KR20080031068A - 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 3 ∼ 7 주령의 돼지에 300 ∼ 500 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하는 단계를 포함하는, 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법 및 상기 제조방법으로 얻어진 이종 장기 이식용 돼지를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 이종 장기 이식용 돼지로부터 적출된 장기를 제공한다.
본 발명에 따른 제조방법은 적혈구 등의 생존에 필요한 혈구의 혈중 농도에는 유의성 있는 변화를 미치지 않으면서 백혈구 및 CD4+ T 및 CD8+ T세포 등의 면역세포만을 선택적으로 감소시킨 이종 장기 이식용 돼지를 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 돼지는 사람 등의 포유동물에 이식될 수 있는 장기를 제공할 수 있다.
돼지, 방사선 조사, 면역세포, 백혈구, 혈소판, 적혈구, 유세포 분석
Description
도 1은 방사선 조사량에 따른 돼지 생존율의 변화를 분석한 결과를 나타낸다.
도 2a 내지 2c는 방사선 조사 전과 조사 후 혈액속의 적혈구, 백혈구 및 혈소판의 숫자를 분석한 결과를 나타내며, 도 2a는 백혈구 세포, 도 2b는 적혈구 세포, 및 도 2c는 혈소판 수 변화를 각각 나타낸다.
도 3은 유세포 분석기(FACSvantage: Fluorescence Activated Cell Sorting)로 800 cGy의 흡수선량으로 방사선을 조사하기 전과 후의 돼지 혈액 속에 존재하는 돼지 면역세포인 CD4+ T 세포인 헬프 T 세포와 CD8+ T세포인 킬러 T 세포의 변화양상을 나타낸다.
도 4a 내지 4c는 유세포 분석기를 통한 분석에 의해 밝혀진 돼지 혈액 내 존재하는 helper T 면역세포의 방사선 조사에 따른 생체 변화 양상을 분석한 결과를 나타낸다. 도 4a는 800 cGy, 도 4b는 600 cGy, 도 4c는 400 cGy의 흡수선량으로 각각 방사선을 조사한 경우의 분석 결과이다.
도 5a 내지 5c는 킬러 T 면역세포의 변화양상을 분석한 결과를 나타낸다. 도 5a는 800 cGy, 도 5b는 600 cGy, 도 5c는 400 cGy의 흡수선량으로 각각 방사선을 조사한 경우의 분석 결과이다.
본 발명은 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법, 상기 제조방법으로 얻어진 이종 장기 이식용 돼지, 및 상기 이종 장기 이식용 돼지로부터 적출된 장기에 관한 것이다.
최근의 급격한 출산율 저하 및 고령화 현상과 더불어 골수를 포함한 세포 및 장기 제공자의 절대적인 부족현상은 심각한 사회문제로 대두되고 있다. 또한 헌혈자의 부족 및 인식도의 감소 현상은 날로 심각해지고 있으며 이로 인한 임상 현장에서의 고초는 날로 더해져만 가고 있다. 특히 이식 장기의 부족으로 인해서 고통받고 있는 환자는 날로 증대되고 있으며 이를 해결하고자하는 방법으로서 돼지를 이용한 사람 장기 이식 기술 방법이 개발되고 있다. 실질적으로 인간 장기 대체용 동물로서 주목을 받고 있는 돼지는 장기 제공원으로서 장기의 크기, 번식효율, 사육기술, 인체감염가능성을 고려할 때에 인간에 가장 적합한 동물로서 평가되고 있으며 실제로 선진국에서는 이미 이식용 돼지를 개발하고 있는 단계이다.
최근에는 복제 돼지를 생산하는 기술 개발이 이루어지고 있으며 이를 바탕으로 사람에의 생체 이식 시 발생될 수 있는 면역 항원을 유전자 재조합 기술을 이용해 제거하는 시도가 이루어지고 있다. 특히 돼지 배아에서 추출한 섬유아세포 및 EG세포를 이용해 사람 면역 세포에 감작되어 면역억제 반응을 유도하는 돼지 항원 인 GAP 유전자를 발현하지 않은 형질전환 돼지가 보고되고 있다.
