CN103003416A - 从小体积的外周血产生诱导性多潜能干细胞 - Google Patents

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Abstract

公开了涉及生产诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)的方法和组合物。例如，可以使用游离重编程和不含饲养物或不含异种物质的条件从外周血细胞如人血液祖细胞产生诱导性多潜能干细胞。在某些实施方案中，本发明提供了以低数量的血液祖细胞提高整个重编程效率的新方法。

Description

从小体积的外周血产生诱导性多潜能干细胞
发明背景
本申请要求2010年6月15日提交的美国专利申请No.61/355,046和2010年10月1日提交的美国专利申请No.61/388,949的优先权，它们的全部公开内容在不弃权的情况下通过引用以其整体明确地并入本文。本申请还与2009年6月5日提交的美国专利申请No.61/184,546、2009年9月4日提交的美国专利申请No.61/240,116，以及2010年6月4日提交的PCT申请PCT/US10/37376相关，它们的全部公开内容在不弃权的情况下通过引用以其整体明确地并入本文。
1.发明领域
本发明一般地涉及分子生物学和干细胞领域。更具体地，本发明涉及体细胞，尤其造血祖细胞的重编程。
2.相关领域的描述
一般而言，干细胞是未分化细胞，其能够产生成熟的功能细胞的演替。例如，造血干细胞可以产生任意的不同类型的末端分化的血细胞。胚胎干(ES)细胞来源于胚胎并且是多潜能的，因而具有发育成任何器官或组织类型或者至少潜在地发育成完整胚胎的能力。
诱导性多潜能干细胞，通常简写为iPS细胞或iPSC，是一类人工地从非多潜能细胞，通常成年体细胞衍生而来的多潜能干细胞。据信，诱导性多潜能干细胞与天然多潜能干细胞如胚胎干细胞在许多方面，例如在某些干细胞基因和蛋白的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、拟胚体的形成、畸胎瘤的形成、活嵌合体的形成以及潜能和分化能力方面来说是相同的，但是它们与天然多潜能干细胞相关性的完整程度仍在评估。
IPS细胞首先于2006年从小鼠细胞中产生(Takahashi等人，2006)以及于2007年从人细胞中产生(Takahashi等人，2007；Yu等人，2007)。这被认为是在干细胞研究中的重要进展，因为它可使研究人员能够获得在研究中具有重要意义并且潜在地具有治疗应用的多潜能干细胞，而不必争议性地使用胚胎。
在人中，iPS细胞通常是从真皮成纤维细胞产生。然而，对于皮肤活组织检查的需求和在体外扩展成纤维细胞数个传代的需要使其成为用于产生患者特异性干细胞的麻烦的来源。而且，先前的用于重编程人体细胞的方法是不方便的，因为它们需要从人受试者直接获取体细胞，或将细胞维持于费力的细胞培养系统中。
因此，需要开发用于从替代来源诱导多潜能干细胞的简单、方便且易达的方法。在开发本发明时，本发明人考虑到血液细胞可以作为此种来源，因为血液可以从患者或健康个体中收集、储存或转移，例如，从中心分配单元转移至一个或多个远的地方。然而，仍然需要开发用于重编程血细胞，尤其外周血细胞的高效方法。
发明概要
本发明的方面旨在增加重编程外周血细胞的全过程效率(血细胞输入数：iPS系输出数的转化效率)并减少例如从标准血液样品(体积为约8-10ml)中获取合理数量的iPS集落(例如，至少5个iPS集落)所需要的输入血量的体积。本发明的某些实施方案是新颖的，其利用扩展来自外周血的CD34+起始细胞数量的能力来克服有关仅可从未动员的外周血中得到少量CD34+起始细胞的限制。本领域技术人员可能已想到，扩展CD34+细胞内在地导致该细胞也分化，可能会使该细胞不太容易重编程。本发明的实施例证明：扩展的细胞提供了足以进行重编程的数量并且获得比未进行扩展的实质上相同的情况高得多的出乎意料的好的全过程效率。有了这一进展，本发明的某些方面能够从小体积的外周血，特别是从未动员的受试者产生iPS细胞。
另一方面，本发明的某些方面具有这样的优势，即，在限定的细胞外基质上从外周血细胞产生iPS细胞，从而避免来自未限定的饲养细胞的问题和潜在异种物质污染。在进一步方面，本发明还克服了使用整合载体用于重编程的问题。
因此，在第一实施方案中，提供了从造血祖细胞生产人iPS细胞的方法，该方法包括以下步骤中的一个或多个：a)提供包含造血祖细胞的人外周血细胞的细胞群体；b)在用于促进造血祖细胞扩展的扩展条件下培养该细胞群体；c)将表达iPS重编程因子的外源性游离遗传元件或外源性RNA遗传元件导入扩展的造血祖细胞中；以及d)将含游离体的扩展的造血祖细胞在实质上不含饲养细胞的培养物或饲养细胞条件化的培养基中，或在不含异种物质的培养物中进行培养，由此从造血祖细胞产生人iPS细胞。在具体方面，利用一个或多个上述步骤可以从小体积，例如最多10ml的血液样品产生iPS细胞。扩展步骤可能并不总是必需的，但是它以意想不到的方式，特别是在小的血液体积的情况下大大增加重编程效率。
