JP2023504573A - 造血幹細胞を生成するための方法 - Google Patents
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Abstract
様々な態様および実施形態において、本開示は、内皮細胞を造血性内皮（ＨＥ）細胞に転換し、ＨＥ細胞を、有意なレベルのＬＴ－ＨＳＣを含むＨＳＣを含むＨＳＣに転換するための、遺伝的、薬理学的、および機械的刺激を提供する。本開示はさらに、遺伝的、薬理学的および機械的刺激を使用してＨＳＣを増殖させる方法を提供する。
Description
優先権の主張
本願は、２０１９年１２月９日に出願された米国仮特許出願番号第６２／９４５，８３８号の利益を請求する。当該出願の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本願は、２０１９年１２月９日に出願された米国仮特許出願番号第６２／９４５，８３８号の利益を請求する。当該出願の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
連邦政府の資金による研究
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された登録番号ＨＬ１３１６４５、の下での政府支援を伴ってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された登録番号ＨＬ１３１６４５、の下での政府支援を伴ってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、胚発生の間に、特異的誘導事象が中胚葉を血液幹細胞および血液前駆細胞に変換させる他とは異なる領域において派生する。ＨＳＣは、造血と呼ばれるプロセスにおいて、赤血球、血小板、骨髄およびリンパ（Ｔ細胞およびＢ細胞）細胞を生じさせることができる。
ＨＳＣ移植（ＨＳＣＴ）は、血液疾患、骨髄疾患、代謝性疾患、および免疫疾患を有する患者を処置するために広く使用されている。臍帯血およびハプロタイプ一致の幹細胞の移植が進歩しているにもかかわらず、ＨＳＣ移植の治療的使用は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合する適切なドナーを適時に、特に少数民族の国において見つけることの困難性、および国内での非血縁ドナー登録がないことから、制限されていることが多い。混血の人は米国人口の１．６パーセント（９７０万人）を占めているが、複合人種のボランティアは登録されている７００万人のうちわずか３パーセント（２１０００人）であり、６０００人の患者が、骨髄が適合しないままである。適切な適合が見つかる場合でも、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ドナー拒絶、および処置に関連する高い死亡率などの免疫学的合併症が、患者の生存を危うくし得る。しかし、これらの合併症は、自家移植によって排除される。自家ＨＳＣは同種異系ＨＳＣの全てに代わるわけではないが、特に血液悪性腫瘍の状況では、自家ＨＳＣは、ドナーアベイラビリティの欠如、ならびに広範囲の悪性および非悪性の血液学的障害、免疫障害、および代謝障害を有する患者でのＧＶＨＤを含む、ＨＳＣＴにおける大きなハードルを克服する。
したがって、ＨＳＣＴのための、自家ＨＳＣまたは既成ＨＳＣを含むＨＳＣを生成することが必要とされている。
本開示は、特定の内皮および造血遺伝子の発現または活性の変化が、内皮細胞からの造血幹細胞（ＨＳＣ）形成、例えば自己再生、生着および多細胞系成人血液を再構成することができる長期（ＬＴ）－ＨＳＣのかなりの数の形成を誘導するという発見に、少なくとも部分的に基づいている。
ｃｄｈ５－モルファント（ｃｄｈ５－ＭＯ）胚は、心拍出量および活性な血流を伴わずに、血管において、心拍動が介在する脈動を有する。脈動に由来する伸展は、ピエゾ１機械感受性チャネルを活性化させ、このチャネルは、大動脈－性腺－中腎（ＡＧＭ）領域におけるＤｎｍｔ３ｂの発現をさらに増強させ、これは次いでコア内皮および造血遺伝子およびその制御因子の発現を調節し、造血性内皮からＨＳＣへの転換を刺激する。脈動の刺激またはピエゾ１の薬理学的活性化はまた、２～３倍多い量のＬＴ－ＨＳＣを生じさせ、このＨＳＣは、連続移植で、正常な機能的な多細胞系成人血液を再構成する。一部の実施形態において、本開示に従って生産される造血幹細胞はかなりの数のＬＴ－ＨＳＣを含み、これは、優れた生着を示し、レシピエントにおいて、機能的な多細胞系成人血液を再構成する。
一部の実施形態において、本発明は、ＬＴ－造血幹細胞（ＨＳＣ）を含むＨＳＣの集団を調製する方法を提供する。方法は、内皮および／または造血性内皮（ＨＥ）細胞を含む細胞集団を提供すること、ならびに内皮および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現を低下させる、または活性を変化させることを含む。方法は、内皮および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現を増大させる、または活性を変化させることをさらに含む。内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、および造血遺伝子の発現または活性を増大させることによって、ＨＥ細胞またはＨＳＣ（かなりの数のＬＴ－ＨＳＣを含む）の形成が刺激される。内皮遺伝子の発現または活性の低下および造血遺伝子の発現または活性の増大は、例えば阻害剤、導入遺伝子、エピソーム、ｍＲＮＡおよびその誘導体の投与による、および／または（本明細書により完全に記載するように）遺伝子編集アプローチを使用した直接的なものであり得る。あるいは、発現または活性におけるそのような変化は、例えばＤＮＡ（シトシン－５－）－メチルトランスフェラーゼ３ベータ（Ｄｎｍｔ３ｂ）および／またはＧＴＰａｓｅ ＩＭＡＰファミリーメンバー６（Ｇｉｍａｐ６）の発現または活性を増大させることによって、少なくとも部分的に間接的に誘導されてもよい。さらに、そのような遺伝子発現調節は、少なくとも部分的に、機械感受性受容体またはチャネルのアゴニスト（例えばピエゾ１アゴニスト）を使用すること、または繰り返しひずみによる生体力学的伸展を細胞に適用することによって行われてもよい。様々な実施形態において、ｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６、およびａｐｌｎから選択される少なくとも１つ、または少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の内皮遺伝子は、発現が直接的または間接的に低下されている。これらの、または他の実施形態において、ｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される少なくとも１つ、または少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の造血遺伝子は、発現が直接的または間接的に増大される。
一部の実施形態において、内皮遺伝子および造血遺伝子の発現または活性は、少なくとも部分的に、ＨＥ細胞またはＨＳＣの形成を刺激するのに十分な条件下において、細胞におけるＤｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の活性または発現を増大させることによって調節される。一部の実施形態において、ＨＥ細胞は回収され、ＨＳＣの形成に使用される。ＨＳＣは回収されてよく、場合によって患者への投与のために増殖させ得る。ＨＳＣは場合によって、本明細書中において記載する、遺伝的、薬理学的または機械的な刺激を使用して増殖される。
一部の実施形態において、内皮細胞は、有効量の、Ｄｎｍｔ３ｂの活性または発現を増大させるか、または内皮遺伝子および造血遺伝子の適切な調節を提供するアゴニストと接触させられる。一部の実施形態において、アゴニストは、機械感受性受容体または機械感受性チャネルのアゴニストである。一部の実施形態において、機械感受性受容体は、ピエゾ１である。典型的なピエゾ１アゴニストとしては、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１およびＪｅｄｉ２が挙げられる。一部の実施形態において、ピエゾ１アゴニスト（例えばＹｏｄａ１）の有効量は、約０．１μＭから約３００μＭ、もしくは約０．１μＭから約２００μＭ、もしくは約１μＭから約１００μＭ、または一部の実施形態において、約１０μＭから約１００μＭ、もしくは約２．５μＭから約１００μＭまたは約２．５μＭから約５０μＭの範囲にある。
代替的な機械感受性受容体または機械感受性チャネルアゴニスト（例えばピエゾ１アゴニスト）は化学ライブラリーから同定することができる。これらの実施形態において、本明細書に記載される内皮および造血遺伝子発現の変化を誘導するアゴニストが同定される。例えば、候補アゴニストは、候補化合物との接触時に、内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６、およびａｐｌｎから選択される内皮遺伝子の発現を低下させるか、または活性を変化させ、内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現を増大させるか、または活性を変化させる。
遺伝子の活性または発現を内皮細胞および／またはＨＥ細胞において直接増大させる場合、様々なアプローチを使用することができる。例えば、遺伝子のｍＲＮＡ発現は、ｍＲＮＡ転写産物（修飾ｍＲＮＡを含む）を細胞に送達することによって、または活性を増大させるためもしくは変化させるための１つもしくは複数の修飾を有し得る導入遺伝子および／もしくはエピソームを導入することによって、増大させることができる。一部の実施形態において、遺伝子編集を利用して、内皮細胞またはＨＥ細胞における発現エレメントに遺伝子修飾を導入して、例えば、プロモーターの強度、リボソーム結合、またはＲＮＡの安定性を増大させる。一部の実施形態において、遺伝子編集は、機能獲得型突然変異を導入するために使用される。
一部の実施形態において、遺伝子の活性または発現は、内皮細胞および／またはＨＥ細胞において直接的に低下されてもよい。例えば、内皮遺伝子の発現または活性は、完全または部分的な遺伝子欠失、ＲＮＡサイレンシング、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を導入すること、および発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること（プロモーター強度、リボソーム結合、またはＲＮＡ安定性を低下させることを含む）または内皮細胞および／またはＨＥ細胞において機能喪失型突然変異を導入することの１つまたは複数によって低下させてもよい。
一部の実施形態において、本発明は、内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるＧｉｍａｐ６の活性または発現を、単独でまたはＤｎｍｔ３ｂと組み合わせて増大させることを含む。Ｇｉｍａｐ６の活性または発現を増大させるために、Ｇｉｍａｐ６のｍＲＮＡ転写産物、または代わりにＧｉｍａｐ６導入遺伝子および／もしくはエピソームを細胞に導入することができ、ならびに／あるいは細胞におけるＧｉｍａｐ６発現エレメントの遺伝子修飾（プロモーターの強度、リボソーム結合、またはＲＮＡの安定性を増大させるための１つまたは複数の修飾など）の導入も行うことができる。
様々な実施形態において、胚様体、内皮細胞および／またはＨＥ細胞を含む細胞集団がバイオリアクターに導入される。一部の実施形態において、バイオリアクターは、繰り返しひずみによる生体力学的伸展を２Ｄまたは３Ｄ培養中の細胞に提供する。例えば、繰り返しひずみによる生体力学的伸展が２Ｄまたは３Ｄ培養表面に適用されてもよい。繰り返しひずみによる生体力学的伸展は、Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の活性または発現を増大させる。例えば、（例えば、底が柔らかい培養プレートの）ナイロン膜、ＰＤＭＳ膜または他の生体適合かつ生物模倣膜に接続された、コンピュータ制御される真空ポンプシステム（例えば、ＦｌｅｘＣｅｌｌ（商標）Ｔｅｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｙｔｏｓｔｒｅｔｃｈｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、または類似のもの）を使用して、規定され制御された繰り返しひずみ条件下で、円周方向の伸展をエクスビボで２Ｄまたは３Ｄ培養において膜に接触する胚様体、内皮細胞またはＨＥ細胞に与えることができる。
様々な実施形態において、ＨＳＣの転換は、ピエゾ１の活性化；機械的伸展；Ｄｎｍｔ３ｂに対する、導入遺伝子による修飾を伴うもしくは伴わない（すなわち、導入遺伝子フリー）、エピソームによる修飾を伴うもしくは伴わない、または遺伝子修飾を伴うもしくは伴わないｍＲＮＡの導入；Ｇｉｍａｐ６に対する、導入遺伝子による修飾を伴うもしくは伴わない（すなわち、導入遺伝子フリー）、エピソームによる修飾を伴うもしくは伴わない、または遺伝子修飾を伴うもしくは伴わない、ｍＲＮＡの導入；本明細書において記載される１つまたは複数の造血遺伝子に対する、導入遺伝子による修飾を伴うもしくは伴わない（すなわち、導入遺伝子フリー）、エピソームによる修飾を伴うもしくは伴わない、または遺伝子修飾を伴うもしくは伴わない、ｍＲＮＡの導入；および、完全または部分的な遺伝子欠失、ＲＮＡサイレンシング、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を導入すること、または本明細書において記載される内皮遺伝子に遺伝子修飾を導入することから選択される１つまたは複数によって誘発される。
一部の実施形態において、内皮細胞および／またはＨＥ細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非造血幹細胞、または線維芽細胞もしくは内皮細胞などの体細胞から得られるかまたはそれに由来する。一部の実施形態において、内皮細胞および／またはＨＥ細胞は、ＨＬＡヌル細胞、ＨＬＡ修飾細胞、遺伝子修正細胞、ウイルスベクター過剰発現細胞、導入遺伝子過剰発現細胞および／もしくは導入遺伝子フリーの細胞から、または胚様体から内皮細胞および／またはＨＥ細胞への遺伝的誘導から得られるか、またはそれに由来する。同種異系ドナーの源細胞に由来する、またはＨＳＣで処置される対象に由来するものを含む、造血性内皮細胞（例えば、Ｆｌｋｌ＋ＣＤ４５＋細胞、Ｆｌｋｌ＋ＣＤ４１＋細胞、またはＣＤ３１＋ＣＤ４３＋細胞）は、あらゆる様式で得ることができる（すなわち、自家細胞または同種細胞から造血性内皮細胞への、化学的誘導、遺伝的誘導、ｍＲＮＡ誘導、導入遺伝子フリーの誘導、またはエピソーム誘導）。一部の実施形態において、内皮細胞またはＨＥ細胞は、レシピエント、既製バンクまたは万能適合ドナー由来の細胞を使用して作製したｉＰＳＣから生成される。一部の実施形態において、発生的に柔軟な（developmentally plastic）内皮細胞が利用される。
様々な実施形態において、本明細書において記載される方法によって調製されたＨＳＣの集団および薬学的に許容されるビヒクルを含む、細胞療法のための医薬組成物が調製される。医薬組成物は、少なくとも約１０２個のＨＳＣ、または少なくとも約１０３個のＨＳＣ、または少なくとも約１０４個のＨＳＣ、または少なくとも約１０５個のＨＳＣ、または少なくとも約１０６個のＨＳＣ、または少なくとも約１０７個のＨＳＣ、または少なくとも１０８個のＨＳＣを含み得る。様々な実施形態において、組成物中のＨＳＣの少なくとも約０．１％、または少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％はＬＴ－ＨＳＣである。例えば、一部の実施形態において、レシピエントの体重１キログラム当たり約１０万から約４×１０６個のＨＳＣ（例えば、約２×１０６個細胞／ｋｇ）を含む医薬組成物が投与される。
一部の実施形態において、本明細書において記載される方法によって調製されたＨＳＣの集団を含む細胞療法が準備される。一部の実施形態において、細胞療法は、薬学的に許容されるビヒクルを含む。細胞療法は、少なくとも約１０２個のＨＳＣ、または少なくとも約１０３個のＨＳＣ、または少なくとも約１０４個のＨＳＣ、または少なくとも約１０５個のＨＳＣ、または少なくとも約１０６個のＨＳＣ、または少なくとも約１０７個のＨＳＣ、または少なくとも１０８個のＨＳＣを含み得る。様々な実施形態において、組成物中のＨＳＣの少なくとも約０．１％、または少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％はＬＴ－ＨＳＣである。例えば、一部の実施形態において、レシピエントの体重１キログラム当たり約１０万個から約４×１０６個のＨＳＣ（例えば、約２×１０６個細胞／ｋｇ）を含む医薬組成物が投与される。ＨＳＣ細胞の数は、患者の年齢および体重に基づいて変化させることができる。
移植のためのＨＳＣは、一部の実施形態において、約２カ月間未満、または約１カ月未満（例えば約４週間）、または約２週間未満、または約１週間未満、または約６日間未満、または約５日間未満、または約４日間未満、または約３日間未満などの、比較的短い期間で生成させることができる。一部の実施形態において、発生的に柔軟な内皮またはＨＥ細胞を、内皮および造血遺伝子の活性または発現を調節して、１～４週間培養する。
本明細書において記載される方法によって調製されたＨＳＣは、例えば静脈内注入または骨髄内移植によって、対象（レシピエント）に投与される。本方法は、骨髄破壊的な、非骨髄破壊的な、または免疫毒素に基づく（例えば、抗ｃ－Ｋｉｔ、抗ＣＤ４５など）前処置レジメンの後に行うことができる。
本明細書において記載される方法は、後天性または先天性の形態の血液疾患（悪性および非悪性）、骨髄疾患、代謝性疾患、ミトコンドリア疾患ならびに免疫疾患を例えば処置するための移植プロトコルにおいて使用するためのＨＳＣの集団を生成するために使用することができる。一部の実施形態において、ＨＳＣ集団は自家細胞に由来し、例えば、レシピエント対象の細胞を使用して作製されるｉＰＳＣから生成される。一部の実施形態において、ＨＳＣ集団は、万能適合ドナー細胞またはＨＬＡヌル造血性内皮細胞または正常なＨＳＣをもたらす類似の細胞に由来する。
本発明のこれらのおよび他の態様および実施形態は、以下の本発明の詳細な説明によって記載される。
胎児の発生の間、大動脈－性腺－中腎（ＡＧＭ）における内皮細胞のサブセットは造血性内皮細胞であり、これは、その運命を変化させて、胎児の肝臓および骨髄を最終的にコロニー形成するＨＳＣとなる。しかし、造血性内皮細胞を刺激する因子の個性は依然として不明確であり、機能的ＨＳＣの潜在的由来源としての、造血性内皮細胞の利用性を制限している。内膜に対する、血流が介在するずり応力は、ＨＳＣの内皮性の出現を刺激する。しかし、Ｃｄｈ５ヌルゼブラフィッシュモデルおよびマウスモデルを使用して、早期の循環停止にもかかわらず、機能的ＨＳＣが生じることが確認された。Anderson H, et al., 「Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.」 Blood 2015。これらのｃｄｈ５がサイレンシングされたモデルを、機能的ＨＳＣの出現を引き起こす、ずり応力および／または一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）非依存性の生体力学的力を研究するための中心として、本開示に従って使用して、脈圧が介在する円周方向の伸展がそれによってＨＳＣの出現を左右するさらなるメカニズムを調べた。
実験室において造血性内皮細胞からＨＳＣを生成するための試みは、造血性内皮細胞からのＨＳＣの出現を刺激する因子についての知識が欠如していることに一部には起因して、広く不成功に終わっている。現在は、拍動している心臓からの脈動に起因する血管の円周方向の伸展が、造血性内皮細胞からの機能的ＨＳＣの出現を引き起こし、この機能的ＨＳＣが最終的に生着し、確定的な細胞系に分化し得ることが確認されている。加えて、伸展感受性の一過性受容体電位型陽イオンチャネルサブファミリーバニロイドメンバー４（Ｔｒｐｖ４）チャネルの活性化は、サイレントな心臓（ｔｎｎｔ２、ｓｉｈ）、すなわち、心拍動および血流が不存在のサイレンシングされた胚における、ＨＳＣの形成を回復させた。参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０９６２１５号パンフレットを参照されたい。
