KR100935335B1 - 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지를이용한 조혈 세포의 생체 내 제조방법 및 조혈 세포 증식을위한 동물 바이오리엑터 - Google Patents
면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지를이용한 조혈 세포의 생체 내 제조방법 및 조혈 세포 증식을위한 동물 바이오리엑터 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 이식하는 단계; 및 얻어진 돼지의 장기로부터 분화 또는 증식된 조혈 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 이식하여 얻어진, 조혈 세포 증식용 돼지를 제공한다.
돼지, 면역억제제, 방사선 조사, 제대혈, 조혈 줄기 세포
Description
본 발명은 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지를 이용한 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법에 관한 것이다. 또한, 또한, 본 발명은 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 이식하여 얻어진, 조혈 세포 증식용 돼지에 관한 것이다.
난치성 또는 불치성 조혈질환인 백혈병을 비롯한 다양한 조혈질환을 치료할 수 있는 유일한 방법으로서 현재까지 주로 골수이식을 통한 치료 기술이 시행되어 왔다. 골수이식을 통한 치료는 조혈 줄기 세포에 근거한 것으로 밝혀졌으며, 상기 조혈 줄기 세포는 골수 속에 존재하고, 자신과 동일한 분화 및 증식능력인 자기복제(Self-renewal)을 보유하고 있으며 15가지 이상의 성숙한 기능성 조혈 세포를 만 들 수 있는 능력인 다 분화 능력(Multi-potential)을 지니고 있다.
최근의 급격한 출산율 저하 및 고령화 현상과 더불어 골수를 포함한 세포 및 장기 제공자의 절대적인 부족현상은 심각한 사회문제로 대두되고 있다. 또한 헌혈자의 부족 및 인식도의 감소 현상은 날로 심각해지고 있으며 이로 인한 임상 현장에서의 고초는 날로 더해져만 가고 있다.
조혈 줄기 세포는 배아 발달과정에서 태아간장조직에서 분화 발달하여 분만과 함께 골수 조직내로 이동하여 정착해, 일생동안 사람의 생명유지를 위해 필수적인 혈액 세포인 적혈구와 백혈구 및 혈소판을 생산한다.
백혈병을 비롯한 수많은 조혈질환 치료제로서의 성공적인 임상이식 결과를 얻기 위해서는 조혈 줄기 세포를 포함하는 조혈 세포의 대량 배양 기술개발이 필수적이다. 최근의 조혈 줄기 세포의 증식과 대량 배양을 위해서는 시험관과 생체를 이용한 조혈 줄기 세포의 특성 규명 연구와 더불어 조혈 줄기 세포의 증식과 분화를 조절하는 다양한 조혈 인자의 규명 및 기능 분석 연구가 보고되고 있다.
최근의 조혈 줄기 세포의 유전자 발현을 통한 자기복제 조절과 이를 이용한 줄기세포의 대량 배양 기술 개발로서, Notch 유전자의 발현 유도를 통한 미분화 상태로의 조혈 줄기 세포의 증식과 유지에 관한 연구가 보고되고 있으며, 또한 전사인자 유전자인 AML-1, Ikaros, SCL/Tal-1, Rbtn-2, GATA-2와 HOX homoebox 유전자 등이 대표적인 조혈 줄기 세포의 자기복제기능 조절에 관여하고 있다는 사실이 밝혀졌다 (Orkin. Divesification of haematipoietic stem cells to specific lineages. Nat Rew Genet. 2000.1(1): 57-64. Cristinal et al., Hematooietic stem cell expansion and distict myeloid developmental abnormalities in a murine modlel of the AML1-ETO translocation. Mol. Cell. Bio. 2002. 22(15). 5506-5517. Nichogiannopoulou et al. Defects in hematopoietic stem cell activity in Ikaros mutant mice. J. Exp. Med. 1999. 190(9). 1201-1214. GATA-2 plays two functionally distict roles during the ontogeny of hematopoietic stem cells. J. Eep. Med. 2004. 200(7), 871-882).
특히 HOXB4 유전자를 과발현시킨 조혈 줄기 세포는 생체 내에서 장기간에 걸친 조혈 재생 능력(Long-term repopulating cells)을 지닌 세포를 증식시킬 수 있으며 또한 다양한 성숙 조혈세포로 분화할 수 있는 세포 분화 능력도 보유하고 있다 (Antonchuk et al., HOXB4-induced expansion of adult hematooietic stem cells ex vivo. Cell. 2002. 109(1): 39-45).
