JP2024514091A

JP2024514091A - 多能性幹細胞由来の造血系統

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Publication number: JP2024514091A
Application number: JP2023560011A
Authority: JP
Inventors: ドバニットシャー
Original assignee: ガルーダセラピューティクスインコーポレイテッド
Priority date: 2021-03-31
Filing date: 2022-03-30
Publication date: 2024-03-28
Also published as: CN117597435A; BR112023019951A2; AU2022252247A1; MX2023011658A; US20240180961A1; CA3214216A1; KR20240037179A; EP4313082A1; WO2022212514A1; IL307219A

Abstract

本開示は、様々な態様及び実施形態において、造血細胞療法のための造血系統細胞を生成する方法を提供する。様々な造血系統としては、前駆Ｔ細胞を含むＴリンパ球、ナチュラルキラー細胞、Ｂリンパ球、好中球、単球及び／又はマクロファージ、赤血球、巨核球、及び血小板が挙げられる。様々な実施形態において、本発明は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から、前駆Ｔ細胞及びＴ細胞系統を含むがこれらに限定されない造血系統を発生させる効率的なｅｘｖｉｖｏプロセスを提供する。様々な実施形態において本開示に従って生成された細胞は、機能的であり、及び／又は末梢血若しくはリンパ器官から単離された対応する系統により酷似している。本発明は、幾つかの態様において、本明細書に開示される方法によって産生された単離細胞及び細胞組成物、並びに養子細胞療法の方法を提供する。

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２１年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６３／１６８，３６０号の利益及び優先権を主張し、この内容全体が引用することによって本明細書の一部をなす。

ｅｘｖｉｖｏでの多能性細胞からの造血細胞の生成は、同種異系の適合細胞ベースの療法の可能性について科学界の関心を集めている。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、「既製の」治療用リンパ球を生成するための供給源として機能する可能性がある（非特許文献１）。しかしながら、臨床的に意義のある数の造血細胞系統（例えば、免疫細胞、リンパ球等）を作製し、臨床的に有利な表現型を有する細胞系統を作製する方法は、依然として大きな障害である。様々な態様及び実施の形態において、本発明は、これらの目的を達成する。

Nianias, A., & Themeli, M., Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived lymphocytes for adoptive cell immunotherapy: recent advances and challenges. Current Hematologic Malignancy Reports, 14(4), 261-268 (2019)

本開示は、様々な態様及び実施の形態において、造血系統を生成する方法を提供する。様々な造血系統としては、Ｔリンパ球（前駆Ｔ細胞を含むＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）（特定の抗体を生成するように設計されたＢ細胞を含む）、好中球、単球及び／又はマクロファージ、巨核球、赤血球、及び血小板が挙げられる。様々な実施の形態において本開示に従って生成された細胞は、機能的であり、及び／又は末梢血若しくはリンパ器官から単離された対応する系統により酷似している。本発明は、幾つかの態様において、本明細書に開示される方法によって産生された単離細胞及び細胞組成物、並びに細胞療法の方法を提供する。

一態様において、本開示は、造血系統の細胞集団を調製する方法を提供する。方法は、胚様体に分化した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）集団等の多能性幹細胞（ＰＳＣ）集団を調製することと、ＣＤ３４＋細胞を富化して、それによってＣＤ３４富化集団を調製することとを含む。ＣＤ３４富化集団において内皮造血転換（ＥＨＴ）が誘導され、それによって造血幹細胞（ＨＳＣ）集団を調製し、造血系統への分化が続く。様々な実施の形態において、造血系統は、Ｔリンパ球（すなわち、Ｔ細胞）、前駆Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｂリンパ球（すなわち、Ｂ細胞）、単球及び／又はマクロファージ、巨核球、及び血小板から選択される。本開示の態様及び実施の形態によれば、ｉＰＳＣ胚様体に由来するＣＤ３４＋細胞集団の内皮造血転換（ＥＨＴ）の誘導が、ｅｘｖｉｖｏでの優れた造血系統の生成に使用できることが見出された。

幾つかの態様及び実施の形態において、本開示は、ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞集団、又はこの集団の誘導体を生成する方法を提供する。例えば、方法は、ｉＰＳＣ（例えば、ｈｉＰＳＣ）からヒト長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む造血幹細胞（ＨＳＣ）集団を生成することを含む。ＨＳＣ集団は、ＣＤ３４＋細胞（例えば、胚様体に由来するＣＤ３４＋細胞）の内皮造血転換の誘導によってもたらされる。ＨＳＣ集団（又はそこから単離された細胞）は、部分的又は完全なＮｏｔｃｈリガンド（ＤＬＬ４、ＤＬＬ１、ＳＦＩＰ等が挙げられるがこれらに限定されない）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＮＦ－α、レトロネクチン（又は他の細胞外マトリックス成分）、及び／又はそれらの組み合わせと共に培養されて、ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞を含む集団又は誘導体細胞集団を産生する。本開示は、ｉＰＳＣからｅｘｖｉｖｏで生成され、ｅｘｖｉｖｏでのＴ前駆細胞及びＴ細胞系統のロバストな産生により、Ｎｏｔｃｈリガンド、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、及び／又は細胞外マトリックスの成分（複数の場合もある）に応答する、ＨＳＣ集団を提供する。

様々な実施の形態において、ｉＰＳＣは、線維芽細胞又はＰＢＭＣ（又はそれらから単離された細胞）等であるが、これらに限定されない体細胞のリプログラミングにより調製される。幾つかの実施の形態において、ｉＰＳＣは、リンパ球、臍帯血細胞、ＰＢＭＣ、ＣＤ３４＋細胞、又は他のヒト一次組織に由来する。幾つかの実施の形態において、ｉＰＳＣは、末梢血から単離されたＣＤ３４＋細胞に由来する。様々な実施の形態において、ｉＰＳＣは、１つ以上のＨＬＡクラスＩ及び／又はクラスＩＩ対立遺伝子又はそれらの主要制御因子の欠失等によって、ＨＬＡ適合を支援するために遺伝子編集することができる。

幾つかの実施の形態において、ｈｉＰＳＣは、ＣＤ３４＋細胞の生成（すなわち、単離又は富化）に使用できる胚様体（ＥＢ）を生成するために使用される。例えば、ＥＢを解離し、ＣＤ３４＋造血前駆体を単離又は富化することができる。幾つかの実施の形態において、各態様によるプロセスは、多能性幹細胞（例えば、ＥＢ）からＣＤ３４富化細胞を生成することと、内皮造血分化を誘導することとを含むことができる。

幾つかの実施の形態において、ＣＤ３４の富化及びＥＨＴは、ｉＰＳＣ分化の８日目～１４日目に誘導することができる。ＥＨＴは、任意のプロセスを使用して誘導することができる。幾つかの実施の形態において、ＥＨＴの誘導は、ＬＴ－ＨＳＣを含む造血幹細胞（ＨＳＣ）集団を生成する。幾つかの実施の形態において、ＥＨＴは、機械的、生化学的、薬理学的及び／又は遺伝学的手段を使用して、内皮細胞又は造血性内皮細胞（ＨＥＣ）前駆体を介してＨＳＣを生成する。幾つかの実施の形態において、方法は、機械的、遺伝学的、生化学的、又は薬理学的手段によって行うことができる、ＰＳＣ、ＥＢ、ＣＤ３４富化細胞、ＥＣ、ＨＥＣ又はＨＳＣにおけるｄｎｍｔ３ｂの発現又は活性を増加させることを含む。

幾つかの実施の形態において、Ｄｎｍｔ３ｂの活性又は発現を増加させる機械感受性受容体又は機械感受性チャネルの有効量のアゴニストと細胞を接触させる。幾つかの実施の形態において、機械感受性受容体はＰｉｅｚｏ１である。例示的なＰｉｅｚｏ１アゴニストとしては、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１、及びＪｅｄｉ２が挙げられる。幾つかの実施の形態において、機械感受性受容体はＴｒｐｖ４である。例示的なＴｒｐｖ４アゴニストはＧＳＫ１０１６７９０Ａである。或る特定の実施の形態において、Ｐｉｅｚｏ１活性化は、少なくともＥＢから単離されたＣＤ３４＋細胞に適用され、これにより、様々な実施の形態に従って、ＥＨＴを誘導する他の方法と比較して、優れたＴ前駆細胞の生成を可能にする。

幾つかの実施の形態において、方法は、細胞にサイクリック２Ｄ、３Ｄ、又は４Ｄストレッチを適用することを含む。様々な実施の形態において、サイクリック２Ｄ、３Ｄ、又は４Ｄストレッチを受ける細胞は、ＣＤ３４富化細胞、ｉＰＳＣ、ＥＣ、及びＨＥＣのうちの１つ以上から選択される。繰り返し歪み生体力学的伸展は、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６の活性又は発現を増加させることができる。

一般に、様々な段階で、細胞集団は、所望の表現型の細胞について富化され、及び／又は望ましくない表現型の細胞を枯渇させることができる。幾つかの実施の形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞について（ＥＨＴを受ける前及び／又は後に）富化される。幾つかの実施の形態において、細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞の増殖を促進する条件下で培養され、それによって増殖された幹細胞の集団を産生する。赤血球系、骨髄系、及びリンパ系の系統を生じさせる造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＣＤ３４の発現及び系統特異的マーカーの不存在（Ｌｉｎ－と称される）に基づいて識別することができる。

様々な実施の形態において、ＨＳＣ集団又はその画分（例えば、ＣＤ３４＋画分）は、前駆Ｔ細胞、Ｔ細胞及びその画分、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、単球又はマクロファージ、巨核球、赤血球、並びに血小板から選択することができる造血系統に分化される。

幾つかの実施の形態において、細胞集団は、少なくとも部分的又は完全なＮｏｔｃｈリガンド（ＤＬＬ４、ＤＬＬ１、ＳＦＩＰ等が挙げられるがこれらに限定されない）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＴＮＦ－α、レトロネクチン（又は他の細胞外マトリックス成分）、及び／又はそれらの組み合わせと共に、ｅｘｖｉｖｏで培養されて、ＨＳＣをＣＤ７^＋前駆Ｔ細胞に、任意に、Ｔ細胞系統又は他の系統（例えば、ＮＫ細胞）に分化させる。様々な実施の形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｄｅｌｔａ様１（ＤＬ１）及びＤｅｌｔａ様４（ＤＬ４）、ＳＦＩＰ、又はそれらの機能部分のうちの少なくとも１つを含む。様々な実施の形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドは、２Ｄ又は３Ｄ培養系に固定化、機能化、及び／又は埋め込まれている。Ｎｏｔｃｈリガンドは、細胞外マトリックスの成分と共に組み込まれてもよい。

他の態様において、本発明は、本明細書に記載の方法によって産生された細胞集団、又はその薬学的に許容される組成物、及び治療方法又は療法における使用を提供する。幾つかの実施の形態において、細胞集団は、必要とする被験体への投与後に、胸腺、脾臓、又は二次リンパ器官に生着することができるリンパ球集団（例えばＴ細胞前駆細胞集団）である。

本開示の他の様々な態様及び実施の形態は、以下の詳細な説明により明らかとなるであろう。

ＥＴＶ２過剰発現（ＯＥ）が多能性に影響を及ぼさないことを示す図である。図１は、ＥＴＶ２及びＧＦＰ配列を過剰発現させるアデノウイルスベクターによるｉＰＳＣの形質導入効率を表すＦＡＣＳプロットを示す。ＥＴＶ２過剰発現は、ＴＲＡ－１－６０幹細胞性マーカーの発現によって示されるように、ｉＰＳＣ幹細胞性に影響を及ぼさない。ＥＴＶ２過剰発現（ＯＥ）が造血性内皮細胞の収率を増加させることを示す図である。造血性内皮細胞（ＣＤ２３５ａ－ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋と記載）の代表的なフローサイトメトリー分析及び相対定量により、ＥＴＶ２－ＯＥが造血性内皮細胞の形成を増進することが実証される。ＥＴＶ２過剰発現（ＯＥ）がｉＰＳＣ分化時のＣＤ３４＋細胞形成を増進することを示す図である。ＣＤ３４＋細胞の代表的なフローサイトメトリー分析及び相対定量により、ＥＴＶ２－ＯＥがＣＤ３４＋細胞形成を増進することが実証される。Ｐｉｅｚｏ１活性化で誘導されたｉＰＳＣ由来ＨＳＣが、骨髄（ＢＭ）－ＨＳＣと同様に前駆Ｔ細胞分化を受けることを示す図である。図４Ａは、骨髄（ＢＭ）ＨＳＣ及びＰｉｅｚｏ１活性化で誘導されたｉＰＳＣ－ＨＳＣの、ＣＤ３４＋ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞への分化効率のＦＡＣＳプロットである。図４Ｂは、（１）ＢＭ－ＨＳＣ及び（２）ｉＰＳＣ－ＨＳＣ（Ｐｉｅｚｏ１活性化）で誘導されたＣＤ３４＋ＣＤ７＋細胞（％）の定量化である。図４Ｂは、３回の実験の平均を示す。Ｐｉｅｚｏ１活性化で生成されたｉＰＳＣ由来ＨＳＣがＴ細胞分化を受け、ＢＭ－ＨＳＣと同様にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化できることを示す図である。図５Ａは、ＢＭ－ＨＳＣ及びＰｉｅｚｏ１活性化で生成されたｉＰＳＣ由来ＨＳＣから分化したＴ細胞の活性化効率（ＣＤ３＋ＣＤ６９＋発現）のＦＡＣＳプロットである。図５Ｂは、（１）ＢＭ－ＨＳＣ及び（２）ｉＰＳＣ－ＨＳＣ（Ｐｉｅｚｏ１活性化）で誘導されたＣＤ３＋ＣＤ６９＋細胞（％）の定量化である。図５Ｂは、３回の実験の平均を示す。Ｐｉｅｚｏ１活性化で生成されたｉＰＳＣ由来ＨＳＣが機能的Ｔ細胞に分化できることを示す図である。ＩＦＮγ発現は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを介したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激後のＴ細胞活性化の結果である。Ｐｉｅｚｏ１活性化により生成されたｉＰＳＣ由来ＨＳＣから分化したＴ細胞におけるＩＦＮγの発現は、機能的Ｔ細胞に更に分化するＨＳＣの能力を高める。図６は、３回の実験の平均を示す。

