ES2951488T3 - Métodos para generar células madre hematopoyéticas funcionales - Google Patents
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Abstract
Se describen métodos para preparar poblaciones de células madre hematopoyéticas (HSC), por ejemplo, HSC autólogas y/o alogénicas, usando estiramiento mecánico o agonistas del miembro 4 vanilloide de la subfamilia del canal catiónico potencial del receptor transitorio (Trpv4), y métodos de uso de las HSC en trasplante. proporcionó. Específicamente, los métodos comprenden proporcionar una población de células que comprende células endoteliales (HE) hemogénicas, poner en contacto las células HE con una cantidad de un agonista de Trpv4; y/o someter las células a un estiramiento bidimensional cíclico, durante un tiempo y en condiciones suficientes para estimular la transición endotelial a HSC. Además se describen métodos para tratar trastornos hematológicos, metabólicos o inmunes malignos o no malignos que comprenden administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de HSC obtenidas mediante los métodos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos para generar células madre hematopoyéticas funcionales
Reivindicación de prioridad
La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos con los números de serie 62/262.464, presentada el 3 de diciembre de 2015, y 62/332.853, presentada el 6 de mayo de 2015.
Investigación o desarrollo financiado con fondos federales
Esta invención se realizó con la ayuda del Gobierno en virtud de la Subvención n.° 5K01DK085217, 2R03DK100672 y 5R01HL131645 concedida por National Institutes of Health. El Gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.
Campo técnico
En el presente documento se describen métodos para preparar poblaciones de células madre hematopoyéticas (HSC), por ejemplo, HSC autólogas y/o alogénicas, utilizando estiramiento mecánico o agonistas de Trpv4, y métodos de uso de las HSC en el trasplante.
Antecedentes
El trasplante de HSC se utiliza generalmente para tratar pacientes con enfermedades de la sangre, la médula ósea, metabólicas e inmunitarias (1-5). A pesar de los avances en el trasplante de células madre del cordón umbilical y haploidéntico, el uso terapéutico del trasplante de HSC a menudo está limitado por la dificultad para encontrar donantes con un antígeno leucocitario humano (HLA) compatible en el momento oportuno, sobre todo en países con minorías étnicas y que carecen de registros nacionales de donantes no emparentados (6-9). Aunque las personas mestizas representan el 1,6 % (9,7 millones) de la población estadounidense, los voluntarios multirraciales sólo representan el 3 % (21.000) de los 7 millones de personas inscritas en el registro, lo que deja a 6.000 pacientes sin un donante de médula ósea compatible. Incluso si se encuentra un donante compatible, complicaciones inmunológicas como la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), el rechazo del donante y la elevada mortalidad relacionada con el tratamiento podrían comprometer la supervivencia del paciente. Sin embargo, el trasplante autólogo elimina estas complicaciones. Aunque las HSC autólogas no sustituirían por completo a las HSC alogénicas, especialmente en el contexto de una neoplasia hematológica, superarían los principales obstáculos del trasplante de HSC, tales como la falta de disponibilidad de donantes y la EICH en pacientes con una amplia variedad de trastornos hematológicos, inmunitarios y metabólicos malignos y no malignos (3-5, 15).
Resumen
En el presente documento se describen métodos para preparar poblaciones de células madre hematopoyéticas (HSC). Los métodos incluyen (i) poner en contacto una población que comprende endotelio hemogénico (HE) ex vivo o in vitro con una cantidad de un agonista del canal catiónico de potencial del receptor transitorio, subfamilia vanilloide, miembro 4 (Trpv4); y/o (ii) someter una población que comprende células endoteliales hemogénicas (HE) a estiramiento bidimensional cíclico ex vivo o in vitro, durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para estimular la transición de endotelio a HSC.
En algunas realizaciones, el sujeto no tiene una neoplasia hematológica.
En el presente documento también se proporcionan células madre hematopoyéticas (HSC) para el uso en métodos de tratamiento de sujetos que padecen enfermedades de la sangre, de la médula ósea, metabólicas e inmunitarias; los métodos incluyen la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de HSC obtenidas mediante un método que comprende: proporcionar una población que comprende células endoteliales hemogénicas (HE), y (i) poner en contacto las células HE con una cantidad de un agonista del canal catiónico de potencial del receptor transitorio, subfamilia vanilloide, miembro 4 (Trpv4); y/o (ii) someter las células a estiramiento bidimensional cíclico, durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para estimular la transición de endotelio a HSC.
En algunas realizaciones, las células HE utilizadas en los métodos aquí descritos se obtienen a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC); por ejemplo, las células de la piel o CD34+ se convierten primero en células madre pluripotentes inducidas (preferiblemente iPSC humanas) utilizando métodos establecidos. A continuación, estas iPSC humanas se diferencian en células HE humanas, utilizando métodos conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento. Por ejemplo, la diferenciación de iPSC humanas en cuerpos embrioides (EB) puede ocurrir en presencia de fármacos, factores de crecimiento, cócteles de citoquinas para inducir el destino endotelial hemogénico, seguido de la clasificación de las células entre los días 7 y 9, y la incubación posterior con un cóctel establecido para enriquecer las células HE.
En algunas realizaciones, el agonista de Trpv4 se selecciona del grupo compuesto por ácido araquidónico, 5.6- EET,8,9-EET, bisandrografolide A (Ba A), éster de forbol (por ejemplo, 4a-PDD y 4a-PDH), RN-1747, análogos sustituidos de 1,4-diaminobutano o 1,3-diaminopropano; y GSK10116790A.
En algunas realizaciones, las células HE o iPSC se obtienen de un sujeto que padece una enfermedad de la sangre, de la médula ósea, metabólica o inmunitaria.
En algunas realizaciones, el agonista de Trpv4 se selecciona del grupo compuesto por ácido araquidónico, 5.6- EET, 8,9-EET, bisandrografolide A (BAA), éster de forbol (por ejemplo, 4a-PDD y 4a-PDH), RN-1747, análogos sustituidos de 1,4-diaminobutano o 1,3-diaminopropano; y GSK10116790A.
En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un humano.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene mieloma múltiple; linfoma no Hodgkin; enfermedad de Hodgkin; leucemia mieloide aguda; neuroblastoma; un tumor de células germinales; un trastorno autoinmune (lupus eritematoso sistémico (LES) o esclerosis sistémica); o amiloidosis.
Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que normalmente entiende una persona con conocimientos ordinarios de la técnica a la que pertenece esta invención. En el presente documento se describen métodos y materiales para el uso en la presente invención; también pueden utilizarse otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos y no pretenden ser limitativos. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluyendo las definiciones.
Otras características y ventajas de la invención se pondrán de manifiesto en la siguiente descripción detallada y las figuras, así como en las reivindicaciones.
Descripción de las ilustraciones
Figuras 1A-G. Las células madre hematopoyéticas emergen a pesar de la inhibición de la vía del cizallamiento (shear stress) y la detención temprana de la circulación. (A-B) Imágenes confocales en lapso de tiempo de las HSC cd41:eGFP+ que emergen de las células endoteliales flk1:mCherry+ en los embriones de control y de cdh5 silenciado a las 30-42 horas después de la fertilización (hpf), lo que sugiere que la pérdida de cdh5 y, por lo tanto, el deterioro de la circulación, no afecta a la aparición endotelial de las HSC cd41:eGFP+ (los ejemplos están marcados con flechas). (C) Análisis qRT-PCR de los niveles de expresión de zf-runx1 y zf-c-Myb, que demuestran que los niveles de expresión de los marcadores sustitutos de HSC son normales a pesar de la pérdida de cdh5 y de la inhibición de la vía NOS en embriones morfantes-cdh5. (D-E) Las imágenes confocales de flk1:mCherry de tipo salvaje (control) y malbec::flk1:mCherry demuestran que se forman arterias y venas en ausencia de cdh5. (F-G) Imágenes confocales en lapso de tiempo de eritrocito lcr:eGFP+ y de la formación de estructuras vasculares flk1:mCherry+ entre 21-48 hpf. A las 21 hpf, los eritrocitos de la hematopoyesis primitiva están presentes en la región AGM. Tan pronto como comienza el latido cardíaco a las 23 hpf, los eritrocitos empiezan a circular en los embriones de control y la expresión de marcadores endoteliales resulta visible entre 25-48 hpf, lo que demuestra la formación de vasculatura. Por el contrario, los eritrocitos lcr:eGFP+ se acumulan en la región AGM en los morfantes-cdh5 a pesar del inicio del latido cardíaco y de la formación vascular, lo que demuestra una detención temprana de la circulación.
