras que en algunas otras realizaciones, la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I comprende la proteína B2M (s Eq ID NO: 2) sin la secuencia líder. Se entiende que las célulasB2M-/-que expresan dos, tres o más tipos diferentes de proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I en cualquier combinación, por ejemplo, que expresan una fusión SC que comprende HLA-A (SEQ ID NO: 4) (o un HLA-A sin líder) y una fusión SC que comprende HLA-E (SEQ ID NO: 10) (o un HLA-E sin líder), o que expresan una fusión SC que comprende HLA-B (SEQ ID NO: 6) (o un HLA-B sin líder), una fusión SC que comprende h La -E (SEQ ID NO: 10) (o un h La -E sin líder) y fusión SC que comprende HLA-G (SEQ ID NO: 14) (o un HLA-G sin líder), etc., están todas contempladas por la invención y se encuentran dentro del alcance de la invención.

Los linfocitos citolíticos naturales (NK) son parte de la respuesta inmunitaria innata. Varios patógenos pueden disminuir la expresión de la proteína HLA de clase I en células infectadas. Las células NK controlan la infección mediante el reconocimiento y la inducción de la apoptosis en células que no expresan proteínas HLA de clase I. Los receptores inhibidores en la superficie de las células NK reconocen los alelos de la cadena a de HLA de clase I previniendo así la apoptosis medicada por NK en células normales no infectadas. Por lo tanto, en determinadas realizaciones particulares, la proteína de fusión monocatenaria HLA-I inhibe la destrucción mediada por células NK de células que no expresan proteínas HLA de clase I endógenas mediante la unión a los receptores inhibidores de las células Nk . Por ejemplo, HLA-E es un ligando para el receptor CD94/NKG2 de las células<n>K que inhibe la apoptosis mediada por células NK. Por lo tanto, en determinadas realizaciones particulares, la célulaB2M-/-expresa la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I que comprende al menos una parte de B2M y al menos una parte de HLA-E. Además, HLA-G normalmente se expresa en la superficie de los citotrofoblastos placentarios que no expresan HLA-A, B o C, y protege estas células de la lisis mediada por células NK mediante la interacción con el receptor inhibidor ILT2 (LIR1) en las células NK (Pazmanyet al.,1996, Science274,792-795). Por lo tanto, en determinadas realizaciones preferidas diferentes, la célulaB2M-/-expresa la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I que comprende al menos una parte de B2M y al menos una parte de HLA-G.

HLA-A0201 (SEQ ID NO: 4) es un alelo HLA de clase I común que se encuentra en un gran porcentaje de la población de Estados Unidos. Otros alelos comunes incluyen, sin limitación, HLA-A0101, HLA-A0301, HLA-B0702, HLA-B0801, HLA-C0401, HLA-C0701 y HLA-C0702.

En determinadas realizaciones adicionales, la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I también comprende un segundo antígeno peptídico diana que ocupa la hendidura de unión a péptido de la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I, en donde el antígeno peptídico está unido covalentemente a la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I (también denominada construcción trimérica). Un ejemplo de la construcción trimérica se muestra en lafigura 2. La construcción HLA-bGBE de lafigura 2comprende B2M y HLA-E unidos covalentemente a un antígeno peptídico (tal como, pero sin limitación, el péptido señal HLA-G como se ilustra en la figura) (SEQ ID NO: 23) diseñado para ocupar la hendidura de unión a péptido de la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I. En determinadas otras realizaciones, el antígeno peptídico unido covalentemente se escinde mediante un sitio de escisión de proteasa incorporado, y el antígeno peptídico escindido puede unirse a la hendidura de unión peptídica de la proteína de fusión monocatenaria HLA-I para su presentación.

En determinadas realizaciones alternativas, el antígeno peptídico que ocupa la hendidura de unión peptídica de la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I se produce mediante la vía de procesamiento del antígeno intracelular, en la que el antígeno peptídico se produce por el proteosoma, se transporta y se carga en la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I en el retículo endoplásmico. En determinadas realizaciones particulares, el antígeno peptídico comprende un péptido de un antígeno tumoral. En determinadas otras realizaciones, el antígeno peptídico comprende un péptido de una proteína de un patógeno que incluye, sin limitación, una bacteria, un virus, un hongo y un parásito. En realizaciones adicionales, el antígeno peptídico comprende un péptido de un antígeno tumoral. En determinadas realizaciones particulares, la célula deficiente en HLA de clase I o la célula deficiente en HLA de clase I/clase II expresa una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I que está unida covalentemente a un péptido que no comprende un autoantígeno o neoantígeno para el paciente. Está dentro de la capacidad de un experto diseñar la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I y el antígeno peptídico presentado en ella para modular la respuesta inmunitaria que puede provocarse en un receptor.

