CN105722975A - 出生后造血内皮细胞及其分离和应用 - Google Patents

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Abstract

本文提供了一种分离并鉴定出生后造血内皮细胞的方法。进一步提供了基本上纯的出生后造血内皮细胞群、出生后造血内皮细胞的组合物、和在对象使用造血内皮细胞再生造血系统的方法。

Description

出生后造血内皮细胞及其分离和应用
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年11月13日申请的美国临时申请61/956,194的优先权，其全部并入本文。
背景技术
在鼠科动物的发育过程中，定向造血干细胞(HSC)起源于主动脉-性腺-中肾(AGM)区内的背主动脉(North,T.E.等,Immunity16:661-672(2002)；deBruijn,M.F.等,EMBOJ192:465-2474(2000)；Medvinsky,A.etal.,Cell86:897-906(1996))。在包括斑马鱼、鼠类以及或许人类的脊椎动物中，HSC被认为从内衬背主动脉底部和脐带动脉的造血血管细胞层出现(Zovein,A.C.等,CellStemCell3:625-636(2008)；Boisset,J.C.等,Nature464:116-120(2010)；Bertrand,J.Y.等,Nature464:108-111(2010)；Kissa,K.等,Nature464:112-115(2010))。胚胎内发育中内皮细胞(EC)和HSC前体细胞的密切联系已产生了造血作用的EC-造血转化理论(Zovein,A.C.等,CellStemCell3:625-636(2008))。尽管已知HSC和定向红系/髓系祖细胞(EMP)产生自包含造血EC的多个位点，但仍然难以表征驱动原始造血EC向造血祖细胞个体自发发育转化的分子模式(Chen,M.J.等,Nature457:887-891(2009)；North,T.E.等,Cell137:736-748(2009))。不过通常公认在出生后不发生从头造血。
已显示在哺乳动物发育过程中，转化中的EC/HEC为CD144+CD45+，但是HSC从胚胎HEC出现后不久CD144(又被称为VE-钙粘蛋白)的表达就下调了(North,T.E.etal.,Immunity16:661-672(2002))。Kim等(Blood106:903-905(2005))进一步发现胚胎E13.5天时鼠类胎肝HSC上存在的CD144表达，在胚胎E16.5天表达下降，成年后在肝脏和骨髓的HSC中缺失。因此已知CD144+CD45+的转化中的EC/HEC仅存在于胚胎，出生后显示不存在。出生后造血内皮细胞是否存在于生物体某处，以及出生后内皮细胞是否能够产生新的HSC和/或多潜能造血祖细胞是未知的。
在出生后哺乳动物中鉴定具有造血潜能的细胞将为再生造血系统开启新的可能性。
发明概述
本文公开了通过从出生后对象分离CD144+CD45+细胞来分离出生后造血内皮细胞(HEC)的方法。这样的HEC移植进入接受者后能够产生造血细胞。在一个实施方案中，CD144+CD45+细胞分离自对象的肝脏、脾、骨髓、血液、脐带、皮肤、肾、肌肉、或者肺，优选分离自对象的肝脏。可以分离HEC以形成基本上纯的CD144+CD45+细胞群。
在另一实施方案中，分离步骤进一步包括基于选自以下的至少一个另外的标志物的表达选择细胞：CD180、趋化因子C-X-C基序受体2(CXCR2)、趋化因子C-X-C基序受体3(CXCR3)、趋化因子C-X3-C基序受体1(CX3CR1)、趋化因子C-C基序受体9(CCR9)、G蛋白偶联受体141(GPR141)、G蛋白偶联受体174(GPR174)、信号淋巴细胞激活分子家族成员(SignalingLymphocyteActivationMoleculeFamilymember)7(SLAMF7)、信号淋巴细胞激活分子家族成员9(SLAMF9)、整合素αL(ITGAL)、整合素αX(ITGAX)和跨膜4-结构域亚族A成员6D(membrane-spanning4-domain,subfamilyA,member6D)(MS4A6D)。
本文进一步考虑包含基本上纯的CD144+CD45+出生后HEC群的组合物。在一个实施方案中，所述HEC是考虑施用所述组合物的对象自体的。在另一实施方案中，所述HEC是考虑施用所述组合物的对象异体的。在另一实施方案中，CD144+CD45+出生后HEC与药物学可接受的载体混合，或者是与合适的培养基混合，或者是与冷冻保护剂混合。