Figuras 2A-E. Los embriones morfantes-cdh5 tienen un ritmo cardíaco normal, un rendimiento cardíaco deficiente y una morfología cardíaca anómala. (A) Electrocardiografía del corazón del pez cebra en embriones de control y morfantes-cdh5 (0,2-0,4 mM), que demuestra que los morfantes-cdh5 tienen un ritmo cardíaco normal. (B) Rendimiento cardíaco en embriones de control y morfantes-cdh5 (0,2-0,4 mM), que demuestra que los morfantes-cdh5 no tienen rendimiento cardíaco. (C) Microangiografía del morfantecdh5, que demuestra que el colorante fluorescente inyectado en el corazón del morfante-cdh5 queda atrapado en la aurícula cardíaca, como pone de relieve el edema pericárdico. (D) Inmunohistoquímica de corazones aislados de embriones de control y morfantes-cdh5 utilizando anticuerpos contra la cadena pesada de miosina de cardiomiocitos (MF20) y células endoteliales (Flk1), que sugiere que la aurícula, el ventrículo y el tracto de salida están distorsionados. *P<0,05 Figuras 3A-C. La pulsación en los vasos sanguíneos se debe a los latidos cardíacos. (A) Análisis Doppler en 3D para medir la frecuencia del pulso en embriones de tipo salvaje y morfantes-cdh5, que demuestra que los morfantes-cdh5 tienen una frecuencia del pulso normal en ausencia de flujo sanguíneo. (B-C) Imágenes confocales en lapso de tiempo de lcr:eGFP::flk1:mCherry en embriones de control, seguidas de una medición basada en el aprendizaje automático (inteligencia artificial) de los valores de correlación de movimiento-frecuencia del vaso sanguíneo pulsátil, que demuestran que el pulso en los vasos sanguíneos está sincronizado con los latidos cardíacos y el flujo sanguíneo.
Figura 4. Representación esquemática de la recapitulación de las condiciones de estiramiento circunferencial en 2D en células endoteliales, endoteliales hemogénicas, vasculares y estromales mesenquimales clasificadas obtenidas de E11.5 AGM utilizando un biorreactor a medida estandarizado. Utilizamos un sistema de bomba de vacío controlado por ordenador (FlexCell Tension System) unido a la membrana de nylon de una placa de cultivo de fondo flexible, seguido de un análisis del potencial funcional
de las HSC emergentes mediante CFU, expresión génica, FACS, injerto a largo plazo (incluido el trasplante en serie) y ensayos de dilución limitante.
Figuras 5A-C. El estiramiento circunferencial en 2D estimula la formación de HSC. (A) Ensayo de unidad de formación de colonias para medir las colonias de GEMM multipotentes (marcador de HSPC) tras tensión cíclica en 2D (6 %, 24 h) y tratamiento con agonista del canal catiónico de potencial del receptor transitorio, subfamilia vanilloide, miembro 4 (Trpv4) (GSK10116790A, denominado en este documento GSK101) de células E11.5 AGM. (B) Porcentaje de quimerismo de CD45.2+ en sangre periférica en receptores trasplantados con E11.5 AGM estáticas, E11.5 AGM tratadas con tensión cíclica en 2D y AGM tratadas con agonista Trpv4 (GSK 101) después de 8 semanas. Cada receptor fue trasplantado con 2 e.e. AGM. (C) Análisis cuantitativo de linaje de sangre periférica de ratones trasplantados con E11.5 AGM estática, E11.5 AGM tratada con tensión cíclica en 2d y E11.5 AGM tratada con agonista de Trpv4 (GSK 101) después de 8 semanas. El aumento de GEMM, el porcentaje de quimerismo de CD45.2 en sangre periférica y el porcentaje de reconstitución multilinaje demostraron que la tensión cíclica en 2D y la activación de Trpv4 estimulan la formación de HSC en este modelo de “órgano en chip” personalizado. n=6; *P<0,05 frente al control estático.
Figura 6. Árbol de decisión para interpretar los posibles resultados tras la aplicación de estiramiento circunferencial en 2D en células clasificadas derivadas de E11.5 AGM.
Figura 7. La inhibición de los canales iónicos activados por estiramiento reduce la formación de HSC. Análisis qRT-PCR de la expresión de zf-runx1 y zf-c-Myb en embriones de pez cebra tratados con GdCl3, rojo de rutenio, GSK205 (antagonista de Trpv4) y GSK101 (agonista de Trpv4). *P<0,05 frente a control; n=120 en cada grupo.
Figuras 8A-D. La activación de Trpv4 mejora la formación de HSPC en embriones normales y rescata la formación de HSC en embriones de corazón silencioso (sih). La hibridación in situ del embrión completo para la expresión del marcador HSPC (c-myb) demuestra que la incubación de embriones de control con el agonista de Trpv4 (GSK101) potencia la formación de HSPC (Fig. 8A frente a 8B), mientras que la incubación de embriones (sih)-MO con el agonista de T rpv4 (GSK101) rescata la formación de HSPC (Fig. 8A frente a 8C frente a 8D). n=120 en cada grupo; los ejemplos de grupos de c-myb+ HSPC se indican con flechas.
Figuras 9A-B. La activación de Trpv4 estimula la formación de HSPC. (A) Esquema de célula endotelial hemogénica obtenida de E11.5 AGM de ratón en cultivo de explante con moduladores del canal iónico sensibles al estiramiento seguido de análisis de su función hematopoyética. (B) Utilizamos un sistema de cultivo de explante para incubar E11.5 AGM completas con un inhibidor inespecífico del canal iónico activado por estiramiento (SAC) (GdCl3), un paninhibidor de Trpv (rojo de rutenio; R.R.), agonista de Trpv4 (GSK101 y 4a-PDD), antagonista de Trpv4 (GSK205), así como agonista de Trpv4 (Gs K101) e inhibidor de la fosforilación de CREB (KT5720) durante 24 horas, seguido de ensayos de formación de colonias. Descubrimos que la activación de Trpv4 estimula la formación de progenitores multipotentes (GEMM), mientras que la inhibición de SAI y Trpv4 atenúa la formación de GEMM.
También establecimos que la inhibición de la fosforilación de CREB (KT5720) atenúa el impacto de estimulación del agonista de Trpv4 (GSK101) en la formación de HSPC. n=8; *P<0,05 frente a control estático; **P<0,05 frente a tratamiento con GSK101.
Figuras 10A-D. Representación esquemática del cultivo ex vivo de embrión de ratón con moduladores de canales iónicos activados por estiramiento, seguido de análisis de su función hematopoyética. Hemos optimizado las condiciones para cultivar embriones de ratón de E9.5 a E10.5 (A), de E10.5 a E11.5 (B) y de E10.5 a E12.5 (C), utilizando nuestra unidad de incubación de embriones de ratón personalizada. Verificamos el crecimiento de los embriones contando el número de somitas en cada etapa del desarrollo y analizamos la función hematopoyética (D).
Figura 11: Mecanismo(s) propuesto(s) para la formación de HSC tras la activación de Trpv4.
Descripción detallada
Durante el desarrollo fetal, un subconjunto de células endoteliales de la aorta-gonadal-mesonefros (AGM), denominadas células endoteliales hemogénicas, cambian su destino para convertirse en HSC que finalmente colonizan el hígado y la médula ósea fetal (10, 11). Sin embargo, la identidad de los factores que estimulan las células endoteliales hemogénicas sigue siendo imprecisa, lo que limita la utilidad de las células endoteliales hemogénicas como fuente potencial de HSC funcionales. El cizallamiento mediado por el flujo sanguíneo en el revestimiento endotelial es la única fuerza biomecánica conocida que estimula la aparición endotelial de HSC (12, 13). Utilizando modelos murinos y de pez cebra sin cdh5, recientemente se ha establecido que las HSC funcionales emergen a pesar de la detención temprana de la circulación (14). Estos modelos de cdh5 silenciado se utilizaron como eje para estudiar las fuerzas biomecánicas independientes del cizallamiento que desencadenan la aparición de HSC funcionales, para investigar otros mecanismos por los que la tensión circunferencial mediada por la presión- pulso rige la aparición de HSC.
Los intentos de generar HSC a partir de células endoteliales hemogénicas en el laboratorio han sido en gran medida infructuosos, debido en parte a la falta de conocimientos sobre los factores que estimulan la aparición de HSC a partir de células endoteliales hemogénicas.
Como se describe en el presente documento, la microangiografía, la ecocardiografía, la ecografía Doppler digital en 3D y las imágenes confocales en lapso de tiempo establecieron que el estiramiento vascular circunferencial debido a las pulsaciones de un corazón que late desencadena la aparición de HSC funcionales a partir de células endoteliales hemogénicas, que en última instancia pueden injertarse y diferenciarse en linajes definitivos. Además, la activación del canal catiónico de potencial del receptor transitorio, subfamilia vanilloide, miembro 4 (Trpv4) sensible al estiramiento rescató la formación de HSC en embriones de corazón silencioso (tnnt2; sih) en ausencia de latido cardíaco y flujo sanguíneo.
