KR20220111317A

KR20220111317A - 조혈 줄기 세포의 생성 방법

Info

Publication number: KR20220111317A
Application number: KR1020227022969A
Authority: KR
Inventors: 드바니트 아이. 샤; 조지아 스카핀
Original assignee: 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크.
Priority date: 2019-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2022-08-09
Also published as: US20230041065A1; AU2020402020A1; IL293685A; CN115066492A; CA3164120A1; EP4072570A4; BR112022011169A2; WO2021119061A1; EP4072570A1; JP2023504573A; MX2022006994A

Abstract

다양한 측면 및 실시양태에서, 본 개시내용은 내피 세포를 헤모제닉 내피 (HE) 세포로 이행시키고, HE 세포를 상당한 수준의 LT-HSC를 포함하는 HSC를 포함한 HSC로 이행시키기 위한 유전적, 약리학적 및 기계적 자극을 제공한다. 본 개시내용은 추가로 유전적, 약리학적 및 기계적 자극을 사용하여 HSC를 확장시키는 방법을 제공한다.

Description

조혈 줄기 세포의 생성 방법

우선권 주장

본 출원은 2019년 12월 9일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/945,838을 우선권 주장한다. 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

연방 정부 지원 연구

본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 승인 번호 HL131645 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리가 있다.

조혈 줄기 세포 (HSC)는 특정 유도 사건이 중배엽을 혈액 줄기 세포 및 전구세포로 전환시키는 별개의 영역에서 배아발생 동안 유래된다. HSC는 조혈로 불리는 과정에서 적혈구, 혈소판, 골수성 및 림프성 (T- & B-세포) 세포를 발생시킬 수 있다.

HSC 이식 (HSCT)은 혈액, 골수, 대사 및 면역 질환을 갖는 환자를 치료하는 데 널리 사용된다. 제대 및 단상-동일 줄기 세포 이식의 진전에도 불구하고, HSC 이식의 치료 용도는, 특히 소수 민족 집단이 있고 국립 비혈연간 공여자 등록부가 없는 국가에서는 시기 적절하게 적합한 인간 백혈구 항원 (HLA)-매칭 공여자를 찾기 어렵기 때문에 종종 제한된다. 비록 혼혈인이 미국 인구의 1.6 퍼센트 (970만명)를 차지하지만, 다민족 지원자는 등록부상 700만명 중 단지 3 퍼센트 (21,000명)를 구성하며 6,000명의 환자는 일치하는 골수가 없는 상태로 남아 있다. 적합하게 일치하는 것을 찾았다고 하더라도, 면역학적 합병증, 예컨대 이식편-대-숙주 질환 (GVHD), 공여자 거부 및 높은 치료-관련 사망률이 환자 생존을 위협할 수 있다. 그러나, 이들 합병증은 자가 이식에 의해 제거된다. 비록 자가 HSC가 특히 혈액 악성종양과 관련하여 동종이계 HSC를 전적으로 대체하지는 않지만, 이들은 공여자 이용가능성의 결여, 및 광범위한 악성 및 비-악성 혈액, 면역 및 대사 장애를 갖는 환자에 대한 GVHD를 비롯한 HSCT에서의 주요 장애를 극복할 것이다.

따라서, HSCT를 위해 자가 HSC 또는 기성품 HSC를 비롯한 HSC를 생성할 필요가 있다.

본 개시내용은 적어도 부분적으로, 특정 내피 및 조혈 유전자의 발현 또는 활성의 변화가 내피 세포로부터 조혈 줄기 세포 (HSC) 형성 (자기-재생, 생착, 및 다계통 성체 혈액을 재구성할 수 있는 상당수의 장기 (Long Term, LT)-HSC의 형성 포함)을 유도한다는 발견에 기초한다.

cdh5-모르판트 (cdh5-MO) 배아는 심장 박출량 및 능동 혈류 없이 혈관에서 심박동-매개 맥동을 갖는다. 맥동-유래 스트레칭은 Piezo1 기계감수성 채널을 활성화시키고, 이는 대동맥-생식선-중간 콩팥 (AGM) 영역에서의 Dnmt3b 발현을 추가로 증진시키고, 이는 차례로 코어 내피 및 조혈 유전자 및 이들의 조절인자의 발현을 조정하여 헤모제닉 내피에서 HSC로의 이행을 자극한다. Piezo1의 맥동의 시뮬레이션 또는 약리학적 활성화는 또한 2배 내지 3배 더 많은 양의 LT-HSC를 생성하며, 이는 연속 이식 시 정상적인 기능적 다계통 성체 혈액으로 재구성된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 생성된 조혈 줄기 세포는 상당수의 LT-HSC를 포함하며, 이는 우수한 생착을 나타내고, 수용자에서 기능적 다계통 성체 혈액으로 재구성된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 LT-HSC를 포함하는 조혈 줄기 세포 (HSC) 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 내피 및/또는 헤모제닉 내피 (HE) 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하는 단계, 및 내피 및/또는 HE 세포에서 vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5종 또는 그 초과의 내피 유전자의 발현을 감소시키거나 그의 활성을 변형시키는 단계를 포함한다. 방법은 내피 및/또는 HE 세포에서 runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5종 또는 그 초과의 조혈 유전자의 발현을 증가시키거나 그의 활성을 변형시키는 것을 추가로 포함한다. 내피 유전자의 발현 또는 활성을 감소시킴으로써 및 조혈 유전자의 발현 또는 활성을 증가시킴으로써, HE 세포 또는 HSC (상당수의 LT-HSC 포함)의 형성이 자극된다. 내피 유전자의 발현 또는 활성의 감소, 및 조혈 유전자의 발현 또는 활성의 증가는 직접적으로, 예를 들어 억제제, 트랜스진, 에피솜, mRNA 및 그의 유도체의 투여에 의해 및/또는 유전자 편집 접근법 (본원에 보다 완전히 기재된 바와 같음)을 사용함으로써 이루어질 수 있다. 대안적으로, 발현 또는 활성의 이러한 변화는 적어도 부분적으로 간접적으로, 예를 들어 DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제 3 베타 (Dnmt3b) 및/또는 GTPase IMAP 패밀리 구성원 6 (Gimap6)의 발현 또는 활성을 증가시킴으로써 유도될 수 있다. 추가로, 이러한 유전자 발현 조정은 적어도 부분적으로 기계감수성 수용체 또는 채널의 효능제 (예를 들어, Piezo1 효능제)를 사용함으로써, 또는 세포에 주기적-변형 생물역학적 스트레칭을 적용함으로써 수행될 수 있다. 다양한 실시양태에서, vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln으로부터 선택되는 적어도 1개 또는 적어도 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 내피 유전자는 직접적으로 또는 간접적으로 발현이 감소된다. 이들 또는 다른 실시양태에서, runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3으로부터 선택되는 적어도 1개 또는 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 조혈 유전자는 직접적으로 또는 간접적으로 발현이 증가된다.

일부 실시양태에서, 내피 유전자 및 조혈 유전자의 발현 또는 활성은 HE 세포 또는 HSC의 형성을 자극하기에 충분한 조건 하에 세포에서 Dnmt3b 및/또는 Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시킴으로써 적어도 부분적으로 조절된다. 일부 실시양태에서, HE 세포는 회수되고, HSC의 형성에 사용된다. HSC는 환자에게 투여하기 위해 회수되고 임의로 확장될 수 있다. HSC는 본원에 기재된 유전적, 약리학적 또는 기계적 자극을 사용하여 임의로 확장된다.

일부 실시양태에서, 내피 세포는 Dnmt3b의 활성 또는 발현을 증가시키거나 또는 내피 유전자 및 조혈 유전자의 적절한 조정을 제공하는 유효량의 효능제와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 효능제는 기계감수성 수용체 또는 기계감수성 채널의 효능제이다. 일부 실시양태에서, 기계감수성 수용체는 Piezo1이다. 예시적인 Piezo1 효능제는 Yoda1, Jedi1 및 Jedi2를 포함한다. 일부 실시양태에서, Piezo1 효능제 (예를 들어, Yoda1)의 유효량은 약 0.1 μM 내지 약 300 μM, 또는 약 0.1 μM 내지 약 200 μM, 또는 약 1 μM 내지 약 100 μM, 또는 일부 실시양태에서, 약 10 μM 내지 약 100 μM, 또는 약 2.5 μM 내지 약 100 μM 또는 약 2.5 μM 내지 약 50 μM의 범위이다.

대안적 기계감수성 수용체 또는 기계감수성 채널 효능제 (예를 들어, Piezo1 효능제)는 화학적 라이브러리로부터 확인될 수 있다. 이들 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 내피 및 조혈 유전자 발현의 변화를 유도하는 효능제가 확인된다. 예를 들어, 후보 효능제는, 후보 화합물과 접촉 시 내피 및/또는 HE 세포에서 vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln으로부터 선택되는 내피 유전자의 발현을 감소시키거나 그의 활성을 변형시키고; 내피 및/또는 HE 세포에서 runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3으로부터 선택되는 2종 이상의 조혈 유전자의 발현을 증가시키거나 그의 활성을 변형시킨다.

유전자의 활성 또는 발현이 내피 및/또는 HE 세포에서 직접적으로 증가되어야 하는 경우, 다양한 접근법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자의 mRNA 발현은 mRNA 전사체 (변형된 mRNA 포함)를 세포에 전달함으로써, 또는 활성을 증가 또는 변형시키기 위한 하나 이상의 변형을 가질 수 있는 트랜스진 및/또는 에피솜을 도입함으로써 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집은 내피 또는 HE 세포에서의 발현 요소에 유전자 변형을 도입하는 데, 예컨대 프로모터 강도, 리보솜 결합 또는 RNA 안정성을 증가시키는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집은 기능 획득 돌연변이를 도입하는 데 사용된다.

일부 실시양태에서, 유전자의 활성 또는 발현은 내피 및/또는 HE 세포에서 직접적으로 감소될 수 있다. 예를 들어, 내피 유전자의 발현 또는 활성은 다음 중 하나 이상에 의해 감소될 수 있다: 내피 및/또는 HE 세포에서 완전 또는 부분 유전자 결실의 도입, RNA 침묵, 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제, 및 발현 요소의 유전자 변형의 도입 (프로모터 강도, 리보솜 결합 또는 RNA 안정성의 감소 포함) 또는 기능 상실 돌연변이의 도입.

일부 실시양태에서, 본 발명은 내피 및/또는 HE 세포에서 Gimap6의 활성 또는 발현을 단독으로 또는 Dnmt3b와 조합하여 증가시키는 것을 포함한다. Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시키기 위해, Gimap6 mRNA 전사체를 세포, 또는 다르게는 Gimap6 트랜스진 및/또는 에피솜에 도입하고/거나 Gimap6 발현 요소의 유전자 변형 (예컨대, 프로모터 강도, 리보솜 결합 또는 RNA 안정성을 증가시키는 하나 이상의 변형)을 세포에 도입할 수 있다.

다양한 실시양태에서, 배아체, 내피 세포 및/또는 HE 세포를 포함하는 세포 집단을 생물반응기에 도입한다. 일부 실시양태에서, 생물반응기는 2D 또는 3D 배양에서 세포에 주기적-변형 생물역학적 스트레칭을 제공한다. 예를 들어, 주기적-변형 생물역학적 스트레칭은 2D 또는 3D 배양 표면에 적용될 수 있다. 주기적-변형 생물역학적 스트레칭은 Dnmt3b 및/또는 Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시킨다. 예를 들어, 나일론, PDMS, 또는 다른 생체적합성 생체모방체 막 (예를 들어, 가요성-바닥 배양 플레이트의 것)에 부착된 컴퓨터 제어 진공 펌프 시스템 (예를 들어, 플렉스셀(FlexCell)™ 텐션 시스템, 사이토스트레쳐 시스템, 또는 유사물)을 사용하여, 한정되고 제어된 주기적 변형 조건 하에 2D 또는 3D 배양에서 막과 접촉하는 배아체, 내피 세포 또는 HE 세포에 생체외 원주방향 스트레치를 적용할 수 있다.

다양한 실시양태에서, HSC 이행은 Piezo1 활성화; 기계적 스트레칭; Dnmt3b에 대한 트랜스진, 에피솜 또는 유전자 변형을 갖거나 갖지 않는 (즉, 트랜스진 무함유) mRNA의 도입; Gimap6에 대한 트랜스진, 에피솜 또는 유전자 변형을 갖거나 갖지 않는 (즉, 트랜스진 무함유) mRNA의 도입; 본원에 기재된 하나 이상의 조혈 유전자에 대한 트랜스진, 에피솜 또는 유전자 변형을 갖거나 갖지 않는 (즉, 트랜스진 무함유) mRNA의 도입; 및 본원에 기재된 내피 유전자(들)에 대한 완전 또는 부분 유전자 결실의 도입, RNA 침묵, 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제, 또는 유전자 변형의 도입으로부터 선택되는 하나 이상에 의해 유도된다.

일부 실시양태에서, 내피 및/또는 HE 세포는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC), 비-조혈 줄기 세포, 또는 체세포, 예컨대 섬유모세포 또는 내피 세포로부터 수득되거나 유래된다. 일부 실시양태에서, 내피 및/또는 HE 세포는 HLA-무효(null) 세포, HLA-변형 세포, 유전자 교정된, 바이러스 벡터 과다발현된, 트랜스진 과다발현된 및/또는 트랜스진-무함유 세포로부터, 또는 배아체의 내피 세포 및/또는 HE 세포로의 유전자 유도로부터 수득되거나 유래된다. 헤모제닉 내피 세포 (예를 들어, Flk1+CD45+ 세포, Flk1+CD41+ 세포 또는 CD31+CD43+ 세포)는 동종이계 공여자의 공급원 세포로부터 유래되거나 또는 HSC로 치료하고자 하는 대상체로부터 유래되는 것 (즉, 헤모제닉 내피 세포에 대한 자가 또는 동종이계 세포의 화학적, 유전적, mRNA, 트랜스진-무함유, 또는 에피솜 유도에 의함)을 비롯한 임의의 방식으로 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 내피 세포 또는 HE 세포는 수용자, 기성품 은행, 또는 범용 상용성 공여자로부터의 세포를 사용하여 생성된 iPSC로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 발생적으로 가소성인 내피 세포가 사용된다.

다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 HSC 집단 및 제약상 허용되는 비히클을 포함하는 세포 요법을 위한 제약 조성물이 제조된다. 제약 조성물은 적어도 약 10²개 HSC, 또는 적어도 약 10³개 HSC, 또는 적어도 약 10⁴개 HSC, 또는 적어도 약 10⁵개 HSC, 또는 적어도 약 10⁶개 HSC, 또는 적어도 약 10⁷개 HSC, 또는 적어도 10⁸개 HSC를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 조성물 중 HSC의 적어도 약 0.1%, 또는 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 2%, 또는 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%는 LT-HSC이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 수용자의 체중 1 kg당 약 100,000 내지 약 4 x 10⁶개 HSC (예를 들어, 약 2 x 10⁶개 세포/kg)를 포함하는 제약 조성물이 투여된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 HSC 집단을 포함하는 세포 요법이 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 제약상 허용되는 비히클을 포함한다. 세포 요법은 적어도 약 10²개 HSC, 또는 적어도 약 10³개 HSC, 또는 적어도 약 10⁴개 HSC, 또는 적어도 약 10⁵개 HSC, 또는 적어도 약 10⁶개 HSC, 또는 적어도 약 10⁷개 HSC, 또는 적어도 10⁸개 HSC를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 조성물 중 HSC의 적어도 약 0.1%, 또는 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 2%, 또는 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%는 LT-HSC이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 수용자의 체중 1 kg당 약 100,000 내지 약 4 x 10⁶개 HSC (예를 들어, 약 2 x 10⁶개 세포/kg)를 포함하는 제약 조성물이 투여된다. HSC 세포의 수는 환자의 연령 및 체중에 기초하여 변형될 수 있다.

이식을 위한 HSC는 일부 실시양태에서 비교적 짧은 기간, 예컨대 약 2개월 미만, 또는 약 1개월 미만 (예를 들어, 약 4주), 또는 약 2주 미만, 또는 약 1주 미만, 또는 약 6일 미만, 또는 약 5일 미만, 또는 약 4일 미만, 또는 약 3일 미만 내에 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발생적으로 가소성인 내피 또는 HE 세포는 1 내지 4주 동안 내피 및 조혈 유전자의 조정된 활성 또는 발현과 함께 배양된다.

본원에 기재된 방법에 의해 제조된 HSC는, 예를 들어 정맥내 주입 또는 골수내 이식에 의해 대상체 (수용자)에게 투여된다. 방법은 골수절제, 비-골수절제, 또는 면역독소-기반 (예를 들어, 항-c-Kit, 항-CD45 등) 조건화 요법 후에 수행될 수 있다.

본원에 기재된 방법은 이식 프로토콜에 사용하기 위한, 예를 들어 후천성 또는 유전성 형태의 혈액 (악성 및 비-악성), 골수, 대사, 미토콘드리아, 및 면역 질환을 치료하기 위한 HSC 집단을 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, HSC 집단은, 예를 들어 수용자 대상체로부터의 세포를 사용하여 생성된 iPSC로부터 생성된 자가 세포로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, HSC 집단은 보편적으로 상용성인 공여자 세포 또는 HLA-무효 헤모제닉 내피 세포 또는 정상 HSC가 되는 데 도움이 되는 유사한 세포로부터 유래된다.

본 발명의 이들 및 다른 측면 및 실시양태는 본 발명의 하기 상세한 설명에 의해 기재된다.

