JP6830437B2

JP6830437B2 - 疾患を処置するための遺伝子改変された細胞、組織および臓器

Info

Publication number: JP6830437B2
Application number: JP2017530596A
Authority: JP
Inventors: バーナードジェイ．へリング，; クリストファーブルラク，
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 2014-12-10
Filing date: 2015-12-10
Publication date: 2021-02-17
Anticipated expiration: 2035-12-10
Also published as: JP2021166542A; CN107249318A; CN116059378A; JP2018500897A; EP3229586A4; US20220104467A1; US9888673B2; AU2015360502A1; AU2022201329B2; WO2016094679A1; JP2020096632A; US11234418B2; CA2969847A1; EP3229586A1; KR20170092692A; CN113699116A; JP2021126129A; AU2022201307A1; US20180092338A1; KR102656470B1

Description

相互参照
本願は、２０１４年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／０９０，０３７号、および２０１５年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２５３，４９３号の利益を主張し、これら両者の全体が本明細書中に参照によって組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１５年１２月１０日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、４７１９０−７０１．６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは６８１，４４４バイトである。

ヒトなどのレシピエントにおける移植のために利用可能な臓器、組織または細胞は不足している。ヒト中への臓器、組織または細胞の異種移植または同種移植は、この要求を満たす潜在力を有し、毎年数十万もの人々を助けている。非ヒト動物が、ヒトとのそれらの解剖学的および生理学的類似性に基づいて、臓器ドナーとして選択され得る。さらに、異種移植は、ヒトだけでなく獣医学適用においても意義を有する。

しかし、未改変の野生型非ヒト動物組織は、ヒトなどのレシピエントによって、免疫系によって拒絶され得る。拒絶は、組織に結合する抗体および細胞媒介性免疫によって少なくとも一部引き起こされて、グラフトの喪失を生じると考えられている。例えば、ブタのグラフトは、適応免疫細胞によって媒介される細胞機構によって拒絶され得る。

参照による組み込み
本明細書中の全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が、具体的かつ個々に参照により組み込まれると示されるのと同じ程度まで、参照により組み込まれる。本明細書中の用語と組み込まれた参考文献中の用語との間に矛盾がある場合には、本明細書中の用語が支配する。

疾患を処置または予防するための組成物および方法が本明細書で開示される。疾患を処置または予防するための、遺伝子改変された細胞および遺伝子改変された細胞を作製する方法もまた開示される。遺伝子改変された非ヒト動物、ならびに、例えば、これらの遺伝子改変された非ヒト動物から細胞、組織または臓器を後に抽出し、それらを対象中に移植することによる、疾患を処置または予防することにおいて使用され得る遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法が、さらに開示される。遺伝子改変された細胞、組織および臓器を使用して疾患を処置または予防するための方法もまた、本明細書で開示される。遺伝子改変された非ヒト動物由来の細胞、組織および／または臓器を使用して疾患を処置または予防するための方法が、さらに開示される。

一態様では、１つまたは複数の第１の遺伝子の低減されたタンパク質発現を有する遺伝子改変された動物であって、遺伝子改変された動物は、ローラシア獣（Ｌａｕｒａｓｉａｔｈｅｒｉａ）上目のメンバーであり、または非ヒト霊長類であり、１つまたは複数の第１の遺伝子は、ａ）主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉ特異的エンハンセオソーム（ｅｎｈａｎｃｅｏｓｏｍｅ）の成分、ｂ）ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーター、および／またはｃ）補体成分３（Ｃ３）を含み、低減されたタンパク質発現は、遺伝子改変されていない対応する動物と比較したものである、遺伝子改変された動物が本明細書で開示される。一部の場合には、ローラシア獣上目のメンバーは、有蹄動物である。一部の場合には、有蹄動物はブタである。一部の場合には、１つまたは複数の第１の遺伝子のタンパク質発現は、遺伝子改変された動物中には存在しない。一部の場合には、タンパク質発現の低減は、１つまたは複数の第１の遺伝子の機能を不活性化する。一部の場合には、遺伝子改変された動物は、２つまたはそれ超の第１の遺伝子の低減されたタンパク質発現を有する。一部の場合には、遺伝子改変された動物は、ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分の低減された発現を含み、ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分は、ＮＯＤ様受容体ファミリーＣＡＲＤドメイン含有５（ＮＬＲＣ５）である。一部の場合には、遺伝子改変された動物は、ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーターの低減された発現を含み、トランスポーターは、抗原プロセシング関連トランスポーター１（ＴＡＰ１）である。一部の場合には、遺伝子改変された動物は、Ｃ３の低減された発現を含む。一部の場合には、遺伝子改変された動物は、３つまたはそれ超の第１の遺伝子の低減されたタンパク質発現を有する。

一部の場合には、遺伝子改変された動物は、１つまたは複数の第２の遺伝子の低減されたタンパク質発現をさらに含み、１つまたは複数の第２の遺伝子は、ａ）ナチュラルキラー（ＮＫ）群２Ｄリガンド、ｂ）ヒトでは発現されない内因性遺伝子、ｃ）ＣＸＣケモカイン受容体（ＣＸＣＲ）３リガンド、および／またはｄ）ＭＨＣＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）を含み、低減されたタンパク質発現は、遺伝子改変されていない対応する動物と比較したものである。一部の場合には、１つまたは複数の第２の遺伝子のタンパク質発現は、遺伝子改変された動物中には存在しない。一部の場合には、タンパク質発現の低減は、１つまたは複数の第２の遺伝子の機能を不活性化する。一部の場合には、遺伝子改変された動物は、ＮＫ群２Ｄリガンドの低減されたタンパク質発現を含み、ＮＫ群２Ｄリガンドは、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）またはＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）である。一部の場合には、遺伝子改変された動物は、ヒトでは発現されない内因性遺伝子の低減されたタンパク質発現を含み、ヒトでは発現されない内因性遺伝子は、糖タンパク質ガラクトシルトランスフェラーゼアルファ１，３（ＧＧＴＡ１）、推定シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ様タンパク質（ＣＭＡＨ）またはβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）である。一部の場合には、遺伝子改変された動物は、ＣＸＣＲ３リガンドの低減されたタンパク質発現を含み、ＣＸＣＲ３リガンドは、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）である。

一部の場合には、遺伝子改変された動物は、１つもしくは複数のタンパク質またはそれらの機能的断片をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、１つまたは複数のタンパク質は、ａ）ＭＨＣＩ形成サプレッサー、ｂ）補体活性化のレギュレーター、ｃ）ＮＫ細胞に対する阻害性リガンド、ｄ）Ｂ７ファミリーメンバー、ｅ）ＣＤ４７、ｆ）セリンプロテアーゼ阻害剤、および／またはｇ）ガレクチンを含む。一部の場合には、１つまたは複数のタンパク質は、ヒトタンパク質である。一部の場合には、遺伝子改変された動物は、ＭＨＣＩ形成サプレッサーをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＭＨＣＩ形成サプレッサーは、感染細胞タンパク質４７（ＩＣＰ４７）である。一部の場合には、遺伝子改変された動物は、補体活性化のレギュレーターをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、補体活性化のレギュレーターは、表面抗原分類４６（ＣＤ４６）、表面抗原分類５５（ＣＤ５５）または表面抗原分類５９（ＣＤ５９）である。一部の場合には、遺伝子改変された動物は、ＮＫ細胞に対する阻害性リガンドをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＮＫ細胞に対する阻害性リガンドは、白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）またはβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）である。一部の場合には、遺伝子改変された動物は、ＨＬＡ−Ｇをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７である。一部の場合には、ＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡ−Ｇ１である。一部の場合には、遺伝子改変された動物は、Ｂ７ファミリーメンバーをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、Ｂ７ファミリーメンバーは、プログラム死−リガンドである。一部の場合には、プログラム死−リガンドは、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）またはプログラム死−リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）である。一部の場合には、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方をコードする。一部の場合には、遺伝子改変された動物は、セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、セリンプロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼ阻害剤９（Ｓｐｉ９）である。一部の場合には、遺伝子改変された動物は、ガレクチンをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、ガレクチンは、ガレクチン−９である。

一部の場合には、遺伝子改変された動物は、ＮＬＲＣ５もしくはＴＡＰ１、Ｃ３の低減されたタンパク質発現、ＣＸＣＬ１０、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよび／もしくはＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減されたタンパク質発現；ならびに／またはＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｅもしくはそれらの機能的断片、ＰＤ−Ｌ１もしくはその機能的断片、ＰＤ−Ｌ２もしくはその機能的断片、および／またはＣＤ４７もしくはその機能的断片をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む。一部の場合には、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、遍在性プロモーターに隣接して挿入される。一部の場合には、遍在性プロモーターは、Ｒｏｓａ２６プロモーターである。一部の場合には、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、標的化遺伝子のプロモーターに隣接して、または標的化遺伝子内に挿入される。一部の場合には、標的化遺伝子は、第１の遺伝子のうちの１つまたは第２の遺伝子のうちの１つである。一部の場合には、１つまたは複数の第１の遺伝子のタンパク質発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して低減される。一部の場合には、１つまたは複数の第２の遺伝子のタンパク質発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して低減される。

別の一態様では、ＮＫ細胞に対する阻害性リガンドまたはその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド、および内因性遺伝子の低減されたタンパク質発現を含む、ローラシア獣上目のメンバーである、または非ヒト霊長類である、遺伝子改変された動物が本明細書で開示され、低減されたタンパク質発現は、遺伝子改変されていない対応する動物と比較したものである。一部の場合には、ＮＫ細胞に対する阻害性リガンドは、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇである。一部の場合には、ＮＫ細胞に対する阻害性リガンドは、ＨＬＡ−Ｇであり、このＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７である。一部の場合には、ＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡ−Ｇ１である。一部の場合には、内因性遺伝子は、ヒトでは発現されない遺伝子である。一部の場合には、内因性遺伝子は、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよび／またはＢ４ＧＡＬＮＴ２である。

一部の場合には、遺伝子改変された動物は、ａ）ＰＤ−Ｌ１もしくはその機能的断片、ｂ）ＰＤ−Ｌ２もしくはその機能的断片、および／またはｃ）ＣＤ４７もしくはその機能的断片、をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。一部の場合には、外因性ポリヌクレオチドは、遍在性プロモーターに隣接して挿入される。一部の場合には、遍在性プロモーターは、Ｒｏｓａ２６プロモーターである。一部の場合には、外因性ポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のプロモーターに隣接して、または内因性遺伝子内に挿入される。一部の場合には、内因性遺伝子のタンパク質発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して低減される。

本出願で開示される２つまたはそれ超の動物を含む遺伝子改変された動物の集団が、本明細書でさらに開示される。一部の場合には、少なくとも２つまたはそれ超の動物は、同一の表現型を有する。一部の場合には、少なくとも２つまたはそれ超の動物は、同一の遺伝子型を有する。

別の一態様では、１つまたは複数の第１の遺伝子の低減されたタンパク質発現を含む、ローラシア獣上目のメンバーまたは非ヒト霊長類由来の遺伝子改変された細胞が本明細書で開示され、１つまたは複数の第１の遺伝子は、ａ）ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分、ｂ）ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーター、および／またはｃ）Ｃ３を含み、低減されたタンパク質発現は、遺伝子改変されていない対応する細胞と比較したものである。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分の低減されたタンパク質発現を含み、ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分は、ＮＬＲＣ５である。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーターの低減されたタンパク質発現を含み、ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーターは、ＴＡＰ１である。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、Ｃ３の低減されたタンパク質発現を含む。

一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、１つまたは複数の第２の遺伝子の低減されたタンパク質発現をさらに含み、１つまたは複数の第２の遺伝子は、ａ）ＮＫ群２Ｄリガンド、ｂ）ヒトでは発現されない内因性遺伝子、ｃ）ＣＸＣＲ３リガンド、および／またはｄ）ＣＩＩＴＡを含み、低減されたタンパク質発現は、遺伝子改変されていない対応する細胞と比較したものである。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、ＮＫ群２Ｄリガンドの低減されたタンパク質発現を含み、ＮＫ群２Ｄリガンドは、ＭＩＣＡおよび／またはＭＩＣＢである。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、ヒトでは発現されない内因性遺伝子の低減されたタンパク質発現を含み、ヒトでは発現されない内因性遺伝子は、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよび／またはＢ４ＧＡＬＮＴ２である。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、ＣＸＣＲ３リガンドの低減されたタンパク質発現を含み、ＣＸＣＲ３リガンドは、ＣＸＣＬ１０である。

一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、１つもしくは複数のタンパク質またはそれらの機能的断片をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、１つもしくは複数のタンパク質またはそれらの機能的断片は、ＭＨＣＩ形成サプレッサー、補体活性化のレギュレーター、ＮＫ細胞に対する阻害性リガンド、Ｂ７ファミリーメンバー、ＣＤ４７、セリンプロテアーゼ阻害剤および／またはガレクチンを含む。一部の場合には、１つもしくは複数のタンパク質またはそれらの機能的断片は、ヒトタンパク質である。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、ＭＨＣＩ形成サプレッサーをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＭＨＣＩ形成サプレッサーは、ＩＣＰ４７である。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、補体活性化のレギュレーターをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、補体活性化のレギュレーターは、ＣＤ４６、ＣＤ５５および／またはＣＤ５９である。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、ＮＫ細胞に対する阻害性リガンドをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＮＫ細胞に対する阻害性リガンドは、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇおよび／またはＢ２Ｍである。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、ＨＬＡ−ＧであるＮＫ細胞に対する阻害性リガンドを含み、ＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６および／またはＨＬＡ−Ｇ７である。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、Ｂ７ファミリーメンバーをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、Ｂ７ファミリーメンバーは、プログラム死−リガンドである。一部の場合には、ＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡ−Ｇ１である。一部の場合には、プログラム死−リガンドは、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）および／またはプログラム死−リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）である。一部の場合には、プログラム死−リガンドは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方である。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、セリンプロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼ阻害剤９（Ｓｐｉ９）である。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、ガレクチンをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、ガレクチンは、ガレクチン−９である。

一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、ＮＬＲＣ５もしくはＴＡＰ１、Ｃ３、ＣＸＣＬ１０、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよび／またはＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減されたタンパク質発現；ならびに／あるいはｉ）ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｅもしくはそれらの機能的断片、ｉｉ）ＰＤ−Ｌ１もしくはその機能的断片、ｉｉｉ）ＰＤ−Ｌ２もしくはその機能的断片、および／またはｉｖ）ＣＤ４７もしくはその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。一部の場合には、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、遍在性プロモーターに隣接して挿入される。一部の場合には、遍在性プロモーターは、Ｒｏｓａ２６プロモーターである。一部の場合には、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドは、標的化遺伝子のプロモーターに隣接して、または標的化遺伝子内に挿入される。一部の場合には、標的化遺伝子は、第１の遺伝子のうちの１つまたは第２の遺伝子のうちの１つである。一部の場合には、１つまたは複数の第１の遺伝子のタンパク質発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して低減される。一部の場合には、１つまたは複数の第２の遺伝子のタンパク質発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して低減される。

別の一態様では、ａ）ＮＫ細胞に対する阻害性リガンドまたはその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド、およびｂ）内因性遺伝子の低減されたタンパク質発現を含む、ローラシア獣上目のメンバーまたは非ヒト霊長類由来の遺伝子改変された細胞が本明細書で開示され、低減されたタンパク質発現は、遺伝子改変されていない対応する細胞と比較したものである。

一部の場合には、ＮＫ細胞に対するこの阻害性リガンドは、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇである。一部の場合には、ＮＫ細胞に対するこの阻害性リガンドは、ＨＬＡ−Ｇであり、ＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７である。一部の場合には、ＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡ−Ｇ１である。一部の場合には、内因性遺伝子は、ヒトでは発現されない。一部の場合には、内因性遺伝子は、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよび／またはＢ４ＧＡＬＮＴ２である。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、ａ）ＰＤ−Ｌ１もしくはその機能的断片、ｂ）ＰＤ−Ｌ２もしくはその機能的断片、および／またはｃ）ＣＤ４７もしくはその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。一部の場合には、外因性ポリヌクレオチドは、遍在性プロモーターに隣接して挿入される。一部の場合には、遍在性プロモーターは、Ｒｏｓａ２６プロモーターである。一部の場合には、外因性ポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のプロモーターに隣接して、または内因性遺伝子内に挿入される。一部の場合には、内因性遺伝子のタンパク質発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して低減される。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、膵、腎臓、眼、肝臓、小腸（ｓｍａｌｌｂｏｗｅｌ）、肺または心臓細胞である。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、膵島細胞である。一部の場合には、膵島細胞は、膵β細胞である。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、脾臓、肝臓、末梢血、リンパ節、胸腺または骨髄細胞である。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、ブタ細胞である。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、萌芽期組織、非ヒト胎仔動物、周産期非ヒト動物、新生仔非ヒト動物、離乳前非ヒト動物、若年成体非ヒト動物または成体非ヒト動物由来である。

別の一態様では、本出願で規定される細胞を含む注射可能な組成物を含む、対象において、移植された細胞、組織または臓器に対する寛容を生じさせることにおける使用に適切なワクチンもまた、本明細書で開示される。本出願に記載される遺伝子改変された細胞を含む寛容化ワクチンもまた、本明細書で開示される。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、アポトーシス性細胞である。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、固定された細胞である。一部の場合には、ワクチンは、固定されていない細胞をさらに含む。一部の場合には、固定された細胞および固定されていない細胞は、遺伝的に同一である。一部の場合には、固定された細胞は、化学物質によって固定され、および／または固定された細胞は、対象において免疫細胞のアネルギーを誘導する。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル（ｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ））カルボジイミド（ＥＣＤＩ）で固定された細胞である。

別の一態様では、本出願に記載される遺伝子改変された細胞を含む組織または臓器が、本明細書で開示される。

別の一態様では、本明細書に記載される遺伝子改変された細胞を含む膵臓または膵島が、本明細書で開示される。

別の一態様では、本明細書に記載される遺伝子改変された細胞および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が、本明細書で開示される。

別の一態様では、それを必要とする対象に移植して、対象において状態を処置することにおける使用のための、遺伝子改変された細胞、遺伝子改変された細胞を含む組織または臓器が本明細書で開示され、対象は、ワクチンの使用によって、遺伝子改変された細胞、組織または臓器に対して寛容化される。一部の場合には、対象には、Ｔ細胞活性化、Ｂ細胞活性化および／または樹状細胞活性化を阻害する１つまたは複数の医薬品が投与される。

別の一態様では、それを必要とする対象において状態を処置するための方法であって、ａ）本出願に記載される遺伝子改変された細胞、組織もしくは臓器を移植するステップ；ｂ）本出願に記載されるワクチンを対象に投与するステップ；および／またはｃ）Ｔ細胞活性化、Ｂ細胞活性化および／もしくは樹状細胞活性化を阻害する１つもしくは複数の医薬品を対象に投与するステップを含む方法が本明細書で開示される。

別の一態様では、それを必要とする対象において状態を処置するための方法であって、ａ）ワクチンを対象に投与するステップ；およびｂ）遺伝子改変された細胞、遺伝子改変された細胞を含む組織または臓器を対象に移植するステップを含む方法が本明細書で開示される。一部の場合には、Ｔ細胞活性化、Ｂ細胞活性化および／または樹状細胞活性化を阻害する１つまたは複数の医薬品を対象に投与するステップ。一部の場合には、移植される遺伝子改変された細胞は、本出願に記載される遺伝子改変された細胞である。一部の場合には、ワクチンは、本出願に記載されるワクチンである。一部の場合には、ワクチンは、対象の体重１ｋｇ当たり、０．００１からまたは約０．００１から１．０までのエンドトキシン単位を含む。一部の場合には、ワクチンは、１μｌ当たり１からまたは約１から１０までの凝集体を含む。一部の場合には、ワクチンは、移植の７日前および移植の１日後に投与される。一部の場合には、ワクチンは、対象の体重１ｋｇ当たり、１×１０^８からまたは約１×１０^８から４×１０^８までの脾細胞または脾臓Ｂ細胞を少なくとも含む。一部の場合には、脾細胞または脾臓Ｂ細胞は、８０％からまたは約８０％から１００％までのＣＤ２１陽性ＳＬＡクラスＩＩ陽性Ｂ細胞を含む。一部の場合には、ワクチンは、静脈内で提供される。一部の場合には、移植された細胞、組織または臓器は、対象に移植された後少なくとも７日間にわたって機能的である。一部の場合には、移植するステップは、異種移植するステップである。一部の場合には、医薬品は、第１の用量の抗ＣＤ４０抗体を含む。一部の場合には、第１の用量は、移植の約８日前に対象に与えられる。一部の場合には、第１の用量は、対象の体重１ｋｇ当たり、３０ｍｇからまたは約３０ｍｇから７０ｍｇまでの抗ＣＤ４０抗体を含む。一部の場合には、方法は、１つまたは複数のさらなる免疫抑制剤を対象に投与するステップをさらに含む。一部の場合には、１つまたは複数のさらなる免疫抑制剤は、Ｂ細胞枯渇化抗体、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦ−アルファ阻害剤、ＩＬ−６阻害剤、補体Ｃ３もしくはＣ５阻害剤、および／またはナイトロジェンマスタードアルキル化剤を含む。一部の場合には、さらなる免疫抑制剤のうちの１つは、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤である。一部の場合には、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤のうちの１つは、シクロホスファミドである。一部の場合には、シクロホスファミドは、ワクチンの投与の２日後または３日後に投与される。

一部の場合には、シクロホスファミドは、５０ｍｇ／ｋｇ／日からまたは約５０ｍｇ／ｋｇ／日から６０ｍｇ／ｋｇ／日までの用量で投与される。一部の場合には、対象は、ヒト対象である。一部の場合には、対象は、非ヒト動物である。一部の場合には、非ヒト動物は、ネコまたはイヌである。一部の場合には、状態は、疾患である。一部の場合には、疾患は、糖尿病である。一部の場合には、糖尿病は、１型糖尿病、２型糖尿病、外科的糖尿病、嚢胞性線維症関連糖尿病および／またはミトコンドリア糖尿病である。

別の一態様では、グラフトに対してレシピエントを免疫寛容化するための方法であって、本出願に記載されるワクチンをレシピエントに提供するステップを含む方法が本明細書で開示される。

別の一態様では、それを必要とする対象において状態を処置するための方法であって、本出願に記載される遺伝子改変された細胞を移植するステップを含む方法が本明細書で開示される。

別の一態様では、それを必要とする対象に移植して、対象において状態を処置することにおける使用のための、本出願に記載される遺伝子改変された細胞、または遺伝子改変された細胞を含む組織もしくは臓器が本明細書で開示され、対象は、本出願に記載されるワクチンによって、遺伝子改変された細胞、組織または臓器に対して寛容化され、Ｔ細胞活性化、Ｂ細胞活性化および／または樹状細胞活性化を阻害する１つまたは複数の医薬品が、対象に投与される。一部の場合には、移植するステップは、異種移植するステップである。

別の一態様では、それを必要とする対象に投与して、対象において状態を処置することにおける使用のための、本出願に記載される遺伝子改変された細胞、または遺伝子改変された細胞を含む組織もしくは臓器が本明細書で開示される。

別の一態様では、グラフトに対してレシピエントを免疫寛容化することにおける使用のための本出願に記載されるワクチンが本明細書で開示される。

別の一態様では、本出願に記載される遺伝子改変された動物を作製するための方法であって、ａ）ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分、ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーターおよび／またはＣ３のうちの１つまたは複数の低減された発現を有する細胞を取得するステップ；ｂ）細胞から胚を生成するステップ；ならびにｃ）胚を、遺伝子改変された動物へと成長させるステップを含む方法が本明細書で開示される。一部の場合には、細胞は接合体である。

別の一態様では、本出願に記載される遺伝子改変された動物を作製するための方法であって、ａ）ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分、ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーターおよび／またはＣ３のうちの１つまたは複数の低減された発現を有する第１の細胞を取得するステップ；ｂ）この第１の細胞の核を第２の細胞に移入して、胚を生成するステップ；ならびにｃ）胚を、遺伝子改変された動物へと成長させるステップを含む方法が本明細書で開示される。一部の場合には、低減は、遺伝子編集によって実施される。一部の場合には、遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して実施される。

本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲で詳細に示される。本発明の特徴および利点のさらに良好な理解は、本発明の原理が利用される、例示的な実施形態を示す、以下の詳細な説明、および添付の図面を参照して得られる。

図１は、免疫療法ストラテジーが、ＭＨＣクラスＩの機能的な発現を欠く遺伝子改変された細胞および臓器グラフトの使用を中心としたことを実証する。グラフト拒絶の予防に必要な維持免疫抑制の必要性は、遺伝子改変された細胞および臓器の移植術が、拮抗性の抗ＣＤ４０抗体の一過性の使用と組み合わされた場合、さらには、抗ＣＤ４０抗体の援護（ｃｏｖｅｒ）のもとでアポトーシス性ドナー細胞を含む寛容化ワクチンの投与と組み合わせた場合でさえ、漸進的に低下される（または細胞および臓器異種グラフトの移植術、ならびに幹細胞由来細胞同種グラフトおよび異種グラフトの移植術の適用性は、漸進的に増大される）。

図２は、遺伝子改変されたブタ膵島細胞および寛容化ワクチンを作製する１つのストラテジーを実証する。ブタの２つのクローン集団を作製する。少なくともＧＧＴＡ１ノックアウトされている１つの集団を使用して寛容化ワクチンを作製してもよい。少なくともＧＧＴＡ１およびＭＨＣＩ遺伝子（例えば、ＮＲＬＣ５）ノックアウトされているブタの他のクローン集団を、細胞、組織、および／または臓器ドナーに使用してもよい。

図３は、陽性および寛容化ワクチン（陰性ワクチンとも呼ばれる）の使用を実証する。

図４は、一過性の免疫抑制の援護のもとで寛容化ワクチン接種のためのアポトーシス性ドナー脾細胞の注入を伴う対象の異種グラフトの生存を延長する例示的なアプローチを実証する。

図５は、異種グラフトレシピエントの慢性および全身性の免疫抑制の非存在下でのレシピエントにおける異種グラフトの拒絶の予防または生存の延長に対する例示的なアプローチを示す。この例示的なアプローチは、以下の３つの構成要素を含み、組み込む：ｉ）αＧａｌ、ＭＨＣクラスＩ、補体Ｃ３およびＣＸＣＬ１０の欠損および／または低減された発現、ならびにＨＬＡ−Ｇのトランスジェニック発現を有する遺伝子操作された膵島；ｉｉ）αＧａｌ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、およびＳｄａ／ＣＡＤの欠損および／または低減された発現、ならびにヒトＣＤ４７、ヒトＰＤ−Ｌ１、ヒトＰＤ−Ｌ２を含むかまたは含まないＨＬＡ−Ｇのトランスジェニック発現を有する遺伝子操作されたドナーのアポトーシス性および非アポトーシス性単核細胞（例えば、脾細胞）（例えば、遺伝子操作されたワクチン）；ならびにｉｉｉ）一過性の免疫抑制、例としては、拮抗性の抗ＣＤ４０ｍＡｂ、抗ＣＤ２０ｍＡｂ、ラパマイシン、および一過性の抗炎症性療法、例としては、コンプスタチン（例えば、コンプスタチン誘導性ＡＰＬ−２）、抗ＩＬ−６受容体ｍＡｂ、および可溶性ＴＮＦ受容体の投与。

図６は、ブタ対カニクイザルの膵島異種移植術における移植拒絶予防についての例示的なプロトコールを実証する。ＩＥ：膵島等価物；ｓＴＮＦＲ：可溶性ＴＮＦ受容体（例えば、エタネルセプト）；α−ＩＬ−６Ｒ：抗インターロイキン６受容体；Ｔｘ’ｄ：移植された。

図７Ａ〜図７Ｅは、ＧＧＴＡ１を標的化するｐｘ３３０−Ｇａｌ２−１プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図７Ａは、ＧＧＴＡ１を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図７Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図７Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図７Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図７Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図７Ａ〜図７Ｅは、ＧＧＴＡ１を標的化するｐｘ３３０−Ｇａｌ２−１プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図７Ａは、ＧＧＴＡ１を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図７Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図７Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図７Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図７Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図７Ａ〜図７Ｅは、ＧＧＴＡ１を標的化するｐｘ３３０−Ｇａｌ２−１プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図７Ａは、ＧＧＴＡ１を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図７Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図７Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図７Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図７Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図７Ａ〜図７Ｅは、ＧＧＴＡ１を標的化するｐｘ３３０−Ｇａｌ２−１プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図７Ａは、ＧＧＴＡ１を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図７Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図７Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図７Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図７Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図７Ａ〜図７Ｅは、ＧＧＴＡ１を標的化するｐｘ３３０−Ｇａｌ２−１プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図７Ａは、ＧＧＴＡ１を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図７Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図７Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図７Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図７Ｅは、シークエンシングの結果を示す。

図８Ａ〜図８Ｅは、ＣＭＡＨを標的化するｐｘ３３０−ＣＭ１Ｆプラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図８Ａは、ＣＭＡＨ１を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図８Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図８Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図８Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図８Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図８Ａ〜図８Ｅは、ＣＭＡＨを標的化するｐｘ３３０−ＣＭ１Ｆプラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図８Ａは、ＣＭＡＨ１を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図８Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図８Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図８Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図８Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図８Ａ〜図８Ｅは、ＣＭＡＨを標的化するｐｘ３３０−ＣＭ１Ｆプラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図８Ａは、ＣＭＡＨ１を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図８Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図８Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図８Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図８Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図８Ａ〜図８Ｅは、ＣＭＡＨを標的化するｐｘ３３０−ＣＭ１Ｆプラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図８Ａは、ＣＭＡＨ１を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図８Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図８Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図８Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図８Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図８Ａ〜図８Ｅは、ＣＭＡＨを標的化するｐｘ３３０−ＣＭ１Ｆプラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図８Ａは、ＣＭＡＨ１を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図８Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図８Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図８Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図８Ｅは、シークエンシングの結果を示す。

図９Ａ〜図９Ｅは、ＮＬＲＣ５を標的化するｐｘ３３０−ＮＬ１＿ＦＩＲＳＴプラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図９Ａは、ＮＬＲＣ５を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図９Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図９Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図９Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図９Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図９Ａ〜図９Ｅは、ＮＬＲＣ５を標的化するｐｘ３３０−ＮＬ１＿ＦＩＲＳＴプラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図９Ａは、ＮＬＲＣ５を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図９Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図９Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図９Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図９Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図９Ａ〜図９Ｅは、ＮＬＲＣ５を標的化するｐｘ３３０−ＮＬ１＿ＦＩＲＳＴプラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図９Ａは、ＮＬＲＣ５を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図９Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図９Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図９Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図９Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図９Ａ〜図９Ｅは、ＮＬＲＣ５を標的化するｐｘ３３０−ＮＬ１＿ＦＩＲＳＴプラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図９Ａは、ＮＬＲＣ５を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図９Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図９Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図９Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図９Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図９Ａ〜図９Ｅは、ＮＬＲＣ５を標的化するｐｘ３３０−ＮＬ１＿ＦＩＲＳＴプラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図９Ａは、ＮＬＲＣ５を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図９Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図９Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図９Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図９Ｅは、シークエンシングの結果を示す。

図１０Ａ〜図１０Ｅは、Ｃ３を標的化するｐｘ３３０／Ｃ３−５プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図１０Ａは、Ｃ３を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図１０Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図１０Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図１０Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図１０Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図１０Ａ〜図１０Ｅは、Ｃ３を標的化するｐｘ３３０／Ｃ３−５プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図１０Ａは、Ｃ３を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図１０Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図１０Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図１０Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図１０Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図１０Ａ〜図１０Ｅは、Ｃ３を標的化するｐｘ３３０／Ｃ３−５プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図１０Ａは、Ｃ３を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図１０Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図１０Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図１０Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図１０Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図１０Ａ〜図１０Ｅは、Ｃ３を標的化するｐｘ３３０／Ｃ３−５プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図１０Ａは、Ｃ３を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図１０Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図１０Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図１０Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図１０Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図１０Ａ〜図１０Ｅは、Ｃ３を標的化するｐｘ３３０／Ｃ３−５プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図１０Ａは、Ｃ３を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図１０Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図１０Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図１０Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図１０Ｅは、シークエンシングの結果を示す。

図１１Ａ〜図１１Ｅは、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２を標的化するｐｘ３３０／Ｂ４１＿第２プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図１１Ａは、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図１１Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図１１Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図１１Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図１１Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図１１Ａ〜図１１Ｅは、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２を標的化するｐｘ３３０／Ｂ４１＿第２プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図１１Ａは、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図１１Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図１１Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図１１Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図１１Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図１１Ａ〜図１１Ｅは、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２を標的化するｐｘ３３０／Ｂ４１＿第２プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図１１Ａは、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図１１Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図１１Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図１１Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図１１Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図１１Ａ〜図１１Ｅは、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２を標的化するｐｘ３３０／Ｂ４１＿第２プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図１１Ａは、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図１１Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図１１Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図１１Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図１１Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図１１Ａ〜図１１Ｅは、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２を標的化するｐｘ３３０／Ｂ４１＿第２プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図１１Ａは、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図１１Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図１１Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図１１Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図１１Ｅは、シークエンシングの結果を示す。

図１２は、実施例２でシークエンシングされたＲｏｓａ２６遺伝子座のマップを実証する。

図１３Ａ〜図１３Ｅは、Ｒｏｓａ２６を標的化するｐｘ３３０／Ｒｏｓａエクソン１プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図１３Ａは、Ｒｏｓａ２６を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図１３Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図１３Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図１３Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図１３Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図１３Ａ〜図１３Ｅは、Ｒｏｓａ２６を標的化するｐｘ３３０／Ｒｏｓａエクソン１プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図１３Ａは、Ｒｏｓａ２６を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図１３Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図１３Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図１３Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図１３Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図１３Ａ〜図１３Ｅは、Ｒｏｓａ２６を標的化するｐｘ３３０／Ｒｏｓａエクソン１プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図１３Ａは、Ｒｏｓａ２６を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図１３Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図１３Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図１３Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図１３Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図１３Ａ〜図１３Ｅは、Ｒｏｓａ２６を標的化するｐｘ３３０／Ｒｏｓａエクソン１プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図１３Ａは、Ｒｏｓａ２６を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図１３Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図１３Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図１３Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図１３Ｅは、シークエンシングの結果を示す。図１３Ａ〜図１３Ｅは、Ｒｏｓａ２６を標的化するｐｘ３３０／Ｒｏｓａエクソン１プラスミドをクローニングするためのストラテジーを実証する。図１３Ａは、Ｒｏｓａ２６を標的化するガイドＲＮＡを作製するためのクローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドを示す。図１３Ｂは、ｐｘ３３０プラスミド上の挿入部位を示す。図１３Ｃは、クローニングおよび確証ストラテジーを実証するフローチャートを示す。図１３Ｄは、クローニング部位およびシークエンシングプライマーを示す。図１３Ｅは、シークエンシングの結果を示す。

図１４Ａは、ＧＧＴＡ１のゲノム配列のマップを示す。図１４Ｂは、ＧＧＴＡ１のｃＤＮＡ配列のマップを示す。図１４Ａは、ＧＧＴＡ１のゲノム配列のマップを示す。図１４Ｂは、ＧＧＴＡ１のｃＤＮＡ配列のマップを示す。

図１５は、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰをトランスフェクトされたブタの胎仔線維芽細胞の例示的な顕微鏡写真を示す。

図１６は、第１染色体上の位置を明らかにする特異的なプローブによるＧＧＴＡ１遺伝子に対する蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を示す。

図１７Ａ〜図１７Ｂは、ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ媒介性ＧＧＴＡ１／ＮＬＣＲ５破壊を有する細胞の表現型選択の例を実証する。図１７Ａは、アルファガラクトシダーゼを発現しない、遺伝子改変された細胞を示す。図１７Ｂは、アルファガラクトシダーゼを発現し、かつイソレクチンＢ４（ＩＢ）連結第一鉄ビーズで標識された、遺伝子改変されていない細胞を示す。

図１８Ａ〜図１８Ｃは、ブタ細胞におけるＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、およびＮＬＲＣ５破壊の確証を実証する。図１８Ａは、ブタ細胞におけるＧＧＴＡ１破壊の確証を実証する。図１８Ｂは、ブタ細胞におけるＣＭＡＨ破壊の確証を実証する。図１８Ｃは、ブタ細胞におけるＮＬＲＣ５破壊の確証を実証する。図１８Ａ〜図１８Ｃは、ブタ細胞におけるＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、およびＮＬＲＣ５破壊の確証を実証する。図１８Ａは、ブタ細胞におけるＧＧＴＡ１破壊の確証を実証する。図１８Ｂは、ブタ細胞におけるＣＭＡＨ破壊の確証を実証する。図１８Ｃは、ブタ細胞におけるＮＬＲＣ５破壊の確証を実証する。図１８Ａ〜図１８Ｃは、ブタ細胞におけるＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、およびＮＬＲＣ５破壊の確証を実証する。図１８Ａは、ブタ細胞におけるＧＧＴＡ１破壊の確証を実証する。図１８Ｂは、ブタ細胞におけるＣＭＡＨ破壊の確証を実証する。図１８Ｃは、ブタ細胞におけるＮＬＲＣ５破壊の確証を実証する。

図１９Ａ〜図１９Ｂは、ブタの膵島誘導性ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞活性化に対する抗ＳＬＡ抗体の阻害性効果を実証する。図１９Ａは、抗ＳＬＡ抗体の存在下（黒のバー）または不在下（白のバー）における７日間の、成体ブタ膵島と混合された培養物中のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を示す。図１９Ｂは、抗ＳＬＡクラスＩ抗体の存在下（黒のバー）または不在下（白のバー）における７日間の、高度に精製されたリンパ球とともにまたはそれを含まずに培養された成体ブタ膵島の生存度（ＡＯ／ＰＩ染色で評価された）を示す。

図２０Ａ〜図２０Ｂは、ブタ膵島によって誘発されたＴ細胞活性化を実証する。図２０Ａは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を実証する。この結果、カニクイザルにおいてＩＦＮ−γを分泌する直接および間接的な特異性を有する抗ドナーＴ細胞の移植後増大の抑制が示される。サルを、ＧＴ−ＫＯドナーブタ由来のアポトーシス性ドナー脾細胞、および０日目の同じドナーブタ由来の膵島の移植前後の注入を用いて、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体、ラパマイシン、ｓＴＮＦＲ、および抗ＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体による一過性の免疫抑制の援護のもとで処置した。図２０Ｂは、移植術後１４１日の拒絶を受けている門脈内移植された成体ブタ膵島のＣＤ８染色を実証する。

図２１Ａ〜図２１Ｄは、維持免疫抑制がないサルにおけるブタ膵島グラフト生存を実証する。図２１Ａは、血糖値および移植術前後の正常な血糖値を維持するために必要な外因性のインスリンを実証する。図２１Ｂは、サルの血清ブタＣペプチドのレベルを実証する。図２１Ｃは、グルコース負荷に応答した血糖値を実証する。図２１Ｄは、グルコース負荷に応答した血清ブタＣペプチドレベルを実証する。図２１Ａ〜図２１Ｄは、維持免疫抑制がないサルにおけるブタ膵島グラフト生存を実証する。図２１Ａは、血糖値および移植術前後の正常な血糖値を維持するために必要な外因性のインスリンを実証する。図２１Ｂは、サルの血清ブタＣペプチドのレベルを実証する。図２１Ｃは、グルコース負荷に応答した血糖値を実証する。図２１Ｄは、グルコース負荷に応答した血清ブタＣペプチドレベルを実証する。

図２２Ａは、膵島を移植されて、移植術ならびにＣＴＬＡ４−Ｉｇおよびラパマイシンによる維持免疫抑制の後に１４日目にわたって抗ＣＤ４０抗体を４回投与されたサルによる遺伝子改変されていないブタ膵島の拒絶を実証する。図２２Ｂは、移植術ならびにＣＴＬＡ４−Ｉｇおよびラパマイシンによる維持免疫抑制の後に１４日目にわたって抗ＣＤ４０抗体を４回投与されたサルにおける移植されたブタ膵島による糖尿病の好転を実証する。

図２３Ａは、移植術後毎週ラパマイシンおよび抗ＣＤ４０抗体での維持免疫抑制を受けているサル（ＩＤ＃１３ＣＰ７）における移植されたブタ膵島による糖尿病の好転（持続する正常血糖およびインスリン非依存性の回復）を実証する。サルは、移植術の日から開始して２１日間、抗ＣＤ４０抗体およびラパマイシンを投与された。図２３Ｂは、同じレシピエント（ＩＤ＃１３ＣＰ７）における血清ブタＣペプチドレベル（絶食、ランダムおよび刺激）を実証する。

図２４は、屠殺の時点で肝臓単核細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞区画内のＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞のベースラインおよび高い存在率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）と比較して屠殺の時点で（推定される拒絶後）２匹のカニクイザルにおける循環中のＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞の増大を示す。両方のサルとも成体ブタ膵島の門脈内異種移植を受けた。ＰｒｅＴｘ：移植前；ＰＢＬ：末梢血白血球；Ｓａｃ：屠殺；Ｌｙｍ：リンパ球；ＬＭＮＣ：肝臓単核細胞。

図２５は、同じ一過性の免疫抑制を受けたが、アポトーシス性ドナー脾細胞（ＭＸ−ＥＣＤＩ−対照）は受けなかった対照と比較して、アポトーシス性ドナー脾細胞（ＭＸ−ＥＣＤＩ−ワクチン）の移植前後の注入による循環中のＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞の抑制を示す。ＰｒｅＴｘ：移植前；Ｓａｃ：屠殺；Ｌｙｍ：リンパ球；ＬＭＮＣ：肝臓単核細胞。

図２６は、アポトーシス性ドナー脾細胞およびα−ＣＤ４０抗体による循環中のＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞の抑制を示す。ＣＭ：カニクイザル；ＰｒｅＴｘ：移植前；Ｄ：日目。

図２７は、アポトーシス性ドナー脾細胞およびα−ＣＤ４０抗体による循環中のＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３＋ＣＤ１２７低制御性Ｔ細胞の抑制を示す。ＣＭ：カニクイザル；ＰｒｅＴｘ：移植前；Ｄ：日目。

図２８は、アポトーシス性ドナー脾細胞およびα−ＣＤ４０抗体による循環中のＣＤ８＋ＣＤ１２２＋ナチュラルサプレッサー細胞の抑制を示す。ＣＭ：カニクイザル；ＰｒｅＴｘ：移植前；Ｄ：日目。

図２９Ａ〜図２９Ｂは、ＧＧＴＡ１（Ｓｕｓｓｃｒｏｆａ品種混合第１染色体、Ｓｓｃｒｏｆａ１０．２ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０１０４４３．４と比較した）標的領域のＰＣＲ増幅に供された２つの別々の同腹仔の胎仔細胞から単離したＤＮＡのシークエンシングを示し（妊娠１：図２９Ａまたは妊娠２：図２９Ｂ）、得られたアンプリコンは、１％アガロースゲル上で分離した。アンプリコンはまた、各々の反応からのフォワードプライマーのみを使用してサンガーシークエンシングによって解析した。図２９Ａでは、結果は、ＧＧＴＡ１の標的部位の後で６ヌクレオチド短縮された妊娠１の胎仔１、２、４、５、６、および７から示される。胎仔３は、切断部位の後で１７ヌクレオチド短縮され、それに続いて、２，５１１（６６８〜３１７９）ヌクレオチド欠失、それに続いて単一塩基置換であった。標的遺伝子の両方のコピー由来の対立遺伝子を含有する単一のシークエンシング実験からの短縮、欠失および置換は、遺伝子改変が生じたことを示唆し得るだけで、各々の対立遺伝子について正確な配列は明らかにしない。この解析から、全ての７匹の胎仔は、ＧＧＴＡ１について単一の対立遺伝子改変を有すると思われる。図２９Ｂによって、妊娠２の胎仔ＤＮＡ試料１、３、４、および５は、ＧＧＴＡ１遺伝子標的部位から３ヌクレオチド短縮されたことが示される。胎仔２は、サンガーシークエンシングで変動を有し、このことは、ＤＮＡ変異の複雑な変動または試料の質が劣ることを示唆する。しかし、胎仔のＤＮＡ鋳型の質は、上記のＧＧＴＡ１遺伝子スクリーニング実験の生成に十分であった。図２９Ａ〜図２９Ｂは、ＧＧＴＡ１（Ｓｕｓｓｃｒｏｆａ品種混合第１染色体、Ｓｓｃｒｏｆａ１０．２ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０１０４４３．４と比較した）標的領域のＰＣＲ増幅に供された２つの別々の同腹仔の胎仔細胞から単離したＤＮＡのシークエンシングを示し（妊娠１：図２９Ａまたは妊娠２：図２９Ｂ）、得られたアンプリコンは、１％アガロースゲル上で分離した。アンプリコンはまた、各々の反応からのフォワードプライマーのみを使用してサンガーシークエンシングによって解析した。図２９Ａでは、結果は、ＧＧＴＡ１の標的部位の後で６ヌクレオチド短縮された妊娠１の胎仔１、２、４、５、６、および７から示される。胎仔３は、切断部位の後で１７ヌクレオチド短縮され、それに続いて、２，５１１（６６８〜３１７９）ヌクレオチド欠失、それに続いて単一塩基置換であった。標的遺伝子の両方のコピー由来の対立遺伝子を含有する単一のシークエンシング実験からの短縮、欠失および置換は、遺伝子改変が生じたことを示唆し得るだけで、各々の対立遺伝子について正確な配列は明らかにしない。この解析から、全ての７匹の胎仔は、ＧＧＴＡ１について単一の対立遺伝子改変を有すると思われる。図２９Ｂによって、妊娠２の胎仔ＤＮＡ試料１、３、４、および５は、ＧＧＴＡ１遺伝子標的部位から３ヌクレオチド短縮されたことが示される。胎仔２は、サンガーシークエンシングで変動を有し、このことは、ＤＮＡ変異の複雑な変動または試料の質が劣ることを示唆する。しかし、胎仔のＤＮＡ鋳型の質は、上記のＧＧＴＡ１遺伝子スクリーニング実験の生成に十分であった。

図３０Ａ〜図３０Ｂは、ＮＬＲＣ５（コンセンサス配列）標的領域のＰＣＲ増幅に供された２つの別々の同腹仔の胎仔細胞から単離されたＤＮＡのシークエンシングを示し（妊娠１：図３０Ａまたは妊娠２：図３０Ｂ）、得られたアンプリコンを、１％アガロースゲル上で分離した。アンプリコンはまた、各々の反応からのフォワードプライマーのみを使用してサンガーシークエンシングによって解析した。妊娠１由来の胎仔のＮＬＲＣ５標的部位の配列解析では（図３０Ａ）、一貫性のあるアラインメントを示すことはできず、サンガーシークエンシング反応および解析を複雑にするＮＬＲＣ５対立遺伝子の間のシークエンシング反応における未知の複雑性または種々のＤＮＡ改変を示唆した。妊娠２からのＮＬＲＣ５遺伝子アンプリコン（図３０Ｂ）は全て、ＮＬＲＣ５遺伝子切断部位下流の短縮された１２０ヌクレオチドであった。図３０Ａ〜図３０Ｂは、ＮＬＲＣ５（コンセンサス配列）標的領域のＰＣＲ増幅に供された２つの別々の同腹仔の胎仔細胞から単離されたＤＮＡのシークエンシングを示し（妊娠１：図３０Ａまたは妊娠２：図３０Ｂ）、得られたアンプリコンを、１％アガロースゲル上で分離した。アンプリコンはまた、各々の反応からのフォワードプライマーのみを使用してサンガーシークエンシングによって解析した。妊娠１由来の胎仔のＮＬＲＣ５標的部位の配列解析では（図３０Ａ）、一貫性のあるアラインメントを示すことはできず、サンガーシークエンシング反応および解析を複雑にするＮＬＲＣ５対立遺伝子の間のシークエンシング反応における未知の複雑性または種々のＤＮＡ改変を示唆した。妊娠２からのＮＬＲＣ５遺伝子アンプリコン（図３０Ｂ）は全て、ＮＬＲＣ５遺伝子切断部位下流の短縮された１２０ヌクレオチドであった。

図３１Ａ〜図３１Ｂは、後肢の生検から単離した胎仔ＤＮＡ（ｗｔおよび１〜７（図３１Ａ：妊娠１）または１〜５（図３１Ｂ：妊娠２）からのデータを示す。標的遺伝子は、ＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ生成物は、１％アガロースゲル上で分離し、かつ蛍光ＤＮＡ染色によって可視化した。ｗｔレーンに存在するアンプリコンのバンドは、未改変のＤＮＡ配列に相当する。アンプリコンのサイズの増減によって、それぞれ、そのアンプリコン内の挿入または欠失が示唆される。１つの試料中の対立遺伝子の間のＤＮＡ改変の変動によって、バンドはさらに拡散されるようになり得る。妊娠１（図３１Ａ）は、７つの胎仔を生じたが、妊娠２（図３１Ｂ）は、５匹の胎仔を生じ、それぞれ、４５日および４３日で回収した。図３１Ａの胎仔１、３および４におけるＮＬＲＣ５ゲル中のバンドがないこと（底部のゲル）によって、標的領域に対する改変が、ＤＮＡ増幅プライマーの結合を破壊したことが示唆される。図３１ＡにおけるＧＧＴＡ１中の全てのバンドの存在（頂部のゲル）によって、ＤＮＡの質が、ＮＬＲＣ５を標的化するＰＣＲ反応中でＤＮＡアンプリコンを生成するのに十分であったことが示唆される。妊娠１の胎仔１、２、４および５（図３１Ａ）は、ＷＴよりも大きいＧＧＴＡ１アンプリコンを有し、このことは、標的エリア内の挿入を示唆する。妊娠１の胎仔３（図３１Ａ）では、ＧＧＴＡ１アンプリコンは、ＷＴ対照よりも早く移動し、このことは、標的エリア内の欠失を示唆する。妊娠１の胎仔６および７（図３１Ａ）ＮＬＲＣ５アンプリコンは、ＷＴよりも早く移動し、このことは、標的エリア内の欠失を示唆する。胎仔１〜５（図３１Ｂ）ＧＧＴＡ１アンプリコンは、サイズで解釈することが困難であって、ＷＴ対照と比較して拡散された。胎仔１〜５（図３１Ｂ）ＮＬＲＣ５アンプリコンは、野生型対照と比較してサイズおよび密度が均一であった。

図３２Ａ〜図３２Ｂは、ブタの２つの別々の同腹仔由来の胎仔の表現型解析を示す（図３２Ａ：妊娠１または図３２Ｂ：妊娠２）。胎仔は、４５日目（妊娠１）または４３日目（妊娠２）で回収し、ＤＮＡおよび培養細胞単離のために処理した。組織断片および細胞を、２日間培養培地中に平板培養して、胎仔細胞を接着および増殖させた。野生型細胞（遺伝子改変されていない胎仔細胞）ならびに妊娠１および２由来の胎仔細胞を、培養プレートから取り出し、ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートされたＩＢ４レクチン、またはＦＩＴＣにコンジュゲートされた抗ブタＭＨＣクラスＩ抗体で標識した。フローサイトメトリー解析は、試験した細胞の標識強度を示すヒストグラムとして示す。ＷＴ細胞のヒストグラムは、各々の群の胎仔細胞の全体的強度における低下を強調するために各々のパネル中に含まれる。ピーク強度の低下として示される、妊娠１におけるアルファＧａｌおよびＭＨＣクラスＩ標識に低下がある（図３２Ａ）。妊娠２（図３２Ｂ）では、胎仔１および３は、ＷＴ胎仔細胞と比較して、アルファｇａｌ標識の大きい低下、およびＭＨＣクラス１標識の有意な低下がある。図３２Ａ〜図３２Ｂは、ブタの２つの別々の同腹仔由来の胎仔の表現型解析を示す（図３２Ａ：妊娠１または図３２Ｂ：妊娠２）。胎仔は、４５日目（妊娠１）または４３日目（妊娠２）で回収し、ＤＮＡおよび培養細胞単離のために処理した。組織断片および細胞を、２日間培養培地中に平板培養して、胎仔細胞を接着および増殖させた。野生型細胞（遺伝子改変されていない胎仔細胞）ならびに妊娠１および２由来の胎仔細胞を、培養プレートから取り出し、ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートされたＩＢ４レクチン、またはＦＩＴＣにコンジュゲートされた抗ブタＭＨＣクラスＩ抗体で標識した。フローサイトメトリー解析は、試験した細胞の標識強度を示すヒストグラムとして示す。ＷＴ細胞のヒストグラムは、各々の群の胎仔細胞の全体的強度における低下を強調するために各々のパネル中に含まれる。ピーク強度の低下として示される、妊娠１におけるアルファＧａｌおよびＭＨＣクラスＩ標識に低下がある（図３２Ａ）。妊娠２（図３２Ｂ）では、胎仔１および３は、ＷＴ胎仔細胞と比較して、アルファｇａｌ標識の大きい低下、およびＭＨＣクラス１標識の有意な低下がある。図３２Ａ〜図３２Ｂは、ブタの２つの別々の同腹仔由来の胎仔の表現型解析を示す（図３２Ａ：妊娠１または図３２Ｂ：妊娠２）。胎仔は、４５日目（妊娠１）または４３日目（妊娠２）で回収し、ＤＮＡおよび培養細胞単離のために処理した。組織断片および細胞を、２日間培養培地中に平板培養して、胎仔細胞を接着および増殖させた。野生型細胞（遺伝子改変されていない胎仔細胞）ならびに妊娠１および２由来の胎仔細胞を、培養プレートから取り出し、ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートされたＩＢ４レクチン、またはＦＩＴＣにコンジュゲートされた抗ブタＭＨＣクラスＩ抗体で標識した。フローサイトメトリー解析は、試験した細胞の標識強度を示すヒストグラムとして示す。ＷＴ細胞のヒストグラムは、各々の群の胎仔細胞の全体的強度における低下を強調するために各々のパネル中に含まれる。ピーク強度の低下として示される、妊娠１におけるアルファＧａｌおよびＭＨＣクラスＩ標識に低下がある（図３２Ａ）。妊娠２（図３２Ｂ）では、胎仔１および３は、ＷＴ胎仔細胞と比較して、アルファｇａｌ標識の大きい低下、およびＭＨＣクラス１標識の有意な低下がある。図３２Ａ〜図３２Ｂは、ブタの２つの別々の同腹仔由来の胎仔の表現型解析を示す（図３２Ａ：妊娠１または図３２Ｂ：妊娠２）。胎仔は、４５日目（妊娠１）または４３日目（妊娠２）で回収し、ＤＮＡおよび培養細胞単離のために処理した。組織断片および細胞を、２日間培養培地中に平板培養して、胎仔細胞を接着および増殖させた。野生型細胞（遺伝子改変されていない胎仔細胞）ならびに妊娠１および２由来の胎仔細胞を、培養プレートから取り出し、ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートされたＩＢ４レクチン、またはＦＩＴＣにコンジュゲートされた抗ブタＭＨＣクラスＩ抗体で標識した。フローサイトメトリー解析は、試験した細胞の標識強度を示すヒストグラムとして示す。ＷＴ細胞のヒストグラムは、各々の群の胎仔細胞の全体的強度における低下を強調するために各々のパネル中に含まれる。ピーク強度の低下として示される、妊娠１におけるアルファＧａｌおよびＭＨＣクラスＩ標識に低下がある（図３２Ａ）。妊娠２（図３２Ｂ）では、胎仔１および３は、ＷＴ胎仔細胞と比較して、アルファｇａｌ標識の大きい低下、およびＭＨＣクラス１標識の有意な低下がある。図３２Ａ〜図３２Ｂは、ブタの２つの別々の同腹仔由来の胎仔の表現型解析を示す（図３２Ａ：妊娠１または図３２Ｂ：妊娠２）。胎仔は、４５日目（妊娠１）または４３日目（妊娠２）で回収し、ＤＮＡおよび培養細胞単離のために処理した。組織断片および細胞を、２日間培養培地中に平板培養して、胎仔細胞を接着および増殖させた。野生型細胞（遺伝子改変されていない胎仔細胞）ならびに妊娠１および２由来の胎仔細胞を、培養プレートから取り出し、ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートされたＩＢ４レクチン、またはＦＩＴＣにコンジュゲートされた抗ブタＭＨＣクラスＩ抗体で標識した。フローサイトメトリー解析は、試験した細胞の標識強度を示すヒストグラムとして示す。ＷＴ細胞のヒストグラムは、各々の群の胎仔細胞の全体的強度における低下を強調するために各々のパネル中に含まれる。ピーク強度の低下として示される、妊娠１におけるアルファＧａｌおよびＭＨＣクラスＩ標識に低下がある（図３２Ａ）。妊娠２（図３２Ｂ）では、胎仔１および３は、ＷＴ胎仔細胞と比較して、アルファｇａｌ標識の大きい低下、およびＭＨＣクラス１標識の有意な低下がある。