Los presentes hallazgos establecen nuevos métodos ex vivo (empleando estiramiento circunferencial en 2D) y nueva(s) diana(s) farmacológica(s) (Trpv4 y/o moduladores de los genes de respuesta inmediata temprana (IEG, una clase de factores transcripcionales; CREB, c-Fos, Elk1, NFAT)) para estimular la formación de HSC funcionales. Los presentes métodos permiten establecer las células endoteliales hemogénicas como fuente independiente de la médula ósea de HSC funcionales en el tratamiento de enfermedades de la sangre, aplasia medular, y trastornos metabolómicos e inmunitarios.
El cribado genético sin sesgos del pez cebra aquí descrito investigó el origen y el desarrollo de las células hematopoyéticas y condujo a la identificación de nuevos factores celulares extrínsecos e intrínsecos que podrían estimular la transición endotelial a las HSC en el pez cebra, el ratón y el ser humano. La activación de NOS mediada por el flujo sanguíneo y el cizallamiento ha participado como desencadenante de la aparición de las HSC a partir del endotelio hemogénico durante el desarrollo fetal (12, 13). Según este modelo, se podría predecir que la ausencia de flujo sanguíneo comprometería la formación de células hematopoyéticas. Sin embargo, utilizando modelos de pez cebra y ratón, se estableció que las HSC funcionales aparecen en ausencia de flujo sanguíneo (14). Para analizar las nuevas fuerzas biomecánicas que estimulan la transición de endotelio a HSC, los presentes experimentos ilustraron que el estiramiento circunferencial mediado por presión-pulso estimuló la formación de HSC funcionales a través de la activación de la señalización Trpv4, y establecen el estiramiento circunferencial como una nueva fuerza biomecánica y Trpv4 como un nuevo mecanismo molecular que estimula la aparición endotelial de HSC. Por consiguiente, los presentes métodos proporcionan una plataforma para utilizar células endoteliales hemogénicas como fuente nueva y segura de HSC funcionales en el tratamiento de enfermedades humanas hematológicas, inmunitarias, metabólicas y de la médula ósea.
La presente divulgación describe cómo se produce la transición del endotelio hemogénico a las HSC durante el desarrollo fetal y proporciona métodos para recapitular este proceso, al menos en parte. Tal y como se demuestra en el presente documento, las HSC emergen, migran, se autorrenuevan, se injertan y se diferencian, a pesar de una circulación sanguínea deficiente y/o de la inhibición de NOS. Por lo tanto, deben existir mecanismos celulares extrínsecos independientes del flujo sanguíneo y el cizallamiento que regulen la aparición endotelial y el desarrollo de las HSC. La microangiografía, las imágenes confocales, la ecografía Doppler en 3D, los análisis de expresión génica y los datos ecocardiográficos demostraron que el estiramiento circunferencial mediado por la presión-pulso estimula la transición endotelial hacia las h Sc . Se utilizó un “órgano en chip” para recapitular las condiciones de estiramiento circunferencial in situ en células E11.5 AGM de ratón y/o células endoteliales, endoteliales hemogénicas, hematopoyéticas, vasculares y estromales mesenquimales obtenidas de AGM. El estiramiento circunferencial activa los canales iónicos de Trpv4, que se expresan en los tejidos endoteliales y hematopoyéticos. Además, la activación de Trpv4 aumenta la formación de HSC y rescata la hematopoyesis en embriones de corazón silencioso. La identificación del estiramiento circunferencial como un nuevo factor biomecánico y extrínseco de la célula que estimula la aparición de HSC convertirá el endotelio hemogénico en una potencial fuente de HSC funcionales.
Células endoteliales hemogénicas
Los presentes métodos utilizan células endoteliales hemogénicas para generar HSC. Las células endoteliales hemogénicas (por ejemplo, células Flk1+ CD45+, células Flk1+CD41+ o células CD31+CD43+) pueden obtenerse de cualquier manera, incluso de un donante alogénico o del sujeto que se va a tratar con las HSC (es decir, células endoteliales hemogénicas autólogas, por ejemplo, generadas a partir de iPSC creadas utilizando células del receptor). Los métodos para aislar células endoteliales hemogénicas son conocidos en la técnica e incluyen la generación a partir de células madre pluripotentes humanas. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 del presente documento y Ditadi et al., Nature Cell Biol. 17(5) 580-591 (2015); Nakajima-Takagi et al., Blood. 2013;121(3):447-458; Zambidis et al., Blood. 1 nov 2008; 112(9):3601-14 y Park et al., Cytometry A. Ene 2013; 83(1): 114-126 (métodos de diferenciación hematoendotelial basados en cuerpos embrioides humanos (hEB) para la diferenciación eficiente de hiPSC); Choi et al., Cell Rep. 27 sep 2012; 2(3): 553-567. (diferenciación de hPSC en cocultivo con OP9); Sandler et al., 17 julio 2014; 511(17509):312-318 (células endoteliales a células hematopoyéticas); véase también Sluvkin, Blood 2013 122:4035-4046.
Generación de HSC a partir de células endoteliales hemogénicas (HE)
Los presentes métodos se utilizan para generar HSC a partir de células HE in vitro e incluyen incubar las células en presencia de agonistas de Trpv4 y/o someter las células a estiramiento, por ejemplo, a estiramiento cíclico.
Agonistas de Trpv4
Trpv4 es un miembro de la subfamilia TRPV de canales iónicos de potencial del receptor transitorio (TRP). El canal puede activarse con estímulos físicos (por ejemplo, hinchazón o estiramiento celular y calentamiento inocuo, por ejemplo a unos 27-35°C) y con ligandos químicos, incluyendo el ácido araquidónico y 5,6-EET y 8,9-e Et (Watanabe et al., Nature 424:434-438 (2003), (Vincent y Duncton, Current topics in medicinal chemistry 11(17):2216-26 (2011)); bisandrografolida A (Ba A, Smith et al., J Biol Chem 281:29897-29904 (2006)); ésteres de forbol como 4a-PDD y 4a-PDH (Watanabe et al., J Biol Chem 277:13569-13577 (2002); Vincent y Duncton, Current topics in medicinal chemistry 11(17):2216-26 (2011)); RN-1747; análogos sustituidos de 1,4-diaminobutano o 1,3-diaminopropano (Vincent y Duncton, Current topics in medicinal chemistry 11(17):2216-26 (2011)); y GSK10116790A (Thorneloe et al., J Pharmacol Exp Ther 326:432-442 (2008)). Véanse, por ejemplo, los compuestos divulgados en Vriens et al., Mol Pharmacol 75 (6)1262-1279 (2009); Vriens et al., Curr Neuropharmacol. 6(1): 79-96 (2008); Vincent y Duncton, Current topics in medicinal chemistry 11(17):2216-26 (2011); WO2007098393; WO2007030761; WO2006105475; WO2007070865; WO2007082262; WO2007082262; y Jeong et al., En: 238° Congreso Nacional de la ACS, Washington, DC, Estados Unidos, 16-20 de agosto de 2009; Washington, DC, Estados Unidos, 2009; MEDI-392.
Estiramiento (Stretch)
Alternativa o adicionalmente, se pueden utilizar medios mecánicos para aplicar fuerzas de estiramiento a las células. Por ejemplo, se puede utilizar un sistema de bomba de vacío controlado por ordenador (por ejemplo, FlexCell™ Tension System) unido a una membrana de nylon de una placa de cultivo de fondo flexible para aplicar estiramiento circunferencial en 2D ex vivo a células derivadas de HE en condiciones de estiramiento cíclico definidas y controladas, por ejemplo, como las descritas en el presente documento.
Métodos de uso
Los métodos aquí descritos generan poblaciones de HSC para el uso en protocolos de trasplante, por ejemplo, para tratar enfermedades de la sangre (malignas y no malignas), de la médula ósea, metabólicas e inmunitarias. En algunas realizaciones, las HSC se obtienen de células autólogas, por ejemplo, generadas a partir de iPSC creadas utilizando células del sujeto receptor. En algunas realizaciones, por ejemplo, cuando se utilizan células de origen autólogo, el sujeto receptor padece una enfermedad seleccionada entre mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin, leucemia mieloide aguda, neuroblastoma, tumores de células germinales, trastornos autoinmunes (lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis sistémica), amiloidosis u otra enfermedad que se pueda tratar utilizando un trasplante de HSC autólogas. En algunas realizaciones en las que se utilizan células de origen autólogo (por ejemplo, en las que las HSC se generan a partir de células del sujeto receptor), el sujeto receptor no tiene una neoplasia hematológica. En algunas realizaciones, el sujeto receptor tiene leucemia mieloide aguda; leucemia linfoblástica aguda;
leucemia mieloide crónica; leucemia linfocítica crónica; trastornos mieloproliferativos; síndromes mielodisplásicos; mieloma múltiple; linfoma no Hodgkin; enfermedad de Hodgkin; anemia aplásica; aplasia eritrocitaria pura; hemoglobinuria paroxística nocturna; anemia de Fanconi; talasemia mayor; anemia de células falciformes; inmunodeficiencia combinada severa (SCID); síndrome de Wiskott-Aldrich; linfohistiocitosis hemofagocítica; metabolopatía congénica; epidermólisis ampollosa; neutropenia congénita severa; síndrome de Shwachman-Diamond; anemia de Diamond-Blackfan; o deficiencia de adhesión leucocitaria. En estas realizaciones, se utilizan preferiblemente células de origen alogénico (por ejemplo, HSC generadas a partir de células de un sujeto distinto del receptor, como un sujeto compatible con el receptor basado en el grupo sanguíneo y la tipificación del antígeno leucocitario humano (h La )).