本開示は、機械感受性受容体（例えば、ピエゾ１）の生体力学的および／または薬理学的活性化が、造血幹細胞（ＨＳＣ）の形成のためにＤｎｍｔ３ｂの発現を増強させるという発見に、少なくとも一部は基づいており、これは次いでコアセットの内皮遺伝子および造血遺伝子ならびにその制御因子の発現を調節する。本明細書において実証されているように、ｃｄｈ５－モルファント（ｃｄｈ５－ＭＯ）胚は、心拍出量および活性な血流を伴わずに、血管において、心拍動が介在する脈動を有する。脈動に由来する伸展は、ピエゾ１機械感受性チャネルを活性化させ、これはさらに、ＡＧＭにおけるＤｎｍｔ３ｂの発現を増強させて、内皮からＨＳＣへの転換を刺激する。脈動の刺激またはピエゾ１の薬理学的活性化はまた、少なくとも３倍多い量のＬＴ－ＨＳＣを生じさせ、これは、連続移植で、正常な機能的な多細胞系の成人血液に再構成する。
したがって、本開示の結果は、心拍動が介在する生体力学的力が、いかにして、機械感受性チャネルおよびエピジェネティックな機構を活性化することによって、細胞運命の転換および幹細胞の形成を刺激するかを実証している。ＬＴ－ＨＳＣの開発、増殖、および幹細胞性の維持は、血液疾患および骨髄疾患を処置するためのＨＳＣ移植および細胞療法における主要な目的である。本開示は、ＬＴ－ＨＳＣを開発するための遺伝的および薬理学的標的を提供する。様々な態様において、本開示は、内皮細胞を造血性内皮（ＨＥ）細胞に転換するため、およびＨＥ細胞を、有意なレベルのＬＴ－ＨＳＣを含むＨＳＣを含むＨＳＣに転換するための遺伝的、薬理学的および機械的刺激を提供する。本開示はさらに、遺伝的、薬理学的および機械的刺激を使用してＨＳＣを増殖させる方法を提供する。
一態様において、本発明は、ＬＴ－ＨＳＣを含むＨＳＣの集団を調製する方法を提供する。特定の実施形態において、方法は、内皮細胞および／またはＨＥ細胞を含む細胞集団を提供すること、ならびに内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６、およびａｐｌｎから選択される２つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現を低下させるか、または活性を変化させることを含む。方法はさらに、内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現を増大させるか、または活性を変化させて、ＬＴ－ＨＳＣを含むＨＳＣの形成を刺激することを含む。
一部の実施形態において、方法は内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６、およびａｐｌｎから選択される３つまたは５つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現を低下させる、または活性を変化させること、ならびに内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２、およびｍｌｌｔ３から選択される３つまたは５つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現を増大させる、または活性を変化させることを含む。例えば、一部の実施形態において、方法は内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｃｄｈ５、およびｐｌｘｎｄ１の発現を低下させる、または活性を変化させること、ならびに内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１およびｇａｔａ２の発現を増大させる、または活性を変化させることを含む。
一部の実施形態において、少なくとも１つ、２つ、３つ、または５つの造血遺伝子の発現または活性は直接的に増大される。本明細書において使用される場合、遺伝子の発現または活性は、前記遺伝子の機能的コピーをコードする核酸が細胞に導入される、またはその発現または関連する活性を増大させる改変が内在性遺伝子になされている場合、「直接的に」増大される。例えば、活性または発現は、コードｍＲＮＡを導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、および機能獲得型突然変異を導入することから独立して選択されるアプローチを使用して直接的に増大され得る。一部の実施形態において、発現または活性が増大する造血遺伝子のフルセットは発現または活性が直接的に増大される。
エピソームを使用した因子の発現を使用する本開示の様々な実施形態によれば、そのような実施形態は所望の要素を発現する非組み込みエピソームプラスミドを、例えば導入遺伝子フリーおよびウイルスフリー細胞集団の作製のために導入することを含み得る。複製能が制限されており、そのためにいくつかの細胞世代で喪失される、知られているエピソームプラスミドが使用されてもよい。
一部の実施形態において、少なくとも１つ、２つ、３つまたは５つの内皮遺伝子の発現または活性が直接的に低下される。本明細書において使用される場合、遺伝子の発現または活性は、核酸または薬理学的阻害剤が細胞に導入されるか、またはその発現または関連する活性を低下させる改変が内在性遺伝子になされる場合、直接的に低下される。例えば、活性または発現は、完全または部分的な遺伝子欠失、ＲＮＡサイレンシング、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害、薬理学的阻害を導入すること、および発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、または機能喪失型突然変異を導入することから独立して選択されるアプローチを使用して直接的に低下され得る。一部の実施形態において、特定の実施形態において発現または活性化が低下されている内皮遺伝子のフルセットは、発現または活性が直接的に低下されている。
一部の実施形態において、１つまたは複数の内皮遺伝子および１つまたは複数の造血遺伝子の発現または活性は、例えば、ＨＳＣの形成を刺激するために十分な条件下で（発現レベルおよび発現がより高い期間を含む）、内皮細胞におけるＤＮＡ（シトシン－５－）－メチルトランスフェラーゼ３ベータ（Ｄｎｍｔ３ｂ）および／またはＧＴＰａｓｅ ＩＭＡＰファミリーメンバー６（Ｇｉｍａｐ６）の活性または発現を増大させることによって間接的に調節し得る。
Ｄｎｍｔ３ｂ（ＤＮＡ（シトシン－５－）－メチルトランスフェラーゼ３ベータ）は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼである。Ｄｎｍｔ３ｂは核に主に局在し、その発現は、発生的に制御されている。Ｇｉｍａｐ６は、免疫関連タンパク質（ＧＩＭＡＰ）ファミリーのＧＴＰａｓｅのメンバーである。ＧＩＭＡＰタンパク質は、ＧＴＰ結合モチーフおよびコイルドコイルモチーフを含有する。
一部の実施形態において、様々な実施形態による内皮細胞、またはＨＥ細胞またはＨＳＣは、有効量の、Ｄｎｍｔ３ｂの活性または発現を増大させる機械感受性受容体または機械感受性チャネルのアゴニストと接触させられ、それによって間接的に内皮遺伝子および造血遺伝子の発現レベルを調節するか、または活性を変化させる。一部の実施形態において、機械感受性受容体は、ピエゾ１である。典型的なピエゾ１アゴニストは、Ｙｏｄａ１である。他の典型的なピエゾ１アゴニストとしては、Ｊｅｄｉ１およびＪｅｄｉ２が挙げられる。
Ｙｏｄａ１（２－［５－［［（２，６－ジクロロフェニル）メチル］チオ］－１，３，４－チアジアゾール－２－イル］－ピラジン）は、機械感受性イオンチャネルであるピエゾ１のために開発された低分子アゴニストである。Syeda R, 「Chemical activation of the mechanotransduction channel Piezo1.」 eLife (2015)。Ｙｏｄａ１は、以下の構造を有する。
Ｙｏｄａ１の誘導体は、様々な実施形態において利用することができる。例えば、２，６－ジクロロフェニル核を含む誘導体が、一部の実施形態において利用されている。典型的なアゴニストは、Evans EL, et al., Yoda1 analogue (Dooku1) which antagonizes Yoda1-evoked activation of Piezo1 and aortic relaxation, British J. of Pharmacology 175(1744-1759): 2018において開示されている。Ｊｅｄｉ１およびＪｅｄｉ２は、Wang Y., et al.,「A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive Piezo1 channel」、Nature Communications (2018)9:1300に記載されている。Ｊｅｄｉ１およびＪｅｄｉ２は、３－カルボン酸メチルフラン構造モチーフを有する。このモチーフを共有する他のピエゾ１アゴニストを、本発明の実施形態に従って使用し得る。
一部の実施形態において、ピエゾ１アゴニスト（例えば、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１またはＪｅｄｉ２）の有効量は、約０．１μＭから約５００μＭ、または約０．１μＭから約３００μＭ、または約０．１μＭから約２００μＭ、または約０．１μＭから約１００μＭ、または一部の実施形態においては、約１μＭから約３００μＭ、約１μＭから約２００μＭ、約１μＭから約１００μＭ、約１μＭから約５０μＭ、または約１０μＭから約１００μＭ、または約１０μＭから約１００μＭ、または約１０μＭから約５０μＭの範囲内にある。
ピエゾ１を含む代替的なアゴニストは化学ライブラリーにおいて同定し得る。このような化学ライブラリーは、ピエゾ１、または他の機械感受性受容体またはチャネルに結合する、および／またはこれを活性化させる化合物を含み得る。ライブラリーは、Ｙｏｄａ１の誘導体を含んでいてもよく、これは、場合によって２，６－ジクロロフェニルコアまたはその化学模倣物を有し得る。ライブラリーは、Ｊｅｄｉ１および／またはＪｅｄｉ２の誘導体を含む、またはさらに含んでいてもよく、これは場合によってフランコア（例えば、３－カルボン酸メチルフランコア、またはその誘導体もしくは化学模倣物）を含み得る。ライブラリーは、候補化合物との接触時に内皮細胞および／またはＨＥ細胞において、本明細書において記載される内皮遺伝子の発現または活性を低下させ、内皮細胞および／またはＨＥ細胞において、本明細書において記載される造血細胞の発現または活性を増大させる化合物についてスクリーニングし得る。発現または活性の変化は、対照細胞、すなわち候補化合物に接触していない細胞との比較によって決定し得る。一部の実施形態において、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ２、および／またはＪｅｄｉ２と接触させた細胞を、遺伝子発現調節についての陽性対照として使用し得る。
これらの実施形態において、本発明は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を作製する方法であって：化学化合物のパネルを内皮細胞および／または造血性内皮細胞と接触させ、前記化学化合物によって誘導されるＤｎｍｔ３ｂまたはＧｉｍａｐ６；ｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎの少なくとも２つ（または少なくとも３つもしくは少なくとも５つ）；およびｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３の少なくとも２つ（または少なくとも３つもしくは少なくとも５つ）の発現レベルの変化を決定することを含む、方法を提供する。以下の遺伝子発現の変化：Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の発現の増大；ｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎの３つまたはそれ以上の発現低下；およびｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３の２つまたはそれ以上の発現の増大の１つまたは複数を誘導する化合物が次いで選択される。選択された化合物を次いで（例えばバイオリアクター中で）使用し、内皮細胞および／または造血性内皮細胞のＨＳＣへの転換を誘導し得る。得られたＨＳＣは、生着し、多細胞系血液を再構成することができる自己再生ＨＳＣである。一部の実施形態において、選択された化合物は、内皮および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｃｄｈ５およびｐｌｘｎｄ１の発現を低下させ；内皮および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１およびｇａｔａ２の発現を増大させる。
一部の実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂの活性または発現は、内皮細胞またはＨＥ細胞において直接増大させることができる。例えば、Ｄｎｍｔ３ｂのｍＲＮＡ発現は、Ｄｎｍｔ３ｂをコードする転写産物を細胞に送達することによって、またはＤｎｍｔ３ｂをコードする導入遺伝子を導入することによって、または、細胞へのエピソームの導入に限定されない、活性を増大させるもしくは変化させるための１つもしくは複数のヌクレオチド修飾（もしくはコードされているアミノ酸の修飾）を有し得る導入遺伝子フリーの方法によって、増大させることができる。一部の実施形態において、遺伝子編集を、遺伝子修飾を内皮細胞内のＤｎｍｔ３ｂ発現エレメントに導入するために利用して、例えば、プロモーターの強度、リボソーム結合、ＲＮＡの安定性を増大させる、またはＲＮＡスプライシングに影響を与える。一部の実施形態において、機能獲得型突然変異がＤｎｍｔ３ｂ遺伝子に導入される。
一部の実施形態において、本発明は、内皮細胞におけるＧｉｍａｐ６の活性または発現を、繰り返しひずみまたはピエゾ１の活性化の際に、単独でまたはＤｎｍｔ３ｂおよび／または他の修飾された遺伝子と組み合わせて増大させることを含む。Ｇｉｍａｐ６の活性または発現を増大させるために、Ｇｉｍａｐ６をコードするｍＲＮＡの転写産物を細胞に導入することができ、導入遺伝子フリーのアプローチもまた利用することができ、これには、限定はしないが、細胞へのエピソームの導入が含まれ、または代わりに、活性を増大させるもしくは変化させるための１つもしくは複数のヌクレオチド修飾（もしくはコードされているアミノ酸の修飾）を有し得る、Ｇｉｍａｐ６をコードする導入遺伝子を利用することができる。一部の実施形態において、遺伝子編集が、遺伝子修飾を内皮細胞内のＧｉｍａｐ６発現エレメントに導入する（プロモーターの強度、リボソーム結合、ＲＮＡの安定性を増大させる、またはＲＮＡスプライシングに影響を与えるための、１つまたは複数の修飾など）ために利用される。一部の実施形態において、機能獲得型突然変異がＧｉｍａｐ６遺伝子に導入される。
一部の実施形態において、ｍＲＮＡおよび／またはエピソーム（例えば、Ｄｎｍｔ３ｂまたはＧｉｍａｐ６をコードするまたは本明細書において記載する１つまたは複数の造血遺伝子をコードする）は、例えば直接的な化学合成またはインビトロでの転写によって、合成的に生産され、内皮細胞に導入される。既知の化学的修飾を使用して、細胞における自然免疫応答を避けることができる。例えば、基準的なヌクレオチドのみを含む合成ＲＮＡは、パターン認識受容体に結合することができ、細胞において強力な免疫応答を引き起こすことができる。この応答は、翻訳の遮断、炎症性サイトカインの分泌、および細胞死を生じさせ得る。ある特定の基準的でないヌクレオチドを含むＲＮＡは、自然免疫系による検出を回避し得、高い効率でタンパク質に翻訳され得る。特に、自然免疫応答を避けるためのヌクレオチド修飾に関しては、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１８１，３１９号明細書を参照されたい。ｍＲＮＡは、既知の方法によって、ＨＳＣ生産の間に１回または定期的に細胞に導入することができる。
一部の実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６および／または本明細書において記載する１つまたは複数の造血遺伝子の発現は、所望のレベルの過剰発現を導き得る導入遺伝子を（様々なプロモーター強度、または発現調節エレメントの他の選択を伴って）細胞に導入することによって増大される。導入遺伝子は、当技術分野において知られている様々なウイルスベクターまたはトランスフェクション試薬を使用して導入することができる。一部の実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６および／または造血遺伝子の発現は、導入遺伝子フリーの方法（例えば、エピソーム送達）によって増大する。
一部の実施形態において、遺伝子の発現または活性は、遺伝子編集技術を使用して、例えばプロモーター強度、リボソーム結合、ＲＮＡ安定性またはＲＮＡスプライシングを変更するように１つまたは複数の修飾を導入するように調節される。様々な編集技術が知られており、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガー（ＺＦ）および転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。これらのＤＮＡ結合ドメインの１つまたは複数およびＦｏｋｌエンドヌクレアーゼの切断ドメインを有する融合タンパク質を使用して、細胞内のＤＮＡの所望の領域において二本鎖切断を生じさせることができる（例えば、これらのうち全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／００６４６２０号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０２３９３１５号明細書、米国特許第８，４７０，９７３号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０２１７１１９号明細書、米国特許第８，４２０，７８２号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号明細書、米国特許第８，４５０，４７１号明細書、米国特許第８，４４０，４３１号明細書、米国特許第８，４４０，４３２号明細書、および米国特許出願公開第２０１３／０１２２５８１号明細書を参照されたい）。一部の実施形態において、遺伝子編集は、当技術分野において知られているＣＲＩＳＰＲ結合Ｃａｓシステムを使用して行われる。例えば、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６９７，３５９号明細書、米国特許第８，９０６，６１６号明細書、および米国特許第８，９９９，６４１号明細書を参照されたい。
様々な実施形態において、発生的に柔軟な内皮細胞またはＨＥ細胞を含む細胞集団（胚様体を含むが、これに限定されない）が、バイオリアクターに導入される。一部の実施形態において、バイオリアクターは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０９６２１５号パンフレットにおいて記載されているように、繰り返しひずみによる生体力学的伸展を提供する。繰り返しひずみによる生体力学的伸展は、Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の活性または発現を増大させ、これは次いで本明細書において記載する内皮遺伝子の発現を低下させ、本明細書において記載する造血遺伝子の発現を増大させる。これらの実施形態において、機械的手段が伸展力を２Ｄまたは３Ｄ培養の細胞に与える。例えば、コンピュータ制御される真空ポンプシステム（例えば、ＦｌｅｘＣｅｌｌ（商標）Ｔｅｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｙｔｏｓｔｒｅｔｃｈｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、または類似のもの）は、培養表面として使用されるナイロン膜、ＰＤＭＳ膜または他の生体適合もしくは生物模倣膜に接続し得る。次いで、システムを使用して、規定され制御された繰り返しひずみ条件下で、円周方向の伸展をエクスビボで２Ｄまたは３Ｄ培養の細胞に与えることができる。