本開示は、様々な態様及び実施形態において、細胞療法のための造血系統を生成する方法を提供する。様々な造血系統としては、Ｔリンパ球（前駆Ｔ細胞を含むＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）（特定の抗体を生成するように設計されたＢ細胞を含む）、好中球、単球及び／又はマクロファージ、巨核球、赤血球、及び血小板が挙げられる。様々な実施形態において、本発明は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から、前駆Ｔ細胞及びＴ細胞系統を含むがこれらに限定されない造血系統を発生させる効率的なｅｘｖｉｖｏプロセスを提供する。様々な実施形態において本開示に従って生成された細胞は、機能的であり、及び／又は末梢血若しくはリンパ器官から単離された対応する系統により酷似している。本発明は、幾つかの態様において、本明細書に開示される方法によって産生された単離細胞及び細胞組成物、並びに細胞療法の方法を提供する。

本開示の態様及び実施形態によれば、本質的に無制限の多能性幹細胞（ＰＳＣ）を産生するヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の能力を活用して、治療用ヒトＴリンパ球（「Ｔ細胞」）又はその前駆細胞を含むがこれらに限定されない造血細胞の無限の供給源を生成する。治療用リンパ球としての初代Ｔ細胞の使用は、入手可能性の制限、細胞数、増殖能の制限、及び組織適合性の問題によって制限されてきた。さらに、初代細胞と比較して、ｈｉＰＳＣはｉｎｖｉｔｒｏでより容易に遺伝子改変を受けることができ、それによって細胞標的特異性、細胞数を改善する機会を提供するだけでなく、例えば、ＨＬＡ適合の問題を回避する。さらに、完全に遺伝子操作されたｈｉＰＳＣクローンは、初代細胞と比較して、安定した安全な供給源として機能することができる（Nianias and Themeli, 2019）。さらに、ｈｉＰＳＣはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）とは異なり、非胚起源であるため、倫理的な問題もない。したがって、本開示によるｈｉＰＳＣの使用は、Ｔリンパ球等の治療用造血系統を生成するために、初代細胞に優る幾つかの利点をもたらす。

一態様において、本開示は、造血系統の細胞集団を調製する方法を提供する。方法は、胚様体に分化した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）集団等の多能性幹細胞（ＰＳＣ）集団を調製することと、ＣＤ３４＋細胞を富化して、それによってＣＤ３４富化集団を調製することとを含む。ＣＤ３４富化集団において内皮造血転換（ＥＨＴ）が誘導され、それによって造血幹細胞（ＨＳＣ）集団を調製し、任意に、ＣＤ３４＋細胞の更なる富化が続く。得られたＨＳＣ集団（又はその画分）は、造血系統に分化される。様々な実施形態において、造血系統は、Ｔリンパ球（すなわち、Ｔ細胞）、前駆Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｂリンパ球（すなわち、Ｂ細胞）、単球及び／又はマクロファージ、巨核球、並びに血小板から選択される。

従来、造血系統は、ＣＤ３４＋細胞を採取するために、最長で８日目までｉＰＳＣを胚様体に分化させることによって調製される。ＣＤ３４は、造血性内皮細胞、造血幹細胞、及び造血前駆細胞のマーカーとして一般的に使用される。本開示の態様及び実施形態によれば、ｉＰＳＣ胚様体に由来し得るＣＤ３４＋細胞集団の内皮造血転換（ＥＨＴ）の誘導が、ｅｘｖｉｖｏでの優れた造血系統の生成に使用できることが見出された。

幾つかの態様及び実施形態において、本開示は、ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞集団、又はこの集団の誘導体を生成する方法を提供する。例えば、方法は、ｉＰＳＣ（例えば、ｈｉＰＳＣ）からヒト長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む造血幹細胞（ＨＳＣ）集団を生成することを含む。ＨＳＣ集団は、ＣＤ３４＋細胞（例えば、胚様体に由来するＣＤ３４＋細胞）の内皮造血転換の誘導によって誘導される。ＨＳＣ集団（又はそこから単離された細胞）は、部分的又は完全なＮｏｔｃｈリガンド、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、レトロネクチン（又は他の細胞外マトリックス成分（複数の場合もある））、及び／又はそれらの組み合わせと共に培養されて、ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞を含む集団又は誘導体細胞集団を産生する。

Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、前駆Ｔ細胞、プレＴ細胞、及び／又は成熟Ｔリンパ球の形成、分化、及び機能を調節する。ｉｎｖｉｖｏでは、Ｔ細胞の発生は、骨髄造血幹細胞からリンパ球前駆細胞が分化し、胸腺に移動した後に進行する。特殊な胸腺上皮細胞が、制御された経路に沿ってＴ細胞の発生を誘導する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、胸腺におけるＴ細胞系統のコミットメント中に重要な役割を果たす。リンパ系前駆細胞が胸腺に入ると、リンパ系前駆細胞は胸腺上皮上のＮｏｔｃｈリガンドの高密度発現に遭遇し、胸腺リンパ球新生が促進される。本開示は、ｉＰＳＣからｅｘｖｉｖｏで生成され、ｅｘｖｉｖｏでのＴ前駆細胞及びＴ細胞系統のロバストな産生により、Ｎｏｔｃｈリガンド、ＳＨＨ、及び／又は細胞外マトリックスの成分（複数の場合もある）に応答する、ＨＳＣ集団を提供する。

様々な実施形態において、ｉＰＳＣは、体細胞のリプログラミングにより調製される。「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」という用語は、胚様多能性状態にリプログラムされた皮膚細胞又は血液細胞等の体細胞に由来する細胞を指す。幾つかの実施形態において、ｉＰＳＣは、線維芽細胞又はＰＢＭＣ（又はそれらから単離された細胞）等（これらに限定されない）の体細胞から生成される。幾つかの実施形態において、ｉＰＳＣは、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等）、臍帯血細胞（臍帯血に由来するＣＤ３＋細胞又はＣＤ８＋細胞を含む）、ＰＢＭＣ、ＣＤ３４＋細胞、又は他のヒト一次組織に由来する。幾つかの実施形態において、ｉＰＳＣは、末梢血から単離されたＣＤ３４＋細胞に由来する。様々な実施形態において、ｉＰＳＣは、レシピエント（本明細書に記載の治療を必要とする被験体）に関して自系又は同種異系（例えば、１つ以上の遺伝子座でＨＬＡ適合）である。様々な実施形態において、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ適合を支援するために遺伝子編集すること（例えば、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＣＩＩＴＡ等を含むがこれらに限定されない、１つ以上のＨＬＡクラスＩ及び／又はクラスＩＩ対立遺伝子又はそれらの主要制御因子の欠失）も、他の機能を欠失又は発現させるために遺伝子編集することもできる。例えば、ｉＰＳＣを遺伝子編集して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上を欠失させたり、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上を欠失させたりすることができる。或る特定の実施形態において、ｉＰＳＣは、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ及び少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩ複合体の発現を保持する。或る特定の実施形態において、ｉＰＳＣは、少なくとも１つの保持されたクラスＩ及びクラスＩＩ遺伝子座についてホモ接合体である。幾つかの実施形態において、ｉＰＳＣは、例えば、既知又は未知のＴＣＲ特異性を有するＴ細胞に由来する。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、腫瘍関連抗原について特異性を有するＴＣＲを持つ。

体細胞は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８及びｋｌｆ４から選択されるリプログラミング因子の発現によりリプログラミングすることができる。幾つかの実施形態において、リプログラミング因子はＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８及びｋｌｆ４である。幾つかの実施形態において、リプログラミング因子はＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ及びｋｌｆ４である。ｉＰＳＣを調製する方法は、例えば米国特許第１０，６７６，１６５号、米国特許第９，５８０，６８９号及び米国特許第９，３７６，６６４号（それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている。様々な実施形態において、リプログラミング因子は、レンチウイルス系、センダイウイルス系、又は麻疹ウイルス系等の既知のウイルスベクター系を用いて発現される。代替的には、リプログラミング因子は、リプログラミング因子をコードするｍＲＮＡ（複数の場合もある）を体細胞に導入することによって発現することができる。さらにまた、リプログラミング因子を発現する非統合エピソームプラスミド、すなわち導入遺伝子フリーかつウイルスフリーのｉＰＳＣを作製するための非統合エピソームプラスミドを導入することにより、ｉＰＳＣを作製してもよい。複製能力が限られ、したがって数細胞世代の間に失われる既知のエピソームプラスミドを用いることもできる。

幾つかの実施形態において、ヒト多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）は遺伝子編集されている。遺伝子編集としては、例えば、ＨＬＡ遺伝子の改変（例えば、１つ以上のＨＬＡクラスＩ及び／又はクラスＩＩ遺伝子の欠失）、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）の欠失、ＣＩＩＴＡの欠失、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の欠失若しくは追加、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子の追加を挙げることができるが、これらに限定されない。例示的なＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ２０等を標的にすることができる。例えば、ｉＰＳＣは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）形質導入ｉＰＳＣであり得る。そのような実施形態は、所望の抗原特異性を有する大規模な再生Ｔリンパ球の産生を可能にする。代替的に、１つ以上のＨＬＡノックアウト及びＴＣＲノックアウトを有する遺伝子操作されたｉＰＳＣを、ＧＭＰグレードの条件下にて、フィーダー及び血清フリーの分化用のバイオリアクターに入れて、完全に機能的で組織適合性のあるＴ細胞を生成することもできる。

幾つかの実施形態において、ｉＰＳＣは、ＣＤ３^＋細胞又は幾つかの実施形態においてＴリンパ球（例えば、ＣＴＬ）から調製される（Ｔ－ｉＰＳＣ）。例えば、Ｔリンパ球を所望の抗原特異性で単離し（例えば、ＨＬＡ－ペプチドリガンドによる細胞選別を使用）、Ｔ－ｉＰＳＣにリプログラムすることができる。次いで、これらのＴ－ｉＰＳＣＳは、本開示に従って、前駆Ｔ細胞、若しくはその誘導体又はＴ細胞系統に再分化される。Ｔ－ｉＰＳＣが抗原特異的Ｔ細胞から産生されると、Ｔ－ｉＰＳＣは再構成されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を受け継ぐ。これらの実施形態において、Ｔ－ｉＰＳＣから再分化したＣＴＬは、元のＣＴＬと同じ抗原特異性を示す。

幾つかの実施形態において、ｈｉＰＳＣは、ＣＤ３４＋細胞の生成（すなわち、単離又は富化）に使用できる胚様体（ＥＢ）を生成するために使用される。例えば、ＥＢを解離し、ＣＤ３４＋造血前駆体を単離又は富化することができる。幾つかの実施形態において、ヒトｉＰＳＣ集合体を、例えばAbecasis B. et al., Expansion of 3D human induced pluripotent stem cell aggregates in bioreactors: Bioprocess intensification and scaling-up approaches. J. of Biotechnol. 246 (2017) 81-93に記載されているようにバイオリアクター内で増殖させる。

幾つかの実施形態において、各態様によるプロセスは、多能性幹細胞（例えば、ＥＢ）からＣＤ３４富化細胞を生成することと、内皮造血分化を誘導することとを含むことができる。比較的高頻度のＬＴ－ＨＳＣを含むＨＳＣは、機械的、生化学的、代謝的、及び／又はトポグラフィカルな刺激、及び細胞外マトリックス、ニッチ因子、細胞外因性因子、細胞固有特性の誘導等の因子、並びに薬理学的及び／又は遺伝学的手段を含む、様々な刺激又は因子を使用して、細胞集団から生成することができる。