Las células aisladas deficientes en HLA de clase II o las células deficientes en HLA de clase I/clase II que expresan una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II y una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I como se define en las reivindicaciones, que comprenden un antígeno peptídico específico unido de forma covalente o no covalente a las proteínas de fusión monocatenarias se pueden utilizar, por ejemplo, para su administración a un receptor para provocar una respuesta inmunitaria. Por consiguiente, en un aspecto relacionado, la invención proporciona una vacuna que comprende la célula aislada de la invención, en donde la vacuna es capaz de provocar en un receptor una respuesta inmunitaria específica para el antígeno peptídico diana. La respuesta inmunitaria incluye, sin limitación, una respuesta inmunitaria celular y/o una respuesta inmunitaria humoral. La vacuna puede comprender una célula madre o una célula diferenciada; en determinadas realizaciones particulares, la célula es una célula dendrítica diferenciada. En determinadas otras realizaciones, la célula expresa además una citocina. Se puede utilizar cualquier citocina adecuada; en determinadas realizaciones particulares, la citocina es IL2 o IFN-<y>. En determinadas realizaciones preferidas, la célula es una célula humana y el receptor es un ser humano. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona kits que comprenden las vacunas de la invención y opcionalmente un adyuvante inmunitario.

La proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I, la proteína HLA de clase II o la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II se pueden expresar a partir de un vector de expresión que permite una expresión transitoria o, más preferentemente, una expresión estable de la proteína en una célula. Los vectores de expresión adecuados ilustrativos son conocidos en la materia. Un ejemplo de ello es un vector retrovírico, que es capaz de integrarse en el genoma celular para proporcionar una expresión estable y a largo plazo de un gen exógeno. En determinadas realizaciones particulares, el vector vírico procede del espumavirus humano, un tipo de retrovirus. Otros vectores víricos adecuados incluyen, sin limitación, vectores procedentes de retrovirus, virus adenovíricos, virus adenoasociados, lentivirus, virus del herpes simple, virus de la variolovacuna y virus de la viruela.

En determinadas realizaciones preferidas, el polinucleótido capaz de codificar una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I o de clase II o una proteína HLA de clase II está integrado en el cromosoma de las células, preferentemente en los lociB2MoHLAde clase II, para una expresión estable. Por lo tanto, en determinadas realizaciones preferidas, los lociB2Mse alteran mediante la inserción en los lociB2Mdel polinucleótido capaz de codificar una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I para reemplazar la expresión de la proteína B2M endógena de tipo silvestre. Por lo tanto, en determinadas realizaciones preferidas diferentes, determinados lociHLA-IIse alteran mediante la inserción en los lociHLA-IIdel polinucleótido capaz de codificar una proteína HLA de clase II o una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II para reemplazar la expresión de la proteína HLA-II endógena de tipo silvestre. El resultado de dicho direccionamiento genético impide la formación de proteínas HLA de clase I de tipo silvestre y de proteínas HLA de clase II específicas, pero permite la expresión de una proteína HLA de clase II predeterminada o de una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I o de clase II de elección en la superficie de las células que, de otro modo, serían deficientes en HLA de clase II. También se contemplan otros vectores de expresión y la selección del vector de expresión adecuado está dentro de la capacidad de un experto habitual en la materia.

La "célula aislada" puede ser cualquier tipo de célula adecuada para un propósito dado. Por ejemplo, la célula puede ser una célula madre pluripotente o una célula diferenciada. "Una célula madre" abarca ampliamente cualquier célula que sea capaz de una mayor diferenciación. "Una célula madre pluripotente" se refiere a una célula madre que tiene el potencial de diferenciarse en cualquiera de las tres capas germinales: endodermo, mesodermo o ectodermo. "Una célula madre adulta", por otro lado, es multipotente porque sólo puede producir un número limitado de tipos de células. "Una célula madre embrionaria (ES)" se refiere a una célula madre pluripotente procedente de la masa celular interna del blastocisto, un embrión en etapa temprana, en donde no se reivindican células madre embrionarias humanas. Las "células madre pluripotentes inducidas (células iPS, del inglésinduced pluripotent stem)"son células madre pluripotentes procedentes de manera artificial de una célula no pluripotente, normalmente una célula somática adulta, mediante la inducción de manera artificial de la expresión de determinados genes.

En otro aspecto, la invención proporciona las células de la presente invención para su uso en trasplante en un paciente que lo necesita, que comprende la etapa de administrar al paciente una cantidad eficaz de las células de la invención para trasplante. Debido a que las células deficientes en HLA de clase II o las células deficientes en HLA de clase I/clase II de la invención no expresan la proteína HLA de clase II de tipo silvestre (y opcionalmente tampoco la proteína HLA de clase I) en la superficie celular, las células, cuando se administran a un paciente, provocan respuestas inmunitarias mínimas o nulas en el paciente. Por lo tanto, el trasplante de células deficientes en HLA de clase II o células deficientes en HLA de clase I/clase II de la invención limita la necesidad de tomar terapias inmunodepresoras. Por lo tanto, en determinadas realizaciones preferidas, el paciente es inmunocompetente. En determinadas otras realizaciones, la célula es una célula isogénica; mientras que en otras realizaciones, la célula es una célula alogénica.

