CN102550486B - 一种nod/scid小鼠异种移植物抗宿主病模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种NOD/SCID小鼠异种移植物抗宿主病模型的建立方法，通过制备活化的人PBMCs，NOD/SCID小鼠造模，小鼠人白细胞数量含量植入检测，小鼠GVHD靶器官的病理表现建立。本发明通过应用环磷酰胺药物联合抗小鼠CD122单克隆抗体预处理代替亚致死剂量辐照方法建立一种人源化NOD/SCID小鼠GVHD模型。该模型具有模拟临床上化疗预处理的异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病的特点；建模型效率高，重复性好；造模过程简单易行；弥补了国内很多研究中心缺乏辐照相关的仪器设备而不能进行相关研究的缺陷，能为在活体动物内进行人类免疫系统GVHD研究提供实验平台。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种NOD/SCID小鼠异种移植物抗宿主病模型的建立方法。建立具有模拟临床异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病特点的疾病模型，可为研究移植物抗宿主病的发生机制和诊疗方法提供研究平台。
背景技术
移植物抗宿主病（GVHD）是异基因造血干细胞移植后的主要并发症和死亡原因，成为阻碍移植成功的关键因素。降低或减轻GVHD的发生及程度相关的体外、动物模型和临床研究显得尤为迫切。目前大部分GVHD动物模型建立在不同H-2抗原不合的小鼠间移植，与人类造血干细胞移植后发生的GVHD存在一定的差异。近年来人源化免疫系统NOD/SCID小鼠的出现为在活体内进行人类免疫功能研究提供了可能。人源化免疫系统NOD/SCID小鼠是指在小鼠体内建立人的免疫系统，该小鼠能够提供研究人免疫系统的体内实验平台，对研究开发疫苗、药物试验、肿瘤防治和移植排斥反应等方面具有重要意义。人源化NOD/SCID小鼠GVHD模型为GVHD研究提供了很好的疾病模型，经典的该模型建立过程中首先需要对NOD/SCID小鼠进行亚致死剂量辐照预处理，接着输注一定数量的人外周血单个核细胞（PBMCs）。亚致死剂量的辐照能够抑制宿主的固有免疫，同时增加植入细胞所需要的龛位，所以亚致死剂量辐照是人源化NOD/SCID小鼠GVHD模型成功建立的关键，但是国内很多研究中心缺乏辐照相关的仪器设备从而限制了该模型的广泛应用。为此，本发明中我们应用环磷酰胺药物联合抗小鼠CD122单克隆抗体预处理代替亚致死剂量辐照并回输在体外预先用植物血凝素（PHA）活化的人PBMCs的方法建立了人源化NOD/SCID小鼠GVHD模型，为国内大多数研究中心能够开展该模型相关研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种NOD/SCID小鼠异种移植物抗宿主病模型的建立方法，通过以下步骤实现：
（1）活化的人PBMCs制备：取正常志愿者外周血标本，肝素抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640重悬细胞至细胞终密度为2×106/mL，加入PHA和白介素-2（IL-2）共培养7天后准备小鼠尾静脉输注用；
（2）NOD/SCID小鼠造模：实验前1周从上海斯莱克实验动物有限责任公司购买6周龄无特定病原体（SPF）级NOD/SCID雄性小鼠，饲养于SPF级层流柜中，饲料及饮用水均经无菌处理，并在饮用水中加入庆大霉素（32×104U/L）和红霉素（250mg/L）。小鼠输入活化的人PBMCs当天作为第0天，第0天前面的时间均以“-”表示。于-3至-1天进行环磷酰胺联合抗小鼠CD122单克隆抗体预处理，预处理后小鼠分为两组，每组6只，一组为实验组，一组为对照组。实验组小鼠中每只输入制备好的活化人PBMCs，对照组小鼠尾静脉输注磷酸盐缓冲液。之后每天定期观察小鼠体重、腹泻、皮肤GVHD表现（毛发脱落、红斑等）、活动情况等。
（3）小鼠人白细胞数量含量植入检测：于第10天从小鼠尾静脉取血50μL，小鼠血进行抗人CD45FITC标记，流式细胞术检测人CD45阳性白细胞数量含量；取小鼠脾脏，制备单细胞悬液，进行抗人CD45FITC标记，流式细胞术检测人CD45阳性白细胞含量。
（4）小鼠GVHD靶器官的病理表现：待小鼠自然死亡后，取小鼠的肝脏、小肠和肾脏等各个器官进行常规石蜡包埋、切片，常规苏木素-伊红（HE）染色，查看各脏器中GVHD病理表现，并用抗人CD45单克隆抗体对各脏器进行免疫组化检测，查看人淋巴细胞在各脏器中的浸润情况。