또한, 면역억제제인 사이클로스포린 A(cyclosporine A)를 투여하여 면역세포의 증식작용을 지닌 사이토카인인 IL-2의 분비억제를 통하여 면역세포의 면역거부 반응을 제어하는 방법이 시도된 바 있다 (Pozzetto et al., Cyclosporine inhibits interleukin-2 production during human cellular immune response to pig antigens. Transplant. Proc. 1994.26.2869-2870). 또한, FK506은 T 면역세포와 다른 면역세포에 발현하고 있는 IL-2 유전자의 발현을 제어하는 전사인인 NFAT의 활성을 제어하는 칼시누린(calcineurin) 억제제로서 개발된 약제로서 사이클로스포린 A와 동일한 면역세포 기능 억제 효능을 지닌 약물로서 미니돼지(miniature swine)의 생체 투여를 통하여 MHC가 다른 동종 돼지의 신장 이식을 시행하여 장기간에 걸친 이식 장기에 대한 면역 관용을 유도시킨 바 있다( Ustuqi et.al., Induction of transplantation tolerance with a short course of tacrolimus(FK506):1. Rapid and stable tolerance to two-haplotype fully mhc-mismatched kidney allografts in miniature swine. Tansplantation 2001. 71(10):1368-79).
돼지를 이용해 사람의 심근세포를 추출하여 돼지의 심장에의 이식을 시행하여 돼지 생체 조직에서의 사람 심근세포의 증식과 분화를 분석한 결과 약 7개월 이상의 장기간에 걸처 사람 세포의 생착이 관찰한 연구결과가 보고된 바 있다 ( Husnain et.al., Myolbast transplantatin for cardiac repair using transient immunosuppression. Basic Appl. Myol.13(1):45-52, 2003).
최근에는 양이나 돼지를 이용한 사람의 줄기세포를 생체 이식한 연구가 진행 되고 있으며 이러한 대 동물 생체 내에서 줄기세포의 다양한 특성 및 기능 분석 연구가 진행되고 있다. 특히 양을 이용해 사람의 조혈 줄기세포를 분리하여 자궁을 통하여 임신 태아 복강 내에 세포이식을 시행하여 장기간에 걸친 조혈세포의 재생능력을 분석하는 연구결과가 보고되고 있으며, 또한 사람의 신경줄기세포(human neural stem cells, NSC)를 복간에 이식하여 조혈세포로의 분화를 유도하는 연구가 진행된 바 있다(Almeida-Porada et.al., In vivo haematopoietic potential of human neural stem cells. Br. J. Haematol. 2005. 130(2):276-83. McNiece et. al., Ex vivo expanded cord blood cells provide rapid engraftment in fetal sheep but lack long-term engrafting potential. Exp. Hematol. 2002. 30(6):612-6.)
한편, 방사선은 백혈병과 같은 조혈질환의 치료 방법으로서 이용되고 있으며 1968년부터 시행되어 사람의 골수이식의 효능을 증진할 수 있는 가장 중요한 치료 방법 중 하나이다. 고용량의 항암화학요법과 방사선 조사를 통하여 골수 및 혈액 속에 존재하는 백혈병 세포의 제거를 통하여 환자의 성공적인 치료를 유도하기 위한 방법으로서 현재에도 유용하게 이용되고 있다. 그러나, 전신 방사선 조사는 백혈병세포를 제거함과 동시에 정상적인 혈액 세포의 파괴도 유도하는 한계를 가지고 있다.
최근, 마우스의 면역세포에 의한 면역거부반응을 억제하는 수단으로서, 방사선 조사를 이용한 예가 보고된 바 있다. 즉, 마우스의 동종 이식 연구에서 치사량(120 cGY) 또는 반치사량(750 cGY)의 방사선을 조사한 후 동종세포의 생체 이식 을 시도한 예가 보고된 바 있다 (Mohiuddin MM et.al., Long-term survival of cardiac xenografts in fully xenogeneic bone marrow chimeras. Ann Thorac Surg. 2001 Sep;72(3):740-5).