幾つかの実施形態において、方法は、ＥＨＴの誘導の前に、多能性幹細胞から造血能を有する内皮細胞を調製することを含む。幾つかの実施形態において、ＧＡＴＡ２／ＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２／ＴＡＬ１、又はＥＲ７１／ＧＡＴＡ２／ＳＣＬの複合過剰発現は、ＰＳＣ供給源からの造血能を有する内皮細胞の形成につながる可能性がある。幾つかの実施形態において、方法は、ｉＰＳＣにおけるＥ２６形質転換特異的変異体２（ＥＴＶ２）転写因子の過剰発現を含む。ＣＤ３４＋富化の後、次いで、機械的、生化学的、薬理学的及び／又は遺伝学的刺激又は改変を使用して内皮細胞からＨＳＣが生成される。ＥＴＶ２は、ＥＴＶ２の構成的又は誘導的発現、及び導入遺伝子フリーの造血性ＥＣの産生のためのコード非統合エピソームプラスミドの導入によって発現させることができる。幾つかの実施形態において、ＥＴＶ２は、ｉＰＳＣに導入されたｍＲＮＡから発現される。ｍＲＮＡは、エレクトロポレーション又はリポフェクションを含む任意の利用可能な方法を使用して導入することができる。ＥＴＶ２を発現する細胞の分化は、ＶＥＧＦ－Ａの添加を含み得る。Wang K, et al., Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of ETV2 with mRNA. Sci. Adv. Vol. 6 (2020)を参照されたい。この方法で生成された細胞は、本開示の実施形態によるＣＤ３４＋細胞を産生し、ＥＨＴを誘導するために使用することができる。

幾つかの実施形態において、ＣＤ３４の富化及びＥＨＴは、例えば、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、又は１４日目等の、ｉＰＳＣ分化の８日目～１４日目に誘導することができる。ｉＰＳＣの分化は、既知の技術によるものであり得る。幾つかの実施形態において、ｉＰＳＣ分化には、ｂＦＧＦ、Ｙ２７６３２、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、及び／又はＩＧＦ－１の組み合わせ等の因子が関与するが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、ｈＰＳＣは、フィーダーフリー、血清フリー、及び／又はＧＭＰに適合した材料を使用して分化される。幾つかの実施形態において、ｈＰＳＣは、血清含有培地中でＯＰ９又はＭＳ５細胞株等のマウス骨髄由来フィーダー細胞と共培養される。培養物には、胚様体又は単層系の分化をサポートするために、増殖因子及びサイトカインを含めることができる。ＯＰ９共培養系は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、巨核球、単球又はマクロファージ、及び赤血球を含む幾つかの造血系統に更に分化させることができる多能性ＨＳＰＣを生成するために使用することができる。Netsrithong R. et al., Multilineage differentiation potential of hematoendothelial progenitors derived from human induced pluripotent stem cells, Stem Cell Research & Therapy Vol. 11 Art. 481 (2020)を参照されたい。代替的に、特異的シグナルで定義された条件を使用する段階的プロセスを使用することもできる。例えば、ヒトＰＳＣにおけるＨＯＸＡ９、ＥＲＧ、ＲＯＲＡ、ＳＯＸ４、及びＭＹＢの発現は、多分化能を有するＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋前駆細胞への直接分化を促進する。さらに、ＨＯＸＢ４、ＣＤＸ４、ＳＣＬ／ＴＡＬ１、又はＲＵＮＸ１ａ等の因子の発現は、ヒトＰＳＣにおける造血プログラムをサポートする。Doulatov S. et al., Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors, Cell Stem Cell. 2013 Oct 3; 13(4)を参照されたい。

ＥＨＴの誘導は、任意の既知のプロセスを用いて行うことができる。幾つかの実施形態において、ＥＨＴの誘導は、ＬＴ－ＨＳＣを含む造血幹細胞（ＨＳＣ）集団を生成する。幾つかの実施形態において、ＥＨＴは、機械的、生化学的、薬理学的及び／又は遺伝学的手段（例えば、刺激、阻害、及び／又は遺伝子改変を介する）を使用して、内皮細胞又は造血性内皮細胞（ＨＥＣ）前駆体を介してＨＳＣを生成する。幾つかの実施形態において、ＥＨＴは、長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）、短期造血幹細胞（ＳＴ－ＨＳＣ）、及び造血幹前駆細胞のうちの１つ以上を含む幹細胞集団を生成する。

幾つかの実施形態において、方法は、機械的、遺伝学的、生化学的、又は薬理学的手段によって行うことができる、ＰＳＣ、胚様体、ＣＤ３４富化細胞、ＥＣ、ＨＥＣ又はＨＳＣにおけるｄｎｍｔ３ｂの発現又は活性を増加させることを含む。幾つかの実施形態において、方法は、細胞におけるＤＮＡ（シトシン－５－）－メチルトランスフェラーゼ３β（Ｄｎｍｔ３ｂ）及び／又はＧＴＰアーゼＩＭＡＰファミリーメンバー６（Ｇｉｍａｐ６）の活性又は発現を増加させることを含む。国際公開第２０１９／２３６９４３号及び国際公開第２０２１／１１９０６１号（それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。幾つかの実施形態において、ＥＨＴの誘導は、ｄｎｍｔ３ｂの発現又は活性を増加させることを含む。

幾つかの実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂの活性又は発現を増加させる機械感受性受容体又は機械感受性チャネルの有効量のアゴニストと細胞を接触させる。幾つかの実施形態において、機械感受性受容体はＰｉｅｚｏ１である。例示的なＰｉｅｚｏ１アゴニストはＹｏｄａ１である。幾つかの実施形態において、機械感受性受容体はＴｒｐｖ４である。例示的なＴｒｐｖ４アゴニストはＧＳＫ１０１６７９０Ａである。Ｙｏｄａ１（２－［５－［［（２，６－ジクロロフェニル）メチル］チオ］－１，３，４－チアジアゾール－２－イル］－ピラジン）は、機械感受性イオンチャネルＰｉｅｚｏ１に対して開発された小分子アゴニストである（Syeda R, Chemical activation of the mechanotransduction channel Piezo1. eLife (2015)）。Ｙｏｄａ１は以下の構造を有する：

Ｙｏｄａ１の誘導体は、様々な実施形態に用いることができる。例えば、２，６－ジクロロフェニルコアを含む誘導体が幾つかの実施形態に用いられる。例示的なアゴニストは、Evans EL, et al., Yoda1 analogue (Dooku1) which antagonizes Yoda1-evoked activation of Piezo1 and aortic relaxation, British J. of Pharmacology 175(1744-1759): 2018に開示されている。更に他のＰｉｅｚｏ１アゴニストとしては、Ｊｅｄｉ１、Ｊｅｄｉ２、及びそれらの誘導体及び類似体が挙げられる。Wang Y., et al., A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive Piezo1 channel. Nature Communications (2018) 9:1300を参照されたい。これらのＰｉｅｚｏ１アゴニストは市販されている。様々な実施形態において、Ｐｉｅｚｏ１アゴニスト又は誘導体の有効量は、約１μＭ～約５００μＭ、若しくは約５μＭ～約２００μＭ、若しくは約５μＭ～約１００μＭの範囲、又は幾つかの実施形態において、約２５μＭ～約１５０μＭ、若しくは約２５μＭ～約１００μＭ、若しくは約２５μＭ～約５０μＭの範囲である。

様々な実施形態において、薬理学的Ｐｉｅｚｏ１活性化は、ＣＤ３４＋細胞（すなわち、ＣＤ３４富化細胞）に適用される。或る特定の実施形態において、薬理学的Ｐｉｅｚｏ１活性化は、ｉＰＳＣ、胚様体、ＥＣ、造血性内皮細胞（ＨＥＣ）、ＨＳＣ、造血前駆細胞、及び造血系統（複数の場合もある）に更に適用することができる。或る特定の実施形態において、Ｐｉｅｚｏ１活性化は、少なくともｉＰＳＣから生成されたＥＢ、ＥＢから単離されたＣＤ３４＋細胞、及び／又はそれらの組み合わせに適用され、これにより、様々な実施形態に従って、ＥＨＴを誘導する他の方法と比較して、優れたＴ前駆細胞の生成を可能にする。

代替的又は付加的に、Ｄｎｍｔ３ｂの活性又は発現は、細胞、例えば、ＣＤ３４富化細胞において、直接増加させることができる。例えば、Ｄｎｍｔ３ｂのｍＲＮＡ発現は、細胞にＤｎｍｔ３ｂをコードする転写産物を送達するか、又はＤｎｍｔ３ｂをコードする導入遺伝子を導入するか、又は非統合エピソームを細胞に導入することに限定されない導入遺伝子フリーの方法によって増加させることができる。幾つかの実施形態において、遺伝子編集を用いて細胞のＤｎｍｔ３ｂ発現エレメントに、例えばプロモーター強度、リボソーム結合、ＲＮＡ安定性を増加させるため、及び／又はＲＮＡスプライシングに影響を与えるための、これらに限定されない遺伝子改変を導入する。

幾つかの実施形態において、方法は、細胞におけるＧｉｍａｐ６の活性又は発現を、単独で、又はＤｎｍｔ３ｂ及び／又は繰り返し歪み若しくはＰｉｅｚｏ１活性化の後に上方制御若しくは下方制御される他の遺伝子と組み合わせて増加させることを含む。Ｇｉｍａｐ６の活性又は発現を増加させるために、Ｇｉｍａｐ６をコードするｍＲＮＡ転写産物を細胞に導入することができ、エピソームを細胞に導入することを含むが、これに限定されない、導入遺伝子フリーのアプローチ又は代替的にはＧｉｍａｐ６をコードする導入遺伝子を用いることもできる。幾つかの実施形態において、遺伝子編集を用いて細胞のＧｉｍａｐ６発現エレメントに遺伝子改変（例えばプロモーター強度、リボソーム結合、ＲＮＡ安定性を増加させるか、又はＲＮＡスプライシングに影響を与えるための１つ以上の改変）を導入する。

細胞へのｍＲＮＡ送達を用いる本開示の実施形態において、既知の化学修飾を用いて、細胞における先天性免疫応答を回避することができる。例えば、カノニカルヌクレオチドのみを含む合成ＲＮＡは、パターン認識受容体に結合することができ、細胞において強力な免疫応答を誘発することができる。この応答は、翻訳ブロック、炎症性サイトカインの分泌、及び細胞死を引き起こし得る。或る特定の非カノニカルヌクレオチドを含むＲＮＡは、自然免疫系による検出を回避することができ、高効率でタンパク質に翻訳され得る。特に先天性免疫応答を回避するためのヌクレオチド修飾に関して、米国特許第９，１８１，３１９号（引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。

幾つかの実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６の発現は、所望のレベルの過剰発現を（様々なプロモーター強度又は発現制御エレメントの他の選択により）指向することができる導入遺伝子を細胞に導入することによって増加させる。導入遺伝子は、当該技術分野で既知の様々なウイルスベクター又はトランスフェクション試薬（脂質ナノ粒子を含む）を用いて導入することができる。幾つかの実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６の発現は、導入遺伝子フリーの方法（例えば、エピソーム送達）によって増加させる。幾つかの実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６又は本明細書に開示される他の遺伝子の発現又は活性は例えば、プロモーター強度、リボソーム結合又はＲＮＡ安定性を増加させるための１つ以上の改変を導入する遺伝子編集技術を用いて増加させる。

様々な編集技術が既知であり、本開示の様々な実施形態に従って適用することができる。遺伝子編集技術としては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）、ジンクフィンガー（ＺＦ）、及び転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）等が挙げられるが、これらに限定されない。これらのＤＮＡ結合ドメイン１つ以上とＦｏｋ１エンドヌクレアーゼの切断ドメインとを含む融合タンパク質を使用して、細胞内のＤＮＡの所望の領域に二本鎖切断を生じさせることができる（例えば、米国特許出願公開第２０１２／００６４６２０号、米国特許出願公開第２０１１／０２３９３１５号、米国特許第８，４７０，９７３号、米国特許出願公開第２０１３／０２１７１１９号、米国特許第８，４２０，７８２号、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号、米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号、米国特許第８，４５０，４７１号、米国特許第８，４４０，４３１号、米国特許第８，４４０，４３２号、及び米国特許出願公開第２０１３／０１２２５８１号（これら全ての内容が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。幾つかの実施形態において、遺伝子編集は、当該技術分野において既知のＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）を使用して行われる。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号、米国特許第８，９０６，６１６号、及び米国特許第８，９９９，６４１号（それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。

幾つかの実施形態において、方法は、細胞にサイクリック２Ｄ、３Ｄ、又は４Ｄストレッチを適用することを含む。様々な実施形態において、サイクリック２Ｄ、３Ｄ、又は４Ｄストレッチを受ける細胞は、ＣＤ３４富化細胞、ｉＰＳＣ、ＥＣ、及びＨＥＣのうちの１つ以上から選択される。例えば、細胞集団は、国際公開第２０１７／０９６２１５号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されているように、繰り返し歪み生体力学的伸展を提供するバイオリアクターに導入される。繰り返し歪み生体力学的伸展は、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６の活性又は発現を増加させることができる。これらの実施形態において、機械的手段が、細胞、又は細胞（例えば、ＥＣ又はＨＥＣ）を上で培養させる細胞培養表面に伸展力を加える。例えば、フレキシブル生体適合性表面及び／又は生体模倣表面に取り付けられたコンピュータ制御真空ポンプシステム又は伸展力を提供する他の手段（例えば、ＦｌｅｘＣｅｌｌ（商標）ＴｅｎｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ、ＣｙｔｏｓｔｒｅｔｃｈｅｒＳｙｓｔｅｍ）を使用して、規定の制御された繰り返し歪み条件下で細胞にｅｘｖｉｖｏでサイクリック２Ｄ、３Ｄ、又は４Ｄストレッチを適用することができる。例えば、適用されるサイクリックストレッチは、数時間又は数日間（例えば、約７日間）、約１％～約２０％の繰り返し歪み（例えば約６％の繰り返し歪み）であり得る。様々な実施形態において、繰り返し歪みは、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約６時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約１２０時間、少なくとも約１４４時間、又は少なくとも約１６８時間適用される。