조혈 줄기 세포의 분열 및 자기복제 유도를 통한 시험관 배양 방법으로서 조혈지지세포와의 배양을 통한 줄기세포 대량배양 법인 LTCIC (long-term culture-initiating cell assay)와 Cobblestone are-forming cell(CAFC), HPP-CFC(high proliferative potential colony-forming cell), colony-forming unit-blast(CFU-BI)방법 등이 있다. 또한 조혈 인자를 이용한 시험관 조혈 줄기 세포의 대량 배양이 시도되었는데, 대표적인 조혈 줄기 세포의 증식 유도 능력을 지닌 인자로서 SCF(stem cell factor)와 FL(flt3/flt2 ligand)와 다른 조혈 인자인 IL(interleukin)-16, IL-11, IL-12, LIF(Leukemiainhibitory factor)와 TPO(thrombopoietin)과의 조합을 통한 조혈 줄기 세포 및 전구세포의 증식 유도가 주로 시도되었고, 또한 조혈 인자와 조혈지지세포와의 공동 작용을 통한 조혈 줄기세포의 증식 유도 시도가 이루어졌으나, 조혈 줄기 세포의 자기 복제 및 증식을 충분히 유도하지는 못하였다(Nakahata et al., Hemopoietic colony-forming cells in umbilical cord blood with extensive capavility to generate mono- and multipotential hemopoietic progenitors. J. Clin. Invest. 1982. 70. 1324-1328), Methology of long-term culture of human hematopoiesis. J. Tissue Cult. Methods. 1991. 13: 55-62).
사람 조혈 줄기 세포의 In vivo 배양 방법으로서 마우스와 같은 동물모델을 이용한 방법이 이용되고 있다. 1988년에 선천성 면역결핍마우스인 SCID(Severe Combined Immunodeficiency)를 이용해 사람의 골수 존재 조혈 줄기 세포를 이용한 생체 이식 연구가 최초로 이루어졌으며, 최근에의 다양한 실험동물모델이 개발되었으며, 이러한 모델로서 beige(Lyst bg , bg), nu와 X-linked immunodeficiency (Btk xid , xid)인 bg -nu-xid 마우스가 개발되었으며, 또한 recombination activating gene-1(Rag1)과 Rag2 유전자 결핍으로 인한 T 세포와 B 세포의 결핍마우스 등이 있다. 이러한 다양한 선천성 면역결핍 마우스를 이용해 사람의 조혈 줄기 세포의 생체 이식을 통하여 이종 동물모델 생체 내에서의 증식과 분화 유도 연구가 시행되었다(Greiner et al., SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem Cells. 1988. 16. 166-177, Christianson et al., Enhanced human CD4+ T cell engraftment in beta-2 microglobulin-deficient NOD-scid mouse, J. Immunol. 1997. 158, 3578-3586, Shinkai et al., RAG-2-deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement. Cell 1992. 68. 855-867).
면역결핍 마우스를 이용한 사람 조혈 줄기 세포의 생체 이식을 통한 생체 증식 방법과 더불어 대 동물을 이용한 사람 조혈 줄기 세포의 생체이식방법이 개발되었고, 대표적인 대 동물로서 양을 비롯해서 원숭이를 이용한 사람 조혈 줄기 세포의 in utero 생체 이식 기술이 있으며, 이는 태아 40-45일경의 자궁에 존재하는 태아 양은 면역세포의 분화되지 않은 면역부전 상태로서 이식한 사람의 조혈 줄기 세포에 대한 면역거부반응을 나타내지 않아 정상적인 이종 모델 생체에서의 증식과 분화가 유도됨이 관찰되었다. 또한 사람의 신경줄기세포(NSC)를 복부에 이식하여 조혈 세포로의 분화를 유도하는 연구가 진행된 바 있다(Almeida-Porada et.al., In vivo haematopoietic potential of human neural stem cells. Br. J. Haematol. 2005. 130(2):276-83. Zanjani et al., Hematopoietic chimerism in sheep and nonhuman primates by in utero transplantation of fetal hematopoietic stem cells. Blood cells. 1991. 17, 349-363), McNiece et. al., Ex vivo expanded cord blood cells provide rapid engraftment in fetal sheep but lack long-term engrafting potential. Exp. Hematol. 2002. 30(6):612-6.).
돼지를 이용해 사람의 심근 세포를 추출하여 돼지의 심장에의 이식을 시행하여 돼지 생체 조직에서의 사람 심근 세포의 증식과 분화를 분석한 결과 약 7개월 이상의 장기간에 걸쳐 사람 세포의 생착이 관찰한 연구결과가 보고된 바 있다 ( Husnain et. al., Myolbast transplantatin for cardiac repair using transient immunosuppression. Basic Appl. Myol.13(1):45-52, 2003).
