KR100935334B1 - 조혈 세포의 생체 내 제조방법 및 조혈 세포 증식을 위한동물 바이오리엑터 - Google Patents
조혈 세포의 생체 내 제조방법 및 조혈 세포 증식을 위한동물 바이오리엑터 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이종 장기 이식용 돼지에 이식하는 단계; 및 얻어진 돼지의 장기로부터 분화 또는 증식된 조혈 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 3 ∼ 7 주령의 돼지에 항암제를 투여하는 단계를 포함하는, 면역이 억제된 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법, 상기 제조방법으로 얻어진 면역이 억제된 이종 장기 이식용 돼지, 및 상기 돼지로부터 적출된 장기를 제공한다. 또한, 본 발명은 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이종 장기 이식용 돼지에 이식하여 얻어진, 조혈 세포 증식용 돼지를 제공한다.
돼지, 면역억제제, 항암제, 방사선 조사, 제대혈, 조혈 줄기 세포
Description
본 발명은 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 면역이 억제된 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법, 상기 제조방법으로 얻어진 면역이 억제된 이종 장기 이식용 돼지, 및 상기 돼지로부터 적출된 장기에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이종 장기 이식용 돼지에 이식하여 얻어진, 조혈 세포 증식용 돼지에 관한 것이다.
난치성 또는 불치성 조혈질환인 백혈병을 비롯한 다양한 조혈질환을 치료할 수 있는 유일한 방법으로서 현재까지 주로 골수이식을 통한 치료 기술이 시행되어 왔다. 골수이식을 통한 치료는 조혈 줄기 세포에 근거한 것으로 밝혀졌으며, 상기 조혈 줄기 세포는 골수 속에 존재하고, 자신과 동일한 분화 및 증식능력인 자기복제(Self-renewal)을 보유하고 있으며 15가지 이상의 성숙한 기능성 조혈 세포를 만들 수 있는 능력인 다 분화 능력(Multi-potential)을 지니고 있다.
최근의 급격한 출산율 저하 및 고령화 현상과 더불어 골수를 포함한 세포 및 장기 제공자의 절대적인 부족현상은 심각한 사회문제로 대두되고 있다. 또한 헌혈자의 부족 및 인식도의 감소 현상은 날로 심각해지고 있으며 이로 인한 임상 현장에서의 고초는 날로 더해져만 가고 있다.
조혈 줄기 세포는 배아 발달과정에서 태아간장조직에서 분화 발달하여 분만과 함께 골수 조직내로 이동하여 정착해, 일생동안 사람의 생명유지를 위해 필수적인 혈액 세포인 적혈구와 백혈구 및 혈소판을 생산한다.
백혈병을 비롯한 수많은 조혈질환 치료제로서의 성공적인 임상이식 결과를 얻기 위해서는 조혈 줄기 세포를 포함하는 조혈 세포의 대량 배양 기술개발이 필수적이다. 최근의 조혈 줄기 세포의 증식과 대량 배양을 위해서는 시험관과 생체를 이용한 조혈 줄기 세포의 특성 규명 연구와 더불어 조혈 줄기 세포의 증식과 분화를 조절하는 다양한 조혈 인자의 규명 및 기능 분석 연구가 보고되고 있다.
최근의 조혈 줄기 세포의 유전자 발현을 통한 자기복제 조절과 이를 이용한 줄기세포의 대량 배양 기술 개발로서, Notch 유전자의 발현 유도를 통한 미분화 상태로의 조혈 줄기 세포의 증식과 유지에 관한 연구가 보고되고 있으며, 또한 전사인자 유전자인 AML-1, Ikaros, SCL/Tal-1, Rbtn-2, GATA-2와 HOX homoebox 유전자 등이 대표적인 조혈 줄기 세포의 자기복제기능 조절에 관여하고 있다는 사실이 밝혀졌다 (Orkin. Divesification of haematipoietic stem cells to specific lineages. Nat Rew Genet. 2000.1(1): 57-64. Cristinal et al., Hematooietic stem cell expansion and distict myeloid developmental abnormalities in a murine modlel of the AML1-ETO translocation. Mol. Cell. Bio. 2002. 22(15). 5506-5517. Nichogiannopoulou et al. Defects in hematopoietic stem cell activity in Ikaros mutant mice. J. Exp. Med. 1999. 190(9). 1201-1214. GATA-2 plays two functionally distict roles during the ontogeny of hematopoietic stem cells. J. Eep. Med. 2004. 200(7), 871-882).
특히 HOXB4 유전자를 과발현시킨 조혈 줄기 세포는 생체 내에서 장기간에 걸친 조혈 재생 능력(Long-term repopulating cells)을 지닌 세포를 증식시킬 수 있으며 또한 다양한 성숙 조혈세포로 분화할 수 있는 세포 분화 능력도 보유하고 있다 (Antonchuk et al., HOXB4-induced expansion of adult hematooietic stem cells ex vivo. Cell. 2002. 109(1): 39-45).
조혈 줄기 세포의 분열 및 자기복제 유도를 통한 시험관 배양 방법으로서 조혈지지세포와의 배양을 통한 줄기세포 대량배양 법인 LTCIC (long-term culture-initiating cell assay)와 Cobblestone are-forming cell(CAFC), HPP-CFC(high proliferative potential colony-forming cell), colony-forming unit-blast(CFU-BI)방법 등이 있다. 또한 조혈 인자를 이용한 시험관 조혈 줄기 세포의 대량 배양이 시도되었는데, 대표적인 조혈 줄기 세포의 증식 유도 능력을 지닌 인자로서 SCF(stem cell factor)와 FL(flt3/flt2 ligand)와 다른 조혈 인자인 IL(interleukin)-16, IL-11, IL-12, LIF(Leukemiainhibitory factor)와 TPO(thrombopoietin)과의 조합을 통한 조혈 줄기 세포 및 전구세포의 증식 유도가 주로 시도되었고, 또한 조혈 인자와 조혈지지세포와의 공동 작용을 통한 조혈 줄기 세포의 증식 유도 시도가 이루어졌으나, 조혈 줄기 세포의 자기 복제 및 증식을 충분히 유도하지는 못하였다(Nakahata et al., Hemopoietic colony-forming cells in umbilical cord blood with extensive capavility to generate mono- and multipotential hemopoietic progenitors. J. Clin. Invest. 1982. 70. 1324-1328), Methology of long-term culture of human hematopoiesis. J. Tissue Cult. Methods. 1991. 13: 55-62).