在某些方面，该细胞群体的来源是来自一个或多个其细胞没有用从外部施加的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)动员的受试者。该细胞群体的来源可以是血液样品或血液组分。血液样品的适宜体积可以为约1ml至约5ml、约1ml至10ml、约1ml至15ml，或更具体地，约1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、11ml、12ml、13ml、14ml、15ml、16ml、17ml、18ml、19ml、20ml、25ml、30ml、40ml、50ml或可从其导出的任何范围的体积。该细胞群体可以获自冷冻保存的血液样品，或者细胞群体来源或细胞群体可以经过冷冻保存。
例如，该细胞群体可以包含至少、约，或至多1x103、2x103、3x103、4x103、5x103、6x103、7x103、8x103、9x103、1x104、2x104、3x104、4x103、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106个或可从其导出的任何范围的造血祖细胞。在某些方面，起始细胞在扩展或重编程之前可以包含至少或约103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013个或可从其导出的任何范围的细胞。起始细胞群体可具有至少或约10、101、102、103、104、105、106、107、108个细胞/ml或可从其导出的任何范围的接种密度。8ml至10ml的标准血液样品可以具有6-12,000个CD34+细胞，并且通常不足以用于重编程以产生iPS细胞集落。然而，本发明的一些方面提供了扩展祖细胞至足够的数量并重编程扩展的细胞从而成功地产生iPS细胞的方法。在具体的方面，该细胞群体可以实质上不含任何末端分化的血细胞如T细胞或B细胞，因此，来源于该细胞群体的iPS细胞可以具有不存在基因重排的全基因组。
在本发明方法的步骤a)中可以采用可用于分离造血祖细胞的任何方法。例如，此种分离可以基于表面标记表达，其可以包含CD34表达的阳性选择和/或谱系特异性标记表达的阴性选择。选择方法可以包括磁激活细胞分选术或荧光激活细胞分选术(FACSTM，即流式细胞术)。
为了扩展造血祖细胞或在初始恢复阶段培养重编程的造血祖细胞，可以在包含含有一种或多种细胞因子的扩展培养基的条件下培养该细胞，所述细胞因子包括干细胞因子(SCF)、Flt-3配体(Flt3L)、血小板生成素(TPO)、白细胞介素3(IL-3)，或白细胞介素6(IL-6)。扩展条件可以进一步包含Notch-1配体，如固定化的工程化Notch配体(Deltal ext-IgG；Delaney等人，2010)，或者可以不包含此种Notch-1配体，因为它被证明对于该目的不重要。在重编程步骤之前，可以将细胞扩展例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25天或可从其导出的任何范围的天数。例如，可以在约扩展阶段的第3、4、5或6天将重编程元件导入细胞中。
造血祖细胞的扩展条件可以实质上不含任何基质组分，或替代地，可以包括限定的或不含异种物质的细胞外基质，如人纤连蛋白片段如
Figure BDA00002587008000051
为了通过模拟造血祖细胞的体内微环境来促进造血祖细胞的体外扩展，用于扩展造血祖细胞的条件或在初始恢复阶段培养重编程的造血祖细胞的条件可以是低氧条件，例如，氧分压为约1％至7％，特别地，氧分压为约2-5％。
在本发明的又一些进一步方面，可以采用任何方法如电穿孔或脂质介导的基因递送，将外源遗传元件导入细胞中。
在某些方面，游离遗传元件可以包含复制起始点和一个或多个表达重编程因子的表达盒。这样的一个或多个表达盒可以进一步包含编码与复制起始点结合以复制染色体外模板的反式作用因子的核苷酸序列。或者，外周血细胞可以表达此种反式作用因子。
在示例性实施方案中，复制起始点可以是嗜淋巴细胞性疱疹病毒或γ疱疹病毒、腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒，或酵母的复制起始点，如对应于EBV的oriP的嗜淋巴细胞性疱疹病毒或γ疱疹病毒的复制起始点。在进一步方面，嗜淋巴细胞性疱疹病毒可以是EB病毒(Epstein Barr virus)(EBV)、卡波希氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)疱疹病毒(KSHV)、松鼠猴疱疹病毒(Herpes virus saimiri)(HS)，或马立克氏病(Marek′s disease)病毒(MDV)。
为了复制和短暂地维持外源性游离遗传元件，反式作用因子可以是对应于EBV的EBNA-1(EBV核抗原1)的野生型蛋白的多肽，或者是所述野生型蛋白的衍生物，优选在对应于EBV的OriP的复制起始点的存在下。该衍生物可以具有与野生型EBNA-1相比降低的激活从整合模板的转录的能力，并因而具有降低的异位激活染色体基因导致致癌转化的机会。同时，在衍生物与复制起始点结合后，该衍生物可以激活至少5％相应野生型蛋白质从染色体外模板的转录。