En determinadas realizaciones adicionales, las células de la invención son células madre pluripotentes; mientras que en otras realizaciones, las células de la invención son células diferenciadas. En determinadas realizaciones preferidas, la célula es una célula humana y el paciente es un paciente humano. En determinadas realizaciones particulares, el método de trasplante comprende administrar a un ser humano una cantidad eficaz de células madre pluripotentes o células diferenciadas. En determinadas realizaciones preferidas, las células de la invención expresan además una o más proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II genomanipuladas y también una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I, como se define en las reivindicaciones. En determinadas otras realizaciones, las células pueden escapar de la destrucción mediada por células NK y provocar una respuesta inmunitaria mínima o nula en el receptor después del trasplante.

El tratamiento de trasplante, el tratamiento de reemplazo o el tratamiento regenerativo se refiere a tratamientos para una enfermedad mediante la administración a un paciente de células o tejidos para reponer o reemplazar funciones celulares defectuosas en un órgano diana. En determinadas realizaciones particulares, la necesidad de un trasplante surge como resultado de lesiones físicas o patológicas a un tejido u órgano. En algunas otras realizaciones particulares, la necesidad de trasplante surge como resultado de uno o más defectos o mutaciones genéticas en el paciente y el trasplante de las células de la invención repone o reemplaza funciones celulares defectuosas en el paciente sin necesidad de tratamiento génico para corregir la mutación genética subyacente del paciente. En determinadas realizaciones adicionales, el trasplante incluye, sin limitación, el trasplante de células madre hematopoyéticas, o el trasplante de células que se incorporan a un órgano tal como el hígado, riñón, páncreas, pulmón, cerebro, músculo, corazón, tubo gastrointestinal, sistema nervioso, piel, huesos, médula ósea, grasa, tejido conjuntivo, sistema inmunitario o vasos sanguíneos. En determinadas realizaciones particulares, el órgano diana es un órgano sólido.

En determinadas realizaciones particulares, las células administradas al receptor pueden incorporarse o no a un órgano que necesite dicho tratamiento. En determinadas realizaciones, las células de la invención se diferencian en el tipo de célula deseado, ya sea antes o después del trasplante, y proporcionan la función celular necesaria sin incorporarse al tejido en el lugar del trasplante. Por ejemplo, en determinadas realizaciones para tratar la diabetes, las células de la invención, ya sean células madre pluripotentes o células p de los islotes de Langerhans diferenciadas, se trasplantan a un paciente diabético. Las células trasplantadas no necesitan reconstituir un páncreas funcional: sólo necesitan secretar insulina en respuesta a los niveles de glucosa. En determinadas realizaciones particulares, las células se trasplantan en una ubicación ectópica y no se incorporan completamente al páncreas. La invención contempla el trasplante de células pluripotentes de la invención, células diferenciadas de la invención, o un tejido diferenciado y desarrolladoex-vivoa partir de las células de la invención. En determinadas realizaciones preferidas, la célula es una célula humana y el paciente es un paciente humano. En determinadas realizaciones preferidas diferentes, las células de la invención expresan una o más proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II y también proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase I, como se define en las reivindicaciones.

En un aspecto adicional, la invención proporciona las células de la presente invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un paciente que lo necesita, que comprende la etapa de administrar al paciente una cantidad eficaz de la célula de la invención para tratar la enfermedad, en donde la enfermedad es diabetes, una enfermedad autoinmunitaria, cáncer, infección, anemia, citopenia, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, afección esquelética o articular, osteogénesis imperfecta o quemaduras. En determinadas realizaciones particulares, la enfermedad resulta de lesiones patológicas o físicas a un tejido u órgano. En determinadas realizaciones, las células de la invención son células madre; mientras que en otras realizaciones, las células de la invención son células diferenciadas. En determinadas realizaciones preferidas, la célula es una célula humana y el paciente es un paciente humano. En determinadas realizaciones particulares, la célula humana es una célula diferenciada. La invención también contempla el trasplante de un tejido desarrolladoex-vivoa partir de las células de la invención. En determinadas realizaciones preferidas, las células de la invención expresan además una o más proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II y también una o más proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase I, como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones, la célula es una célula isogénica; mientras que en otras realizaciones, la célula es una célula alogénica.