一部の実施形態において、繰り返しひずみによる生体力学的伸展は、内皮細胞および／またはＨＥ細胞における内皮遺伝子の発現または活性を低下させ、内皮細胞および／またはＨＥ細胞における造血遺伝子の発現または活性を増大させて、ＨＳＣの形成を刺激する。
様々な実施形態において、ＨＳＣの転換は、ピエゾ１の活性化、機械的伸展、ｍＲＮＡの導入、Ｄｎｍｔ３ｂに対する、ｍＲＮＡ、導入遺伝子による修飾、導入遺伝子フリーの（例えば、エピソームによる）修飾、もしくは遺伝子修飾の導入、および／または、Ｇｉｍａｐ６に対する、ｍＲＮＡ、導入遺伝子による修飾、導入遺伝子フリーの（例えば、エピソームによる）修飾、もしくは遺伝子修飾の導入、から選択される少なくとも手段によって誘発される。様々な実施形態において、内皮細胞またはＨＥ細胞における、本明細書において記載される少なくとも１つの造血遺伝子は、発現または活性が直接的に増大する、および／または本明細書において記載される少なくとも１つの内皮遺伝子は発現または活性が直接的に低下される。
内皮細胞またはＨＥ細胞は、血液疾患、骨髄疾患、代謝性疾患、または免疫疾患を有する対象から得ることができるかまたはそれに由来し得る。一部の実施形態において、対象は、血液の悪性腫瘍を有していない。ＨＳＣの集団をレシピエントに投与することができる。自家ＨＳＣ移植のための、ｉＰＳ細胞、内皮細胞および／またはＨＥ細胞の源細胞はレシピエントに由来しているであろう。
一部の実施形態において、内皮細胞および／またはＨＥ細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非造血幹細胞、または限定はしないが線維芽細胞および内皮細胞を含む体細胞から得られるかまたはそれに由来する。一部の実施形態において、内皮細胞またはＨＥ細胞は、ＨＬＡヌル細胞、ＨＬＡ修飾細胞、および／もしくは導入遺伝子フリーの細胞から、または内皮細胞からＨＥ細胞への遺伝的誘導から得られるかまたはそれに由来する。造血性内皮細胞（例えば、Ｆｌｋｌ＋ＣＤ４５＋細胞、Ｆｌｋｌ＋ＣＤ４１＋細胞、またはＣＤ３１＋ＣＤ４３＋細胞）は、例えば同種異系のドナーのまたはＨＳＣで処置される対象の源細胞から、任意の様式で得ることができる。例えば、ＨＥ細胞は、自家細胞または同種細胞から造血性内皮細胞への化学的誘導、遺伝的誘導、導入遺伝子フリーの誘導、またはエピソームによる誘導によって得ることができる。一部の実施形態において、ＨＥ細胞は、レシピエントの細胞から、またはＨＬＡ修飾されている細胞から、またはＨＬＡヌル細胞である細胞から作製されたｉＰＳＣから生じる。一部の実施形態において、ＨＥ細胞は、万能適合ドナーである対象の細胞から得られるかまたはそれに由来する。造血性内皮細胞を調製するための方法は、当技術分野において知られており、この方法としては、ヒト多能性幹細胞からの生成が含まれる。参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０９６２１５号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１９／０１１９６４３号明細書を参照されたい。また、Ditadi et al., Nature Cell Biol. 17(5) 580-591 (2015)、Sugimura et al., Nature 2017; 545(7655):432-438、Nakajima-Takagi et al, Blood. 2013; 121(3):447-458、Zambidis et al., Blood. 2008 Nov 1; 112(9):3601-14、およびPark et al, Cytometry A. 2013 Jan; 83(1): 114-126（効率的なｈｉＰＳＣ分化のための、ヒト胚様体（ｈＥＢ）に基づく血液－内皮分化方法）；Choi et al., Cell Rep. 2012 Sep 27; 2(3): 553-567（ＯＰ９との共培養におけるｈＰＳＣ分化）；Sandler et al, 2014 July 17; 511(17509):312-318（内皮細胞から造血細胞）も参照されたく、また、Sluvkin, Blood 2013 122:4035-4046も参照されたい。一部の実施形態において、ＨＳＣの生産を開始するためのＨＥ細胞の数は、少なくとも約１０２個細胞、約１０３個細胞、約１０４個細胞、約１０５個細胞、約１０６個細胞、約１０７個細胞、または少なくとも１０８個細胞である。一部の実施形態において、本開示に従って生産される造血幹細胞は、レシピエントにおいて優れた生着を示し、機能的な多細胞系成人血液を再構成する、長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む。一部の実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋細胞を含む。
一部の実施形態において、多能性幹細胞は、体細胞をリプログラミングすることによって調製された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。例えば、体細胞は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８およびｋｌｆ４から選択されるリプログラミング因子の発現によってリプログラミングされ得る。一部の実施形態において、リプログラミング因子は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８およびｋｌｆ４である。一部の実施形態において、リプログラミング因子は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、およびｋｌｆ４である。ｉＰＳＣを調製する方法は、例えば米国特許第１０，６７６，１６５号明細書、米国特許第９，５８０，６８９号明細書、および米国特許第９，３７６，６６４号明細書に記載されており、これらは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。様々な実施形態において、リプログラミング因子は、よく知られたウイルスベクターシステム、例えばレンチウイルスまたはセンダイウイルスシステムを用いて発現される。あるいは、リプログラミング因子は、リプログラミング因子をコードするｍＲＮＡを体細胞に導入することによって発現され得る。なおさらに、ｉＰＳＣは、リプログラミング因子を発現する非組み込みエピソームプラスミドを、すなわち、導入遺伝子フリーおよびウイルスフリーなｉＰＳＣの作製のために導入することによって作製することができる。複製能が限定されており、そのためにいくつかの細胞世代の間に喪失される、知られているエピソームプラスミドが使用されてもよい。一部の実施形態において、ｉＰＳＣは、（これらに限定されないが）線維芽細胞またはＰＢＭＣなどの体細胞から生成される。様々な実施形態において、ｉＰＳＣはレシピエントと自家または同種異系（例えばＨＬＡ適合）である。一部の実施形態において、ｉＰＳＣはＨＬＡ修飾細胞またはＨＬＡヌル細胞である。
様々な実施形態において、作製されたＨＳＣは増殖される。例えば、ＨＳＣは、米国特許第８，１６８，４２８号明細書、米国特許第９，０２８，８１１号明細書、米国特許第１０，２７２，１１０号明細書、および米国特許第１０，２７８，９９０号明細書に開示されている方法に従って増殖されてもよく、これらは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、一部の実施形態において、ＨＳＣのエクスビボ増殖は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）またはＰＧＥ２誘導体を使用する。
様々な実施形態において、本明細書において記載される方法によって調製されたＨＳＣの集団および薬学的に許容されるビヒクルを含む、細胞療法のための医薬組成物が調製される。医薬組成物は、少なくとも約１０２個のＨＳＣ、または少なくとも約１０３個のＨＳＣ、または少なくとも約１０４個のＨＳＣ、または少なくとも約１０５個のＨＳＣ、または少なくとも約１０６個のＨＳＣ、または少なくとも約１０７個のＨＳＣｓ、または少なくとも約１０８個のＨＳＣを含み得る。一部の実施形態において、細胞の部分集団（例えば、ＬＴ－ＨＳＣ）は、例えば細胞選別アプローチを使用して単離または濃縮し得る。様々な実施形態において、組成物中のＨＳＣの少なくとも約０．１％、または少なくとも約０．５％、または少なくとも約１％、または少なくとも約２％、または少なくとも約３％、または少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％はＬＴ－ＨＳＣである。様々な実施形態において、組成物は、約２から約２５％のＬＴ－ＨＳＣを含み、いくつかの実施形態においては、約５％～約２５％を含む。例えば、一部の実施形態において、レシピエントの体重１キログラム当たり約１０万から約４×１０６個の（ＣＤ３４＋）ＨＳＣ（例えば、約２×１０６個細胞／ｋｇ）を含む医薬組成物が投与される。一部の実施形態において、医薬組成物は、少なくとも約１０３個、少なくとも約１０４個、または少なくとも約１０５個のＬＴ－ＨＳＣ細胞を含む。
治療または移植のためのＨＳＣは、一部の実施形態において、２カ月間未満、または１カ月間未満、または約２週間未満、または約１週間未満、または約６日間未満、または約５日間未満、または約４日間未満、または約３日間未満などの、比較的短い期間で生成させることができる。一部の実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の活性または発現が増大した内皮細胞が、１から４週間にわたり培養される。
細胞組成物は、静脈内注入または他の投与経路に適した薬学的に許容される担体またはビヒクルをさらに含み得、また、適切な凍結保護物質を含み得る。典型的な担体は、ＤＭＳＯ（例えば、約１０％ＤＭＳＯ）である。細胞組成物は、単位バイアルまたは袋で提供され得、使用まで凍結状態で保存され得る。ある特定の実施形態において、組成物の容積は、約１液量オンスから１パイントである。
本明細書において記載される方法を使用して生成されたＨＳＣは、例えば静脈内注入または骨髄内移植によって、対象（レシピエント）に投与される。本方法は、骨髄破壊的な、非骨髄破壊的な、または免疫毒素に基づく（例えば、抗ｃ－Ｋｉｔ、抗ＣＤ４５など）前処置レジメンの後に行うことができる。
本明細書において記載される方法は、例えば、血液疾患（悪性および非悪性の）、骨髄疾患、代謝性疾患、ならびに免疫疾患を処置するための移植プロトコルにおいて使用するためのＨＳＣの集団を生成するために使用することができる。一部の実施形態において、ＨＳＣ集団は、自家細胞または万能適合ドナー細胞またはＨＬＡ修飾細胞またはＨＬＡヌル細胞に由来する。すなわち、ＨＳＣ集団は、レシピエント対象の細胞から調製されたまたはドナー細胞（例えば、万能ドナー細胞、ＨＬＡ適合細胞、ＨＬＡ修飾細胞、もしくはＨＬＡヌル細胞）から調製された、発生的に柔軟な内皮細胞またはｉＰＳＣに由来するＨＥ細胞から生成される。一部の実施形態において、自己に由来する細胞が使用され、レシピエント対象は、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、胚細胞腫瘍、自己免疫障害（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症）、骨髄異形成症候群、アミロイドーシス、または自家ＨＳＣ移植を使用して処置可能な他の状態から選択される状態を有している。一部の実施形態において、自己に由来する細胞（例えば、ＨＳＣは、レシピエント対象の細胞から生成される）が使用され、レシピエント対象は、血液の悪性腫瘍を有していない。
一部の実施形態において、レシピエント対象は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性障害、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、再生不良性貧血、純赤血球無形成症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコニ貧血、サラセミアメジャー、鎌状赤血球性貧血、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、ウィスコット・オルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球症、先天性代謝異常、表皮水疱症、重症先天性好中球減少症、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ピアソン症候群、および白血球接着不全症から選択される状態を有している。一部のこのような実施形態において、同種異系由来細胞または万能適合ドナー細胞またはＨＬＡ修飾細胞またはＨＬＡヌル細胞が、ＨＥ細胞の生成に使用される。例えば、ＨＳＣは、ドナー対象、すなわちレシピエント対象以外の対象の細胞から生成される。一部の実施形態において、ドナー対象は、血液型およびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイピングに基づいてレシピエント対象と適合している。
本明細書において使用される場合、用語「約」は、それが伴う数値の±１０％を意味する。
本発明のこれらの態様および他の態様をここで、以下の非限定的な実施例で説明する。
二次造血の際、第１のセットのＨＳＣが、胎児発生の間にＡＧＭにおいて造血性内皮細胞から生じる。したがって、内皮細胞および／または造血性内皮細胞は、ＡＧＭ微小環境に存在する内因性因子および外因性因子のレパートリーが確立されていれば、臨床的使用のためのＨＳＣを発生または増殖させるための源であり得る。
一度形成されると、ＡＧＭ由来のＨＳＣは、胎児の肝臓および骨髄に移動し、ここで長期（ＬＴ）および短期（ＳＴ）ＨＳＣへの非対称分裂を起こす。ＬＴ ＨＳＣは、非対称分裂をさらに起こすことによってＨＳＣのプールを保存する一方で、ＳＴ－ＨＳＣは、対称分裂によって血液生産の動的需要を支持する。７つの転写因子（ＥＲＧ、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＬＣＯＲ、ＲＵＮＸ１およびＳＰＩ１）の誘導（Sugimura, R, et al., Nature, 2017）ならびに血管ニッチ由来のアンジオクラインサイトカイン（ＴＧＦβ、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＲ４およびＢＭＰ）を伴うＦＧＲＳ（Ｆｏｓｂ、Ｇｆｉ１、Ｒｕｎｘ１およびＳｐｉ１）転写因子の誘導（Lis, R. et al., Nature, 2017）は、内皮から造血への転換を増強する。しかし、これらのアプローチは、内皮細胞または造血性内皮細胞にＬＴ－ＨＳＣの機能および特性を付与しない。さらに、これらの転写因子の多くは、制御解除されると、造血器悪性腫瘍に関連しているため、組み込みベクターまたは導入遺伝子フリーのアプローチを使用する、その過剰発現に基づく研究は、遺伝子量効果の分析を可能にするものではない。さらに、エクスビボで増殖させたＨＳＣは、ＨＬＡ適合健常ドナーＨＳＣを見つける必要性を除くものではない。したがって、長期血液形成のためのＬＴ－ＨＳＣの自家または既製リザーバーを開発するために、造血性内皮細胞からの新規ＬＴ－ＨＳＣ形成に寄与する細胞外因性または非組み込み因子を分析することが重要である。
ＨＳＣに転換する内皮細胞運命のプロセスは、造血プログラムの漸進的な変性を伴う、内皮の潜在性の初期の喪失によって特徴付けられる。ＥＨＴの間に、内皮遺伝子の長期サイレンシングを付与するエピジェネティックなメカニズムが存在し得る。ＥＺＨ１は、原始的な造血期間の間の最終的な造血プログラムを活発に抑制する（Vo, LT, et al., Nature, 2018）一方で、ＩＳＷＩクロマチンリモデリングは、原始的および最終的な造血の両方を制御する（Huang HT, et al., Nat. Cell. Biol., 2013）。さらに、ｄｎｍｔ３ｂが、ＨＳＰＣ維持のためにｃ－ｍｙｂ発現を制御する（Gore AV, et al., Elife, 2016）にもかかわらず、内皮遺伝子サイレンシングまたは新規ＬＴ－ＨＳＣ形成におけるｄｎｍｔ３ｂの役割は未知である。どのメカニズムがＬＴ－ＨＳＣの形成を支持するように内皮のエピジェネティックランドスケープを持続的に変更し得るかは未知である。
本明細書において開示されているように、本開示は、心拍動および／または脈動介在性の生体力学的伸展および／またはピエゾ１機械感受性経路の薬理学的活性化がいかにしてコア遺伝子の発現に影響を与え、ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣを含む）を形成するための内皮エピジェネティックランドスケープを消失させるかを実証している。さらに、脈動様状態を模倣するバイオリアクターを開発し、ピエゾ１を、ＬＴ－ＨＳＣ形成を刺激し、スケールアップするための薬理学的標的であると定めた。
心拍動が介在する脈動は、内皮からＨＳＣへの転換を刺激する。
不偏のゼブラフィッシュエチルニトロソウレア（ＥＮＵ）突然変異生成のスクリーニングによって、カドヘリン－５（ｃｄｈ５、ｖｅ－ｃｄｈ）のゼブラフィッシュ突然変異体であるｍａｌｂｅｃ（ｂｗ２０９ｍｌｂ）を得た。ｍａｌｂｅｃ胚およびｃｄｈ５－モルファント（ＭＯ）胚は、循環不全にもかかわらず、正常な一次造血および二次造血を示す。
不偏のゼブラフィッシュエチルニトロソウレア（ＥＮＵ）突然変異生成のスクリーニングによって、カドヘリン－５（ｃｄｈ５、ｖｅ－ｃｄｈ）のゼブラフィッシュ突然変異体であるｍａｌｂｅｃ（ｂｗ２０９ｍｌｂ）を得た。ｍａｌｂｅｃ胚およびｃｄｈ５－モルファント（ＭＯ）胚は、循環不全にもかかわらず、正常な一次造血および二次造血を示す。
内皮からＨＳＣへの転換を刺激する、血流およびずり応力に依存しない生体力学的力を同定するために、ｃｄｈ５欠損胚における心臓の機能および解剖学ならびに血管を分析した。
微細血管造影を、蛍光デキストランビーズをゼブラフィッシュ胚の２腔心臓の心房に注射することによってまず行い、デキストランビーズを次いで、循環内で追跡した。蛍光デキストランビーズは、対照胚では房室（ＡＶ）弁および心室を経由して全身循環に入るが、このビーズは、ｃｄｈ５－モルファント胚の心房で捕捉された。
心臓の構造を調べるために、心臓を、対照胚およびｃｄｈ５がサイレンシングされた胚から単離し、免疫組織化学を、内膜（ｇｆｐ）および心筋細胞（ｍｆ２０）について行った。心房（Ａ）、房室（ＡＶ）弁、心室（Ｖ）、および流出路（ＯＴ）がｃｄｈ５－モルファントでは形成されたが、ＡＶ弁は延び、歪んでいることが分かった。
ｃｄｈ５がサイレンシングされた胚においてなぜ循環が弱まったかを調べるために、ｃｄｈ５がサイレンシングされた胚における血管構造、ならびに血液循環、心拍数、心拍出量、および心臓タンポナーデを分析した。
ｍｌｂ×ｋｄｒ：ｄｓＲＥＤ胚において、内膜の完全性を分析した。動脈および静脈の構造がｃｄｈ５欠損胚において無傷であることが分かった。
心臓の経時的発生、心拍動、血管、血液循環、およびＨＳＣ形成は、ゼブラフィッシュ、マウス、およびヒトにおいて保存されている。ゼブラフィッシュの発生の間、心臓は受精の約２３時間後（ｈｐｆ）に拍動し始め、血液循環はおよそ２４～２６ｈｐｆで開始され、確定的なＨＳＣは、３０～４８ｈｐｆの間にＡＧＭ領域において造血性内皮細胞から生じる。
心臓が拍動を開始する前後の血管内の循環を分析するために、対照胚およびｃｄｈ５がサイレンシングされたｌｃｒ：ｅＧＦＰ×ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ胚の低速度撮影共焦点イメージングを行った。
