JPWO2021119061A5 - - Google Patents
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Description
統計分析
データは、別段の記載がない限り、平均±平均の標準誤差（平均±ＳＥＭ）として表されている。統計分析は、対応のあるまたは対応のないスチューデントｔ検定によって行った。有意性は、Ｐ＜０．０５で設定された。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載の発明を列挙する。
［発明１］
長期（ＬＴ）－造血幹細胞（ＨＳＣ）を含むＨＳＣの集団を調製する方法であって、
内皮細胞および／または造血性内皮（ＨＥ）細胞を含む集団を提供すること、
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される２つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、ならびに
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させて、ＬＴ－ＨＳＣを含む前記ＨＳＣの形成を刺激すること
を含む、前記方法。
［発明２］
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される３つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、ならびに前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される３つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させて、前記ＨＳＣの形成および場合によって増殖を刺激することを含む、発明１に記載の方法。
［発明３］
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｃｄｈ５およびｐｌｘｎｄ１の発現または活性を低下させること、ならびに前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１およびｇａｔａ２の発現または活性を増大させることによって、前記ＨＳＣの形成および場合によって増殖を刺激することを含む、発明１に記載の方法。
［発明４］
前記造血遺伝子の活性または発現の前記増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、および発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、または前記造血遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明１～３のいずれか一つに記載の方法。
［発明５］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下が、完全または部分的な遺伝子欠失、ＲＮＡサイレンシング、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害、薬理学的阻害を導入すること、および発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、または前記内皮遺伝子に機能喪失型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明１～４のいずれか一つに記載の方法。
［発明６］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、有効なレベルおよび期間、Ｄｎｍｔ３ｂの発現または活性を増大させることによって行われる、発明１～３のいずれか一つに記載の方法。
［発明７］
Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、および前記Ｄｎｍｔ３ｂ遺伝子に発現エレメントの遺伝子修飾または機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明６に記載の方法。
［発明８］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、有効なレベルおよび期間、Ｇｉｍａｐ６の発現または活性を増大させることによって行われる、発明１～３のいずれか一つに記載の方法。
［発明９］
Ｇｉｍａｐ６の前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、およびＧｉｍａｐ６遺伝子に発現エレメントの遺伝子修飾または機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明８に記載の方法。
［発明１０］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、前記内皮細胞またはＨＥ細胞を２Ｄまたは３Ｄの繰り返しひずみ、有効な濃度および期間のピエゾ１のアゴニスト、またはその組合せと接触させることによって行われる、発明１～３のいずれか一つに記載の方法。
［発明１１］
前記ピエゾ１アゴニストが、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１、および／またはＪｅｄｉ２である、発明１０に記載の方法。
［発明１２］
前記ピエゾ１アゴニストの有効量が、０．１から５００μＭの範囲、または０．１から１００μＭの範囲にある、発明１１に記載の方法。
［発明１３］
前記ピエゾ１のアゴニストが、候補化合物との接触時の、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される内皮遺伝子の発現または活性の低下、および前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性の増大に基づいて、化学ライブラリーにおいて同定される、発明１０に記載の方法。
［発明１４］
胚様体、内皮細胞、造血性内皮（ＨＥ）細胞、またはその組合せを含む集団をバイオリアクターに提供することを含む、発明１～１３のいずれか一つに記載の方法。
［発明１５］
前記バイオリアクターが、繰り返しひずみによる生体力学的伸展、有効な濃度および期間のピエゾ１のアゴニストまたはその組合せを提供する、発明１４に記載の方法。
［発明１６］
前記繰り返しひずみによる生体力学的伸展が、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される３つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現または活性を低下させ、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させて、前記ＨＳＣの形成および場合によって増殖を刺激する、発明１５に記載の方法。
［発明１７］
前記ＨＳＣが造血ニッチにおいて生着し、機能的な多細胞系成人血液を再構成する、発明１～１６のいずれか一つに記載の方法。
［発明１８］
ＨＥ細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非造血幹細胞、体細胞、または内皮細胞から得られる、発明１～１７のいずれか一つに記載の方法。
［発明１９］
前記造血幹細胞が、少なくとも１％の長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）または少なくとも５％のＬＴ－ＨＳＣを含む、発明１～１８のいずれか一つに記載の方法。
［発明２０］
前記造血幹細胞が、少なくとも０．１％の長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、発明１９に記載の方法。