현재 대두되고 있는 심각한 난치성 및 불치성 질환 치료 방법으로서, 줄기세포를 이용한 세포 치료제 개발과 장기배양을 통한 치료 기술 개발에 대한 중요성과 필요성이 전 세계적으로 대두되고 있다. 배아줄기세포를 필두로 한 줄기세포에 대한 연구는 면역거부반응과 종양 형성이라는 난 과제를 해결해야 임상적용이 가능하다. 그러나, 조혈 줄기 세포와 신경 줄기 세포 등과 같이 성체 조직에 존재하는 성체 줄기 세포는 자가 세포이식을 통하여 배아줄기세포가 지니고 있는 단점과 문제점을 극복할 수 있는 대안 세포로서 주목되고 있다. 또한 장기이식은 돼지를 이용한 방법이 시도되고 있으며, 이는 돼지가 사람의 장기 제공원으로서 장기의 크기, 번식효율, 사육기술, 인체감염가능성을 고려할 때에 가장 적합한 장기 제공 동물로서 인식되고 있어, 국내 연구진을 포함한 국외에서도 다양한 장기 이식 돼지의 개발이 시도되고 있다.
한편, 본 발명자들은 면역세포만이 선택적으로 억제된 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법, 즉, 어린 돼지(piglet)에 특정 흡수선량으로 전신 방사선 조사(total body irradiation, TBI)를 실시함으로써, 적혈구 등의 생존에 필요한 혈구의 혈중 농도에는 유의성 있는 변화를 미치지 않으면서 백혈구 및 CD4+ T 및 CD8+ T세포 등의 면역세포만을 선택적으로 감소시킨 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법을 개발한 바 있다 (대한민국 특허출원 제10-2006-0097071호, 2006년 10월 24일자 출원, 미공개).
본 발명자들은 선행 연구 결과를 바탕으로, 임상에 적용할 수 있는 조혈 세포의 생체 내 제조방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이식하였을 때, 돼지의 다양한 조직에서 상기 조혈 줄기 세포의 분화 또는 증식이 유도됨으로써, 이를 분리할 경우 임상에 적용 가능한 조혈 세포를 제조할 수 있으며, 또한 상기 돼지가 조혈 세포의 동물 바이오리엑터(animal bioreactor)로서 활용될 수 있음을 발견하였다. 이는 면역이 억제된 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지가 생체 내에서 조혈 줄기 세포의 분화 또는 증식을 유도한다는 것으로, 매우 놀라운 것이다.
따라서, 본 발명은 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포의 이식을 포함하는, 분화 또는 증식된 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 이식하여 얻어진, 조혈 세포 증식용 돼지를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, (a) 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함 하는 단핵구 세포를 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산(erythropoietin-produceable) 형질전환 돼지에 이식하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 돼지의 장기로부터 분화 또는 증식된 조혈 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법이 제공된다.
상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지는 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 약 4 주령의 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 300 ∼ 500 cGY, 바람직하게는 약 400 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하여 얻은 돼지일 수 있으며, 상기 방사선은 X-선, γ-선, 또는 전자빔일 수 있다. 또한, 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지는 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 약 4 주령의 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 면역억제제, 바람직하게는 사이클로스포린 A(Cyclosporin A)를 투여하여 얻은 돼지일 수 있다. 또한, 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지는 상기 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 방사선 조사 및 면역억제제 투여를 시행하여 얻어진 돼지일 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포는 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포일 수 있으며, 상기 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포는 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포일 수 있다. 또한, 단계(a)의 상기 이식은 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지의 골수에 주입함으로써 바람직하게 수행될 수 있으며, 단계(b)의 상기 돼지의 장기는 심장, 간장, 폐, 신장, 골수, 또는 말초혈액 등일 수 있으며, 바람직하게는 말초혈액일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산(erythropoietin-produceable) 형질전환 돼지에 이식하여 얻어진, 조혈 세포 증식용 돼지가 제공된다.
본 발명의 조혈 세포 증식용 돼지에 있어서, 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지는 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 약 4 주령의 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 300 ∼ 500 cGY, 바람직하게는 약 400 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하여 얻은 돼지일 수 있으며, 상기 방사선은 X-선, γ-선, 또는 전자빔일 수 있다. 또한, 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지는 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 약 4 주령의 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 면역억제제, 바람직하게는 사이클로스포린 A(Cyclosporin A)를 투여하여 얻은 돼지일 수 있다. 또한, 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지는 상기 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 방사선 조사 및 면역억제제 투여를 시행하여 얻어진 돼지일 수 있다.
또한, 본 발명의 조혈 세포 증식용 돼지에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포는 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포 또는 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포가 바람직하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 이식은 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지의 골수에 주입함으로써 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라, 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이식할 경우, 돼지의 생체 내에서 상기 조혈 줄기 세포의 분화 또는 증식이 유도됨으로써, 이를 분리할 경우 임상에 적용가능한 조혈 세포를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따라, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 이식하여 얻어진, 조혈 세포 증식용 돼지는 분화 또는 증식된 조혈 세포와 돼지의 세포가 공존하는 키메라 장기를 갖는 조혈 세포 증식용 바이오리엑터(bioreactor)로서 기능할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 조혈 세포 증식용 돼지는 조혈 세포를 생체에서 지속적이고 안정적으로 공급할 수 있는 생체 바이오리엑터(bioreactor)로서 활용될 수 있다.