本文进一步公开了用于免疫缺陷性疾患的治疗方法，其中所述治疗包括向需要的对象施用基本上纯的CD144+CD45+出生后造血内皮细胞群。所述免疫缺陷性疾患可以选自T-细胞缺陷、B-细胞缺陷、T-细胞/B-细胞联合缺陷、抗体缺陷、补体缺陷、白血病、淋巴瘤、贫血、嗜中性白细胞减少症、淋巴细胞减少症、狼疮、和威斯科特-奥尔德里奇综合征。所述免疫缺陷性疾患可以是施用免疫抑制剂或细胞毒素剂、或人类免疫缺陷病毒(HIV)或肝炎感染引起或导致的。
本文进一步公开了在出生后对象中鉴定造血内皮细胞(HEC)的方法，涉及鉴定对象内CD144+CD45+的细胞。鉴定HEC的方法可以进一步包括鉴定表达选自以下至少一个另外的标志物：CD180、趋化因子C-X-C基序受体2(CXCR2)、趋化因子C-X-C基序受体3(CXCR3)、趋化因子C-X3-C基序受体1(CX3CR1)、趋化因子C-C基序受体9(CCR9)、G蛋白偶联受体141(GPR141)、G蛋白偶联受体174(GPR174)、信号淋巴细胞激活分子家族成员7(SLAMF7)、信号淋巴细胞激活分子家族成员9(SLAMF9)、整合素αL(ITGAL)、整合素αX(ITGAX)和跨膜4-结构域亚家族成员6D(MS4A6D)。
附图说明
图1A-1B。出生后小鼠中内皮细胞的时间限制基因示踪。A.具有内皮特异性VE-钙粘蛋白启动子控制下的它莫西芬-可诱导cre-重组酶CreERT2的转基因小鼠(VCC-CreERT2小鼠)与ACTB-loxp-tdTmomato-STOP-loxp-EGFP报道基因小鼠杂交以产生可诱导VCC-EGFP报道基因小鼠(iVCC-EGFP)。B.它莫西芬注射诱导了血管床内衬表达VE-钙粘蛋白的内皮细胞中的EGFP表达。左侧图显示iVCC-EGFP小鼠皮肤内tdTomato(红色)的表达。中间图显示它莫西芬诱导后(出生后3周)与左侧图所示相同区域的EGFP表达(绿色)。右侧图显示左侧图和中间图的叠加。只有脉管结构显示EGFP表达。
图2A-2C。CD144+CD45+细胞发现于包括肝脏、脾、肺和骨髓的组织中。出生后4周用它莫西芬诱导iVCC-EGFP小鼠。A.从诱导的小鼠收集的几个器官的分析显示CD144+CD45+内皮细胞存在于肺、肝脏、脾、和骨髓。B.分选的CD144+CD45+细胞的亮视场图像。比例尺，400μm。C.与B相同视野的绿色荧光图像，显示CD144+CD45+细胞也是GFP+。如B和C可见，分选的细胞不像普通内皮细胞那样贴附于培养板表面，并且不像普通造血祖细胞那样在有造血细胞因子存在时铺展。
图3A-3C。CD144+CD45+内皮细胞能够功能重建造血系统。SSC，侧散射光。FSC，前散射光。BM，骨髓。PB，外周血。A.出生后6周(成年小鼠)用它莫西芬诱导iVCC-EGFP小鼠，诱导后两周用于实验。用抗-CD144+抗体注射小鼠，注射后8分钟处死。消化肝脏，用抗CD31和CD45抗体后染色。采用FACS分选CD144+GFP+CD31+CD45+细胞(红色区域)，并移植入免疫受损的亚-致死剂量照射的小鼠(NOD-SCID-IL2g("NSG")小鼠)。B.移植后12周，测试小鼠外周血供体细胞的存在。其外周血的显著部分(>35％)由供体GFP+CD45.2+细胞(绿色区域)组成(NSG小鼠表达CD45.1表面蛋白)。C.从初级接受者的骨髓分离GFP+CD45.2+细胞并用于二次移植进入亚-致死剂量照射(650RAD)的表达CD45.1的小鼠(非-NSG)。移植后19周，在二次接受者外周血中检测到CD45.2+GFP+细胞(绿色区域)。这些实验证实CD144+CD45+内皮细胞是造血的(HEC)，并且当体内移植时能够重建造血系统。
图4A-4D。全转录组深度测序显示CD144+CD45+内皮细胞的造血特征。A.用它莫西芬诱导6周龄(成年)iVCC-EGFP小鼠，并在诱导后两周注射抗-CD144+抗体。消化肝脏，用抗-CD45抗体后染色。采用FACS(中图中的绿色门)分选CD144+GFP+CD45+(左图中的红色门)和CD144+GFP+CD45-(左图中的蓝色门)内皮细胞。分选的细胞用于总RNA提取。RNA用于全转录组深度测序(RNA-Seq)。B.比较CD144+GFP+CD45+和CD144+GFP+CD45-内皮细胞的全转录组序列，显示CD144+GFP+CD45+内皮细胞内一群基因(红点)上调(log2[CD144+GFP+CD45+/CD144+GFP+CD45-]>3)。C.分析上调的基因(最小表达，蓝色；最大表达，红色)展现了一组代表其他出生后HEC表面标志物的细胞表面表达蛋白(在CD144+CD45+细胞中显示最大表达，在CD144+CD45-细胞中显示最小表达)。D.分析其他出生后HEC表面标志物显示这些标志物在发育过程中在已知与定向造血、尤其是AGM相关的区域出现的造血细胞/造血内皮细胞通常是上调的(显示最大/红色表达模式)。