도 1a는 26-42 hpf 사이에 트랜스제닉 배아에서 flk1:mCherry⁺ 내피 세포로부터 출현하는 cd41:eGFP⁺ HSC의 저속 공초점 영상화를 도시하며; 데이터는 piezo1의 침묵이 내피에서 HSC로의 이행을 약화시키는 반면에, piezo1 (Yoda1)의 약리학적 활성화는 대조군 배아에서 HSC 형성을 자극할 뿐만 아니라 sih-MO 배아에서 HSC 형성을 구제한다는 것을 입증한다. 군당 n=5. *P<0.05 vs. 대조군; ^$P<0.05 vs. sih-MO.
도 1b는 주기적 변형 및 Piezo1 활성화제 (Yoda1)로 처리된 E11.5 AGM 세포에서 차등 발현된 유전자의 히트 맵이며; 이는 주기적 변형 및 Piezo1 활성화가 내피에서 조혈로의 이행 동안 AGM에서 유사한 유전자 발현 패턴을 갖는다는 것을 입증한다. 군당 n=3.
도 1c는 E11.5 AGM 세포 상에서의 조혈 콜로니 형성 단위 (CFU) 검정의 그래프를 도시하며, 이는 Piezo1의 Yoda1-매개 약리학적 활성화가 내피에서 조혈로의 이행을 자극한다는 것을 입증한다. 군당 n≥6. *P<0.05 vs. 대조군. 약어: GEMM (과립구, 적혈구, 대식세포, 거핵구); GM (과립구 대식세포); G (과립구); M (대식세포); E (적혈구).
도 1d는 E11.5 AGM 세포 상에서의 조혈 CFU 검정의 그래프를 도시하며, 이는 Piezo1의 GsMtX4-매개된 약리학적 억제가 내피에서 HSC로의 이행에 대한 주기적 변형의 유도 영향을 약화시킨다는 것을 입증한다. 군당 n≥6. *P<0.05 vs. 대조군. 약어: GEMM (과립구, 적혈구, 대식세포, 거핵구); GM (과립구 대식세포); G (과립구); M (대식세포); E (적혈구).
도 1e는 50 μM Jedi1, 50 μM Jedi2 또는 25 μM Yoda1로 처리된 E11.5 AGM 세포 상에서의 조혈 CFU 검정을 도시하며, 이는 Jedi1, Jedi2 또는 Yoda1-매개 Piezo1 활성화가 GEMM 형성을 증진시킨다는 것을 입증한다. 군당 N=6. 각 샘플당 3.e.e. AGM. *P≤0.05.
도 2a는 실험 개요 (상단) 및 선 그래프 (하단)를 도시한다. 실험 개요 (상단)는 E11.5 마우스 AGM에서 기원하는 HSC의 연속 이식에 이어서 골수절제 면역손상 마우스 내로의 10% 주기적 변형 또는 Yoda1로의 처리를 나타내는 개략도를 도시한다. 선 그래프 (하부)는 제8주 내지 제16주 사이에 4-주 간격으로 1차 이식 (수용자)에서 E11.5 AGM (공여자; 3개의 배아 등가물)-유래 HSC의 재구성으로부터의 말초 혈액 키메라 현상 백분율을 도시하며; 이는 E11.5 AGM에 대한 주기적 변형 또는 Piezo1 (Yoda1 처리)의 약리학적 활성화가 HSC의 형성을 자극한다는 것을 나타낸다. 군당 1차 수용자 n≥5. *P<0.05 vs. 대조군; ^$P<0.05 vs. 제8주 키메라 현상. 3개의 배아 등가물 (e.e.) AGM 공여자 세포를 각각의 수용자에게 주사하였다.
도 2b는 제16주에 1차 이식 (수용자)에서 Mac1⁺Gr1⁺ 골수 세포, Cd8⁺Cd3⁺ T-세포, 및 B220⁺Cd19⁺ B-세포로의 E11.5 AGM (공여자; 3종의 배아 등가물)-유래 HSC의 재구성 백분율을 나타낸 그래프이며; 이는 E11.5 AGM에 대한 주기적 변형 또는 Piezo1 (Yoda1)의 약리학적 활성화가 혈액으로 재구성되는 HSC의 형성을 자극한다는 것을 나타낸다. 군당 1차 수용자 n≥5.
도 2c는 8-12주 사이에 4-주 간격으로 2차 이식 (수용자)에서 1차 이식 (공여자)-유래된 유동-분류된 Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺ HSPC (n=2000)의 재구성으로부터의 말초 혈액 키메라 현상 백분율을 나타낸 선 그래프이며; 이는 E11.5 AGM의 주기적 변형 또는 Yoda1 처리가 연속 생착 및 자기-재생 능력을 갖는 HSC를 생성한다는 것을 나타낸다. 군당 2차 수용자 n≥5. *P<0.05 vs. 대조군.
도 2d는 제12주에 2차 이식 (수용자)에서 Mac1⁺Gr1⁺ 골수 세포, Cd8⁺Cd3⁺ T-세포, 및 B220⁺Cd19⁺ B-세포로의 1차 이식 (공여자)-유래 HSC의 백분율 재구성을 나타낸 그래프이며; 이는 E11.5 AGM의 주기적 변형 또는 Yoda1 처리가 혈액으로 연속적으로 재구성될 수 있는 HSC를 생성한다는 것을 나타낸다. 군당 2차 수용자 n≥5.
도 3a는 실험 개요 (상단) 및 그래프 (하단)를 도시한다. 실험 개요 (상단)는 1차 이식의 조혈 조직 (수용자 마우스)에서 공여자-유래 혈액 계통의 기능적 및 표현형 분석을 위한 전략을 도시한다. 그래프 (하부)는 골수-유래 Cd71⁺Ter119⁺ 분류된 (공여자) 적혈구 세포에서의 헤모글로빈의 β-주요 (성체), εγ (배아) 및 β-H1 (배아) 유형의 발현 백분율을 도시하며; 데이터는 E11.5 AGM의 생물역학적 스트레칭 또는 Yoda1-처리 후에 생성된 공여자 HSC가 성체 헤모글로빈을 함유하는 적혈구로 재구성된다는 것을 나타낸다. 군당 n≥6.
도 3b는 골수-유래 Gr1⁺Mac1⁺ 분류된 (공여자) 호중구의 밤샘 배양 (O/N)에 이어서 미엘로퍼옥시다제 (MPO) 단백질의 ELISA-기반 정량화를 나타낸 그래프이고; 데이터는 공여자 HSC가 E11.5 AGM의 생물역학적 스트레칭 또는 Yoda1 처리 후에 생성되었으며, 이는 충분한 MPO 수준을 나타내는 기능적 골수 세포로 재구성된다는 것을 입증한다. 군당 n≥5.
도 3c는 1차 이식 (수용자) 마우스의 말초 혈액에서 면역전 이뮤노글로불린 (Ig) 이소형의 ELISA 분석을 나타낸 그래프이고; 데이터는 1차 이식이 이뮤노글로불린의 완전한 레퍼토리를 갖는 B-세포를 생성한다는 것을 나타낸다. 군당 n≥6.
도 3d는 비장-분류된 Cd3⁺ T 세포 (공여자) (상단) 또는 Mac1⁺ 골수 세포 (공여자; 음성 대조군) (하단)의 T-세포 수용체 (TCR_β) 유전자좌 분석을 나타낸 2개의 겔 사진의 영상이고; 데이터는, E11.5 AGM의 생물역학적 스트레칭 또는 Yoda1-처리 후에 공여자 HSC가 T-세포를 생성하고 T-세포 수용체 β (TCR β) 재배열을 나타내며, 이는 비장으로 이동하고 TCR_β 유전자좌를 재배열하기에 충분한 기능적 재조합 기구를 보유하는 T-세포로 재구성된다는 것을 나타낸다.
도 3e는 생물역학적 스트레칭 또는 Yoda1-처리된 E11.5 AGM-유래 공여자 HSC로 재구성된 1차 이식 (수용자) 마우스가 T-세포 매개된 면역 반응을 보유한다는 것을 입증하는 지연 과민성 검정을 나타낸 도트 플롯이다. 군당 n≥6. *P<0.05 vs. 우측 발바닥 (음성 대조군).
도 4는 EC 대 HSC (①), EC 대 HEC (②), 및 HEC 대 HSC (③) 동안 상향조절된 유전자의 맥락에서 주기적 변형 및/또는 Yoda1로 처리된 E11.5 AGM 세포에서 상향조절된 유전자의 벤 다이어그램을 도시한다. 상기 분석에서 통상적으로 상향조절된 유전자의 벤 비교 (① 대 ② 대 ③)는 원주방향 스트레칭 및 Piezo1 활성화 둘 다가 내피에서 HSC로의 이행 동안 Dnmt3b 전사체 발현 및 Gimap6 전사체 발현을 특이적으로 자극한다는 것을 입증한다.
도 5a는 주기적 변형 또는 Yoda1로 처리된 E11.5 마우스 AGM 세포의 핵 분획 내의 Dnmt3b 및 Dnmt3a의 단백질 수준의 2개의 그래프를 도시한다; 데이터는 원주방향 스트레칭 또는 Piezo1 활성화가 Dnmt3a의 발현에 영향을 미치지 않으면서 Dnmt3b 단백질 발현 수준을 특이적으로 자극한다는 것을 입증한다. 군당 n≥3. *P<0.05 vs. 대조군.
도 5b는 나노마이신 (Nana)의 존재 하에 주기적 변형 또는 Yoda1로 처리된 E11.5 마우스 AGM 세포의 조혈 CFU 검정의 그래프를 도시한다; 데이터는 Dnmt3b의 약리학적 억제가 원주방향 스트레치 또는 Piezo1 활성화에 의해 자극된 내피에서 HSC로의 이행을 약화시킨다는 것을 나타낸다. 군당 배아 n≥6. *P<0.05 vs. 대조군; ^$P<0.05 vs. 스트레치; ⁺P<0.05 vs. Yoda1.
도 5c는 26-42 hpf 사이에서의 트랜스제닉 배아에서 flk1:mCherry⁺ 내피 세포로부터 출현하는 cd41:eGFP⁺ HSC의 저속 공초점 영상화의 결과를 나타낸 그래프이고; 데이터는 dnmt3bb.1의 침묵이 Dnmt3a에 비해 Dnmt3b에 대한 나노마이신의 특이성, 및 piezo1 활성화에 의해 자극된 내피에서 HSC로의 이행을 약화시킨다는 것을 입증한다. 군당 n≥5. *P<0.05 vs. 대조군; ^$P<0.05 vs. Yoda1.
도 6a는 주기적 스트레치- 또는 Yoda1-처리된 E11.5 AGM 세포에서의 내피 및 조혈 유전자의 차등 발현을 도시하고, 이는 주기적 변형 및 Piezo1 활성화가 내피에서 조혈로의 이행 동안 조혈 유전자의 발현을 자극하면서 내피 유전자의 발현을 억제한다는 것을 나타낸다.
도 6b는 내피 및 조혈 유전자 발현의 qRT-PCR 분석을 도시하며; 이는 주기적 변형 또는 Piezo1 활성화가 E11.5 AGM 세포에서 내피 유전자의 발현을 억제하고 조혈 유전자의 발현을 자극한다는 것을 입증한다. 군당 n=5. *P≤0.05 vs. 대조군.
도 6c는 Yoda1-처리 후의 인간 iPSC-유래 MACS-분류된 CD34+ 세포의 조혈 CFU 검정을 도시하며; 이는 PIEZO1의 약리학적 활성화가 다능 GEMM 전구체 형성 및 인간 조혈을 자극한다는 것을 입증한다. 군당 n=6; 샘플당 20,000개 hCD34+ 세포. *≤0.05 vs. 대조군.
도 6d는 인간화 마우스 (1차 이식)에서의 인간 PSC (DF19-9-7T)-유래 hCD34+ 조혈 세포의 주사 8-10주 후의 골수 키메라 현상의 백분율 (좌측)을 도시하며, 이는 Piezo1의 Yoda1-매개 약리학적 활성화가 생착가능한 hCD34+ 세포의 형성을 증진시킨다는 것을 나타낸다. 도 6d는 인간 PSC-유래 hCD34+ 조혈 세포 (우측)의 인간 CD33+ 골수 세포, 인간 CD3+ T 세포, 및 인간 CD19+ B-세포로의 골수 재구성의 백분율을 추가로 도시하며, 이는 Piezo1 (Yoda1)의 약리학적 활성화가 다계통 혈액을 재구성하는 hCD34+ 조혈 세포의 형성을 자극한다는 것을 나타낸다. n=8 (대조군; 1차 이식의 경우) 및 n=8 (Yoda1 처치, 1차 이식). ***P≤0.001.
도 6e는 인간화 마우스 (2차 이식)에서 DFT19-9-7T hPSC 세포주로부터 유래된 hCD34+ 조혈 세포의 1차 이식으로부터 유래된 골수 세포의 주사 16주 후의 말초 혈액 키메라 현상의 백분율을 도시하며 (좌측), 이는 Piezo1의 Yoda1-매개 약리학적 활성화가 자기-재생 LT-HSC의 형성을 증진시킨다는 것을 나타낸다. 도 6e는 인간 CD33+ 골수 세포, 인간 CD3+ T 세포, 및 인간 CD19+ B 세포에 대한 2차 이식에서의 1차 이식 골수-유래 인간 조혈 세포의 말초 혈액 재구성 백분율을 추가로 도시하며 (우측), 이는 Piezo1 (Yoda1)의 약리학적 활성화가 연속 이식 시 다계통 혈액을 재구성하는 인간 LT-HSC의 형성을 자극한다는 것을 나타낸다. N=5 (Yoda1 처치, 2차 이식).
도 7a는 FACS 분석으로 주기적 스트레치가 EC에서 HEC로의 이행 (좌측) 뿐만 아니라 HEC에서 HSPC로의 이행 (중심)을 촉진한다는 것을 입증한다. 주기적 스트레치를 이용한 HSPC 확장의 분석은 우측에 제시된다. N=6. **P≤0.001, *P≤0.05. 도 7a (상단)는 마우스 E11.5 AGM-분류된 EC (CD31⁺), HEC (CD31⁺cKit⁺) 및 HSPC (cKit⁺) 세포에 대한 10% 주기적 스트레치의 적용에 이어서 FACS 분석을 도시한다.
도 7b는 조혈 분화 제8일의 인간-유래 배상체 (EB)의 FACS 분석을 도시하며, 이는 Yoda1-매개 PIEZO1 활성화가 대조군에서는 hCD43^negCD235^negCD144⁺CD34⁺ HEC의 형성을 증진시키지만 PIEZO1^-/- PSC에서는 그렇지 않다음을 나타낸다. PIEZO1의 손실은 HEC 형성에 영향을 미치지 않았다. 군당 N=3. **P≤0.001 *P≤0.05.
도 7c는 인간 PSC의 조혈 분화 제8+7일에 유래된 CD34⁺CD90⁺ HSC의 FACS 플롯이며, 이는 Yoda1-매개 PIEZO1 활성화가 hPSC로부터의 HSC의 형성을 증진시킨다는 것을 나타낸다.

태아 발생 동안, 대동맥-생식선-중간 콩팥 (AGM)에서의 내피 세포의 하위세트는 헤모제닉 내피 세포이며, 이는 그의 운명을 HSC가 되도록 변화시켜 궁극적으로 태아 간 및 골수를 콜로니화한다. 그러나, 헤모제닉 내피 세포를 자극하는 인자의 실체는 여전히 규명하기 어려운 채로 남아 있으며, 이는 기능적 HSC의 잠재적 공급원으로서 헤모제닉 내피 세포의 유용성을 제한한다. 내피 내층에 대한 혈류-매개 전단-스트레스는 HSC의 내피 출현을 자극한다. 그러나, Cdh5-무효 제브라피쉬 및 뮤린 모델의 사용 시 조기 주기적 정지에도 불구하고 기능적 HSC가 출현한다는 것이 확립되었다 (문헌 [Anderson H, et al., "Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression." Blood 2015]). 이들 cdh5-침묵 모델을 본 개시내용에 따라 기능적 HSC 출현을 촉발하는 전단-스트레스 및/또는 산화질소 신타제 (NOS)-비의존성 생물역학적 힘을 연구하기 위한 중추로서 사용하여, 맥압-매개된 원주방향 스트레치가 HSC 출현을 지배하는 추가의 메카니즘을 조사하였다.

부분적으로 헤모제닉 내피 세포로부터 HSC 출현을 자극하는 인자에 관한 지식의 결여로 인해, 실험실에서 헤모제닉 내피 세포로부터 HSC를 생성시키려는 시도는 대부분 성공적이지 못했다. 박동하는 심장으로부터의 맥동으로 인한 원주방향 혈관 스트레치는 기능적 HSC가 헤모제닉 내피 세포로부터 출현하도록 촉발하며, 이는 궁극적으로 생착하여 확정적 계통으로 분화될 수 있다는 것이 현재 확립되어 있다. 또한, 스트레치-감수성 일시적 수용체 전위 양이온 채널-서브패밀리 바닐로이드 구성원 4 (Trpv4) 채널의 활성화가 심박동 및 혈류의 부재 하에 침묵 심장 (tnnt2; sih)-침묵 배아에서 HSC 형성을 구제하였다. 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 2017/096215를 참조한다.

본 개시내용은 적어도 부분적으로 기계감수성 수용체 (예를 들어, Piezo1)의 생물역학적 및/또는 약리학적 활성화가 조혈 줄기 세포 (HSC) 형성을 위한 Dnmt3b 발현을 증진시키며, 이는 차례로 코어 세트 내피 유전자 및 조혈 유전자 및 그의 조절인자의 발현을 조정한다는 발견에 기초한다. 본원에서 입증된 바와 같이, cdh5-모르판트 (cdh5-MO) 배아는 심장 박출량 및 능동 혈류 없이 혈관에서 심박동-매개 맥동을 갖는다. 맥동-유래 스트레칭은 AGM에서 Dnmt3b 발현을 추가로 증진시키는 Piezo1 기계감수성 채널을 활성화시켜 내피에서 HSC로의 이행을 자극한다. Piezo1의 맥동의 시뮬레이션 또는 약리학적 활성화는 또한 적어도 3배 더 많은 양의 LT-HSC를 생성하며, 이는 연속 이식 시 정상적인 기능적 다계통 성체 혈액으로 재구성된다.