［発明２１］
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞がＨＬＡ修飾細胞もしくはＨＬＡヌル細胞、および／または導入遺伝子フリー細胞、遺伝子修正細胞、導入遺伝子過剰発現細胞に由来し、場合によってｉＰＳ細胞または体細胞の遺伝的または化学的誘導によって導出される、発明１～２０のいずれか一つに記載の方法。
［発明２２］
源細胞が、対象、細胞の既製ライブラリーから得られるか、またはこれに由来し、前記対象が場合によって万能適合ドナーである、発明１～２１のいずれか一つに記載の方法。
［発明２３］
前記源細胞が、血液疾患、骨髄疾患、リソソーム蓄積疾患、ミトコンドリア疾患、代謝疾患または免疫疾患を有する対象から得られるか、またはそれに由来する、発明２２に記載の方法。
［発明２４］
前記対象が血液または非血液悪性腫瘍を有していない、発明２３に記載の方法。
［発明２５］
前記ＨＳＣを回収すること、および場合によって増殖させることをさらに含む、発明１～２４のいずれか一つに記載の方法。
［発明２６］
前記ＨＳＣの集団がレシピエントに投与され、前記レシピエントが場合によってドナー対象である、発明２５に記載の方法。
［発明２７］
少なくとも約１０ ２ 個のＨＳＣが投与される、発明２６に記載の方法。
［発明２８］
少なくとも約１０ ３ 個のＨＳＣが投与される、発明２６に記載の方法。
［発明２９］
少なくとも約１０ ４ 個のＨＳＣが投与される、発明２６に記載の方法。
［発明３０］
少なくとも約１０ ５ 個のＨＳＣが投与される、発明２６に記載の方法。
［発明３１］
細胞集団を造血内皮（ＨＥ）細胞に転換する方法であって、
胚様体または内皮細胞を含む集団を提供し、
前記細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される１つまたは複数の内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、および前記細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させること、
２Ｄまたは３Ｄの繰り返しひずみを適用すること、および
前記細胞を有効な濃度および期間、ピエゾ１のアゴニストと接触させること
の１つまたは複数から選択される遺伝的、薬理学的、および／または機械的刺激を提供して、前記細胞をＨＥ細胞に転換すること
を含む、前記方法。
［発明３２］
前記造血遺伝子の活性または発現の前記増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、および前記造血遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明３１に記載の方法。
［発明３３］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下が、完全または部分的な遺伝子欠失、ＲＮＡサイレンシング、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害、薬理学的阻害を導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、および前記内皮遺伝子に機能喪失型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明３１に記載の方法。
［発明３４］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、有効なレベルおよび期間、Ｄｎｍｔ３ｂの発現または活性を増大させることによって行われる、発明３３または３３に記載の方法。
［発明３５］
Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、およびＤｎｍｔ３ｂ遺伝子に機能獲得型突然変異を取り込むことの１つまたは複数を含む、発明３４に記載の方法。
［発明３６］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、有効なレベルおよび期間、Ｇｉｍａｐ６の前記発現または活性を増大させることによって行われる、発明３２～３５のいずれか一つに記載の方法。
［発明３７］
Ｇｉｍａｐ６の前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、およびＧｉｍａｐ６遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明３６に記載の方法。
［発明３８］
前記細胞を、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１および／またはＪｅｄｉ２から選択される有効量のピエゾ１アゴニストと接触させる、発明３１に記載の方法。
［発明３９］
前記ピエゾ１アゴニストの有効量が、０．１から５００ｕＭの範囲、または０．１から１００μＭの範囲にある、発明３８に記載の方法。
［発明４０］
前記集団をバイオリアクターに提供することを含み、前記バイオリアクターが繰り返しひずみによる生体力学的伸展を提供する、発明３１から３９のいずれか一つに記載の方法。
［発明４１］
場合によって前記遺伝的、薬理学的、および／または機械的刺激を適用することによって、前記ＨＥ細胞が回収されるか、またはＨＳＣに転換される、発明４０に記載の方法。
［発明４２］
前記ＨＥ細胞が、造血ニッチにおいて生着し、機能的な多細胞系成人血液を再構成するＨＳＣに転換される、発明４１に記載の方法。
［発明４３］
胚様体または内皮細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、発明３１～４２のいずれか一つに記載の方法。
［発明４４］
前記内皮細胞が非造血幹細胞に由来する、発明３１～４２のいずれか一つに記載の方法。
［発明４５］
前記ＨＥ細胞が長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む造血幹細胞に転換される、発明３１～４４のいずれか一つに記載の方法。
［発明４６］
前記細胞集団が、ＨＬＡ修飾細胞またはＨＬＡヌル細胞に由来する、発明３１～４５のいずれか一つに記載の方法。
［発明４７］
前記細胞集団が導入遺伝子フリー細胞である、発明３１～４５のいずれか一つに記載の方法。
［発明４８］
前記遺伝的、薬理学的および／または機械的刺激を前記ＨＳＣ細胞に適用することを含むプロセスにおいて前記ＨＳＣを増殖させることをさらに含む、発明３１～４７のいずれか一つに記載の方法。
［発明４９］
前記ＨＳＣがレシピエントに投与され、前記レシピエントが場合によってドナー対象である、発明４８に記載の方法。
［発明５０］
造血幹細胞（ＨＳＣ）の集団を増殖させる方法であって、
ＨＳＣ集団を提供し、
前記細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される１つまたは複数の内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、および前記細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させること、
２Ｄまたは３Ｄの繰り返しひずみを適用すること、および
前記細胞を有効な濃度および期間、ピエゾ１のアゴニストと接触させること
の１つまたは複数から選択される遺伝的、薬理学的および／または機械的刺激を提供して、ＨＳＣを増殖させること
を含む、前記方法。
［発明５１］
前記造血遺伝子の活性または発現の前記増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、および前記造血遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明５０に記載の方法。