사람 조혈 줄기 세포의 In vivo 배양 방법으로서 마우스와 같은 동물모델을 이용한 방법이 이용되고 있다. 1988년에 선천성 면역결핍마우스인 SCID(Severe Combined Immunodeficiency)를 이용해 사람의 골수 존재 조혈 줄기 세포를 이용한 생체 이식 연구가 최초로 이루어졌으며, 최근에의 다양한 실험동물모델이 개발되었으며, 이러한 모델로서 beige(Lyst bg , bg), nu와 X-linked immunodeficiency (Btk xid , xid)인 bg -nu-xid 마우스가 개발되었으며, 또한 recombination activating gene-1(Rag1)과 Rag2 유전자 결핍으로 인한 T 세포와 B 세포의 결핍마우스 등이 있다. 이러한 다양한 선천성 면역결핍 마우스를 이용해 사람의 조혈 줄기 세포의 생체 이식을 통하여 이종 동물모델 생체 내에서의 증식과 분화 유도 연구가 시행되었다(Greiner et al., SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem Cells. 1988. 16. 166-177, Christianson et al., Enhanced human CD4+ T cell engraftment in beta-2 microglobulin-deficient NOD-scid mouse, J. Immunol. 1997. 158, 3578-3586, Shinkai et al., RAG-2-deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement. Cell 1992. 68. 855-867).
면역결핍 마우스를 이용한 사람 조혈 줄기 세포의 생체 이식을 통한 생체 증식 방법과 더불어 대 동물을 이용한 사람 조혈 줄기 세포의 생체이식방법이 개발되었고, 대표적인 대 동물로서 양을 비롯해서 원숭이를 이용한 사람 조혈 줄기 세포의 in utero 생체 이식 기술이 있으며, 이는 태아 40-45일경의 자궁에 존재하는 태아 양은 면역세포의 분화되지 않은 면역부전 상태로서 이식한 사람의 조혈 줄기 세포에 대한 면역거부반응을 나타내지 않아 정상적인 이종 모델 생체에서의 증식과 분화가 유도됨이 관찰되었다. 또한 사람의 신경줄기세포(NSC)를 복부에 이식하여 조혈 세포로의 분화를 유도하는 연구가 진행된 바 있다(Almeida-Porada et.al., In vivo haematopoietic potential of human neural stem cells. Br. J. Haematol. 2005. 130(2):276-83. Zanjani et al., Hematopoietic chimerism in sheep and nonhuman primates by in utero transplantation of fetal hematopoietic stem cells. Blood cells. 1991. 17, 349-363), McNiece et. al., Ex vivo expanded cord blood cells provide rapid engraftment in fetal sheep but lack long-term engrafting potential. Exp. Hematol. 2002. 30(6):612-6.).
돼지를 이용해 사람의 심근 세포를 추출하여 돼지의 심장에의 이식을 시행하여 돼지 생체 조직에서의 사람 심근 세포의 증식과 분화를 분석한 결과 약 7개월 이상의 장기간에 걸쳐 사람 세포의 생착이 관찰한 연구결과가 보고된 바 있다 ( Husnain et. al., Myolbast transplantatin for cardiac repair using transient immunosuppression. Basic Appl. Myol.13(1):45-52, 2003).
현재 대두되고 있는 심각한 난치성 및 불치성 질환 치료 방법으로서, 줄기세포를 이용한 세포 치료제 개발과 장기배양을 통한 치료 기술 개발에 대한 중요성과 필요성이 전 세계적으로 대두되고 있다. 배아줄기세포를 필두로 한 줄기세포에 대한 연구는 면역거부반응과 종양 형성이라는 난 과제를 해결해야 임상적용이 가능하다. 그러나, 조혈 줄기 세포와 신경 줄기 세포 등과 같이 성체 조직에 존재하는 성체 줄기 세포는 자가 세포이식을 통하여 배아줄기세포가 지니고 있는 단점과 문제점을 극복할 수 있는 대안 세포로서 주목되고 있다. 또한 장기이식은 돼지를 이용한 방법이 시도되고 있으며, 이는 돼지가 사람의 장기 제공원으로서 장기의 크기, 번식효율, 사육기술, 인체감염가능성을 고려할 때에 가장 적합한 장기 제공 동물로서 인식되고 있어, 국내 연구진을 포함한 국외에서도 다양한 장기 이식 돼지의 개발이 시도되고 있다.
한편, 본 발명자들은 면역세포만이 선택적으로 억제된 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법, 즉, 어린 돼지(piglet)에 특정 흡수선량으로 전신 방사선 조사(total body irradiation, TBI)를 실시함으로써, 적혈구 등의 생존에 필요한 혈구의 혈중 농도에는 유의성 있는 변화를 미치지 않으면서 백혈구 및 CD4+ T 및 CD8+ T세포 등의 면역세포만을 선택적으로 감소시킨 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법을 개발한 바 있다 (대한민국 특허출원 제10-2006-0097071호, 2006년 10월 24일자 출원, 미공개).