心臓が拍動を開始した後でも、ｌｃｒ：ｅＧＦＰ＋赤血球が、ｃｄｈ５がサイレンシングされた胚の血管内に蓄積していたことが分かった。このことは、心拍動が開始し、血管が形成されているにもかかわらず、ｃｄｈ５－モルファントにおいて活性な循環が不存在であることを実証している。
ｃｄｈ５がサイレンシングされた胚における心臓の機能を調べるために、電気生理学的評価および心臓超音波による評価を行った。ｃｄｈ５－ＭＯ胚における心拍数は対照に匹敵していたが、一回拍出量はｃｄｈ５－ＭＯ胚においてほとんど存在しなかった。したがって、心拍出量（＝一回拍出量×心拍数）は、ｃｄｈ５－ＭＯ胚において減少していることが確認された。
ｃｄｈ５－ＭＯ胚は、心腔内に、心臓からの血液の逆流に起因し得る心膜液貯留を有していた。心膜腔における体液の蓄積によって、心室充満が低減し、その後、血行動態が悪化する。心臓タンポナーデが心膜腔内での体液の蓄積における因子であったかどうかを調べるために、ｃｄｈ５－ＭＯ胚の心腔を、心膜穿刺のように穿刺し、次いで、心膜液を吸入して、心臓に与えられる流体圧力を低減させた。しかし、ｃｄｈ５－モルファント心臓の心拍出量の欠乏は回復させることができなかった。
心拍動はｃｄｈ５－モルファントにおいて正常であったが、ｃｄｈ５－モルファントの心拍出量は、心臓の構造的欠陥に起因して損なわれており、その結果、囲心腔に血液が蓄積した。ｃｄｈ５－ＭＯ胚は正常な造血を有しているため、心拍動に由来する生体力学的力が活性循環の不存在下でのＨＳＣ形成に影響することが仮定された。
ｃｄｈ５－ＭＯ胚は拍動している心臓を有しており、活性な循環は有していないが、ｃｄｈ５－ＭＯ胚は、その血管の大動脈内皮でのＨＳＣ形成を有する。対照ゼブラフィッシュ胚のＡＧＭを拡大すると、血管の、他とは異なる脈動が確認された。循環血球に依存しない、血管内での脈動の存在と、おそらく血流であると思われるものとを区別するために、血管の脈動周波数と、循環血球の脈動周波数および血流に起因する動きとを比較した。具体的には、ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ＋血管内の循環ｌｃｒ：ｅＧＦＰ＋赤血球を有するダブルトランスジェニック系の低速度撮影共焦点イメージング、ならびに、両血管および循環血球からのシグナルのフーリエ分析を行った。血管の周波数スペクトルは、別個のピークを有することが分かった。したがって、血管内の脈動および血流は共存するが、これらの存在および性質は、互いに独立している。
３６ｈｐｆでのＡＧＭにおける脈動の時間的、空間的、および機能的存在を調べるために、対照ゼブラフィッシュ胚における血管領域のライトシート顕微鏡法と、その後のフーリエ分析とを行った。データは、ＡＧＭが、ｆｌｋ１：ｅＧＦＰ＋内皮細胞から生じるｒｕｎｘ１：ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＨＳＰＣの低速度撮影共焦点イメージングで見られる内皮細胞から造血細胞への転換のための時間および位置である３６ｈｐｆで、他とは異なる脈動周波数を有することをさらに裏付けている。総合すると、ＡＧＭ領域は拍動していることが分かり、ＡＧＭにおける脈動は、内皮細胞から造血細胞への転換と同時に発生する。
血管は、円周方向の壁応力および内皮のずり応力を生じさせる、心拍動が介在する血圧および血流からの一定の機械的ロード下にある。血流は内皮細胞にずり応力を与え、血管拡張を誘発するが、心拍動が介在する脈動は内皮細胞および平滑筋細胞の両方に対して円周方向の伸展を生じさせ、機械的膨張を生じさせる。
ＨＳＣ由来のｃｄｈ５－ＭＯ胚が血流介在性のおよびずり応力介在性のＮＯＳ活性化を経由するかまたはそれに依存しないかを分析するために、ＨＳＰＣの発現を、ＮＯＳ阻害剤であるＬ－ＮＡＭＥで処置した対照胚およびｃｄｈ５－ＭＯ胚において分析した。ＮＯＳの阻害は対照胚においてＨＳＰＣ形成を弱めるが、ｃｄｈ５－ＭＯ胚においてはＨＳＰＣ形成に影響を与えないことが実証された。したがって、ＨＳＣ由来のｃｄｈ５－ＭＯ胚は、ＮＯＳの活性化に依存しない。
総合すると、心拍動が介在する脈動は、循環に依存しない内皮からＨＳＣへの形成を刺激する。
伸展は、ＨＳＣ形成のためにピエゾ１を活性化させる。
生体力学的力は、細胞の形状および運命の転換を刺激するため、造血性内皮細胞の脈動介在性の周期的伸展がＨＳＣ形成を刺激すると仮定した。
生体力学的力は、細胞の形状および運命の転換を刺激するため、造血性内皮細胞の脈動介在性の周期的伸展がＨＳＣ形成を刺激すると仮定した。
内皮からのＨＳＣの形成における脈動の機能を試験するために、Ｅ１１．５マウス胚から採取したＡＧＭ細胞に対して繰り返しひずみを与え得るバイオリアクターを開発した（図２Ａ、上部のパネル）。造血コロニーの形成およびフローの分析アッセイは、１０％繰り返しひずみが多能性造血前駆細胞の形成を強化し、この形成が、伸展活性化受容体（ＳＡＲ）の、ＧｄＣｌ３介在性の全ての薬理学的阻害によって弱められることを実証した。ＧｄＣｌ３はまた、ゼブラフィッシュ胚におけるＨＳＰＣの発現を、ｓｉｈ－ＭＯ胚のレベルまで弱めた。
ＳＡＲファミリーメンバーは、４つの下位カテゴリー：Ｋ１－ファミリーメンバー、ならびにピエゾチャネル、ＴＲＰチャネル、およびＤＥＧ／ＥＮａＣチャネルを有する。組織の発現およびコンピュータ分析は、内皮組織および造血組織においてピエゾ１およびＴｒｐｖ４を示し、したがって、内皮からＨＳＣへの転換におけるこれらの役割を試験した。
ｔｒｐｖ４およびピエゾ１の機能喪失分析および薬理学的阻害は、ＨＳＰＣマーカーの発現および内皮からＨＳＣへの転換をなくした（図１Ａ）。逆に、ｔｒｐｖ４またはピエゾ１の薬理学的活性化は、対照胚におけるＨＳＰＣマーカーの発現を増強させ、ｓｉｈ胚におけるＨＳＰＣの発現を回復させた。時間的および空間的分析では、ｔｒｐｖ４は３６ｈｐｆでゼブラフィッシュ胚のＡＧＭ領域において検出されず、その一方で、ピエゾ１は、Ｅ１１．５ ＡＧＭにおいてＣｄ３１（内皮）およびｃ－Ｋｉｔ（造血）と共局在化していた。
伸展が介在するＨＳＣ形成の基にある分子メカニズムを確認するために、繰り返しひずみまたはピエゾ１の薬理学的アクチベーターのいずれかで処置したＡＧＭの全トランスクリプトーム分析を行った。繰り返しひずみおよびピエゾ１の活性化が類似の遺伝子シグネチャーを生じさせたことが分かった（図１Ｂ）。
ピエゾ１の薬理学的活性化は、多能性造血前駆細胞の形成をさらに増強させたが（図１Ｃ）、その一方で、ピエゾ１の薬理学的阻害は、ＨＳＰＣ形成の繰り返しひずみ介在性の誘発を弱めた（図１Ｄ）。総合すると、繰り返しひずみが介在する生体力学的伸展は、ピエゾ１を活性化して、内皮からＨＳＣへの転換を刺激する。
同様の結果が、ピエゾ１アゴニスト Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１およびＪｅｄｉ２によって得られた。特に、図１Ｅに示すように、５０μＭ Ｊｅｄｉ１、５０μＭ Ｊｅｄｉ２または２５μＭ Ｙｏｄａ１によって処置されたＥ１１．５ ＡＧＭ細胞における造血ＣＦＵアッセイは、Ｊｅｄｉ１、Ｊｅｄｉ２またはＹｏｄａ１介在性ピエゾ１活性化がＧＥＭＭ形成を増強することを実証した。
生体力学的伸展またはピエゾ１の活性化は、ＬＴ－ＨＳＣを生産する。
繰り返しひずみまたはピエゾ１の活性化が長期自己再生ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）を生産するかを分析するために、連続移植アッセイを行った。繰り返しひずみまたはピエゾ１のアクチベーターで処置されたＡＧＭの一次移植体は、より高い生着および正常な多細胞系の再構成を示した（図２Ａ、図２Ｂ）。また、繰り返しひずみまたはピエゾ１のアクチベーターで処置されたＡＧＭを移植された一次レシピエントの骨髄は、２倍から３倍多い量のＬｉｎ－Ｓｃａ１＋ｃ－Ｋｉｔ＋Ｃｄ４８－Ｃｄ１５０＋ＨＳＣ（すなわち、ＬＴ－ＨＳＣ）を示した。免疫不全の二次レシピエントへの一次レシピエント由来の選別されたＬｉｎ－Ｓｃａ１＋ｃ－Ｋｉｔ＋ＨＳＰＣの移植もまた、より高い生着および正常な多細胞系の再構成をもたらした（図２Ｃ、図２Ｄ）。したがって、繰り返しひずみおよび／またはピエゾ１の活性化の両方が、より多い量の正常なＬＴ－ＨＳＣを生産することが予想された。この仮説を試験するために、限界希釈アッセイを、段階的な量のＬｉｎ－Ｓｃａ１＋ｃ－Ｋｉｔ＋ＨＳＰＣを免疫不全の三次レシピエントに移植することによって行った。三次移植体の分析は、繰り返しひずみが２倍から３倍多い量のＬＴ－ＨＳＣを生産したことを実証した。
繰り返しひずみまたはピエゾ１の活性化が長期自己再生ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）を生産するかを分析するために、連続移植アッセイを行った。繰り返しひずみまたはピエゾ１のアクチベーターで処置されたＡＧＭの一次移植体は、より高い生着および正常な多細胞系の再構成を示した（図２Ａ、図２Ｂ）。また、繰り返しひずみまたはピエゾ１のアクチベーターで処置されたＡＧＭを移植された一次レシピエントの骨髄は、２倍から３倍多い量のＬｉｎ－Ｓｃａ１＋ｃ－Ｋｉｔ＋Ｃｄ４８－Ｃｄ１５０＋ＨＳＣ（すなわち、ＬＴ－ＨＳＣ）を示した。免疫不全の二次レシピエントへの一次レシピエント由来の選別されたＬｉｎ－Ｓｃａ１＋ｃ－Ｋｉｔ＋ＨＳＰＣの移植もまた、より高い生着および正常な多細胞系の再構成をもたらした（図２Ｃ、図２Ｄ）。したがって、繰り返しひずみおよび／またはピエゾ１の活性化の両方が、より多い量の正常なＬＴ－ＨＳＣを生産することが予想された。この仮説を試験するために、限界希釈アッセイを、段階的な量のＬｉｎ－Ｓｃａ１＋ｃ－Ｋｉｔ＋ＨＳＰＣを免疫不全の三次レシピエントに移植することによって行った。三次移植体の分析は、繰り返しひずみが２倍から３倍多い量のＬＴ－ＨＳＣを生産したことを実証した。
ＡＧＭ－ＨＳＣ（ドナー）が生着し、正常な成人血液に再構成するかを調べるために、再構成した血液系の分子特徴および機能的特性を次いで、対照、繰り返しひずみ、またはピエゾ１のアクチベーターで処置されたＡＧＭを移植された一次レシピエントにおいて分析した。骨髄におけるドナー由来の赤血球系細胞の分析は、Ｂｃｌ１１ａの存在下での、Ｃｄ７１＋／Ｔｅｒ１１９＋の発現、および、胚のグロビンを利用した成人グロビンマーカーの発現の増強を示した（図３Ａ）。骨髄および血清における、ドナー由来の骨髄細胞のさらなる分析は、十分な量のＧｒ１＋／Ｍａｃ１＋骨髄細胞、およびそれらのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）生産を示した（図３Ｂ）。次に、リンパ節、胸腺、および脾臓における、ドナー由来のキメリズム、Ｍａｃ１＋骨髄細胞、Ｃｄ１９＋Ｂ細胞、およびＣｄ４＋／Ｃｄ８＋Ｔ細胞の分析は、ドナーＨＳＣ由来の前駆細胞が循環し、造血ニッチにおいてコロニー形成して、成人血液系を再構成することを実証した。一次移植体由来の血清の分析では、これらが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＡ、およびＩｇＭなどの免疫化前の免疫グロブリン（Ｉｇ）の正常なレパートリーを生産したことも分かった（図３Ｃ）。脾臓のドナー由来Ｃｄ３＋Ｔ細胞の選別は、脾臓のドナー由来Ｍａｃ１＋骨髄細胞（陰性対照）では不存在の、Ｔ細胞受容体β（ＴＣＲβ）の再編成を実証した（図３Ｄ）。一次移植体におけるＴ細胞の機能的特性を分析するために、遅延型過敏反応アッセイは、一次移植体をヒツジ赤血球の注射で感作することによる、足蹠における抗原特異的な機能的Ｔ細胞の成功裏の動員を実証した（図３Ｅ）。したがって、ＡＧＭまたは造血性内皮細胞の繰り返しひずみまたはピエゾ１活性化はＨＳＣを生産し、このＨＳＣは、造血ニッチにおいて生着し、機能的な多細胞系成人血液を再構成した。
生体力学的伸展およびピエゾ１の活性化は、内皮からＨＳＣへの転換のためにＤｎｍｔ３ｂを上方調節する。
ＡＧＭは異種組織であるため、伸展が介在するピエゾ１の活性化がいかにしてＨＳＣへの大動脈内皮細胞の運命の転換を刺激するかは不明であった。Ｅ１０．５ ＡＧＭ選別型内皮細胞、造血性内皮細胞、およびＨＳＣからの変動遺伝子発現シグネチャーが得られた。ＡＧＭに由来する内皮細胞、造血性内皮細胞、およびＨＳＣの状況における、ＡＧＭの繰り返しひずみまたはピエゾ１の活性化で誘発される遺伝子シグネチャーの階層的クラスタリングは、さらに、過剰発現した生物学的プロセス、分子経路、遺伝子発現クラスター、およびこれらの遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームについての定量的概要を示した。内皮からＨＳＣへの転換の間に上方調節された、繰り返し伸展および／またはピエゾ１の活性化が介在する遺伝子の、ベン図分析は、Ｄｎｍｔ３ｂを、ＨＳＣ形成に必要な内皮機構のサイレンシングに関与する潜在的候補メカニズムとして同定した（図４）。加えて、Ｇｉｍａｐ６もまた、ＨＳＣ形成に必要な内皮機構のサイレンシングに関与する潜在的候補メカニズムとして同定された。
ＡＧＭは異種組織であるため、伸展が介在するピエゾ１の活性化がいかにしてＨＳＣへの大動脈内皮細胞の運命の転換を刺激するかは不明であった。Ｅ１０．５ ＡＧＭ選別型内皮細胞、造血性内皮細胞、およびＨＳＣからの変動遺伝子発現シグネチャーが得られた。ＡＧＭに由来する内皮細胞、造血性内皮細胞、およびＨＳＣの状況における、ＡＧＭの繰り返しひずみまたはピエゾ１の活性化で誘発される遺伝子シグネチャーの階層的クラスタリングは、さらに、過剰発現した生物学的プロセス、分子経路、遺伝子発現クラスター、およびこれらの遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームについての定量的概要を示した。内皮からＨＳＣへの転換の間に上方調節された、繰り返し伸展および／またはピエゾ１の活性化が介在する遺伝子の、ベン図分析は、Ｄｎｍｔ３ｂを、ＨＳＣ形成に必要な内皮機構のサイレンシングに関与する潜在的候補メカニズムとして同定した（図４）。加えて、Ｇｉｍａｐ６もまた、ＨＳＣ形成に必要な内皮機構のサイレンシングに関与する潜在的候補メカニズムとして同定された。
バイオインフォマティクスおよびコンピュータ分析を検証するために、Ｅ１１．５ ＡＧＭにおけるＤｎｍｔ３ｂの時間的および空間的タンパク質発現を分析した。免疫組織化学アッセイは、Ｄｎｍｔ３ｂがＣｄ３１＋内皮およびｃ－Ｋｉｔ＋造血細胞と共局在化することを実証した。したがって、Ｄｎｍｔ３ｂが内皮からＨＳＣへの転換を刺激し得ると仮定された。
Ｄｎｍｔ３ｂおよびＤｎｍｔ３ａは高度に相同であり、ＨＳＣの維持または分化において他とは異なる機能を有するが、ＡＧＭでの内皮からＨＳＣへの転換におけるこれらの潜在的役割は未知であった。遺伝子シグネチャーおよび組織発現の分析は、ＡＧＭにおけるＨＳＣ形成におけるＤｎｍｔ３ａのあらゆる関与を排除した。Ｄｎｍｔ３ｂおよびＤｎｍｔ３ａの別個のまたは重複する造血性の役割を区別するために、Ｄｎｍｔ３ｂおよびＤｎｍｔ３ａタンパク質のレベルを、繰り返しひずみ処置またはＹｏｄａ１処置されたＡＧＭ細胞の核画分において分析し、これは、繰り返しひずみまたはピエゾ１の活性化が、Ｅ１１．５ ＡＧＭ細胞においてＤｎｍｔ３ｂタンパク質の発現を刺激し、Ｄｎｍｔ３ａは刺激しないことを明らかにした（図５Ａ）。
血流の不存在下での血管の脈動が、Ｄｎｍｔ３ｂの活性化を介するＨＳＣ形成を刺激したかどうかを分析するために、ＨＳＰＣマーカーの発現を、Ｄｎｍｔ３ｂ阻害剤であるナナオマイシンで処置されたｃｄｈ５－ＭＯ胚において測定した。Ｄｎｍｔ３ｂの薬理学的阻害は、対照胚およびｃｄｈ５－ＭＯ胚においてＨＳＰＣマーカーの発現を弱めた。
次に、この実施例の実験は、生体力学的伸展またはピエゾ１の活性化が、Ｄｎｍｔ３ｂの活性化を介する内皮細胞から造血細胞への転換を刺激したかどうかを分析した。Ｄｎｍｔ３ｂの阻害が、多能性造血前駆細胞形成の、生体力学的伸展が介在するまたはピエゾ１の活性化が介在する誘発（図５Ｂ）、および内皮細胞から造血細胞への転換（図５Ｂ）を弱めたことが分かった。ナナオマイシン処置は造血細胞を表現型内皮細胞に戻すが、このような内皮細胞は機能的ではなかった。ＨＳＰＣマーカーのホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および、Ｙｏｄａ１と同時に処置されたまたはＹｏｄａ１を伴わずに処置された、ナナオマイシン処置されたまたはｄｎｍｔ３ｂ－ＭＯを注射されたゼブラフィッシュ胚における、内皮からＨＳＣへの転換の低速度撮影イメージングはさらに、ｄｎｍｔ３ｂの阻害または喪失が、ピエゾ１活性化が介在するＨＳＣ形成の増大を弱めたことを確認した（図５Ｃ）。総合すると、脈動が介在するピエゾ１の活性化は、ＡＧＭにおけるＤｎｍｔ３ｂの発現を増強して、内皮からＨＳＣへの転換を刺激した。
ＥＨＴにおけるＤｎｍｔ３ｂの役割を決定するために、本発明者らは全トランスクリプトーム分析を使用して内皮および造血遺伝子発現レベルを分析した。本発明者らは、２Ｄの繰り返し伸展またはＹｏｄａ１処置ＡＧＭサンプルが内皮遺伝子（Ｖｅｇｆａ、Ａｐｌｎ、Ｈｅｙ２、Ｇｐｒ１１６、Ｂｃｌ６、Ｇｎａ１３、Ｃｄｈ５、Ｐｌｘｎｄ１）の発現を減少させ、造血遺伝子（Ｓｃａ１、Ｔａｌ１、Ｆｌｔ３、Ｓｐｉ１、Ｇａｔａ２、Ｃｅｂｐａ）の発現を上昇させることを見出した（図６Ａ）。本発明者らの発見を強化するために、本発明者はさらに内皮および造血遺伝子の転写レベルを独立して測定した。本発明者らは、繰り返しひずみによる－またはピエゾ１活性化介在性のＤｎｍｔ３ｂ過剰発現がともに、ＥＨＴの間の内皮遺伝子サイレンシング（Ｖｅｇｆａ、Ｈｅｙ２、Ｇｐｒ１１６、Ｇｎａ１３）および造血遺伝子のより高い発現（Ｒｕｎｘ１、Ｓｐｉ１、Ｃｅｂｐａ、Ｔａｌ１、Ｇｆｉ１）をもたらしたことを見出した（図６Ｂ）。要約すると、脈動介在性のピエゾ１活性化は、Ｄｎｍｔ３ｂ発現を増強して内皮遺伝子を抑制し、内皮からＨＳＣへの転換を刺激する。ヒト造血におけるピエゾ１介在性の機械感受性メカニズムにおける保存された役割を分析するために、本発明者らは、構成的ＲＵＮＸ１ｃ：ｔｄＴｏｍａｔｏヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の造血性内皮細胞への指向性分化を使用し、そのような造血性内皮細胞をＹｏｄａ１によって処置した。本発明者らは、Ｙｏｄａ１介在性のピエゾ１活性化が、ヒトの内皮から造血への転換を刺激することを見出した。本発明者らはまた、Ｙｏｄａ１介在性のピエゾ１活性化は、ＤＮＭＴ３Ｂの発現を増強したが、ＤＮＭＴ３Ａの発現は増強せず、内皮遺伝子（ＶＥＧＦＡ、ＨＥＹ２、ＧＰＲ１１６、ＧＮＡ１３、ＣＤＨ５、ＰＬＸＮＤ１）をサイレンシングし、造血遺伝子（ＲＵＮＸ１、ＳＰＩ１、ＣＥＢＰＡ、ＴＡＬ１、ＧＡＴＡ２）の発現を誘導し；これにより、多能性造血性前駆細胞の形成およびヒト造血の上昇がもたらされることを見出した（図６Ｃ）。したがって、脈動介在性のピエゾ１活性化は、ゼブラフィッシュ、マウスおよびヒトモデルシステムにおける内皮から造血への転換を刺激する。
さらに、図６Ｄに示すように、ピエゾ１のＹｏｄａ１介在性薬理学的活性化は、生着可能なヒトＣＤ３４＋細胞の形成を増強し、そのようなピエゾ１の薬理学的活性化は、多細胞系血液を再構成するヒトＣＤ３４＋造血細胞の形成を刺激する。さらに、ピエゾ１の薬理学的活性化は、連続移植時に多細胞系血液を再構成する自己再生ＬＴ－ＨＳＣの形成を増強する。図６Ｅを参照のこと。
繰り返し伸展およびピエゾ１アゴニストは、ＥＣからＨＳＣへの転換、例えばＥＣからＨＥ細胞への転換およびＨＥ細胞からＨＳＣへの転換を促進する。図７Ａ（上）は、マウスＥ１１．５ ＡＧＭ選別ＥＣ（ＣＤ３１＋）、ＨＥＣ（ＣＤ３１＋ｃＫｉｔ＋）およびＨＳＰＣ（ｃＫｉｔ＋）細胞に対する１０％ 繰り返し伸展に次いでＦＡＣＳ分析を行う試験を示す。図７Ａ（下）に示すように、繰り返し伸展は、ＥＣからＨＥ細胞への転換（左）ならびにＨＥＣからＨＳＰＣへの転換（中央）を促進する。ＨＳＰＣに対する影響を右に示す。
図７Ｂは、造血分化の８日目における、ヒト由来の胚葉体（ＥＢ）のＦＡＣＳ分析を示し、これは、Ｙｏｄａ１介在性のピエゾ１活性化が、対照においてはｈＣＤ４３ｎｅｇＣＤ２３５ｎｅｇＣＤ１４４＋ＣＤ３４＋ＨＥ細胞の形成を増強するが、ピエゾ１－／－ＰＳＣにおいては増強しないことを示す。Ｙｏｄａ１介在性のピエゾ１活性化が、ｈＰＳＣからＨＳＣの形成を増強する。図７Ｃは、Ｙｏｄａ１介在性のピエゾ１活性化を使用して、ｈＰＳＣから生産されたＨＳＣの数の２倍の改善を示す。
