CN115066492A - 产生造血干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
在各方面和实施方案中，本公开提供用于使内皮细胞转变为生血内皮(HE)细胞、和用于使HE细胞转变为HSC、包括含有显著水平的LT‑HSC的HSC的基因、药理学、和机械刺激。本公开还提供了使用所述基因、药理学、和机械刺激扩增HSC的方法。
Description
优先权声明
本申请要求2019年12月9日提交的美国临时专利申请系列号62/945,838的权益。前述的完整内容通过引用并入本文。
联邦赞助的研究或开发
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号HL131645下在美国政府支持下完成的。美国政府享有本发明的一定的权利。
背景技术
造血干细胞(HSC)是在胚胎发生期间在不同区域衍生的，在所述区域中特定的诱导事件将中胚层转化为血液干细胞和祖细胞。HSC可以在称为造血作用(hematopoiesis)的过程中引起红细胞、血小板、骨髓和淋巴(T-&B细胞)细胞。
HSC移植(HSCT)被广泛用于治疗患有血液、骨髓、代谢、和免疫疾病的患者。尽管脐带和单倍体相合(haplo-identical)干细胞移植取得了进展，但由于难以及时找到合适的人白细胞抗原(HLA)匹配的供体，因此HSC移植的治疗用途常常受到限制，特别是在少数族裔和缺乏国家无关供体登记的国家。尽管混合种族人口占美国人口的1.6％(970万)，但多种族志愿者仅占登记册中700万人中的3％(21,000)，使6,000名患者无法进行骨髓匹配。即使找到合适的匹配，免疫系统并发症如移植物抗宿主病(GVHD)、供体排斥、以及与治疗有关的高死亡率也可危及患者的生存。然而，这些并发症通过自体移植消除。尽管自体HSC不会完全替代同种异体HSC，尤其是在血液系统恶性肿瘤的情况下，但它们将克服HSCT中的主要障碍，包括对于患有广泛恶性和非恶性血液、免疫、和代谢异常的患者缺乏供体可用性和GVHD。
因此，需要产生用于HSCT的HSC，包括自体HSC或即需即用HSC(off-the-shelfHSC)。
发明内容
本公开至少部分地基于以下发现：某些内皮基因和造血基因的表达或活性的变化诱导自内皮细胞的造血干细胞(HSC)形成，包括形成大量的可自我更新、定植(engraft)、并重建多谱系成体血液的长期(LT)-HSC。
cdh5-吗啡啉突变体(morphant)(cdh5-MO)胚胎在无心输出量(cardiac output)和活跃血液流动(active blood flow)的血管中具有心跳介导的脉动。脉动来源的拉伸激活Piezo1机械敏感通道，进一步增强了主动脉-性腺-中肾(AGM)区域中的Dnmt3表达，并且这反过来调节核心内皮基因和造血基因以及它们的调节子的表达以刺激生血内皮细胞-至-HSC转变。脉动的模拟或Piezo1的药理激活还产生两倍至三倍更高量的LT-HSC，这些LT-HSC在连续移植的情况下重建为正常的功能性多谱系成体血液。在一些实施方案中，根据本公开生产的造血干细胞包含大量的表现优异定植并在接受者(recipient)中重建为功能性的多谱系成体血液的LT-HSC。
在一些实施方案中，本发明提供制备包括LT-HSC的造血干细胞(HSC)的群体的方法。所述方法包括提供包括内皮细胞和/或生血内皮(HE)细胞的细胞的群体，和在内皮细胞和/或HE细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的两种、三种、四种、五种或更多种内皮基因的表达或修饰其活性。所述方法进一步包括在内皮细胞和/或HE细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的两种、三种、四种、五种或更多种造血基因的表达或修饰其活性。通过降低内皮基因的表达或活性，并通过增加造血基因的表达或活性，刺激HE细胞或HSC(包括大量的LT-HSC)的形成。可直接降低内皮基因的表达或活性，增加造血基因的表达或活性，例如通过施用抑制剂、转基因、附加体、mRNA及其衍生物、和/或使用基因编辑方法(如本文中更充分描述的)。可选地，可至少部分地间接地诱导表达或活性的此类变化，例如通过增加DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3β(Dnmt3b)和/或GTPase IMAP家族成员6(Gimap6)的表达或活性。此外，可通过使用机械敏感受体或通道的激动剂(例如，Piezo1激动剂)、或通过向细胞施加循环应变生物力学拉伸来至少部分地进行此类基因表达调节。在各种实施方案中，直接或间接地降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的至少一种或至少两种、三种、四种、五种或更多种内皮基因的表达。在这些或其它实施方案中，直接或间接地增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的至少一种或至少两种、三种、四种、五种或更多种造血基因的表达。
在一些实施方案中，通过在足以刺激HE细胞或HSC的形成的条件下、在细胞中增加Dnmt3b和/或Gimap6的活性或表达来至少部分地调节内皮基因和造血基因的表达或活性。在一些实施方案中，回收HE细胞并用于HSC的形成。可回收HSC并任选地扩增用于施用至患者。HSC是使用本文所述的基因、药理学、或机械刺激任选地扩增的。
在一些实施方案中，内皮细胞与有效量的增加Dnmt3b的活性或表达、或提供内皮基因和造血基因的适当调节的激动剂接触。在一些实施方案中，激动剂是机械敏感受体或机械敏感通道的激动剂。在一些实施方案中，机械敏感受体是Piezo1。示例性的Piezo1激动剂包括Yoda1、Jedi1、和Jedi2。在一些实施方案中，Piezo1激动剂(例如，Yoda1)的有效量在约0.1μM至约300μM、或约0.1μM至约200μM、或约1μM至约100μM的范围内，或者在一些实施方案中，在约10μM至约100μM、或约2.5μM至约100μM或约2.5μM至约50μM的范围内。
替代的机械敏感受体或机械敏感通道激动剂(例如，Piezo1激动剂)可从化学文库中鉴定出。在这些实施方案中，鉴定出如本文所述诱导内皮基因和造血基因表达的变化的激动剂。例如，在与候选化合物接触的情况下，候选激动剂在内皮细胞和/或HE细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的内皮基因的表达或修饰其活性；和在内皮细胞和/或HE细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的两种或更多种造血基因的表达或修饰其活性。
在内皮细胞和/或HE细胞中直接增加基因的活性或表达的情况下，可采用各种方法。例如，可通过以下来增加基因的mRNA表达：通过将mRNA转录本(包括修饰的mRNA)递送至细胞、或通过引入可对其具有一种或更多种修饰以增加或修饰活性的转基因和/或附加体。在一些实施方案中，采用基因编辑以将基因修饰引入内皮细胞或HE细胞中的表达元件，以便增加启动子强度、核糖体结合、或RNA稳定性。在一些实施方案中，采用基因编辑以引入功能获得型突变(gain-of-function mutation)。
在一些实施方案中，可在内皮细胞和/或HE细胞中直接降低基因的活性或表达。例如，可通过以下的一种或更多种来降低内皮基因的表达或活性：在内皮细胞和/或HE细胞中引入完整或部分的基因删除、RNA沉默、反义寡核苷酸抑制、和引入表达元件的基因修饰(包括以降低启动子强度、核糖体结合、或RNA稳定性)或引入功能丧失型突变(loss-of-function mutation)。
在一些实施方案中，本发明包括单独或与Dnmt3b组合，在内皮细胞和/或HE细胞中增加Gimap6的活性或表达。为了增加Gimap6的活性或表达，可以将Gimap6 mRNA转录本引入细胞，或可选地在细胞中引入Gimap6转基因和/或附加体、和/或引入Gimap6表达元件的基因修饰(例如一种或更多种修饰以增加启动子强度、核糖体结合、或RNA稳定性)。
在各种实施方案中，将包括拟胚体、内皮细胞和/或HE细胞的细胞群体引入生物反应器。在一些实施方案中，生物反应器在2D或3D培养中向细胞提供循环应变生物力学拉伸。例如，可将循环应变生物力学拉伸施加至2D或3D培养表面。循环应变生物力学拉伸增加Dnmt3b和/或Gimap6的活性或表达。例如，附接至尼龙、PDMS、或其它生物相容性仿生膜的(例如，柔性底培养板的)计算机控制的真空泵系统(例如，FlexCellTM张力系统、Cytostretcher系统、或类似的系统)可用于在限定和控制的循环应变条件下将周向拉伸(circumferential stretch)离体施加至2D或3D培养中的与膜接触的拟胚体、内皮细胞或HE细胞。
在各种实施方案中，HSC转变是通过选自以下的一种或更多种诱导的：Piezo1激活；机械拉伸；将mRNA(利用或不利用转基因(即，无转基因))、附加体、或基因修饰引入Dnmt3b；将mRNA(利用或不利用转基因(即，无转基因))、附加体、或基因修饰引入Gimap6；将mRNA(利用或不利用转基因(即，无转基因))、附加体、或基因修饰引入本文所述的一种或更多种造血基因；和将完整或部分的基因删除、RNA沉默、反义寡核苷酸抑制引入本文所述的内皮基因(一种或更多种)、或将基因修饰引入本文所述的内皮基因(一种或更多种)。
在一些实施方案中，内皮细胞和/或HE细胞获得自或源自诱导性多能干细胞(iPSC)、非造血干细胞、或体细胞如成纤维细胞或内皮细胞。在一些实施方案中，内皮细胞和/或HE细胞获得自或源自HLA-空白(null)细胞，HLA-修饰的细胞，基因校正的、病毒载体过表达的、转基因过表达的、和/或无转基因的细胞，或者获得自或源自拟胚体向内皮细胞和/或HE细胞的遗传诱导。生血内皮细胞(例如，Flkl+CD45+细胞、Flkl+CD41+细胞或CD31+CD43+细胞)可以以任何方式获得，包括源自同种异体供体的源细胞或源自要用HSC治疗的受试者(例如，通过自体或同种异体细胞向生血内皮细胞的化学的、遗传的、mRNA、无转基因的、或附加体诱导)。在一些实施方案中，内皮细胞或HE细胞产生自使用来自接受者、即需即用银行、或通用相容供体(universal compatible donor)的细胞产生的iPS。在一些实施方案中，采用发育可塑性(developmentally plastic)内皮细胞。
在各种实施方案中，制备用于细胞疗法的药物组合物，所述药物组合物包含通过本文所述方法制备的HSC的群体、以及药学上可接受的载体。药物组合物可包含至少约102个HSC、或至少约103个HSC、或至少约104个HSC、或至少约105个HSC、或至少约106个HSC、或至少约107个HSC、或至少108个HSC。在各种实施方案中，组合物中的HSC的至少约0.1％、或至少约1％、或至少约2％、或至少约5％、或至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％为LT-HSC。例如，在一些实施方案中，施用药物组合物，其包含每千克接受者体重约100,000至约4x106个HSC(例如，约2x106个细胞/kg)。
在一些实施方案中，制备细胞疗法，其包含通过本文所述方法制备的HSC的群体。在一些实施方案中，细胞疗法包括药学上可接受的载体。细胞疗法可包括至少约102个HSC、或至少约103个HSC、或至少约104个HSC、或至少约105个HSC、或至少约106个HSC、或至少约107个HSC、或至少108个HSC。在各种实施方案中，组合物中HSC的至少约0.1％、或至少约1％、或至少约2％、或至少约5％、或至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％为LT-HSC。例如，在一些实施方案中，施用药物组合物，其包含每千克接受者体重约100,000至约4x106个HSC(例如，约2x106个细胞/kg)。HSC细胞的数量可根据患者的年龄和体重进行调整。
在一些实施方案中，可以在相对短的时间内产生用于移植的HSC，例如少于约两个月、或少于约一个月(例如，约4周)、或少于约两周、或少于约一周、或少于约6天、或少于约5天、或少于约4天、或少于约3天。在一些实施方案中，在内皮基因和造血基因的活性或表达受到调节下培养发育可塑性内皮细胞或HE细胞1至4周。
将通过本文所述方法制备的HSC例如通过静脉内输注或骨髓内移植施用至受试者(接受者)。可以根据清髓性、非清髓性或基于免疫毒素的(例如，抗c-Kit、抗CD45等)调节方案进行所述方法。
本文所述方法可用于产生HSC的群体用于移植方案，例如来治疗后天性或先天性血液(恶性和非恶性)、骨髓、代谢、线粒体、和免疫疾病。在一些实施方案中，HSC群体源自自体细胞，例如产生自iPSC，其是使用来自接受者受试者的细胞产生的。在一些实施方案中，HSC群体源自通用相容供体细胞或HLA-空白生血内皮细胞或有助于变成正常HSC的类似的细胞。
通过本发明的以下详细描述来描述本发明的这些和其它方面以及实施方案。
附图说明
图1A显示26-42hpf之间的转基因胚胎中从flk1:mCherry+内皮细胞产生的cd41:eGFP+HSC的延时共聚焦图像；数据表明，piezo1的沉默减弱了内皮细胞-至-HSC转变，而piezo1的药理学激活(Yoda1)刺激对照胚胎中的HSC形成，并挽救sih-MO胚胎中的HSC形成。每组n＝5。*P<0.05vs.对照；$P<0.05vs.sih-MO。
图1B是由循环应变和Piezo1激活剂(Yoda1)处理的E11.5 AGM细胞中的差异表达基因的热图；表明在内皮细胞-至-造血细胞转变期间，循环应变和Piezo1激活在AGM中具有相似的基因表达模式。每组n＝3。