图5。从人肝脏样品发现并分离CD144+CD45+细胞。分析人肝脏活检CD144+CD45+和CD144+CD45-细胞的存在。大部分CD144+细胞也是CD45+，类似于小鼠肝脏。左图中红色门对应于右图中红色轮廓图。左图中蓝色门对应于右图中蓝色图。
发明详述
本发明提供一种之前未知的能够产生造血细胞的出生后哺乳动物中的造血内皮细胞(HEC)库，和能够从其他细胞类型分离HEC的表面标志物。HEC发现于几种器官的内皮细胞层，并且具有用于治疗造血疾病的重建免疫系统的能力。
造血内皮细胞
“造血内皮细胞”(HEC)是具有产生包括造血干细胞的造血细胞能力的内皮细胞。本文公开的HEC具有移植(建立定居)和在移植进入接受者、例如免疫受损对象后提供长期的造血细胞再增殖的能力。所公开的HEC也能够从一个接受者后续移植到一个或多个其他接受者，并因此保持再生免疫系统的能力。用于治疗造血疾病的细胞群体非常需要能够长期移植(例如移植后4周、8周、12周、16周或20周或更长)和二次移植的能力。
本文公开的HEC能够通过标志物CD45(分化簇45，也称为蛋白酪氨酸磷酸酶，受体类型C或者白细胞共同抗原/LCA)和CD144(分化簇144，也称为血管-内皮钙粘蛋白或VE-钙粘蛋白)的表达而界定。CD144+CD45+表达表明是HEC，并且这种标志物组合之前未在任何出生后对象的细胞类型中鉴定过。
除了CD144+CD45+之外，进一步可选地通过一个或多个选自以下的另外的标志物界定HEC：CD180、趋化因子C-X-C基序受体2(CXCR2)、趋化因子C-X-C基序受体3(CXCR3)、趋化因子C-X3-C基序受体1(CX3CR1)、趋化因子C-C基序受体9(CCR9)、G蛋白偶联受体141(GPR141)、G蛋白偶联受体174(GPR174)、信号淋巴细胞激活分子家族成员7(SLAMF7)、信号淋巴细胞激活分子家族成员9(SLAMF9)、整合素αL(ITGAL)、整合素αX(ITGAX)和跨膜4-结构域亚族A成员6D(MS4A6D)。优选地，所述细胞显示一个或多个这些另外的标志物的阳性表达。除了CD144+CD45+表达之外，能够通过1、2、3、4、5、6、7、8个或所有这些标志物的表达而界定HEC。在一个实施方案中，HEC被界定为CD144+CD45+SLAMF9+CXCR1+细胞。
HEC具有一些内皮细胞(EC)的特征，例如，表达EC标志物CD144，并且可选的，表达EC标志物CD31(也称为血小板内皮细胞粘附分子-1或PECAM-1)。HEC也能够发现于器官和组织的普通内皮细胞层，临近EC。然而，不像普通EC在培养中贴附于明胶包被和其他包被表面，HEC在培养中不贴附于包被表面，例如明胶包被的表面。
“造血干细胞”(HSC)是能够产生造血细胞(HC)的细胞。HSC能够通过Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-CD45+(人HSC)和Lin-cKit+Scal+Flk2-CD34-Slamf1+(鼠类HSC)的表达而被界定。
“造血细胞”包含髓系细胞，其包括红细胞、单核细胞、巨噬细胞、巨核细胞、成髓细胞、树突细胞、和粒细胞(嗜碱粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞)；和淋巴系细胞，其包括T淋巴细胞/T细胞、B淋巴细胞/B细胞和自然杀伤细胞。本文公开的HEC具有产生HSC和HC的能力，包括髓系细胞和淋巴系细胞。
HEC具有HSC的一些特征，例如HEC能够产生新的HC。然而，不像HC和HSC，在使用标准浓度的造血细胞因子(例如SCF(干细胞因子)、TPO(血小板生成素)、FLT3L(Flt-3配体)和IL-3(白介素-3))的用于培养HSC的通常条件下未发现HEC铺展。
鉴定HEC
本文公开了在出生后对象内鉴定造血内皮细胞(HEC)的方法。该方法涉及鉴定出生后对象内的CD144+CD45+细胞。该方法可以进一步涉及鉴定CD144+CD45+并且也显示表达一或多个另外的标志物的细胞，特别是表达1、2、3、4、5、6、7、8个、或更多选自CD180、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、CCR9、GPR141、GPR174、SLAMF7、SLAMF9、ITGAL、ITGAX和MS4A6D的标志物。鉴定可以是体内的或体外的，例如使用结合细胞表面标志物的抗体或其抗原结合片段，其缀合至显像部分例如荧光或磁性试剂、放射性同位素或其他合适的显像剂。