그러나, 마우스와 같은 소동물과 달리, 인간 장기 제공원으로서 바람직한 동물인 돼지를 방사선 조사에 의해 면역 거부반응을 억제시킨 보고는 아직 없다. 또한, 면역 억제를 위해 중대 동물에 속하는 돼지에 방사선을 조사할 경우, 면역세포 뿐만 아니라, 생존에 필요한 적혈구 등의 혈구세포도 파괴됨으로써 돼지가 사망하는 결과가 초래되게 된다.
본 발명자들은 면역세포만이 선택적으로 억제된 이종 장기 이식용 돼지를 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 어린 돼지(piglet)에 특정 흡수선량으로 전신 방사선 조사(total body irradiation, TBI)를 실시할 경우, 적혈구 등의 생존에 필요한 혈구의 혈중 농도에는 유의성 있는 변화를 미치지 않으면서 백혈구 및 CD4+ T 및 CD8+ T세포 등의 면역세포만을 선택적으로 감소시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 방사선을 전신 조사하는 단계를 포함하는 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 얻어진 이종 장기 이식용 돼지를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 이종 장기 이식용 돼지로부터 적출된 장기를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 3 ∼ 7 주령의 돼지에 300 ∼ 500 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하는 단계를 포함하는, 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 제조방법으로 얻어진 이종 장기 이식용 돼지가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 이종 장기 이식용 돼지로부터 적출된 장기가 제공된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서, "이종 장기 이식용 돼지"라 함은 인간 등을 포함한 포유동물에 심장, 신장, 폐, 간, 췌장 등의 장기를 이식할 수 있는 돼지로서, 혈액분석학적으로(hematologically) 백혈구 및 CD4+ T 및 CD8+ T세포 등의 면역세포의 혈중 농도는 유의성 있게 감소되나, 적혈구의 혈중 농도는 유의성 있는 변화가 없는 돼지를 말한다.
본 발명에 따라, 어린(약 3 ∼ 7 주령) 돼지에 특정 흡수선량으로 전신 방사선 조사(total body irradiation, TBI)를 실시할 경우, 적혈구 등의 생존에 필요한 혈구의 혈중 농도에는 유의성 있는 변화를 미치지 않으면서 백혈구 및 CD4+ T 및 CD8+ T세포 등의 면역세포만을 선택적으로 감소시키는 혈액분석학적 양상(hematological profile)을 나타낸다. 특히, 특정 흡수선량으로 전신 방사선 조사를 실시함으로써, 돼지와 같은 중대(中大)형 동물이 면역거부반응을 최소화할 수 있다는 것은 매우 놀라운 것이며, 따라서, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 돼지는 사람 등의 포유동물에 이식될 수 있는 장기를 제공할 수 있다.
본 발명은 3 ∼ 7 주령, 바람직하게는 4 ∼ 6 주령, 더욱 바람직하게는 약 5 주령의 돼지에 300 ∼ 500 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하는 단계를 포함하는, 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 방사선의 흡수선량은 300 ∼ 500 cGY이며, 바람직하게는 약 400 cGY 이다. 상기 방사선은 의료 분야에서 널리 사용되는 방사선을 채용할 수 있으며, 예를 들면 X-선, γ-선, 전자빔 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 방사선 조사는 전신 조사(total body irradiation)로 수행되며, 방사선 전신 조사방법은 의료 분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 실시할 수 있으며, 별도로 제한되지 않는다. 예를 들어, 방사선 조사를 위해 전신을 고정시킨 후 방사선 조사기의 중앙에 위치시켜, 배면과 복면에 각각 방사선을 조사하여 방사선 전신 조사를 실시할 수 있다.
본 발명은 상기 제조방법으로 얻어진 이종 장기 이식용 돼지를 포함하며, 또한, 상기 이종 장기 이식용 돼지로부터 적출된 장기를 포함한다. 상기 적출된 장기는 상기에서 열거한 심장, 신장, 폐, 간, 췌장 등을 모두 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
.
생후 5∼7주령의 돼지를 마취하고, 분당 차병원 방사선실에서 800 cGy, 600 cGy, 400 cGy의 흡수선량으로 방사선을 조사한 다음, 방사선 조사전과 방사선 조사후의 돼지의 말초혈액을 항응고제가 포함된 튜브로 2-5ml 혈액을 채취하여 돼지 면역세포의 변화 양상 및 혈액세포의 변화를 분석하였다.