El uso de las HSC obtenidas por el método puede incluir la administración a un sujeto de las HSC generadas mediante los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, mediante infusión intravenosa o trasplante de médula intraóseo. Los métodos pueden realizarse tras aplicar pautas de acondicionamiento mieloablativo, no mieloablativo o basadas en inmunotoxinas (por ejemplo, anti-c-Kit, etc.).
EJEMPLOS
La invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones. Cualquier ejemplo que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se ofrece únicamente con fines comparativos.
EJEMPLO 1: Análisis de la fisiología celular de los efectos del estiramiento circunferencial sobre la aparición endotelial de HSC.
Introducción
Durante el desarrollo embrionario, el flujo sanguíneo genera un cizallamiento en la pared ventral del revestimiento endotelial aórtico y estimula la transición endotelial a las HSC (12). El cizallamiento activa además la vía endotelial de NOS, que desencadena la aparición endotelial de las HSC (13). Recientemente se ha demostrado que las HSC aparecen, se desarrollan, injertan y reconstituyen en sangre adulta multilinaje en ausencia de circulación sanguínea activa (14). Por lo tanto, en este ejemplo se investigaron nuevos mecanismos extrínsecos a las células que estimulan la aparición endotelial de las HSC. Utilizando ecografía Doppler en 3D, microangiografía, ecocardiografía e imágenes confocales demostramos que la presión-pulso genera un estiramiento circunferencial en los vasos sanguíneos (Figs. 1-3). Desarrollamos “AGM en chip” para recapitular las condiciones de estiramiento circunferencial ex vivo aplicando tensión cíclica sobre una suspensión unicelular de células endoteliales hemogénicas E11.5 AGM superpuestas sobre una membrana flexible de nylon del pocillo FlexCell (Fig. 4). Determinamos que el estiramiento circunferencial en 2D sobre células E11.5 AGM estimulaba la formación de HSC (Fig. 5).
Diseño de la investigación
En ratones, las HSC empiezan a surgir de las células endoteliales hemogénicas AGM entre E10.5 y E12.5. Estas HSC colonizan el hígado fetal entre E12.5 y E15.5 y, en última instancia, se injertan en la médula ósea y reconstituyen la sangre multilinaje (10, 21-26). Recogimos embriones E10.5 o E11.5 de ratones gestantes apareados en periodos establecidos, diseccionamos la AGM y realizamos una suspensión unicelular para clasificar las células endoteliales, endoteliales hemogénicas, hematopoyéticas, vasculares y/o estromales mesenquimales.
Para recapitular las condiciones de estiramiento circunferencial in situ utilizando células obtenidas de AGM, utilizamos el FlexCell FX-5000 Tension System basado en el enfoque de “órgano en placa” (también conocido como “órgano en chip” o biorreactor). Nuestro biorreactor basado en presión de vacío y controlado por ordenador genera estiramiento circunferencial en 2D ex vivo en células obtenidas de AGM, mediante la aplicación de unas condiciones de tensión cíclica definidas y controladas en las células que crecen en la membrana de nylon de una placa de cultivo de fondo flexible (Fig. 4).
Primero recubrimos cada pocillo de la placa FlexCell de 6 pocillos con fibronectina/Matrigel y dejamos que se asentara en la membrana de nylon de cada pocillo. A continuación, sembramos dos suspensiones unicelulares equivalentes a embriones (e.e.) de AGM (compuestas de células endoteliales, endoteliales hemogénicas, hematopoyéticas, músculo liso vascular (VSMC) y células estromales mesenquimales) en cada pocillo FlexCell, con un recubrimiento de fibronectina/Matrigel que permite que las células obtenidas de AGM (clasificadas o no clasificadas) se adhieran al fondo del pocillo. Rellenamos cada pocillo con un medio de cultivo de explante que contenía Myelocult y factores de crecimiento (27, 28). Colocamos estas placas de 6 pocillos en la máquina FlexCell y aplicamos tensión cíclica (4-12 %) durante 6-48 horas utilizando clavijas personalizadas enganchadas al fondo de cada pocillo. Insertamos la junta de goma personalizada en varios pocillos para simular también las condiciones de control estático. A continuación, añadimos fármacos que modulan la señalización del canal iónico activado por estiramiento en unos cuantos pocillos sometidos a la tensión cíclica externa. Tras 6-48 horas de estimulación externa de estiramiento circunferencial, recogimos las células obtenidas de AGM de la placa FlexCell y analizamos su capacidad para producir células hematopoyéticas: (I) Realizamos ensayos de CFU utilizando medios Methocult para contar granulocitos multipotenciales, eritroides, macrófagos, progenitores de megacariocitos (GEMm ), progenitores de granulocitos-macrófagos (CFU-GM, CFU-M, c FU-G) y colonias de progenitores eritroides (BFU-E) después de haber sembrado las células clasificadas obtenidas de AGM. (II) Analizamos los niveles de expresión de Runx1, c-Myb, Lmo2, Gata2, CD144 y Gata1. (III) También teñimos las células obtenidas de AGM con anticuerpos conjugados marcados con fluorescencia para medir los niveles de expresión de Flkl, CD144, CD41, c-Kit y CD45.2. (IV) Inyectamos dos e.e. de células obtenidas de AGM (donante; CD45.2) en ratones CD45.1 (SJL; receptor) irradiados subletalmente. Analizamos el injerto a largo plazo y el potencial de reconstitución multilinaje de las células del donante durante 16 semanas, seguido de trasplantes en serie para diferenciar entre las HSC y las células endoteliales hemogénicas. (V) También realizamos ensayos de dilución limitante para analizar el número de HSC generadas por célula derivada de AGM tras el estiramiento circunferencial en 2D.
Resultados
Un cribado no sesgado de mutagénesis química en pez cebra produjo malbec, un mutante de la cadherina endotelial vascular (ve-cdh, cdh5). Cdh5 es una molécula de adhesión celular que ayuda a preservar la permeabilidad endotelial y la integridad del revestimiento endotelial (16-18). La pérdida de cdh5 provocó la ausencia de rendimiento cardíaco y el deterioro de la circulación sanguínea activa. malbec, embriones
morfantes-cdh5, quimera Cdh5-/-Gfp+:Cdh5+/+Gfp- y embriones de ratón Cdhfl/fl:Sd-Cre-CRT presentaron una hematopoyesis primitiva y definitiva normal a pesar de la detención temprana de la circulación (14).
En el pez cebra, el corazón empieza a latir alrededor de las 23 hpf, la circulación sanguínea comienza aproximadamente a las 24-26 hpf y las HSC definitivas emergen de las células endoteliales hemogénicas en la región AGM entre las 26-48 hpf (11). El flujo sanguíneo genera un cizallamiento en la pared ventral del endotelio aórtico y estimula la transición de endotelio a HSC mediante la activación de la vía NOS (12, 13). Cuando realizamos imágenes confocales en lapso de tiempo tanto de los embriones de control como de los cd41:eGFP::flk1:mCherry cdh5-silenciados entre las 30-48 hpf, encontramos células cd41:eGFlowHSCs cdh5-silenciadas surgidas de las células endoteliales flk1:mCherry+ a pesar de la detención temprana de la circulación (Fig. 1A-B). Además, incubamos embriones cdh5-silenciados en presencia de L-NAME, un inhibidor farmacológico de NOS (12), entre las 19-48 hpf. Comprobamos que la inhibición de NOS no impedía la formación de HSC en los embriones cdh5-silenciados (Fig. 1C). Por lo tanto, las HSC surgirían de las células endoteliales hemogénicas, a pesar del deterioro de la circulación y de la inhibición de NOS. Estos sorprendentes datos nos llevaron a investigar los mecanismos biomecánicos y moleculares independientes del cizallamiento responsables de la transición endotelial a HSC.
Para documentar si la circulación está deteriorada en los embriones cdh5-silenciados, analizamos la estructura vascular y la circulación sanguínea en los embriones cdh5-silenciados. Primero realizamos imágenes confocales de los vasos sanguíneos en los embriones de control y en los flk1:mCherry cdh5-silenciados. Observamos que tanto las arterias como las venas estaban intactas en los embriones cdh5-silenciados (Fig. 1D-E). A continuación, analizamos la circulación de eritrocitos en los vasos sanguíneos antes y después de que el corazón comenzara a latir utilizando imágenes confocales en lapso de tiempo de los embriones control y Icr:eGFP::flk1:mCherry cdh5-silenciados. Descubrimos que los eritrocitos lcr:eGFP+ se acumulaban en los vasos sanguíneos de los embriones cdh5-silenciados incluso después de que el corazón comenzara a latir (Fig. 1F-G). Estos datos demuestran que los morfantes-cdh5 no tenían circulación activa a pesar de la formación de vasos sanguíneos.
