CN110891967A - 抗原特异性免疫效应细胞 - Google Patents

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张新
A·J·布兰德尔
D·拉杰什
B·斯万森
C·姆恩
S·伯顿
王文波
E·麦克劳德
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Abstract

本文提供了从多能干细胞产生表达嵌合抗原受体(CAR)的抗原特异性效应T细胞和NK细胞的方法。本文还提供了通过施用本文所提供的效应T细胞和/或NK细胞进行过继性细胞疗法的方法。

Description

抗原特异性免疫效应细胞
本申请要求2017年4月18日提交的美国临时申请序列号62/486,875的优先权，将其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明一般地涉及分子生物学领域。更具体地说，本发明涉及抗原特异性免疫效应细胞(例如T细胞和NK细胞)有关的方法和组合物。
背景技术
相关现有技术的描述
尽管在对诊断出患有癌症的患者可用的诊断和治疗选择方面有了技术上的进步，但通常预后仍然很差，许多患者无法痊愈。免疫疗法有望为诊断出患有各种肿瘤的患者提供强效但靶向性的治疗，有可能根除恶性肿瘤细胞而不会损害正常组织。从理论上讲，免疫系统的T细胞能够识别肿瘤细胞特异性蛋白模式，并通过各种效应器机制介导其破坏。过继性T细胞疗法试图利用和增强患者自身T细胞根除肿瘤的能力，然后将这些效应器以有效消除残留肿瘤但又不损害健康组织的状态回输到患者。尽管这种方法在肿瘤免疫学领域并不陌生，但是过继性T细胞疗法在临床使用中的许多缺点妨碍了该方法在癌症治疗中的充分利用。
目前的过继性T细胞疗法受限于患者和肿瘤特异性的T细胞的缺乏，包括它们在体内很稀有、它们无法克服多种肿瘤免疫系统逃避机制以及它们的寿命很短。对所需抗原具有反应性的通常数量很少的T细胞是难以分离和扩增的。因此，对于免疫疗法的有效利用来说，还存在对治疗上足够的且有功能的抗原特异性免疫细胞的未满足需求。
发明内容
在第一个实施方案中，本公开提供了产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞的方法，其包括改造多能干细胞(PSC)以表达嵌合抗原受体(CAR)，从而产生CAR-PSC；使CAR-PSC分化或正向重编程为CD34+造血祖细胞(HPC)；使CD34+HPC进一步分化为T细胞和/或NK细胞；并扩增T细胞和/或NK细胞。在一些方面，扩增包括与抗原特异性靶细胞共培养，从而产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞。
在某些方面，经改造表达CAR的PSC是诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。在特定方面，iPSC是从体细胞(例如T细胞)重编程的。
在一些方面，使CAR-PSC分化为CD34+HPC的步骤包括进行定向分化。在某些方面，定向分化包括在blebbistatin、GSK-3抑制剂、FGF2和VEGF存在下形成类胚体(EB)；使EB与BMP4、VEGF和FGF2接触以诱导中胚层诱导；在Flt-3配体、IL-3、SCF和TPO存在下分化EB，从而产生HPC。在一些方面，分化是在基本不含或不含BMP4的培养基中进行的。在其他方面，分化是在BMP4存在下进行的。在特定方面，GSK-3抑制剂是CHIR99021。在一些方面，分化还包括IL-11、cAMP和/或VEGF的存在。
在一些方面，定向分化包括在blebbistatin、BMP4、VEGF和bFGF存在下，在胺包被的表面上培养个体化PSC。通过使PSC与BMP4、VEGF和FGF2接触来开始分化；并在Flt-3配体、IL-3、IL-6、SCF、TPO和肝素存在下进一步分化PSC，从而产生HPC，其中该方法不包括EB形成。
在特定方面，本方法包括在限定的无饲养层的条件下培养细胞，例如在整个方法的持续时间内。在一些方面，PSC是基本无转基因的或无转基因的。在特定方面，PSC是人的。在某些方面，T细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、细胞毒性T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、初始T细胞
Figure BDA0002270886280000021
记忆T细胞和/或γδT细胞。
在某些方面，经改造表达CAR的PSC被进一步改造以表达ERG/ETV2、GATA2和HOXA9，例如在单个诱导型启动子的控制下。在一些方面，本方法还包括改造PSC以表达HMGA2、MYCN、NR4A2、SOX17、TFEC、MEIS1和/或HOXA4。因此，在一些方面，使CAR-PSC分化为CD34+HPC的步骤包括在足以产生HPC的一段时间内诱导ERG/ETV2、GATA2和HOXA9的表达，并在使HPC进一步分化为T细胞和/或NK细胞之前终止表达诱导。
在具体方面，使CAR-PSC分化为CD34+HPC的步骤还包括在分化为抗原特异性T细胞和/或NK细胞之前，选择表达CD34和/或CD43的细胞。在特定方面，选择包括进行磁激活细胞分选(MACS)。在一些方面，表达CD34和/或CD43的细胞占总细胞群的至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更高的百分比。在一些方面，不进行以MACS进行CD34和/或CD43阳性细胞选择的步骤。
在特定方面，至少2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或更高百分比的HPC表达CAR。在一些方面，至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或更高百分比的HPC表达CAR。
在一些方面，将HPC分化为T细胞和/或NK细胞包括：在低氧条件下，在抗坏血酸和烟酰胺存在下，在retronectin和Notch DLL-4包被的表面上培养HPC。在一些方面，培养物还包含SCF、FLT-3配体、TPO和IL-7，并任选地包含GSK抑制剂(例如CHIR99021)、IL-2和/或IL-12。在某些方面，扩增步骤还包括在抗CD3抗体和IL-2存在下培养抗原特异性T细胞。在还有的方面，扩增步骤还包括在抗CD3抗体、IL-2、IL-15和IL-21存在下培养抗原特异性T细胞。在一些方面，扩增步骤包括在抗CD3抗体、FLT3-配体、IL-7、IL-2和/或IL-15存在下培养抗原特异性T细胞，并任选地还包含SCF、TPO和/或IL-21。在特定方面，至少1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高百分比的分化CD34+HPC是CD3+CAR+T细胞。在一些方面，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％或更高百分比的分化的CD34+HPC是CD3-CAR+NK细胞。在一些方面，至少2％的扩增CD34+HPC是CD3+CAR+T细胞。在特定方面，至少10％的扩增CD34+HPC是CD3-CAR+NK细胞。
在某些方面，CAR和抗原特异性靶细胞针对同一抗原。在一个具体方面，抗原是CD19。在特定方面，抗原特异性靶细胞是肿瘤细胞。在一些方面，抗原特异性靶细胞是人的。在特定方面，抗原特异性靶细胞是HLA I类阴性的。在一些方面，至少5％(例如6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％或更高百分比)的抗原特异性效应T细胞显示出对靶细胞的细胞毒性活性。在某些方面，至少10％(例如15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高百分比)的抗原特异性效应NK细胞显示出对靶细胞的细胞毒性活性。
在一些方面，CAR是由整合到PSC基因组中的DNA所编码的。在某些方面，CAR包含胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包含抗原结合区的胞外结构域。在具体方面，胞内信号传导结构域包含CD3ζ和CD28。在一些方面，抗原结合区是F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv或scFv。
在某些方面，PSC是HLA纯合形式的。在一些方面，HLA纯合形式的PSC对基因座等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ中的一个或多个是纯合形式的。在某些方面，HLA纯合形式的PSC对基因座等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ中的两个是纯合形式的。在特定方面，HLA纯合形式的PSC对HLA-A和HLA-B是纯合形式的。在某些方面，HLA纯合形式的PSC对HLA-A、HLA-B和HLA-C是纯合形式的。
另一实施方案提供了产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞的方法，其包括改造PSC以表达CAR，从而产生CAR-PSC。在blebbistatin、GSK-3抑制剂、FGF2和VEGF存在下培养CAR-PSC，从而形成EB；使EB与BMP4、VEGF和FGF2接触以诱导中胚层诱导；在Flt-3配体、BMP4、IL-3、SCF和TPO存在下分化EB，从而产生CD34+HPC；使CD34+HPC进一步分化为T细胞和/或NK细胞；并扩增T细胞和/或NK细胞，其中扩增包括与抗原特异性靶细胞共培养，从而产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞。在特定方面，GSK-3抑制剂是CHIR99021。
在还有的另一实施方案中，提供了产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞的方法，其包括改造PSC以表达CAR，从而产生CAR-PSC；在blebbistatin、BMP4、VEGF存在下，在胺包被的表面上培养个体化CAR-PSC，并通过使CAR-PSC与BMP4、VEGF和FGF2接触来开始分化；在Flt-3配体、IL-3、IL-6、SCF、TPO和肝素存在下进一步分化CAR-PSC，从而产生CD34+HPC；使CD34+HPC分化为T细胞和/或NK细胞；并扩增T细胞和/或NK细胞，其中扩增包括与抗原特异性靶细胞共培养，从而产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞，其中所述方法不包括EB形成。
还有实施方案提供了产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞的方法，其包括改造PSC以表达CAR，从而产生CAR-PSC；使CAR-PSC分化为CD34+HPC；选择CD34+CD43+HPC；使CD34+CD43+HPC进一步分化为T细胞和/或NK细胞；并扩增T细胞和/或NK细胞，其中扩增包括与抗原特异性靶细胞共培养，从而产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞。
在另一实施方案中，提供了根据上述实施方案所产生的抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞群。本文还提供了药物组合物，其包含根据本文所述实施方案所产生的抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞。本文还提供了包含根据所述实施方案所产生的抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞的组合物用于在受试者中治疗癌症。本文还提供了根据所述实施方案所产生的抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞用于癌症治疗的用途。
在还有的另一实施方案中，提供了在受试者中治疗癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的根据本文所述实施方案所产生的抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞。在一些方面，癌症表达肿瘤抗原，并且抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞针对所述肿瘤抗原。在特定方面，受试者是人。
根据以下详细说明，本发明的其他目的、特征和优点将变得清楚。然而，应理解的是，尽管详细说明和具体例子指示了本发明的优选实施方案，但仅仅是通过举例说明的方式给出的，因为本领域技术人员根据该详细说明就将清楚本发明的精神和范围内的各种改变和修改。
附图说明
以下附图构成了本说明书的一部分，将其包括在内以进一步证实本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅，结合本文所介绍的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1A-1G：(图1A)示意性描述了从PSC产生T细胞和NK细胞的方法，包括正向编程方法和定向分化方法。(图1B)代表hPCS的无饲养层和无血清的T和NK细胞分化的图解。缩写：CHIR-CHIR99021 GSK-3抑制剂；HDM，无血清造血分化培养基；TCDM，T细胞分化培养基；TCEM，T细胞扩增培养基；HPC，造血祖细胞；标有星号(*)的是任选的增强组分。(图1C)通过定向分化或正向编程从PSC到CD34+CD43+HPC的效率。(图1D)T/NK分化培养物的流式细胞分析。(图1E)整个分化过程中不同细胞群的产率。(图1F)PSC衍生的T细胞的表型。(图1G)PSC衍生的T细胞的扩增。固定的抗CD3抗体(iCD3)用于扩增PSC衍生的T细胞(条形图)。在扩增培养物中增殖的T细胞获得不规则形状的淋巴母细胞的特征形态(照片)。2周T细胞扩增获得CD56和CD8表达(流式细胞点图)。
图2：PSC衍生的T/NK细胞中的CAR表达。通过使用蛋白质L染色的流式细胞术所评价的整个分化阶段的CAR表达。将CD3+T细胞与λ链小鼠抗人CD3 mAb(克隆SP34-2)共染色。显示了由E11 PSC以及E11衍生的HPC和T细胞的CAR表达。
图3A-B：PSC衍生的T/NK细胞中的体外抗CD19 CAR介导的细胞毒性。(图3A)使用表达荧光素酶的CD19+Daudi和Raji靶细胞进行的体外细胞毒性测定。(图3B)使用IncucyteS3活细胞分析系统(Essen Bioscience)通过实时靶细胞计数测得的CAR-T细胞的溶细胞潜能。
图4：PSC衍生的T/NK细胞中的体外抗CD19 CAR所诱导的细胞因子产生。
图5A-5B：PSC衍生的CAR-T/NK细胞的体内溶瘤潜能。(图5A)通过体内生物发光成像监测到的小鼠肿瘤进展。(图5B)用PSC衍生的T(1C)或NK(A16)细胞处理的不同组小鼠的存活曲线。
具体实施方式
说明性实施方案的描述
在某些实施方案中，本公开提供了从人多能干细胞(PSC)产生抗原特异性免疫效应细胞的高效方法，所述PSC已被改造从而表达抗原受体(例如嵌合抗原受体(CAR))，本文称为CAR-PSC。通过该方法所产生的免疫效应细胞可包括但不限于T细胞、NK细胞和iNKT细胞。
可通过重编程(例如通过逆转录病毒或附加体方法)T细胞的起始群体以产生T细胞衍生的iPSC(TiPSC)来获得PSC。T细胞可从各种来源分离，例如血液样品。T细胞的起始群体可保留其特征性T细胞受体(TCR)基因重排，并且可以是HLA纯合形式的细胞(即对MHC I类和II类基因是纯合形式的)。因此，可从分离自HLA纯合形式的受试者(本文称为HLA超级供体)的细胞来产生iPSC。
然后可以对CAR-PSC进行分化或编程以产生CD34+造血祖细胞(HPC)。这可以通过使用细胞因子(例如SCF、TPO、FLT-3、IL-6、IL-3和肝素)的组合进行定向分化来实现(例如在PCT/US2016/057899中所描述的，通过引用将其整体并入本文)。在备选方法中，可以使用正向编程，用编码ETV2/ERG、GATA2和HOXA9的表达构建体(即EGH)，使CAR-PSC分化为CD34+HPC(例如在PCT/US2016/057893中所描述的，通过引用将其整体并入本文)。这些EGH-PSC可被进一步改造以表达HMGA2、MYCN、NR4A2、SOX17、TFEC、MEIS1和/或HOXA4，以实现长期移植性(engraftability)。
最后，CD34+CAR-HPC可被分化为CD3+T细胞或CD56+CD3-NK细胞。通过CD34和CD43的表达确定，在HPC分化期间(例如7-11天)，淋巴样潜能的最佳时间范围可能是7-11天。例如，可以通过对标志物CD 144、CD34、CD45和CD7中的两个或更多个阳性的细胞级分进行分选来分离具有增强的淋巴样潜能的HPC。
T细胞分化的示例性方法包括使用RetroNectin和DLL-4作为无饲养层基质。通过使用抗坏血酸来增加效率和成熟，以及通过在低氧条件下培养，可以进一步增强T细胞分化。
此外，可以通过在分化过程中与抗原特异性靶细胞(例如肿瘤细胞)共培养来扩增T细胞和/或NK细胞。发现该方法增加了T细胞和NK细胞对靶细胞的细胞毒性活性，具体而言是通过注射肿瘤细胞的小鼠的肿瘤生长减少和存活增加而观察到的。
因此，本公开的方法可提供无限数量的抗原特异性免疫效应细胞(例如T细胞和NK细胞)用于广泛的应用，例如体内稳定移植、体外化合物筛选以及阐明血液病和损伤的机制。
I.定义
就具体组分而言，如本文所使用的“基本上不含”在本文中是指该具体组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染所导致的该具体组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是用标准分析方法不能从中检测到该具体组分的量的组合物。
如本文说明书中所使用的，“一”或“一个”(“a”或“an”)可表示一个或多个。如本文权利要求中所使用的，当与词语“包括(comprising)”结合使用时，词语“一”或“一个”可表示一个或多于一个。
除非明确指出仅涉及备选方案或者备选方案是互斥的，否则权利要求中所使用的术语“或”用来表示“和/或”，尽管本公开支持仅涉及备选方案和“和/或”的定义。如本文所使用的“另一”可表示至少第二个或更多个。
在整个本申请中，使用术语“约”来表示数值包括了用于确定该数值的设备、方法的固有误差变化或者研究对象之间所存在的变化。
当与细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸关联使用时，术语“外源”是指已通过人工或天然手段引入细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸；或者与细胞关联使用时，该术语是指被分离并随后通过人工或天然手段引入其他细胞或生物体的细胞。外源核酸可来自不同的生物体或细胞，或者可以是在该生物体或细胞中天然存在的核酸的一个或多个额外拷贝。外源细胞可来自不同生物体，也可来自同一生物体。作为非限制性的例子，外源核酸是处在与天然细胞中的染色体位置不同的染色体位置、或者其侧翼具有不同于天然存在的核酸序列的核酸。
“表达构建体”或“表达盒”是指能够指导转录的核酸分子。表达构建体至少包括指导一种或多种所需细胞类型、组织或器官中的基因表达的一个或多个转录控制元件(例如启动子、增强子或其功能等效的结构)。还可包括另外的元件，例如转录终止信号。
“载体”或“构建体”(有时称为基因递送系统或基因转移“载体”)是指包含要在体外或体内递送至宿主细胞的多核苷酸的大分子或分子复合物。
“质粒”是载体的常见类型，是与染色体DNA分开的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。在某些情况下，它是环形的并且是双链的。
“复制的起始点”(“ori”)或“复制起始点”是例如淋巴性疱疹病毒(lymphotrophicherpes virus)中的DNA序列，当其在质粒中而存在于细胞中时，它能够维持质粒中和/或DNA合成起始位点处或附近的连接序列。作为例子，EBV(埃巴病毒)的ori包括FR序列(30bp重复的20个不完美拷贝)，优选DS序列；但是，EBV中的其他位点会结合EBNA-1，例如，Rep*序列可代替DS作为复制起始点(Kirshmaier和Sugden,1998)。因此，EBV的复制起始点包括FR、DS或Rep*序列，或者通过核酸修饰的任何功能上等同的序列或由其衍生的合成组合。例如，本公开还可使用EBV的遗传改造的复制起始点，例如通过单个元件的插入或突变而基因改造的，如Lindner等,2008中所具体描述的。