ヒトｉＰＳＣから生成したＨＥ細胞からのＨＳＣの生産
胚様体および造血性内皮細胞の分化を、（Sugimura et al. 2017、Ditadi et al. 2015）において記載されているように行った。簡潔に述べると、ｈｉＰＳＣコロニーを０．０５％トリプシンで５分間、３７℃で解離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄し、そして、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１ｍＭ）、ヒトホロ－トランスフェリン（１５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｔ０６６５）、モノチオグリセロール（ＭＴＧ、０．４ｍＭ）、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＹ－２７６３２（１０μＭ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ－３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０６３９－０１１）中に再懸濁した。５００万個の細胞を、１０ｃｍのディッシュ（Ｅｚｓｐｈｅｒｅ、旭硝子株式会社）に播種して、スフェロイドを形成させた。１日目に、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加した。２日目に、培地を、ＳＢ４３１５４２（６μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、およびＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ－３４で交換した。３日目に、培地を、ＶＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍｌ）およびｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ－３４で置き換えた。６日目に、培地を、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン（ＩＬ）－６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ－１（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－１１（５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＥＰＯ（２ＩＵ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ－３４に交換した。細胞を、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、および９５％湿度のインキュベーター内で維持した。全てのサイトカインは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した。
胚様体および造血性内皮細胞の分化を、（Sugimura et al. 2017、Ditadi et al. 2015）において記載されているように行った。簡潔に述べると、ｈｉＰＳＣコロニーを０．０５％トリプシンで５分間、３７℃で解離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄し、そして、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１ｍＭ）、ヒトホロ－トランスフェリン（１５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｔ０６６５）、モノチオグリセロール（ＭＴＧ、０．４ｍＭ）、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＹ－２７６３２（１０μＭ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ－３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０６３９－０１１）中に再懸濁した。５００万個の細胞を、１０ｃｍのディッシュ（Ｅｚｓｐｈｅｒｅ、旭硝子株式会社）に播種して、スフェロイドを形成させた。１日目に、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加した。２日目に、培地を、ＳＢ４３１５４２（６μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、およびＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ－３４で交換した。３日目に、培地を、ＶＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍｌ）およびｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ－３４で置き換えた。６日目に、培地を、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン（ＩＬ）－６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ－１（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－１１（５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＥＰＯ（２ＩＵ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ－３４に交換した。細胞を、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、および９５％湿度のインキュベーター内で維持した。全てのサイトカインは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した。
ＣＤ３４＋細胞を単離するため、胚様体（８日目に得た）を０．０５％トリプシンによって解離し、７０μｍのストレーナーを通して濾過し、ＣＤ３４＋細胞をＣＤ３４磁気ビーズ染色によって単離し、その後、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に通した。全てのバッチのサンプルをＦＡＣＳによって試験して、その純度をパネルで検証した。以下の抗体を利用した：ＣＤ３４－ＰＥｃｙ７（Ｃｌｏｎｅ ５８１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦＬＫ１－ＰＥ（ＣＬＯＮＥ＃８９１０６、ＢＤ）、および４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）。
単離されたＣＤ３４＋細胞を、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）、ＴＰＯ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－１１（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ－１（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＬＴ３（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で再懸濁した（Ferrel et al 2015）。細胞を、ウェル当たり５００００個細胞の密度で薄層マトリゲルコーティング２４－ウェルプレートに播種した。播種の１日後、Ｙｏｄａ１（６．２５から１００μＭの間）を培養物に添加した。７日後、浮遊細胞を回収し、ＦＡＣＳ分析を行った。ＦＡＣＳ分析では、細胞をＣＤ３４－ＰＥｃｙ７（Ｃｌｏｎｅ ５８１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＣＤ４５－ＡＰＣ（クローン２Ｄ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。全てのサイトカインは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した。
結論
長期ＨＳＣの発生、増殖、および維持は、幹細胞の生物学および造血において、非常に求められていたものであった。ゼブラフィッシュにおける低速度撮影共焦点、ライトシート、およびフーリエ変換分析に基づいて、血管内の脈動を刺激するスケーラブルバイオリアクターが確立されただけではなく、ピエゾ１の活性化が、内皮細胞をＬＴ－ＨＳＣに変換するための薬理学的な標的として同定された。この研究は、連続移植の際に生着し得、自己再生し得、および多細胞系の機能的な成人血液に再構成し得るＬＴ－ＨＳＣを開発するための、導入遺伝子フリーの新規なアプローチを提供する。
長期ＨＳＣの発生、増殖、および維持は、幹細胞の生物学および造血において、非常に求められていたものであった。ゼブラフィッシュにおける低速度撮影共焦点、ライトシート、およびフーリエ変換分析に基づいて、血管内の脈動を刺激するスケーラブルバイオリアクターが確立されただけではなく、ピエゾ１の活性化が、内皮細胞をＬＴ－ＨＳＣに変換するための薬理学的な標的として同定された。この研究は、連続移植の際に生着し得、自己再生し得、および多細胞系の機能的な成人血液に再構成し得るＬＴ－ＨＳＣを開発するための、導入遺伝子フリーの新規なアプローチを提供する。
心拍動が介在する脈動は、内皮細胞および平滑筋細胞の両方に対して円周方向の伸展を生じさせ、機械的膨張を生じさせた。しかし、ピエゾ１は、Ｅ１１．５ ＡＧＭにおいて内皮細胞と造血細胞との間で共発現するが、血管の血管平滑筋細胞においては共発現せず、このことは、生体力学的伸展およびピエゾ１の活性化の造血性の役割が、ＡＧＭ－内皮細胞に対して固有であることを示唆した。
血管の生体力学的伸展は、ピエゾ１、Ｔｒｐｖ４、Ｋ１－ファミリーメンバー、およびＤＥＧ／ＥＮａＣチャネルを活性化し得た。ピエゾ１およびＴｒｐｖ４の両方の活性化は、内皮細胞から造血細胞への転換を刺激した。しかし、ピエゾ１阻害だけが、伸展が介在する造血効果を弱め、このことは、ピエゾ１およびＴｒｐｖ４が部分的に余分な役割を有し得ることを示唆した。
Ｄｍｎｔ３ｂの活性化は、内皮機構による、ＨＳＣへの自己再生能力および多細胞系再構成能力の付与をなくした。Ｄｎｍｔ３ｂの阻害は造血細胞を表現型内皮細胞に戻すが、これらの細胞は、機能的内皮特性を欠いていた。このことは、内皮細胞から造血細胞への転換におけるＤｎｍｔ３ｂの時間的および空間的役割が不可逆であったことを示唆した。生体力学的伸展またはピエゾ１の活性化は、Ｄｎｍｔ３ａの発現に影響を与えることなく、Ｄｎｍｔ３ｂの時間的および空間的発現を増強した。データは、ＨＳＣの発生および分化の間の、Ｄｎｍｔ３ｂの造血性の役割とＤｎｍｔ３ａの白血病性の役割との間の区別を実証した。
本明細書において開示されている所見は、いかにして生体力学的力が細胞の運命の転換を刺激し、エピジェネティックな機構を引き起こすことによって幹細胞に自己再生能力を付与することを実証している。この研究はまた、多能性幹細胞（ＰＳＣ）またはドナー細胞に由来する内皮細胞または造血性内皮細胞からＬＴ－ＨＳＣを誘導するためのプラットフォームを提供する。目的は万能適合ＨＳＣを開発することであるが、本明細書において開示されているバイオインスパイアードバイオリアクターは、万能適合の導入遺伝子フリーの源細胞が良性および悪性の血液疾患、代謝性疾患、免疫疾患、および骨髄疾患を有する患者を処置するために利用可能となる足掛かりである。
材料および方法
全ての手順は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院およびボストン小児病院の動物実験委員会によって承認された。
全ての手順は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院およびボストン小児病院の動物実験委員会によって承認された。
マウスＣｄ４５．２（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ）およびＣｄ４５．１（ＳＪＬ）はジャクソン研究所から購入し、ゼブラフィッシュモルフォリノはＧｅｎｅＴｏｏｌｓから購入した。微細血管造影を、蛍光標識したデキストラン色素をゼブラフィッシュの心臓の心房に注射することによって行い、その通過を、ライブイメージングを使用して記録した。ゼブラフィッシュの心臓およびマウスのＡＧＭの免疫染色を、倒立型蛍光顕微鏡を使用して分析した。ゼブラフィッシュ胚における心臓タンポナーデ、心拍数、および脈動周波数を、明視野イメージングまたは低速度撮影共焦点顕微鏡法を使用して分析した。ゼブラフィッシュトランスジェニック胚における血管内の赤血球の動きおよび内皮からＨＳＣへの転換を、低速度撮影共焦点イメージングを使用して分析した。
脈動血管様の状態を、Ｆｌｅｘｃｅｌｌ ＦＸ－４０００機を使用してインビトロで刺激した。内皮からＨＳＣへの転換の調節における薬理学的標的の役割を分析するために、マウス胚に由来するＡＧＭまたは全マウス胚を、生体力学的伸展、化学物質、または薬剤にエクスビボで曝露した。次に、造血コロニー形成アッセイを、マウスＡＧＭに由来する細胞をＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｍ３４３４培地中で７日間インキュベートすることによって行った。致死線量照射したＳＪＬマウスにおいて、ＡＧＭ由来のＨＳＣの連続移植を行った。生体力学的伸展の際の幹細胞頻度を、限界希釈アッセイを使用して分析した。一次移植体におけるＡＧＭ－ＨＳＣ由来の血球の特性を特徴付けるために、キメリズムおよび再構成のパーセンテージを、ＦＡＣＳを使用して測定し、グロビン転写産物を、定量的逆転写酵素ＰＣＲを使用して分析し、ミエロペルオキシダーゼの量を、ＰｉｃｏＫｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定し、ＴＣＲ－βの再編成を、ＴＣＲ－β遺伝子座についてのＰＣＲを使用して分析し、免疫前ＩＧの検出を、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇキットを使用して分析し、そして遅延型過敏反応を、ヒツジＲＢＣ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を感作前のマウスの足蹠に注射することによって分析した。
ＲＮＡシーケンシング分析を行って、繰り返しひずみまたは薬理学的調節物質で処置したマウスＡＧＭにおける遺伝子発現パターンを測定した。コンピュータアルゴリズムを使用して、発現変動遺伝子の階層的クラスタリングを行い、これらの過剰に出現している生物学的プロセスおよび経路を測定した。発現変動遺伝子の遺伝子発現クラスターを分析し、細胞集団ごとのこれらの平均発現レベルを比較した。次に、アップ遺伝子およびダウン遺伝子のベン図比較を構築して、繰り返しひずみまたは薬理学的調節物質が介在する内皮からＨＳＣへの転換に重要な候補を分析した。さらに、Ｄｎｍｔ３ｂタンパク質およびＤｎｍｔ３ａタンパク質の発現を、マウスＡＧＭ細胞の核画分において、ＥｑｉＱｕｉｃｋアッセイキットを使用して分析した。データは、別段の記載がない限り、平均±ｓ．ｄ．として表されている。統計分析は、対応のあるまたは対応のないスチューデントｔ検定によって行った。有意性は、Ｐ＜０．０５で設定された。
動物
実験では、野生型ＡＢ、Ｃａｓｐｅｒ、およびトランスジェニックゼブラフィッシュ系統ｌｃｒ：ｅＧＦＰ、ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ、ｆｌｋ１：ｅＧＦＰ、ｃｄ４１：ｅＧＦＰを使用した。胚は、受精後４日間までを使用した。実験では、ジャクソン研究所のＣｄ４５．２（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ）マウスおよびＣｄ４５．１（ＳＪＬ）マウスを使用した。
実験では、野生型ＡＢ、Ｃａｓｐｅｒ、およびトランスジェニックゼブラフィッシュ系統ｌｃｒ：ｅＧＦＰ、ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ、ｆｌｋ１：ｅＧＦＰ、ｃｄ４１：ｅＧＦＰを使用した。胚は、受精後４日間までを使用した。実験では、ジャクソン研究所のＣｄ４５．２（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ）マウスおよびＣｄ４５．１（ＳＪＬ）マウスを使用した。
モルフォリノ
モルフォリノアンチセンスオリゴを入手し（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ、以下の配列）、一細胞期のｃａｓｐｅｒゼブラフィッシュ胚に注射した。注射された胚および注射されていない胚を、固定するまで、Ｅ３培地において２８℃でインキュベートした。
モルフォリノアンチセンスオリゴを入手し（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ、以下の配列）、一細胞期のｃａｓｐｅｒゼブラフィッシュ胚に注射した。注射された胚および注射されていない胚を、固定するまで、Ｅ３培地において２８℃でインキュベートした。
胚の化学的処置
ゼブラフィッシュの胚を、Ｅ３ ｆｉｓｈ培地中の以下の化学調節物質で処置した：１００ｕＭのＬ－ＮＡＭＥ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５０ｕＭのジギトキシゲニン（Ｓｉｇｍａ）、２５～５０ｕＭのＹｏｄａ１（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、１ｕＭのナナオマイシン（Ｎａｎａ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００ｕＭの塩化ガドリニウム（ＧｄＣｌ３、Ｓｉｇｍａ）、５～１０ｕＭの４α－ホルボール１２，１３－ジデカン酸塩（４Αｐｄｄ、Ｓｉｇｍａ）、またはＧＳＫ２０５（１０ｕＭ）。
ゼブラフィッシュの胚を、Ｅ３ ｆｉｓｈ培地中の以下の化学調節物質で処置した：１００ｕＭのＬ－ＮＡＭＥ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５０ｕＭのジギトキシゲニン（Ｓｉｇｍａ）、２５～５０ｕＭのＹｏｄａ１（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、１ｕＭのナナオマイシン（Ｎａｎａ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００ｕＭの塩化ガドリニウム（ＧｄＣｌ３、Ｓｉｇｍａ）、５～１０ｕＭの４α－ホルボール１２，１３－ジデカン酸塩（４Αｐｄｄ、Ｓｉｇｍａ）、またはＧＳＫ２０５（１０ｕＭ）。
微細血管造影
蛍光色素標識したデキストランビーズを対照胚およびｃｄｈ５－ＭＯ胚の心房に注射し、リアルタイムな明視野ビデオを、Ｎｉｋｋｏｎ ＳＭＺ１５００実体顕微鏡を使用して捕捉した。
蛍光色素標識したデキストランビーズを対照胚およびｃｄｈ５－ＭＯ胚の心房に注射し、リアルタイムな明視野ビデオを、Ｎｉｋｋｏｎ ＳＭＺ１５００実体顕微鏡を使用して捕捉した。
心拍数および心拍出量
生きたゼブラフィッシュ心臓の画像を、組み込み型の白熱照明を使用して、５×対物レンズを有するＡｘｉｏｐｌａｎ（Ｚｅｉｓｓ）正立顕微鏡、および５１２×４８０ピクセルのグレースケールイメージセンサーを有するＦａｓｔＣａｍ－ＰＣＩハイスピードデジタルカメラ（Ｐｈｏｔｒｏｎ）で得た。画像は１秒当たり２５０フレームで得られ、１０８８フレーム（８回の心周期）が条件ごとに得られた。カスタムソフトウェアを使用して（ＭＡＴＬＡＢにおいて実装された）、連続イメージファイルから心拍数を決定した。心室の長軸および短軸を、各ビデオについての拡張期および収縮期の両方で、ＩｍａｇｅＪを使用して手動で測定し、これを使用して、標準的な幾何学的仮定を使用して心腔容積を推定した。モルフォリノ用量当たり少なくとも１０個の胚について、心拍出量を、拡張期の心室容積から収縮期の心室容積を差し引き、そこに心拍数をかけたものとして測定した（Shin et al., 2010）。