在一个实施方案中，使用体内显像法能在个体内检测特异结合和标记的抗体，所述显像法包括但不限于放射性核素显像、正电子发射断层扫描、计算机轴向断层扫描、X-射线或磁共振成像方法、荧光检测和化学发光检测。
分离HEC
本文公开了分离出生后HEC的方法。该方法涉及从出生后对象的至少一个组织分离CD144+CD45+细胞。该方法可以进一步涉及分离CD144+CD45+并且也显示一个或多个另外的标志物表达的细胞，特别是1、2、3、4、5、6、7、8个、或更多选自CD180、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、CCR9、GPR141、GPR174、SLAMF7、SLAMF9、ITGAL、ITGAX和MS4A6D的标志物的表达。
术语“分离的”和“纯化的”在本文中可交换使用，指基本上或本质上从其天然环境离开或浓缩的材料。例如，如果细胞基本上从其在对象中被发现时通常靠近的其他内源细胞类型、组织和材料离开，则该细胞被分离。根据细胞表面标志物的表达纯化和分离细胞类型的方法是已有记录的方法。“基本上分离的”细胞或细胞群体是至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或更多从对象组织中发现的其他细胞类型、组织或材料分离的细胞或细胞群体。当细胞样品中至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或更多细胞表达感兴趣的细胞表面标志物时，细胞或细胞群体也是“基本上纯化的”。
HEC能够从全身的组织和器官分离，包括但不限于肝脏、脾、骨髓、血液、脐带、皮肤、肾、肌肉、或肺。优选组织包括肝脏、血液、脐带和皮肤。在一个实施方案中，HEC从获得自组织或器官活检的生物样品中分离。在另一实施方案中，HEC分离自血液或血浆样品。自体HEC分离自待施用HEC的相同对象。异体HEC分离自至少一个与待施用HEC的对象相同物种的个体。异种HEC分离自至少一个与待施用HEC的对象不同物种的个体。非自体HEC(即，异体或异种HEC)可以来源于出生前、出生后或死后组织或器官。优选HEC是自体的。优选非自体HEC是异体的出生后HEC。最优选HEC是自体的和出生后的。
作为第一步，根据CD144+CD45+表达，可选地与一个或多个上述另外的标志物组合，从组织、器官或生物样品分离HEC。根据细胞表面标志物的表达分离(isolate)或分开(separate)细胞的方法包括：通过使用例如针对CD144和CD45的抗体或其片段，和可选的使用针对另外的标志物的其他抗体或其片段的荧光激活细胞分选；磁分离，使用例如抗体包被的磁珠；使用抗体或其片段的亲和色谱；使用连接至固相基质(例如板或其他固相基质)的抗体或其片段“淘选”(panning)；或其他本领域已知的和使用的基于细胞表面标志物表达分离细胞的技术。在优选实施方案，荧光激活细胞分选或磁性分离用于从非HEC分离HEC。
HEC的分离产生基本上纯的CD144+CD45+细胞群。如本文所述，CD144+CD45+细胞的“基本上纯的群”指分离/分开步骤后多于50％、多于60％、多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、多于98％、多于99％或甚至100％的细胞是CD144+CD45+。
培养、维持和冻存HEC
分离后，HEC能够用标准人/哺乳动物细胞培养基在培养物中维持多达一周，例如RPMI1460、最小必需培养基(MEM)，或杜氏改良培养基(DMEM)(每一种这些和类似培养基可通过例如Gibco/LifeTechnologies获得)，添加有血清，例如5-30％，优选10-25％，最优选20％血清，例如胎牛/小牛血清(FBS或FCS)，和一或多个用于内皮细胞的生长添加剂，例如2-200μg/mL内皮细胞生长添加剂(ECGS)。在优选实施方案，HEC维持于含20％FCS和2-200μg/mlECGS的RPMI1640培养基中1至7天，优选4至72小时或1、2、3或4天，接着使用本文公开的冻存方法冷冻保存直至需要。
HEC的培养需要特别的条件，因为使用用于培养内皮细胞或造血细胞的标准方法，这些细胞生存和增殖不好或者根本无法生存和增殖。优选培养条件可以包括在饲养细胞(例如骨髓基质或胎儿/胚胎器官特异性(肝脏)纤维母细胞)层上培养HEC。