“编码”特定蛋白质的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“区段”、“片段”或“转基因”是处在合适调节序列控制下时在体外或体内被转录并任选地还翻译成基因产物(例如多肽)的核酸分子。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，核酸分子可以是单链的(即有义链)或双链的。编码区的边界由位于5'(氨基)末端的起始密码子和位于3'(羧基)末端的翻译终止密码子所确定。基因可包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列以及合成的DNA序列。转录终止序列通常会位于基因序列的3'末端。
术语“控制元件”笼统地指启动子区、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节结构域、复制起始点、内部核糖体进入位点(IRES)、增强子、剪接界(splice junction)等，它们共同提供编码序列在接受体细胞中的复制、转录、转录后加工和翻译。这些控制元件不需要都存在，只要所选择的编码序列能够在合适的宿主细胞中复制、转录和翻译即可。
术语“启动子”在本文中以其通常的含义使用，是指包含DNA调节序列的核苷酸区，其中所述调节序列源自能够结合RNA聚合酶并启动下游(3'方向)编码序列转录的基因。它可包含调节蛋白和分子可以结合的遗传元件(例如RNA聚合酶和其他转录因子)以启动核酸序列的特异性转录。短语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在控制之下”和“在转录控制之下”是指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或方向，以控制该序列的转录启动和/或表达。
“增强子”是指当其位于启动子附近时，相对于没有增强子结构域时由启动子所产生的转录活性，赋予转录活性增加的核酸序列。
关于核酸分子的“可操作地连接”或“共表达”是指两种或更多种核酸分子(例如待转录的核酸分子、启动子和增强子元件)以允许核酸分子转录的方式进行连接。关于肽和/或多肽分子的“可操作地连接”或“共表达”是指两种或多种肽和/或多肽分子以产生单个多肽链(即融合多肽)的方式进行连接，所述单个多肽链具有融合的每种肽和/或多肽组分的至少一种特性。融合多肽优选是嵌合的，即由异源分子组成。
“同源性”是指两种多核苷酸或两种多肽之间的同一性百分比。一种序列和另一序列之间的对应关系能够通过本领域已知的技术来确定。例如，能够通过比对序列信息并使用容易获得的计算机程序，通过直接比较两种多肽分子之间的序列信息来确定同源性。备选地，能够通过在促进同源区域之间形成稳定双链体的条件下杂交多核苷酸，然后用单链特异性核酸酶消化，并确定消化片段的大小来确定同源性。如使用上述方法所确定的，当至少约80％、优选至少约90％、最优选至少约95％的核苷酸或氨基酸分别在分子的确定长度上匹配时，两种DNA或两种多肽序列就彼此“基本同源”。
术语“细胞”在本文中以其在本领域中的最广泛含义使用，是指此类活体：它是多细胞生物体组织的结构单元，被将其与外界隔离的膜结构所包围，其具有自我复制能力、具有遗传信息和表达遗传信息的机制。本文所使用的细胞可以是天然存在的细胞或人工修饰的细胞(例如融合细胞、遗传修饰的细胞等)。
术语“干细胞”在本文中是指在合适的条件下能够分化为各种各样专门细胞类型、同时在其他合适的条件下能够自我更新并保持基本未分化的多能状态的细胞。术语“干细胞”还涵盖多能细胞、专能细胞(multipotent cell)、前体细胞和祖细胞。示例性的人干细胞可获自由骨髓组织所获得的造血或间充质干细胞、由胚胎组织所获得的胚胎干细胞或由胎儿生殖器组织所获得的胚胎生殖细胞。示例性的多能干细胞也可通过表达某些与多潜能性相关的转录因子而将体细胞重编程为多能状态而从体细胞中产生；这些细胞被称为“诱导性多能干细胞”或“iPSC或iPS细胞”。
“胚胎干(ES)细胞”是未分化的多能细胞，它是从早期的胚胎(例如在囊胚期的内细胞团)中获得的，或者通过人工手段(例如核移植)所产生的，能够产生胚胎或成人中的任何分化细胞类型，包括生殖细胞(例如精子和卵子)。
“诱导性多能干细胞(iPSC或iPS细胞)”是通过表达或诱导多种因子(本文称为重编程因子)的组合来重编程体细胞而产生的细胞。可使用胎儿、出生后、新生儿、青少年或成人体细胞来生成iPS细胞。在某些实施方案中，可用来将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括例如Oct4(有时称为Oct 3/4)、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog和Lin28。在一些实施方案中，通过表达至少两种重编程因子、至少三种重编程因子、至少四种重编程因子、至少五种重编程因子、至少六种重编程因子或至少七种重编程因子来重编程体细胞以将体细胞重编程为多能干细胞。
“造血祖细胞”或“造血前体细胞”是指属于造血谱系但能够进一步造血分化的细胞，包括造血干细胞、专能造血干细胞、共同髓样祖细胞、巨核细胞祖细胞、祖红细胞和淋巴祖细胞。造血干细胞(HSC)是专能干细胞，其产生所有血细胞类型，包括髓样(单核细胞和巨噬细胞，粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞)，红细胞，巨核细胞/血小板，树突细胞)和淋巴样谱系(T细胞，B细胞，NK细胞)(参见例如Doulatov等,2012；Notta等,2015)。“多淋巴祖细胞”(MLP)被定义为描述产生所有淋巴样谱系(B、T和NK细胞)但可能具有或不具有其他(髓样)潜能的任何祖细胞(Doulatov等,2010)，它们是CD45RA+/CD10+/CD7-。任何B、T和NK祖细胞都能被称为MLP。“共同髓样祖细胞”(CMP)是指通过CD45+/CD31+/CD43+/CD34-的表达所定义的共同髓样祖细胞，能够产生粒细胞、单核细胞、巨核细胞和红细胞。造血祖细胞可表达CD34。造血祖细胞可共表达CD133，且是CD38表达阴性的。造血前体细胞包括CD34+/CD45+造血前体细胞和CD34+/CD45+/CD43+造血前体细胞。CD34+/CD43+/CD45+造血前体细胞可高度富集髓样祖细胞。造血细胞还包括原始造血细胞的各种亚群，包括：CD34-/CD133+/CD38-(原始造血前体细胞)，CD43(+)CD235a(+)CD41a(+/-)(红细胞-巨核细胞生成)，lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(-)(专能)和lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(+)(髓样倾向)细胞，CD133+/ALDH+(醛脱氢酶)。可以预期任何这些原始造血细胞类型或造血前体细胞均可如本文所述转变为iPS细胞。在一些方面，细胞可包括肥大细胞、朗氏细胞(Langerhan’s cell)、破骨细胞、NK细胞、T细胞、CIK T细胞或者T细胞、NK细胞和B细胞的其他亚型。
如本文所使用的术语“免疫细胞”是指免疫系统的细胞，包括但不限于T细胞、NK细胞、T/NK细胞、树突细胞、巨噬细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞及其任何组合。
T细胞“激活剂”或将激活T细胞的条件是指激活T细胞的刺激物，包括可呈递于抗原呈递细胞上或其他表面上的抗原；多克隆激活剂，无论特异性如何，其都可与许多T细胞受体(TCR)复合物结合，包括凝集素(例如伴刀豆球蛋白A(Con-A)和植物凝集素(PHA))以及特异性结合于TCR或CD3蛋白的恒定构架表位上的试剂(例如抗体)；以及刺激大量T细胞的超抗原，包括例如肠毒素(例如葡萄球菌肠毒素)。
术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换使用，是指表达TCR的细胞，所述TCR当与一种或多种MHC分子或者一种或多种非经典MHC分子一起展示在抗原呈递细胞或基质的表面上时，能够识别抗原。
术语“T细胞”是指现有技术中所定义的T淋巴细胞，旨在包括胸腺细胞、未成熟的T淋巴细胞、成熟的T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或激活的T淋巴细胞。T细胞可以是CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞或CD4-CD8-细胞。T细胞也可以是T辅助细胞(例如T辅助细胞1(TH1)或T辅助细胞2(TH2)或TH17细胞)，以及细胞毒性T细胞，调节T细胞，自然杀伤T细胞，初始T细胞，记忆T细胞或γδT细胞(Wilson等,2009；Wynn,2005；Ladi等,2006)。彼此相差至少一种标志物(例如CD4)的T细胞，在本文中被称为T细胞的“亚群”。
“CD4+T细胞”是指在其表面表达CD4并且与细胞介导的免疫应答相关的T细胞亚群。它们的特征在于刺激后的分泌谱，可包括细胞因子(例如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4和IL-10)的分泌。“CD4”是最初被定义为T淋巴细胞上的分化抗原的55-kD糖蛋白，但也存在于包括单核细胞/巨噬细胞在内的其他细胞上。CD4抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，作为关联识别元件参与MHC(主要组织相容性复合体)II类限制性免疫应答。它们在T淋巴细胞上定义了辅助/诱导亚群。
“CD8+T细胞”是指在其表面表达CD8的T细胞亚群，是MHC-I类限制性的并起细胞毒性T细胞作用。“CD8”分子是在胸腺细胞以及细胞毒性和抑制性T淋巴细胞上所发现的分化抗原。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，是主要组织相容性复合体I类限制性相互作用中的关联识别元件。
“多能干细胞”是指具有分化为构成一种或多种组织或器官的所有细胞的潜能的干细胞，或者优选地具有分化为下述三种胚层中任一种的潜能：内胚层(内胃壁、胃肠道、肺)，中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)或外胚层(表皮组织和神经系统)。
如本文使用的术语“体细胞”是指除生殖细胞(例如卵子、精子等)以外的任何细胞，它不直接将其DNA转移至下一代。通常，体细胞具有有限的多潜能或没有多潜能。本文所使用的体细胞可以是天然存在的或遗传修饰的。
“编程”是改变细胞可产生后代的类型的过程。例如，与在相同条件下未经编程而将能形成的细胞相比，在改变细胞时已对其进行了编程，以使其能够在培养时或体内形成至少一种新细胞类型的后代。这意味着在充分增殖后，会观察到明显比例的具有新细胞类型的表型特征的后代，而在编程之前基本上没有这种后代可能形成；备选地，具有新细胞类型特征的比例比编程之前明显更高。该过程包括分化、去分化和转分化。
“分化”是将不那么专门的细胞变为更专门的细胞类型的过程。“去分化”是将部分分化细胞或终末分化细胞恢复到更早发育阶段(例如多潜能性或多能性)的细胞过程。“转分化”是将一种分化的细胞类型转变为另一种分化的细胞类型的过程。通常，通过编程进行转分化，使细胞不经过中间的多能阶段——即将细胞直接从一种分化的细胞类型编程为另一种分化的细胞类型。在某些条件下，具有新细胞类型特征的后代的比例按偏好增加的顺序可以是至少约1％、5％、25％或更高。
“重编程”是与在相同条件下无需重编程相比，赋予细胞明显提高的可在培养时或体内形成至少一种新细胞类型的后代的能力的过程。更具体地说，重编程是赋予体细胞多潜能的过程。这意味着在充分增殖后存在明显比例的具有新细胞类型的表型特征的后代，而在重编程之前基本上没有这种后代可能形成；要不然，具有新细胞类型特征的比例比重编程之前明显更高。在某些条件下，具有新细胞类型特征的后代的比例按偏好增加的顺序可以是至少约1％、5％、25％或更高。
术语“正向编程”是指通过向专能细胞或多能细胞提供一种或多种特异性谱系决定基因或基因产物而对专能细胞或多能细胞编程，而不是对无多潜能性的分化的体细胞编程。例如，正向编程可以描述将ESC或iPSC编程为造血前体细胞或其他前体细胞或编程为造血细胞或其他分化的体细胞的过程。
如本文所使用的术语“受试者”或“有此需要的受试者”是指需要细胞或组织移植的任何年龄的雄性或雌性哺乳动物，优选人。通常，受试者由于适合通过细胞或组织移植进行治疗的病症或者病理性或不希望的病况、状态或综合征，或者物理、形态或生理异常而需要细胞或组织移植(在本文中也称为接受体)。
如本文所使用的基因“破坏”是指与不存在破坏的基因产物的表达水平相比，消除或减少了由受试者基因所编码的一种或多种基因产物在细胞中的表达。示例性的基因产物包括由该基因所编码的mRNA和蛋白质产物。在一些情况下，破坏是瞬时的或可逆的，而在其他情况下是永久的。尽管可能会产生截短或无功能的产物，但在一些情况下会破坏功能性或全长蛋白质或mRNA。在本文的一些实施方案中，基因活性或功能被破坏，而不是表达被破坏。通常通过人工方法(即通过添加或引入化合物、分子、复合物或组合物和/或通过破坏与基因相关联的核酸)例如在DNA水平诱导基因破坏。用于基因破坏的示例性方法包括基因沉默、敲低(knockdown)、敲除和/或基因破坏技术(例如基因编辑)。例子包括反义技术(例如RNAi、siRNA、shRNA和/或核酶，通常会导致表达的瞬时降低)以及基因编辑技术(导致目标基因失活或破坏，例如通过诱导断裂和/或同源重组)。例子包括插入、突变和缺失。破坏通常导致基因所编码的正常或“野生型”产物的表达被抑制和/或完全不表达。此类基因破坏的例子是基因或基因一部分的插入、移码和错义突变、缺失、敲入和敲除，包括整个基因的缺失。此类破坏可发生在编码区(例如一个或多个外显子中)，导致无法产生全长产物、功能产物或任何产物，例如通过插入终止密码子发生此类破坏。此类破坏也可能通过启动子或增强子或者影响转录激活的其他区域的破坏而发生，以便阻止基因的转录。基因破坏包括基因靶向，其包括通过同源重组进行的靶向基因失活。
“Notch配体”是能够结合存在于许多不同哺乳动物细胞(如造血干细胞)膜中的Notch受体多肽的蛋白质。在人细胞中已经鉴定出的Notch受体包括Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4。Notch配体通常具有DSL结构域(D-Delta，S-Serrate和L-Lag2)，其在氨基末端包含20至22个氨基酸，并在细胞外表面上具有3至8个EGF样重复序列(Furie和Furie,1988；Knust等,1987；Suzuki等,1987)。
“超级供体”在本文中是指对某些MHC I类和II类基因纯合形式的个体。这些纯合个体可用作超级供体，并且它们的细胞(包括含有其细胞的组织和其他材料)可被移植到对该单倍型纯合形式或杂合形式的个体中。超级供体对HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ基因座/基因座等位基因可以是各自纯合形式的。
如本文所使用的术语“嵌合抗原受体(CAR)”可以指例如人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体，并包括将人工特异性移植到特定免疫效应细胞上的改造的受体。可利用CAR来将单克隆抗体特异性赋予给T细胞，从而允许产生大量特异性T细胞，例如用于过继性细胞疗法。在具体实施方案中，例如CAR指导细胞对肿瘤相关抗原的特异性。在一些实施方案中，CAR包含胞内激活结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区的胞外结构域。在特定方面，CAR包含源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合物，其跨膜结构域和内结构域(endodomain)融合至CD3-ζ。其他CAR设计的特异性可以源自受体(例如肽)的配体或源自模式识别受体(例如Dectins)。在某些情况下，可以修饰抗原识别结构域的间隔以减少活化诱导的细胞死亡。在某些情况下，CAR包含用于额外共刺激信号的结构域，例如CD3ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10和/或OX40。在一些情况下，分子可与CAR共表达，所述分子包括共刺激分子，用于成像(例如用于正电子发射断层成像)的报告基因，在添加前体药物时条件性消融T细胞的基因产物，归巢受体，趋化因子，趋化因子受体，细胞因子和细胞因子受体。
术语“抗原呈递细胞(APC)”是指一类能够以免疫系统的特异性效应细胞可识别的肽-MHC复合物形式呈递一种或多种抗原从而诱导针对所呈递抗原的有效细胞免疫应答的细胞。APC可以是完整的整个细胞，例如巨噬细胞、B细胞、内皮细胞、活化的T细胞以及树突细胞；或者其他天然存在或合成的分子，例如与β2-微球蛋白复合的纯化MHC I类分子。尽管许多类型的细胞都可能能够在其细胞表面上呈递抗原以进行T细胞识别，但只有树突细胞才有能力呈递有效量的抗原来激活初始T细胞以产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。
II.多能干细胞
在某些实施方案中，将多能干细胞改造以表达抗原受体，例如CAR。多能干细胞可以是干细胞，包括但不限于诱导性多能干细胞和胚胎干细胞。在特定方面，本文所使用的多能干细胞是人胚胎干细胞(ESC)或诱导性多能干细胞(iPSC)，其能够在体外长期增殖，同时保留分化为身体所有细胞类型(包括本公开的造血前体细胞)的潜力。
A.胚胎干细胞
在某些方面，多能干细胞为ESC。ES细胞来源于囊胚的内细胞团，具有很高的体外分化能力。可通过移除发育中胚胎的外滋养胚层，然后在非生长细胞的饲养层上培养内细胞团细胞来分离ES细胞。重铺板的细胞能够继续增殖并产生新的ES细胞集落，其能够被移除、分离、再次重铺板并使其生长。可多次重复这种“传代”未分化ES细胞的过程，以产生含有未分化ES细胞的细胞系(美国专利号5,843,780；6,200,806；7,029,913)。ES细胞具有在保持其多潜能的同时进行增殖的潜力。例如，ES细胞适用于研究细胞和控制细胞分化的基因。可通过转基因、嵌合和敲除小鼠的产生，将ES细胞的多潜能性与遗传操作和选择相结合，用于进行体内基因分析研究。
产生小鼠ES细胞的方法是众所周知的。在一种方法中，用小鼠抗血清处理来自129品系小鼠的植入前囊胚以移除滋养外胚层，并将内细胞团培养在含有胎牛血清的培养基中化学灭活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层上。在胎牛血清存在下，将发育中的未分化ES细胞集落在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上传代培养，以产生ES细胞群。在一些方法中，可通过将细胞因子白血病抑制因子(LIF)添加到含血清的培养基中，在没有饲养层的情况下使小鼠ES细胞生长。在其他方法中，小鼠ES细胞能够在骨形态发生蛋白和LIF存在下在无血清培养基中生长。
人ES细胞可由合子或囊胚期哺乳动物胚胎所产生或源自它们，所述合子或囊胚期哺乳动物胚胎是通过将精子与卵细胞融合、核移植、发病(pathogenesis)而产生的，或者通过先前所描述的方法(Thomson和Marshall,1998；Reubinoff等，2000)通过染色质重编程、然后将重编程的染色质掺入质膜中以产生胚胎细胞而产生。在一种方法中，将人囊胚暴露于抗人血清中，将滋养外胚层细胞裂解并从培养在小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上的内细胞团中分离。此外，将源自内细胞团的细胞团块进行化学或机械解离、重铺板，通过微量移液管选择未分化形态的集落，解离并重铺板。在一些方法中，可通过在碱性成纤维细胞生长因子存在下，在成纤维细胞饲养层上培养ES细胞而在无血清的情况下培养人ES细胞。在其他方法中，可通过在含有碱性成纤维细胞生长因子的“条件”培养基存在下，在蛋白质基质(例如MATRIGELTM或层粘连蛋白)上培养细胞而在没有饲养细胞层的情况下培养人ES细胞(Xu等,2001)。
通过先前所描述的方法(Thomson和Marshall,1998；Thomson等,1995；Thomson和Odorico,2000；美国专利号5,843,780)，ES细胞也可源自其他生物体(包括恒河猴和狨猴)以及源自已建立的小鼠和人细胞系。例如，已建立的人ES细胞系包括MAOI、MA09、ACT-4、HI、H7、H9、H13、H14和ACT30。作为更多例子，已建立的小鼠ES细胞系包括由小鼠品系129胚胎的内细胞团所建立的CGR8细胞系，CGR8细胞的培养物能够在没有饲养层的情况下在LIF的存在下生长。
ES干细胞可通过蛋白质标志物进行检测，所述蛋白质标志物包括转录因子Oct4、碱性磷酸酶(AP)、阶段特异性胚胎抗原SSEA-1、阶段特异性胚胎抗原SSEA-3、阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、转录因子NANOG、肿瘤排斥抗原1-60(TRA-1-60)、肿瘤排斥抗原1-81(TRA-1-81)、SOX2或REX1。
B.诱导性多能干细胞
在其他方面，本文中所使用的多能干细胞是诱导性多能干(iPS)细胞，通常缩写为iPS细胞或iPSC。多潜能的诱导最初是在2006年使用小鼠细胞(Yamanaka等,2006)和2007年使用人细胞(Yu等,2007；Takahashi等,2007)通过引入多潜能相关联的转录因子对体细胞进行重编程而实现的。iPSC的使用规避了与ES细胞大规模临床使用相关的大多数伦理和实践问题，并且具有源自iPSC的自体移植的患者可能不需要终生免疫抑制治疗来防止移植物排斥。