본 발명은 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산(erythropoietin-produceable) 형질전환 돼지에 이식하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 돼지의 장기로부터 분화 또는 증식된 조혈 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법을 포함한다.
상기 "에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지"는 에리스로포이에 틴(erythropoietin, EPO)을 발현하도록 형질전환된 돼지로서, 공지의 제조방법 즉 대한민국 특허등록 제10-0358754호 또는 대한민국 특허공개 제10-2007-0081531호에 따라 제조된 형질전환 돼지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 형질전환 돼지는 인간으로부터 채취된 인간의 EPO 게놈유전자(genome DNA)를 생쥐의 유선으로부터 2.6kb의 WAP 프로모터를 중합효소연쇄반응을 이용하여 크로닝한 후, hEPO와 SV40 poly A 유전자로 EPO 형질전환 발현 벡터를 구축한 후 돼지의 수정란에 과배란 유도제 호르몬인 임마혈청성 성선자극 호르몬(eCG) 및 태반융모성 성선자극 호르몬(hCG)을 근육내 주사하여 과배란을 유기하여 발정 확인 자연종부를 시킨 후, 1 세포기 수정란을 회수하여 상기에서 나타난 유전자(DNA)를 매니퓰래이터를 이용하여 웅성 전핵에 주입한 후 즉시 대리모 돼지에 이식시킨 후, 상기 대리모 돼지를 통하여 분만된 형질전환 돼지일 수 있다.
본 발명의 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법에 있어서, 상기 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지의 면역 억제는 본 발명자들의 선행 연구에 의해 개발된 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법(대한민국 특허출원 제10-2006-0097071호, 2006년 10월 24일자 출원, 미공개)에 따라 수행할 수 있다. 즉, 어린(약 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 4 ∼ 6 주령, 더욱 바람직하게는 약 4 주령) 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 특정 흡수선량으로 전신 방사선 조사(total body irradiation, TBI)를 실시하여 얻어진 돼지를 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 방사선 조사에 의해 얻어진 돼지는 적혈구 등 생존에 필요한 혈구의 혈중 농도에는 유의성 있는 변화를 미치지 않으면서 백혈구 및 CD4+ T 및 CD8+ T세포 등의 면역세 포만이 선택적으로 감소된 혈액분석학적 양상(hematological profile)을 나타낸다.
상기 방사선 조사에 의해 얻어진 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 있어서, 상기 흡수선량은 300 ∼ 500 cGY, 더욱 바람직하게는 약 400 cGY일 수 있으며, 상기 방사선은 X-선, γ-선, 또는 전자빔일 수 있다. 상기 전신 조사(total body irradiation) 방법은 의료 분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 실시할 수 있으며, 별도로 제한되지 않는다. 예를 들어, 방사선 조사를 위해 전신을 고정시킨 후 방사선 조사기의 중앙에 위치시켜, 배면과 복면에 각각 방사선을 조사하여 방사선 전신 조사를 실시할 수 있다.
또한, 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지는 어린(약 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 4 ∼ 6 주령, 더욱 바람직하게는 약 4 주령) 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 사이클로스포린 A(Cyclosporin A) 등의 면역억제제를 투여하여 얻은 돼지일 수 있다. 상기 면역억제제의 투여는 면역거부반응을 억제할 수 있는 함량 및 투여방법이 사용될 수 있으며, 특히 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 면역억제제의 투여는 정맥주입 등에 의해 투여될 수 있으며, 면역억제제인 사이클로스포린 A는 2-15 mg/kg, 바람직하게는 2-7 mg/kg, 더욱 바람직하게는 5 mg/kg의 양을 매일 한 번씩 2주 동안 정맥 주입함으로써 면역을 억제시킬 수 있다.
또한, 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지는 상기한 바와 같이 방사선 조사 및 면역억제제 투여를 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 동시에 시행함으로써 얻어진 돼지를 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포는 인간의 골수, 제대혈, G-CSF나 GM-CSF 투여를 통하여 골수조직으로부터 말초혈액으로 줄기세포의 세포 이동을 유도해서 채취된 사이토카인 유도 말초혈액 등의 성체 세포에서 유래된 것을 제한 없이 사용할 수 있다. 이 중, 침습적이지 않고 쉽게 얻을 수 있으며, 면역거부반응이 적을 뿐만 아니라, 윤리성의 문제를 야기하지 않는 인간 제대혈로부터 유래된 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포는 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 바람직하게 사용할 수 있으며, 상기 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포는 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 조혈 줄기 세포 및 단핵구 세포는 공지의 방법에 따라 분리될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 단계(a)의 이식은 통상의 방법에 따라 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지의 생체에 정맥주입, 복강주입 등의 방법으로 이식함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게는 상기 이식은 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지의 골수에 주입함으로써 수행될 수 있다. 즉, 상기 이식은 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지의 골수 조직에 직접 이식하는 골수 천자(Intra-bone marrow) 방법을 사용하여 바람직하게 수행될 수 있다.