代替的又は付加的に、ＥＨＴは、Ｔｒｐｖ４活性化によって刺激される。Ｔｒｐｖ４活性化は、細胞（例えば、ＣＤ３４富化細胞、ＥＣ、又はＨＥＣ）を、任意に、ＧＳＫ１０１６７９０Ａ、４ａｌｐｈａ－ＰＤＤ、又はそれらの類似体及び／又は誘導体から選択される、１つ以上のＴｒｐｖ４アゴニストと接触させることによって行うことができる。

一般に、様々な段階で、細胞集団は、所望の表現型の細胞について富化され、及び／又は望ましくない表現型の細胞を枯渇させることができる。そのような正及び負の選択方法は、当該技術分野において既知である。例えば、細胞は、蛍光活性化セルソーター、又は細胞を或る特定の細胞表面抗原と結合する磁気ビーズを使用して、細胞表面抗原（本明細書に記載のものを含む）に基づいて選別することができる。負の選択カラムは、望ましくない細胞表面マーカーを発現する細胞を除去するために使用することができる。幾つかの実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞について（ＥＨＴを受ける前及び／又は後に）富化される。幾つかの実施形態において、細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞の増殖を促進する条件下で培養され、それによって増殖された幹細胞の集団を産生する。

様々な実施形態において、ＣＤ３４＋細胞（例えば、浮遊細胞及び／又は接着細胞）は、ｉＰＳＣ分化の８日目～１５日目の間に内皮造血転換を受ける培養物から採取される。

様々な実施形態において、ＨＳＣ又はＣＤ３４富化細胞は、更に増殖される。例えば、ＨＳＣ又はＣＤ３４富化細胞は、米国特許第８，１６８，４２８号、米国特許第９，０２８，８１１号、米国特許第１０，２７２，１１０号、及び米国特許第１０，２７８，９９０号（それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に開示される方法に従って増殖させることができる。幾つかの実施形態において、ＨＳＣ又はＣＤ３４富化細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖は、プロスタグランジンＥ_２（ＰＧＥ２）又はＰＧＥ_２誘導体を用いる。本開示の幾つかの実施形態において、ＨＳＣは、少なくとも約０．０１％のＬＴ－ＨＳＣ、又は少なくとも約０．０５％のＬＴ－ＨＳＣ、又は少なくとも約０．１％のＬＴ－ＨＳＣ、又は少なくとも約０．５％のＬＴ－ＨＳＣ、又は少なくとも約１％のＬＴ－ＨＳＣを含む。

赤血球系、骨髄系、及びリンパ系の系統を生じさせる造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＣＤ３４の発現及び系統特異的マーカーの不存在（Ｌｉｎ－と称される）に基づいて識別することができる。幾つかの実施形態において、ＨＳＣを含む幹細胞の集団は、例えば、米国特許第９，８３４，７５４号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されているように富化される。例えば、このプロセスは、ＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ３８、及びＣＤ４３のうちの１つ以上の発現に基づいて細胞集団を選別することを含むことができる。ＣＤ３４^＋、ＣＤ９０^＋、ＣＤ３８^－、及びＣＤ４３^－のうちの１つ以上の画分を、更なる分化のために選択することができる。幾つかの実施形態において、造血系統への分化のための幹細胞集団は、少なくとも約８０％のＣＤ３４^＋、又は少なくとも約９０％のＣＤ３４^＋、又は少なくとも約９５％のＣＤ３４^＋である。

幾つかの実施形態において、幹細胞集団、又はＣＤ３４富化細胞若しくはその画分、又は誘導体集団は、米国特許出願公開第２０２０／０３０８５４０号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されているように増殖される。例えば、細胞を、例えば、ＳＲ１又はＳＲ１誘導体を含むアリール炭化水素受容体アンタゴニストに曝露することによって細胞を増殖させる。Wagner et al., Cell Stem Cell 2016;18(1):144-55及びBoitano A., et al., Aryl Hydrocarbon Receptor Antagonists Promote the Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells. Science 2010 Sep 10; 329(5997): 1345-1348も参照されたい。

幾つかの実施形態において、ＣＤ３４^＋細胞の増殖を促進する化合物としては、例えば、ＵＭ１７１又はＵＭ７２９を含むピリミドインドール誘導体が挙げられる（米国特許出願公開第２０２０／０３０８５４０号（引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。

幾つかの実施形態において、幹細胞集団又はＣＤ３４富化細胞は、国際公開第２０２０／２０５９６９号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されているように、ペリオスチン及び／又は血小板由来増殖因子受容体α（ｐｄｇｆｒａ）を発現する細胞、又はペリオスチン及び／又はｐｄｇｆｒａを発現するように改変された細胞について更に富化される。そのような発現は、細胞にコード化転写産物を送達するか、又はコード化導入遺伝子を導入するか、又は非統合エピソームを細胞に導入することに限定されない導入遺伝子フリーの方法によって行うことができる。幾つかの実施形態において、遺伝子編集を用いて細胞の発現エレメントに、例えばプロモーター活性若しくは強度、リボソーム結合、ＲＮＡ安定性を改変させるか、又はＲＮＡスプライシングに影響を与えるための遺伝子改変を導入する。

更に他の実施形態において、幹細胞集団又はＣＤ３４富化細胞は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ１の阻害剤と共に培養される。代替的に、ＥＺＨ１は、幹細胞集団において、部分的に若しくは完全に欠失若しくは不活性化されるか、又は一時的に抑制される。ＥＺＨ１の阻害により、骨髄前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋）をリンパ系の系統に導くことができる。国際公開第２０１８／０４８８２８号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。更に他の実施形態において、ＥＺＨ１は、幹細胞集団において過剰発現される。

様々な実施形態において、ＨＳＣ集団又はその画分は、前駆Ｔ細胞、Ｔ細胞及びその画分、Ｂ細胞、或る特定の抗体を産生するようにカスタム設計されたＢ細胞、ＮＫ細胞、好中球、単球又はマクロファージ、巨核球、赤血球、並びに血小板から選択することができる造血系統に分化される。

幾つかの実施形態において、細胞集団は、部分的又は完全なＮｏｔｃｈリガンド、ＳＨＨ、細胞外マトリックス成分（複数の場合もある）、及び／又はそれらの組み合わせと共に、ｅｘｖｉｖｏで培養されて、ＨＳＣをＣＤ７^＋前駆Ｔ細胞に、任意に、Ｔ細胞系統又は他の系統（例えば、ＮＫ細胞）に分化させる。さらに、既知のプロセスによれば、異種ＯＰ９－ＤＬ１細胞が、Ｔ細胞への分化のために多くの場合用いられる。ＯＰ９－ＤＬ１共培養系は、幹細胞供給源からのＴ細胞発生をサポートするために、Ｎｏｔｃｈリガンドｄｅｌｔａ様１（ＤＬＬ１）で形質導入した骨髄間質細胞株（ＯＰ９）を使用する。ＯＰ９－ＤＬ１系は、臨床用途のための細胞の可能性を制限する。臨床使用のためにｈｉＰＳＣからＴリンパ球を生成することができるフィーダー細胞フリー系が必要とされており、幾つかの実施形態において、本発明はこの目的を達成する。

「Ｎｏｔｃｈリガンド」という用語は、本明細書において使用される場合、造血幹細胞又は前駆Ｔ細胞の膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドに結合することができるリガンドを指す。Ｎｏｔｃｈ受容体としては、Ｎｏｔｃｈ－１、Ｎｏｔｃｈ－２、Ｎｏｔｃｈ－３、及びＮｏｔｃｈ－４が挙げられる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、典型的には、アミノ末端に２０個～２２個のアミノ酸を含むＤＳＬドメイン（Ｄ－Ｄｅｌｔａ、Ｓ－Ｓｅｒｒａｔｅ、及びＬ－Ｌａｇ２）を有し、細胞外表面に３個～８個のＥＧＦリピートを有する。様々な実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｄｅｌｔａ様１（ＤＬＬ１）、Ｄｅｌｔａ様４（ＤＬＬ４）、ＳＦＩＰ３、又はそれらの機能部分のうちの少なくとも１つを含む。ｉｎｖｉｖｏで胸腺間質細胞によって入ってくるリンパ球前駆細胞に伝達される重要なシグナルは、皮質胸腺上皮細胞によって発現されるＤＬ４によって媒介される。

最も初期の胸腺内前駆細胞は、高レベルのＣＤ３４及びＣＤ７を発現し、ＣＤ１ａを発現せず、成熟Ｔ細胞マーカーであるＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ３についてトリプルネガティブ（ＴＮ）である。Ｔ細胞系統へのコミットメントは、ＣＤ７発現前胸腺細胞によるＣＤ１ａの発現と関連している。したがって、Ｔ細胞発生の未成熟段階は、典型的には、ＣＤ３４^＋ＣＤ１ａ^－細胞（最も未成熟）及びＣＤ３４^＋ＣＤ１ａ^＋細胞として描写される。初期の胸腺細胞によるＣＤ３４^＋ＣＤ７^＋ＣＤ１ａ^－からＣＤ３４^＋ＣＤ７^＋ＣＤ１ａ^＋への移行は、Ｔ細胞のコミットメントと関連している。ＣＤ３４^＋ＣＤ７^＋ＣＤ１ａ^＋細胞は、Ｔ細胞系統が制限されている可能性が高い。この段階の後、胸腺細胞はＣＤ４未成熟シングルポジティブ段階に進み、この時点でＣＤ８の不存在下でＣＤ４が発現される。その後、細胞のサブセットはＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ダブルポジティブ（ＤＰ）段階に分化する。最後に、ＴＣＲα再構成の後、ＴＣＲαβ発現ＤＰ胸腺細胞は正及び負の選択を受け、ＣＤ４^＋ＣＤ８^－シングルポジティブ（ＳＰ）Ｔ細胞及びＣＤ４^－ＣＤ８^＋シングルポジティブ（ＳＰ）Ｔ細胞を産生する。

幾つかの実施形態において、前駆Ｔ細胞は、ＣＤ７発現について富化によって単離される。幾つかの実施形態において、前駆Ｔ細胞は、米国特許出願公開第２０２０／０３０８５４０号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されているように増殖される。例えば、細胞を、例えば、ＳＲ１又はＳＲ１誘導体を含むアリール炭化水素受容体アンタゴニストに曝露することによって細胞を増殖させることができる。Wagner et al., Cell Stem Cell 2016;18(1):144-55も参照されたい。幾つかの実施形態において、増殖を促進する化合物としては、例えば、ＵＭ１７１又はＵＭ７２９を含むピリミドインドール誘導体が挙げられる（米国特許出願公開第２０２０／０３０８５４０号（引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。

前駆Ｔ細胞への分化は、幾つかの実施形態において、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ３Ｌ及びインターロイキン（ＩＬ）－７の存在を更に含むことができる。様々な実施形態において、作製されたＣＤ７＋前駆Ｔ細胞は、ＣＤ１ａを発現する。ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞は、ＣＤ３４を発現しないか、又はＨＳＣ集団と比較して低下したレベルのＣＤ３４を発現する。幾つかの実施形態において、ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞（又はその一部分）は更にＣＤ５を発現する。したがって、前駆Ｔ細胞の表現型はＣＤ７^＋ＣＤ１ａ^＋であってもよい。幾つかの実施形態において、前駆Ｔ細胞の表現型はＣＤ７^＋ＣＤ５^＋である。幾つかの実施形態において、前駆Ｔ細胞は、ＣＤ７^＋ＣＤ１ａ^＋ＣＤ５^＋、及び任意に、ＣＤ３４^＋である。

幾つかの実施形態において、前駆Ｔ細胞は、低下したレベルのＣＤ３４発現、最小限のＣＤ３４発現（ＨＳＣ集団と比較して）を示すか、又はＣＤ３４発現を示さない。幾つかの実施形態において、ＣＤ３４発現は、ＨＳＣ集団に対して、集団において少なくとも約５０％、又は少なくとも約７５％減少する。

幾つかの実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に結合して関与することができる抗Ｎｏｔｃｈ（アゴニスト）抗体である。幾つかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体（ヒト又はヒト化抗体を含む）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ナノボディ、又はＮｏｔｃｈシグナル伝達経路を活性化することができる他の抗体フラグメント若しくは抗原結合分子である。

幾つかの実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドは、ＤｅｌｔａファミリーのＮｏｔｃｈリガンドである。幾つかの実施形態において、Ｄｅｌｔａファミリーのリガンドは、Ｄｅｌｔａ－１（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ００３５２２、ホモ・サピエンス（Homo sapiens））、Ｄｅｌｔａ様１（ＤＬＬ１、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００５６１８及びＮＰ＿００５６０９、ホモ・サピエンス、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ８０９０３、１４８３２４、ハツカネズミ（M. musculus））、Ｄｅｌｔａ－４（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ２７３４５４、ＢＡＢ１８５８０、ハツカネズミ、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ２７９３０５、ＡＡＦ８１９１２、ホモ・サピエンス）、及び／又はＤｅｌｔａ様４（ＤＬＬ４、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｑ９ＮＲ６１、ＡＡＦ７６４２７、ＡＦ２５３４６８、ＮＭ＿０１９０７４、ホモ・サピエンス、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＭ０１９４５４、ハツカネズミ（Mus musculus））である。Ｎｏｔｃｈリガンドは市販されているか、又は例えば、組換えＤＮＡ技術によって製造することができる。

