CN110373391A - 一种适合心脏异种移植供体猪的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适合心脏异种移植供体猪的构建方法，属动物生物技术领域。在猪胎儿成纤维细胞的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个基因后并定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，再结合体细胞核移植技术构建GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰的异种移植供体基础猪，再在此基础猪的Rosa26位点再定点插入hCD39、hTBM两个心脏功能修饰特异基因，构建出多基因修饰的心脏异种器官移植供体猪再进行功能验证，获得适合心脏异种移植的供体猪。本发明为异种心脏移植提供了可靠的供体猪，为处于终末期的心脏病患者的治疗提供了希望。
Description
技术领域
本发明属于动物生物技术领域，具体地说，涉及一种适合心脏异种移植供体猪的构建方法。
背景技术
器官移植是治疗终末期器官衰竭患者的唯一途径，而异种心脏移植是解决人类心脏供体严重短缺的最有效的途径。近年来，随着我国心血管疾病等慢性疾病患者的大幅增长，使得发展成为终末期心脏衰竭的病人正在急剧增加，对器官需求的压力也将逐渐加大。据不完全统计，我国目前每年可以实施临床器官移植的数量约为1万例，而等待器官移植的病人则有150万，等待器官移植与可进行器官移植患者的数量比值已达150:1。而且，从2015年起，我国已经全面停止使用死囚器官作为移植供体来源，只能将人类去世后自愿捐献的器官作为我国器官移植使用的最终来源，这势必导致心脏等器官供体本已日益短缺的形势更加严峻，这对于全国等待供体的庞大患者群体来说，死者捐献的器官已严重不能满足需求。因此，寻找新的心脏等器官移植供体来解决目前心脏供体严重短缺的难题刻不容缓。
谈到心脏异种器官移植，因猪易于饲养繁殖，心脏尺寸与人类相匹配，且生理和代谢方面与人类极为相近，人猪共患病发生的可能性较小，涉及伦理道德争议少，并可通过人为的基因修饰来增强供体器官的匹配性。因此，猪被公认是最适合用作心脏异种移植供体的物种。经过科学家们近半个多世纪的努力和探索，目前已筛选到近30个能有效缓解免疫学不相容性和克服功能性障碍的相关修饰基因，多种基因修饰的供体猪也被开发并进行了猪到非人灵长类的异种移植试验。
尽管猪作为人类器官移植的来源得到了认可，但心脏移植仍面临着病原微生物感染风险、免疫学不相容性和功能性障碍三大问题使得猪心脏作为异种器官移植面临严重的困难和关键性的挑战，还不足以向临床医学转化。1986年，Lexer等通过猪到狒狒的心脏移植模型发现受体死于超急性排斥反应（Hyperacute rejection, HAR）。到2002年，赖良学等又通过体细胞核移植技术成功获得了GGTA1失活的供体猪，这进一步克服了HAR，使异种器官移植向前迈进了一大步。然而，利用GGTA1敲除（GTKO）猪进行猪到非人灵长类的心脏、肾脏等异种移植尽管GTKO在一定程度上克服了HAR，但受体最终因急性血管排斥反应（Acutevascular rejection, AVR）引起的血栓微血管病而死。2016年，Mohiuddin等用GTKO/CD39/CD46/CD47/CD55/EPCR 6基因修饰的供体猪进行了2例猪到狒狒的异位心脏移植，一只狒狒存活了46天，另一只狒狒存活了143天。同年，该团队使用抗CD40抗体对移植了GTKO/hCD46/hTBM三基因修饰猪心脏的狒狒进行治疗，狒狒平均存活时间为298天，最长存活时间可达945天。2018年，Längin等对上述研究结果加以改进，通过非缺血性保存GTKO/hCD46/hTBM修饰的猪心脏，采用原位移植方式移植后辅以免疫抑制剂的同时加入替西罗莫司抑制心脏过度生长，心脏可在狒狒体内正常发挥功能，且最长存活达到195天。这些猪的心脏仅仅进行了GGTA1、hCD46和hTBM三基因修饰便达到了良好的移植效果，而这也并非最佳的基因组合修饰，修饰所采用的方法也未必能控制基因在体内的表达水平。为此，一种适合心脏异种移植供体猪的构建将为异种器官移植研究开辟新的途径，将助推心脏异种移植取得阶段性成果，如敲除α-1,3-半乳糖苷转移酶（GGTA1）基因可避免超急性免疫排斥反应发生，敲除猪内源性逆转录病毒（PERVs）基因可避免病毒的跨物种感染，解决了异种移植的生物安全问题，但异种心脏移植后的免疫学不相容性和凝血等功能性障碍更需关注。因此，一种适合心脏异种移植供体猪的构建必将对开展心脏异种器官移植的研究和推广应用具有重要的意义。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种适合心脏异种移植供体猪的构建方法，本方法只需再前期已构建的GTKO/CMAHKO/B4GaINT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰基础供体猪的基础上，再定点插入hCD39和hTBM两个心脏特异修饰基因，尽可能地避免心脏异种移植的免疫排斥反应及凝血功能障碍，对增加猪到非灵长类异种心脏器官移植的成功率具有重要的意义，可促进心脏异种移植的临床转化和应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种适合心脏异种移植供体猪的构建方法，具体步骤为：