따라서, 본 개시내용의 결과는 심박동-매개 생물역학적 힘이 어떻게 기계감수성 채널 뿐만 아니라 후성적 기구를 활성화시킴으로써 세포-운명 이행 및 줄기 세포 형성을 자극하는지를 입증한다. LT-HSC의 개발, 확장 및 줄기세포성 유지는 혈액 및 골수 질환을 치료하기 위한 HSC 이식 및 세포 요법에서 주요 도전과제이다. 본 개시내용은 LT-HSC를 개발하기 위한 유전적 및 약리학적 표적을 제공한다. 다양한 측면에서, 본 개시내용은 내피 세포를 헤모제닉 내피 (HE) 세포로 이행시키고, HE 세포를 상당한 수준의 LT-HSC를 포함하는 HSC를 비롯한 HSC로 이행시키기 위한 유전적, 약리학적 및 기계적 자극을 제공한다. 본 개시내용은 추가로 유전적, 약리학적 및 기계적 자극을 사용하여 HSC를 확장시키는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 LT-HSC를 포함하는 집단 HSC를 제조하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 내피 및/또는 HE 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하는 단계, 및 내피 및/또는 HE 세포에서 vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln으로부터 선택되는 2종 이상의 내피 유전자의 발현을 감소시키거나 그의 활성을 변형시키는 단계를 포함한다. 방법은 내피 및/또는 HE 세포에서 runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3으로부터 선택되는 2종 이상의 조혈 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 그의 활성을 변형시켜, LT-HSC를 포함하는 HSC의 형성을 자극하는 것을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 방법은 내피 및/또는 HE 세포에서 vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln으로부터 선택되는 3종 또는 5종 이상의 내피 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 그의 활성을 변형시키는 것; 및 내피 및/또는 HE 세포에서 runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3으로부터 선택되는 3종 또는 5종 이상의 조혈 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 그의 활성을 변형시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 방법은 내피 및/또는 HE 세포에서 vegfa, hey2, grp116, gna13, cdh5, 및 plxnd1의 발현을 감소시키거나 또는 그의 활성을 변형시키는 것; 및 내피 및/또는 HE 세포에서 runx1, spi1, cebpa, tal1, 및 gata2의 발현을 증가시키거나 또는 그의 활성을 변형시키는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 적어도 1, 2, 3 또는 5종의 조혈 유전자의 발현 또는 활성은 직접적으로 증가된다. 본원에 사용된 유전자의 발현 또는 활성은 "직접적으로" 증가되며, 여기서 상기 유전자의 기능적 카피를 코딩하는 핵산이 세포에 도입되거나 또는 내인성 유전자에 대해 그의 발현 또는 관련 활성을 증가시키는 변형이 이루어진다. 예를 들어, 활성 또는 발현은 코딩 mRNA의 도입, 코딩 트랜스진 또는 에피솜의 도입, 발현 요소의 유전자 변형의 도입, 및 기능 획득 돌연변이(들)의 도입으로부터 독립적으로 선택되는 접근법을 사용하여 직접적으로 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 또는 활성이 증가된 조혈 유전자의 전체 세트는 직접적으로 발현 또는 활성이 증가된다.

에피솜을 사용한 인자의 발현을 이용하는 본 개시내용의 다양한 실시양태에 따르면, 이러한 실시양태는 목적하는 인자를 발현하는 비-통합 에피솜 플라스미드를 도입하는 것, 즉 트랜스진-무함유 및 바이러스-무함유 세포 집단의 생성을 위해 이를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 공지된 에피솜 플라스미드는 제한된 복제 능력으로 사용될 수 있고, 따라서 여러 세포 세대에 걸쳐 손실된다.

일부 실시양태에서, 적어도 1, 2, 3 또는 5종의 내피 유전자의 발현 또는 활성은 직접적으로 감소된다. 본원에 사용된 유전자의 발현 또는 활성은 직접적으로 감소되며, 여기서 핵산 또는 약리학적 억제제가 세포에 도입되거나 또는 내인성 유전자에 대해 그의 발현 또는 관련 활성을 감소시키는 변형이 이루어진다. 예를 들어, 활성 또는 발현은 완전 또는 부분 유전자 결실의 도입, RNA 침묵, 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제, 약리학적 억제, 및 발현 요소의 유전자 변형의 도입 또는 기능 상실 돌연변이(들)의 도입으로부터 독립적으로 선택되는 접근법을 사용하여 직접적으로 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 실시양태에서 발현 또는 활성이 감소된 내피 유전자의 전체 세트는 직접적으로 발현 또는 활성이 감소된다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 내피 유전자 및 하나 이상의 조혈 유전자의 발현 또는 활성은, 예를 들어 HSC의 형성을 자극하기에 충분한 조건 (발현 수준 및 보다 높은 발현의 지속기간 포함) 하에 내피 세포에서 DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제 3 베타 (Dnmt3b) 및/또는 GTPase IMAP 패밀리 구성원 6 (Gimap6)의 활성 또는 발현을 증가시킴으로써 간접적으로 조정될 수 있다.

Dnmt3b (DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제 3 베타)는 DNA 메틸트랜스퍼라제이다. 주로 핵에 국재화되는 Dnmt3b 및 그의 발현은 발생적으로 조절된다. Gimap6은 면역-연관 단백질의 GTPase (GIMAP) 패밀리의 구성원이다. GIMAP 단백질은 GTP-결합 및 코일드-코일 모티프를 함유한다.

일부 실시양태에서, 다양한 실시양태에 따른 내피 세포 또는 HE 세포, 또는 HSC는 Dnmt3b의 활성 또는 발현을 증가시키는 기계감수성 수용체 또는 기계감수성 채널의 효능제의 유효량과 접촉되고, 이에 의해 간접적으로 내피 및 조혈 유전자의 발현 수준을 조정하거나 그의 활성을 변형시킨다. 일부 실시양태에서, 기계감수성 수용체는 Piezo1이다. 예시적인 Piezo1 효능제는 Yoda1이다. 다른 예시적인 Piezo1 효능제는 Jedi1 및 Jedi2를 포함한다.

Yoda1 (2-[5-[[(2,6-디클로로페닐)메틸]티오]-1,3,4-티아디아졸-2-일]-피라진)은 기계감수성 이온 채널 Piezo1을 위해 개발된 소분자 효능제이다 (문헌 [Syeda R, "Chemical activation of the mechanotransduction channel Piezo1." eLife (2015)]). Yoda 1은 하기 구조를 갖는다:

Yoda1의 유도체가 다양한 실시양태에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 2,6-디클로로페닐 코어를 포함하는 유도체가 일부 실시양태에서 사용된다. 예시적인 효능제는 문헌 [Evans EL, et al., "Yoda1 analogue (Dooku1) which antagonizes Yoda1-evoked activation of Piezo1 and aortic relaxation," British J. of Pharmacology 175(1744-1759): 2018]에 개시되어 있다. Jedi1 및 Jedi2는 문헌 [Wang Y., et al., "A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive Piezo1 channel," Nature Communications (2018)9:1300]에 기재되어 있다. Jedi1 및 Jedi2는 3-카르복실산 메틸푸란 구조 모티프를 갖는다. 이러한 모티프를 공유하는 다른 Piezo1 효능제가 본 발명의 실시양태에 따라 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, Piezo1 효능제 (예를 들어, Yoda1, Jedi1 또는 Jedi2)의 유효량은 약 0.1 μM 내지 약 500 μM, 또는 약 0.1 μM 내지 약 300 μM, 또는 약 0.1 μM 내지 약 200 μM, 또는 약 0.1 μM 내지 약 100 μM, 또는 일부 실시양태에서, 약 1 μM 내지 약 300 μM, 약 1 μM 내지 약 200 μM, 약 1 μM 내지 약 100 μM, 약 1 μM 내지 약 50 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 100 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 100 μM 또는 약 10 μM 내지 약 50 μM의 범위이다.

Piezo1을 비롯한 대안적 효능제는 화학물질 라이브러리에서 확인될 수 있다. 이러한 화학물질 라이브러리는 Piezo1, 또는 다른 기계감수성 수용체 또는 채널에 결합하고/거나 활성화시키는 화합물을 포함할 수 있다. 라이브러리는 Yoda1의 유도체를 포함할 수 있고, 이는 임의로 2,6-디클로로페닐 코어 또는 이의 화학적 모방체를 가질 수 있다. 라이브러리는 임의로 푸란 코어 (예를 들어, 3-카르복실산 메틸푸란 코어, 또는 그의 유도체 또는 화학적 모방체)를 포함할 수 있는 Jedi1 및/또는 Jedi2의 유도체를 포함하거나 추가로 포함할 수 있다. 라이브러리는, 후보 화합물과의 접촉 시 내피 및/또는 HE 세포에서 본원에 기재된 내피 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키고; 내피 및/또는 HE 세포에서 본원에 기재된 조혈 세포의 발현 또는 활성을 증가시키는 화합물에 대해 스크리닝될 수 있다. 발현 또는 활성의 변화는 대조군 세포, 즉 후보 화합물과 접촉되지 않은 세포와 비교하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, Yoda1, Jedi2, 및/또는 Jedi2와 접촉된 세포가 유전자 발현 조정에 대한 양성 대조군으로서 사용될 수 있다.

이들 실시양태에서, 본 발명은 화학적 화합물의 패널을 내피 세포 및/또는 헤모제닉 내피 세포와 접촉시키는 단계, 및 상기 화학적 화합물에 의해 유도된 Dnmt3b 또는 Gimap6; vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln 중 적어도 2종 (또는 적어도 3종 또는 적어도 5종); 및 runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3 중 적어도 2종 (또는 적어도 3종 또는 적어도 5종)의 발현 수준의 변화를 결정하는 단계를 포함하는, 조혈 줄기 세포 (HSC)를 제조하는 방법을 제공할 수 있다. 이어서, 유전자 발현의 다음 변화: Dnmt3b 및/또는 Gimap6의 발현의 증가; vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln 중 3종 이상의 발현의 감소; 및 2종 이상의 runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3의 발현의 증가 중 하나 이상을 유도하는 화합물이 선택된다. 이어서, 선택된 화합물을 (예를 들어, 생물반응기에서) 사용하여 내피 세포 및/또는 헤모제닉 내피 세포의 HSC로의 이행을 유도할 수 있다. 생성된 HSC는 생착하고 다계통 혈액을 재구성할 수 있는 자기-재생 HSC이다. 일부 실시양태에서, 선택된 화합물은 내피 및/또는 HE 세포에서 vegfa, hey2, grp116, gna13, cdh5 및 plxnd1의 발현을 감소시키고; 내피 및/또는 HE 세포에서 runx1, spi1, cebpa, tal1 및 gata2의 발현을 증가시킨다.

일부 실시양태에서, Dnmt3b의 활성 또는 발현은 내피 또는 HE 세포에서 직접적으로 증가될 수 있다. 예를 들어, Dnmt3b의 mRNA 발현은 Dnmt3b-코딩 전사체를 세포에 전달함으로써, 또는 Dnmt3b-코딩 트랜스진을 도입함으로써, 또는 활성을 증가 또는 변형시키기 위한 하나 이상의 뉴클레오티드 변형 (또는 코딩된 아미노산 변형)을 가질 수 있는 에피솜을 세포에 도입하는 것으로 제한되지는 않는 트랜스진-무함유 방법에 의해 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집은 내피 세포에서 Dnmt3b 발현 요소에 유전자 변형을 도입하는 데, 예컨대 프로모터 강도, 리보솜 결합, RNA 안정성을 증가시키거나, 또는 RNA 스플라이싱에 영향을 미치는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 기능 획득 돌연변이가 Dnmt3b 유전자에 도입된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 주기적 변형 또는 Piezo1 활성화 시에 내피 세포에서 Gimap6의 활성 또는 발현을 단독으로 또는 Dnmt3b 및/또는 다른 변형된 유전자와 조합하여 증가시키는 것을 포함한다. Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시키기 위해, Gimap6-코딩 mRNA 전사체를 세포에 도입할 수 있고, 에피솜을 세포에 도입하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 트랜스진-무함유 접근법; 또는 다르게는 활성을 증가 또는 변형시키기 위한 하나 이상의 뉴클레오티드 변형 (또는 코딩된 아미노산 변형)을 가질 수 있는 Gimap6-코딩 트랜스진을 또한 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집은 내피 세포에서 Gimap6 발현 요소에 유전자 변형 (예컨대, 프로모터 강도, 리보솜 결합, RNA 안정성을 증가시키거나 또는 RNA 스플라이싱에 영향을 미치는 하나 이상의 변형)을 도입하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 기능 획득 돌연변이가 Gimap6 유전자에 도입된다.

일부 실시양태에서, mRNA 및/또는 에피솜(들) (예를 들어, Dnmt3b 또는 Gimap6을 코딩하거나, 또는 본원에 기재된 하나 이상의 조혈 유전자를 코딩함)이 합성적으로, 예컨대 직접적인 화학적 합성에 의해 또는 시험관내 전사에 의해 생성되고, 내피 세포 내로 도입된다. 공지된 화학적 변형을 사용하여 세포에서 선천성-면역 반응을 피할 수 있다. 예를 들어, 정규 뉴클레오티드만을 포함하는 합성 RNA는 패턴 인식 수용체에 결합할 수 있고, 세포에서 강력한 면역 반응을 촉발할 수 있다. 이러한 반응은 번역 차단, 염증성 시토카인의 분비, 및 세포 사멸을 유발할 수 있다. 특정 비-정규 뉴클레오티드를 포함하는 RNA는 선천 면역계에 의한 검출을 피할 수 있고, 높은 효율로 단백질로 번역될 수 있다. 특히 선천 면역 반응을 피하기 위한 뉴클레오티드 변형과 관련하여, 본원에 참조로 포함되는 US 9,181,319를 참조한다. mRNA는 HSC 생성 동안 1회 또는 주기적으로 공지된 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Dnmt3b 및/또는 Gimap6 및/또는 1종 이상의 조혈 유전자의 발현은 트랜스진을 세포 내로 도입함으로써 증가되며, 이는 목적하는 수준의 과다발현 (다양한 프로모터 강도 또는 발현 제어 요소의 다른 선택을 가짐)을 지시할 수 있다. 트랜스진은 관련 기술분야에 공지된 다양한 바이러스 벡터 또는 형질감염 시약을 사용하여 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, Dnmt3b 및/또는 Gimap6 및/또는 조혈 유전자의 발현은 트랜스진-무함유 방법 (예를 들어, 에피솜 전달)에 의해 증가된다.

일부 실시양태에서, 유전자의 발현 또는 활성은, 예를 들어 프로모터 강도, 리보솜 결합, RNA 안정성 또는 RNA 스플라이싱을 변경시키는 하나 이상의 변형을 도입하기 위해 유전자 편집 기술을 사용하여 조정된다. 다양한 편집 기술이 공지되어 있고, CRISPR, 아연 핑거 (ZF) 및 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALEN)를 포함한다. 이러한 DNA-결합 도메인 및 FokI 엔도뉴클레아제의 절단 도메인 중 하나 이상을 함유하는 융합 단백질을 사용하여, 세포 내에서 DNA의 원하는 영역에 이중-가닥 파괴를 생성시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2012/0064620, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0239315, 미국 특허 번호 8,470,973, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2013/0217119, 미국 특허 번호 8,420,782, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0301073, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0145940, 미국 특허 번호 8,450,471, 미국 특허 번호 8,440,431, 미국 특허 번호 8,440,432, 및 미국 특허 출원 공개 번호 US2013/0122581 (이들 모두의 내용은 본원에 참조로 포함됨) 참조). 일부 실시양태에서, 유전자 편집은 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 CRISPR 연관 Cas 시스템을 사용하여 수행된다. 예를 들어, US 8,697,359, US 8,906,616 및 US 8,999,641을 참조하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

다양한 실시양태에서, 발생적으로 가소성인 내피 또는 HE 세포 (배아체를 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 포함하는 세포 집단을 생물반응기에 도입한다. 일부 실시양태에서, 생물반응기는 WO 2017/096215 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 주기적-변형 생물역학적 스트레칭을 제공한다. 주기적-변형 생물역학적 스트레칭은 Dnmt3b 및/또는 Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시키고, 이는 차례로 본원에 기재된 내피 유전자의 발현을 감소시키고, 본원에 기재된 조혈 유전자의 발현을 증가시킨다. 이들 실시양태에서, 기계적 수단은 2D 또는 3D 배양에서 세포에 스트레칭 힘을 적용한다. 예를 들어, 컴퓨터 제어 진공 펌프 시스템 (예를 들어, 플렉스셀™ 텐션 시스템, 사이토스트레쳐 시스템, 또는 유사물)이 배양 표면으로서 사용되는 나일론, PDMS, 또는 다른 생체적합성 또는 생체모방체 막에 부착될 수 있다. 이어서, 상기 시스템을 사용하여, 한정되고 제어된 주기적 변형 조건 하에 2D 또는 3D 배양에서 세포에 생체외 원주방향 스트레치를 적용할 수 있다.

일부 실시양태에서, 주기적-변형 생물역학적 스트레칭은 내피 및/또는 HE 세포에서 내피 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키고; 내피 및/또는 HE 세포에서 조혈 유전자의 발현 또는 활성을 증가시켜 HSC의 형성을 자극한다.