分离的HEC可以使用本领域已知的用于细胞冻存的技术冻存。HEC可以分离后直接地、或者如上所述在培养条件下维持后、或者在培养物中增殖后冷冻保存。相应地，在一个实施方案中，HEC可以从对象分离并冷冻，直至确定对象需要治疗免疫缺陷性疾患时，这时HEC可以解冻并移植回该对象(用于自体移植)或解冻并移植至需要治疗的不同对象(用于非自体移植)。
可以通过添加一种或组合冷冻保护剂例如二甲基亚砜(DMSO)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、右旋糖酐、蔗糖、乙二醇、无旋光赤藓醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨糖醇、无旋光肌醇、D-乳糖、氯化胆碱、氨基酸、甲醇、乙酰胺、甘油一乙酸酯和无机盐准备冷冻保存分离的HEC。添加血浆或血清(例如至浓度20-25％)可以增加DMSO的保护效果。HEC可以在例如具有40-60％血清和5-20％DMSO的60-40％上述生长培养基(例如RPMI1650、MEM或DMEM)中冷冻。在一个实施方案中，HEC在具有10％DMSO的50％生长培养基、50％FCS(胎牛血清)中冷冻。
与冷冻保护剂混合的分离的HEC应该以受控速率冷却用于冷冻保存。不同冷冻保护剂和不同细胞类型具有不同的优化冷却速率。用于操作、冻存和长期保存HSC源的注意事项和步骤是本领域已知的。解冻和冷冻细胞源重建的注意事项也是本领域已知的。
分离和纯化的HEC群及其组合物
本发明进一步包括基本上纯的CD144+CD45+出生后造血内皮细胞群，其中分离/分开步骤后多于80％、多于85％、多于90％、多于91％、多于92％、多于93％、多于94％、多于95％、多于96％、多于97％、多于98％、多于99％、多于99.5％、或甚至100％的细胞是CD144+CD45+。
还考虑了包括基本上纯的CD144+CD45+出生后HEC群的组合物。在一个实施方案中，所述基本上纯的CD144+CD45+出生后HEC群与至少一种例如上述冷冻保护剂包括在组合物中。在这种组合物中的细胞可以是冷冻或非冷冻状态。在另一实施方案，所述基本上纯的CD144+CD45+出生后HEC群与合适的培养基包括在组合物中，例如公开的用于体外维持HEC的培养基。在另一实施方案中，所述基本上纯的CD144+CD45+出生后HEC群与适合于施用给对象的药物学可接受的载体包括在组合物中。
本文使用的短语“药学可接受的”是指载体、或媒介物，当施用给哺乳动物时不引起副反应。这样的载体是非毒性的，并且在机体内不造成炎性或无变应性反应。实施本发明的药物学可接受的载体包括熟知成分，例如培养基和磷酸缓冲盐。其他药物学可接受的载体及其剂型是熟知的并且在例如Remington'sPharmaceuticalScience(18thEd.,ed.Gennaro,MackPublishingCo.,Easton,Pa.,1990)和theHandbookofPharmaceuticalExcipients(4thed.,Ed.Roweetal.PharmaceuticalPress,Washington,D.C.)中概述，其每一份通过引用并入本文。
CD144+CD45+出生后造血内皮细胞的组合物的例子包括用于肠道外、皮下、皮肤内、肌肉内或静脉注射(例如可注射施用)的液态制剂，例如无菌混悬剂或乳剂。这样的组合物可以与合适的载体、稀释液或赋形剂混合，例如无菌水、生理盐水、葡萄糖等等。所述组合物也可以是冻干的。根据施用路径和所需制剂，所述组合物可以包含辅料，例如润湿或乳化剂、pH缓冲试剂、凝胶或增加粘度添加物、防腐剂、调味剂、颜料等等。
还提供单位剂量形式的、包含所述分离的HEC的预装注射瓶、安瓿或输液袋。所述注射瓶、安瓿或输液袋可以包括1×104至1×1010HEC、1×105至1×109HEC、或1×106至1×108HEC。
本发明的组合物以与剂型相配的形式和治疗有效剂量施用。待施用的量取决于例如待治疗的对象和衰弱，对象器官、细胞和免疫系统接纳所述治疗组合物的能力，以及细胞或组织治疗的特性等。治疗组合物施用所需的精确量取决于医生的判断，并且每个个体是不同的。然而，本发明的治疗组合物的合适剂量可以是大约每剂量1×104-1×1010HEC、或大约每剂量1×105-1×109HEC、或大约每剂量1×106-1×108HEC的范围，取决于施用的路径。用于初次施用和继续施用的合适治疗方案也是不同的，但是可以包括初始施用，然后以一个或多个小时或天为间隔随后注射或另外施用重复剂量。
治疗的方法