상기한 바와 같이, 형질전환 돼지에 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이식하면, 이식된 돼지의 생체 내에서 상기 조혈 줄기 세포가 분화 또는 증식되어, 새롭게 분화 또는 증식된 조혈 세포와 돼지의 세포가 공존하는 키메라 장기가 형성되게 된다. 따라서, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포가 이식된 돼지의 장기로부터 분화 또는 증식된 조혈 세포를 분리하면, 임상에 적용가능한 조혈 세포를 얻을 수 있다.
상기 장기는 특별히 제한된 것은 아니며, 조혈 세포를 포함하는 다양한 장기, 예를 들어 심장, 간장, 폐, 신장, 골수, 또는 말초혈액 등을 포함한다. 바람직하게는 원하는 조혈 세포를 손쉽게 얻을 수 있는 말초혈액으로부터 조혈 세포를 분리할 수 있다.
상기 돼지의 장기로부터 분화 또는 증식된 조혈 세포의 분리는 사람 조혈세포 특이 마커 형광색소 결합 항체인 CD45 항체로 면역염색을 실시하여 레이저장치로 양성세포만을 분리할 수 있는 장치인 유세포 분리기(Flow cytometry)로 사람의 세포만을 분리할 수 있으며, 또한 형광색소와 자석이 결합된 항체로 면역염색을 실시한 후 자석의 원리를 이용해 세포를 분리할 수 있는 장치인 MACS(Magnetic cell sorter)를 이용해서 사람의 세포만을 손쉽게 분리함으로써 수행할 수 있다.
본 발명은 또한, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 이식하여 얻어진, 조혈 세포 증식용 돼지를 포함한다. 즉, 본 발명은 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포의 이식을 통하여, 이식된 돼지의 생체 내에서 상기 조혈 줄기 세포가 분화 또는 증식됨으로써, 새롭게 분화 또는 증식된 조혈 세포와 돼지의 세포가 공존하는 키메라 장기를 갖는 조혈 세포 증식용 바이오리엑터(bioreactor) 돼지를 포함한다.
본 발명의 조혈 세포 증식용 돼지에 있어서, 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지는 상기한 바와 같이, 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 4 ∼ 6 주령, 더욱 바람직하게는 약 4 주령의 돼지에 300 ∼ 500 cGY, 바람직하게는 약 400 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하여 얻은 돼지일 수 있으며, 상기 방사선은 X-선, γ-선, 또는 전자빔일 수 있다. 또한, 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지는 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 4 ∼ 6 주령, 더욱 바람직하게는 약 4 주령의 돼지에 사이클로스포린 A를 투여하여 얻은 돼지일 수 있다. 또한, 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지는 상기한 바와 같이 방사선 조사 및 면역억제제 투여를 동시에 수행하여 얻어진 돼지일 수 있다.
또한, 본 발명의 조혈 세포 증식용 돼지에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포는, 상기한 바와 같이, 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포 또는 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포가 바람직하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 이식은 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지의 골수에 주입함으로써 수행되는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
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생후 5∼7주령의 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지를 마취하고, 분당 차병원 방사선실에서 400 cGy의 흡수선량으로 방사선을 조사하고 면역억제제인 사이클로스포린 A를 정맥주입을 통하여 면역을 억제시킨 돼지를 이용하여, 이종 세포인 사람의 제대혈에서 분리한 조혈 줄기 세포를 포함하고 있는 단핵구 세포를 상기 돼지의 골수 조직에 직접 이식한 후 돼지의 말초혈액과 골수조직을 포함하는 조혈조직을 채취하여 조직 내 사람 세포의 존재를 유세포 분석기와 유전자 검사방법을 이용해 분석하였다.
실시예
1. 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포의 분리
항응고제(헤파린)가 첨가된 제대혈을 20 ml의 Ficoll-Paque 용액(Amersham Biosciences AB, 스웨덴)을 주입한 50 ml 팔콘 튜브(Falcon Tube)에 중층하여, 실온에서 20 분간 2000 rpm으로 원심분리하였다. 분리된 중간층의 단핵구 부분을 채취하여 인산 완충 생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 2배 부피로 첨가하여 희석한 다음, 실온에서 5 분간 원심 분리하고 2회 세척하여, 사람 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 얻었다.