図３３Ａ〜図３３Ｂは、遺伝子クローン由来の野生型胎仔細胞と比較して、胎仔３（妊娠１）由来の細胞でのＭＨＣクラスＩ発現の低下の影響を示す。ブタの対照の線維芽細胞およびＮＬＲＣ５ノックアウト胎仔細胞に対するヒトＣＤ８＋細胞およびＣＤ４Ｔ細胞の増殖応答を測定した。図３３Ａ。細胞は、増殖の評価の前にＣＤ４またはＣＤ８としてゲーティングされた。図３３Ｂ。ＣＤ８Ｔ細胞増殖は、対照の未改変のブタ線維芽細胞と比較して、ブタ胎仔ＧＧＴＡ１／ＮＬＲＣ５ノックアウト細胞による処置刺激後に低下した。ＣＤ８Ｔ細胞増殖におけるほとんど５５％の低下が、ヒトの応答物がブタ胎仔ＧＧＴＡ１／ＮＬＲＣ５ノックアウト細胞で１：１の比で処置されたときに観察された。野生型胎仔細胞は、ヒトＣＤ８Ｔ細胞で１７．２％の増殖を誘発したが、胎仔３（妊娠１）由来のＭＨＣクラスＩ欠損細胞は、７．６％の増殖しか誘導しなかった。未改変の胎仔細胞と比較して１：５および１：１０の比で、ＣＤ８Ｔ細胞増殖応答に相違は見られなかった。研究した全ての比で、ＮＬＲＣ５ノックアウトおよび対照の未改変のブタ胎仔細胞に応答した、ＣＤ４Ｔ細胞増殖の変化は観察されなかった。図３３Ａ〜図３３Ｂは、遺伝子クローン由来の野生型胎仔細胞と比較して、胎仔３（妊娠１）由来の細胞でのＭＨＣクラスＩ発現の低下の影響を示す。ブタの対照の線維芽細胞およびＮＬＲＣ５ノックアウト胎仔細胞に対するヒトＣＤ８＋細胞およびＣＤ４Ｔ細胞の増殖応答を測定した。図３３Ａ。細胞は、増殖の評価の前にＣＤ４またはＣＤ８としてゲーティングされた。図３３Ｂ。ＣＤ８Ｔ細胞増殖は、対照の未改変のブタ線維芽細胞と比較して、ブタ胎仔ＧＧＴＡ１／ＮＬＲＣ５ノックアウト細胞による処置刺激後に低下した。ＣＤ８Ｔ細胞増殖におけるほとんど５５％の低下が、ヒトの応答物がブタ胎仔ＧＧＴＡ１／ＮＬＲＣ５ノックアウト細胞で１：１の比で処置されたときに観察された。野生型胎仔細胞は、ヒトＣＤ８Ｔ細胞で１７．２％の増殖を誘発したが、胎仔３（妊娠１）由来のＭＨＣクラスＩ欠損細胞は、７．６％の増殖しか誘導しなかった。未改変の胎仔細胞と比較して１：５および１：１０の比で、ＣＤ８Ｔ細胞増殖応答に相違は見られなかった。研究した全ての比で、ＮＬＲＣ５ノックアウトおよび対照の未改変のブタ胎仔細胞に応答した、ＣＤ４Ｔ細胞増殖の変化は観察されなかった。図３３Ａ〜図３３Ｂは、遺伝子クローン由来の野生型胎仔細胞と比較して、胎仔３（妊娠１）由来の細胞でのＭＨＣクラスＩ発現の低下の影響を示す。ブタの対照の線維芽細胞およびＮＬＲＣ５ノックアウト胎仔細胞に対するヒトＣＤ８＋細胞およびＣＤ４Ｔ細胞の増殖応答を測定した。図３３Ａ。細胞は、増殖の評価の前にＣＤ４またはＣＤ８としてゲーティングされた。図３３Ｂ。ＣＤ８Ｔ細胞増殖は、対照の未改変のブタ線維芽細胞と比較して、ブタ胎仔ＧＧＴＡ１／ＮＬＲＣ５ノックアウト細胞による処置刺激後に低下した。ＣＤ８Ｔ細胞増殖におけるほとんど５５％の低下が、ヒトの応答物がブタ胎仔ＧＧＴＡ１／ＮＬＲＣ５ノックアウト細胞で１：１の比で処置されたときに観察された。野生型胎仔細胞は、ヒトＣＤ８Ｔ細胞で１７．２％の増殖を誘発したが、胎仔３（妊娠１）由来のＭＨＣクラスＩ欠損細胞は、７．６％の増殖しか誘導しなかった。未改変の胎仔細胞と比較して１：５および１：１０の比で、ＣＤ８Ｔ細胞増殖応答に相違は見られなかった。研究した全ての比で、ＮＬＲＣ５ノックアウトおよび対照の未改変のブタ胎仔細胞に応答した、ＣＤ４Ｔ細胞増殖の変化は観察されなかった。

以下の説明および例は、本発明の実施形態を詳細に説明する。本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されず、変動し得ることを理解すべきである。当業者は、その範囲内に包含される、本発明の多数のバリエーションおよび改変が存在することを認識する。

臓器および組織機能の不全は、個体の早死にを生じ得る。移植は、この問題を潜在的に解決し得、多くの個体の生命を延長させ得る。しかし、移植に使用できる細胞、臓器および／または組織は不足している。

異種グラフトまたは同種グラフト（例えば、胚性または誘導多能性幹細胞）は、移植に使用される細胞、臓器および／または組織の無制限の供給を創出するために使用され得る。一般に、一部の移植は、移植拒絶を最終的にもたらし得る増加した免疫応答をもたらし得る。同系グラフトまたは自家グラフトは典型的に、拒絶を生じない。しかし、同種グラフトおよび異種グラフトは、免疫反応を生じ得、グラフトの破壊を最終的にもたらし得る。拒絶のリスクは、一部の場合には、免疫応答を抑制することによって軽減され得る。

伝統的には、免疫抑制薬は、移植後に使用された。しかし、がんおよび感染の増加したリスクが含まれるがこれらに限定されない、免疫抑制薬を用いた長期処置に関連する多くの有害効果が存在する。グラフト拒絶を予防し免疫系を抑制するための代替方法が求められた。免疫応答は、本明細書に記載されるものを含む種々の技術の使用によって抑えられ得る。例えば、最小限の免疫抑制薬の使用なしまたはありの、移植拒絶を予防するためまたは移植拒絶までの時間を延長させるための、本明細書に記載される１つの方法では、動物、例えばドナー非ヒト動物は、例えば、遺伝的に変更され得る。引き続いて、変更された動物、例えばドナー非ヒト動物の細胞、臓器および／または組織が回収され得、同種グラフトまたは異種グラフトにおいて使用され得る。あるいは、細胞は、動物、例えば、ヒトもしくは非ヒト動物から抽出され得（初代細胞が含まれるがこれらに限定されない）、または細胞は、以前に抽出された動物細胞、例えば、細胞株であり得る。これらの細胞は、遺伝的に変更された細胞を創出するために使用され得る。

移植拒絶（例えば、Ｔ細胞媒介性移植拒絶）は、慢性免疫抑制によって予防され得る。しかし、免疫抑制は費用がかかり、重篤な副作用のリスクと関連する。慢性免疫抑制の必要を回避するために、
ｉ）ＭＨＣクラスＩの機能的発現を欠く遺伝子改変されたグラフトを利用し、それによって、直接的な特異性でＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化を妨害し、これらのＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞溶解性エフェクター機能を除外する、
ｉｉ）拮抗性の抗ＣＤ４０ｍＡｂ（ならびに枯渇化抗ＣＤ２０ｍＡｂおよびｍＴＯＲ阻害剤）を含む誘導免疫療法を使用して、Ｂ細胞（および他のＡＰＣ）媒介性プライミングおよび抗ドナーＴ細胞のメモリー生成を妨害する、および／または
ｉｉｉ）アポトーシス性ドナー細胞ワクチンの移植前後の注入を介して、間接的な特異性で抗ドナーＴ細胞を欠失させる、
多面的なＴ細胞標的化拒絶予防が開発された（図１）。

遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、非ヒト霊長類、またはローラシア獣上目のメンバー、例えば有蹄動物である遺伝子改変された動物）およびそれから単離された臓器、組織または細胞、寛容化ワクチン、ならびに非ヒト動物から単離された臓器、組織または細胞の移植によって、それを必要とするレシピエントにおいて疾患を処置または予防するための方法が本明細書に記載される。非ヒト動物（例えば、非ヒト霊長類、またはローラシア獣上目のメンバー、例えば有蹄動物である遺伝子改変された動物）から単離された臓器、組織または細胞は、同じ種（同種移植片）または異なる種（異種移植片）から、それを必要とするレシピエント中に移植され得る。レシピエントは、寛容化ワクチンおよび／または１つもしくは複数の免疫調節剤（例えば、抗体）で寛容化され得る。異種移植が関与する実施形態では、このレシピエントは、ヒトであり得る。処置され得る適切な疾患は、レシピエントの臓器、組織または細胞（例えば、心臓、肺、肝臓、静脈、皮膚または膵島細胞）が欠損しているまたは傷害される任意の疾患であり、レシピエントは、非ヒト動物から単離された臓器、組織または細胞の移植によって処置され得る。

定義
本明細書で使用される場合、参照数値およびその文法的等価物に関して、用語「約」は、その数値自体およびその数値からプラスまたはマイナス１０％の範囲の値を含み得る。例えば、量「約１０」は、１０および９から１１までの任意の量を含む。例えば、参照数値に関して、用語「約」は、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の範囲の値もまた含み得る。

用語「非ヒト動物」およびその文法的等価物は、本明細書で使用する場合、ネイティブ動物または遺伝子改変された非ヒト動物であり得る非ヒト哺乳動物を含む、ヒト以外の全ての動物種を含む。非ヒト哺乳動物には、有蹄動物、例えば、偶蹄動物（例えば、ブタ、ペッカリー、カバ、ラクダ、ラマ、マメジカ（ネズミジカ）、シカ、キリン、プロングホーン、アンテロープ、ヤギ−アンテロープ（ヒツジ、ヤギなどを含む）またはウシ）もしくは奇蹄動物（例えば、ウマ、バクおよびサイ）、非ヒト霊長類（例えば、サルまたはチンパンジー）、イヌ科（Ｃａｎｉｄａｅ）（例えば、イヌ）またはネコが含まれる。非ヒト動物は、ローラシア獣上目のメンバーであり得る。ローラシア獣上目には、Ｗａｄｄｅｌｌら、ＴｏｗａｒｄｓＲｅｓｏｌｖｉｎｇｔｈｅＩｎｔｅｒｏｒｄｉｎａｌＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆＰｌａｃｅｎｔａｌＭａｍｍａｌｓ．ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢｉｏｌｏｇｙ４８巻（１号）：１〜５頁（１９９９年）に記載されるような哺乳動物の群が含まれ得る。ローラシア獣上目のメンバーには、真無盲腸目（Ｅｕｌｉｐｏｔｙｐｈｌａ）（ハリネズミ、トガリネズミおよびモグラ）、奇蹄目（Ｐｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）（サイ、ウマおよびバク）、食肉目（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）（肉食動物）、鯨偶蹄目（Ｃｅｔａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）（偶蹄目およびクジラ目）、翼手目（Ｃｈｉｒｏｐｔｅｒａ）（コウモリ）および有鱗目（Ｐｈｏｌｉｄｏｔａ）（センザンコウ）が含まれ得る。ローラシア獣上目のメンバーは、本明細書に記載される有蹄動物、例えば、奇蹄動物または偶蹄動物であり得る。有蹄動物はブタであり得る。メンバーは、食肉目のメンバー、例えば、ネコまたはイヌであり得る。一部の場合には、ローラシア獣上目のメンバーは、ブタであり得る。

用語「ブタ」およびその文法的等価物は、本明細書で使用する場合、イノシシ科（Ｓｕｉｄａｅ）の偶蹄動物内のイノシシ（Ｓｕｓ）属中の動物を指し得る。例えば、ブタは、野生ブタ、家畜ブタ、ミニブタ、Ｓｕｓｓｃｒｏｆａブタ、Ｓｕｓｓｃｒｏｆａｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓブタまたは近交系ブタであり得る。

用語「導入遺伝子」およびその文法的等価物は、本明細書で使用する場合、生物中に移入され得る遺伝子または遺伝物質を指し得る。例えば、導入遺伝子は、生物中に導入される遺伝子を含むＤＮＡのストレッチまたはセグメントであり得る。導入遺伝子が生物中に移入される場合、生物は、トランスジェニック生物と呼ばれ得る。導入遺伝子は、トランスジェニック生物においてＲＮＡまたはポリペプチド（例えば、タンパク質）を産生するその能力を保持し得る。導入遺伝子は、タンパク質またはその断片（例えば、機能的断片）をコードするポリヌクレオチドを含み得る。導入遺伝子のポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチドであり得る。タンパク質の断片（例えば、機能的断片）は、タンパク質のアミノ酸配列の少なくともまたは少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％を含み得る。タンパク質の断片は、タンパク質の機能的断片であり得る。タンパク質の機能的断片は、タンパク質の機能の一部または全てを保持し得る。

用語「遺伝子改変」およびその文法的等価物は、本明細書で使用する場合、核酸、例えば、生物のゲノム内の核酸の１つまたは複数の変更を指し得る。例えば、遺伝子改変とは、遺伝子の変更、付加および／または欠失を指し得る。遺伝子改変された細胞は、付加された、欠失されたおよび／または変更された遺伝子を有する細胞もまた指し得る。遺伝子改変された細胞は、遺伝子改変された非ヒト動物由来であり得る。遺伝子改変された非ヒト動物由来の遺伝子改変された細胞は、かかる遺伝子改変された非ヒト動物から単離された細胞であり得る。遺伝子改変された非ヒト動物由来の遺伝子改変された細胞は、かかる遺伝子改変された非ヒト動物に起源する細胞であり得る。例えば、細胞

用語「島」または「島細胞」およびそれらの文法的等価物は、本明細書で使用する場合、生物の膵臓中に存在する内分泌（例えば、ホルモン産生）細胞を指し得る。例えば、島細胞は、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞および／または膵ε細胞が含まれるがこれらに限定されない、異なる型の細胞を含み得る。島細胞は、細胞の群、細胞クラスターなどもまた指し得る。

用語「状態」状態およびその文法的等価物は、本明細書で使用する場合、疾患、事象、または健康状態における変化を指し得る。

用語「糖尿病」およびその文法的等価物は、本明細書で使用する場合、延長された期間にわたる高い血糖レベルを特徴とする疾患を指し得る。例えば、用語「糖尿病」およびその文法的等価物は、本明細書で使用する場合、１型、２型、嚢胞性線維症関連、外科的、妊娠糖尿病およびミトコンドリア糖尿病が含まれるがこれらに限定されない、全てのまたは任意の型の糖尿病を指し得る。一部の場合には、糖尿病は、遺伝性糖尿病の一形態であり得る。

用語「表現型」およびその文法的等価物は、本明細書で使用する場合、生物の観察可能な特徴または形質、例えば、その形態学、発生、生化学的もしくは生理学的特性、生物季節学、行動および行動の所産の複合を指し得る。文脈に依存して、用語「表現型」とは、時折、集団の観察可能な特徴または形質の複合を指し得る。

用語「破壊すること」およびその文法的等価物は、本明細書で使用する場合、例えば、欠失、挿入、変異、再編成またはそれらの任意の組合せによって遺伝子を変更するプロセスを指し得る。例えば、遺伝子は、ノックアウトによって破壊され得る。遺伝子を破壊することは、遺伝子の発現（例えば、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現）を部分的に低減させるまたは完全に抑制することであり得る。破壊することは、阻害テクノロジー、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ドミナントネガティブ、または遺伝子もしくはタンパク質の機能性もしくは発現を阻害するための任意の他の手段もまた含み得る。

用語「遺伝子編集」およびその文法的等価物は、本明細書で使用する場合、１つまたは複数のヌクレオチドが挿入、置き換えまたはゲノムから除去される遺伝子操作を指し得る。例えば、遺伝子編集は、ヌクレアーゼ（例えば、天然に存在するヌクレアーゼまたは人工的に操作されたヌクレアーゼ）を使用して実施され得る。

用語「移植拒絶」およびその文法的等価物は、本明細書で使用する場合、臓器移植レシピエントの免疫応答が、移植された材料の機能を損なうまたは破壊するのに十分な、移植された材料（例えば、細胞、組織および／または臓器）に対する反応を開始させる、プロセス（単数または複数）を指し得る。

用語「超急性拒絶」およびその文法的等価物は、本明細書で使用する場合、移植後最初の２４時間以内に生じるまたは開始する、移植された材料または組織の拒絶を指し得る。例えば、超急性拒絶は、「急性体液性拒絶」および「抗体媒介性拒絶」を包含し得るがこれらに限定されない。

用語「陰性ワクチン」、「寛容化ワクチン」およびそれらの文法的等価物は、本明細書で使用する場合、相互交換可能に使用され得る。寛容化ワクチンは、適切な免疫療法の援護の下に使用される場合、グラフトに対してレシピエントを寛容化し得る、またはグラフトに対するレシピエントの寛容化に寄与し得る。これは、移植拒絶の予防を助け得る。

用語「レシピエント」、「対象」およびそれらの文法的等価物は、本明細書で使用する場合、相互交換可能に使用され得る。レシピエントまたは対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。レシピエントまたは対象は、移植グラフト、寛容化ワクチンおよび／もしくは本出願で開示される他の組成物を受ける、それらを受けている、またはそれらを受けた、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。レシピエントまたは対象は、移植グラフト、寛容化ワクチンおよび／または本出願で開示される他の組成物を必要とするレシピエントまたは対象であり得る。一部の場合には、レシピエントは、移植グラフトを受けることになる、受けている、または受けたヒトまたは非ヒト動物であり得る。

全体で開示される一部の数値は、例えば、「Ｘは、少なくともまたは少なくとも約１００；または２００［または任意の数字］である」と言われる。この数値は、その数自体、および以下の全てを含む：
ｉ）Ｘは、少なくとも１００である；
ｉｉ）Ｘは、少なくとも２００である；
ｉｉｉ）Ｘは、少なくとも約１００である；および
ｉｖ）Ｘは、少なくとも約２００である。
全てのこれらの異なる組合せは、全体で開示される数値によって企図される。全ての開示された数値は、治療剤の投与を指すのであれ、日数、月数、年数、重量、投薬量などを指すのであれ、反対のものが具体的に示されない限り、この様式で解釈すべきである。

全体で開示される範囲は、時折、例えば、「Ｘは、１日目からもしくは約１日目から２日目まで；または２日目からもしくは約２日目から３日目まで［または任意の数値範囲］に投与される」と言われる。この範囲は、その数自体（例えば、範囲の終点）、および以下の全てを含む：
ｉ）Ｘは、１日目と２日目との間に投与される；
ｉｉ）Ｘは、２日目と３日目との間に投与される；
ｉｉｉ）Ｘは、約１日目と２日目との間に投与される；
ｉｖ）Ｘは、約２日目と３日目との間に投与される；
ｖ）Ｘは、１日目と約２日目との間に投与される；
ｖｉ）Ｘは、２日目と約３日目との間に投与される；
ｖｉｉ）Ｘは、約１日目と約２日目との間に投与される；および
ｖｉｉｉ）Ｘは、約２日目と約３日目との間に投与される。
全てのこれらの異なる組合せは、全体で開示される範囲によって企図される。全ての開示された範囲は、治療剤の投与を指すのであれ、日数、月数、年数、重量、投薬量などを指すのであれ、反対のものが具体的に示されない限り、この様式で解釈すべきである。

用語「および／または」および「それらの任意の組合せ」ならびにそれらの文法的等価物は、本明細書で使用する場合、相互交換可能に使用され得る。これらの用語は、任意の組合せが具体的に企図されることを伝え得る。例示のみを目的として、以下の語句「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」または「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの任意の組合せ」は、「個々にＡ；個々にＢ；個々にＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；ＡおよびＣ；ならびにＡ、ＢおよびＣ」を意味し得る。

Ｉ．遺伝子改変された非ヒト動物
移植のための細胞、組織および／または臓器のドナーであり得る遺伝子改変された動物が、本明細書で提供される。遺伝子改変された非ヒト動物は、任意の所望の種であり得る。例えば、本明細書に記載される遺伝子改変された非ヒト動物は、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物であり得る。遺伝子改変された非ヒト哺乳動物は、遺伝子改変された偶蹄動物（例えば、ブタ、ペッカリー、カバ、ラクダ、ラマ、マメジカ（ネズミジカ）、シカ、キリン、プロングホーン、アンテロープ、ヤギ−アンテロープ（ヒツジ、ヤギなどを含む）またはウシ）もしくは遺伝子改変された奇蹄動物（例えば、ウマ、バクおよびサイ）が含まれる遺伝子改変された有蹄動物、遺伝子改変された非ヒト霊長類（例えば、サルまたはチンパンジー）または遺伝子改変されたイヌ科（例えば、イヌ）であり得る。遺伝子改変された非ヒト動物は、ローラシア獣上目のメンバーであり得る。遺伝子改変された非ヒト動物は、非ヒト霊長類、例えば、サルまたはチンパンジーであり得る。非ヒト動物がブタである場合、このブタは、少なくともまたは少なくとも約５、５０、１００または３００ポンドであり得る、例えば、このブタは、５ポンドからもしくは約５ポンドから５０ポンドの間；２５ポンドからもしくは約２５ポンドから１００ポンドの間；または７５ポンドからもしくは約７５ポンドから３００ポンドの間であり得る。一部の場合には、非ヒト動物は、少なくとも１回出産したブタである。

遺伝子改変された非ヒト動物は、任意の齢の動物であり得る。例えば、遺伝子改変された非ヒト動物は、胎仔；１日からまたは約１日から１ヵ月；１ヵ月からまたは約１ヵ月から３ヵ月；３ヵ月からまたは約３ヵ月から６ヵ月；６ヵ月からまたは約６ヵ月から９ヵ月；９ヵ月からまたは約９ヵ月から１歳；１歳からまたは約１歳から２歳までであり得る。遺伝子改変された非ヒト動物は、非ヒト胎仔動物、周産期非ヒト動物、新生仔非ヒト動物、離乳前非ヒト動物、若年成体非ヒト動物または成体非ヒト動物であり得る。

遺伝子改変された非ヒト動物は、遺伝子改変されていない対応する動物と比較して、１つまたは複数の遺伝子の低減された発現を含み得る。遺伝子改変されていない対応する動物は、遺伝子改変された動物と実質的に同一であるが、ゲノム中に遺伝子改変を有さない、動物であり得る。例えば、遺伝子改変されていない対応する動物は、遺伝子改変された動物と同じ種の野生型動物であり得る。非ヒト動物は、それを必要とするレシピエントまたは対象に移植するための細胞、組織または臓器を提供できる。それを必要とするレシピエントまたは対象は、状態を有することが既知のまたは状態を有すると疑われるレシピエントまたは対象であり得る。状態は、本明細書で開示される方法および組成物によって、処置、予防、低減、排除または増大され得る。レシピエントは、移植された細胞、組織もしくは臓器に対する低い免疫応答を示し得る、または移植された細胞、組織もしくは臓器に対する免疫応答を示さなくてもよい。移植された細胞、組織または臓器は、レシピエント（例えば、ヒトまたは別の動物）のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識不能であり得る。その発現が低減される遺伝子には、ＭＨＣ分子、ＭＨＣ分子発現のレギュレーター、およびドナー非ヒト動物とレシピエント（例えば、ヒトまたは別の動物）との間で示差的に発現される遺伝子が含まれ得る。低減された発現は、１つまたは複数の遺伝子のｍＲＮＡ発現またはタンパク質発現であり得る。例えば、低減された発現は、１つまたは複数の遺伝子のタンパク質発現であり得る。低減された発現は、発現なしもまた含み得る。例えば、遺伝子の低減された発現を有する動物、細胞、組織または臓器は、遺伝子の発現（例えば、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現）なしであり得る。遺伝子の発現の低減は、遺伝子の機能を不活性化し得る。一部の場合には、遺伝子の発現が遺伝子改変された動物において低減される場合、遺伝子の発現は、遺伝子改変された動物中には存在しない。

遺伝子改変された非ヒト動物は、遺伝子改変されていない対応する動物と比較して、１つまたは複数のＭＨＣ分子の低減された発現を含み得る。例えば、非ヒト動物は、１つまたは複数の豚白血球抗原（ＳＬＡ）クラスＩおよび／またはＳＬＡクラスＩＩ分子の低減された発現を有する有蹄動物、例えばブタであり得る。

遺伝子改変された非ヒト動物は、遺伝子改変されていない対応する動物と比較して、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、ＭＨＣＩ分子および／またはＭＨＣＩＩ分子）を調節する任意の遺伝子の低減された発現を含み得る。かかる遺伝子の発現を低減させることは、ＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣＩ分子および／またはＭＨＣＩＩ分子）の低減された発現および／または機能を生じ得る。一部の場合には、その発現が非ヒト動物において低減される１つまたは複数の遺伝子は、ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分、ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーター、ナチュラルキラー群２Ｄリガンド、ＣＸＣケモカイン（ｃｈｅｍｉｃａｌ）受容体（ＣＸＣＲ）３リガンド、補体成分３（Ｃ３）および主要組織適合遺伝子複合体ＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）のうちの１つまたは複数を含み得る。一部の場合には、ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分は、ＮＬＲＣ５であり得る。一部の場合には、ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分は、調節因子Ｘ（ＲＦＸ）（例えば、ＲＦＸ１）、核転写因子Ｙ（ＮＦＹ）およびｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）もまた含み得る。一部の例では、ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーターは、抗原プロセシング関連トランスポーター１（ＴＡＰ１）であり得る。一部の場合には、ナチュラルキラー（ＮＫ）群２Ｄリガンドは、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢを含み得る。例えば、遺伝子改変された非ヒト動物は、以下の遺伝子：ＮＯＤ様受容体ファミリーＣＡＲＤドメイン含有５（ＮＬＲＣ５）、抗原プロセシング関連トランスポーター１（ＴＡＰ１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）、補体成分３（Ｃ３）およびＣＩＩＴＡのうちの１つまたは複数の低減された発現を含み得る。遺伝子改変された動物は、以下の遺伝子：ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分（例えば、ＮＬＲＣ５）、ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーター（ＴＡＰ１）およびＣ３のうちの１つまたは複数の低減された発現を含み得る。

遺伝子改変された非ヒト動物は、非ヒト動物と、非ヒト動物由来の細胞、組織または臓器を受けているレシピエントとの間で異なるレベルで発現される１つまたは複数の遺伝子の遺伝子改変されていない対応動物と比較して、低減された発現を含み得る。例えば、１つまたは複数の遺伝子は、非ヒト動物中よりも、ヒトにおいてより低いレベルで発現され得る。一部の場合には、１つまたは複数の遺伝子は、非ヒト動物の内因性遺伝子であり得る。内因性遺伝子は、一部の場合には、別の種では発現されない遺伝子である。例えば、非ヒト動物の内因性遺伝子は、ヒトでは発現されない遺伝子であり得る。例えば、一部の場合には、１つまたは複数の遺伝子のホモログ（例えば、オルソログ）は、ヒトには存在しない。別の例では、１つまたは複数の遺伝子のホモログ（例えば、オルソログ）は、ヒトに存在し得るが、発現はされない。

一部の場合には、非ヒト動物は、ブタであり得、レシピエントは、ヒトであり得る。これらの場合には、１つまたは複数の遺伝子は、ブタでは発現されるがヒトでは発現されない任意の遺伝子であり得る。例えば、１つまたは複数の遺伝子は、糖タンパク質ガラクトシルトランスフェラーゼアルファ１，３（ＧＧＴＡ１）、推定シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ様タンパク質（ＣＭＡＨ）およびβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）を含み得る。遺伝子改変された非ヒト動物は、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＧＧＴＡ１またはＣＭＡＨの低減された発現を含み得、低減された発現は、遺伝子改変されていない対応する動物と比較したものである。遺伝子改変された非ヒト動物は、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２およびＧＧＴＡ１の低減された発現を含み得、低減された発現は、遺伝子改変されていない対応する動物と比較したものである。遺伝子改変された非ヒト動物は、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２およびＣＭＡＨの低減された発現を含み得、低減された発現は、遺伝子改変されていない対応する動物と比較したものである。遺伝子改変された非ヒト動物は、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＧＧＴＡ１およびＣＭＡＨの低減された発現を含み得、低減された発現は、遺伝子改変されていない対応する動物と比較したものである。

遺伝子改変された非ヒト動物は、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｃ３、ＣＩＩＴＡ、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２が含まれる本明細書で開示される遺伝子のいずれかのうちの１つまたは複数の遺伝子改変されていない対応動物と比較して低減された発現を含み得る。

遺伝子改変された非ヒト動物は、その発現が低減される、例えば、遺伝子発現が低減される、１つまたは複数の遺伝子を含み得る。その発現が低減される１つまたは複数の遺伝子には、ＮＯＤ様受容体ファミリーＣＡＲＤドメイン含有５（ＮＬＲＣ５）、抗原プロセシング関連トランスポーター１（ＴＡＰ１）、糖タンパク質ガラクトシルトランスフェラーゼアルファ１，３（ＧＧＴＡ１）、推定シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ様タンパク質（ＣＭＡＨ）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）、ベータ−１，４−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）、補体成分３（Ｃ３）、および／またはそれらの任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない。

遺伝子改変された非ヒト動物は、その発現が破壊されている１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ超の遺伝子を含み得る。種々の組合せを限定するのではなく例示目的のために、当業者は、遺伝子改変された非ヒト動物が、個々に破壊されたＮＬＲＣ５およびＴＡＰ１を有し得ることを想定できる。遺伝子改変された非ヒト動物はまた、破壊されたＮＬＲＣ５およびＴＡＰ１の両方を有し得る。遺伝子改変された非ヒト動物は、破壊された以下のＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２またはＣＩＩＴＡ遺伝子のうちの１つまたは複数に加えて、破壊されたＮＬＲＣ５およびＴＡＰ１もまた有し得る；例えば、「ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１およびＧＧＴＡ１」または「ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１およびＣＭＡＨ」が破壊され得る。遺伝子改変された非ヒト動物は、破壊されたＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１およびＣＭＡＨもまた有し得る。あるいは、遺伝子改変された非ヒト動物は、破壊されたＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２およびＣＭＡＨもまた有し得る。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、破壊されたＣ３およびＧＧＴＡ１を有し得る。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＮＬＲＣ５、Ｃ３、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨおよびＣＸＣＬ１０の低減された発現を有し得る。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨおよびＣＸＣＬ１０の低減された発現を有し得る。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨおよびＣＸＣＬ１０の低減された発現を有し得る。

移植されたヒト細胞上のＭＨＣクラスＩ発現の欠如は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の受動的活性化を引き起こし得る（Ｏｈｌｅｎら、１９８９年）。ＭＨＣクラスＩ発現の欠如は、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１またはＢ２Ｍ遺伝子欠失に起因し得る。ＮＫ細胞の細胞傷害性は、ＮＫ細胞上の阻害性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを刺激して細胞死滅を防止できるヒトＭＨＣクラス１遺伝子ＨＬＡ−Ｅの発現によって克服され得る（Ｗｅｉｓｓら、２００９年；Ｌｉｌｉｅｎｆｅｌｄら、２００７年；Ｓａｓａｋｉら、１９９９年）。ＨＬＡ−Ｅ遺伝子の首尾よい発現は、ヒトＢ２Ｍ（ベータ２ミクログロブリン）遺伝子および同族ペプチドの共発現に依存し得る（Ｗｅｉｓｓら、２００９年；Ｌｉｌｉｅｎｆｅｌｄら、２００７年；Ｓａｓａｋｉら、１９９９年；Ｐａｓｃａｓｏｖａら、１９９９年）。幹細胞ＤＮＡにおけるヌクレアーゼ媒介性切断は、相同組換え修復を介した１つまたは複数の遺伝子の挿入を可能にし得る。ＨＬＡ−ＥおよびｈＢ２Ｍ遺伝子は、順番に、ヌクレアーゼ媒介性ＤＮＡ切断の領域において組み込まれ得、そうして、標的遺伝子（例えば、ＮＬＲＣ５）の発現を防止しつつ、導入遺伝子を挿入する。

遺伝子の発現レベルは、種々の程度まで低減され得る。例えば、１つまたは複数の遺伝子の発現は、１００％または約１００％低減され得る。一部の場合には、１つまたは複数の遺伝子の発現は、例えば、未改変対照の発現と比較して、正常な発現の９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％もしくは５０％または約９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％もしくは５０％、低減され得る。一部の場合には、１つまたは複数の遺伝子の発現は、例えば、未改変対照の発現と比較して、正常な発現の少なくともまたは少なくとも約９９％から９０％；８９％から８０％、７９％から７０％；６９％から６０％；５９％から５０％、低減され得る。例えば、１つまたは複数の遺伝子の発現は、正常発現の少なくとももしくは少なくとも約９０％、または少なくとももしくは少なくとも約９０％から９９％、低減され得る。

発現は、任意の公知の方法、例えば、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ（例えば、Ｓｙｂｒ−ｇｒｅｅｎ）および／またはホットＰＣＲが含まれるがこれらに限定されない定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって測定され得る。一部の場合には、１つまたは複数の遺伝子の発現は、遺伝子の転写物のレベルを検出することによって測定され得る。例えば、１つまたは複数の遺伝子の発現は、ノザンブロッティング、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護アッセイ）、逆転写ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ（例えば、リアルタイムＰＣＲ、例えば、リアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ）、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））、ドットブロット分析、ディファレンシャルディスプレイ、遺伝子発現の連続的分析、サブトラクティブハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、ナノストリングおよび／またはシークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）によって測定され得る。一部の場合には、１つまたは複数の遺伝子の発現は、遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを検出することによって測定され得る。例えば、１つまたは複数の遺伝子の発現は、タンパク質免疫染色、タンパク質免疫沈降、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ウエスタンブロッティング、ビシンコニン酸アッセイ、分光光度測定、質量分析、酵素アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ）、免疫組織化学、フローサイトメトリーおよび／または免疫細胞化学によって測定される。１つまたは複数の遺伝子の発現は、顕微鏡によっても測定され得る。顕微鏡は、光学、電子または走査型プローブ顕微鏡であり得る。光学顕微鏡は、明視野、傾斜照明（ｏｂｌｉｑｕｅｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）、交差偏光、分散染色、暗視野、位相差、微分干渉、干渉反射顕微鏡（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、蛍光（例えば、粒子、例えば細胞が免疫染色される場合）、共焦点、単一平面照明顕微鏡、ライトシート蛍光顕微鏡、デコンボリューションまたは連続時間符号化増幅顕微鏡（ｓｅｒｉａｌｔｉｍｅ−ｅｎｃｏｄｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）の使用を含み得る。ＭＨＣＩ分子の発現は、本明細書に記載される、発現を試験するための任意の方法によっても検出され得る。

破壊された遺伝子
本発明者らは、異なる組合せの破壊された遺伝子を有する細胞、臓器および／または組織が、レシピエント中に移植された場合、拒絶に対してあまり感受性でない細胞、臓器および／または組織を生じ得ることを見出した。例えば、本発明者らは、特定の遺伝子、例えば、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨ、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｃ３および／またはＣＩＩＴＡを破壊すること（例えば、それらの発現を低減させること）が、グラフト生存の見込みを増加させ得ることを見出した。

しかし、破壊は、これらの遺伝子のみに限定されない。破壊は、任意の特定の遺伝子の破壊であり得る。本出願内の遺伝子の遺伝子ホモログ（例えば、任意の哺乳動物バージョンの遺伝子）が網羅されることが企図される。例えば、破壊される遺伝子は、本明細書で開示される遺伝子、例えば、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨ、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｃ３および／またはＣＩＩＴＡに対して特定の同一性および／または相同性を示し得る。したがって、（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）少なくともまたは少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示す遺伝子、例えば、少なくともまたは少なくとも約５０％から６０％；６０％から７０％；７０％から８０％；８０％から９０％；または９０％から９９％までの相同性を示す遺伝子が破壊され得ることが企図される。（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）少なくともまたは少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９９％または１００％の同一性を示す遺伝子、例えば、少なくともまたは少なくとも約５０％から６０％；６０％から７０％；７０％から８０％；８０％から９０％；または９０％から９９％までの同一性を示す遺伝子が破壊され得ることもまた企図される。一部の遺伝子ホモログは、当該分野で公知であるが、一部の場合には、ホモログは未知である。しかし、哺乳動物間の相同遺伝子は、ＮＣＢＩＢＬＡＳＴなどの公に利用可能なデータベースを使用して核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列またはタンパク質配列を比較することによって見出され得る。例示的な遺伝子のゲノム配列、ｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、表１中に示される。

遺伝子抑制もまた、いくつかの方法で実施され得る。例えば、遺伝子発現は、ノックアウト、遺伝子のプロモーターを変更すること、および／または干渉ＲＮＡを投与すること（ノックダウン）によって、低減され得る。これは、生物レベルで、または組織、臓器および／もしくは細胞レベルで実施され得る。１つまたは複数の遺伝子が、非ヒト動物、細胞、組織および／または臓器においてノックダウンされる場合、１つまたは複数の遺伝子は、ＲＮＡ干渉試薬、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡを投与することによって低減され得る。例えば、ｓｈＲＮＡを発現し得る核酸は、発現をノックダウンするために、細胞中に安定にトランスフェクトされ得る。さらに、ｓｈＲＮＡを発現し得る核酸は、非ヒト動物のゲノム中に挿入され得、そうして、非ヒト動物内の遺伝子をノックダウンする。

破壊方法は、ドミナントネガティブタンパク質を過剰発現させることもまた含み得る。この方法は、機能的野生型遺伝子の全体的に減少した機能を生じ得る。さらに、ドミナントネガティブ遺伝子を発現させることは、ノックアウトおよび／またはノックダウンの表現型と類似した表現型を生じ得る。

時折、停止コドンが、１つまたは複数の遺伝子において（例えば、ヌクレオチド置き換えによって）挿入または創出され得、これは、非機能的な転写物またはタンパク質を生じ得る（時折、ノックアウトと呼ばれる）。例えば、停止コドンが１つまたは複数の遺伝子の内部に創出される場合、得られた転写および／またはタンパク質は、短縮され得、非機能的であり得る。しかし、一部の場合には、短縮は、活性な（部分的にまたは過度に活性な）タンパク質をもたらし得る。一部の場合には、タンパク質が過度に活性である場合、これは、ドミナントネガティブタンパク質、例えば、野生型タンパク質の活性を破壊する変異体ポリペプチドを生じ得る。

このドミナントネガティブタンパク質は、任意のプロモーターの制御範囲内の核酸中で発現され得る。例えば、プロモーターは、遍在性プロモーターであり得る。プロモーターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターおよび／または発生特異的プロモーターでもあり得る。

次いで、ドミナントネガティブタンパク質をコードする核酸は、細胞または非ヒト動物中に挿入され得る。任意の公知の方法が使用され得る。例えば、安定なトランスフェクションが使用され得る。さらに、ドミナントネガティブタンパク質をコードする核酸は、非ヒト動物のゲノム中に挿入され得る。

非ヒト動物中の１つまたは複数の遺伝子は、当該分野で公知の任意の方法を使用してノックアウトされ得る。例えば、１つまたは複数の遺伝子をノックアウトすることは、非ヒト動物のゲノムから１つまたは複数の遺伝子を欠失させることを含み得る。ノックアウトすることは、非ヒト動物から遺伝子配列の全てまたは一部を除去することもまた含み得る。ノックアウトすることは、非ヒト動物のゲノム中の遺伝子の全てまたは一部を、１つまたは複数のヌクレオチドで置き換えることを含み得ることもまた企図される。１つまたは複数の遺伝子をノックアウトすることは、１つまたは複数の遺伝子中に配列を挿入し、それによって、１つまたは複数の遺伝子の発現を破壊することもまた含み得る。例えば、配列を挿入することは、１つまたは複数の遺伝子の内部に停止コドンを生成し得る。配列を挿入することはまた、１つまたは複数の遺伝子のオープンリーディングフレームをシフトさせ得る。

ノックアウトは、非ヒト動物中の任意の細胞、臓器および／または組織において実施され得る。例えば、ノックアウトは、全身ノックアウトであり得る、例えば、１つまたは複数の遺伝子の発現が、非ヒト動物の全ての細胞において低減される。ノックアウトはまた、非ヒト動物の１つまたは複数の細胞、組織および／または臓器に対して特異的であり得る。これは、コンディショナルノックアウトによって達成され得、このとき、１つまたは複数の遺伝子の発現が、１つまたは複数の臓器、組織、または細胞の型において、選択的に低減される。コンディショナルノックアウトは、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系によって実施され得、このとき、ｃｒｅは、細胞、組織および／または臓器特異的プロモーターの制御下で発現される。例えば、１つまたは複数の遺伝子は、１つまたは複数の組織または臓器においてノックアウトされ得（または発現が低減され得）、１つまたは複数の組織または臓器には、脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、膵臓、小腸（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、大腸、骨格筋、平滑筋、皮膚、骨、脂肪組織、毛髪、甲状腺、気管、胆嚢、腎臓、尿管、膀胱、大動脈、静脈、食道、横隔膜、胃、直腸、副腎、気管支、耳、眼、網膜、生殖器、視床下部、喉頭、鼻、舌、脊髄もしくは尿管、子宮、卵巣、精巣、および／またはそれらの任意の組合せが含まれ得る。１つまたは複数の遺伝子はまた、１つの型の細胞においてノックアウトされ得（または発現が低減され得）、細胞の１つまたは複数の型には、毛包（ｔｒｉｃｈｏｃｙｔｅ）、ケラチノサイト、ゴナドトロピン産生細胞、コルチコトロピン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、成長ホルモン産生細胞、プロラクチン分泌細胞、クロマフィン細胞、傍濾胞細胞、糸球小体細胞（ｇｌｏｍｕｓｃｅｌｌ）メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）、母斑細胞、メルケル細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞角膜実質細胞、網膜ミューラー細胞、網膜色素上皮細胞、ニューロン、グリア（例えば、オリゴデンドロサイトアストロサイト）、上衣細胞、松果体細胞、肺胞細胞（例えば、Ｉ型肺胞細胞およびＩＩ型肺胞細胞）、クララ細胞、杯細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、腸クロマフィン様細胞、胃主細胞、壁細胞（ｐａｒｉｅｔａｌｃｅｌｌ）、小窩細胞、Ｋ細胞、Ｄ細胞、Ｉ細胞、杯細胞、パネート細胞、腸細胞、ミクロフォールド細胞、肝細胞、肝星細胞（例えば、中胚葉由来のクッパー細胞）、胆嚢細胞（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｃｙｔｅ）、房心細胞、膵星細胞、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞、膵ε細胞、甲状腺（例えば、濾胞細胞）、副甲状腺（例えば、副甲状腺主細胞）、好酸性細胞、尿路上皮細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋芽細胞、筋細胞、筋衛星細胞（ｍｙｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌ）、腱細胞、心筋細胞、脂肪芽細胞、脂肪細胞、カハールの間質細胞、血管芽細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞（例えば、糸球体内メサンギウム細胞および糸球体外メサンギウム細胞）、傍糸球体細胞、緻密斑細胞（ｍａｃｕｌａｄｅｎｓａｃｅｌｌ）、間質細胞（ｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌ）、間質細胞（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｃｅｌｌ）、テロサイト単純上皮細胞（ｔｅｌｏｃｙｔｅｓｓｉｍｐｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ）、有足細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞（ｋｉｄｎｅｙｐｒｏｘｉｍａｌｔｕｂｕｌｅｂｒｕｓｈｂｏｒｄｅｒｃｅｌｌ）、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、顆粒膜細胞、栓細胞（ｐｅｇｃｅｌｌ）、生殖細胞、精子卵子、リンパ球、骨髄系細胞、内皮前駆体細胞、内皮幹細胞、血管芽細胞、中胚葉性血管芽細胞（ｍｅｓｏａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）、周皮細胞壁細胞（ｍｕｒａｌｃｅｌｌ）、および／またはそれらの任意の組合せが含まれる。

コンディショナルノックアウトは、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター、発生特異的プロモーターを使用することによって、誘導可能であり得る。これは、任意の時点または特定の時点において遺伝子／タンパク質の発現を排除または抑制することを可能にし得る。例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーターの場合、テトラサイクリンが、誕生後のいつでも非ヒト動物に与えられ得る。非ヒト動物が胎内で発生する存在である場合、プロモーターは、妊娠の間に母親にテトラサイクリンを与えることによって誘導され得る。非ヒト動物が卵中で発生する場合、プロモーターは、テトラサイクリンを注射すること、またはテトラサイクリン中でインキュベートすることによって誘導され得る。テトラサイクリンが非ヒト動物に与えられると、テトラサイクリンは、目的の遺伝子の切り出しを次いで生じるｃｒｅの発現を生じる。

ｃｒｅ／ｌｏｘ系は、発生特異的プロモーターの制御下にあってもよい。例えば、一部のプロモーターは、誕生後、またはさらには思春期の開始後にオンになる。これらのプロモーターは、ｃｒｅ発現を制御するために使用され得、したがって、発生特異的ノックアウトにおいて使用され得る。

ノックアウトテクノロジーの任意の組合せが組み合わされ得ることもまた企図される。例えば、組織特異的ノックアウトは、誘導性テクノロジーと組み合わされて、組織特異的な誘導性ノックアウトを創出し得る。さらに、他の系、例えば発生特異的プロモーターが、組織特異的プロモーターおよび／または誘導性ノックアウトと組み合わせて使用され得る。

ノックアウトテクノロジーは、遺伝子編集もまた含み得る。例えば、遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびメガヌクレアーゼが含まれるヌクレアーゼを使用して実施され得る。ヌクレアーゼは、天然に存在するヌクレアーゼ、遺伝子改変された、および／または組換えであり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系は、遺伝子編集系として適切であり得る。

非ヒト動物の１つまたは複数の遺伝子の全て未満の対立遺伝子がノックアウトされ得ることもまた企図される。例えば、二倍体非ヒト動物では、２つの対立遺伝子のうち一方がノックアウトされることが企図される。これは、遺伝子の減少した発現および減少したタンパク質レベルを生じ得る。全体的に減少した発現は、両方の対立遺伝子が機能している場合、例えば、ノックアウトされていないおよび／またはノックダウンされていない場合と比較して、９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％もしくは２０％未満または約９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％もしくは２０％未満；例えば、９９％からもしくは約９９％から９０％；９０％からもしくは約９０％から８０％；８０％からもしくは約８０％から７０％；７０％からもしくは約７０％から６０％；６０％からもしくは約６０％から５０％；５０％からもしくは約５０％から４０％；４０％からもしくは約４０％から３０％、または３０％からもしくは約３０％から２０％までであり得る。さらに、タンパク質レベルにおける全体的な減少は、全体的な発現における減少と同じであり得る。タンパク質レベルにおける全体的な減少は、両方の対立遺伝子が機能している場合、例えば、ノックアウトされていないおよび／またはノックダウンされていない場合と比較して、９９％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％もしくは２０％未満または約９９％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％もしくは２０％未満、例えば、９９％からもしくは約９９％から９０％；９０％からもしくは約９０％から８０％；８０％からもしくは約８０％から７０％；７０％からもしくは約７０％から６０％；６０％からもしくは約６０％から５０％；５０％からもしくは約５０％から４０％；４０％からもしくは約４０％から３０％、または３０％からもしくは約３０％から２０％までであり得る。しかし、非ヒト動物中の１つまたは複数の遺伝子の全ての対立遺伝子がノックアウトされ得ることもまた企図される。

１つまたは複数の遺伝子のノックアウトは、遺伝子型決定によって検証され得る。遺伝子型決定のための方法には、シークエンシング、制限断片長多型同定（ＲＦＬＰＩ）、ランダム増幅多型検出（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型検出（ＡＦＬＰＤ）、ＰＣＲ（例えば、ロングレンジＰＣＲまたはステップワイズＰＣＲ）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ、およびＤＮＡマイクロアレイまたはビーズに対するハイブリダイゼーションが含まれ得る。例えば、遺伝子型決定は、シークエンシングによって実施され得る。一部の場合には、シークエンシングは、高忠実度シークエンシングであり得る。シークエンシングの方法には、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシークエンシング、鎖終結方法（例えば、Ｓａｎｇｅｒシークエンシング）、ショットガンシークエンシングおよびブリッジＰＣＲが含まれ得る。一部の場合には、遺伝子型決定は、次世代シークエンシングによって実施され得る。次世代シークエンシングの方法には、大規模並列シグネチャーシークエンシング、ポロニーシークエンシング、ピロシークエンシング（例えば、４５４ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓによって開発されたピロシークエンシング）、単分子リアルタイムシークエンシング（例えば、ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによる）、Ｉｏｎ半導体シークエンシング（例えば、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ半導体シークエンシングによる）、合成によるシークエンシング（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａによるＳｏｌｅｘａシークエンシングによる）、ライゲーションによるシークエンシング（例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるＳＯＬｉＤシークエンシング）、ＤＮＡナノボールシークエンシングおよびヘリスコープ単分子シークエンシングが含まれ得る。一部の場合には、本明細書の非ヒト動物の遺伝子型決定は、全ゲノムシークエンシング分析を含み得る。一部の場合には、動物における遺伝子のノックアウトは、遺伝子の一部または遺伝子全体をシークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）することによって検証され得る。例えば、ブタにおけるＮＬＲＣ５遺伝子のノックアウトは、ＮＬＲＣ５全体の次世代シークエンシングによって検証され得る。ＮＬＲＣ５の次世代シークエンシングは、例えば、フォワードプライマー５’−ｇｃｔｇｔｇｇｃａｔａｔｇｇｃａｇｔｔｃ−３’（配列番号１）およびリバースプライマー５’−ｔｃｃａｔｇｔａｔａａｇｔｃｔｔｔｔａ−３’（配列番号２）、またはフォワードプライマー５’−ｇｇｃａａｔｇｃｃａｇａｔｃｃｔｃａａｃ−３’（配列番号３）およびリバースプライマー５’−ｔｇｔｃｔｇａｔｇｔｃｔｔｔｃｔｃａｔｇ−３’（配列番号４）を使用して実施され得る。

導入遺伝子
導入遺伝子は、導入遺伝子なしよりも高いレベルで内因性遺伝子を過剰発現させるために有用であり得る。さらに、導入遺伝子は、外因性遺伝子を発現させるために使用され得る。導入遺伝子は、他の型の遺伝子、例えばドミナントネガティブ遺伝子もまた包含し得る。

タンパク質Ｘの導入遺伝子は、タンパク質Ｘをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を指し得る。本明細書で使用する場合、一部の場合には、タンパク質Ｘをコードする導入遺伝子は、タンパク質Ｘのアミノ酸配列の１００％または約１００％をコードする導入遺伝子であり得る。一部の場合には、タンパク質Ｘをコードする導入遺伝子は、タンパク質Ｘの完全または部分的アミノ酸配列をコードし得る。例えば、この導入遺伝子は、タンパク質Ｘのアミノ酸配列の少なくともまたは少なくとも約９９％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％もしくは５％、例えば、９９％からもしくは約９９％から９０％；９０％からもしくは約９０％から８０％；８０％からもしくは約８０％から７０％；７０％からもしくは約７０％から６０％；または６０％からもしくは約６０％から５０％までをコードし得る。導入遺伝子の発現は、機能的なタンパク質、例えば、部分的にまたは完全に機能的なタンパク質を最終的に生じ得る。上で議論したように、部分的配列が発現される場合、最終的な結果は、一部の場合には、非機能的タンパク質またはドミナントネガティブタンパク質であり得る。非機能的タンパク質またはドミナントネガティブタンパク質はまた、機能的（内因性または外因性）タンパク質と競合し得る。導入遺伝子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡ）もまたコードし得る。一部の場合には、導入遺伝子がｍＲＮＡをコードする場合、これは、次に、ポリペプチド（例えば、タンパク質）へと翻訳され得る。したがって、導入遺伝子は、タンパク質をコードし得ることが企図される。導入遺伝子は、一部の例では、タンパク質またはタンパク質の一部分をコードし得る。さらに、タンパク質は、野生型ポリペプチドと比較して、１つまたは複数の変異（例えば、欠失、挿入、アミノ酸置き換えまたは再編成）を有し得る。タンパク質は、天然ポリペプチドまたは人工ポリペプチド（例えば、組換えポリペプチド）であり得る。導入遺伝子は、２つまたはそれ超のポリペプチドによって形成される融合タンパク質をコードし得る。