다양한 실시양태에서, HSC 이행은 적어도 Piezo1 활성화, 기계적 스트레칭, mRNA, 트랜스진, 트랜스진-무함유 (예를 들어, 에피솜), 또는 Dnmt3b에 대한 유전자 변형의 도입, 및/또는 mRNA, 트랜스진, 트랜스진-무함유 (예를 들어, 에피솜), 또는 Gimap6에 대한 유전자 변형의 도입으로부터 선택되는 수단에 의해 유도된다. 다양한 실시양태에서, 내피 또는 HE 세포에서 본원에 기재된 적어도 1종의 조혈 유전자는 발현 또는 활성이 직접적으로 증가되고/거나, 본원에 기재된 적어도 1종의 내피 유전자는 발현 또는 활성이 직접적으로 감소된다.

내피 세포 또는 HE 세포는 혈액, 골수, 대사, 또는 면역 질환을 갖는 대상체로부터 수득되거나 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 혈액 악성종양을 갖지 않는다. HSC 집단은 수용자에게 투여될 수 있다. 자가 HSC 이식을 위해, iPS 세포, 내피 세포 및/또는 HE 세포에 대한 공급원 세포가 수용자로부터 유래될 것이다.

일부 실시양태에서, 내피 세포 및/또는 HE 세포는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC), 비-조혈 줄기 세포, 또는 섬유모세포 및 내피 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 체세포로부터 수득되거나 유래된다. 일부 실시양태에서, 내피 또는 HE 세포는 HLA-무효 세포, HLA-변형 세포, 및/또는 트랜스진-무함유 세포로부터, 또는 내피 세포의 HE 세포로의 유전자 유도로부터 수득되거나 유래된다. 헤모제닉 내피 세포 (예를 들어, Flk1+CD45+ 세포, Flk1+CD41+ 세포 또는 CD31+CD43+ 세포)는 동종이계 공여자로부터의 공급원 세포 또는 HSC로 치료하고자 하는 대상체로부터의 것을 포함한, 임의의 방식으로 수득될 수 있다. 예를 들어, HE 세포는 헤모제닉 내피 세포에 대한 자가 또는 동종이계 세포의 화학적, 유전적, 트랜스진-무함유 또는 에피솜 유도에 의해 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, HE 세포는 수용자의 세포로부터, 또는 HLA-변형 세포로부터, 또는 HLA-무효 세포인 세포로부터 생성된 iPSC로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, HE 세포는 보편적으로 상용성인 공여자인 대상체의 세포로부터 수득되거나 유래된다. 헤모제닉 내피 세포를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 인간 만능 줄기 세포로부터의 생성을 포함한다. WO 2017/096215 및 US 2019/0119643을 참조하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한, 문헌 [Ditadi et al., Nature Cell Biol. 17(5) 580-591 (2015); Sugimura et al., Nature 2017; 545(7655):432-438; Nakajima-Takagi et al., Blood. 2013; 121(3):447-458; Zambidis et al., Blood. 2008 Nov 1; 112(9):3601-14 and Park et al., Cytometry A. 2013 Jan; 83(1): 114-126 (human embryoid body (hEB)-based hemato-endothelial differentiation methods for efficient hiPSC differentiation); Choi et al., Cell Rep. 2012 Sep 27; 2(3): 553-567 (hPSC differentiation in coculture with OP9); Sandler et al., 2014 July 17; 511(17509):312-318 (endothelial cells to hematopoietic cells)]을 참조한다; 또한, 문헌 [Sluvkin, Blood 2013 122:4035-4046]을 참조한다. 일부 실시양태에서, HSC의 생성을 개시하는 HE 세포의 수는 적어도 약 10²개 세포, 약 10³개 세포, 약 10⁴개 세포, 약 10⁵개 세포, 약 10⁶개 세포, 약 10⁷개 세포, 또는 적어도 10⁸개 세포이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 생성된 조혈 줄기 세포는 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)를 포함하며, 이는 우수한 생착을 나타내고, 수용자에서 기능적 다계통 성체 혈액으로 재구성된다. 일부 실시양태에서, HSC는 CD34+ 세포를 포함한다.

일부 실시양태에서, 만능 줄기 세포는 체세포를 재프로그램화함으로써 제조된 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)이다. 예를 들어, 체세포는 Sox2, Oct3/4, c-Myc, Nanog, Lin28, 및 klf4로부터 선택되는 재프로그램화 인자의 발현에 의해 재프로그램화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재프로그램화 인자는 Sox2, Oct3/4, c-Myc, Nanog, Lin28, 및 klf4이다. 일부 실시양태에서, 재프로그램화 인자는 Sox2, Oct3/4, c-Myc, 및 klf4이다. iPSC를 제조하는 방법은, 예를 들어 미국 특허 10,676,165; 미국 특허 9,580,689; 및 미국 특허 9,376,664에 기재되어 있으며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 다양한 실시양태에서, 재프로그램화 인자는 널리 공지된 바이러스 벡터 시스템, 예컨대 렌티바이러스 또는 센다이 바이러스 시스템을 사용하여 발현된다. 대안적으로, 재프로그램화 인자를 코딩하는 mRNA(들)를 체세포 내로 도입함으로써 재프로그램화 인자가 발현될 수 있다. 또한, iPSC는 재프로그램화 인자를 발현하는 비-통합 에피솜 플라스미드를 도입함으로써, 즉 트랜스진-무함유 및 바이러스-무함유 iPSC의 생성을 위해 이를 도입함으로써 생성될 수 있다. 공지된 에피솜 플라스미드는 제한된 복제 능력으로 사용될 수 있고, 따라서 여러 세포 세대에 걸쳐 손실된다. 일부 실시양태에서, iPSC는 체세포, 예컨대 (그러나 이에 제한되지는 않음) 섬유모세포 또는 PBMC로부터 생성된다. 다양한 실시양태에서, iPSC는 수용자와 관련하여 자가 또는 동종이계 (예를 들어, HLA-매칭)이다. 일부 실시양태에서, iPSC는 HLA-변형 또는 HLA-무효 세포이다.

다양한 실시양태에서, 생성된 HSC는 확장된다. 예를 들어, HSC는 US 8,168,428; US 9,028,811; US 10,272,110; 및 US 10,278,990 (이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 방법에 따라 확장될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, HSC의 생체외 확장은 프로스타글란딘 E₂ (PGE2) 또는 PGE₂ 유도체를 이용한다.

다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 HSC 집단 및 제약상 허용되는 비히클을 포함하는 세포 요법을 위한 제약 조성물이 제조된다. 제약 조성물은 적어도 약 10²개 HSC, 또는 적어도 약 10³개 HSC, 또는 적어도 약 10⁴개 HSC, 또는 적어도 약 10⁵개 HSC, 또는 적어도 약 10⁶개 HSC, 또는 적어도 약 10⁷개 HSC, 또는 적어도 약 10⁸개 HSC를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포의 하위집단 (예를 들어, LT-HSC)은, 예를 들어 세포 분류 접근법을 이용하여 단리되거나 농축될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 조성물 중의 HSC의 적어도 약 0.1%, 또는 적어도 약 0.5%, 또는 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 2%, 또는 적어도 약 3%, 또는 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%가 LT-HSC이다. 다양한 실시양태에서, 조성물은 약 2 내지 약 25% LT-HSC를 포함하고, 일부 실시양태에서 약 5% 내지 약 25%를 포함할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 수용자의 체중 1 kg당 약 100,000 내지 약 4x10⁶개 (CD34+) HSC (예를 들어, 약 2x10⁶개 세포/kg)를 포함하는 제약 조성물이 투여된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 적어도 약 10³개, 적어도 약 10⁴개, 또는 적어도 약 10⁵개 LT-HSC 세포를 포함한다.

요법 또는 이식을 위한 HSC는 일부 실시양태에서 비교적 짧은 기간, 예컨대 2개월 미만, 또는 1개월 미만, 또는 약 2주 미만, 또는 약 1주 미만, 또는 약 6일 미만, 또는 약 5일 미만, 또는 약 4일 미만, 또는 약 3일 미만 내에 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 내피 세포는 1 내지 4주 동안 증가된 Dnmt3b 및/또는 Gimap6 활성 또는 발현과 함께 배양된다.

세포 조성물은 정맥내 주입 또는 다른 투여 경로에 적합한 제약상 허용되는 담체 또는 비히클을 추가로 포함할 수 있고, 적합한 동결보호제를 포함할 수 있다. 예시적인 담체는 DMSO (예를 들어, 약 10% DMSO)이다. 세포 조성물은 단위 바이알 또는 백에 제공될 수 있고, 사용 시까지 동결 저장될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물의 부피는 약 1 액량 온스 내지 1 파인트이다.

본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 HSC는, 예를 들어 정맥내 주입 또는 골수내 이식에 의해 대상체 (수용자)에게 투여된다. 방법은 골수절제, 비-골수절제, 또는 면역독소-기반 (예를 들어, 항-c-Kit, 항-CD45 등) 조건화 요법 후에 수행될 수 있다.

본원에 기재된 방법은 이식 프로토콜에 사용하기 위한, 예를 들어 혈액 (악성 및 비-악성), 골수, 대사, 및 면역 질환을 치료하기 위한 HSC 집단을 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, HSC 집단은 자가 세포 또는 보편적으로 상용성인 공여자 세포 또는 HLA-변형 또는 HLA 무효 세포로부터 유래된다. 즉, HSC 집단은 HE 세포, 발생적으로 가소성인 내피 세포로부터 유래된 HE 세포, 또는 수용자 대상체의 세포로부터 제조되거나 또는 공여자 세포 (예를 들어, 범용 공여자 세포, HLA-매칭 세포, HLA-변형 세포, 또는 HLA-무효 세포)로부터 제조된 iPSC로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 자기-유래 세포가 사용되고, 수용자 대상체는 다발성 골수종; 비-호지킨 림프종; 호지킨병; 급성 골수성 백혈병; 신경모세포종; 배세포 종양; 자가면역 장애 (전신 홍반성 루푸스 (SLE), 전신 경화증); 골수이형성 증후군, 아밀로이드증; 또는 자가 HSC 이식을 사용하여 치료가능한 다른 상태로부터 선택되는 상태를 갖는다. 일부 실시양태에서, 자기-유래 세포 (예를 들어, 수용자 대상체로부터의 세포로부터 HSC가 생성됨)가 사용되고, 수용자 대상체는 혈액 악성종양을 갖지 않는다.

일부 실시양태에서, 수용자 대상체는 급성 골수성 백혈병; 급성 림프모구성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 만성 림프구성 백혈병; 골수증식성 장애; 골수이형성 증후군; 다발성 골수종; 비-호지킨 림프종; 호지킨병; 재생불량성 빈혈; 순수 적혈구 무형성증; 발작성 야간 혈색소뇨증; 판코니 빈혈; 중증성 빈혈; 겸상 적혈구성 빈혈; 중증 복합 면역결핍 (SCID); 비스코트-알드리치 증후군; 혈구포식성 림프조직구증식증; 선천성 대사 이상; 수포성 표피박리증; 중증 선천성 호중구감소증; 슈와크만-다이아몬드 증후군; 다이아몬드-블랙판 빈혈; 피어슨 증후군 및 백혈구 부착 결핍으로부터 선택되는 상태를 갖는다. 일부 이러한 실시양태에서, 동종-유래 또는 보편적-적합성 공여자 세포 또는 HLA-변형 또는 HLA-무효 세포가 HE 세포를 생성하는 데 사용된다. 예를 들어, HSC는 공여자 대상체, 즉 수용자 대상체 이외의 대상체로부터의 세포로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 공여자 대상체는 혈액형 및 인간 백혈구 항원 (HLA) 결정에 기초하여 수용자 대상체와 매칭된다.

본원에 사용된 용어 "약"은 연관된 수치의 ±10%를 의미한다.

본 발명의 이들 및 다른 측면은 이제 하기 비제한적 실시예로 기재될 것이다.

실시예

확정적 조혈 동안, HSC의 제1 세트는 태아 발생 동안 AGM 내의 헤모제닉 내피 세포로부터 발생한다. 따라서, 내피 및/또는 헤모제닉 내피 세포는 AGM 미세환경에 존재하는 내인성 및 외인성 인자의 레퍼토리의 확립을 제공하는 임상 용도를 위해 HSC를 개발 또는 확장시키기 위한 공급원일 수 있다.

일단 형성되면, AGM-유래 HSC는 태아 간 및 골수로 이동하고, 여기서 이들은 장기 (LT) 및 단기 (ST) HSC로의 비대칭 분열을 겪는다. LT HSC는 비대칭 분열을 추가로 겪음으로써 HSC의 풀을 보존하지만, ST-HSC는 대칭 분열에 의한 혈액 생성의 동적 요구를 지지한다. 7종의 전사 인자 (ERG, HOXA5, HOXA9, HOXA10, LCOR, RUNX1, 및 SPI1)의 유도 (문헌 [Sugimura, R, et al., Nature, 2017]) 뿐만 아니라 혈관 함요-유래 혈관분비 시토카인 (TGFβ, CXCR7, CXCR4, 및 BMP)과 커플링된 FGRS (Fosb, Gfi1, Runx1, 및 Spi1) 전사 인자의 유도 (문헌 [Lis, R. et al., Nature, 2017])는 내피에서 조혈로의 이행을 증진시킨다. 그러나, 이들 접근법은 내피 또는 헤모제닉 내피 세포에 LT-HSC 기능 및 특성을 부여하지 않는다. 추가로, 이들 전사 인자 중 다수는 탈조절되는 경우에 조혈 악성종양과 연관되기 때문에, 통합 벡터 또는 트랜스진-무함유 접근법을 사용한 그의 과다발현-기반 연구는 유전자 투여량 효과의 분석을 허용하지 않는다. 또한, 생체외 확장된 HSC는 HLA-매칭된 건강한 공여자 HSC를 찾아야 하는 필요성을 제거하지 않는다. 따라서, 평생 혈액 형성을 위한 LT-HSC의 자가 또는 기성품 저장소를 개발하기 위해 헤모제닉 내피 세포로부터 신생 LT-HSC 형성에 기여하는 세포-외인성 또는 비-통합 인자를 분석하는 것이 중요하다.

HSC로의 내피 세포 운명의 이행 과정은 조혈 프로그램의 점진적인 언폴딩과 함께 내피 전위의 조기 손실을 특징으로 한다. EHT 동안 내피 유전자(들)의 장기간 침묵을 부여하는 후성적 메카니즘(들)이 존재할 수 있다. EZH1은 원시 조혈 기간 동안 확정적 조혈 프로그램을 능동적으로 억제하지만 (문헌 [Vo, LT, et al., Nature, 2018]), ISWI 염색질 재형성은 원시 및 확정적 조혈 둘 다를 조절한다 (문헌 [Huang HT, et al., Nat. Cell. Biol., 2013]). 추가로, dnmt3b가 HSPC 유지를 위해 c-myb 발현을 조절함에도 불구하고 (문헌 [Gore AV, et al., Elife, 2016]), 내피 유전자 침묵 또는 신생 LT-HSC 형성에서의 dnmt3b의 역할은 공지되어 있지 않다. 어떤 메카니즘이 내피 후성적 지형을 영구적으로 변형시켜 LT-HSC의 형성을 지지할 수 있는지는 알려져 있지 않다.

본원에 개시된 바와 같이, 본 개시내용은 Piezo1 기계감수성 경로의 심박동 및/또는 맥동-매개 생물역학적 스트레칭 및/또는 약리학적 활성화가 어떻게 코어 유전자의 발현에 영향을 미쳐 내피 후성적 지형을 소거하여 HSC (LT-HSC 포함)를 형성하는지를 나타낸다. 또한, 맥동-유사 조건을 모방하고, LT-HSC 형성을 자극하고 스케일-업하기 위한 약리학적 표적으로서 Piezo1을 확립한 생물반응기를 개발하였다.

심박동-매개 맥동은 내피에서 HSC로의 이행을 자극함.

비편향 제브라피쉬 에틸니트로소우레아 (ENU) 돌연변이유발 스크린은 카드헤린-5 (cdh5, ve-cdh)에 대한 제브라피쉬 돌연변이체인 malbec (bw209^mlb)를 생성하였다. malbec 및 cdh5-모르판트 (MO) 배아는 순환 결함에도 불구하고 정상적인 원시 및 확정적 조혈을 나타낸다.

내피에서 HSC로의 이행을 자극하는 혈류 및 전단 스트레스-비의존성 생물역학적 힘을 확인하기 위해, 심장의 기능 및 해부학 뿐만 아니라 cdh5-결핍 배아에서의 혈관을 분석하였다.

제브라피쉬 배아의 2-챔버 심장의 심방에 형광 덱스트란 비드를 주사하여 미세혈관조영술을 먼저 수행한 후, 순환계 중의 덱스트란 비드를 추적하였다. 형광 덱스트란 비드는 대조군 배아에서 방실 (AV) 판막 및 심실을 통과하여 일반 순환계로 들어가는 반면에, cdh5-모르판트 배아의 심방에서는 포획되었다.

심장의 구조를 검사하기 위해, 심장을 대조군 및 cdh5-침묵 배아로부터 단리하고, 내피 내층 (gfp) 및 심근세포 (mf20)에 대해 면역조직화학을 수행하였다. 심방 (A), 방실 (AV) 판막, 심실 (V), 및 유출로 (OT)가 cdh5-모르판트에서 형성되었지만, AV 판막은 연장되고 왜곡된 것으로 밝혀졌다.

cdh5-침묵 배아에서 순환이 손상된 이유를 조사하기 위해, cdh5-침묵 배아에서 혈관 구조뿐만 아니라 혈액 순환, 심박수, 심장 박출량 및 심장 압전을 분석하였다.

내피 내층의 완전성을 mlb x kdr:dsRED 배아에서 분석하였다. 동맥 및 정맥 둘 다의 구조는 cdh5-결핍 배아에서 무손상인 것으로 밝혀졌다.