除生殖细胞外，任何细胞都可用作iPSC的起点。例如，细胞类型可能是角质形成细胞、成纤维细胞、造血细胞、间充质细胞、肝细胞或胃细胞。T细胞也可用作体细胞来源进行重编程(美国专利号8,741,648)。对细胞分化的程度或收集细胞的动物的年龄没有限制；在本文所公开的方法中，甚至未分化的祖细胞(包括体干细胞)和最终分化的成熟细胞都可用作体细胞来源。
能够使用本领域技术人员已知的方法将体细胞重编程以产生iPSC。本领域技术人员可容易地产生诱导性多能干细胞，参见例如公开的美国专利申请号20090246875、公开的美国专利申请号2010/0210014；公开的美国专利申请号20120276636；美国专利号8,058,065；美国专利号8,129,187；美国专利号8,268,620；PCT公开号WO 2007/069666 A1和美国专利号8,268,620，通过引用将它们并入本文。通常使用核重编程因子从体细胞产生多能干细胞。在一些实施方案中，利用了Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28中的至少三种或至少四种。在其他实施方案中，利用了Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4。
这些核重编程物质的小鼠和人cDNA序列可参考WO 2007/069666和美国专利号8,183,038中提及的NCBI登录号获得，通过引用将它们并入本文。引入一种或多种重编程物质或编码这些重编程物质的核酸的方法都是本领域已知的，并公开于例如美国专利号8,268,620、8,691,574、8,741,648、8,546,140，公开的美国专利号8,900,871和美国专利号8,071,369，它们均通过引用并入本文。
产生iPSC后，iPSC可在足以维持多潜能的培养基中进行培养。iPSC可与开发来培养多能干细胞(更具体地说是胚胎干细胞)的各种培养基和技术一起使用，如美国专利号7,442,548和美国专利公开号2003/0211603中所述的。在小鼠细胞的情况下，在普通培养基中添加白血病抑制因子(LIF)作为分化抑制因子进行培养。就人细胞而言，添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)代替LIF是合乎需要的。如本领域技术人员已知的，培养和维持iPSC的其他方法可与本发明的方法一起使用。
在某些实施方案中，可使用非限定条件；例如，可将多能细胞培养在成纤维细胞饲养细胞上或者已暴露于成纤维细胞饲养细胞的培养基上，以便保持干细胞处于未分化状态。在一些实施方案中，将用放射线或抗生素处理过的小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，与细胞共存进行培养以终止细胞分裂。备选地，可以使用限定的、无需饲养细胞的培养系统(例如TESRTM培养基(Ludwig等,2006a；Ludwig等,2006b)或E8TM/Essential 8TM培养基(Chen等,2011))，将多能细胞培养并维持在基本未分化的状态。
设计质粒时要考虑许多目标，例如实现受调控的高拷贝数并避免细菌中质粒不稳定的潜在原因，提供与在哺乳动物细胞(包括人细胞)中应用兼容的质粒选择手段。特别要注意用于人细胞的质粒的双重要求。第一，它们适合在大肠杆菌中进行维持和发酵，因此能够产生和纯化大量DNA。第二，它们是安全的，适合用于人患者和动物。第一个要求就需要能够在细菌发酵过程中相对容易地选择并稳定维持的高拷贝数的质粒。第二个要求就需要注意诸如选择性标志物和其他编码序列之类的元件。在一些实施方案中，编码标志物的质粒由以下部分组成：(1)高拷贝数复制起始点，(2)选择性标志物，例如但不限于用卡那霉素进行抗生素选择的neo基因，(3)转录终止序列，包括酪氨酸酶增强子；和(4)用于掺入各种核酸盒的多克隆位点；以及(5)编码与酪氨酸酶启动子可操作地连接的标志物的核酸序列。有许多本领域已知的用于诱导编码蛋白质的核酸的质粒载体。这些载体包括但不限于下述中所公开的载体：美国专利号6,103,470；美国专利号7,598,364；美国专利号7,989,425；和美国专利号6,416,998，通过引用将它们并入本文。
附加型基因传递系统可以是质粒、基于埃巴病毒(EBV)的附加型载体(美国专利8,546,140)、基于酵母的载体、基于腺病毒的载体、基于猿猴病毒40(SV40)的附加型载体、基于牛乳头瘤病毒(BPV)的载体或者慢病毒载体。病毒基因递送系统可以是基于RNA或基于DNA的病毒载体。
1.用于产生iPSC的细胞
本公开的某些实施方案涉及被重编程为iPSC的体细胞(例如血细胞或皮肤细胞)的起始群。血细胞群可包括外周血单核细胞(PBMC)，包含混合群的全血或其部分，脾细胞，骨髓细胞，肿瘤浸润淋巴细胞，通过白细胞分离术获得的细胞，活检组织和淋巴结(例如从肿瘤引流的淋巴结)。合适的供体包括免疫过的供体、未经免疫的(初次免疫的)供体、已处理的供体或未经处理的供体。“已处理的”供体是已经暴露于一种或多种生物修饰剂的供体。“未经处理的”供体尚未暴露于一种或多种生物修饰剂。
在一些方面，血细胞群包含T细胞。T细胞可以是纯化的T细胞群，或者备选地，T细胞可以是具有不同类型的细胞(例如B细胞和/或其他外周血细胞)的群。T细胞可以是T细胞亚群(例如CD4+T细胞)的纯化群，或者它们可以是包含不同T细胞亚群的T细胞群。在另一个实施方案中，T细胞是已经在培养物中长期维持的T细胞克隆。T细胞克隆能够被不同程度地转化。在具体的实施方案中，T细胞是在培养物中无限增殖的T细胞克隆。
在一些方面，T细胞是原代T细胞。术语“原代T细胞”旨在包括从个体所获得的T细胞，与已经在培养物中长期维持的T细胞相反。因此，原代T细胞是获自受试者的特定外周血T细胞。一群原代T细胞可主要由一个T细胞亚群所组成。备选地，原代T细胞群可由不同T细胞亚群所组成。
T细胞可来自先前存储的血样、来自健康个体或者备选地来自患有某种病况的个体。病况可以是传染性疾病，例如由病毒感染、细菌感染或任何其他微生物感染所引起的病况，或者是过度增殖性疾病，例如癌症(如黑素瘤)。在具体实施方案中，T细胞来自感染了人类免疫缺陷病毒(HIV)的个体。在还有的另一实施方案中，T细胞来自患有或易患自身免疫性疾病或T细胞病变的受试者。T细胞可以是人源、鼠源或任何其他哺乳动物物种的。
获得包含T细胞的细胞群的方法是本领域众所周知的。例如，可根据本领域已知的方法所描述的那样获得外周血单核细胞(PBMC)。此类方法的例子在实施例中阐述，且在Kim等(1992)；Biswas等(1990)；Biswas等(1991)中探讨过。
在一些方面，血细胞的起始群包括造血干细胞(HSC)。HSC通常位于骨髓中，但能够使其进入血液，这一过程被称为动员，临床上用于在外周血中收集大量HSC。所选的一种动员剂是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。可通过单采血液成分技术在平静状态下或在外部施用造血生长因子(如G-CSF)后进行动员之后收集外周血中循环的CD34+造血干细胞或祖细胞。动员后所收集的干细胞或祖细胞的数量要多于平静状态下的单采血液成分术后所获得的干细胞或祖细胞的数量。在一些方面，细胞群的来源是其细胞尚未被外源施加的因子所动员的受试者，因为不需要富集造血干细胞或祖细胞。
从细胞群获得造血前体细胞的方法也是本领域众所周知的。可使用各种细胞因子(例如hSCF、hFLT3和/或IL-3)扩增造血前体细胞(Akkina等,1996)，或者可使用MACS或FACS富集CD34+细胞。如上所述，也可使用负选择技术来富集CD34+细胞。
用于本文所述方法的细胞群可以是哺乳动物细胞，例如人细胞、非人灵长类细胞、啮齿动物细胞(例如小鼠或大鼠)、牛细胞、羊细胞、猪细胞、马细胞、绵羊细胞、犬细胞和猫细胞或其混合物。非人灵长类细胞包括恒河猴细胞。细胞可获自动物，例如人患者，或可获自细胞系。如果细胞是从动物获得的，则可以按原样使用，例如作为未经分离的细胞(即混合群)；它们可能已首先通过例如转化而被培养建系；或者它们可能已经过初步纯化方法处理。例如，可基于细胞表面标志物的表达通过正选择或负选择来操作细胞群；在体外或体内用一种或多种抗原进行刺激；在体外或体内用一种或多种生物修饰剂进行处理；或者它们的任意组合或全部。在说明性实施方案中，对细胞群进行负选择以除去非T细胞和/或特定T细胞亚群。可基于各种分子的细胞表面表达来进行负选择，所述分子包括B细胞标志物(例如CD19和CD20)；单核细胞标志物CD14；NK细胞标志物CD56。备选，可对细胞群进行负选择以除去非CD34+造血细胞和/或特定造血细胞亚群。可基于各种分子的细胞表面表达来进行负选择，所述分子例如抗体混合物(例如CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123、CD235a和CD41(例如用于巨核细胞谱系的细胞))，它们可用于其他类型细胞的分离，例如通过MACS或柱分离。
还可从受试者获得细胞样品，然后使其富集所需的细胞类型。例如，可以如本文所述从血液中分离PBMC和/或CD34+造血细胞。可使用逆流离心(淘析)从PBMC中富集T细胞。也可使用各种技术从其他细胞分离细胞，例如用与所需细胞类型的细胞表面上的表位结合的抗体分离和/或激活，例如某一些T细胞分离试剂盒使用缀合抗体的珠子激活细胞，然后用相同的珠子进行柱分离。可以使用的另一方法包括使用针对细胞表面标志物的抗体进行负选择，以选择性富集具体细胞类型而不通过受体结合来激活细胞。
骨髓细胞可从髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或其他髓腔获得。可从患者体内取出骨髓，通过各种分离和漂洗程序进行分离。分离骨髓细胞的已知方法包括以下步骤：a)将骨髓悬浮液离心分离成三个级分，并收集中间级分或白膜层；b)将步骤(a)的白膜层级分在通常为Ficoll(Pharmacia Fine Chemicals AB的商标)的分离液中再离心一次，收集含有骨髓细胞的中间级分；c)漂洗步骤(b)所收集的级分，回收可回输的骨髓细胞。
如果希望使用富含T细胞的细胞群，则可以使用连续流式细胞分离器通过白细胞分离术和机械单采血液成分术从混合细胞群中获得这种细胞群。例如，可通过任何已知方法从白膜层中分离T细胞，包括通过Ficoll-HypaqueTM梯度分离、Percoll梯度分离或淘析。
在某些方面，T细胞被与T细胞受体结合以触发T细胞活化的信号传导级联的试剂所活化。例如可使用CD3抗体。为了大量扩增T细胞且处于重编程的增殖状态，也可使用细胞因子，例如IL-2。在某些方面，在涉及共刺激的情况下，抗CD3和抗CD28都可用于T细胞活化。在备选的方面，可应用抗CD3的交联，例如与板结合的抗CD3。如果使用可溶性抗CD3来激活PBMC中的T细胞，则可溶性抗CD3抗体可能会与PBMC中的APC结合，然后将抗体呈递给T细胞。如果将可溶性抗CD3抗体单独用于纯化的T细胞群，则由于上述原因将导致无应答(anergy)。某些实施方案包括在抗CD3(OKT3)和IL2存在下培养T细胞，这是有利和方便的，因为不需要使用昂贵且繁琐的珠子或与板结合的抗体；加入OKT3和IL2后，PBMC的细胞环境将有助于激活T细胞。然后，T细胞由于优先扩增而挤掉了PBMC培养物中的其他细胞类型。
在某些方面，血细胞的起始群体包含淋巴母细胞，例如来自淋巴母细胞系(LCL)。LCL的生成是本领域已知的，例如通过用埃巴病毒(EBV)感染B细胞生成LCL(Frisan等,2001)。
2.体细胞重编程
在一些实施方案中，将起始细胞(例如T细胞)群重编程为iPSC，例如通过美国专利公开号2014/0315304所描述的方法；通过引用将其整体并入本文。在本公开的某些方面，重编程因子由包含在一种或多种载体(例如整合型载体或附加型载体)中的表达盒所表达。在另一方面，可通过蛋白质转导将重编程蛋白质直接引入体细胞中。
通过标准重组技术(参见例如Sambrook等,2001和Ausubel等,1996，均通过引用并入本文)，本领域技术人员将熟练地构建载体。载体包括但不限于质粒，粘粒，病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)，例如逆转录病毒载体(例如源自Moloney鼠白血病病毒载体(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等)，慢病毒载体(例如源自HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等)，腺病毒(Ad)载体(包括其可复制形式、复制缺陷形式和空壳形式)，腺相关病毒(AAV)载体，猿猴病毒40(SV-40)载体，牛乳头瘤病毒载体，埃巴病毒载体，疱疹病毒载体，牛痘病毒载体，Harvey鼠肉瘤病毒载体，鼠乳腺瘤病毒载体，Rous肉瘤病毒载体。
a.病毒载体
在本公开的某些方面可提供病毒载体。在产生重组病毒载体中，通常将非必需基因替换为异源(或非天然)蛋白的基因或编码序列。病毒载体是一类表达构建体，它利用病毒序列将核酸和可能的蛋白质引入细胞。某些病毒通过受体介导的胞吞作用感染细胞或进入细胞、整合入宿主细胞基因组并稳定有效地表达病毒基因的能力，使其成为将外源核酸转移至细胞(例如哺乳动物细胞)的吸引人的候选物。下文描述了可用于递送本公开某些方面的核酸的病毒载体的非限制性例子。
逆转录病毒有望作为基因递送载体，因为它们能够将基因整合到宿主基因组中，转移大量外源遗传物质，感染广泛的物种和细胞类型，并包装在特殊细胞系中(Miller,1992)。
为构建逆转录病毒载体，将核酸插入病毒基因组中代替某些病毒序列以产生复制缺陷型病毒。为产生病毒体，构建了包含gag、pol和env基因但不含LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等,1983)。当将包含cDNA的重组质粒以及逆转录病毒LTR和包装序列一起引入特殊的细胞系时(例如通过磷酸钙沉淀)，包装序列允许将重组质粒的RNA转录产物包装成病毒颗粒然后被分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein,1988；Temin,1986；Mann等,1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选进行浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。但是，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind等,1975)。
慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含具有调节或结构性功能的其他基因。慢病毒载体是本领域众所周知的(参见例如Naldini等,1996；Zuferey等,1997；Blomer等,1997；美国专利6,013,516和5,994,136)。
重组慢病毒载体能够感染未分裂细胞，可用于体内和离体基因转移以及核酸序列的表达。例如，在美国专利5,994,136中描述了能够感染未分裂细胞的重组慢病毒，其中用两种或更多种携带包装功能(即gag、pol和env，以及rev和tat)的载体转染合适的宿主细胞；通过引用将美国专利5,994,136并入本文。
b.附加型载体
在本公开内容的某些方面，也可提供基于质粒或脂质体的染色体外(即附加型)载体的使用。此类附加型载体可包括例如基于oriP的载体和/或编码EBNA-1衍生物的载体。此类载体可允许将大的DNA片段引入细胞并保持在染色体外，每个细胞周期复制一次，有效地分配给子细胞，且基本上不引起免疫应答。
特别地，EBNA-1是基于oriP的表达载体复制所需的唯一病毒蛋白质，它不会引发细胞免疫应答，因为它已经发展出有效机制来绕过其抗原在MHC I类分子上的呈递所需的过程(Levitskay等,1997)。此外，EBNA-1能够以反式作用来增强克隆基因的表达，在一些细胞系中诱导克隆基因高达100倍的表达(Langle-Rouault等,1998；Evans等,1997)。最后，这种基于oriP的表达载体的生产是廉价的。
其他染色体外载体包括其他基于淋巴营养性疱疹病毒(lymphotrophic herpesvirus)的载体。淋巴营养性疱疹病毒是在淋巴母细胞(例如人B淋巴母细胞)中复制并成为其天然生命周期一部分的质粒的疱疹病毒。单纯疱疹病毒(HSV)不是“淋巴营养性”疱疹病毒。示例性的淋巴营养性疱疹病毒包括但不限于EBV、卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)；松鼠猴疱疹病毒(HS)和马立克氏病病毒(MDV)。还包括基于附加体的载体的其他来源，例如酵母ARS、腺病毒、SV40或BPV。
通过标准的重组技术(参见例如Maniatis等,1988和Ausubel等,1994，均通过引用并入本文)，本领域技术人员将熟练地构建载体。
载体还可包含其他组分或功能，其进一步调节基因递送和/或基因表达，或者以其他方式为被靶向的细胞提供有益的特性。此类其他组分包括例如：影响结合或靶向细胞的组分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组分)；影响载体核酸的细胞摄取的组分；摄取后影响细胞内多核苷酸定位的组分(例如介导核定位的试剂)；以及影响多核苷酸表达的组分。
此类组分还可包括标志物，例如可用于检测或选择已摄取并表达由载体所递送的核酸的细胞的可检测和/或选择性标志物。此类组分可作为载体的天然特征提供(例如使用某些具有介导结合和摄取的组分或功能的病毒载体)，或者可修饰载体以提供此类功能。大量此类载体是本领域已知的，且通常都可获得。当将载体维持在宿主细胞中时，载体能够在有丝分裂期间作为自主结构被细胞稳定地复制、掺入到宿主细胞的基因组中或者保持在宿主细胞的核或细胞质中。
c.基于转座子的系统
在某些方面，编程因子的递送可使用转座子-转座酶系统。例如，转座子-转座酶系统可以是众所周知的睡美人(Sleeping Beauty)、青蛙王子(Frog Prince)转座子-转座酶系统(对后者的描述参见例如EP1507865)或TTAA特异性转座子PiggyBac系统。
转座子是能够在单个细胞的基因组内移动到周围不同位置的DNA序列，这一过程称为转座。在此过程中，它们可引起突变并改变基因组中DNA的量。转座子也曾经被称为跳跃基因，是移动遗传元件的例子。
移动遗传元件种类繁多，可根据它们的转座机制进行分组。I类移动遗传元件或逆转座子通过首先转录为RNA、然后通过逆转录酶逆转录回DNA、然后插入基因组的另一个位置来复制自身。II类移动遗传元件使用转座酶直接从一个位置移动到另一位置，以在基因组内“剪切并粘贴”它们。
在特定实施方案中，本公开中所提供的构建体(例如多谱系构建体)使用PiggyBac表达系统。PiggyBac(PB)DNA转座子通过“剪切并粘贴”机制进行动员，由此由转座子本身所编码的转座酶(PB转座酶)在基因组内其他位点处剪切并重新整合转座子。PB转座酶特异性识别转座子侧翼的PB反向末端重复(ITR)；它与这些序列结合并催化转座子的剪切。然后，PB以相对随机的方式整合到整个基因组的TTAA位点。为形成基因陷阱突变(或适于产生转基因动物)，在一个质粒上反式提供转座酶，与含有供体转座子(包含侧翼为转座酶结合位点(ITR)的基因陷阱的重组转座子)的质粒共转染。转座酶将催化转座子从质粒上剪切下来并随后整合到基因组中。在编码区域内的整合将捕获基因陷阱表达所必需的元件。PB具有几个理想的特性：(1)优先插入基因内(50％至67％插入到基因内)，(2)不表现出局部性跳跃(广泛的基因组覆盖)，(3)对超产抑制(其中转座酶水平升高导致转座减少)不敏感，(4)它会从供体部位干净地剪切掉，不留“脚印”，这与睡美人不同。
d.调节元件
可用于本公开的重编程载体中所包括的表达盒优选包含(沿5'至3'方向)可操作地连接至蛋白质编码序列的真核转录启动子，包括间插序列的剪接信号，以及转录终止/聚腺苷酸化序列。
(i)启动子/增强子
本文所提供的表达构建体包含启动子以驱动编程基因的表达。启动子通常包含起定位RNA合成起始位点作用的序列。该序列最著名的例子是TATA盒，但在一些缺少TATA盒的启动子(例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点的离散元件本身帮助确定起始位置。另外的启动子元件调节转录起始的频率。通常，它们位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管已表明许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。为了使编码序列“处在启动子的控制下”，就要将转录阅读框的转录起始位点的5'末端定位在所选启动子的“下游”(即3')。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进所编码RNA的表达。
启动子元件之间的间隔通常是灵活的，以便当元件相对于彼此反转或移动时，启动子功能得以保留。在tk启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可增加到相隔50bp。取决于启动子，似乎单个元件可以协同或独立地起作用来激活转录。启动子可以与“增强子”结合使用，也可以不与“增强子”结合使用，“增强子”是指参与核酸序列转录激活的顺式作用调节序列。