導入遺伝子は、導入遺伝子の産物を産生する様式で、生物、細胞、組織または臓器中に配置され得る。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子を含む非ヒト動物が、本明細書で開示される。１つまたは複数の導入遺伝子は、本明細書に記載される１つまたは複数の破壊と組み合わせてであり得る。導入遺伝子は、細胞中に取り込まれ得る。例えば、導入遺伝子は、生物の生殖系列中に取り込まれ得る。細胞中に挿入される場合、導入遺伝子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のコピーである相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）セグメント、またはゲノムＤＮＡのその元の領域中に存在する遺伝子自体（イントロンありまたはなし）のいずれかであり得る。

非ヒト動物は、１つまたは複数のポリヌクレオチド挿入物を含む１つまたは複数の導入遺伝子を含み得る。これらのポリヌクレオチド挿入物は、１つもしくは複数のタンパク質またはそれらの機能的断片をコードし得る。一部の場合には、非ヒト動物は、ＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣＩ分子および／またはＭＨＣＩＩ分子）の発現および／または機能を低減させ得るタンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド挿入物を含む１つまたは複数の導入遺伝子を含み得る。１つまたは複数の導入遺伝子は、ＭＨＣＩ形成サプレッサー、補体活性化のレギュレーター、ＮＫ細胞に対する阻害性リガンド、Ｂ７ファミリーメンバー、ＣＤ４７、セリンプロテアーゼ阻害剤、ガレクチン、および／またはそれらの任意の断片をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド挿入物を含み得る。一部の場合には、ＭＨＣＩ形成サプレッサーは、感染細胞タンパク質４７（ＩＣＰ４７）であり得る。一部の場合には、補体活性化のレギュレーターは、表面抗原分類４６（ＣＤ４６）、表面抗原分類５５（ＣＤ５５）および表面抗原分類５９（ＣＤ５９）を含み得る。一部の場合には、ＮＫ細胞に対する阻害性リガンドは、白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）およびβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を含み得る。ＮＫ細胞に対する阻害性リガンドは、ＨＬＡ−Ｇのアイソフォーム、例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７であり得る。例えば、ＮＫ細胞に対する阻害性リガンドは、ＨＬＡ−Ｇ１であり得る。ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）の導入遺伝子は、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を指し得る。本明細書で使用する場合、一部の場合には、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）をコードする導入遺伝子は、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）のアミノ酸配列の１００％または約１００％をコードする導入遺伝子であり得る。他の場合には、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）をコードする導入遺伝子は、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）の完全または部分的配列をコードする導入遺伝子であり得る。例えば、導入遺伝子は、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）のアミノ酸配列の少なくともまたは少なくとも約９９％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％または５０％をコードし得る。例えば、導入遺伝子は、ＨＬＡ−Ｇアミノ酸配列の９０％をコードし得る。導入遺伝子は、機能的な（例えば、部分的にまたは完全に機能的な）ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）をコードするポリヌクレオチドを含み得る。一部の場合には、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）およびＢ２Ｍのうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド挿入物を含み得る。ＨＬＡ−ＧゲノムＤＮＡ配列は、８つのエクソンを有し得、選択的スプライシングが７つのアイソフォームを生じる。ＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームは、エクソン７を排除し得る。ＨＬＡ−Ｇ２アイソフォームは、エクソン３および７を排除し得る。イントロン２またはイントロン４の翻訳は、膜貫通ドメイン発現の喪失に起因して、分泌型アイソフォームを生じ得る。ＨＬＡ−Ｇのゲノム配列およびｃＤＮＡのマップは、図１４Ａ〜１４Ｂに示される。一部の場合には、Ｂ７ファミリーメンバーは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死−リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、Ｖ−ｓｅｔドメイン含有Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）、血小板受容体Ｇｉ２４、ナチュラル細胞傷害性誘発受容体３リガンド１（ＮＲ３Ｌ１）およびＨＥＲＶ−ＨＬＴＲ関連２（ＨＨＬＡ２）を含み得る。例えば、Ｂ７ファミリーメンバーは、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２であり得る。一部の場合には、セリンプロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼ阻害剤９（Ｓｐｉ９）であり得る。一部の場合には、ガレクチンは、ガレクチン−１、ガレクチン−２、ガレクチン−３、ガレクチン−４、ガレクチン−５、ガレクチン−６、ガレクチン−７、ガレクチン−８、ガレクチン−９、ガレクチン−１０、ガレクチン−１１、ガレクチン−１２、ガレクチン−１３、ガレクチン−１４およびガレクチン−１５を含み得る。例えば、ガレクチンは、ガレクチン−９であり得る。

遺伝子改変された非ヒト動物は、本明細書で開示される１つまたは複数の遺伝子の低減された発現および１つまたは複数の導入遺伝子を含み得る。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｃ３、ＣＩＩＴＡ、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２のうちの１つまたは複数の低減された発現、ならびにＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７、Ｓｐｉ９およびガレクチン−９のうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド挿入物を含む１つまたは複数の導入遺伝子を含み得る。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減された発現、ならびにＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、ＣＤ４７（例えば、ヒトＣＤ４７）、ＰＤ−Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−Ｌ２（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ２）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み得る。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減された発現、ならびにＨＬＡ−Ｅ、ＣＤ４７（例えば、ヒトＣＤ４７）、ＰＤ−Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−Ｌ２（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ２）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み得る。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＮＬＲＣ５、Ｃ３、ＣＸＣ１０、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減された発現、ならびにＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、ＣＤ４７（例えば、ヒトＣＤ４７）、ＰＤ−Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−Ｌ２（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ２）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み得る。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＣＸＣ１０ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減された発現、ならびにＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、ＣＤ４７（例えば、ヒトＣＤ４７）、ＰＤ−Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−Ｌ２（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ２）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み得る。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＮＬＲＣ５、Ｃ３、ＣＸＣ１０、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減された発現、ならびにＨＬＡ−Ｅ、ＣＤ４７（例えば、ヒトＣＤ４７）、ＰＤ−Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−Ｌ２（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ２）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み得る。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＣＸＣ１０、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減された発現、ならびにＨＬＡ−Ｅをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み得る。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＧＧＴＡ１の低減された発現、およびＨＬＡ−Ｅをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド挿入物を含む導入遺伝子を含み得る。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＧＧＴＡ１の低減された発現、およびＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド挿入物を含む導入遺伝子を含み得る。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、Ｒｏｓａ２６プロモーター、例えば、ブタＲｏｓａ２６プロモーターに隣接して挿入された、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド挿入物を含む導入遺伝子を含み得る。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＮＬＲＣ５、Ｃ３、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減された発現、ならびにタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含み得、タンパク質は、ＨＬＡ−Ｇ１、Ｓｐｉ９、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７およびガレクチン−９を含む。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減された発現、ならびにタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含み得、タンパク質は、ＨＬＡ−Ｇ１、Ｓｐｉ９、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７およびガレクチン−９を含む。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減された発現、ならびにタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含み得、タンパク質は、ＨＬＡ−Ｇ１、Ｓｐｉ９、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７およびガレクチン−９を含む。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＮＬＲＣ５、Ｃ３、ＧＧＴＡ１およびＣＸＣＬ１０の低減されたタンパク質発現、ならびにタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含み得、タンパク質は、ＨＬＡ−Ｇ１またはＨＬＡ−Ｅを含む。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＧＧＴＡ１およびＣＸＣＬ１０の低減されたタンパク質発現、ならびにタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含み得、タンパク質は、ＨＬＡ−Ｇ１またはＨＬＡ−Ｅを含む。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物は、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＧＧＴＡ１およびＣＸＣＬ１０の低減されたタンパク質発現、ならびにタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含み得、タンパク質は、ＨＬＡ−Ｇ１またはＨＬＡ−Ｅを含む。一部の場合には、本明細書の導入遺伝子によってコードされるＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ヒトＣＤ４７、ヒトＰＤ−Ｌ１およびヒトＰＤ−Ｌ２であり得る。

遺伝子改変された非ヒト動物は、動物のゲノム中の遺伝子座中に挿入された導入遺伝子を含み得る。一部の場合には、導入遺伝子は、標的化遺伝子のプロモーターに隣接して、または標的化遺伝子の内側に、挿入され得る。一部の場合には、導入遺伝子の挿入は、標的化遺伝子の発現を低減させ得る。標的化遺伝子は、本明細書で開示される、その発現が低減される遺伝子であり得る。例えば、導入遺伝子は、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｃ３、ＣＩＩＴＡ、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２のうちの１つもしくは複数のプロモーターに隣接して、またはそれらの内側に、挿入され得る。一部の場合には、導入遺伝子は、ＧＧＴＡ１のプロモーターに隣接して、またはＧＧＴＡ１の内側に、挿入され得る。

例えば、非ヒト動物は、感染細胞タンパク質４７（ＩＣＰ４７）、表面抗原分類４６（ＣＤ４６）、表面抗原分類５５（ＣＤ５５）、表面抗原分類５９（ＣＤ５９）、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｂ２Ｍ、Ｓｐｉ９、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７、ガレクチン−９、それらの任意の機能的断片、またはそれらの任意の組合せの１つまたは複数のポリヌクレオチド挿入物を含む１つまたは複数の導入遺伝子を含み得る。ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）またはＢ２Ｍをコードするポリヌクレオチドは、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｂ２Ｍ、Ｓｐｉ９、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７またはガレクチン−９ヒトタンパク質のうちの１つまたは複数をコードし得る。非ヒト動物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ超の導入遺伝子を含み得る。例えば、非ヒト動物は、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｂ２Ｍ、Ｓｐｉ９、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７、ガレクチン−９、それらの任意の機能的断片、またはそれらの任意の組合せを含む１つまたは複数の導入遺伝子を含み得る。非ヒト動物はまた、ＩＣＰ４７をコードする単一の導入遺伝子を含み得る。非ヒト動物は、時折、ＣＤ５９をコードする単一の導入遺伝子を含み得る。非ヒト動物は、時折、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）をコードする単一の導入遺伝子を含み得る。非ヒト動物は、時折、ＨＬＡ−Ｅをコードする単一の導入遺伝子を含み得る。非ヒト動物は、時折、Ｂ２Ｍをコードする単一の導入遺伝子を含み得る。非ヒト動物はまた、２つまたはそれ超の導入遺伝子を含み得、２つまたはそれ超の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、および／またはそれらの任意の組合せである。例えば、２つまたはそれ超の導入遺伝子は、ＣＤ５９およびＣＤ４６またはＣＤ５９およびＣＤ５５を含み得る。非ヒト動物はまた、３つまたはそれ超の導入遺伝子を含み得、３つまたはそれ超の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、またはそれらの任意の組合せを含み得る。例えば、３つまたはそれ超の導入遺伝子は、ＣＤ５９、ＣＤ４６およびＣＤ５５を含み得る。非ヒト動物はまた、４つまたはそれ超の導入遺伝子を含み得、４つまたはそれ超の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９を含み得る。非ヒト動物は、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９を含む４つまたはそれ超の導入遺伝子を含み得る。

導入遺伝子および遺伝子破壊の組合せが使用され得る。非ヒト動物は、１つまたは複数の低減された遺伝子および１つまたは複数の導入遺伝子を含み得る。例えば、その発現が低減される１つまたは複数の遺伝子は、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨ、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｃ３、ＣＩＩＴＡ、および／またはそれらの任意の組合せのうちいずれか１つを含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、それらの任意の機能的断片、および／またはそれらの任意の組合せを含み得る。例えば、様々な組合せを単に例示するために、その発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子は、ＮＬＲＣ５を含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７を含む。その発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＴＡＰ１を含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７を含む。その発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５およびＴＡＰ１を含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７を含む。その発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１およびＧＧＴＡ１を含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７を含む。その発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２およびＣＭＡＨを含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７を含む。その発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２およびＣＭＡＨを含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７を含む。その発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５を含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ５９を含む。その発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＴＡＰ１を含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ５９を含む。その発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５およびＴＡＰ１を含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ５９を含む。その発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１およびＧＧＴＡ１を含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ５９を含む。その発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２およびＣＭＡＨを含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ５９を含む。その発現が破壊される１つまたは複数の遺伝子はまた、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２およびＣＭＡＨを含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ５９を含む。

使用され得、具体的に企図される導入遺伝子は、本明細書で開示される遺伝子、例えば、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｂ２Ｍ、Ｓｐｉ９、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７、ガレクチン−９、それらの任意の機能的断片、および／またはそれらの任意の組合せに対して特定の同一性および／または相同性を示す遺伝子が含まれ得る。したがって、遺伝子が、（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）少なくともまたは少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の相同性、例えば、少なくともまたは少なくとも約９９％から９０％；９０％から８０％；８０％から７０％；７０％から６０％の相同性を示す場合、それが導入遺伝子として使用され得ることが企図される。（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）少なくともまたは少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性、例えば、少なくとも９９％または少なくとも約９９％から９０％；９０％から８０％；８０％から７０％；７０％から６０％の同一性を示す遺伝子が導入遺伝子として使用され得ることもまた企図される。

非ヒト動物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ超のドミナントネガティブ導入遺伝子もまた含み得る。ドミナントネガティブ導入遺伝子の発現は、ドミナントネガティブ導入遺伝子の野生型対応動物の発現および／または機能を抑制し得る。したがって、例えば、ドミナントネガティブ導入遺伝子Ｘを含む非ヒト動物は、その発現が低減されるＸ遺伝子を含む異なる非ヒト動物と比較して、類似の表現型を有し得る。１つまたは複数のドミナントネガティブ導入遺伝子は、ドミナントネガティブＮＬＲＣ５、ドミナントネガティブＴＡＰ１、ドミナントネガティブＧＧＴＡ１、ドミナントネガティブＣＭＡＨ、ドミナントネガティブＢ４ＧＡＬＮＴ２、ドミナントネガティブＣＸＣＬ１０、ドミナントネガティブＭＩＣＡ、ドミナントネガティブＭＩＣＢ、ドミナントネガティブＣＩＩＴＡ、ドミナントネガティブＣ３、またはそれらの任意の組合せであり得る。

遺伝子発現を抑制し得る、例えば、遺伝子をノックダウンし得る１つまたは複数の核酸をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含む非ヒト動物もまた提供される。遺伝子発現を抑制するＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉおよびｍｉｃｒｏＲＮＡを含み得るがこれらに限定されない。例えば、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉおよび／またはｍｉｃｒｏＲＮＡは、遺伝子発現を抑制するために、非ヒト動物に与えられ得る。さらに、非ヒト動物は、ｓｈＲＮＡをコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含み得る。ｓｈＲＮＡは、特定の遺伝子に対して特異的であり得る。例えば、ｓｈＲＮＡは、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨ、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＩＩＴＡ、Ｃ３、および／またはそれらの任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない、本出願に記載される任意の遺伝子に対して特異的であり得る。

対象に移植される場合、遺伝子改変された非ヒト動物由来の細胞、組織または臓器は、遺伝子改変されていない対応動物由来の細胞、組織または臓器と比較して、対象においてより低い免疫応答（例えば、移植拒絶）を誘発し得る。一部の場合には、免疫応答には、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞）およびＮＫ細胞の活性化、増殖および細胞傷害性が含まれ得る。したがって、本明細書で開示される遺伝子改変された細胞の表現型は、細胞をＮＫ細胞、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞）と共培養し、ＮＫ細胞またはＴ細胞の活性化、増殖および細胞傷害性を試験することによって測定され得る。一部の場合には、遺伝子改変された細胞によって誘導される、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の活性化、増殖および細胞傷害性は、遺伝子改変されていない細胞によって誘導されるものよりも低い可能性がある。一部の場合には、本明細書の遺伝子改変された細胞の表現型は、酵素免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイによって測定され得る。

１つまたは複数の導入遺伝子は、異なる種由来であり得る。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子は、ヒト遺伝子、マウス遺伝子、ラット遺伝子、ブタ遺伝子、ウシ遺伝子、イヌ遺伝子、ネコ遺伝子、サル遺伝子、チンパンジー遺伝子、またはそれらの任意の組合せを含み得る。例えば、導入遺伝子は、ヒト遺伝子配列を有する、ヒト由来であり得る。１つまたは複数の導入遺伝子は、ヒト遺伝子を含み得る。一部の場合には、１つまたは複数の導入遺伝子は、アデノウイルス遺伝子ではない。

導入遺伝子は、ランダムまたは部位特異的様式で、非ヒト動物のゲノム中に挿入され得る。例えば、導入遺伝子は、非ヒト動物のゲノム中のランダム遺伝子座に挿入され得る。これらの導入遺伝子は、ゲノムのどこに挿入されても、完全に機能的であり得る。例えば、導入遺伝子は、それ自身のプロモーターをコードし得る、または内因性プロモーターの制御下にある位置に挿入され得る。あるいは、導入遺伝子は、遺伝子、例えば、遺伝子のイントロンもしくは遺伝子のエクソン、プロモーターまたは非コード領域中に挿入され得る。

時折、１コピーよりも多い導入遺伝子が、ゲノム中の１つよりも多いランダム遺伝子座中に挿入され得る。例えば、複数のコピーが、ゲノム中の１つのランダム遺伝子座中に挿入され得る。これは、導入遺伝子がランダムに１回挿入される場合よりも、増加した全体的発現をもたらし得る。あるいは、１コピーの導入遺伝子が、ある遺伝子中に挿入され得、別のコピーの導入遺伝子が、異なる遺伝子中に挿入され得る。導入遺伝子は、非ヒト動物のゲノム中の特定の遺伝子座に挿入され得るように、標的化され得る。

導入遺伝子の発現は、１つまたは複数のプロモーターによって制御され得る。プロモーターは、遍在性、組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。プロモーターに隣接して挿入された導入遺伝子の発現は、調節され得る。例えば、導入遺伝子が、遍在性プロモーターの近傍またはその隣に挿入される場合、導入遺伝子は、非ヒト動物の全ての細胞において発現される。一部の遍在性プロモーターは、ＣＡＧＧＳプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＲｏｓａ２６プロモーターであり得る。

プロモーターは、内因性または外因性であり得る。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子は、内因性または外因性のＲｏｓａ２６プロモーターに隣接して挿入され得る。さらに、プロモーターは、非ヒト動物に特異的であり得る。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子は、ブタＲｏｓａ２６プロモーターに隣接して挿入され得る。

組織特異的プロモーター（これは、細胞特異的プロモーターと同義語であり得る）は、発現の位置を制御するために使用され得る。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子は、組織特異的プロモーターに隣接して挿入され得る。組織特異的プロモーターは、ＦＡＢＰプロモーター、Ｌｃｋプロモーター、ＣａｍＫＩＩプロモーター、ＣＤ１９プロモーター、ケラチンプロモーター、アルブミンプロモーター、ａＰ２プロモーター、インスリンプロモーター、ＭＣＫプロモーター、ＭｙＨＣプロモーター、ＷＡＰプロモーターまたはＣｏｌ２Ａプロモーターであり得る。例えば、プロモーターは、膵臓特異的プロモーター、例えば、インスリンプロモーターであり得る。

誘導性プロモーターも同様に使用され得る。これらの誘導性プロモーターは、誘導剤を添加または除去することによって、所望に応じて、オンおよびオフにされ得る。誘導性プロモーターは、Ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒａＢＡＤ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ＰＬ、ｃｓｐＡ、Ｔ７、ＶＨＢ、Ｍｘおよび／またはＴｒｅｘであり得ることが企図される。

本明細書に記載される非ヒト動物または細胞は、インスリンをコードする導入遺伝子を含み得る。インスリンをコードする導入遺伝子は、ヒト遺伝子、マウス遺伝子、ラット遺伝子、ブタ遺伝子、ウシ遺伝子、イヌ遺伝子、ネコ遺伝子、サル遺伝子、チンパンジー遺伝子または任意の他の哺乳動物遺伝子であり得る。例えば、インスリンをコードする導入遺伝子は、ヒト遺伝子であり得る。インスリンをコードする導入遺伝子は、キメラ遺伝子、例えば、部分的にヒトの遺伝子でもあり得る。

導入遺伝子の発現は、導入遺伝子の転写物のレベルを検出することによって測定され得る。例えば、導入遺伝子の発現は、ノザンブロッティング、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護アッセイ）、逆転写ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ（例えば、リアルタイムＰＣＲ、例えば、リアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ）、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））、ドットブロット分析、ディファレンシャルディスプレイ、遺伝子発現の連続的分析、サブトラクティブハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、ナノストリングおよび／またはシークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）によって測定され得る。一部の場合には、導入遺伝子の発現は、遺伝子によってコードされるタンパク質を検出することによって測定され得る。例えば、１つまたは複数の遺伝子の発現は、タンパク質免疫染色、タンパク質免疫沈降、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ウエスタンブロッティング、ビシンコニン酸アッセイ、分光光度測定、質量分析、酵素アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ）、免疫組織化学、フローサイトメトリー、および／または免疫細胞化学によって測定され得る。一部の場合には、導入遺伝子の発現は、顕微鏡によって測定され得る。顕微鏡は、光学、電子または走査型プローブ顕微鏡であり得る。一部の場合には、光学顕微鏡は、明視野、傾斜照明、交差偏光、分散染色、暗視野、位相差、微分干渉、干渉反射顕微鏡、蛍光（例えば、粒子、例えば細胞が免疫染色される場合）、共焦点、単一平面照明顕微鏡、ライトシート蛍光顕微鏡、デコンボリューションまたは連続時間符号化増幅顕微鏡の使用を含む。

導入遺伝子の挿入は、遺伝子型決定によって検証され得る。遺伝子型決定のための方法には、シークエンシング、制限断片長多型同定（ＲＦＬＰＩ）、ランダム増幅多型検出（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型検出（ＡＦＬＰＤ）、ＰＣＲ（例えば、ロングレンジＰＣＲまたはステップワイズＰＣＲ）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ、およびＤＮＡマイクロアレイまたはビーズに対するハイブリダイゼーションが含まれ得る。一部の場合には、遺伝子型決定は、シークエンシングによって実施され得る。一部の場合には、シークエンシングは、高忠実度シークエンシングであり得る。シークエンシングの方法には、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシークエンシング、鎖終結方法（例えば、Ｓａｎｇｅｒシークエンシング）、ショットガンシークエンシングおよびブリッジＰＣＲが含まれ得る。一部の場合には、遺伝子型決定は、次世代シークエンシングによって実施され得る。次世代シークエンシングの方法には、大規模並列シグネチャーシークエンシング、ポロニーシークエンシング、ピロシークエンシング（例えば、４５４ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓによって開発されたピロシークエンシング）、単分子リアルタイムシークエンシング（例えば、ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによる）、Ｉｏｎ半導体シークエンシング（例えば、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ半導体シークエンシングによる）、合成によるシークエンシング（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａによるＳｏｌｅｘａシークエンシングによる）、ライゲーションによるシークエンシング（例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるＳＯＬｉＤシークエンシング）、ＤＮＡナノボールシークエンシングおよびヘリスコープ単分子シークエンシングが含まれ得る。一部の場合には、本明細書の非ヒト動物の遺伝子型決定は、全ゲノムシークエンシング分析を含み得る。

一部の場合には、動物における導入遺伝子の挿入は、導入遺伝子の一部または導入遺伝子全体をシークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）することによって検証され得る。例えば、ブタにおけるＲｏｓａ２６プロモーターに隣接した導入遺伝子の挿入は、例えば、フォワードプライマー５’−ｃｇｃｃｔａｇａｇａａｇａｇｇｃｔｇｔｇ−３’（配列番号３５）およびリバースプライマー５’−ｃｔｇｃｔｇｔｇｇｃｔｇｔｇｇｔｇｔａｇ−３’（配列番号３６）を使用して、Ｒｏｓａのエクソン１から４の次世代シークエンシングによって検証され得る。

非ヒト動物の集団
単一の非ヒト動物、およびまた非ヒト動物の集団が、本明細書で提供される。非ヒト動物の集団は、遺伝的に同一であり得る。非ヒト動物の集団はまた、表現型的に同一であり得る。非ヒト動物の集団は、表現型的に同一および遺伝的に同一の両方であり得る。

遺伝子改変され得る非ヒト動物の集団が、本明細書でさらに提供される。例えば、集団は、本明細書で開示されるように、少なくともまたは少なくとも約２、５、１０、５０、１００または２００の非ヒト動物を含み得る。集団の非ヒト動物は、同一の表現型を有し得る。例えば、集団の非ヒト動物は、クローンであり得る。非ヒト動物の集団は、同一の肉体的特徴を有し得る。同一の表現型を有する集団の非ヒト動物は、同じ導入遺伝子を含み得る。同一の表現型を有する集団の非ヒト動物はまた、その発現が低減される同じ遺伝子を含み得る。同一の表現型を有する集団の非ヒト動物はまた、その発現が低減される同じ遺伝子を含み得、同じ導入遺伝子を含み得る。非ヒト動物の集団は、少なくともまたは少なくとも約２、５、１０、５０、１００または２００の、同一の表現型を有する非ヒト動物を含み得る。例えば、任意の特定の同腹仔の表現型は、同一の表現型を有し得る（例えば、一例では、１から約２０までのいずれかの非ヒト動物）。集団の非ヒト動物は、同一の表現型を有するブタであり得る。

集団の非ヒト動物は、同一の遺伝子型を有し得る。例えば、集団中の非ヒト動物の染色体中の全ての核酸配列は、同一であり得る。同一の遺伝子型を有する集団の非ヒト動物は、同じ導入遺伝子を含み得る。同一の遺伝子型を有する集団の非ヒト動物はまた、その発現が低減される同じ遺伝子を含み得る。同一の遺伝子型を有する集団の非ヒト動物はまた、その発現が低減される同じ遺伝子を含み得、同じ導入遺伝子を含み得る。非ヒト動物の集団は、少なくともまたは少なくとも約２、５、５０、１００または２００の、同一の遺伝子型を有する非ヒト動物を含み得る。集団の非ヒト動物は、同一の遺伝子型を有するブタであり得る。

同一の遺伝子型および／または表現型を有する２つまたはそれ超の非ヒト動物由来の細胞は、寛容化ワクチンにおいて使用され得る。一部の場合には、本明細書で開示される寛容化ワクチンは、同一の遺伝子型および／または表現型を有する２つまたはそれ超の非ヒト動物（例えば、ブタ）由来の複数の細胞（例えば、遺伝子改変された細胞）を含み得る。グラフトに対してレシピエントを免疫寛容化するための方法は、同一の遺伝子型または表現型を有する２つまたはそれ超の非ヒト動物由来の複数の細胞（例えば、遺伝子改変された細胞）を含む寛容化ワクチンをレシピエントに投与するステップを含み得る。

同一の遺伝子型および／または表現型を有する２つまたはそれ超の非ヒト動物由来の細胞は、移植において使用され得る。一部の場合には、グラフト（例えば、異種グラフトまたは同種グラフト）は、同一の遺伝子型および／または表現型を有する２つまたはそれ超の非ヒト動物由来の複数の細胞を含み得る。本明細書に記載される方法の実施形態では、例えば、それを必要とする対象において疾患を処置するための方法は、同一の遺伝子型および／または表現型を有する２つまたはそれ超の非ヒト動物由来の複数の細胞（例えば、遺伝子改変された細胞）を移植するステップを含み得る。

非ヒト動物の集団は、当該分野で公知の任意の方法を使用して生成され得る。一部の場合には、非ヒト動物の集団は、繁殖によって生成され得る。例えば、同系交配は、表現型的にまたは遺伝的に同一の非ヒト動物または非ヒト動物の集団を生成するために使用され得る。同系交配、例えば、同胞対同胞または親対仔、または孫対祖父母、またはひ孫対曾祖父母が使用され得る。連続的ラウンドの同系交配は、表現型的にまたは遺伝的に同一の非ヒト動物を最終的に生じ得る。例えば、少なくともまたは少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０または５０世代の同系交配は、表現型的におよび／または遺伝的に同一の非ヒト動物を生じ得る。１０〜２０世代の同系交配後に、非ヒト動物の遺伝的構成は、少なくとも９９％純粋であると考えられる。非ヒト動物は、同一の双生児でない可能性があるので、継続的な同系交配は、本質的に同質遺伝子的な、または同質遺伝子的に近い、非ヒト動物をもたらし得る。

繁殖は、同じ遺伝子型を有する非ヒト動物を使用して実施され得る。例えば、非ヒト動物は、その発現が低減される同じ遺伝子（複数可）を有する、および／または同じ導入遺伝子（複数可）を保有する。繁殖は、異なる遺伝子型を有する非ヒト動物を使用しても実施され得る。繁殖は、遺伝子改変された非ヒト動物および遺伝子改変されていない非ヒト動物、例えば、遺伝子改変された雌性ブタおよび野生型雄性ブタ、または遺伝子改変された雄性ブタおよび野生型雌性ブタを使用して実施され得る。繁殖の全てのこれらの組合せは、所望の非ヒト動物を産生するために使用され得る。

遺伝子改変された非ヒト動物の集団は、クローニングによっても生成され得る。例えば、遺伝子改変された非ヒト動物細胞の集団は、遺伝的にまたは表現型的に同一の個々の非ヒト動物の類似の集団を無性生殖的に生成し得る。クローニングは、種々の方法、例えば、双子化（ｔｗｉｎｎｉｎｇ）（例えば、１つまたは複数の細胞を胚から分割し、それらを新たな胚へと成長させる）、体細胞核移入または人工授精によって、実施され得る。方法のさらなる詳細は、本開示を通して提供される。

ＩＩ．遺伝子改変された細胞
疾患を処置または予防するために使用され得る１つまたは複数の遺伝子改変された細胞が、本明細書で開示される。これらの遺伝子改変された細胞は、遺伝子改変された非ヒト動物由来であり得る。例えば、上に開示された遺伝子改変された非ヒト動物は、１つまたは複数の細胞が、単離された遺伝子改変された細胞を生成するために単離されるように、処理され得る。これらの単離された細胞はまた、一部の場合には、さらに遺伝子改変された細胞であり得る。しかし、細胞は、改変されたまたは未改変のヒトまたは非ヒト動物細胞を使用して、ｅｘｖｉｖｏで、例えば、動物の外側で、改変され得る。例えば、細胞（ヒトおよび非ヒト動物細胞を含む）は、培養物中で改変され得る。遺伝子改変された細胞は、本明細書に記載される遺伝子改変された非ヒト動物を生成するために使用され得ることもまた企図される。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、遺伝子改変された動物から単離され得る。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、遺伝子改変されていない動物由来の細胞に由来し得る。細胞の単離は、初代細胞の単離および培養の方法を含む、当該分野で公知の方法によって実施され得る。遺伝子改変された細胞は、ヒトからは抽出されないことが、具体的に企図される。

したがって、全体で記載されるような作製する種々の方法を含む、遺伝子改変された非ヒト動物に適用され得るどんなものも、本明細書に同様に適用され得る。例えば、破壊される遺伝子および過剰発現される導入遺伝子は全て、本明細書で使用される遺伝子改変された細胞を作製する際に適用可能である。さらに、全体で記載される遺伝子改変された非ヒト動物において遺伝子型および遺伝子の発現を試験するための任意の方法は、細胞の遺伝子改変を試験するために使用され得る。

遺伝子改変された細胞は、ローラシア獣上目のメンバーまたは非ヒト霊長類由来であり得る。かかる遺伝子改変された細胞は、ローラシア獣上目のメンバーまたは非ヒト霊長類から単離され得る。あるいは、かかる遺伝子改変された細胞は、ローラシア獣上目のメンバーまたは非ヒト霊長類に起源し得る。例えば、遺伝子改変された細胞は、例えば、細胞培養または遺伝子改変方法を使用して、ローラシア獣上目のメンバーまたは非ヒト霊長類から単離された細胞から作製され得る。

遺伝子改変された細胞、例えば、遺伝子改変された動物由来の細胞またはｅｘｖｉｖｏで作製された細胞は、分析および選別され得る。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、フローサイトメトリー、例えば、蛍光活性化細胞選別によって分析および選別され得る。例えば、導入遺伝子を発現する遺伝子改変された細胞は、導入遺伝子によってコードされるポリペプチドを認識する標識（例えば、蛍光標識）に基づくフローサイトメトリーを使用して検出され得、他の細胞から精製され得る。

非ヒト動物およびヒトの幹細胞を含む幹細胞が使用され得る。幹細胞は、生存可能なヒトを生成する能力を有さない。例えば、幹細胞は、生存可能なヒトを生成することができないように、不可逆的に分化され得る。幹細胞は、幹細胞が生存可能なヒトを生成できないという警告付きで、多能性であり得る。

遺伝子改変された非ヒト動物に関するセクションにおいて上で議論したように、遺伝子改変された細胞は、その発現が低減される１つまたは複数の遺伝子を含み得る。遺伝子改変された非ヒト動物について上で開示したのと同じ遺伝子が、破壊され得る。例えば、遺伝子改変された細胞は、その発現が破壊、例えば低減されている１つまたは複数の遺伝子を含み、１つまたは複数の遺伝子は、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨ、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｃ３、ＣＩＩＴＡおよび／またはそれらの任意の組合せを含む。さらに、遺伝子改変された細胞は、１つまたは複数のポリヌクレオチド挿入物を含む１つまたは複数の導入遺伝子を含み得る。例えば、遺伝子改変された細胞は、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｂ２Ｍ、Ｓｐｉ９、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７、ガレクチン−９、それらの任意の機能的断片、またはそれらの任意の組合せの１つまたは複数のポリヌクレオチド挿入物を含む１つまたは複数の導入遺伝子を含み得る。遺伝子改変された細胞は、１つまたは複数の低減された遺伝子および１つまたは複数の導入遺伝子を含み得る。例えば、その発現が低減される１つまたは複数の遺伝子は、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨ、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＩＩＴＡ、および／またはそれらの任意の組合せのうちいずれか１つを含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｂ２Ｍ、Ｓｐｉ９、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７、ガレクチン−９、それらの任意の機能的断片、および／またはそれらの任意の組合せを含み得る。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、ＮＬＲＣ５、Ｃ３、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減された発現、ならびにタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含み得、タンパク質は、ＨＬＡ−Ｇ１、Ｓｐｉ９、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７およびガレクチン−９を含む。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減された発現、ならびにタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含み得、タンパク質は、ＨＬＡ−Ｇ１、Ｓｐｉ９、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７およびガレクチン−９を含む。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減された発現、ならびにタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含み得、タンパク質は、ＨＬＡ−Ｇ１、Ｓｐｉ９、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７およびガレクチン−９を含む。一部の場合には、本明細書の導入遺伝子によってコードされるＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ヒトＣＤ４７、ヒトＰＤ−Ｌ１およびヒトＰＤ−Ｌ２であり得る。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、その表面上がＣＤ４７でコーティングされ得る。細胞の表面上のＣＤ４７のコーティングは、細胞表面をビオチン化し、その後、ビオチン化細胞をストレプトアビジン−ＣＤ４７キメラタンパク質と共にインキュベートすることによって達成され得る。コーティングされるＣＤ４７は、ヒトＣＤ４７であり得る。

遺伝子改変された非ヒト動物に関するセクションにおいて上で議論したように、遺伝子改変された細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ超の破壊された遺伝子を含み得る。遺伝子改変された細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ超の導入遺伝子もまた含み得る。

上で詳細に議論したように、遺伝子改変された細胞、例えば、ブタ細胞は、ドミナントネガティブ導入遺伝子および／または１つもしくは複数のノックダウン遺伝子を発現する導入遺伝子もまた含み得る。上でも議論したように、導入遺伝子の発現は、１つまたは複数のプロモーターによって制御され得る。

遺伝子改変された細胞は、組織または臓器由来の１つまたは複数の細胞であり得、組織または臓器には、脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、膵臓、小腸、大腸、骨格筋、平滑筋、皮膚、骨、脂肪組織、毛髪、甲状腺、気管、胆嚢、腎臓、尿管、膀胱、大動脈、静脈、食道、横隔膜、胃、直腸、副腎、気管支、耳、眼、網膜、生殖器、視床下部、喉頭、鼻、舌、脊髄もしくは尿管、子宮、卵巣および精巣が含まれる。例えば、遺伝子改変された細胞、例えば、ブタ細胞は、脳、心臓、肝臓、皮膚、腸、肺、腎臓、眼、小腸または膵臓由来であり得る。一部の場合には、遺伝子改変された細胞は、膵臓由来であり得る。より具体的には、膵臓細胞は、島細胞であり得る。さらに、１つまたは複数の細胞は、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞（例えば、ＰＰ細胞）または膵ε細胞であり得る。例えば、遺伝子改変された細胞は、膵β細胞であり得る。本明細書で開示される組織または臓器は、１つまたは複数の遺伝子改変された細胞を含み得る。組織または臓器、例えば、１つまたは複数の遺伝子改変されたブタ由来の膵組織、例えば膵島は、本出願に記載される１つまたは複数の遺伝子改変された動物由来であり得る。

遺伝子改変された細胞、例えば、ブタ細胞は、１つまたは複数の型の細胞を含み得、細胞の１つまたは複数の型には、毛包、ケラチノサイト、ゴナドトロピン産生細胞、コルチコトロピン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、成長ホルモン産生細胞、プロラクチン分泌細胞、クロマフィン細胞、傍濾胞細胞、糸球小体細胞メラニン細胞、母斑細胞、メルケル細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞角膜実質細胞、網膜ミューラー細胞、網膜色素上皮細胞、ニューロン、グリア（例えば、オリゴデンドロサイトアストロサイト）、上衣細胞、松果体細胞、肺胞細胞（例えば、Ｉ型肺胞細胞およびＩＩ型肺胞細胞）、クララ細胞、杯細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、胃主細胞、壁細胞、小窩細胞、Ｋ細胞、Ｄ細胞、Ｉ細胞、杯細胞、パネート細胞、腸細胞、ミクロフォールド細胞、肝細胞、肝星細胞（例えば、中胚葉由来のクッパー細胞）、胆嚢細胞、房心細胞、膵星細胞、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞（例えば、ＰＰ細胞）、膵ε細胞、甲状腺（例えば、濾胞細胞）、副甲状腺（例えば、副甲状腺主細胞）、好酸性細胞、尿路上皮細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋芽細胞、筋細胞、筋衛星細胞、腱細胞、心筋細胞、脂肪芽細胞、脂肪細胞、カハールの間質細胞、血管芽細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞（例えば、糸球体内メサンギウム細胞および糸球体外メサンギウム細胞）、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、間質細胞、間質細胞、テロサイト単純上皮細胞、有足細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、顆粒膜細胞、栓細胞、生殖細胞、精子卵子、リンパ球、骨髄系細胞、内皮前駆体細胞、内皮幹細胞、血管芽細胞、中胚葉性血管芽細胞および周皮細胞壁細胞が含まれる。遺伝子改変された細胞は、潜在的に、細胞治療において使用される任意の細胞であり得る。例えば、細胞治療は、糖尿病などの疾患に対する膵β細胞補充または置換であり得る。

遺伝子改変された細胞、例えば、ブタ細胞は、非ヒト動物由来であり（例えば、非ヒト動物から抽出され）得る。１つまたは複数の細胞は、成熟成体非ヒト動物由来であり得る。しかし、１つまたは複数の細胞は、胎仔または新生仔組織由来であり得る。

疾患に依存して、１つまたは複数の細胞は、成体ドナー、例えば、島細胞ドナーとして有用であるのに十分なサイズまで成長したトランスジェニック非ヒト動物由来であり得る。一部の場合には、非ヒト動物は、離乳後の齢であり得る。例えば、非ヒト動物は、少なくともまたは少なくとも約６月齢であり得る。一部の場合には、非ヒト動物は、少なくともまたは少なくとも約１８月齢であり得る。非ヒト動物は、一部の場合には、繁殖齢に達するまで生存する。例えば、異種移植のための島は、新生仔（例えば、３〜７日齢）または離乳前（例えば、１４から２１日齢）のドナーブタ由来であり得る。１つまたは複数の遺伝子改変された細胞、例えば、ブタ細胞は、培養細胞であり得る。例えば、培養細胞は、野生型細胞由来または遺伝子改変された細胞（本明細書に記載される）由来であり得る。さらに、培養細胞は、初代細胞であり得る。初代細胞は、抽出され得、例えば、液体窒素中でまたは−２０℃から−８０℃で凍結され得る。培養細胞はまた、公知の方法によって不死化され得、例えば、液体窒素中でまたは−２０℃から−８０℃で、凍結および貯蔵され得る。

本明細書に記載される遺伝子改変された細胞、例えば、ブタ細胞は、野生型の遺伝子改変されていない細胞が移植される場合と比較した場合、拒絶のより低いリスクを有し得る。

ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｂ２Ｍ、Ｓｐｉ９、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７、ガレクチン−９、それらの任意の機能的断片、またはそれらの任意の組合せのポリヌクレオチド配列を含むベクターが、本明細書で開示される。これらのベクターは、（トランスフェクション、形質転換、ウイルス送達、または任意の他の公知の方法によって）細胞のゲノム中に挿入され得る。これらのベクターは、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｂ２ＭＳｐｉ９、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７および／もしくはガレクチン−９タンパク質またはそれらの機能的断片をコードし得る。

企図されるベクターには、プラスミドベクター、人工／ミニ染色体、トランスポゾンおよびウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。ＲＮＡを含む単離されたまたは合成核酸が本明細書でさらに開示され、ＲＮＡは、表２中の任意の配列によってコードされる。ＲＮＡはまた、表２中の任意の配列に対して少なくともまたは少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示す任意の配列をコードし得る。ＲＮＡはまた、表２中の任意の配列に対して少なくともまたは少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を示す任意の配列をコードし得る。

ＲＮＡは、単鎖ガイドＲＮＡであり得る。本開示は、表１中の任意の配列を含む単離されたまたは合成された核酸もまた提供する。ＲＮＡはまた、表１中の任意の配列に対して少なくともまたは少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示す単離されたまたは合成された核酸を提供し得る。ＲＮＡはまた、表１中の任意の配列に対して少なくともまたは少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を示す単離されたまたは合成された核酸を提供し得る。

ガイドＲＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノム中の１つまたは複数の遺伝子を標的化する際に使用され得る。例えば、ガイドＲＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノム中の単一の遺伝子を標的化し得る。一部の場合には、ガイドＲＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノム中の１つまたは複数の遺伝子の各々の１つまたは複数の標的部位を標的化し得る。

遺伝子改変された細胞はまた、白血球、リンパ球、Ｂリンパ球または任意の他の細胞、例えば、島細胞、島ベータ細胞もしくは肝細胞であり得る。これらの細胞は、本明細書で開示される任意の方法によって、例えば、ＥＣＤＩ固定によって、固定され得る、またはアポトーシス性にされ得る。

遺伝子改変された細胞は、非ヒト胎仔動物、周産期非ヒト動物、新生仔非ヒト動物、離乳前非ヒト動物、若年成体非ヒト動物、成体非ヒト動物、またはそれらの任意の組合せに由来し得る（例えば、そこから回収され得る）。一部の場合には、遺伝子改変された非ヒト動物細胞は、胚性組織、例えば、胚性膵組織に由来し得る。例えば、遺伝子改変された細胞は、胎生４２日目（Ｅ４２）由来の胚性ブタ膵組織に由来し得る（例えば、そこから回収され得る）。

用語「胎仔動物」およびその文法的等価物は、動物の任意の未誕生子孫を指し得る。用語「周産期動物」およびその文法的等価物は、誕生の直前または直後の動物を指し得る。例えば、周産期は、妊娠期間の２０週目から２８週目に開始し得、誕生の１から４週間後に終了し得る。用語「新生仔動物」およびその文法的等価物は、任意の新たに生まれた動物を指し得る。例えば、新生仔動物は、１ヵ月以内に誕生した動物であり得る。用語「離乳前非ヒト動物」およびその文法的等価物は、母親の乳汁から引き離される前の任意の動物を指し得る。

遺伝子改変された非ヒト動物細胞は、医薬組成物へと製剤化され得る。例えば、遺伝子改変された非ヒト動物細胞は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わされ得る。使用され得る賦形剤は、生理食塩水である。医薬組成物は、移植を必要とする患者を処置するために使用され得る。

遺伝子改変された細胞は、本明細書で開示される任意の遺伝子の低減された発現および／または任意の導入遺伝子を含み得る。細胞の遺伝子改変は、遺伝子改変された動物を作製するために本明細書に記載されるのと同じ方法のいずれかを使用することによって実施され得る。一部の場合には、非ヒト動物に起源する遺伝子改変された細胞を作製する方法は、１つもしくは複数の遺伝子の発現を低減させるステップおよび／または１つもしくは複数の導入遺伝子を挿入するステップを含み得る。遺伝子発現の低減および／または導入遺伝子挿入は、本出願に記載される任意の方法、例えば、遺伝子編集を使用して実施され得る。

幹細胞に由来する遺伝子改変された細胞
遺伝子改変された細胞は、幹細胞であり得る。これらの遺伝子改変された幹細胞は、本明細書で開示される方法によって、固定された細胞またはアポトーシス性細胞へと引き続いて処理され得る細胞の、潜在的に無制限の供給を行うために使用され得る。上で議論したように、幹細胞は、生存可能なヒトを生成することが不可能である。

ヒト多能性幹細胞からの、数億のインスリン産生性グルコース応答性膵ベータ細胞の産生は、糖尿病における細胞移植治療のための前例のない細胞供給源を提供する（Ｐａｇｌｉｕｃａら、２０１４年）。糖尿病および他の疾患における細胞移植治療のための他のヒト幹細胞（胚性、多能性、胎盤、誘導多能性など）由来の細胞供給源が、開発されている。

これらの幹細胞由来の細胞性グラフトは、拒絶に供される。拒絶は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介され得る。１型糖尿病レシピエントでは、ヒト幹細胞由来の機能的ベータ細胞は、拒絶および自己免疫性再発（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）に供される。両方とも、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介されると考えられる。

これらの同種反応性および自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化およびエフェクター機能を妨害するために、ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９遺伝子標的化を含む、遺伝子改変の確立された分子的方法が、幹細胞由来の、部分的にまたは完全に分化した細胞性グラフトにおいて、機能的ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現を防止することを目的として、ヒト幹細胞中のＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１および／またはＢ２Ｍ遺伝子を変異させるために使用され得る。したがって、ＭＨＣクラスＩの機能的発現を欠くヒト幹細胞由来の細胞性グラフトを移植することは、拒絶および自己免疫性再発を予防するために他に必要とされる免疫抑制の要求を最小化し得る。

しかし、移植されたヒト細胞上のＭＨＣクラスＩ発現の欠如は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の受動的活性化を引き起こす可能性が高い（Ｏｈｌｅｎら、１９８９年）。ＮＫ細胞の細胞傷害性は、ＮＫ細胞上の阻害性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを刺激して細胞死滅を防止するヒトＭＨＣクラス１遺伝子ＨＬＡ−Ｅの発現によって克服され得る（Ｗｅｉｓｓら、２００９年；Ｌｉｌｉｅｎｆｅｌｄら、２００７年；Ｓａｓａｋｉら、１９９９年）。ＨＬＡ−Ｅ遺伝子の首尾よい発現は、ヒトＢ２Ｍ（ベータ２ミクログロブリン）遺伝子および同族ペプチドの共発現に依存した（Ｗｅｉｓｓら、２００９年；Ｌｉｌｉｅｎｆｅｌｄら、２００７年；Ｓａｓａｋｉら、１９９９年；Ｐａｓｃａｓｏｖａら、１９９９年）。幹細胞ＤＮＡにおけるヌクレアーゼ媒介性切断は、相同組換え修復を介した１つまたは複数の遺伝子の挿入を可能にする。ＨＬＡ−ＥおよびｈＢ２Ｍ遺伝子は、順番に、ヌクレアーゼ媒介性ＤＮＡ切断の領域において組み込まれ得、そうして、導入遺伝子を挿入しながら、標的遺伝子（例えば、ＮＬＲＣ５）の発現を防止する。

排除までいかないとしても、ＭＨＣクラスＩの機能的発現を欠く幹細胞由来の細胞性グラフトのレシピエントにおける維持免疫抑制の必要をさらに最小化するために、これらのグラフトのレシピエントは、本明細書で開示される寛容化アポトーシス性ドナー細胞によっても処置され得る。

インスリン産生性膵ベータ細胞の産生のための方法（Ｐａｇｌｉｕｃａら、２０１４年）は、潜在的に、非ヒト（例えば、ブタ）の初代の単離された多能性、胚性幹細胞または幹様細胞に適用され得る（Ｇｏｎｃａｌｖｅｓら、２０１４年；ＨａｌｌらＶ．２００８年）。しかし、これらのインスリン産生性膵ベータ細胞のレシピエントは、グラフトの成功を脅かす活性な免疫応答を有する可能性が高い。抗体媒介性およびＣＤ８＋Ｔ細胞免疫攻撃を克服するために、ドナー動物は、本願を通して開示されるＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２またはＭＨＣクラスＩ関連遺伝子の発現を防止するために、初代非ヒト多能性、胚性幹細胞または幹様細胞の単離の前に遺伝子改変され得る。次いで、遺伝子改変された動物から単離された多能性、胚性幹細胞または幹様細胞は、数百万のインスリン産生性膵ベータ細胞へと分化され得る。

一部の場合には、異種幹細胞由来の細胞移植片が望まれ得る。例えば、ヒト胚性幹細胞の使用は、レシピエントにとって倫理的に不愉快であり得る。したがって、ヒトレシピエントは、非ヒト供給源の胚性幹細胞に由来する細胞性グラフトを受けることをより心地よく感じ得る。

非ヒト幹細胞には、ブタ幹細胞が含まれ得る。これらの幹細胞は、野生型ブタまたは遺伝子操作されたブタに由来し得る。野生型ブタに由来する場合、ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９遺伝子標的化を含む、遺伝子改変の確立された分子的方法を使用する遺伝子操作が、幹細胞段階で最良に実施され得る。遺伝子操作は、ＭＨＣクラスＩの機能的発現を防止するために、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１および／またはＢ２Ｍ遺伝子の発現を破壊するために標的化され得る。グラフトにおいてＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１およびＢ２Ｍなどの遺伝子を破壊することは、島ベータ細胞上を含むグラフト細胞上でのＭＨＣクラスＩの機能的発現の欠如を引き起こし、それによって、自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の移植後活性化を妨害し得る。したがって、これは、自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解性エフェクター機能から、移植片、例えば、移植された島ベータ細胞を保護できる。

しかし、幹細胞の遺伝子操作は、分化の潜在力を変更し得るので、１つのアプローチは、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１および／またはＢ２Ｍ遺伝子の発現が破壊されたブタを含む、遺伝子操作されたブタ由来の幹細胞株を生成することであり得る。

本願を通して開示される、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２遺伝子の発現もまた防止するために遺伝子改変された、または補体調節タンパク質ＣＤ４６、ＣＤ５５もしくはＣＤ５９をコードする導入遺伝子を発現するように改変されたブタからの幹細胞の生成は、インスリン産生性膵ベータ細胞または他の細胞性治療産物の治療的使用をさらに改善し得る。同様に、本明細書に記載されるのと同じストラテジーが、全体で記載される他の方法および組成物において使用され得る。

ＭＨＣクラスＩの機能的発現を欠くヒト幹細胞由来の細胞性グラフトのレシピエント中と同様に、ブタ幹細胞由来のグラフトのレシピエントにおける維持免疫抑制の必要は、寛容化アポトーシス性ドナー細胞による移植前後の処置によってさらに最小化され得る。

ＩＩＩ．寛容化ワクチン
伝統的に、ワクチンは、宿主に免疫を付与するために使用される。例えば、不活性化ウイルスをアジュバントと共に皮膚の下に注射することは、活性および／または毒性バージョンのウイルスに対する一時的または永久的な免疫をもたらし得る。これは、陽性ワクチンと呼ばれ得る（図３）。しかし、静脈内注射される不活性化細胞（例えば、ドナーまたはドナーとは遺伝的に異なる動物由来の細胞）は、ドナー細胞、または類似の細胞性マーカーを有する細胞の寛容を生じ得る。これは、寛容化ワクチン（陰性ワクチンとも呼ばれる）と呼ばれ得る（図３）。不活性細胞は、アジュバントなしで注射され得る。あるいは、不活性細胞は、アジュバントと共に注射され得る。これらの寛容化ワクチンは、レシピエントを寛容化し、拒絶を予防することによって、移植、例えば異種移植において有利であり得る。寛容化は、免疫抑制治療の使用なしに、レシピエントに付与され得る。しかし、一部の場合には、寛容化ワクチンと組み合わせた他の免疫抑制治療が、移植拒絶を減少させ得る。

図４は、一過的免疫抑制の援護の下での寛容化ワクチン接種のための、ドナー由来のアポトーシス性細胞の注入（例えば、静脈内注入）による、対象（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）における移植されたグラフト（例えば、異種グラフト）の生存を延長させるための例示的なアプローチを実証している。ドナーは、寛容化ワクチンとしての、移植のための異種グラフト（例えば、島）、ならびに細胞（例えば、脾細胞）を提供し得る。寛容化ワクチン細胞は、（例えば、ＥＣＤＩ固定による）アポトーシス性細胞であり得、移植の前（例えば、移植の７日前の最初のワクチン）および移植の後（例えば、移植の１日後の追加免疫ワクチン）に、レシピエントに投与され得る。寛容化ワクチンは、移植されたグラフト（例えば、島）の生存の時間を延長させる一過的免疫抑制を提供し得る。