En determinadas realizaciones particulares, la célula es una célula diferenciada que incluye, sin limitación, una célula dendrítica, linfocito, glóbulo rojo, plaqueta, célula hematopoyética, célula del islote de Langerhans, célula hepática, miocito, queratinocito, cardiomiocito, célula neuronal, célula muscular esquelética, célula ocular, célula mesenquimatosa, fibroblasto, célula pulmonar, célula del tubo gastrointestinal, célula vascular, célula endocrina y adipocito. En algunas otras realizaciones particulares, la invención proporciona las células de la presente invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un órgano sólido. En determinadas realizaciones, las células de la invención utilizadas en el tratamiento de una enfermedad expresan una o más proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II y también una o más proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase I.

"Tratar" a un paciente que padece una enfermedad o trastorno significa lograr uno o más de los siguientes: (a) reducir la intensidad de la enfermedad; (b) detener el desarrollo de la enfermedad o trastorno; (c) inhibir el empeoramiento de la enfermedad o trastorno; (d) limitar o prevenir la recidiva de la enfermedad o trastorno en pacientes que han tenido previamente la enfermedad o trastorno; (e) provocar la regresión de la enfermedad o trastorno; (f) mejorar o eliminar los síntomas de la enfermedad o trastorno; y (f) mejorar la supervivencia. En determinadas realizaciones preferidas, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno que puede tratarse mediante trasplante de tejidos o células.

La cantidad eficaz de las células aisladas de la invención para su uso en trasplantes o para tratar una enfermedad depende de varios factores, tales como el tipo de tejido, la intensidad de la patología, la reacción del trasplante, el motivo del trasplante, y la edad y estado de salud general del paciente. La cantidad eficaz la puede determinar un investigador o médico experto mediante la práctica habitual. Debido a la reducida inmunogenia de las células trasplantadas, un paciente puede tolerar una cantidad relativamente grande de células para lograr los efectos terapéuticos deseados. De manera alternativa, las células se pueden trasplantar repetidamente a intervalos hasta que se logre el efecto terapéutico deseado.

La vía de administración de las células de la invención no está limitada de ninguna manera particular. Las vías de administración ilustrativas incluyen, sin limitación, la vía intravenosa, intramuscular, subdérmica, intraperitoneal, transcutánea, intracutánea y subcutánea. Las células de la presente invención también se pueden administrar mediante inyección. Por ejemplo, las células se pueden inyectar en una articulación lesionada, un hueso fracturado, un sitio de infarto, un sitio isquémico o su periferia.

En determinadas realizaciones particulares, las células se administran a través de un dispositivo de administración que incluye, sin limitación, una jeringuilla. Por ejemplo, las células se pueden suspender en una solución o una composición farmacéutica contenida en dicho dispositivo de administración. La "solución" o "composición farmacéutica" comprende un tampón fisiológicamente compatible y opcionalmente un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en el que las células de la invención permanecen viables. El uso de dichos vehículos y diluyentes es bien conocido en la materia. La solución incluye, sin limitación, tampones fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hank, solución de Ringer o solución salina fisiológicamente tamponada. Las células pueden mantenerse en la solución o composición farmacéutica para almacenamiento a corto plazo sin perder su viabilidad. En determinadas realizaciones particulares, las células se congelan para su almacenamiento a largo plazo sin perder su viabilidad de acuerdo con métodos de crioconservación bien conocidos en la materia.

Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carmelosa sódica, sorbitol o dextrano, pero sigue siendo líquido hasta el punto de que se puede administrar fácilmente mediante inyección con jeringuilla. La solución es preferentemente estéril, estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y está libre de contaminación por microorganismos mediante el uso de, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. Las células contenidas en la solución pueden ser células madre o células diferenciadas como se describe en el presente documento, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y, según sea necesario, otros ingredientes indicados anteriormente.

Las células pueden administrarse de manera sistémica(por ejemplo,por vía intravenosa) o de manera local(por ejemplo,directamente en un defecto miocárdico con la guía de un ecocardiograma, o mediante la aplicación directa a tejidos u órganos dañados accesibles durante una cirugía abierta). Para la inyección, las células pueden estar en una preparación de suspensión líquida inyectable o en un medio biocompatible que es inyectable en forma líquida y se vuelve semisólido en el sitio del tejido dañado. Se puede utilizar una jeringuilla, un dispositivo de administración endoscópico controlable u otros dispositivos similares siempre que la luz de la aguja tenga un diámetro suficiente(por ejemplo,al menos calibre 30 o más) para evitar daños físicos a las células durante la administración.