本发明通过应用环磷酰胺药物联合抗小鼠CD122单克隆抗体预处理代替亚致死剂量辐照方法建立一种人源化NOD/SCID小鼠GVHD模型。其具有如下特点：（1）该模型具有模拟临床上化疗预处理的异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病的特点；（2）建模型效率高，重复性好；（3）造模过程简单易行；（4）弥补了国内很多研究中心缺乏辐照相关的仪器设备而不能进行相关研究的缺陷，能为在活体动物内进行人类免疫系统GVHD研究提供实验平台。
附图说明
图1是对照组小鼠和实验组小鼠中分离的外周血细胞、脾细胞和骨髓细胞的流式分析图。
图2是对照组和实验组小鼠处死后分离的肝脏、小肠和肾脏的病理活检HE染色图。
图3是对照组和实验组小鼠肝脏、小肠和肾脏组织的抗人CD45单克隆抗体免疫组化图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。本实验所用NOD/SCID小鼠均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，药物环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司，抗小鼠CD122单克隆抗体和抗人CD45FITC单克隆抗体购自eBioscience公司，人IL-2购自Peprotech公司，PHA购自广州市医药工业研究所。本实验重复了6只NOD/SCID小鼠，均取得了类似结果。
实施例1活化的人PBMCs制备
1、在15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液；
2、取肝素抗凝人外周静脉血10mL与等量Hank's液充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面，水平离心600g×20分钟；
3、离心后见管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带；
4、用滴管插到云雾层，吸取单个核细胞，置入另一15mL离心管中，加入5倍体积的Hank's液，300g×5分钟离心，洗涤细胞2次；末次离心后，弃上清，用含10%FBS的RPMI1640培养液重悬细胞，调整细胞密度至2×106/mL；
5、细胞悬液中加入250U/mL的IL-2和100μg/mL的PHA，置于37℃的CO2培养箱中培养7天以备下一步使用。
实施例2NOD/SCID小鼠造模
1、于‐3至‐1天对NOD/SCID小鼠进行预处理，预处理方案为：‐3天、‐2天分别腹腔注射（或灌注）环磷酰胺50mg/kg/天，‐1天腹腔注射抗小鼠CD122单克隆抗体100μg/只；
2、第0天在实验组小鼠中每只从尾静脉输注（或灌注）制备好的活化人PBMCs1×107共0.2mL，对照组小鼠中每只从尾静脉输注（或灌注）磷酸盐缓冲液0.2mL；
3、每天定期观察小鼠体重、腹泻、皮肤GVHD表现（毛发脱落、红斑等）、活动情况等。
实施例3小鼠人白细胞数量含量植入检测
1、取肝素抗凝小鼠血1mL，或脾细胞悬液1mL（细胞总数106），加氯化铵溶液（NH4Cl:8.99g/L,KHCO3:1g/L,Na4-EDTA:0.037g/L）3mL裂解红细胞，混匀，37℃作用10分钟后300g离心5分钟，弃上清；
2、用1×磷酸盐缓冲液40μL重悬细胞，加入抗CD45FITC单克隆抗体20μL，充分混匀，4℃避光孵育30分钟；
3、用1×磷酸盐缓冲液2mL洗涤2次，每次洗涤后倾倒用滤纸吸干管口液体；
4、加入500μL1×磷酸盐缓冲液重悬细胞，流式细胞仪上机检测；应用CELL-QUEST软件每管获取10000个细胞，以人CD45阳性作为人白细胞的表型特征，计算人CD45阳性细胞占总有核细胞的百分含量。检测结果发现小鼠外周血中CD45阳性人白细胞占总有核细胞的54.0%，小鼠脾细胞中CD45阳性人白细胞占总有核细胞的84.4%，小鼠骨髓细胞中CD45阳性人白细胞占总有核细胞的21.7%。结果参见图1，其中对照组是未经任何处理的NOD/SCID小鼠，实验组是经环磷酰胺和抗小鼠CD122单克隆抗体预处理后回输体外活化的人PBMCs后NOD/SCID小鼠。以上结果说明人外周血白细胞能在经环磷酰胺和抗小鼠CD122单克隆抗体预处理的NOD/SCID小鼠体内获得较高水平的植入。图中百分数指人白细胞在总有核细胞中的数量百分含量。
实施例3小鼠GVHD靶器官的病理检测
1、固定：取各脏器组织切成小块，10%中性福尔马林溶液内固定24小时；1×磷酸盐缓冲液洗5分钟，5次；