1）敲除引起抗原抗体免疫排斥反应的三个主要抗原基因
在上述猪成纤维细胞系基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个引起免疫排斥反应的主要抗原基因；
2）定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因
在上述GTKO/CMAHKO/B4GaINT2KO三基因修饰的基础上，再定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，获得GTKO/CMAHKO/B4GaINT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰的猪成纤维细胞系；
3）体细胞核移植和胚胎移植
利用体细胞核移植技术，将筛选获得的GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因细胞系进行体细胞核移植和胚胎移植，待妊娠时取出胎儿鉴定胎儿基因的编辑情况，分离培养获得六基因修饰的异种移植基础供体猪胎儿成纤维细胞系；
4）在上述基础猪胎儿成纤维细胞的Rosa26位点再定点插入hCD39和hTBM两个心脏特异修饰的基因，经细胞筛选、体细胞核移植和胚胎移植后获得多基因修饰的心脏异种器官移植供体猪；
5）对上述所获得的多基因修饰的心脏异种移植供体猪进行功能验证，获得适合心脏异种移植的供体猪。
步骤4）中，在异种器官移植基础供体猪的基础上，针对异种心脏移植面临的免疫排斥和凝血功能障碍，采用基于基因定点插入策略，再将调控心脏免疫及凝血功能的特异基因hCD39和hTBM定点插入修饰，获得心脏异种移植的供体猪。
步骤5）中，对多基因修饰的心脏异种移植供体猪所进行的功能验证主要包括人血清介导的细胞毒性实验、人补体介导的细胞毒性实验、补体激活实验、抗原抗体结合分析、细胞免疫组化分析、凝血相关检测和淋巴细胞活性检测等。
本发明公开了一种适合心脏异种移植供体猪的构建方法，在初步解决异种移植生物安全、免疫学不相容性及功能性障碍三大共性问题的基础上，该方法采用针对心脏异种移植适合的基因组合修饰策略，在GTKO/CMAHKO/B4GaINT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰基础供体猪的基础上，再定点插入hCD39、hTBM两个基因进行修饰，最大限度地减少移植免疫排斥反应及凝血功能性障碍，这对开发真正有效的心脏异种移植供体猪具有重要的意义。
附图说明
图1是本发明的流程图。
具体实施方式
实施例1
一种适合心脏异种移植供体猪的构建方法，具体操作过程按以下步骤进行：
1）敲除引起免疫排斥反应的三个主要抗原基因
在猪胎儿成纤维细胞系的基础上，利用CRISPR/Cas9技术敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个主要引起免疫排斥反应的抗原基因；
2）定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因
在上述GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO三基因修饰的基础上，再定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，构建获得GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰的猪成纤维细胞系；
3）体细胞核移植和胚胎移植
利用体细胞核移植技术，将筛选获得的GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因细胞系进行体细胞核移植和胚胎移植，待妊娠时取出胎儿鉴定基因编辑情况，分离培养获得六基因修饰的异种移植基础供体猪成纤维细胞系；
4）在上述分离培养的基础猪胎儿成纤维细胞的Rosa26位点再定点插入hCD39和hTBM两个心脏特异的修饰基因，筛选获得GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46/hCD39/hTBM猪成纤维细胞系再进行体细胞核移植和胚胎移植，构建获得多基因修饰的心脏异种器官移植供体猪。
步骤4）中，在异种器官移植基础供体猪的基础上，针对异种心脏移植面临的免疫排斥和凝血功能障碍，采用基因定点插入策略，再将调控心脏免疫及凝血功能的特异基因hCD39和hTBM定点插入修饰，获得心脏异种移植的供体猪。
实施例2