En determinadas otras realizaciones, las células se pueden trasplantar a través de un soporte sólido,por ejemplo,una superficie plana o una matriz tridimensional. La matriz o superficie plana se implanta quirúrgicamente en el sitio adecuado en un paciente. Por ejemplo, a un paciente que necesita un injerto de páncreas se le pueden implantar quirúrgicamente células diferenciadas en un soporte sólido en el tejido del páncreas. El soporte sólido ilustrativo incluye, sin limitación, un parche, una matriz de gel (tal como GELFOAM®de Pharmacia-Upjohn), implantes de esponja de alcohol polivinílico (PVA)-gel de colágeno (tal como IVALON, Unipoint Industries, High Point, NC) y otros dispositivos similares o equivalentes. Se puede utilizar una variedad de otras tecnologías de encapsulación con las células de la invención, por ejemplo, el documento WO 91/10470; el documento WO 91/10425; la patente de EE. UU. n.° 5.837.234; la patente de EE. UU. n.° 5.011.472; y la patente de EE. UU. n.° 4.892.538).

Las células de la invención se pueden diferenciar en varios tipos de células de los tres linajes, incluidas, sin limitación, células hematopoyéticas, mesenquimatosas, del endodermo pancreático, cardíacas y queratinocitos. En determinadas realizaciones, la célula diferenciada expresa además una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II y también una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I, como se define en las reivindicaciones. En general, cada tipo de célula se puede analizar para determinar la expresión de proteínas HLA de clase II y opcionalmente también de clase I, la reactividad con linfocitos T humanos y células NK, los marcadores de diferenciación adecuados y el xenotrasplante en ratones inmunodeficientes para examinar potencial de desarrolloin vivo.A continuación se describe brevemente cada tipo de célula diferenciada.

En determinadas realizaciones, las células de la invención se pueden diferenciar en células hematopoyéticas para tratar diversas enfermedades hematopoyéticas actualmente tratadas mediante trasplante de médula ósea. Los pacientes que reciben transfusiones pueden volverse resistentes a las transfusiones de plaquetas debido a incompatibilidades de HLA. Los pacientes anémicos o citopénicos se pueden tratar mediante la administración de los eritrocitos, plaquetas o neutrófilos procedentes de las células de la invención para tratar hemorragias o infecciones.

Además, las células dendríticas procedentes de las células madre de la invención son células presentadoras de antígenos que se pueden utilizar como vacunas celulares cuando se genomanipulan de manera adecuada. En determinadas realizaciones, las células de la invención genomanipuladas para expresar una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II y también una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I, como se define en las reivindicaciones, y un antígeno peptídico único se utilizan para vacunar contra antígenos patógenos o tumorales específicos. En determinadas otras realizaciones, para eliminar células infectadas o células tumorales se utilizan linfocitos citotóxicos diferenciados deficientes en HLA de clase II o deficientes en HLA de clase I/clase II con reactividad restringida en HLA contra antígenos específicos.

Para obtener células hematopoyéticas, primero se permite que las células pluripotentes formen cuerpos embrioides, posteriormente, las células no adherentes se cultivaron en presencia de citocinas hematopoyéticas para desarrollarse en linajes celulares específicos. La diferenciación de células hematopoyéticas a partir de las células de la invención que expresan una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase II y también una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I, como se define en las reivindicaciones, se puede analizar mediante citometría de flujo y ensayos de colonias. Las diferentes poblaciones de células se clasifican según sus marcadores de superficie y se utilizan para controlar la expresión de genesHLAy la reactividad con células NK humanas y linfocitos T medida mediante Elispot, reacciones mixtas de linfocitos y ensayos de citotoxicidad. La eficacia de las construcciones HLA de fusión monocatenarias en la supresión de la destrucción mediada por células NK se puede examinar en diferentes etapas de diferenciación y trasplante. Véase Bixet al.,1991, Nature349,329-331. Las células madre hematopoyéticas también se pueden analizar utilizando modelos de xenotrasplante en, por ejemplo, ratones inmunodeficientes (células repobladoras de SCID o SRC).

Las células de la invención se pueden diferenciar en células hematopoyéticas antes o después de que las células se administren a un paciente. En determinadas realizaciones preferidas, la célula es una célula humana y el paciente es un humano. La diferenciación hematopoyéticain vitrose puede realizar de acuerdo con protocolos establecidos. Véase, por ejemplo, Slukvinet al.,2006, J Immunol176:2924-32y Changet al.,2006, Blood 108:1515-23.

En determinadas otras realizaciones, las células de la invención se pueden diferenciar en células madre mesenquimatosas. En determinadas realizaciones, las células de la invención expresan una o más proteínas HLA de clase II o proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II y también una o más proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase I, como se define en las reivindicaciones. Las MSC tienen el potencial de formar varios tipos de células diferenciadas, incluidas las células del estroma de la médula, adipocitos, osteoblastos y condrocitos. Por lo tanto, inducir células madre pluripotentes para que formen MSC (iMSC) es útil en el tratamiento de afecciones esqueléticas y articulares. Las iMSC se pueden diferenciar aún más en osteoblastos y formar huesoin vivo.Deyleet al.,2012, Mol Ther. 20(1):204-13. Se pueden examinar las respuestas celulares de linfocitos T y células NK a las ESC, iMSC y sus derivados más diferenciados terminalmente, como los osteoblastos.