심장, 심박동, 혈관, 혈액 순환, 및 HSC 형성의 시간적 발생은 제브라피쉬, 마우스, 및 인간에서 보존된다. 제브라피쉬 발생 동안, 심장은 수정 후 약 23시간 (hpf)에 박동하기 시작하고, 혈액 순환은 대략 24-26 hpf에 시작하며, 최종 HSC는 30-48 hpf 사이에 AGM 영역에서 헤모제닉 내피 세포로부터 출현한다.

심장이 박동을 시작하기 전후에 혈관에서의 순환을 분석하기 위해, 대조군 및 cdh5-침묵 lcr:eGFP x flk1:mCherry 배아의 저속 공초점 영상화를 수행하였다.

심장이 박동을 시작한 후에도 lcr:eGFP ⁺ 적혈구가 cdh5-침묵 배아의 혈관에 축적된 것으로 밝혀졌으며; 이는 심박동의 개시 및 혈관의 형성에도 불구하고 cdh5-모르판트에서 능동 순환의 부재를 나타낸다.

cdh5-침묵 배아에서 심장의 기능을 검사하기 위해, 전기생리학 및 심장초음파검사 평가를 수행하였다. cdh5-MO 배아에서 심박수는 대조군과 대등하였지만, cdh5-MO 배아에서 일회 박출량은 거의 존재하지 않았다. 따라서, cdh5-MO 배아에서 심장 박출량 (=일회 박출량 X 심박수)이 손상되었음이 확립되었다.

cdh5-MO 배아는 심장강에서 심막 부종을 가졌으며, 이는 심장으로부터의 혈액의 역류로 인한 것일 수 있다. 심막 공간에서의 유체의 축적은 감소된 심실 충전 및 후속 혈류역학적 손상을 초래한다. 심장 압전이 심막 공간에서의 유체 축적의 인자인지 여부를 검사하기 위해, cdh5-MO 배아의 심장강을 심장막천자에서와 같이 천공한 다음, 심막액을 흡인하여 심장 상의 유체-압력 축적을 감소시켰다. 그러나, cdh5-모르판트 심장의 심장 박출량 결핍을 구제할 수는 없었다.

cdh5-모르판트에서 심박동은 정상이었지만, 그의 심장 박출량은 심장에서의 구조적 결함으로 인해 손상되어 심막강에서 혈액의 축적을 초래하였다. cdh5-MO 배아는 정상 조혈을 갖기 때문에, 심박동-유래 생물역학적 힘이 능동 순환의 부재 하에 HSC 형성에 영향을 미치는 것으로 가정되었다.

cdh5-MO 배아는 박동 중인 심장을 갖고 능동 순환을 갖지 않지만, 이들은 그의 혈관의 대동맥 내피에서 형성되는 HSC를 갖는다. 대조군 제브라피쉬 배아의 AGM을 확대하였을 때, 혈관의 뚜렷한 맥동이 관찰되었다. 순환하는 혈액 세포 및 아마도 혈류와 독립적으로 혈관 내의 맥동의 존재를 구별하기 위해, 혈관의 맥동 주파수와 순환하는 혈액 세포의 맥동 주파수 및 혈류로 인한 이동을 비교하였다. 구체적으로, flk1:mCherry⁺ 혈관 내에 순환하는 lcr:eGFP⁺ 적색 세포를 갖는 이중 트랜스제닉 계통의 저속 공초점 영상화, 뿐만 아니라 혈관 및 순환하는 혈액 세포 둘 다로부터의 신호의 푸리에 분석을 수행하였다. 혈관의 주파수 스펙트럼은 뚜렷한 피크를 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 혈관 내의 맥동 및 혈류가 공존하지만, 이들의 존재 및 성질은 서로 독립적이다.

36 hpf에서 AGM에서의 맥동의 시간적, 공간적 및 기능적 존재를 조사하기 위해, 대조군 제브라피쉬 배아에서의 혈관 영역의 광 시트 현미경검사에 이어 푸리에 분석을 수행하였다. 데이터는 AGM이 36 hpf에서 뚜렷한 맥동 주파수를 갖는다는 것을 추가로 확증하며; 이는 flk1:eGFP ⁺ 내피 세포로부터 출현하는 runx1:mCherry ⁺ HSPC의 저속 공초점 영상화로 보여지는 바와 같이 내피에서 조혈로의 이행을 위한 시간 및 위치이다. 종합하면, AGM 영역은 맥동성인 것으로 밝혀졌고, AGM에서의 맥동은 내피에서 조혈로의 이행과 동시에 일어난다.

혈관은 심박동-매개 혈압 및 혈류로부터 일정한 기계적 부하 하에 있으며, 이는 원주방향 벽 스트레스 및 내피 전단 스트레스를 유발한다. 혈류는 내피 세포에 전단 스트레스를 부과하고 혈관확장을 유도하지만, 심박동-매개 맥동은 원주방향 스트레치를 생성하고 내피 세포 및 평활근 세포 둘 다에 기계적 팽만을 유발한다.

cdh5-MO 배아가 혈류- 및 전단-스트레스 매개된 NOS 활성화를 통해 HSC를 형성하는지 또는 그와 독립적인지를 분석하기 위해, NOS 억제제인 L-NAME로 처리된 대조군 및 cdh5-MO 배아에서 HSPC 발현을 분석하였다. NOS의 억제는 대조군 배아에서 HSPC 형성을 약화시키지만, cdh5-MO 배아에서는 HSPC 형성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 따라서, cdh5-MO 배아는 NOS 활성화와 독립적으로 HSC를 형성한다.

종합하면, 심박동-매개 맥동은 순환과 독립적으로 내피에서 HSC로의 형성을 자극한다.

스트레치는 HSC 형성을 위해 Piezo1을 활성화시킴.

생물역학적 힘은 세포 형상 및 운명 이행을 자극하기 때문에, 헤모제닉 내피의 맥동-매개된 주기적 스트레칭이 HSC 형성을 자극하는 것으로 가정되었다.

내피에서 HSC로의 형성에서 맥동의 기능을 시험하기 위해, E11.5 마우스 배아로부터 수거된 AGM 세포에 주기적 변형을 적용할 수 있는 생물반응기를 개발하였다 (도 2a, 상부 패널). 조혈 콜로니 형성 및 유동 분석 검정은 10% 주기적 변형이 다능 조혈 전구세포의 형성을 강화하고, 이는 스트레치-활성화 수용체 (SAR)의 GdCl₃-매개 범-약리학적 억제에 의해 약화된다는 것을 입증하였다. GdCl₃은 또한 제브라피쉬 배아에서 HSPC 발현을 sih-MO 배아의 수준으로 약화시켰다.

SAR 패밀리 구성원은 4개의 하위-카테고리를 갖는다: K1-패밀리 구성원뿐만 아니라 Piezo, TRP, 및 DEG/ENaC 채널. 조직 발현 및 컴퓨터 분석은 내피 및 조혈 조직에서 Piezo1 및 Trpv4를 나타내므로, 내피에서 HSC로의 이행에서 이들의 역할을 시험하였다.

trpv4 및 piezo1의 기능 상실 분석 및 약리학적 억제는 HSPC 마커 발현 및 내피에서 HSC로의 이행을 무효화하였다 (도 1a). 반대로, trpv4 또는 piezo1의 약리학적 활성화는 대조군 배아에서 HSPC 마커 발현을 증진시켰고, sih-배아에서 HSPC 발현을 구제하였다. 시간적 및 공간적 분석 시, trpv4는 36 hpf에 제브라피쉬 배아의 AGM 영역에서 검출되지 않은 반면에, Piezo1은 E11.5 AGM에서 Cd31 (내피) 및 c-Kit (조혈)와 공동-국재화되었다.

스트레치-매개 HSC 형성의 기저를 이루는 분자 메카니즘을 강화하기 위해, 주기적 변형 또는 Piezo1의 약리학적 활성화제로 처리된 AGM의 전체 트랜스크립톰 분석을 수행하였다. 주기적 변형 및 Piezo1 활성화는 유사한 유전자 서명을 생성하는 것으로 밝혀졌다 (도 1b).

Piezo1의 약리학적 활성화는 다능 조혈 전구 세포 형성을 추가로 증진시킨 반면에 (도 1c), Piezo1의 약리학적 억제는 HSPC 형성의 주기적 변형-매개 유도를 약화시켰다 (도 1d). 함께, 주기적 변형-매개 생물역학적 스트레칭은 Piezo1을 활성화하여 내피에서 HSC로의 이행을 자극한다.

유사한 결과를 Piezo1 효능제 Yoda1, Jedi1 및 Jedi2로 얻었다. 구체적으로, 도 1e에 나타낸 바와 같이, 50 μM Jedi1, 50 μM Jedi2, 또는 25 μM Yoda1로 처리된 E11.5 AGM 세포에 대한 조혈 CFU 검정은 Jedi1, Jedi2, 또는 Yoda1-매개 Piezo1 활성화가 GEMM 형성을 증진시킨다는 것을 입증하였다.

생물역학적 스트레칭 또는 Piezo1 활성화는 LT-HSC를 생성함.

주기적 변형 또는 Piezo1 활성화가 장기 자기-재생 HSC (LT-HSC)를 생성하는지 여부를 분석하기 위해, 연속 이식 검정을 수행하였다. 주기적 변형 또는 Piezo1 활성화제 처리된 AGM의 1차 이식은 보다 높은 생착 및 정상 다계통 재구성을 나타냈다 (도 2a, 도 2b). 또한, 주기적 변형 또는 Piezo1 활성화제 처리된 AGM이 이식된 1차 수용자의 골수는 2배 내지 3배 더 많은 양의 Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺Cd48^-Cd150⁺ HSC (즉, LT-HSC)를 나타냈다. 면역손상된 2차 수용자 내로의 1차 수용자-유래 분류된 Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺ HSPC의 이식은 또한 보다 높은 생착 및 정상 다계통 재구성을 유발하였다 (도 2c, 도 2d). 따라서, 주기적 변형 및/또는 Piezo1 활성화 둘 다가 보다 많은 양의 정상 LT-HSC를 생성하는 것으로 예측되었다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 등급화된 양의 Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺ HSPC를 면역손상된 3차 수용자 내로 이식함으로써 한계 희석 검정을 수행하였다. 3차 이식 분석은 주기적-변형이 2배 내지 3배 더 많은 양의 LT-HSC를 생성하였음을 입증하였다.

AGM-HSC (공여자)가 생착하고 성체 정상 혈액으로 재구성되는지를 조사하기 위해, 이어서, 재구성된 혈액 계통의 분자적 특징 및 기능적 특성을 대조군, 주기적 변형 또는 Piezo1 활성화제 처리된 AGM으로 이식된 1차 수용자에서 분석하였다. 골수에서의 공여자-유래 적혈구 세포의 분석은 Cd71⁺/Ter119⁺ 발현, 뿐만 아니라 Bcl11a의 존재 하에 배아 글로빈의 대가로 성체 글로빈 마커의 증진된 발현을 나타냈다 (도 3a). 골수 및 혈청에서의 공여자-유래 골수 세포의 추가 분석은 충분한 양의 Gr1⁺/Mac1⁺ 골수 세포, 뿐만 아니라 그의 미엘로퍼옥시다제 (MPO)의 생성을 나타냈다 (도 3b). 다음으로, 림프절, 흉선 및 비장에서의 공여자-유래 키메라 현상, Mac1⁺ 골수 세포, Cd19⁺ B-세포, 뿐만 아니라 Cd4⁺/Cd8⁺ T-세포의 분석은 공여자 HSC-유래 전구세포가 순환하고 조혈 함요에서 콜로니화되어 성체 혈액 계통으로 재구성된다는 것을 입증하였다. 1차 이식-유래 혈청의 분석 시, 이들이 면역전 이뮤노글로불린 (Ig), 예컨대 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgA, 및 IgM의 정상 레퍼토리를 생성한 것으로 또한 밝혀졌다 (도 3c). 비장으로부터의 공여자-유래 Cd3⁺ T-세포의 분류는 T-세포 수용체β (TCRβ) 재배열을 나타냈으며, 이는 비장으로부터의 공여자-유래 Mac1⁺ 골수 세포 (음성 대조군)에서는 부재하였다 (도 3d). 1차 이식에서 T-세포의 기능적 특성을 분석하기 위해, 지연형 과민성 검정에서, 양 적혈구 주사로 1차 이식을 감작화함으로써 발바닥에서 항원-특이적 기능적 T-세포의 성공적인 동원을 입증하였다 (도 3e). 따라서, AGM 또는 헤모제닉 내피 세포의 주기적 변형 또는 Piezo1 활성화는, 조혈 함요에 생착되고 기능적 다계통 성체 혈액으로 재구성되는 HSC를 생성하였다.

생물역학적 스트레칭 및 Piezo1 활성화는 내피에서 HSC로의 이행을 위해 Dnmt3b를 상향조절함.

AGM은 이종 조직이기 때문에, 스트레치-매개된 Piezo1 활성화가 HSC로의 대동맥 내피 세포 운명 이행을 어떻게 자극하는지는 불명확하였다. E10.5 AGM-분류된 내피 세포, 헤모제닉 내피 세포, 및 HSC로부터의 차등 유전자 발현 서명을 개발하였다. AGM-유래 내피 세포, 헤모제닉 내피 세포, 및 HSC와 관련하여 AGM의 주기적 변형 또는 Piezo1 활성화 시 유래된 유전자 서명의 계층적 클러스터링은 과다발현된 생물학적 과정, 분자 경로, 유전자 발현 클러스터, 및 그의 유전자 온톨로지 (GO) 용어의 정량적 개관을 추가로 제공하였다. 내피에서 HSC로의 이행 동안 상향조절된 주기적 스트레치 및/또는 Piezo1 활성화-매개 유전자의 벤 다이어그램 분석으로 Dnmt3b가 HSC 형성에 요구되는 내피 기구의 침묵을 담당하는 잠재적인 후보 메커니즘으로서 확인되었다 (도 4). 게다가, Gimap6은 또한 HSC 형성에 요구되는 내피 기구의 침묵을 담당하는 잠재적인 후보 메카니즘으로서 확인되었다.

생물정보학 및 컴퓨터 분석을 검증하기 위해, E11.5 AGM에서의 Dnmt3b의 시간적 및 공간적 단백질 발현을 분석하였다. 면역조직화학 검정은 Dnmt3b가 Cd31⁺ 내피 및 c-Kit⁺ 조혈 세포와 공동-국재화된다는 것을 입증하였다. 따라서, Dnmt3b가 내피에서 HSC로의 이행을 자극할 수 있는 것으로 가정되었다.

Dnmt3b 및 Dnmt3a가 고도로 상동성이고 HSC 유지 또는 분화에서 별개의 기능을 갖지만, AGM에서의 내피에서 HSC로의 그의 잠재적 역할은 알려지지 않았다. 유전자 서명 및 조직 발현 분석은 AGM에서 HSC 형성에 Dnmt3a의 관여를 배제하였다. Dnmt3b 및 Dnmt3a의 별개의 또는 중첩되는 헤모제닉 역할(들)을 구별하기 위해, Dnmt3b 및 Dnmt3a 단백질 수준을 주기적 변형- 또는 Yoda1-처리된 AGM 세포의 핵 분획에서 분석하였고, 이는 주기적 변형 또는 Piezo1 활성화가 E11.5 AGM 세포에서 Dnmt3b 단백질 발현을 자극하지만 Dnmt3a는 자극하지 않는다는 것을 확립하였다 (도 5a).

혈류의 부재 하에 혈관의 맥동이 Dnmt3b 활성화를 통해 HSC 형성을 자극하였는지 여부를 분석하기 위해, Dnmt3b 억제제인 나노마이신으로 처리된 cdh5-MO 배아에서 HSPC 마커 발현을 측정하였다. Dnmt3b의 약리학적 억제는 대조군 및 cdh5-MO 배아에서 HSPC 마커 발현을 약화시켰다.

다음으로, 본 실시예의 실험은 생물역학적 스트레칭 또는 Piezo1 활성화가 Dnmt3b 활성화를 통해 내피에서 조혈로의 이행을 자극하였는지 여부를 분석하였다. Dnmt3b의 억제가 다능 조혈 전구 세포 형성의 생물역학적 스트레칭- 또는 Piezo1 활성화-매개 유도 (도 5b), 뿐만 아니라 내피에서 조혈로의 이행 (도 5b)을 약화시켰음이 발견되었다. 나노마이신 처리는 조혈 세포를 표현형 내피 세포로 복귀시키지만, 이러한 내피 세포는 기능적이지 않았다. Yoda1의 존재 또는 부재 하에 동시에 처리된 나노마이신-처리 또는 dnmt3b-MO-주사 제브라피쉬 배아에서 HSPC 마커의 전체 마운트(whole mount) 계내 혼성화, 뿐만 아니라 내피에서 HSC로의 이행의 저속 영상화는 dnmt3b의 억제 또는 상실이 HSC 형성에서 Piezo1 활성화-매개 증가를 약화시켰음을 추가로 검증하였다 (도 5c). 이와 함께, 맥동-매개 Piezo1 활성화는 AGM에서 Dnmt3b 발현을 증진시켜 내피에서 HSC로의 이행을 자극하였다.