为了重编程造血祖细胞，本发明方法的某些方面可以涉及使用重编程因子，所述重编程因子可包含选自由以下组成的组的一种或多种：Sox、Oct、Nanog、Lin-28、Klf4，以及或C-myc或L-myc，或它们的组合，例如，Sox、Oct、Nanog和任选的Lin-28的集合，Sox、Oct、Klf4和任选的C-myc或L-myc的集合，或这六种因子的组合。在某些方面，为了降低C-myc表达的可能毒性作用，SV40大T基因(SV40LT)可以与C-myc一起被包括。在具体的方面，外源元件，DNA或RNA，可以包含一个或多个多顺反子盒，如在相同的转录调控元件下的两个或更多个重编程因子基因。
在一些进一步方面，已导入外源重编程因子的造血祖细胞可以在不含异种物质的细胞外基质的存在下进行培养。对于人细胞，不含异种物质的基质被定义为实质上不含动物组分的细胞外基质，其中该动物不是人。在具体的方面，该基质可以被定义为例如具有单一类型的细胞外基质肽，如人纤连蛋白片段，例如
Figure BDA00002587008000061
此外，步骤d)在导入用于重编程的外源遗传元件之后，可以在一种以上的不同条件下培养细胞。在紧接在导入重编程元件之后的第一子步骤中，可以在如上所述的造血祖细胞扩展培养基，或重编程培养基，或它们的组合或等同物中培养细胞。例如，可以在包含含有用于恢复造血祖细胞的一种或多种细胞因子的培养基的条件下培养细胞，所述细胞因子包括干细胞因子(SCF)、Flt-3配体(Flt3L)、血小板生成素(TPO)、白细胞间介素3(IL-3)，或白细胞间介素6(IL-6)。这个子步骤可以持续约、至少，或至多2、4、8、12、16、24、32、48、96小时或可从其导出的任何范围的时间。在这个子步骤中，基质组分可以是任选的。在这个子步骤之后，如果细胞不是已经在一个基质上，则将细胞转移到基质上。
可以在包含以下扩展培养基的条件下进一步培养细胞：扩展培养基、重编程培养基，如包含GSK-3抑制剂、MEK抑制剂、TGF-β受体抑制剂、肌球蛋白IIATP酶抑制剂，和/或Rho相关激酶(ROCK)信号传导抑制剂从而有效地增强重编程的培养基；或它们的组合或它们的等同物，接着转换到100％重编程培养基中。例如，GSK-3抑制剂可以是CHIR99021；MEK抑制剂可以是PD0325901；TGF-β受体抑制剂可以是A-83-01；肌球蛋白II ATP酶抑制剂可以是blebbistatin；ROCK抑制剂可以是HA-100或H1152。这个子步骤可以持续约、至少，或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或可从其导出的任何范围的时间。在一些方面，重编程培养基可以是化学限定的培养基，或者可以基于TeSR培养基、人胚胎细胞培养基，或N2B27培养基。在进一步方面，可以将细胞转移，优选逐渐转移至实质上不含外部施加的信号传导抑制剂如GSK-3抑制剂、MEK抑制剂、肌球蛋白IIATP酶抑制剂和TGF-β受体抑制剂的培养基中。此种培养基可以是TeSR2或其他干细胞培养基并且可以优选为化学限定的培养基。
用于任何步骤或子步骤或在整个过程中的任何培养基、培养物或基质可以是不含异种物质或限定的培养基。培养基可以是化学限定的培养基，如TeSRTM培养基。
在某些方面，该方法可以进一步包括例如基于一种或多种胚胎细胞特性如ES细胞样形态来选择iPS细胞。在进一步方面，该方法可以包括在包含选自由以下组成的组的一种或多种物质的iPS细胞扩展培养基中培养所选择的iPS细胞：GSK-3抑制剂、MEK抑制剂、肌球蛋白II ATP酶抑制剂、TGF-β受体抑制剂、Rho相关激酶(ROCK)信号传导抑制剂、任选的白血病抑制因子(LIF)，或其组合。
还可以提供根据上述方法产生的iPS细胞群体。
还可以提供细胞培养组合物，其包含含有造血祖细胞和其子代细胞的人外周血细胞的细胞群体、不含异种物质的细胞外基质，和培养基，其中造血祖细胞包含一种或多种表达重编程因子的外源性游离遗传元件或外源性RNA遗传元件。具体地，该基质可以是限定基质。例如，该基质可以具有单一类型的细胞外基质肽，如重组纤连蛋白片段。该重组纤连蛋白片段可以是
Figure BDA00002587008000081
在进一步方面，细胞培养组合物可以是不含异种物质或限定的组合物。包含在培养组合物中的培养基可以是不含异种物质或化学限定的培养基。此种培养基可以包含用于重编程的造血祖细胞的初始阶段的一种或多种细胞因子，所述细胞因子包括干细胞因子(SCF)、Flt-3配体(Flt3L)、血小板生成素(TPO)、白细胞介素3(IL-3)，或白细胞介素6(IL-6)。这种培养组合物也可以包含Notch-1配体，如固定化的工程化Notch配体(Deltal ext-IgG；Delaney等人，2010)。为了增强重编程效率，培养基可以包含GSK-3抑制剂、MEK抑制剂、TGF-β受体抑制剂、肌球蛋白II ATP酶抑制剂，和/或Rho相关激酶(ROCK)信号传导抑制剂。