一种适合心脏异种移植供体猪的构建方法，具体操作过程按以下步骤进行：
1）敲除引起免疫排斥反应的三个主要抗原基因
在猪胎儿成纤维细胞系的基础上，利用CRISPR/Cas9技术敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个引起免疫排斥反应的抗原基因；
2）定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因
在上述GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO三基因修饰的基础上，再定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，构建获得GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰的猪成纤维细胞系；
3）体细胞核移植和胚胎移植
利用体细胞核移植技术，将筛选获得的GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因细胞系进行体细胞核移植和胚胎移植，待妊娠时取出胎儿鉴定基因编辑情况，分离培养获得六基因修饰的异种移植基础供体猪成纤维细胞系；
4）在上述分离培养的基础猪胎儿成纤维细胞的Rosa26位点再定点插入
hCD39和hTBM两个心脏特异修饰的基因，筛选获得GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46/hCD39/hTBM多基因修饰猪成纤维细胞系再进行体细胞核移植和胚胎移植，构建出多基因修饰的心脏异种器官移植供体猪；
5）对构建出的多基因修饰的心脏异种器官移植供体猪进行功能验证，获得适合心脏异种器官移植的供体猪；
6）对获得的多基因修饰的心脏异种器官移植供体猪进行主要包括人血清介导的细胞毒性实验、人补体介导的细胞毒性实验、补体激活实验、抗原抗体结合分析、细胞免疫组化分析、凝血相关检测和淋巴细胞活性检测等的功能验证。
利用实施例中构建的一种适合心脏异种移植的供体猪，在初步解决了异种移植生物安全性、抗原免疫排斥及器官功能性障碍等问题的基础上，再将调控心脏凝血功能的hCD39和hTBM基因定点插入，获得GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46/hCD39/hTBM多基因共同修饰的适合心脏异种移植的供体猪，该基因组合编辑策略科学合理，使心脏异种移植的成功率更高，将极大地促进心脏异种器官移植的研发进程，对利用基因组合修饰策略来开发真正有效的异种心脏移植供体猪具有重要的应用价值。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (2)
1.一种适合心脏异种移植供体猪的构建方法，其特征在于：具体步骤为：
1）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除引起抗原免疫排斥反应的三个主要基因
在猪成纤维细胞系的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除引起抗原免疫排斥反应的GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个基因；
2）定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因
在上述GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO三基因敲除的基础上，再定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，获得GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰的猪成纤维细胞系；
3）体细胞核移植和胚胎移植
利用体细胞核移植技术，将筛选获得的GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因细胞系进行体细胞核移植和胚胎移植，待妊娠时取出胎儿鉴定胎儿基因的编辑情况，分离培养获得六基因修饰异种器官移植基础供体猪胎儿成纤维细胞系；
4）在上述基础猪胎儿成纤维细胞的Rosa26位点再定点插入hCD39、hTBM两个心脏特异修饰基因，经细胞筛选、体细胞核移植和胚胎移植获得多基因修饰的心脏异种移植供体猪；
5）对步骤4）所获得的多基因修饰的心脏异种移植供体猪进行功能验证，获得适合心脏异种移植的供体猪。
2.根据权利要求1所述的一种适合心脏异种移植供体猪的构建方法，其特征在于：步骤5）中，功能验证包括人血清介导的细胞毒性实验、人补体介导的细胞毒性实验、补体激活实验、抗原抗体结合分析、细胞免疫组化分析、凝血相关检测和淋巴细胞活性检测。
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