본 발명자들은 선행 연구 결과를 바탕으로, 임상에 적용할 수 있는 조혈 세포의 생체 내 제조방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 이종 장기 이식용 돼지에 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이식하였을 때, 돼지의 다양한 조직에서 상기 조혈 줄기 세포의 분화 또는 증식이 유도됨으로써, 이를 분리할 경우 임상에 적용 가능한 조혈 세포를 제조할 수 있으며, 또한 상기 돼지가 조혈 세포의 동물 바이오리엑터(animal bioreactor)로서 활용될 수 있음을 발견하였다. 이는 면역이 억제된 이종 장기 이식용 돼지가 생체 내에서 조혈 줄기 세포의 분화 또는 증식을 유도한다는 것으로, 매우 놀라운 것이다. 또한, 본 발명자들은 어린(3 ∼ 7 주령)의 돼지에 시타라빈 등의 항암제를 투여할 경우, 적혈구의 숫자는 영향을 미치지 않으면서 CD4 양성의 hT 면역세포 및 백혈구만을 감소시킴으로써, 선택적으로 면역이 억제된 이식용 돼지가 제조될 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 이종 장기 이식용 돼지에 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포의 이식을 포함하는, 분화 또는 증식된 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 선택적으로 면역이 억제된 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 얻어진 면역이 억제된 이종 장기 이식용 돼지 및 이로부터 적출된 장기를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이종 장기 이식용 돼지에 이식하여 얻어진, 조혈 세포 증식용 돼지를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, (a) 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이종 장기 이식용 돼지에 이식하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 돼지의 장기로부터 분화 또는 증식된 조혈 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법이 제공된다.
상기 이종 장기 이식용 돼지는 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 약 5 주령의 돼지에 300 ∼ 500 cGY, 바람직하게는 약 400 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하여 얻은 돼지일 수 있으며, 상기 방사선은 X-선, γ-선, 또는 전자빔일 수 있다. 또한, 상기 이종 장기 이식용 돼지는 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 약 5 주령의 돼지에 항암제, 바람직하게는 시타라빈(Cytarabine)을 투여하여 얻은 돼지일 수 있으며, 또한, 상기 이종 장기 이식용 돼지는 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 약 5 주령의 돼지에 면역억제제, 바람직하게는 사이클로스포린 A(Cyclosporin A)를 투여하여 얻은 돼지일 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포는 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포일 수 있으며, 상기 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포는 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포일 수 있다. 또한, 단계(a)의 상기 이식은 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포 를 상기 이종 장기 이식용 돼지의 골수에 주입함으로써 바람직하게 수행될 수 있으며, 단계(b)의 상기 돼지의 장기는 심장, 간장, 폐, 신장, 골수, 또는 말초혈액 등일 수 있으며, 바람직하게는 말초혈액일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 약 5 주령의 돼지에 항암제, 바람직하게는 시타라빈을 투여하는 단계를 포함하는, 면역이 억제된 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, 상기 제조방법으로 얻어진 면역이 억제된 이종 장기 이식용 돼지 및 이로부터 적출된 장기가 제공된다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이종 장기 이식용 돼지에 이식하여 얻어진, 조혈 세포 증식용 돼지가 제공된다.
본 발명의 조혈 세포 증식용 돼지에 있어서, 상기 이종 장기 이식용 돼지는 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 4 ∼ 6 주령, 더욱 바람직하게는 약 5 주령의 돼지에 300 ∼ 500 cGY, 바람직하게는 약 400 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하여 얻은 돼지일 수 있으며, 상기 방사선은 X-선, γ-선, 또는 전자빔일 수 있다. 또한, 상기 이종 장기 이식용 돼지는 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 4 ∼ 6 주령, 더욱 바람직하게는 약 5 주령의 돼지에 시타라빈 등의 항암제를 투여하여 얻은 이식용 돼지이거나 사이클로스포린 A를 투여하여 얻은 돼지일 수 있다.
또한, 본 발명의 조혈 세포 증식용 돼지에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포는 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포 또는 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포가 바람직하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 이식은 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 상기 이종 장기 이식용 돼지의 골수에 주입함으로써 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라, 이종 장기 이식용 돼지에 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이식할 경우, 돼지의 생체 내에서 상기 조혈 줄기 세포의 분화 또는 증식이 유도됨으로써, 이를 분리할 경우 임상에 적용가능한 조혈 세포를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 면역이 억제된 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법에 의해, 적혈구의 숫자는 영향을 미치지 않으면서 CD4 양성의 hT 면역세포 및 백혈구만을 감소시킴으로써, 선택적으로 면역이 억제된 이식용 돼지가 제조될 수 있다.
또한, 본 발명에 따라, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이종 장기 이식용 돼지에 이식하여 얻어진, 조혈 세포 증식용 돼지는 분화 또는 증식된 조혈 세포와 돼지의 세포가 공존하는 키메라 장기를 갖는 조혈 세포 증식용 바이오리엑터(bioreactor)로서 기능할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 조혈 세포 증식용 돼지는 조혈 세포를 생체에서 지속적이고 안정적으로 공급할 수 있는 생체 바이오리엑터(bioreactor)로서 활용될 수 있다.
본 발명은 (a) 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포 를 이종 장기 이식용 돼지에 이식하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 돼지의 장기로부터 분화 또는 증식된 조혈 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법을 포함한다.
상기 "이종 장기 이식용 돼지"는 인간 등을 포함한 포유동물에 심장, 신장, 폐, 간, 췌장 등의 장기를 이식할 수 있는 돼지로서, "장기 이식용 돼지" 혹은 "이식용 돼지"로도 지칭된다. 상기 "이종 장기 이식용 돼지"는 통상 면역을 억제시킨 돼지이며, 상기 면역 억제는 통상 사이클로스포린 A 등의 면역억제제의 투여에 의해 수행된다.