图1C显示对E11.5 AGM细胞的造血集落形成单位(CFU)测定的图，其表明Piezo1的Yoda1介导的药理学激活刺激内皮细胞-至-造血细胞转变。每组n≥6。*P<0.05vs.对照。缩写：GEMM(粒细胞、红系(erythroid)、巨噬细胞、巨核细胞)；GM(粒细胞巨噬细胞)；G(粒细胞)；M(巨噬细胞)；E(红系)。
图1D显示对E11.5 AGM细胞的造血CFU测定的图，其表明Piezo1的GsMtX4介导的药理学抑制减弱了循环应变对内皮细胞-至-HSC转变的诱导作用。每组n≥6。*P<0.05vs.对照。缩写：GEMM(粒细胞、红系、巨噬细胞、巨核细胞)；GM(粒细胞巨噬细胞)；G(粒细胞)；M(巨噬细胞)；E(红系)。
图1E显示对用50μM Jedi1、50μM Jedi2、或25μM Yoda1处理的E11.5AGM细胞的造血CFU测定，表明Jedi1、Jedi2、或Yoda1介导的Piezo1激活增强了GEMM形成。每组n＝6。每样品3.e.e.AGM。*P≤0.05。
图2A显示实验概要(上图)和线图(下图)。实验概要(上图)显示了表示源自E11.5小鼠AGM的HSC、接着用10％循环应变或Yoda1进行处理、连续移植至清髓性免疫受损小鼠的示意图。线图(下图)显示第8-16周之间、以四周间隔的、来自初次移植体(接受者)中的E11.5 AGM(供体；三胚当量)来源的HSC的重建的外周血嵌合体百分比；表明对E11.5 AGM的循环应变或Piezo1的药理学激活(Yoda1处理)刺激HSC的形成。每组n≥5个初次接受者。*P<0.05vs.对照；$P<0.05vs.第8周嵌合体。在每个接受者中注射三胚当量的(e.e.)AGM供体细胞。
图2B是显示第16周的初次移植体(接受者)中的E11.5 AGM(供体；三个胚胎当量)来源的HSC重建为Mac1+Gr1+骨髓细胞、Cd8+Cd3+ T细胞、和B220+Cd19+ B细胞的百分比的图；表明对E11.5 AGM的循环应变或Piezo1的药理学激活(Yoda1)刺激重建为血液的HSC的形成。每组n≥5个初次接受者。
图2C是显示第8-12周之间、以四周间隔的、来自二次移植体(接受者)中的初次移植体(供体)来源的流动分选的Lin-Sca1+c-Kit+HSPC(n＝2000)的重建的外周血嵌合体百分比的线图；表明E11.5 AGM的循环应变或Yoda1处理产生具有连续定植和自我更新能力的HSC。每组n≥5个二次接受者。*P<0.05vs.对照。
图2D是显示第12周的二次移植体(接受者)中的初次移植体(供体)来源的HSC重建为Mac1+Gr1+骨髓细胞、Cd8+Cd3+ T细胞、和B220+Cd19+ B细胞的百分比的图；表明E11.5 AGM的循环应变或Yoda1处理产生可以连续重建为血液的HSC。每组n≥5个二次接受者。
图3A显示实验概要(上图)和图(下图)。实验概要(上图)显示用于初次移植体(接受者小鼠)的造血组织中的供体来源的血液谱系的功能性和表型分析的策略。图(下图)显示骨髓来源的Cd71+Ter119+分选的(供体)红系细胞中血红蛋白的β-Major(成体)、εγ(胚胎)、和β-H1(胚胎)类型的表达百分比；数据表明对E11.5 AGM进行生物力学拉伸或Yoda1处理后产生的供体HSC重建为含有成体血红蛋白的红细胞。每组n≥6。
图3B是显示过夜培养(O/N)骨髓来源的Gr1+Mac1+分选的(供体)中性粒细胞、然后进行基于ELISA的髓过氧化物酶(MPO)蛋白的定量的图；数据表明对E11.5 AGM进行生物力学拉伸或Yoda1处理后产生供体HSC，其重建为显示足够MPO水平的功能性髓系细胞。每组n≥5。
图3C是显示初次移植体(接受者)小鼠的外周血中预免疫免疫球蛋白(Ig)同种型的ELISA分析的图；数据表明初次移植产生具有完整的免疫球蛋白库(repertoire)的B细胞。每组n≥6。
图3D是显示脾脏分选的Cd3+ T细胞(供体)(上图)或Mac1+髓系细胞(供体；阴性对照)(下图)的T细胞受体(TCRβ)基因座分析的两张凝胶照片的图像；数据表明，在E11.5 AGM的生物力学拉伸或Yoda1处理后，供体HSC产生T细胞并显示T细胞受体β(TCRβ)重排，其迁移至脾脏并重建为具有足以重排TCRβ基因座的功能重组机制的T细胞。
图3E是显示迟发型超敏反应测定的点状图，其表明用生物力学拉伸或Yoda1处理的E11.5 AGM来源的供体HSC重建的初次移植体(接受者)小鼠具有T细胞介导的免疫应答。每组n≥6。*P<0.05vs.右脚掌(right footpad)(阴性对照)。
图4显示在EC vs.HSC(①)、EC vs.HEC(②)、和HEC vs.HSC(③)期间上调的基因的背景下，用循环应变和/或Yoda1处理的E11.5 AGM细胞中上调的基因的维恩图。上述分析(①vs.②vs.③)中普遍上调的基因的维恩比较表明，在内皮细胞-至-HSC转变期间，周向拉伸和Piezo1激活均特异性刺激Dnmt3b转录本表达和Gimap6转录本表达。
图5A显示用循环应变或Yoda1处理的E11.5小鼠AGM细胞的细胞核部分中的Dnmt3b和Dnmt3a的蛋白水平的两个图；数据表明，周向拉伸或Piezo1激活特异性刺激Dnmt3b蛋白表达水平，而不影响Dnmt3a的表达。每组n≥3。*P<0.05vs.对照。
图5B显示在七尾霉素(Nana)的存在下，用循环应变或Yoda1处理的E11.5小鼠AGM细胞的造血CFU测定的图；数据表明，Dnmt3b的药理学抑制减弱了由周向拉伸或Piezo1激活刺激的内皮细胞-至-HSC转变。每组n≥6个胚胎。*P<0.05vs.对照；$P<0.05vs.拉伸；+P<0.05vs.Yoda1。
图5C是显示在26-42hpf之间的转基因胚胎中从flk1:mCherry+内皮细胞产生的cd41:eGFP+HSC的延时共聚焦成像结果的图；数据表明dnmt3bb.1的沉默减弱了由piezo1激活刺激的内皮细胞-至-HSC转变，并且七尾霉素对Dnmt3b的特异性超过Dnmt3a。每组n≥5。*P<0.05vs.对照；$P<0.05vs.Yoda1。
图6A显示循环拉伸或Yoda1处理的E11.5 AGM细胞中内皮基因和造血基因的差异表达，表明循环应变和Piezo1激活在内皮细胞-至-造血细胞转变期间抑制内皮基因的表达、同时刺激造血基因的表达。
图6B显示内皮基因和造血基因表达的qRT-PCR分析；表明循环应变或Piezo1激活抑制E11.5 AGM细胞中的内皮基因的表达并刺激造血基因的表达。每组n＝5。*P≤0.05vs.对照。
图6C显示Yoda1处理后人iPSC来源的MACS分选的CD34+细胞的造血CFU测定；这表明PIEZO1的药理学激活刺激多能GEMM祖细胞形成和人造血作用。每组n＝6；每样品20,000个hCD34+细胞。*≤0.05vs.对照。
图6D显示自人源化小鼠(初次移植体)中人PSC(DF19-9-7T)来源的hCD34+造血细胞的注射8-10周后的骨髓嵌合体的百分比(左图)，表明Piezo1的Yoda1介导的药理学激活增强可定植的hCD34+细胞的形成。图6D还显示人PSC来源的hCD34+造血细胞(右图)至人CD33+骨髓细胞、人CD3+ T细胞、和人CD19+ B细胞的骨髓重建的百分比，表明Piezo1的药理学激活(Yoda1)刺激重建多谱系血液的hCD34+造血细胞的形成。n＝8(对照；初次移植体)和n＝8(Yoda1处理，初次移植体)。***P≤0.001。
图6E显示自人源化小鼠(二次移植体)中源自来源于DFT19-9-7T hPSC系的hCD34+造血细胞的初次移植的骨髓细胞的注射16周后的外周血嵌合体的百分比(左图)，表明Piezo1的Yoda1介导的药理学激活增强自我更新LT-HSC的形成。图6E还显示二次移植体(右图)中初次移植骨髓来源的人造血细胞至人CD33+骨髓细胞、人CD3+ T细胞、和人CD19+ B细胞的外周血重建百分比，表明Piezo1的药理学激活(Yoda1)刺激在连续移植的情况下重建多谱系血液的人LT-HSC的形成。N＝5(Yoda1处理，二次移植体)。
图7A由FACS分析表明循环拉伸促进EC至HEC转变(左图)以及HEC至HSPC转变(中间图)。在右图示出由循环拉伸的HSPC扩增的分析。N＝6。**P≤0.001，*P≤0.05。图7A(上图)示出对小鼠E11.5 AGM-分选的EC(CD31+)、HEC(CD31+cKit+)和HSPC(cKit+)细胞施加10％循环拉伸、接着进行FACS分析。
图7B显示造血分化的第8天时人来源的拟胚体(EB)的FACS分析，表明Yoda1介导的PIEZO1激活增强对照中的hCD43negCD235negCD144+CD34+HEC的形成、但不增强PIEZO1-/-PSC中的。PIEZO1的丧失不影响HEC形成。每组N＝3。**P≤0.001，*P≤0.05。
图7C是在人PSC的造血分化的第8+7天衍生的CD34+CD90+HSC的FACS图，表明Yoda1介导的PIEZO1激活增强自hPSC的HSC的形成。
具体实施方式
在胎儿发育过程中，主动脉-性腺-中肾(AGM)中的一部分的内皮细胞是生血内皮细胞，这改变这些细胞的命运，成为最终定殖(colonize)于胎儿肝脏和骨髓的HSC。然而，刺激生血内皮细胞的因素的特性仍然难以捉摸，限制了生血内皮细胞作为功能性HSC的潜在来源的实用性。血液流动介导的内皮内衬上的剪切应力刺激HSC的内皮出现。然而，使用Cdh5-空白的斑马鱼和鼠模型，确定尽管早期循环停止，但功能性HSC仍会出现。AndersonH,等,“Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin5expression.”Blood 2015。根据本公开内容，这些cdh5沉默的模型被用作研究触发功能性HSC出现的独立于剪切应力和/或一氧化氮合酶(NOS)的生物力学力的枢纽(pivot)，以研究其中脉动压力介导的周向拉伸控制HSC出现的其它机制。
实验室中从生血内皮细胞产生HSC的尝试大都是不成功的，部分是由于缺乏关于刺激HSC从生血内皮细胞中出现的因素的了解。现在已经确定，由于来自跳动的心脏的脉动而引起的周向血管拉伸触发功能性HSC从生血内皮细胞出现，这些HSC可以最终定植并分化为定型谱系(definitive lineages)。此外，在没有心跳和血液流动的情况下，拉伸敏感的瞬态受体电位阳离子通道亚家族香草酸成员4(transient receptor potential cationchannel-subfamily vanilloid member 4,Trpv4)通道的激活拯救了沉默心脏(tnnt2；sih)沉默的胚胎中HSC的形成。参见WO 2017/096215，其全部内容通过引用并入本文。
本公开至少部分地基于以下发现：机械敏感受体(例如，Piezo1)的生物力学和/或药理学激活增强了用于造血干细胞(HSC)形成的Dnmt3b表达，这反过来调节核心集(coreset)内皮基因和造血基因及其调节子的表达。如本文所证明的，cdh5-吗啡啉突变体(cdh5-MO)胚胎在没有心输出量和活跃血液流动的血管中具有心跳介导的脉动。脉动来源的拉伸激活了Piezo1机械敏感通道，进一步增强了AGM中Dnmt3b的表达以刺激内皮细胞-至-HSC转变。脉动的模拟和Piezo1的药理学激活还产生至少三倍更高量的LT-HSC，它们在连续移植后重建为正常的功能性多谱系成体血液。
因此，本公开的结果表明了心跳介导的生物力学力如何通过激活机械敏感通道以及表观遗传机制来刺激细胞命运的转变和干细胞形成。LT-HSC的发育、扩增和干细胞特性维持是用于治疗血液和骨髓疾病的HSC移植和细胞疗法的主要挑战。本公开提供开发LT-HSC的基因和药理学靶标。在各个方面，本公开提供用于使内皮细胞转变为生血内皮(HE)细胞、和用于使HE细胞转变为HSC、包括含有显著水平的LT-HSC的HSC的基因、药理学、和机械刺激。本公开进一步提供了使用基因、药理学、和机械刺激扩增HSC的方法。
在一方面，本发明提供制备包括LT-HSC的HSC群体的方法。在某些实施方案中，所述方法包括提供包括内皮细胞和/或HE细胞的细胞群体，和在内皮细胞和/或HE细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的两种或更多种内皮基因的表达或修饰其活性。所述方法进一步包括在内皮细胞和/或HE细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的两种或更多种造血基因的表达或修饰其活性，以刺激包括LT-HSC的HSC的形成。
在一些实施方案中，所述方法包括在内皮细胞和/或HE细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的三种或五种或更多种内皮基因的表达或修饰其活性；和在内皮细胞和/或HE细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的三种或五种或更多种造血基因的表达或修饰其活性。例如，在一些实施方案中，所述方法包括在内皮细胞和/或HE细胞中降低vegfa、hey2、grp116、gna13、cdh5、和plxnd1的表达或修饰其活性；和在内皮细胞和/或HE细胞中增加runx1、spi1、cebpa、tal1、和gata2的表达或修饰其活性。
在一些实施方案中，直接增加至少一种、两种、三种、或五种造血基因的表达或活性。如本文所用，“直接”增加基因的表达或活性，其中将编码所述基因的功能性拷贝的核酸引入细胞、或对内源基因进行增加其表达或相关活性的修饰。例如，可使用独立地选自以下的方法直接增加活性或表达：引入编码mRNA、引入编码转基因或附加体、引入表达元件的基因修饰、和引入功能获得型突变(一种或更多种)。在一些实施方案中，全套的表达或活性增加的造血基因是表达或活性直接增加的。