启动子可以是与核酸序列天然结合的启动子，可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列来获得。此类启动子可以称为“内源的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然缔合的一种，位于该序列的下游或上游。备选地，通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子的控制下将获得某些优点，重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的启动子。重组或异源增强子还指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的增强子。此类启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他病毒、原核或真核细胞中分离的启动子或增强子，以及不是“天然存在”的启动子或增强子，即包含不同转录调节区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，重组DNA构建中最常用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)，乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列外，还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)结合本文公开的组合物来产生序列(参见美国专利号4,683,202和5,928,906，每个通过引用并入本文)。此外，预期也可以采用指导序列在非核细胞器内的转录和/或表达的控制序列，所述细胞器例如线粒体、叶绿体等。
自然地，重要的是采用能有效指导DNA区段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域的技术人员通常知道使用启动子、增强子和细胞类型组合进行蛋白质表达(参见例如Sambrook等，1989年，其通过引用并入本文)。所用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、可诱导的和/或在适当的条件下可用于指导导入的DNA区段的高水平表达，例如在重组蛋白质和/或肽的大规模生产中是有利的。启动子可以是异源的或内源的。
另外，任何启动子/增强子组合(例如，根据真核启动子数据库EPDB)也可以用于驱动表达。T3、T7或SP6细胞质表达系统的使用是另一个可能的实施方案。如果提供适当的细菌聚合酶(无论是作为递送复合物的一部分还是作为额外的基因表达构建体)，真核细胞可以支持某些细菌启动子的细胞质转录。
启动子的非限制性例子包括早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如β-肌动蛋白启动子(Ng,1989；Quitsche等,1989)、GADPH启动子(Alexander等,1988，Ercolani等,1988)、金属硫蛋白启动子(Karin等,1989；Richards等,1984)；以及多联应答元件启动子，例如环状AMP应答元件启动子(cre)、血清应答元件启动子(sre)、佛波酯启动子(TPA)和最小TATA盒附近的应答元件启动子(tre)。也可能使用人生长激素启动子序列(例如Genbank登录号X05244所述的人生长激素最低启动子，核苷酸283-341)或小鼠乳腺瘤启动子(可从ATCC产品编号ATCC 45007获取)。
组织特异性转基因表达，特别是在源自编程的造血细胞和造血细胞前体中的报告基因表达，可能是鉴定衍生的造血细胞和前体的理想方法。为了增加特异性和活性，已经考虑使用顺式作用调节元件。例如，可使用造血细胞特异性启动子。许多此类造血细胞特异性启动子是本领域已知的，例如表1中所提供的造血基因的启动子。
在某些方面，本公开的方法还涉及增强子序列，即增加启动子活性并具有顺式作用潜能的核酸序列，不论其方向如何，即使在相当长的距离(远离目标启动子多至几千个碱基)下。然而，增强子功能不必限于如此长的距离，因为它们也可在非常接近给定启动子的情况下起作用。
已鉴定了许多造血细胞启动子和增强子序列，可适用于本发明方法。参见例如美国专利5,556,954；美国专利申请20020055144；美国专利申请20090148425。
(ii)起始信号和连接表达
也可在本公开内容所提供的表达构建体中使用特异性起始信号以有效翻译编码序列。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将能够容易地确定这一点并提供所需信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框“同框”，以确保整个插入片段的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含合适的转录增强子元件可提高表达效率。
在某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5'甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模式，并在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg,1988)。已经描述了来自小RNA病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg,1988)，以及来自哺乳动物信息的IRES元件(Macejak和Sarnow,1991)。可将IRES原件连接到异源开放阅读框。可将多个开放阅读框转录在一起，每个都由一个IRES隔开，从而产生多顺反子信息。借助于IRES元件，每个开放阅读框都可接近核糖体进行有效翻译。使用单个启动子/增强子来转录单个信息能够有效地表达多个基因(参见美国专利号5,925,565和5,935,819，各自都通过引用并入本文)。
另外，可使用某些2A序列元件在本公开所提供的构建体中产生编程基因的连接表达或共表达。例如，通过连接开放阅读框形成单个顺反子，切割序列就可用于共表达基因。示例性的切割序列是F2A(口蹄疫病毒2A)或“2A样”序列(例如，Thosea asigna病毒2A；T2A)。在特定的实施方案中，使用F2A切割肽来连接多谱系构建体中基因的表达。
e.复制起始
为使载体在宿主细胞中增殖，它可包含一个或多个复制位点起始点(通常称为“ori”)，例如相应于上述EBV oriP或者在编程中具有相似或增强功能的遗传改造的oriP的核酸序列，它是复制起始处的具体核酸序列。备选地，可采用如上所述的其他染色体外复制病毒的复制起始点或者自主复制序列(ARS)。
f.选择和筛选标志物
在某些实施方案中，可通过在表达载体中包括标志物来在体外或体内鉴定含有核酸构建体的细胞。此类标志物会赋予细胞可识别的改变，从而允许容易地鉴定含有表达载体的细胞。通常，选择标志物是一种赋予允许选择的特性的标志物。正选择标志物是其中存在标志物允许其选择的标志物，而负选择标志物是其存在阻止其选择的标志物。正选择标志物的一个例子是耐药性标志物。
通常，包含药物选择标志物有助于克隆和鉴定转化子，例如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素(zeocin)和组氨醇抗性的基因是有用的选择标志物。除了赋予表型以允许基于条件的实施来区分转化子的标志物之外，还考虑了其他类型的标志物，包括筛选标志物(例如GFP)，其基础是比色分析。备选地，可以利用筛选酶作为负选择标志物，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也会知道如何采用免疫学标志物，可能结合FACS分析。只要能够与编码基因产物的核酸同时表达，相信所使用的标志物是不重要的。选择和筛选标志物的其他更多例子是本领域技术人员众所周知的。
通过本公开内容，将核酸(例如DNA或RNA)引入将被编程为造血前体细胞的多能干细胞中，可使用如本文所述或本领域普通技术人员已知的用于递送核酸进行细胞转化的任何合适方法。此类方法包括但不限于直接递送DNA，例如通过离体转染(Wilson等,1989，Nabel等,1989)，通过注射(美国专利号5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，各自通过引用并入本文)，包括显微注射(Harland和Weintraub,1985；美国专利号5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利号5,384,253，通过引用并入本文；Tur-Kaspa等,1986；Potter等,1984)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb,1973；Chen和Okayama,1987；Rippe等,1990)；通过使用DEAE-葡聚糖再用聚乙二醇(Gopal,1985)；通过直接声波加载(Fechheimer等,1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene,1982；Fraley等,1979；Nicolau等,1987；Wong等,1980；Kaneda等,1989；Kato等，1991)和受体介导的转染(Wu和Wu,1987；Wu和Wu,1988)；通过微粒轰击(microprojectile bombardment，PCT申请号WO 94/09699和95/06128；美国专利号5,610,042；5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，各自都通过引用并入本文)；通过用碳化硅纤维震荡(Kaeppler等,1990；美国专利号5,302,523和5,464,765，各自都通过引用并入本文)；通过农杆菌介导的转化(美国专利号5,591,616和5,563,055，各自都通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等,1985)，以及这些方法的任何组合。通过应用诸如此类的技术，可以稳定地或瞬时地转化细胞器、细胞、组织或生物体。
C.MHC单倍型匹配
主要组织相容性复合体(MHC)是异体器官移植免疫排斥的主要原因。有三种主要的MHC I类单倍型(A、B和C)和三种主要的MHC II类单倍型(DR、DP和DQ)。HLA基因座高度多态，在6号染色体上分布超过4Mb。在该区域内对HLA基因进行单倍分型的能力在临床上很重要，因为该区域与自身免疫和感染性疾病相关，并且供体和接受体之间的HLA单倍型相容性会影响移植的临床结果。对应MHC I类的HLA从细胞内部呈递肽，对应MHC II类的HLA将抗原从细胞外部呈递给T淋巴细胞。移植物和宿主之间MHC单倍型的不相容会引发针对移植物的免疫应答，并导致其排斥。因此，可用免疫抑制剂治疗患者以防止排斥。HLA匹配的干细胞系可以克服免疫排斥的风险。
由于HLA在移植中的重要性，通常通过血清学和PCR对HLA基因座进行分型，以鉴别有利的供体-接受体对。HLA I类和II类抗原的血清学检测可使用纯化的T或B淋巴细胞进行补体介导的淋巴细胞毒性测试来完成。该方法主要用于匹配HLA-A和-B基因座。基于分子的组织分型通常可能比血清学测试更准确。低分辨率分子方法(例如SSOP(序列特异性寡核苷酸探针)方法)可用于鉴别HLA抗原，其中将PCR产物针对一系列寡核苷酸探针进行测试，目前这些方法是用于II类HLA分型的最常用方法。利用等位基因特异性引物进行PCR扩增的高分辨率技术(例如SSP(序列特异性引物)方法)能够鉴别特异性MHC等位基因。
如果供体细胞是HLA纯合形式的，即每个抗原呈递蛋白质都包含相同的等位基因，则供体和接受体之间的MHC相容性将显著提高。大多数个体是MHC I类和II类基因杂合形式的，但某些个体的这些基因是纯合形式的。这些纯合形式的个体能够充当超级供体，从其细胞所产生的移植物可被移植到该单倍型纯合形式的或杂合形式的所有个体中。此外，如果纯合形式的供体细胞具有在群体中高频率存在的单倍型，则这些细胞就可在许多个体的移植治疗中进行应用。
因此，在一些实施方案中，本方法的PSC可由待治疗受试者或者具有与患者相同或基本相同的HLA类型的另一受试者的体细胞产生。在一种情况下，供体的主要HLA(例如HLA-A、HLA-B和HLA-DR的三个主要基因座)与接受体的主要HLA相同。在一些情况下，体细胞供体可以是超级供体；因此，可使用源自MHC纯合形式超级供体的PSC来产生HPC，并随后产生免疫细胞(例如T细胞)。因此，可将源自超级供体的免疫效应细胞移植到对该单倍型为纯合形式或杂合形式的受试者中。例如，免疫细胞可以对两个HLA等位基因(例如HLA-A和HLA-B)是纯合形式的。这样，就可在本文所公开的方法中使用由超级供体所产生的免疫细胞，以产生能够潜在地“匹配”大量潜在接受体的免疫细胞。
D.遗传改造的抗原受体
可对PSC进行遗传改造以表达抗原受体，例如改造的TCR或CAR。例如，将PSC(例如自体的或同种异体的)进行修饰以表达对癌症抗原具有抗原特异性的TCR或CAR。
合适的修饰方法是本领域已知的。参见例如Sambrook和Ausubel，见上文。例如，可以使用Heemskerk等,Hum Gene Ther.19:496-510(2008)和Johnson等,Blood 114：535-46(2009)中所描述的转导技术来转导细胞，以表达对癌症抗原具有抗原特异性的TCR。
编码全长TCRα和β(或者γ和δ)链的RNA的电穿孔可用作备选方法，以克服由逆转录病毒转导的和内源性TCR链配对所引起的长期自身反应性问题。即使这种备选的配对发生在瞬时转染策略中，可能产生的自身反应性T细胞在一段时间后就将失去这种自身反应性，因为所引入的TCRα和β链仅仅瞬时表达。当引入的TCRα和β链表达减少时，就只剩下正常的自体T细胞。当通过稳定的逆转录病毒转导引入全长TCR链时，就不是这种情况，就将永远不会丢失所引入的TCR链，从而导致患者体内不断出现自身反应性。
在一些实施方案中，细胞包含通过遗传改造所引入的编码一种或多种抗原受体的一种或多种核酸，以及此类核酸的遗传改造产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从该细胞所获得的样品中，例如从另一种生物体或细胞所获得的样品，例如其通常不在该改造的细胞和/或此类细胞所来源的生物体中存在。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，例如自然界中不存在的核酸(例如嵌合的)。
在一些实施方案中，CAR含有与抗原特异性结合的胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，抗原是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，且抗原是经加工的肽抗原，例如胞内蛋白质的肽抗原，它就像TCR一样在主要组织相容性复合体(MHC)分子的环境下于细胞表面上被识别。
包括CAR和重组TCR在内的示例性抗原受体以及将受体改造并引入细胞的方法，包括例如在国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP2537416中所描述的那些，和/或Sadelain等,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等.(2013)PLoS ONE8(4):e61338；Turtle等,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等,Cancer,2012年3月18(2):160-75中所描述的那些。在一些方面，遗传改造的抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的CAR和国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。
1.嵌合抗原受体
在一些实施方案中，CAR包含：a)胞内信号传导结构域，b)跨膜结构域，和c)包含抗原结合区的胞外结构域。
在一些实施方案中，改造的抗原受体包括CAR，其包括活化或刺激性CAR、共刺激性CAR(参见WO2014/055668)和/或抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等,2013)。CAR通常包含与一种或多种胞内信号传导组分连接的胞外抗原(或配体)结合结构域，在一些方面是通过接头和/或跨膜结构域连接的。此类分子通常模拟或近似于通过天然抗原受体的信号，通过这种受体与共刺激受体组合的信号和/或仅通过共刺激受体的信号。
本公开的某些实施方案涉及核酸的用途，核酸包括编码抗原特异性CAR多肽的核酸，包括已被人源化以降低免疫原性的CAR(hCAR)，其包含胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包含一个或多个信号基序的胞外结构域。在某些实施方案中，CAR可识别包含一种或多种抗原之间的共用空间的表位。在某些实施方案中，结合区可包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一实施方案中，特异性源自与受体结合的肽(例如细胞因子)。
可预期的是，人CAR核酸可以是用于增强人患者的细胞免疫疗法的人基因。在具体实施方案中，本发明包括全长CAR cDNA或编码区。抗原结合区或结构域可包含源自特定人单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的VH和VL链的片段，例如美国专利7,109,304中所描述的那些，美国专利7,109,304通过引用并入本文。片段也可是人抗原特异性抗体的任何数量的不同抗原结合结构域。在一个更具体的实施方案中，片段是由针对人密码子使用而优化的序列所编码的抗原特异性scFv，以在人细胞中进行表达。
排列可以是多聚的，例如双抗体或多聚体。多聚体最有可能通过将轻链和重链的可变部分交叉配对成双抗体而形成。构建体的铰链部分可具有多种选择，从完全缺失到保留第一个半胱氨酸到脯氨酸而不是丝氨酸取代，直至被截短到第一个半胱氨酸。Fc部分可被删除。任何稳定的和/或二聚化的蛋白质都能够达到这个目的。可仅使用Fc结构域之一，例如人免疫球蛋白的CH2或CH3结构域。还可使用已经过修饰的人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3区以改善二聚化。还可只使用免疫球蛋白的铰链部分。还可使用CD8α的部分。
在一些实施方案中，CAR核酸包含编码其他共刺激受体的序列，例如跨膜结构域和修饰的CD28胞内信号传导结构域。其他共刺激受体包括但不限于CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10和4-1BB(CD137)中的一种或多种。除了由CD3ζ起始的原发性信号外，由插入人CAR中的人共刺激受体所提供的额外信号对于NK细胞的完全活化也很重要，可帮助改善过继性免疫疗法的体内持久性和治疗成功。
在一些实施方案中，将CAR构建为对特定抗原(或标志物或配体)具有特异性，例如在特定细胞类型中所表达的要被过继治疗靶向的抗原(例如癌标志物)和/或旨在诱导减弱应答的抗原(例如在正常或非疾病细胞类型上所表达的抗原)。因此，CAR通常在其胞外部分包含一个或多个抗原结合分子，例如一个或多个抗原结合片段、结构域或部分，或者一个或多个抗体可变结构域和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的抗原结合部分，例如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
在嵌合抗原受体的某些实施方案中，受体的抗原特异性部分(可称为包含抗原结合区的胞外结构域)包含肿瘤相关抗原或病原体特异性抗原结合结构域。抗原包括由模式识别受体(例如Dectin-1)所识别的碳水化合物抗原。肿瘤相关抗原可以是任何种类的，只要它在肿瘤细胞的细胞表面上表达即可。肿瘤相关抗原的示例性实施方案包括CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Met、AKT、Her2、Her3、上皮肿瘤抗原、黑素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras等等。
可以从基因组DNA来源、cDNA来源获得编码嵌合受体的开放阅读框的序列，或者可以合成(例如经由PCR)或其组合。取决于基因组DNA大小和内含子数目，使用cDNA或其组合可能是合乎需要的，因为发现内含子稳定了mRNA。而且，使用内源或外源非编码区来稳定mRNA可能是进一步有利的。
可以预期，能够将嵌合构建体以裸DNA或合适载体的形式引入免疫细胞。使用裸DNA通过电穿孔稳定转染细胞的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号6,410,319。裸DNA通常是指以正确表达方向包含在质粒表达载体中的编码嵌合受体的DNA。