실시예
1. 방사선 조사에 따른 돼지 생존율
생후 5∼7주령의 란드레이스(Landrace)계 돼지에 X-Ray 방사선기(Linac 2100CD, Varian. USA)를 방사선 전신 조사를 실시하였다. 방사선 조사 전에 케타민과 럼푼으로 돼지를 마취하고, 돼지의 전 체적을 측정하였다. 방사선 조사는 각각 800 cGy (n=2), 600 cGy (n=2), 및 400 cGy (n=4)의 3개의 군으로 나누어 실시하였으며, 방사선 조사 후 사육장에서 사육하면서 방사선 조사에 따른 돼지의 생존율 변화를 관찰하였다.
도 1은 각각의 조사량에 따른 돼지의 생존율 변화를 그래프로 나타낸 것이다. 800 cGy의 흡수선량으로 방사선을 조사한 경우 조사 2주령에서 1 마리가 사망하였으며 그 후 4주째에 나머지 한 마리도 사망하였다. 600 cGy의 흡수선량으로 방사선을 조사한 경우에도 유사한 결과를 얻었으며 방사선 조사 후 약 4 주령에서 모든 돼지가 사망하였다. 이에 반해, 400 cGy의 흡수선량으로 방사선을 조사한 경우 2주령에서 한 마리가 사망하였고 5주에도 한 마리가 사망하였으나 나머지 두 마리 의 돼지는 7주 이상 생존하였다.
실시예
2. 방사선 조사에 따른 돼지 혈구세포의 변화 분석
실시예 1에서 방사선 조사된 돼지로부터 혈액을 채취하여 방사선 조사에 따른 혈액 내의 혈액세포인 백혈구, 적혈구 및 혈소판의 변화를 분석하였다. 구체적으로, 방사선 조사 전 및 조사 후의 소정의 시간에 채취한 혈액(1 ml)을 채취하여 혈액 1 ㎕에 존재하는 백혈구, 적혈구 및 혈소판의 숫자를 혈구카운터로서 측정하였다.
도 2a 내지 2c는 방사선 조사 전과 조사 후 혈액속의 적혈구, 백혈구 및 혈소판의 숫자를 분석한 결과를 나타내며, 도 2a는 백혈구 세포, 도 2b는 적혈구 세포, 및 도 2c는 혈소판 수 변화를 각각 나타낸다. 도 2a에서 알 수 있는 바와 같이 모든 흡수선량에서 백혈구가 크게 감소함으로써 면역이 크게 저하되는 것을 확인할 수 있다. 이에 반해, 도 2b에서 알 수 있는 바와 같이 800 cGy를 조사한 경우, 조사 10 일후부터 급격한 적혈구 감소의 빈혈 현상이 관찰되었고, 600 cGy 및 400cGy를 조사한 경우 적혈구는 크게 변화하지 않았다. 또한, 도 2c에서 알 수 있는 바와 같이, 800 cGy, 600 cGy, 및 400 cGy의 흡수선량 모두에서 흡수선량 의존적으로 혈소판의 감소가 관찰되었으나, 400cGy의 흡수선량으로 방사선을 조사한 경우에는 2 주까지에도 약 50% 이상을 유지하고 있어 감소폭이 매우 작았다. 따라서, 사망률 및 혈구 분석 결과에 근거할 때, 적어도 600 cGy의 흡수선량 미만으로 방사선을 조사한 경우, 생존에 필요한 적혈구 수준 및 혈소판 수준을 유지하면서, 면역력 만을 선택적으로 감소시킬 수 있을 것으로 판단된다.