根据采用使用附加体的因子的表达的本公开的各种实施方案，此类实施方案可包括引入表达期望的因子的非整合型附加体质粒，即，用于产生无转基因和无病毒细胞群体。可使用具有有限复制能力并因此在几个细胞世代中丢失的已知附加体质粒。
在一些实施方案中，直接降低至少一种、两种、三种、或五种内皮基因的表达或活性。如本文所用，直接降低基因的表达或活性，其中将核酸或药物抑制剂引入细胞、或对内源基因进行降低其表达或相关活性的修饰。例如，可使用独立地选自以下的方法直接降低活性或表达：引入完整或部分的基因删除、RNA沉默、反义寡核苷酸抑制、药理学抑制、和引入表达元件的基因修饰或引入功能丧失型突变(一种或更多种)。在一些实施方案中，在某些实施方案中，全套的表达或活性降低的造内皮基因是表达或活性直接降低的。
在一些实施方案中，可间接地调节一种或更多种内皮基因和一种或更多种造血基因的表达或活性，例如，通过在足以刺激HSC的形成的条件(包括较高表达的表达水平和持续时间)下、增加内皮细胞中DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3β(Dnmt3b)和/或GTPase IMAP家族成员6(Gimap6)的活性或表达。
Dnmt3b(DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3β)是DNA甲基转移酶。Dnmt3b主要位于细胞核并且其表达是发育性调节的。Gimap6是免疫相关蛋白家族的GTPases(GIMAP)的成员。GIMAP蛋白包含GTP结合和卷曲螺旋基序。
在一些实施方案中，将根据各实施方案所述的内皮细胞或HE细胞、或HSC与有效量的增加Dnmt3b的活性或表达的机械敏感受体或机械敏感通道的激动剂接触，从而间接地调节内皮基因和造血基因的表达水平或修饰其活性。在一些实施方案中，机械敏感受体是Piezo1。示例性Piezo1激动剂是Yoda1。其它示例性Piezo1激动剂包括Jedi1和Jedi2。
Yoda1(2-[5-[[(2,6-二氯苯基)甲基]硫代]-1,3,4-噻二唑-2-基]-吡嗪)是为了机械敏感离子通道Piezo1而开发的小分子激动剂。Syeda R,“Chemical activation ofthe mechanotransduction channel Piezo1.”eLife(2015)。Yoda 1具有以下结构：
Yoda1的衍生物可以用于各种实施方案。例如，在一些实施方案中，采用包含2,6-二氯苯基核的衍生物。示例性激动剂公开于Evans EL,等,“Yoda1 analogue(Dooku1)whichantagonizes Yoda1-evoked activation of Piezo1 and aortic relaxation,”BritishJ.of Pharmacology 175(1744-1759):2018。Jedi1和Jedi2描述于Wang Y.,等,“A lever-like transduction pathway for long-distance chemical-and mechano-gating ofthe mechanosensitive Piezo1 channel,”Nature Communications(2018)9:1300。Jedi1和Jedi2具有3-羧酸甲基呋喃结构基序。根据本发明的实施方案可使用共用该基序的其它Piezo1激动剂。
在一些实施方案中，Piezo1激动剂(例如，Yoda1、Jedi1或Jedi2)的有效量在约0.1μM至约500μM、或约0.1μM至约300μM、或约0.1μM至约200μM、或约0.1μM至约100μM的范围内，或者在一些实施方案中，在约1μM至约300μM、约1μM至约200μM、约1μM至约100μM、约1μM至约50μM、或约10μM至约100μM、或约10μM至约100μM或约10μM至约50μM的范围内。
替代的激动剂、包括Piezo1的替代的激动剂可在化学文库中鉴定出。此类化学文库可包括结合和/或激活Piezo1、或其它机械敏感受体或通道的化合物。文库可包括Yoda1的衍生物，其可任选地具有2,6-二氯苯基核或其化学模拟物。文库可包括或进一步包括Jedi1和/或Jedi2的衍生物，其可任选地包括呋喃核(例如，3-羧酸甲基呋喃核、或其衍生物或化学模拟物)。可对文库筛选在与候选化合物接触的情况下，在内皮细胞和/或HE细胞中降低本文所述的内皮基因的表达或活性的化合物；和在内皮细胞和/或HE细胞中增加本文所述的造血细胞的表达或活性的化合物。可以通过与对照细胞、即不与候选化合物接触的细胞来确定表达或活性的变化。在一些实施方案中，与Yoda1、Jedi2、和/或Jedi2接触的细胞可用作基因表达调节的阳性对照。
在这些实施方案中，本发明可提供制备造血干细胞(HSC)的方法，其包括：使一组化合物与内皮细胞和/或生血内皮细胞接触，确定以下的由所述化合物诱导的表达水平的变化：Dnmt3b或Gimap6；vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的至少两种(或至少三种或至少五种)；和runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的至少两种(或至少三种或至少五种)。然后，选择诱导基因表达的以下变化的一种或更多种的化合物：增加Dnmt3b和/或Gimap6的表达；降低vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的三种或更多种的表达；和增加runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的两种或更多种的表达。然后，所选化合物可用于(例如，在生物反应器中)诱导内皮细胞和/或生血内皮细胞向HSC的转变。所得HSC是可定植并重建多谱系血液的自我更新的HSC。在一些实施方案中，所选化合物在内皮细胞和/或HE细胞中降低vegfa、hey2、grp116、gna13、cdh5、和plxnd1的表达；和在内皮细胞和/或HE细胞中增加runx1、spi1、cebpa、tal1、和gata2的表达。
在一些实施方案中，可以在内皮细胞或HE细胞中直接增加Dnmt3b的活性或表达。例如，可以通过以下来增加Dnmt3b的mRNA表达：将编码Dnmt3b的转录本递送至细胞，或通过引入编码Dnmt3b的转基因、或无转基因法、不限于引入附加体至细胞，这可使其中具有一种或更多种核苷酸修饰(或编码的氨基酸修饰)以增加或修饰活性。在一些实施方案中，采用基因编辑将基因修饰引入内皮细胞中的Dnmt3b表达元件，使得增加启动子强度、核糖体结合、RNA稳定性、或影响RNA剪接。在一些实施方案中，在Dnmt3b基因中引入功能获得型突变。
在一些实施方案中，本发明包括在循环应变或Piezo1激活的情况下，单独与Dnmt3b和/或其它修饰的基因组合，在内皮细胞中增加Gimap6的活性或表达。为了增加Gimap6的活性或表达，可以将编码Gimap6的mRNA转录本引入细胞，也可以采用无转基因法，包括但不限于将附加体引入细胞；或可选地，编码Gimap6的转基因，其中可具有一种或更多种核苷酸修饰(或编码的氨基酸修饰)以增加或修饰活性。在一些实施方案中，采用基因编辑将基因修饰引入内皮细胞中的Gimap6表达元件(例如，一种或更多种修饰以增加启动子强度、核糖体结合、RNA稳定性、或影响RNA剪接)。在一些实施方案中，在Gimap6基因中引入功能获得型突变。
在一些实施方案中，例如通过直接化学合成或体外转录来合成地产生mRNA和/或附加体(一种或更多种)(例如，编码Dnmt3b或Gimap6、或编码本文所述的一种或更多种造血基因)，并引入内皮细胞。可以使用已知的化学修饰以避免细胞中的先天免疫应答。例如，仅包含典型核苷酸的合成RNA可以结合模式识别受体，并且可以在细胞中引发强力的免疫应答。该应答可导致翻译阻滞、炎性细胞因子的分泌、和细胞死亡。包含某些非典型核苷酸的RNA可以逃避先天免疫系统的检测，并可以高效地翻译成蛋白质。参见US9,181,319，其通过引用并入本文，特别是关于避免先天免疫应答的核苷酸修饰。在HSC产生过程中，可以通过已知方法将mRNA一次或周期性地引入细胞。
在一些实施方案中，通过将转基因引入细胞来增加Dnmt3b和/或Gimap6和/或本文所述的一种或更多种造血基因的表达，这可以指导所需水平的过表达(具有各种启动子强度或表达控制元件的其它选择)。可以使用本领域已知的各种病毒载体或转染试剂引入转基因。在一些实施方案中，通过无转基因法(例如，附加体的递送)增加Dnmt3b和/或Gimap6和/或造血基因的表达。
在一些实施方案中，使用基因编辑技术，例如，引入一种或更多种修饰以改变启动子强度、核糖体结合、RNA稳定性、或RNA剪接，来调节基因的表达或活性。各种编辑技术是已知的，包括CRISPR、锌指(ZF)和转录激活因子样效应物(TALE)。包含一种或更多种这些DNA结合结构域和Fokl核酸内切酶的切割结构域的融合蛋白可用于在细胞中的DNA的期望的区域中产生双链断裂(参见，例如，美国专利申请公开号US 2012/0064620、美国专利申请公开号US 2011/0239315、美国专利号8,470,973、美国专利申请公开号US 2013/0217119、美国专利号8,420,782、美国专利申请公开号US 2011/0301073、美国专利申请公开号US 2011/0145940、美国专利号8,450,471、美国专利号8,440,431、美国专利号8,440,432、和美国专利申请公开号2013/0122581，其全部内容通过引用并入本文)。在一些实施方案中，如本领域中已知的，基因编辑是使用CRISPR相关的Cas系统来进行的。参见，例如，US 8,697,359、US 8,906,616、和US 8,999,641，其全部内容通过引用并入本文。
在各种实施方案中，将包含发育可塑性内皮细胞或HE细胞(包括但不限于拟胚体)的细胞群体引入生物反应器。在一些实施方案中，生物反应器提供如WO 2017/096215中所述的循环应变生物力学拉伸，其全部内容通过引用并入本文。循环应变生物力学拉伸增加了Dnmt3b和/或Gimap6的活性或表达，这反过来降低了本文所述内皮基因的表达、并增加了本文所述造血基因的表达。在这些实施方案中，机械装置向2D或3D培养中的细胞施加拉伸力。例如，计算机控制的真空泵系统(例如，FlexCellTM张力系统、Cytostretcher系统、或类似系统)可附接至用作培养表面的尼龙、PDMS、或其它生物相容性仿生膜。然后，所述系统可用于在限定和控制的循环应变条件下将周向拉伸离体施加至2D或3D培养中的细胞。
在一些实施方案中，循环应变生物力学拉伸降低内皮细胞和/或HE细胞中内皮基因的表达或活性；和增加内皮细胞和/或HE细胞中造血基因的表达或活性，从而刺激HSC的形成。
在各种实施方案中，HSC转变是通过至少选自以下的手段来诱导的：Piezo1激活，机械拉伸，将mRNA、转基因、无转基因(例如，附加体)、或基因修饰引入Dnmt3b，和/或将mRNA、转基因、无转基因(例如，附加体)、或基因修饰引入Gimap6。在各种实施方案中，在内皮细胞或HE细胞中，直接增加至少一种本文所述的造血基因的表达或活性，和/或直接降低至少一种本文所述的内皮基因的表达或活性。
内皮细胞或HE细胞可获得自或源自患有血液、骨髓、代谢、或免疫疾病的受试者。在一些实施方案中，所述受试者不患有血液系统恶性肿瘤。可将HSC群体施用至接受者。对于自体HSC移植，iPS细胞、内皮细胞和/或HE细胞的源细胞将已源自所述接受者。
在一些实施方案中，内皮细胞和/或HE细胞获得自或源自诱导性多能干细胞(iPSC)、非造血干细胞、或体细胞(包括但不限于成纤维细胞和内皮细胞)。在一些实施方案中，内皮细胞或HE细胞获得自或源自HLA-空白细胞、HLA-修饰的细胞、和/或无转基因的细胞，或获得自或源自内皮细胞向HE细胞的遗传诱导。生血内皮细胞(例如，Flkl+CD45+细胞、Flkl+CD41+细胞或CD31+CD43+细胞)可以任何方式获得，包括从来自同种异体供体的源细胞或从要用HSC处理的受试者中获得。例如，HE细胞可以通过自体或同种异体细胞向生血内皮细胞的化学的、遗传的、无转基因的、或附加体诱导来获得。在一些实施方案中，HE细胞是由iPSC产生的，iPSC是由接受者的细胞、或由HLA-修饰的细胞、或由作为HLA-空白细胞的细胞产生的。在一些实施方案中，HE细胞获得自或源自受试者的细胞，其中受试者是通用相容供体。本领域已知制备生血内皮细胞的方法，包括从人多能干细胞中产生。参见，WO 2017/096215和US 2019/0119643，其全部内容通过引用并入本文。还参见Ditadi等,Nature CellBiol.17(5)580-591(2015)；Sugimura等,Nature 2017；545(7655):432-438；Nakajima-Takagi等,Blood.2013；121(3):447-458；Zambidis等,Blood.2008 Nov 1；112(9):3601-14和Park等,Cytometry A.2013 Jan；83(1):114-126(用于有效hiPSC分化的基于人拟胚体(hEB)生血内皮细胞分化方法)；Choi等,Cell Rep.2012 Sep 27；2(3):553-567(与OP9共培养中的hPSC分化)；Sandler等,2014 July 17；511(17509):312-318(内皮细胞至造血细胞)；还参见Sluvkin,Blood 2013 122:4035-4046。在一些实施方案中，起始HSC的产生的HE细胞的数量为至少约102个细胞、约103个细胞、约104个细胞、约105个细胞、约106个细胞、约107个细胞、或至少108个细胞。在一些实施方案中，根据本公开所述产生的造血干细胞包含长期造血干细胞(LT-HSC)，其表现出优异的定植，并在接受者中重建为功能性多谱系成体血液。在一些实施方案中，HSC包括CD34+细胞。