幾つかの実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドは、ヒトＤＬＬ１又はＤＬＬ４Ｎｏｔｃｈリガンドと少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％同一（例えば、約１００％同一）であるアミノ酸配列を含む。Ｎｏｔｃｈリガンドの機能的誘導体（フラグメント又はその一部分を含む）は、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合して活性化することができる。Ｎｏｔｃｈ受容体への結合は、ｉｎｖｉｔｒｏ結合アッセイ及び受容体活性化／細胞シグナル伝達アッセイを含む、当該技術分野において既知の種々の方法によって決定することができる。

様々な実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドは可溶性であり、任意に、磁気富化又は濃縮プロセスを可能にするために、任意に常磁性である微小粒子又はナノ粒子上に固定化される。更に他の実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドは２Ｄ又は３Ｄ培養表面に固定化され、任意に、ＶＣＡＭ－１等の他の接着分子と共に固定化される。米国特許出願公開第２０２０／０３９９５９９号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。他の実施形態において、ビーズ又は粒子は、ポリマー（例えば、ポリスチレン又はＰＬＧＡ）、金、デキストラン鉄であるか、又は脂質及び／又はタンパク質から形成される粒子等の生体物質で構成される。様々な実施形態において、粒子は、約０．０１μｍ（１０ｎｍ）～約５００μｍ（例えば、１μｍ～約７μｍ）の直径又は最大寸法を有する。更に他の実施形態において、国際公開第２０２０／１３１５８２号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されているように、コンジュゲートしたリガンドを有するポリマー足場を用いることができる。例えば、足場は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ、アルギン酸又はアルギン酸誘導体、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、ヒアルロン酸、ポリ（リジン）、ポリヒドロキシブチレート、ポリ－ε－カプロラクトン、ポリフォスファジン（polyphosphazines）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（アリルアミン）、ポリ（アクリレート）、ポリ（４－アミノメチルスチレン）、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリオキサマー（polyoxamer）、ポリ（ウロン酸）、ポリ（無水物）、ポリ（ビニルピロリドン）、及びそれらの任意の組み合わせで構成することができる。幾つかの実施形態において、足場は、約１ｐｍ～１００ｐｍの直径を有する細孔を含む。

幾つかの実施形態において、ＮｏｔｃｈリガンドのＣ末端は、選択された支持体にコンジュゲートしている。幾つかの実施形態において、これには、例えば、ビオチン分子を介して支持体に酵素的にコンジュゲートすることができるＮｏｔｃｈリガンドのＣ末端に配列を追加することが含まれ得る。別の実施形態において、Ｆｃセグメントが支持体にコンジュゲートしているプロテインＡ又はプロテインＧに結合することによって固定化することができるように、Ｎｏｔｃｈリガンド－Ｆｃ融合物が調製される。当然のことながら、既知のタンパク質コンジュゲーション方法のいずれかを用いることができる。

したがって、様々な実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンドは、２Ｄ又は３Ｄ培養系に固定化、機能化、及び／又は埋め込まれている。Ｎｏｔｃｈリガンドは、例えば、フィブロネクチン、レトロネクチン、及びラミニンから選択される１つ以上の細胞外マトリックスの成分と共に組み込まれてもよい。幾つかの実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンド及び／又は細胞外マトリックスの成分は、３Ｄ培養条件を提供する不活性材料に埋め込まれている。例示的な材料としては、セルロース、アルギン酸塩、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、Ｎｏｔｃｈリガンド、細胞外マトリックスの成分、又はそれらの組み合わせは、分化及び／又は増殖を促す細胞にトポグラフィカルパターン及び／又はテクスチャ（例えば、粗さ）を提供する培養条件と接触している。

幾つかの実施形態において、ＨＳＣは、ＴＮＦ－α及び／又はアリール炭化水素／ダイオキシン受容体（ＳＲ１）のアンタゴニストを含む培地中で、Ｎｏｔｃｈリガンドの存在下において培養することによって、前駆Ｔ細胞に分化する。米国特許出願公開第２０２０／０３９０８１７号、米国特許出願公開第２０２１／０１６９９３４号、及び米国特許出願公開第２０２１／０１６９９３５号（それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。幾つかの実施形態において、ＨＳＣは、固定化されたＤｅｌｔａ様４リガンド及びフィブロネクチンフラグメントの存在下において、ＴＮＦ－α、ＩＬ－７、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３Ｌ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び任意にＳＲ１を含む培地中で培養される。幾つかの実施形態において、細胞は、３つの機能的ドメインであるヒトフィブロネクチン細胞結合ドメイン（Ｃドメイン）、ヘパリン結合ドメイン（Ｈドメイン）、及びＣＳ－１配列ドメインを含む、組換えヒトフィブロネクチンであるレトロネクチンと共に培養される。幾つかの実施形態において、細胞は、固定化されたＤｅｌｔａ様４リガンド及びレトロネクチンの存在下において培養される。幾つかの実施形態において、細胞は、固定化されたＤｅｌｔａ様４リガンド、ＴＮＦ－α、及びレトロネクチンの存在下において培養される。幾つかの実施形態において、細胞は、固定化されたＤｅｌｔａ様１リガンド及びレトロネクチンの存在下において培養される。幾つかの実施形態において、細胞は、ＳＦＩＰ３及びレトロネクチンの存在下において培養される。幾つかの実施形態において、細胞は、固定化されたＤｅｌｔａ様４リガンド及びＳＨＨ分子及び／又はそれらの機能的誘導体の存在下において培養される。例示的なフィブロネクチンフラグメントには、１つ以上のＲＧＤＳ、ＣＳ－１、及びヘパリン結合モチーフが含まれる。フィブロネクチンフラグメントは、溶液中に遊離している場合もあれば、培養表面又は粒子上に固定化されている場合もある。幾つかの実施形態において、細胞は、ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞を調製するために、５日間～７日間培養される。

様々な実施形態において、方法は、ＨＳＣ集団を、Ｎｏｔｃｈリガンド（上記の実施形態のいずれかを含む）と共に、細胞外マトリックスの成分（複数の場合もある）あり又はなしで培養し、任意に、分化の或る特定の段階で培養物にＴＮＦ－αを添加することによって、前駆Ｔ細胞、又はＴ細胞系統を産生する。したがって、幾つかの実施形態において作製される細胞は、Ｔ細胞系統にコミットされた前駆細胞（progenitor or precursor cells）（「前駆Ｔ細胞」）である。幾つかの実施形態において、細胞はＣＤ７^＋前駆Ｔ細胞である。幾つかの実施形態において、細胞は、ＣＤ２５^＋未成熟Ｔ細胞、又はＣＤ４若しくはＣＤ８系統のコミットメントを受けた細胞である。幾つかの実施形態において、細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋ダブルポジティブ（ＤＰ）、ＣＤ４^－ＣＤ８^＋、又はＣＤ４^＋ＣＤ８^－である。幾つかの実施形態において、細胞は、ＣＤ４^－ＣＤ８^＋又はＣＤ４^＋ＣＤ８^－及びＴＣＲ^ｈｉであるシングルポジティブ（ＳＰ）細胞である。幾つかの実施形態において、細胞はＴＣＲαβ^＋及び／又はＴＣＲγΔ^＋である。様々な実施形態において、細胞はＣＤ３^＋である。

前駆Ｔ細胞の養子移入は、Ｔ細胞の再構成を促進するための戦略である。前駆Ｔ細胞は発生的に未成熟であり、宿主の胸腺において正及び負の選択を受ける。したがって、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に関連する臨床的課題を回避できる宿主耐性Ｔ細胞を産生する、レシピエントの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に限定されるようになる。重要なことに、前駆Ｔ細胞との生着は胸腺構造を回復させ、その後のＨＳＣ由来前駆細胞による胸腺播種を改善する。その固有の再生医療特性に加えて、前駆Ｔ細胞をＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で遺伝子操作して（遺伝子又はｍＲＮＡ送達のいずれかを介して）、腫瘍関連抗原に対する特異性を付与することもできる。

様々な実施形態において、前駆Ｔ細胞は、１つ以上のＮｏｔｃｈリガンドを含めて、所望のＴ細胞系統の細胞を生成するために好適な条件下で更に培養される。例えば、Ｔ細胞系統の細胞を形成するのに十分な時間、記載されているように、１つ以上のＮｏｔｃｈリガンドの存在下において細胞を培養することができる。幾つかの実施形態において、幹細胞又は前駆Ｔ細胞は、可溶性Ｎｏｔｃｈリガンド、又は粒子若しくは他の支持体にコンジュゲートされたＮｏｔｃｈリガンド、又はＮｏｔｃｈリガンド発現細胞と共に懸濁液中で培養される。幾つかの実施形態において、前駆Ｔ細胞又は幹細胞は、バイオリアクター、任意に、閉鎖型又は閉鎖型の自動バイオリアクターにおいて、懸濁液中又は接着形式で、懸濁液中の可溶性又はコンジュゲートしたＮｏｔｃｈリガンドと共に培養される。所望のＴ細胞系統へのコミットメント及び分化を促進する、１つ以上のサイトカイン、細胞外マトリックス成分（複数の場合もある）、及び胸腺ニッチ因子（複数の場合もある）も、培養物又はリアクターに添加することができる。そのようなサイトカイン又は因子は、当該技術分野において既知である。様々な実施形態において、ＨＳＣ集団をＮｏｔｃｈリガンドと共に約４日間～約２１日間、又は約６日間～約１８日間、又は約７日間～約１４日間培養して、前駆Ｔ細胞を生成する。幾つかの実施形態において、幹細胞集団又はその誘導体を少なくとも約２１日間、又は少なくとも約２８日間培養して、成熟Ｔ細胞系統又はＮＫ細胞を生成する。

様々な実施形態において、ＨＳＣ集団は、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）中で培養される。Hagen, M. et al. (2019)を参照されたい。ＡＴＯには、血清フリーの条件でＮｏｔｃｈリガンド発現間質細胞株を用いたＨＳＣ（又はＨＳＣの集合体）の培養物が含まれる。人工胸腺オルガノイドは３Ｄ系であり、造血前駆体のナイーブＣＤ３^＋ＣＤ８^＋及びＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞への分化を誘導する。

様々な実施形態において、方法は、前駆Ｔ細胞の誘導体を生成すること、又は前駆Ｔ細胞からＴ細胞系統を生成することを含む。或る特定の実施形態において、前駆Ｔ細胞の誘導体又はＴ細胞系統は、ＣＤ３及びＴ細胞受容体を発現する。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞系統はＣＤ８^＋及び／又はＣＤ４^＋である。例えば、Ｔ細胞系統には、ＣＤ８^＋ＣＤ４^－、ＣＤ８^－ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋ＣＤ４^＋、及びＣＤ８^－ＣＤ４^－細胞のうちの１つ以上が含まれ得る。幾つかの実施形態において、ｉＰＳＣ、ＣＤ３４＋細胞、又はそれらの誘導体は、前駆Ｔ細胞、Ｔ細胞、及び／又はＮＫ細胞レベルでキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されている。

幾つかの実施形態において、Ｔ細胞系統は制御性Ｔ細胞である。制御性Ｔ細胞（又はＴレグ）は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋として定義される。Ｔレグは、自己抗原及び外来抗原に対する免疫応答を制御し、自己免疫疾患の予防に役立つ。幾つかの実施形態における前駆Ｔ細胞のＴレグへの分化には、前駆Ｔ細胞又はＴレグ前駆体を、ＴＧＦβ及び任意にＩＬ－２及び／又はＩＬ－１０と共に培養することが含まれる。

幾つかの実施形態において、ＨＳＣ集団又はその画分は、Ｂリンパ球（「Ｂ細胞」）に分化される。例えば、ＣＤ３４＋又はＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を、ＭＳ５間質細胞又はＳ１７間質細胞と共に培養すると（例えば、１５日間～２５日間、又は約２１日間）、ＣＤ１９、ＣＤ４５、及びＣＤ１０の発現を伴うＢリンパ系同一性を生成することができる。Carpenter L. et al., Human induced pluripotent stem cells are capable of B-cell lymphopoiesis, Blood 117(15):4008-4011、Dubois F. et al., Toward a better definition of hematopoietic progenitors suitable for B cell differentiation, Plos One Dec. 15, 2020を参照されたい。様々な実施形態において、本開示に従って産生されたＢ細胞は、表面ＩｇＭ（ｓＩｇＭ）を発現し、ＶＤＪ再構成を受ける。様々な実施形態において、本開示に従って産生されたＢ細胞は、成熟のために被験体の脾臓及び二次リンパ組織に生着する。