本文进一步提供治疗免疫缺陷性疾患的方法，该方法包括给有需要的对象施用具有基本上纯的CD144+CD45+HEC群的组合物。本发明的HEC可以用于例如但不限于放射治疗和化疗后在免疫受损对象中重建全部造血细胞。施用所公开的HEC，例如通过注入或移植至对象，可以增加或代替例如肝脏、胰腺、肾、肺、神经系统、肌肉系统、骨、骨髓、胸腺或脾的干细胞或祖细胞。应该理解，对宿主进行处理以减少供体细胞的免疫排斥也许是必需的。
优选的所述公开方法可治疗的疾病包括以免疫细胞数量或活性不足为特征的免疫缺陷性疾患。所述免疫缺陷性疾患可以是原发性或继发性的。在一个实施方案，所述免疫缺陷性疾患是选自以下的原发性免疫缺陷性疾患：T-细胞、B-细胞、或T-细胞/B-细胞联合免疫缺陷，例如重症联合免疫缺陷(SCID)；抗体缺陷，例如丙种球蛋白缺乏症；补体缺陷，例如狼疮；白血病；淋巴瘤；贫血，例如重度再生障碍性贫血；嗜中性白细胞减少症；淋巴细胞减少症；或任何与免疫缺陷相关的状况，例如威斯科特-奥尔德里奇综合征。在另一实施方案，所述免疫缺陷性疾患是与包括人类免疫缺陷病毒(HIV)或肝炎的传染病相关的继发性免疫缺陷性疾患。在另一实施方案，所述免疫缺陷性疾患是与施用免疫抑制剂相关的继发性免疫缺陷性疾患，例如氟尿嘧啶、长春新碱、顺铂、奥沙利铂、甲氨蝶呤、3'-叠氮-3'-脱氧胸苷、紫杉醇、多西紫杉醇、蒽环抗生素、或其具有继发性免疫抑制效果的混合物。
本文使用的术语“对象”和“患者”可交换使用，是指动物，包括哺乳动物，例如非灵长类(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长类(例如猴和人)。在特定实施方案中，所述对象是出生后的，即所述对象是例如新生动物、幼年动物、青年动物、成年动物或者老年动物。
本文使用的“治疗”是指试图改变治疗的个体或细胞的疾病进程的临床干预。治疗的治疗效果无限制的包括预防疾病复发、减轻症状、消除疾病的任何直接的或间接的病理影响、降低疾病进程的速率、改善或缓和疾病状态、和缓解或改善预后。本文使用的术语“治疗有效量”和“有效量”可交换使用，指足以治疗所述免疫状况的本发明组合物的量。
关于给患者施用本文提供的HEC，有效量的细胞可以从少至几百或更少到多至数百万或更多。应该理解的是待施用HEC的数量将根据待治疗的疾病的特性而不同，包括但不限于待治疗的大小或总体积，以及接受者的需要和状况，还有其他医疗专业人员熟悉的因素。在一些实施方案中，向对象或个体施用或移植每100公斤人104和1010之间的细胞。本文提供的HEC可以例如使用本领域已知的方法通过静脉注射或直接移植施用或移植。
在一个实施方案中，HEC用于在骨髓移植中增加或替代骨髓细胞。目前人类自体和异体骨髓移植用作例如白血病和淋巴瘤的治疗方法。然而，这些方法的缺点是必须分离大量供体骨髓以确保有足够的细胞用于移植。本发明通过用HEC替代或补充骨髓捐赠用于移植入接受者，降低或消除对大量骨髓捐赠的需求。HEC可以是对象自体的，或者是对象异体的，或者是对象异种的。
在另一实施方案，通过输液施用HEC至血流。
在另一实施方案，通过移植施用HEC至器官，例如肝脏、脾、肾、肺、眼睛、中枢神经系统、肌肉、皮肤、骨、卵巢、睾丸、心脏、血管、小肠或淋巴结。
在一些实施方案，提供细胞的单次施用。在其他实施方案，使用多次施用。可以在周期性的时间段提供多次施用，例如连续3至7天的初始治疗方案，接着在其他时间重复。
进一步考虑了涉及共同施用的方法，即，施用可能耗竭对象免疫系统或免疫应答的治疗之前、之后或同时施用本发明的组合物。这些方法涉及在包括癌症治疗和用免疫抑制剂治疗的治疗之前、之中和/或之后给对象施用含有HEC的组合物。术语“癌症治疗”包括施用任意癌症试剂，包括放射性同位素和细胞毒素剂。细胞毒素剂的例子包括但不限于maytansinoids、钇、铋、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、二羟基蒽二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、莫迪素A链、α帚曲毒蛋白、白树毒素、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、卡里奇毒素、肥阜草抑制剂和糖皮质激素及其他化疗试剂。免疫抑制剂的例子包括环孢霉素、GAD65抗体、氟二氧嘧啶、顺铂、奥沙利铂、甲氨蝶呤、3'-叠氮-3'-脱氧胸苷、紫杉醇、紫杉萜、蒽环抗生素、或其具有继发性免疫抑制效果的混合物。本文所指的几种细胞毒素剂也是免疫抑制剂。
本发明进一步通过以下非限制性实施例阐述。
实施例