在一些实施方案中，多能干细胞是通过重编程体细胞来制备的诱导性多能干细胞(iPSC)。例如，可以通过选自Sox2、Oct3/4、c-Myc、Nanog、Lin28、和klf4的重编程因子的表达来重编程体细胞。在一些实施方案中，重编程因子为Sox2、Oct3/4、c-Myc、Nanog、Lin28、和klf4。在一些实施方案中，重编程因子为Sox2、Oct3/4、c-Myc、和klf4。制备iPSC的方法描述于例如美国专利10,676,165；美国专利9,580,689；和美国专利9,376,664，其以其整体通过引用并入本文。在各种实施方案中，使用公知的病毒载体系统如慢病毒或仙台(Sendai)病毒系统表达重编程因子。可选地，通过将编码重编程因子的mRNA (一条或更多条)引入体细胞来表达重编程因子。仍进一步地，iPSC可通过引入表达重编程因子的非整合型附加体质粒来产生，即用于产生无转基因和无病毒iPSC。可使用具有有限复制能力并因此在几个细胞世代中丢失的已知附加体质粒。在一些实施方案中，iPSC产生自例如(但不限于)成纤维细胞或PBMC等体细胞。在各种实施方案中，iPSC是对于接受者为自体或同种异体的(例如，HLA-匹配的)。在一些实施方案中，iPSC是HLA-修饰的细胞或HLA-空白的细胞。
在各种实施方案中，扩增产生的HSC。例如，可根据US 8,168,428；US 9,028,811；US 10,272,110；和US 10,278,990中公开的方法扩增HSC，其以其整体通过引用并入本文。例如，在一些实施方案中，HSC的离体扩增采用前列腺素E2(PGE2)或PGE2衍生物。
在各种实施方案中，制备用于细胞疗法的药物组合物，其包含通过本文所述方法制备的HSC群体、以及药学上可接受的载体。药物组合物可包含至少约102个HSC、或至少约103个HSC、或至少约104个HSC、或至少约105个HSC、或至少约106个HSC、或至少约107个HSC、或至少约108个HSC。在一些实施方案中，细胞的亚群(例如，LT-HSC)可使用例如细胞分选方法来分离或富集。在各种实施方案中，组合物中的HSC的至少约0.1％、或至少约0.5％、或至少约1％、或至少约2％、或至少约3％、或至少约5％、或至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％是LT-HSC。在各种实施方案中，组合物包含约2至约25％LT-HSC，并且在一些实施方案中将包含约5％至约25％LT-HSC。例如，在一些实施方案中，施用药物组合物，其包含每千克接受者体重约100,000至约4x106个(CD34+)HSC(例如，约2x106个细胞/kg)。在一些实施方案中，药物组合物包含至少约103、至少约104、或至少约105个LT-HSC细胞。
在一些实施方案中，可以在相对短的时间段内产生用于治疗或移植的HSC，例如少于两个月、或少于一个月、或少于约两周、或少于约一周、或少于约6天、或少于约5天、或少于约4天、或少于约3天。在一些实施方案中，用增加的Dnmt3b和/或Gimap6活性或表达培养内皮细胞1至4周。
细胞组合物可进一步包含适合于静脉内输注或其它施用途径的药学上可接受的运载体(carrier)或载体(vehicle)，并且可包含合适的冷冻保护剂。示例性载体是DMSO(例如，约10％DMSO)。细胞组合物可以提供于单位小瓶或袋中，并冷冻保存直至使用。在某些实施方案中，组合物的体积为约一流体盎司至一品脱。
将使用本文所述方法产生的HSC例如通过静脉内输注或骨髓内移植施用至受试者(接受者)。所述方法可以按照清髓性、非清髓性、或基于免疫毒素的(例如，抗c-Ki、抗CD45等)调节方案来进行。
本文所述的方法可用于产生用于移植方案的HSC的群体，例如用于治疗血液(恶性和非恶性)、骨髓、代谢、和免疫疾病。在一些实施方案中，HSC群体源自自体细胞或通用相容供体细胞或HLA-修饰的细胞或HLA-空白细胞。即，HSC群体是从HE细胞产生的，所述HE细胞源自发育可塑性内皮细胞或iPSC，它们是从接受者受试者的细胞制备的或从供体细胞(例如，通用供体细胞、HLA-匹配的细胞、HLA-修饰的细胞、或HLA-空白细胞)制备的。在一些实施方案中，使用自体来源的细胞，并且接受者受试者患有选自以下的病况：多发性骨髓瘤；非霍奇金淋巴瘤；霍奇金病；急性骨髓性白血病；成神经细胞瘤；生殖细胞瘤；自身免疫病症(系统性红斑狼疮(SLE)，系统性硬化病)；骨髓增生异常综合征、淀粉样变性；或使用自体HSC移植可治疗的其它病况。在一些实施方案中，使用自体来源的细胞(例如，HSC是从来自接受者受试者的细胞产生的)，并且接受者受试者不患有血液系统恶性肿瘤。
在一些实施方案中，接受者受试者患有选自以下的病况：急性骨髓性白血病；急性淋巴细胞白血病；慢性骨髓性白血病；慢性淋巴细胞白血病；骨髓增生性疾病；骨髓增生异常综合征；多发性骨髓瘤；非霍奇金淋巴瘤；霍奇金病；再生障碍性贫血；纯红细胞再生障碍；阵发性夜间血红蛋白尿症；范可尼贫血；重型地中海贫血；镰状细胞性贫血；重症联合免疫缺陷症(SCID)；Wiskott-Aldrich综合征；噬血细胞性淋巴组织细胞增多症；先天性代谢异常；大疱表皮松解；重症先天性中性粒细胞减少症；Shwachman-Diamond综合征；Diamond-Blackfan贫血；Pearson综合征、和白血球黏附缺乏症。在一些这样的实施方案中，同种异体来源的或通用相容的供体细胞或HLA-修饰的细胞或HLA-空白的细胞用于产生HE细胞。例如，HSC从供体受试者即接受者受试者以外的受试者的细胞中产生。在一些实施方案中，基于血液类型和人白细胞抗原(HLA)分型，将供体受试者与接受者受试者配对。
如本文所用，术语“约”是指相关数值的±10％。
现在将通过以下非限制性实施例描述本发明的这些和其它方面。
实施例
在终末造血作用(definitive hematopoiesis)过程中，第一组HSC是在胎儿发育期间从AGM中的生血内皮细胞中产生的。因此，只要建立存在于AGM微环境中的内在和外在因素库，内皮细胞和/或生血内皮细胞就可以成为临床使用的用于开发或扩增HSC的来源。
一旦形成，AGM来源的HSC迁移至胎儿的肝脏和骨髓，在那里它们经历不对称分裂为长期(LT)和短期(ST)HSC。在LT HSC通过进一步经历不对称分裂来保留HSC的池的同时，ST-HSC通过对称分裂来支持血液生产的动态需求。七种转录因子(ERG、HOXA5、HOXA9、HOXA10、LCOR、RUNX1、和SPI1)(Sugimura,R,等,Nature,2017)的诱导、以及FGRS(Fosb、Gfi1、Runx1、和Spi1)转录因子的诱导、加上血管龛来源的内分泌性血管障碍(angiocrine)细胞因子(TGFβ、CXCR7、CXCR4、和BMP)(Lis,R.等,Nature,2017)，增强了内皮细胞-至-造血细胞转变。然而，这些方法不赋予内皮细胞或生血内皮细胞以LT-HSC功能和性质。进一步地，由于许多这些转录因子在下调时与造血恶性肿瘤相关，使用整合型载体或无转基因方法的基于它们的过表达的研究不允许分析基因剂量效应。此外，离体扩增的HSC不消除寻找HLA-匹配的健康供体HSC的需求。因此，分析有助于自生血内皮细胞的从头LT-HSC形成的细胞外在的或非整合因子以开发LT-HSC的自体或即需即用的储蓄库用于长期血液形成是至关重要的。
内皮细胞命运转变为HSC的过程的特征在于内皮细胞潜能的早期丧失，连同造血程序的逐步揭露。可存在在EHT期间损害内皮基因(一种或更多种)的长期沉默的表观遗传学机制(一个或更多个)。尽管EZH1主动抑制在原始造血作用(primitive hematopoiesis)期间的终末造血程序(Vo,LT,等,Nature,2018)，ISWI染色质重构调节原始和终末造血作用(Huang HT,等,Nat.Cell.Biol.,2013)。此外，尽管dnmt3b调节c-myb表达用于HSPC维持(Gore AV,等,Elife,2016)，dnmt3b在内皮基因沉默或在从头LT-HSC形成中的作用是未知的。尚不知晓哪种机制可以永久修饰内皮细胞的表观遗传学景观(epigenetic landscape)以支持LT-HSC的形成。
如本文所公开，本公开说明心跳和/或脉动介导的生物力学拉伸和/或Piezo1机械敏感途径的药理学激活如何影响核心基因的表达，以消除内皮细胞的表观遗传学景观来形成HSC(包括LT-HSC)。此外，还开发了一种模拟脉动样条件的生物反应器，并将Piezo1确定为刺激和扩大LT-HSC形成的药理学靶标。
心跳介导的脉动刺激内皮细胞-至-HSC转变。
无偏斑马鱼乙基亚硝基脲(ENU)诱变筛选产生了malbec(bw209mlb)，斑马鱼的cadherin-5(cdh5,ve-cdh)的突变体。尽管存在血液循环缺陷，但malbec和cdh5-吗啡啉突变体(MO)胚胎仍显示正常的原始和终末造血作用。
为了识别刺激内皮细胞-至-HSC转变的血液流动和与剪切应力无关的生物力学力，在cdh5缺陷型胚胎中分析心脏以及血管的功能和解剖结构。
首先通过在斑马鱼胚胎的两室心脏的心房中注入荧光葡聚糖珠进行微血管造影，然后在循环中跟踪葡聚糖珠。在对照胚胎中，在荧光葡聚糖珠通过房室(AV)瓣和心室进入体循环的同时，它们被困在cdh5-吗啡啉突变体胚胎的心房中。
为了检查心脏的结构，从对照和cdh5-沉默胚胎中分离心脏，并对内皮内衬(gfp)和心肌细胞(mf20)进行免疫组织化学。发现在cdh5-吗啡啉突变体中形成了心房(A)、房室(AV)瓣、心室(V)、和流出道(OT)，但该AV瓣被拉长并变形。
为了研究循环在cdh5-沉默胚胎中受损的原因，分析了血管结构，以及在cdh5-沉默胚胎中的血液循环、心率、心输出量、和心脏压塞。
在mlb x kdr:dsRED胚胎中分析了内皮内衬的完整性。发现在cdh5缺陷型胚胎中动脉和静脉的结构均完好无损。
心脏、心跳、血管、血液循环、和HSC形成的时序发育在斑马鱼、小鼠和人中为保守的。在斑马鱼发育过程中，心脏在受精(hpf)后约23小时开始跳动，血液循环大约在24-26hpf时开始，并且确定的HSC在30-48hpf之间从AGM区域中的生血内皮细胞中出现。
为了分析心脏开始跳动前后血管的循环，对对照和cdh5沉默的lcr:eGFP x flk1:mCherry胚胎进行了延时共聚焦成像。
发现即使在心脏开始跳动后，cdh5沉默胚胎的血管中仍积聚了lcr:eGFP+红血细胞；证实了尽管心跳开始并形成血管，但cdh5-吗啡啉突变体中没有活跃的循环。
为了检查cdh5沉默胚胎中心脏的功能，进行了电生理和超声心动图评估。cdh5-MO胚胎的心率与对照组相当，但cdh5-MO胚胎的每搏输出量(stroke volume)几乎为零。因此，确定cdh5-MO胚胎的心输出量(＝每搏输出量X心率)受损。
cdh5-MO胚胎在心腔中有心囊水肿，这可能是由于血液从心脏回流造成的。心包空间中积聚的液体会导致心室充盈减少以及随后的血液动力学损害。为了检查心脏压塞是否是心包空间液体积聚的一个因素，如心包穿刺术中那样，刺穿cdh5-MO胚胎的心脏腔，然后吸出心包液以减少心脏上形成的液体压力。但是，无法挽救cdh5突变体心脏的心输出量不足。
cdh5-吗啡啉突变体中的心跳是正常的，但是由于心脏的结构缺陷，它们的心输出量受损，导致心包腔中血液的积聚。由于cdh5-MO胚胎具有正常的造血作用，因此假设在没有活跃的循环的情况下，心跳来源的生物力学力影响HSC的形成。
尽管cdh5-MO胚胎具有跳动的心脏并且没有活跃的循环，但是它们在其血管的主动脉内皮中形成了HSC。当放大对照斑马鱼胚胎的AGM时，注意到血管的明显脉动。为了区分独立于循环血细胞和或许是血液流动的血管中脉动的存在，比较血管的脉动频率与循环血细胞的脉动频率以及由于血液流动引起的运动。具体而言，对在lk1:mCherry+血管内具有循环lcr:eGFP+红细胞的双转基因品系进行延时共聚焦成像，并对来自血管和循环血细胞的信号进行傅立叶分析。发现血管的频谱具有明显的峰。因此，血管中的脉动和血液流动并存，但是它们的存在和性质是相互独立的。
为了研究36hpf时的AGM中脉动的时间、空间和功能存在，对对照斑马鱼胚胎的血管区域进行光片照明显微镜观察(light sheet microscopy)，然后进行傅立叶分析。数据进一步证实了AGM在36hpf时具有明显的脉动频率；这是从flk1:eGFP+内皮细胞产生的runx1:mCherry+HSPC的延时共聚焦成像中观察到的内皮细胞-至-造血细胞转变的时间和位置。总之，发现AGM区域是脉动的，并且AGM中的脉动与内皮细胞-至-造血细胞转变同时发生。
血管承受来自心跳介导的血液压力和流动的恒定机械负荷，从而引起周壁应力和内皮剪切应力。当血液流动在内皮细胞上施加剪切应力并引起血管舒张时，心跳介导的脉动则产生周向拉伸，并对内皮细胞和平滑肌细胞造成机械性扩张。
为了分析cdh5-MO胚胎是否通过或独立于血液流动和剪切应力介导的NOS激活而形成HSC，分析了经NOS抑制剂L-NAME处理的对照和cdh5-MO胚胎中的HSPC表达。已经证明，NOS的抑制减弱了对照胚胎中HSPC的形成，但不影响cdh5-MO胚胎中的HSPC的形成。因此，cdh5-MO胚胎形成HSC与NOS激活无关。
总之，心跳介导的脉动刺激内皮细胞-至-HSC的形成，而与循环无关。