幾つかの実施形態において、ＨＳＣ集団又はその画分は、単球、マクロファージ、又は好中球に分化される。例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－３、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ＳＣＦ、ＦＧＦ２、及びＶＥＧＦとの培養によって赤血球骨髄系前駆体（erythromyeloid precursors）（ＥＭＰ）（ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋）を生成することができ、単球への分化が続く。Ｍ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、及びＩＬ－６との培養を用いるための単球への分化。Cao X et al., Differentiation and Functional Comparison of Monocytes and Macrophages from hiPSCs with Peripheral Blood Derivatives, Stem Cell Reports. 2019 Jun 11; 12(6): 1282-1297を参照されたい。本開示に従って調製された単球及びマクロファージ系統はＣＤ１４＋であり、エンドサイトーシス及び食細胞機能を示す。幾つかの実施形態において、マクロファージは、ｅｘｖｉｖｏでＭ１（炎症促進性）又はＭ２（免疫抑制性）表現型に極性化される。幾つかの実施形態において、ｉＰＳＣ由来ｈＣＤ３４＋細胞の分化によって、ＣＤ３３及びＣＤ１１ｂ等の食細胞マーカーを有するＣＤ４５＋造血細胞が生成され、任意に、その後、例えばＣＤ６６ｂ、ＣＤ１６ｂ、ＧＰＩ－８０等の好中球特異的マーカーを有する細胞が生成される。これらのプロセスでは、ＳＣＦ、ＩＬ３、ＦＬＴ３、ＩＬ６、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、及び／又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、サイトカイン及び増殖因子の混合物を含む分化培地を用いることができる。幾つかの実施形態において、好中球及びその前駆体は、Saeki L., et al., A Feeder-Free and Efficient Production of Functional Neutrophils from Human Embryonic Stem Cells, Stem Cells Vol. 27, Issue 1, 2009, Pages 59-67、Morishima T. et al., Neutrophil differentiation from human-induced pluripotent stem cells. J. Cell. Physiol. 226: 1283-1291, 2011、Yokoyama Y. et al., Derivation of functional mature neutrophils from human embryonic stem cells. Blood 2009 Jun 25;113(26):6584-92、及びSweeney CL et al., Generation of functionally mature neutrophils from induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol 2014; 1124:189-206に記載されている方法によって生成される。

幾つかの実施形態において、ＨＳＣ集団又はその画分は、巨核球又は血小板に分化される。例えば、（血小板の再生可能な供給源として）巨核球は、ＳＣＦ、ＩＬ－１１、及びＴＰＯとの数日間（例えば、約５日）の培養によって、ＨＳＣ又はその画分から調製することができる。代替的に、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＳＤＦ－１、及びＦＧＦ－４等の他のサイトカイン及び増殖因子を用いることもできる。巨核球はＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋となる。Liu L., Efficient Generation of Megakaryocytes From Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Food and Drug Administration-Approved Pharmacological Reagents, Stem Cells Transl Med. 2015 Apr; 4(4): 309-319を参照されたい。血小板は、ＩＬ－１１を含む血清フリー培地での培養により、巨核球から更に生成することができる。ＣＤ４１＋ＣＤ４２ａ＋血小板様粒子が培地から回収される。

幾つかの実施形態において、前駆Ｔ細胞の誘導体はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。幾つかの実施形態において、ＮＫ細胞は、米国特許第１０，２６６，８０５号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されているように、前駆Ｔ細胞から生成される。例えば、前駆Ｔ細胞は、ＩＬ－１５と共に培養するとＮＫ細胞を生じさせることができる。幾つかの実施形態において、ＮＫ細胞は、ｉＰＳＣ、胚体、ｈＣＤ３４＋細胞、若しくはＮＫ細胞の遺伝子編集に基づいて、又はＮＫ細胞におけるｍＲＮＡ発現を介して、ＣＡＲを発現する。

幾つかの実施形態において、ＨＳＣ集団又はその画分は、赤血球又はその誘導体に分化される。本開示に従って産生された赤血球は、例えば、遺伝性又は後天性の赤血球障害、骨髄不全障害、高地関連の生理学的及び病理学的状態、化学物質又は放射線曝露に関連する状態に対する療法において、及び／又はＨＳＣ移植を受ける被験体の治療のために、投与又は使用することができる。更なる実施形態において、本開示に従って調製された赤血球は、ヒトの疾患又は生理学的若しくは病理学的状態を治療するために、薬物（酵素を含むがこれらに限定されない）、酸素担体、又は他の好適な材料を送達又はカプセル化する薬学的に許容される組成物として提供される。

他の態様において、本発明は、本明細書に記載の方法によって産生された細胞集団、又はその薬学的に許容される組成物を提供する。幾つかの実施形態において、細胞集団は、必要とする被験体への投与後に、胸腺、脾臓、又は二次リンパ器官に生着することができるリンパ球集団である。様々な実施形態において、所望の細胞集団、薬学的に許容されるビヒクルを含む細胞療法用の組成物が調製される。薬学的組成物は、少なくとも約１０^２個の細胞、又は少なくとも約１０^３個、若しくは少なくとも約１０^４個、若しくは少なくとも約１０^５個、若しくは少なくとも約１０^６個、若しくは少なくとも約１０^７個、若しくは少なくとも約１０^８個の細胞を含むことができる。例えば、幾つかの実施形態において、レシピエントの体重１ｋｇ当たり約１０００００個～約４０００００個の細胞（例えば、約２０００００細胞／ｋｇ）を含む薬学的組成物が投与される。

本開示の細胞組成物は、静脈内注入又は他の投与経路に適した薬学的に許容される担体又はビヒクルを更に含んでいてもよく、組成物は好適な抗凍結剤を含んでいてもよい。例示的な担体は、ＤＭＳＯ（例えば約１０％のＤＭＳＯ）である。細胞組成物は、ユニットバイアル又はバッグで提供し、使用まで凍結して保管することができる。或る特定の実施形態において、組成物の容量は、約１液量オンス～１パイントである。

幾つかの実施形態において、本開示は、ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞、又はその薬学的に許容される組成物を提供し、本明細書に開示される方法によってＣＤ７＋前駆Ｔ細胞が産生される。様々な実施形態において、前駆Ｔ細胞は、レシピエントの胸腺又は脾臓に生着することができる。前駆Ｔ細胞は、骨髄移植患者における白血病又は他の種類の癌の再発リスクを低下させ、患者の著しい罹患率及び死亡率を引き起こす移植後の感染症の数を減少させる可能性を有する。別の態様において、本開示は、本明細書に開示される方法によって産生された、前駆Ｔ細胞の誘導体若しくはＴ細胞系統、又はそれらの薬学的に許容される組成物を提供する。

幾つかの実施形態において、細胞集団は、Ｔ細胞集団（又は前駆Ｔ細胞集団）又はＮＫ細胞集団であり、例えば、リンパ球減少症、癌、免疫不全、ウイルス感染症、自己免疫疾患（特にＴ細胞集団がＴレグを含む場合）、骨格形成異常、骨髄不全症候群、又はＴ細胞の発生若しくは機能を損なう遺伝性障害から選択される病態を患っているヒト被験体に対する養子細胞療法に有用である。例示的な遺伝性障害は、免疫系に影響を与え、免疫低下状態として現れることもあれば、自己免疫状態又は炎症促進性状態として現れることもある。幾つかの実施形態において、被験体は、場合により、血液悪性腫瘍又は固形腫瘍である癌を患っている。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞はＣＡＲ－Ｔ細胞である。

幾つかの実施形態において、細胞集団はＢリンパ球集団であり、被験体の脾臓又は二次リンパ組織に生着することができる。本開示によるＢ細胞集団は、免疫無防備状態患者における液性免疫を部分的に再構成する可能性を有し、例えば、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫感染症を含む感染性疾患からの防御又はそれらの治療を提供する。様々な実施形態において、本開示によるＢ細胞は、ｉｎｖｉｖｏで抗原特異的抗体を産生するために形質細胞に分化することができる。他の実施形態において、本開示に従って産生されたＢ細胞は、癌免疫療法に用いることができる。幾つかの実施形態において、キメラ抗原Ｂ細胞（ＣＡＲＢ細胞）は、ｉＰＳＣ、胚体、ｈＣＤ３４＋細胞、造血前駆細胞、又はＢ細胞レベルでの遺伝子改変によって調製される。ＣＡＲＢ細胞は、表面ＢＣＲを発現し、及び／又は癌抗原若しくは感染性疾患抗原等の標的抗原を認識する組換えモノクローナル抗体を分泌する。更に他の実施形態において、本開示に従って産生されたＢ細胞は、抗体（例えば、感染性病原体からの防御を提供するワクチン抗体）のｅｘｖｉｖｏ産生に使用される。

幾つかの実施形態において、細胞集団は単球又はマクロファージ細胞集団であり、細胞集団は腫瘍を含む被験体の様々な組織において生着及び成熟することができる。様々な実施形態において、単球又はマクロファージ細胞集団は、被験体において組織定住マクロファージを形成することができる。様々な実施形態において、マクロファージは、主にＭ１（炎症促進性）又はＭ２（免疫抑制性）表現型である。様々な実施形態において、治療を必要とする被験体は、様々な組織若しくは臓器のいずれかの癌、肝臓若しくは腎臓の炎症性疾患、又は細菌感染症（例えば、敗血症又は感染症又は留置医療機器のコロニー形成）を患っている。

幾つかの実施形態において、細胞集団は巨核球集団であるか、又はそこから発生した血小板である。これらの細胞又は血小板は、例えば、凝固経路に影響を与える遺伝性血小板異常の治療に有用である。

幾つかの実施形態において、細胞集団は赤血球集団である。

幾つかの実施形態において、細胞集団（又は血小板）は、自系細胞、又はユニバーサル適合（universally compatible）ドナー細胞、又はＨＬＡ改変細胞若しくはＨＬＡ欠損（HLA null）細胞（例えば、本明細書に記載されるようなもの）に由来する。すなわち、細胞集団は、レシピエント被験体の細胞から調製されたか、又はドナー細胞（例えば、ユニバーサルドナー細胞、ＨＬＡ適合細胞、ＨＬＡ改変細胞、又はＨＬＡ欠損細胞）から調製されたｉＰＳＣから生成される。

他の態様において、本発明は、本明細書に記載の細胞集団、又はその薬学的に許容される組成物を、それを必要とするヒト被験体に投与することを含む、細胞療法の方法を提供する。様々な実施形態において、本明細書に記載の方法は、血液疾患（悪性及び非悪性）、骨髄疾患、及び免疫疾患を治療するために使用される。様々な実施形態において、ヒト被験体は、リンパ球減少症、癌、免疫不全、自己免疫疾患、骨格形成異常、異常ヘモグロビン症、貧血、骨髄不全症候群、及び遺伝性障害（例えば、免疫系に影響を与える遺伝性障害）のうちの１つ以上を含む病態を患っている。幾つかの実施形態において、被験体は、血液悪性腫瘍又は固形腫瘍等の癌を患っている。

幾つかの実施形態において、被験体は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性障害、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、再生不良性貧血、赤芽球癆、発作性夜間血色素尿症、ファンコニ貧血、重症型サラセミア、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、ウィスコット－アルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球症、先天性代謝異常、重症先天性好中球減少症、シュワッハマン－ダイアモンド症候群、ダイアモンド－ブラックファン貧血及び白血球接着不全症から選択される病態を患っている。

本明細書に記載の方法を使用して生成された細胞系統は、例えば、静脈内注入によって被験体に投与される。幾つかの実施形態において、方法は、骨髄破壊的、骨髄非破壊的、又は免疫毒素ベース（例えば、抗ｃ－Ｋｉｔ、抗ＣＤ４５等）の移植前処置（conditioning regimes）に続いて行うことができる。

本明細書において使用される場合、「約」という用語は、関連の数値の±１０％を意味する。

本開示の或る特定の態様及び実施形態を、以下の実施例を参照して更に説明する。

実施例１－ＥＴＶ２過剰発現は、造血性内皮細胞の収率を増加させ、ｉＰＳＣ分化時のＣＤ３４＋細胞形成を増進するが、多能性には影響しない
方法
ｉＰＳＣは、当該技術分野において既知のように、基本的に、Yu, et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells, Science 318, 1917-1920, (2007)、及びJ. Yu, et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science 324, 797-801, (2009)に記載されているように、エピソームリプログラミングによってｈＣＤ３４＋細胞から発生させた。胚様体及び造血性内皮の分化は、基本的に、R. Sugimura, et al., Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature 545, 432-438, (2017)、C. M. Sturgeon, et al, Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 32, 554-561, (2014)、J. Yu, et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318, 1917-1920, (2007)、及びJ. Yu, et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science 324, 797-801, (2009)に記載されているように行った。

要約すると、ｈｉＰＳＣを解離し、Ｌ－グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、アスコルビン酸、ヒトホロトランスフェリン、モノチオグリセロール、ＢＭＰ４、及びＹ－２７６３２を追加した培地に再懸濁した。次に、細胞を、ＥＢ形成のために１０ｃｍ皿（ＥＺＳＰＨＥＲＥ又は低付着プレート）に播種した。１日目に、ｂＦＧＦ及びＢＭＰ４を培地に添加した。２日目に、培地を、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ｂＦＧＦ、及びＢＭＰ４を含む培地に交換した。４日目に、細胞培地を、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを追加した培地に交換した。６日目に、細胞培地を、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、インターロイキン（ＩＬ）－６、ＩＧＦ－１、ＩＬ－１１、ＳＣＦ、及びＥＰＯを追加した培地に交換した。細胞を、ＣＯ_２５％、Ｏ_２５％、及び湿度９５％のインキュベーター内で維持した。ＣＤ３４＋細胞を採取するために、８日目にＥＢを解離し、細胞を７０μｍのストレーナーに通して濾過し、ＣＤ３４磁気ビーズ染色によってＣＤ３４＋細胞を単離した。