Para empezar a analizar la morfología y la función del corazón bicameral en el embrión de pez cebra silenciado con cdh5, realizamos microangiografía, inmunohistoquímica, ecocardiografía y evaluación electrofisiológica del corazón morfante-cdh5. Utilizamos la electrofisiología y la ecocardiografía para demostrar que la frecuencia cardiaca en el morfante-cdh5 era comparable a la del control (Fig. 2A), pero el volumen sistólico era casi nulo en los morfantes-cdh5. Por lo tanto, descubrimos que el rendimiento cardíaco (=volumen sistólico X frecuencia cardíaca) también estaba deteriorado en los morfantes-cdh5 (Fig. 2B).
Inyectamos perlas fluorescentes en los corazones de los morfantes-cdh5 y seguimos su trayectoria. A diferencia de los embriones de control, observamos que las perlas fluorescentes no entraban en la circulación aórtica principal de los embriones morfantes-cdh5 porque quedaban atrapadas en el corazón (Fig. 2C-D). Para examinar la integridad estructural del corazón, aislamos los corazones de los embriones control y de los flk1:mCherry::cmlc2:eGFP cdh5-silenciados y aplicamos inmunohistoquímica al revestimiento endotelial (GFP) y los cardiomiocitos (MF20). Observamos que la aurícula, la válvula auriculoventricular (AV), el ventrículo y el tracto de salida se forman en los morfantes-cdh5, se contraen, pero están alargados y distorsionados (Fig. 2E). Además, observamos un edema pericárdico significativo en las cavidades cardíacas del morfante-cdh5, que puede deberse al reflujo de sangre desde el corazón (Fig. 2C). La acumulación de líquido en el espacio pericárdico provoca una reducción del llenado ventricular y el consiguiente problema hemodinámico (19, 20). Para examinar si el taponamiento cardíaco es un factor en la acumulación de líquido en el espacio pericárdico, puncionamos la cavidad cardíaca (como en la pericardiocentesis) y aspiramos líquido pericárdico para reducir la acumulación de presión de líquido en el corazón. Sin embargo, no pudimos resolver la deficiencia de rendimiento cardíaco del corazón morfantecdh5 (datos de vídeo no mostrados). Estos datos demuestran que el latido cardíaco es normal en los morfantes-cdh5, pero su rendimiento cardíaco está deteriorado debido a defectos estructurales del corazón, que provocan la acumulación de sangre en la cavidad pericárdica.
Aunque el corazón latía y se habían formado vasos sanguíneos, el rendimiento cardíaco era casi nulo y las células sanguíneas no circulaban activamente por los vasos sanguíneos. Por consiguiente, nos centramos en las señales biomecánicas independientes del cizallamiento que promueven la aparición de HSC en los vasos sanguíneos. Sorprendentemente, descubrimos que los vasos sanguíneos eran pulsátiles, a pesar de la falta de flujo sanguíneo. Estos sorprendentes datos nos llevaron a investigar si el pulso en los vasos sanguíneos se debe a sus propiedades inherentes, como se observa en los vasos linfáticos, o si se debe a la presión-pulso generado por los latidos cardíacos. Por lo tanto, utilizamos ecografía Doppler digital en 3D para medir la frecuencia del pulso en los embriones de control y en los morfantes-cdh5. Descubrimos una frecuencia del pulso normal, pero una amplitud menor en los morfantes-cdh5 en comparación con el control (Fig. 3A). Dado que la amplitud de la frecuencia del pulso se rige por los latidos cardíacos y el flujo sanguíneo, se esperaba una amplitud más baja en los morfantes-cdh5 por la ausencia de flujo sanguíneo. Sin embargo, se cree que tanto el control como los morfantes-cdh5 tenían una frecuencia del pulso óptima como para desarrollar estiramiento circunferencial en los vasos sanguíneos. Por consiguiente, los
embriones morfantes-cdh5 se convierten en un eje para que investiguemos el papel del estiramiento circunferencial mediado por la presión-pulso en la aparición endotelial de las HSC.
Para documentar que los mecanismos biomecánicos independientes de la circulación y del cizallamiento también están activos en embriones de tipo salvaje, realizamos imágenes confocales en lapso de tiempo de los vasos sanguíneos pulsátiles en embriones flk1:mCherry::lcr:eGFP para investigar el origen del pulso y examinar si el pulso en los vasos sanguíneos está sincronizado con el latido cardíaco (Fig. 3B). Posteriormente utilizamos algoritmos de aprendizaje automático (inteligencia artificial) para medir los valores individuales de correlación movimiento-frecuencia del canal de flk1:mCherry, que representa los vasos sanguíneos pulsátiles, y el canal de lcr:eGFP, que representa los eritrocitos en la circulación sanguínea (Fig. 3C). Cuando superpusimos los valores de correlación movimiento-frecuencia de los canales GFP y mCherry, comprobamos que sus frecuencias se solapan. Estos datos eliminan la posibilidad de que el pulso sea una propiedad inherente de los vasos sanguíneos. Así pues, la presión-pulso mediada por los latidos cardíacos provoca que los vasos sanguíneos oscilen, lo que posteriormente crea un estiramiento circunferencial. Dado que las HSC aparecieron en ausencia de circulación sanguínea activa, estudiamos el efecto directo del estiramiento circunferencial sobre las células endoteliales hemogénicas en la formación de HSC.
En resumen, estos análisis ilustran que el latido cardíaco y el estiramiento circunferencial mediado por el pulso estimulan la aparición endotelial de HSC funcionales.
Utilizando un biorreactor personalizado basado en “órgano en chip” (Fig. 4), aplicamos estiramiento circunferencial en 2D (6 % de tensión cíclica, 24 horas) a una suspensión unicelular de dos e.e. de células AGM. Paralelamente, también incubamos dos e.e. de células E11.5 AGM estáticas con el agonista de T rpv4 (GSK101 (29)). Observamos que tanto el estiramiento circunferencial en 2D como el tratamiento con agonista de Trpv4 no solo mejoraron la formación de GEMM, sino que también aumentaron el porcentaje de injertos y la reconstitución multilinaje.
Estos datos demuestran que el estiramiento circunferencial en 2D y la activación de los canales de Trpv4 en las células obtenidas de E11.5 AGM pueden potenciar la formación de HSC funcionales.
La AGM de ratón es un tejido heterogéneo. Para entender mejor el papel del estiramiento circunferencial a nivel celular, clasificamos las células endoteliales, las células endoteliales hemogénicas, las células de músculo liso vascular, las células estromales mesenquimales y las células hematopoyéticas de E11.5 AGM utilizando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS). Superponemos una suspensión unicelular de cada tipo de célula en un pocillo FlexCell, aplicamos estiramiento circunferencial en 2D y analizamos la capacidad de formación de CFU, los cambios en la expresión génica (FACS y qRT-PCR), la dilución limitante, así como la capacidad de injerto a largo plazo y de reconstitución multilinaje, seguido de ensayos de trasplante en serie (Fig. 4, 6).
También analizamos si la transición endotelial a HSC mediada por estiramiento circunferencial se debe a la interferencia entre las células endoteliales o endoteliales hemogénicas con las VSMC o las células mesenquimales de la AGM. Por lo tanto, aplicamos tensión cíclica en 2D sobre células endoteliales o células endoteliales hemogénicas obtenidas de AGM previamente mezcladas con VSMC o células mesenquimales, seguido de ensayos funcionales de las HSC (Fig. 4, 6).
Para excluir el ruido potencial del injerto de células endoteliales hemogénicas y distinguir entre células endoteliales hemogénicas y HSC, realizamos una dilución limitante y ensayos de autorrenovación (trasplante en serie a largo plazo) (Fig. 4,6) utilizando métodos establecidos (14, 30-32).
Los procesos de la especificación hemogénica de las células endoteliales y la aparición endotelial de las HSC son dinámicos y complementarios (13, 14, 24-26). Como se ha demostrado aquí, las HSC emergen, se desarrollan, se injertan y se diferencian en ausencia de circulación sanguínea activa debido a mecanismos independientes del cizallamiento. Ya hemos conseguido optimizar las condiciones experimentales para recapitular las condiciones controladas de estiramiento circunferencial en 2D en las células que crecen en el FlexCell Tension System (Fig. 4, 5). Dado que los latidos cardíacos provocan pulsaciones en los vasos sanguíneos y, por lo tanto, generan estiramiento circunferencial (Fig. 1-3), una reconstitución ex vivo del estiramiento circunferencial podría convertirse en una fuerza biomecánica, extrínseca a la célula, independiente, aditiva o sinérgica que estimula la transición endotelial a HSC.