En determinadas realizaciones particulares, las células madre mesenquimatosas son capaces de diferenciarse en ejemplos no limitantes de tipos de células, tales como células del estroma de la médula, adipocitos, osteoblastos, osteocitos y condrocitos. Las células de la invención se diferencian en células madre mesenquimatosas antes o después de que se administren las células a un paciente. En determinadas realizaciones preferidas, la célula es una célula humana y el paciente es un humano. La diferenciación mesenquimatosain vitrose puede realizar de acuerdo con protocolos establecidos. Véase, por ejemplo, Deyleet al.,anteriormente citado.

Incluso en otras realizaciones particulares, las células de la invención se pueden diferenciar en células de los islotes de Langerhans productoras de insulina. En determinadas realizaciones, las células de la invención expresan una o más proteínas HLA de clase II o proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II y también una o más proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase I, como se define en las reivindicaciones. Las células de la invención se pueden utilizar para tratar la diabetes de tipo 1. De manera ventajosa, las células trasplantadas no necesitan reconstituir un páncreas funcional: sólo necesitan secretar insulina en respuesta a los niveles de glucosa. Por tanto, el tratamiento puede tener éxito con diferentes dosis de células, con células que no están perfectamente diferenciadas en tipos de células adultas y cuando las células se trasplantan en una ubicación ectópica. Los autoantígenos específicos como los procedentes de GAD65 o la insulina pueden provocar destrucción autoinmunitaria de las células p en la diabetes (Di Lorenzoet al.,2007, Clin Exp Immunol148,1-16). Por lo tanto, las células deficientes en HLA de clase II o deficientes en HLA de clase I/clase II que expresan una proteína HLA de fusión monocatenaria que presentan un antígeno peptídico predeterminado proporcionan ventajas adicionales porque no presentan estos autoantígenos y pueden evitar el rechazo autoinmunitario y prevenir una recaída de la diabetes después del trasplante.

Las células de la invención se pueden diferenciar en células pancreáticas como se describió anteriormente, que emplea la exposición de las células a diferentes citocinas y fármacos para promover la formación secuencial del mesendodermo, endodermo definitivo y progenitores pancreáticos (Kroonet al.,2008, Nat Biotechnol26,443-452). Estas células se pueden cultivar aún más en implantes en ratones inmunodeficientes. Las células de la invención, como se define en las reivindicaciones, se pueden analizar en diferentes etapas de desarrollo para determinar su reactividad con linfocitos T y células NK.

Las células de la invención se diferencian en células de los islotes de Langerhans antes o después de la administración al paciente. En determinadas realizaciones preferidas, la célula es una célula humana y el paciente es un humano. La diferenciación hematopoyéticain vitrose puede realizar de acuerdo con protocolos establecidos. Véase, por ejemplo, Kroonet al.,2008, Nat Biotechnol 26, 443-452.

En algunas otras realizaciones particulares, las células de la invención se pueden diferenciar en cardiomiocitos. En determinadas realizaciones, las células de la invención expresan además una o más proteínas HLA de clase II o proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II y también una o más proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase I, como se define en las reivindicaciones. Los problemas clínicos comunes del infarto de miocardio y la insuficiencia cardíaca congestiva se pueden tratar mediante el trasplante de cardiomiocitos sanos procedentes de células madre que se injertan y restablecen el miocardio funcional. Los cardiomiocitos derivados de las células de la invención permiten realizar estos tratamientos con células preenvasadas y evitar la inmunodepresión que actualmente requieren los alotrasplantes de corazón. Se pueden realizar pruebas fisiológicamente relevantes en los cardiomiocitos procedentes de las células de la invención, tal como estudios de conducción y contracción eléctrica. Se pueden analizar células madre deficientes en HLA de clase II o deficientes en HLA de clase I/clase II o cardiomiocitos diferenciados que expresan una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I para determinar su reactividad inmunitaria cuando expresan genes de cardiomiocitos y para establecer qué modificaciones de HLA minimizan estas respuestas inmunitarias.

Las células de la invención se pueden diferenciar en cardiomiocitos antes o después de que se administren las células a un paciente. En determinadas realizaciones preferidas, la célula es una célula humana y el paciente es un humano. En determinadas realizaciones, las células de la invención se diferencian en cardiomiocitos para tratar enfermedades que incluyen, sin limitación, infarto de miocardio e insuficiencia cardíaca congestiva. La diferenciación de cardiomiocitosin vitrose puede realizar de acuerdo con protocolos establecidos. Véase, por ejemplo, Laflammeet al.,2007, Nat Biotechnol25,1015-1024.