实施例1.产生具有CD144启动子控制下的可诱导Cre-重组酶表达的小鼠。具有内皮特异性VE-钙粘蛋白启动子控制下的它莫西芬-可诱导的Cre-重组酶CreERT2的转基因小鼠(VCC-CreERT2小鼠)(PitulescuM.等,Nat.Protoc.5:1518-1534(2010))与ACTB-loxp-tdTmomato-STOP-loxp-EGFP报道基因小鼠(MuzumdarM.等,Genesis45:593-605(2007))杂交(图1A)。ACTB-loxp-tdTomato-STOP-loxp-EGFP报道基因由鸡β-肌动蛋白核心启动子和CMV增强子(pCA)驱动的loxP，以及侧翼的膜靶向串联二聚体Tomato(membrane-targetedtandemdimerTomato)(tdTomato)组成，导致膜定位tdTomato(一种红色应该蛋白)表达。在杂交子代中(可诱导的VCC-EGFP报告基因小鼠或"iVCC-EGFP小鼠")，注射它莫西芬诱导Cre-重组酶在细胞内表达，细胞内VE-钙粘蛋白/CD144表达被激活的。Cre-重组酶介导染色体内重组，引起CD144表达细胞内loxP位点处的tdTomato的切除(并失去红色荧光)。tdTomato的切除使得pCA启动子驱动膜定位增强绿色荧光蛋白的表达，从而通过绿色荧光鉴定其中CD144在它莫西芬诱导之后表达开启的细胞。这使得能够以时间限制形式示踪内皮细胞。
出生后4周用它莫西芬诱导iVCC-EGFP小鼠(在3周断奶龄小鼠被视为成年小鼠)。由图1B可见，它莫西芬注射诱导了VE-钙粘蛋白表达细胞内EGFP的表达。图1B左图显示tdTomato(红色)在iVCC-EGFP小鼠的皮肤内表达。中图显示它莫西芬诱导后与左图所示相同区域的EGFP表达(绿色)。右图显示左图和中图的叠加。只有脉管系统显示EGFP表达。
实施例2.从肝脏、脾、肺和骨髓分离的出生后CD144+CD45+细胞。从出生后4周用它莫西芬诱导的iVCC-EGFP小鼠收集的几个器官的分析显示在肺、肝脏、脾、和骨髓存在CD144+CD45+内皮细胞(图2A)。
使用标准技术分选CD144+(GFP+)CD45+细胞，并铺板用于在明胶包被的组织培养板上体外培养，使用添加了20％FCS、2-200μg/ml内皮细胞生长添加剂(ECGS)和用于铺展造血细胞的细胞因子(SCF、TPO、FLT3L、IL6和IL3)的RPMI1640培养基(图2B)。分选的细胞不像普通内皮细胞那样贴附于明胶包被的组织培养表面。分选的细胞也不像普通造血祖细胞那样对造血细胞因子起反应或有造血细胞因子存在时铺展。这表明所分离的细胞并不是真的内皮细胞，它们也不是标准造血细胞。
实施例3.CD144+CD45+内皮细胞能够功能性重建造血系统。出生后6周(成年小鼠)用它莫西芬诱导iVCC-EGFP小鼠，诱导后两周用于实验。为了标记CD144+内皮细胞(动脉、静脉和毛细管)，用抗-CD144+抗体眶周注射小鼠。注射后8分钟处死注射的小鼠以排除淋巴血管床的标记。这使得可以双标记CD144+内皮细胞－遗传性(通过它莫西芬诱导VE-钙粘蛋白启动子驱动CRE重组酶的表达)和通过使用抗CD144+抗体活体染色CD144+内皮细胞。如NolanD.J.等,DevCell26:204-219(2013)所述消化肝脏。简单地说，切碎肝脏，并与胶原酶A(25mg/ml)、分散酶II(25mg/ml)和DNase(250mg/ml)(Roche)在37℃孵育20-30分钟，以建立单细胞悬液。消化后，用抗-CD45抗体和抗-CD31(另一内皮特异性表面标志物)后染色细胞。
采用FACS分选CD144+GFP+CD31+CD45+细胞，并移植入免疫受损的亚-致死剂量照射的小鼠(NOD-SCID-IL2g或"NSG"小鼠)(图3A)。移植12周后，测试移植小鼠外周血中供体细胞的存在。其外周血的显著部分(>35％)由供体GFP+CD45.2+细胞组成(NSG小鼠表达CD45.1表面蛋白)(图3B)。从初级接受者的骨髓分离GFP+CD45.2+细胞并二次移植进入亚-致死剂量照射(650RAD)的表达CD45.1的小鼠(非-NSG)。移植后19周，在二次接受者外周血中检测到CD45.2+GFP+细胞。这些实验证实CD144+CD45+内皮细胞是造血的(HEC)，并且当体内移植时能够重建造血系统(图3C)。
实施例4.鉴定区别HEC的另外的标志物。为了鉴定能够进一步从包括但不限于肝脏的供体组织表征HEC的其他表面标志物，比较了CD144+CD45+肝脏细胞和CD144+CD45-肝脏细胞的全转录组谱。在出生后6周(成年小鼠)用它莫西芬诱导iVCC-EGFP小鼠并在诱导后两周用于实验。为了标记CD144+内皮细胞，用抗-CD144+抗体眶周注射小鼠，并在注射后8分钟处死。如上所述所述消化肝脏，并用抗-CD45抗体后染色。使用FACS分选CD144+GFP+CD45+和CD144+GFP+CD45-内皮细胞。分选的细胞用于总RNA提取。RNA用于全转录组深度测序(RNA-Seq))(图4A)。