［発明５２］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下が、完全または部分的な遺伝子欠失、ＲＮＡサイレンシング、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害、薬理学的阻害を導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、および前記内皮遺伝子に５３喪失型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明５１に記載の方法。
［発明５３］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が有効なレベルおよび期間、Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現または活性を増大させることによって行われる、発明５１または５２に記載の方法。
［発明５４］
Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、およびＤｎｍｔ３ｂ遺伝子に機能獲得型突然変異を取り込むことの１つまたは複数を含む、発明５３に記載の方法。
［発明５５］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、有効なレベルおよび期間、Ｇｉｍａｐ６の前記発現または活性を増大させることによって行われる、発明５０～５４のいずれか一つに記載の方法。
［発明５６］
Ｇｉｍａｐ６の前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、およびＧｉｍａｐ６遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明５５に記載の方法。
［発明５７］
前記細胞を、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１および／またはＪｅｄｉ２から選択される有効量のピエゾ１アゴニストと接触させる、発明５０に記載の方法。
［発明５８］
前記ピエゾ１アゴニストの有効量が、０．１から５００ｕＭの範囲、または０．１から１００μＭの範囲にある、発明５７に記載の方法。
［発明５９］
前記集団をバイオリアクターに提供することを含み、前記バイオリアクターが繰り返しひずみによる生体力学的伸展を提供する、発明５０～５８のいずれか一つに記載の方法。
［発明６０］
前記ＨＳＣが造血ニッチにおいて生着し、機能的な多細胞系成人血液を再構成する、発明５９に記載の方法。
［発明６１］
前記ＨＳＣが、内皮細胞またはＨＥ細胞から転換される、発明５０～６０のいずれか一つに記載の方法。
［発明６２］
前記ＨＳＣが長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、発明５０～６１のいずれか一つに記載の方法。
［発明６３］
前記ＨＳＣ集団が、ＨＬＡ修飾細胞またはＨＬＡヌル細胞に由来する、発明５０～６２のいずれか一つに記載の方法。
［発明６４］
前記細胞集団が導入遺伝子フリー細胞である、発明６３に記載の方法。
［発明６５］
発明１から６４のいずれか一つに記載の方法によって調製されたＨＳＣの集団、および薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物。
［発明６６］
少なくとも１０ 4 個のＬＴ－ＨＳＣ細胞を含む、発明６５に記載の医薬組成物。
［発明６７］
造血幹細胞療法または移植を必要とする対象を処置する方法であって、治療有効量の、発明１から６４のいずれか一つに記載の方法によって調製された造血幹細胞（ＨＳＣ）を前記対象に投与すること、または発明６５もしくは６６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
［発明６８］
前記対象が、悪性形態のまたは非悪性形態の血液疾患、骨髄疾患、リソソーム蓄積疾患、ミトコンドリア疾患、代謝性疾患、または免疫疾患を有する、発明６７に記載の方法。
［発明６９］
前記対象が、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性障害、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、神経芽細胞腫、胚細胞腫瘍、またはアミロイドーシスから選択される状態を有する、発明６７または６８に記載の方法。
［発明７０］
前記対象が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または全身性硬化症などの自己免疫障害、再生不良性貧血、純赤血球無形成症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコニ貧血、サラセミアメジャー、鎌状赤血球性貧血、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、ウィスコット・オルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球症、先天性代謝異常、表皮水疱症、重症先天性好中球減少症、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ピアソン症候群および白血球接着不全症から選択される状態を有する、発明６９に記載の方法。
［発明７１］
造血幹細胞（ＨＳＣ）を作製する方法であって、
化学化合物のパネルを胚様体、内皮細胞および／または造血性内皮細胞と接触させ、前記化学化合物によって誘導されるＤｎｍｔ３ｂまたはＧｉｍａｐ６；ｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６、およびａｐｌｎの少なくとも２つ；およびｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３の少なくとも２つの発現レベルの変化を決定すること；
遺伝子発現の以下の変化：
Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の発現の増大、
ｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎの２つまたはそれ以上の発現の低下；および
ｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３の２つまたはそれ以上の発現の増大
を誘導する化合物を選択すること；ならびに
内皮細胞および／または造血性内皮細胞のＨＳＣへの転換を、前記選択された化合物を内皮細胞および／または造血性内皮細胞と接触させることによって誘導し、それによって生着し多細胞系成人血液を再構成することができる自己再生ＨＳＣを作製すること
を含む、前記方法。
［発明７２］
前記選択された化合物が、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される５つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現を低下させ、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される５つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現を増大させて、前記ＨＥ細胞、ＨＳＣまたはその組合せの形成および場合によって増殖を刺激する、発明７１に記載の方法。
［発明７３］
前記選択された化合物が、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｃｄｈ５およびｐｌｘｎｄ１の発現を低下させ、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１およびｇａｔａ２の発現を増大させる、発明７２に記載の方法。