EHT에서의 Dnmt3b의 역할을 결정하기 위해, 본 발명가들은 전체 트랜스크립톰 분석을 사용하여 내피 및 조혈 유전자 발현 수준을 분석하였다. 본 발명자들은 2D 주기적 스트레치- 또는 Yoda1-처리된 AGM 샘플이 내피 유전자 (Vegfa, Apln, Hey2, Gpr116, Bcl6, Gna13, Cdh5, Plxnd1)의 발현을 감소시켰고, 조혈 유전자 (Sca1, Tal1, Flt3, Spi1, Gata2, Cebpa)의 발현을 상승시켰음을 발견하였다 (도 6a). 본 발명의 발견을 강화하기 위해, 본 발명자들은 추가로 내피 및 조혈 유전자의 전사체 수준을 독립적으로 측정하였다. 본 발명가들은 EHT 동안 주기적 변형- 또는 Piezo1 활성화-매개 Dnmt3b 과발현 양쪽 모두가 내피 유전자 침묵 (Vegfa, Hey2, Gpr116, Gna13) 및 조혈 유전자 (Runx1, Spi1, Cebpa, Tal1, Gfi1)의 더 높은 발현을 유발하였음을 발견하였다 (도 6b). 요약하면, 맥동-매개 Piezo1 활성화가 Dnmt3b 발현을 증진시켜 내피 유전자를 억제하고, 내피에서 HSC로의 이행을 자극한다. 인간 조혈에서 PIEZO1-매개 기계감수성 메카니즘의 보존된 역할을 분석하기 위해, 본 발명자들은 구성적 RUNX1c:tdTomato 인간 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)의 헤모제닉 내피 세포로의 지정 분화를 이용하였고, 이러한 헤모제닉 내피 세포를 Yoda1로 처리하였다. 본 발명자들은 Yoda1-매개 PIEZO1 활성화가 인간 내피에서 조혈로의 이행을 자극하였음을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 Yoda1-매개 PIEZO1 활성화가 DNMT3B 발현을 증진시켰지만 DNMT3A 발현은 증진시키지 않았고, 내피 유전자 (VEGFA, HEY2, GPR116, GNA13, CDH5, PLXND1)를 침묵시켰고, 조혈 유전자 (RUNX1, SPI1, CEBPA, TAL1, GATA2)의 발현을 유도하였으며; 이는 상승된 다능 조혈 전구세포 형성 및 인간 조혈을 유발하였음을 발견하였다 (도 6c). 따라서, 맥동-매개 PIEZO1 활성화는 제브라피쉬, 뮤린 및 인간 모델 시스템에서 내피에서 조혈로의 이행을 자극한다.

추가로, 도 6d에 나타낸 바와 같이, Piezo1의 Yoda1-매개 약리학적 활성화는 생착가능한 인간 CD34+ 세포의 형성을 증진시키고, Piezo1의 약리학적 활성화는 다계통 혈액을 재구성하는 인간 CD34+ 조혈 세포의 형성을 자극한다. 추가로, Piezo1의 약리학적 활성화는 연속 이식 시 다계통 혈액을 재구성하는 자기-재생 LT-HSC의 형성을 증진시킨다. 도 6e를 참조한다.

주기적 스트레치 및 Piezo1 효능제는 EC에서 HE 세포로의 이행, 및 HE 세포에서 HSC로의 이행을 포함한 EC에서 HSC로의 이행을 촉진한다. 도 7a (상단)는 마우스 E11.5 AGM-분류된 EC (CD31⁺), HEC (CD31⁺cKit⁺) 및 HSPC (cKit⁺) 세포에 대한 10% 주기적 스트레치에 이어서 FACS 분석을 수행한 연구를 예시한다. 도 7a (하부)에 나타낸 바와 같이, 주기적 스트레치는 EC에서 HE로의 세포 이행 (좌측) 뿐만 아니라 HEC에서 HSPC로의 이행 (중심)를 촉진한다. HSPC에 대한 효과는 우측에 나타낸다.

도 7b는 조혈 분화 제8일의 인간-유래 배상체 (EB)의 FACS 분석을 도시하며, 이는 Yoda1-매개 PIEZO1 활성화가 대조군에서 hCD43^negCD235^negCD144⁺CD34⁺ HE 세포의 형성을 증진시키지만 PIEZO1^-/- PSC에서는 그렇지 않음을 나타낸다. Yoda1-매개 Piezo1 활성화는 hPSC로부터 HSC의 형성을 증진시킨다. 도 7c. 도 7c는 Yoda1-매개 Piezo1 활성화를 사용하여 hPSC로부터 생성된 HSC의 수의 2배 개선을 도시한다.

인간 iPSC로부터 생성된 HE 세포로부터 HSC 생성

배상체 및 헤모제닉 내피 분화를 문헌 [Sugimura et al. 2017; Ditadi et al. 2015]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, hiPSC 콜로니를 0.05% 트립신으로 5분 동안 37℃에서 해리시키고, PBS + 2% FBS로 세척하고, L-글루타민 (2 mM), 페니실린/스트렙토마이신 (10 ng/ml), 아스코르브산 (1 mM), 인간 홀로-트랜스페린 (150 μg/ml, 시그마 T0665), 모노티오글리세롤 (MTG, 0.4 mM), BMP4 (10 ng/ml), 및 Y-27632 (10 μM)로 보충된 스템프로(StemPro)-34 (인비트로젠, 10639-011) 중에 재현탁시켰다. 타원체 형성을 위해 5백만개의 세포를 10 cm 디쉬 (에즈스피어(Ezsphere), 아사히 글래스)에 시딩하였다. 제1일에, bFGF (5 ng/ml) 및 BMP4 (10 ng/ml)를 배지에 첨가하였다. 제2일에, 배지를 SB431542 (6 μM), CHIR99021 (3 μM), bFGF (5 ng/ml), 및 BMP4 (10 ng/ml)로 보충된 스템프로-34로 교체하였다. 제3일에, 배지를 VEGF (15 ng/ml) 및 bFGF (10 ng/ml)로 보충된 스템프로-34로 대체하였다. 제6일에, 배지를 bFGF (5 ng/ml), VEGF (15 ng/ml), 인터류킨 (IL)-6 (10 ng/ml), IGF-1 (25 ng/ml), IL-11 (5 ng/ml), SCF (50 ng/ml) 및 EPO (2IU)로 보충된 스템프로-34로 교체하였다. 세포를 5% CO₂, 5% O₂ 및 95% 습도 인큐베이터에서 유지하였다. 모든 시토카인은 페프로테크로부터 구입하였다.

CD34⁺ 세포를 단리하기 위해, 배상체 (제8일부터)를 0.05% 트립신에 의해 해리시키고, 70 μm 스트레이너를 통해 여과하고, CD34⁺ 세포를 CD34 자기 비드 염색에 의해 단리하고, 후속적으로 LS 칼럼 (밀테니)을 통해 통과시켰다. 모든 배치로부터의 샘플을 FACS에 의해 시험하여 패널로 그의 순도를 검증하였다. 다음 항체를 사용하였다: CD34-PEcy7 (클론 581; 바이오레전드), FLK1-PE (CLONE # 89106; BD), 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI).

단리된 CD34⁺ 세포를 Y-27632 (10 μM), TPO (30 ng/ml), IL-3 (10 ng/ml), SCF (50 ng/ml), IL-6 (10 ng/ml), IL-11 (5 ng/ml), IGF-1 (25 ng/ml), VEGF (5 ng/ml), bFGF (5 ng/ml), BMP4 (10 ng/ml), 및 FLT3 (10 ng/ml)을 함유한 스템프로-34 배지 중에 재현탁시켰다 (문헌 [Ferrel et al. 2015]). 세포를 박층 매트리겔-코팅된 24-웰 플레이트 상에 웰당 50,000개 세포의 밀도로 시딩하였다. 시딩 1일 후, Yoda1 (6.25 내지 100 μM)을 배양물에 첨가하였다. 7일 후, 부유 세포를 수집하고, FACS 분석을 수행하였다. FACS 분석을 위해, 세포를 CD34-PEcy7 (클론 581; 바이오레전드) 및 CD45-APC (클론 2D1; 바이오레전드)로 염색하였다. 모든 시토카인은 페프로테크로부터 구입하였다.

결론

장기 HSC의 발생, 확장 및 유지는 줄기 세포 생물학 및 조혈에서 궁극적인 목표였다. 제브라피쉬에서의 저속 공초점, 광 시트, 및 푸리에 변환 분석에 기초하여, 혈관의 맥동을 시뮬레이션하는 확장가능한 생물반응기가 확립되었을 뿐만 아니라 Piezo1 활성화가 내피 세포를 LT-HSC로 변형시키는 약리학적 표적으로 확인되었다. 본 연구는 연속 이식 시 생착, 자기-재생, 및 다계통의 기능적 성체 혈액으로 재구성될 수 있는 LT-HSC를 개발하기 위한 신규 트랜스진-무함유 접근법을 제공한다.

심박동-매개 맥동은 원주방향 스트레치를 발생시켰고, 내피 세포 및 평활근 세포 둘 다에 대해 기계적 팽창을 유발하였다. 그러나, Piezo1은 E11.5 AGM에서 내피 세포와 조혈 세포 사이에서 공동-발현되었지만, 혈관의 혈관 평활근 세포에서는 발현되지 않았으며, 이는 생물역학적 스트레칭 및 Piezo1 활성화의 헤모제닉 역할이 AGM-내피 세포에 내재적임을 시사하였다.

혈관의 생물역학적 스트레칭은 Piezo1, Trpv4, K1-패밀리 구성원뿐만 아니라 DEG/ENaC 채널을 활성화시킬 수 있다. Piezo1 및 Trpv4 활성화 둘 다 내피에서 조혈로의 이행을 자극하였다. 그러나, Piezo1 억제만이 스트레치-매개 헤모제닉 효과를 약화시켰고, 이는 Piezo1 및 Trpv4가 부분적으로 중복되는 역할을 할 수 있음을 시사하였다.

Dmnt3b 활성화는 내피 기구를 침묵시켜 HSC에 자기-재생 및 다계통 재구성 능력을 부여하였다. Dnmt3b의 억제는 조혈 세포를 표현형 내피 세포로 복귀시키지만, 이들 세포에는 기능적 내피 특성이 결여되었다. 이는 내피에서 조혈로의 이행에서 Dnmt3b의 시간적 및 공간적 역할이 비가역적이었음을 시사하였다. 생물역학적 스트레칭 또는 Piezo1 활성화는 Dnmt3a 발현에 영향을 미치지 않으면서 Dnmt3b의 시간적 및 공간적 발현을 증진시켰다. 데이터는 HSC 발달 및 분화 동안의 Dnmt3b의 헤모제닉 역할과 Dnmt3a의 백혈병성 역할 사이의 구별을 입증하였다.

본원에 개시된 발견은 생물역학적 힘이 어떻게 세포 운명 이행을 자극하고 후성적 기구를 유발함으로써 줄기 세포에 자기-재생 능력을 부여하는지를 입증한다. 본 연구는 또한 만능 줄기 세포 (PSC) 또는 공여자 세포-유래 내피 또는 헤모제닉 내피 세포로부터 LT-HSC를 유도하기 위한 플랫폼을 제공한다. 보편적으로 상용성인 HSC를 개발하는 것이 목표이지만, 보편적으로 상용성인 트랜스진-무함유 공급원 세포가 양성 및 악성 혈액, 대사, 면역, 및 골수 질환을 갖는 환자를 치료하는 데 이용가능하게 될 때 본원에 개시된 생체-모방형 생물반응기는 발판이 된다.

물질 및 방법

모든 절차는 브리검 여성 병원 및 보스턴 아동 병원의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다.

마우스는 더 잭슨 래보러토리로부터 Cd45.2 (C57BL6/J) 및 Cd45.1 (SJL)을 구입하고, 제브라피쉬 모르폴리노는 진툴즈로부터 구입하였다. 형광-표지된 덱스트란 염료를 제브라피쉬 심장의 심방에 주사함으로써 미세혈관조영을 수행하고, 그의 계대배양을 라이브 영상화를 사용하여 기록하였다. 제브라피쉬 심장 및 마우스 AGM의 면역염색을 도립 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. 심장 압전, 심박수, 및 맥박 빈도를 명시야 영상화 또는 저속 공초점 현미경을 사용하여 제브라피쉬 배아에서 분석하였다. 저속 공초점 영상화를 사용하여 혈관에서의 적혈구의 이동 뿐만 아니라 제브라피쉬 트랜스제닉 배아에서의 내피에서 HSC로의 이행을 분석하였다.

맥동 혈관 유사 조건을 플렉스셀 FX-4000 기계를 사용하여 시험관내에서 자극하였다. 내피에서 HSC로의 이행을 조절하는 데 있어서 약리학적 표적의 역할을 분석하기 위해, 마우스 배아-유래 AGM 또는 전체 마우스 배아를 생체외에서 생물역학적 스트레칭, 화학물질 또는 약물에 노출시켰다. 다음으로, 마우스 AGM-유래 세포를 스템셀 M3434 배지에서 7일 동안 인큐베이션함으로써 조혈 콜로니 형성 검정을 수행하였다. 치사 방사선조사된 SJL 마우스에서 AGM-유래 HSC의 연속 이식을 수행하였다. 생물역학적 스트레칭 시 줄기 세포 빈도를 한계 희석 검정을 사용하여 분석하였다. 1차 이식에서 AGM-HSC-유래 혈액 세포의 특성을 특징화하기 위해, FACS를 사용하여 키메라 현상 및 재구성 백분율을 측정하고, 정량적 리버스 트랜스크립타제-PCR을 사용하여 글로빈 전사체를 분석하고, 피코카인 ELISA 키트를 사용하여 미엘로퍼옥시다제 양을 측정하고, TCR-β 유전자좌에 대한 PCR을 사용하여 TCR-β 재배열을 분석하고, 써모-피셔 마우스 Ig 이소형 결정 키트를 사용하여 면역전 IG 검출을 분석하고, 사전-감작화된 마우스의 발바닥에 양 RBC (록랜드 이뮤노케미칼스)를 주사함으로써 지연형 과민성을 분석하였다.

RNA-서열분석을 수행하여 주기적 변형 또는 약리학적 조정제로 처리된 마우스 AGM에서 유전자 발현 패턴을 측정하였다. 컴퓨터 알고리즘을 사용하여, 차등 발현된 유전자의 계층적 클러스터링을 수행할 뿐만 아니라 그의 과다표현된 생물학적 과정 및 경로를 측정하였다. 차등 발현된 유전자의 유전자 발현 클러스터를 분석하고, 세포 집단에 걸친 그들의 평균 발현 수준을 비교하였다. 다음으로, 주기적 변형- 또는 약리학적 조정제(들)-매개된 내피에서 HSC로의 이행에 중요한 후보(들)를 분석하기 위해 업- 및 다운-유전자의 벤 비교를 구축하였다. 또한, Dnmt3b 및 Dnmt3a 단백질 발현을 이퀴킥(EqiQuick) 검정 키트를 사용하여 마우스 AGM 세포의 핵 분획에서 분석하였다. 달리 나타내지 않는 한, 데이터는 평균 ± s.d.로 제시된다. 통계적 분석은 대응표본 또는 독립표본 스튜던트 t-검정에 의해 수행하였다. 유의성은 P<0.05로 설정하였다.

동물

실험은 야생형 AB, 카스퍼(Casper), 및 트랜스제닉 제브라피쉬 계통 lcr:eGFP, flk1:mCherry, flk1:eGFP, cd41:eGFP를 사용하였다. 배아를 4일 pf까지 사용하였다. 실험은 더 잭슨 래보러토리로부터의 Cd45.2 (C57BL6/J) 및 Cd45.1 (SJL) 마우스를 사용하였다.

모르폴리노

모르폴리노 안티센스 올리고를 수득하고 (진 툴즈; 하기 서열), 1-세포 단계 카스퍼 제브라피쉬 배아 내로 주사하였다. 주사 및 비주사 배아를 고정 시까지 28℃에서 E3 배지에서 인큐베이션하였다.

배아의 화학적 처리

제브라피쉬 배아를 E3 어류 배지 중에서 다음의 화학적 조정제로 처리하였다: 100 uM L-NAME (피셔 사이언티픽), 50 uM 디지톡시게닌 (시그마), 25-50 uM Yoda1 (케이만 케미칼), 1 uM 나노마이신 (Nana; 피셔 사이언티픽), 100 uM 염화가돌리늄 (GdCl₃; 시그마), 5-10 uM 4α-포르볼 12, 13-디데카노에이트 (4Apdd; 시그마), 또는 GSK205 (10 uM).

미세혈관조영술

형광 염료-표지된 덱스트란 비드를 대조군 및 cdh5-MO 배아의 심방 내로 주사하고, 니콘 SMZ1500 입체 현미경을 사용하여 실시간 명시야 비디오를 캡쳐하였다.

심박수 및 심장 박출량

살아있는 제브라피쉬 심장의 영상을 통합 백열 조명을 사용하는 5x 대물 렌즈가 장착된 악시오플랜 (자이스) 직립 현미경 및 512x480 픽셀 그레이스케일 영상 센서가 장착된 패스트캠-PCI 고속 디지털 카메라 (포트론) 상에서 획득하였다. 초당 250 프레임으로 영상을 수득하였고, 조건당 1088 프레임 (8 심장 주기)을 획득하였다. 순차적 영상 파일로부터 심박수를 측정하기 위해 맞춤 소프트웨어 (MATLAB로 실행됨)를 사용하였다. 심실 장축 및 단축을 영상J를 사용하여 각 비디오에 대해 확장기 및 수축기 둘 다에서 수동으로 측정하고, 표준 기하학적 가정을 이용하여 챔버 부피를 추정하는 데 사용하였다. 모르폴리노 용량당 적어도 10개의 배아에 대해 심장 박출량을 확장기 마이너스 수축기 심실 부피 곱하기 심박수로서 측정하였다 (문헌 [Shin et al., 2010]).

주기성 분석

제브라피쉬 카스퍼 배아를 트리카인 (시그마)과 함께 0.8% 저융점 아가로스에 포매시키고, 페트리 디쉬에 탑재하였다. 다음으로, NIS 엘리먼츠 (니콘) 소프트웨어가 장착된 니콘 SMZ1500 입체현미경을 사용하여 AGM 영역에서 맥동 혈관의 실시간 명시야 비디오를 캡쳐하였다. 비디오를 사용하여 혈관에서의 맥박 빈도를 정량화하였다.