在细胞培养组合物中，人外周血细胞的细胞群体可以来自一个或多个其细胞没有用从外部施加的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)动员的受试者。该造血祖细胞可以已经在体外，例如在一种或多种细胞因子的存在下进行扩展，所述细胞因子包括干细胞因子(SCF)、Flt-3配体(Flt3L)、血小板生成素(TPO)、白细胞介素3(IL-3)，或白细胞介素6(IL-6)。扩展培养物可以是悬浮细胞培养物并且可能不需要使用如本文描述的任何底物或基质。细胞群体的来源可以是血液样品或血液组分。血液样品的适宜体积可以是约1ml至约5ml、约1ml至10ml、约1ml至15ml，或者更具体地，约3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml或可从其导出的任何范围的体积。细胞群体可以获自冷冻保存的血液样品，或者细胞群体来源或细胞群体可以经过冷冻保存。
在本发明方法和/或组合物的上下文中讨论的实施方案可以相对于本文描述的任何其他方法或组合物使用。因而，与一种方法或组合物有关的实施方案也可以适用于本发明的其他方法和组合物。
如本文使用的关于核酸的术语“编码(encode)”或“编码(encoding)”用来使本发明容易被技术人员理解；然而，这些术语可以分别与“包含(comprise)”或“包含(comprising)”互换使用。
如本文在说明书中使用的“一”或“一个(种)”可以指一个(种)或多个(种)。如本文在一条(多条)权利要求中结合词语“包含”使用的词语“一”或“一个(种)”可以指一个(种)或一个(种)以上。
在权利要求书中使用的术语“或(或者)”用来指“和/或”，除非明确表示仅二者之一或者二者是相互排斥的，尽管本公开支持表示仅二者之一及“和/或”的定义。如本文使用的“另一个(种)”可以指至少第二个(种)或更多个(种)。
在本申请全文中，术语“约”用于表示值包括测定该值所用的装置、方法的误差的内在差异，或者存在于研究对象之间的差异。
根据下面的详细描述，本发明的其他目的、特征和优势将变得明显。然而，应理解，详细描述和具体实施例虽然指示本发明的优选实施方案，但仅以举例说明的方式给出，因为在本发明精神和范围内的各种变化和修饰将根据该详细描述对本领域技术人员而言变得明显。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分，且包括这些附图的目的是进一步表现本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个附图结合本文提供的具体实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。
图1-示例性重编程过程的示意图。用标准方式加工8ml全血小瓶以获取PBMC，将该PBMC冷冻或者新鲜纯化以富集CD34-表达细胞。然后为扩展期接种这些细胞以获得最佳数量的用于转染的细胞。然后将转染的细胞重悬在100％新鲜扩展培养基中或者将其与和小分子复合的重编程培养基结合在一起。在至少48个小时内，将细胞转换到限定的不含饲养物的基质中，并每隔一天用与小分子复合的100％重编程培养基喂养细胞。在约转染后的9至14天(dpt)，给该培养物喂养不含小分子(即TeSR2)的限定多潜能干细胞培养基。然后在18-25dpt用Tra1-81对集落进行染色以鉴定iPS克隆。
图2A-2E-造血祖细胞(HP)是可从未动员的血液供体扩展的。图2A示出使用三种测试条件对来自单个未动员的血液供体的HP的扩展。每种条件均依赖于细胞因子富集的培养基，而基质在从不含基质、纤连蛋白包被(Notch-)，和纤连蛋白/DLL-1包被(Notch+)之间变化。图2B示出随着祖细胞逐渐转向更分化的细胞类型而发生的CD34表达的自然下降。CD45表达一般是造血细胞的指示器。在扩展期间的第10天从同一供体取样的细胞表现出主要为髓系性质的表达谱(图2C)，其具有很小至不具有B、T和NK标记的表达(数据未示出)。此外，在本文发现该扩展在多个供体间是一致的，但是该扩展的幅度在患者样品之间变化(图2D)。创建5个供体的汇集物以便为待执行的多个重编程实验确立较大数量的细胞。测定这个汇集物的扩展潜力两次(重复1和2，R1和R2)(图2E)。
图3-供造血祖细胞(HP)转染用的载体。为了成功地重编程细胞，通过电穿孔用表达GFP的对照质粒或表达用于重编程的因子的质粒组合转染HP。有多个质粒排列(permutation)可用来表达已被成功使用的各种重编程因子组合，并且本文示出此类质粒的实例。每种质粒均具有oriP和表达EBNA1的盒以确保转染细胞内的质粒的保留。
图4-用于多顺反子载体的载体图-集合1和集合2。