备选地，可使用病毒载体(例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或者慢病毒载体)将嵌合构建体引入免疫细胞。用于根据本公开的方法的合适载体在免疫细胞中是非复制性的。已知许多基于病毒的载体，其中在细胞中维持的病毒的拷贝数低到足以维持细胞存活，所述载体例如基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。
在一些方面，将抗原特异性结合或识别组分与一个或多个跨膜和胞内信号传导结构域连接。在一些实施方案中，CAR包括与CAR的胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免这些结构域与相同或不同表面膜蛋白质的跨膜结构域结合，使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然或合成来源。如果来源是天然的，则该结构域在一些方面源自任何膜结合蛋白质或跨膜蛋白质。跨膜区域包括那些源自(即至少包括其跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ζ，CD3ε，CD3γ，CD3δ，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD 16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD 134，CD137，CD154，ICOS/CD278，GITR/CD357，NKG2D和DAP分子。备选地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成的跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，在合成的跨膜结构域的每个末端都将发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体。
在某些实施方案中，本文所公开的遗传修饰免疫细胞(例如NK细胞)的平台技术包括：(i)使用电穿孔装置(例如核转染仪)的非病毒基因转移，(ii)通过内结构域发信号的CAR(例如CD28/CD3-ζ、CD137/CD3-ζ或其他组合)，(iii)具有可变长度的将抗原识别结构域连接到细胞表面的CAR，在一些情况下还包括(iv)源自K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)以能够稳定地大量扩增CAR+免疫细胞(Singh等,2008；Singh等,2011)。
2.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，遗传改造抗原受体包括重组TCR和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。“T细胞受体”或“TCR”是指含有可变α和β链(分别还称为TCRα和TCRβ)或者可变γ和δ链(分别还称为TCRγ和TCRδ)的分子，能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽。在一些实施方案中，TCR为αβ形式。
通常，以αβ和γδ形式存在的TCR通常在结构上相似，但是表达它们的T细胞可能具有截然不同的解剖位置或功能。TCR可在细胞表面或以可溶形式存在。通常，TCR在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上存在，通常负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原。在一些实施方案中，TCR还可包含恒定结构域、跨膜结构域和/或短的胞质尾巴(参见例如Janeway等,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,3rd Ed.,Current Biology Publications,p.433,1997)。例如，在一些方面，TCR的每条链都可具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短胞质尾巴。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质相关。除非另有说明，术语“TCR”应理解为涵盖其功能性TCR片段。该术语还涵盖完整的或全长的TCR，包括αβ形式或γδ形式的TCR。
因此，出于本文的目的所提及的TCR包括任何TCR或功能片段，例如与结合在MHC分子中的特异性抗原肽(即MHC-肽复合物)结合的TCR的抗原结合部分。可互换使用的TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指包含TCR的一部分结构域但结合完整TCR所结合的抗原(例如MHC-肽复合物)的分子。在一些情况下，抗原结合部分包含TCR的可变结构域(例如TCR的可变α链和可变β链)，足以形成结合位点来结合特定MHC-肽复合物，例如通常每条链包含三个互补决定区。
在一些实施方案中，TCR链的可变结构域缔合形成类似于免疫球蛋白的环或互补决定区(CDR)，其通过形成TCR分子的结合位点而赋予抗原识别并决定肽特异性，并决定肽特异性。通常，像免疫球蛋白一样，CDR被构架区(FR)分开(参见例如Jores等,1990；Chothia等,1988；Lefranc等,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责识别已加工抗原的主要CDR，尽管也已显示α链的CDR1与抗原肽的N末端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C末端部分相互作用。CDR2被认为可识别MHC分子。在一些实施方案中，β链的可变区还可包含高变(HV4)区。
在一些实施方案中，TCR链包含恒定结构域。例如，像免疫球蛋白一样，TCR链(例如α链、β链)的胞外部分可包含两个免疫球蛋白结构域、N末端可变结构域(例如Va或Vp；根据Kabat编号通常为氨基酸1至116：Kabat等,"Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,US Dept.Health and Human Services,Public Health Service NationalInstitutes of Health,1991,5th ed.)和一个临近细胞膜的恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Ca，根据Kabat编号通常为氨基酸117至259，β-链恒定结构域或Cp，根据Kabat编号通常为氨基酸117至295)。例如，在一些情况下，由两条链所形成的TCR的胞外部分含有两个膜近端的恒定结构域和两个含有CDR的膜远端可变结构域。TCR结构域的恒定结构域包含短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而在两条链之间形成连接。在一些实施方案中，TCR可在每条α和β链中具有额外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中包含两个二硫键。
在一些实施方案中，TCR链可包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链包含胞质尾巴。在一些情况下，该结构允许TCR与其他分子(如CD3)缔合。例如，含有带跨膜区的恒定结构域的TCR可将蛋白质锚定在细胞膜中，与CD3信号传导装置或复合物的不变亚基缔合。
通常，CD3是多蛋白复合物，在哺乳动物可拥有三条不同的链(γ、δ和ε)和ζ链。例如，在哺乳动物中，复合物可包含CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链和CD3ζ链的同二聚体。CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链是包含单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链的跨膜区带负电荷，这是允许这些链与带正电荷的T细胞受体链进行缔合的特征。CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链的胞内尾巴各包含单个保守基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM，而每条CD3ζ链则具有三个。通常，ITAM参与TCR复合体的信号传导能力。这些辅助分子具有带负电荷的跨膜区，在将信号从TCR传播到细胞的过程中发挥作用。CD3-和ζ链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或任选γ和δ)的异二聚体，或者它可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有连接在一起的两条分开的链(α和β链或者γ和δ链)的异二聚体，例如通过一个或多个二硫键连接在一起。在一些实施方案中，鉴定了针对靶抗原(例如癌症抗原)的TCR，并将其引入细胞中。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可从各种来源获得，例如通过公开可获得的TCR DNA序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，TCR获自生物来源，例如获自细胞，例如获自T细胞(如细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他可公开获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以获自体内分离的细胞。在一些实施方案中，可从患者中分离出高亲和力的T细胞克隆，并分离出TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，已在用人免疫系统基因(例如人白细胞抗原系统或HLA)改造的转基因小鼠中产生了针对靶抗原的TCR克隆。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的TCR。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可根据TCR序列的知识合成产生。
3.抗原呈递细胞
通过它们所表达的特定MHC分子来区分包括巨噬细胞、B淋巴细胞和树突细胞在内的APC。APC将抗原内在化，并与MHC分子一起在其外细胞膜上重新表达该抗原的一部分。MHC是具有多个基因座的大型遗传复合体。MHC基因座编码两类主要的MHC膜分子，称为MHC I类和II类。T辅助淋巴细胞通常识别与MHC II类分子相关的抗原，而T细胞毒性淋巴细胞识别与MHC I类分子相关的抗原。MHC在人中被称为HLA复合体，在小鼠中被称为H-2复合体。
在一些情况下，aAPC可用于制备实施方案的治疗组合物和细胞治疗产品。对于有关抗原呈递系统的制备和使用的通用指南，参见例如美国专利号6,225,042、6,355,479、6,362,001和6,790,662。
aAPC系统可包含至少一种外源性辅助分子。可以采用任何合适数量和组合的辅助分子。辅助分子可以选自例如共刺激分子和黏附分子这样的辅助分子。示例性共刺激分子包括CD86、CD64(FcγRI)、41BB配体和IL-21。黏附分子可以包括结合碳水化合物的糖蛋白(例如选择素)、跨膜结合糖蛋白(例如整联蛋白)、钙依赖蛋白(例如钙黏素)和单次穿膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白(例如细胞间黏附分子(ICAM))，它们促进例如细胞-细胞或细胞-基质间的接触。示例性的黏附分子包括LFA-3和ICAMs(例如ICAM-1)。适用于包括共刺激分子和黏附分子在内的示例性辅助分子的选择、克隆、制备和表达的技术、方法和试剂在例如美国专利号6,225,042、6,355,479和6,362,001中进行了举例说明。
4.抗原
遗传改造的抗原受体靶向的抗原是通过过继细胞疗法所靶向的疾病、病况或细胞类型环境下所表达的抗原。疾病和病况是增生性、肿瘤性和恶性疾病和病症，包括癌症和肿瘤，包括血液癌症、免疫系统癌症，例如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，例如B、T和髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，与正常的或者未被靶向的细胞或组织相比，抗原在疾病或病况细胞(例如肿瘤或病原性细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在改造的细胞上表达。
任何合适的抗原均可用于本方法。示例性的抗原包括但不限于来自感染原的抗原分子、自身抗原、肿瘤/癌症相关抗原和肿瘤新生抗原(Linnemann等,2015)。
肿瘤相关抗原可以源自前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、间皮瘤、卵巢癌或黑素瘤癌症。示例性的肿瘤相关抗原或肿瘤细胞衍生抗原包括MAGE 1、3和MAGE 4(或其他MAGE抗原)；PRAME；BAGE；RAGE，Lage(也称为NY-ESO-1)；SAGE；以及HAGE或GAGE。肿瘤抗原的这些非限制性例子在多种肿瘤类型(例如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌)中表达。参见例如美国专利号6,544,518。前列腺癌的肿瘤相关抗原包括例如前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酶、NKX3.1和前列腺六跨膜上皮抗原(STEAP)。
其他肿瘤相关抗原包括Plu-1、HASH-1、HasH-2、Cripto和Criptin。另外，肿瘤抗原可以是自身肽类激素，例如全长促性腺激素释放激素(GnRH)，10个氨基酸长的短肽，可用于治疗许多癌症。
肿瘤抗原包括源自癌症的肿瘤抗原，所述癌症的特征在于肿瘤相关抗原表达，例如HER-2/neu表达。感兴趣的肿瘤相关抗原包括谱系特异性肿瘤抗原，例如黑素细胞-黑素瘤谱系抗原MART-1/Melan-A，gp100，gp75，mda-7，酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白。示例性的肿瘤相关抗原包括但不限于源自或包含以下任一或多种抗原：p53，Ras，c-Myc，胞质丝氨酸/苏氨酸激酶(例如A-Raf、B-Raf和C-Raf，细胞周期蛋白依赖性激酶)，MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A10，MAGE-A12，MART-1，BAGE，DAM-6、-10，GAGE-1、-2、-8，GAGE-3、-4、-5、-6、-7B，NA88-A，MART-1，MC1R，Gp100，PSA，PSM，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，ART-4，CAMEL，CEA，Cyp-B，hTERT，hTRT，iCE，MUC1，MUC2，磷脂酰肌醇-3激酶(PI3Ks)，TRK受体，PRAME，P15，RU1，RU2，SART-1，SART-3，肾母细胞肿瘤抗原(WT1)，AFP，-catenin/m，胱天蛋白酶-8/m，CEA，CDK-4/m，ELF2M，GnT-V，G250，HSP70-2M，HST-2，KIAA0205，MUM-1，MUM-2，MUM-3，肌球蛋白/m，RAGE，SART-2，TRP-2/INT2，707-AP，膜联蛋白II，CDC27/m，TPI/mbcr-abl，BCR-ABL，干扰素调节因子4(IRF4)，ETV6/AML，LDLR/FUT，Pml/RAR，肿瘤相关钙信号转导蛋白1(TACSTD1)、TACSTD2，受体酪氨酸激酶(例如表皮生长因子受体(EGFR)(特别是EGFRvIII)、血小板衍生生长因子(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR))，胞质酪氨酸激酶(例如src家族、syk-ZAP70家族)，整联蛋白连接激酶(ILK)，信号转导和转录激活因子STAT3、STATS和STATE，低氧诱导因子(例如HIF-1和HIF-2)，核因子-Kappa B(NF-B)，Notch受体(例如Notch1-4)，c-Met，雷帕霉素的哺乳动物靶点(mTOR)，WNT，胞外信号调节激酶(ERK)及其调节亚基，PMSA，PR-3，MDM2，间皮素，肾细胞癌-5T4，SM22-α，碳酸酐酶I(CAI)IX(CAIX)(也称为G250)，STEAD，TEL/AML1，GD2，蛋白酶3，hTERT，肉瘤易位断点，EphA2，ML-IAP，EpCAM，ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)，NA17，PAX3，ALK，雄激素受体，细胞周期蛋白B1，多聚唾液酸，MYCN，RhoC，GD3，岩藻糖GM1，mesothelian，PSCA，sLe，PLAC1，GM3，BORIS，Tn，GLoboH，NY-BR-1，RGsS，SART3，STn，PAX5，OY-TES1，精子蛋白17，LCK，HMWMAA，AKAP-4，SSX2，XAGE 1，B7H3，豆荚蛋白(legumain)，TIE2，Page4，MAD-CT-1，FAP，MAD-CT-2，fos相关抗原1，CBX2，CLDN6，SPANX，TPTE，ACTL8，ANKRD30A，CDKN2A，MAD2L1，CTAG1B，SUNC1，LRRN1和独特型。
抗原可以包括表位区或表位肽，它们源自肿瘤细胞中突变的基因或者肿瘤细胞中与正常细胞相比以不同水平转录的基因，例如端粒酶、存活蛋白、间皮素、突变的ras、bcr/abl重排、Her2/neu、突变的或野生型p53、细胞色素P450 1B1和异常表达的内含子序列，例如N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V；在骨髓瘤和B细胞淋巴瘤中产生独特的独特型的免疫球蛋白基因的克隆重排；肿瘤抗原，包括源自致癌病毒过程的表位区或表位肽，例如人乳头瘤病毒蛋白E6和E7；埃巴病毒蛋白LMP2；具有肿瘤选择性表达的非突变癌胚蛋白，例如癌胚抗原和甲胎蛋白。
在其他实施方案中，抗原是从病原微生物或机会性病原微生物(在本文中也称为传染病微生物)获得或来源的，例如病毒、真菌、寄生虫和细菌。在某些实施方案中，源自此类微生物的抗原包括全长蛋白。
III.免疫效应细胞
A.造血前体细胞
通过本领域已知的方法，可将改造表达抗原受体(例如CAR)的本公开的PSC分化为HPC。在一种方法中，通过定向分化使CAR-PSC分化为CD34+HPC。在另一种方法中，通过正向编程使CAR-PSC分化为CD34+HPC。
1.定向分化
本公开的某些实施方案涉及使CAR-PSC分化为HPC。通过本领域已知的方法，例如在美国专利号8,372,642中所描述的方法，使CAR-PSC分化为HPC，美国专利号8,372,642通过引用并入本文。在一种方法中，可使用BMP4、VEGF、Flt3配体、IL-3和GM-CSF的组合来促进造血分化。在某些实施方案中，将细胞培养物依次暴露于第一培养基制备用于分化的PSC，包括BMP4、VEGF和FGF的第二培养基，然后在包括Flt3配体、SCF、TPO、IL-3和IL-6的第三培养基中培养，就能使多能细胞分化为HPC和造血细胞。第二限定培养基也可包含肝素。另外，在含有BMP4和VEGF的培养基中包括FGF-2(50ng/ml)能够增强从多能细胞生成造血前体细胞的效率。此外，在第一限定培养基中包含糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂(例如CHIR99021、BIO和SB-216763)能够进一步增强HPC的产量。
通常，可以使用限定的或未限定的条件使多能细胞分化为造血前体细胞。要理解的是，在所得细胞预期施用至人受试者的实施方案中，限定条件通常是优选的。可以在限定条件下(例如使用TeSR培养基)从多能干细胞衍生造血干细胞，造血细胞可以从源自多能细胞的胚状体产生。在其他实施方案中，多能细胞可以在OP9细胞或小鼠胚胎成纤维细胞上共培养，随后进行分化。
作为分化过程的一部分，可以使多能细胞形成胚状体或聚集体。为诱导分化，“胚状体”(EB)或生长中的细胞簇的形成通常涉及人多能干细胞在体外聚集成EB，并使人多能干细胞能够自发且随机分化为代表内胚层、外胚层和中胚层起源的多种组织类型。因此，可使用三维EB来产生一部分造血细胞和内皮细胞。
可使用以下操作规程形成EB。可在汇合时于室温下使用0.5M EDTA处理约8-10分钟，收获适于在MATRIGELTM包被的板上进行无饲养层生长的未分化iPSC。温育后将EDTA吸出，可通过将细胞收集在含有rock抑制剂或blebbistatin的SFD培养基中形成EB。第二天可将培养基更换为包含不同细胞因子制剂的EB1分化培养基。将细胞以每毫升25万-50万个细胞的密度铺板以促进聚集体形成。