［発明７４］
前記選択された化合物が、Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現を増大させる、発明７１～７３のいずれか一つに記載の方法。
［発明７５］
前記選択された化合物が、ピエゾ１アゴニストである、発明７１～７３のいずれか一つに記載の方法。
［発明７６］
前記選択された化合物が、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１および／またはＪｅｄｉ２の誘導体である、発明７４に記載の方法。
［発明７７］
胚様体、内皮細胞またはＨＥ細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非造血幹細胞、体細胞、または内皮細胞から得られる、発明７１～７６のいずれか一つに記載の方法。
［発明７８］
得られた前記造血幹細胞が、少なくとも０．１％の長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、発明７１～７６のいずれか一つに記載の方法。
［発明７９］
得られた前記造血幹細胞が、少なくとも約１％または少なくとも約１０％の長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、発明７８に記載の方法。
［発明８０］
得られた前記造血幹細胞が、約２％から約２５％のＬＴ－ＨＳＣを含む、発明７８に記載の方法。
［発明８１］
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞が、ＨＬＡ修飾細胞またはＨＬＡヌル細胞、導入遺伝子過剰発現細胞および／または導入遺伝子フリー細胞に由来し、場合によってｉＰＳ細胞または体細胞の遺伝的または化学的誘導によって導出される、発明７１～８０のいずれか一つに記載の方法。
［発明８２］
源細胞が、対象から得られるか、またはこれに由来し、前記対象が、場合によって患者、適合もしくは非適合ドナー、または万能適合ドナーである、発明７１～８１のいずれか一つに記載の方法。
［発明８３］
前記ＨＳＣを回収することをさらに含む、発明７１～８２のいずれか一つに記載の方法。
［発明８４］
本開示に従って生産され、少なくとも約１０ ３ 個または少なくとも約１０ ４ 個のＬＴ－ＨＳＣ細胞を含む、細胞療法のための組成物。
データは、別段の記載がない限り、平均±平均の標準誤差（平均±ＳＥＭ）として表されている。統計分析は、対応のあるまたは対応のないスチューデントｔ検定によって行った。有意性は、Ｐ＜０．０５で設定された。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載の発明を列挙する。
［発明１］
長期（ＬＴ）－造血幹細胞（ＨＳＣ）を含むＨＳＣの集団を調製する方法であって、
内皮細胞および／または造血性内皮（ＨＥ）細胞を含む集団を提供すること、
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される２つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、ならびに
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させて、ＬＴ－ＨＳＣを含む前記ＨＳＣの形成を刺激すること
を含む、前記方法。
［発明２］
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される３つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、ならびに前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される３つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させて、前記ＨＳＣの形成および場合によって増殖を刺激することを含む、発明１に記載の方法。
［発明３］
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｃｄｈ５およびｐｌｘｎｄ１の発現または活性を低下させること、ならびに前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１およびｇａｔａ２の発現または活性を増大させることによって、前記ＨＳＣの形成および場合によって増殖を刺激することを含む、発明１に記載の方法。
［発明４］
前記造血遺伝子の活性または発現の前記増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、および発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、または前記造血遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明１～３のいずれか一つに記載の方法。
［発明５］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下が、完全または部分的な遺伝子欠失、ＲＮＡサイレンシング、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害、薬理学的阻害を導入すること、および発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、または前記内皮遺伝子に機能喪失型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明１～４のいずれか一つに記載の方法。
［発明６］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、有効なレベルおよび期間、Ｄｎｍｔ３ｂの発現または活性を増大させることによって行われる、発明１～３のいずれか一つに記載の方法。
［発明７］
Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、および前記Ｄｎｍｔ３ｂ遺伝子に発現エレメントの遺伝子修飾または機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明６に記載の方法。
［発明８］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、有効なレベルおよび期間、Ｇｉｍａｐ６の発現または活性を増大させることによって行われる、発明１～３のいずれか一つに記載の方法。
［発明９］
Ｇｉｍａｐ６の前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、およびＧｉｍａｐ６遺伝子に発現エレメントの遺伝子修飾または機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明８に記載の方法。
［発明１０］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、前記内皮細胞またはＨＥ細胞を２Ｄまたは３Ｄの繰り返しひずみ、有効な濃度および期間のピエゾ１のアゴニスト、またはその組合せと接触させることによって行われる、発明１～３のいずれか一つに記載の方法。
［発明１１］
前記ピエゾ１アゴニストが、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１、および／またはＪｅｄｉ２である、発明１０に記載の方法。
［発明１２］
前記ピエゾ１アゴニストの有効量が、０．１から５００μＭの範囲、または０．１から１００μＭの範囲にある、発明１１に記載の方法。
［発明１３］