Incluso en otras realizaciones particulares, las células de la invención se pueden diferenciar en queratinocitos. En determinadas realizaciones, las células de la invención utilizadas para la diferenciación en queratinocitos expresan una o más proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II y también una o más proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase I, como se define en las reivindicaciones. Las quemaduras graves y las afecciones genéticas de la piel necesitan tratamiento con injertos de piel, y esto se realiza actualmente con una variedad de fuentes celulares, tales como injertos de piel porcina y queratinocitos humanos autólogos cultivados. Los queratinocitos procedentes de las células de la invención pueden proporcionar un avance clínico importante, ya que las quemaduras podrían tratarse como una emergencia con células preenvasadas, y las enfermedades genéticas, como la epidermólisis ampollosa, pueden tratarse con células deficientes en HLA de clase II o deficientes en HLA de clase I/clase II normales que no requieren corrección de las mutaciones genéticas responsables. En muchos casos, las células sólo necesitan injertarse el tiempo suficiente para que las células hospedadoras vecinas repoblen la zona afectada. Para la diferenciaciónin vivo,las células de la invención se pueden incrustar en implantes de esponja de alcohol polivinílico (PVA)-gel de colágeno para su trasplante en un receptor. Las células de la invención se pueden diferenciar en queratinocitos antes o después del trasplante. En determinadas realizaciones preferidas, la célula es una célula humana y el paciente es un humano.

Además, las células de la invención pueden servir como una herramienta de investigación para proporcionar un sistema para estudiar las funciones de las proteínas inmunorreguladoras en un acervo genético deficiente en HLA de clase II o deficiente en HLA de clase I/clase II. En determinadas realizaciones, las células de la invención expresan además una o más proteínas HLA de clase II o proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II y también una o más proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase I, como se define en las reivindicaciones. Por consiguiente, en un aspecto relacionado, la invención proporciona un método para determinar la función de una proteína inmunorreguladora que comprende las etapas de introducir uno o más genes inmunorreguladores en las células de la invención y analizar las actividades de los genes inmunorreguladores. Por ejemplo, las células de la invención se pueden utilizar para estudiar la función de un gen regulador inmunitario, o para estudiar una respuesta inmunitaria, en ausencia de antígenos HLA de clase II o antígenos HLA de clase I/clase II no deseados. En un aspecto relacionado adicional, la invención proporciona un método para identificar un compuesto o molécula que modula la función de la proteína inmunorreguladora que comprende las etapas de poner en contacto las células deficientes en HLA de clase II o células deficientes en HLA de clase I/clase II que comprenden el uno o más genes inmunorreguladores con un compuesto o molécula de interés y analizar las actividades de los genes inmunorreguladores.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona kits que comprenden las células deficientes en HLA de clase II o deficientes en HLA de clase I/clase II de la invención y un implante, en donde el implante comprende las células de la invención.

En otro aspecto más, la invención proporciona las células de la invención para su uso en una herramienta de investigaciónin vivoen un mamífero, en particular, en un primate no humano, en donde las células de la invención se administran para estudiar las funciones de genes inmunorreguladores, o para identificar un compuesto que module la función de un gen inmunorregulador en las células administradas en un acervo genético deficiente en HLA de clase II, deficiente en HLA de clase I o deficiente en HLA de clase I/clase II. En determinadas realizaciones, las células de la invención expresan además una o más proteínas HLA de clase II o proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II y también una o más proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase I.

Se han utilizado ratones, en especial ratones inmunodeficientes, como sistema modelo para estudiar células humanasin vivo.Las células madre humanas pueden comportarse de manera diferente en ratones. Además, los sistemas inmunitarios del ratón y del ser humano tienen diferentes genesHLAde clase II, receptores de células NK y genesMHCde clase I no clásicos(por ejemplo,HLA-E, F y G). Por tanto, se puede desarrollar un modelo deMacaca nemestrina(Mn, macaco de cola de cerdo) para estudiar las células de la invención. Se ha secuenciado el genoma deMacaca mulatta,que es altamente homólogo al genoma denemestrina.Además, la organización de los lociMHCde macaco es similar a la del HLA humano, incluidos los genes no clásicos. Se han identificado en macacos homólogos de los genes humanosHLA-EyHLA-G.Los lociMHCde macaco también contienen homólogos de muchos receptores de células NK humanas. Las ESC humanas y Mn deficientes en HLA de clase II, deficientes en HLA de clase I o deficientes en HLA de clase I/clase II se pueden utilizar para trasplantes en macacos.

Las ESC de macaco deficientes en MHC de clase II o deficientes en MHC de clase I/clase II se pueden desarrollar con la misma estrategia de direccionamiento de genes mediada por AAV descrita para células humanas. Las versiones paraMnde las proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase II y, opcionalmente, las proteínas de fusión monocatenarias HLA de clase I, se expresan en las ESC de macacos deficientes en HLA de clase II o HLA de clase II/clase I con los vectores víricos análogos como se describió anteriormente.