본 발명의 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법에 있어서, 상기 이종 장기 이식용 돼지는 본 발명자들의 선행 연구에 의해 개발된 이종 장기 이식용 돼지를 사용할 수 있다(대한민국 특허출원 제10-2006-0097071호, 2006년 10월 24일자 출원, 미공개). 즉, 어린(약 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 4 ∼ 6 주령, 더욱 바람직하게는 약 5 주령) 돼지에 특정 흡수선량으로 전신 방사선 조사(total body irradiation, TBI)를 실시하여 얻어진 돼지를 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 방사선 조사에 의해 얻어진 이종 장기 이식용 돼지는 적혈구 등 생존에 필요한 혈구의 혈중 농도에는 유의성 있는 변화를 미치지 않으면서 백혈구 및 CD4+ T 및 CD8+ T세포 등의 면역세포만이 선택적으로 감소된 혈액분석학적 양상(hematological profile)을 나타낸다.
상기 방사선 조사에 의해 얻어진 이종 장기 이식용 돼지에 있어서, 상기 흡수선량은 300 ∼ 500 cGY, 더욱 바람직하게는 약 400 cGY일 수 있으며, 상기 방사 선은 X-선, γ-선, 또는 전자빔일 수 있다. 상기 전신 조사(total body irradiation) 방법은 의료 분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 실시할 수 있으며, 별도로 제한되지 않는다. 예를 들어, 방사선 조사를 위해 전신을 고정시킨 후 방사선 조사기의 중앙에 위치시켜, 배면과 복면에 각각 방사선을 조사하여 방사선 전신 조사를 실시할 수 있다.
또한, 본 발명의 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법에 있어서, 상기 이종 장기 이식용 돼지는 어린(약 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 4 ∼ 6 주령, 더욱 바람직하게는 약 5 주령) 돼지에 시타라빈(Cytarabine) 등의 항암제 또는 사이클로스포린 A(Cyclosporin A) 등의 면역억제제를 투여하여 얻은 돼지일 수 있다.
상기 항암제 또는 면역억제제의 투여는 면역거부반응을 억제할 수 있는 함량 및 투여방법이 사용될 수 있으며, 특히 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 항암제 또는 면역억제제의 투여는 경구투여, 정맥주입 등에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어 면역억제제인 사이클로스포린 A는 2-15 mg/kg, 바람직하게는 2-7 mg/kg, 더욱 바람직하게는 5 mg/kg의 양을 매일 한 번씩 2주 동안 정맥 주입함으로써 이종 장기 이식용 돼지를 얻을 수 있다. 또한, 항암제인 시타라빈은 예를 들어 100-400 mg/kg, 바람직하게는 150-300 mg/kg, 더욱 바람직하게는 200 mg/kg의 양으로 3일 동안 정맥 주입하여 돼지의 백혈구 세포를 감소시킴으로써, 이종 장기 이식용 돼지를 얻을 수 있다.
본 발명의 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포는 인간의 골수, 제대혈, G- CSF나 GM-CSF 투여를 통하여 골수조직으로부터 말초혈액으로 줄기세포의 세포 이동을 유도해서 채취된 사이토카인 유도 말초혈액 등의 성체 세포에서 유래된 것을 제한 없이 사용할 수 있다. 이 중, 침습적이지 않고 쉽게 얻을 수 있으며, 면역거부반응이 적을 뿐만 아니라, 윤리성의 문제를 야기하지 않는 인간 제대혈로부터 유래된 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포는 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 바람직하게 사용할 수 있으며, 상기 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포는 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 조혈 줄기 세포 및 단핵구 세포는 공지의 방법에 따라 분리될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 단계(a)의 이식은 통상의 방법에 따라 돼지의 생체에 정맥주입, 복강주입 등의 방법으로 이식함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게는 상기 이식은 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 상기 이종 장기 이식용 돼지의 골수에 주입함으로써 수행될 수 있다. 즉, 상기 이식은 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이종 장기 이식용 돼지의 골수 조직에 직접 이식하는 골수 천자(Intra-bone marrow) 방법을 사용하여 바람직하게 수행될 수 있다.
상기한 바와 같이, 이식용 돼지에 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이식하면, 이식된 돼지의 생체 내에서 상기 조혈 줄기 세포가 분화 또는 증식되어, 새롭게 분화 또는 증식된 조혈 세포와 돼지의 세포가 공존하는 키메라 장기가 형성되게 된다. 따라서, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포 를 포함하는 단핵구 세포가 이식된 돼지의 장기로부터 분화 또는 증식된 조혈 세포를 분리하면, 임상에 적용가능한 조혈 세포를 얻을 수 있다.
상기 장기는 특별히 제한된 것은 아니며, 조혈 세포를 포함하는 다양한 장기, 예를 들어 심장, 간장, 폐, 신장, 골수, 또는 말초혈액 등을 포함한다. 바람직하게는 원하는 조혈 세포를 손쉽게 얻을 수 있는 말초혈액으로부터 조혈 세포를 분리할 수 있다.
상기 돼지의 장기로부터 분화 또는 증식된 조혈 세포의 분리는 사람 조혈세포 특이 마커 형광색소 결합 항체인 CD45 항체로 면역염색을 실시하여 레이저장치로 양성세포만을 분리할 수 있는 장치인 유세포 분리기(Flow cytometry)로 사람의 세포만을 분리할 수 있으며, 또한 형광색소와 자석이 결합된 항체로 면역염색을 실시한 후 자석의 원리를 이용해 세포를 분리할 수 있는 장치인 MACS(Magnetic cell sorter)를 이용해서 사람의 세포만을 손쉽게 분리함으로써 수행할 수 있다.