前記ピエゾ１のアゴニストが、候補化合物との接触時の、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される内皮遺伝子の発現または活性の低下、および前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性の増大に基づいて、化学ライブラリーにおいて同定される、発明１０に記載の方法。
［発明１４］
胚様体、内皮細胞、造血性内皮（ＨＥ）細胞、またはその組合せを含む集団をバイオリアクターに提供することを含む、発明１～１３のいずれか一つに記載の方法。
［発明１５］
前記バイオリアクターが、繰り返しひずみによる生体力学的伸展、有効な濃度および期間のピエゾ１のアゴニストまたはその組合せを提供する、発明１４に記載の方法。
［発明１６］
前記繰り返しひずみによる生体力学的伸展が、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される３つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現または活性を低下させ、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させて、前記ＨＳＣの形成および場合によって増殖を刺激する、発明１５に記載の方法。
［発明１７］
前記ＨＳＣが造血ニッチにおいて生着し、機能的な多細胞系成人血液を再構成する、発明１～１６のいずれか一つに記載の方法。
［発明１８］
ＨＥ細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非造血幹細胞、体細胞、または内皮細胞から得られる、発明１～１７のいずれか一つに記載の方法。
［発明１９］
前記造血幹細胞が、少なくとも１％の長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）または少なくとも５％のＬＴ－ＨＳＣを含む、発明１～１８のいずれか一つに記載の方法。
［発明２０］
前記造血幹細胞が、少なくとも０．１％の長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、発明１９に記載の方法。
［発明２１］
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞がＨＬＡ修飾細胞もしくはＨＬＡヌル細胞、および／または導入遺伝子フリー細胞、遺伝子修正細胞、導入遺伝子過剰発現細胞に由来し、場合によってｉＰＳ細胞または体細胞の遺伝的または化学的誘導によって導出される、発明１～２０のいずれか一つに記載の方法。
［発明２２］
源細胞が、対象、細胞の既製ライブラリーから得られるか、またはこれに由来し、前記対象が場合によって万能適合ドナーである、発明１～２１のいずれか一つに記載の方法。
［発明２３］
前記源細胞が、血液疾患、骨髄疾患、リソソーム蓄積疾患、ミトコンドリア疾患、代謝疾患または免疫疾患を有する対象から得られるか、またはそれに由来する、発明２２に記載の方法。
［発明２４］
前記対象が血液または非血液悪性腫瘍を有していない、発明２３に記載の方法。
［発明２５］
前記ＨＳＣを回収すること、および場合によって増殖させることをさらに含む、発明１～２４のいずれか一つに記載の方法。
［発明２６］
前記ＨＳＣの集団がレシピエントに投与され、前記レシピエントが場合によってドナー対象である、発明２５に記載の方法。
［発明２７］
少なくとも約１０ ２ 個のＨＳＣが投与される、発明２６に記載の方法。
［発明２８］
少なくとも約１０ ３ 個のＨＳＣが投与される、発明２６に記載の方法。
［発明２９］
少なくとも約１０ ４ 個のＨＳＣが投与される、発明２６に記載の方法。
［発明３０］
少なくとも約１０ ５ 個のＨＳＣが投与される、発明２６に記載の方法。
［発明３１］
細胞集団を造血内皮（ＨＥ）細胞に転換する方法であって、
胚様体または内皮細胞を含む集団を提供し、
前記細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される１つまたは複数の内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、および前記細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させること、
２Ｄまたは３Ｄの繰り返しひずみを適用すること、および
前記細胞を有効な濃度および期間、ピエゾ１のアゴニストと接触させること
の１つまたは複数から選択される遺伝的、薬理学的、および／または機械的刺激を提供して、前記細胞をＨＥ細胞に転換すること
を含む、前記方法。
［発明３２］
前記造血遺伝子の活性または発現の前記増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、および前記造血遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明３１に記載の方法。
［発明３３］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下が、完全または部分的な遺伝子欠失、ＲＮＡサイレンシング、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害、薬理学的阻害を導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、および前記内皮遺伝子に機能喪失型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明３１に記載の方法。
［発明３４］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、有効なレベルおよび期間、Ｄｎｍｔ３ｂの発現または活性を増大させることによって行われる、発明３３または３３に記載の方法。
［発明３５］
Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、およびＤｎｍｔ３ｂ遺伝子に機能獲得型突然変異を取り込むことの１つまたは複数を含む、発明３４に記載の方法。
［発明３６］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、有効なレベルおよび期間、Ｇｉｍａｐ６の前記発現または活性を増大させることによって行われる、発明３２～３５のいずれか一つに記載の方法。
［発明３７］
Ｇｉｍａｐ６の前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、およびＧｉｍａｐ６遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明３６に記載の方法。
［発明３８］
前記細胞を、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１および／またはＪｅｄｉ２から選択される有効量のピエゾ１アゴニストと接触させる、発明３１に記載の方法。
［発明３９］
前記ピエゾ１アゴニストの有効量が、０．１から５００ｕＭの範囲、または０．１から１００μＭの範囲にある、発明３８に記載の方法。
［発明４０］
前記集団をバイオリアクターに提供することを含み、前記バイオリアクターが繰り返しひずみによる生体力学的伸展を提供する、発明３１から３９のいずれか一つに記載の方法。
［発明４１］
場合によって前記遺伝的、薬理学的、および／または機械的刺激を適用することによって、前記ＨＥ細胞が回収されるか、またはＨＳＣに転換される、発明４０に記載の方法。
［発明４２］
前記ＨＥ細胞が、造血ニッチにおいて生着し、機能的な多細胞系成人血液を再構成するＨＳＣに転換される、発明４１に記載の方法。
［発明４３］