为促进聚集体形成，可将细胞转移至低黏附培养板上，在无血清分化(SFD)培养基中过夜温育，该培养基由75％IMDM(Gibco)、25％Ham's改良的F12(Cellgro)组成，补充有不含RA补充剂的0.05％N2和B-27、200mM 1-谷氨酰胺、0.05mg/ml抗坏血酸-2-磷酸镁盐(Asc2-P)(WAKO)和4.5x 10-4MTG。第二天，可从每个孔收集细胞并离心。然后可在分化的前四天，将细胞重悬于“EB分化培养基”中，该培养基由补充了约50ng/ml骨形态发生因子(BMP4)、约50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和50ng/ml zb FGF的SFD基础培养基组成。每48小时将细胞培养液更换一半。在分化的第五天，将培养基替换为第二培养基，该第二培养基包含SFD培养基，补充了50ng/ml干细胞因子(SCF)，约50ng/ml Flt-3配体(Flt-3L)，50ng/ml白细胞介素6(IL-6)，50ng/ml白细胞介素3(IL-3)，50ng/ml血小板生成素(TPO)。每48小时用新鲜的分化培养基将细胞培养液更换一半。通过将分化培养物以300g离心5分钟并从分化培养物中吸取一半体积并补充新鲜培养基来进行培养基更换。在某些实施方案中，EB分化培养基可包括约BMP4(例如约50ng/ml)，VEGF(例如约50ng/ml)和任选的FGF-2(例如约25-75ng/ml或约50ng/ml)。可以吸出上清液，并用新鲜的分化培养基代替。备选地，可以每两天用新鲜培养基将细胞培养液更换一半。在分化过程中可以在不同时间点收获细胞。
可以使用限定培养基从多能干细胞培养HPC。使用限定培养基将多能细胞分化为造血CD34+干细胞的方法在例如美国申请12/715,136中描述，通过引用将美国申请12/715,136整体并入。预期这些方法可以与本公开一起使用。
例如，可使用限定培养基来诱导造血CD34+分化。限定培养基可包含生长因子BMP4、VEGF、Flt3配体、IL-3和/或GMCSF。可以将多能细胞在包含BMP4、VEGF和任选FGF-2的第一限定培养基中培养，然后在包含(Flt3配体、IL-3和GMCSF)或(Flt3配体、IL-3、IL-6和TPO)的第二培养基中培养。第一和第二培养基也可以包含SCF、IL-6、G-CSF、EPO、FGF-2和/或TPO中的一种或多种。基本上低氧的条件(例如低于20％O2)可进一步促进造血或内皮分化。
可以通过机械或酶促手段(例如使用胰蛋白酶或TrypLETM)使细胞基本上个体化。ROCK抑制剂(例如H1152或Y-27632)也可以包括在培养基中。可以预期，这些方法可以使用例如机器人自动化自动进行。
在某些实施方案中，可使用基本上低氧的条件来促进多能细胞分化为造血祖细胞。如本领域技术人员将认识到的，低于约20.8％的气氛氧含量将被认为是低氧的。与环境空气相比，培养基中的人细胞能够在氧气含量降低的气氛条件下生长。这种相对的低氧可以通过减少暴露于培养基的气氛氧来实现。胚胎细胞通常在氧气减少的条件下在体内发育，通常为约1％至约6％的气氛氧，而二氧化碳处于环境水平。不希望受到理论的束缚，可预期的是，低氧条件可以模拟某些胚胎发育条件的方面。如以下例子所示，在某些实施方案中可使用低氧条件来促进多能细胞(例如iPSC或hESC)进一步分化为更高分化的细胞类型(例如HPC)。
以下低氧条件可用于促进多能细胞分化为造血祖细胞。在某些实施方案中，可使用小于约20％，小于约19％，小于约18％，小于约17％，小于约16％，小于约15％，小于约14％，小于约13％，小于约12％，小于约11％，小于约10％，小于约9％，小于约8％，小于约7％，小于约6％，小于约5％，约5％，约4％，约3％，约2％或约1％的气氛氧含量来促进分化为造血前体细胞。在某些实施方案中，低氧气氛包含约5％的氧气。
无论在任何给定的造血祖细胞扩增中使用的是哪种具体培养基，所用培养基均优选补充有至少一种浓度约0.1ng/mL至约500ng/mL，更通常为10ng/mL至100ng/mL的细胞因子。合适的细胞因子包括但不限于c-kit配体(KL)(也称为steel因子(StI)、肥大细胞生长因子(MGF)和干细胞因子(SCF))，IL-6，G-CSF，IL-3，GM-CSF，IL-1α，IL-11，MIP-1α，LIF，c-mpl配体/TPO和flk2/flk3配体(Flt2L或Flt3L)。特别地，培养基将包括SCF、Flt3L和TPO中的至少一种。更特别地，培养基将包括SCF、Flt3L和TPO。
在一个实施方案中，将细胞因子包含在培养基中，并通过培养基灌注进行补充。备选地，当使用生物反应器系统时，可以通过单独的入口将细胞因子作为浓缩溶液单独添加，而无需培养基灌注。当不进行灌注而添加细胞因子时，它们将通常作为10×至100×的溶液添加，其量等于生物反应器中体积的十分之一至1/100，并大约每2至4天添加新鲜的细胞因子。此外，也可将新鲜的浓缩细胞因子另外分开添加到灌注培养基的细胞因子中。
在一些实施方案中，HPC表现出甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)的破坏，将其在促进髓样分化或淋巴样分化的条件下进行培养。在一些方面，HPC表达基本上不与甲基化DNA结合的非功能性MeCP2。在某些方面，HPC不表达足以影响MeCP2 DNA结合活性的水平的MeCP2。在特定方面，由于MeCP2基因中的截短或突变，MeCP2是无功能的。在一些方面，获得表现出MeCP2破坏的HPC包括将HPC与siRNA、shRNA或MeCP2的小分子抑制剂接触。
(i)示例性3D分化方法
将PSC分化为HPC的示例性方法包括维持在无饲养层条件下，例如在Essential 8(E8)培养基中的MATRIGELTM或玻连蛋白包被的培养板上。从PSC(特别是亚汇合的，例如<80％汇合的)制备聚集体，PSC以每毫升50万-100万个细胞的密度于Essential 3(E3)培养基(例如仅包含E8培养基8种组分中的3种：DMEM/F12基础培养基、抗坏血酸(例如100-500μM)、2-磷酸镁和亚硒酸钠)中，补充有50ng/ml FGF2、50ng/ml VEGF、2μM CHIR99021(GSK-3抑制剂)和blebbistatin(肌球蛋白-II抑制剂)(例如2-10μM，例如10μM)。聚集体形成和后续步骤是在连续搅拌下于超低黏附(ULA)烧瓶中24小时培养的过程中进行的。
将形成的细胞聚集体(即EB)进一步转移至无血清分化培养基(例如50％IMDM、50％Hams F12培养基、100μg/ml聚乙烯醇、100μg/ml重组人血清白蛋白、1x非必需氨基酸补充剂(Invitrogen)、0.lx化学成分确定的脂质补充剂(Invitrogen)、125μM抗坏血酸2-磷酸镁、0.25μM亚油酸、微量元素补充剂A(0.3x)、B(0.2x)和C(0.1x)(Corning)、5mM氯化钠、100μM单硫代甘油、20μM乙醇胺、100ng/ml肝素和10ng/ml IGF1)，补充造血中胚层诱导细胞因子——25ng/ml BMP4、50mg/ml VEGF和50ng/ml FGF2。继续培养(例如进行4天)，第二天更换完全培养基。
为支持造血CD34+祖细胞的分化和扩增，将细胞聚集体进一步转移至补充有造血支持性细胞因子(例如50ng/ml SCF、20mg/ml TPO、10ng/ml FLT3L、20ng/ml IL-3和25ng/ml BMP4)的无血清分化培养基(如上所述)中。继续培养(例如进行4天)，第二天更换完全培养基。
在分化过程之后(例如9天)收获培养物。通过消化已分化的细胞聚集体(例如在Accutase中)获得单细胞悬液。然后将分离的CD34+细胞(例如通过MACS分离的)铺板到T/NK分化培养基中，或者冷冻保存以备分离后1小时内的随后使用。
(ii)示例性2D分化方法
在替代的示例性方法中，对PSC进行2D分化方案以产生HPC。首先，在无饲养层的条件下，例如在Essential 8(E8)培养基中使用MATRIGELTM或玻连蛋白包被的情况下，使PSC适应低氧条件，例如5-10次传代。将PSC个体化，并在补充有5uM blebbistatin(例如2-10μM，如10μM)的无血清限定的(SFD)培养基存在下，以25000/cm2的密度铺板在PureCoat胺包被的6孔板(Coming Inc.)上。SFD基础培养基可能包含75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)，25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)，0.5％N2-补充剂(Invitrogen 17502-048)，不含视黄酸的1％B27补充剂(Invitrogen 12587-010)，0.05％BSA，50μg/ml抗坏血酸和4.5x 10-4M单硫代甘油补充了50ng/ml BMP-4，VEGF和bFGF。
第1天，通过在例如包含75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(具有谷氨酰胺和25mMHEPES+P/S)、25％Hams F12(Mediatech10-080-CV)、0.5％N2-补充剂(Invitrogen 17502-048)、不含视黄酸的1％B27补充剂(Invitrogen 12587-010)、0.05％BSA、50μg/ml抗坏血酸和4.5x 10-4M单硫代甘油补充了50ng/ml的BMP4、VEGF和bFGF的SFD基础培养基中培养，而起始造血分化诱导。在第2天，吸出培养基，将细胞置于新鲜的EB1培养基(例如，含有75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含有谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)，25％Hams F12(Mediatech10-080-CV)，0.5％N2补充剂(Invitrogen17502-048)，不含视黄酸的1％B27补充剂(Invitrogen 12587-010)，0.05％BSA，50μg/ml抗坏血酸和4.5x 10-4M单硫代甘油补充了50ng/ml BMP4，VEGF和bFGF的SFD基础培养基)中，持续另外48小时。
在第5-10天，吸出培养基，并将细胞置于EB2培养基中，再持续48小时。EB2培养基可包含新鲜的SFD基础培养基，其中包含75％IMDM(Invitrogen 12200-069)(含谷氨酰胺和25mM HEPES+P/S)，25％Hams F12(Mediatech 10-080-CV)，0.5％N2补充剂(Invitrogen17502-048)，不含视黄酸的1％B27补充剂(Invitrogen 12587-010)，0.05％BSA，50μg/ml抗坏血酸和4.5x 10-4M单硫代甘油补充了50ng/ml Flt-3配体，IL3，IL6，SCF和TPO(各自为50ng/ml)和5000U/ml肝素。在分化的第7、8、9、10天使用TrypLE收获细胞，并针对HPC标志物和淋巴祖细胞的存在进行染色。
2.正向编程
本公开的某些实施方案通过正向编程CAR-PSC来提供HPC，其通过表达对造血细胞分化/功能重要的编程基因组合进行。在一种方法中，修饰PSC以表达至少三种造血前体编程基因，例如ETS基因(如ETC2或ERG)、造血发育基因(如GATA2)和同源盒基因(如HOXA9)，诸如在PCT/US2016/057893中所描述的，通过引用将其整体并入本文。在特定方面，使用被转染到CAR-PSC中的双向Tight启动子，通过一种载体(如诱导型PiggyBac载体)共表达ETV2/ERG、GATA2和HOXA9基因。
此外，可进一步修饰EGH-CAR-PSC以表达用于长期植入潜能的额外基因。示例性基因包括HMGA2、MYCN、NR4A2、SOX17、TFEC、MEIS1、HOXA4、ZNF414、KLF4、ZNF131、BCL2、ETV6、ZNF350和/或RBAK。例如，可用一种或多种载体转染PSC以表达HMGA2、MYCN、NR4A2、SOX17、TFEC、MEIS1和HOXA4。
优选地，仅将ETV2/GAT2/HOXA9基因表达足以将PSC正向编程为造血前体细胞的一段时间。因此，造血前体编程基因可在诱导型启动子的控制下。这样，就可在PSC中诱导造血前体编程基因表达足以正向编程为多谱系造血前体细胞的一段时间。这段时间可以是约1天至约20天，例如约3、4、5、6、7、8、9或10天。备选地，可通过附加型载体将造血前体编程基因引入PSC。这样，造血前体编程基因就可在PSC中瞬时表达。
B.淋巴样细胞分化
然后，HPC可进一步分化为淋巴样谱系细胞，包括T细胞、NK细胞和T/NK细胞。在一些方面，将分化期间的HPC在第7-12天(例如第8-11天)进行分离，以分化为淋巴样细胞。该阶段的HPC可通过CD34和CD43的表达来鉴别。此外，具有淋巴样潜能的HPC可低水平表达CD144、DLL4、CD7和CD235，并在第11天下降，这意味着需要这些标志物的一定阈值表达水平，才能在DLL4存在下使细胞趋向于淋巴样分化。
在一些方面，可将分化过程第7-11天(例如第7天、第8天、第9天、第10天或第11天)所分离的HPC分化为淋巴样细胞，例如T细胞和NK细胞。在一些方面，淋巴祖细胞的起源时间与HPC分化过程中造血内皮祖细胞的减少和祖红细胞的出现相吻合。在特定方面，第9天的HPC可具有增加的产生T细胞的效率。可通过某些标志物的表达来分离和/或鉴别能够淋巴样分化的HPC。例如，可以选择具有CD34和/或CD43表面表达(特别是同时表达CD34和CD43)的细胞用于淋巴样分化，例如通过MACS分选进行选择。
用于检测淋巴祖细胞的其他标志物包括DLL4、CD144、CD31、CD34、CD43lo、CD45lo/-、CD235、CD7、Flk-1、APNLR。在特定方面，使用CD34/CD7、CD235/CD7、DLL4/CD34、DLL4/CD31、DLL4/CD144或CD34/CD43lo双阳性群体的存在来鉴别淋巴祖细胞。HPC上的CD144表达与CD31、CD34和DLL4共同染色。HPC上的CD7表达与CD235、CD34和CD43共同染色。因此，HPC共表达CD144和CD7证实了表达膜结合的notch配体(DLL4)和造血内皮细胞标志物的淋巴样潜能捕获前体，并产生了能够在体外生成确定性造血细胞谱系的新兴淋巴祖细胞的表型特征。在特定方面，可通过分选包括CD31、CD34、CD144、CD43、CD45、CD6、CD335、Flk-1和DLL4在内的表面标志物，进一步将HPC分选为具有增强的淋巴样潜能的细胞。在一些方面，HPC的CD114/CD34、CD144/CD45、CD144/CD7和CD144/CD34/CD45/CD7阳性级分分化为淋巴样细胞。在特定方面，HPC的CD144/CD7阳性级分分化为淋巴样细胞。
可以在无饲养层的限定条件下培养HPC，进行淋巴样分化。培养基可包含一种或多种基质组分，例如RetroNectin、纤连蛋白或RGD肽。不希望受到任何理论的束缚，基质组分可以为胚胎干细胞的生长提供固相支持。在某些实施方案中，在将细胞接种到培养基之前，可将基质组分应用于培养表面并与培养基接触。例如，可以在将细胞机械分离成团块或将细胞个体化并诱导分化为造血前体细胞之前，在纤连蛋白或MATRIGELTM包被培养板上的限定培养基(例如TeSR培养基)中培养细胞。
各种基质组分都可用于培养多能细胞，包括胶原蛋白(例如胶原蛋白IV)、层粘连蛋白、玻连蛋白、MATRIGELTM、明胶、聚赖氨酸、血小板应答蛋白(例如TSP-1、-2、-3、-4和/或-5)和/或PRONECTIN-FTM。在某些实施方案中，由于可能对细胞存活力的不利影响，可避免仅将MATRIGELTM、胶原蛋白IV或层粘连蛋白与先前使用TeSR培养过的细胞一起使用；尽管如此，这些组合物还是可以有利地与其他基质组分结合使用。这些基质组分的组合可以为促进细胞生长和细胞活力提供额外的好处。在某些实施方案中，例如在造血分化之前，可将1、2、3、4、5、6种或更多的上述基质组分用于培养细胞。
在一些实施方案中，可使用抗坏血酸增强淋巴样分化。限定培养基可补充约10μM至约1mM的抗坏血酸，例如100至500μM，例如约50μM至约100μM，例如约95μM。抗坏血酸可选自各种抗坏血酸盐，例如抗坏血酸磷酸镁。在一些实施方案中，可使用烟酰胺(例如烟酸)增强淋巴样分化，例如以约0.1mM至约5mM的浓度使用烟酰胺。
在一些方面，通过施用可增加受试者体内Notch配体产生的物质来改变Notch配体的内源性活性，将HPC分化为淋巴样细胞(诸如T细胞)。该方法还包括在培养基中培养细胞，其中培养基包括有效量的notch配体和选自IL-7、IL-15、SCF、Flt-3和IL-3的一种或多种细胞因子。在一些特定的实施方案中，培养基还可包含IL-6。在一些实施方案中，notch配体是δ4notch配体(DLL4)，例如DLL4:Fc嵌合体。
选择促进和维持T细胞谱系细胞的分化和增殖的Notch配体。Notch配体可以是人源的，或者可源自其他物种，包括哺乳动物物种，诸如啮齿动物、狗、猫、猪、绵羊、母牛、山羊和灵长类。Notch配体的具体例子包括Delta家族。Delta家族包括Delta-1(Genbank登录号AF003522，智人)，Delta-3(Genbank登录号AF084576，褐家鼠)，Delta样-1(Genbank登录号NM-005618和NP-005609，智人；Genbank登录号X80903，I48324，小家鼠)，Delta样-3(Genbank登录号NM-053666，N-446118，褐家鼠)，Delta-4(Genbank登录号AF273454，BAB18580，小家鼠；Genbank登录号AF279305，AAF81912，智人)和Delta样-4(Genbank登录号Q9NR61，AAF76427，AF253468，NM-019074，智人；Genbank登录号NM-019454，小家鼠)。Notch配体是可商购的，或者能够通过重组DNA技术生产并纯化至不同程度。
该方法还包括将HPC细胞维持在上述培养基中的步骤，维持的时间足以产生分化的NK细胞。在一些实施方案中，分化的NK细胞与T细胞一起出现在培养物中，但是NK细胞可能在第6周后就停止增殖。通常，使用本领域普通技术人员已知的常规方法来评估NK细胞数量增加和/或其分化状态的确认。例如，可通过用抗CD56和抗CD3抗体染色细胞，通过流式细胞术监测所培养细胞的NK细胞发展。抗CD3抗体(例如OKT3)可以0.5至2μg的浓度存在。CD56+/CD3-细胞将指示出分化的NK细胞。
在特定方面，通过在retronectin和DLL4包被的培养板上的2D低氧培养，进行向CD3+T细胞或CD56+CD3-NK细胞的淋巴样分化。在特定方面，可以用DLL4:Fc嵌合蛋白和RetroNectin(纤连蛋白片段CH-296；Takara Shuzo，日本)来包被非组织培养物处理过的培养板，进行HPC的淋巴样分化。分化可包括T/NK细胞分化的第一阶段，然后是T或NK细胞扩增的第二阶段。分化的第一阶段可能持续约1周至约2周，而扩增的第二阶段也可能持续约1周至约2周。这样，淋巴样分化和扩增的整个周期可能就是约2-4周。
在一些实施方案中，淋巴样分化过程可包括与抗原特异性靶细胞(例如抗原特异性肿瘤细胞)共培养，以增加T细胞和NK细胞的细胞毒性活性。在特定方面，淋巴样分化的扩增期可包括与抗原特异性靶细胞共培养。例如，CD19-CAR-T细胞或NK细胞可以在扩增期间与CD19+肿瘤细胞(例如CD19+Daudi细胞)共培养诸如一至三周，特别是两周。在一些方面，扩增期还可包括添加细胞因子(例如IL2、IL15和/或IL21，特别是IL2)来改善扩增。可以优化细胞因子的浓度，例如10至50μM。
C.细胞培养
在某些实施方案中，可以使用基本上低氧的条件来促进HPC分化为髓样或淋巴样谱系。在某些实施方案中，小于约20％、小于约19％、小于约18％、小于约17％、小于约16％、小于约15％、小于约14％、小于约13％、小于约12％、小于约11％、小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的气氛氧含量可用于促进分化为造血前体细胞。在某些实施方案中，低氧气氛包含约5％的氧气。
如本文所述，可以有利地使用一种或多种限定培养基来促进HPC分化为髓样和淋巴样谱系。特别地，排除动物产品(如血清和小鼠饲养层)可降低细胞暴露于动物产品相关的风险，使得能够生成可更安全地施用给人受试者的细胞。由于传统干细胞培养的发展一直依赖于血清产品和小鼠饲养层来将干细胞分化为各种细胞类型，因此这些传统方法已限制了能够进行分化的规模，增加了生物变异性和潜在的污染，严重阻碍了ES细胞在转化疗法中的使用，否则可能会证明是有用的。