한편, 면역거부반응이 억제된 이종 장기 이식용 돼지를 얻기 위하여 항암제를 사용할 경우, 항암제 자체의 독성으로 인하여 면역억제 뿐만 아니라 생존에 필수적인 세포, 예를 들어 적혈구까지도 파괴되므로, 항암제를 사용하여 면역을 억제시킨 이식용 돼지를 얻었다는 것은 아직 보고된 바 없다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 의해, 어린(약 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 4 ∼ 6 주령, 더욱 바람직하게는 약 5 주령) 돼지에 시타라빈 등의 항암제를 투여할 경우, 돼지의 생체에 존재하는 백혈구 및 CD4양성의 면역세포는 유의성 있게 감소되지만 생존에 필요한 적혈구의 혈중농도는 유의성 있는 변화를 나타내지 않는다는 것이 새롭게 발견되었다.
따라서, 본 발명은 3 ∼ 7 주령의 돼지에 항암제를 투여하는 단계를 포함하는, 면역이 억제된 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법을 포함한다. 상기 항암제로는 시타라빈(Cytarabine)을 바람직하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 얻어진 면역이 억제된 이식용 돼지 및 이로부터 적출된 장기를 포함한다. 상기 장기는 폐, 흉선, 간장, 심장, 신장, 간장, 골수, 및 말초혈액 등을 모두 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
1969년의 사람의 신장조직 이식을 시작으로 국내의 장기이식은 현재 약 2만건 이상이 이루어지고 있다. 그러나 절대적인 장기기증자의 감소와 더불어 장기수요자는 날로 증가추세로 이에 따른 장기의 불법매매 등의 사회적 문제와 더불어 장기이식을 위해서 중국으로의 원정 장기이식이 유행되고 있고 그에 따른 심각한 국제적 문제점이 대두되고 있는 실정이다. 일반적인 장기이식용 장기는 신장, 간장, 췌장, 심장, 폐 등의 고형장기와 골수, 각막, 뇌 세포 조직, 피부 조직 등을 들 수 있다. 이러한 절대적인 장기부족을 해결할 수 있는 해결책으로서 사람의 장기와 비슷한 크기를 지니고 있으며 새끼를 많이 낳고 사육기간이 짧은 특성을 지니고 있는 돼지가 가장 유력한 사람 장기이식용 동물로 인정되고 있다. 그러나 이종 장기 이식에 있어서의 최대의 문제점인 돼지조직에 대한 인체 면역거부반응은 현재 면역세포 인식 항원을 제거하는 유전자 변이 돼지 제작 등의 연구가 국내외적으로 활발하게 진행되고 있다. 본 발명에 의해서 제작되는 장기는 자기 자신의 조직에서 유래된 세포와 돼지의 세포가 공존하고 있는 장기로서 순수한 돼지세포로만 구성된 조직에 비해서 면역세포에 의한 거부반응이 낮기 때문에 유력한 이종 장기용 조직으 로 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이종 장기 이식용 돼지에 이식하여 얻어진, 조혈 세포 증식용 돼지를 포함한다. 즉, 본 발명은 이종 장기 이식용 돼지에 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포의 이식을 통하여, 이식된 돼지의 생체 내에서 상기 조혈 줄기 세포가 분화 또는 증식됨으로써, 새롭게 분화 또는 증식된 조혈 세포와 돼지의 세포가 공존하는 키메라 장기를 갖는 조혈 세포 증식용 바이오리엑터(bioreactor) 돼지를 포함한다.
본 발명의 조혈 세포 증식용 돼지에 있어서, 상기 이종 장기 이식용 돼지는 상기한 바와 같이, 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 4 ∼ 6 주령, 더욱 바람직하게는 약 5 주령의 돼지에 300 ∼ 500 cGY, 바람직하게는 약 400 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하여 얻은 돼지일 수 있으며, 상기 방사선은 X-선, γ-선, 또는 전자빔일 수 있다. 또한, 상기 이종 장기 이식용 돼지는 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 4 ∼ 6 주령, 더욱 바람직하게는 약 5 주령의 돼지에 시타라빈 등의 항암제를 투여하여 얻은 돼지이거나 사이클로스포린 A를 투여하여 얻은 돼지일 수 있다.
또한, 본 발명의 조혈 세포 증식용 돼지에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포는, 상기한 바와 같이, 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포 또는 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포가 바람직하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 이식은 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 상기 이종 장기 이식용 돼지의 골수에 주입함으로써 수행되는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
.
생후 5∼7주령의 돼지를 마취하고, 분당 차병원 방사선실에서 400 cGy의 흡수선량으로 방사선을 조사한 돼지, 면역억제제인 사이클로스포린을 정맥주입을 통하여 면역세포 기능을 억제시킨 돼지, 항암제인 시타라빈을 정맥주입하여 백혈구 세포를 포함한 면역세포를 억제시킨 돼지를 이용하여, 이종 세포인 사람의 제대혈에서 분리한 조혈 줄기 세포를 포함하고 있는 단핵구 세포를 돼지의 골수 조직에 직접 이식한 후 돼지의 말초혈액과 골수조직을 포함하는 조혈조직과, 폐, 흉선, 간장, 심장, 신장과 간장 등을 적출하여 조직 내 사람 세포의 존재를 유세포 분석기와 유전자 검사방법을 이용해 분석하였다 (도 1 참조).
또한, 상기 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포의 이식은 이식용 돼지의 골수에 직접 이식하였다 (도 2 참조). 즉, 도 2에 나타낸 바와 같이, 골수천자기를 이용해 마취된 돼지의 골수조직에 주사한 후 상기 세포를 이식하였다. 도 2의 좌측 사진은 골수천자기를 이용해 마취된 돼지의 골수조직에 주사한 후 단핵구 세포를 이식하는 것을 나타낸 것이고, 도 2의 우측 사진은 골수천자에 의해서 실질적으로 돼지 골수 조직 내에 정확하게 주입되는지를 자기공명장치(MRI) 를 이용해 확인한 것을 나타낸 것이다.