명시야 라이브 영상화

명시야 라이브 영상화를 수행하기 위해, 제브라피쉬 카스퍼 배아를 트리카인 (시그마)과 함께 0.8% 저융점 아가로스에 포매시키고, 페트리 디쉬에 탑재하였다. NIS 엘리먼츠 (니콘) 소프트웨어가 장착된 니콘 SMZ1500 입체 현미경을 사용하여 실시간 명시야 비디오 및 정지 영상을 캡쳐하였다.

공초점 현미경검사

cd41:eGFP를 flk1:mCherry 제브라피쉬와 교배시키고, flk1:mCherry를 lcr:eGFP 제브라피쉬와 교배시키고, 그의 트랜스제닉 배아에 모르폴리노를 주사하였다. 트랜스제닉 배아를 저융점 아가로스에 탑재하고, 스피닝-디스크 공초점 현미경을 사용하여 30 내지 42 hpf에 flk1⁺ 내피로부터 출현한 cd41:eGFP ⁺ HSC의 저속 공초점 영상화를 수행하였다. lcr:eGFP ⁺ 적혈구의 상대 이동을 flk1:mCherry ⁺ 내피의 맥락에서 분석하였다. 본 발명자들은 이마리스(Imaris) (비트플레인) 소프트웨어를 사용하여 영상 분석을 수행하였다.

전체 마운트 계내 혼성화

전체 마운트 계내 혼성화를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다.

심장 압전

미세주사 바늘을 사용하여 심낭을 천공하고, 48 hpf에 cdh5-MO-주사된 제브라피쉬 배아의 심장 주위에 축적된 유체를 방출시켰다.

면역염색

E10.5 키메라 마우스 배아를 수거하고, 파라핀 블록에 포매시키고, 횡단 절편을 수행하고, E10.5 AGM 영역에서의 그의 발현을 검출하기 위해 1차 항체 Piezo1 (토끼 항-마우스 IgG; 압캠), Cd31 (당나귀 항-마우스 IgG; 알앤디 시스템즈), c-Kit (토끼 항-마우스 IgG; 알앤디 시스템즈), 또는 Dnmt3b (당나귀 항-마우스 IgG; 압캠), 및 4,6 디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) 항체, 및 또한 2차 항체 알렉사 플루오르 488 (당나귀 항-토끼 IgG; 피셔 사이언티픽) 및 알렉사 플루오르 647 (당나귀 항-염소 IgG; 압캠)로 면역염색하였다.

flk1 (GFP), mf2 (mCherry) 및 DAPI (보라색)의 발현을 대조군 및 cdh5-MO 침묵 제브라피쉬 배아로부터 단리된 심장에서 측정하였다.

AGM 체외이식편

E11.5 AGM을 C57BL6/J Cd45.2 마우스 배아로부터 수거하고, 3-배아 당량의 세포의 단일 세포 현탁액을 바이오플렉스 6-웰 배양 플레이트 (플렉스셀)의 각 웰에 시딩하였다. 본 발명자들은 주기적 변형 (플렉스셀® FX-4000™ 텐션 시스템)의 적용 및/또는 화학적 조정제 (2-100 μM Yoda1, 1 μM 나노마이신, 100 μM Gdcl₃, 1 uM GsMTx4, 5-20 μM 4αPDD, 10 uM GSK205)로의 처리로 세포를 밤새 배양하였다. 다음으로, 수거된 세포를 사용하여 이식, 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석, 및 콜로니-형성 단위 (CFU) 검정을 수행하였다.

배아와 약물의 생체외 인큐베이션

E11.5 마우스 배아를 교배 시기 임신한 암컷의 자궁으로부터 FBS, 1 mM 글루코스, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 및/또는 선택된 화학적 조정제 (2-100 μM Yoda1, 1 μM 나노마이신, 5-20 μM 4αPDD, 또는 10 uM GSK205)를 함유하는 멸균 유리 바이알 내로 수거하였다. 본 발명자들은 롤러 장치 (~30 rpm 회전), 일정한 기체 공급 (21% 0₂, 5% CO₂, 나머지 N₂) 및 37℃의 일정한 온도로 이루어진 생체외 인큐베이터 (BTC 엔지니어링, 영국 캠브리지)에 유리 바이알을 넣었다. 24시간 후, AGM을 수거하여 FACS 및 CFU 검정에 의해 조혈 세포의 형성을 분석하였다.

이식

1차 이식을 위해, 비처리 또는 처리된 (주기적 변형 또는 25 μM Yoda1) AGM + 비장 헬퍼 세포 (마우스당~500,000)의 3-배아 등가물을 안와후 주사에 의해 치사 방사선조사된 (분할 선량 10.5 cGy) Cd45.1 (SJL) 마우스에 주사하였다. 2차 및 3차 이식을 위해, 이식된 마우스로부터 골수를 단리하였다 (다리, 팔, 골반골, 척추, 흉골). 골수를 피콜 구배 (히스토파크(Histopaque)®-1083, 시그마-알드리치) 상에 로딩하고, 백혈구 연층으로부터의 세포를 비오틴-접합된 계통 항체 및 스트렙타비딘 마이크로비드 (밀테니 바이오텍)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 계통 음성 (Lin^-) 세포를 MACS LS 칼럼 (밀테니 바이오텍)으로 분리하고, 공여자 Cd45.2 Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺ (LSK) 세포를 모플로 베크만 쿨터 분류기로 분류하였다. 후속적으로, 분류된 Cd45.2 LSK 세포를 Cd45.1 비장 헬퍼 세포 (마우스당 ~500,000)와 혼합하고, 안와후 주사에 의해 Cd45.1 조사된 (분할 선량 10.5 cGy) SJL 마우스에 이식하였다.

생존 수용자를 한계 희석 검정에 대한 반응으로서 계수하였다: 1/(줄기-세포 빈도)의 신뢰 구간을 푸아송 분포에 따라 ELDA에 의해 계산하였다.

CFU 및 FACS 검정

CFU 검정을 위해, AGM 체외이식편 또는 생체외로부터의 세포를 메토컬트 GF M3434 배지 (스템셀 테크놀로지스)에 플레이팅하였다. 시딩 7일 후, 본 발명자들은 과립구, 적혈구, 대식세포, 거핵구 (GEMM), 과립구 대식세포 (GM), 과립구 (G), 대식세포 (M), 및 적혈구 (E) 콜로니를 제조하는 그의 능력을 분석하였다.

체외이식편 및 생체외로부터의 AGM 세포를 Sca1-퍼시픽-블루 (E13-161.7, 바이오레전드) 및 Flk1-APC-Cy7 (아바스 12α 1, BD)로 염색하였다. 이식된 마우스로부터의 혈액을 다음 항체 칵테일로 염색하였다: Cd45.2-퍼시픽-블루 (104, 바이오레전드), Cd45.1-FITC(A20, 바이오레전드), Cd3-PE (145-2C11, 바이오레전드), Cd8-PE (53-6.7, 바이오레전드), Mac1-APC(M1/70, 바이오레전드), Gr1-APC (108412, 바이오레전드), Cd19-APC-CY7 (6D5, 바이오레전드), B220-APC-CY7 (RA3-6B2, 바이오레전드).

E11.5 AGM 세포를 이식한 마우스로부터의 골수, 비장, 흉선 및 림프절로부터의 세포를 다음 항체 패널로 염색하였다: 골수 LT-HSC: Cd45.2-FITC (104, 바이오레전드), Ter119-비오틴 (TER-119 BD), Gr1-비오틴 (RB6-8C5, BD), Cd5-비오틴 (53-7.3, BD), Cd8a-비오틴 (53-6.7, BD), B220-비오틴 (RA3-6B2, BD), 스트렙타비딘-퍼시픽 블루 (이바이오사이언스), Sca1-PE-CY7 (D7, 이바이오사이언스), cKit-APC (2B8, 이바이오사이언스), Cd48-APC-CY7 (HM48-1, BD), Cd150-PE-CY5 (TC15-12F12.2, 바이오레전드). 골수에서의 적혈구 발생 RI-RV: Cd45.2-퍼시픽-블루 (104, 바이오레전드), Cd45.1-FITC(A20, 바이오레전드), Ter119-APC(TER-119, 바이오레전드), Cd71-PE(R17217, 이바이오사이언스). 골수 과립구: Cd45.2-퍼시픽-블루 (104, 바이오레전드), Cd45.1-FITC(A20, 바이오레전드), Gr1-PE, (RB6-8C5, BD); Mac1-APC(M1/70, 바이오레전드). 비장, 흉선 및 림프절 T 세포: Cd45.2-퍼시픽-블루 (104, 바이오레전드), Cd45.1-FITC(A20, 바이오레전드), Cd8-PE (53-6.7, 바이오레전드), Cd4-APC(RM4-5, 이바이오사이언스). 비장, 흉선 및 림프절 골수성 및 B 세포: Cd45.2-퍼시픽-블루 (104, 바이오레전드), Cd45.1-FITC(A20, 바이오레전드), Cd19-APC-CY7 (6D5, 바이오레전드), Mac1-APC(M1/70, 바이오레전드). 본 발명자들은 BD 포르테사 세포측정기 상에서 모든 FACS 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 이식 16주 후에 조혈 기관 분석을 수행하였다.

정량적 리버스 트랜스크립타제-폴리머라제 연쇄 반응 분석 (qRT-PCR)

FACS를 사용하여 AGM-이식된 마우스로부터 단리된 용해되지 않은 골수로부터 적혈구 전구체 (Cd45.2⁺, Ter119⁺, Cd71⁺)를 분류하였다. 총 RNA를 RNA이지 미니키트(RNAeasy Minikit) (퀴아젠)를 사용하여 단리하고, cDNA 합성을 슈퍼스크립트(Superscript) III (인비트로젠)을 사용하여 수행하였다. 명시된 프라이머를 갖는 MX3000P 기계 상에서 SYBR 그린 (퀀타바이오)을 사용하여 정량적 실시간 PCR을 수행하였다 (문헌 [Sankaran et al., 2009]). 본 발명자들은 발현을 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제 (Gapdh)의 발현에 대해 정규화하였다 (문헌 [Ochida et al., 2010]).

미엘로퍼옥시다제 (MPO) 발현

호중구 (Cd45.2⁺, Gr1⁺, Mac1⁺)를 16주-1차 이식된 마우스의 단리된 골수로부터 FACS 분류하고, 24-웰 플레이트에서 10% FBS를 함유하는 IMDM 중에서 밤새 (500,000개 세포/mL) 배양하였다. 상청액을 수집하고, MPO 농도를 마우스 MPO/미엘로퍼옥시다제 피코카인™ ELISA 키트 (부스터)를 사용하여 측정하였다. MPO 농도를 또한 혈청에서 측정하였다.

TCR-β 재배열에 대한 PCR 검정

T 세포 (Cd45.2⁺, Cd3⁺) 및 골수 세포 (Cd45.2⁺, Mac1⁺)를 16주-1차 이식된 마우스의 비장세포로부터 FACS 분류하였다. 다음으로, 게놈 DNA를 추출하고, TCR-β 유전자좌 내의 DH β2.1-JH β2.7 재배열에 대해 PCR을 수행하였다. 본 발명의 샘플을 변성시키고 (94℃, 1분), 어닐링하고 (63℃, 2분), 35 사이클 동안 연장시켰다 (72℃, 2분). 프라이머 서열은 다음과 같다:

문헌 [Lu et al., 2017] 참조.

면역전 Ig 검출

혈액 혈청을 16주-1차 이식된 마우스로부터 단리하고, 면역전 Ig 이소형을 마우스 Ig 이소형결정 키트 (써모 피셔)에 의해 정량하였다.

지연형 과민성

이식 마우스를 피하 (하배부) 및 피내 주사 (우측 발바닥)를 통해 양 적혈구 (sRBC, 10⁹개 세포/mL, 부위당 50 μL, 록랜드 이뮤노케미칼스)로 감작화시켰다. 감작 6일 후, 사전-감작화된 마우스를 좌측 발바닥에 2x10⁹ sRBC/mL 및 우측 발바닥에 동일한 부피의 PBS (대조군으로서)로 챌린지하였다. 챌린지 48시간 후, 발바닥 두께를 마이크로-캘리퍼로 측정하였다. 본 발명자들은 챌린지 전의 각 발바닥 두께를 이용하여 제6일의 퍼센트 변화를 정규화하였다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 발현

AGM 체외이식편으로부터의 핵 추출물을 에피퀵 핵 추출 키트 (에피젠텍 그룹 인크.)를 사용하여 수거하였다. Dnmt3b 및 Dnmt3a 단백질 수준을 비색 에피퀵 검정 키트 (에피젠텍 그룹 인크.)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 분석하였다. Dnmt3b 및 Dnmt3a의 농도는 1 μg의 핵 추출물 단백질에 대한 것이다.

RNAseq 및 컴퓨터 분석

E11.5 마우스 AGM 체외이식편 배양물로부터의 총 RNA를 RNA이지 미니키트 (퀴아젠)로 단리하였다 (대조군, 스트레치, Yoda1 및 4αPDD 조건). 본 발명의 cDNA 라이브러리를 BGI 아메리카스 코포레이션에 의해 생성하고, 레인당 8개의 샘플에서 HiSeq4000 장치 (일루미나)로 서열분석하였다. 본 발명자들은 게놈 짧은-판독물 뉴클레오티드 정렬 프로그램 (버전 2012-07-20)을 사용하여 본 발명의 서열분석된 판독물 단편을 마우스 참조 게놈 GRCm38 (ENSEMBL 방출 69)에 맵핑하였다. DESeq2 및 DEXSeq를 사용하여 각각 차등 발현 (FDR=0.1) 및 차등 엑손 사용에 대해 시험하였다. 차등 발현된 유전자의 유전자 발현 클러스터를 분석하고, 세포 집단에 걸친 그들의 평균 발현 수준을 비교하였다. 다음으로, 주기적 변형- 또는 약리학적 조정제(들)-매개된 내피에서 HSC로의 이행에 중요한 후보(들)를 분석하기 위해 업- 및 다운-유전자의 벤 비교를 수행하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 R (문헌 [R Development Core Team, 2012])에서 gplot 패키지 (문헌 [Warners et al., 2017])를 사용하여 부트스트랩 분석으로 계층적 클러스터링을 수행하였다. GO 분석을 위해, 본 발명자들은 피셔 정확 검정을 사용하여 GO 카테고리 또는 경로 상에서 본 발명의 차등 발현된 유전자의 과다-표현에 대해 시험하고, 본페로니 방법을 사용하여 다중 시험에 대해 보정하였다. 본 발명자들은 통계적으로 유의한 풍부화에 대한 최소값으로서 0.001의 P 값을 사용하여 기존에 기재된 바와 같이 GO 용어 풍부화 분석을 수행하였다.

통계 분석

데이터는 달리 나타내지 않는 한 평균 ± 평균의 표준 오차 (평균 ± SEM)로서 제시된다. 통계적 분석은 대응표본 또는 독립표본 스튜던트 t-검정에 의해 수행하였다. 유의성은 P<0.05로 설정하였다.