拉伸激活Piezo1用于HSC形成。
由于生物力学力刺激细胞形状和命运转变，推测生血内皮细胞的脉动介导的周期性拉伸刺激了HSC的形成。
为了试验脉动在内皮细胞-至-HSC形成中的功能，开发了一种生物反应器，其可以对收获自E11.5小鼠胚胎的AGM细胞施加循环应变(图2A，上图)。造血细胞集落的形成和流动分析实验表明，10％的循环应变可增强多能造血祖细胞的形成，这种细胞可被GdCl3介导的拉伸激活受体(SAR)的泛药理学抑制所减弱。GdCl3也将斑马鱼胚胎中的HSPC表达减弱至sih-MO胚胎的水平。
SAR家族成员具有四个子类别：K1-家族成员以及Piezo、TRP、和DEG/ENaC通道。组织表达和计算分析显示，内皮组织和造血组织中存在Piezo1和Trpv4，因此在内皮细胞-至-HSC转变中试验它们的作用。
trpv4和piezo1的功能丧失型分析和药理学抑制消除了HSPC标志物表达以及内皮细胞-至-HSC转变(图1A)。相反，trpv4或piezo1的药理学激活增强了对照胚胎中HSPC标志物表达，并挽救了sih胚胎中的HSPC表达。通过时空分析，在36hpf时的斑马鱼胚胎的AGM区域中未检测到trpv4，而在E11.5 AGM中Piezo1与Cd31(内皮细胞)和c-Kit(造血细胞)共定位。
为了巩固潜在的拉伸介导的HSC形成的分子机制，进行了用循环应变或Piezo1的药理学激活剂处理的AGM的全转录组分析。发现循环应变和Piezo1活化激活产生相似的基因标签(图1B)。
Piezo1的药理学激活进一步增强了多能造血祖细胞的形成(图1C)，而Piezo1的药理学抑制减弱了循环应变介导的HSPC形成的诱导(图1D)。总之，循环应变介导的生物力学拉伸激活Piezo1以刺激内皮细胞-至-HSC转变。
用Piezo1激动剂Yoda1、Jedi1、和Jedi2获得类似的结果。具体地，如图1E中所示，对用50μM Jedi1、50μM Jedi2、或25μM Yoda1处理的E11.5 AGM细胞的造血CFU测定表明Jedi1、Jedi2、或Yoda1介导的Piezo1激活增强GEMM形成。
生物力学拉伸或Piezo1激活产生LT-HSC。
为了分析循环应变或Piezo1激活是否产生长期、自我更新的HSC(LT-HSC)，进行连续移植分析。循环应变或Piezo1激活剂处理的AGM的初次移植体显示更高的定植和正常的多谱系重建(图2A，图2B)。同样，移植有循环应变或Piezo1激活剂处理的AGM的初次接受者的骨髓，显示出两倍至三倍更高量的Lin-Sca1+c-Kit+Cd48-Cd150+HSC(即，LT-HSC)。将初次接受者来源的分选的Lin-Sca1+c-Kit+HSPC移植至免疫受损的二次接受者内，也导致更高的定植和正常的多谱系重建(图2C，2D)。因此，预测循环应变和/或Piezo1激活均会产生较高量的正常LT-HSC。为了检验该假设，通过将分级量的Lin-Sca1+c-Kit+HSPC移植至免疫受损的三次接受者内进行有限稀释测定。三次移植分析表明，循环应变产生两至三倍更高量的LT-HSC。
为了研究AGM-HSC(供体)是否定植并重建为成体正常血液，接着在移植有对照、循环应变或Piezo1激活剂处理的AGM的初次接受者中分析重建的血液谱系的分子特征和功能特性。在Bcl11a存在的情况下，以胚胎球蛋白为代价，对供体来源的红系细胞在骨髓中的分析显示Cd71+/Ter119+的表达，以及成体球蛋白标志物的增强的表达(图3A)。进一步的骨髓和血液血清中的供体来源的髓系细胞的分析显示足够量的Gr1+/Mac1+髓系细胞，以及它们的髓过氧化物酶(MPO)的产生(图3B)。接下来，对淋巴结，胸腺、和脾脏中的供体来源的嵌合体、Mac1+髓系细胞、Cd19+ B细胞、以及Cd4+/Cd8+ T细胞进行分析，证明了供体HSC来源的祖细胞在造血龛中循环并定殖，以重建为成体血液谱系。在对初次移植体来源的血液血清进行分析时，还发现它们产生了预免疫的免疫球蛋白(Ig)例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgA和IgM的正常库(图3C)。脾脏中供体来源的Cd3+ T细胞的分选显示T细胞受体β(TCRβ)重排，而这在脾脏中供体来源的Mac1+髓系细胞(阴性对照)中是不存在的(图3D)。为了分析初次移植体中T细胞的功能特性，通过用绵羊红血细胞注射使初次移植体致敏，迟发型超敏反应测定法证明了抗原特异性功能性T细胞在脚掌中的成功募集(图3E)。因此，AGM或生血内皮细胞的循环应变或Piezo1激活产生定植造血龛并重建为功能性多谱系成体血液的HSC。
生物力学拉伸和Piezo1激活上调Dnmt3b用于内皮细胞-至-HSC转变。
由于AGM是异质组织，因此尚不清楚拉伸介导的Piezo1激活如何刺激主动脉内皮细胞命运转变为HSC。开发从E10.5 AGM分选的内皮细胞、生血内皮细胞、和HSC的差异基因表达签名(signature)。在AGM来源的内皮细胞、生血内皮细胞、和HSC的背景下，在AGM的循环应变或Piezo1激活下产生的基因签名的层次聚类还提供过表达的生物过程、分子途径、基因表达簇、及其基因本体(GO)术语的定量概述。内皮细胞-至-HSC转变过程中的循环拉伸和/或Piezo1激活介导的基因的上调的维恩图分析确定Dnmt3b是导致HSC形成所需的内皮机制沉默的潜在候选机制(图4)。另外，确定Gimap6也是导致HSC形成所需的内皮机制沉默的潜在候选机制。
为了验证生物信息学和计算分析，分析了在E11.5 AGM中Dnmt3b的时空蛋白表达。免疫组织化学测定表明，Dnmt3b与Cd31+内皮细胞和c-Kit+造血细胞共定位。因此，假设Dnmt3b可以刺激内皮细胞-至-HSC转变。
尽管Dnmt3b和Dnmt3a具有高度同源性，并且在HSC维持或分化中具有独特的功能，但它们在AGM中内皮细胞-至-HSC的潜在作用尚不清楚。基因签名和组织表达分析排除了Dnmt3a参与AGM中HSC的形成的任何可能。为了区分Dnmt3b和Dnmt3a的独特或重叠的造血作用(一个或更多个)，在循环应变或Yoda1处理的AGM细胞的细胞核部分中分析Dnmt3b和Dnmt3a的蛋白水平，从而确定循环应变或Piezo1激活在E11.5 AGM细胞中刺激Dnmt3b蛋白表达，而不是Dnmt3a蛋白表达(图5A)。
为了分析在没有血液流动的情况下、血管的脉动是否通过Dnmt3b激活来刺激HSC形成，在用Dnmt3b抑制剂七尾霉素处理的cdh5-MO胚胎中测定HSPC标志物的表达。Dnmt3b的药理学抑制减弱了对照和cdh5-MO胚胎中的HSPC标志物表达。
接下来，本实施例的实验分析了生物力学拉伸或Piezo1激活是否通过Dnmt3b激活刺激内皮细胞-至-造血细胞转变。发现Dnmt3b的抑制减弱了生物力学拉伸或Piezo1激活介导的多能造血祖细胞形成的诱导(图5B)，以及内皮细胞-至-造血细胞转变(图5B)。尽管七尾霉素处理将造血细胞还原为表型内皮细胞，但这种内皮细胞没有功能。经七尾霉素处理或dnmt3b-MO注射的同时用Yoda1处理或不用Yoda1处理的斑马鱼胚胎的HSPC标志物的整体原位杂交，以及内皮细胞-至-HSC转变的延时成像进一步证实了dnmt3b的抑制或丧失减弱了Piezo1激活介导的HSC形成的增加(图5C)。总之，脉动介导的Piezo1激活增强AGM中Dnmt3b的表达，以刺激内皮细胞-至-HSC转变。
为了确定Dnmt3b在EHT中的作用，我们使用全转录组分析来分析内皮基因和造血基因表达水平。我们发现2D循环拉伸-或Yoda1-处理的AGM样品具有减少的内皮基因(Vegfa、Apln、Hey2、Gpr116、Bcl6、Gna13、Cdh5、Plxnd1)的表达和升高的造血基因(Sca1、Tal1、Flt3、Spi1、Gata2、Cebpa)的表达(图6A)。为了强化我们的发现，我们进一步独立地测定内皮基因和造血基因的转录本水平。我们发现循环应变-或Piezo1激活-介导的Dnmt3b过表达在EHT期间导致内皮基因沉默(Vegfa、Hey2、Gpr116、Gna13)和较高的造血基因(Runx1、Spi1、Cebpa、Tal1、Gfi1)的表达(图6B)。总之，脉动介导的Piezo1激活增强Dnme3b表达以抑制内皮基因，刺激内皮细胞-至-HSC转变。为了分析PIEZO1介导的机械敏感机制在人造血作用中的保守作用，我们采用组成型RUNX1c:tdTomato人诱导性多能干细胞(iPSC)至生血内皮细胞的直接分化，并用Yoda1处理此类生血内皮细胞。我们发现Yoda1介导的PIEZO1激活刺激人内皮细胞-至-造血细胞转变。我们还发现，Yoda1介导的PIEZO1激活增强DNMT3B表达、但不增强DNMT3A表达，沉默内皮基因(VEGFA、HEY2、GPR116、GNA13、CDH5、PLXND1)，并诱导造血基因(RUNX1、SPI1、CEBPA、TAL1、GATA2)的表达；这导致升高的多潜能造血祖细胞形成和人造血作用(图6C)。因此，脉动介导的PIEZO1激活刺激斑马鱼、鼠、和人模型系统中的内皮细胞-至-造血细胞转变。
进一步地，如图6D中所示，Piezo1的Yoda1介导的药理学激活增强可定植人CD34+细胞的形成，并且Piezo1的药理学激活刺激重建多谱系血液的人CD34+造血细胞的形成。进一步地，Piezo1的药理学激活增强在连续移植的情况下重建多谱系血液的自我更新的LT-HSC的形成。参见图6E。
循环拉伸和Piezo1激动剂促进EC至HSC转变，包括从EC向HE细胞的转变和从HE细胞向HSC的转变。图7A(上图)示出其中对小鼠E11.5 AGM-分选的EC(CD31+)、HEC(CD31+cKit+)和HSPC(cKit+)细胞施加10％循环拉伸、接着进行FACS分析的研究。如图7A(下图)中所示，循环拉伸促进EC至HE细胞转变(左图)以及HEC至HSPC转变(中间图)。右图中示出对HSPC的影响。
图7B显示造血分化的第8天时的人来源的拟胚体(EB)的FACS分析，显示Yoda1介导的PIEZO1激活增强对照中的hCD43negCD235negCD144+CD34+HE细胞的形成、但不增强PIEZO1-/-PSC中的。Yoda1介导的Piezo1激活增强HSC从hPSC的形成。图7C。图7C显示使用Yoda1介导的Piezo1激活的从hPSC产生的HSC的数量中2倍的增加。
由人iPSC产生的HE细胞产生HSC
如(Sugimura等人.2017；Ditadi等人.2015)中所述进行拟胚体和生血内皮分化。简而言之，在37℃下用0.05％胰蛋白酶解离hiPSC集落5分钟，用PBS+2％FBS洗涤，然后重悬于补充有L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素/链霉素(10ng/ml)、抗坏血酸(1mM)、人全-转铁蛋白(150μg/ml,Sigma T0665)、一硫代甘油(MTG,0.4mM)、BMP4(10ng/ml)、和Y-27632(10μM)的StemPro-34(Invitrogen,10639-011)中。将五百万个细胞接种至10cm的培养皿(Ezsphere,Asahi Glass)中以形成球状体。在第1天，将bFGF(5ng/ml)和BMP4(10ng/ml)添加至培养基中。在第2天，将培养基更换为用补充有SB431542(6μM)、CHIR99021(3μM)、bFGF(5ng/ml)、和BMP4(10ng/ml)的StemPro-34。在第3天，将培养基替换为补充有VEGF(15ng/ml)和bFGF(10ng/ml)的StemPro-34。在第6天，将培养基更换为补充有bFGF(5ng/ml)、VEGF(15ng/ml)、白介素(IL)-6(10ng/ml)、IGF-1(25ng/ml)、IL-11(5ng/ml)、SCF(50ng/ml)和EPO(2IU)的StemPro-34。将细胞维持在5％CO2、5％O2和95％湿度的培养箱中。所有细胞因子均购自Peprotech。
为了分离CD34+细胞，用0.05％的胰蛋白酶解离拟胚体(从第8天开始)，通过70μm过滤器过滤，通过CD34磁珠染色分离CD34+细胞，然后通过LS柱(Miltenyi)。通过FACS对每批样品进行试验，以验证其板的纯度。使用了以下抗体：CD34-PEcy7(克隆581；Biolegend)、FLK1-PE(克隆#89106；BD)、和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。
将分离的CD34+细胞重悬于含有以下的StemPro-34培养基中：Y-27632(10μM)、TPO(30ng/ml)、IL-3(10ng/ml)、SCF(50ng/ml)、IL-6(10ng/ml)、IL-11(5ng/ml)、IGF-1(25ng/ml)、VEGF(5ng/ml)、bFGF(5ng/ml)、BMP4(10ng/ml)、和FLT3(10ng/ml)(Ferrel等2015)。将细胞以每孔50,000个细胞的密度接种至薄层Matrigel(基质胶)包被的24孔板上。接种后一天，将Yoda1(6.25和100μM之间)添加至培养物中。7天后，收集漂浮的细胞并进行FACS分析。为了进行FACS分析，用CD34-PEcy7(克隆581；Biolegend)和CD45-APC(克隆2D1；Biolegend)染色细胞。所有细胞因子均购自Peprotech。
结论
长期HSC的发育、扩增、和维持一直是干细胞生物学和造血作用的圣杯。基于对斑马鱼的延时共聚焦、光片照明、和傅立叶变换分析，不仅建立了模拟血管中的脉动的可扩展的生物反应器，而且还将Piezo1激活确定为内皮细胞转变为LT-HSC的药理学靶标。这项研究提供了一种新型的无转基因方法，可以在连续移植下开发可以定植、自我更新、和重建多谱系功能性成体血液的LT-HSC。