실시예
1. 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포의 분리
항응고제(헤파린)가 첨가된 제대혈을 20 ml의 Ficoll-Paque 용액(Amersham Biosciences AB, 스웨덴)을 주입한 50 ml 팔콘 튜브(Falcon Tube)에 중층하여, 실온에서 20 분간 2000 rpm으로 원심분리하였다. 분리된 중간층의 단핵구 부분을 채취하여 인산 완충 생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 2배 부피로 첨가하여 희석한 다음, 실온에서 5 분간 원심 분리하고 2회 세척하여, 사람 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 얻었다.
실시예
2. 면역억제제(
CyA
) 투여를 시행한 이식용 돼지에의 사람 제대혈 유래 단핵구 세포의 이식
생후 5∼7주령의 란드레이스(Landrace)계 돼지(n=2)에 300 mg/kg의 사이클로스포린 A를 2주에 걸쳐 매일 정맥주입하여 면역을 억제시켰다. 사이클로스포린 A 투여 시작 후 24시간에 케타민과 럼푼으로 마취시킨 돼지의 골수 조직 내에 골수천자기를 사용하여 골수 내에 주입한 후 20ml의 주사기로 흡입하여 돼지 골수 조직 세포가 주사기에 흡입되는 것을 확인한 후, 10ml의 주사기에 생리식염수로 희석한 실시예 1에서 얻은 단핵구 세포(9 x 107 세포)를 주입하였다. 돼지의 골수조직에 주입한 후 매주에 걸쳐 말초혈액을 채취하여, 사람의 조혈 세포 특이적인 항체인 hCD45-항체, hCD34-항체(조혈줄기세포 및 전구세포), hCD3-항체(T 면역세포), hCD19-항체(B 면역세포), hCD14-항체(골수계 세포)로 면역염색을 실시하여 유세포분석기(Flowcytometry)로 이식 후 1주부터 5주 동안 분석을 시행하였다.
도 3은 상기 돼지의 말초혈액에서 채취한 혈액을 사람 조혈 세포 특이적인 항체로 면역염색을 실시하여 돼지 혈액 속에 존재하는 사람 조혈 줄기 세포와 조혈 세포의 존재 여부를 분석한 결과로서, 도 3a는 사람 조혈 세포 특이 항체인 hCD45와 조혈 줄기 세포 특이 항체인 hCD34 항체를 이용한 면역염색을 시행한 말초혈액을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸다. 도 3b는 이식 후 1주부터 5주 동안 말초혈액을 채취하여 사람 특이적인 항체인 hCD45, hCD3, hCD19와 hCD14로 염색을 실시하여 말초혈액 중의 사람 조혈 세포의 증식 변화 양상을 분석한 도표를 나타낸다. 도 3c는 상기 돼지를 제대혈 이식 후 5주에 도살하여 돼지의 각 장기 조직을 적출하고, 적출된 장기 속 세포의 게놈 DNA를 추출한 후, 사람 세포 특이적 액틴(actin) 유전자에 대한 PCR 프라이머를 이용해 각 조직에 존재하는 사람 세포의 유전자 검사를 시행한 결과를 나타낸다. 도 3d는 상기 돼지 두 마리에서 말초혈액을 추출하여 상기와 동일한 방법으로 추출한 게놈 유전자를 이용해 사람 특이적 액틴 유전자 프라이머로 유전자 분석을 시행한 결과를 나타낸다.
도 3의 결과로부터 돼지의 말초혈액을 포함한 폐, 흉선, 간장, 심장, 신장과 간장 등의 조직에서 이식된 사람 세포의 존재를 유전자 분석을 통하여 확인할 수 있으며, 또한, 유세포 분석기를 통한 세포분석방법을 통하여 사람의 조혈세포인 T 면역세포, B 면역세포, 골수계 세포가 존재하고 있음을 알 수 있다.
실시예
3. 방사선 조사를 시행한 돼지 생체에의 사람 제대혈 유래
조혈세포
생체이식 및 증식 효능
생후 3∼6주령의 란드레이스(Landrace)계 돼지를 X-Ray 방사선기(Linac 2100CD, Varian. USA)를 방사선 전신 조사를 실시하였다. 방사선 조사 전에 케타민과 럼푼으로 돼지를 마취하고, 적정한 방사선 조사량을 결정하기 위해서 돼지의 전 체적을 측정하였다. 방사선 조사는 400cGy (n=3)으로 실시하였으며, 방사선 조사 후 실시예 1에서 얻은 단핵구 세포(6-10 x 108 세포)를 방사선 조사된 돼지 골수조직에 골수천자를 이용해 세포이식을 시행하였다.
도 4a는 사람 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 400cGY의 방사선이 조사된 돼지 골수조직에 세포이식을 실시한 후, 3주에 채취된 말초혈액을 사람 조혈 세포 특이적 항체인 hCD45와 조혈 줄기 세포 결합 항체인 hCD34로 면역염색을 시행하여 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸다. 도 4b는 상기 방법으로 이식된 돼지를 상기 단핵구 세포의 골수조직 이식 후 2주, 4주, 6주에 말초혈액을 채취한 후 상기 항체로 면역염색을 실시하여 유세포분석기로 분석한 결과를 나타낸 것으로, 사람 조혈세포, NK 세포, B 세포, T 세포의 존재 여부를 나타낸다. 도 4c는 단핵구 세포 이식 후 27주 후에 말초혈액과 골수조직에서 혈액세포를 채취한 후 사람 조혈 줄기 세포(CD34양성)를 포함하여 NK세포(CD56양성), 골수계세포(CD14양성, CD13/33양성), B 세포(CD19양성), T 세포(CD3양성)의 존재 여 부를 특이적 항체 염색을 시행한 후 유세포분석기로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 방사선 조사된 돼지의 골수조직과 말초혈액 내에서 이식된 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하여 다양한 조혈세포의 존재가 확인되었으며 27주의 장기간 동안 조혈 줄기 세포의 정상적인 분화 또는 증식이 관찰되었다. 이러한 결과는 방사선 조사에 의해서 유도된 면역거부반응 제어 돼지가 이종 세포인 사람의 제대혈에서 분리된 조혈 줄기 세포를 생체 내에서 분화 또는 증식을 유도하여 사람 조혈세포의 생체 바이오리엑터(bioreactor)로서 활용될 수 있음을 나타낸다.