SEQUENCE LISTING <110> The Brigham and Women's Hospital, Inc. <120> METHODS FOR GENERATING HEMATOPOIETIC STEM CELLS <130> 29618-0259WO1 <140> PCT/US2020/063901 <141> 2020-12-09 <150> 62/945,838 <151> 2019-12-09 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligo cdh5-MO <400> 1 tacaagaccg tctacctttc caatc 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligo sih-MO <400> 2 catgtttgct ctgatctgac acgca 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligo piezo1-MO <400> 3 caaagttcag ttcagctcac ctcat 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligo dnmt3bb.1-MO1 <400> 4 ttatttcttc cttcctcatc ctgtc 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligo dnmt3bb.1-MO2 <400> 5 ctctcatctg aaagaatagc agagt 25 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer 5' of DH beta2.1 <400> 6 gtaggcacct gtggggaaga aact 24 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer 3' of JH beta2.7 <400> 7 tgagagctgt ctcctactat cgatt 25

Claims

내피 및/또는 헤모제닉 내피 (HE) 세포를 포함하는 집단을 제공하는 단계,
내피 및/또는 HE 세포에서 vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln으로부터 선택되는 2종 이상의 내피 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계;
내피 및/또는 HE 세포에서 runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3으로부터 선택되는 2종 이상의 조혈 유전자의 발현 또는 활성을 증가시켜, 장기 (LT)-조혈 줄기 세포 (HSC)를 포함하는 HSC의 형성을 자극하는 단계
를 포함하는, LT-HSC를 포함하는 조혈 줄기 세포 (HSC) 집단을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 내피 및/또는 HE 세포에서 vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln으로부터 선택되는 3종 이상의 내피 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키는 것; 및 내피 및/또는 HE 세포에서 runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3으로부터 선택되는 3종 이상의 조혈 유전자의 발현 또는 활성을 증가시켜, HSC의 형성 및 임의로 확장을 자극하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 내피 및/또는 HE 세포에서 vegfa, hey2, grp116, gna13, cdh5, 및 plxnd1의 발현 또는 활성을 감소시키는 것; 및 내피 및/또는 HE 세포에서 runx1, spi1, cebpa, tal1, 및 gata2의 발현 또는 활성을 증가시켜, HSC의 형성 및 임의로 확장을 자극하는 것을 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 유전자의 활성 또는 발현의 증가가 코딩 mRNA 또는 mRNA 유도체의 도입, 코딩 트랜스진 또는 에피솜의 도입, 및 발현 요소의 유전자 변형의 도입 또는 조혈 유전자에 기능 획득 돌연변이의 도입 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 내피 유전자의 발현 또는 활성의 감소가 전체 또는 부분 유전자 결실의 도입, RNA 침묵, 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제, 약리학적 억제, 및 발현 요소의 유전자 변형의 도입 또는 내피 유전자에 기능 상실 돌연변이의 도입 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내피 유전자의 발현 또는 활성의 감소 및 상기 조혈 유전자의 발현 또는 활성의 증가가 Dnmt3b의 발현 또는 활성을 유효 수준 및 지속기간으로 증가시킴으로써 수행되는 것인 방법.
제6항에 있어서, Dnmt3b의 발현 또는 활성의 증가가 코딩 mRNA 또는 mRNA 유도체의 도입, 코딩 트랜스진 또는 에피솜의 도입, 및 발현 요소의 유전자 변형 또는 Dnmt3b 유전자에 기능 획득 돌연변이의 도입 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내피 유전자의 발현 또는 활성의 감소 및 상기 조혈 유전자의 발현 또는 활성의 증가가 Gimap6의 발현 또는 활성을 유효 수준 및 지속기간으로 증가시킴으로써 수행되는 것인 방법.
제8항에 있어서, Gimap6의 발현 또는 활성의 증가가 코딩 mRNA 또는 mRNA 유도체의 도입, 코딩 트랜스진 또는 에피솜의 도입, 및 발현 요소의 유전자 변형 또는 Gimap6 유전자에 기능 획득 돌연변이의 도입 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내피 유전자의 발현 또는 활성의 감소 및 상기 조혈 유전자의 발현 또는 활성의 증가가 내피 세포 또는 HE 세포를 2D 또는 3D 주기적 변형, 유효 농도 및 지속기간의 Piezo1의 효능제, 또는 그의 조합과 접촉시킴으로써 수행되는 것인 방법.
제10항에 있어서, Piezo1 효능제가 Yoda1, Jedi1 및/또는 Jedi2인 방법.
제11항에 있어서, Piezo1 효능제의 유효량이 0.1 내지 500 uM의 범위, 또는 0.1 내지 100 μM의 범위인 방법.
제10항에 있어서, Piezo1의 효능제가, 후보 화합물과 접촉 시 내피 및/또는 HE 세포에서 vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln으로부터 선택되는 내피 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키는 것; 및 내피 및/또는 HE 세포에서 runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3으로부터 선택되는 2종 이상의 조혈 유전자의 발현 또는 활성을 증가시키는 것에 기초하여 화학적 라이브러리에서 확인되는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 배아체, 내피 세포, 헤모제닉 내피 (HE) 세포 또는 그의 조합을 포함하는 집단을 생물반응기에 제공하는 것을 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 생물반응기가 주기적-변형 생물역학적 스트레칭, 유효 농도 및 지속기간의 Piezo1의 효능제, 또는 그의 조합을 제공하는 것인 방법.
제15항에 있어서, 주기적-변형 생물역학적 스트레칭이 내피 및/또는 HE 세포에서 vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln으로부터 선택되는 3종 이상의 내피 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키고; 내피 및/또는 HE 세포에서 runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3으로부터 선택되는 2종 이상의 조혈 유전자의 발현 또는 활성을 증가시켜, HSC의 형성, 및 임의로 확장을 자극하는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, HSC가 조혈 함요(niche)에 생착되고, 기능적 다계통 성체 혈액으로 재구성되는 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, HE 세포가 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC), 비-조혈 줄기 세포, 체세포, 또는 내피 세포로부터 수득되는 것인 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포가 적어도 1% 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC) 또는 적어도 5% LT-HSC를 포함하는 것인 방법.
제19항에 있어서, 조혈 줄기 세포가 적어도 0.1% 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 내피 및/또는 HE 세포가 HLA-변형 또는 HLA-무효 세포, 및/또는 트랜스진-무함유 세포로부터 유래되고, 유전자-교정되고, 트랜스진-과다발현되고, 임의로 iPS 세포 또는 체세포의 유전적 또는 화학적 유도에 의해 유래된 것인 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 공급원 세포가 대상체, 세포의 기성품 라이브러리로부터 수득되거나 유래되며, 여기서 대상체는 임의로 보편적으로 상용성인 공여자인 방법.
제22항에 있어서, 공급원 세포가 혈액, 골수, 리소솜 저장, 미토콘드리아, 대사 또는 면역 질환을 갖는 대상체로부터 수득되거나 유래된 것인 방법.
제23항에 있어서, 대상체가 혈액 또는 비-혈액 악성종양을 갖지 않는 것인 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, HSC를 회수하고 임의로 확장시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제25항에 있어서, HSC 집단이 수용자에게 투여되며, 여기서 수용자는 임의로 공여자 대상체인 방법.
제26항에 있어서, 적어도 약 10²개 HSC가 투여되는 것인 방법.
제26항에 있어서, 적어도 약 10³개 HSC가 투여되는 것인 방법.
제26항에 있어서, 적어도 약 10⁴개 HSC가 투여되는 것인 방법.
제26항에 있어서, 적어도 약 10⁵개 HSC가 투여되는 것인 방법.
배아체 또는 내피 세포를 포함하는 집단을 제공하고, 하기 중 하나 이상으로부터 선택되는 유전적, 약리학적 및/또는 기계적 자극을 제공하는 단계:
세포에서 vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln으로부터 선택되는 1종 이상의 내피 유전자의 발현 또는 활성의 감소; 및 세포에서 runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3으로부터 선택되는 2종 이상의 조혈 유전자의 발현 또는 활성의 증가;
2D 또는 3D 주기적 변형을 적용하는 단계, 및
세포를 유효 농도 및 지속기간의 Piezo1의 효능제와 접촉시켜; 세포를 조혈 내피 (HE) 세포로 이행시키는 단계
를 포함하는, 세포 집단을 조혈 내피 (HE) 세포로 이행시키는 방법.
제31항에 있어서, 조혈 유전자의 활성 또는 발현의 증가가 코딩 mRNA 또는 mRNA 유도체의 도입, 코딩 트랜스진 또는 에피솜의 도입, 발현 요소의 유전자 변형의 도입; 및 조혈 유전자에 기능 획득 돌연변이의 도입 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제32항에 있어서, 내피 유전자의 발현 또는 활성의 감소가 전체 또는 부분 유전자 결실의 도입, RNA 침묵; 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제, 약리학적 억제, 발현 요소의 유전자 변형의 도입, 및 내피 유전자에 기능 상실 돌연변이의 도입 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제33항 또는 제33항에 있어서, 상기 내피 유전자의 발현 또는 활성의 감소 및 상기 조혈 유전자의 발현 또는 활성의 증가가 Dnmt3b의 발현 또는 활성을 유효 수준 및 지속기간으로 증가시킴으로써 수행되는 것인 방법.
제34항에 있어서, Dnmt3b의 발현 또는 활성의 증가가 코딩 mRNA 또는 mRNA 유도체의 도입, 코딩 트랜스진 또는 에피솜의 도입, 발현 요소의 유전자 변형의 도입, 및 Dnmt3b 유전자에 기능 획득 돌연변이의 혼입 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내피 유전자의 발현 또는 활성의 감소 및 상기 조혈 유전자의 발현 또는 활성의 증가가 Gimap6의 발현 또는 활성을 유효 수준 및 지속기간으로 증가시킴으로써 수행되는 것인 방법.
제36항에 있어서, Gimap6의 발현 또는 활성의 증가가 코딩 mRNA 또는 mRNA 유도체의 도입, 코딩 트랜스진 또는 에피솜의 도입, 발현 요소의 유전자 변형의 도입, 및 Gimap6 유전자에 기능 획득 돌연변이(들)의 도입 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제31항에 있어서, 세포를 Yoda1, Jedi1 및/또는 Jedi2로부터 선택되는 Piezo1 효능제의 유효량과 접촉시키는 것인 방법.
제38항에 있어서, Piezo1 효능제의 유효량이 0.1 내지 500 μM의 범위, 또는 0.1 내지 100 μM의 범위인 방법.
제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 집단을 생물반응기에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 생물반응기는 주기적-변형 생물역학적 스트레칭을 제공하는 것인 방법.
제40항에 있어서, HE 세포가 임의로 상기 유전적, 약리학적 및/또는 기계적 자극을 적용함으로써 회수되거나 또는 HSC로 이행되는 것인 방법.
제41항에 있어서, HE 세포가, 조혈 함요에 생착되고 기능적 다계통 성체 혈액으로 재구성되는 HSC로 이행되는 것인 방법.
제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 배아체 또는 내피 세포가 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 유래된 것인 방법.
제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 내피 세포가 비-조혈 줄기 세포로부터 유래된 것인 방법.
제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, HE 세포가 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)를 포함하는 조혈 줄기 세포로 이행되는 것인 방법.
제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 HLA-변형 또는 HLA-무효 세포로부터 유래된 것인 방법.
제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 트랜스진-무함유 세포인 방법.
제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전적, 약리학적 및/또는 기계적 자극을 HSC 세포에 적용하는 것을 포함하는 과정에서 HSC를 확장시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제48항에 있어서, HSC가 수용자에게 투여되며, 여기서 수용자는 임의로 공여자 대상체인 방법.
조혈 줄기 세포 (HSC) 집단을 제공하고, 하기 중 하나 이상으로부터 선택되는 유전적, 약리학적 및/또는 기계적 자극을 제공하는 단계:
세포에서 vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln으로부터 선택되는 1종 이상의 내피 유전자의 발현 또는 활성의 감소; 및 세포에서 runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3으로부터 선택되는 2종 이상의 조혈 유전자의 발현 또는 활성의 증가;
2D 또는 3D 주기적 변형을 적용하는 단계, 및
세포를 유효 농도 및 지속기간의 Piezo1의 효능제와 접촉시켜; HSC를 확장시키는 단계
를 포함하는, 조혈 줄기 세포 (HSC) 집단을 확장시키는 방법.
제50항에 있어서, 조혈 유전자의 활성 또는 발현의 증가가 코딩 mRNA 또는 mRNA 유도체의 도입, 코딩 트랜스진 또는 에피솜의 도입, 발현 요소의 유전자 변형의 도입; 및 조혈 유전자에 기능 획득 돌연변이의 도입 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제51항에 있어서, 내피 유전자의 발현 또는 활성의 감소가 전체 또는 부분 유전자 결실의 도입, RNA 침묵, 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제, 약리학적 억제, 발현 요소의 유전자 변형의 도입, 및 내피 유전자에 53-상실 돌연변이의 도입 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 내피 유전자의 발현 또는 활성의 감소 및 상기 조혈 유전자의 발현 또는 활성의 증가가 Dnmt3b의 발현 또는 활성을 유효 수준 및 지속기간으로 증가시킴으로써 수행되는 것인 방법.
제53항에 있어서, Dnmt3b의 발현 또는 활성의 증가가 코딩 mRNA 또는 mRNA 유도체의 도입, 코딩 트랜스진 또는 에피솜의 도입, 발현 요소의 유전자 변형의 도입; 및 Dnmt3b 유전자에 기능 획득 돌연변이의 혼입 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내피 유전자의 발현 또는 활성의 감소 및 상기 조혈 유전자의 발현 또는 활성의 증가가 Gimap6의 발현 또는 활성을 유효 수준 및 지속기간으로 증가시킴으로써 수행되는 것인 방법.
제55항에 있어서, Gimap6의 발현 또는 활성의 증가가 코딩 mRNA 또는 mRNA 유도체의 도입, 코딩 트랜스진 또는 에피솜의 도입, 발현 요소의 유전자 변형의 도입, 및 Gimap6 유전자에 기능 획득 돌연변이(들)의 도입 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제50항에 있어서, 세포를 Yoda1, Jedi1 및/또는 Jedi2로부터 선택되는 Piezo1 효능제의 유효량과 접촉시키는 것인 방법.
제57항에 있어서, Piezo1 효능제의 유효량이 0.1 내지 500 μM의 범위, 또는 0.1 내지 100 μM의 범위인 방법.
제50항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 집단을 생물반응기에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 생물반응기는 주기적-변형 생물역학적 스트레칭을 제공하는 것인 방법.
제59항에 있어서, HSC가 조혈 함요에 생착되고, 기능적 다계통 성체 혈액으로 재구성되는 것인 방법.
제50항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, HSC가 내피 세포 또는 HE 세포로부터 이행되는 것인 방법.
제50항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, HSC가 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)를 포함하는 것인 방법.
제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, HSC 집단이 HLA-변형 또는 HLA-무효 세포로부터 유래된 것인 방법.
제63항에 있어서, 세포 집단이 트랜스진-무함유 세포인 방법.
제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 HSC 집단, 및 제약상 허용되는 비히클을 포함하는 제약 조성물.
제65항에 있어서, 적어도 10⁴개 LT-HSC 세포를 포함하는 제약 조성물.
조혈 줄기 세포 요법 또는 이식을 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 조혈 줄기 세포 (HSC)의 치료 유효량을 투여하거나 또는 제65항 또는 제66항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 조혈 줄기 세포 요법 또는 이식을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법.
제67항에 있어서, 대상체가 악성 또는 비-악성 형태의 혈액, 골수, 리소솜 축적, 미토콘드리아, 대사, 또는 면역 질환을 갖는 것인 방법.
제67항 또는 제68항에 있어서, 대상체가 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 장애; 골수이형성 증후군; 다발성 골수종; 비-호지킨 림프종, 호지킨병, 신경모세포종, 배세포 종양 또는 아밀로이드증으로부터 선택되는 상태를 갖는 것인 방법.
제69항에 있어서, 대상체가 자가면역 장애, 예컨대 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 전신 경화증; 재생불량성 빈혈; 순수 적혈구 무형성증; 발작성 야간 혈색소뇨, 판코니 빈혈; 중증성 빈혈; 겸상 적혈구성 빈혈; 중증 복합 면역결핍 (SCID); 비스코트-알드리치 증후군; 혈구포식성 림프조직구증식증; 선천성 대사 이상; 수포성 표피박리증; 중증 선천성 호중구감소증; 슈와크만-다이아몬드 증후군; 다이아몬드-블랙판 빈혈; 피어슨 증후군 및 백혈구 부착 결핍으로부터 선택되는 상태를 갖는 것인 방법.
화학적 화합물의 패널을 배아체, 내피 세포 및/또는 헤모제닉 내피 세포와 접촉시키고, 상기 화학적 화합물에 의해 유도된 Dnmt3b 또는 Gimap6; vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln 중 적어도 2종; 및 runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3 중 적어도 2종의 발현 수준의 변화를 결정하는 단계;
유전자 발현에서 하기 변화를 유도하는 화합물을 선택하는 단계:
Dnmt3b 및/또는 Gimap6의 발현의 증가,
vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln 중 2종 이상의 발현의 감소; 및
2종 이상의 runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3의 발현의 증가; 및
선택된 화합물을 내피 세포 및/또는 헤모제닉 내피 세포와 접촉시켜 내피 세포 및/또는 헤모제닉 내피 세포의 조혈 줄기 세포 (HSC)로의 이행을 유도함으로써, 생착하고 다계통 성체 혈액을 재구성할 수 있는 자기-재생 HSC를 제조하는 단계
를 포함하는, 조혈 줄기 세포 (HSC)를 제조하는 방법.
제71항에 있어서, 선택된 화합물이 내피 및/또는 HE 세포에서 vegfa, hey2, grp116, gna13, sox17, cdh5, plxnd1, bcl6 및 apln으로부터 선택되는 5종 이상의 내피 유전자의 발현을 감소시키고; 내피 및/또는 HE 세포에서 runx1, spi1, cebpa, tal1, gfi1, gata2 및 mllt3으로부터 선택되는 5종 이상의 조혈 유전자의 발현을 증가시켜, HE 세포, HSC 또는 그의 조합의 형성 및 임의로 확장을 자극하는 것인 방법.
제72항에 있어서, 선택된 화합물이 내피 및/또는 HE 세포에서 vegfa, hey2, grp116, gna13, cdh5 및 plxnd1의 발현을 감소시키고; 내피 및/또는 HE 세포에서 runx1, spi1, cebpa, tal1 및 gata2의 발현을 증가시키는 것인 방법.
제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 화합물이 Dnmt3b의 발현을 증가시키는 것인 방법.
제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 화합물이 Piezo1 효능제인 방법.
제74항에 있어서, 선택된 화합물이 Yoda1, Jedi1 및/또는 Jedi2의 유도체인 방법.
제71항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 배아체, 내피 세포 또는 HE 세포가 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC), 비-조혈 줄기 세포, 체세포 또는 내피 세포로부터 수득되는 것인 방법.
제71항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 조혈 줄기 세포가 적어도 0.1% 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)를 포함하는 것인 방법.
제78항에 있어서, 수득된 조혈 줄기 세포가 적어도 약 1% 또는 적어도 약 10% 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)를 포함하는 것인 방법.
제78항에 있어서, 수득된 조혈 줄기 세포가 약 2% 내지 약 25% LT-HSC를 포함하는 것인 방법.
제71항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 내피 및/또는 HE 세포가 HLA-변형 또는 HLA-무효 세포, 트랜스진-과다발현 및/또는 트랜스진-무함유 세포로부터 유래되고, 임의로 iPS 세포 또는 체세포의 유전적 또는 화학적 유도에 의해 유래된 것인 방법.
제71항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 공급원 세포가 대상체로부터 수득되거나 유래되며, 여기서 대상체는 임의로 환자, 매칭 또는 비매칭 공여자, 또는 보편적으로 상용성인 공여자인 방법.
제71항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, HSC를 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
적어도 약 10³개 또는 적어도 약 10⁴개 LT-HSC 세포를 포함하는, 본 개시내용에 따라 생성된 세포 요법을 위한 조성물.