图5A-5F-优化用于重编程的输入细胞数量和转染效率。图5A.将来自源于供体GG(leukopak来源)的PBMC的纯化细胞扩展6天。用对照，表达GFP的基于oriP/EBNA1的质粒转染一系列细胞数量。通过计算采用流式细胞术检测的表达GFP的活细胞的百分比来确定转染效率。图5B.将来自PBMC(供体A2389)的纯化细胞扩展3或6天，并用对照，表达GFP的质粒转染6x104至1x105个细胞。该图描述了呈GFP-阳性的总群体的百分比和总细胞的绝对数量。图5C.该图代表当在扩展的第3天或第6天转染时还共表达GFP和CD34的b中的细胞的分数。图5D.使用用于转染的组合质粒集合2进行的来自新抽出的血液(供体3002)的代表性重编程试验。示出6孔板的单个孔，其含有对碱性磷酸酶活性染色呈阳性的集落(i)。白色箭头强调在组ii中放大的集落，其也对Tra1-81表达染色呈阳性，组iii。图5E.使用质粒集合2对扩展6天的一系列输入细胞数量(供体GG)执行重编程试验。图5F.将从四种不同供体纯化的CD34表达细胞扩展6天并使用表达C-myc(集合1)或L-myc(集合2)的质粒组合转染以进行比较，并比较iPSC的总数量。
图6-在不存在含有BSA的补充物B27的情况下发生的iPSC的产生。
图7A-7B-CD34表达量与重编程效率相关联。图7A.代表性重编程试验，在该试验中将纯化之后的CD34阳性(i)和阴性(ii)级分都用于重编程。组(i)示出6孔板的1个孔，该孔含有基于其表达碱性磷酸酶(AP染色，蓝色)的能力被成功重编程的来自供体2939的集落。当与纯化的群体组ii平行执行时，来自供体2939的CD34耗竭级分不能形成集落，如缺少AP染色指示的。组iii和iv放大组(i)中用白色箭头标记的集落，并且展示Tra1-81(绿色)的表达。图7B.将从四种不同血液供体纯化的细胞扩展3天、6天、9天或13天。使用表达L-myc的质粒DNA组合集合2，在不含饲养物的重编程方案中测试来自所有时间点或时间点子集的细胞群体。重编程效率计算为表现出ES细胞特有的形态特征和对Tra1-81染色呈阳性的能力的iPSC的总数量除以用于转染的细胞的总数量。黑方块描述了在指示时间点时表达CD34的群体的百分比。
图8A-8B-使用完全限定的试剂(不含动物成分(animal-free))的血细胞来源的iPSC。图8A.从多个供体汇集的CD34表达细胞在标准(n＝13)和完全限定的不含动物成分的培养基(n＝2)中扩展6天后的扩展倍数。扩展倍数由第6天时的细胞总数量除以纯化后一天的细胞数量来计算。百分比指示表达CD34的细胞在总群体中的分数。图8B.该图代表6孔板的1个孔，该孔含有在利用完全限定的不含动物成分的试剂重编程针对CD34表达富集的扩展细胞后，对碱性磷酸酶染色呈阳性的集落。
示例性实施方案的描述
I.绪论
本发明涉及用于提高外周血细胞重编程的全过程效率的方法和组合物。此种重编程可以在不含异种物质的或限定的条件下进行，并且可以实质上不含外源性逆转录病毒遗传元件，由此制得与临床更加相关的iPS细胞。
使用未明确限定的(ill-defined)系统和涉及依赖于染色体整合的基于病毒的方法的方法，iPS细胞的临床相关性的全面评估受到它们的起源的阻碍。例如，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)与已经在MEF的存在下条件化的重编程培养基一起经常被用作用于促进iPS发育的支持层。本发明人已发现重编程效率部分地受在不同批次之间可以有所变化的所用MEF的质量影响。因此很难控制和定量该差异性，因为MEF赋予重编程的贡献未明确限定。因此，优选建立易于操纵、独立于MEF的较明确限定的系统，以便结果具有更高的可预测性。多个实验室已经在使用不含饲养物的底物如MatrigelTM(小鼠起源)或其衍生物产生iPS细胞方面取得成功(Aasen和Belmonte，2010；Sun等人，2009)，但是它们都没有使用外周血细胞或不含异种物质的基质。
此外，基于病毒的重编程方法迄今为止已被证明比非整合方法更有效，因此更一致地用于产生iPS细胞。不幸地，携带编码已知癌基因如C-myc和T-抗原的表达盒的整合DNA的存在因为至少两个原因而不可接受。它们的存在总是造成在临床应用的限制标准范围内不能被容忍的那些基因的重激活和表达的威胁。由基于病毒的方法引发的整合也发生在多个往往不可预测的位置，其可能会破坏存在于宿主DNA内的内源基因的表达，该表达对于控制增殖或导致在下游分析中这些细胞的性能存在差异性的重要细胞过程是至关重要的。因此，使用限定条件产生iPS细胞的非整合策略将减轻这种潜在差异性。
为了提供患者特异性细胞以满足要求高的临床应用标准，iPS克隆必须从含有高分数的靶细胞的或者至少易于扩展的易处理的源物质产生，从不含饲养物的条件或化学限定的条件产生，并且可经由可跨越数百个样品扩展的工艺重编程。血液是从世界各地的患者常规提取的极容易获得的组织源，并且来自动员和未动员的血液供体的细胞已经成功地被整合病毒载体重编程(Loh等人，2009；Ye等人，2009)(PloS，出版中)。特别地，针对CD34表达富集的细胞已被证明能比成纤维细胞更有效地重编程。
然而，目前用于重编程CD34+细胞的方法不能满足临床应用所需的严格、不含异种物质的标准。首先，CD34+细胞仅构成未动员的外周血(仅1000个细胞/ml血液)的一小部分(0.1％)。其次，研究者依赖于基于病毒的方法，该方法需要整合到染色体DNA中的步骤。第三，公布的方法涉及MEF和条件化培养基，因此未明确限定并且含有异种污染物。