寛容化ワクチンは、以下の型の細胞：ｉ）ＧＧＴＡ１単独、またはＧＧＴＡ１およびＣＭＡＨ、またはＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減された発現を有する遺伝子型的に同一な細胞を含むアポトーシス性細胞のうちの１つまたは複数を含み得る。これは、アポトーシス性細胞ワクチンドナー動物と遺伝子型的に同一な動物由来の、またはさらなる遺伝子改変（例えば、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＸＣＬ１０、Ｃ３、ＣＩＩＴＡ遺伝子の抑制、またはＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｂ２Ｍ、ＣＤ５９、もしくはそれらの任意の機能的断片の２もしくはそれ超のポリヌクレオチド挿入物を含む導入遺伝子の発現）を受けているが、アポトーシス性細胞ワクチンが由来するドナー動物と遺伝子型的に類似している動物由来の、臓器、組織、細胞および細胞株グラフト（例えば、異種グラフト）に対する細胞媒介性免疫および細胞依存的抗体媒介性免疫を最小化または排除し得る；ｉｉ）アポトーシス性細胞ワクチンドナー動物と遺伝子型的に同一な動物由来の、またはさらなる遺伝子改変（例えば、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＸＣＬ１０、Ｃ３、ＣＩＩＴＡ遺伝子の抑制、またはＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｂ２Ｍ、ＣＤ５９、もしくはそれらの任意の機能的断片の２もしくはそれ超のポリヌクレオチド挿入物を含む導入遺伝子の発現）を受けているが、アポトーシス性幹細胞由来の細胞ワクチンが由来するドナー動物と遺伝子型的に類似している動物由来の、臓器、組織、細胞および細胞株グラフト（例えば、異種グラフト）に対する細胞媒介性免疫および細胞依存的抗体媒介性免疫を最小化または排除するための、アポトーシス性幹細胞（例えば、胚性、多能性、胎盤、誘導多能性など）由来のドナー細胞（例えば、白血球、リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、赤血球、グラフト細胞または任意の他のドナー細胞）；ｉｉｉ）遺伝子改変（例えば、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＸＣＬ１０、Ｃ３、ＣＩＩＴＡ遺伝子の抑制）を受けているが、アポトーシス性ヒト幹細胞由来のドナー細胞ワクチンと他の点では遺伝子型的に類似している同じ幹細胞株に由来するヒト幹細胞株またはグラフト（例えば、同種グラフト）と遺伝子型的に同一な臓器、組織、細胞および細胞グラフト（例えば、同種グラフト）に対する細胞媒介性免疫および細胞依存的抗体媒介性免疫を最小化または排除するための、アポトーシス性幹細胞（例えば、胚性、多能性、胎盤、誘導多能性など）由来のドナー細胞（白血球、リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、赤血球、グラフト細胞、例えば、機能的島ベータ細胞または任意の他のドナー細胞）；ｉｖ）アポトーシス性ドナー細胞であって、細胞は、ＵＶ照射、ガンマ−照射、またはＥＣＤＩの存在下でのインキュベーションが関与しない他の方法によってアポトーシス性にされる、アポトーシス性ドナー細胞。一部の場合には、寛容化ワクチン細胞は、それを必要とする対象に投与され得る、例えば、注入（一部の場合には反復して注入）され得る。寛容化ワクチンは、細胞由来の１つまたは複数の遺伝子を破壊する（例えば、発現を低減させる）ことによって産生され得る。例えば、本出願を通じて記載される遺伝子改変された細胞は、寛容化ワクチンを作製するために使用され得る。例えば、細胞は、糖タンパク質ガラクトシルトランスフェラーゼアルファ１，３（ＧＧＴＡ１）、推定シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ様タンパク質（ＣＭＡＨ）、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、および／またはそれらの任意の組合せを含む、破壊され得る（例えば、低減された発現）１つまたは複数の遺伝子を有し得る。例えば、細胞は、破壊されたＧＧＴＡ１のみ、または破壊されたＣＭＡＨのみ、または破壊されたＢ４ＧＡＬＮＴ２のみを有し得る。細胞はまた、破壊されたＧＧＴＡ１およびＣＭＡＨ、破壊されたＧＧＴＡ１およびＢ４ＧＡＬＮＴ２、または破壊されたＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２を有し得る。細胞は、破壊されたＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２を有し得る。一部の場合には、破壊された遺伝子は、ＧＧＴＡ１を含まない。細胞はまた、ＮＬＲＣ５を（内因的にまたは外因的に）発現し得、一方で、ＧＧＴＡ１および／またはＣＭＡＨは破壊される。細胞はまた、破壊されたＣ３を有し得る。

寛容化ワクチンは、例えば、本出願を通じて記載される１つまたは複数の導入遺伝子をさらに発現するものを含む細胞を用いて産生され得る。例えば、寛容化ワクチンは、感染細胞タンパク質４７（ＩＣＰ４７）、表面抗原分類４６（ＣＤ４６）、表面抗原分類５５（ＣＤ５５）、表面抗原分類５９（ＣＤ５９）、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４７、それらの任意の機能的断片、またはそれらの任意の組合せの１つまたは複数のポリヌクレオチド挿入物を含む１つまたは複数の導入遺伝子を含む細胞を含み得る。一部の場合には、寛容化ワクチンは、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減されたタンパク質発現、ならびにタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含む遺伝子改変された細胞を含み得、タンパク質は、ＨＬＡ−Ｇ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＣＤ４７を含む。一部の場合には、寛容化ワクチンは、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減されたタンパク質発現、ならびにタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含む遺伝子改変された細胞を含み得、タンパク質は、ＨＬＡ−Ｅ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＣＤ４７を含む。一部の場合には、寛容化ワクチンは、その表面上がＣＤ４７でコーティングされた細胞を含み得る。細胞の表面上のＣＤ４７のコーティングは、細胞表面をビオチン化し、その後、これらのビオチン化細胞をストレプトアビジン−ＣＤ４７キメラタンパク質と共にインキュベートすることによって達成され得る。例えば、寛容化ワクチンは、その表面上がＣＤ４７でコーティングされた細胞を含み得、細胞は、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減されたタンパク質発現、ならびにタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含み、タンパク質は、ＨＬＡ−Ｇ１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を含む。ＣＤ４７でコーティングされた細胞は、非アポトーシス性細胞であり得る。あるいは、ＣＤ４７でコーティングされた細胞は、アポトーシス性細胞であり得る。

対象に投与される場合、寛容化ワクチンの細胞は、循環半減期を有し得る。寛容化ワクチンの細胞は、少なくともまたは少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１８、２４、３６、４８、６０もしくは７２時間の循環半減期を有し得る。例えば、寛容化ワクチンの循環半減期は、０．１からもしくは約０．１から０．５；０．５からもしくは約０．５から１．０；１．０からもしくは約１．０から２．０；１．０からもしくは約１．０から３．０；１．０からもしくは約１．０から４．０；１．０からもしくは約１．０から５．０；５からもしくは約５から１０；１０からもしくは約１０から１５；１５からもしくは約１５から２４；２４からもしくは約２４から３６；３６からもしくは約３６から４８；４８からもしくは約４８から６０；または６０からもしくは約６０から７２時間までであり得る。寛容化ワクチン中の細胞は、その循環半減期を増強するために処理され得る。かかる処理は、細胞をタンパク質、例えばＣＤ４７でコーティングすることを含み得る。その循環半減期を増強するために処理された細胞は、非アポトーシス性細胞であり得る。その循環半減期を増強するために処理された細胞は、アポトーシス性細胞であり得る。あるいは、寛容化ワクチン中の細胞は、その循環半減期を増強するために、遺伝子改変され得る（例えば、そのゲノム中での、ＣＤ４７などの導入遺伝子の挿入）。その循環半減期を増強するために遺伝子改変された細胞は、非アポトーシス性細胞であり得る。その循環半減期を増強するために遺伝子改変された細胞は、アポトーシス性細胞であり得る。

寛容化ワクチンは、１つまたは複数の破壊された遺伝子（例えば、低減された発現）および１つまたは複数の導入遺伝子の両方を有し得る。本明細書に記載される任意の遺伝子および／または導入遺伝子が使用され得る。

１つまたは複数の破壊された遺伝子（例えば、低減された発現）を含む細胞は、寛容化ワクチンとして、または寛容化ワクチンの一部として、使用され得る。言い換えると、１つまたは複数の破壊された遺伝子を含む細胞は、寛容化ワクチンであり得る、または寛容化ワクチンにされ得る。

寛容化ワクチンは、移植において使用される細胞、臓器および／または組織と同じ遺伝子型および／または表現型を有し得る。時折、寛容化ワクチンおよび移植片の遺伝子型および／または表現型は、異なる。移植レシピエントのために使用される寛容化ワクチンは、移植グラフトドナー由来の細胞を含み得る。移植レシピエントのために使用される寛容化ワクチンは、移植グラフトとは遺伝的におよび／または表現型的に異なる細胞を含み得る。一部の場合には、移植レシピエントのために使用される寛容化ワクチンは、移植グラフトドナー由来の細胞ならびに移植グラフトとは遺伝的におよび／または表現型的に異なる細胞を含み得る。移植グラフトとは遺伝的におよび／または表現型的に異なる細胞は、同じ種の移植グラフトドナーの動物由来であり得る。

寛容化ワクチンのための細胞の供給源は、ヒトまたは非ヒト動物由来であり得る。

本出願全体で開示される細胞は、寛容化ワクチンにされ得る。例えば、寛容化ワクチンは、本明細書で開示される１つまたは複数の移植される細胞から作製され得る。あるいは、寛容化ワクチンは、移植される細胞のいずれとも異なる１つまたは複数の細胞から作製され得る。例えば、寛容化ワクチンにされる細胞は、移植される細胞のいずれとも遺伝子型的におよび／または表現型的に異なり得る。しかし、一部の場合には、寛容化ワクチンは、ＮＬＲＣ５を（内因的にまたは外因的に）発現する。寛容化ワクチンは、移植における細胞、臓器および／または組織の生存を促進し得る。寛容化ワクチンは、ドナー細胞、臓器および／または組織と遺伝子型的に同一または類似の非ヒト動物に由来し得る。例えば、寛容化ワクチンは、ドナーブタ細胞、臓器および／または組織と遺伝子型的に同一または類似のブタに由来する細胞（例えば、アポトーシス性ブタ細胞）であり得る。引き続いて、ドナー細胞、臓器および／または組織は、同種グラフトまたは異種グラフトにおいて使用され得る。一部の場合には、寛容化ワクチンのための細胞は、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＢ４ＧａｌＮＴ２の低減された発現を有し、ＨＬＡ−Ｇ（またはＨＬＡ−Ｅ−）、ヒトＣＤ４７、ヒトＰＤ−Ｌ１およびヒトＰＤ−Ｌ２をコードする導入遺伝子を有する、遺伝子改変された動物（例えば、ブタ）由来であり得る。グラフトドナー動物は、寛容化ワクチン細胞のために動物（例えば、ブタ）をさらに遺伝子改変することによって生成され得る。例えば、グラフトドナー動物は、寛容化ワクチン細胞のための上述の動物においてさらなる遺伝子（例えば、ＮＬＲＣ５（またはＴＡＰ１）、Ｃ３およびＣＸＣＬ１０）を破壊することによって生成され得る（図５）。

寛容化ワクチンは、非ヒト動物細胞（例えば、非ヒト哺乳動物細胞）を含み得る。例えば、非ヒト動物細胞は、ブタ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、フェレット、ガウル、ヤギ、ウマ、マウス、ムフロン、ラバ、ウサギ、ラット、ヒツジまたは霊長類由来であり得る。具体的には、非ヒト動物細胞は、ブタ細胞であり得る。寛容化ワクチンはまた、遺伝子改変された非ヒト動物細胞を含み得る。例えば、遺伝子改変された非ヒト動物細胞は、死細胞（例えば、アポトーシス性細胞）であり得る。寛容化ワクチンはまた、本明細書で開示される任意の遺伝子改変された細胞を含み得る。

寛容化ワクチンを作製するための細胞の処理
寛容化ワクチンは、化学物質で処理された細胞を含み得る。一部の場合には、処理は、細胞のアポトーシスを誘導し得る。理論に束縛されることなく、アポトーシス性細胞は、宿主抗原提示細胞（例えば、脾臓中の）によって捕らえられ得、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）におけるアネルギーの誘導をもたらす非免疫原性の様式で、宿主免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に提示され得る。

寛容化ワクチンは、アポトーシス性細胞および非アポトーシス性細胞を含み得る。寛容化ワクチン中のアポトーシス性細胞は、寛容化ワクチン中の非アポトーシス性細胞と遺伝的に同一であり得る。あるいは、寛容化ワクチン中のアポトーシス性細胞は、寛容化ワクチン中の非アポトーシス性細胞とは遺伝的に異なり得る。寛容化ワクチンは、固定された細胞および固定されていない細胞を含み得る。寛容化ワクチン中の固定された細胞は、寛容化ワクチン中の固定されていない細胞と遺伝的に同一であり得る。あるいは、寛容化ワクチン中の固定された細胞は、寛容化ワクチン中の固定されていない細胞とは遺伝的に異なり得る。一部の場合には、固定された細胞は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＣＤＩ）で固定された細胞であり得る。

寛容化ワクチン中の細胞は、化学物質、例えば、ＥＣＤＩを使用して固定され得る。固定は、細胞をアポトーシス性にし得る。本明細書で開示される寛容化ワクチン、細胞、キットおよび方法は、ＥＣＤＩおよび／またはＥＣＤＩ処理を含み得る。例えば、寛容化ワクチンは、細胞、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＣＤＩ）で処理された、本明細書で開示される遺伝子改変された細胞であり得る。言い換えると、全体で記載される遺伝子改変された細胞は、寛容化ワクチンを創出するためにＥＣＤＩで処理され得る。次いで、寛容化ワクチンは、移植された細胞、臓器および／または組織の生存を促進するために、移植において使用され得る。ＥＣＤＩ誘導体、官能化ＥＣＤＩおよび／または置換ＥＣＤＩもまた、寛容化ワクチンのために細胞を処理するために使用され得ることもまた企図される。一部の場合には、寛容化ワクチンのための細胞は、任意の適切なカルボジイミド誘導体、例えば、ＥＣＤＩ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、および当業者に理解される他のカルボジイミド誘導体で処理され得る。

寛容化ワクチンのための細胞はまた、ＥＣＤＩの存在下でのインキュベーションが関与しない方法、例えば、他の化学物質または照射、例えば、ＵＶ照射もしくはガンマ−照射によってアポトーシス性にされ得る。

ＥＣＤＩは、遊離アミンおよびカルボキシル基を化学的に架橋し得、例えば、寛容化ワクチンおよびドナー非ヒト動物の両方を生じさせた動物由来の細胞、臓器および／または組織においてアポトーシスを効果的に誘導できる。言い換えると、同じ遺伝子改変された動物は、移植において使用される寛容化ワクチンならびに細胞、組織および／または臓器を生じさせ得る。例えば、本明細書で開示される遺伝子改変された細胞は、ＥＣＤＩで処理され得る。このＥＣＤＩ固定は、寛容化ワクチンの創出をもたらし得る。

寛容化ワクチンを作製するために使用され得る遺伝子改変された細胞は、脾臓（脾臓Ｂ細胞を含む）、肝臓、末梢血（末梢血Ｂ細胞を含む）、リンパ節、胸腺、骨髄、またはそれらの任意の組合せに由来し得る。例えば、細胞は、脾臓細胞、例えば、ブタ脾臓細胞であり得る。一部の場合には、細胞は、ｅｘ−ｖｉｖｏで拡大増殖され得る。一部の場合には、細胞は、胎仔、周産期、新生仔、離乳前および／または若年成体の非ヒト動物に由来し得る。一部の場合には、細胞は、非ヒト動物の胚に由来し得る。

寛容化ワクチン中の細胞は、２つまたはそれ超の破壊された（例えば、低減された発現）遺伝子もまた含み得、２つまたはそれ超の破壊された遺伝子は、糖タンパク質ガラクトシルトランスフェラーゼアルファ１，３（ＧＧＴＡ１）、推定シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ様タンパク質（ＣＭＡＨ）、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｂ２ＭおよびＢ４ＧＡＬＮＴ２、それらの任意の機能的断片、またはそれらの任意の組合せであり得る。一部の場合には、２つまたはそれ超の破壊された遺伝子は、ＧＧＴＡ１を含まない。上記のように、破壊は、ノックアウトまたは遺伝子発現の抑制であり得る。ノックアウトは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用することによって、遺伝子編集によって実施され得る。あるいは、遺伝子発現の抑制は、例えば、ＲＮＡ干渉、ｓｈＲＮＡ、１つまたは複数のドミナントネガティブ導入遺伝子を使用するノックダウンによって、実施され得る。一部の場合には、細胞は、本明細書で開示される１つまたは複数の導入遺伝子をさらに含み得る。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、またはそれらの任意の組合せであり得る。

寛容化ワクチン中の細胞はまた、１つまたは複数のドナー非ヒト動物に由来し得る。一部の場合には、細胞は、同じドナー非ヒト動物に由来し得る。細胞は、１つまたは複数のレシピエント非ヒト動物に由来し得る。一部の場合には、細胞は、２つまたはそれ超の非ヒト動物（例えば、ブタ）に由来し得る。

寛容化ワクチンは、見込まれるレシピエントの体重１ｋｇ当たり、０．００１からまたは約０．００１から約５．０まで、例えば、０．００１からまたは約０．００１から１．０までの、エンドトキシン単位を含み得る。例えば、寛容化ワクチンは、見込まれるレシピエントの体重１ｋｇ当たり、０．０１からもしくは約０．０１から５．０；０．０１からもしくは約０．０１から４．５；０．０１からもしくは約０．０１から４．０、０．０１からもしくは約０．０１から３．５；０．０１からもしくは約０．０１から３．０；０．０１からもしくは約０．０１から２．５；０．０１からもしくは約０．０１から２．０；０．０１からもしくは約０．０１から１．５；０．０１からもしくは約０．０１から１．０；０．０１からもしくは約０．０１から０．９；０．０１からもしくは約０．０１から０．８；０．０１からもしくは約０．０１から０．７；０．０１からもしくは約０．０１から０．６；０．０１からもしくは約０．０１から０．５；０．０１からもしくは約０．０１から０．４；０．０１からもしくは約０．０１から０．３；０．０１からもしくは約０．０１から０．２；または０．０１からもしくは約０．０１から０．１までの、エンドトキシン単位を含み得る。

寛容化ワクチンは、１μｌ当たり１からまたは約１から１００までの凝集体を含み得る。例えば、寛容化ワクチンは、１μｌ当たり１からもしくは約１から５；１からもしくは約１から１０、または１からもしくは約１から２０までの凝集体を含み得る。寛容化ワクチンは、少なくともまたは少なくとも約１、５、１０、２０、５０または１００の凝集体を含み得る。

寛容化ワクチンは、約５０，０００の凍結から解凍されたヒト末梢血単核細胞が約１６０，０００細胞の寛容化ワクチン（例えば、ブタ細胞）と共にインキュベートされる場合、０．００１ｐｇ／ｍｌからまたは約０．００１ｐｇ／ｍｌから１０．０ｐｇ／ｍｌまで、例えば、０．００１ｐｇ／ｍｌからまたは約０．００１ｐｇ／ｍｌから１．０ｐｇ／ｍｌまでのＩＬ−１ベータの放出を誘発し得る。例えば、寛容化ワクチンは、約５０，０００の凍結から解凍されたヒト末梢血単核細胞が約１６０，０００細胞の寛容化ワクチン（例えば、ブタ細胞）と共にインキュベートされる場合、０．００１からもしくは約０．００１から１０．０；０．００１からもしくは約０．００１から５．０；０．００１からもしくは約０．００１から１．０；０．００１からもしくは約０．００１から０．８；０．００１からもしくは約０．００１から０．２；または０．００１からもしくは約０．００１から０．１ｐｇ／ｍｌまでのＩＬ−１ベータの放出を誘発する。寛容化ワクチンは、約５０，０００の凍結から解凍されたヒト末梢血単核細胞が約１６０，０００細胞の寛容化ワクチン（例えば、ブタ細胞）と共にインキュベートされる場合、０．００１からまたは約０．００１から２．０ｐｇ／ｍｌまで、例えば、０．００１からまたは約０．００１から０．２ｐｇ／ｍｌまでのＩＬ−６の放出を誘発し得る。例えば、寛容化ワクチンは、約５０，０００の凍結から解凍されたヒト末梢血単核細胞が約１６０，０００細胞の寛容化ワクチン（例えば、ブタ細胞）と共にインキュベートされる場合、０．００１からもしくは約０．００１から２．０；０．００１からもしくは約０．００１から１．０；０．００１からもしくは約０．００１から０．５；または０．００１からもしくは約０．００１から０．１ｐｇ／ｍｌまでのＩＬ−６の放出を誘発し得る。

寛容化ワクチンは、３７℃で４時間の放出後インキュベーションの後に、または３７℃で約４時間の放出後インキュベーションの後に、６０％よりも多いまたは約６０％よりも多い、例えば、８５％よりも多いまたは約８５％よりも多い、ＡｎｎｅｘｉｎＶ陽性アポトーシス性細胞を含み得る。例えば、寛容化ワクチンは、３７℃で約４時間の放出後インキュベーションの後に、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％よりも多い、ＡｎｎｅｘｉｎＶ陽性のアポトーシス性細胞を含む。

寛容化ワクチンは、０．０１％からまたは約０．０１％から１０％まで、例えば、０．０１％からまたは約０．０１％から２％までの壊死細胞を含み得る。例えば、寛容化ワクチンは、０．０１％からもしくは約０．０１％から１０％；０．０１％からもしくは約０．０１％から７．５％、０．０１％からもしくは約０．０１％から５％；０．０１％からもしくは約０．０１％から２．５％；または０．０１％からもしくは約０．０１％から１％までの壊死細胞を含む。

ドナー細胞の投与の前、その間および／またはその後に、ＥＣＤＩ処理された細胞、臓器および／または組織を含む寛容化ワクチンを投与することは、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）において細胞、臓器および／または組織に対する寛容を誘導し得る。ＥＣＤＩ処理細胞は、静脈内注入によって投与され得る。

ＥＣＤＩ処理脾細胞を含む寛容化ワクチンの注入によって誘導される寛容は、インタクトなプログラム死１受容体−プログラム死リガンド１シグナル伝達経路とＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋調節性Ｔ細胞との間の相乗効果に依存する可能性が高い。

寛容化ワクチン中の細胞は、ＥＣＤＩ固定だけでなく、他の方法によっても、アポトーシス性細胞（例えば、寛容化ワクチン）にされ得る。例えば、全体で開示される遺伝子改変された細胞、例えば、非ヒト細胞動物細胞またはヒト細胞（幹細胞を含む）のいずれかは、遺伝子改変された細胞をＵＶ照射に曝露させることによって、アポトーシス性にされ得る。遺伝子改変された細胞は、それをガンマ−照射に曝露させることによっても、アポトーシス性にされ得る。例えば、ＥｔＯＨ固定による、ＥＣＤＩが関与しない他の方法もまた企図される。

寛容化ワクチン中の細胞、例えば、ＥＣＤＩ処理細胞、抗原カップリング細胞および／またはエピトープカップリング細胞は、ドナー細胞（例えば、移植グラフトのドナー由来の細胞）を含み得る。寛容化ワクチン中の細胞、例えば、ＥＣＤＩ処理細胞、抗原カップリング細胞および／またはエピトープカップリング細胞は、レシピエント細胞（例えば、移植グラフトのレシピエント由来の細胞）を含み得る。寛容化ワクチン中の細胞、例えば、ＥＣＤＩ処理細胞、抗原カップリング細胞および／またはエピトープカップリング細胞は、第三者（例えば、ドナーでもレシピエントでもない）細胞を含み得る。一部の場合には、第三者細胞は、レシピエントおよび／またはドナーと同じ種の非ヒト動物由来である。他の場合には、第三者細胞は、レシピエントおよび／またはドナーとは異なる種の非ヒト動物由来である。

細胞のＥＣＤＩ処理は、１つまたは複数の抗原および／またはエピトープの存在下で実施され得る。ＥＣＤＩ処理細胞は、ドナー、レシピエントおよび／または第三者の細胞を含み得る。同様に、抗原および／またはエピトープは、ドナー、レシピエントおよび／または第三者の抗原および／またはエピトープを含み得る。一部の場合には、ドナー細胞は、レシピエント抗原および／またはエピトープにカップリング（例えば、ＥＣＤＩ誘導性カップリング）される。例えば、遺伝子操作されたおよび遺伝子型的に同一なドナー細胞（例えば、ブタ細胞）に由来する可溶性ドナー抗原は、ＥＣＤＩを用いてレシピエント末梢血単核細胞にカップリングされ、このＥＣＤＩでカップリングされた細胞は、静脈内注入を介して投与される。

一部の場合には、レシピエント細胞は、ドナー抗原および／またはエピトープにカップリング（例えば、ＥＣＤＩ誘導性カップリング）される。一部の場合には、レシピエント細胞は、第三者抗原および／またはエピトープにカップリング（例えば、ＥＣＤＩ誘導性カップリング）される。一部の場合には、ドナー細胞は、レシピエント抗原および／またはエピトープにカップリング（例えば、ＥＣＤＩ誘導性カップリング）される。一部の場合には、ドナー細胞は、第三者抗原および／またはエピトープにカップリング（例えば、ＥＣＤＩ誘導性カップリング）される。一部の場合には、第三者細胞は、ドナー抗原および／またはエピトープにカップリング（例えば、ＥＣＤＩ誘導性カップリング）される。一部の場合には、第三者細胞は、レシピエント抗原および／またはエピトープにカップリング（例えば、ＥＣＤＩ誘導性カップリング）される。例えば、遺伝子操作されたおよび遺伝子型的に同一なドナー細胞（例えば、ブタ細胞）に由来する可溶性ドナー抗原は、ＥＣＤＩを用いてポリスチレンナノ粒子にカップリングされ、ＥＣＤＩでカップリングされた細胞は、静脈内注入を介して投与される。

これらの寛容化細胞ワクチンのいずれかの寛容原性効力は、ＩＦＮ−ｇ、ＮＦ−ｋＢ阻害剤（例えば、クルクミン、トリプトライド、Ｂａｙ−１１７０８５）、ビタミンＤ３、ｓｉＣＤ４０、コバルトプロトポルフィリン、インスリンＢ９−２３、または宿主抗原提示細胞および宿主リンパ球の機能を改変する他の免疫調節分子のうちの１つまたは複数を細胞の表面にカップリングさせることによってさらに最適化され得る。

これらのアポトーシス性細胞ワクチンはまた、ドナー反応性細胞のアポトーシス死を誘発する分子（例えば、ＦａｓＬ、ＰＤ−Ｌ１、ガレクチン−９、ＣＤ８アルファ）をそれらの表面上にディスプレイするように操作されたドナー細胞によって補完され得る。

本明細書で開示される寛容化ワクチンは、レシピエント中での移植片（例えば、異種グラフトまたは同種グラフト移植片）の生存の持続時間を増加させ得る。本明細書で開示される寛容化ワクチンは、移植後の免疫抑制の必要を低減または排除することもできる。異種グラフト移植片または同種グラフト移植片は、臓器、組織、細胞または細胞株であり得る。異種グラフト移植片および寛容化ワクチンはまた、異なる種由来であり得る。あるいは、異種グラフト移植片および寛容化ワクチンは、同じ種由来であり得る。例えば、異種グラフト移植片および寛容化ワクチンは、実質的に遺伝的に同一の個体（例えば、同じ個体）由来であり得る。

ＥＣＤＩで固定された細胞は、医薬組成物へと製剤化され得る。例えば、ＥＣＤＩで固定された細胞は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わされ得る。使用され得る賦形剤は、生理食塩水である。使用され得る賦形剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。次いで、医薬組成物は、移植を必要とする患者を処置するために使用され得る。

幹細胞由来の細胞から作製された寛容化ワクチン
寛容化ワクチンを作製するための細胞は、幹細胞に由来し得る。かかる細胞は、幹細胞由来の機能的インスリン分泌性島β細胞、または同一のもしくは遺伝子型的に類似の幹細胞株から分化した他の細胞のいずれかである寛容化アポトーシス性ドナー細胞を含み得る。これらの他の細胞には、白血球、リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、赤血球、または任意の他のドナー細胞が含まれ得る。

これらの幹細胞由来の寛容化アポトーシス性ドナー細胞は、ＭＨＣクラスＩの機能的発現を欠くように遺伝子操作される必要はない。アポトーシス性ドナー細胞上でのＭＨＣクラスＩの機能的発現は、それらの寛容原性潜在力を増強し得る。

幹細胞由来の細胞は、ＵＶ照射、ガンマ−照射、またはＥＣＤＩの存在下でのインキュベーションが関与しない他の方法によって、アポトーシス性にされ得る。

これらの陰性細胞ワクチンは、各々、拮抗性の抗ＣＤ４０抗体（例えば、ヒト化２Ｃ１０）、Ｂ細胞枯渇化または標的化抗体（例えば、リツキシマブ）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）、およびＴＮＦ−アルファ阻害剤（例えば、エタネルセプトを含むｓＴＮＦＲ）、およびＩＬ−６阻害剤（例えば、トシリズマブを含む抗ＩＬ−６Ｒ抗体）が含まれるがこれらに限定されない一過的免疫抑制の援護の下で、移植前、または移植前および移植後に間隔をおいての両方で、静脈内注入され得る。

これらの寛容化細胞ワクチンのいずれかの寛容原性効力は、以下の分子：ＩＦＮ−ｇ、ＮＦ−ｋＢ阻害剤（例えば、クルクミン、トリプトライド、Ｂａｙ−１１７０８５）、ビタミンＤ３、ｓｉＣＤ４０、コバルトプロトポルフィリン、インスリンＢ９−２３、または宿主抗原提示細胞および宿主リンパ球の機能を改変する他の免疫調節分子のうちの１つまたは複数を細胞の表面にカップリングさせることによってさらに最適化され得る。

ヒト幹細胞由来の寛容化ワクチンと同様、寛容化アポトーシス性ドナーブタワクチンは、同じ細胞供給源に由来し得、ＭＨＣクラスＩ抗原を発現し得、同じ方法を使用してアポトーシス性にされ得、細胞の表面に１つまたは複数の免疫調節分子をカップリングさせることによって最適化され得、併用の免疫療法の援護の下で、移植前、または移植前および移植後に間隔をおいての両方で、静脈内注入され得る。

ＩＶ．遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法
上記のように遺伝子改変された非ヒト動物を作製するために、種々の技術が使用され得る。遺伝子改変された動物を創出するためのいくつかの例が本明細書で開示される。本明細書で開示される方法は、単なる例であり、決して限定を意味しないことを理解すべきである。

遺伝子破壊
遺伝子破壊は、上記の任意の方法、例えば、ノックアウト、ノックダウン、ＲＮＡ干渉、ドミナントネガティブなどによって実施され得る。方法の詳細な記載は、遺伝子改変された非ヒト動物に関するセクションにおいて上に開示される。

ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系

本明細書に記載される方法は、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を利用し得る。例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ）は、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系、例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して生成され得る。本明細書で開示される方法で使用されるＣａｓ酵素は、ＤＮＡ切断を触媒するＣａｓ９であり得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９または任意の近縁のＣａｓ９による酵素作用は、２０ヌクレオチドのガイド配列にハイブリダイズし、２０ヌクレオチドの標的配列の後ろにプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する標的部位配列において、二本鎖切断を生成し得る。

ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする酵素コード配列に作動可能に連結され得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、それらのホモログ、またはそれらの改変されたバージョンが含まれる。未改変のＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ切断活性を有し得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列において、例えば、標的配列内および／または標的配列の相補体内で、一方または両方の鎖の切断を指向し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初のヌクレオチドまたは最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００またはそれ超の塩基対内で、一方または両方の鎖の切断を指向し得る。対応する野生型酵素に対して、変異したＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターが、使用され得る。

１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターが使用され得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のＮＬＳが使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ（ａｍｍｏ）末端もしくはその近傍においてＮＬＳを、カルボキシ末端もしくはその近傍において、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のＮＬＳもしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個超のＮＬＳを、またはこれらの任意の組合せ（例えば、アミノ末端における１つまたは複数のＮＬＳおよびカルボキシ末端における１つまたは複数のＮＬＳ）を含み得る。１つよりも多いＮＬＳが存在する場合、単一のＮＬＳが、１よりも多いコピーで存在し得るように、および／または１つもしくは複数のコピーで存在する１つもしくは複数の他のＮＬＳと組み合わせて存在し得るように、各々は互いに独立して選択され得る。

方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、多くても６個のＮＬＳを含み得る。ＮＬＳは、ＮＬＳに対して最も近いアミノ酸が、Ｎ末端またはＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約５０アミノ酸以内、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０または５０アミノ酸以内にある場合、Ｎ末端またはＣ末端の近傍にあるとみなされる。

ガイドＲＮＡ
本明細書で使用する場合、用語「ガイドＲＮＡ」およびその文法的等価物は、標的ＤＮＡに対して特異的であり得、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し得るＲＮＡを指し得る。ＲＮＡ／Ｃａｓ複合体は、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡへと「ガイドする」ことを補助し得る。

本明細書で開示される方法は、少なくとも１つのガイドＲＮＡまたは核酸、例えば、少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、細胞または胚中に導入するステップもまた含み得る。ガイドＲＮＡは、エンドヌクレアーゼを特異的標的部位に指向させるように、ＲＮＡガイドされるエンドヌクレアーゼと相互作用し得、この部位において、ガイドＲＮＡの５’末端は、染色体配列中の特異的プロトスペーサー配列と塩基対合する。

ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。ガイドＲＮＡは、時折、単鎖ＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの一部分（例えば、機能的部分）の融合によって形成される単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み得る。ガイドＲＮＡはまた、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むｄｕａｌＲＮＡであり得る。さらに、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡとハイブリダイズし得る。

上で議論したように、ガイドＲＮＡは、発現産物であり得る。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする配列を含むベクターであり得る。ガイドＲＮＡは、細胞または生物に、単離されたガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードする配列およびプロモーターを含むプラスミドＤＮＡをトランスフェクトすることによって、細胞または生物中に移入され得る。ガイドＲＮＡはまた、例えば、ウイルス媒介性遺伝子送達を使用して、細胞または生物中に他の方法で移入され得る。

ガイドＲＮＡは、単離され得る。例えば、ガイドＲＮＡは、細胞または生物中に、単離されたＲＮＡの形態でトランスフェクトされ得る。ガイドＲＮＡは、当該分野で公知の任意のｉｎｖｉｔｒｏ転写系を使用するｉｎｖｉｔｒｏ転写によって調製され得る。ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡのコード配列を含むプラスミドの形態ではなく、単離されたＲＮＡの形態で、細胞に移入され得る。

ガイドＲＮＡは、３つの領域を含み得る：染色体配列中の標的部位に対して相補的であり得る、５’末端の第１の領域、ステムループ構造を形成し得る第２の内部領域、および一本鎖であり得る第３の３’領域。各ガイドＲＮＡの第１の領域はまた、各ガイドＲＮＡが、融合タンパク質を特異的標的部位にガイドするように、異なり得る。さらに、各ガイドＲＮＡの第２および第３の領域は、全てのガイドＲＮＡにおいて同一であり得る。

ガイドＲＮＡの第１の領域は、ガイドＲＮＡの第１の領域が標的部位と塩基対合できるように、染色体配列中の標的部位における配列に対して相補的であり得る。一部の場合には、ガイドＲＮＡの第１の領域は、１０ヌクレオチドからまたは約１０ヌクレオチドから２５ヌクレオチドまで（即ち、１０ヌクレオチドから２５ヌクレオチドまで；または約１０ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまで；または１０ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまで；または約１０ヌクレオチドから２５ヌクレオチドまで）またはそれ超を含み得る。例えば、ガイドＲＮＡの第１の領域と染色体配列中の標的部位との間で塩基対合する領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５もしくはそれを超えるヌクレオチド長であり得る、または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５もしくはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。時折、ガイドＲＮＡの第１の領域は、１９、２０もしくは２１ヌクレオチド長であり得る、または約１９、２０もしくは２１のヌクレオチド長であり得る。

ガイドＲＮＡは、二次構造を形成する第２の領域もまた含み得る。例えば、ガイドＲＮＡによって形成される二次構造は、ステム（またはヘアピン）およびループを含み得る。ループおよびステムの長さは変動し得る。例えば、ループは、３からまたは約３から１０ヌクレオチド長までの範囲であり得、ステムは、６からまたは約６から２０塩基対長までの範囲であり得る。ステムは、１から１０ヌクレオチドまたは約１０ヌクレオチドの１つまたは複数のバルジを含み得る。第２の領域の全体的な長さは、１６からまたは約１６から６０ヌクレオチド長までの範囲であり得る。例えば、ループは、４ヌクレオチド長であり得る、または約４ヌクレオチド長であり得、ステムは、１２塩基対であり得る、または約１２塩基対であり得る。

ガイドＲＮＡは、本質的に一本鎖であり得る、３’末端における第３の領域もまた含み得る。例えば、第３の領域は、時折、目的の細胞中のいずれの染色体配列に対しても相補的でなく、時折、ガイドＲＮＡの残部に対して相補的でない。さらに、第３の領域の長さは変動し得る。第３の領域は、４ヌクレオチド長よりも長いまたは約４ヌクレオチド長よりも長い可能性がある。例えば、第３の領域の長さは、５からまたは約５から６０ヌクレオチド長までの範囲であり得る。

ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ分子として細胞または胚中に導入され得る。例えば、ＲＮＡ分子は、ｉｎｖｉｔｒｏで転写され得る、および／または化学合成され得る。ＲＮＡは、合成ＤＮＡ分子、例えば、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）遺伝子断片から転写され得る。次いで、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ分子として細胞または胚中に導入され得る。ガイドＲＮＡは、非ＲＮＡ核酸分子、例えば、ＤＮＡ分子の形態でも、細胞または胚中に導入され得る。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、目的の細胞または胚におけるガイドＲＮＡの発現のためのプロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。ＲＮＡコード配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）によって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結され得る。ガイドＲＮＡを発現させるために使用され得るプラスミドベクターには、ｐｘ３３０ベクターおよびｐｘ３３３ベクターが含まれるがこれらに限定されない。一部の場合には、プラスミドベクター（例えば、ｐｘ３３３ベクター）は、２つのガイドＲＮＡコードＤＮＡ配列を含み得る。

ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列はまた、ベクターの一部であり得る。さらに、ベクターは、さらなる発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含み得る。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、線状であってもよい。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、環状であってもよい。

ＲＮＡガイドされるエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列が細胞中に導入される場合、各ＤＮＡ配列は、別々の分子の一部であり得る（例えば、ＲＮＡガイドされるエンドヌクレアーゼコード配列を含む１つのベクター、およびガイドＲＮＡコード配列を含む第２のベクター）、または両方とも、同じ分子の一部であり得る（例えば、ＲＮＡガイドされるエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの両方のコード（および調節）配列を含む１つのベクター）。

ガイドＲＮＡは、ブタまたはブタ細胞中の遺伝子を標的化し得る。一部の場合には、ガイドＲＮＡは、ブタＮＬＲＣ５遺伝子、例えば、表４に列挙される配列を標的化し得る。一部の場合には、ガイドＲＮＡは、ブタＮＬＲＣ５、ＧＧＴＡ１またはＣＭＡＨ遺伝子を標的化するように設計され得る。ガイドＲＮＡを作製するための例示的なオリゴヌクレオチドは、表５に列挙される。

相同組換え
相同組換えもまた、本明細書で開示される関連する遺伝子改変のいずれかのために使用され得る。相同組換えは、内因性遺伝子における部位特異的改変を可能にし得、したがって、新規改変が、ゲノムにおいて操作され得る。例えば、ＤＮＡ分子間で遺伝子配列情報を移行させる相同組換え（遺伝子変換および古典的鎖切断／再結合）の能力は、標的化相同組換えを提供し得、遺伝子操作（ｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）および遺伝子操作（ｇｅｎｅｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）における強力な方法であり得る。

相同組換えを受けた細胞は、いくつかの方法によって同定され得る。例えば、選択方法は、例えば、ヒト抗ｇａｌ抗体によって、細胞に対する免疫応答の非存在を検出できる。選択方法は、細胞または組織に曝露された場合の、ヒト血液中の凝固のレベルを評価することもまた含み得る。抗生物質耐性を介した選択は、スクリーニングのために使用され得る。

トランスジェニック非ヒト動物の作製
ランダム挿入
本明細書に記載される方法の１つまたは複数の導入遺伝子は、細胞のゲノム中の任意の遺伝子座にランダムに挿入され得る。これらの導入遺伝子は、ゲノムのどこに挿入されても、機能的であり得る。例えば、導入遺伝子は、それ自身のプロモーターをコードし得る、または内因性プロモーターの制御下になる位置に挿入され得る。あるいは、導入遺伝子は、遺伝子、例えば、遺伝子のイントロンもしくは遺伝子のエクソン、プロモーターまたは非コード領域中に挿入され得る。

導入遺伝子配列をコードするＤＮＡは、細胞の染色体中にランダムに挿入され得る。ランダム組込みは、当業者に公知の、細胞中にＤＮＡを導入する任意の方法から生じ得る。これには、エレクトロポレーション、超音波処理、遺伝子銃の使用、リポトランスフェクション（ｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウムトランスフェクション、デンドリマーの使用、マイクロインジェクション、アデノウイルス、ＡＡＶおよびレトロウイルスベクターが含まれるウイルスベクターの使用ならびに／またはＩＩ群リボザイムが含まれ得るがこれらに限定されない。

導入遺伝子をコードするＤＮＡは、導入遺伝子またはその発現産物の存在が、レポーター遺伝子の活性化を介して検出され得るように、レポーター遺伝子を含むようにも設計され得る。上に開示したものなどの、当該分野で公知の任意のレポーター遺伝子が使用され得る。レポーター遺伝子が活性化された細胞を細胞培養物中で選択することによって、導入遺伝子を含む細胞が選択され得る。

導入遺伝子をコードするＤＮＡは、エレクトロポレーションを介して細胞中に導入され得る。ＤＮＡはまた、リポフェクション、感染または形質転換を介して、細胞中に導入され得る。エレクトロポレーションおよび／またはリポフェクションは、線維芽細胞をトランスフェクトするために使用され得る。

導入遺伝子の発現は、発現アッセイ、例えばｑＰＣＲによって、またはＲＮＡのレベルを測定することによって、確証され得る。発現レベルは、コピー数もまた示し得る。例えば、発現レベルが極端に高い場合、これは、１よりも多いコピーの導入遺伝子がゲノム中に組み込まれたことを示し得る。あるいは、高い発現は、導入遺伝子が、例えば、高度に発現されるプロモーター近傍の、高度に転写されるエリア中に組み込まれたことを示し得る。発現は、例えば、ウエスタンブロッティングを介して、タンパク質レベルを測定することによっても確証され得る。

部位特異的挿入
本明細書で開示される方法のいずれかで１つまたは複数の導入遺伝子を挿入することは、部位特異的であり得る。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子は、プロモーターに隣接して、例えば、Ｒｏｓａ２６プロモーターに隣接してまたはＲｏｓａ２６プロモーターの近傍に、挿入され得る。

細胞の標的化遺伝子座の改変は、ＤＮＡを細胞中に導入することによって生成され得、ＤＮＡは、標的遺伝子座に対する相同性を有する。ＤＮＡは、組み込まれた構築物を含む細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を含み得る。標的ベクター中の相同ＤＮＡは、標的遺伝子座において染色体ＤＮＡと組み換わり得る。マーカー遺伝子には、相同ＤＮＡ配列、３’組換えアームおよび５’組換えアームが、両方の側で隣接し得る。

種々の酵素が、宿主ゲノム中への外来ＤＮＡの挿入を触媒し得る。例えば、部位特異的リコンビナーゼは、別個の生化学的特性を有する２つのタンパク質ファミリー、即ち、チロシンリコンビナーゼ（ＤＮＡがチロシン残基に共有結合される）およびセリンリコンビナーゼ（セリン残基において共有結合が生じる）へとクラスター化され得る。一部の場合には、リコンビナーゼは、Ｃｒｅ、ｆＣ３１インテグラーゼ（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓファージｆＣ３１に由来するセリンリコンビナーゼ）、またはバクテリオファージ由来の部位特異的リコンビナーゼ（Ｆｌｐ、ラムダインテグラーゼ、バクテリオファージＨＫ０２２リコンビナーゼ、バクテリオファージＲ４インテグラーゼおよびファージＴＰ９０１−１インテグラーゼが含まれる）を含み得る。

発現制御配列もまた、構築物において使用され得る。例えば、発現制御配列は、広範な種々の細胞型において発現される構成的プロモーターを含み得る。例えば、適切な強力な構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーには、ＤＮＡウイルス（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、ＣＭＶ、ＨＳＶなど）由来またはレトロウイルスＬＴＲ由来の発現制御配列がある。組織特異的プロモーターもまた使用され得、発現を特定の細胞系譜に指向させるために使用され得る。以下の実施例で議論される実験は、Ｒｏｓａ２６遺伝子プロモーターを使用して実施されるが、遺伝子発現を指向させることが可能な他のＲｏｓａ２６関連プロモーターが、当業者に明らかなように、類似の結果を得るために使用され得る。したがって、本明細書の記載は、限定を意味せず、むしろ多くの可能な例のうちの１つを開示する。一部の場合には、同じ程度の発現をそれにもかかわらず達成し得るより短いＲｏｓａ２６５’上流配列が、使用され得る。Ｒｏｓａ２６プロモーターの軽微なＤＮＡ配列バリアント、例えば、点変異、部分的欠失または化学的改変もまた、有用である。

Ｒｏｓａ２６プロモーターは、哺乳動物において発現可能である。例えば、他の種（例えば、ヒト、ウシ、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウサギおよびラット）のＲｏｓａ２６ホモログのプロモーターが含まれるがこれらに限定されない、ブタＲｏｓａ２６遺伝子の５’隣接配列と類似する配列もまた、使用され得る。Ｒｏｓａ２６遺伝子は、異なる哺乳動物種間で十分に保存され得、他の哺乳動物Ｒｏｓａ２６プロモーターもまた使用され得る。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、部位特異的挿入を実施するために使用され得る。例えば、ゲノム中の挿入部位上のニックが、挿入部位における導入遺伝子の挿入を促進するために、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓによって作製され得る。

本明細書に記載される方法は、リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈殿、核中へのＤＮＡのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インタクトな細胞との細菌プロトプラスト融合、トランスフェクション、リポフェクション、感染、微粒子銃、精子（ｓｐｅｒｍ）媒介性遺伝子移入、または当業者に公知の任意の他の技術が含まれるがこれらに限定されない、宿主細胞中へのＤＮＡまたはＲＮＡ構築物の進入を可能にするために使用され得る技術を利用し得る。

本明細書で開示されるある特定の態様は、ベクターを利用し得る。任意のプラスミドおよびベクターは、それらが選択された宿主において複製可能かつ生存可能である限り、使用され得る。当該分野で公知のベクターおよび市販のベクター（およびそのバリアントまたは誘導体）は、方法における使用のために１つまたは複数の組換え部位を含むように操作され得る。使用され得るベクターには、真核生物発現ベクター、例えば、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃＤＵＡＬ、ｐＳＦＶおよびｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡおよびｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０およびｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏおよびｐＯＧ４４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）、ならびにｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａ−ｃＨｉｓＡ、ＢおよびＣ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ１１１、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４ならびにｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．）、ならびにそれらのバリアントまたは誘導体が含まれるがこれらに限定されない。

これらのベクターは、遺伝子、例えば、導入遺伝子、または目的の遺伝子の部分を発現させるために使用され得る。部分の遺伝子または遺伝子は、公知の方法、例えば、制限酵素ベースの技術を使用することによって挿入され得る。

接合体を使用する遺伝子改変された非ヒト動物の作製
別の遺伝子改変された非ヒト動物由来の核酸を使用して、遺伝子改変された非ヒト動物を作製することは、例えば、接合体操作などによる、当該分野で公知の種々の技術を使用して実施され得る。

例えば、接合体は、類似の遺伝子改変された非ヒト動物を作製するために使用され得る。類似の遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法は、ａ）本明細書で開示される１つもしくは複数の遺伝子の低減された発現および／または外因性ポリヌクレオチドを有する細胞を産生するステップ、ｂ）ａ）の得られた細胞を使用して胚を生成するステップ；ならびにｃ）胚を、遺伝子改変された非ヒト動物へと成長させるステップ、を含む。ａ）の細胞は、細胞（例えば、遺伝子改変された非ヒト動物中の上記のもの）中の１つまたは複数の遺伝子を破壊する（例えば、発現を低減させる）ことによって産生され得る。

この方法は、本明細書で開示される類似の遺伝子改変された非ヒト動物を作製するために使用され得る。例えば、遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法は、以下を含み得る：ａ）本明細書で開示される１つまたは複数の遺伝子（例えば、上に開示される）の低減された発現を有する細胞を産生するステップであって、１つまたは複数の遺伝子は、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１および／またはＣ３を含む、ステップ；ｂ）ａ）の得られた細胞から胚を生成するステップ；ならびにｃ）胚を、遺伝子改変された非ヒト動物へと成長させるステップ。

この方法で使用される細胞は、本明細書に記載される任意の開示された遺伝子改変された細胞由来であり得る。例えば、破壊される遺伝子は、ＮＲＬＣ５、ＴＡＰ１および／またはＣ３に限定されない。遺伝子破壊および導入遺伝子の他の組合せは、本明細書の開示を通じて見出され得る。さらに、遺伝子改変された細胞は、任意の起源のもの、例えば、非ヒト動物（本明細書に記載される）または遺伝子改変された細胞（本明細書に記載される）由来であり得る。

本明細書で開示される方法におけるａ）の細胞は、接合体（例えば、精子および卵子の結合によって形成される細胞）であり得る。接合体は、ｉ）野生型非ヒト動物の精子および野生型非ヒト動物の卵子；ｉｉ）野生型非ヒト動物の精子および遺伝子改変された非ヒト動物の卵子；ｉｉｉ）遺伝子改変された非ヒト動物の精子および野生型非ヒト動物の卵子；ならびに／またはｉｖ）遺伝子改変された非ヒト動物の精子および遺伝子改変された非ヒト動物の卵子、の結合によって形成され得る。非ヒト動物は、ブタであり得る。

本明細書で開示される方法におけるａ）の細胞中の１つまたは複数の遺伝子は、ゲノム中の所望の位置において切断を生成することによって破壊され得る。例えば、切断は、二本鎖切断（ＤＳＢ）であり得る。ＤＳＢは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよびメガヌクレアーゼが含まれるヌクレアーゼを使用して生成され得る。ヌクレアーゼは、天然に存在するヌクレアーゼまたは改変されたヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼをコードする核酸はまた、細胞に送達され得、ここでヌクレアーゼが発現される。

ＤＳＢ後、１つまたは複数の遺伝子は、ＤＮＡ修復機構、例えば、相同組換え（ＨＲ）および／または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって破壊され得る。

方法は、ａ）の細胞のゲノムに１つまたは複数の導入遺伝子を挿入するステップを含み得る。１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｂ２Ｍ、それらの任意の機能的断片、および／またはそれらの任意の組合せを含み得る。

本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の導入遺伝子を挿入するステップを含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、本明細書で開示される任意の非ヒト動物または遺伝子改変された細胞中の任意の導入遺伝子であり得る。導入遺伝子は、本明細書に記載されるように、ランダム様式または標的化様式で、非ヒト動物または遺伝子改変された細胞のゲノム中に挿入され得る。

導入遺伝子はまた、本明細書で開示されるように、非ヒト動物または遺伝子改変された細胞のゲノム中の特定の遺伝子座にも挿入され得る。例えば、導入遺伝子は、プロモーターに隣接して挿入され得る。導入遺伝子は、プロモーターから少なくともまたは少なくとも約１、１０、５０、１００、５００または１０００塩基対であり得る、プロモーター近傍に挿入され得る。一部の場合には、異なる染色体中に挿入される遺伝子は、プロモーターによってなおも制御され得る。導入遺伝子はまた、プロモーターから、センス鎖の３’領域（例えば、プロモーターの下流）において挿入され得る。あるいは、導入遺伝子は、プロモーターから、センス鎖の５’領域（例えば、プロモーターの上流）において挿入され得る。導入遺伝子は、ブタプロモーターに隣接して挿入され得る。例えば、導入遺伝子は、ブタＲｏｓａ２６プロモーターに隣接して挿入され得る。

本明細書で使用され得るプロモーターは、本出願を通じて記載されている。例えば、方法で使用され得るプロモーターは、遍在性、組織特異的または誘導性プロモーターであり得る。プロモーターに隣接して挿入される導入遺伝子の発現は、調節され得る。例えば、導入遺伝子が、遍在性プロモーターの近傍またはその隣に挿入される場合、導入遺伝子は、非ヒト動物の全ての細胞において発現される。一部の遍在性プロモーターは、ＣＡＧＧＳプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＲｏｓａ２６プロモーターであり得る。

プロモーターは、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、ブタ、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウスまたはラットのゲノム内に存在するプロモーター配列に対して相同であり得る。プロモーターは、ヒトまたは非ヒト動物のゲノム内に存在するプロモーター配列に対して少なくともまたは少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を示し得る。プロモーターは、ヒトまたは非ヒト動物のゲノム内に存在するプロモーター配列に対して１００％の相同性を示し得る。プロモーターはまた、ヒトまたは非ヒト動物のゲノム内に存在するプロモーター配列に対して少なくともまたは少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を示し得る。プロモーターはまた、ヒトまたは非ヒト動物のゲノム内に存在するプロモーター配列に対して１００％の同一性を示し得る。

細胞核移入を使用する類似の遺伝子改変された非ヒト動物の作製
遺伝子改変された非ヒト動物を作製する代替方法は、細胞核移入によるものであり得る。遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法は、ａ）本明細書で開示される１つもしくは複数の遺伝子の低減された発現および／または外因性ポリヌクレオチドを有する細胞を産生するステップ；ｂ）第２の細胞を提供し、ａ）から得られた細胞の核を第２の細胞に移入して、胚を生成するステップ；ｃ）胚を、遺伝子改変された非ヒト動物へと成長させるステップを含み得る。この方法における細胞は、除核細胞であり得る。ａ）の細胞は、本明細書に記載されるまたは当該分野で公知の任意の方法、例えば、遺伝子破壊および／または挿入を使用して作製され得る。

この方法は、本明細書で開示される類似の遺伝子改変された非ヒト動物を作製するために使用され得る。例えば、遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法は、ａ）ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１および／またはＣ３の低減された発現を有する細胞を産生するステップ；ｂ）第２の細胞を提供し、ａ）から得られた細胞の核を第２の細胞に移入して、胚を生成するステップ；ならびにｃ）胚を、遺伝子改変された非ヒト動物へと成長させるステップを含み得る。この方法における細胞は、除核細胞であり得る。

この方法で使用される細胞は、本明細書に記載される任意の開示された遺伝子改変された細胞由来であり得る。例えば、破壊される遺伝子は、ＮＲＬＣ５、ＴＡＰ１および／またはＣ３に限定されない。遺伝子破壊および導入遺伝子の他の組合せは、本明細書の開示を通じて見出され得る。例えば、方法は、本明細書で開示される任意の非ヒト動物由来の第１の細胞を提供するステップ；第２の細胞を提供するステップ；ａ）の第１の細胞の核をｂ）の第２の細胞に移入するステップ；ｃ）の産物から胚を生成するステップ；および胚を、遺伝子改変された非ヒト動物へと成長させるステップを含み得る。

本明細書で開示される方法におけるａ）の細胞は、接合体であり得る。接合体は、ｉ）野生型非ヒト動物の精子および野生型非ヒト動物の卵子；ｉｉ）野生型非ヒト動物の精子および遺伝子改変された非ヒト動物の卵子；ｉｉｉ）遺伝子改変された非ヒト動物の精子および野生型非ヒト動物の卵子；ならびに／またはｉｖ）遺伝子改変された非ヒト動物の精子および遺伝子改変された非ヒト動物の卵子、の結合によって形成され得る。非ヒト動物は、ブタであり得る。