Las células se pueden expandirin vitroy marcar con un vector que expresa GFP para la posterior identificación de las células trasplantadas. Las células se pueden incrustar en implantes de esponja de alcohol polivinílico (PVA)-gel de colágeno y colocarse por vía subdérmica en macacos. Los implantes se pueden extraer, seccionar y teñir para determinar los tipos de células que están presentes. Se pueden utilizar anticuerpos específicos para identificar los tipos de células diferenciadas formadas por las células trasplantadas.

Todas y cada una de las realizaciones descritas anteriormente se aplican a todos y cada uno de los aspectos de la invención, salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Todas las realizaciones dentro y entre diferentes aspectos se pueden combinar a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

Ejemplos

Ejemplo 1 Construcción de células madre embrionarias humanas con mutación inactivada en el gen RFXANK

En la figura 1 se muestra la estructura de dos vectores ilustrativos de virus adenoasociados (AAV) dirigidos a genes, diseñados para insertar un genTKNeo(AAV-RFXANK-ETKNpA) oHyTK(AAV-RFXANK-HyTK) controlado por un promotor EFIalfa (EF) en el exón 3 del genRFXANK,que también se muestra debajo de los vectores. La selección de células infectadas por vectores con G418 o higromicina (Higro) permite aislar las células diana de los vectores TKNeo o HyTK, respectivamente. La expresión posterior de la recombinasa Cre y la selección con ganciclovir (GCV) permiten aislar clones que han eliminado los genesTKNeooHyTK,dejando dos alelos de RFXANK inactivados con codones de parada en los 3 marcos de lectura, un sitio loxP y un sitio de poliadenilación (StopX3-loxP-pA). LoxP es el sitio de recombinación de la recombinasa Cre. ITR (del inglésinverted terminal repeat)es una repetición terminal invertida vectorial. Se podrían diseñar vectores similares para dirigirse a otros genes.

Se utilizó el vector AAV-RFXANK-ETKNpA (SEQ ID NO: 56) para crear una mutación inactivada en un primer alelo del genRFXANK.Se infectaron células madre embrionarias humanas con AAV-RFXANK-ETKNpA y se examinaron para determinar su direccionamiento mediante PCR utilizando un cebador directo homólogo a la secuencia de neomicina del casete de selección y un cebador inverso homólogo al genRFXANKque estaba fuera del brazo de homología de direccionamiento, como lo indican las flechas de arriba. Como se muestra en lafigura 2, arriba se muestran 5 clones positivos del tamaño correcto de 40 clones seleccionados, lo que arroja una frecuencia de selección del 12,5%.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula aislada que comprende una alteración genomanipulada en todas las copias de un gen relacionado con el antígeno leucocitario humano, HLA, de clase II, en donde la célula es una célula humana, en donde:

a) el gen relacionado con HLA de clase II se selecciona del grupo que consiste en proteína que contiene anquirina asociada al factor regulador X de SEQ ID NO: 24 a 27, factor regulador 5 de SEQ iD NO: 28 a 31, proteína asociada al factor regulador X de SEQ ID NO: 32 a 33, transactivador de clase II de SEQ ID NO: 34 a 35; y

b) la célula comprende además uno o más polinucleótidos, y en donde el uno o más polinucleótidos es capaz de codificar una proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I, en donde la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I comprende al menos una parte de la B2M de SEQ ID NO: 2 unida covalentemente a al menos una parte de una cadena a de HLA de clase I seleccionada del grupo que consiste en HLA-E SEQ ID NO: 10, HLA-F SEQ ID NO: 12 y HLA-G SEQ ID NO: 14; y

c) la célula comprende además una alteración genomanipulada en el gen de la microglobulina p<2>,B2M,de SEQ ID NO: 1; y

e) en donde se excluyen células madre embrionarias humanas.

2. La célula de la reivindicación 1, en donde el gen relacionado con HLA de clase II es una proteína que contiene anquirina asociada al factor regulador X de SEQ ID NO: 24 a 27.

3. La célula de la reivindicación 1, en donde la célula expresa además un antígeno peptídico diana que se presenta mediante la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I en la superficie celular.

4. La célula de la reivindicación 3, en donde el antígeno peptídico diana está unido covalentemente a la proteína de fusión monocatenaria HLA de clase I.

5. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la célula comprende además uno o más genes recombinantes capaces de codificar un producto génico suicida.

6. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la célula tiene un cariotipo normal.

7. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la célula es una célula no transformada.

8. Una célula como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en trasplante en un paciente que lo necesita, en donde el uso comprende la etapa de administrar al paciente una cantidad eficaz de la célula como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una célula para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el paciente es inmunocompetente.

10. Una célula para su uso de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en donde la célula es una célula diferenciada.

11. Una célula para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde el paciente es un ser humano.