心跳介导的脉动产生周向拉伸，并引起内皮细胞和平滑肌细胞二者的机械性扩张。然而，Piezo1在E11.5 AGM中的内皮细胞和造血细胞之间共表达，但在血管的血管平滑肌细胞中却不表达，这表明生物力学拉伸和Piezo1激活的造血作用是AGM-内皮细胞固有的。
血管的生物力学拉伸可以激活Piezo1、Trpv4、K1-家族成员、以及DEG/ENaC通道。Piezo1和Trpv4激活均刺激内皮细胞-至-造血细胞的转变。但是，只有Piezo1抑制作用减弱了拉伸介导的造血作用，这表明Piezo1和Trpv4可能具有部分重复的作用。
Dmnt3b激活沉默了内皮机制，以赋予HSC自我更新和多谱系重建的能力。尽管Dnmt3b的抑制使造血细胞恢复为表型内皮细胞，但这些细胞缺乏功能性内皮细胞特性。这表明Dnmt3b在内皮细胞-至-造血细胞转变中的时空作用是不可逆的。生物力学拉伸或Piezo1激活增强Dnmt3b的时空表达，而不影响Dnmt3a的表达。数据表明，在HSC发育和分化过程中，Dnmt3b的造血作用与Dnmt3a的白血病作用之间存在区别。
本文公开的发现证明了生物力学力如何通过调用表观遗传机制来刺激细胞命运的转变和赋予干细胞自我更新能力。这项研究还提供了从多能干细胞(PSC)或供体细胞来源的内皮细胞或生血内皮细胞中获得LT-HSC的平台。尽管我们的目标是开发通用相容的HSC，但当通用相容的非转基因来源的细胞可用于治疗患有良性和恶性血液、代谢，免疫、和骨髓疾病的患者时，本文公开的生物仿生型生物反应器便是踏脚石。
材料和方法
所有程序由布里格姆妇女医院和波士顿儿童医院动物的保护和使用委员会(theAnimal Care and Use Committees of Brigham and Women’s Hospital and BostonChildren’s Hospital)批准。
从Jackson实验室购买小鼠Cd45.2(C57BL6/J)和Cd45.1(SJL)，从GeneTools购买吗啉代斑马鱼(zebrafish morpholinos)。通过将荧光标记的葡聚糖染料注入斑马鱼心脏的心房进行微血管造影术，并通过实时成像记录其通过。使用倒置荧光显微镜分析斑马鱼心脏和小鼠AGM的免疫染色。使用明场成像或延时共聚焦显微镜分析斑马鱼胚胎中的心脏压塞、心跳、脉动频率。使用延时共聚焦成像分析斑马鱼转基因胚胎中血管中红血细胞的运动以及内皮细胞-至-HSC转变。
使用Flexcell FX-4000机器体外刺激脉动血管等状况。为了分析药理学靶标在调节内皮细胞-至-HSC转变的调控中的作用，将小鼠胚胎来源的AGM或整个小鼠胚胎离体暴露于生物力学拉伸、化学品、或药物。接下来，通过在StemCell M3434培养基中孵育小鼠AGM来源的细胞7天来进行造血集落形成测定。进行致命照射的SJL小鼠中AGM来源的HSC的连续移植。使用有限稀释测定法分析生物力学拉伸后的干细胞频率。为了表征初次移植体中AGM-HSC来源的血细胞的特性，使用FACS测定嵌合体和重建百分比，使用定量逆转录酶-PCR分析球蛋白转录本，使用PicoKine ELISA试剂盒测定髓过氧化物酶量，使用TCR-β基因座的PCR分析TCR-β重排，使用Thermo-Fisher小鼠Ig分型试剂盒分析预免疫IG检测，和通过在预致敏小鼠的脚掌中注射绵羊RBC(Rockland Immunochemicals)来分析迟发型超敏反应。
进行RNA测序分析以测定用循环应变或药理学调节剂处理的小鼠AGM中的基因表达模式。使用计算算法，对差异表达的基因进行层次聚类，以及测定它们过度显示的生物学过程和途径。分析差异表达基因的基因表达簇，并比较它们在整个细胞群中的平均表达水平。接下来，构建上基因和下基因的维恩比较，以分析对循环应变或药理学调节剂介导的内皮细胞-至-HSC转变重要的候选物(一种或更多种)。此外，使用EqiQuick测定试剂盒分析小鼠AGM细胞的细胞核部分中的Dnmt3b和Dnmt3a蛋白的表达。除非另有说明，否则数据表示为平均值±s.d。统计分析是通过配对或未配对的学生t检验进行的。在P<0.05设定显著性。
动物
实验使用野生型AB、Casper、和转基因斑马鱼品系lcr:eGFP、flk1:mCherry、flk1:eGFP、cd41:eGFP。胚胎使用长达4天pf。实验使用来自Jackson实验室的Cd45.2(C57BL6/J)和Cd45.1(SJL)小鼠。
吗啉代
获得吗啉代反义寡核苷酸(Gene Tools；序列如下)，并将其注射入一细胞期(one-cell stage)casper斑马鱼胚胎中。在E3培养基中、在28℃下孵育注射和未注射的胚胎，直至固定。
| 靶 | 序列(5’–3’) | SEQ ID NO: |
| cdh5-MO | TACAAGACCGTCTACCTTTCCAATC | 1 |
| sih-MO | CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA | 2 |
| piezo1-MO | CAAAGTTCAGTTCAGCTCACCTCAT | 3 |
| dnmt3bb.1-MO1 | TTATTTCTTCCTTCCTCATCCTGTC | 4 |
| dnmt3bb.1-MO2 | CTCTCATCTGAAAGAATAGCAGAGT | 5 |
胚胎的化学处理
在E3鱼培养基中用以下化学调节剂处理斑马鱼胚胎：100uM L-NAME(FisherScientific)、50uM洋地黄毒苷配基(Sigma)、25-50uM Yoda1(Cayman Chemical)、1uM七尾霉素(Nana；Fisher Scientific)、100uM氯化钆(GdCl3；Sigma),5-10uM 4α-佛波醇12,13-二癸酸酯(4α-phorbol 12,13-didecanaote)(4Αpdd；Sigma)、或GSK205(10uM)。
微血管造影术
将荧光染料标记的葡聚糖珠注射至对照和cdh5-MO胚胎的心房中，并使用NikkonSMZ1500立体显微镜捕获实时明视场视频。
心率和心输出量
在具有5倍物镜的Axioplan(Zeiss)立式显微镜上使用集成的白炽灯照明和带有512×480像素灰度图像传感器的FastCam-PCI高速数码相机(Photron)，获取活斑马鱼心脏的图像。以每秒250帧获取图像，每种情况下获取1088帧(′8个心动周期)。使用定制软件(在MATLAB中实现)从顺序图像文件中确定心率。对于每个视频，使用ImageJ手动测量舒张期和收缩期的心室长轴和短轴，并用于估计使用标准几何假设的心室体积。对于每个吗啉代剂量至少十个胚胎，将心输出量测量为心脏舒张心室体积减去心脏收缩心室体积，乘以心率(Shin等人，2010)。
周期性分析
将斑马鱼Casper胚胎包埋在含有三卡因(Sigma)的0.8％低熔点琼脂糖中，并置于培养皿中。接下来，使用配备有NIS Elements(Nikon)软件的Nikon SMZ1500立体显微镜捕获AGM区域中脉动血管的实时明场视频。视频被用来量化血管中的脉动频率。
明视场实时成像
为了进行明视场实时成像，将斑马鱼Casper胚胎包埋在具有三卡因(Sigma)的0.8％低熔点琼脂糖中，并置于培养皿中。使用配备有NIS Elements(Nikon)软件的NikonSMZ1500立体显微镜捕获实时明视场视频和静止图像。
共聚焦显微镜
将cd41:eGFP融合至flk1:mCherry斑马鱼和具有lcr:eGFP的flk1:mCherry斑马鱼，并在其转基因胚胎中注入吗啉代。将转基因胚胎置于低熔点琼脂糖中，并使用旋转盘共聚焦显微镜从30至42hpf对由flk1+内皮细胞产生的cd41:eGFP+HSC进行延时共聚焦成像。在flk1:mCherry+内皮细胞的背景下分析lcr:eGFP+红血细胞的相对运动。我们使用Imaris(Bitplane)软件进行图像分析。
整体原位杂交
如前所述进行整体原位杂交。
心脏压塞
在48hpf时使用微注射针刺穿心包膜囊并释放cdh5-MO注射的斑马鱼胚胎的心脏周围积聚的液体。
免疫染色
收获E10.5嵌合小鼠胚胎，包埋在石蜡块中，进行横向切片，并用一抗Piezo1(兔抗小鼠IgG；Abcam)、Cd31(驴抗小鼠IgG；R&D Systems)、c-Kit(兔抗小鼠IgG；R&D Systems)、或Dnmt3b(驴抗小鼠IgG；Abcam)和4,6二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)抗体，以及二抗AlexaFluor 488(驴抗兔IgG；Fisher Scientific)和Alexa Fluor 647(驴抗山羊IgG；Abcam)进行免疫染色以检测其在E10.5 AGM区域的表达。
在从对照和cdh5-MO沉默的斑马鱼胚胎中分离的心脏中测定flk1(GFP)、mf2(mCherry)、和DAPI(violet)的表达。
AGM外植体
从C57BL6/J Cd45.2小鼠胚胎中收获E11.5 AGM，并将三胚当量的单细胞悬浮液接种至BioFlex六孔培养板(FlexCell)的各个孔中。我们施加循环应变(
FX-4000TM张力系统)和/或用化学调节剂(2-100μM Yoda1、1μM七尾霉素、100μM Gdcl3、1uM GsMTx4、5-20μM 4αPDD、10uM GSK205)处理，将细胞过夜培养。接下来，将收获的细胞用于进行移植、荧光激活细胞分选(FACS)分析、和集落形成单位(CFU)测定。
由药物的胚胎的离体孵育
E11.5小鼠胚胎从定期交配的怀孕雌性的子宫中获得，放入含有FBS、1mM葡萄糖、1％青霉素-链霉素、和/或选定的化学调节剂(2-100μM Yoda1,1μM七尾霉素、5-20μM 4αPDD、或10uM GSK205)的无菌玻璃小瓶中。我们将玻璃小瓶置于离体培养箱(BTCEngineering,Cambridge,UK)中，该培养箱由滚筒设备(旋转至～30rpm)、恒定气体供应量(21％02、5％CO2、余量为N2)和37℃恒温组成。24小时后，收获AGM以通过FACS和CFU测定分析造血细胞的形成。
移植
对于初次移植，将三胚当量的未经处理或已处理(循环应变或25μM Yoda1)的AGM加脾脏辅助细胞(每只小鼠约500,000个)通过眼眶后注射注入致死剂量辐射(分割剂量为10.5cGy)的Cd45.1(SJL)小鼠。对于二次和三次移植，从移植小鼠中分离出骨髓(腿、臂、骨盆骨、脊柱、胸骨)。将骨髓加载至Ficoll梯度(
-1083,Sigma-Aldrich)上，并将血沉棕黄层的细胞与结合生物素的谱系抗体和链霉亲和素微珠(Miltenyi Biotec)一起孵育。接下来，使用MACS LS色谱柱(Miltenyi Biotec)分离谱系阴性(Lin-)细胞，并使用MoFlo Beckman Coulter分选仪分选供体Cd45.2 Lin-Sca1+c-Kit+(LSK)细胞。随后，将分选的Cd45.2 LSK细胞与Cd45.1脾脏辅助细胞混合(每只小鼠约500,000个)，并通过眼眶后注射移植到Cd45.1辐射(分割剂量为10.5cGy)的SJL小鼠中。
存活的接受者被计为有限稀释测定的反应：根据泊松分布，由ELDA计算1/(干细胞频率)的置信区间。
CFU和FACS测定
为了进行CFU测定，将来自AGM外植体或离体的细胞接种在MethoCult GF M3434培养基(StemCell Technologies)中。接种后7天，我们分析了它们形成粒细胞、红系、巨噬细胞、巨核细胞(GEMM)、粒细胞巨噬细胞(GM)、粒细胞(G)、巨噬细胞(M)、和红系(E)集落的能力。
用Sca1-Pacific-Blue(E13-161.7,Biolegend)和Flk1-APC-Cy7(Avas 12α1,BD)对来自外植体和离体的AGM细胞进行染色。用以下抗体混合物对移植小鼠的血液进行染色：Cd45.2-Pacific-Blue(104,Biolegend)、Cd45.1-FITC(A20,Biolegend)、Cd3-PE(145-2C11,Biolegend)、Cd8-PE(53-6.7,Biolegend)、Mac1-APC(M1/70,Biolegend)、Gr1-APC(108412,Biolegend)、Cd19-APC-CY7(6D5,Biolegend)、B220-APC-CY7(RA3-6B2,Biolegend)。
来自E11.5 AGM细胞移植小鼠的骨髓、脾脏、胸腺、和淋巴结的细胞用以下抗体组染色：骨髓LT-HSC:Cd45.2-FITC(104,Biolegend)、Ter119-生物素(TER-119BD)、Gr1-生物素(RB6-8C5,BD)、Cd5-生物素(53-7.3,BD)、Cd8a-生物素(53-6.7,BD)、B220-生物素(RA3-6B2,BD)、链霉亲和素-Pacific Blue(eBioscience)、Sca1-PE-CY7(D7,eBioscience)、cKit-APC(2B8,eBioscience)、Cd48-APC-CY7(HM48-1,BD)、Cd150-PE-CY5(TC15-12F12.2,Biolegend)。骨髓中红系发育RI-RV：Cd45.2-Pacific-Blue(104,Biolegend)、Cd45.1-FITC(A20,Biolegend)、Ter119-APC(TER-119,Biolegend)、Cd71-PE(R17217,eBioscience)。骨髓粒细胞：Cd45.2-Pacific-Blue(104,Biolegend)、Cd45.1-FITC(A20,Biolegend)、Gr1-PE,(RB6-8C5,BD)；Mac1-APC(M1/70,Biolegend)。脾脏、胸腺和淋巴结T细胞：Cd45.2-Pacific-Blue(104,Biolegend)、Cd45.1-FITC(A20,Biolegend)、Cd8-PE(53-6.7,Biolegend)、Cd4-APC(RM4-5,eBioscience)。脾脏、胸腺和淋巴结骨髓和B细胞：Cd45.2-Pacific-Blue(104,Biolegend)、Cd45.1-FITC(A20,Biolegend)、Cd19-APC-CY7(6D5,Biolegend)、Mac1-APC(M1/70,Biolegend)。我们在BD Fortessa细胞仪上进行所有FACS分析。移植16周后，我们进行造血器官分析。