실시예
4. 항암제 투여 돼지
말초혈액속의
면역세포의 변화 양상 분석
생후 5∼7주령의 란드레이스(Landrace)계 돼지(n=3)에 200 mg/kg의 시타라빈을 3일 동안 매일 정맥투여한 다음, 말초혈액을 채취하여 백혈구 세포와 적혈구 세포의 변화 및 면역세포의 변화를 분석하였다.
도 5a는 상기와 같이 처리하여 채취한 말초혈액 중의 백혈구와 적혈구의 변화 양상을 측정한 결과를 나타내고, 도 5b는 시타라빈 투여를 시행한 돼지에서 투여 전, 투여 후 4주에 동안 돼지 말초혈액을 채취하여 돼지 T 면역세포 특이적 항체인 CD4와 CD8항체로 면역염색을 실시하여 돼지 말초혈액 내에서의 면역세포인 CD4양성 T 세포와 CD8양성 T 세포의 변화 양상을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b의 결과로부터, 시타라빈 투여 후 1주에서 돼지의 CD4양성의 hT 면역세포의 비율이 급감하는 것이 관찰되었으며 백혈구의 수도 투여를 시작한 후 급감하는 것으로 나타났다. 놀랍게도, 적혈구는 시타라빈 투여에도 불구하고 전혀 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 항암제 시타라빈이 선택적으로 백혈구만을 제어하고 있음을 시사한다.
실시예
5. 항암제 투여 돼지 생체에의 사람 제대혈 유래 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포의 생체이식 및 증식 효능
실시예 4에서 얻어진 시타라빈이 투여된 돼지의 골수조직에 골수 천자를 이용하여 사람의 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포의 생체 이식을 시행한 후, 돼지의 말초혈액을 채취하여 사람의 조혈 줄기 세포를 포함하는 조혈세포의 존재 여부를 특이적 항체 염색을 통한 유세포 분석기로 분석을 실시하였다.
도 6a는 상기 사람의 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 돼지 골수조직에 세포이식을 실시한 후 3주에 채취한 말초혈액을 이용해 사람 조혈세포 항체인 hCD45와 조혈줄기세포 특이 항체인 hCD34로 면역염색을 실시하여 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸다. 도 6b는 상기 이식 후 1주부터 4주 동안 말초혈액 속에 존재하는 사람 조혈 세포의 존재 유무를 유세포 분석기로 분석한 결과로서 사람 조혈세포, 조혈줄기세포, B 세포, T 세포, 골수계 세포, NK 세포의 존재 비율을 나타낸다.
도 6a 및 도 6b의 결과로부터, 시타라빈 투여를 통하여 돼지 면역세포의 기 능 억제를 시행한 돼지의 말초혈액에서 사람의 조혈 세포의 분화 또는 증식이 확인되었으며, 특히 NK세포와 골수계세포의 증식과 분화가 관찰되었다. 이러한 결과(도 5 및 도 6의 결과)는 시타라빈에 의한 돼지 면역제어 방법이 이종 세포 이식용 돼지의 제조를 위한 유용한 방법일 뿐만 아니라, 사람의 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포가 이식된 돼지가 사람의 조혈 세포의 생체 증식용 바이오 리엑터(bioreactor)로서 기능할 수 있음을 나타낸다.
도 1은 이종 세포인 사람의 제대혈에서 분리한 조혈 줄기 세포를 돼지의 골수 조직에 생체 이식한 후, 이식 조직 및 세포의 특성을 분석하는 연구 흐름도를 나타낸다.
도 2는 사람 제대혈에서 유래된 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 골수천자 방법을 이용하여 돼지의 골수조직 내에 세포를 주입하는 방법을 나타낸 것이다. 좌측 사진은 골수천자기를 이용해 마취된 돼지의 골수조직에 주사한 후 단핵구 세포를 이식하는 것을 나타낸 것이고, 우측 사진은 골수천자에 의해서 실질적으로 돼지 골수 조직 내에 정확하게 주입되는지를 자기공명장치(MRI)를 이용해 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 면역억제제인 사이클로스포린 A를 투여하여 면역을 억제시킨 돼지에 사람 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이식한 후, 돼지의 말초혈액에서 채취한 혈액을 사람 조혈 세포 특이적인 항체로 면역염색을 실시하여 돼지 혈액 속에 존재하는 사람 조혈 줄기 세포와 조혈 세포의 존재 여부를 분석한 결과이다. 도 3a는 사람 조혈 세포 특이 항체인 hCD45와 조혈 줄기 세포 특이 항체인 hCD34 항체를 이용한 면역염색을 시행한 말초혈액을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸다. 도 3b는 이식 후 1주부터 5주 동안 말초혈액을 채취하여 사람 특이적인 항체인 hCD45, hCD3, hCD19와 hCD14로 염색을 실시하여 말초혈액 중의 사람 조혈 세포의 증식 변화 양상을 분석한 도표를 나타낸다. 도 3c는 상기 돼지를 제대혈 이식 후 5주에 도살하여 돼지의 각 장기 조직을 적출하고, 적출된 장기 속 세포 의 게놈 DNA를 추출한 후, 사람 세포 특이적 액틴(actin) 유전자에 대한 PCR 프라이머를 이용해 각 조직에 존재하는 사람 세포의 유전자 검사를 시행한 결과를 나타낸다. 도 3d는 상기 돼지 두 마리에서 말초혈액을 추출하여 상기와 동일한 방법으로 추출한 게놈 유전자를 이용해 사람 특이적 액틴 유전자 프라이머로 유전자 분석을 시행한 결과를 나타낸다.