실시예
2. 방사선 조사 및 면역억제제(
CyA
) 주입을 통한 형질전환 돼지의 생 체 혈구세포의 변화 분석
생후 5∼7주령의 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지(대한민국 특허등록 제10-0358754호에 따라 얻어진 돼지)(n=3)에 X-Ray 방사선기(Linac 2100CD, Varian. USA)를 사용하여 방사선 전신조사를 실시하였다. 방사선 조사 전에 케타민과 럼푼으로 돼지를 마취하고, 400 cGy의 방사선 조사량으로 상기 형질전환 돼지의 방사선 조사를 실시하였다. 방사선 조사 후 1일째부터 매일 5 mg/Kg의 농도로 2주 동안 면역억제제 사이클로스포린 A(CyA)를 정맥 주입하였다. 방사선 조사와 사이클로스포린 A 주입을 시작한 후, 소정의 시간에 채취한 혈액(1 ml)을 채취하여 혈액 1 ㎕에 존재하는 백혈구, 적혈구 및 혈소판의 숫자를 혈구카운터로서 측정하였다.
도 1은 방사선 조사 및 사이클로스포린 A를 투여한 형질전환 돼지로부터 혈액을 채취하여 방사선 조사에 따른 혈액 내의 혈구세포인 백혈구, 적혈구 및 혈소판의 변화를 분석한 결과를 나타낸다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이 방사선 조사와 사이클로스포린 A 주입을 실시한 형질전환 돼지에서 분석 2일째부터 급격한 백혈구 감소현상이 관찰되었으며, 혈소판의 감소는 시간의 경과에 따라서 점진적으로 감소되는 현상이 관찰되었다. 그러나 적혈구는 방사선 조사와 사이클로스포린 주입에도 불구하고 유의성 있는 변화 양상을 보이지 않았다. 이러한 결과는 사람을 포함한 이종 세포와 장기이식을 위한 형질전환 돼지를 이용한 효율적인 이식과 효능 증진을 위해서, 방사선 조사와 사이클로스포린 주입을 통할 경우 선택적으로 이종 세포에 대한 면역세포의 면역거부반응에 관여하고 있는 돼지 백혈구 세포를 포함한 면역세포의 기능을 억제할 수 있음을 나타낸다.
실시예
3. 방사선 조사와 사이클로스포린 A(
CyA
) 투여에 따른 형질전환 돼지 면역세포의 특성 분석
실시예 2에서 방사선 조사 및 사이클로스포린 A가 주입된 형질전환 돼지로부터 혈액을 채취하여 방사선 조사에 따른 면역세포(CD4+T 세포 및 CD8+ T 세포)의 변화를 분석하였다. 방사선 조사와 사이클로스포린 A 주입 후 1주부터 5주까지 혈액(1 ml)을 매주 채취하여 면역세포 분석용 샘플로 이용하였다. 항응고제가 함유된 튜브에 형질전환 돼지의 귀 정맥에서 채취한 혈액 3-5 ml를 이용해 유세포 분석용 세포로 면역염색을 실시하였다. 혈액속의 단핵구는 Ficoll(슈크로스의 중합체)과 Hypaque(디크리조에이트나트륨: sodium ditrizoate)의 중합체인 Ficoll-Hypaque를 이용하여 분리하였다. 혈액을 Ficoll-Hypaque 위에 중층하여 2000 rpm으로 20분간 원심분리하여 중간층의 단핵구 부분을 채취한 후, PBS(Phosphate Buffer Saline)를 넣은 코니컬튜브에 채취된 단핵구를 넣고 1300rpm으로 5분간 2회 원심분리하여, 코니컬튜브 바닥에 모인 백혈구가 함유된 단핵구 세포만을 분리하였다.
분리된 단핵구 세포 1x106 세포를 돼지 면역세포 항원인 CD3의 항체인 항 CD3 항체(BD bioscience, USA)와 돼지 헬퍼(helper) T 세포 항원인 CD4에 대한 항 CD4 항체(BD bioscience, USA), 돼지 cytotoxic T세포 항원인 CD8에 대한 항 CD8 항체(BD bioscience, USA)로 96 웰 플레이트에서 면역염색을 30분 동안 실시하였다. 염색되지 않은 항체를 제거하기 위해서 면역 염색용 완충액인 Staining Media(PBS(-)에 2% 우태아혈청(FBS:fetal bovine serum, GIBCO)와 0.05%의 소듐 아지드(sodium azide)를 첨가한 용액)으로 2회 세척하였다.
도 2는 유세포 분석기(FACSvantage: Fluorescence Activated Cell Sorting)로 400 cGy의 흡수선량의 방사선 조사 및 5 mg/Kg의 사이클로스포린 A를 정맥 주입한 형질전환 돼지 혈액 속에 존재하는 돼지 면역세포인 CD4+ T 세포인 헬프 T 세포와 CD8+ T세포인 킬러 T 세포의 변화양상을 나타낸다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 2 주 후부터 CD3+CD4+ 헬프 T 세포는 방사선 조사전에 비해서 크게 감소 현상이 관찰되었고 3주에도 지속되었다. 그에 비해서 CD3+CD8+ 킬러 T세포는 방사선 조사 전에 비해서 비율상으로는 약간의 증가 현상이 관찰되었다. 그러나, 도 1의 백혈구세포의 절대 수치의 감소현상으로 보면 이는 방사선 조사와 사이클로스포린 A 주입을 통하여 돼지 면역세포인 CD4+ T세포와 CD8+ T 면역세포 대부분이 제거되거나 기능억제가 유도되었음을 나타낸다.