定量逆转录酶-聚合酶链反应分析(qRT-PCR)
FACS用于从分离自AGM移植小鼠的未溶解的骨髓中分选红系前体(Cd45.2+,Ter119+,Cd71+)。使用RNAeasy Minikit(QIAGEN)分离总RNA，并使用Superscript III(Invitrogen)进行cDNA合成。使用SYBR Green(QuantaBio)在MX3000P机器上使用所示引物进行实时定量PCR(Sankaran等人,2009)。我们将表达标准化为3-磷酸甘油醛-脱氢酶(Gapdh)(Ochida等人,2010)。
髓过氧化物酶(MPO)表达
从16周初次移植的小鼠的分离的骨髓FACS分选中性粒细胞(Cd45.2+,Gr1+,Mac1+)，并在24孔板中在具有10％FBS的IMDM中过夜培养(500,000个细胞/mL)。收集上清液，并使用小鼠MPO/髓过氧化物酶PicoKineTMELISA试剂盒(Boster)测定MPO浓度。还测定血液血清中的MPO浓度。
TCR-β重排的PCR测定
从16周初次移植的小鼠的脾细胞FACS分选T细胞(Cd45.2+,Cd3+)和髓系细胞(Cd45.2+,Mac1+)。接下来，提取基因组DNA，并对于TCR-β基因座内的DHβ2.1-JHβ2.7重排进行PCR。将我们的样品变性(94℃,1分钟)，退火(63℃,2分钟)，并延伸(72℃,2分钟)35个循环。引物序列如下：
| 靶 | 序列 | SED ID NO: |
| DHβ2.1的5’ | GTAGGCACCTGTGGGGAAGAAACT | 6 |
| JHβ2.7的3’ | TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT | 7 |
参见Lu等,2017。
预免疫Ig检测
从16周初次移植的小鼠中分离血液血清，并通过小鼠Ig分型试剂盒(ThermoFisher)定量预免疫Ig同种型。
迟发型超敏反应
通过皮下(下背部)和皮内注射(右脚掌)，用绵羊红血细胞(sRBC，109个细胞/mL，每个部位50μL，Rockland Immunochemicals)致敏移植小鼠。敏化六天后，在左脚掌中用2x109个sRBC/mL和在右脚掌中用等体积PBS激发预敏小鼠(作为对照)。激发48小时后，用微型卡尺测量脚掌厚度。我们在第6天将每个脚掌的预激发厚度归一化为百分比变化。
DNA甲基转移酶表达
使用EpiQuik细胞核提取试剂盒(Epigentek Group Inc.)收获来自AGM外植体的细胞核提取物。根据制造商的说明，使用比色EpiQuik测定试剂盒(Epigentek Group Inc.)分析Dnmt3b和Dnmt3a蛋白水平。Dnmt3b和Dnmt3a的浓度是相对于1μg的细胞核提取蛋白而言的。
RNAseq和计算分析
使用RNAeasy MiniKit(QIAGEN)分离来自E11.5小鼠AGM外植体培养物的总RNA(对照、拉伸、Yoda1和4αPDD情况)。我们的cDNA文库是由BGI Americas Corporation生成的，并使用HiSeq4000设备(Illumina)进行测序，每个泳道有八个样本。我们使用基因组短读段核苷酸比对程序(2012-07-20版)将测序的读段片段映射到小鼠参考基因组GRCm38(ENSEMBL版本69)。DESeq2和DEXSeq分别用于试验差异表达(FDR＝0.1)和差异外显子的使用。分析差异表达基因的基因表达簇，并比较它们在整个细胞群中的平均表达水平。接下来，对上基因和下基因进行维恩比较，以分析对循环应变或药理学调节剂介导的内皮细胞-至-HSC转变重要的候选物(一种或更多种)。具体来说，我们使用R(R Development Core Team，2012)中的gplots包(Warners等人，2017)通过引导程序分析进行层次聚类。对于GO分析，我们使用Fisher精确检验试验我们在GO类别或途径上差异表达基因的过量表达，并使用Bonferroni方法进行了多次试验的校正。我们进行了如前所述的GO项富集分析，使用0.001的P值作为具有统计学上显著富集的最小值。
统计分析
除非另有说明，否则数据以平均值±平均值的标准误差(平均值±SEM)表示。统计分析是通过配对或未配对的学生t检验进行的。在P<0.05设定显著性。
Claims (84)
1.一种制备包括长期(LT)-HSC的造血干细胞(HSC)的群体的方法，所述方法包括：
提供包括内皮细胞和/或生血内皮(HE)细胞的群体，
在所述内皮细胞和/或HE细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的两种或更多种内皮基因的表达或活性；
在所述内皮细胞和/或HE细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2和mllt3的两种或更多种造血基因的表达或活性，从而刺激包括LT-HSC的HSC的形成。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括在所述内皮细胞和/或HE细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的三种或更多种内皮基因的表达或活性；和在所述内皮细胞和/或HE细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的三种或更多种造血基因的表达或活性，从而刺激HSC的形成和任选地扩增。
3.根据权利要求1所述的方法，其包括在所述内皮细胞和/或HE细胞中降低vegfa、hey2、grp116、gna13、cdh5、和plxnd1的表达或活性；和在所述内皮细胞和/或HE细胞中增加runx1、spi1、cebpa、tal1、和gata2的表达或活性，从而刺激HSC的形成和任选地扩增。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述增加造血基因的活性或表达包括以下的一种或更多种：将编码mRNA或mRNA衍生物引入所述造血基因、将编码转基因或附加体引入所述造血基因、和将表达元件的基因修饰引入所述造血基因或将功能获得型突变引入所述造血基因。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性包括以下的一种或更多种：将完整或部分的基因删除、RNA沉默、反义寡核苷酸抑制、药理学抑制引入所述内皮基因，和将表达元件的基因修饰引入所述内皮基因或将功能丧失型突变引入所述内皮基因。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性和所述增加造血基因的表达或活性是通过增加有效水平和持续时间下的Dnmt3b的表达或活性来进行的。
7.根据权利要求6所述的方法，其中增加Dnmt3b的表达或活性包括以下的一种或更多种：将编码mRNA或mRNA衍生物引入所述Dnmt3b基因、将编码转基因或附加体引入所述Dnmt3b基因、和将表达元件的基因修饰或功能获得型突变引入所述Dnmt3b基因。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性和所述增加造血基因的表达或活性是通过增加有效水平和持续时间下的Gimap6的表达或活性来进行的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中增加Gimap6的表达或活性包括以下的一种或更多种：将编码mRNA或mRNA衍生物引入所述Gimap6基因、将编码转基因或附加体引入所述Gimap6基因、和将表达元件的基因修饰或功能获得型突变引入所述Gimap6基因。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性和所述增加造血基因的表达或活性是通过使内皮细胞或HE细胞与2D或3D循环应变、有效浓度和持续时间下的Piezo1的激动剂、或其组合接触来进行的。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述Piezo1激动剂是Yoda1、Jedi1、和/或Jedi2。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述Piezo1激动剂的有效量在0.1至500uM的范围内、或在0.1至100μM的范围内。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述Piezo1的激动剂基于以下在化学文库中鉴定：在与候选化合物接触的情况下，在内皮细胞和/或HE细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的内皮基因的表达或活性；和在内皮细胞和/或HE细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的两种或更多种造血基因的表达或活性。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述方法包括将包括拟胚体、内皮细胞、生血内皮(HE)细胞、或其组合的群体提供至生物反应器。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述生物反应器提供循环应变生物力学拉伸、有效浓度和持续时间下的Piezo1的激动剂、或其组合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述循环应变生物力学拉伸在内皮细胞和/或HE细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的三种或更多种内皮基因的表达或活性；和在内皮细胞和/或HE细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的两种或更多种造血基因的表达或活性，从而刺激HSC的形成、和任选地扩增。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述HSC定植在造血龛中并重建为功能性多谱系成体血液。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中HE细胞获得自诱导性多能干细胞(iPSC)、非造血干细胞、体细胞、或内皮细胞。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞包括至少1％长期造血干细胞(LT-HSC)、或至少5％LT-HSC。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述造血干细胞包括至少0.1％长期造血干细胞(LT-HSC)。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述内皮细胞和/或HE细胞源自HLA-修饰的细胞或HLA-空白细胞、和/或无转基因的细胞、基因校正的、转基因过表达的，并且任选地通过iPS细胞或体细胞的基因或化学诱导衍生。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中源细胞获得自或源自受试者、即需即用细胞文库，其中所述受试者任选地为通用相容供体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述源细胞获得自或源自患有血液、骨髓、溶酶体储存、线粒体、代谢或免疫疾病的受试者。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述受试者不患有血液系统或非血液系统恶性肿瘤。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其还包括回收和任选地扩增所述HSC。
26.根据权利要求25所述的方法，其中将所述HSC的群体施用至接受者，其中所述接受者任选地为供体受试者。
27.根据权利要求26所述的方法，其中施用至少约102个HSC。
28.根据权利要求26所述的方法，其中施用至少约103个HSC。
29.根据权利要求26所述的方法，其中施用至少约104个HSC。
30.根据权利要求26所述的方法，其中施用至少约105个HSC。
31.一种将细胞群体转变为生血内皮(HE)细胞的方法，所述方法包括：
提供包括拟胚体或内皮细胞的群体，并提供选自以下的一种或更多种的基因、药理学、和/或机械刺激：
在所述细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的一种或更多种内皮基因的表达或活性；和在所述细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的两种或更多种造血基因的表达或活性；
施加2D或3D循环应变，和