2、脱水：把固定好的组织标本分别在70%乙醇1小时，80%乙醇1小时，95%乙醇Ⅰ1小时，95%乙醇Ⅱ2小时，95%乙醇Ⅲ2小时，100%乙醇Ⅰ1小时和100%乙醇2小时；
3、透明：将脱水后标本分别在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中放置10分钟和20分钟；
4、浸蜡：经透明后的组织放入熔化的石蜡中浸透，反复3次，每次0.5-1小时；
5、包埋：在包埋器中倒人熔化的新石蜡，在其凝固之前迅速放入组织块，放入前要分清组织的各个面，将所需断面朝下；包埋有腔组织时，把组织平放或立放；
6、切片：在切片机上切下4μm切片，在37摄氏度水浴展开，并捞于免疫组化专用玻片上；在60摄氏度烤箱中烘烤4小时；
7、脱蜡：把切片放置与二甲苯I、II各5分钟；
8、进水：把切片分别放置于100%、95％、85％、75%、50%乙醇中各5分钟，放置于自来水5分钟；
9、HE染色：把切片放于苏木素中5分钟，1％盐酸水溶液分化数秒钟（3～4秒），流水冲洗后放置于0.5％伊红乙醇溶液中1分钟；
10、脱水：将切片放置于85％、95％乙醇各数秒钟，100％乙醇I、II各1分钟；
11、二甲苯中放置数秒透明，采用中性树胶封片；
12、光学显微镜下观察HE染色组织切片，结果发现小鼠肝脏、小肠、肺脏和肾脏中均可见大量淋巴细胞浸润，尤以肝脏和肺脏组织最为明显，肝脏组织可见肝细胞水肿、坏死，小肠腺体可见破坏；结果参见图2；
13、应用抗人CD45单克隆抗体对组织切片进行免疫组化检测，同HE染色一样先对石蜡切片进行脱蜡和进水；
14、抗原修复:切片放入已预热的0.01M柠檬酸缓冲液（PH6.0）内煮沸20分钟，自然冷却20分钟；
15、用3%过氧化氢室温孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；
16、应用蒸馏水冲洗切片，磷酸盐缓冲液中浸泡5分钟；
17、除去磷酸盐缓冲液,每张切片加1滴或50uL正常非免疫动物血清,封闭，室温下孵育10分钟，倾去血清，勿洗，滴加1：100稀释的抗人CD45单克隆抗体（用磷酸盐缓冲液稀释），4摄氏度湿盒过夜；
18、磷酸盐缓冲液冲洗切片，每次5分钟，共3次；
19、滴加Envision工作液，室温中放置30分钟
20、磷酸盐缓冲液冲洗切片，每次5分钟，共3次；
21、除去PBS液,每张切片加2滴或100uL新鲜配制的DAB溶液,显微镜下观察3-10分钟；
22、自来水冲洗,苏木素复染1分钟,自来水冲洗返蓝；
23、将切片放置于85％、95％乙醇各数秒钟，100％乙醇I、II各1分钟，二甲苯中放置数秒透明，采用中性树胶封片；
24、光学显微镜下观察各切片中CD45阳性人白细胞的浸润情况；观察结果发现小肠、肝脏和肾脏中均可见大量CD45阳性人白细胞浸润，尤以小肠和肝脏最多。结果参见图3。
Claims (2)
1.一种NOD/SCID小鼠异种移植物抗宿主病模型的建立方法，通过以下步骤实现：
（1）活化的人PBMCs制备：取正常志愿者外周血标本，肝素抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640重悬细胞至细胞终密度为2×106/mL，加入PHA和白介素-2共培养7天；
（2）NOD/SCID小鼠造模：实验前1周取6周龄无特定病原体级NOD/SCID雄性小鼠，饲养于SPF级层流柜中，饲料及饮用水均经无菌处理，并在饮用水中加入庆大霉素32×104U/L和红霉素250mg/L，小鼠输入活化的人PBMCs当天作为第0天，第0天前面的时间均以“-”表示，于-3至-1天进行环磷酰胺联合抗小鼠CD122单克隆抗体预处理，预处理后小鼠分为两组，每组6只，一组为实验组，一组为对照组，实验组小鼠中每只输入制备好的活化人PBMCs，对照组小鼠输入磷酸盐缓冲液，之后每天定期观察小鼠体重、腹泻、皮肤GVHD表现、活动情况；
（3）小鼠人白细胞数量含量植入检测：于第10天取小鼠血50μL，小鼠血进行抗人CD45 FITC标记，流式细胞术检测人CD45阳性白细胞数量含量；取小鼠脾脏，制备单细胞悬液，进行抗人CD45 FITC标记，流式细胞术检测人CD45阳性白细胞含量；
（4）小鼠GVHD靶器官的病理表现：待小鼠自然死亡后，取小鼠的肝脏、小肠和肾脏等各个器官进行常规石蜡包埋、切片，常规苏木素-伊红染色，查看各脏器中GVHD病理表现，并用抗人CD45单克隆抗体对各脏器进行免疫组化检测，查看人淋巴细胞在各脏器中的浸润情况。
2.根据权利要求1所述的一种NOD/SCID小鼠异种移植物抗宿主病模型的建立方法，其特征在于，步骤（2）皮肤GVHD表现是指毛发脱落、红斑。
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