도 3은 방사선 조사와 사이클로스포린을 주입한 형질전환 돼지의 말초 혈액내 helper T 면역세포와 cytotoxic T 면역세포의 생체 변화를 도 2의 유세포 분석을 통하여 말초혈액내의 비율을 분석하여 나타낸 것이다. 방사선 조사와 사이클로스포린 A를 주입한 형질전환 돼지의 생체 helper T 면역세포는 주입 후 1 주에는 비율적으로 증가 추세에 있다가 2 주만에 거의 모든 세포가 제거되고 있다는 사실을 알 수 있고, 그에 반해서 cytotoxic T 면역세포는 점진적인 감소현상이 관찰되었다. 도 1의 생체 백혈구세포의 절대적인 숫적 변화 결과와 도 3의 결과를 종합해 보면, 방사선 조사 및 사이클로스포린 주입을 통하여 형질전환 돼지의 면역세포 제 거 방법은 매우 효과적인 것임을 알 수 있다.
실시예
4. 면역억제 유도 돼지 생체에의 사람 제대혈 유래 세포 이식 및 증식 효능
실시예 2와 동일한 방법으로 형질전환 돼지 생체 존재 면역세포의 제거 및 기능 억제를 시행한 형질전환 돼지(n=3)를 케타민과 럼푼으로 마취하고, 돼지의 골수 조직 내에 골수천자기를 골수 내에 주입한 후 20ml의 주사기로 흡입하여 돼지 골수 조직 세포가 주사기에 흡입되는 것을 확인한 후, 10ml의 주사기에 생리식염수로 희석한 실시예 1에서 얻은 단핵구 세포 즉, 사람 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 주입하였다 (표 1 참조). 단핵구 세포의 주입 후 매주에 걸쳐 말초혈액을 채취하여, 사람의 조혈세포 특이적인 항체인 hCD45-항체, hCD3-항체(T 면역세포), hCD19-항체(B 면역세포), hCD56-항체(NK 세포)로 면역염색을 실시하여 유세포분석기(Flowcytometry)로 이식 후 1주부터 5주 동안 분석을 시행하였다.
| 돼지 | 방사선 흡수선량 | 단핵구 세포 | 성별 | 나이(주령) | 체중 |
| 10 | 400 cGy | 1.2 X 109 cells | 웅성 | 4 | 9.0 kg |
| 11 | 400 cGy | 9.0 X 108 cells | 자성 | 4 | 6.0 kg |
| 12 | 400 cGy | 7.9 X 108 cells | 자성 | 4 | 4.8 kg |
도 4는 돼지 말초혈액에서 채취한 혈액을 사람 조혈세포 특이적인 항체로 면역염색을 실시하여 돼지 혈액 속에 존재하는 사람 조혈세포와 NK 세포의 존재 여부를 분석한 결과로서, 사람 조혈세포 특이 항체인 hCD45와 NK세포 특이 항체인 hCD56 항체를 이용한 면역염색을 시행한 말초혈액으로 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 5는 이식 후 1주부터 5주 동안 말초혈액을 채취하여 사람 특이적인 항체인 hCD45, hCD3, hCD19와 hCD56로 염색을 실시하여 말초혈액중의 사람 조혈세포의 증식 변화 양상을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 6은 상기의 방법에 의해서 이식된 형질전환 돼지를 이식 후 22주 후에 말초혈액과 골수조직에서 혈액세포를 채취한 후 사람 조혈줄기세포(CD34양성)를 포함하여 NK세포(CD56양성), 골수계세포(CD14양성, CD13/33양성), B 세포(CD19양성), T 세포(CD3양성)의 존재여부를 특이적 항체 염색을 시행한 후 유세포 분석기로 분석을 시행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4 내지 도 6의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 방사선 조사 및 사이클로스포린 A 주입 형질전환 돼지의 골수조직과 말초혈액 내에서 이식된 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하여 다양한 성숙 조혈 세포의 존재가 확인되었으며 22주의 장기간 동안 조혈 줄기 세포의 정상적인 증식과 분화가 관찰되었다. 이러한 결과는 방사선 조사와 사이클로스포린 A 주입에 의해서 유도된 면역거부반응 제어 형질전환 돼지가 이종 세포인 사람의 제대혈에서 분리된 조혈 세포를 생체 내에서 증식과 분화를 유도하여 사람 조혈세포의 생체 증식용 바이오리엑터(bioreactor)로서 기능할 수 있음을 나타낸다.