本发明部分地基于从外周血产生iPS细胞的完全限定的工艺的发现。如实施例中所示，提供了扩展来自少于10ml血液的CD34表达细胞的群体以及在不含整合DNA且最终不含染色体外DNA的无饲养物条件下产生iPS细胞的方法。
下面描述了本发明的进一步的实施方案和优势。
II.定义
“重编程”是这样的过程：其赋予细胞与没有重编程的相同条件下相比，可测量的增加的形成至少一种新细胞类型的能力(无论是在培养物中还是在体内)。更具体地，重编程是赋予体细胞多潜能潜力的过程。这意味着，在足够的增殖之后，可测量的比例的子代具有新细胞类型的表型特征(如果在重编程之前实质上没有此类子代能够形成)；或者，具有新细胞类型的特征的比例比重编程之前是可测量的增加。在某些条件下，具有新细胞类型的特征的子代比例可以是至少约1％、5％、25％或更高，按次序以渐增为优选。
当用于与培养基、细胞外基质或培养条件相关时，术语“不含异种物质(XF)”或“不含动物组分(ACF)”或“不含动物成分”是指实质上不含异质的动物来源的组分的培养基、细胞外基质或培养条件。为了培养人细胞，非人动物如小鼠的任何蛋白质都是异种组分。在某些方面，不含异种物质的基质可以实质上不含任何非人动物来源的组分，因此排除了小鼠饲养细胞或MatrigelTM。MatrigelTM是一种溶解型基底膜制剂，其是从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤(一种富含细胞外基质蛋白的肿瘤)中提取，从而包括层粘连蛋白(主要组分)、胶原蛋白IV、硫酸肝素蛋白多糖和内功素(entactin)/巢蛋白(nidogen)。
当用于与培养基、细胞外基质或培养条件相关时，术语“限定的”是指其中几乎所有组分的性质和量都是已知的培养基、细胞外基质或培养条件。
“化学限定的培养基”是指其中几乎所有成分的化学性质及它们的量都是已知的培养基。这些培养基也被称为合成培养基。化学限定的培养基的实例包括TeSRTM。
当细胞具有少于10％的如本文使用的外源遗传元件或载体元件时，所述细胞“基本上不含”所述的一种(多种)元件，而当细胞具有少于1％的外源遗传元件或载体元件时，所述细胞“实质上不含”所述的一种(多种)元件。然而，其中少于0.5％或少于0.1％的总细胞群体包含外源遗传元件或载体元件的细胞群体是甚至更合乎需要的。
当培养物、基质或培养基所具有的某些试剂如信号传导抑制剂、动物组分或饲养细胞的水平低于利用本领域普通技术人员已知的常规检测方法可检测的水平或者这些试剂没有从外部添加到培养物、基质或培养基中时，所述培养物、基质或培养基“实质上不含”这些试剂。
“外周血细胞”是指血液的细胞组分，包括在血液循环池中发现的红血细胞、白血细胞和血小板。
“造血祖细胞”或“造血前体细胞”是指定向于造血谱系但能够进一步造血分化的细胞，其包括造血干细胞、多潜能造血干细胞(成血细胞)、髓样祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴样祖细胞。造血干细胞(HSC)是多潜能干细胞，其产生所有的血细胞类型，包括髓样(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴样谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。造血祖细胞可以表达或可以不表达CD34。造血祖细胞可以共表达CD133并且对于CD38的表达呈阴性。在某些实施方案中，某些人造血祖细胞可以不表达CD34，但这些细胞仍可以通过本文公开的方法转化为iPS细胞。造血前体细胞包括CD34+/CD45+造血前体细胞和CD34+/CD45+/CD43+造血前体细胞。CD34+/CD43+/CD45+造血前体细胞可以针对髓样祖细胞高度富集。造血祖细胞的多个谱系，例如CD34+/CD43+/CD45+造血前体细胞，可以通过本文公开的方法转化为iPS细胞。造血祖细胞还包括原代造血细胞的多个子集，包括：CD34-/CD133+/CD38-(原代造血前体细胞)、CD43(+)CD235a(+)CD41a(+/-)(红细胞-巨核细胞生成性的)、lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(-)(多潜能)，以及lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(+)(偏髓样的)细胞、CD133+/ALDH+(醛脱氢酶)(例如，Hess等人2004；Christ等人，2007)。预想到：可以如本文描述的那样将这些原代造血细胞类型或造血前体细胞中的任一种转化为iPS细胞。
“载体”或“构建体”(有时称为基因递送或基因转移“媒介物”)是指大分子或分子复合物，其包含待在体外或体内递送到宿主细胞中的多核苷酸。载体可以是线性或环状分子。
“质粒”是常见类型的载体，是分离自染色体DNA的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA而复制。在某些情况下，它是环状的和双链的。