胚様体または内皮細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、発明３１～４２のいずれか一つに記載の方法。
［発明４４］
前記内皮細胞が非造血幹細胞に由来する、発明３１～４２のいずれか一つに記載の方法。
［発明４５］
前記ＨＥ細胞が長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む造血幹細胞に転換される、発明３１～４４のいずれか一つに記載の方法。
［発明４６］
前記細胞集団が、ＨＬＡ修飾細胞またはＨＬＡヌル細胞に由来する、発明３１～４５のいずれか一つに記載の方法。
［発明４７］
前記細胞集団が導入遺伝子フリー細胞である、発明３１～４５のいずれか一つに記載の方法。
［発明４８］
前記遺伝的、薬理学的および／または機械的刺激を前記ＨＳＣ細胞に適用することを含むプロセスにおいて前記ＨＳＣを増殖させることをさらに含む、発明３１～４７のいずれか一つに記載の方法。
［発明４９］
前記ＨＳＣがレシピエントに投与され、前記レシピエントが場合によってドナー対象である、発明４８に記載の方法。
［発明５０］
造血幹細胞（ＨＳＣ）の集団を増殖させる方法であって、
ＨＳＣ集団を提供し、
前記細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される１つまたは複数の内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、および前記細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させること、
２Ｄまたは３Ｄの繰り返しひずみを適用すること、および
前記細胞を有効な濃度および期間、ピエゾ１のアゴニストと接触させること
の１つまたは複数から選択される遺伝的、薬理学的および／または機械的刺激を提供して、ＨＳＣを増殖させること
を含む、前記方法。
［発明５１］
前記造血遺伝子の活性または発現の前記増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、および前記造血遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明５０に記載の方法。
［発明５２］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下が、完全または部分的な遺伝子欠失、ＲＮＡサイレンシング、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害、薬理学的阻害を導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、および前記内皮遺伝子に５３喪失型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明５１に記載の方法。
［発明５３］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が有効なレベルおよび期間、Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現または活性を増大させることによって行われる、発明５１または５２に記載の方法。
［発明５４］
Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、およびＤｎｍｔ３ｂ遺伝子に機能獲得型突然変異を取り込むことの１つまたは複数を含む、発明５３に記載の方法。
［発明５５］
内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が、有効なレベルおよび期間、Ｇｉｍａｐ６の前記発現または活性を増大させることによって行われる、発明５０～５４のいずれか一つに記載の方法。
［発明５６］
Ｇｉｍａｐ６の前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、およびＧｉｍａｐ６遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、発明５５に記載の方法。
［発明５７］
前記細胞を、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１および／またはＪｅｄｉ２から選択される有効量のピエゾ１アゴニストと接触させる、発明５０に記載の方法。
［発明５８］
前記ピエゾ１アゴニストの有効量が、０．１から５００ｕＭの範囲、または０．１から１００μＭの範囲にある、発明５７に記載の方法。
［発明５９］
前記集団をバイオリアクターに提供することを含み、前記バイオリアクターが繰り返しひずみによる生体力学的伸展を提供する、発明５０～５８のいずれか一つに記載の方法。
［発明６０］
前記ＨＳＣが造血ニッチにおいて生着し、機能的な多細胞系成人血液を再構成する、発明５９に記載の方法。
［発明６１］
前記ＨＳＣが、内皮細胞またはＨＥ細胞から転換される、発明５０～６０のいずれか一つに記載の方法。
［発明６２］
前記ＨＳＣが長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、発明５０～６１のいずれか一つに記載の方法。
［発明６３］
前記ＨＳＣ集団が、ＨＬＡ修飾細胞またはＨＬＡヌル細胞に由来する、発明５０～６２のいずれか一つに記載の方法。
［発明６４］
前記細胞集団が導入遺伝子フリー細胞である、発明６３に記載の方法。
［発明６５］
発明１から６４のいずれか一つに記載の方法によって調製されたＨＳＣの集団、および薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物。
［発明６６］
少なくとも１０ 4 個のＬＴ－ＨＳＣ細胞を含む、発明６５に記載の医薬組成物。
［発明６７］
造血幹細胞療法または移植を必要とする対象を処置する方法であって、治療有効量の、発明１から６４のいずれか一つに記載の方法によって調製された造血幹細胞（ＨＳＣ）を前記対象に投与すること、または発明６５もしくは６６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
［発明６８］
前記対象が、悪性形態のまたは非悪性形態の血液疾患、骨髄疾患、リソソーム蓄積疾患、ミトコンドリア疾患、代謝性疾患、または免疫疾患を有する、発明６７に記載の方法。
［発明６９］
前記対象が、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性障害、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、神経芽細胞腫、胚細胞腫瘍、またはアミロイドーシスから選択される状態を有する、発明６７または６８に記載の方法。
［発明７０］
前記対象が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または全身性硬化症などの自己免疫障害、再生不良性貧血、純赤血球無形成症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコニ貧血、サラセミアメジャー、鎌状赤血球性貧血、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、ウィスコット・オルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球症、先天性代謝異常、表皮水疱症、重症先天性好中球減少症、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ピアソン症候群および白血球接着不全症から選択される状態を有する、発明６９に記載の方法。
［発明７１］
造血幹細胞（ＨＳＣ）を作製する方法であって、