比较CD144+GFP+CD45+和CD144+GFP+CD45-内皮细胞的全转录组序列，显示CD144+GFP+CD45+内皮细胞内一个独立集群的基因(图4B红点)过表达(log2[CD144+GFP+CD45+/CD144+GFP+CD45-]>3)。分析过表达基因(图4B)显示一组另外的细胞表面表达蛋白能够可选地用于进一步界定CD144+GFP+CD45+HEC(图4C)。
分析所述新的出生后HEC表面标志物显示这些标志物在发育过程中在已知与定向造血、特别是胎盘、AGM和胎肝相关的区域中出现的造血细胞/造血内皮细胞内通常上调(McKinney-FreemanS.等,CellStemCell11:701-14(2012))(图4D)。
实施例5.从人肝脏分离CD144+CD45+细胞。研究了成年人类肝脏内CD144+CD45+HEC的存在。分析了来自三个身份未知成年个体的人类肝脏组织样品中CD144+CD45+和CD144+CD45-细胞的存在。令人惊讶地，大部分CD144+细胞也是CD45+，类似于小鼠肝脏(图5)。这证明HEC存在于成年人中。

Claims (18)

1.一种分离出生后造血内皮细胞(HEC)的方法，包括从出生后对象分离CD144+CD45+细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述HEC移植进入接受者后能够产生造血细胞。
3.权利要求1的方法，其中所述CD144+CD45+细胞分离自所述对象的肝脏、脾、骨髓、血液、脐带、皮肤、肾、肌肉、或肺。
4.权利要求3的方法，其中所述细胞分离自所述对象的肝脏。
5.权利要求1的方法，其中分离的HEC包括在基本上纯的CD144+CD45+出生后细胞群中。
6.权利要求1的方法，其中所述分离步骤进一步包括基于选自以下至少一个另外的标志物的表达选择细胞：CD180、趋化因子C-X-C基序受体2(CXCR2)、趋化因子C-X-C基序受体3(CXCR3)、趋化因子C-X3-C基序受体1(CX3CR1)、趋化因子C-C基序受体9(CCR9)、G蛋白偶联受体141(GPR141)、G蛋白偶联受体174(GPR174)、信号淋巴细胞激活分子家族成员7(SLAMF7)、信号淋巴细胞激活分子家族成员9(SLAMF9)、整合素αL(ITGAL)、整合素αX(ITGAX)和跨膜4-结构域亚族A成员6D(MS4A6D)。
7.一种组合物，包含基本上纯的CD144+CD45+出生后造血内皮细胞(HEC)群。
8.权利要求7的组合物，其中所述HEC是考虑施用所述组合物的对象自体的。
9.权利要求7的组合物，其中所述HEC是考虑施用所述组合物的对象异体的。
10.权利要求7的组合物，其中所述组合物包括与药物学可接受的载体混合的CD144+CD45+出生后HEC。
11.权利要求7的组合物，其中所述组合物包括与培养基混合的CD144+CD45+出生后HEC。
12.权利要求7的组合物，其中所述组合物包括与冷冻保护剂混合的CD144+CD45+出生后HEC。
13.一种治疗免疫缺陷性疾患的方法，包括向需要的对象施用基本上纯的CD144+CD45+出生后造血内皮细胞群。
14.权利要求13的方法，其中所述免疫缺陷性疾患选自T-细胞缺陷、B-细胞缺陷、T-细胞/B-细胞联合缺陷、抗体缺陷、补体缺陷、白血病、淋巴瘤、贫血、嗜中性白细胞减少症、淋巴细胞减少症、狼疮和威斯科特-奥尔德里奇综合征。
15.权利要求13的方法，其中所述免疫缺陷性疾患是施用免疫抑制剂或细胞毒素剂的结果。
16.权利要求13的方法，其中所述免疫缺陷性疾患是人类免疫缺陷病毒(HIV)或肝炎感染的结果。
17.在出生后对象内鉴定造血内皮细胞(HEC)的方法，包括鉴定所述对象内的CD144+CD45+细胞。
18.权利要求17的方法，进一步包括鉴定选自以下至少一个另外的标志物的表达：CD180、趋化因子C-X-C基序受体2(CXCR2)、趋化因子C-X-C基序受体3(CXCR3)、趋化因子C-X3-C基序受体1(CX3CR1)、趋化因子C-C基序受体9(CCR9)、G蛋白偶联受体141(GPR141)、G蛋白偶联受体174(GPR174)、信号淋巴细胞激活分子家族成员7(SLAMF7)、信号淋巴细胞激活分子家族成员9(SLAMF9)、整合素αL(ITGAL)、整合素αX(ITGAX)和跨膜4-结构域亚族A成员6D(MS4A6D)。
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