“表达构建体”或“表达盒”意思是能够指导转录的核酸分子。表达构建体至少包括启动子或功能上等同于启动子的结构。还可以包括另外的元件，例如增强子和/或转录终止信号。
当用于与细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸相关时，术语“外源的”是指通过人工方式被导入该细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸；或者当用于与细胞相关时，是指通过人工方式被分离并随后被导入其他细胞或导入生物体中的细胞。外源核酸可以来自不同的生物体或细胞，或者它可以是天然存在于生物体或细胞中的核酸的一个或多个另外的拷贝。外源细胞可以来自不同的生物体，或者它可以来自相同的生物体。通过非限制性举例来讲，外源核酸位于与天然细胞中的染色体位置不同的染色体位置上，或者其两侧是与在自然界发现的核酸序列不同的核酸序列。
术语“对应于”在本文中用于意指多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或一部分是同源的(即相同的，非严格进化相关)；或者多肽序列与参考多肽序列是相同的。与此对比，术语“互补于”在本文中用于意指互补序列与参考多核苷酸序列的全部或一部分是同源的。举例说明：核苷酸序列″TATAC″对应于参考序列″TATAC″并且互补于参考序列″GTATA″。
“编码”特定蛋白的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“区段”、“片段”或“转基因”是指：在体外或体内时，当被置于合适的调节序列控制下时，转录并且还任选地被翻译成基因产物例如多肽的核酸分子。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，核酸分子可以是单链的(即正义链)或双链的。编码区的边界由5′(氨基)末端的起始密码子和3′(羧基)末端的翻译终止密码子来确定。基因可以包括但不限于，来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列，以及合成的DNA序列。转录终止序列通常位于基因序列的3′端。
术语“细胞”在本文中以其在本领域中最宽的含义使用，是指活体，所述活体为多细胞生物体的组织的结构单元，被将其与外界隔离的膜结构环绕，具有自我复制的能力，并且具有遗传信息和用于表达它的机制。本文使用的“细胞”可以是天然存在的细胞或人工修饰的细胞(例如，融合细胞、遗传修饰的细胞等)。
如本文使用的术语“干细胞”是指能够自我复制和具有多潜能性的细胞。通常，干细胞可以使损伤的组织再生。本文的干细胞可以是但不限于，胚胎干(ES)细胞或组织干细胞(也称为组织特异性干细胞，或体干细胞)。任何可具有上述能力的人工产生的细胞(例如本文使用的融合细胞、重编程细胞等)都可以是干细胞。
“胚胎干(ES)细胞”是源自早期胚胎的多潜能干细胞。ES细胞首先于1981年建立，从1989年开始，其也被用于产生敲除小鼠。在1998年建立了人ES细胞，其目前正开始应用于再生医学。
与ES细胞不同，组织干细胞具有有限的分化潜力。组织干细胞存在于组织中的特定位置，并且具有未分化的细胞内结构。因此，组织干细胞的多潜能性通常低。组织干细胞具有较高的细胞核/细胞质比并且具有很少的细胞内细胞器。多数组织干细胞具有低的多潜能性、长的细胞周期和超出个体寿命的增殖能力。基于细胞所来源的位点，例如真皮系统、消化系统、骨髓系统、神经系统等，组织干细胞被分成多个类别。真皮系统中的组织干细胞包括表皮干细胞、毛囊干细胞等。消化系统中的组织干细胞包括胰腺(普通)干细胞、肝脏干细胞等。骨髓系统中的组织干细胞包括造血干细胞、间质干细胞等。神经系统中的组织干细胞包括神经干细胞、视网膜干细胞等。
“诱导性多潜能干细胞”通常简写为iPS细胞或iPSC，是指通过导入被称为重编程因子的某些因子以人工方式从非多潜能细胞制备的一类多潜能干细胞，所述非多潜能细胞通常是成年体细胞或末端分化的细胞，例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等。
“多潜能性”是指干细胞具有分化成构成一种或多种组织或器官或特别是三个胚层中的任一个胚层的所有细胞的潜力，所述三个胚层为：内胚层(胃内衬、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖道)或外胚层(表皮组织和神经系统)。如本文使用的“多潜能干细胞”是指可以分化成来源于三个胚层中的任一个胚层的细胞的细胞，例如，全能细胞或诱导性多潜能细胞的直接后代。
关于核酸分子的“可操作地连接”意指按照允许核酸分子转录的方式连接两种或更多种核酸分子(例如待转录的核酸分子、启动子和增强子元件)。关于肽和/或多肽分子的“可操作地连接”意指按照产生单一多肽链，即具有融合物的每种肽和/或多肽组分的至少一种性质的融合多肽的方式连接两种或更多种肽和/或多肽分子。特别地，融合多肽是嵌合的，即，由异源分子组成。
III.血细胞的重编程