本明細書で開示される方法におけるａ）の細胞中の１つまたは複数の遺伝子は、ゲノム中の所望の位置において切断を生成することによって破壊され得る。例えば、切断は、二本鎖切断（ＤＳＢ）であり得る。ＤＳＢは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよびメガヌクレアーゼが含まれるヌクレアーゼを使用して生成され得る。ヌクレアーゼは、天然に存在するヌクレアーゼまたは改変されたヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼをコードする核酸は、細胞に送達され得、ここでヌクレアーゼが発現される。Ｃａｓ９および細胞中の遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、細胞に送達され得る。一部の場合には、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡをコードするｍＲＮＡ分子は、細胞中に注射され得る。一部の場合には、Ｃａｓ９をコードするプラスミドおよびガイドＲＮＡをコードする異なるプラスミドが、（例えば、感染によって）細胞中に送達され得る。一部の場合には、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの両方をコードするプラスミドが、（例えば、感染によって）細胞中に送達され得る。

上記のように、ＤＳＢ後、１つまたは複数の遺伝子は、ＤＮＡ修復機構、例えば、相同組換え（ＨＲ）および／または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって破壊され得る。方法は、ａ）の細胞のゲノムに１つまたは複数の導入遺伝子を挿入するステップを含み得る。１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｂ２Ｍ、それらの任意の機能的断片、および／またはそれらの任意の組合せを含み得る。

本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の導入遺伝子を挿入するステップを含み得、１つまたは複数の導入遺伝子は、本明細書で開示される任意の非ヒト動物または遺伝子改変された細胞中の任意の導入遺伝子であり得る。

遺伝子改変された非ヒト動物由来の細胞を使用して非ヒト動物を作製する方法もまた、本明細書で開示される。細胞は、本明細書で開示される任意の遺伝子改変された非ヒト動物由来であり得る。方法は以下を含み得る：ａ）遺伝的に同一の非ヒト動物由来の細胞を提供するステップ；ｂ）細胞を提供するステップ；ｃ）ａ）の細胞の核をｂ）の細胞に移入するステップ；ｃ）ｃ）の産物から胚を生成するステップ；およびｄ）胚を、遺伝子改変された非ヒト動物へと成長させるステップ。この方法の細胞は、除核細胞であり得る。

さらに、方法におけるａ）の細胞は、遺伝子改変された非ヒト動物由来の任意の細胞であり得る。例えば、本明細書で開示される方法におけるａ）の細胞は、体細胞、例えば、線維芽細胞または胎仔線維芽細胞であり得る。

方法における除核細胞は、生物由来の任意の細胞であり得る。例えば、除核細胞は、ブタ細胞である。除核細胞は、卵子、例えば、除核未受精卵子であり得る。

本明細書で開示される遺伝子改変された非ヒト動物は、当該分野で公知の任意の適切な技術を使用して作製され得る。例えば、これらの技術には、マイクロインジェクション（例えば、前核の）、精子媒介性遺伝子移入、卵子もしくは接合体のエレクトロポレーション、および／または核移植が含まれるがこれらに限定されない。

類似の遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法は、ａ）細胞中の１つまたは複数の遺伝子を破壊するステップ、ｂ）ａ）の得られた細胞を使用して胚を生成するステップ；およびｃ）胚を、遺伝子改変された非ヒト動物へと成長させるステップ、を含み得る。

本明細書で開示される方法におけるａ）の細胞は、体細胞であり得る。体細胞の型または供給源に制限はない。例えば、この細胞は、ブタ由来または培養細胞株もしくは任意の他の生存可能な細胞由来であり得る。細胞はまた、真皮細胞、神経細胞、卵丘細胞、卵管上皮細胞、線維芽細胞（例えば、胎仔線維芽細胞）または肝細胞であり得る。本明細書で開示される方法におけるａ）の細胞は、野生型非ヒト動物、遺伝子改変された非ヒト動物または遺伝子改変された細胞由来であり得る。さらに、ｂ）の細胞は、除核卵子（例えば、除核未受精卵子）であり得る。

除核もまた、公知の方法によって実施され得る。例えば、第二分裂中期の卵母細胞は、即時の除核のために、任意選択で、１ミリリットル当たり７〜１０マイクログラムのサイトカラシンＢを含むまたは１ミリリットル当たり約７〜１０マイクログラムのサイトカラシンＢを含むいずれかのＨＥＣＭ中に配置され得、または適切な培地（例えば、胚培養培地、例えば、ＣＲｌａａプラス１０％発情期雌ウシ血清）中に配置され得、次いで、後に除核され得る（例えば、２４時間以下後、または１６〜１８時間後）。除核はまた、極体および隣接する原形質を除去するためにマイクロピペットを使用して顕微手術的に達成され得る。次いで、卵母細胞は、そのうちのどれが首尾よく除核されたかを同定するためにスクリーニングされ得る。卵母細胞をスクリーニングするための１つの方法は、適切な維持培地中で１ミリリットル当たり３〜１０マイクログラムの３３３４２Ｈｏｅｃｈｓｔ色素または１ミリリットル当たり約３〜１０マイクログラムの３３３４２Ｈｏｅｃｈｓｔ色素で卵母細胞を染色し、次いで、１０秒未満にわたる紫外線照射下で卵母細胞を見ることであり得る。次いで、首尾よく除核された卵母細胞は、適切な培養培地、例えば、ＣＲｌａａプラス１０％血清中に配置され得る。卵母細胞の取り扱いもまた、核移入のために最適化され得る。

本明細書で生成された胚は、子孫（例えば、子ブタ）を生成するために、代理非ヒト動物（例えば、ブタ）に移入され得る。例えば、胚は、発情の当日または発情の１日後、例えば、全身麻酔下での正中線開腹術の後に、レシピエント未経産ブタの卵管に移入され得る。妊娠は、例えば、超音波によって診断され得る。妊娠は、移入から２８日後または約２８日後に診断され得る。次いで、妊娠は、超音波試験によって、２週間間隔でまたは約２週間間隔でチェックされ得る。マイクロインジェクションされた子孫（例えば、子ブタ）の全てが、自然分娩によって分娩され得る。妊娠および分娩の情報（例えば、妊娠の時間、妊娠の割合、子孫の数、生存率など）が報告され得る。子孫の遺伝子型および表現型は、本出願を通じて記載される任意の方法、例えば、シークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）を使用して測定され得る。

培養細胞は、核移入（例えば、体細胞核移入）、胚移入および／または妊娠の誘導のために即座に使用され得、健康で安定な遺伝子改変に由来する胚が子孫（例えば、子ブタ）を生じさせるのを可能にする。かかるアプローチは、時間およびコストを低減させ得、例えば、遺伝子改変された細胞を生じ得る費用のかかる数ヵ月の細胞スクリーニングは、健康な子ブタを生成することができない。

胚の成長および移入は、胚の成長および移入の産業において使用される標準的な手順を使用して実施され得る。例えば、代理母が使用され得る。胚はまた、例えば、インキュベーターを使用することによって、培養物中で成長および移入され得る。一部の場合には、胚は、妊娠を樹立するために、動物、例えば、代理動物に移入され得る。

本明細書で開示される同一の遺伝子型および／または表現型を有する複数の遺伝子改変された非ヒト動物を複製または生成することが望まれ得る。例えば、遺伝子改変された非ヒト動物は、繁殖（例えば、選択的繁殖）によって複製され得る。遺伝子改変された非ヒト動物は、核移入（例えば、体細胞核移入）、または細胞（例えば、卵母細胞、精子、接合体または胚性幹細胞）中へのＤＮＡの導入によって、複製され得る。これらの方法は、本明細書で開示される複数の遺伝子改変された非ヒト動物を複製または生成するために、複数回再現され得る。一部の場合には、細胞は、妊娠中の遺伝子改変された非ヒト動物の胎仔から単離され得る。単離された細胞（例えば、胎仔細胞）は、妊娠中の動物と類似または同一の複数の遺伝子改変された非ヒト動物を生成するために使用され得る。例えば、単離された胎仔細胞は、核移入（例えば、体細胞核移入）によって遺伝子改変された動物を生成するためのドナー核を提供し得る。

Ｖ．使用方法
細胞、臓器、および／または組織は、本明細書に記載されるような非ヒト動物から抽出され得る。細胞、臓器、および／または組織はｅｘｖｉｖｏで遺伝子的に変更されて、適宜使用されてもよい。これらの細胞、臓器、および／または組織は、細胞ベースの治療に使用されてもよい。これらの細胞、臓器、および／または組織を使用して、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）における疾患を処置または予防してもよい。驚くべきことに、本明細書において記載されるような遺伝子改変は拒絶の防止を補助し得る。さらに、細胞、臓器、および／または組織を、寛容化ワクチンに作製して、また移植術に対して免疫系を寛容化することを補助してもよい。さらに、寛容化ワクチンは、自己免疫応答を抑止することを含め、免疫系を抑え得る。

本明細書に開示されるのは、それを必要とする対象において疾患を処置するための方法であり、この方法は、寛容化ワクチンを対象に投与すること；Ｔ細胞活性化を阻害する医薬品を対象に投与すること；および遺伝子改変された細胞を対象に移植するステップを含み得る。Ｔ細胞活性化を阻害する医薬品は、抗体であってもよい。抗体は、本明細書に開示される抗ＣＤ４０抗体であってもよい。対象に移植された細胞は、本出願全体にわたって記載される任意の遺伝子改変された細胞であってもよい。対象に移植された組織または臓器は、遺伝子改変された細胞の１つまたは複数を含んでもよい。いくつかの場合には、方法は、本出願に記載される１つまたは複数の免疫抑制剤を投与するステップをさらに含み得、例えば、これはさらに、レシピエントに、Ｂ細胞枯渇化抗体、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦアルファ阻害剤、ＩＬ−６阻害剤、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）、および補体Ｃ３またはＣ５阻害剤のうちの１つまたは複数を提供することを含む。

また本明細書に開示されるのは、疾患を処置するための方法であって、１つまたは複数の細胞を、それを必要とする対象に移植するステップを含む方法である。１つまたは複数の細胞は、本明細書に開示される任意の遺伝子改変された細胞であってもよい。いくつかの場合には、方法は、１つまたは複数の細胞（例えば、遺伝子改変された細胞）を含む組織または臓器を、それを必要とする対象に移植するステップを含み得る。

本明細書に記載されるのは、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）における疾患を処置または予防する方法であって、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に、低減された発現を有する１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子改変された非ヒト動物由来の１つまたは複数の細胞（臓器および／または組織を含む）を移植するステップを含む方法である。１つまたは複数の細胞は、全体を通じて記載される遺伝子改変された非ヒト動物由来であってもよい。

本明細書に開示される方法は、限定するものではないが、糖尿病、心血管系疾患、肺疾患、肝疾患、皮膚疾患、または神経学的障害を含む疾患を処置または予防するために使用され得る。例えば、方法は、パーキンソン病またはアルツハイマー病を処置または予防するために使用されてもよい。方法はまた、１型、２型、嚢胞性線維症関連、外科的糖尿病、妊娠糖尿病、ミトコンドリア糖尿病、またはそれらの組合せを含む糖尿病を処置または予防するためにも使用されてもよい。いくつかの場合には、方法は、遺伝性糖尿病またはある形態の遺伝性糖尿病を処置または予防するために使用されてもよい。さらに、方法は、１型糖尿病を処置または予防するために使用されてもよい。方法はまた、２型糖尿病を処置または予防するために使用されてもよい。この方法は、前糖尿病を処置または予防するために使用されてもよい。

例えば、糖尿病を処置する場合、遺伝子改変された脾細胞を、ＥＣＤＩで固定して、レシピエントに与えてもよい。さらに、遺伝子改変された膵島細胞を、同じレシピエントにグラフト移植して、インスリンを生成してもよい。遺伝子改変された脾細胞および膵島細胞は遺伝子的に同一であってもよく、また同じ遺伝子改変された非ヒト動物由来であってもよい。

本明細書に提供されるものとしては、ｉ）対象における状態を処置するためにそれを必要とする対象に対する投与における使用のための遺伝子改変された細胞、組織もしくは臓器；ｉｉ）グラフトに対して対象を免疫寛容化するのにおける使用のための寛容化ワクチンであって、遺伝子改変された細胞、組織、もしくは臓器を含む寛容化ワクチン；ｉｉｉ）対象において、Ｔ細胞活性化、Ｂ細胞活性化、樹状細胞活性化、もしくはそれらの組合せを阻害するのにおける使用のための１つまたは複数の医薬品；または、ｉｖ）それらの任意の組合せが挙げられる。

また本明細書に提供されるものとしては、対象における状態を処置するためにそれを必要とする対象に対する投与における使用のための遺伝子改変された細胞、組織または臓器も挙げられる。対象は、寛容化ワクチンの使用による遺伝子改変された細胞、組織、または臓器に対して寛容化されたか、または寛容化されてもよい。さらに、対象は、Ｔ細胞活性化、Ｂ細胞活性化、樹状細胞活性化、またはそれらの組合せを阻害する１つまたは複数の医薬品を投与されてもよい。

移植術
本明細書に開示される方法は、移植を含んでもよい。移植は、自己移植、同種移植、異種移植または任意の他の移植であってもよい。例えば、移植は、異種移植であってもよい。移植はまた、同種移植であってもよい。

「異種移植術」およびその文法上の等価物は、本明細書において使用する場合、レシピエントおよびドナーが異なる種である、レシピエントへの細胞、組織、または臓器の移植術、植え込みまたは注入を含む任意の手順を包含し得る。本明細書に記載される細胞、臓器、および／または組織の移植術は、ヒトへの異種移植術に使用されてもよい。異種移植術としては限定するものではないが、血管柄付き異種移植（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）、部分的血管柄付き異種移植（ｐａｒｔｉａｌｌｙｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）、血管柄付きでない異種移植（ｕｎｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）、異種ドレッシング（ｘｅｎｏｄｒｅｓｓｉｎｇ）、異種バンテージ（ｘｅｎｏｂａｎｄａｇｅ）、および異種構造（ｘｅｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）が挙げられる。

「同種移植術」およびその文法上の等価物は、本明細書において使用する場合、レシピエントおよびドナーが同じ種である、レシピエントへの細胞、組織、または臓器の移植術、植え込みまたは注入を含む任意の手順を包含し得る。本明細書に記載される細胞、臓器、および／または組織の移植術は、ヒトへの同種移植術のために使用してもよい。同種移植術としては限定するものではないが、血管柄付き同種移植、部分的血管柄付き同種移植、血管柄付きでない同種移植、同種ドレッシング（ａｌｌｏｄｒｅｓｓｉｎｇ）、同種バンテージ（ａｌｌｏｂａｎｄａｇｅ）、および同種構造（ａｌｌｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）が挙げられる。

処置（例えば、本明細書で開示されるような任意の処置）の後、移植拒絶は、１つまたは複数の野生型細胞がレシピエントに移植された場合と比較して改善され得る。例えば、移植拒絶は、超急性拒絶である場合がある。移植拒絶はまた、急性拒絶である場合がある。他の種の拒絶は、慢性拒絶を含む場合がある。移植拒絶はまた、細胞媒介性拒絶である場合も、またはＴ細胞媒介性拒絶である場合もある。移植拒絶はまた、ナチュラルキラー細胞媒介性拒絶である場合がある。

「改善すること」およびその文法上の等価物は、本明細書において使用する場合、当業者によって認識される任意の改善を意味し得る。例えば、移植術の改善とは、望ましくない効果または症状の低下、軽減または低減を包含し得る、超急性拒絶の軽減を意味し得る。

本開示は、糖尿病または前糖尿病を処置または予防する方法を記載する。例えば、この方法は、限定するものではないが、レシピエントにまたはそれを必要とするレシピエントに、本明細書に記載されるドナー非ヒト動物由来の１つまたは複数の膵島細胞を投与するステップを含み得る。方法は、移植術であっても、またはいくつかの場合には異種移植術であってもよい。ドナー動物は、非ヒト動物であってもよい。レシピエントは、霊長類、例えば、非ヒト霊長類、例としては、限定するものではないが、サルであってもよい。レシピエントは、ヒトであっても、いくつかの場合には、糖尿病または前糖尿病を有するヒトであってもよい。いくつかの場合には、糖尿病または前糖尿病を有する患者を、移植術で処置し得るか否かは、例えば、その全体が参照によって本明細書に援用されるＤｉａｂｅｔｅｓＣａｒｅ、２０１５年；３８巻：１０１６〜１０２９頁に記載のようなアルゴリズムを使用して決定され得る。

方法はまた、本明細書に提供されるトランスジェニック細胞、組織および／または臓器、例えば、膵臓の組織または細胞が、霊長類、例えば、ヒトに移植されて、移植後に、その霊長類が、免疫抑制療法をそれほどまたは全く必要としない、異種移植術の方法を含み得る。免疫抑制療法が少ないかまたは全くないとしては、限定するものではないが、他の方法によって必要とされるものと比較して免疫抑制薬／剤の用量の低下（またはその完全な排除）；他の方法によって必要とされるものと比較して免疫抑制薬／剤の種類の数の減少（またはその完全な排除）；他の方法によって必要とされるものと比較した免疫抑制処置の期間の低下（またはその完全な排除）；および／または他の方法によって必要とされるものと比較した維持免疫抑制における低下（またはその完全な排除）が挙げられる。

本明細書に開示される方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）における疾患を処置または予防するために使用してもよい。レシピエントは、任意の非ヒト動物であっても、またはヒトであってもよい。例えば、レシピエントは、哺乳動物であってもよい。レシピエントの他の例としては、限定するものではないが、霊長類、例えば、サル、チンパンジー、バンブー（ｂａｍｂｏｏ）、またはヒトが挙げられる。レシピエントがヒトである場合、レシピエントは、それを必要とするヒトであり得る。本明細書に記載される方法はまた、非霊長類、非ヒトレシピエントに使用されてもよく、例えば、レシピエントは、愛玩動物、例としては、限定するものではないが、イヌ、ネコ、ウマ、オオカミ、ウサギ、フェレット、アレチネズミ、ハムスター、チンチラ、ファンシーラット（ｆａｎｃｙｒａｔ）、モルモット、カナリア、インコ、またはオウムであってもよい。レシピエントが愛玩動物である場合、愛玩動物は、それを必要とする愛玩動物であってもよい。例えば、レシピエントは、それを必要とするイヌであっても、またはそれを必要とするネコであってもよい。

移植は、当該分野で公知の任意の移植によってもよい。グラフトは、レシピエントにおける種々の部位に移植されてもよい。部位としては、限定するものではないが、肝臓被膜下腔、脾臓被膜下腔、腎臓被膜下腔、網、胃もしくは小腸の粘膜下組織、小腸の血管部分、静脈嚢（ｖｅｎｏｕｓｓａｃ）、精巣、脳、脾臓または角膜が挙げられる。例えば、移植は、被膜下移植であってもよい。移植はまた、筋肉内移植術であってもよい。移植は、門脈内移植術であってもよい。

移植は、ヒトまたは非ヒト動物由来の１つまたは複数の細胞、組織、および／または臓器であってもよい。例えば、上記組織および／もしくは臓器は、脳、心臓、肺、眼、胃、膵臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛髪、爪、耳、腺、鼻、口、唇、脾臓、歯茎、歯、舌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、食道、大腸、小腸、直腸、肛門、甲状腺、胸腺、骨、軟骨、腱、靭帯、腎上体、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、幽門、副腎、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節またはリンパ管由来であってもよく、または上記１つもしくは複数の細胞は、上記のものに由来してもよい。１つまたは複数の細胞はまた、脳、心臓、肝臓、皮膚、腸、肺、腎臓、眼、小腸、または膵臓由来であってもよい。１つまたは複数の細胞は、膵臓、腎臓、眼、肝臓、小腸、肺、または心臓由来である。１つまたは複数の細胞は、膵臓由来であってもよい。１つまたは複数の細胞は、膵島細胞、例えば、膵臓のβ細胞であってもよい。さらに、１つまたは複数の細胞は、膵島細胞であっても、および／または細胞クラスターなど、例としては、限定するものではないが、膵臓のα細胞、膵臓のβ細胞、膵臓のδ細胞、膵臓のＦ細胞（例えば、ＰＰ細胞）、または膵臓のε細胞であってもよい。ある場合には、１つまたは複数の細胞は、膵臓のα細胞であってもよい。別の場合には、１つまたは複数の細胞は、膵臓のβ細胞であってもよい。

上記で考察されるとおり、遺伝子改変された非ヒト動物を、異種グラフト（例えば、細胞、組織および／または臓器）の提供に使用してもよい。単に例示の目的のために、遺伝子改変された非ヒト動物、例えば、ブタを、膵臓の組織、例としては、限定するものではないが、膵島および／または膵島細胞のドナーとして使用してもよい。このような組織由来の膵臓の組織または細胞は、膵島細胞、または膵島、または膵島細胞クラスターを含んでもよい。例えば、細胞は、移植され得る膵島であってもよい。さらに具体的には、細胞は、膵臓のβ細胞であってもよい。細胞はまた、インスリン産生性であってもよい。あるいは、細胞は、膵島様細胞であってもよい。膵島細胞クラスターは、α、β、δ、ＰＰまたはε細胞のうちの任意の１つまたは複数を含んでもよい。適切には、本明細書の方法および組成物によって処置されるべき疾患は糖尿病であってもよい。適切には、移植可能なグラフトは、膵島であっても、および／または膵島由来の細胞であってもよい。適切には、トランスジェニック動物に対する改変は、膵島または膵島由来の細胞に対してのものである。適切には、膵島または膵島由来の細胞は、ブタのものである。いくつかの場合には、膵島由来の細胞は、膵臓のβ細胞であるか、またはそれを含む。

ドナーの非ヒト動物は、限定するものではないが、胎仔、新生仔、若年および成体を含む任意の発生段階であってもよい。例えば、ドナー細胞膵島細胞は、成体非ヒト動物から単離されてもよい。ドナー細胞、例えば、膵島細胞はまた、胎仔または新生仔の非ヒト動物から単離されてもよい。ドナー非ヒト動物は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１歳未満であってもよい。例えば、膵島細胞は、６歳未満の非ヒト動物から単離されてもよい。膵島細胞はまた、３歳未満の非ヒト動物から単離されてもよい。ドナーは、非ヒト動物であってもよく、０からもしくは約０から（胎仔を含む）２歳；２からもしくは約２から４歳；４からもしくは約４から６歳；６からもしくは約６から８歳；または８からもしくは約８から１０歳までのいずれかの年齢であってもよい。非ヒト動物は、１０歳超または約１０歳超であってもよい。ドナー細胞は、同様にヒトに由来してもよい。

膵島細胞は、種々の年齢の非ヒト動物から単離されてもよい。例えば、膵島細胞は、新生仔からまたはほぼ新生仔から２歳までの非ヒト動物から単離されてもよい。膵島細胞はまた、胎仔からまたはほぼ胎仔から２歳までの非ヒト動物から単離されてもよい。膵島細胞は、６ヵ月齢からまたは約６ヵ月齢から２歳までの非ヒト動物から単離されてもよい。膵島細胞はまた、７ヵ月齢からまたは約７ヵ月齢から１歳までの非ヒト動物から単離されてもよい。膵島細胞は、２歳からまたは約２歳から３歳までの非ヒト動物から単離されてもよい。いくつかの場合には、非ヒト動物は、０歳未満（例えば、胎仔または胚）であってもよい。いくつかの場合には、新生仔の膵島は、成体膵島よりも元気でかつ単離後に一貫性がある場合があり、酸化的ストレスにさらに耐性である場合があり、有意な増殖能を示し得（おそらく、発生期の膵島幹細胞小集団由来）、その結果、その膵島は、移植部位に移植および生着後に増殖する能力を有し得る。

糖尿病を処置することに関して、新生仔の膵島は、有意なレベルのインスリンを生じるのに十分成熟するまで最大４〜６週間または最大約４〜６週間かかる場合があるという不利な点があり得るが、これは、新生仔の膵島の成熟に十分な期間にわたって外因性のインスリンでの処置によって克服できる。異種グラフト移植術では、新生仔の膵島の生存および機能的な生着は、任意のレシピエントの内因性ｃペプチドから容易に識別されるドナー特異的なｃペプチドレベルを測定することによって決定され得る。

上記で考察されるとおり、成体細胞は単離され得る。例えば、成体非ヒト動物膵島、例えば、成体ブタ細胞は、単離されてもよい。次いで、膵島は、混入する外分泌組織の調製物を枯渇するために、移植術前に１〜３日間または約１〜３日間培養してもよい。処置の前に、膵島をカウントしてもよく、生存度を、二重蛍光カルセインＡＭおよびヨウ化プロピジウム染色によって評価してもよい。膵島細胞の生存度＞７５％を使用してもよい。しかし、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％超または約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％超の細胞生存度を使用してもよい。例えば、４０％からもしくは約４０％から５０％；５０％からもしくは約５０％から６０％；６０％からもしくは約６０％から７０％；７０％からもしくは約７０％から８０％；８０％からもしくは約８０％から９０％；９０％からもしくは約９０％から９５％、または９０％からもしくは約９０％から１００％までの生存度を示す細胞を使用してもよい。さらに、純度は、全組織あたり８０％超または約８０％超の膵島であってもよい。純度はまた、全組織あたり、少なくともまたは少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の膵島であってもよい。例えば、純度は、４０％からまたは約４０％から５０％；５０％からまたは約５０％から６０％；６０％からまたは約６０％から７０％；７０％からまたは約７０％から８０％；８０％からまたは約８０％から９０％；９０％からまたは約９０％から１００％；９０％からまたは約９０％から９５％、または９５％からまたは約９５％から１００％までであってもよい。

動的な洗い流し（ｐｅｒｉｆｕｓｉｏｎ）および生存度を含む膵島の機能的な特性は、処置前にｉｎｖｉｔｒｏで決定され得る（Ｂａｌａｍｕｒｕｇａｎ、２００６年）。例えば、非ヒト動物膵島細胞、例えば、トランスジェニックのブタ膵島細胞は、それらがグラフト移植に適切であるように、それらを拡大増殖、成熟および／または精製するためにｉｎｖｉｔｒｏで培養してもよい。

膵島細胞はまた、刻んだ膵臓の標準的なコラゲナーゼ消化によって単離してもよい。例えば、無菌技術を使用して、腺を、組織解離性の酵素（膵臓の迅速な解離およびランゲルハンスの健康、インタクトかつ機能的な膵島の最大回収のために処方された精製された酵素の混合物、ここでこれらの酵素の標的基質は、完全には特定されないが、膵臓腺房組織の細胞間マトリクスを含む、コラーゲンおよび非コラーゲンタンパク質であると仮定される）（１．５ｍｇ／ｍｌ）を用いて膨張させて、過剰の脂肪、血管および結合組織を取り除いて、刻んで、１２０ｒｐｍで、１５分間振盪水浴中で、３７℃で消化することができる。消化は、消化の間の細胞損傷を回避するために組織解離性の酵素と混合されたリグノカインを使用して達成してもよい。消化の後、細胞は、無菌のビーカー中に、無菌の５０ｍｍ〜１０００ｍｍのメッシュ、例えば、１００ｍｍ、２００ｍｍ、３００ｍｍ、４００ｍｍ、５００ｍｍ、６００ｍｍ、７００ｍｍ、８００ｍｍ、９００ｍｍ、または１０００ｍｍのメッシュを通過させてもよい。さらに、第２の消化プロセスを、任意の未消化組織に使用してもよい。

膵島は、成体ブタ膵臓から単離してもよい（Ｂｒａｎｄｈｏｒｓｔら、１９９９年）。膵臓は、適切な供給源のブタから回収し、膵臓周囲の組織を除去し、膵臓を、脾臓の葉に、および十二指腸／接続葉（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇｌｏｂｅ）で分けて、各々の葉の管にカニューレ挿入し、その葉を組織解離性の酵素で膨張させる。膵臓の葉は、リコルディ・チャンバ（Ｒｉｃｏｒｄｉｃｈａｍｂｅｒ）に入れ、温度を２８〜３２℃まで漸増し、膵臓の葉を、酵素活性および機械的な力によって解離する。解放された膵島を、腺房および管状組織から、連続密度勾配を使用して分離する。精製された膵島を、２〜７日間または約２〜７日間培養し、特徴付けに供し、全ての仕様を満たす膵島生成物を、移植術にリリースする（Ｋｏｒｂｕｔｔら、２００９年）。

ドナーの細胞、臓器、および／または組織は、移植術の前、後、および／または間に機能的であり得る。例えば、移植された細胞、臓器、および／または組織は、移植術後、少なくともまたは少なくとも約１、５、１０、２０、３０日の間、機能的であり得る。移植された細胞、臓器、および／または組織は、移植術後、少なくともまたは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヵ月の間、機能的であり得る。移植された細胞、臓器、および／または組織は、移植術後、少なくともまたは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０年の間、機能的であり得る。いくつかの場合には、移植された細胞、臓器、および／または組織は、レシピエントの寿命まで機能的であり得る。これによって移植術が成功したことが示され得る。これによって、また、移植された細胞、組織、および／または臓器の拒絶がないことも示され得る。

さらに、移植された細胞、臓器、および／または組織は、その正常な意図される作用（ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）の１００％で機能し得る。移植された細胞、臓器、および／または組織はまた、その正常な意図される作用の少なくともまたは少なくとも約５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９もしくは１００％で、例えば、５０からまたは約５０から６０；６０からまたは約６０から７０；７０からまたは約７０から８０；８０からまたは約８０から９０；９０からまたは約９０から１００％までで機能し得る。特定の場合には、移植された細胞、臓器、および／または組織は、その正常な意図される作用のうち１００％超で機能し得る（ＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎによって決定される、移植されていない正常な機能性の細胞、臓器または組織と比較した場合）。例えば、移植された細胞、臓器、および／または組織は、その正常な意図される作用の１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００％もしくはそれ超で、または約１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００％もしくはそれ超で、例えば、１００からまたは約１００から１２５；１２５からまたは約１２５から１５０；１５０からまたは約１５０から１７５；１７５からまたは約１７５から２００％までで機能し得る。

ある特定の場合には、移植された細胞は、少なくともまたは少なくとも約１日間機能し得る。移植された細胞は、少なくともまたは少なくとも約７日間、機能し得る。移植された細胞は、少なくともまたは少なくとも約１４日間、機能し得る。移植された細胞は、少なくともまたは少なくとも約２１日間、機能し得る。移植された細胞は、少なくともまたは少なくとも約２８日間、機能し得る。移植された細胞は、少なくともまたは少なくとも約６０日間、機能し得る。

首尾よい移植術の別の指標は、レシピエントが免疫抑制療法を必要としない日数である場合がある。例えば、本明細書に提供される処置（例えば、移植術）後、レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約１、５、１０、１００、３６５、５００、８００、１０００、２０００、４０００日もしくはそれを超える日数の間、免疫抑制療法を必要としない場合がある。これによって、移植術が成功したことが示され得る。これはまた、移植された細胞、組織、および／または臓器の拒絶がないことを示し得る。

いくつかの場合には、レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約１日間、免疫抑制療法を必要としない場合がある。レシピエントはまた、少なくともまたは少なくとも約７日間、免疫抑制療法を必要としない場合もある。レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約１４日間、免疫抑制療法を必要としない場合がある。レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約２１日間、免疫抑制療法を必要としない場合がある。レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約２８日間、免疫抑制療法を必要としない場合がある。レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約６０日間、免疫抑制療法を必要としない場合がある。さらに、レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０もしくは５０年の間、例えば、少なくともまたは少なくとも約１〜２；２〜３；３〜４；４〜５；１〜５；５〜１０；１０〜１５；１５〜２０；２０〜２５；２５〜５０年の間、免疫抑制療法を必要としない場合がある。

首尾よい移植術の別の指標は、レシピエントが低減された免疫抑制療法を要する日数である場合がある。例えば、本明細書に提供される処置後、レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約１、５、１０、５０、１００、２００、３００、３６５、４００、５００日の間、例えば、少なくともまたは少なくとも約１〜３０；３０〜１２０；１２０〜３６５；３６５〜５００日の間、低減された免疫抑制療法を必要とし得る。これによって、移植術が成功したことが示され得る。これによってまた、移植された細胞、組織、および／または臓器の拒絶がないかまたは最小であることが示され得る。

例えば、レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約１日間、低減された免疫抑制療法を必要とし得る。レシピエントはまた、少なくとも７日間、低減された免疫抑制療法を必要とし得る。レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約１４日間、低減された免疫抑制療法を必要とし得る。レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約２１日間、低減された免疫抑制療法を必要とし得る。レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約２８日間、低減された免疫抑制療法を必要とし得る。レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約６０日間、低減された免疫抑制療法を必要とし得る。さらにレシピエントは、少なくともまたは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０もしくは５０年の間、例えば、少なくともまたは少なくとも約１〜２；２〜３；３〜４；４〜５；１〜５；５〜１０；１０〜１５；１５〜２０；２０〜２５；２５〜５０年の間、低減された免疫抑制療法を必要とし得る。

「低減された（ｒｅｄｕｃｅｄ）」およびその文法上の等価物は、本明細書において使用する場合、１つまたは複数の野生型細胞がレシピエントに移植されるとき、必要な免疫抑制療法と比較して少ない免疫抑制療法を指し得る。

免疫抑制療法
免疫抑制療法は、免疫系を抑制する任意の処置を含んでもよい。免疫抑制療法は、レシピエントにおける移植拒絶を緩和、最小化または排除することを補助し得る。例えば、免疫抑制療法は、免疫抑制薬を含んでもよい。移植の前、間および／または後に使用され得る免疫抑制薬は、当業者に公知の任意のものであり、これには限定するものではないが、ＭＭＦ（ミコフェノール酸モフェチル（Ｃｅｌｌｃｅｐｔ））、ＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン）、抗ＣＤ１５４（ＣＤ４ＯＬ）、抗ＣＤ４０（２Ｃ１０、ＡＳＫＰ１２４０、ＣＣＦＺ５３３Ｘ２２０１）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、抗ＣＤ２０（リツキシマブ）、抗ＩＬ−６Ｒ抗体（トシリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ）、抗ＩＬ−６抗体（サリルマブ、オロキズマブ（ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ））、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（アバタセプト／オレンシア）、ベラタセプト（ＬＥＡ２９Ｙ）、シロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）、エベロリムス、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）、ダクリズマブ（Ｚｅ−ｎａｐａｘ）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、シクロスポリン、デオキシスパガリン、可溶性補体受容体１、コブラ毒因子、コンプスタチン、抗Ｃ５抗体（エクリズマブ／Ｓｏｌｉｒｉｓ）、メチルプレドニゾロン、ＦＴＹ７２０、エベロリムス、レフルノミド、抗ＩＬ−２Ｒ−Ａｂ、ラパマイシン、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＯＸ４０抗体、および抗ＣＤ１２２抗体が挙げられる。さらに、１つまたは１つより多い免疫抑制剤／薬を一緒に使用しても、または逐次使用してもよい。１つまたは１つより多い免疫抑制剤／薬を誘導療法に使用してもよいし、または維持療法に使用してもよい。同じ薬物または異なる薬物を、誘導および維持の段階の間に使用してもよい。いくつかの場合には、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）を誘導療法に使用してもよく、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）およびシロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）を維持療法に使用してもよい。ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）をまた誘導療法にも使用してもよく、低用量タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）および低用量シロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）を維持療法に使用してもよい。免疫抑制はまた、全身照射、胸腺照射、ならびに完全および／または部分的な脾臓摘出を含むがこれに限定されない非薬物レジメンを使用して達成してもよい。これらの技術はまた、１つまたは複数の免疫抑制薬と併用してもよい。

トランスジェニック膵島細胞は、限定されるものではないが、レシピエント生物の門脈、肝臓被膜下腔、脾臓被膜下腔、腎臓被膜下腔、網、胃または腸の粘膜下組織、小腸の血管部分、静脈嚢、精巣、脳、角膜または脾臓を介する導入を含む当技術分野で公知の任意の手段を使用して移植してもよい。例えば、本明細書に提供される膵臓細胞、例えば、ブタの膵臓細胞を霊長類、例えば、ヒトに移植するために異種移植術の方法を用いてもよく、ここでは膵島が、門脈内の注入によって投与される。本明細書に提供される膵臓細胞を霊長類に移植するために異種移植術の方法を提供してもよく、ここでは膵島が、腹腔内腔、腎被膜下、腎被膜、網を介して、または膵臓のベッドインフュージョン（ｂｅｄｉｎｆｕｓｉｏｎ）を介して投与される。例えば、移植は、被膜下移植であっても、筋肉内移植であっても、または門脈内移植であってもよい。

同種移植および異種移植の両方とも、自己免疫を再発させやすい場合がある。例えば、膵島細胞移植術に関して、膵島β細胞は、自己反応性Ｔ細胞により、例えば、ＣＤ８＋自己反応性Ｔ細胞、および自己反応性抗体によって、移植術後、攻撃されて、破壊される場合がある。レシピエントが、寛容化ワクチンを与えられる場合、自己免疫性再発は妨げられ得る。例えば、寛容化ワクチンが、自己抗原、例えば、インスリンＢ９−２３を、アポトーシス性キャリア細胞またはマイクロ粒子、例えば、ポリスチレン粒子の表面上に存在するように操作される場合、自己抗原に対する寛容は、回復され得、自己免疫性再発は、妨げられ得る。例えば、糖尿病に関して、本明細書に開示される寛容化ワクチンは、自己免疫１型糖尿病の発生を妨げるか、または移植された膵島β細胞における自己免疫性再発を妨げ得る。

寛容化ワクチンはまた、レシピエントに与えて、糖尿病を予防または処置してもよい（例えば、１型、２型、妊娠性、外科的、嚢胞性線維症関連糖尿病、またはミトコンドリア糖尿病。いくつかの場合には、疾患は、遺伝性の糖尿病であっても、またはある種の遺伝性の糖尿病であってもよい）。

さらに、同種移植および異種移植の両方に関して、グラフト中でＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、およびＢ２Ｍのような遺伝子を破壊することは、膵島ベータ細胞上を含む、グラフト細胞上のＭＨＣクラスＩの機能的発現の欠失を生じ得、それによって、自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の移植後活性を妨げる。したがって、これは、自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解性のエフェクター機能から移植片、例えば、移植された膵島ベータ細胞を防御し得る。

寛容化ワクチンを使用するレシピエントにおける移植グラフトの寛容の誘導
ＥＣＤＩ処置細胞を含む寛容化ワクチンは、ドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植の前、後、および／または間に投与して、レシピエントにおいてドナー特異的な寛容を誘導してもよい。図４に示される例としては、ブタ膵島が０日目にレシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に移植される。同じドナーブタ由来のアポトーシス性細胞（例えば、寛容化ワクチン）を最初に、異種グラフト（例えば、同じドナー由来のブタ膵島）に対する寛容を誘導するために膵島移植の７日前（−７日目）に投与してもよい。追加の寛容化ワクチンは、寛容を増進する（ｂｏｏｓｔｅｒ）ために膵島移植の１日後（１日目）に投与してもよい（図４）。さらに、寛容化ワクチンの投与は、一過性の免疫抑制の投与を伴ってもよい（図４）。いくつかの場合には、ＥＣＤＩ処置細胞を含む寛容化ワクチンを、０日目のドナーの細胞、臓器および／または組織の移植に対して、−１００日目、−９０日目、−８０日目、−７０日目、−６０日目、−５０日目、−４０日目、−３０日目、−２０日目、−１５日目、−１４日目、−１３日目、−１２日目、−１１日目、−１０日目、−９日目、−８日目、−７日目、−６日目、−５日目、−４日目、−３日目、−２日目もしくは−１日目に、または約−１００日目、約−９０日目、約−８０日目、約−７０日目、約−６０日目、約−５０日目、約−４０日目、約−３０日目、約−２０日目、約−１５日目、約−１４日目、約−１３日目、約−１２日目、約−１１日目、約−１０日目、約−９日目、約−８日目、約−７日目、約−６日目、約−５日目、約−４日目、約−３日目、約−２日目もしくは約−１日目に、例えば、−１００〜−５０日目；−５０〜−４０日目；−４０〜−３０日目；−３０〜−２０日目；−２０〜−１０日目；−１０〜−５日目；−７〜−１日目に、または約−１００〜−５０日目；約−５０〜−４０日目；約−４０〜−３０日目；約−３０〜−２０日目；約−２０〜−１０日目；約−１０〜−５日目；約−７〜−１日目に投与してもよい。例えば、ＥＣＤＩ処置細胞を含む寛容化ワクチンを、ドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植の７日前（例えば、−７日目）に投与してもよい。いくつかの場合には、ＥＣＤＩ処置細胞を含む寛容化ワクチンを、ドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植と同じ日（例えば、０日目）に投与してもよい。いくつかの場合には、ＥＣＤＩ処置細胞は、０日目のドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植に対して１００日目、９０日目、８０日目、７０日目、６０日目、５０日目、４０日目、３０日目、２０日目、１５日目、１４日目、１３日目、１２日目、１１日目、１０日目、９日目、８日目、７日目、６日目、５日目、４日目、３日目、２日目もしくは１日目に、または約１００日目、約９０日目、約８０日目、約７０日目、約６０日目、約５０日目、約４０日目、約３０日目、約２０日目、約１５日目、約１４日目、約１３日目、約１２日目、約１１日目、約１０日目、約９日目、約８日目、約７日目、約６日目、約５日目、約４日目、約３日目、約２日目もしくは約１日目に、投与され得る。例えば、ＥＣＤＩ処置細胞を含む寛容化ワクチンは、ドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植の１日後（例えば、１日目）に投与されてもよい。いくつかの場合には、寛容化ワクチンは、ドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植術の前および後に投与されてもよい。

遺伝子改変された細胞、寛容化ワクチンおよび抗体を一緒に使用して、移植拒絶を抑制してもよい。図５は、グラフト（例えば、異種グラフト）の拒絶を防ぐか、および／またはその生存を延長する例示的なアプローチを実証する。このアプローチは、ｉ）グラフトドナーの遺伝子操作；ｉｉ）ワクチンドナーの遺伝子操作、ならびにｉｉｉ）遺伝子操作された寛容化ワクチン（アポトーシス性細胞単独または非アポトーシス性細胞とともに）の投与、および一過性の免疫抑制の援護のもとでのグラフト移植を組み込んでもよい。グラフトドナーおよびワクチンドナーは、同じ遺伝子型を有してもよい。あるいは、グラフトドナーおよびワクチンドナーは、異なる遺伝子型を有してもよい。いくつかの場合には、グラフトドナーは、ＮＬＲＣ５、Ｃ３、ＣＸＣＬ１０およびＧＧＴＡ１の低減された発現、ならびにＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１）またはＨＬＡ−Ｅをコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含み得る。いくつかの場合には、グラフトドナーは、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＣＸＣＬ１０およびＧＧＴＡ１の低減された発現、ならびにＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１）またはＨＬＡ−Ｅをコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含んでもよい。いくつかの場合には、グラフトドナーは、ＮＬＲＣ５およびＴＡＰ１、Ｃ３、ＣＸＣＬ１０およびＧＧＴＡ１の低減された発現、ならびにＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１）またはＨＬＡ−Ｅをコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含んでもよい。ワクチンドナーは、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２の低減された発現、ならびに／またはＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１）、ＣＤ４７（例えば、ヒトＣＤ４７）、ＰＤ−Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１）、およびＰＤ−Ｌ２（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ２）をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を有し得る。ワクチンドナーは、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２の低減された発現、ならびに／またはＨＬＡ−Ｅ、ＣＤ４７（例えば、ヒトＣＤ４７）、ＰＤ−Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１）、およびＰＤ−Ｌ２（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ２）をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を有し得る。このワクチンはいくつかの場合には、移植レシピエントに、前に（例えば、−７日目に）および／または後に（例えば、１日目に）与えられてもよい。他の免疫抑制試薬、例えば、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ２０抗体、ラパマイシン、コンプスタチン、抗ＩＬ−６Ｒ抗体、およびｓＴＮＦＲ、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）のうちの１つまたは複数もまた、移植の前および／または後に対象に与えられてもよい。

本明細書に開示される、遺伝子改変された細胞、組織、臓器、寛容化ワクチンおよび抗ＣＤ４０抗体に加えて、１つまたは複数の追加の免疫抑制剤を、遺伝子改変された細胞、組織、臓器、寛容化ワクチンおよび／または抗ＣＤ４０抗体を受容している対象に投与してもよい。追加の免疫抑制剤を対象に投与して、例えば、対象における寛容化ワクチンの寛容原性の有効性を増強してもよい。追加の免疫抑制剤は、Ｂ細胞枯渇化抗体、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦアルファ阻害剤、ＩＬ−６阻害剤、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）、補体Ｃ３もしくはＣ５阻害剤、またはそれらの任意の組合せを含んでもよい。

追加の免疫抑制剤は、例えば、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤であってもよい。例えば、追加の免疫抑制剤は、シクロホスファミドであってもよい。

追加の免疫抑制剤は、寛容化ワクチンの投与の前、後、および／または間に投与されてもよい。いくつかの場合には、追加の免疫抑制剤は、寛容化ワクチンの投与に対して、−１００日目〜０日目の間に、例えば、−９０日目、−８０日目、−７０日目、−６０日目、−５０日目、−４０日目、−３０日目、−２０日目、−１５日目、−１４日目、−１３日目、−１２日目、−１１日目、−１０日目、−９日目、−８日目、−７日目、−６日目、−５日目、−４日目、−３日目、−２日目または−１日目に投与されてもよい。いくつかの場合には、追加の免疫抑制剤は、寛容化ワクチンの投与に対して、−１００〜−５０日目；−５０〜−４０日目；−４０〜−３０日目；−３０〜−２０日目；−２０〜−１０日目；−１０〜−５日目；−７〜−１日目に、または約−１００〜−５０日目；約−５０〜−４０日目；約−４０〜−３０日目；約−３０〜−２０日目；約−２０〜−１０日目；約−１０〜−５日目；約−７〜−１日目に投与されてもよい。いくつかの場合には、追加の免疫抑制剤は、寛容化ワクチンの投与に対して、０日〜１００日目の間に、例えば、１００日目、９０日目、８０日目、７０日目、６０日目、５０日目、４０日目、３０日目、２０日目、１５日目、１４日目、１３日目、１２日目、１１日目、１０日目、９日目、８日目、７日目、６日目、５日目、４日目、３日目、２日目または１日目に投与されてもよい。例えば、この免疫抑制剤は、寛容化ワクチンの投与に対して、１００〜５０日目；５０〜４０日目；４０〜３０日目；３０〜２０日目；２０〜１０日目；１０〜５日目；７〜１日目に、または約１００〜５０日目；約５０〜４０日目；約４０〜３０日目；約３０〜２０日目；約２０〜１０日目；約１０〜５日目；約７〜１日目に投与されてもよい。いくつかの場合には、追加の免疫抑制剤は、寛容化ワクチンが投与される日に投与されてもよい。他の場合には、追加の免疫抑制は、寛容化ワクチンの投与の前後に投与されてもよい。例えば、シクロホスファミドは、寛容化ワクチンの投与後３日目または約３日目に投与されてもよい。

寛容原性の有効性レギュレーター（例えば、シクロホスファミド）を、５からまたは約５から１００ｍｇ／ｋｇ／日までの用量で投与してもよい。「ｍｇ／ｋｇ／日」という単位は、１日あたり対象の体重１キログラムあたりに投与される寛容原性の有効性レギュレーターのミリグラム数を指す場合がある。いくつかの場合には、寛容原性の有効性レギュレーター（例えば、シクロホスファミド）は、２０ｍｇ／ｋｇ／日からもしくは約２０ｍｇ／ｋｇ／日から１００ｍｇ／ｋｇ／日；３０ｍｇ／ｋｇ／日からもしくは約３０ｍｇ／ｋｇ／日から９０ｍｇ／ｋｇ／日；４０ｍｇ／ｋｇ／日からもしくは約４０ｍｇ／ｋｇ／日から８０ｍｇ／ｋｇ／日；５０ｍｇ／ｋｇ／日からもしくは約５０ｍｇ／ｋｇ／日から７０ｍｇ／ｋｇ／日；５０ｍｇ／ｋｇ／日からもしくは約５０ｍｇ／ｋｇ／日から６０ｍｇ／ｋｇ／日；または４０ｍｇ／ｋｇ／日からもしくは約４０ｍｇ／ｋｇ／日から６０ｍｇ／ｋｇ／日までの用量で投与されてもよい。

細胞（例えば、脾細胞）を、適切な抗原（複数可）および／またはエピトープ（複数可）（例えば、ＣＤ４）の存在下においてＥＣＤＩで処置してもよい。ＥＣＤＩ処置は、ＥＣＤＩ処置細胞に対する抗原（複数可）および／またはエピトープ（複数可）のカップリングを生じ得る。他のコンジュゲート、例えば、ヘキサメチレンジイソシアネート、プロピレングリコールジ−グリシジルエーテル（２つのエポキシ残基を含有する）、およびエピクロロヒドリンをまた使用して、細胞を処置して、抗原（複数可）および／またはエピトープ（複数可）をカップリングして、寛容化ワクチンのための細胞を作製してもよい。

抗原カップリングされた細胞および／またはエピトープカップリングされた細胞（例えば、ＥＣＤＩ誘導性カップリング）を、ドナーの移植細胞、臓器、および／または組織の投与の前、間、および／または後に投与して、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）における細胞、臓器および／または組織について寛容を誘導してもよい。いくつかの場合には、抗原カップリングされた細胞および／またはエピトープカップリングされた細胞を、０日目のドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植に対して、−１００日目、−９０日目、−８０日目、−７０日目、−６０日目、−５０日目、−４０日目、−３０日目、−２０日目、−１５日目、−１４日目、−１３日目、−１２日目、−１１日目、−１０日目、−９日目、−８日目、−７日目、−６日目、−５日目、−４日目、−３日目、−２日目または−１日目に投与してもよい。いくつかの場合には、抗原カップリングされた細胞および／またはエピトープカップリングされた細胞を、０日目のドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植に対して−１００から−５０日目；−５０から−４０日目；−４０から−３０日目；−３０から−２０日目；−２０から−１０日目；−１０から−５日目；−７から−１日目に、または約−１００から−５０日目；約−５０から−４０日目；約−４０から−３０日目；約−３０から−２０日目；約−２０から−１０日目；約−１０から−５日目；約−７から−１日目に投与してもよい。例えば、抗原カップリングされた細胞および／またはエピトープカップリングされた細胞は、ドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植の７日前（例えば、−７日目）に投与してもよい。いくつかの場合には、抗原カップリングされた細胞および／またはエピトープカップリングされた細胞を、ドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植と同じ日（例えば、０日目）に投与してもよい。いくつかの場合には、抗原カップリングされた細胞および／またはエピトープカップリングされた細胞は、０日目のドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植に対して、１００日目、９０日目、８０日目、７０日目、６０日目、５０日目、４０日目、３０日目、２０日目、１５日目、１４日目、１３日目、１２日目、１１日目、１０日目、９日目、８日目、７日目、６日目、５日目、４日目、３日目、２日目または１日目に投与されてもよい。例えば、抗原カップリングされた細胞および／またはエピトープカップリングされた細胞は、０日目のドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植に対して１００から５０日目；５０から４０日目；４０から３０日目；３０から２０日目；２０から１０日目；１０から５日目；７から１日目に、または約１００から５０日目；約５０から４０日目；約４０から３０日目；約３０から２０日目；約２０から１０日目；約１０から５日目；約７から１日目に投与されてもよい。例えば、抗原カップリングされた細胞および／またはエピトープカップリングされた細胞は、ドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植の１日後（例えば、１日目）に投与されてもよい。

ＥＣＤＩ処置細胞、抗原カップリングされた細胞、および／またはエピトープカップリングされた細胞は、レシピエントに対するドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植術の前にレシピエントに投与されてもよい。ＥＣＤＩ処置細胞、抗原カップリングされた細胞、および／またはエピトープカップリングされた細胞は、レシピエントに対するドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植術の前にレシピエントに同時投与されてもよい。ＥＣＤＩ処置細胞、抗原カップリングされた細胞、および／またはエピトープカップリングされた細胞は、レシピエントに対するドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植術の移植後にレシピエントに投与されてもよい。移植術の前、間、および／または後の移植レシピエントに対するＥＣＤＩ処置細胞、抗原カップリングされた細胞、および／またはエピトープカップリングされた細胞の投与は、移植された細胞、臓器、および／または組織の寛容の増大を生じ得る。例えば、ＥＣＤＩ処置細胞、抗原カップリングされた細胞、および／またはエピトープカップリングされた細胞は、移植された細胞、臓器、および／または組織の初期の寛容、長期の寛容および／または総合的な許容を増大し得る。いくつかの場合には、移植レシピエントにＥＣＤＩ処置細胞（例えば、エピトープカップリングされた細胞）を投与することは、追加の免疫抑制も抗拒絶療法もなく、移植された材料の寛容を生じ得る。

寛容化ワクチンは、細胞、臓器、および／または組織の拒絶を妨げるのに必要な免疫抑制の用量または持続期間を減少し得る。寛容化ワクチンは、必要な免疫抑制の用量を、少なくともまたは少なくとも約５％低下し得る。例えば、寛容化ワクチンは、必要な免疫抑制の用量を、少なくともまたは少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％、例えば、少なくともまたは少なくとも約５〜２５％；２５〜５０％；５０〜７５％；７５〜８５％；８５〜９０％；９０〜９５％；９５〜１００％低下する。いくつかの場合には、移植レシピエントは、寛容化ワクチンの投与後に免疫抑制を必要としない場合がある。「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」という用語、およびその文法上の等価物は、本明細書において使用する場合、１つまたは複数の野生型細胞、臓器、および／または組織が、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に移植された場合、免疫抑制の必要な用量と比較して少ない免疫抑制を使用することを指す場合がある。「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」という用語はまた、１つまたは複数の野生型細胞、臓器、および／または組織が、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に移植された場合、免疫抑制の必要な用量と比較して少ない免疫抑制薬（複数可）または剤（複数可）を使用することを指す場合もある。

レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、移植術後少なくともまたは少なくとも約１日、５日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、６０日、７０日、８０日、９０日、または１００日、例えば、少なくともまたは少なくとも約１から５日；５から１０日；１０から２０日；２０から３０日；３０から６０日；６０〜１００日間の間、低減された用量の免疫抑制を必要とし得る。レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、移植術後少なくともまたは少なくとも約１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、または１２ヵ月、例えば、移植術後少なくともまたは少なくとも約１から２ヵ月；２から３ヵ月；３から６ヵ月；６から９ヵ月；９から１２ヵ月の間、低減された用量の免疫抑制を必要とし得る。レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、移植術後、少なくともまたは少なくとも約１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１５年、２０年、２５年、または３０年、例えば、移植術後少なくともまたは少なくとも約１から２年；２から３年；３から４年；４から５年；１から５年；５から１０年；１０から１５年；１５から２０年；２０から２５年；２５から３０年の間、低減された用量の免疫抑制を必要とし得る。いくつかの場合には、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、そのレシピエントの寿命まで低減された用量の免疫抑制を必要とし得る。

レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、移植術後、少なくともまたは少なくとも約１日、５日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、６０日、７０日、８０日、９０日または１００日、例えば、少なくともまたは少なくとも約１から５日；５から１０日；１０から２０日；２０から３０日；３０から６０日；６０から１００日の間、免疫抑制を必要としない場合がある。レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、移植術後、少なくともまたは少なくとも約１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月または１２ヵ月、例えば、移植術後、少なくともまたは少なくとも約１から２ヵ月；２から３ヵ月；３から６ヵ月；６から９ヵ月；９から１２ヵ月の間、低減された用量の免疫抑制を必要とし得る。レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、移植術後、少なくともまたは少なくとも約１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１５年、２０年、２５年または３０年、例えば、移植術後、少なくともまたは少なくとも約１から２年；２から３年；３から４年；４から５年；１から５年；５から１０年；１０から１５年；１５から２０年；２０から２５年；２５から３０年の間、低減された用量の免疫抑制を必要とし得る。いくつかの場合には、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）は、そのレシピエントの寿命まで免疫抑制を必要としない場合がある。

本明細書に記載される免疫抑制とは、移植術の直前、後、および／または間に投与される免疫抑制を指す場合がある。本明細書に記載される免疫抑制とはまた、移植術後、少なくともまたは少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、６０日、７０日、８０日、９０日または１００日（例えば、少なくともまたは少なくとも約１から５日；５から１０日；１０から２０日；２０から３０日；３０から６０日；６０から１００日の間）、あるいは１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１５年、２０年、２５年もしくは３０年（例えば、少なくともまたは少なくとも約１から２年；２から３年；３から４年；４から５年；１から５年；５から１０年；１０から１５年；１５から２０年；２０から２５年；２５から３０年の間）で投与された維持免疫抑制を指す場合がある。寛容化ワクチンは、維持免疫抑制を必要せずに、細胞、臓器、および／または組織の生存を増大し得る。

免疫抑制を、免疫抑制療法で使用して、レシピエントにおける移植拒絶を抑制してもよい。免疫抑制療法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）における移植拒絶を抑制する任意の処置を含んでもよい。免疫抑制療法は、免疫抑制薬を投与することを含み得る。移植の前、間および／または後に使用され得る免疫抑制薬としては、限定するものではないが、ＭＭＦ（ミコフェノール酸モフェチル（Ｃｅｌｌｃｅｐｔ））、ＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン）、抗ＣＤ１５４（ＣＤ４ＯＬ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、抗ＣＤ２０（リツキシマブ）、抗ＩＬ−６Ｒ抗体（トシリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ）、抗ＩＬ−６抗体（サリルマブ、オロキズマブ）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（アバタセプト／オレンシア）、ベラタセプト（ＬＥＡ２９Ｙ）、シロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）、ダクリズマブ（Ｚｅ−ｎａｐａｘ）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、シクロスポリン、デオキシスパガリン、可溶性補体受容体１、コブラ毒因子、コンプスタチン、抗Ｃ５抗体（エクリズマブ／Ｓｏｌｉｒｉｓ）、メチルプレドニゾロン、ＦＴＹ７２０、エベロリムス、抗ＣＤ１５４−Ａｂ、レフルノミド、抗ＩＬ−２Ｒ−Ａｂ、ラパマイシン、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＯＸ４０抗体、および抗ＣＤ１２２抗体、およびヒト抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体が挙げられる。１つまたは１つより多い免疫抑制剤／薬を一緒に使用しても、または逐次使用してもよい。１つまたは１つより多い免疫抑制剤／薬を、誘導療法に使用してもよいし、または維持療法に使用してもよい。同じ薬物または異なる薬物を、誘導および維持の段階の間に使用してもよい。例えば、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）を誘導療法に使用し、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）およびシロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）を維持療法に使用する。別の実施例では、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）が誘導療法に使用され、低用量タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）および低用量シロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）が維持療法に使用される。免疫抑制はまた、限定するものではないが、全身照射、胸腺照射、ならびに完全および／または部分的な脾臓摘出を含む非薬物レジメンを使用して達成してもよい。これらの技術はまた、１つまたは複数の免疫抑制薬と併用してもよい。

抗体処置
劇症性、超急性、および／または急性の血管拒絶を回避する同種グラフトおよび異種グラフトの両方を、Ｔ細胞媒介性の拒絶に供する。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔリンパ球は拒絶に寄与する。これらのＴ細胞は、Ｔ細胞に対するドナー抗原提示細胞による提示に関与する免疫認識の直接経路を介して、または宿主抗原提示細胞による内部移行された可溶性ドナー抗原の提示に関与する間接的経路を介して活性化され得る。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、拒絶の主要な媒介因子である。Ｂ細胞は、抗原提示、サイトカイン産生および共刺激のような機構によって、活性化された抗ドナーＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖、抗ドナーＣＤ８^＋Ｔ細胞の生存、およびＴ細胞記憶生成を促進する。本明細書に開示される組成物および方法を使用して、ドナーから移植された細胞、組織または臓器に対するレシピエントの直接免疫応答、間接免疫応答、またはその両方を低減してもよい。本明細書に記載されるような処置の方法は、ＥＣＤＩ処置細胞（例えば、寛容化ワクチン）、および１つまたは複数の生物学的物質または化学的物質をヒトに提供するステップを含み得る。例えば、ＥＣＤＩ処置細胞は、ブタ細胞、例えば、ブタの脾細胞であってもよい。

１つまたは複数の生物学的物質または化学的物質は抗体であり得る。抗体は、抗ＣＤ４０であっても、または抗ＩＬ−６Ｒであってもよい。抗ＣＤ４０抗体は、抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体、抗ＣＤ４０ｍＡｂＡＳＫＰ１２４０（４Ｄ１１）（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅら、「ＡＳＫＰ１２４０，ａｆｕｌｌｙｈｕｍａｎａｎｔｉ−ＣＤ４０ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，ｐｒｏｌｏｎｇｓｐａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔａｌｌｏｇｒａｆｔｓｕｒｖｉｖａｌｉｎｎｏｎｈｕｍａｎｐｒｉｍａｔｅｓ」、ＡｍＪＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３巻（８号）：１９７６〜８８頁（２０１３年）に記載のとおり）、または抗ＣＤ４０ｍＡｂＣＦＺ５３３（Ｃｏｒｏｄｏｂａら、「ＡＮｏｖｅｌ，Ｂｌｏｃｋｉｎｇ，Ｆｃ−ＳｉｌｅｎｔＡｎｔｉ−ＣＤ４０ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｌｏｎｇｓＮｏｎｈｕｍａｎＰｒｉｍａｔｅＲｅｎａｌＡｌｌｏｇｒａｆｔＳｕｒｖｉｖａｌｉｎｔｈｅＡｂｓｅｎｃｅｏｆＢＣｅｌｌＤｅｐｌｅｔｉｏｎ」、ＡｍＪＴｒａｎｓｐｌａｎｔ、１５巻（１１号）：２８２５〜３６頁（２０１５年）に記載のとおり）であってもよい。

移植術（例えば、異種移植術）のためにレシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）を免疫寛容化するための本明細書に記載される方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に、ＥＣＤＩ処置細胞、Ｂ細胞枯渇化抗体、拮抗性の抗ＣＤ４０抗体、ｍＴＯＲ阻害剤、およびＴＮＦアルファ阻害剤、およびＩＬ−６阻害剤、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される２つまたはそれ超の生物学的物質または化学的物質を提供するステップを含み得る。レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）における移植術生存を延長するための本明細書の方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に、ＥＣＤＩ処置細胞、抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体、ｓＴＮＦＲ、抗ＩＬ−６Ｒ抗体、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される２つまたはそれ超の生物学的物質を投与するステップを含み得る。例えば、方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に、ＥＣＤＩ処置細胞を提供するステップを含み得、ここでＥＣＤＩ処置細胞は、本明細書で開示される。方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に、Ｂ細胞枯渇化抗体、例えば、リツキシマブを提供するステップを含み得る。方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に拮抗性の抗ＣＤ４０抗体、例えば、ヒト化２Ｃ１０を提供するステップを含み得る。方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）にｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンを提供するステップを含み得る。方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に、ＴＮＦアルファ阻害剤、例えば、ｓＴＮＦＲを提供するステップを含み得る。ｓＴＮＦＲはまた、トシリズマブまたはエタネルセプトであってもよい。方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に、ＩＬ−６阻害剤、例えば、抗ＩＬ−６Ｒ抗体を提供するステップを含み得る。いくつかの場合には、方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の非冗長エピトープを標的化する抗体（例えば、モノクローナル抗体）を提供するステップを含み得る。いくつかの場合には、方法は、Ｔ細胞活性化、Ｂ細胞活性化、樹状細胞活性化、またはそれらの任意の組合せを阻害する医薬品を投与するステップを含み得る。

本開示はまた、脾細胞；抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体；ｓＴＮＦＲ；および抗ＩＬ−６Ｒ抗体のうちの２つまたはそれ超を含むキットを提供し得る。例えば、キットは、脾細胞および抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体を備えてもよい。キットは、脾細胞およびｓＴＮＦＲを備えてもよい。キットは、脾細胞および抗ＩＬ−６Ｒ抗体を備えてもよい。キットは、抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体およびｓＴＮＦＲを備えてもよい。キットは、抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体および抗ＩＬ−６Ｒ抗体を備えてもよい。キットは、ｓＴＮＦＲおよび抗ＩＬ−６Ｒ抗体を備えてもよい。キットは、脾細胞、抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体およびｓＴＮＦＲを備えてもよい。キットは、脾細胞、抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体および抗ＩＬ−６Ｒ抗体を備えてもよい。キットは、脾細胞、ｓＴＮＦＲおよび抗ＩＬ−６Ｒ抗体を備えてもよい。キットは、抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体、ｓＴＮＦＲおよび抗ＩＬ−６Ｒ抗体を備えてもよい。キットは、脾細胞；抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体；ｓＴＮＦＲ；および抗ＩＬ−６Ｒ抗体を備えてもよい。キットは、さらにＥＣＤＩ固定用の試薬を備えてもよい。

本明細書の方法は、ＥＣＤＩ処置細胞、例えば、ＥＣＤＩ処置脾細胞を含んでもよい。いくつかの場合には、方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）にＥＣＤＩ処置脾細胞および抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体を提供するステップを含み得る。いくつかの場合には、方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）にＥＣＤＩ処置脾細胞およびｓＴＮＦＲを提供するステップを含み得る。いくつかの場合には、方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に、ＥＣＤＩ処置脾細胞および抗ＩＬ−６Ｒ抗体を提供するステップを含み得る。いくつかの場合には、方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体およびｓＴＮＦＲを提供するステップを含み得る。いくつかの場合には、方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に、抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体および抗ＩＬ−６Ｒ抗体を提供するステップを含み含み得る。いくつかの場合には、方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に、ＥＣＤＩ処置脾細胞、抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体、およびｓＴＮＦＲを提供するステップを含み得る。いくつかの場合には、方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に、ＥＣＤＩ処置脾細胞、抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体、および抗ＩＬ−６Ｒを提供するステップを含み得る。いくつかの場合には、方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に、ＥＣＤＩ処置脾細胞、ｓＴＮＦＲ、および抗ＩＬ−６Ｒ抗体を提供するステップを含み得る。いくつかの場合には、方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に、ＥＣＤＩ処置脾細胞、抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体、ｓＴＮＦＲ、および抗ＩＬ−６Ｒ抗体を提供するステップを含み得る。いくつかの場合には、方法は、レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に、ＥＣＤＩ処置脾細胞、および抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の非冗長エピトープを標的化する抗体（例えば、モノクローナル抗体）を提供するステップを含み得る。

ドナー（例えば、寛容化ワクチン中の移植グラフトおよび／または細胞のためのドナー）は哺乳動物であり得る。同種グラフトのドナーは、限定するものではないが、多能性幹細胞を含む未改変のヒト細胞、組織、および／または臓器であってもよい。異種グラフトのドナーは、哺乳動物のような、非ヒト動物由来の任意の細胞、組織、および／または臓器であってもよい。いくつかの場合には、哺乳動物は、ブタであってもよい。

本明細書の方法はさらに、疾患を有するレシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）を診断するステップを含み得る。例えば、疾患は、糖尿病であり、例としては限定するものではないが、１型、２型、妊娠性、外科的、嚢胞性線維症関連糖尿病、またはミトコンドリア糖尿病が挙げられる。いくつかの場合には、疾患は、遺伝性糖尿病であっても、またはある種の遺伝性糖尿病であってもよい。

本明細書の方法は、ドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植の前、後、および／または間にＥＣＤＩ処置細胞を投与して、レシピエントにおいてドナー特異的寛容を誘導するステップを含み得る。いくつかの場合には、ＥＣＤＩ処置細胞は、０日目のドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植に対して、−１００日目、−９０日目、−８０日目、−７０日目、−６０日目、−５０日目、−４０日目、−３０日目、−２０日目、−１５日目、−１４日目、−１３日目、−１２日目、−１１日目、−１０日目、−９日目、−８日目、−７日目、−６日目、−５日目、−４日目、−３日目、−２日目もしくは−１日目に、または約−１００日目、約−９０日目、約−８０日目、約−７０日目、約−６０日目、約−５０日目、約−４０日目、約−３０日目、約−２０日目、約−１５日目、約−１４日目、約−１３日目、約−１２日目、約−１１日目、約−１０日目、約−９日目、約−８日目、約−７日目、約−６日目、約−５日目、約−４日目、約−３日目、約−２日目もしくは約−１日目に投与され得る。いくつかの場合には、抗原カップリングされた細胞および／またはエピトープカップリングされた細胞は、０日目のドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植に対して−１００から−５０日目；−５０から−４０日目；−４０から−３０日目；−３０から−２０日目；−２０から−１０日目；−１０から−５日目；−７から−１日目に、または約−１００から−５０日目；約−５０から−４０日目；約−４０から−３０日目；約−３０から−２０日目；約−２０から−１０日目；約−１０から−５日目；約−７から−１日目に投与され得る。例えば、ＥＣＤＩ処置細胞は、ドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植の７日前（例えば、−７日目）に投与されてもよい。いくつかの場合には、ＥＣＤＩ処置細胞は、ドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植と同じ日（例えば、０日目）に投与されてもよい。いくつかの場合には、ＥＣＤＩ処置細胞は、０日目のドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植に対して、１００日目、９０日目、８０日目、７０日目、６０日目、５０日目、４０日目、３０日目、２０日目、１５日目、１４日目、１３日目、１２日目、１１日目、１０日目、９日目、８日目、７日目、６日目、５日目、４日目、３日目、２日目もしくは１日目に、または約１００日目、約９０日目、約８０日目、約７０日目、約６０日目、約５０日目、約４０日目、約３０日目、約２０日目、約１５日目、約１４日目、約１３日目、約１２日目、約１１日目、約１０日目、約９日目、約８日目、約７日目、約６日目、約５日目、約４日目、約３日目、約２日目もしくは約１日目に投与されてもよい。例えば、抗原カップリングされた細胞および／またはエピトープカップリングされた細胞は、０日目のドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植に対して、１００から５０日目；５０から４０日目；４０から３０日目；３０から２０日目；２０から１０日目；１０から５日目；７から１日目に、または約１００〜５０日目；約５０から４０日目；約４０から３０日目；約３０から２０日目；約２０から１０日目；約１０から５日目；約７から１日目に投与され得る。例えば、ＥＣＤＩ処置細胞は、ドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植の１日後（例えば、１日目）に投与されてもよい。

本明細書の方法は、レシピエントの体重１ｋｇあたり少なくともまたは少なくとも約０．２５×１０^９個のＥＣＤＩ処置細胞（例えば、ドナー脾細胞）を投与するステップを含み得る。例えば、レシピエントの体重１ｋｇあたり少なくともまたは少なくとも約１×１０^７、１×１０^８、０．２５×１０^９、０．５０×１０^９、０．７５×１０^９、１．００×１０^９、１．２５×１０^９、１．５０×１０^９、１．７５×１０^９または２×１０^９個のＥＣＤＩ処置細胞（例えば、ドナー脾細胞）、ＥＣＤＩ処置細胞を投与してもよい。ＥＣＤＩ処置細胞はまた、脾臓のＢ細胞であってもよい。本明細書の方法は、レシピエントの体重１ｋｇあたり１×１０^８からまたは約１×１０^８から２×１０^９、例えば、１×１０^８から２×１０^８、１×１０^８から３×１０^８、１×１０^８から４×１０^８、１×１０^８から５×１０^８、１×１０^８から１×１０^９個までのＥＣＤＩ処置細胞（例えば、ドナー脾細胞）を投与するステップを含み得る。

ドナー脾細胞は、新鮮に単離されてもよい。あるいは、ＥＣＤＩ処置細胞は、ｅｘ−ｖｉｖｏで拡大増殖され得る。いくつかの場合には、ドナー脾細胞は、少なくともまたは少なくとも約１０％、例えば、２５％のＣＤ２１陽性ＳＬＡクラスＩＩ陽性Ｂ細胞を含む。例えば、ドナー脾細胞は、少なくともまたは少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％または６０％のＣＤ２１陽性ＳＬＡクラスＩＩ陽性Ｂ細胞（例えば、少なくともまたは少なくとも約１０から２０；２０から３０；３０から４０；または４０から５０％）を含む。いくつかの場合には、脾臓のＢ細胞は、少なくともまたは少なくとも約６０％、例えば、９０％のＣＤ２１陽性ＳＬＡクラスＩＩ陽性Ｂ細胞を含む。例えば、脾臓のＢ細胞は、少なくともまたは少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のＣＤ２１陽性ＳＬＡクラスＩＩ陽性Ｂ細胞（例えば、少なくともまたは少なくとも約６０から７０；７０から８０；８０から９０；または９０から９５％）を含む。いくつかの場合には、ドナー脾細胞は、５０％からまたは約５０％から１００％、例えば、６０％からもしくは約６０％から１００％、または８０％からもしくは約８０％から１００％までのＣＤ２１陽性ＳＬＡクラスＩＩ陽性Ｂ細胞を含む。

ＥＣＤＩ処置細胞は、静脈内に与えられてもよい。ＥＣＤＩ処置細胞は、静脈内に注入される。いくつかの場合には、ＥＣＤＩ処置細胞は、レシピエントの体重１ｋｇあたり少なくともまたは少なくとも約１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、４０ｍｌまたは５０ｍｌ、例えば、少なくともまたは少なくとも約１から２；２から３；３から４；４から５；１から５；５から１０；１０から２０；２０から３０；３０から４０；または４０から５０の体積で静脈内に与えられてもよい。例えば、ＥＣＤＩ処置細胞は、レシピエントの体重１ｋｇあたり７ｍｌの体積で静脈内に与えられる。

本明細書の方法は、免疫寛容化レシピエント（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に１つまたは複数のドナー細胞を移植することによって疾患を処置することをさらに含み得る。

方法は、ＮＯＤ様受容体ファミリーＣＡＲＤドメイン含有５（ＮＬＲＣ５）、抗原プロセシング関連トランスポーター１（ＴＡＰ１）、ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨ、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）、またはクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）から選択される１つまたは複数の破壊された遺伝子を細胞（例えば、ＥＣＤＩ処置細胞）に提供するステップを含み得る。ＥＣＤＩ処置細胞は、同じドナー由来であってもよい。さらに、ＥＣＤＩ処置細胞は、さらに、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、またはそれらの任意の組合せから選択される１つまたは複数の導入遺伝子を含んでもよい。いくつかの場合には、ドナー細胞は、膵島細胞であってもよい。いくつかの場合には、１つまたは複数の破壊された遺伝子は、ＧＧＴＡ１を含まない。

拮抗性の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体２Ｃ１０は、他の免疫療法（ｓＴＮＦＲ、抗ＩＬ−６Ｒ、ｍＴＯＲ阻害剤、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を含むおよび含まない、ならびにＣＴＬＡ４−Ｉｇを含むおよび含まない）と組み合わせて、およびドナーアポトーシス性細胞の静脈内注入の有無と組み合わせて与えてもよい。この処置は、霊長類、例えば、サルにおいて、顕著かつ前例のない膵島同種グラフトおよびブタ膵島異種グラフトの生存を容易にし得る。例えば、最も顕著なのは、外因性のインスリンの中断、および移植後２１日目または約２１日目の全免疫抑制にかかわらず、移植されたサルにおける優れた血糖制御の維持である。例としては、少なくともまたは少なくとも約２００日間、４匹のサルのうち３匹での優れた膵島同種グラフト機能の維持（２匹はドナーのアポトーシス性細胞の投与なしで１匹はあり）、および少なくともまたは少なくとも約１００日間、１匹のサルのうち１匹での優れた膵島異種グラフト機能の維持（ドナーアポトーシス性細胞の投与あり）が挙げられる。

使用の他の方法は、ｉ）遺伝子改変されたグラフトの拒絶予防のための抗ＣＤ４０モノクローナル抗体２Ｃ１０または同様の抗体の一過性または低頻度の使用、ｉｉ）炎症を標的化する他の免疫療法（例えば、補体阻害剤およびサイトカインおよびケモカイン阻害剤、例えば、ＩＬ−８阻害剤レパラキシン）と組み合わせた移植術における、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体２Ｃ１０または同様の抗体の一過性または低頻度の使用、ならびに機能的なヒト膵島ベータ細胞などの幹細胞由来細胞性グラフトの予防のための抗ＣＤ４０モノクローナル抗体２Ｃ１０または同様の抗体の使用を含み得る。

本明細書の方法は、ドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植の前、後、および／または間にレシピエントに１つまたは複数の用量の抗ＣＤ４０抗体を投与してレシピエントにおいてドナー特異的な寛容を誘導するステップを含み得る。いくつかの場合には、第１の用量の抗ＣＤ４０抗体は、０日目のドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植に対して、−１００日目、−９０日目、−８０日目、−７０日目、−６０日目、−５０日目、−４０日目、−３０日目、−２０日目、−１５日目、−１４日目、−１３日目、−１２日目、−１１日目、−１０日目、−９日目、−８日目、−７日目、−６日目、−５日目、−４日目、−３日目、−２日目もしくは−１日目に、または約−１００日目、約−９０日目、約−８０日目、約−７０日目、約−６０日目、約−５０日目、約−４０日目、約−３０日目、約−２０日目、約−１５日目、約−１４日目、約−１３日目、約−１２日目、約−１１日目、約−１０日目、約−９日目、約−８日目、約−７日目、約−６日目、約−５日目、約−４日目、約−３日目、約−２日目もしくは約−１日目に与えられてもよい。いくつかの場合には、第１の用量の抗ＣＤ４０抗体を、０日目のドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植に対して、−１００から−５０日目；−５０から−４０日目；−４０から−３０日目；−３０から−２０日目；−２０から−１０日目；−１０から−５日目；−７から−１日目にまたは約−１００から−５０日目；約−５０から−４０日目；約−４０から−３０日目；約−３０から−２０日目；約−２０から−１０日目；約−１０から−５日目；約−７から−１日目に与えられてもよい。例えば、第１の用量の抗ＣＤ４０抗体は、ドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植の８日前（例えば、−８日目）に与えられてもよい。

異なる用量の抗ＣＤ４０抗体を、レシピエントに、ドナーの細胞、臓器、および／または組織の移植の前、後および／または間に与えて、レシピエントにおいてドナー特異的な寛容を誘導してもよい。いくつかの場合には、第１の用量の抗ＣＤ４０抗体は、レシピエントの体重１ｋｇあたり、少なくともまたは少なくとも約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇまたは２００ｍｇの抗ＣＤ４０抗体を含んでもよい。ある特定の場合には、第１の用量の抗ＣＤ４０抗体は、レシピエントの体重１ｋｇあたり少なくともまたは少なくとも約３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇの抗ＣＤ４０抗体を含んでもよい。いくつかの場合には、第１の用量の抗ＣＤ４０抗体は、レシピエントの体重１ｋｇあたり１ｍｇからもしくは約１ｍｇから２００ｍｇ、例えば、２０ｍｇからもしくは約２０ｍｇから１００ｍｇ；３０ｍｇからもしくは約３０ｍｇから８０ｍｇ；３０ｍｇからもしくは約３０ｍｇから７０ｍｇ；４０ｍｇからもしくは約４０ｍｇから７０ｍｇ；４０ｍｇからもしくは約４０ｍｇから６０ｍｇ；５０ｍｇからもしくは約５０ｍｇから７０ｍｇ；または６０ｍｇからもしくは約６０ｍｇから８０ｍｇまでの抗ＣＤ４０抗体を含んでもよい。

図６は、ブタ対カニクイザルの膵島異種移植術における移植拒絶予防についての例示的なプロトコールを実証する。０日目（移植術の日）に１ｋｇあたり２５，０００個の膵島等価物を移植されたカニクイザルについて、移植拒絶予防についてのプロトコールは、カニクイザルに対して、−７日目および１日目にＥＣＤＩ固定の、アポトーシス性ドナー脾細胞を投与すること、−８日目、−１日目、７日目、１４日目にα−ＣＤ４０（例えば、２Ｃ１０）５０ｍｇ／ｋｇを投与すること、−１０日目、−３日目、５日目、および１２日目にα−ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）２０ｍｇ／ｋｇを投与すること、ラパマイシン（標的トラフ１５〜２５ｎｇ／ｍＬ）を投与すること、ｓＴＮＦＲ（−７日目および０日目に１ｍｇ／ｋｇ、ならびに３日目、７日目、１０日目、１４日目、および２１日目に０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与すること、ならびに−７日目、０日目、７日目、１４日目および２１日目にα−ＩＬ−６Ｒ抗体を投与することを含み得る。

（実施例１：ブタでＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、ＮＬＲＣ５、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、および／またはＣ３遺伝子を破壊するためのガイドＲＮＡを発現するプラスミドの生成）
遺伝子改変されたブタは、レシピエントにおいて低い免疫拒絶を誘導するか、もしくは免疫拒絶を誘導しない移植グラフト、および／または細胞を、レシピエントにおける免疫寛容化を増強する寛容化ワクチンとして提供する。このようなブタは、遺伝子改変されていない対応する動物と比較して、ＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣＩ分子および／またはＭＨＣＩＩ分子）を調節する任意の遺伝子の発現が低減されている。このような遺伝子の発現の低減は、ＭＨＣ分子の発現および／または機能の低減を生じる。これらの遺伝子は、ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分、ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーター、ナチュラルキラー群２Ｄリガンド、ＣＸＣＲ３リガンド、Ｃ３、およびＣＩＩＴＡのうちの１つまたは複数である。さらに、またはあるいは、このようなブタは、ヒトでは発現されていない内因性遺伝子の低減されたタンパク質発現を含む（例えば、ＣＭＡＨ、ＧＧＴＡ１および／またはＢ４ＧＡＬＮＴ２）。例えば、このブタは、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＩＩＴＡ、ＣＭＡＨ、ＧＧＴＡ１および／またはＢ４ＧＡＬＮＴ２のうちの１つまたは複数の低減されたタンパク質発現を含む。いくつかの場合には、ブタは、ＮＬＲＣ５、Ｃ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＭＡＨ、ＧＧＴＡ１および／またはＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減されたタンパク質発現を含む。

この実施例は、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９システムを使用するブタにおける、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、ＮＬＲＣ５、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、および／またはＣ３遺伝子を破壊するためのプラスミドを生成するための例示的な方法を示す。このプラスミドは、Ｃａｓ９ＤＮＡエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを同時に発現した、ｐｘ３３０ベクターを使用して生成した。

ｐｘ３３０−Ｕ６−キメラ＿ＢＢ−ＣＢｈ−ｈＳｐＣａｓ９（＃４２２３０）プラスミドは、細菌の穿刺培養形式でＡｄｄｇｅｎｅから入手した。穿刺培養は、アンピシリンを含む事前に温めたＬＢアガープレート上にストリークして、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、単一のコロニーを選択して、アンピシリンを含む液体ＬＢ一晩培養物に接種した（ミニプレップに関して５ｍＬ、またはマキシプレップについて８０〜１００ｍＬ）。ミニプレップは、製造業者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎキットを使用して行った。プラスミドは、ヌクレアーゼを含まない水中で溶出して、ストックを−２０℃で保管した。ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、ＮＬＲＣ５、Ｃ３、およびＢ４ＧＡＬＮＴ２を標的化するために設計したオリゴヌクレオチドを表６に示す。オリゴヌクレオチドを、ＩＤＴによって合成した。図７Ａ〜図７Ｅ、図８Ａ〜図８Ｅ、図９Ａ〜図９Ｅ、図１０Ａ〜図１０Ｅ、および図１１Ａ〜図１１Ｅは、ＧＧＴＡ１（すなわち、ｐｘ３３０／Ｇａｌ２−１）（図７Ａ〜図７Ｅ）、ＣＭＡＨ（すなわち、ｐｘ３３０／ＣＭ１Ｆ）（図８Ａ〜図８Ｅ）、ＮＬＲＣ５（すなわち、ｐｘ３３０／ＮＬ１＿第１）（図９Ａ〜図９Ｅ）、Ｃ３（すなわち、ｐｘ３３０／Ｃ３−５）（図１０Ａ〜図１０Ｅ）、およびＢ４ＧＡＬＮＴ２（すなわち、ｐｘ３３０／Ｂ４１＿第２）（図１１Ａ〜図１１Ｅ）を標的化するプラスミドをクローニングするためのクローニングストラテジーを示す。構築されたｐｘ３３０プラスミドを、表７に示されるシークエンシングプライマーを使用してシークエンシングすることによって確認した。オリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼを含まない水を用いて１００μＭで再懸濁して、−２０℃の冷凍庫中に保管した。

ベクター消化：ｐｘ３３０ベクターを、５μｇのｐｘ３３０ストック、５μＬの１０×ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ、３５μＬのヌクレアーゼを含まない水、および５μＬのＦａｓｔＤｉｇｅｓｔＢｂｓＩ酵素（切断部位：ＧＡＡＧＡＣ）を含有する反応溶液中で消化した。その反応溶液は、３７℃で１５分間インキュベートし、６５℃で１５分間熱不活性化した。ベクターを脱リン酸化するために、０．２μＬ（２Ｕ；１Ｕ／１ｐｍｏｌのＤＮＡ末端）ＣＩＰを添加して、得られた混合物を、３７℃で６０分間インキュベートした。直線化したプラスミドを、ＱｉａｇｅｎＰＣＲＣｌｅａｎｕｐキットを使用して精製し、ヌクレアーゼを含まない水で溶出して、使用まで−２０℃で保管した。

オリゴヌクレオチドアニーリングおよびリン酸化：溶液は、１μＬの１００ｕＭのフォワードオリゴヌクレオチド、１μＬの１００ｕＭのリバースオリゴヌクレオチド、１μＬの１０×Ｔ４ＬｉｇａｓｅＢｕｆｆｅｒ、６μＬのヌクレアーゼを含まない水、１μＬのＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＫｉｎａｓｅ（ＰＮＫ）を混合することによって作製した。得られた溶液を、以下のプログラムで行うサーマルサイクラーでインキュベートした：３７℃で３０分間、９５℃で５分間、１秒あたり０．１℃で２５℃まで低下。

ライゲーション反応：溶液は、希釈されたアニーリングされたオリゴヌクレオチド（１：２５０）と、ヌクレアーゼを含まない水、２μＬの希釈されたアニーリングされたオリゴヌクレオチド、１００ｎｇの直線化され／脱リン酸化されたｐｘ３３０ベクター、５μＬの１０×Ｔ４ＬｉｇａｓｅＢｕｆｆｅｒ、ヌクレアーゼを含まない水（５０μＬの最終体積を得るため）、および２．５μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼを混合することによって作製した。その溶液を、室温で４時間インキュベートし、次いで、６５℃で１０分間熱不活性化した。

形質転換：ＴＯＰ１０Ｅ．ｃｏｌｉバイアルを、形質転換の前１５分間、氷上で−８０℃の冷凍庫から解凍させた。２μＬのライゲーション反応生成物を、細胞に添加し、チューブを穏やかに軽く叩くことによって混合した。そのチューブを、氷上で５分間インキュベートして、４２℃の水浴中で３０秒間熱ショックを与え、熱ショック後、さらに２分間氷上に戻した。５０μＬの形質転換された細胞をアンピシリンを含むＬＢアガープレート上にプレートして、ピペット先端部で広げた。そのプレートを、３７℃で一晩インキュベートした。

正確に挿入されたオリゴヌクレオチドについてのコロニーＰＣＲスクリーニング：３×コロニーを、プレートから選択して、プレートの底に１〜３と標識した。ＰＣＲ反応のためのマスター混合物は、１５μＬの１０×ＳｔａｎｄａｒｄＴａｑＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ、３μＬの１０ｍＭｄＮＴＰｍｉｘ、０．５μＬの１００ｕＭｐｘ３３０−Ｆ１プライマー（表７中の配列番号１２５）、０．５μＬの１００ｕＭｐｘ３３０−Ｒ１プライマー（表７中の配列番号１２６）、１３０μＬのヌクレアーゼを含まない水、および１μＬのＳｔａｎｄａｒｄＴａｑＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを混合することによって調製した。マスター混合物は、短時間ボルテックスし、次いで１〜３と標識した３×ＰＣＲのチューブに５０μＬを分注した。ピペット先端部を、アガープレート上のコロニー＃１に軽く塗って、次いでＰＣＲチューブ＃１中でピペットで吸引・排出した。各々のコロニーについての繰り返しを、各々のコロニーについて新しい先端部を使用してスクリーニングした。チューブをサーマルサイクラー中に入れて、以下のプログラムを行った：９５℃で５分間、９５℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、６８℃で３０秒間、サイクルステップ２〜４を３０サイクル、６８℃で５分間、使用まで４℃で保持。ＰＣＲクリーンアップは、ＱｉａｇｅｎＰＣＲＣｌｅａｎｕｐＫｉｔを使用し、かつ製造業者のプロトコールに従って行った。生成物を、ヌクレアーゼを含まない水中で溶出した。

シークエンシングのための試料調製：溶液は、１２０ｎｇのＰＣＲ生成物、６．４ｐｍｏｌのｐｘ３３０−Ｆ１プライマー（１μＬの６．４μＭストック）、および最終体積を１２μＬにする、ヌクレアーゼを含まない水を混合することによって作製された。配列データが得られた後、正確な配列挿入を特定した。正確な挿入を有するコロニーのグリセロールストックを調製した。＃１〜３としてコロニーＰＣＲの間に標識したＬＢアガープレート上で、正確に挿入されたコロニーを、ピペット先端部で軽く塗ること、および培地のチューブ中に押し出すことによってアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地中に接種した。液体培養物を、ＯＤが、１．０〜１．４の間に達するまで、増殖させた。５００μＬの細菌培養物を、冷凍保存バイアル中の５００μＬの無菌の５０％グリセロールに添加して、−８０℃の冷凍庫に移すまで直ちにドライアイス上に置いた。

（実施例２：ブタにおけるＲｏｓａ２６遺伝子座を標的化するガイドＲＮＡを発現するプラスミドの生成）
ＭＨＣ欠損のあるブタは、レシピエントにおいて低い免疫拒絶を誘導するか、または免疫拒絶を誘導しない移植グラフトを提供する。ＭＨＣ機能を阻害する外因性タンパク質を、ブタで発現させてＭＨＣ欠損を生じる。このプロジェクトにさらにそう本発明者らの別の目的は、１つまたは複数のタンパク質の遍在性の発現を指向する遍在性プロモーターの制御下に１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを挿入することである。この実施例によって、このような遍在性プロモーターＲｏｓａ２６の１つを標的化するガイドＲＮＡを発現するプラスミドの生成が示される。Ｒｏｓａ２６プロモーターは、Ｒｏｓａ２６遺伝子座での遺伝子の遍在性の発現を指向する。したがって、トランスジェニックブタは、Ｒｏｓａ２６遺伝子座で外因性タンパク質をコードする導入遺伝子を挿入することによって生成され、その結果、遺伝子生成物は、ブタの全ての細胞で発現される。Ｒｏｓａ２６を標的化するガイドＲＮＡを発現するプラスミドを使用して、Ｒｏｓａ２６遺伝子座への導入遺伝子の挿入を容易にする。この実施例は、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９システムを使用して、ブタでＲｏｓａ２６遺伝子座を標的化するためのプラスミドを生成するための例示的な方法を示す。このプラスミドは、Ｃａｓ９ＤＮＡエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを同時に発現するために使用された、ｐｘ３３０ベクターを使用して生成した。

Ｒｏｓａ２６のシークエンシング：

ブタにおけるＲｏｓａ２６遺伝子座を標的化するガイドＲＮＡを設計するために、ブタのＲｏｓａ２６をシークエンシングして、正確な配列情報を得た。

プライマー設計：プライマーを生成するために利用されるＲｏｓａ２６参照配列は、Ｋｏｎｇら、Ｒｏｓａ２６ＬｏｃｕｓＳｕｐｐｏｒｔｓＴｉｓｓｕｅ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｏｍｏｔｅｒＤｒｉｖｉｎｇＴｒａｎｓｇｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｉｎＰｉｇ．、ＰＬｏＳＯＮＥ、２０１４年；９巻（９号）：ｅ１０７９４５頁、Ｌｉら、Ｒｏｓａ２６−ｔａｒｇｅｔｅｄｓｗｉｎｅｍｏｄｅｌｓｆｏｒｓｔａｂｌｅｇｅｎｅｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＣｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄｌｉｎｅａｇｅｔｒａｃｉｎｇ．、ＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ、２０１４年；２４巻（４号）：５０１〜５０４頁、およびＬｉら、ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｌｏｎｉｎｇｏｆｔｈｅｐｏｒｃｉｎｅＲＯＳＡ２６ｐｒｏｍｏｔｅｒａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ．、ＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４年：２巻（１号）からとった。次いで、参照配列は、ブタゲノムデータベース（ＮＣＢＩ）を検索することによって、およびＥｎｓｅｍｂｌＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｓｅｒを使用することによって拡張した。ベースの配列を、４つの１２１８塩基対領域に分けて、プライマー設計を容易にした。プライマーは、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔＴｏｏｌを使用して設計し、次いで、ＳｔａｎｄａｒｄヌクレオチドＢＬＡＳＴを使用してＳｕｓｓｃｒｏｆａ参照ゲノム配列に対して検索して、特異性についてチェックした。プライマー長は、２００〜２５０塩基対に限定された。プライマーアニーリング温度は、１０００ｎＭのプライマー濃度に関してＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＴｍＣａｌｃｕｌａｔｏｒ、およびＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＫｉｔを使用して算出した。

ＰＣＲ：ＰＣＲは、ＳｔａｎｄａｒｄＴａｑＢｕｆｆｅｒ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）とともにＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用して行った。ＰＣＲに使用したＤＮＡ鋳型は、クローニングしたブタから単離した細胞から抽出した。ＰＣＲ条件は、以下の３０サイクルであった：９５℃、３０秒；５０℃、３０秒、５１℃３０秒、５２℃３０秒、５３℃３０秒、５４℃３０秒、５５℃３０秒；および６８°で３０秒間の伸長ステップ。ＰＣＲ生成物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。シークエンシングに使用するプライマーは、表８に列挙する。

シークエンシング解析：ＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェアを使用して、ＤＮＡ配列をアラインメントさせた。ＤＮＡ配列の結果は、ミネソタ大学バイオゲノミクスセンター（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｉｎｎｅｓｏｔａＢｉｏｇｅｎｏｍｉｃｓＣｅｎｔｅｒ）から受け取った後、ＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェアにアップロードして、解析のためにソフトウェアでアラインメントさせた。塩基対の置換、欠失および挿入は、クロマトグラムを参照することによって決定して、異なるプライマーを使用して増幅したＤＮＡ断片の配列を比較することによって確認した。全ての編集および確認を行った際、得られた新規のＤＮＡ親配列を、元の親のＤＮＡ配列をアラインメントさせた配列で置き換えることによって作製した（配列番号１８８、図１２に示されるマップ）。Ｒｏｓａ２６配列は、参照Ｒｏｓａ２６配列とは異なった。例えば、塩基対の置換は、２２３、４２０、３９２７、４０２９、および４０６６位に、そして塩基対の欠失は、２６９２〜２６９３位の間にあった。ヌクレオチド置換および欠失によって、この配列は固有のものになる（図１２）。したがって、このシークエンシングデータによって、Ｒｏｓａ２６遺伝子座を標的化するガイドＲＮＡを設計するためのさらに正確な配列情報が得られた。

Ｒｏｓａ２６を標的化するガイドＲＮＡを発現するプラスミドの生成
Ｒｏｓａ２６を標的化するオリゴヌクレオチドを設計してＩＤＴによって合成した。ガイドＲＮＡの配列を表９に示す。Ｒｏｓａ２６を標的化するガイドＲＮＡを発現するｐｘ３３０プラスミドを、実施例１に記載の方法を使用して生成した。図１３Ａ〜図１３Ｅは、Ｒｏｓａ２６を標的化するプラスミド（すなわち、ｐｘ３３０／ＲＯＳＡエクソン１）をクローニングするためのクローニングストラテジーを示す（図１３Ａ〜図１３Ｅ）。この構築されたｐｘ３３０プラスミドを、表７に示すシークエンシングプライマーを使用するシークエンシングによって確証した。

（実施例３：ブタ細胞中のＲｏｓａ２６遺伝子座におけるＨＬＡ−Ｇ１導入遺伝子の挿入）
導入遺伝子は、ブタが全ての細胞中で導入遺伝子を発現するようにブタのＲｏｓａ２６遺伝子座に挿入する。この実施例は、ブタ細胞（例えば、ブタ胎仔線維芽細胞）におけるＲｏｓａ２６遺伝子座へＨＬＡ−Ｇ１のｃＤＮＡを挿入するための例示的な方法を示す。得られた細胞を使用して、ブタでＨＬＡ−Ｇ１の遍在性の発現を指向する、Ｒｏｓａ２６プロモーターによって制御されるＨＬＡ−Ｇ１を発現するブタを生成する。

ＧＧＴＡ１またはＲｏｓａ２６に特異的な１０００ｂｐの相同性アームを有するＨＬＡ−Ｇ１遺伝子構築物を作製して、ＰＣＲおよびシークエンシングによって確認する。ＨＬＡ−Ｇ１のｃＤＮＡ配列を表２に示し、ＨＬＡ−Ｇのゲノム配列を配列番号１９１に示す。ＨＬＡ−Ｇのゲノム配列およびｃＤＮＡのマップを、図１４Ａ〜図１４Ｂに示す。細胞中のＧＧＴＡ１およびＲｏｓａ２６の隣接領域をシークエンシングする。構築物によるＨＬＡ−Ｇ１の発現を確証する。シークエンシングおよび発現の確証の後、遺伝子標的化構築物を、導入遺伝子とアセンブルして、体性ブタ細胞を改変するために使用される相同性ドメイン修復鋳型を作製する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を使用して、ＧＧＴＡ１またはＲｏｓａ２６を、プラスミド発現のガイドＲＮＡオリゴを用いて標的化して、効率的な遺伝子標的化および改変を可能にする。ガイドＲＮＡによって作製される二本鎖ＤＮＡの切断を、導入遺伝子を組み込むＤＮＡ修復を誘導する１０００ｂｐの相同性アームを有するＨＬＡ−Ｇ１遺伝子構築物の存在において作製する。決定されたオープンリーディングフレーム全体にわたる（イントロン領域を除く）プロモーター配列の５０ｂｐ内の挿入部位を、ＰＡＭ配列およびプロモーター強度の存在に基づいて試験して、追加のＣａｓ９発現性プラスミドの存在下で導入遺伝子発現を駆動する。トランスジェニックおよびノックアウトの表現型は、フローサイトメトリー（例えば、サイトゾルおよび膜表面での導入遺伝子発現の検出）、ウエスタンブロッティング、およびＤＮＡ／ＲＮＡシークエンシングによって評価する。

（実施例４：２つのガイドＲＮＡを同時に発現するプラスミドの生成）
２つのガイドＲＮＡを同時に発現する代替的ベクター（例えば、ｐｘ３３３）はまた、単一遺伝子の２つの領域を標的化するガイドＲＮＡを発現するためにも使用する。ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９システムによって単一遺伝子の２つの領域を標的化することで、ＤＮＡが一緒に修復されるときに２つの切断部位の間の全体的な遺伝子の除去が生じる。２つの領域を標的化することは、２対立遺伝子ノックアウトを生じる機会を増大し、結果として、遺伝子中の１つの遺伝子座のみを標的化することに比べて、陰性の遺伝子型を有するブタを生成するのに優れたソート、より多くの２対立遺伝子欠失および全体的な機会の高さが生じる。

ｐｘ３３３プラスミド構築で使用されるオリゴヌクレオチド対は、ｐｘ３３０プラスミドに使用されるオリゴヌクレオチドと比較して、高いＧ含量、低いＡ含量、および可能な限り多くのＧＧＧＧの四つ組を含有する。ＧＧＴＡ１標的は、ほぼＧＧＴＡ１遺伝子全体にまたがり、これがこのゲノムから全体的な遺伝子を除去する。さらに、このストラテジーを用いて複数の部位を標的化することは、このプロジェクトにさらにそった本発明者らの別の目標である、導入遺伝子挿入の際に使用される。

（実施例５：遺伝子改変されたブタを作製するためのブタ胎仔線維芽細胞の単離、培養およびトランスフェクション）
ある遺伝子を標的化するガイドＲＮＡを発現するｐｘ３３０プラスミドを使用して遺伝子改変されたブタを生成するために、ｐｘ３３０プラスミドを、ブタ胎仔線維芽細胞にトランスフェクトした。このトランスフェクトされた線維芽細胞は、１つまたは複数の標的遺伝子の破壊を生じるガイドＲＮＡを発現する。得られた線維芽細胞を、例えば、体細胞核移入によって、遺伝子改変されたブタを作製するために使用した。この実施例によって、ブタ胎仔線維芽細胞の単離および培養、ならびにｐｘ３３０プラスミドでの線維芽細胞のトランスフェクションが示される。

細胞培養

遺伝子改変されたブタの生成に使用した胎仔線維芽細胞株としては以下が挙げられた：ＫａｒｏｌｉｎｅＦｅｔａｌ（膵島単離の後に高い膵島収量を示した雌性ブタドナーＰ１１０１由来）、ＭａｒｉｅＬｏｕｉｓｅＦｅｔａｌ（膵島単離の後に高い膵島収量を示した雌性ブタドナーＰ１１０２由来）、Ｓｌａｕｇｈｔｅｒｈｏｕｓｅブタ＃４１（雄性；天然の膵臓において多数の膵島を示した（極めて高いジチゾン（ＤＴＺ）スコアで評価されたとおり））、Ｓｌａｕｇｈｔｅｒｈｏｕｓｅブタ＃５３（高いジチゾン（ＤＴＺ）スコアで評価されたとおり天然の膵臓において多数の膵島を示した）。

これらのブタの各々からとった筋肉および皮膚の組織試料を、切開して培養して、線維芽細胞を増殖させた。次いで、この細胞を回収して、体細胞核移入（ＳＣＮＴ）に使用し、クローンを生成した。複数の胎仔（最大８）を３０日目に回収した。胎仔を、別々に解剖して、１５０ｍｍのディッシュにプレートして、胎仔線維芽細胞を成長させた。培養を通して、胎仔細胞株を、別々に保持し、各々のチューブまたは培養容器上に胎仔番号を標識した。コンフルエントになったとき、細胞を回収して、液体窒素凍結貯蔵のために１０％のＤＭＳＯを含むＦＢＳ中で１ｍＬあたり約百万個の細胞に凍結して戻した。

培養培地調製物：５ｍＬのＧｌｕｔａｍａｘ、５ｍＬのｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、および２５ｍＬのＨＩ−ＦＢＳ（標準の５％ＦＢＳ培地について；貯蔵細胞について１０％ＦＢＳを使用する）を、ＤＭＥＭ、高グルコース、グルタミンなし、フェノールレッドなしの５００ｍＬのボトルに添加した。全ての胎仔線維芽細胞をスピンダウンするための遠心分離機設定は、４℃で０．４ｒｃｆ（１６００ｒｐｍ）で５分であった。細胞を、水浴中で３７℃まで急速に温めることによって液体窒素貯蔵から解凍させた。解凍した細胞を、（十分にＤＭＳＯを希釈するのに十分な）約２５ｍＬの新鮮な、予め温めた培養培地に迅速に移した。次いで、細胞をスピンダウンして、上清を取り出し、細胞を、カウントまたはプレートのために１〜５ｍＬの新鮮な培養培地に再懸濁した。細胞は、予め温めた培地で３〜４日ごとに培地交換して、ＴｒｙｐＬＥＥｘｐｒｅｓｓＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔを使用して９０〜１００％コンフルエントのとき継代した。

接着性の線維芽細胞の回収：培地を細胞から吸引した。ＤＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。予め温めた（３７℃）ＴｒｙｐＬＥＥｘｐｒｅｓｓ試薬を細胞に添加した。最小量の試薬を使用して、細胞層を薄く覆った。細胞を、３７℃で１０分間インキュベートした。ＦＢＳを含有するある体積の培養培地を、ＴｒｙｐＬＥ細胞懸濁物に添加して、酵素を中和した。細胞懸濁物をピペットで吸引・排出して、培養表面から全ての細胞を取り外した。その細胞懸濁物を、氷上の１５または５０ｍＬの円錐管に移した。そのプレート／フラスコを、顕微鏡下でチェックして、全ての細胞を収集したことを確実にした。時に、培地洗浄で、後に残った細胞の収集を助けた。細胞をスピンダウンし、次いで新鮮な培養培地で再懸濁した（カウントのために１〜５ｍＬの間）。カウントする場合、１：５希釈の細胞懸濁物を、２０μＬの細胞懸濁物を８０μＬの０．２％のＴｒｙｐａｎＢｌｕｅに添加することによって調製した。懸濁物は、ピペットで吸引・排出することによってよく混合した。１２〜１４μＬの希釈物を、血球計数器に添加して、４コーナーをカウントした。数を平均した。例えば、各々のコーナーについて２０、２４、２２、２２のカウントで、平均２２を得た。この数に希釈係数５を掛けて、１１０×１０^４細胞／ｍＬを得た。その数を、小数位を２つ左に動かすことによって１０^６に補正した（１．１０×１０^６細胞／ｍＬ）。最終的に、その数に、細胞の総数を得るためにどれくらい多くのｍＬ数のもとの試料をとったかを掛けた。

胎仔線維芽細胞のトランスフェクション
この実験は、胎仔線維芽細胞をトランスフェクトすることであった。このトランスフェクトされた胎仔線維芽細胞を使用して、体細胞核移入技術を使用して、遺伝子改変された動物を生成した。

トランスフェクションに使用したＧＦＰプラスミド（ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰ）は、それがＧＦＰ発現領域を含有したこと以外は、ｐｘ３３０プラスミドの正確なコピーであった。

ＧＦＰトランスフェクトの対照細胞：トランスフェクションは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍを使用して行った。キットは、１０μＬおよび１００μＬの先端部サイズで供給された。実験前日または２日前に、細胞を、実験のサイズ、ならびに所望の細胞数および密度次第で適切な培養容器中にプレートした。トランスフェクションの日に約８０％のコンフルエンスを達成した。

実験の日に、Ｎｅｏｎモジュールおよびピペットスタンドをバイオフードにセットした。Ｎｅｏｎ管を、ピペットスタンドに置いて、３ｍＬの緩衝液Ｅ（ＮｅｏｎＫｉｔ）をＮｅｏｎ管に添加した。そのモジュールを、オンにして、所望の設定まで調節した（胎仔ブタ線維芽細胞について：１３００Ｖ、３０ｍｓ、１パルス）。細胞を、ＴｒｙｐＬＥを使用して回収して、カウントして実験の設定を決定した。必要量の細胞を、新しいチューブに移し、残りの細胞を再度プレートした。細胞を、カウント後にスピンダウンして、ＰＢＳ中で再懸濁して洗浄した。細胞をスピンダウンして、細胞の数および先端部のサイズについて表１０に応じて緩衝液Ｒ（ＮｅｏｎＫｉｔ）中に再懸濁した。

表１０によるＤＮＡの適切な量を、細胞懸濁物に添加して、ピペットで吸引・排出することによって混合した。Ｎｅｏｎ先端部を、このキットからＮｅｏｎピペットに適用して、細胞懸濁物の体積をＮｅｏｎ先端部中に吸引した。そのピペットを、Ｎｅｏｎ先端部が緩衝液Ｅに浸漬されるように、ピペットスタンド中のＮｅｏｎ管に入れた。ＳＴＡＲＴを、「完了」メッセージが出現するまでモジュールインターフェース上で押圧した。そのピペットを、ピペットスタンドから取り出して、細胞懸濁物を、表１０による適切なサイズのウェル中に抗生物質なしで、予め温めた、ある体積の培養培地中に排出した。

上記のステップを、細胞懸濁物全体を使用するまで繰り返した。Ｎｅｏｎ先端部を、２回のトランスフェクションごとに交換し、Ｎｅｏｎ管は１０回のトランスフェクションごとに交換した。細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、次いで培地を、抗生物質を含有する通常の培養培地と交換した。得られた細胞を約５日間培養して、Ｃａｓ９切断のために、遺伝子ノックアウト後の表面タンパク質の完全なリサイクル、およびソーティングの前の適切な細胞分裂を可能にした。ＧＦＰプラスミドをトランスフェクトされた細胞を、図１５に示した。

（実施例６：ＲＮＡポリメラーゼを使用するｐｘ３３０プラスミドによるガイドＲＮＡ生成の確証）
ｐｘ３３０プラスミドがブタ胎仔線維芽細胞にトランスフェクトされた後、ｐｘ３３０プラスミドによるガイドＲＮＡの発現は、ＲＮＡポリメラーゼを使用して確証される。

ｐｘ３３０プラスミドによるガイドＲＮＡ生成は、ＲＮＡポリメラーゼによって正確に構築されたプラスミドのｉｎｖｉｔｒｏ転写によって確証される。この実験は、標的領域のＰＣＲを通じて導入されたプロモーターとＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるｓｇＲＮＡの生成によって、プラスミドが転写されて、ｓｇＲＮＡが細胞に存在することが示される。反応生成物（例えば、ｓｇＲＮＡ）のサイズのＧｅｌ確証を使用して、ＲＮＡポリメラーゼによりｓｇＲＮＡ転写物を確認する。