生きたゼブラフィッシュ心臓の画像を、組み込み型の白熱照明を使用して、５×対物レンズを有するＡｘｉｏｐｌａｎ（Ｚｅｉｓｓ）正立顕微鏡、および５１２×４８０ピクセルのグレースケールイメージセンサーを有するＦａｓｔＣａｍ－ＰＣＩハイスピードデジタルカメラ（Ｐｈｏｔｒｏｎ）で得た。画像は１秒当たり２５０フレームで得られ、１０８８フレーム（８回の心周期）が条件ごとに得られた。カスタムソフトウェアを使用して（ＭＡＴＬＡＢにおいて実装された）、連続イメージファイルから心拍数を決定した。心室の長軸および短軸を、各ビデオについての拡張期および収縮期の両方で、ＩｍａｇｅＪを使用して手動で測定し、これを使用して、標準的な幾何学的仮定を使用して心腔容積を推定した。モルフォリノ用量当たり少なくとも１０個の胚について、心拍出量を、拡張期の心室容積から収縮期の心室容積を差し引き、そこに心拍数をかけたものとして測定した（Shin et al., 2010）。
周期性の分析
ゼブラフィッシュＣａｓｐｅｒの胚を、トリカイン（Ｓｉｇｍａ）を有する０．８％低融点アガロースに包埋し、ペトリ皿に載せた。次に、ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（株式会社ニコン）ソフトウェアを備えたＮｉｋｏｎ ＳＭＺ１５００実体顕微鏡を使用して、ＡＧＭ領域における拍動する血管のリアルタイムな明視野ビデオを捕捉した。ビデオを使用して、血管内の脈動周波数を定量した。
ゼブラフィッシュＣａｓｐｅｒの胚を、トリカイン（Ｓｉｇｍａ）を有する０．８％低融点アガロースに包埋し、ペトリ皿に載せた。次に、ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（株式会社ニコン）ソフトウェアを備えたＮｉｋｏｎ ＳＭＺ１５００実体顕微鏡を使用して、ＡＧＭ領域における拍動する血管のリアルタイムな明視野ビデオを捕捉した。ビデオを使用して、血管内の脈動周波数を定量した。
明視野のライブイメージング
明視野のライブイメージングを行うために、ゼブラフィッシュＣａｓｐｅｒの胚を、トリカイン（Ｓｉｇｍａ）を有する０．８％低融点アガロースに包埋し、ペトリ皿に載せた。ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（株式会社ニコン）ソフトウェアを備えたＮｉｋｏｎ ＳＭＺ１５００実体顕微鏡を使用して、リアルタイムな明視野のビデオおよび静止画像を捕捉した。
明視野のライブイメージングを行うために、ゼブラフィッシュＣａｓｐｅｒの胚を、トリカイン（Ｓｉｇｍａ）を有する０．８％低融点アガロースに包埋し、ペトリ皿に載せた。ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（株式会社ニコン）ソフトウェアを備えたＮｉｋｏｎ ＳＭＺ１５００実体顕微鏡を使用して、リアルタイムな明視野のビデオおよび静止画像を捕捉した。
共焦点顕微鏡法
ｃｄ４１：ｅＧＦＰをｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙゼブラフィッシュと交配し、ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙをｌｃｒ：ｅＧＦＰゼブラフィッシュと交配し、モルフォリノをこれらのトランスジェニック胚に注射した。トランスジェニック胚を低融点アガロースに載せ、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して、３０から４２ｈｐｆのｆｌｋ１＋内皮から生じるｃｄ４１：ｅＧＦＰ＋ＨＳＣの低速度撮影共焦点イメージングを行った。ｌｃｒ：ｅＧＦＰ＋赤血球の相対的な動きを、ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ＋内皮の状況で分析した。本発明らは、Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）ソフトウェアを使用して画像分析を行った。
ｃｄ４１：ｅＧＦＰをｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙゼブラフィッシュと交配し、ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙをｌｃｒ：ｅＧＦＰゼブラフィッシュと交配し、モルフォリノをこれらのトランスジェニック胚に注射した。トランスジェニック胚を低融点アガロースに載せ、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して、３０から４２ｈｐｆのｆｌｋ１＋内皮から生じるｃｄ４１：ｅＧＦＰ＋ＨＳＣの低速度撮影共焦点イメージングを行った。ｌｃｒ：ｅＧＦＰ＋赤血球の相対的な動きを、ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ＋内皮の状況で分析した。本発明らは、Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）ソフトウェアを使用して画像分析を行った。
ホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、以前に記載されているように行った。
ホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、以前に記載されているように行った。
心臓タンポナーデ
マイクロインジェクション針を使用して心膜を穿刺し、４８ｈｐｆのｃｄｈ５－ＭＯを注射したゼブラフィッシュ胚の心臓の周辺を構成する体液を放出させた。
マイクロインジェクション針を使用して心膜を穿刺し、４８ｈｐｆのｃｄｈ５－ＭＯを注射したゼブラフィッシュ胚の心臓の周辺を構成する体液を放出させた。
免疫染色
Ｅ１０．５キメラマウス胚を採取し、パラフィンブロックに包埋し、横断面を作製し、そして一次抗体であるピエゾ１（ウサギ抗マウスＩｇＧ、Ａｂｃａｍ）、Ｃｄ３１（ロバ抗マウスＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ｃ－Ｋｉｔ（ウサギ抗マウスＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、またはＤｎｍｔ３ｂ（ロバ抗マウスＩｇＧ、Ａｂｃａｍ）、および４，６ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）抗体、ならびに二次抗体であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ロバ抗ウサギＩｇＧ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ロバ抗ヤギＩｇＧ、Ａｂｃａｍ）で免疫染色して、Ｅ１０．５ ＡＧＭ領域におけるこれらの発現を検出した。
Ｅ１０．５キメラマウス胚を採取し、パラフィンブロックに包埋し、横断面を作製し、そして一次抗体であるピエゾ１（ウサギ抗マウスＩｇＧ、Ａｂｃａｍ）、Ｃｄ３１（ロバ抗マウスＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ｃ－Ｋｉｔ（ウサギ抗マウスＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、またはＤｎｍｔ３ｂ（ロバ抗マウスＩｇＧ、Ａｂｃａｍ）、および４，６ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）抗体、ならびに二次抗体であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ロバ抗ウサギＩｇＧ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ロバ抗ヤギＩｇＧ、Ａｂｃａｍ）で免疫染色して、Ｅ１０．５ ＡＧＭ領域におけるこれらの発現を検出した。
ｆｌｋ１（ＧＦＰ）、ｍｆ２（ｍＣｈｅｒｒｙ）、およびＤＡＰＩ（ｖｉｏｌｅｔ）の発現を、対照胚およびｃｄｈ５－ＭＯをサイレンシングしたゼブラフィッシュ胚から単離した心臓において測定した。
ＡＧＭ外植片
Ｅ１１．５ ＡＧＭをＣ５７ＢＬ６／Ｊ Ｃｄ４５．２マウス胚から採取し、細胞の３胚同等物の単一細胞懸濁液を、ＢｉｏＦｌｅｘ ６ウェル培養プレート（ＦｌｅｘＣｅｌｌ）の各ウェルに播種した。本発明らは、細胞を一晩、繰り返しひずみ（Ｆｌｅｘｃｅｌｌ（登録商標）ＦＸ－４０００（商標）Ｔｅｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）、および／または化学調節物質（２～１００μＭのＹｏｄａ１、１μＭのナナオマイシン、１００μＭのＧｄｃｌ３、１ｕＭのＧｓＭＴｘ４、５～２０μＭの４αＰＤＤ、１０ｕＭのＧＳＫ２０５）での処置を適用して培養した。次に、採取した細胞を使用して、移植、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析、およびコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイを行った。
Ｅ１１．５ ＡＧＭをＣ５７ＢＬ６／Ｊ Ｃｄ４５．２マウス胚から採取し、細胞の３胚同等物の単一細胞懸濁液を、ＢｉｏＦｌｅｘ ６ウェル培養プレート（ＦｌｅｘＣｅｌｌ）の各ウェルに播種した。本発明らは、細胞を一晩、繰り返しひずみ（Ｆｌｅｘｃｅｌｌ（登録商標）ＦＸ－４０００（商標）Ｔｅｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）、および／または化学調節物質（２～１００μＭのＹｏｄａ１、１μＭのナナオマイシン、１００μＭのＧｄｃｌ３、１ｕＭのＧｓＭＴｘ４、５～２０μＭの４αＰＤＤ、１０ｕＭのＧＳＫ２０５）での処置を適用して培養した。次に、採取した細胞を使用して、移植、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析、およびコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイを行った。
薬剤での胚のエクスビボでのインキュベーション
Ｅ１１．５マウス胚を、タイミングを合わせて交配した（time－mated）妊娠したメスの子宮から採取し、ＦＢＳ、１ｍＭのグルコース、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、および／または選択された化学調節物質（２～１００μＭのＹｏｄａ１、１μＭのナナオマイシン、５～２０μＭの４αＰＤＤ、もしくは１０ｕＭのＧＳＫ２０５）を含有する無菌のガラスバイアルに入れた。本発明らは、ガラスバイアルを、ローラー器具（≒３０ｒｐｍで回転する）、一定のガス供給（２１％Ｏ２、５％ＣＯ２、残部Ｎ２）、および３７℃の一定温度で構成されるエクスビボインキュベーター（ＢＴＣ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）内に置いた。２４時間後、ＡＧＭを採取して、ＦＡＣＳアッセイおよびＣＦＵアッセイによって造血細胞の形成を分析した。
Ｅ１１．５マウス胚を、タイミングを合わせて交配した（time－mated）妊娠したメスの子宮から採取し、ＦＢＳ、１ｍＭのグルコース、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、および／または選択された化学調節物質（２～１００μＭのＹｏｄａ１、１μＭのナナオマイシン、５～２０μＭの４αＰＤＤ、もしくは１０ｕＭのＧＳＫ２０５）を含有する無菌のガラスバイアルに入れた。本発明らは、ガラスバイアルを、ローラー器具（≒３０ｒｐｍで回転する）、一定のガス供給（２１％Ｏ２、５％ＣＯ２、残部Ｎ２）、および３７℃の一定温度で構成されるエクスビボインキュベーター（ＢＴＣ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）内に置いた。２４時間後、ＡＧＭを採取して、ＦＡＣＳアッセイおよびＣＦＵアッセイによって造血細胞の形成を分析した。
移植体
一次移植では、未処置のまたは処置された（繰り返しひずみまたは２５μＭのＹｏｄａ１）ＡＧＭの３胚同等物と、脾臓ヘルパー細胞（マウス当たり≒５０万個）とを、致死線量照射した（分割線量１０．５ｃＧｙ）Ｃｄ４５．１（ＳＪＬ）マウスに、眼窩後注射によって注射した。二次移植および三次移植では、移植されたマウスから骨髄を単離した（脚、腕、骨盤骨、脊椎、胸骨）。骨髄をフィコール勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）－１０８３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）にロードし、バフィーコートから得た細胞を、ビオチンコンジュゲート型系統抗体およびストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）とインキュベートした。次に、細胞系陰性の（Ｌｉｎ－）細胞をＭＡＣＳ ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で分離し、ドナーＣｄ４５．２のＬｉｎ－Ｓｃａ１＋ｃ－Ｋｉｔ＋（ＬＳＫ）細胞を、ＭｏＦｌｏ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒソーターで選別した。その後、選別されたＣｄ４５．２ ＬＳＫ細胞をＣｄ４５．１脾臓ヘルパー細胞（≒マウス当たり５０万個）と混合し、放射線照射した（分割線量１０．５ｃＧｙ）Ｃｄ４５．１ ＳＪＬマウスに、眼窩後注射によって移植した。
一次移植では、未処置のまたは処置された（繰り返しひずみまたは２５μＭのＹｏｄａ１）ＡＧＭの３胚同等物と、脾臓ヘルパー細胞（マウス当たり≒５０万個）とを、致死線量照射した（分割線量１０．５ｃＧｙ）Ｃｄ４５．１（ＳＪＬ）マウスに、眼窩後注射によって注射した。二次移植および三次移植では、移植されたマウスから骨髄を単離した（脚、腕、骨盤骨、脊椎、胸骨）。骨髄をフィコール勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）－１０８３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）にロードし、バフィーコートから得た細胞を、ビオチンコンジュゲート型系統抗体およびストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）とインキュベートした。次に、細胞系陰性の（Ｌｉｎ－）細胞をＭＡＣＳ ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で分離し、ドナーＣｄ４５．２のＬｉｎ－Ｓｃａ１＋ｃ－Ｋｉｔ＋（ＬＳＫ）細胞を、ＭｏＦｌｏ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒソーターで選別した。その後、選別されたＣｄ４５．２ ＬＳＫ細胞をＣｄ４５．１脾臓ヘルパー細胞（≒マウス当たり５０万個）と混合し、放射線照射した（分割線量１０．５ｃＧｙ）Ｃｄ４５．１ ＳＪＬマウスに、眼窩後注射によって移植した。
生存しているレシピエントを、限界希釈アッセイに対する応答としてカウントした：信頼区間１／（幹細胞頻度）を、ポアソン分布に従って、ＥＬＤＡによって計算した。
ＣＦＵアッセイおよびＦＡＣＳアッセイ
ＣＦＵアッセイでは、ＡＧＭ外植片のまたはエクスビボの細胞を、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ ＧＦ Ｍ３４３４培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において平板培養した。播種の７日後、本発明らは、顆粒球、赤血球系、マクロファージ、巨核球（ＧＥＭＭ）、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）、顆粒球（Ｇ）、マクロファージ（Ｍ）、および赤血球系（Ｅ）コロニーを作るこれらの能力を分析した。
ＣＦＵアッセイでは、ＡＧＭ外植片のまたはエクスビボの細胞を、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ ＧＦ Ｍ３４３４培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において平板培養した。播種の７日後、本発明らは、顆粒球、赤血球系、マクロファージ、巨核球（ＧＥＭＭ）、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）、顆粒球（Ｇ）、マクロファージ（Ｍ）、および赤血球系（Ｅ）コロニーを作るこれらの能力を分析した。
外植片のおよびエクスビボのＡＧＭ細胞を、Ｓｃａ１－Ｐａｃｉｆｉｃ－Ｂｌｕｅ（Ｅ１３－１６１．７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＦｌｋ１－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ａｖａｓ １２α１、ＢＤ）で染色した。移植されたマウスの血液を、以下の抗体カクテルで染色した：Ｃｄ４５．２－Ｐａｃｉｆｉｃ－Ｂｌｕｅ（１０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ４５．１－ＦＩＴＣ（Ａ２０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ３－ＰＥ（１４５－２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ８－ＰＥ（５３－６．７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｍａｃ１－ＡＰＣ（Ｍ１／７０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｇｒ１－ＡＰＣ（１０８４１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ１９－ＡＰＣ－ＣＹ７（６Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｂ２２０－ＡＰＣ－ＣＹ７（ＲＡ３－６Ｂ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。