一般而言，本公开的细胞是在能够维持细胞生长的富含营养的缓冲溶液培养基中培养的。根据本文所述的方法，适用于将多能干细胞分离、扩增和分化为造血前体细胞和造血细胞的培养基包括但不限于高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、DMEM/F-15、RPMI 1640、Iscove改良的Dubelcco培养基(IMDM)和Opti-MEM SFM(Invitrogen Inc.)。化学成分确定的培养基包含极限必需培养基(如Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)(Gibco))，补充了人血清白蛋白、人ExCyte脂蛋白、转铁蛋白、胰岛素、维生素、必需和非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺和丝裂原也是合适的。如本文所使用的丝裂原是指刺激细胞分裂的试剂。试剂可以是化学物质，通常是刺激细胞开始细胞分裂从而引发有丝分裂的某种蛋白质形式。在一个实施方案中，无血清培养基(例如美国序列号08/464,599和WO 96/39487中所描述的)和美国专利号5,486,359中所描述的“完全培养基”可被预期适用于本文所描述的方法。在一些实施方案中，培养基补充有10％胎牛血清(FBS)、人自体血清、人AB血清或补充有肝素(2U/ml)的富含血小板的血浆。
可通过在增加足以促进细胞分化为髓样或淋巴样谱系的因子的胞内水平的条件下，在培养基中培养多能干细胞或造血前体细胞来产生免疫细胞。培养基还可包含一种或多种造血细胞分化和成熟试剂，如各种生长因子。这些试剂可以帮助诱导细胞形成更成熟的表型——或者优选促进成熟细胞的存活——或者同时具有这两种作用。分化和成熟试剂可包括能够促进造血细胞谱系细胞的生长的可溶性生长因子(肽激素、细胞因子、配体-受体复合物和其他化合物)。此类试剂的非限制性例子包括但不限于造血或内皮生长因子，例如成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、FLT-3配体(FLT3L)、白介素3(IL-3)、白介素6(IL-6)、白介素9(IL-9)或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其同种型或变体。
IV.抗原特异性免疫细胞的用途
通过某些方面的方法和组合物所提供的抗原特异性免疫效应细胞能够用于各种应用中。这些应用包括但不限于细胞的体内移植或植入；体外筛选细胞毒性化合物、致癌物、诱变剂、生长/调节因子、药物化合物等；阐明血液病和损伤的机制；研究药物和/或生长因子的运作机制；诊断和监测患者的癌症；基因治疗；以及生物活性产品的生产，这仅仅例举了一小部分。
A.测试化合物筛选
本公开的免疫细胞可用于筛选影响本文所提供淋巴样细胞的特征的因素(如溶剂、小分子药物、肽和多核苷酸)或环境条件(如培养条件或操作)。
本公开的特定筛选应用涉及药物研究中的药物化合物测试。读者通常参考标准教科书In vitro Methods in Pharmaceutical Research,Academic Press,1997和美国专利号5,030,015。在某些方面，如先前已在短期培养中对造血细胞和前体所进行的那样，髓样和淋巴样细胞在测试细胞的标准药物筛选和毒性测定中起作用。候选药物化合物活性的评估通常涉及将某些方面中所提供的造血细胞或前体与候选化合物混合，确定可归因到该化合物的细胞形态、标志物表型或代谢活性的任何变化(与未经处理的细胞或用惰性化合物处理过的细胞相比)，然后将化合物的作用与所观察到的变化进行关联。可以进行筛选是因为将化合物设计为对造血细胞或前体具有药理效应，或者是因为被设计为在其他地方具有作用的化合物可能对造血细胞或前体具有意想不到的作用。可组合测试两种或更多种药物(通过同时或顺序地与细胞混合)来检测可能的药物-药物相互作用。
B.过继性细胞疗法
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于免疫治疗的方法，其包括施用有效量的本公开内容的免疫细胞。在一个实施方案中，通过将引发免疫应答的免疫细胞群进行转移来治疗医学疾病或病症。在本公开的某些实施方案中，通过将引发免疫应答的免疫细胞群进行转移来治疗癌症或感染。本文提供了用于治疗或延缓个体中癌症进展的方法，其包括向所述个体施用有效量的抗原特异性细胞疗法。本方法可用于治疗免疫病、实体癌症、血液癌症和病毒感染。
本治疗方法适用的肿瘤包括任何恶性细胞类型，例如在实体瘤或血液肿瘤中所发现的那些。示例性实体瘤可包括但不限于选自胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头部、颈部、卵巢、肾、喉部、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺和乳房等器官的肿瘤。示例性血液肿瘤的例子包括骨髓肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、骨髓瘤等。可以使用本文所提供的方法进行治疗的癌症的更多例子包括但不限于肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)，腹膜癌，胃癌(包括胃肠道癌和胃肠道间质癌)，胰腺癌，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，各种类型的头颈癌和黑色素瘤。
癌症可以具体地是以下组织学类型，尽管并不限于这些：恶性赘生物；癌；未分化癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；家族性息肉腺癌；实体癌；恶性类癌肿瘤；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌(chromophobe carcinoma)；嗜酸细胞癌；嗜酸性细胞腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附件癌；顶泌腺癌(apocrineadenocarcinoma)；皮脂腺癌；盯聍腺腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性卵泡膜细胞瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性睾丸母细胞瘤；sertoli细胞癌；恶性leydig细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑色素瘤；无色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；恶性雀斑样黑色素瘤(lentigo malignant melanoma)；肢端雀斑样黑色素瘤；结节性黑色素瘤；巨大色素痔内恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤(alveolar rhabdomyosarcoma)；基质肉瘤；恶性混合瘤；mullerian混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性brenner肿瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤(dysgerminoma)；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤(struma ovarii)；绒毛膜癌；恶性中肾瘤(mesonephroma)；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；邻皮质骨肉瘤(juxtacortical osteosarcoma)；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞肿瘤；尤文氏肉瘤(ewing's sarcoma)；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆型星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)；成少突神经胶质细胞瘤(oligodendroblastoma)；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤(neurilemmoma)；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金副肉芽肿(paragranuloma)；小淋巴细胞恶性淋巴瘤；大细胞弥漫性恶性淋巴瘤；滤泡型恶性淋巴瘤；蕈样真菌病；其他具体非霍奇金淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；低级别/滤泡型非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级别/滤泡型NHL；中级别弥漫性NHL；高级别免疫母细胞NHL；高级别淋巴母细胞NHL；高级别小无裂细胞NHL；巨大肿块(bulky disease)NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；Waldenstrom巨球蛋白血症；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病(basophilic leukemia)；嗜酸性粒细胞白血病(eosinophilic leukemia)；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；毛细胞白血病；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；急性髓细胞性白血病(AML)；以及慢性粒细胞白血病。
为确定本文所提供的细胞进行治疗应用的适合性，可首先在合适的动物模型中测试细胞。首先评估细胞在体内存活并维持其表型的能力。将本文所提供的细胞在适合进一步观察的部位(例如在肾包膜下、脾脏内、肝小叶内或骨髓内)施用给免疫缺陷动物(如NOG小鼠，或者经化学或辐照使其免疫缺陷的动物)。在几天到几周或更长时间之后，收集组织并评估是否仍然存在开始的细胞类型(如红细胞)。这可以通过给已施用的细胞提供可检测标志物(如绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶)来进行；或者通过测量对已施用的人细胞具有特异性的组成型标志物来进行。当在啮齿动物模型中对本文所提供的细胞进行测试时，可通过免疫组化或ELISA(使用人特异性抗体)或通过RT-PCR分析(使用产生对人多核苷酸序列特异性的扩增引物和杂交条件)评估已施用的细胞的存在和表型。在本公开的其他地方提供了用于在mRNA或蛋白质水平上评估基因表达的合适标志物。
可以在各种动物模型中测试由本公开的方法所提供的免疫细胞治疗血液病和损伤的能力。例如，镰状细胞贫血小鼠模型或T/B细胞缺陷型Rag-2敲除小鼠可能是用于测试本文所公开的髓样和淋巴样细胞的特别有用的动物模型。
在本公开的某些方面中所提供的在动物模型中证实了期望的功能特征或功效的免疫细胞，也可能适合直接施用给有此需要的人受试者。为了止血的目的，可在足以进入循环的任何部位施用细胞。也可在损伤或疾病部位递送造血细胞或其前体。
在本公开的某些方面中所提供的细胞能够用于有此需要的任何受试者的治疗。可适于这种治疗的人病况包括各种贫血和血红蛋白病，以及以造血细胞数量减少为特征的疾病(如骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、中性粒细胞减少症、粒细胞缺乏症、Glanzmann血小板无力症(Glanzmann’s thrombasthenia)、血小板减少症和获得性免疫缺陷综合征)。对于人治疗而言，剂量通常在约109至1012个细胞之间，通常在约5×109至5×1010个细胞之间，根据受试者的体重、疾病的性质和严重性以及所施用细胞的复制能力进行调整。确定治疗方式和合适剂量的最终责任在于分管临床医生。
治疗有效量的免疫细胞能够通过多种途径施用，包括肠胃外施用，例如静脉内、腹膜内、肌肉内、胸骨内或关节内注射或输液。
用于过继细胞疗法的免疫细胞的治疗有效量是在被治疗受试者中达到所需效果的量。例如，这可以是抑制进展、或者引起自身免疫或同种免疫疾病消退、或者能够缓解由自身免疫疾病所引起的症状(如疼痛和炎症)所必需的免疫细胞数量。它可以是缓解与炎症相关的症状(如疼痛、水肿和体温升高)所必需的量。它也可以是减少或防止移植器官排斥所必需的量。
可按照与疾病相一致的治疗方案施用免疫细胞群，例如在一到几天内单次或几次施用以改善疾病状态，或在延长时间内周期性施用以抑制疾病进展并防止疾病复发。制剂中所采用的精确剂量还将取决于施用途径和疾病或病症的严重性，应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。免疫细胞的治疗有效量将取决于所治疗的受试者、患病的严重程度和类型以及施用方式。在一些实施方案中，用于人受试者的治疗剂量可在至少3.8×104、至少3.8×105、至少3.8×106、至少3.8×107、至少3.8×108、至少3.8×109或至少3.8×1010个免疫细胞/m2的范围。在某些实施方案中，用于人受试者的治疗剂量在约3.8×109至约3.8×1010个免疫细胞/m2。在另外的实施方案中，免疫细胞的治疗有效量可在每千克体重约5×106个细胞到每千克体重约7.5×108个细胞之间，例如每千克体重约2×107个细胞到约5×108个细胞，或每千克体重约5×107个细胞到约2×108个细胞。免疫细胞的确切数量很容易由本领域技术人员根据受试者的年龄、体重、性别和生理状况来确定。可从体外或动物模型测试系统所得剂量反应曲线推断有效剂量。
可以将免疫细胞与一种或多种其他治疗剂联合施用来治疗免疫介导的病症。联合疗法可包括但不限于一种或多种抗微生物剂(例如抗生素、抗病毒剂和抗真菌剂)，抗肿瘤剂(例如氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、紫杉醇、氟达拉滨、依托泊苷、阿霉素或长春新碱)，免疫清除剂(例如氟达拉滨、依托泊苷、阿霉素或长春新碱)，免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤或糖皮质激素(如地塞米松或泼尼松))，抗炎剂(例如糖皮质激素(如氢化可的松、地塞米松或泼尼松))或非甾体抗炎剂(例如乙酰水杨酸、布洛芬或萘普生钠)，细胞因子(例如白介素10或转化生长因子-β)，激素(例如雌激素)或者疫苗。另外，可以施用免疫抑制剂或致耐受剂(tolerogenic agent)，包括但不限于钙调神经磷酸酶抑制剂(例如环孢菌素和他克莫司)；mTOR抑制剂(例如雷帕霉素)；霉酚酸酯，抗体(例如识别CD3、CD4、CD40、CD154、CD45、IVIG或B细胞)；化疗剂(例如甲氨蝶呤、曲奥舒凡(Treosulfan)、白消安)；辐照；或者趋化因子、白介素或其抑制剂(例如BAFF、IL-2、抗IL-2R、IL-4、JAK激酶抑制剂)。根据所需效果，可在施用免疫细胞之前、期间或之后施用此类额外药剂。可通过相同途径或通过不同途径进行细胞和试剂的这种施用，可在相同部位或在不同部位施用。
C.药物组合物
本文还提供了包含免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)和药学上可接受的运载体的药物组合物和制剂。施用可以是自体的或非自体的。例如，可从一个受试者获得T细胞和/或NK细胞以及包含它们的组合物，并施用到同一受试者或不同的相容性受试者。本公开的免疫细胞可通过局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。当施用本公开的治疗组合物时，通常将其配制为单位剂量可注射形式(例如溶液、混悬液、乳剂)。
本文所述的药物组合物和制剂可通过将具有所需纯度的活性组分(例如抗体或多肽)与一种或多种任选的药学上可接受的运载体进行混合来制备(Remington'sPharmaceutical Sciences 22nd edition,2012)，为冻干制剂或水溶液形式。药学上可接受的运载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受体无毒，包括但不限于：缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的反离子，例如钠；金属配合物(例如锌蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文示例性的药学上可接受的运载体还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(
Figure BDA0002270886280000631
Baxter International,Inc.)。美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968描述了某些示例性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。一方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(如硫酸软骨素酶)结合。
V.实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成其实施的优选方式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，可以在所公开的特定实施方案中进行许多改变，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下仍可获得相似或类似的结果。
实施例1——表达抗CD19 CAR的PSC所衍生的T/NK细胞的衍生
为产生表达嵌合抗原受体(CAR)的多能干细胞，使用了两种单独的方法。在一种方法中，使用逆转录病毒载体产生1C细胞(US20160257939；通过引用将其整体并入本文)或者使用附加型载体产生E11细胞，从T细胞衍生出无转基因的PSC。在第二种方法中，用编码造血编程基因ETV2/ERG、GATA2和HOXA9的PiggyBac表达载体(带有引入的DOX诱导型ETV2-GATA2-HOXA9(EGH)造血编程基因的改造的H1 ESC)转染PSC以产生A16细胞。然后对来自两种方法的PSC进行遗传修饰，以组成型表达第二代抗人CD19嵌合抗原受体(CAR)，它由FMC63mAb衍生的结合人CD19的scFv结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域组成。
通过细胞因子定向分化(1C、E11)或EGH诱导的编程(A16)，将未修饰的和CAR修饰的PSC分化为CD34+T/NK祖细胞(图1A-B)。使用DLL4/retronectin包被的培养板上的4周低氧培养，在StemSpan SFEM(Stem Cell Technologies)(补充有抗坏血酸磷酸镁(0.25mM)、烟酰胺(2mM)和细胞因子(SCF、TPO、FLT3L、IL7、IL2))中，将所分离的CD34+祖细胞进一步分化为CD3+T(1C、E11)和CD3-CD56+NK(A16)细胞。在平行T/NK培养中，在分化的最后2周内添加丝裂霉素C处理的Daudi细胞(β2-微球蛋白缺陷型HLA I类阴性CD19+B淋巴母细胞样细胞系)作为抗原(CD19)特异性CAR激活源。所产生的T/NK细胞命名如下：1C或E11衍生的T细胞——T、CAR-T、CAR-T/Ag(Daudi共培养物)；A16衍生的NK细胞——NK、CAR-NK、CAR-NK/Ag(Daudi共培养物)。
通过流式细胞术，使用蛋白L染色来评价整个分化阶段的CAR表达。将CD3+T细胞与λ链小鼠抗人CD3 mAb(克隆SP34-2)共染色。向T/NK细胞分化后，CAR表达就被显著沉默了，然而在用CAR特异性抗原(Ag；与CD19+Daudi细胞共培养)激活培养后，就可选择性扩增CAR阳性T和NK细胞。
通过使用表达荧光素酶的CD19+Daudi和Raji靶细胞的体外细胞毒性测定，评估了PSC衍生的T(1C)和NK(A16)细胞的细胞毒性功能。将靶标与T/NK效应物以1:1的比例温育24小时，通过Steady-Glo荧光素酶测定系统(Promega)对培养物裂解物中的荧光素酶活性进行定量。细胞毒性百分比由下公式计算：(1-(ET/T))×100，其中ET——效应物+靶标培养物，T——仅靶标。
尽管未修饰的T/NK细胞缺乏任何可检测出的活性，但表达CAR的T(1C)和NK(A16)细胞均显示出针对CD19+靶标的细胞毒性。与CD19+靶标(Daudi)细胞(CAR/Ag变体)进行2周T/NK共培养后，CAR依赖性细胞毒性活性显著增强了(图3A)。
通过使用Incucyte S3活细胞分析系统(Essen Bioscience)进行的实时靶细胞计数，证实了CAR-T细胞的溶细胞潜能。将表达GFP的CD19+Raji靶细胞与未经修饰的和转染CAR的PSC(E11 TiPSC)衍生的T细胞以1:1的比例进行温育。在9小时内进行GFP+Raji细胞的延时成像和计数。仅在有CAR-T细胞的培养物中检测到存活的(GFP+)Raji细胞的显著减少(图3B)。
将通过2周的T/NK分化接着1周的抗CD3诱导的T细胞扩增培养而从PSC(E11TiPSC)衍生的CD34+HPC所产生的CAR-T细胞与用人CD19抗原转染的小鼠P815肥大细胞瘤细胞(CD19+P815)和未转染的P815一起温育24小时，分别评估CAR诱导型和组成型细胞因子产生。使用LEGENDplex流式细胞术多重细胞因子测定(BioLegend)在培养上清液中测量细胞因子(图4)。CAR-T细胞证实了特异性CAR诱导型IFNγ、TNFα、IL2、IL13和GM-CSF的产生。组成型粒酶B的分泌也显示了PSC衍生的CAR-T细胞的细胞毒性。