将所述细胞与有效浓度和持续时间下的Piezo1的激动剂接触；从而将所述细胞转变为HE细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述增加造血基因的活性或表达包括以下的一种或更多种：将编码mRNA或mRNA衍生物引入所述造血基因、将编码转基因或附加体引入所述造血基因，将表达元件的基因修饰引入所述造血基因；和将功能获得型突变引入所述造血基因。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性包括以下的一种或更多种：将完整或部分的基因删除、RNA沉默；反义寡核苷酸抑制、药理学抑制引入所述内皮基因，将表达元件的基因修饰引入所述内皮基因、和将功能丧失型突变引入所述内皮基因。
34.根据权利要求33或33所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性和所述增加造血基因的表达或活性是通过增加有效水平和持续时间下的Dnmt3b的表达或活性来进行的。
35.根据权利要求34所述的方法，其中增加Dnmt3b的表达或活性包括以下的一种或更多种：将编码mRNA或mRNA衍生物引入所述Dnmt3b基因、将编码转基因或附加体引入所述Dnmt3b基因、将表达元件的基因修饰引入所述Dnmt3b基因、和将功能获得型突变引入所述Dnmt3b基因。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性和所述增加造血基因的表达或活性是通过增加有效水平和持续时间下的Gimap6的表达或活性来进行的。
37.根据权利要求36所述的方法，其中增加Gimap6的表达或活性包括以下的一种或更多种：将编码mRNA或mRNA衍生物引入所述Gimap6基因、将编码转基因或附加体引入所述Gimap6基因、将表达元件的基因修饰引入所述Gimap6基因、和将功能获得型突变(一种或更多种)引入所述Gimap6基因。
38.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞与有效量的选自Yoda1、Jedi1、和/或Jedi2的Piezo1激动剂接触。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述Piezo1激动剂的有效量在0.1至500uM的范围内、或在0.1至100μM的范围内。
40.根据权利要求31至39中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述群体提供至生物反应器，其中所述生物反应器提供循环应变生物力学拉伸。
41.根据权利要求40所述的方法，其中将所述HE细胞回收，或将所述HE细胞转变为HSC，所述转变任选地通过施加所述基因、药理学、和/或机械刺激来进行。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述HE细胞转变为HSC，所述HSC定植在造血龛中并重建为功能性多谱系成体血液。
43.根据权利要求31至42中任一项所述的方法，其中拟胚体或内皮细胞源自诱导性多能干细胞(iPSC)。
44.根据权利要求31至42中任一项所述的方法，其中所述内皮细胞源自非造血干细胞。
45.根据权利要求31至44中任一项所述的方法，其中所述HE细胞转变为造血干细胞，所述造血干细胞包括长期造血干细胞(LT-HSC)。
46.根据权利要求31至45中任一项所述的方法，其中所述细胞的群体源自HLA-修饰的细胞或HLA-空白细胞。
47.根据权利要求31至45中任一项所述的方法，其中所述细胞的群体是无转基因的细胞。
48.根据权利要求31至47中任一项所述的方法，所述方法还包括在包括向所述HSC细胞施加所述基因、药理学、和/或机械刺激的过程中扩增所述HSC。
49.根据权利要求48所述的方法，其中将所述HSC施用至接受者，其中所述接受者任选地为供体受试者。
50.一种扩增造血干细胞(HSC)的群体的方法，所述方法包括：
提供HSC的群体，并提供选自以下的一种或更多种的基因、药理学、和/或机械刺激：
在所述细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的一种或更多种内皮基因的表达或活性；和在所述细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的两种或更多种造血基因的表达或活性；
施加2D或3D循环应变，和
将所述细胞与有效浓度和持续时间下的Piezo1的激动剂接触；从而扩增所述HSC。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述增加造血基因的活性或表达包括以下的一种或更多种：将编码mRNA或mRNA衍生物引入所述造血基因、将编码转基因或附加体引入所述造血基因、将表达元件的基因修饰引入所述造血基因；和将功能获得型突变引入所述造血基因。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性包括以下的一种或更多种：将完整或部分的基因删除、RNA沉默、反义寡核苷酸抑制、药理学抑制引入所述内皮基因，将表达元件的基因修饰引入所述内皮基因，和将53缺失型突变引入所述内皮基因。
53.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性和所述增加造血基因的表达或活性是通过增加有效水平和持续时间下的Dnmt3b的表达或活性来进行的。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述增加Dnmt3b的表达或活性包括以下的一种或更多种：将编码mRNA或mRNA衍生物引入所述Dnmt3b基因、将编码转基因或附加体引入所述Dnmt3b基因、将表达元件的基因修饰引入所述Dnmt3b基因；和将功能获得型突变并入所述Dnmt3b基因。
55.根据权利要求50至54中任一项所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性和所述增加造血基因的表达或活性是通过增加有效水平和持续时间下的Gimap6的表达或活性来进行的。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述增加Gimap6的表达或活性包括以下的一种或更多种：将编码mRNA或mRNA衍生物引入所述Gimap6基因、将编码转基因或附加体引入所述Gimap6基因、将表达元件的基因修饰引入所述Gimap6基因、和将功能获得型突变(一种或更多种)引入所述Gimap6基因。
57.根据权利要求50所述的方法，其中所述细胞与有效量的选自Yoda1、Jedi1、和/或Jedi2的Piezo1激动剂接触。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述Piezo1激动剂的有效量在0.1至500uM的范围内、或在0.1至100μM的范围内。
59.根据权利要求50至58中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述群体提供至生物反应器，其中所述生物反应器提供循环应变生物力学拉伸。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述HSC定植在造血龛中并重建为功能性多谱系成体血液。
61.根据权利要求50至60中任一项所述的方法，其中所述HSC转变自内皮细胞或HE细胞。
62.根据权利要求50至61中任一项所述的方法，其中所述HSC包括长期造血干细胞(LT-HSC)。
63.根据权利要求50至62中任一项所述的方法，其中所述HSC的群体源自HLA-修饰的细胞或HLA-空白细胞。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述细胞的群体是无转基因的细胞。
65.一种药物组合物，其包括通过根据权利要求1至64中任一项所述的方法制备的HSC的群体、和药学上可接受的载体。
66.根据权利要求65所述的药物组合物，其包括至少104个LT-HSC细胞。
67.一种治疗有造血干细胞治疗或移植需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的通过根据权利要求1至64中任一项所述的方法制备的造血干细胞(HSC)或施用根据权利要求65或66所述的药物组合物。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述受试者患有恶性或非恶性形式的血液、骨髓、溶酶体储存、线粒体、代谢、或免疫疾病。
69.根据权利要求67或68所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的病况：急性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病；骨髓增生异常综合征；多发性骨髓瘤；非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、成神经细胞瘤、生殖细胞瘤、或淀粉样变性。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的病况：自身免疫性疾病如全身性红斑狼疮(SLE)或全身性硬化病；再生障碍性贫血；纯红细胞再生障碍；阵发性夜间血红蛋白尿症、范可尼贫血；重型地中海贫血；镰状细胞性贫血；重症联合免疫缺陷症(SCID)；Wiskott-Aldrich综合征；噬血细胞性淋巴组织细胞增多症；先天性代谢异常；大疱表皮松解；重症先天性中性粒细胞减少症；Shwachman-Diamond综合征；Diamond-Blackfan贫血；Pearson综合征、和白血球黏附缺乏症。
71.一种制备造血干细胞(HSC)的方法，所述方法包括：
使一组化合物与拟胚体、内皮细胞和/或生血内皮细胞接触，和确定以下的由所述化合物诱导的表达水平的变化：Dnmt3b或Gimap6；vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的至少两种；和runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的至少两种；
选择诱导基因表达中的以下变化的化合物：
Dnmt3b和/或Gimap6的表达增加，
vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的两种或更多种的表达降低；和
runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的两种或更多种的表达增加；和
通过使所选化合物与内皮细胞和/或生血内皮细胞接触而诱导内皮细胞和/或生血内皮细胞转变至HSC，从而制备可定植并重建多谱系成体血液的自我更新的HSC。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述所选化合物在内皮细胞和/或HE细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的五种或更多种内皮基因的表达；和在内皮细胞和/或HE细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的五种或更多种造血基因的表达，从而刺激HE细胞、HSC、或其组合的形成和任选地扩增。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述所选化合物在内皮细胞和/或HE细胞中降低vegfa、hey2、grp116、gna13、cdh5、和plxnd1的表达；和在内皮细胞和/或HE细胞中增加runx1、spi1、cebpa、tal1、和gata2的表达。
74.根据权利要求71至73中任一项所述的方法，其中所述所选化合物增加Dnmt3b的表达。
75.根据权利要求71至73中任一项所述的方法，其中所述所选化合物是Piezo1激动剂。
76.根据权利要求74所述的方法，其中所述所选化合物是Yoda1、Jedi1、和/或Jedi2的衍生物。
77.根据权利要求71至76中任一项所述的方法，其中拟胚体、内皮细胞、或HE细胞获得自诱导性多能干细胞(iPSC)、非造血干细胞、体细胞、或内皮细胞。
78.根据权利要求71至76中任一项所述的方法，其中所获得的造血干细胞包括至少0.1％长期造血干细胞(LT-HSC)。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所获得的造血干细胞包括至少约1％或至少约10％长期造血干细胞(LT-HSC)。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所获得的造血干细胞包括约2％至约25％LT-HSC。
81.根据权利要求71至80中任一项所述的方法，其中所述内皮细胞和/或HE细胞源自HLA-修饰的细胞或HLA-空白细胞、转基因-过表达的、和/或无转基因的细胞，并且任选地通过iPS细胞或体细胞的遗传或化学诱导衍生。
82.根据权利要求71至81中任一项所述的方法，其中源细胞获得自或源自受试者，其中所述受试者任选地为患者、匹配或非匹配供体、或通用相容供体。
83.根据权利要求71至82中任一项所述的方法，所述方法还包括回收所述HSC。
84.一种用于细胞治疗的组合物，所述组合物是根据本公开生产的，和包括至少约103或至少约104个LT-HSC细胞。
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