Ｅ１１．５ ＡＧＭ細胞を移植したマウスの骨髄、脾臓、胸腺、およびリンパ節の細胞を、以下の抗体パネルで染色した：骨髄ＬＴ－ＨＳＣ：Ｃｄ４５．２－ＦＩＴＣ（１０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｔｅｒ１１９－ビオチン（ＴＥＲ－１１９ ＢＤ）、Ｇｒ１－ビオチン（ＲＢ６－８Ｃ５、ＢＤ）、Ｃｄ５－ビオチン（５３－７．３、ＢＤ）、Ｃｄ８ａ－ビオチン（５３－６．７、ＢＤ）、Ｂ２２０－ビオチン（ＲＡ３－６Ｂ２、ＢＤ）、ストレプトアビジン－パシフィックブルー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｓｃａ１－ＰＥ－ＣＹ７（Ｄ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ｃＫｉｔ－ＡＰＣ（２Ｂ８、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｃｄ４８－ＡＰＣ－ＣＹ７（ＨＭ４８－１、ＢＤ）、Ｃｄ１５０－ＰＥ－ＣＹ５（ＴＣ１５－１２Ｆ１２．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。骨髄における赤血球系分化ＲＩ－ＲＶ：Ｃｄ４５．２－Ｐａｃｉｆｉｃ－Ｂｌｕｅ（１０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ４５．１－ＦＩＴＣ（Ａ２０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｔｅｒ１１９－ＡＰＣ（ＴＥＲ－１１９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ７１－ＰＥ（Ｒ１７２１７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。骨髄顆粒球：Ｃｄ４５．２－Ｐａｃｉｆｉｃ－Ｂｌｕｅ（１０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ４５．１－ＦＩＴＣ（Ａ２０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｇｒ１－ＰＥ（ＲＢ６－８Ｃ５、ＢＤ）、Ｍａｃ１－ＡＰＣ（Ｍ１／７０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。脾臓、胸腺、およびリンパ節Ｔ細胞：Ｃｄ４５．２－Ｐａｃｉｆｉｃ－Ｂｌｕｅ（１０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ４５．１－ＦＩＴＣ（Ａ２０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ８－ＰＥ（５３－６．７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ４－ＡＰＣ（ＲＭ４－５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。脾臓、胸腺、およびリンパ節の骨髄細胞およびＢ細胞：Ｃｄ４５．２－Ｐａｃｉｆｉｃ－Ｂｌｕｅ（１０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ４５．１－ＦＩＴＣ（Ａ２０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ１９－ＡＰＣ－ＣＹ７（６Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｍａｃ１－ＡＰＣ（Ｍ１／７０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。本発明らは、全てのＦＡＣＳ分析を、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａサイトメーターで行った。本発明らは、造血器官分析を、移植の１６週間後に行った。
定量的逆転写酵素－ポリメラーゼ連鎖反応分析（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
ＦＡＣＳを使用して、ＡＧＭ移植マウスから単離された未溶解の骨髄から得た赤血球前駆体（Ｃｄ４５．２＋、Ｔｅｒ１１９＋、Ｃｄ７１＋）を選別した。全ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離し、ｃＤＮＡ合成を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。定量的リアルタイムＰＣＲを、ＭＸ３０００Ｐ機でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（ＱｕａｎｔａＢｉｏ）を指示されたプライマー（Sankaran et al., 2009）と共に使用して行った。本発明らは、発現を、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）の発現に対して正規化した（Ochida et al., 2010）。
ＦＡＣＳを使用して、ＡＧＭ移植マウスから単離された未溶解の骨髄から得た赤血球前駆体（Ｃｄ４５．２＋、Ｔｅｒ１１９＋、Ｃｄ７１＋）を選別した。全ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離し、ｃＤＮＡ合成を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。定量的リアルタイムＰＣＲを、ＭＸ３０００Ｐ機でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（ＱｕａｎｔａＢｉｏ）を指示されたプライマー（Sankaran et al., 2009）と共に使用して行った。本発明らは、発現を、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）の発現に対して正規化した（Ochida et al., 2010）。
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の発現
好中球（Ｃｄ４５．２＋、Ｇｒ１＋、Ｍａｃ１＋）を、１６週齢の一次移植されたマウスの単離された骨髄からＦＡＣＳ選別し、１０％ＦＢＳを有するＩＭＤＭ中で一晩（５０万個細胞／ｍＬ）、２４ウェルプレートにおいて培養した。上清を回収し、ＭＰＯ濃度を、マウスＭＰＯ／ミエロペルオキシダーゼＰｉｃｏＫｉｎｅ（商標）ＥＬＩＳＡキット（Ｂｏｓｔｅｒ）を使用して測定した。ＭＰＯ濃度はまた、血清においても測定した。
好中球（Ｃｄ４５．２＋、Ｇｒ１＋、Ｍａｃ１＋）を、１６週齢の一次移植されたマウスの単離された骨髄からＦＡＣＳ選別し、１０％ＦＢＳを有するＩＭＤＭ中で一晩（５０万個細胞／ｍＬ）、２４ウェルプレートにおいて培養した。上清を回収し、ＭＰＯ濃度を、マウスＭＰＯ／ミエロペルオキシダーゼＰｉｃｏＫｉｎｅ（商標）ＥＬＩＳＡキット（Ｂｏｓｔｅｒ）を使用して測定した。ＭＰＯ濃度はまた、血清においても測定した。
ＴＣＲ－βの再編成についてのＰＣＲアッセイ
Ｔ細胞（Ｃｄ４５．２＋、Ｃｄ３＋）および骨髄細胞（Ｃｄ４５．２＋、Ｍａｃ１＋）を、１６週齢の一次移植されたマウスの脾細胞からＦＡＣＳ選別した。次に、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを、ＴＣＲ－β遺伝子座内のＤＨ β２．１－ＪＨ β２．７の再編成について行った。本発明らのサンプルは、変性させ（９４℃、１分間）、アニーリングし（６３℃、２分間）、そして３５サイクル伸長させた（７２℃、２分間）ものであった。プライマー配列は以下の通りである：
Ｔ細胞（Ｃｄ４５．２＋、Ｃｄ３＋）および骨髄細胞（Ｃｄ４５．２＋、Ｍａｃ１＋）を、１６週齢の一次移植されたマウスの脾細胞からＦＡＣＳ選別した。次に、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを、ＴＣＲ－β遺伝子座内のＤＨ β２．１－ＪＨ β２．７の再編成について行った。本発明らのサンプルは、変性させ（９４℃、１分間）、アニーリングし（６３℃、２分間）、そして３５サイクル伸長させた（７２℃、２分間）ものであった。プライマー配列は以下の通りである：
免疫前Ｉｇの検出
血清を１６週齢の一次移植されたマウスから単離し、免疫前Ｉｇのアイソタイプを、マウスＩｇアイソタイピングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって定量した。
血清を１６週齢の一次移植されたマウスから単離し、免疫前Ｉｇのアイソタイプを、マウスＩｇアイソタイピングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって定量した。
遅延型過敏反応
移植体マウスを、皮下注射（腰背部）および皮内注射（右足蹠）を介して、ヒツジ赤血球（ｓＲＢＣ、１０９個細胞／ｍＬ、部位当たり５０μＬ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で感作した。感作の６日後、感作前のマウスを、左足蹠では２×１０９個ＲＢＣ／ｍＬで、また右足蹠では等容積のＰＢＳで（対照として）チャレンジした。チャレンジの４８時間後、足蹠の厚みをマイクロキャリパーで測定した。本発明らは、６日目の変化のパーセントを、各足蹠のチャレンジ前の厚みで正規化した。
移植体マウスを、皮下注射（腰背部）および皮内注射（右足蹠）を介して、ヒツジ赤血球（ｓＲＢＣ、１０９個細胞／ｍＬ、部位当たり５０μＬ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で感作した。感作の６日後、感作前のマウスを、左足蹠では２×１０９個ＲＢＣ／ｍＬで、また右足蹠では等容積のＰＢＳで（対照として）チャレンジした。チャレンジの４８時間後、足蹠の厚みをマイクロキャリパーで測定した。本発明らは、６日目の変化のパーセントを、各足蹠のチャレンジ前の厚みで正規化した。
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現
ＡＧＭ外植片からの核抽出物を、ＥｐｉＱｕｉｋ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．）を使用して採取した。Ｄｎｍｔ３ｂタンパク質およびＤｎｍｔ３ａタンパク質のレベルを、比色分析ＥｐｉＱｕｉｋアッセイキット（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．）を製造者の指示に従って使用して分析した。Ｄｎｍｔ３ｂおよびＤｎｍｔ３ａの濃度は、１μｇの核抽出タンパク質と関連している。
ＡＧＭ外植片からの核抽出物を、ＥｐｉＱｕｉｋ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．）を使用して採取した。Ｄｎｍｔ３ｂタンパク質およびＤｎｍｔ３ａタンパク質のレベルを、比色分析ＥｐｉＱｕｉｋアッセイキット（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．）を製造者の指示に従って使用して分析した。Ｄｎｍｔ３ｂおよびＤｎｍｔ３ａの濃度は、１μｇの核抽出タンパク質と関連している。
ＲＮＡｓｅｑ分析およびコンピュータ分析
Ｅ１１．５マウスのＡＧＭ外植片培養物の全ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で単離した（対照条件、伸展条件、Ｙｏｄａ１条件、および４αＰＤＤ条件）。本発明らのｃＤＮＡライブラリーは、ＢＧＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって作製され、ＨｉＳｅｑ４０００装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でレーン当たり８つのサンプルでシーケンシングされた。本発明らは、本発明らのシーケンシングされた読み取り断片を、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｈｏｒｔ－Ｒｅａｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラム（バージョン２０１２－０７－２０）を使用して、マウス参照ゲノムＧＲＣｍ３８（ＥＮＳＥＭＢＬリリース６９）に対してマッピングした。ＤＥＳｅｑ２およびＤＥＸＳｅｑを使用して、それぞれ発現変動（ＦＤＲ＝０．１）およびエキソン使用の変動について試験した。発現変動遺伝子の遺伝子発現クラスターを分析し、細胞集団ごとのこれらの平均発現レベルを比較した。次に、アップ遺伝子およびダウン遺伝子のベン図比較を行って、繰り返しひずみまたは薬理学的調節物質が介在する内皮からＨＳＣへの転換に重要な候補を分析した。具体的には、本発明らは、Ｒ（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ、２０１２）におけるｇｐｌｏｔｓパッケージ（Warners et al., 2017）を使用するブートストラップ分析で階層的クラスタリングを行った。ＧＯ分析では、本発明らは、ＧＯカテゴリーまたはパスウェイでの本発明らの発現変動遺伝子の過剰な出現について、フィッシャーの正確確率検定を使用して試験し、ボンフェローニ法を使用して複数の試験について補正した。本発明らは、Ｐ値０．００１を統計的に有意なエンリッチメントの最小として使用して、以前に記載されているように、ＧＯタームエンリッチメント分析を行った。
Ｅ１１．５マウスのＡＧＭ外植片培養物の全ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で単離した（対照条件、伸展条件、Ｙｏｄａ１条件、および４αＰＤＤ条件）。本発明らのｃＤＮＡライブラリーは、ＢＧＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって作製され、ＨｉＳｅｑ４０００装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でレーン当たり８つのサンプルでシーケンシングされた。本発明らは、本発明らのシーケンシングされた読み取り断片を、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｈｏｒｔ－Ｒｅａｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラム（バージョン２０１２－０７－２０）を使用して、マウス参照ゲノムＧＲＣｍ３８（ＥＮＳＥＭＢＬリリース６９）に対してマッピングした。ＤＥＳｅｑ２およびＤＥＸＳｅｑを使用して、それぞれ発現変動（ＦＤＲ＝０．１）およびエキソン使用の変動について試験した。発現変動遺伝子の遺伝子発現クラスターを分析し、細胞集団ごとのこれらの平均発現レベルを比較した。次に、アップ遺伝子およびダウン遺伝子のベン図比較を行って、繰り返しひずみまたは薬理学的調節物質が介在する内皮からＨＳＣへの転換に重要な候補を分析した。具体的には、本発明らは、Ｒ（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ、２０１２）におけるｇｐｌｏｔｓパッケージ（Warners et al., 2017）を使用するブートストラップ分析で階層的クラスタリングを行った。ＧＯ分析では、本発明らは、ＧＯカテゴリーまたはパスウェイでの本発明らの発現変動遺伝子の過剰な出現について、フィッシャーの正確確率検定を使用して試験し、ボンフェローニ法を使用して複数の試験について補正した。本発明らは、Ｐ値０．００１を統計的に有意なエンリッチメントの最小として使用して、以前に記載されているように、ＧＯタームエンリッチメント分析を行った。
統計分析
データは、別段の記載がない限り、平均±平均の標準誤差（平均±ＳＥＭ）として表されている。統計分析は、対応のあるまたは対応のないスチューデントｔ検定によって行った。有意性は、Ｐ＜０．０５で設定された。
データは、別段の記載がない限り、平均±平均の標準誤差（平均±ＳＥＭ）として表されている。統計分析は、対応のあるまたは対応のないスチューデントｔ検定によって行った。有意性は、Ｐ＜０．０５で設定された。
Claims (84)
- 長期（ＬＴ）－造血幹細胞（ＨＳＣ）を含むＨＳＣの集団を調製する方法であって、
内皮細胞および／または造血性内皮（ＨＥ）細胞を含む集団を提供すること、
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される２つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、ならびに
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させて、ＬＴ－ＨＳＣを含む前記ＨＳＣの形成を刺激すること
を含む、前記方法。 - 前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される３つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、ならびに前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される３つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させて、前記ＨＳＣの形成および場合によって増殖を刺激することを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｃｄｈ５およびｐｌｘｎｄ１の発現または活性を低下させること、ならびに前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１およびｇａｔａ２の発現または活性を増大させることによって、前記ＨＳＣの形成および場合によって増殖を刺激することを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記造血遺伝子の活性または発現の前記増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、および発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、または前記造血遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 内皮遺伝子の発現または活性の前記低下が、完全または部分的な遺伝子欠失、ＲＮＡサイレンシング、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害、薬理学的阻害を導入すること、および発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、または前記内皮遺伝子に機能喪失型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、有効なレベルおよび期間、Ｄｎｍｔ３ｂの発現または活性を増大させることによって行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、および前記Ｄｎｍｔ３ｂ遺伝子に発現エレメントの遺伝子修飾または機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、請求項６に記載の方法。
- 内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、有効なレベルおよび期間、Ｇｉｍａｐ６の発現または活性を増大させることによって行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- Ｇｉｍａｐ６の前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、およびＧｉｍａｐ６遺伝子に発現エレメントの遺伝子修飾または機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、請求項８に記載の方法。
- 内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、前記内皮細胞またはＨＥ細胞を２Ｄまたは３Ｄの繰り返しひずみ、有効な濃度および期間のピエゾ１のアゴニスト、またはその組合せと接触させることによって行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ピエゾ１アゴニストが、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１、および／またはＪｅｄｉ２である、請求項１０に記載の方法。
- 前記ピエゾ１アゴニストの有効量が、０．１から５００μＭの範囲、または０．１から１００μＭの範囲にある、請求項１１に記載の方法。
- 前記ピエゾ１のアゴニストが、候補化合物との接触時の、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される内皮遺伝子の発現または活性の低下、および前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性の増大に基づいて、化学ライブラリーにおいて同定される、請求項１０に記載の方法。
- 胚様体、内皮細胞、造血性内皮（ＨＥ）細胞、またはその組合せを含む集団をバイオリアクターに提供することを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオリアクターが、繰り返しひずみによる生体力学的伸展、有効な濃度および期間のピエゾ１のアゴニストまたはその組合せを提供する、請求項１４に記載の方法。