실시예
3. 방사선 조사에 따른 돼지 면역세포의 특성
실시예 1에서 방사선 조사된 돼지로부터 혈액을 채취하여 방사선 조사에 따른 면역세포(CD4+T 세포 및 CD8+ T 세포)의 변화를 분석하였다. 구체적으로, 방사선 조사 전 및 조사 후 1주부터 7주까지 혈액(1 ml)을 매주 채취하여 면역세포 분석용 샘플로 이용하였다. 항응고제가 함유된 튜브에 돼지의 귀 정맥에서 채취한 혈액 3-5 ml를 이용해 유세포 분석용 세포로 면역염색을 실시하였다. 혈액속의 단핵구는 Ficoll(슈크로스의 중합체)과 Hypaque(디크리조에이트나트륨: sodium ditrizoate)의 중합체인 Ficoll-Hypaque를 이용하여 분리하였다. 혈액을 Ficoll-Hypaque 위에 중층하여 2000 rpm으로 20분간 원심분리하여 중간층의 단핵구 부분을 채취한 후, PBS(Phosphate Buffer Saline)를 넣은 코니컬튜브에 채취된 단핵구를 넣고 1300rpm으로 5분간 2회 원심분리하여, 코니컬튜브 바닥에 모인 백혈구가 함유된 단핵구 세포만을 분리하였다.
분리된 단핵구 세포 1x106 세포를 돼지 면역세포 항원인 CD3의 항체인 항 CD3 항체(BD bioscience, USA)와 돼지 헬퍼(helper) T 세포 항원인 CD4에 대한 항 CD4 항체(BD bioscience, USA), 돼지 cytotoxic T세포 항원인 CD8에 대한 항 CD8 항체(BD bioscience, USA)로 96 웰 플레이트에서 면역염색을 30분 동안 실시하였다. 염색되지 않은 항체를 제거하기 위해서 면역 염색용 완충액인 Staining Media(PBS(-)에 2% 우태아혈청(FBS:fetal bovine serum, GIBCO)와 0.05%의 소듐 아지드(sodium azide)를 첨가한 용액)으로 2회 세척하였다.
도 3은 유세포 분석기(FACSvantage: Fluorescence Activated Cell Sorting)로 800 cGy의 흡수선량으로 방사선을 조사하기 전과 후의 돼지 혈액 속에 존재하는 돼지 면역세포인 CD4+ T 세포인 헬프 T 세포와 CD8+ T세포인 킬러 T 세포의 변화양상을 나타낸다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 1 주후부터 CD3+CD4+ 헬프 T 세포와 CD3+CD8+ 킬러 T세포는 방사선 조사 전에 비해서 크게 감소하였고 이러한 현상은 2 주후에도 지속되었다. 이는 방사선 조사를 통하여 돼지 면역세포인 CD4+ T세포와 CD8+ T 면역세포를 직접적으로 생체에서 제거된다는 것을 나타낸다.
도 4a 내지 4d는 유세포 분석기를 통한 분석에 의해 밝혀진 돼지 혈액 내 존재하는 helper T 면역세포의 방사선 조사에 따른 생체 변화 양상을 분석한 결과를 나타낸다. 800 cGy와 600 cGy의 방사선 조사에 따른 면역세포의 변화(각각 도 4a 및 4b)는 조사 후 일주 후부터 급격한 감소현상이 관찰되었으며, 400 cGy의 흡수선량으로 조사된 돼지도 역시 면역세포의 감소가 관찰되었으나(도 4c 참조).
도 5a 내지 5d는 상기와 동일한 방법으로 킬러 T 면역세포의 변화양상을 분석한 결과를 나타낸다. 800 cGy의 방사선을 조사한 경우, 킬러 T 면역세포의 비율이 급격히 감소하였으며, 400 cGy의 흡수선량으로 조사된 돼지도 역시 면역세포의 감소가 관찰되었으나(도 5c 참조).
본 발명에 따른 제조방법은 적혈구 등의 생존에 필요한 혈구의 혈중 농도에 는 유의성 있는 변화를 미치지 않으면서 백혈구 및 CD4+ T 및 CD8+ T세포 등의 면역세포만을 선택적으로 감소시킨 이종 장기 이식용 돼지를 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 돼지는 사람 등의 포유동물에 이식될 수 있는 장기를 제공할 수 있다.
Claims (6)
- 3 ∼ 7 주령의 돼지에 300 ∼ 500 cGY의 흡수선량으로 방사선을 전신 조사하는 단계를 포함하는, 이종 장기 이식용 돼지의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 돼지가 약 5 주령의 돼지인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 흡수선량이 약 400 cGY인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방사선이 X-선, γ-선, 또는 전자빔인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 얻어진 이종 장기 이식용 돼지.
- 제5항에 따른 이종 장기 이식용 돼지로부터 적출된 장기.
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