도 1은 방사선 조사 및 사이클로스포린 A를 투여한 형질전환 돼지로부터 혈액을 채취하여 방사선 조사에 따른 혈액 내의 혈구세포인 백혈구, 적혈구 및 혈소판의 변화를 분석한 결과를 나타낸다.
도 2는 유세포 분석기(FACSvantage: Fluorescence Activated Cell Sorting)로 400 cGy의 흡수선량의 방사선 조사 및 5 mg/Kg의 사이클로스포린 A를 정맥 주입한 형질전환 돼지 혈액 속에 존재하는 돼지 면역세포인 CD4+ T 세포인 헬프 T 세포와 CD8+ T세포인 킬러 T 세포의 변화양상을 나타낸다.
도 4는 돼지 말초혈액에서 채취한 혈액을 사람 조혈세포 특이적인 항체로 면역염색을 실시하여 돼지 혈액 속에 존재하는 사람 조혈세포와 NK 세포의 존재 여부를 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 이식 후 1주부터 5주 동안 말초혈액을 채취하여 사람 특이적인 항체인 hCD45, hCD3, hCD19와 hCD56로 염색을 실시하여 말초혈액중의 사람 조혈세포의 증식 변화 양상을 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 상기의 방법에 의해서 이식된 형질전환 돼지를 이식 후 22주 후에 말초혈액과 골수조직에서 혈액세포를 채취한 후 사람 조혈줄기세포(CD34양성)를 포함하여 NK세포(CD56양성), 골수계세포(CD14양성, CD13/33양성), B 세포(CD19양성), T 세포(CD3양성)의 존재여부를 특이적 항체 염색을 시행한 후 유세포 분석기로 분석을 시행한 결과를 나타낸다.
Claims (22)
- (a) 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를, 3 ∼ 7 주령의 에리스로포이에틴-생산(erythropoietin-produceable) 형질전환 돼지에 300 ∼ 500 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하여 얻은 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 이식하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 돼지의 장기로부터 분화 또는 증식된 조혈 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 흡수선량이 약 400 cGY인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방사선이 X-선, γ-선, 또는 전자빔인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지가 3 ∼ 7 주령의 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 300 ∼ 500 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하고, 면역억제제를 투여하여 얻은 돼지인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항, 제3항, 제4항, 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포가 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항, 제3항, 제4항, 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포가 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항, 제3항, 제4항, 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(a)의 상기 이식이 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지의 골수에 주입함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항, 제3항, 제4항, 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(b)의 상기 돼지의 장기가 심장, 간장, 폐, 신장, 골수, 또는 말초혈액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제11항에 있어서, 단계(b)의 상기 돼지의 장기가 말초혈액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를, 3 ∼ 7 주령의 에리스로포이에틴-생산(erythropoietin-produceable) 형질전환 돼지에 300 ∼ 500 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하여 얻은 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 이식하여 얻어진, 조혈 세포 증식용 돼지.
- 삭제
- 제13항에 있어서, 상기 흡수선량이 약 400 cGY인 것을 특징으로 하는 조혈 세포 증식용 돼지.
- 제13항에 있어서, 상기 방사선이 X-선, γ-선, 또는 전자빔인 것을 특징으로 하는 조혈 세포 증식용 돼지.
- 삭제
- 삭제
- 제13항에 있어서, 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지가 3 ∼ 7 주령의 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지에 300 ∼ 500 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하고, 면역억제제를 투여하여 얻은 돼지인 것을 특징으로 하는 조혈 세포 증식용 돼지.
- 제13항, 제15항, 제16항, 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포가 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 조혈 세포 증식용 돼지.
- 제13항, 제15항, 제16항, 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포가 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포인 것을 특징으로 하는 조혈 세포 증식용 돼지.
- 제13항, 제15항, 제16항, 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(a)의 상기 이식이 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 상기 면역이 억제된 에리스로포이에틴-생산 형질전환 돼지의 골수에 주입함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 조혈 세포 증식용 돼지.
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| US6018096A (en) * | 1993-05-03 | 2000-01-25 | Surrogen, Inc. | Animal model for engraftment, proliferation and differentiation of human hematopoietic stem cells |
| KR100358754B1 (ko) * | 2000-02-14 | 2002-11-07 | 대한민국 | 인간의 조혈촉진제 생산을 위한 형질전환 돼지를 생산하는방법 및 그 형질전환 돼지 |
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|---|---|---|---|---|
| US6018096A (en) * | 1993-05-03 | 2000-01-25 | Surrogen, Inc. | Animal model for engraftment, proliferation and differentiation of human hematopoietic stem cells |
| KR100358754B1 (ko) * | 2000-02-14 | 2002-11-07 | 대한민국 | 인간의 조혈촉진제 생산을 위한 형질전환 돼지를 생산하는방법 및 그 형질전환 돼지 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Transplantation, 제75권, 제7호, 제916-922면.* |
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