- 前記繰り返しひずみによる生体力学的伸展が、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される３つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現または活性を低下させ、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させて、前記ＨＳＣの形成および場合によって増殖を刺激する、請求項１５に記載の方法。
- 前記ＨＳＣが造血ニッチにおいて生着し、機能的な多細胞系成人血液を再構成する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
- ＨＥ細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非造血幹細胞、体細胞、または内皮細胞から得られる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記造血幹細胞が、少なくとも１％の長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）または少なくとも５％のＬＴ－ＨＳＣを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記造血幹細胞が、少なくとも０．１％の長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、請求項１９に記載の方法。
- 前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞がＨＬＡ修飾細胞もしくはＨＬＡヌル細胞、および／または導入遺伝子フリー細胞、遺伝子修正細胞、導入遺伝子過剰発現細胞に由来し、場合によってｉＰＳ細胞または体細胞の遺伝的または化学的誘導によって導出される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
- 源細胞が、対象、細胞の既製ライブラリーから得られるか、またはこれに由来し、前記対象が場合によって万能適合ドナーである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記源細胞が、血液疾患、骨髄疾患、リソソーム蓄積疾患、ミトコンドリア疾患、代謝疾患または免疫疾患を有する対象から得られるか、またはそれに由来する、請求項２２に記載の方法。
- 前記対象が血液または非血液悪性腫瘍を有していない、請求項２３に記載の方法。
- 前記ＨＳＣを回収すること、および場合によって増殖させることをさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨＳＣの集団がレシピエントに投与され、前記レシピエントが場合によってドナー対象である、請求項２５に記載の方法。
- 少なくとも約１０２個のＨＳＣが投与される、請求項２６に記載の方法。
- 少なくとも約１０３個のＨＳＣが投与される、請求項２６に記載の方法。
- 少なくとも約１０４個のＨＳＣが投与される、請求項２６に記載の方法。
- 少なくとも約１０５個のＨＳＣが投与される、請求項２６に記載の方法。
- 細胞集団を造血内皮（ＨＥ）細胞に転換する方法であって、
胚様体または内皮細胞を含む集団を提供し、
前記細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される１つまたは複数の内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、および前記細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させること、
２Ｄまたは３Ｄの繰り返しひずみを適用すること、および
前記細胞を有効な濃度および期間、ピエゾ１のアゴニストと接触させること
の１つまたは複数から選択される遺伝的、薬理学的、および／または機械的刺激を提供して、前記細胞をＨＥ細胞に転換すること
を含む、前記方法。 - 前記造血遺伝子の活性または発現の前記増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、および前記造血遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、請求項３１に記載の方法。
- 内皮遺伝子の発現または活性の前記低下が、完全または部分的な遺伝子欠失、ＲＮＡサイレンシング、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害、薬理学的阻害を導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、および前記内皮遺伝子に機能喪失型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、請求項３１に記載の方法。
- 内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、有効なレベルおよび期間、Ｄｎｍｔ３ｂの発現または活性を増大させることによって行われる、請求項３３または３３に記載の方法。
- Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、およびＤｎｍｔ３ｂ遺伝子に機能獲得型突然変異を取り込むことの１つまたは複数を含む、請求項３４に記載の方法。
- 内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、有効なレベルおよび期間、Ｇｉｍａｐ６の前記発現または活性を増大させることによって行われる、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の方法。
- Ｇｉｍａｐ６の前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、およびＧｉｍａｐ６遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、請求項３６に記載の方法。
- 前記細胞を、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１および／またはＪｅｄｉ２から選択される有効量のピエゾ１アゴニストと接触させる、請求項３１に記載の方法。
- 前記ピエゾ１アゴニストの有効量が、０．１から５００ｕＭの範囲、または０．１から１００μＭの範囲にある、請求項３８に記載の方法。
- 前記集団をバイオリアクターに提供することを含み、前記バイオリアクターが繰り返しひずみによる生体力学的伸展を提供する、請求項３１から３９のいずれか一項に記載の方法。
- 場合によって前記遺伝的、薬理学的、および／または機械的刺激を適用することによって、前記ＨＥ細胞が回収されるか、またはＨＳＣに転換される、請求項４０に記載の方法。
- 前記ＨＥ細胞が、造血ニッチにおいて生着し、機能的な多細胞系成人血液を再構成するＨＳＣに転換される、請求項４１に記載の方法。
- 胚様体または内皮細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、請求項３１～４２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記内皮細胞が非造血幹細胞に由来する、請求項３１～４２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨＥ細胞が長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む造血幹細胞に転換される、請求項３１～４４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団が、ＨＬＡ修飾細胞またはＨＬＡヌル細胞に由来する、請求項３１～４５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団が導入遺伝子フリー細胞である、請求項３１～４５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝的、薬理学的および／または機械的刺激を前記ＨＳＣ細胞に適用することを含むプロセスにおいて前記ＨＳＣを増殖させることをさらに含む、請求項３１～４７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨＳＣがレシピエントに投与され、前記レシピエントが場合によってドナー対象である、請求項４８に記載の方法。
- 造血幹細胞（ＨＳＣ）の集団を増殖させる方法であって、
ＨＳＣ集団を提供し、
前記細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される１つまたは複数の内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、および前記細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させること、
２Ｄまたは３Ｄの繰り返しひずみを適用すること、および
前記細胞を有効な濃度および期間、ピエゾ１のアゴニストと接触させること
の１つまたは複数から選択される遺伝的、薬理学的および／または機械的刺激を提供して、ＨＳＣを増殖させること
を含む、前記方法。 - 前記造血遺伝子の活性または発現の前記増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、および前記造血遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、請求項５０に記載の方法。
- 内皮遺伝子の発現または活性の前記低下が、完全または部分的な遺伝子欠失、ＲＮＡサイレンシング、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害、薬理学的阻害を導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、および前記内皮遺伝子に５３喪失型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、請求項５１に記載の方法。
- 内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が有効なレベルおよび期間、Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現または活性を増大させることによって行われる、請求項５１または５２に記載の方法。
- Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、およびＤｎｍｔ３ｂ遺伝子に機能獲得型突然変異を取り込むことの１つまたは複数を含む、請求項５３に記載の方法。
- 内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、有効なレベルおよび期間、Ｇｉｍａｐ６の前記発現または活性を増大させることによって行われる、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の方法。
- Ｇｉｍａｐ６の前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、およびＧｉｍａｐ６遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、請求項５５に記載の方法。
- 前記細胞を、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１および／またはＪｅｄｉ２から選択される有効量のピエゾ１アゴニストと接触させる、請求項５０に記載の方法。
- 前記ピエゾ１アゴニストの有効量が、０．１から５００ｕＭの範囲、または０．１から１００μＭの範囲にある、請求項５７に記載の方法。
- 前記集団をバイオリアクターに提供することを含み、前記バイオリアクターが繰り返しひずみによる生体力学的伸展を提供する、請求項５０～５８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨＳＣが造血ニッチにおいて生着し、機能的な多細胞系成人血液を再構成する、請求項５９に記載の方法。
- 前記ＨＳＣが、内皮細胞またはＨＥ細胞から転換される、請求項５０～６０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨＳＣが長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、請求項５０～６１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨＳＣ集団が、ＨＬＡ修飾細胞またはＨＬＡヌル細胞に由来する、請求項５０～６２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団が導入遺伝子フリー細胞である、請求項６３に記載の方法。
- 請求項１から６４のいずれか一項に記載の方法によって調製されたＨＳＣの集団、および薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物。
- 少なくとも１０4個のＬＴ－ＨＳＣ細胞を含む、請求項６５に記載の医薬組成物。
- 造血幹細胞療法または移植を必要とする対象を処置する方法であって、治療有効量の、請求項１から６４のいずれか一項に記載の方法によって調製された造血幹細胞（ＨＳＣ）を前記対象に投与すること、または請求項６５もしくは６６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記対象が、悪性形態のまたは非悪性形態の血液疾患、骨髄疾患、リソソーム蓄積疾患、ミトコンドリア疾患、代謝性疾患、または免疫疾患を有する、請求項６７に記載の方法。
- 前記対象が、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性障害、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、神経芽細胞腫、胚細胞腫瘍、またはアミロイドーシスから選択される状態を有する、請求項６７または６８に記載の方法。
- 前記対象が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または全身性硬化症などの自己免疫障害、再生不良性貧血、純赤血球無形成症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコニ貧血、サラセミアメジャー、鎌状赤血球性貧血、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、ウィスコット・オルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球症、先天性代謝異常、表皮水疱症、重症先天性好中球減少症、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ピアソン症候群および白血球接着不全症から選択される状態を有する、請求項６９に記載の方法。
- 造血幹細胞（ＨＳＣ）を作製する方法であって、
化学化合物のパネルを胚様体、内皮細胞および／または造血性内皮細胞と接触させ、前記化学化合物によって誘導されるＤｎｍｔ３ｂまたはＧｉｍａｐ６；ｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６、およびａｐｌｎの少なくとも２つ；およびｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３の少なくとも２つの発現レベルの変化を決定すること；
遺伝子発現の以下の変化：
Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の発現の増大、
ｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎの２つまたはそれ以上の発現の低下；および
ｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３の２つまたはそれ以上の発現の増大
を誘導する化合物を選択すること；ならびに
内皮細胞および／または造血性内皮細胞のＨＳＣへの転換を、前記選択された化合物を内皮細胞および／または造血性内皮細胞と接触させることによって誘導し、それによって生着し多細胞系成人血液を再構成することができる自己再生ＨＳＣを作製すること
を含む、前記方法。 - 前記選択された化合物が、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される５つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現を低下させ、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される５つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現を増大させて、前記ＨＥ細胞、ＨＳＣまたはその組合せの形成および場合によって増殖を刺激する、請求項７１に記載の方法。
- 前記選択された化合物が、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｃｄｈ５およびｐｌｘｎｄ１の発現を低下させ、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１およびｇａｔａ２の発現を増大させる、請求項７２に記載の方法。
- 前記選択された化合物が、Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現を増大させる、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択された化合物が、ピエゾ１アゴニストである、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択された化合物が、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１および／またはＪｅｄｉ２の誘導体である、請求項７４に記載の方法。
- 胚様体、内皮細胞またはＨＥ細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非造血幹細胞、体細胞、または内皮細胞から得られる、請求項７１～７６のいずれか一項に記載の方法。
- 得られた前記造血幹細胞が、少なくとも０．１％の長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、請求項７１～７６のいずれか一項に記載の方法。
- 得られた前記造血幹細胞が、少なくとも約１％または少なくとも約１０％の長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、請求項７８に記載の方法。
- 得られた前記造血幹細胞が、約２％から約２５％のＬＴ－ＨＳＣを含む、請求項７８に記載の方法。
- 前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞が、ＨＬＡ修飾細胞またはＨＬＡヌル細胞、導入遺伝子過剰発現細胞および／または導入遺伝子フリー細胞に由来し、場合によってｉＰＳ細胞または体細胞の遺伝的または化学的誘導によって導出される、請求項７１～８０のいずれか一項に記載の方法。
- 源細胞が、対象から得られるか、またはこれに由来し、前記対象が、場合によって患者、適合もしくは非適合ドナー、または万能適合ドナーである、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨＳＣを回収することをさらに含む、請求項７１～８２のいずれか一項に記載の方法。
- 本開示に従って生産され、少なくとも約１０３個または少なくとも約１０４個のＬＴ－ＨＳＣ細胞を含む、細胞療法のための組成物。
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