結果
ＥＦ１Ａプロモーターの制御下のＥＴＶ２及びＧＦＰ配列の両方を含むアデノウイルスベクターを用いて、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を形質導入した。形質導入後に、ｉＰＳＣ培養物の約４５％がＧＦＰ陽性であることが観察され、ＥＴＶ２過剰発現（ＥＴＶ２－ＯＥ）が確認された。幹細胞性マーカー発現ＴＲＡ－１－６０によって示されるように、ｉＰＳＣ細胞におけるＥＴＶ２－ＯＥがｉＰＳＣの多能性特性を保持することが更に観察された（図１）。図１は、ＥＴＶ２及びＧＦＰ配列を過剰発現させるアデノウイルスベクターによるｉＰＳＣの形質導入効率を表すＦＡＣＳプロットを示す。

次に、ＥＴＶ２－ＯＥ－ｉＰＳＣを（ＥＴＶ２を含まないＧＦＰ配列を有するベクターで形質導入した対照ｉＰＳＣとともに）胚様体に分化させ、続いて造血性内皮細胞に分化させた（Strugeon et al., 2014）。結果から、ＣＤ２３５ａ^－集団におけるＣＤ３４^＋及びＣＤ３１^＋マーカーの発現によって実証されるように、ＥＴＶ２の過剰発現が造血性内皮細胞の形成を増進させることが示唆される（図２）。具体的には、図２は、造血性内皮細胞（ここではＣＤ２３５ａ－ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋と定義される）の代表的なフローサイトメトリー分析を示し、相対定量により、ＥＴＶ２－ＯＥが対照と比べて造血性内皮細胞の形成を増進することが実証される。

さらに、結果から、ＥＴＶ２－ＯＥがＣＤ３４^＋細胞の形成を増進することが示唆される（図３）。図３は、ＣＤ３４＋細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示し、相対定量により、ＥＴＶ２－ＯＥがＣＤ３４＋細胞形成を増進することが実証される。

総合すると、これらのデータから、ｉＰＳＣにおけるＥＴＶ２過剰発現が、それらの多能性特性に影響を与えず、造血性内皮分化及び造血分化を受けるそれらの能力を促進することが示される。

実施例２－Ｐｉｅｚｏ１活性化で生成されたｉＰＳＣ由来ＨＳＣは、骨髄由来ＨＳＣと同様にＴ細胞分化を受ける
方法
ＥＨＴを分析するために、ＥＢ由来ＣＤ３４＋細胞を、Ｙ－２７６３２、ＴＰＯ、ＩＬ－３、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＧＦ－１、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、及びＦＬＴ３を含む培地に懸濁した。細胞が約４時間～１８時間ウェルの底に接着した後（目視検査による）、Ｙｏｄａ１を培養物に添加した。４日～７日後、分析のために細胞を収集した。

ｉＰＳＣを、８日間胚様体に分化させた。８日目に、ｉＰＳＣ由来胚様体からＣＤ３４＋細胞を採取し、更に５日間～７日間培養して、内皮造血転換（ＥＨＴ）を誘導した。次いで、更なる造血系統分化のために、５日目～７日目の間にＣＤ３４＋細胞をＥＨＴ培養物から採取した。

５日目～７日目（又はｉＰＳＣからの分化の合計１３日目～２１日目）の間にＥＨＴ培養物から採取したＣＤ３４＋細胞を、ｒｈＤＬ４及びレトロネクチンでプレコーティングされた４８ウェルプレートに播種した。Ｔ細胞系統分化を、ａＭＥＭ、ＦＢＳ、ＩＴＳ－Ｇ、２ＢＭＥ、アスコルビン酸－２－ホスフェート、グルタマックス、ｒｈＳＣＦ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＩＬ７、ＦＬＴ３Ｌ、ｒｈＳＤＦ－１ａ、及びＳＢ２０３５８０を含む培地で誘導した。

２日目～６日目の間、１日置きに８０％の培地を交換した。７日目に、細胞を新しいコーティングプレートに移し、前駆Ｔ細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ７＋ＣＤ５＋／－）の存在について分析した。

８日目～１３日目の間、１日置きに８０％の培地を交換した。１４日目に、１０００００細胞／ウェルを新しいコーティングプレートに移し、プレＴ細胞（ＣＤ３４－ＣＤ７＋ＣＤ５＋／－）の存在について細胞を分析した。

１５日目～２０日目の間、１日置きに８０％の培地を交換した。２１日目に細胞を採取し、細胞を、ＦＡＣＳを介してＴ細胞の代替としてＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＣＲａｂの発現について分析し、及び／又はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して活性化して機能的特性を評価した。

分化の２１日後、細胞を収集し、ＲＰＭＩ１６４０（Ｌ－グルタミンなし、フェノールレッドなし）にＦＢＳ、Ｌ－グルタミン、ＩＬ－２を加えたものに、新しい９６ウェル培養プレートに約８００００細胞にて再播種し、次いで、１：１のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化した。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで７２時間活性化した後、細胞を、ＦＡＣＳによってＣＤ３、ＣＤ６９、ＣＤ２５の発現及びＲＴ－ｑＰＣＲを使用してＩＦＮ－γの発現について分析した。上清はＥＬＩＳＡによって分析した。

結果
図４Ａ及び図４Ｂは、Ｐｉｅｚｏ１活性化で誘導されたｉＰＳＣ由来ＨＳＣが、骨髄（ＢＭ）－ＨＳＣと同様に前駆Ｔ細胞分化を受けることを示す。さらに、図５Ａ及び図５Ｂは、Ｐｉｅｚｏ１活性化で生成されたｉＰＳＣ由来ＨＳＣがＴ細胞分化を受け、ＢＭ－ＨＳＣと同様にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化できることを示す。図６は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる刺激後のＩＦＮγ発現によって示されるように、Ｐｉｅｚｏ１活性化で生成されたｉＰＳＣ由来ＨＳＣが機能的Ｔ細胞に分化できることを示す。まとめると、これらの結果は、ＨＳＣ形成中のＰｉｅｚｏ１活性化が、ｅｘｖｉｖｏで前駆Ｔ細胞及び機能的Ｔ細胞に更に分化するＨＳＣの能力を高めることを示す。