Dado que el estiramiento circunferencial en 2D en una suspensión unicelular de células E11.5 AGM estimuló la formación de HSC (Fig. 5), se espera que el estiramiento circunferencial en 2D aplicado a células endoteliales hemogénicas seleccionadas aumente también la formación de HSC.
La reprogramación de células endoteliales humanas en células hematopoyéticas requiere inducción vascular (33). Además, el nicho vascular promueve la formación de progenitores hematopoyéticos multipotentes (34). Por lo tanto, se espera que el estiramiento circunferencial en 2D de células endoteliales
o hemogénicas previamente mezcladas con VSMC clasificadas tenga un efecto hemogénico sustancialmente mayor que el estiramiento circunferencial en 2D sobre las células endoteliales o hemogénicas por sí solo.
En primer lugar, diferenciamos células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) en cuerpos embrioides (EB) y, a continuación, las tratamos con fármacos y factores de crecimiento para inducir el mesodermo y, posteriormente, la especificación hematopoyética y endotelial (véase el Ejemplo 3). Entre los días 7 y 8 de la diferenciación de los EB, separamos las células CD34+CD43- y las tratamos con fármacos y factores de crecimiento.
durante siete días para enriquecer las células endoteliales hemogénicas. A continuación, sembramos células endoteliales hemogénicas humanas (35) en una membrana flexible de nylon y comprobamos si el estiramiento circunferencial en 2D ex vivo estimula su potencial de formación de células hematopoyéticas mediante ensayos de CFU, análisis de expresión génica y trasplante en ratones inmunodeprimidos NOD-SCID.
EJEMPLO 2: Examinar los mecanismos moleculares subyacentes a la señalización de Trpv4 durante la formación de HSC.
Introducción
El impacto del estiramiento circunferencial es comunicado por miembro(s) de la familia selectiva K1, familia Trp, familia ENaC/DEG y/o familia Piezo (36-39). Nuestros análisis de expresión génica demuestran que Trpv4 se expresa tanto en células endoteliales como hematopoyéticas. Por lo tanto, investigamos el papel de Trpv4 en la transición de células endoteliales a células HSC.
Demostramos que la inhibición inespecífica de los canales iónicos activados por estiramiento (40, 41) y del canal de la familia Trpv (41, 42), así como la inhibición dirigida de Trpv4 (42) redujeron la expresión de marcadores para y el número de HSPC en peces cebra y ratones (Fig. 7, 9). También establecimos un vínculo funcional entre la señalización de trpv4 y la generación de HSC, demostrando que la activación de los canales de trpv4 (29) aumentaba la formación de HSC en peces cebra y ratones (Fig. 7, 8A-B, 9), al tiempo que rescataba la deficiencia hematopoyética en embriones sih (tnnt2) silenciosos, en ausencia de latido cardíaco y flujo sanguíneo (Fig. 8A, C-D).
Analizamos el potencial funcional de otras HSC generadas tras la activación de Trpv4 realizando un trasplante de embrión a embrión de pez cebra, así como un cultivo ex vivo de embriones de ratón E10.5, seguido de un injerto a largo plazo y un ensayo de reconstitución multilinaje.
Esperamos que la estimulación de los canales iónicos de Trpv4 activados por estiramiento suponga un gran paso hacia la explotación de células endoteliales obtenidas de pacientes como fuente de HSC de grado clínico para el tratamiento de trastornos malignos y no malignos de la sangre y la médula ósea.
Resultados
Para demostrar si la activación de los canales iónicos activados por estiramiento influye en la aparición de HSC, incubamos embriones de pez cebra con un inhibidor no específico de los canales iónicos activados por estiramiento (SAC) (cloruro de gadolinio, GdCl3; (40)) entre las 19-42 hpf. Mediante un ensayo WISH y RT-PCR cuantitativa en pez cebra, comprobamos que la expresión de los marcadores sustitutos de HSPC, runx1 y c-myb, se redujo (Fig. 7) en los embriones de pez cebra tratados con GdCl3. Estos datos demuestran que la señalización celular desencadenada por los canales iónicos activados por estiramiento regula la aparición endotelial de las HSC.
El impacto del estiramiento circunferencial es comunicado por miembro(s) de la superfamilia selectiva K1, la superfamilia Trp, la superfamilia ENaC/DEG y/o la familia Piezo (36-39). Los análisis de expresión génica in silicio demostraron que Trpv4 se expresa tanto en células endoteliales como hematopoyéticas. Sin embargo, no se ha establecido el papel directo de Trpv4 en la aparición de las HSC. Por lo tanto, tratamos embriones de pez cebra con un paninhibidor de los canales de Trpv (rojo de rutenio; (41)), un antagonista de T rpv4 (Gs K 205; (42)) y un agonista de T rpv4 (GSK101; (29)) entre las 19-42 hpf, seguido de qRTPCR y ensayo WISH para marcadores sustitutos de HSPC (c-myb y runx1). Tras la paninhibición de los canales de la familia Trpv (usando rojo de rutenio (41)), o la inhibición específica de Trpv4 (usando el antagonista de Trpv4; GSK205; (42)), encontramos una reducción en la expresión de runx1 y c-myb (Fig. 7). Demostramos además que la incubación de embriones de control con el agonista de trpv4 (GSK101; (29)) aumentaba la expresión de los marcadores de HSPC, c-myb (Fig. 7, 8A-B) y runx1. Estos datos implican la activación de los canales iónicos de Trpv4 como factores de señalización clave en la aparición de las HSC. En conjunto, estos hallazgos demuestran que el estiramiento circunferencial estimula la señalización de Trpv4 y, por tanto, desencadena la aparición endotelial de las HSC.
Los embriones mutantes de troponina cardiaca de corazón silencioso (sih, tnnt2) carecen de latido cardíaco y circulación sanguínea (43). Nosotros y otros (12) hemos demostrado que los embriones sih carecen de expresión de marcadores de células madre progenitoras hematopoyéticas (HSPC), como c-myb (Fig. 8A frente a 8C) y runx1 (datos no mostrados). Debido a que la presión-pulso mediada por los latidos cardíacos
en los vasos sanguíneos estimula la aparición de HSC, estudiamos si la activación de los canales iónicos de Trpv4 desencadena la formación de HSC en ausencia de latido cardíaco y circulación sanguínea. Para ello, incubamos embriones silenciados sih (casper o cd41:eGFP::flk1:mCherry) con un agonista de trpv4 (GSK101) entre las 19-42 hpf. Demostramos que el agonista de trpv4 (GSK101) rescata la formación de células madre progenitoras hematopoyéticas (HSPC) en embriones sih en base a los niveles de expresión de ARNm de runx1 y c-myb mediante técnicas de ensayo WISH (Fig. 8A y 8C frente a 8D) y qRT-PCR.
También establecimos que la activación de trpv4 rescata la formación de HSC cd41:eGFP+ en embriones cd41-eGFP:flk1-mCherry silenciados (sih) tratados con agonista de trpv-4.
En ratones, el primer latido se produce en E8.25 y las HSC empiezan a surgir del endotelio hemogénico derivado de AGM entre E10.5-E12.5 (10, 11). Para investigar si los canales iónicos activados por estiramiento circunferencial también intervienen en la aparición de las HSC de mamífero, incubamos E11.5 AGM con un inhibidor inespecífico de los canales SAC (GdCl3) y un inhibidor del canal pan-Trpv (rojo de rutenio) en medios de cultivo de explante, y analizamos su capacidad como CFU hematopoyética y la expresión de genes endoteliales y hematopoyéticos (CD41, CD45.2, c-Kit, Flk1, CD144). Observamos que el GdCl3 y el rojo de rutenio reducían la expresión de genes hematopoyéticos (datos no mostrados) y la capacidad de formación de colonias GEMM (Fig. 9B). Estos datos demuestran que la vía de señalización del estiramiento circunferencial en la aparición y el desarrollo de las HSC se conserva en los sistemas de mamíferos.
Para investigar más a fondo la influencia de Trpv4 en la formación de HSC a partir de células endoteliales hemogénicas, incubamos E11.5 AGM (28) con agonista de Trpv4 (GSK101, 4a-PDD (44)) y antagonista de Trpv4 (GSK 205) durante 24-48 horas (Fig. 9). Descubrimos que la activación farmacológica de Trpv4 estimulaba la formación de GEMM multipotentes mientras que la inhibición de Trpv4 atenuaba la formación de GEMM multipotentes (Fig. 9B). Estos datos demuestran que la modulación del canal de Trpv4 regula la transición de células endoteliales a HSC.
En resumen, los datos ponen de relieve que la activación de Trpvr4, una molécula de señalización del estiramiento circunferencial, estimula la transición endotelial a HSC. Por consiguiente, estos hallazgos establecen la activación farmacológica de Trpv4 como una nueva vía para estimular la formación de HSC. EJEMPLO 2A: Investigar la utilidad funcional de las HSC generadas tras la activación de Trpv4.