化学化合物のパネルを胚様体、内皮細胞および／または造血性内皮細胞と接触させ、前記化学化合物によって誘導されるＤｎｍｔ３ｂまたはＧｉｍａｐ６；ｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６、およびａｐｌｎの少なくとも２つ；およびｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３の少なくとも２つの発現レベルの変化を決定すること；
遺伝子発現の以下の変化：
Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の発現の増大、
ｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎの２つまたはそれ以上の発現の低下；および
ｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３の２つまたはそれ以上の発現の増大
を誘導する化合物を選択すること；ならびに
内皮細胞および／または造血性内皮細胞のＨＳＣへの転換を、前記選択された化合物を内皮細胞および／または造血性内皮細胞と接触させることによって誘導し、それによって生着し多細胞系成人血液を再構成することができる自己再生ＨＳＣを作製すること
を含む、前記方法。
［発明７２］
前記選択された化合物が、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される５つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現を低下させ、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される５つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現を増大させて、前記ＨＥ細胞、ＨＳＣまたはその組合せの形成および場合によって増殖を刺激する、発明７１に記載の方法。
［発明７３］
前記選択された化合物が、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｃｄｈ５およびｐｌｘｎｄ１の発現を低下させ、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１およびｇａｔａ２の発現を増大させる、発明７２に記載の方法。
［発明７４］
前記選択された化合物が、Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現を増大させる、発明７１～７３のいずれか一つに記載の方法。
［発明７５］
前記選択された化合物が、ピエゾ１アゴニストである、発明７１～７３のいずれか一つに記載の方法。
［発明７６］
前記選択された化合物が、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１および／またはＪｅｄｉ２の誘導体である、発明７４に記載の方法。
［発明７７］
胚様体、内皮細胞またはＨＥ細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非造血幹細胞、体細胞、または内皮細胞から得られる、発明７１～７６のいずれか一つに記載の方法。
［発明７８］
得られた前記造血幹細胞が、少なくとも０．１％の長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、発明７１～７６のいずれか一つに記載の方法。
［発明７９］
得られた前記造血幹細胞が、少なくとも約１％または少なくとも約１０％の長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、発明７８に記載の方法。
［発明８０］
得られた前記造血幹細胞が、約２％から約２５％のＬＴ－ＨＳＣを含む、発明７８に記載の方法。
［発明８１］
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞が、ＨＬＡ修飾細胞またはＨＬＡヌル細胞、導入遺伝子過剰発現細胞および／または導入遺伝子フリー細胞に由来し、場合によってｉＰＳ細胞または体細胞の遺伝的または化学的誘導によって導出される、発明７１～８０のいずれか一つに記載の方法。
［発明８２］
源細胞が、対象から得られるか、またはこれに由来し、前記対象が、場合によって患者、適合もしくは非適合ドナー、または万能適合ドナーである、発明７１～８１のいずれか一つに記載の方法。
［発明８３］
前記ＨＳＣを回収することをさらに含む、発明７１～８２のいずれか一つに記載の方法。
［発明８４］
本開示に従って生産され、少なくとも約１０ ３ 個または少なくとも約１０ ４ 個のＬＴ－ＨＳＣ細胞を含む、細胞療法のための組成物。
Claims (26)
- 造血幹細胞（ＨＳＣ）の集団を増殖させる方法であって、
ＨＳＣ集団を提供し、
前記細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される１つまたは複数の内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、および前記細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させること、
２Ｄまたは３Ｄの繰り返しひずみを適用すること、および
前記細胞を有効な濃度および期間、ピエゾ１のアゴニストと接触させること
の１つまたは複数から選択される遺伝的、薬理学的および／または機械的刺激を提供して、ＨＳＣを増殖させること
を含む、前記方法。 - 前記造血遺伝子の活性または発現の前記増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、および前記造血遺伝子に機能獲得型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
- 内皮遺伝子の発現または活性の前記低下が、完全または部分的な遺伝子欠失、ＲＮＡサイレンシング、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害、薬理学的阻害を導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、および前記内皮遺伝子に５３喪失型突然変異を導入することの１つまたは複数を含む、請求項２に記載の方法。
- 内皮遺伝子の発現または活性の前記低下および造血遺伝子の発現または活性の前記増大が有効なレベルおよび期間、Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現または活性を増大させることによって行われる、請求項２または３に記載の方法。
- Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現または活性の増大が、コードｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ誘導体を導入すること、コード導入遺伝子またはエピソームを導入すること、発現エレメントの遺伝子修飾を導入すること、およびＤｎｍｔ３ｂ遺伝子に機能獲得型突然変異を取り込むことの１つまたは複数を含む、請求項４に記載の方法。
- 前記細胞を、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１および／またはＪｅｄｉ２から選択される有効量のピエゾ１アゴニストと接触させる、請求項１に記載の方法。
- 前記ピエゾ１アゴニストの有効量が、０．１から５００ｕＭの範囲、または０．１から１００μＭの範囲にある、請求項６に記載の方法。