参考文献
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Claims

造血系統の細胞集団を調製する方法であって、
多能性幹細胞（ＰＳＣ）集団を調製することと、
ＣＤ３４＋細胞を富化してＣＤ３４富化集団を調製することと、
前記ＣＤ３４富化集団の内皮造血転換を誘導して、造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む集団を調製し、任意に、内皮造血転換を受けるＣＤ３４富化集団から細胞を採取することと、
前記ＨＳＣ集団を造血系統に分化させることと、
を含む、方法。
前記ＰＳＣ集団が、リンパ球、臍帯血細胞、末梢血単核細胞、ＣＤ３４＋細胞、又はヒト一次組織に由来するヒトｉＰＳＣ集団である、請求項１に記載の方法。
前記ＰＳＣ集団が、末梢血から単離されたＣＤ３４富化細胞に由来する、請求項２に記載の方法。
前記ｉＰＳＣが、１つ以上のＨＬＡクラスＩ及び／又はクラスＩＩ遺伝子についてホモ接合体である、請求項２に記載の方法。
前記ｉＰＳＣが、１つ以上のＨＬＡクラスＩ遺伝子を欠失させるため、１つ以上のクラスＩＩ遺伝子を欠失させるため、及び／又はＨＬＡ若しくはＭＨＣの発現若しくは提示能力を支配する１つ以上の遺伝子を欠失させるために遺伝子編集されている、請求項２に記載の方法。
ＨＬＡ又はＭＨＣの発現又は提示能力を支配する前記１つ以上の遺伝子が、β２－ミクログロブリン及び／又はＣＩＩＴＡである、請求項５に記載の方法。
ＣＤ３４富化及び内皮造血転換が、ｉＰＳＣ分化の８日目～１５日目に誘導される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
前記内皮造血転換が、長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）、短期造血幹細胞、及び造血幹前駆細胞のうちの１つ以上を含むＨＳＣ集団を生成する、請求項７に記載の方法。
ＣＤ３４＋細胞が、ＣＤ３４＋浮遊細胞及び／又は接着細胞の採取を含め、内皮造血転換を受ける培養物から採取される、請求項７に記載の方法。
前記ＨＳＣ集団が長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、請求項８に記載の方法。
内皮造血転換の前記誘導が、ｄｎｍｔ３ｂの発現又は活性を増加させることを含む、請求項７に記載の方法。
内皮造血転換の前記誘導が、前記ＣＤ３４富化細胞にサイクリックストレッチを適用することを含む、請求項７に記載の方法。
前記サイクリックストレッチが、２Ｄ、３Ｄ、又は４Ｄのサイクリックストレッチである、請求項１２に記載の方法。
内皮造血転換の前記誘導が、Ｐｉｅｚｏ１活性化を含む、請求項７に記載の方法。
前記Ｐｉｅｚｏ１活性化が、前記ＣＤ３４富化細胞又はその画分を、任意に、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１、Ｊｅｄｉ２、又はそれらの類似体若しくは誘導体から選択される、１つ以上のＰｉｅｚｏ１アゴニストと接触させることによるものである、請求項１４に記載の方法。
内皮造血転換の前記誘導が、Ｔｒｐｖ４活性化を含む、請求項７に記載の方法。
前記Ｔｒｐｖ４活性化が、前記ＣＤ３４富化細胞を、任意に、ＧＳＫ１０１６７９０Ａ、４ａｌｐｈａ－ＰＤＤ、又はそれらの類似体若しくは誘導体から選択される、１つ以上のＴｒｐｖ４アゴニストと接触させることによるものである、請求項１６に記載の方法。
前記造血系統が、前駆Ｔ細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、好中球、単球、マクロファージ、赤血球、巨核球、及び血小板から選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
前記ＨＳＣ集団又はその画分が、ｅｘｖｉｖｏで前駆Ｔ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び／又はそれらの画分若しくは類似体に分化される、請求項１８に記載の方法。
前記ＨＳＣ集団又はその画分が、部分的又は完全なＮｏｔｃｈリガンドと共に培養されて、ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞を含む集団又は誘導体細胞集団を産生する、請求項１９に記載の方法。
前記ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞がＣＤ１ａを発現する、請求項２０に記載の方法。
前記ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞が、ＣＤ３４を発現しないか、又は前記ＨＳＣ集団と比較して低下したレベルのＣＤ３４を発現する、請求項２１に記載の方法。
前記ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞がＣＤ５を発現する、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＳＦＩＰ３、又はそれらの機能部分のうちの少なくとも１つを含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、２Ｄ又は３Ｄ培養系に固定化、機能化、及び／又は埋め込まれている、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、任意に、フィブロネクチン、レトロネクチン、及びラミニン、それらの誘導体若しくは類似体、及び／又はそれらの組み合わせから選択される細胞外マトリックスの成分と共に組み込まれている、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｎｏｔｃｈリガンド及び／又は細胞外マトリックスの成分が、任意に、セルロース、アルギン酸塩、及びそれらの組み合わせから選択される３Ｄ培養条件を提供する不活性材料に埋め込まれている、請求項２６に記載の方法。
前記Ｎｏｔｃｈリガンド、細胞外マトリックスの成分、又はそれらの組み合わせが、細胞にトポグラフィカルパターン及び／又は粗さを提供する培養条件と接触している、請求項２６又は２７に記載の方法。
前記Ｎｏｔｃｈリガンド、細胞外マトリックスの成分、トポグラフィカルパターン及び／又は粗さ、又はそれらの組み合わせが、任意に、ＴＮＦ－α及びＳＨＨのうちの１つ以上から選択されるサイトカイン及び／又は増殖因子と共に培養される、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＨＳＣ集団又はその画分が、人工胸腺オルガノイド中で培養される、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の方法。
前記前駆Ｔ細胞からＴ細胞系統を生成することを含む、請求項２０～３０のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｔ細胞系統が少なくとも１つのＣＤ３及びＴ細胞受容体を発現する、請求項３１に記載の方法。
前記Ｔ細胞系統がＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋である、請求項３２に記載の方法。
前記Ｔ細胞系統がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｔ細胞系統が制御性Ｔ細胞である、請求項３１に記載の方法。
前記Ｔ細胞系統がγδＴ細胞である、請求項３１に記載の方法。
前記Ｔ細胞系統がαβＴ細胞である、請求項３１に記載の方法。
前記Ｔ細胞系統が細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項３１に記載の方法。
前記前駆Ｔ細胞からナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団を生成することを含む、請求項３１に記載の方法。
前記ＮＫ細胞系統がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、請求項３９に記載の方法。
請求項１９～４０のいずれか一項に記載の方法によって産生された、Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞集団、又はそれらの薬学的許容性組成物。
前記細胞集団が、胸腺又は二次リンパ器官に生着することができる、請求項４１に記載のＴ細胞又はＮＫ細胞集団。
細胞療法の方法であって、請求項４１又は請求項４２に記載のＴ細胞若しくはＮＫ細胞集団又はそれらの薬学的に許容される組成物を、それを必要とするヒト被験体に投与することを含む、方法。
前記ヒト被験体が、リンパ球減少症、癌、免疫不全、自己免疫疾患、ウイルス感染症、骨格形成異常、及び骨髄不全症候群のうちの１つ以上を含む病態を患っている、請求項４３に記載の方法。
前記被験体が、場合により、血液悪性腫瘍又は固形腫瘍である癌を患っている、請求項４４に記載の方法。
前記ＨＳＣ集団又はその画分が、Ｂリンパ球又はその誘導体に分化される、請求項１８に記載の方法。
請求項４６に記載の方法によって産生された、Ｂリンパ球集団又はその薬学的に許容される組成物。
前記Ｂリンパ球集団が、被験体の脾臓又は二次リンパ組織に生着する、請求項４７に記載のＢリンパ球集団。
細胞療法又はワクチン接種の方法であって、請求項４７又は請求項４８に記載のＢリンパ球集団、又はその薬学的に許容される組成物を、それを必要とするヒト被験体に投与することを含む、方法。
前記ヒト被験体が免疫無防備状態である、請求項４９に記載の方法。
前記ヒト被験体が、即時の治療及び／又は防御免疫の獲得のために抗体療法又はワクチン接種を必要としている、請求項４９又は５０に記載の方法。
前記被験体が、ウイルス、細菌、真菌、若しくは寄生虫感染症を患っているか、又はそのリスクがある、請求項５０又は請求項５１に記載の方法。
前記被験体が、癌を患っているか、又はそのリスクがある、請求項４９又は請求項５０に記載の方法。
前記Ｂ細胞がＣＡＲ－Ｂ細胞である、請求項４９～５３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＨＳＣ集団又はその画分が、好中球、単球又はマクロファージに分化される、請求項１８に記載の方法。
請求項５５に記載の方法によって産生された、好中球、単球、若しくはマクロファージ集団又はそれらの薬学的に許容される組成物。
細胞療法の方法であって、請求項５６に記載の好中球、単球若しくはマクロファージ集団又はそれらの薬学的に許容される組成物を、それを必要とするヒト被験体に投与することを含む、方法。
前記被験体が、癌、後天性若しくは遺伝性の血液疾患、肝臓若しくは腎臓の炎症性疾患、又は細菌感染症から選択される病態を患っている、請求項５７に記載の方法。
前記ＨＳＣ集団又はその画分が、巨核球に分化され、任意に血小板に分化される、請求項１８に記載の方法。
請求項５９に記載の方法によって産生された、巨核球集団若しくはそれに由来する血小板集団又はそれらの薬学的に許容される組成物。
細胞療法の方法であって、請求項６０に記載の巨核球若しくは血小板集団又はそれらの薬学的に許容される組成物を、それを必要とするヒト被験体に投与することを含む、方法。
前記被験体が、遺伝性又は後天性の血小板異常を患っている、請求項６１に記載の方法。
前記ＨＳＣ集団又はその画分が、赤血球又はその誘導体に分化される、請求項１８に記載の方法。
請求項６３に記載の方法によって産生された、赤血球集団若しくはそれに由来する集団又はそれらの薬学的に許容される組成物。
細胞療法の方法であって、請求項６４に記載の細胞集団又はその薬学的に許容される組成物を、それを必要とするヒト被験体に投与することを含む、方法。
前記被験体が、遺伝性若しくは後天性の赤血球障害、骨髄不全障害、高地関連の生理学的若しくは病理学的状態、化学物質若しくは放射線曝露に関連する状態を有しているか、又は前記被験体がＨＳＣ移植を受けている、請求項６５に記載の方法。
前記薬学的に許容される組成物が、１つ以上の薬物又は酸素担体を送達又はカプセル化するために使用される、請求項６５に記載の方法。
ヒト多能性幹細胞からヒト長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含むＨＳＣ集団を生成することと、
なお、前記ＨＳＣ集団がＣＤ３４＋細胞の内皮造血転換によって誘導される；
前記ＨＳＣ集団又はそこから単離された細胞を、部分的又は完全なＮｏｔｃｈリガンド及び／又は細胞外マトリックスの成分と共に培養して、ＣＤ７＋前駆Ｔ細胞を含む集団又は誘導体細胞集団を産生することと、
を含む、方法。
前記ヒト多能性幹細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項６８に記載の方法。
前記ヒト多能性幹細胞が、リンパ球、臍帯血細胞、末梢血単核細胞、ＣＤ３４^＋細胞、又はヒト一次組織に由来する、請求項６９に記載の方法。
前記ｉＰＳＣ集団が、末梢血から単離されたＣＤ３４富化細胞に由来する、請求項７０に記載の方法。
前記ｉＰＳＣ集団が、末梢血から単離されたＴリンパ球に由来する、請求項７０に記載の方法。
前記ｉＰＳＣが、１つ以上のＨＬＡクラスＩ及び／又はクラスＩＩ遺伝子についてホモ接合体である、請求項６８～７２のいずれか一項に記載の方法。
前記ｉＰＳＣが、１つ以上のＨＬＡクラスＩ遺伝子、１つ以上のクラスＩＩ遺伝子を欠失させるため、及び／又はＨＬＡ若しくはＭＨＣの発現若しくは提示能力を支配する１つ以上の遺伝子を欠失させるために遺伝子編集されている、請求項７３に記載の方法。
ＨＬＡ又はＭＨＣの発現又は提示能力を支配する前記１つ以上の遺伝子が、β２－ミクログロブリン及び／又はＣＩＩＴＡである、請求項７４に記載の方法。
前記ＣＤ３４＋細胞の前記内皮造血転換が、ｉＰＳＣ分化の８日目～１５日目に誘導される、請求項６８～７５のいずれか一項に記載の方法。
ＣＤ３４＋細胞が、ＣＤ３４＋浮遊細胞及び／又は接着細胞の採取を含め、内皮造血転換を受ける培養物から採取される、請求項７６に記載の方法。
前記内皮造血転換が、長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）、短期造血幹細胞、及び造血幹前駆細胞のうちの１つ以上を含むＨＳＣ集団を生成する、請求項７６又は７７に記載の方法。
前記ＨＳＣ集団を生成することが、ＣＤ３４＋細胞におけるｄｎｍｔ３ｂの発現又は活性を増加させることを含む、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＨＳＣ集団を生成することが、ＣＤ３４＋細胞にサイクリックストレッチを適用することを含む、請求項６８～７９のいずれか一項に記載の方法。
１つ以上の細胞集団が、２Ｄ、３Ｄ、又は４Ｄのサイクリックストレッチを受け、前記サイクリックストレッチを受ける細胞が、任意に、ｉＰＳＣ、ＣＤ３４＋細胞、内皮細胞（ＥＣ）、及び造血性内皮細胞（ＨＥＣ）のうちの１つ以上から選択される、請求項８０に記載の方法。
前記ＨＳＣ集団を生成することが、Ｐｉｅｚｏ１活性化を含む、請求項６８～７８のいずれか一項に記載の方法。
Ｐｉｅｚｏ１活性化を受ける前記細胞が、ｉＰＳＣ、ＥＢ、ＣＤ３４＋細胞、ＥＣ、ＨＥＣ、及びＨＳＣのうちの１つ以上から選択される、請求項８２に記載の方法。
前記Ｐｉｅｚｏ１活性化が、前記細胞を、任意に、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１、Ｊｅｄｉ２、又はそれらの類似体若しくは誘導体から選択される、１つ以上のＰｉｅｚｏ１アゴニストと接触させることによるものである、請求項８２又は８３に記載の方法。
前記ＨＳＣ集団を生成することが、ＣＤ３４＋細胞のＴｒｐｖ４活性化を含む、請求項６８～７８のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｔｒｐｖ４活性化が、前記多能性幹細胞又はそれから分化した細胞を、任意に、ＧＳＫ１０１６７９０Ａ、４ａｌｐｈａ－ＰＤＤ、又はそれらの類似体若しくは誘導体から選択される、１つ以上のＴｒｐｖ４アゴニストと接触させることによるものである、請求項８５に記載の方法。
前記ＨＳＣ集団が、ヒトｉＰＳＣの分化の８日目～１７日目に誘導される、請求項６８～８６のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ７^＋前駆Ｔ細胞がＣＤ１ａを発現する、請求項６８～８７のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ７^＋前駆Ｔ細胞が、ＣＤ３４を発現しないか、又は前記ＨＳＣ集団と比較して低下したレベルのＣＤ３４を発現する、請求項６８～８８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ７^＋前駆Ｔ細胞がＣＤ５を発現する、請求項６８～８９のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、ＤＬＬ１及びＤＬＬ４、又はそれらの機能部分のうちの少なくとも１つを含む、請求項６８～９０のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、ＤＬＬ１アミノ酸配列、又はその機能部分を含む、請求項９１に記載の方法。
前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、ＤＬＬ４アミノ酸配列、又はその機能部分を含む、請求項９１に記載の方法。
前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、２Ｄ又は３Ｄ培養系に固定化、機能化、及び／又は埋め込まれている、請求項９１～９３のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、任意に、フィブロネクチン、レトロネクチン、及びラミニンから選択される細胞外マトリックスの１つ以上の成分と共に組み込まれる、請求項９４に記載の方法。
前記Ｎｏｔｃｈリガンド及び／又は細胞外マトリックスの成分が、任意に、セルロース、アルギン酸塩、及びそれらの組み合わせから選択される３Ｄ培養条件を提供する不活性材料に埋め込まれている、請求項９５に記載の方法。
前記Ｎｏｔｃｈリガンド、細胞外マトリックスの成分、又はそれらの組み合わせが、細胞にトポグラフィカルパターン及び／又は粗さを提供する培養条件と接触している、請求項９５又は９６に記載の方法。
前記Ｎｏｔｃｈリガンド、細胞外マトリックスの成分、トポグラフィカルパターン及び／又は粗さ、又はそれらの組み合わせが、任意に、ＴＮＦ－α、ＳＨＨ、又はそれらの組み合わせから選択されるサイトカイン及び／又は増殖因子と共に培養される、請求項９４～９７のいずれか一項に記載の方法。
前記幹細胞集団が、人工胸腺オルガノイド中で培養される、請求項６８～９８のいずれか一項に記載の方法。
前記前駆Ｔ細胞の誘導体を生成すること、又は前記前駆Ｔ細胞からＴ細胞系統を生成することを含む、請求項６８～９９のいずれか一項に記載の方法。
前記前駆Ｔ細胞の前記誘導体又はＴ細胞系統が、ＣＤ３及びＴ細胞受容体を発現する、請求項１００に記載の方法。
前記Ｔ細胞系統がＣＤ８^＋及び／又はＣＤ４^＋である、請求項１０１に記載の方法。
前記Ｔ細胞系統が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されている、請求項１００～１０２のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｔ細胞系統が制御性Ｔ細胞である、請求項１００に記載の方法。
前記Ｔ細胞系統がγδＴ細胞である、請求項１００に記載の方法。
前記Ｔ細胞系統がαβＴ細胞である、請求項１００に記載の方法。
前記Ｔ細胞系統が細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項１００に記載の方法。
前記前駆Ｔ細胞の前記誘導体がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１００に記載の方法。
請求項６８～９９のいずれか一項に記載の方法によって産生された、ＣＤ７^＋前駆Ｔ細胞又はその薬学的許容性組成物。
前記前駆Ｔ細胞がＣＤ３４^－又はＣＤ３４^ｌｏｗである、請求項１０９に記載のＣＤ７^＋前駆Ｔ細胞又はその組成物。
前記前駆Ｔ細胞が、投与後に胸腺又は脾臓に生着することができる、請求項１０９又は１１０に記載のＣＤ７^＋前駆Ｔ細胞。
細胞療法の方法であって、請求項１０９～１１１のいずれか一項に記載のＣＤ７^＋前駆Ｔ細胞又はその薬学的に許容される組成物を、Ｔ細胞数の増加を必要とするヒト被験体に投与することを含む、方法。
前記ヒト被験体が、リンパ球減少症、癌、免疫不全、自己免疫疾患、骨格形成異常、骨髄不全症候群、及びウイルス感染症のうちの１つ以上を含む病態を患っている、請求項１１２に記載の方法。
前記被験体が癌を患っている、請求項１１３に記載の方法。
前記癌が血液悪性腫瘍である、請求項１１４に記載の方法。
前記被験体が固形腫瘍を患っている、請求項１１４に記載の方法。
請求項１００～１０８のいずれか一項に記載の方法によって産生された、ＣＤ７^＋前駆Ｔ細胞の誘導体若しくはＴ細胞系統、又はそれらの薬学的に許容される組成物。
前記ＣＤ７^＋前駆細胞の前記誘導体又はＴ細胞系統が、胸腺又は脾臓に生着することができる、請求項１１７に記載のＣＤ７^＋前駆Ｔ細胞の誘導体。
養子細胞療法の方法であって、請求項１１７又は１１８に記載のＣＤ７^＋前駆Ｔ細胞の誘導体若しくはＴ細胞系統、又はそれらの組成物を、Ｔ細胞数の増加を必要とするヒト被験体に投与することを含む、方法。
前記ヒト被験体が、リンパ球減少症、癌、免疫不全、自己免疫疾患、骨格形成異常、骨髄不全症候群、及びウイルス感染症のうちの１つ以上を含む病態を患っている、請求項１１９に記載の方法。
前記被験体が癌を患っている、請求項１２０に記載の方法。
前記癌が血液悪性腫瘍である、請求項１２１に記載の方法。
前記被験体が固形腫瘍を患っている、請求項１２１に記載の方法。