Argumento, estrategias y plan analítico: El estiramiento circunferencial activa trpv4 en células endoteliales (45). Aquí demostramos que la activación de trpv4 mediada por el estiramiento circunferencial estimula la transición endotelial a h Sc . Para demostrar que las HSC producidas tras la activación de Trpv4 son funcionales, incubamos embriones de pez cebra con agonistas deTrpv4, seguido de un trasplante de HSC de embrión a embrión, así como la incubación ex vivo de embriones de ratón E10.5 con agonistas de Trpv4, seguida de un trasplante de AGM.
Ensayos funcionales en pez cebra y trasplante de HSC de embrión a embrión:
Utilizamos líneas transgénicas de pez cebra, cd41:eGFP para HSC y flk1:mCherry para análisis de expresión de células endoteliales (14). Inyectamos trpv4-morfolino en embriones de pez cebra y/o incubamos embriones transgénicos de d41:eGFP::flk1:mCherry con agonistas de trpv4 (GSKl01,4a PDD), entre las 19 y 42 hpf. A las 42 hpf realizaremos un análisis FACS para medir los niveles relativos de cd41: eGFP+ HSCs, células endoteliales hemogénicas cd41:eGFP+ flk1:mCherry y células endoteliales flk1:mCherry+. Además, colocamos embriones de cd41:eGFP::flk1:mCherry tratados con fármacos o inyectados con morfolino en agarosa de bajo punto de fusión, y realizamos imágenes confocales en lapso de tiempo para cuantificar las cd41:eGFP+ HSC que surgen de las células endoteliales flk1:mCherry+. Estos análisis examinan cómo la activación o el silenciamiento de las vías del canal iónico de trpv4 podrían influir en la capacidad de generación de HSC de las células endoteliales hemogénicas. Se trata de técnicas establecidas (Fig. 1A-B).
Trasplante de HSC en pez cebra: el trasplante de cd41:eGFPlow HSC en embriones irradiados de pez cebra ha contribuido previamente con éxito a la formación de progenitores sanguíneos en la médula renal receptora, demostrando el potencial funcional de las cd41:eGFPlow HSC (46, 47). Para examinar el potencial funcional de las HSC generadas tras la activación de trpv4, clasificamos las cd41:eGFP+ HSC de los embriones cd41:eGFP+ tratados con agonista de trpv4 y preparamos una suspensión de 400 células/microlitro con rodamina-dextrano al 0,5 % como marcador para la inyección. Rellenamos una aguja de microinyección con la suspensión celular y la calibramos para garantizar que se puedan inyectar 1, 2 o 4 gotas en cada embrión. Esto da una dosis celular estimada de 0,4, 0,8 o 1,6 células por embrión. Inyectamos las gotas en el seno venoso (es decir, el conducto de Cuvier) de receptores de tipo salvaje de 48 hpf, colocados en rampas de inyección de agarosa. Inyectamos aproximadamente 30 embriones por dosis y esperamos que 12-26 embriones por grupo sobrevivan hasta la edad adulta (3-5 meses) en base a nuestra experiencia previa. Analizamos las plaquetas de cd41:eGFP+ en embriones receptores y/o médula renal completa para obtener un porcentaje de células cd41+ injertadas utilizando una máquina de FACS. Puntuamos como injertados todos los receptores con células GFP+-positivas por encima del nivel de partida (> 0,001 % de WKM). Este método ha sido descrito previamente (14, 48).
Sistemas de incubación de embriones ex vivo de ratón:
Para investigar los factores que estimulan la aparición endotelial de las HSC, hemos desarrollado un sistema de cultivo ex vivo de embriones de ratón para cultivar embriones de ratón desde E9.5 hasta E12.5, optimizando las condiciones de los medios y la temperatura, las mezclas gaseosas y el nivel de humedad en nuestra cámara de incubación ex vivo de última generación (Figs. 10A-C). De este modo, tratamos embriones de ratón con agentes farmacológicos dirigidos a Trpv4 entre E9.5 y E12.5 para comprobar su influencia en la aparición endotelial de las HSC. Estos análisis validan la eficacia generadora de HSC funcionales de los moduladores del canal iónico de Trpv4 (Fig. 10D).
Para investigar cómo influye Trpv4 en la formación de HSC de mamíferos en condiciones ex vivo, incubamos embriones de ratón E10.5 o E11.5 con moduladores de Trpv4 durante 24-48 horas (Figs. 10A-C). Posteriormente, diseccionamos tejido de AGM de embriones de ratón E11.5 o E12.5 para realizar ensayos de CFU, y medimos la expresión de CD41, c-Kit, CD144, y CD45.2 utilizando análisis FACS y qRT-PCR (Fig. 10D). También trasplantamos las HSC definitivas obtenidas de AGM en ratones inmunodeprimidos y/o irradiados subletalmente para validar su injerto a largo plazo, así como su potencial de reconstitución multilinaje, evaluando la distribución de los linajes sanguíneos en los receptores durante un máximo de 16 semanas. Para comprender el papel de Trpv4 a nivel celular, clasificamos las células endoteliales, endoteliales hemogénicas y hematopoyéticas de E11.5 AGM antes del trasplante utilizando ensayos CFC conocidos, análisis FACS y qRT-PCR, y análisis de injerto a largo plazo (14, 30-32, 49, 50).
EJEMPLO 2B: Mecanismos moleculares subyacentes a la activación de Trpv4 durante el desarrollo de las HSC.
Argumento y estrategias: La activación de Trpv4 estimula los niveles de calcio intracelular (51-56). Un aumento transitorio de los niveles de calcio intracelular ([Ca+2]i) estimula aún más la clase de genes tempranos inmediatos de los factores de transcripción (57, 58), tales como CREB (38, 59-61), Fos/Jun (62 64), SRHElk1 (57, 65), NFAT (66, 67), TCF (68, 69), TGF-p1/MRTF-A (63). Dado que la activación de Trpv4 estimula la formación de células endoteliales a HSC (Fig. 5, 7-9), investigamos cómo la señalización de Trpv4 modula los niveles de iones celulares y los cambios transcripcionales en la especificación del destino de las células endoteliales a HSC.
Nuestra incubación de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) con agonista de Trpv4 (GSK101) produjo un aumento de los niveles de [Ca+2]i. Para analizar si Trpv4 y CREB interactúan durante la transición endotelial a HSC, utilizamos cultivos de explante de E11.5 a Gm (Fig. 9A) y descubrimos que la inhibición farmacológica de la fosforilación de CREB (utilizando KT5720; (70)) atenuaba el aumento de la formación de GEMM multipotentes mediado por el agonista de Trpv4 (Fig. 9B).
Para establecer las correlaciones funcionales entre la activación de Trpv4, [Ca+2]I, la fosforilación de CREB, y/o el factor de transcripción adicional durante la formación de HSC, incubamos embriones de pez cebra y/o ratón con agonista de Trpv4 e inhibidor del factor de transcripción específico (Fig. 9B, 10). Realizamos qRT-PCR, hibridación in situ (WMISH) e imágenes confocales en lapso de tiempo en embriones de pez cebra, así como CFU, FACS y ensayos de injerto a largo plazo para células AGM obtenidas de embriones de ratón E11.5 tratados con fármacos.
Estos resultados proporcionan la primera prueba del papel directo de Trpv4 en la aparición endotelial de HSC funcionales. Puesto que hemos demostrado que el tratamiento de E11.5 AGM con el agonista de Trpv4 estimula la formación de HSC funcionales, es razonable esperar que las cd41:eGFP+ HSC generadas tras la activación de Trpv4 se injerten y, por tanto, sean funcionales. Del mismo modo, nuestra incubación ex vivo de embriones de ratón E10.5 con agonistas de Trpv4, seguida de trasplante, también podría demostrar mayores niveles de formación de HSC funcionales. Al igual que la incubación de embriones de pez cebra con agonista de Trpv4 aumentó la expresión génica de HSPC, la incubación de embriones de ratón y/o AGM enteras produciría un aumento de la formación de HSC funcionales, dando lugar a una mayor formación de GEMM, expresión de genes hematopoyéticos, así como un aumento del injerto a largo plazo y la reconstitución multilinaje. Dado que la activación de Trpv4 aumenta los niveles de [Ca+2]i en HUVEC, observaríamos un aumento de los niveles de [Ca+2]i en las células endoteliales hemogénicas tratadas con agonista de Trpv4. Los IEG se activan por un aumento transitorio de los niveles de calcio intracelular (57, 58). Por lo tanto, esperamos ver una mayor fosforilación de CREB (Fig. 9B) y/o una mayor expresión/actividad de otros IEG en las células endoteliales hemogénicas activadas por Trpv4. Así pues, los enfoques complementarios basados en el pez cebra y el ratón podrían establecer un papel conservado de Trpv4 en la aparición y el desarrollo de HSC funcionales.
Combinamos herramientas genéticas y farmacológicas con métodos de cultivo de explante y embriones de ratón ex vivo para demostrar la prometedora utilidad de los moduladores de Trpv4 y/o IEG para establecer las células endoteliales como fuente de HSC funcionales en el tratamiento de enfermedades hematológicas humanas.