- 前記集団をバイオリアクターに提供することを含み、前記バイオリアクターが繰り返しひずみによる生体力学的伸展を提供する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨＳＣが、内皮細胞またはＨＥ細胞から転換される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団が、ＨＬＡ修飾細胞に由来し、かつ、導入遺伝子フリー細胞である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法によって調製されたＨＳＣの集団、および薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物。
- 少なくとも１０4個のＬＴ－ＨＳＣ細胞を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
- 造血幹細胞療法または移植を必要とする対象を処置する方法であって、治療有効量の、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法によって調製された造血幹細胞（ＨＳＣ）を前記対象に投与すること、または請求項１１もしくは１２に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記対象が、悪性形態のまたは非悪性形態の血液疾患、骨髄疾患、リソソーム蓄積疾患、ミトコンドリア疾患、代謝性疾患、または免疫疾患を有する、請求項１３に記載の方法。
- 前記対象が、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性障害、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、神経芽細胞腫、胚細胞腫瘍、またはアミロイドーシスから選択される状態を有する、請求項１３または１４に記載の方法。
- 前記対象が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または全身性硬化症などの自己免疫障害、再生不良性貧血、純赤血球無形成症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコニ貧血、サラセミアメジャー、鎌状赤血球性貧血、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、ウィスコット・オルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球症、先天性代謝異常、表皮水疱症、重症先天性好中球減少症、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ピアソン症候群および白血球接着不全症から選択される状態を有する、請求項１５に記載の方法。
- 造血幹細胞（ＨＳＣ）を作製する方法であって、
化学化合物のパネルを胚様体、内皮細胞および／または造血性内皮細胞と接触させ、前記化学化合物によって誘導されるＤｎｍｔ３ｂまたはＧｉｍａｐ６；ｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６、およびａｐｌｎの少なくとも２つ；およびｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３の少なくとも２つの発現レベルの変化を決定すること；
遺伝子発現の以下の変化：
Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の発現の増大、
ｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎの２つまたはそれ以上の発現の低下；および
ｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３の２つまたはそれ以上の発現の増大
を誘導する化合物を選択すること；ならびに
内皮細胞および／または造血性内皮細胞のＨＳＣへの転換を、前記選択された化合物を内皮細胞および／または造血性内皮細胞と接触させることによって誘導し、それによって生着し多細胞系成人血液を再構成することができる自己再生ＨＳＣを作製すること
を含む、前記方法。 - 前記選択された化合物が、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される５つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現を低下させ、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される５つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現を増大させて、前記ＨＥ細胞、ＨＳＣまたはその組合せの形成および場合によって増殖を刺激する、請求項１７に記載の方法。
- 前記選択された化合物が、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｃｄｈ５およびｐｌｘｎｄ１の発現を低下させ、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１およびｇａｔａ２の発現を増大させる、請求項１８に記載の方法。
- 前記選択された化合物が、Ｄｎｍｔ３ｂの前記発現を増大させる、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択された化合物が、ピエゾ１アゴニストである、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択された化合物が、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１および／またはＪｅｄｉ２の誘導体である、請求項２０に記載の方法。
- 胚様体、内皮細胞またはＨＥ細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非造血幹細胞、体細胞、または内皮細胞から得られる、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 得られた前記造血幹細胞が、少なくとも０．１％の長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 長期（ＬＴ）－造血幹細胞（ＨＳＣ）を含むＨＳＣの集団を調製する方法であって、
内皮細胞および／または造血性内皮（ＨＥ）細胞を含む集団を提供すること、
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される２つまたはそれ以上の内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、ならびに
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させて、ＬＴ－ＨＳＣを含む前記ＨＳＣの形成を刺激すること
を含む、前記方法。 - 細胞集団を造血内皮（ＨＥ）細胞に転換する方法であって、
胚様体または内皮細胞を含む集団を提供し、
前記細胞におけるｖｅｇｆａ、ｈｅｙ２、ｇｒｐ１１６、ｇｎａ１３、ｓｏｘ１７、ｃｄｈ５、ｐｌｘｎｄ１、ｂｃｌ６およびａｐｌｎから選択される１つまたは複数の内皮遺伝子の発現または活性を低下させること、および前記細胞におけるｒｕｎｘ１、ｓｐｉ１、ｃｅｂｐａ、ｔａｌ１、ｇｆｉ１、ｇａｔａ２およびｍｌｌｔ３から選択される２つまたはそれ以上の造血遺伝子の発現または活性を増大させること、
２Ｄまたは３Ｄの繰り返しひずみを適用すること、および
前記細胞を有効な濃度および期間、ピエゾ１のアゴニストと接触させること
の１つまたは複数から選択される遺伝的、薬理学的、および／または機械的刺激を提供して、前記細胞をＨＥ細胞に転換すること
を含む、前記方法。
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