（実施例７：ＧＧＴＡ１遺伝子に対する蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））
ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９による遺伝子破壊は、細胞中のＦＩＳＨを使用して確証された。この実施例は、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用してＧＧＴＡ１遺伝子を検出するための例示的な方法を示す。この方法を使用して、動物由来の細胞におけるＧＧＴＡ１遺伝子の有無を確証した（例えば、ＧＧＴＡ１ノックアウトを含む動物）。

ＦＩＳＨプローブの調製：ＧＧＴＡ１のＤＮＡを、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＰｕｒｅＬｉｎｋキットを使用して、ＲＰ−４４ブタＢＡＣクローン（ＲＰ４４−３２４Ｂ２１）から抽出した。ＤＮＡは、ニック翻訳反応（ＮｉｃｋＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎＫｉｔ−ＡｂｂｏｔｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ）によって、Ｏｒａｎｇｅ−５５２ｄＵＴＰ（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）を使用して標識した。ニック翻訳された断片のサイズを、電気泳動によって、１％のＴＢＥゲル上でチェックした。標識されたＤＮＡを、ＣＯＴ−１ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、酢酸ナトリウムおよび９５％エタノール中に沈殿させ、次いで乾燥させて、５０％のホルムアミドハイブリダイゼーション緩衝液中に再懸濁した。

ＦＩＳＨプローブのハイブリダイゼーション：ブタ線維芽細胞（１５ＡＳ２７）由来のプローブ／ハイブリダイゼーション緩衝液混合物および細胞遺伝学的スライドを変性させた。プローブをスライドに加えて、加湿チャンバ内で、３７℃で２４時間スライドをハイブリダイズした。使用したプローブを配列番号１９２に示す。

ＦＩＳＨ検出、可視化および画像取り込み：ハイブリダイゼーション後、ＦＩＳＨスライドを、２×ＳＳＣ溶液中で、７２℃で１５秒間洗浄して、ＤＡＰＩ染色で対比染色した。蛍光シグナルを、ＤＡＰＩおよびＦＩＴＣフィルターセットを備えるＯｌｙｍｐｕｓＢＸ６１顕微鏡ワークステーション（ＡｐｐｌｉｅｄＳｐｅｃｔｒａｌＩｍａｇｉｎｇ、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）で可視化した。ＦＩＳＨ画像は、干渉計ベースのＣＣＤ冷却カメラ（ＡＳＩ）およびＦＩＳＨＶｉｅｗＡＳＩソフトウェアを使用して取り込んだ。ＦＩＳＨ画像を図１６に示す。

（実施例８：Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ媒介性ＧＧＴＡ１ノックアウトを有する細胞の表現型選択）
Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡシステムによるＧＧＴＡ１遺伝子の破壊を、ＧＧＴＡ１遺伝子生成物を標識することによって確証した。ＧＧＴＡ１ノックアウトは、ノックアウト実験で表現型ソーティングについてのマーカーとして使用する。ＧＧＴＡ１遺伝子は、ブタ細胞の表面上で見出される糖タンパク質をコードし、ノックアウトされた場合、その糖タンパク質が細胞表面上に存在しないことをもたらした。ＧＧＴＡ１陰性細胞についてソーティングするために使用されるレクチンは、イソレクチンＧＳ−ＩＢ_４ビオチン−ＸＸコンジュゲートであって、これは、ＧＧＴＡ１遺伝子によって生じる糖タンパク質のような、末端アルファ−Ｄ−ガラクトシル残基に選択的に結合した。

ブタ胎仔線維芽細胞に、ＧＧＴＡ１を標的化するガイドＲＮＡを発現するｐｘ３３０プラスミド（実施例１で生成された）をトランスフェクトした。

トランスフェクション後、陰性の細胞について選択するために、細胞を約５日間成長させて、それらの表面タンパク質をリサイクルした。次いで、細胞を回収して、ＩＢ_４レクチンで標識した。次いで、細胞を、細胞表面上のビオチンコンジュゲートされたレクチンと極めて緊密に結合したストレプトアビジンテールを有した２．８ミクロンの超磁性ビーズであった、ＤｙｎａＢｅａｄｓＢｉｏｔｉｎ−Ｂｉｎｄｅｒでコーティングした。磁石中においた場合、表面にレクチン／ビーズが結合した「陽性」細胞は、チューブの側面に付着したが、「陰性」細胞は、いかなるビーズにも結合せず、容易な分離のために懸濁物中で浮遊したままであった。

具体的には、細胞は、ＴｒｙｐＬＥプロトコールを使用してプレートから回収して、単一のチューブに収集した。細胞をスピンダウンして、１ｍＬのソーティング培地（ＤＭＥＭ、補充なし）中に再懸濁してカウントした。細胞が一千万個未満である場合、細胞をスピンダウンして、上清を廃棄した。別々のチューブでは、ＩＢ_４レクチン（１μｇ／μＬ）を、５μＬ〜１ｍＬのソーティング培地で希釈した（最終濃度５μｇ／ｍＬ）。細胞ペレットを、１ｍＬの希釈レクチンで再懸濁した。細胞懸濁物を、約１５〜２０分間、数分ごとに穏やかに振盪しながら、氷上でインキュベートした。

ビオチンビーズを、インキュベーションの間に調製した。ビーズのボトルを、３０秒間ボルテックスした。１Ｍの細胞あたり、２０μＬのビーズを、１５ｍＬの円錐管中で５ｍＬのソーティング培地に添加した。チューブをボルテックスして、ＤｙｎａＭａｇ−１５磁石中に入れて、３分間静置させた。培地を取り出した。１ｍＬの新鮮なソーティング培地を添加して、そのチューブをボルテックスして、ビーズを洗浄した。その洗浄したビーズは使用するまで氷上に置いた。

細胞インキュベーション後、細胞懸濁物体積を、ソーティング培地を用いて１５ｍＬにして、レクチンを希釈した。細胞をスピンして、１ｍＬの洗浄したビオチンビーズで再懸濁した。懸濁物を、振盪インキュベーター中で、１２５ｒｐｍで３０分間、氷上でインキュベートした。細胞懸濁物を、振盪インキュベーターから取り出して、検査した。小さい凝集物が観察され得る。

５ｍＬのソーティング培地を、細胞懸濁物に添加し、そのチューブを、ＤｙｎａＭａｇ−１５中に３分間入れた。「陰性」細胞の第１の画分を収集して、新しい１５ｍＬの円錐管に移した。さらに５ｍＬのソーティング培地を添加して、依然として磁石上にあった「陽性」チューブを洗浄した。磁石を数回反転して、細胞懸濁物を再度混合した。そのチューブを３分間静置して、細胞を分離した。次いで、第２の「陰性」画分を取り出して、第１の画分と組み合わせた。１０ｍＬのソーティング培地を「陽性」チューブに添加した。そのチューブを、磁石から取り出して、すぐ使えるまで氷浴中に入れた。

「陰性」画分のチューブを、磁石上に置いて、二次的な分離を得て、第１のチューブから超えていた場合がある、あらゆるビーズ結合した細胞を除去した。チューブを磁石上に３分間保持した。細胞を、磁石からピペッティングして除き、新しい１５ｍＬの円錐管に移した。元の「陽性」チューブおよび二重ソーティングした「陰性」チューブを、バランスをとって、それらのチューブ中の細胞をスピンダウンした。「陽性」ペレットは、濃い錆びた赤色に見えた。「陰性」ペレットは、可視ではないか、白く見えた。

各々のペレットを、１ｍＬの新鮮な培養培地（１０％ＦＢＳ）中で再懸濁して、２４ウェルプレート上の別々のウェル中にプレートした。そのウェルを顕微鏡下で検査して、必要な場合、より多くのウェルに希釈した。細胞を、３７℃で培養した。遺伝子改変された細胞、すなわち、未標識の細胞を、磁石で陰性選択した（図１７Ａ）。遺伝子改変されていない細胞、すなわち、標識された細胞は、細胞表面上に第一鉄のビーズが蓄積していた（図１７Ｂ）。

（実施例９：ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／ＮＬＲＣ５三重ノックアウトブタの作製）
この実施例は、三重ノックアウトブタを生成するための例示的な方法を示す。三重ノックアウトブタは、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＩＩＴＡ、ＣＭＡＨ、ＧＧＴＡ１および／またはＢ４ＧＡＬＮＴ２のうちの３つのタンパク質発現が低減され得る。このような三重ノックアウトブタの１つは、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９システムを使用するＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／ＮＬＲＣ５三重ノックアウトブタであった。このブタは、移植術用の膵島を提供した。ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／ＮＬＲＣ５が破壊されたブタの膵島は、ＭＨＣクラスＩ欠損を有し、レシピエントに移植された場合、免疫拒絶の誘導が低いかまたは全くない。

胎仔線維芽細胞のトランスフェクション
実施例１で生成したＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、およびＮＬＲＣ５を標的化するガイドＲＮＡを発現するｐｘ３３０プラスミドを、ブタ胎仔線維芽細胞中でトランスフェクトした。ブタ胎仔線維芽細胞を、５〜１０％の血清、グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。線維芽細胞に、製造業者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００システム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して、Ｃａｓ９およびＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨまたはＮＬＲＣ５遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡを発現する２つまたは３つのプラスミドを同時トランスフェクトした。

ＧＧＴＡ１ＫＯ細胞の対抗選択
トランスフェクションの４日後、トランスフェクトされた細胞を回収して、イソレクチンＢ４（ＩＢ４）−ビオチンで標識した。αＧａｌを発現する細胞を、ビオチンコンジュゲートされたＩＢ４で標識して、ストレプトアビジンコーティングしたＤｙｎａｂｅａｄｓ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって、磁場の中で枯渇させた。αＧａｌ欠損細胞を、上清から選択した。細胞を顕微鏡によって検査した。ソーティング後に結合したビーズを含有しないかまたはほとんど含有しない細胞を、陰性の細胞として特定した。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＮＬＲＣ５遺伝子のＤＮＡシークエンシング解析
ＩＢ４対抗選択した細胞およびクローニングしたブタ胎仔由来のゲノムＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎＤＮｅａｓｙＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔを使用して抽出した。ＰＣＲは、表１１に示されるような、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびＮＬＲＣ５特異的プライマー対を用いて行った。ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰａｃｋ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＧＧＴＡ１のＰＣＲ条件は、それらのプライマーについて理想的なアニーリング温度および融解温度に基づいた。ＰＣＲ生成物は、１％アガロースゲル上で分離し、ＱｉａｇｅｎＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔによって精製し、表７に示されるような特定のシークエンシングプライマーを用いるサンガー方法（ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｉｎｎｅｓｏｔａ）によってシークエンシングした。図１８Ａ〜図１８Ｃは、ＰＣＲ生成物の配列およびアガロースゲル画像を示す。

体細胞核移入（ＳＣＮＴ）
ＳＣＮＴは、その全体が参照によって本明細書に援用される、Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈら、ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、９１巻（３号）：７８、１〜１３頁、（２０１４年）に記載のとおり行った。ＳＣＮＴは、ｉｎｖｉｔｒｏで成熟した卵母細胞を使用して行った（ＤｅＳｏｔｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．、Ｓｔ．Ｓｅｙｍｏｕｒ、ＴＮ）。卵丘細胞は、０．１％ヒアルロニダーゼ中でピペッティングすることによって、卵母細胞から取り除いた。正常な形態学および可視の極体を有する卵母細胞のみをＳＣＮＴのために選択した。卵母細胞を、５μｇ／ｍＬのビスベンズイミドおよび７．５μｇ／ｍＬのサイトカラシンＢを含有する操作培地（Ｃａを含まないＮＣＳＵ−２３、５％ＦＢＳを含む）中で１５分間インキュベートした。卵母細胞を、第一極体および第二分裂中期板を除去することによって除核した。単一の細胞を、各々の除核された卵母細胞中に注入して、融合して、５０μｓｅｃの間、１８０Ｖの２つのＤＣパルス（ＢＴＸ細胞エレクトロポレーター、ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）によって、２８０ｍＭのマンニトール、０．１ｍＭのＣａＣｌ_２、および０．０５ｍＭのＭｇＣｌ_２中で同時に活性化した。活性化された胚は、０．４％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＮＣＳＵ−２３培地中に戻して、３８．５℃、５％ＣＯ_２で、１時間未満加湿雰囲気中で培養し、代理ブタに移入した。

（実施例１０：ＩＣＰ４７導入遺伝子を発現するＮＬＲＣ５ノックアウト非ヒト動物の作製）
この実施例は、１つまたは複数の内因性遺伝子の発現が低減されており、その一方で１つまたは複数の導入遺伝子を発現する、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、ブタ）を生成するための例示的な方法を示す。このような遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、ブタ）を生成することは、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＩＩＴＡ、ＣＭＡＨ、ＧＧＴＡ１および／またはＢ４ＧＡＬＮＴ２のうちの１つまたは複数の発現が低減されており、その一方で、１つまたは複数のＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６、またはＨＬＡ−Ｇ７）、Ｌ２、Ｓｐｉ９、ガレクチン−９ＣＤ４７、Ｂ２Ｍ、ＰＤ−Ｌ１、および／またはＰＤ−Ｌ２を発現する。このような動物の１つは、ＮＬＲＣ５遺伝子を破壊されており、その一方で、ＩＣＰ４７をコードする導入遺伝子を過剰発現する。ＮＬＲＣ５破壊およびＩＣＰ４７発現は、ＭＨＣ−１のアセンブリおよび機能を抑制する。したがって、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、ブタ）由来の細胞、組織、および／または臓器は、レシピエントに移植された場合、免疫拒絶の誘導が低いかまたは全くない。

Ｒｏｓａ２６プロモーターのクローニング
Ｒｏｓａ２６プロモーター配列は、マウスＲｏｓａ２６プロモーター配列およびヒトＲｏｓａ２６プロモーター配列を参照として使用して、ゲノムデータベース（ＮＣＢＩ）を検索することによって得る。Ｒｏｓａ２６の非ヒト動物のバージョンを得る。プライマーを設計して、鋳型として非ヒト動物の（例えば、家畜用のブタの）ゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲによって潜在的なＲｏｓａ２６プロモーター（例えば、ブタＲｏｓａ２６プロモーター）を保有するＤＮＡ断片を増幅する。ＡｓｃＩおよびＭｌｕＩ部位を、それぞれ、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの５’に追加する。ＰｗｏＳｕｐｅｒＹｉｅｌｄＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、ＰＣＲ条件は以下のとおりである：９４℃、２分；９４℃、１５秒、５５℃、３０秒；７２℃４分、１５サイクル；９４℃、１５秒、５５℃、３０秒；７２℃４分および５秒を、２５サイクルに関して各サイクルに追加；ならびに最終の伸長ステップは７２℃で８分間。ＰＣＲ生成物を、引き続いて、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にクローニングして、ｐＣＲ−ＸＬ−Ｒｏｓａ２６を生成する。非ヒト動物のＲｏｓａプロモーター（例えば、ブタＲｏｓａ２６プロモーター）を、設計されたプライマーを使用してシークエンシングする。

トランスジェニックベクターの構築
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）のＣＭＶプロモーターおよびマルチクローニング部位（ＭＣＳ）は、リンカーＡｓｅＩ−ＮｒｕＩ−ＡｓｃＩ−ＳａｌＩ−ＭｌｕＩ−ＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩによって置き換える。潜在的な非ヒト動物（例えば、ブタ）のＲｏｓａ２６プロモーターを含有する３．９ｋｂの断片は、ＡｓｃＩおよびＭｌｕＩ消化によってｐＣＲ−ＸＬ−Ｒｏｓａ２６から切り出して、ＡｓｃＩ部位とＭｌｕＩ部位との間でプロモーターのないｐＥＧＦＰ−Ｎ１に挿入して、プラスミドｐＲｏｓａ２６−ＥＧＦＰを生じる。ヒトＩＣＰ４７のｃＤＮＡをクローニングして、プラスミド中のＥＧＦＰを置き換える。対照のベクターは、ＥｃｏＲＩ部位でのマウスのＭＨＣクラスＩＨ−２Ｋ^ｂプロモーターの下流へＩＣＰ４７のｃＤＮＡのクローニングによって構築して、プラスミドｐＨ−２Ｋ^ｂ−ＩＣＰ４７を得る。

一過性のトランスフェクション
実施例１または実施例２の方法で作製したＮＬＲＣ５ノックアウト非ヒト動物（例えば、ブタ）由来のＮＬＲＣ５ＫＯ胎仔線維芽細胞を得る。Ｒｏｓａ２６、Ｈ−２Ｋ^ｂ、およびＣＭＶの間のプロモーター強度を比較するために、胎仔線維芽細胞に、製造業者の指示に従って、Ｎｅｏｎ（商標）ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用することによって、ｐＲｏｓａ２６−ＩＣＰ４７、ｐＨ−２Ｋ^ｂ−ＩＣＰ４７およびｐＥＧＦＰ−Ｎ１をトランスフェクトする。３×１０^５個の細胞を、それぞれ、１．５μｇの各々のＤＮＡと混合して、１３００Ｖ、３０ｍｓ、１パルスでエレクトロポレーションする。次いで、細胞を、３７℃で、５％のＣＯ_２および１０％のＯ_２と培養する。４８時間後、細胞を回収して、ＩＣＰ４７発現は、ウエスタンブロットおよび／またはフローサイトメトリーによって検査する。トランスフェクトされていない胎仔線維芽細胞を対照として使用する。

ＥＧＦＰ安定細胞株の樹立
ＮＬＲＣ５ＫＯ胎仔線維芽細胞を８０〜９０％コンフルエンスで、トリプシンを用いて回収して、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＤＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて洗浄する。ｐＲｏｓａ２６−ＩＣＰ４７は、ＡｓｃＩ消化によって直線化する。トランスフェクションは、Ｎｅｏｎ（商標）ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによって行う。簡潔に説明すると、１０^６個の細胞を、１２０μｌのＲ緩衝液中に懸濁して、２μｇの直線化されたＤＮＡを、添加する。細胞を、１３００Ｖ、３０ｍｓ、１パルスでエレクトロポレーションして、抗生物質なしの培養培地中でコラーゲンＩコーティングプレート（ＢＤ）上にプレートする。４８時間後、培養培地を、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する選択培地で置き換える。１０日間のＧ４１８選択後、ＩＣＰ４７陽性細胞を、フローソーティングによって単離する。選択された細胞を、拡大増殖させて、第２のフローソーティングを行い、ＩＣＰ４７陽性細胞を精製および富化する。

体細胞核移入
ＳＣＮＴは、ｉｎｖｉｔｒｏの成熟した卵母細胞を使用して行う（ＤｅＳｏｔｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．ＳｔＳｅｙｍｏｕｒ、ＴＮ．およびＭｉｎｉｔｕｂｏｆＡｍｅｒｉｃａ、ＭｏｕｎｔＨｏｒｅｂ、ＷＩ．）。卵丘細胞を、０．１％ヒアルロニダーゼ中でピペッティングすることによって、卵母細胞から取り除く。正常な形態学および可視の極体を有する卵母細胞のみを、クローニングのために選択する。５ｍｇ／ｍＬビスベンズイミドおよび７．５ｍｇ／ｍＬサイトカラシンＢを含有する操作培地（Ｃａを含まないＮＣＳＵ−２３、５％ＦＢＳを含む）中で卵母細胞を１５分間インキュベートする。このインキュベーション期間の後、卵母細胞を、第一極体および第二分裂中期板を除去することによって除核して、１つの単一の細胞を各々の除核された卵母細胞に注入する。電気融合は、ＢＴＸ細胞エレクトロポレーター（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）で誘導する。カップルを、１４０Ｖの２つのＤＣパルスに、５０ｍｓの間、２８０ｍＭのマンニトール、０．００１ｍＭのＣａＣｌ_２、および０．０５ｍＭのＭｇＣｌ_２中で曝露した。１時間後、再構築された卵母細胞を、１２０Ｖの２つのＤＣパルスで６０ｍｓの間、２８０ｍＭのマンニトール、０．１ｍＭのＣａＣｌ_２、および０．０５ｍＭのＭｇＣｌ_２中で活性化する。活性化後、卵母細胞を、０．４％のウシ血清アルブミンＢＳＡを含むＮＣＳＵ−２３培地中に戻して、３８．５℃、５％ＣＯ_２で、加湿雰囲気で１時間未満、培養した後、レシピエントに移入する。レシピエントは、それらの発情期の最初の日に同期した非ヒト動物（例えば、オクシデンタルブタ（ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｐｉｇ））である。

ＩＣＰ４７トランスジェニック胎仔の遺伝子型決定
妊娠は、３５日目で終わり、胎仔を回収する。ゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出する。ＰＣＲプライマーを、ゲノム中のＩＣＰ４７ｃＤＮＡ配列を検出するように設計する。２０μｌの反応混合物は、１０μｌの２×Ｇｏ−ＴａｑＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、５ｐｍｏｌの各々のプライマー、および５０ｎｇのゲノムＤＮＡを含有した。ＰＣＲを行って、ＩＣＰ４７挿入の有無を検出する。正常な細胞から抽出されるゲノムＤＮＡを、陰性対照として使用する。

（実施例１１：Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡをコードするＲＮＡを注射することによるＮＬＲＣ５ノックアウト非ヒト動物の作製）
ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓを使用する遺伝子を標的化する代替的なアプローチは、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９システムによる遺伝子を破壊するために細胞に、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡをコードするＲＮＡ分子（例えば、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））を直接注射することである。この実施例は、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡおよび単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を注射することによって、非ヒト動物（例えば、ブタ）におけるＮＬＲＣ５を破壊するための例示的な方法を示す。

ＮＬＲＣ遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡを設計して合成する。Ｃａｓ９コードプラスミドを構築するために、Ｃａｓ９コード配列を合成し、次いで、Ｃａｓ９のｉｎｖｉｔｒｏ転写のためのＴ７プロモーターを保有する、ｐＥＡＳＹ−Ｔ１ベクター中にクローニングする。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、Ｃａｓ９カセットの３’末端であり、かつ固有のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、直線化のためのＳＶ４０シグナルの外側である。Ｔ７プロモーター含有ｓｇＲＮＡ足場をまた、順序付けて、プロモーターのないｐＵＣ１９ベクター中にクローニングする。２つのＢｓａＩ制限部位を、スペーサー挿入に使用して、プラスミドは、ｉｎｖｉｔｒｏ転写のためにＰｓｉＩによって直線化する。ベクター構築を標的化するために、部位特異的２０ｎｔスペーサーを合成して、ＢｓａＩ制限部位の間にＴ７−ｓｇＲＮＡ足場中にクローニングする。

Ｃａｓ９ｍＲＮＡを調製するために、Ｔ７−Ｃａｓ９発現プラスミドを、ＨｉｎｄＩＩＩによって直線化して、ＤＮＡＣｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５（ＺＹＭＯＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製する。

ｓｇＲＮＡを調製するために、ｓｇＲＮＡベクターを、ＰｓｉＩを使用して直線化して、ＤＮＡＣｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５（ＺＹＭＯＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製する。

全ての直線化されたプラスミドは、製造業者の指示に従って、Ｔ７ＨｉｇｈＹｉｅｌｄＲＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＮＥＢ）によってｉｎｖｉｔｒｏ転写する。Ｃａｓ９ｍＲＮＡを合成するために、ｍ７Ｇ（５’）ＧＲＮＡＣａｐＳｔｒｕｃｔｕｒｅＡｎａｌｏｇ（ＮＥＢ）をさらに添加して、転写されたｍＲＮＡを安定化した。調製されたＲＮＡを、ＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅＲＮＡＣｌｅａｎ−ＵｐＫｉｔ（Ｏｍｅｇａ）を使用して精製して、ＤＥＰＣ水中に回収する。

非ヒト動物、例えば、Ｂａｍａミニブタ由来の接合体を、受精の次に収集して、操作培地に移し、２〜１０ｐｌの１２５ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡおよび１２．５ｎｇ／μｌのｓｇＲＮＡの単一の細胞質マイクロインジェクションに供する。あるいは、非ヒト動物の受精した卵母細胞を収集する。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを、受精した卵母細胞に注入して、遺伝子改変された子孫を生成する。ＲＮＡ注射後に、非ヒト動物（例えば、ブタ）胚の生存度を試験するために、ｉｎｖｉｔｒｏで生成された単為生殖の胚を、予備実験に使用する。単為生殖の胚の調製のために、非ヒト動物（例えば、ブタ）卵巣を収集し、予め温めた生理食塩水で洗浄して、卵胞を吸引する。卵母細胞を、ＴＬ−ＨＥＰＥＳ中で洗浄した後に、成熟培地中で４４時間培養する。成熟したＭＩＩ卵母細胞は、穏やかにピペッティングすることによって、周囲の卵丘細胞を除去し、続いて、３０マイクロ秒の間、１．２ｋＶ／ｃｍの２つの直流パルス（１秒間隔）で電気活性化をする。活性化された卵母細胞を、ＴＬ−ＨＥＰＥＳ培地に移し、１２５ｎｇ／μｌのＣａｓ９ｍＲＮＡおよび１２．５ｎｇ／μｌのｓｇＲＮＡという単回の２〜１０ｐｌの細胞質注射に供する。接合体および活性化卵母細胞を、ＰＺＭ３培地中で、胚盤胞段階まで、１４４時間、５％ＣＯ２下、３９℃で培養する。

Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡは、非ヒト動物接合体（例えば、ブタ接合体）に同時注射される。Ｃａｓ９ｍＲＮＡ／ガイドＲＮＡを注射された接合体、および水を注射された接合体のｉｎｖｉｔｒｏの発生効率を、非ヒト動物（例えば、ブタ）の早期胚発生に対するＣａｓ９ｍＲＮＡ／ガイドＲＮＡのマイクロインジェクション操作の効果を決定するために測定する。

注射された胚を、代理の非ヒト動物（例えば、ブタ）に移入して、子孫（例えば、仔豚）を生成する。生存した胚を、発情期の日またはその１日後にレシピエント未経産ブタの卵管に、全身麻酔下での正中線開腹術後に移入する。妊娠は、約２８日後に診断し、次いで超音波検査によって２週間隔で定期的にチェックする。全てのマイクロインジェクションされた子孫（例えば、仔豚）は、自然分娩によって分娩される。

全部で７６の注入された胚を、５つの独立実験で、５匹の代理母に移植する。ＮＬＲＣ５遺伝子の標的化部位中の挿入または欠失は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）アッセイによって検出される。子孫（例えば、仔豚）の遺伝子型は、各々の個々の子孫（例えば、仔豚）の標的化部位を含有するＰＣＲ生成物のサンガーシークエンシングによって解析する。

（実施例１２：非ヒト霊長類におけるブタ膵島異種グラフトに応答する免疫細胞の特定）
この実施例は、細胞の異種移植術における免疫介入のために標的化免疫細胞を特定するための例示的な方法を示す。この目的を達成するために、エフェクターおよび調節性機能を有する循環中およびグラフトのＴおよびＢリンパ球サブセットの表現型を、ブタ膵島異種グラフト拒絶の予防のためのドナー抗原特異的免疫療法を伴ってまたは伴わずに、免疫抑制を受けている、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｍａｃａｑｕｅ）（ＣＭ）で試験した。

門脈内ブタ膵島異種グラフトに対する細胞免疫は、糖尿病ＣＭの４つのコホートでレトロスペクティブに解析した：α−ＣＤ４０での誘導、ならびにＣＴＬＡ４−Ｉｇおよびラパマイシンでの維持（コホートＡ；ｎ＝４；グラフト機能７７〜３３３日）；ＣＴＬＡ４−Ｉｇでの誘導、ならびにα−ＣＤ４０およびラパマイシンでの維持（コホートＢ；ｎ＝３；安定なグラフト機能１８０日超）；α−ＣＤ４０、α−ＣＤ２０、およびラパマイシンでの誘導、維持なし（コホートＣ；ｎ＝２；グラフト機能、３２日および４０日間）、ならびにα−ＣＤ４０、α−ＣＤ２０、およびラパマイシンの援護のもとでアポトーシス性ドナー白血球の移植前後の注入による誘導、維持なし（コホートＤ；ｎ＝３；グラフト機能、８１、１００、および１１３日間）。屠殺時の循環中の免疫細胞サブセットおよび肝臓単核細胞（ＬＭＮＣ）の頻度は、フローサイトメトリーによって決定した。ＬＭＮＣはまた、ドナー抗原でのｅｘ−ｖｉｖｏ刺激後にエフェクター分子で解析した。統計学的有意性は、ウェルチの補正を伴うかまたは伴わない、対のないｔ検定を使用して決定した。

循環中の免疫細胞サブセットのベースライン頻度は、コホートの間で異なることはなかった。コホートＡＣＭ（移植後１００日目まで）と比較して、コホートＢＣＭは、以下を示した：ｉ）ナイーブ（ＣＤ３−ＣＤ２０＋ＣＤ２１＋ＣＤ２７−）対、活性化されたメモリー（ＣＤ３−ＣＤ２０＋ＣＤ２１＋ＣＤ２７＋）および未熟（ＣＤ３−ＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＩｇＭ＋）対、成熟（ＣＤ３−ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＣＤ３８＋）循環中のＢ細胞の比における有意な増大、ｉｉ）循環中のＢｒｅｇｓ（ＣＤ１９＋ＣＤ２４ｈｉＣＤ３８ｈｉ）、Ｔｒｅｇｓ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ１２７）、およびナチュラルサプレッサー細胞（ＮＳＣ；ＣＤ１２２＋ＣＤ８＋）における有意な増大、ならびにｉｉｉ）匹敵する循環中の頻度のＣＤ８＋エフェクターメモリー（ＴＥＭ）細胞（ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−ＣＤ８＋）。コホートＣＣＭは、移植後１４日目、ＣＤ８＋ＴＥＭの有意な拡大増殖を示したがコホートＤＣＭは示さなかった。コホートＣＣＭと比較して、移植後５０±１０日目では、コホートＤＣＭは、ＴｒｅｇｓおよびＮＳＣの循環中の頻度の有意な増大を示した。５０日目まで、コホートＤにおけるＣＤ８＋ＴＥＭの有意な拡大増殖もあった。推定される拒絶のために終結するＣＭでは、ＬＭＮＣによって、ＣＸＣＲ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ２０＋Ｂ細胞（α−ＣＤ２０処置したコホートＣおよびＤＣＭに含まれる）；ＣＤ８＋ＴＥＭの実質的な存在は、ＬＭＮＣの間の優勢な表現型であることが示された。ドナー抗原でのｅｘ−ｖｉｖｏ刺激の際、これらのＣＤ８＋ＴＥＭは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびパーフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）の豊富な染色を示した。

この結果は、ブタ対ＣＭ膵島異種移植術における細胞免疫に対する免疫療法の効果への洞察を提供し、Ｂ細胞およびＣＤ８＋ＴＥＭを、細胞の異種移植術における免疫介入のための標的として特定する。

（実施例１３：ブタ膵島でのＳＬＡの抑制は、ブタ膵島に対するヒトＣＤ８＋Ｔ細胞応答を阻害した）
ブタ膵島（例えば、ＳＬＡ）におけるＭＨＣの抑制が、ヒトレシピエントにおけるＴ細胞活性化を阻害し得るか否かを決定するために、ＳＬＡ抗体を使用して、ブタ膵島でＭＨＣを抑制し、ブタ膵島に対するヒトＴ細胞の応答を検査した。

ヒト末梢血単核細胞は、抗ＳＬＡクラスＩブロッキング抗体を伴ってまたは伴わずに７日間、成体ブタ膵島とともに培養した。高度に精製されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（ｈＣＤ８）、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（ｈＣＤ４）、およびヒトナチュラルキラー細胞（ｈＮＫ）の増殖を測定した。高度に精製されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は阻害されたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞もＮＫ細胞も阻害されなかった。ブタ膵島上のＭＨＣクラスＩ分子の認識は、混合培養物中で７日後に抗ＳＬＡクラスＩブロッキング抗体でブロックされた（図１９Ａ）。

抗ＳＬＡクラスＩブロッキング抗体の存在下または不在下で、７日間、高度に精製されたリンパ球を伴ってまたは伴わずに培養された成体のブタ膵島。培養された細胞の生存度は、アクリジンオレンジ（ＡＯ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって評価した。精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性は、抗ＳＬＡＩ抗体の存在下で阻害された（図１９Ｂ）。有意な増殖にかかわらず、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性と比較した場合、膵島に相対的に害を与えなかった（図１９Ｂ）。

（実施例１４：ブタ膵島を移植されたサルでのＥＣＤＩ固定脾細胞によるＴ細胞活性化の抑制）
異種グラフトドナー由来のアポトーシス性脾細胞が、レシピエントによる異種グラフトの免疫拒絶を抑制し得るか否かを決定するために、ドナー由来のアポトーシス性脾細胞を、移植の前後にレシピエントに投与した。次いで、レシピエントのＰＢＭＣにおけるＴ細胞活性化を検査した。

ブタ膵島を、糖尿病のサルに移植した。膵島ドナーから調製されたアポトーシス性脾細胞を、移植の１日前および７日後にサルに投与した。ＰＢＭＣを、移植術前に、ならびに移植術の７、１４、２８、４９、７７、および９１日後にサルから収集した。ＰＢＭＣにおける直接および間接的なＴ細胞活性化を、ＥＬＩＳＰＯＴによって検査した。ＥＬＩＳＰＯＴの結果を、１０^６個のＰＢＭＣあたりスポット形成細胞（ＳＦＣ）として示した（図２０Ａ）。１４１日目、膵島を、サルから収集して、ＣＤ８を、抗ＣＤ８抗体を使用して免疫組織化学によって検出した（図２０Ｂ）。４２匹の移植されていないサル由来のＰＢＭＣを、陰性対照（「対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）」）として使用した。遺伝子改変されていないブタ膵島を移植された１０匹のサル由来のＰＢＭＣを、陽性対照（「リジェクター（Ｒｅｊｅｃｔｏｒ）」）として使用した。脾細胞の投与は、サルにおけるブタ膵島によって誘導されたＴ細胞活性化を有意に低減した。

（実施例１５：免疫抑制の維持なしで、サルにおいて同じドナー由来の免疫調節性ブタ膵島およびＥＣＤＩ固定脾細胞を移植することによる糖尿病の処置）
実施例１４における、免疫細胞に対するＥＣＤＩ固定ドナー細胞の免疫抑制効果を試験することに加えて、この実施例での実験は、ｉｎｖｉｖｏでの（サルでの）ＥＣＤＩ固定ドナー細胞の免疫抑制効果を検査した。その結果、ブタ由来のＥＣＤＩ固定脾細胞が、ブタ由来の膵島を移植されたサルにおける免疫拒絶を低減することが示された。

糖尿病のサルは、ブタ膵島を移植された。サルは、移植術の７日前および１日後にＥＣＤＩ固定ドナー脾細胞を与えられた（静脈内注入による）。免疫抑制薬は、移植術の日から移植術後２１日目にわたって与えた。小用量の外因性のインスリンを、移植術後２１日目にわたって投与した。正常な血糖値を維持するために必要な外因性のインスリン（灰色のバーに示される）は、移植術の日に低下して、２１日目に完全に停止した。血糖値（線で示される）は、移植術後直ちに正常になり、２１日目のインスリンの中断にかかわらず正常のまま続いた。血糖値は、移植術後１００日目にわたって外因性のインスリンなしで正常に維持された（図２１Ａ）。移植術後ピーク値を含む血液Ｃペプチドレベル、ランダムレベル、ならびに絶食およびグルコース刺激条件下のレベルを試験した（図２１Ｂ）。

サルの糖代謝を、静脈内グルコース負荷検査（ＩＶＧＴＴ）によって検査した（図２１Ｃおよび図２１Ｄ）。ＩＶＧＴＴでは、外因性のグルコースを、サルに注射し、血糖値を注射後経時的に測定した。移植術後、２８日目および９０日目でＩＶＧＴＴをサルで行った。ストレプトゾトシンを伴ってまたは伴わずに処置された移植されていないサルを対照として使用した。ストレプトゾトシンで処置した移植されていないサルを糖尿病の対照として使用した。血糖値（図２１Ｃ）およびＣペプチド（図２１Ｄ）レベルを測定して、対照と比較した。

（実施例１６：ＥＣＤＩ固定細胞によるレシピエントの寛容化および移植）
移植ドナー由来の細胞を、ＥＣＤＩで固定して、レシピエントにおける免疫拒絶を抑制するために使用する。この実施例は、ＥＣＤＩ固定の遺伝子改変された細胞で移植片レシピエントを寛容化するための例示的な方法を示す。移植術の必要なヒトレシピエントを、ＥＣＤＩ固定細胞で処置して、レシピエントを移植術に対して寛容化する。ＥＣＤＩ固定細胞は、遺伝子改変され、例えば、ＧＧＴＡ１およびＣＭＡＨはノックアウトされる。Ｂ４ＧＡＬＮＴ２はまた、ＥＣＤＩ固定細胞のいくつかではノックアウトされている。ＥＣＤＩ固定細胞の一部または全てはまた、ＩＣＰ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、またはＣＤ５９である１つまたは複数の遺伝子も発現する。

ＥＣＤＩ固定細胞は、移植術の約７日前、および再度、移植術の約１日後にレシピエントに与えられる。

ある用量の拮抗性の抗ＣＤ４０抗体はまた、移植術の約８日前、ならびに移植術の７および１４日後にレシピエントに与えられる。その用量は、レシピエントの体重１ｋｇあたり少なくとも約３０ｍｇの抗ＣＤ４０抗体である。

レシピエントは、移植片を受ける。移植片は、限定するものではないが、有蹄動物を含む非ヒト動物由来の細胞、組織、および／または臓器である。

例えば、膵島細胞は、改変されていない有蹄動物から取り出して、糖尿病に罹患しているヒトレシピエントに移植する。レシピエントは、移植術前に適切に寛容化されたので、ヒトレシピエントは、移植片を拒絶しない。

（実施例１７：抗ＣＤ４０抗体処置を受けているサルにおいてブタ膵島を移植することによる糖尿病の処置）
この実施例は、ブタ膵島を移植されたサルでの免疫拒絶に対する種々の時点で投与された抗ＣＤ４０抗体の効果を比較した。

対照の糖尿病のサルに、遺伝子改変されていないブタ膵島を移植した（図２２Ａ）。そのサルに、移植術の日に抗ＣＤ４０抗体を与えた。正常な血糖値を維持するために必要な外因性のインスリン（灰色のバーで示される）は、移植の日に低下して、２１日目に完全に停止した。血糖値（線で示される）は、移植術後直ちに正常になり、両方のサルで２１日目のインスリンの停止にかかわらず正常のまま続く。しかし、血糖値は、１００日目の後に継続し、外因性のインスリンは、１２５日目の後に正常な血糖値を維持するために必要である。

野生型ブタから収集されたブタ膵島を、糖尿病のサルに移植した。移植術後、サルに、移植術後１４日目にわたって４回、抗ＣＤ４０抗体処置を与えた（図２２Ｂ）。正常な血糖値を維持するために必要な外因性のインスリン（灰色のバーで示される）は、移植の日に低下し、２１日目に完全に停止した。血糖値（線で示される）は、移植術後直ちに正常になり、サルでは２１日目にインスリンの停止にかかわらず正常なまま続く。血糖値は、移植術後、２５０日目で外因性のインスリンなしで正常なままであった（図２２Ｂ）。

（実施例１８：抗体およびＥＣＤＩ固定脾細胞によるサル膵島を移植された糖尿病サルの免疫寛容化）
この実施例は、サル（ＩＤ＃１３ＣＰ７）における同種グラフトに対する免疫拒絶に対する抗ＣＤ４０抗体および寛容化ワクチンの効果を比較した。この結果、抗ＣＤ４０抗体および寛容化ワクチンの両方が、サル膵島を移植されたサルで免疫拒絶を有効に低下することが示された。

糖尿病のサルにサル膵島を移植した。サルには、移植術の日から開始して抗ＣＤ４０抗体およびラパマイシンを２１日間与えた。このサルは、移植術の最大２１日後まで外因性のインスリンを与えられた。２１日目の後、サルは、朝（絶食）で正常な血糖値を有したが、午後は高い血糖値を有した（図２３Ａ）。図２３Ｂは、同じレシピエント（ＩＤ＃１３ＣＰ７）における血清ブタＣペプチドレベル（絶食された、ランダムおよび刺激された）を実証する。

（実施例１９：α−ＣＤ４０抗体およびＣＴＬＡ４−Ｉｇによる、ブタ膵島を移植された糖尿病サルの免疫寛容化）
この実施例の実験は、ブタ膵島細胞を移植されたサルで他の薬物によって誘導された免疫抑制を維持することに対するα−ＣＤ４０抗体およびＣＴＬＡ４−Ｉｇの効果を比較した。その結果によって、α−ＣＤ４０抗体が、膵島異種グラフトの生存の延長においてＣＴＬＡ４−Ｉｇよりも能力が優れていることが示された（表１２）。

ストレプトゾトシン誘発性の糖尿病を有する２つの群のカニクイザル（ＭＸ−ＬＩＳＡ−Ａ（４匹のサル）およびＭＸ−ＬＩＳＡ−Ｂ（３匹のサル））に、遺伝子改変されていないブタ膵島を門脈内に移植した。ＭＸ−ＬＩＳＡ−Ａ群のサルに関しては、免疫抑制は、α−ＣＤ２５抗体、α−ＣＤ４０抗体、ｓＴＮＦＲ、およびα−ＩＬ−６Ｒ抗体によって誘導し、ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよびラパマイシンによって維持した。ＭＸ−ＬＩＳＡ−Ｂ群のサルに関しては、免疫抑制は、α−ＣＤ２５抗体、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ｓＴＮＦＲ、およびα−ＩＬ−６Ｒ抗体によって誘導し、α−ＣＤ４０抗体およびラパマイシンによって維持した。より長い膵島異種グラフト生存は、免疫抑制がＭＸ−ＬＩＳＡ−Ａ群と比較してα−ＣＤ４０抗体によって維持された場合に（ＭＸ−ＬＩＳＡ−Ｂ群）、達成された（表１２）。

（実施例２０：α−ＣＤ４０抗体およびＥＣＤＩ固定ドナー脾細胞によるブタ膵島を移植された糖尿病サルの免疫寛容化）
この実施例は、ブタ膵島を移植されたサルでの免疫拒絶に対するアポトーシス性脾細胞の効果を検査した。この結果、アポトーシス性脾細胞は、膵島異種グラフト生存を延長したことが示された（表１３）。

ストレプトゾトシン誘発性の糖尿病を有する２つの群のカニクイザル（ＭＸ−ＥＣＤＩ対照（２匹のサル）およびＭＸ−ＥＣＤＩ−ワクチン（３匹のサル））に、遺伝子改変されていないブタ膵島を、門脈内に移植した。全てのサルに、α−ＣＤ２０抗体、α−ＣＤ４０抗体、ｓＴＮＦＲ、α−ＩＬ−６Ｒ抗体、およびラパマイシンを、移植術の日から移植術後２１日目まで与えた。ＭＸ−ＥＣＤＩ−ワクチン群のサルはまた、移植術の７日前および１日後、体重１ｋｇあたり０．２５×１０^９個のアポトーシス性ドナー脾細胞を、移植前後に静脈内注入で与えられた。脾細胞は、ＧＧＴＡ１ノックアウトブタから調製されたもの、およびαＧａｌ複合糖質ＧＡＳ９１４の援護のもとで注入されたものを、その全体が参照によって援用される、Ｋａｔａｐｏｄｉｓら、ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．、１１０巻（１２号）：１８６９〜１８７頁（２００２年）に記載のとおり含む。延長された膵島異種グラフト生存は、一過性の免疫抑制の援護のもとでアポトーシス性ドナー脾細胞を与えられたサルで達成されたが（ＭＸ−ＥＣＤＩワクチン）、一過性の免疫抑制のみを与えられたレシピエントでは達成されなかった（ＭＸ−ＥＣＤＩ対照）（表１３）。

（実施例２１：ＥＣＤＩ固定ドナー脾細胞およびα−ＣＤ４０抗体による循環中の免疫細胞レベルの抑制）
この実施例における実験は、移植術後の循環中の免疫細胞のレベルに対する、ＥＣＤＩ固定細胞（寛容化ワクチン）およびα−ＣＤ４０抗体を検査した。循環中の免疫細胞のレベルは、移植拒絶の指標であった。この結果によって、ＥＣＤＩ固定細胞（寛容化ワクチン）およびα−ＣＤ４０抗体の両方が、移植術後のレシピエントにおける循環中の免疫細胞のレベルを低下することが示された。

ここで試験した循環中の免疫細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３＋ＣＤ１２７低制御性Ｔ細胞、およびＣＤ８＋ＣＤ１２２＋ナチュラルサプレッサー細胞であった。

ＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞
カニクイザルにブタ膵島を移植した。寛容化ワクチンはサルに与えなかった。循環中のＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞のレベルは、フローサイトメトリーによって決定した（図２４）。その結果、移植術を受けているサル（１４ＧＰ０４）における循環中のＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞のレベルは、ベースラインの対照（１３ＣＰ０４）と比較して増大され、およびＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞は、屠殺の時点で肝臓単核細胞中のＣＤ８＋Ｔ細胞区画内で高い存在率を有することが示される（図２４）。

実施例２４のブタ膵島を移植された２つの群のカニクイザル（ＭＸ−ＥＣＤＩ−対照およびＭＸ−ＥＣＤＩ−ワクチン）における循環中のＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞を、フローサイトメトリーによって測定した。ＭＸ−ＥＣＤＩ−ワクチン群のサルは、アポトーシス性ドナー脾細胞の移植前後の注入を寛容化ワクチンとして受けた。循環中のＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞のレベルを、フローサイトメトリーによって決定した（図２５）。フローサイトメトリーの結果によって、アポトーシス性ドナー脾細胞（ＭＸ−ＥＣＤＩ−ワクチン）の移植前後の注入は、カニクイザルにおける循環中のＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞の移植後の増大を、アポトーシス性ドナー脾細胞とともに寛容化ワクチン接種を受けなかった対照のレシピエント（ＭＸ−ＥＣＤＩ−対照）と比較して、少なくとも一時的に低下した。屠殺の時点（推定の拒絶後）、肝臓単核細胞中のＣＤ８＋Ｔ細胞区画内のＣＤ８＋ＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞の割合は、両方の群のレシピエントで比較的高かった（図２５）。

実施例２８（ＭＸ−ＬＩＳＡ−ＡおよびＭＸ−ＬＩＳＡ−Ｂ）および実施例２９（ＭＸ−ＥＣＤＩ−対照およびＭＸ−ＥＣＤＩ−ワクチン）におけるブタ膵島を移植されたサルにおける循環中のＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞を、移植術の日、移植術後の７日目、５０日目および１００日目にフローサイトメトリーによって測定した。ナイーブなサル由来の循環中のＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞のレベルを対照として使用した。

フローサイトメトリーの結果によって、アポトーシス性ドナー脾細胞の移植前後の注入は（ＭＸ−ＥＣＤＩワクチン）、カニクイザルにおける循環中のＣＤ８＋ＣＤ２ｈｉＣＤ２８−エフェクターメモリーＴ細胞の移植後の増大を、アポトーシス性ドナー脾細胞とともに寛容化ワクチン接種を受けなかった対照のレシピエント（ＭＸ−ＥＣＤＩ−対照）と比較して、少なくとも一時的に抑制することが示される。ＭＸ−ＥＣＤＩ−ワクチンレシピエントにおけるＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞の移植後の増大の抑制のレベルは、ブタ膵島異種移植術の後、さらに強力かつさらに長い免疫抑制を受けるレシピエントでの抑制と匹敵した（ＭＸ−ＬＩＳＡ−ＡおよびＭＸ−ＬＩＳＡ−Ｂ群）（図２６）。

ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３＋ＣＤ１２７低制御性Ｔ細胞
この実施例での実験は、ＥＣＤＩ固定細胞（寛容化ワクチン）およびα−ＣＤ４０抗体を、移植術後の循環中のＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３＋ＣＤ１２７低制御性Ｔ細胞のレベルに対して検査した。循環中のＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３＋ＣＤ１２７低制御性Ｔ細胞のレベルは、移植拒絶の指標であった。

ブタ膵島（ＭＸ−ＬＩＳＡ−Ａ、ＭＸ−ＬＩＳＡ−Ｂ、ＭＸ−ＥＣＤＩ−対照、およびＭＸ−ＥＣＤＩ−ワクチン）を移植されたサルでの循環中のＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３＋ＣＤ１２７低制御性Ｔ細胞を、移植術の日、移植術後の７日目、５０日目および１００日目にフローサイトメトリーによって測定した。ナイーブなサル由来の循環中のＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３＋ＣＤ１２７低制御性Ｔ細胞のレベルを、対照として使用した。

フローサイトメトリーの結果によって、アポトーシス性ドナー脾細胞（ＭＸ−ＥＣＤＩ−ワクチン）の移植前後の注入は、アポトーシス性ドナー脾細胞（ＭＸ−ＥＣＤＩ−対照）を用いて寛容化ワクチン接種を受けなかった対照レシピエントと比較して、カニクイザルにおける循環中のＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３＋ＣＤ１２７低制御性Ｔ細胞の増大を促進した。ＭＸ−ＥＣＤＩ−ワクチンレシピエントにおけるこれらの制御性Ｔ細胞の移植後の増大は、ブタ膵島異種移植術後の抗ＣＤ４０抗体およびラパマイシン（ＭＸ−ＬＩＳＡ−Ｂ）での維持免疫抑制を受けるレシピエントでの増大と匹敵した（図２７）。

ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋ナチュラルサプレッサー細胞
ブタ膵島（ＭＸ−ＬＩＳＡ−Ａ、ＭＸ−ＬＩＳＡ−Ｂ、ＭＸ−ＥＣＤＩ−対照、およびＭＸ−ＥＣＤＩ−ワクチン）を移植されたサルでの循環中のＣＤ８＋ＣＤ１２２＋ナチュラルサプレッサー細胞は、移植術の日、移植術後の７日目、５０日目、および１００日目にフローサイトメトリーによって測定した。ナイーブサル由来の循環中のＣＤ８＋ＣＤ１２２＋ナチュラルサプレッサー細胞のレベルを対照として使用した。

フローサイトメトリーの結果は、ドナーアポトーシス性脾細胞（ＭＸ−ＥＣＤＩ−ワクチン）の移植前後の注入が、アポトーシス性ドナー脾細胞（ＭＸ−ＥＣＤＩ−対照）を用いた寛容化ワクチン接種を受けなかった対照のレシピエントおよびＭＸ−ＬＩＳＡ−Ａレシピエントと比較してカニクイザルにおける循環中のＣＤ８＋ＣＤ１２２＋ナチュラルサプレッサー細胞の増大を促進したことを示している。ＭＸ−ＥＣＤＩ−ワクチンレシピエントにおけるこれらの制御性Ｔ細胞の移植後の増大は、ブタ膵島異種移植術後の抗ＣＤ４０抗体およびラパマイシン（ＭＸ−ＬＩＳＡ−Ｂ）での維持免疫抑制を受けるレシピエントでの増大と匹敵している（図２８）。

（実施例２２：ＥＣＤＩ固定細胞、リツキシマブ、抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０抗体、ｓＴＮＦＲ、抗ＩＬ−６Ｒ抗体、およびラパマイシンによるサルでのブタ膵島異種グラフト生存の延長）
この実施例は、他の免疫抑制薬と組み合わせてＥＣＤＩ固定ドナー細胞を使用して免疫拒絶を抑制するための例示的な方法を示す。

移植前後に、ｉ）ＥＣＤＩ固定細胞に対する抗原送達、ｉｉ）ラパマイシン、リツキシマブ、ｓＴＮＦＲ、および抗ＩＬ−６Ｒ抗体、ならびにｉｉｉ）抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０を含む、新規な三部からなるプロトコールの寛容原性の有効性を、サルにおける成体ブタ膵島の門脈内移植術の設定で試験する。

ＥＣＤＩ固定ドナー脾細胞は、クローニングされたブタドナー由来の新鮮に調製されたサイトカイン動員化脾臓のＢ細胞から調製する。約０．２５×１０^９／ｋｇのＥＣＤＩ固定ドナー脾細胞を、−７日目（０日目の同じドナー膵島移植に対して）にＩＶを介してサルに投与する。ドナー脾臓は、脾臓摘出術を使用して、クローニングされたブタドナーから新鮮に得られる。ドナー脾臓Ｂ細胞を、ｅｘ−ｖｉｖｏで拡大増殖して、＋１日目にサルに対するＩＶ注入を介して投与する。７日間培養された、クローニングされたブタドナー由来の、全てのリリース基準を満たす成体ブタ膵島生成物（２５，０００膵島等価物／ｋｇ）を、門脈の静脈血管アクセスポートを介して０日目に門脈内に注入する。

Ｂ細胞枯渇は、リツキシマブを用いて、−１０日目に、すなわち、膵島移植術前に、およびまたＥＣＤＩ固定ドナー細胞の最初の注入の前にも開始する。４用量の２０ｍｇ／ｋｇを、ＩＶを介して、−１０日目、−３日目、＋５日目、および＋１２日目にサルに投与する。サルに、ラパマイシンを、−７日目から移植後２１日目まで、１２〜１５ｎｇ／ｍｌの標的トラフレベルで投与する。ｓＴＮＦＲは、−６日目から＋１０日目まで皮下に投与される。さらに、抗ＩＬ−６Ｒは、ＩＶを介して−７日目、０日目、７日目、１４日目および２１日目に投与される。

サルを、異種移植動物モデルでＥＣＤＩ固定ドナー細胞と一緒に薬学的に活性な薬剤を使用する有効性を決定するために試験する。３用量の５０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０を、−１日目、＋７日目、および＋１４日目にＩＶを介してサルに投与するが、４用量の５０ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０Ａｂ２Ｃ１０を、異なるサルに、ＩＶを介して、−８日目、−１日目、＋７日目、および＋１４日目に投与する。

グラフト機能、例としては、毎日の午前の血糖（ＡＭＢＧ）および午後の血糖（ＰＭＢＧ）、毎週のＣペプチド、毎月のＨｂＡ１ｃおよび２ヵ月に１回のＩＶＧＴＴ（グルコースに応答する急性Ｃペプチドの決定、およびグルコース消失速度を伴う）の移植後モニタリングを測定する。首尾よい生着とは、大きく低下した（ベースラインの３３％以下）または存在しない外因性のインスリンに対して、非絶食ＢＧ＜２００ｍｇ／ｄＬの維持として規定される。主な有効性の転帰は、血糖値が２００ｍｇ／ｄＬ以上である、３連続日（安定な低用量インスリンまたはインスリンの中断後）の最初のものとして規定される膵島グラフト不全までの日数である。