EJEMPLO 3: Protocolo ejemplar para la generación de células HE a partir de iPSC humanas.
El siguiente protocolo se basa en la publicación de Ditadi et al., Nat Cell Biol. 2015;17(5):580-91.
Medios de agregación D0-D2
375 ml IMDM (Invitrogen 10639-011)
125 ml Ham's F-12
5 ml P/S (10 ng/ml)
5 ml N2 (LifeTech 17502-048)
10 ml B27 (LifeTech 17504-044)
3,3 ml de BSA (0,05 %; stock 7,5 %, almacenado a 4°C)
(5 ml de L-glutamina (2 mM); normalmente suplementada en el IMDM)
880 uL ácido ascórbico (1 mM; 100 mg/mL stock (0,57 M) en H2O, almacenado a - 20°C)
750 uL de holo-transferrina (150 ug/ml; Sigma T0665-1G; 100 mg/ml stock en IMDM, almacenado a -20°C) 1 mL MTG 500x (0,4 mM; preparar 500x stock: 35 uL/2 ml PBS, esterilizado por filtro, almacenado a 4°C de recepción)
Medios hEB de D3
500 ml de StemPro-34 con suplemento (Invitrogen 10639-011)
5 ml de L-glutamina (2 mM)
880 uL ácido ascórbico (1 mM; 100 mg/mL stock (0,57 M) en H2O, almacenado a - 20°C)
750 uL de holo-transferrina (150 ug/ml; Sigma T0665-1G; 100 mg/ml stock en IMDM, almacenado a -20°C) 1 mL MTG 500x (0,4 mM; preparar 500x stock: 35 uL/2 ml PBS, esterilizado por filtro, almacenado a 4°C de recepción)
5 ml P/S (10 ng/ml)
D0. Generación de EB
1) Por lo general, una semana después de dividir las hiPSC, las células están listas para producir EB. Las colonias deben tener una apariencia gruesa, densa, blanca y bastante libre de diferenciación.
2) Aspirar el medio de cada placa de 15 cm. Reemplazar con 8 mL de 1X colagenasa IV diluida en 0,22 uM de DMEM/F12 colagenasa IV filtrada (Gibco Cat#17104-019). Frigorífico de recepción. Medir 0,5 g de colagenasa IV y diluir con 50 mL de DMEM/F 12. Filtrar con 0,22 uM de Steriflip (500mg/50mL = 10X). Antes de usar, diluir 10X de colagenasa con DMEM/F12 hasta 1X (1 mg/mL).
3) Incubar a temperatura ambiente en la campana durante 5 minutos.
4) Aspirar la colagenasa IV y sustituirla por 8 mL de DMEM/F12 filtrado.
5) Utilizando un raspador celular, raspar las colonias una sola vez, procurando conservar la colonia entera.
6) T ransferir las células suave y lentamente a un tubo Falcon-15 utilizando una pipeta de vidrio de 5 mL. Si hay colonias residuales, lavar las placas con otros 5 mL y añadir al mismo Falcon-15.
7) Dejar que las células se asienten en el Falcon-15 por gravedad (unos 3-5 minutos). Aspirar el sobrenadante para eliminar la mayoría de los MEF que permanecen en suspensión. Añadir con cuidado unos 10 mL de DMEM/F12 para lavar las células y centrifugar a 1000 rpm durante 1 min.
8) Mientras las células giran, añadir 11 mL de medio de agregación a las placas de 10 cm de baja adherencia.
9) Aspirar los medios y resuspender las células suavemente con 1 mL de medio de agregación.
10) Transferir con cuidado 1 mL de células a cada placa de 10 cm de baja adherencia que contenga medio de agregación. Con la misma pipeta, pipetear 1 mL de una zona de la placa sin células y lavar el Falcon-15. Añadir de nuevo 1 mL al Falcon-15; el volumen final de cada placa, que ahora contiene 2 placas iniciales de hiPSC, es de 12 mL.
11) Trasladar a la incubadora hipóxica a 37°C. Pueden apilarse 4-5 placas una encima de otra, con una placa llena de PBS en la parte inferior de la pila para evitar la evaporación. Este es el día 0 del cultivo de hEB.
D0. Añadir 10 ng/ml de BMP4. Cultivar bajo hipoxia (5 % CO2/5 % O2/90 % N2) durante los días 0-8. D1. 10 ng/ml BMP4 5 ng/ml bFGF. Añadir directamente a los medios.
D2. 10 ng/ml BMP4 5ng/ml bFGF 6 mM SB-431542+ 3 mM CHIR99021. Añadir directamente a los medios, a menos que el color haya cambiado o haya muchos restos celulares.
D3. 5 ng/ml bFGF 15 ng/ml VEGF. Recoger los medios, centrifugar 1 min a 1.000 rpm, sustituir los medios por medios hEB.
D4-5. 5 ng/ml bFGF 15 ng/ml VEGF. Añadir directamente a los medios.
D6-7. 5 ng/ml bFGF 15 ng/ml VEGF 10 ng/ml IL-6 5 ng/ml IL-11 25 ng/ml IGF-1 50 ng/ml SCF 2 U/ml EPO final. Recoger los medios, centrifugar 1 min a 1.000 rpm, sustituir los medios por medios hEB y citoquinas hematopoyéticas.
D8. 5 ng/ml bFGF 15 ng/ml VEGF 10 ng/ml IL-6 5 ng/ml IL-11 25 ng/ml IGF-1 50 ng/ml SCF 2 U/ml final EPO 30 ng/ml TPO 10 ng/ml Flt-3L 30 ng/ml IL-3
D9. 5 ng/ml bFGF 15 ng/ml VEGF 10 ng/ml IL-6 5 ng/ml IL-11 25 ng/ml IGF-1 50 ng/ml SCF 2 U/ml final EPO 30 ng/ml TPO 10 ng/ml Flt-3L 30 ng/ml IL-3. Trasladar las células a la incubadora de O2 normal.
Tabla 1. Protocolo de tratamiento celular
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Claims (14)
1. Un método in vitro para preparar una población de células madre hematopoyéticas (HSC), que comprende: proporcionar una población que comprende células endoteliales hemogénicas (HE), y (i) someter a una población que comprende células endoteliales hemogénicas (HE) a un estiramiento bidimensional cíclico ex vivo o in vitro, durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para estimular la transición endotelial a HSC; y/o
(ii) poner en contacto una población que comprende células endoteliales hemogénicas (HE) ex vivo o in vitro con una cantidad de un agonista del canal catiónico de potencial del receptor transitorio, subfamilia vanilloide, miembro 4 (Trpv4).
2. El método de la reivindicación 1, en el que las células HE se obtienen a partir de iPSC.
3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde el agonista de Trpv4 se selecciona del grupo que consiste en ácido araquidónico, 5,6-EET, 8,9-EET, bisandrografolida A (BAA), éster de forbol (por ejemplo, 4a-PDD y 4a-PDH), RN- 1747, análogos sustituidos de 1,4-diaminobutano o 1,3-diaminopropano; y GSK10116790A.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde las células se obtienen de un sujeto que padece una enfermedad de la sangre, de la médula ósea, metabólica o inmunitaria.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el sujeto no tiene una neoplasia hematológica.
6. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las HSC son células de origen autólogo.
7. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las HSC son células de origen alogénico.
8. Células madre hematopoyéticas (HSC) obtenidas por un método in vitro que comprende: proporcionar una población que comprende células endoteliales hemogénicas (HE), y
(i) someter las células a un estiramiento bidimensional cíclico, durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para estimular la transición endotelial a HSC; y/o
(ii) poner en contacto las células HE con una cantidad de un agonista del canal catiónico de potencial del receptor transitorio, subfamilia vanilloide, miembro 4 (Trpv4), para el uso en un método de tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad de la sangre, de la médula ósea, metabólica o inmunitaria, donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de dichas células madre hematopoyéticas (HSC).
9. Las HSC para el uso de la reivindicación 8, donde las células HE se obtienen a partir de iPSC.
10. Las HSC para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, en las que el agonista de Trpv4 se selecciona del grupo compuesto por ácido araquidónico, 5,6-EET, 8,9-EET, bisandrografólido A (BAA), éster de forbol (por ejemplo, 4a-PDD y 4a-PDH),
RN-1747, análogos sustituidos de 1,4-diaminobutano o 1,3-diaminopropano; y GSK10116790A.
11. Las HSC para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde el sujeto es un ser humano.
12. Las HSC para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde el sujeto tiene mieloma múltiple; linfoma no Hodgkin; enfermedad de Hodgkin; leucemia mieloide aguda; neuroblastoma; tumor de células germinales; un trastorno autoinmune (lupus eritematoso sistémico (SLE) o esclerosis sistémica); o amiloidosis.
13. Las HSC para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, donde las HSC son células de origen autólogo.
14. Las HSC para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, donde las HSC son células de origen alogénico.
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