为测试CAR-T细胞的体内功效，用5×104个表达荧光素酶的Raji细胞经腹膜内(ip)注射8周龄NSG小鼠。在下一天(第1天)，以107个/小鼠的剂量注射(ip)了T(1C衍生的)和NK(A16衍生的)细胞。在第3天和第5天重复进行T/NK注射。在T/NK注射期间(第1-5天)，还向所有小鼠额外注射(ip)了IL2和IL15细胞因子组合(均为500ng/小鼠)。每2周通过体内生物发光成像监测小鼠的肿瘤进展(图5A)。注射荧光素后15分钟内，使用Pearl Trilogy体内成像仪(LiCor)对注射(ip)了150mg/kg InVivo-Glo荧光素(Promega)的麻醉小鼠进行分析。图5B显示了用PSC衍生的T(1C)或NK(A16)细胞处理的不同组小鼠的存活曲线。
检测到在2周时肿瘤被显著抑制了，通过用表达CAR的PSC衍生的T或NK细胞进行的一个治疗疗程(间隔2天的3次注射)，使小鼠平均存活时间延长了约2倍。通过将表达CAR的PSC衍生的T或NK细胞与抗原阳性肿瘤细胞预先进行体外共培养，能够显著改善体内溶瘤潜能。
实施例2——定向分化方法
PCS分化为CD34+淋巴造血祖细胞：通过聚集体悬浮培养，将实施例1的T细胞衍生的PSC(分别通过逆转录病毒和附加体重编程而从外周血T细胞衍生的1C和E11 TiPSC)分化为CD34+造血祖细胞。在无饲养层条件下将PSC维持在MatrigelTM或玻连蛋白包被的6孔板上的Essential 8(E8)培养基中。在补充有2μM CHIR99021(GSK-3抑制剂)和5μMblebbistatin(肌球蛋白-II抑制剂)的E8培养基中，从亚汇合的PSC(＜80％汇合)以每毫升50万个细胞的密度制备聚集体。在rocker平台上以15-20rpm连续搅拌下(包括所有后续培养步骤)，在超低黏附(ULA)烧瓶中进行6小时培养形成聚集体。
将具有预先形成的细胞聚集体的培养物逐渐转移至无血清的造血分化培养基(HDM：50％IMDM，50％Hams F12培养基，100μg/ml聚乙烯醇，100μg/ml重组人血清白蛋白，1x非必需氨基酸补充剂(Invitrogen)，0.1x化学成分确定的脂质补充剂(Invitrogen)，125μM抗坏血酸2-磷酸镁，0.25μM亚油酸，微量元素补充剂A(0.3x)、B(0.2x)和C(0.1x)(Corning)，5mM氯化钠，100μM单硫代甘油，20μM乙醇胺，100ng/ml肝素和10ng/ml IGF1)中，通过在第6小时和24小时时添加等培养基体积补充2μM CHIR99021、50ng/ml VEGF和50ng/ml FGF2。在第2天，通过沉降使细胞聚集体沉淀15分钟，吸出培养基，将培养物转移至补充有造血中胚层诱导细胞因子——25ng/ml BMP4、50mg/ml VEGF和50ng/ml FGF2的HDM中。继续培养3天，每天更换完全培养基。
为支持造血CD34+祖细胞的分化和扩增，将细胞聚集体进一步转移至补充有造血支持性细胞因子——50ng/ml SCF、50ng/ml TPO、20ng/ml FLT3L和20ng/ml IL-3的HDM中。继续培养3-5天，每天更换完全培养基。为改善造血转变过程，可添加以下增强组分：IL11(5-20ng/ml)、8Br-cAMP(100-300μM)和/或VEGF(20-50ng/ml)。
在2+3+3-5天的分化过程(总共8-10天)后，收获悬浮液中被鉴定为漂浮的单个细胞或小簇的HPC。通过将整个分化培养物通过70μm和30μm细胞过滤器(Corning)过滤来分离HPC。将通过离心从滤液中所收集的HPC在HDM中洗涤一次，重悬于TCDM(T细胞分化培养基)中。为富集具有T/NK潜能的HPC，可根据制造商的建议，使用直接CD34微珠(MyltenyiBiotec)通过磁激活细胞分选(MACS)来进行CD34+HPC级分的分离。将HPC铺板到T/NK分化培养基中或者冷冻保存以备分离后1小时内的随后使用。
T/NK分化培养物：为进行T/NK分化，将非组织培养物处理过的塑料板用稀释在PBS中的Notch配体hDLL4-Fc嵌合蛋白和retronectin进行包被(各0.5μg/cm2)。在细胞铺板之前，吸出包被溶液，用PBS洗涤培养板一次，充满0.25ml/cm2 T细胞分化培养基(TCDM)，该培养基由StemSpan SFEM(Stem Cell Technologies)、GlutaMax(1/100)、抗坏血酸磷酸镁(250μM)、烟酰胺(2mM)和细胞因子SCF、TPO、FLT3L和IL7(各50ng/ml)组成。将PSC衍生的HPC以5000个细胞/cm2的密度铺板，在低氧(5％O2)CO2培养箱中培养2周，在第3天添加相等TCDM培养体积，并在每个接下来的第二天更换一半体积培养液。通过轻轻重悬并收集非贴壁细胞，然后通过用PBS-EDTA(0.5mM)处理5-10分钟来收集松散贴壁的细胞，从而收获总分化细胞。为继续分化过程并提高T/NK细胞的产率，可通过以10000个细胞/cm2的密度将所收获的细胞重新铺板到新鲜制备的DLL4/retronectin培养板上来重复T细胞分化培养，直到达到所需的T/NK细胞产率。也可通过向TCDM中添加以下增强组分来提高T/NK分化的效率：CHIR99021(1-3μM)、IL2(2-10ng/ml)、IL12(10-50ng/ml)。
T细胞扩增培养：为进行T细胞扩增，将非组织培养物处理过的培养板用稀释在PBS中的抗CD3 mAb(克隆OKT3)、hDLL4-Fc和retronectin进行包被(各0.5μg/cm2)。在细胞铺板之前，吸出包被溶液，用PBS洗涤培养板一次，充满0.25ml/cm2 T细胞扩增培养基(TCEM)，该培养基由StemSpan SFEM(Stem Cell Technologies)、GlutaMax(1/100)、抗坏血酸磷酸镁(250μM)、烟酰胺(2mM)以及细胞因子SCF、TPO、FLT3L和IL7(各50ng/ml)和IL2、IL15(各10ng/ml)组成。还可添加IL21(5-20ng/ml)以改善扩增。将从T/NK分化培养物中收获的细胞以10000个细胞/cm2的密度铺板，在低氧(5％O2)CO2培养箱中培养达2周，在第3天添加相等TCEM培养体积，并在每个接下来的第二天更换一半体积培养液。通过非贴壁细胞的轻轻重悬和收集来收获所扩增的T细胞。
实施例3——定向分化方法的表征
通过8-10天内的WNT诱导的分化引发、中胚层诱导和HPC分化的连续步骤，首先在悬浮细胞聚集培养物中将PSC分化为CD34+HPC(图1B)。通过过滤分离HPC级分。尽管可以使用直接CD34顺磁珠(Myltenyi Biotec)任选地进行CD34+HPC的MACS分选，但没有进行。然后将HPC转移至人DLL4-Fc+retronectin包被的培养板上进行2-4周T/NK分化。可将T细胞在抗CD3 mAb(OKT3克隆)包被培养板上的培养中再扩增1-2周。
在T/NK分化条件下2周后，PSC(1C TiPSC)衍生的CD34+细胞就形成了由低FSC/SSC参数所确定的典型淋巴样细胞群(图1D，左点图)。该淋巴样群主要包含CD3+T和CD56+CD3-NK细胞(图1D，中间点图)。T细胞群包括CD4+和CD8+单阳性和双阳性细胞以及显著比例的双阴性细胞(图1D，右边点图)。
将每种相应细胞类型的产量计算为细胞衍生每个阶段的输出与输入的绝对细胞数之比。例如，1.5的CD34+HPC产率就表明平均可从1个(输入)PSC得到1.5个(输出)CD34+HPC。因此，102的T细胞产率就表明可从1个(输入)CD34+HPC得到102个(输出)T细胞(图1E)。
PSC(1C TiPSC)衍生的T细胞(CD3+)在表达α/βTCR(不是γ/δ，也不是不变的Vα24NKT TCR)和典型T细胞标志物CD5、CD27和CD7的4周内进行了分化和扩增(图1F)。它们还表达了细胞毒性T/NK相关的(CD161、CD94)和激活(CD69)标志物。
最少需要固定化的抗CD3抗体(iCD3)和足以实现PSC衍生T细胞的扩增(图1G，条形图)。用CD3和CD28 mAb的可溶性刺激(sCD3、sCD28)单独或组合(sCD3+sCD28)或者当添加至iCD3(iCD3+sCD28)时均无效。在扩增培养物中增殖的T细胞获得了不规则形状淋巴母细胞的特征形态(图1G，照片)。与相对异质的输入细胞群相反，从2周T细胞扩增所收获的细胞基本上是纯的CD3+T细胞，也表达CD56并获得了CD8表达(图1G，流式细胞术点图)。因此，定向分化方法有效地产生了T细胞。
***
根据本公开就能够在不进行过度实验的情况下进行和执行本文所公开和要求保护的所有方法。尽管已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员将显而易见的是，可以在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，对方法以及方法的步骤或步骤顺序进行改变。更具体地，将显而易见的是，化学和生理相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改都被认为落入由所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念之内。
参考文献
以下参考文献通过引用被明确地并入本文，它们在一定程度上为本文所阐述的内容提供了示例性的过程或其他细节的补充。
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Claims (63)

1.产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞的方法，其包括：
(a)改造多能干细胞(PSC)以表达嵌合抗原受体(CAR)，从而产生CAR-PSC；
(b)使所述CAR-PSC分化或正向编程为CD34+造血祖细胞(HPC)；
(c)进一步使所述CD34+HPC分化为T细胞和/或NK细胞；以及
(d)扩增所述T细胞和/或NK细胞，其中扩增包括与抗原特异性靶细胞共培养，从而产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤(a)所述的PSC是诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。
3.权利要求2所述的方法，其中所述iPSC是从T细胞重编程的。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中步骤(b)包括进行定向分化。
5.权利要求4所述的方法，其中定向分化包括：
(a)在blebbistatin、GSK-3抑制剂、FGF2和VEGF存在下形成类胚体(EB)；
(b)使所述EB与BMP-4、VEGF和FGF2接触以诱导中胚层诱导；以及
(c)在Flt-3配体、IL3、SCF和TPO存在下分化所述EB，从而产生HPC。
6.权利要求5所述的方法，其中步骤(c)的分化基本上不含BMP4。
7.权利要求5所述的方法，其中步骤(c)的分化不含BMP4。
8.权利要求5所述的方法，其中步骤(c)的分化还包括IL-11、cAMP和/或VEGF的存在。
9.权利要求5所述的方法，其中步骤(c)的分化还包括IL-11、cAMP和VEGF的存在。
10.权利要求5所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂是CHIR99021。
11.权利要求4所述的方法，其中定向分化包括：
(a)在blebbistatin、BMP4、VEGF和bFGF存在下，在胺包被的表面上培养个体化的PSC；
(b)通过使所述PSC与BMP-4、VEGF和FGF2接触来开始分化；以及
(c)在Flt-3配体、IL3、IL6、SCF、TPO和肝素存在下进一步分化所述PSC，从而产生HPC，
其中所述方法不包括EB形成。
12.权利要求1-11任一项所述的方法，其中所述PSC基本上是无转基因的。
13.权利要求12所述的方法，其中所述PSC是人的。
14.权利要求1或权利要求3所述的方法，其中所述T细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、细胞毒性T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、初始T细胞、记忆T细胞或γδT细胞。
15.权利要求1所述的方法，其中步骤(a)所述的PSC被进一步改造以在单个诱导型启动子的控制下表达ERG/ETV2、GATA2和HOXA9。
16.权利要求15所述的方法，其还包括改造所述PSC以表达HMGA2、MYCN、NR4A2、SOX17、TFEC、MEIS1和HOXA4。
17.权利要求15或权利要求16所述的方法，其中步骤(b)的编程包括在足以产生HPC的一段时间内诱导ERG/ETV2、GATA2和HOXA9的表达，并在步骤(c)之前终止表达诱导。
18.权利要求1所述的方法，其中所述方法包括在限定的无饲养层的条件下培养细胞。
19.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)还包括在分化为抗原特异性T细胞和/或NK细胞之前，选择表达CD34和CD43的细胞。
20.权利要求19所述的方法，其中选择包括进行磁激活细胞分选(MACS)。
21.权利要求19所述的方法，其中表达CD34和CD43的细胞占总细胞群体的至少35％。
22.权利要求19所述的方法，其中表达CD34和CD43的细胞占总细胞群体的至少65％。
23.权利要求1所述的方法，其中至少5％的HPC表达所述CAR。
24.权利要求1所述的方法，其中至少10％的HPC表达所述CAR。
25.权利要求1所述的方法，其中至少15％的HPC表达所述CAR。
26.权利要求1所述的方法，其中步骤(c)的分化包括在低氧条件下，在抗坏血酸和烟酰胺存在下，在retronectin和Notch DLL-4包被的表面上培养所述HPC。
27.权利要求26所述的方法，其中培养物还包含SCF、FLT-3配体、TPO和IL7。
28.权利要求27所述的方法，其中培养物还包含GSK-3抑制剂、IL-2和/或IL-12。
29.权利要求27所述的方法，其中培养物还包含GSK-3抑制剂、IL-2和IL-12。
30.权利要求1所述的方法，其中步骤(d)的扩增还包括在抗CD3抗体、IL-2和IL-15存在下培养抗原特异性T细胞。
31.权利要求1所述的方法，其中步骤(d)的扩增还包括在抗CD3抗体、IL-2、IL-15和IL-21存在下培养抗原特异性T细胞。
32.权利要求1所述的方法，其中步骤(d)的扩增还包括在抗CD3抗体、FLT3-配体、IL-7、IL-2、IL-15和/或IL-21存在下培养抗原特异性T细胞。
33.权利要求33所述的方法，其中步骤(d)的扩增还包括从由SCF和TPO组成的组中选择的一种或两种额外组分。
34.权利要求26所述的方法，其中至少1.5％的分化的CD34+HPC是CD3+CAR+T细胞。
35.权利要求26所述的方法，其中至少2％的分化的CD34+HPC是CD3-CAR+NK细胞。
36.权利要求30所述的方法，其中至少2％的扩增的CD34+HPC是CD3+CAR+T细胞。
37.权利要求26所述的方法，其中至少10％的扩增的CD34+HPC是CD3-CAR+NK细胞。
38.权利要求1所述的方法，其中所述CAR和所述抗原特异性靶细胞针对相同的抗原。
39.权利要求38所述的方法，其中所述抗原是CD19。
40.权利要求1所述的方法，其中所述抗原特异性靶细胞是肿瘤细胞。
41.权利要求1所述的方法，其中所述抗原特异性靶细胞是人的。
42.权利要求38-41任一项所述的方法，其中所述抗原特异性靶细胞是HLA I类阴性的。
43.权利要求42所述的方法，其中至少5％的抗原特异性效应T细胞表现出对靶细胞的细胞毒性活性。
44.权利要求42所述的方法，其中至少40％的抗原特异性效应NK细胞表现出对靶细胞的细胞毒性活性。
45.权利要求1所述的方法，其中所述CAR是由整合到所述PSC基因组中的DNA所编码的。
46.权利要求1所述的方法，其中所述CAR包含胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包含抗原结合区的胞外结构域。
47.权利要求46所述的方法，其中所述胞内信号传导结构域包含CD3ζ和CD28。
48.权利要求46所述的方法，其中所述抗原结合区是F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv或scFv。
49.权利要求1所述的方法，其中所述PSC是HLA纯合形式的。
50.权利要求49所述的方法，其中所述HLA纯合形式的PSC对基因座等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ中的一个或多个是纯合形式的。
51.权利要求49所述的方法，其中所述HLA纯合形式的PSC对基因座等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ中的两个是纯合形式的。
52.权利要求51所述的方法，其中所述HLA纯合形式的PSC对HLA-A和HLA-B是纯合形式的。
53.权利要求49所述的方法，其中所述HLA纯合形式的PSC对HLA-A、HLA-B和HLA-C是纯合形式的。
54.产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞的方法，其包括：
(a)改造PSC以表达CAR，从而产生CAR-PSC；
(b)在blebbistatin、GSK-3抑制剂、FGF2和VEGF存在下培养所述CAR-PSC，从而形成EB；
(c)使所述EB与BMP-4、VEGF和FGF2接触以诱导中胚层诱导；
(d)在Flt-3配体、IL3、SCF和TPO存在下分化所述EB，从而产生CD34+HPC；
(e)进一步使所述CD34+HPC分化为T细胞和/或NK细胞；以及
(f)扩增所述T细胞和/或NK细胞，其中扩增包括与抗原特异性靶细胞共培养，从而产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞。
55.权利要求54所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂是CHIR99021。
56.产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞的方法，其包括：
(a)改造PSC以表达CAR，从而产生CAR-PSC；
(b)在blebbistatin、BMP4、VEGF和bFGF存在下，在胺包被的表面上培养个体化的CAR-PSC；
(c)通过使所述CAR-PSC与BMP-4、VEGF和FGF2接触来开始分化；
(d)在Flt-3配体、IL3、IL6、SCF、TPO和肝素存在下进一步分化所述CAR-PSC，从而产生HPC；
(e)使所述HPC分化为T细胞和/或NK细胞；以及
(f)扩增所述T细胞和/或NK细胞，其中扩增包括与抗原特异性靶细胞共培养，从而产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞，
其中所述方法不包括EB形成。
57.产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞的方法，其包括：
(a)改造PSC以表达CAR，从而产生CAR-PSC；
(b)使所述CAR-PSC分化为CD34+HPC；
(c)选择CD34+CD43+HPC；
(d)进一步使所述CD34+CD43+HPC分化为T细胞和/或NK细胞；以及
(e)扩增所述T细胞和/或NK细胞，其中扩增包括与抗原特异性靶细胞共培养，从而产生抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞。
58.根据权利要求1-57任一项所产生的抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞群。
59.包含根据权利要求1-57任一项所产生的抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞的药物组合物。
60.包含根据权利要求1-57任一项所产生的抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞的组合物，其用于在受试者中治疗癌症。
61.在受试者中治疗癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-58任一项所产生的抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞。
62.权利要求61所述的方法，其中所述癌症表达肿瘤抗原，并且所述抗原特异性效应T细胞和/或NK细胞针对所述肿瘤抗原。
63.权利要求61所述的方法，其中所述受试者是人。
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