移植後の膵島グラフト機能は、さらに、ＩＶグルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）でさらに実証される。ある用量のグルコースを、ＩＶによって摂取して、血中レベルを間隔をおいてチェックする。糖尿病誘導の前後にＩＶグルコースに対する血清ブタＣペプチド応答（ＳＴＺの前後）も測定する。＋２８日目のＩＶグルコースに対する応答は、誘導された糖尿病状態の逆転を示す。

（実施例２３：遺伝子改変された移植グラフトを移植して、ＥＣＤＩ固定ドナー細胞を投与することによる、レシピエントにおける免疫拒絶の低下）
この実施例は、ドナーから移植片を受け取るレシピエントにおける免疫拒絶の抑制のための例示的な方法であって、ｉ）ＥＣＤＩ固定ドナー細胞を投与すること；およびｉｉ）移植片をレシピエントにおける免疫拒絶の誘導が低いかまたは全くないようにドナーを遺伝子改変することによる方法を示す。

移植術の必要なヒトレシピエントを、ＥＣＤＩ固定細胞を用いてレシピエントを処置することによってグラフトに対して寛容化する。寛容化後、レシピエントは、移植片を受ける。移植片は、限定するものではないが、有蹄動物を含む非ヒト動物由来の細胞、組織、および／または臓器である。これらの非ヒト動物は、遺伝子改変された非ヒト動物である。遺伝子改変は、少なくともＮＬＲＣ５／ＴＡＰ１ノックアウトを含む。ノックアウトされる他の遺伝子は、表１および２に列挙する。過剰発現される遺伝子は、表３および表４に列挙する。

例えば、糖尿病を有するヒトレシピエントに、ＩＣＰ４７を過剰発現する１つまたは複数のＮＬＲＣ５／ＴＡＰ１ノックアウト膵島細胞を移植する。移植された膵島細胞は、ヒトＩＣＰ４７に対して相同または同一なペプチドをコードする導入遺伝子を過剰発現する。膵島細胞は、ブタのような遺伝子改変された非ヒト動物由来である。

移植術後、ヒトレシピエントは、内因性のインスリンレベルの増大があり、かつグルコース耐性が優れる。野生型膵島細胞を移植されたヒトレシピエントと比較した場合、ヒトＩＰＣ４７を過剰発現するＮＬＲＣ５ノックアウト膵島細胞を移植されたヒトレシピエントは、移植拒絶が有意に低下しており、したがって、免疫抑制療法をほとんどまたは全く必要としない。

（実施例２４：レシピエントの慢性および全身性の免疫抑制の非存在下で、臨床設定における、ヒトレシピエントでのブタ膵島異種グラフトの拒絶の予防または生存の延長）
この実施例は、異種グラフトレシピエントの慢性および全身性の免疫抑制の非存在下における臨床設定におけるヒトレシピエントでのブタ膵島（ならびに／または他の細胞、組織、および臓器）異種グラフトの拒絶を予防するかまたは生存を延長するための例示的なアプローチを示す。このアプローチは、以下の３つの構成要素を含み、組み込む：ｉ）αＧａｌ、ＭＨＣクラスＩ、補体Ｃ３、およびＣＸＣＬ１０の欠損および／または低減された発現、ならびにトランスジェニック発現ＨＬＡ−Ｇを有する、遺伝子操作されたブタ膵島；ｉｉ）αＧａｌ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、およびＳｄａ／ＣＡＤの欠損／低減された発現、ならびにヒトＣＤ４７、ヒトＰＤ−Ｌ１、ヒトＰＤ−Ｌ２（遺伝子操作されたワクチン）を含むか含まないＨＬＡ−Ｇのトランスジェニック発現を有する遺伝子操作されたドナーアポトーシス性および非アポトーシス性単核細胞（例えば、脾細胞）；ならびにｉｉｉ）一過性の免疫抑制、例としては、拮抗性の抗ＣＤ４０ｍＡｂ、抗ＣＤ２０ｍＡｂ、ラパマイシンおよび一過性の抗炎症性療法、例としては、コンプスタチン（例えば、コンプスタチン誘導性ＡＰＬ−２）、抗ＩＬ−６受容体ｍＡｂ、および可溶性ＴＮＦ受容体の投与。

ワクチンドナーブタであって、破壊されたＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、およびＢ４ＧａｌＮＴ２、ならびにＨＬＡ−Ｇ（またはＨＬＡ−Ｅ）、ヒトＣＤ４７、ヒトＰＤ−Ｌ１およびヒトＰＤ−Ｌ２を発現する導入遺伝子を含むワクチンドナーブタを生成する。これらのワクチンドナーブタは、αＧａｌ−、Ｎｅｕ５Ｇｃ−、Ｓｄａ／ＣＡＤ−欠損、ならびにＨＬＡ−Ｇ、ヒトＣＤ４７、ヒトＰＤ−Ｌ１、およびヒトＰＤ−Ｌ２の発現を有する単核細胞（例えば、脾細胞）を提供する。いくつかの単核細胞（例えば、脾細胞）は、ＥＣＤＩ固定によってアポトーシス性にされる。アポトーシス性および非アポトーシス性単核細胞（例えば、脾細胞）を混合して寛容化ワクチンを作製する。グラフトドナーブタは、ワクチンドナーブタにおいてさらにＮＬＲＣ５（またはＴＡＰ１−）、Ｃ３、およびＣＸＣＬ１０遺伝子を破壊することによって作製する。グラフトドナーブタは、ヒトレシピエントにおける移植のための細胞、組織または臓器（例えば、膵島）を提供する。ワクチンドナーブタおよびグラフトドナーブタの集団を、クローニングによって、例えば、体性核移入を使用して増やす。

グラフトドナーブタ由来のグラフトを、レシピエントに移植する。ワクチンドナーブタによって提供される細胞由来の寛容化ワクチンを、ヒトレシピエントに、移植１日前および移植７日後に投与する。免疫抑制剤、例えば、α−ＣＤ４０抗体、α−ＣＤ２０抗体およびラパマイシン、ならびに／または抗炎症性剤、例えば、コンプスタチン、α−ＩＬ−６Ｒ抗体、およびｓＴＮＦＲを、移植前の時点から移植後２１日目まで投与する。このアプローチは、レシピエントの慢性および全身性の免疫抑制の非存在下で、ヒトレシピエントにおけるブタ異種グラフト（例えば、ブタ膵島）の拒絶を予防するか、または生存を延長する（図５）。

（実施例２５：ＧＧＴＡ１／ＮＬＲＣ５ノックアウトブタの生成および特徴付け）
この実施例は、ノックアウトブタを生成するための例示的な方法を示す。ノックアウトブタは、ＮＬＲＣ５、ＴＡＰ１、Ｃ３、ＣＸＣＬ１０、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＩＩＴＡ、ＣＭＡＨ、ＧＧＴＡ１および／またはＢ４ＧＡＬＮＴ２のうちの２つまたはそれ超のタンパク質発現が低減され得る。このようなノックアウトブタの１種は、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９システムを使用する、ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／ＮＬＲＣ５ノックアウトブタであった。このブタは、移植術のための膵島を提供した。ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／ＮＬＲＣ５が破壊されたブタ膵島は、ＭＨＣクラスＩ欠損を有し、レシピエントに移植された場合、免疫拒絶の誘導が低いかまたは全くない。

胎仔線維芽細胞のトランスフェクション
実施例１で生成した、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、およびＮＬＲＣ５を標的化するガイドＲＮＡを発現するｐｘ３３０プラスミドを、ブタ胎仔線維芽細胞中でトランスフェクトした。ブタ胎仔線維芽細胞は、５〜１０％血清、グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。線維芽細胞に、製造業者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００システム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して、Ｃａｓ９およびＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨまたはＮＬＲＣ５遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡを発現する２つまたは３つのプラスミドを同時トランスフェクトした。

ＧＧＴＡ１ＫＯ細胞の対抗選択
トランスフェクション４日後、トランスフェクトされた細胞を、回収して、イソレクチンＢ４（ＩＢ４）−ビオチンで標識した。αＧａｌを発現する細胞を、ビオチンコンジュゲートされたＩＢ４で標識し、ストレプトアビジンコーティングしたＤｙｎａｂｅａｄｓ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって、磁場中で枯渇させた。αＧａｌ欠損細胞を、上清から選択した。細胞を、顕微鏡によって検査した。ソーティング後に、結合したビーズを含有しないかまたはほとんど含有しない細胞を、陰性の細胞として特定した。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化ＧＧＴＡ１およびＮＬＲＣ５遺伝子のＤＮＡシークエンシング解析
ＩＢ４対抗選択した細胞およびクローニングしたブタ胎仔由来のゲノムＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎＤＮｅａｓｙＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔを使用して抽出した。ＰＣＲは、表１１に示されるとおり、ＧＧＴＡ１およびＮＬＲＣ５特異的なプライマー対で行った。ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰａｃｋ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＧＧＴＡ１のＰＣＲ条件は、それらのプライマーに理想的であるアニーリング温度および融解温度に基づいた。ＰＣＲ生成物を、１％アガロースゲル上で分離し、ＱｉａｇｅｎＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔによって精製し、表７に示されるような特定のシークエンシングプライマーを用いるサンガー方法（ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｉｎｎｅｓｏｔａ）によってシークエンシングした。

体細胞核移入（ＳＣＮＴ）
ＳＣＮＴを、Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈら、ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、９１巻（３号）：７８、１〜１３頁、（２０１４年）に記載のとおり行った。ＳＣＮＴは、ｉｎｖｉｔｒｏで成熟した卵母細胞を使用して行った（ＤｅＳｏｔｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．、Ｓｔ．Ｓｅｙｍｏｕｒ、ＴＮ）。卵丘細胞を、０．１％ヒアルロニダーゼ中で、ピペッティングすることによって、卵母細胞から取り出した。正常な形態学および可視の極体を有する卵母細胞のみを、ＳＣＮＴについて選択した。卵母細胞を、５μｇ／ｍＬのビスベンズイミドおよび７．５μｇ／ｍＬのサイトカラシンＢを含有する操作培地（Ｃａを含まないＮＣＳＵ−２３、５％ＦＢＳを含む）中で１５分間インキュベートした。卵母細胞を、第一極体および第二分裂中期板を除去することによって除核した。単一の細胞を、各々の除核された卵母細胞に注射して、融合して、１８０Ｖの２つのＤＣパルスによって、５０μｓｅｃの間（ＢＴＸ細胞エレクトロポレーター、ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）、２８０ｍＭのマンニトール、０．１ｍＭのＣａＣｌ_２、および０．０５ｍＭのＭｇＣｌ_２中で同時に活性化した。活性化した胚を、０．４％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＮＣＳＵ−２３培地中に戻して、３８．５℃、５％ＣＯ_２で、１時間未満、加湿雰囲気で培養し、代理ブタに移入した。

胚を使用する遺伝子改変されたブタの生成
代理ブタに移入するための胚を、胚移入培地を充填したペトリ皿に加えた。細胞凍結保存のための０．２５ｍｌの無菌のストローもまた使用した。胚の吸引は２５〜３５℃で行った。

胚の吸引は、この順序に従って行った：培地層−空気層−培地層−空気層−胚層−空気層−培地層−空気層−培地層。ＥＯガスで滅菌したストローを使用する場合、その内部を、胚の吸引の前、胚移植術のための培地の吸引および分注を１〜３回反復することによって洗浄した。吸引後、ストローの先端末端部を、プラスチックキャップによってシールした。吸引しシールしたストローを無菌で保持するために、プラスチックピペット（Ｆａｌｃｏｎ、２ｍｌ）を、ストローよりわずかに大きいサイズに切断し、その中に入れ、パラフィンフィルムでシールした。シールしたストローの温度は、携帯型のインキュベーターを使用して、使用の直前まで維持した。

胚および発情期に同期させた代理母を準備した。胚の移入は、代理母の開腹術を通じて卵巣を露出することによって行う。麻酔後、腹部領域の正中線を切開して、子宮、卵巣、卵管、およびふさ（ｆｉｍｂｒｉａｅ）を露出させた。胚を吸引するストローを、携帯型のインキュベーターから無菌的に採取して、卵管の入り口に挿入した。挿入したストローを、膨大部−峡部の接合領域まで動かした。挿入手順後、ストローを、ハサミを使用して反対側で空気含有層で切断した。１ｃｃのシリンジを切断末端に装着し、およそ０．３ｃｃの空気を注射して胚および培地をストローから卵管中に遊離した。この時点で、０．２ｍｌの黄色の先端部の５ｍｍの先端末端部を切り離して、シリンジおよびストローを接続するために使用した。

胚移入後、露出した子宮、卵巣、卵管、およびふさを腹腔に入れ、腹部筋膜を、吸収性の縫合材を使用して閉じた。次いで、手術部位をベタジンできれいにし、抗生物質および抗炎症薬および鎮痛薬を用いて処置した。胚を移植された代理母の妊娠試験を行い、続いて、首尾よく妊娠した非ヒト動物の分娩を誘導した。

妊娠および胎仔
ブタ胎仔の２つの同腹仔（妊娠１の７匹および妊娠２の５匹）を得た。胎仔を、４５日目（妊娠１）または４３日目（妊娠２）で回収して、ＤＮＡおよび培養細胞単離のために処理した。組織の断片および細胞を、２日間培養培地中に平板培養して、胎仔細胞を、接着および増殖させた。野生型細胞（遺伝子改変されていない胎仔細胞）および妊娠１または２由来の胎仔細胞を、培養プレートから取り出して、ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートされたＩＢ４レクチン、またはＦＩＴＣにコンジュゲートされた抗ブタＭＨＣクラスＩ抗体で標識した。フローサイトメトリー解析を行い、データは、図３２Ａ：妊娠１または図３２Ｂ：妊娠２に示した。ＷＴ細胞のヒストグラムは、胎仔細胞の各々の群の全体的強度における低下を強調するために、各々のパネルに含まれる。特に興味深いのは、ピーク強度の低下として示される妊娠１におけるアルファＧａｌおよびＭＨＣクラスＩ標識の低下である。妊娠２では、胎仔１および３は、ＷＴ胎仔細胞と比較して、アルファｇａｌ標識における大きな低下、およびＭＨＣクラス１標識における有意な低下がある。

胎仔の遺伝子型
胎仔細胞由来のＤＮＡを、ＧＧＴＡ１（Ｓｕｓｓｃｒｏｆａ品種混合第１染色体、Ｓｓｃｒｏｆａ１０．２ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０１０４４３．４と比較した）またはＮＬＲＣ５（コンセンサス配列）標的領域のＰＣＲ増幅に供し、得られたアンプリコンを、１％のアガロースゲル上で分離した（図２９Ａ、図２９Ｂ、図３０Ａ、および図３０Ｂ）。アンプリコンをまた、各々の反応からのフォワードプライマーのみを使用してサンガーシークエンシングによって解析した。その結果は、ＧＧＴＡ１の標的部位の後で６ヌクレオチド短縮された妊娠１の胎仔１、２、４、５、６、および７として示される。胎仔３は、切断部位後で１７ヌクレオチド短縮され、それに続いて２，５１１（６６８〜３１７９）ヌクレオチド欠失、それに続いて単一塩基置換であった。標的遺伝子の両方のコピー由来の対立遺伝子を含有する単一のシークエンシング実験からの短縮、欠失および置換は、遺伝子改変が生じたことを示唆し得るだけで、各々の対立遺伝子について正確な配列は明らかにしない。この解析から、全ての７匹の胎仔は、単一の対立遺伝子改変を含有したと思われる。妊娠１由来の胎仔のＮＬＲＣ５標的部位の配列解析では、一貫性のあるアラインメントを示すことはできず、サンガーシークエンシング反応および解析を複雑にするＮＬＲＣ５対立遺伝子の間のシークエンシング反応における未知の複雑性または種々のＤＮＡ改変を示唆する。妊娠２の胎仔ＤＮＡ試料１、３、４、および５は、ＧＧＴＡ１遺伝子標的部位由来の短縮された３ヌクレオチドであった。胎仔２は、サンガーシークエンシングで変動を有し、このことは、ＤＮＡ変異の複雑な変動または試料の質が劣ることを示唆する。しかし、胎仔ＤＮＡ鋳型の質は、上記のＧＧＴＡ１遺伝子スクリーニング実験の生成に十分であった。ＮＬＲＣ５遺伝子アンプリコンは全て、ＮＬＲＣ５遺伝子切断部位下流の短縮された１２０ヌクレオチドであった。

胎仔のＤＮＡ（野生型（ＷＴ）対照、および妊娠１由来の胎仔１〜７由来）を、後肢の生検から単離して、標的遺伝子ＮＬＲＣ５およびＧＧＴＡを、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ生成物を、１％アガロースゲル上で分離して、蛍光ＤＮＡ染色によって可視化した。ＷＴレーンにおけるアンプリコンのバンドは、未改変のＤＮＡ配列に相当する。アンプリコンのサイズの増減は、それぞれ、アンプリコン内の挿入または欠失を示唆した。１つの試料中の対立遺伝子の間のＤＮＡ改変の変動によって、バンドはより拡散されるようになる場合がある。ＤＮＡ改変におけるわずかな変動は、１％アガロースゲルで分離可能であった。その結果を図３１Ａ〜図３１Ｂに示す。ＮＬＲＣ５ゲルにバンドがないこと（妊娠１の胎仔１、３、および４；図３１Ａ底部）によって、標的領域に対する改変は、ＤＮＡ増幅プライマーの結合を破壊したことが示唆された。ＧＧＴＡ１標的化実験における全てのバンドの存在によって、ＤＮＡの質は、ＮＬＲＣ５標的化ＰＣＲ反応においてＤＮＡアンプリコンを生成するのに十分であったことが示唆される。妊娠１の胎仔１、２、４、および５（図３１Ａ、頂部）は、より大きいＧＧＴＡ１アンプリコンを有し、このことは、標的化領域内の挿入を示唆している。妊娠１の胎仔３（図３１Ａ、頂部）について、ＧＧＴＡ１アンプリコンは、ＷＴ対照よりも早く移動したが、このことは、標的化領域内の欠失を示唆している。妊娠１の胎仔６および７（図３１Ａ、底部）に関して、ＮＬＲＣ５アンプリコンは、ＷＴよりも早く移動し、これは標的領域内の欠失を示唆している。妊娠２の胎仔１〜５（図３１Ｂ、頂部）ＧＧＴＡ１アンプリコンは、サイズによる解釈が困難で、ＷＴ対照と比較して拡散していた。胎仔１〜５（図３１Ｂ、底部）ＮＬＲＣ５アンプリコンは、野生型対照と比較してサイズおよび密度が均一であった。

アルファＧａｌおよびＭＨＣクラス１フローサイトメトリー標識の表現型結果における変動を考慮すると、ＧＧＴＡ１およびＮＬＲＣ５遺伝子における２対立遺伝子変異にかなりの変動がある。この観察は、アガロースゲル中のバンドのサイズの相違、短縮された遺伝子生成物、およびシークエンシングの困難、図２９Ａ〜図２９Ｂ、図３０Ａ〜図３０Ｂ、図３１Ａ〜図３１Ｂ、および図３２Ａ〜図３２Ｂによって支持される。個々の対立遺伝子のクローニングを、配列の改変を詳細に解読するために行う。しかし、胎仔の表現型、ＤＮＡシークエンシング、および機能的な解析によって、胎仔ブタにおける２対立遺伝子のＧＧＴＡ１およびＮＬＲＣ５遺伝子改変の作製が支持される。

ヒト免疫細胞の増殖に対する遺伝子ノックアウトの影響
次に、妊娠１の胎仔３由来の細胞を用いて、同時培養アッセイを行って、ヒト免疫細胞の増殖に対するＭＨＣクラスＩ発現の低下の影響を評価した。

混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
同時培養は、平底の９６ウェルプレートで行った。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識したヒトＰＢＭＣ（２．５μＭ／ｍｌ）を、応答物として、０．３〜０．９×１０^５細胞／ウェルで使用した。野生型またはブタ線維芽細胞を、０．１〜０．３×１０^５細胞／ウェル（野生型ブタまたはＧＧＴＡ１／ＮＬＲＣ５ノックアウト胎仔由来）を、刺激因子として、刺激因子−応答物の比が１：１、１：５および１：１０として使用した。ＭＬＲ同時培養を、全てのＭＬＲアッセイで４日間行った。別の並行実験では、全てのＰＢＭＣ細胞を、陽性対照としてフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（２ｕｇ／ｍｌ）で刺激した。

培養された細胞を洗浄して、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体で染色し、その後にホルムアルデヒド固定を続け、洗浄した。ＢＤＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターを使用して、未改変のブタ線維芽細胞と比較したＧＧＴＡ１／ＮＬＲＣ５ノックアウト胎仔由来の線維芽細胞に応答したＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖能力を評価した。データを、ＦＡＣＳｄｉｖａ／ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｉｓｔａｒ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して解析し、パーセンテージＣＦＳＥｄｉｍ／ｌｏｗを、プレゲーティングしたＣＤ８Ｔ細胞およびＣＤ４Ｔ細胞で決定した。

野生型およびＧＧＴＡ１／ＮＬＲＣ５ノックアウト胎仔細胞に対するヒトＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答を、図３３Ａ〜図３３Ｂに示す。細胞を、増殖の評価の前にＣＤ４＋またはＣＤ８＋としてゲーティングした（図３３Ａ）。ＣＤ８Ｔ細胞増殖は、野生型胎仔細胞と比較して、ＧＧＴＡ１／ＮＬＲＣ５ノックアウト線維芽細胞を有する胎仔細胞により処置刺激後に低下した。ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖におけるほぼ５５％の低下が、ヒト応答物が、１：１の比でＧＧＴＡ１／ＮＬＲＣ５ノックアウト胎仔細胞で処置された場合に観察された（図３３Ｂ）。野生型胎仔細胞は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞で１７．２％の増殖を惹起したが、胎仔３（妊娠１）由来のＧＧＴＡ１／ＮＬＲＣ５ノックアウト胎仔細胞は、７．６％の増殖しか誘導しなかった（図３３Ｂ）。野生型胎仔細胞と比較して、１：５および１：１０の比で、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖応答に相違は観察されなかった（図３３Ｂ）。野生型胎仔細胞と比較して、ＧＧＴＡ１／ＮＬＲＣ５ノックアウトに応答したＣＤ４＋Ｔ細胞増殖に変化は観察されなかった（図３３Ｂ）。

一部の実施形態を示し、記載してきたが、このような実施形態は、単なる例示で示される。多くの変動、変化および置き換えが、本発明から逸脱することなく、ここで当業者に思い浮かぶ。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替が、本発明を行うのに使用されることが理解されるべきである。
一実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
１つまたは複数の第１の遺伝子の低減されたタンパク質発現を有する遺伝子改変された動物であって、前記遺伝子改変された動物は、ローラシア獣上目のメンバーであり、または非ヒト霊長類であり、前記１つまたは複数の第１の遺伝子は、
ａ）主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉ特異的エンハンセオソームの成分、
ｂ）ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーター、および／または
ｃ）補体成分３（Ｃ３）
を含み、
前記低減されたタンパク質発現は、遺伝子改変されていない対応する動物と比較したものである、遺伝子改変された動物。
（項目２）
ローラシア獣上目のメンバーを含み、ローラシア獣上目の前記メンバーが有蹄動物である、項目１に記載の遺伝子改変された動物。
（項目３）
前記有蹄動物がブタである、項目２に記載の遺伝子改変された動物。
（項目４）
前記１つまたは複数の第１の遺伝子の前記タンパク質発現が、前記遺伝子改変された動物中には存在しない、項目１から３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目５）
タンパク質発現の前記低減が、前記１つまたは複数の第１の遺伝子の機能を不活性化する、項目１から４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目６）
２つまたはそれ超の前記第１の遺伝子の低減されたタンパク質発現を有する、項目１から５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目７）
ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分の低減されたタンパク質発現を含み、ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの前記成分がＮＯＤ様受容体ファミリーＣＡＲＤドメイン含有５（ＮＬＲＣ５）である、項目１から６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目８）
ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーターの低減されたタンパク質発現を含み、前記トランスポーターが抗原プロセシング関連トランスポーター１（ＴＡＰ１）である、項目１から７のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目９）
Ｃ３の低減されたタンパク質発現を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目１０）
３つまたはそれ超の前記第１の遺伝子の低減されたタンパク質発現を含む、項目１から９のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目１１）
１つまたは複数の第２の遺伝子の低減されたタンパク質発現をさらに含み、前記１つまたは複数の第２の遺伝子は、
ａ）ナチュラルキラー（ＮＫ）群２Ｄリガンド、
ｂ）ヒトでは発現されない内因性遺伝子、
ｃ）ＣＸＣケモカイン受容体（ＣＸＣＲ）３リガンド、および／または
ｄ）ＭＨＣＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）
を含み、
前記低減されたタンパク質発現は、遺伝子改変されていない対応する動物と比較したものである、項目１から１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目１２）
前記１つまたは複数の第２の遺伝子の前記タンパク質発現が、前記遺伝子改変された動物中には存在しない、項目１１に記載の遺伝子改変された動物。
（項目１３）
タンパク質発現の前記低減が、前記１つまたは複数の第２の遺伝子の機能を不活性化する、項目１１または１２に記載の遺伝子改変された動物。
（項目１４）
ＮＫ群２Ｄリガンドの低減されたタンパク質発現を含み、前記ＮＫ群２Ｄリガンドが、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）またはＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）である、項目１１から１３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目１５）
ヒトでは発現されない内因性遺伝子の低減されたタンパク質発現を含み、ヒトでは発現されない前記内因性遺伝子が、糖タンパク質ガラクトシルトランスフェラーゼアルファ１，３（ＧＧＴＡ１）、推定シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ様タンパク質（ＣＭＡＨ）またはβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）である、項目１１から１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目１６）
ＣＸＣＲ３リガンドの低減されたタンパク質発現を含み、前記ＣＸＣＲ３リガンドが、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）である、項目１１から１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目１７）
１つもしくは複数のタンパク質またはそれらの機能的断片をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、前記１つまたは複数のタンパク質は、
ａ）ＭＨＣＩ形成サプレッサー、
ｂ）補体活性化のレギュレーター、
ｃ）ＮＫ細胞に対する阻害性リガンド、
ｄ）Ｂ７ファミリーメンバー、
ｅ）ＣＤ４７、
ｆ）セリンプロテアーゼ阻害剤、および／または
ｇ）ガレクチン
を含む、項目１から１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目１８）
前記１つまたは複数のタンパク質がヒトタンパク質である、項目１７に記載の遺伝子改変された動物。
（項目１９）
ＭＨＣＩ形成サプレッサーをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記ＭＨＣＩ形成サプレッサーが感染細胞タンパク質４７（ＩＣＰ４７）である、項目１７または１８に記載の遺伝子改変された動物。
（項目２０）
補体活性化のレギュレーターをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記補体活性化のレギュレーターが、表面抗原分類４６（ＣＤ４６）、表面抗原分類５５（ＣＤ５５）または表面抗原分類５９（ＣＤ５９）である、項目１７から１９のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目２１）
ＮＫ細胞に対する阻害性リガンドをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＮＫ細胞に対する前記阻害性リガンドが、白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）またはβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）である、項目１７から２０のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目２２）
ＨＬＡ−Ｇをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記ＨＬＡ−Ｇが、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７である、項目２１に記載の遺伝子改変された動物。
（項目２３）
前記ＨＬＡ−ＧがＨＬＡ−Ｇ１である、項目２２に記載の遺伝子改変された動物。
（項目２４）
Ｂ７ファミリーメンバーをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記Ｂ７ファミリーメンバーがプログラム死−リガンドである、項目１７から２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目２５）
前記プログラム死−リガンドが、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）またはプログラム死−リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）である、項目２４に記載の遺伝子改変された動物。
（項目２６）
前記１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドが、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方をコードする、項目２５に記載の遺伝子改変された動物。
（項目２７）
セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記セリンプロテアーゼ阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害剤９（Ｓｐｉ９）である、項目１７から２６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目２８）
ガレクチンをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記ガレクチンがガレクチン−９である、項目１７から２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目２９）
ａ）Ｃ３の低減されたタンパク質発現；
ｂ）ＣＸＣＬ１０、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよび／もしくはＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減されたタンパク質発現；ならびに／または
ｃ）
ｉ）ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｅもしくはそれらの機能的断片、
ｉｉ）ＰＤ−Ｌ１もしくはその機能的断片、
ｉｉｉ）ＰＤ−Ｌ２もしくはその機能的断片、および／または
ｉｖ）ＣＤ４７もしくはその機能的断片
をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチド
を含む、項目１から２８のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目３０）
前記１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドが、遍在性プロモーターに隣接して挿入される、項目１７から２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目３１）
前記遍在性プロモーターがＲｏｓａ２６プロモーターである、項目３０に記載の遺伝子改変された動物。
（項目３２）
前記１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドが、標的化遺伝子のプロモーターに隣接して、または前記標的化遺伝子内に挿入される、項目１７から３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目３３）
前記標的化遺伝子が、前記第１の遺伝子のうちの１つまたは前記第２の遺伝子のうちの１つである、項目３２に記載の遺伝子改変された動物。
（項目３４）
前記１つまたは複数の第１の遺伝子の前記タンパク質発現が、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して低減される、項目１から３３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目３５）
前記１つまたは複数の第２の遺伝子の前記タンパク質発現が、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して低減される、項目１１から３４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目３６）
ａ）ＮＫ細胞に対する阻害性リガンドまたはその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド、および
ｂ）内因性遺伝子の低減されたタンパク質発現
を含む、ローラシア獣上目のメンバーである、または非ヒト霊長類である、遺伝子改変された動物であって、
前記低減されたタンパク質発現は、遺伝子改変されていない対応する動物と比較したものである、遺伝子改変された動物。
（項目３７）
ＮＫ細胞に対する前記阻害性リガンドが、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇである、項目３６に記載の遺伝子改変された動物。
（項目３８）
ＮＫ細胞に対する前記阻害性リガンドがＨＬＡ−Ｇであり、前記ＨＬＡ−Ｇが、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７である、項目３７に記載の遺伝子改変された動物。
（項目３９）
前記ＨＬＡ−ＧがＨＬＡ−Ｇ１である、項目３８に記載の遺伝子改変された動物。
（項目４０）
前記内因性遺伝子が、ヒトでは発現されない遺伝子である、項目３６から３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目４１）
前記内因性遺伝子が、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよび／またはＢ４ＧＡＬＮＴ２である、項目３６から４０のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目４２）
ａ）ＰＤ−Ｌ１もしくはその機能的断片、
ｂ）ＰＤ−Ｌ２もしくはその機能的断片、および／または
ｃ）ＣＤ４７もしくはその機能的断片
をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、項目３６から４１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目４３）
前記外因性ポリヌクレオチドが、遍在性プロモーターに隣接して挿入される、項目３６から４２のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目４４）
前記遍在性プロモーターがＲｏｓａ２６プロモーターである、項目４３に記載の遺伝子改変された動物。
（項目４５）
前記外因性ポリヌクレオチドが、前記内因性遺伝子のプロモーターに隣接して、または前記内因性遺伝子内に挿入される、項目３６から４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目４６）
前記内因性遺伝子の前記タンパク質発現が、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して低減される、項目３６から４５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物。
（項目４７）
項目１から４６のいずれか一項に記載の２つまたはそれ超の動物を含む、遺伝子改変された動物の集団。
（項目４８）
少なくとも２つまたはそれ超の動物が、同一の表現型を有する、項目４７に記載の遺伝子改変された動物の集団。
（項目４９）
少なくとも２つまたはそれ超の動物が、同一の遺伝子型を有する、項目４７または４８に記載の遺伝子改変された動物の集団。
（項目５０）
項目１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物から単離された、膵臓または膵島。
（項目５１）
項目１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物から単離された、遺伝子改変された細胞、組織または臓器。
（項目５２）
１つまたは複数の第１の遺伝子の低減されたタンパク質発現を含む、ローラシア獣上目のメンバーまたは非ヒト霊長類由来の遺伝子改変された細胞であって、前記１つまたは複数の第１の遺伝子は、
ａ）ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分、
ｂ）ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーター、および／または
ｃ）Ｃ３
を含み、
前記低減されたタンパク質発現は、遺伝子改変されていない対応する細胞と比較したものである、遺伝子改変された細胞。
（項目５３）
ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分の低減されたタンパク質発現を含み、ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの前記成分がＮＬＲＣ５である、項目５２に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目５４）
ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーターの低減されたタンパク質発現を含み、ＭＨＣＩ結合性ペプチドの前記トランスポーターがＴＡＰ１である、項目５２または５３に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目５５）
Ｃ３の低減されたタンパク質発現を含む、項目５２から５４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目５６）
１つまたは複数の第２の遺伝子の低減されたタンパク質発現をさらに含み、前記１つまたは複数の第２の遺伝子が、
ａ）ＮＫ群２Ｄリガンド、
ｂ）ヒトでは発現されない内因性遺伝子、
ｃ）ＣＸＣＲ３リガンド、および／または
ｄ）ＣＩＩＴＡ
を含み、
前記低減されたタンパク質発現は、遺伝子改変されていない対応する細胞と比較したものである、項目５２から５５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目５７）
ＮＫ群２Ｄリガンドの低減されたタンパク質発現を含み、前記ＮＫ群２Ｄリガンドが、ＭＩＣＡおよび／またはＭＩＣＢである、項目５６に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目５８）
ヒトでは発現されない内因性遺伝子の低減されたタンパク質発現を含み、ヒトでは発現されない前記内因性遺伝子が、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよび／またはＢ４ＧＡＬＮＴ２である、項目５６または５７に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目５９）
ＣＸＣＲ３リガンドの低減されたタンパク質発現を含み、前記ＣＸＣＲ３リガンドがＣＸＣＬ１０である、項目５６から５８のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目６０）
１つもしくは複数のタンパク質またはそれらの機能的断片をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、前記１つもしくは複数のタンパク質またはそれらの機能的断片が、
ａ）ＭＨＣＩ形成サプレッサー、
ｂ）補体活性化のレギュレーター、
ｃ）ＮＫ細胞に対する阻害性リガンド、
ｄ）Ｂ７ファミリーメンバー、
ｅ）ＣＤ４７、
ｆ）セリンプロテアーゼ阻害剤、および／または
ｇ）ガレクチン
を含む、項目５２から５９のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目６１）
前記１つもしくは複数のタンパク質またはそれらの機能的断片がヒトタンパク質である、項目６０に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目６２）
ＭＨＣＩ形成サプレッサーをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記ＭＨＣＩ形成サプレッサーがＩＣＰ４７である、項目６０または６１に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目６３）
補体活性化のレギュレーターをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記補体活性化のレギュレーターが、ＣＤ４６、ＣＤ５５および／またはＣＤ５９である、項目６０から６２のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目６４）
ＮＫ細胞に対する阻害性リガンドをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＮＫ細胞に対する前記阻害性リガンドが、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇおよび／またはＢ２Ｍである、項目６０から６３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目６５）
ＮＫ細胞に対する前記阻害性リガンドがＨＬＡ−Ｇであり、前記ＨＬＡ−Ｇが、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６および／またはＨＬＡ−Ｇ７である、項目６４に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目６６）
前記ＨＬＡ−ＧがＨＬＡ−Ｇ１である、項目６５に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目６７）
Ｂ７ファミリーメンバーをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記Ｂ７ファミリーメンバーがプログラム死−リガンドである、項目６０から６６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目６８）
前記プログラム死−リガンドが、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）および／またはプログラム死−リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）である、項目６７に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目６９）
前記プログラム死−リガンドが、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方である、項目６８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目７０）
セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記セリンプロテアーゼ阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害剤９（Ｓｐｉ９）である、項目６０から６９のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目７１）
ガレクチンをコードする１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記ガレクチンがガレクチン−９である、項目６０から７０のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目７２）
ａ）Ｃ３の低減されたタンパク質発現；
ｂ）ＣＸＣＬ１０、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよび／もしくはＢ４ＧＡＬＮＴ２の低減されたタンパク質発現；ならびに／または
ｃ）
ｉ）ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｅもしくはそれらの機能的断片、
ｉｉ）ＰＤ−Ｌ１もしくはその機能的断片、
ｉｉｉ）ＰＤ−Ｌ２もしくはその機能的断片、および／または
ｉｖ）ＣＤ４７もしくはその機能的断片
をコードする外因性ポリヌクレオチド
を含む、項目５３から７１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目７３）
前記１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドが、遍在性プロモーターに隣接して挿入される、項目６０から７２のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目７４）
前記遍在性プロモーターがＲｏｓａ２６プロモーターである、項目７３に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目７５）
前記１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドが、標的化遺伝子のプロモーターに隣接して、または前記標的化遺伝子内に挿入される、項目６０から７４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目７６）
前記標的化遺伝子が、前記第１の遺伝子のうちの１つまたは前記第２の遺伝子のうちの１つである、項目７５に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目７７）
前記１つまたは複数の第１の遺伝子の前記タンパク質発現が、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して低減される、項目５２から７６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目７８）
前記１つまたは複数の第２の遺伝子の前記タンパク質発現が、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して低減される、項目５６から７７のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目７９）
ａ）ＮＫ細胞に対する阻害性リガンドまたはその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド、および
ｂ）内因性遺伝子の低減されたタンパク質発現
を含む、ローラシア獣上目のメンバーまたは非ヒト霊長類由来の遺伝子改変された細胞であって、
前記低減されたタンパク質発現は、遺伝子改変されていない対応する細胞と比較したものである、遺伝子改変された細胞。
（項目８０）
ＮＫ細胞に対する前記阻害性リガンドが、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇである、項目７９に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目８１）
ＮＫ細胞に対する前記阻害性リガンドがＨＬＡ−Ｇであり、前記ＨＬＡ−Ｇが、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６またはＨＬＡ−Ｇ７である、項目８０に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目８２）
前記ＨＬＡ−ＧがＨＬＡ−Ｇ１である、項目８１に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目８３）
前記内因性遺伝子が、ヒトでは発現されない、項目７９から８２のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目８４）
前記内因性遺伝子が、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよび／またはＢ４ＧＡＬＮＴ２である、項目７９から８３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目８５）
ａ）ＰＤ−Ｌ１もしくはその機能的断片、
ｂ）ＰＤ−Ｌ２もしくはその機能的断片、および／または
ｃ）ＣＤ４７もしくはその機能的断片
をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、項目７９から８４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目８６）
前記外因性ポリヌクレオチドが、遍在性プロモーターに隣接して挿入される、項目７９から８５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目８７）
前記遍在性プロモーターがＲｏｓａ２６プロモーターである、項目８６に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目８８）
前記外因性ポリヌクレオチドが、前記内因性遺伝子のプロモーターに隣接して、または前記内因性遺伝子内に挿入される、項目７９から８７のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目８９）
前記内因性遺伝子の前記タンパク質発現が、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して低減される、項目７９から８８のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目９０）
膵、腎臓、眼、肝臓、小腸、肺または心臓細胞である、項目５２から８９のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目９１）
膵島細胞である、項目５２から８９のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目９２）
前記膵島細胞が膵β細胞である、項目９１に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目９３）
脾臓、肝臓、末梢血、リンパ節、胸腺または骨髄細胞である、項目５２から９２のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目９４）
ブタ細胞である、項目５２から９３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目９５）
萌芽期組織、非ヒト胎仔動物、周産期非ヒト動物、新生仔非ヒト動物、離乳前非ヒト動物、若年成体非ヒト動物または成体非ヒト動物由来である、項目５２から９４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目９６）
項目５１から９５のいずれか一項に記載の細胞を含む注射可能な組成物を含む、対象において、移植された細胞、組織または臓器に対する寛容を生じさせることにおける使用に適切なワクチン。
（項目９７）
項目５１から９６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞を含む寛容化ワクチン。
（項目９８）
前記遺伝子改変された細胞が、アポトーシス性細胞である、項目９６または９７に記載のワクチン。
（項目９９）
前記遺伝子改変された細胞が、固定された細胞である、項目９６から９８のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目１００）
固定されていない細胞をさらに含む、項目９６から９９のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目１０１）
前記固定された細胞および前記固定されていない細胞が、遺伝的に同一である、項目１００に記載のワクチン。
（項目１０２）
前記固定された細胞が、化学物質によって固定され、および／または前記固定された細胞が、前記対象において免疫細胞のアネルギーを誘導する、項目９９から１０１のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目１０３）
前記遺伝子改変された細胞が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＣＤＩ）で固定された細胞である、項目９６から１０２のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目１０４）
項目５２から９５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞を含む、組織または臓器。
（項目１０５）
項目５２から９５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞を含む、膵臓または膵島。
（項目１０６）
項目５２から９５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
（項目１０７）
状態の処置を必要とする対象に移植して、前記対象において状態を処置することにおける使用のための、遺伝子改変された細胞、遺伝子改変された細胞を含む組織または臓器であって、前記対象は、ワクチンの使用によって、前記遺伝子改変された細胞、組織または臓器に対して寛容化される、遺伝子改変された細胞、組織または臓器。
（項目１０８）
前記対象に、Ｔ細胞活性化、Ｂ細胞活性化および／または樹状細胞活性化を阻害する１つまたは複数の医薬品が投与される、項目１０７に記載の遺伝子改変された細胞、組織または臓器。
（項目１０９）
状態の処置を必要とする対象において状態を処置するための方法であって、
ａ）項目５１から９５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞または項目１０４から１０８のいずれか一項に記載の細胞、組織もしくは臓器を前記対象に移植するステップ；
ｂ）項目９６から１０３のいずれか一項に記載のワクチンを前記対象に投与するステップ；および／あるいは
ｃ）Ｔ細胞活性化、Ｂ細胞活性化および／または樹状細胞活性化を阻害する１つまたは複数の医薬品を前記対象に投与するステップ
を含む、方法。
（項目１１０）
状態の処置を必要とする対象において状態を処置するための方法であって、
ａ）ワクチンを前記対象に投与するステップ；および
ｂ）遺伝子改変された細胞、遺伝子改変された細胞を含む組織または臓器を前記対象に移植するステップ
を含む、方法。
（項目１１１）
Ｔ細胞活性化、Ｂ細胞活性化および／または樹状細胞活性化を阻害する１つまたは複数の医薬品を前記対象に投与するステップをさらに含む、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
移植される前記遺伝子改変された細胞が、項目５２から９５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞である、項目１１０もしくは１１１に記載の方法または項目１０７もしくは１０８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１１３）
前記ワクチンが、項目９６から１０３のいずれか一項に記載のワクチンである、項目１１０から１１２のいずれか一項に記載の方法または項目１０７もしくは１０８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１１４）
前記ワクチンが、前記対象の体重１ｋｇ当たり、０．００１から１．０までのエンドトキシン単位または約０．００１から１．０までのエンドトキシン単位を含む、項目１１０から１１３のいずれか一項に記載の方法または項目１０７もしくは１０８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１１５）
前記ワクチンが、１μｌ当たり１からまたは約１から１０までの凝集体を含む、項目１１０から１１４のいずれか一項に記載の方法または項目１０７もしくは１０８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１１６）
前記ワクチンが、前記移植の７日前および前記移植の１日後に投与される、項目１１０から１１５のいずれか一項に記載の方法または項目１０７もしくは１０８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１１７）
前記ワクチンが、前記対象の体重１ｋｇ当たり、１×１０ ^８からまたは約１×１０ ^８から４×１０ ^８までの脾細胞または脾臓Ｂ細胞を少なくとも含む、項目１１０から１１６のいずれか一項に記載の方法または項目１０７もしくは１０８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１１８）
前記脾細胞または脾臓Ｂ細胞が、８０％からまたは約８０％から１００％までのＣＤ２１陽性ＳＬＡクラスＩＩ陽性Ｂ細胞を含む、項目１１７に記載の方法または遺伝子改変された細胞。
（項目１１９）
前記ワクチンが静脈内で提供される、項目１１０から１１８のいずれか一項に記載の方法または項目１０７もしくは１０８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１２０）
前記移植された細胞、組織または臓器が、前記対象に移植された後少なくとも７日間にわたって機能的である、項目１１０から１１９のいずれか一項に記載の方法または項目１０７もしくは１０８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１２１）
前記移植するステップが異種移植するステップである、項目１０９から１２０のいずれか一項に記載の方法または項目１０７もしくは１０８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１２２）
前記医薬品が、第１の用量の抗ＣＤ４０抗体を含む、項目１１０から１２１のいずれか一項に記載の方法または項目１０７もしくは１０８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１２３）
前記第１の用量が、前記移植の約８日前に前記対象に与えられる、項目１２２に記載の方法または遺伝子改変された細胞。
（項目１２４）
前記第１の用量が、前記対象の体重１ｋｇ当たり３０ｍｇからまたは約３０ｍｇから７０ｍｇまでの抗ＣＤ４０抗体を含む、項目１２３に記載の方法または遺伝子改変された細胞。
（項目１２５）
１つまたは複数のさらなる免疫抑制剤を前記対象に投与するステップをさらに含む、項目１０９から１２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２６）
前記対象に投与するための１つまたは複数のさらなる免疫抑制剤をさらに含む、項目１０７または１０８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１２７）
前記１つまたは複数のさらなる免疫抑制剤が、Ｂ細胞枯渇化抗体、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦ−アルファ阻害剤、ＩＬ−６阻害剤、補体Ｃ３もしくはＣ５阻害剤、および／またはナイトロジェンマスタードアルキル化剤を含む、項目１２５に記載の方法または項目１２６に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１２８）
前記さらなる免疫抑制剤のうちの１つが、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤である、項目１２７に記載の方法または遺伝子改変された細胞。
（項目１２９）
前記ナイトロジェンマスタードアルキル化剤のうちの１つが、シクロホスファミドである、項目１２８に記載の方法または遺伝子改変された細胞。
（項目１３０）
前記シクロホスファミドが、前記ワクチンの前記投与の２日後または３日後に投与される、項目１２９に記載の方法または遺伝子改変された細胞。
（項目１３１）
前記シクロホスファミドが、５０ｍｇ／ｋｇ／日からまたは約５０ｍｇ／ｋｇ／日から６０ｍｇ／ｋｇ／日までの用量で投与される、項目１２９または１３０に記載の方法または遺伝子改変された細胞。
（項目１３２）
前記対象がヒト対象である、項目１１０から１３１のいずれか一項に記載の方法または項目１０７もしくは１０８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１３３）
前記対象が非ヒト動物である、項目１１０から１３１のいずれか一項に記載の方法または項目１０７もしくは１０８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１３４）
前記非ヒト動物が、ネコまたはイヌである、項目１３３に記載の方法または遺伝子改変された細胞。
（項目１３５）
前記状態が疾患である、項目１０９から１３４のいずれか一項に記載の方法または項目１０７もしくは１０８に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１３６）
前記疾患が糖尿病である、項目１３５に記載の方法または遺伝子改変された細胞。
（項目１３７）
前記糖尿病が、１型糖尿病、２型糖尿病、外科的糖尿病、嚢胞性線維症関連糖尿病および／またはミトコンドリア糖尿病である、項目１３６に記載の方法または遺伝子改変された細胞。
（項目１３８）
グラフトに対してレシピエントを免疫寛容化するための方法であって、項目９６から１０３のいずれか一項に記載のワクチンを前記レシピエントに提供するステップを含む、方法。
（項目１３９）
状態の処置を必要とする対象において状態を処置するための方法であって、項目５２から９５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞を前記対象に移植するステップを含む、方法。
（項目１４０）
状態の処置を必要とする対象に移植して、前記対象において状態を処置することにおける使用のための、項目５２から９５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞、または項目５２から９５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞を含む組織もしくは臓器であって、前記対象は、項目９６から１０３のいずれか一項に記載のワクチンによって、前記遺伝子改変された細胞、組織または臓器に対して寛容化され、Ｔ細胞活性化、Ｂ細胞活性化および／または樹状細胞活性化を阻害する１つまたは複数の医薬品が、前記対象に投与される、遺伝子改変された細胞、または遺伝子改変された細胞を含む組織もしくは臓器。
（項目１４１）
前記移植するステップが異種移植するステップである、項目１４０に記載の遺伝子改変された細胞。
（項目１４２）
状態の処置を必要とする対象に投与して、前記対象において状態を処置することにおける使用のための、項目５２から９５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞、または項目５２から９５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞を含む組織もしくは臓器。
（項目１４３）
グラフトに対してレシピエントを免疫寛容化することにおける使用のための、項目９６から１０３のいずれか一項に記載のワクチン。
（項目１４４）
項目１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物を作製するための方法であって、
ａ）ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分、ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーターおよび／またはＣ３のうちの１つまたは複数の低減された発現を有する細胞を取得するステップ；
ｂ）前記細胞から胚を生成するステップ；ならびに
ｃ）前記胚を、前記遺伝子改変された動物へと成長させるステップ
を含む、方法。
（項目１４５）
前記細胞が接合体である、項目１４４に記載の方法。
（項目１４６）
項目１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物を作製するための方法であって、
ａ）ＭＨＣＩ特異的エンハンセオソームの成分、ＭＨＣＩ結合性ペプチドのトランスポーターおよび／またはＣ３のうちの１つまたは複数の低減された発現を有する第１の細胞を取得するステップ；
ｂ）前記第１の細胞の核を第２の細胞に移入して、胚を生成するステップ；ならびに
ｃ）前記胚を、前記遺伝子改変された動物へと成長させるステップ
を含む、方法。
（項目１４７）
前記低減が、遺伝子編集によって実施される、項目１４４から１４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４８）
前記遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して実施される、項目１４７に記載の方法。

Claims

ローラシア獣上目のメンバーである、または非ヒト霊長類である、遺伝子改変された動物であって、
ａ）ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）配列を含むタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列、および
ｂ）糖タンパク質ガラクトシルトランスフェラーゼアルファ１，３（ＧＧＴＡ１）の低減されたタンパク質発現を生じる、ＧＧＴＡ１をコードする遺伝子における破壊
を含み、
前記低減されたタンパク質発現は、遺伝子改変されていない対応する動物と比較したものであり、ここで、前記遺伝子改変された動物は、前記ＨＬＡ−Ｇ配列を含む前記タンパク質の遍在性の発現を含む、遺伝子改変された動物。
前記ＨＬＡ−ＧがＨＬＡ−Ｇ１を含む、請求項１に記載の遺伝子改変された動物。
前記ＨＬＡ−Ｇ配列がβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）配列をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子改変された動物。
前記遺伝子改変されていない対応する動物と比較して、推定シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ様タンパク質（ＣＭＡＨ）、ＮＯＤ様受容体ファミリーＣＡＲＤドメイン含有５（ＮＬＲＣ５）、β１，４Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧａｌＮＴ２）、またはこれらの組み合わせの低減されたタンパク質発現をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子改変された動物。
β−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）、またはこれらの組み合わせを含むタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子改変された動物。
前記外因性ポリヌクレオチド配列が、前記ＧＧＴＡ１をコードする遺伝子中に挿入される、請求項１に記載の遺伝子改変された動物。
ローラシア獣上目のメンバーを含み、ローラシア獣上目の前記メンバーが有蹄動物である、請求項１に記載の遺伝子改変された動物。
前記有蹄動物がブタである、請求項７に記載の遺伝子改変された動物。
前記遺伝子改変された動物が、ＣＭＡＨをコードする遺伝子、ＮＬＲＣ５をコードする遺伝子、Ｂ４ＧａｌＮＴ２をコードする遺伝子、またはこれらの組み合わせにおける破壊を含む、請求項１に記載の遺伝子改変された動物。
請求項１から９のいずれか一項に記載の遺伝子改変された動物から単離された、遺伝子改変された細胞、組織または臓器。
ローラシア獣上目のメンバーである、または非ヒト霊長類である、遺伝子改変された細胞であって、
ａ）ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）をコードする外因性ポリヌクレオチド配列、および
ｂ）糖タンパク質ガラクトシルトランスフェラーゼアルファ１，３（ＧＧＴＡ１）の低減されたタンパク質発現を生じる、ＧＧＴＡ１をコードする遺伝子における破壊
を含み、
前記低減されたタンパク質発現は、遺伝子改変されていない対応する細胞と比較したものであり、ここで、前記外因性ポリヌクレオチド配列は、前記遺伝子改変された細胞のゲノム中の標的遺伝子座中に挿入される、遺伝子改変された細胞。
前記ＨＬＡ−ＧがＨＬＡ−Ｇ１である、請求項１１に記載の遺伝子改変された細胞。
ローラシア獣上目の細胞を含み、前記ローラシア獣上目が有蹄動物である、請求項１１に記載の遺伝子改変された細胞。
前記有蹄動物がブタである、請求項１３に記載の遺伝子改変された細胞。
前記遺伝子改変されていない対応する細胞と比較して、推定シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ様タンパク質（ＣＭＡＨ）、ＮＯＤ様受容体ファミリーＣＡＲＤドメイン含有５（ＮＬＲＣ５）、β１，４Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧａｌＮＴ２）、もしくはこれらの組み合わせの低減されたタンパク質発現をさらに含む、かつ／またはβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）、もしくはこれらの組み合わせをコードする外因性ポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１１に記載の遺伝子改変された細胞。
前記外因性ポリヌクレオチド配列が、前記ＧＧＴＡ１をコードする遺伝子中に挿入される、かつ／または前記遺伝子改変された細胞がブタのものである、かつ／または前記遺伝子改変された細胞が、ＣＭＡＨをコードする遺伝子、ＮＬＲＣ−５をコードする遺伝子、Ｂ４ＧａｌＮＴ２をコードする遺伝子、もしくはこれらの組み合わせにおける破壊を含む、請求項１１に記載の遺伝子改変された細胞。
状態の処置を必要とする対象において、前記対象における前記状態を処置するための、請求項１０に記載の遺伝子改変された細胞、組織もしくは臓器、または請求項１１に記載の遺伝子改変された細胞を含む組成物であって、前記組成物は、前記対象に移植されることを特徴とする、組成物。
状態の処置を必要とする対象において、前記対象における前記状態を処置するための寛容化ワクチンであって、前記寛容化ワクチンは、前記対象において、前記遺伝子改変された細胞、組織または臓器に対する寛容を生じさせるのに十分な量で、請求項１７に記載の組成物と組み合わせて前記対象に投与されることを特徴とし、前記寛容化ワクチンがアポトーシス性細胞を含み、前記アポトーシス性細胞が、移植される前記遺伝子改変された細胞、組織、または臓器が単離された遺伝子改変された動物と同一の遺伝子改変された動物から単離されたものである、寛容化ワクチン。
前記アポトーシス性細胞が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＣＤＩ）で固定された細胞である、請求項１８に記載の寛容化ワクチン。