도 4a는 사람 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 400cGY의 방사선이 조사된 돼지 골수조직에 세포이식을 실시한 후, 3주에 채취된 말초혈액을 사람 조혈 세포 특이적 항체인 hCD45와 조혈 줄기 세포 결합 항체인 hCD34로 면역염색을 시행하여 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸다. 도 4b는 상기 방법으로 이식된 돼지를 상기 단핵구 세포의 골수조직 이식 후 2주, 4주, 6주에 말초혈액을 채취한 후 상기 항체로 면역염색을 실시하여 유세포분석기로 분석한 결과를 나타낸 것으로, 사람 조혈세포, NK 세포, B 세포, T 세포의 존재 여부를 나타낸다. 도 4c는 단핵구 세포 이식 후 27주 후에 말초혈액과 골수조직에서 혈액세포를 채취한 후 사람 조혈 줄기 세포(CD34양성)를 포함하여 NK세포(CD56양성), 골수계세포(CD14양성, CD13/33양성), B 세포(CD19양성), T 세포(CD3양성)의 존재 여부를 특이적 항체 염색을 시행한 후 유세포분석기로 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 항암제인 시타라빈을 투여하여 면역을 억제시킨 돼지의 말초혈액을 분석한 결과이다. 도 5a는 말초혈액 중의 백혈구와 적혈구의 변화 양상을 측정한 결과를 나타내고, 도 5b는 시타라빈 투여를 시행한 돼지에서 투여 전, 투여 후 4주에 동안 돼지 말초혈액을 채취하여 돼지 T 면역세포 특이적 항체인 CD4와 CD8항체 로 면역염색을 실시하여 돼지 말초혈액 내에서의 면역세포인 CD4양성 T 세포와 CD8양성 T 세포의 변화 양상을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸다.
도 6a는 항암제인 시타라빈을 투여하여 면역을 억제시킨 돼지에 사람 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 이식한 후 3주 후에 채취한 말초혈액을 이용해 사람 조혈세포 항체인 hCD45와 조혈줄기세포 특이 항체인 hCD34로 면역염색을 실시하여 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸다. 도 6b는 상기 이식 후 1주부터 4주 동안 말초혈액 속에 존재하는 사람 조혈 세포의 존재 유무를 유세포 분석기로 분석한 결과로서 사람 조혈세포, 조혈줄기세포, B 세포, T 세포, 골수계 세포, NK 세포의 존재 비율을 나타낸다.
Claims (30)
- (a) 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를, 3 ∼ 7 주령의 돼지에 300 ∼ 500 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하여 얻은 이종 장기 이식용 돼지에 이식하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 돼지의 장기로부터 분화 또는 증식된 조혈 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 조혈 세포의 생체 내(in vivo) 제조방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 흡수선량이 약 400 cGY인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방사선이 X-선, γ-선, 또는 전자빔인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 장기 이식용 돼지가 약 5 주령의 돼지인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포가 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포가 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(a)의 상기 이식이 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 상기 이종 장기 이식용 돼지의 골수에 주입함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(b)의 상기 돼지의 장기가 심장, 간장, 폐, 신장, 골수, 또는 말초혈액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제13항에 있어서, 단계(b)의 상기 돼지의 장기가 말초혈액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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- 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를, 3 ∼ 7 주령의 돼지에 300 ∼ 500 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하여 얻은 이종 장기 이식용 돼지에 이식하여 얻어진, 조혈 세포 증식용 돼지.
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- 제19항에 있어서, 상기 흡수선량이 약 400 cGY인 것을 특징으로 하는 조혈 세포 증식용 돼지.
- 제19항에 있어서, 상기 방사선이 X-선, γ-선, 또는 전자빔인 것을 특징으로 하는 조혈 세포 증식용 돼지.
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- 제19항, 제21항, 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 장기 이식용 돼지가 약 5 주령의 돼지인 것을 특징으로 하는 조혈 세포 증식용 돼지.
- 제19항, 제21항, 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포가 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 조혈 세포 증식용 돼지.
- 제19항, 제21항, 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포가 인간 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포인 것을 특징으로 하는 조혈 세포 증식용 돼지.
- 제19항, 제21항, 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식이 상기 조혈 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포를 상기 이종 장기 이식용 돼지의 골수에 주입함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 조혈 세포 증식용 돼지.
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020070091351A KR100935334B1 (ko) | 2007-09-10 | 2007-09-10 | 조혈 세포의 생체 내 제조방법 및 조혈 세포 증식을 위한동물 바이오리엑터 |
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| US6018096A (en) * | 1993-05-03 | 2000-01-25 | Surrogen, Inc. | Animal model for engraftment, proliferation and differentiation of human hematopoietic stem cells |
| KR20080031068A (ko) * | 2006-10-02 | 2008-04-08 | 포천중문의과대학교 산학협력단 | 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법 |
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2007
- 2007-09-10 KR KR1020070091351A patent/KR100935334B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| US6018096A (en) * | 1993-05-03 | 2000-01-25 | Surrogen, Inc. | Animal model for engraftment, proliferation and differentiation of human hematopoietic stem cells |
| KR20080031068A (ko) * | 2006-10-02 | 2008-04-08 | 포천중문의과대학교 산학협력단 | 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Transplantation, 제75권, 제7호, 제916-922면.* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20090026409A (ko) | 2009-03-13 |
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