为了从目前本领域通常使用的真皮成纤维细胞之外的替代来源提供iPS细胞，可以提供用于重编程包含外周血细胞的细胞群体的方法。还非常希望重编程容易获得并且暴露于环境诱变剂的可能性较小的血细胞。例如，收集并储存在血库中的外周血细胞可以用作自体或同种异体但组织相容的iPS细胞系的来源。更关键地，如果希望产生含有限制于血细胞并且仅在获得性血液学病症中被发现的体细胞突变的iPS细胞来调查它们的发病机理，那么重编程血细胞的能力是必需的。在某些实施方案中，扩展外周血细胞群体中的造血祖细胞以提供相当数量的用于进行重编程的起始细胞。因此，本发明中的从人血细胞的重编程代表一种从在培养时需要很少的操作时间的供体细胞建立iPS细胞的新方法。重编程来自人血液的细胞的能力将促进用于产生患者特异性干细胞的可靠方法的形成。
A.造血祖细胞
由于造血干细胞和造血祖细胞的重要的医学潜在意义，已经进行了实质性工作以试图改善从胚胎干细胞分化造血祖细胞的方法。在成人中，主要存在于骨髓中的造血干细胞产生活跃分裂的造血(CD34+)祖细胞的异质群体，所述祖细胞分化为血液系统的所有细胞。虽然预期到CD34+内皮细胞可以被转化为iPS细胞，但是在某些实施方案中，使用非内皮细胞的造血细胞可能是理想的；例如，在一些情况下，使用不表达CD31或VE-钙粘蛋白的造血祖细胞或造血前体细胞可能是理想的。其他标记，例如CD43和/或CD45标记，也可用于辅助鉴定造血祖细胞(例如，Kadaja-Saarepuu等人，2008；Vodyanik等人，2006)。造血祖细胞包括原代造血细胞的多个子集，包括：CD43(+)CD235a(+)CD41a(+/-)(红细胞-巨核细胞生成性的)、lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(-)(多潜能)，和lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(+)(偏髓样的)细胞。在成人中，造血祖细胞增殖并分化，导致每日产生数千亿成熟血细胞。造血祖细胞也存在于脐带血中。在体外，人胚胎干细胞可以分化为造血祖细胞。也可以从如下所述的外周血样品扩展或富集造血祖细胞。造血细胞可以来源于人、鼠科动物或任何其他哺乳动物物种。
造血祖细胞的分离包括任何选择方法，其包括细胞分选仪、使用抗体包被的磁珠进行的磁力分离、填充柱；亲和色谱法；联接至单克隆抗体或与单克隆抗体联用的细胞毒性剂，包括但不限于补体和细胞毒素；以及利用附连至固体基质例如板上的抗体进行的“淘选”，或任何其他常规技术。
分离和隔离技术的使用包括但不限于，基于物理性质(密度梯度离心和反流离心淘洗)、细胞表面性质(凝集素和抗体亲和性)，以及活体染色性质(线粒体结合染料rhol23和DNA结合染料Hoechst33342)的差异的那些。提供准确分离的技术包括但不限于FACS(荧光激活细胞分选)或MACS(磁激活细胞分选)，其可以具有不同程度的混杂(sophistication)，例如，多个颜色通道、低角和迟钝的光散射探测通道、阻抗通道(impedance channel)等。
在前述技术或用于评估细胞类型纯度的技术(如流式细胞术)中使用的抗体可以缀合至可鉴定试剂，所述可鉴定试剂包括但不限于酶、磁珠、胶体磁珠、半抗原、荧光染料、金属化合物、放射性化合物、药物或半抗原。可缀合至抗体的酶包括但不限于碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶和β-半乳糖苷酶。可缀合至抗体的荧光染料包括但不限于异硫氰酸荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明、藻红蛋白、别藻蓝蛋白和德克萨斯红(Texas Red)。对于可缀合至抗体的另外的荧光染料，参见Haugland，Molecular Probes：Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals(1992-1994)。可缀合至抗体的金属化合物包括但不限于铁蛋白、胶体金，特别是胶体的超顺磁性珠。可缀合至抗体的半抗原包括但不限于，生物素、地高辛(digoxygenin)、oxazalone，和硝基苯酚。可缀合或掺入到抗体中的放射性化合物是本领域已知的，包括但不限于锝99m(99TC)、125I和包含任何放射性核素的氨基酸，所述放射性核素包括但不限于14C、3H和35S。
可以采用允许准确分离的其他阳性选择技术，如亲和柱等。该方法应当允许除去非靶细胞群体的少于约20％，优选少于约5％的残余量。
可以基于光散射性质及细胞对各种细胞表面抗原的表达来选择细胞。根据FACS分析，纯化的干细胞具有低的侧向散射分布和低至中等的正向散射分布。Cytospin(细胞离心涂片机)制剂显示富集的干细胞具有介于成熟淋巴样细胞和成熟粒细胞之间的尺寸。
还可以在培养之前，使用例如Sutherland等人(1992)和描述于美国专利No.4,714,680中的方法富集CD34+细胞的接种群体。例如，对细胞进行阴性选择以除去表达谱系特异性标记的那些细胞。在示例性实施方案中，可以对细胞群体进行阴性选择，以消除非CD34+造血细胞和/或特定造血细胞子集。阴性选择可以基于多种分子的细胞表面表达进行，所述多种分子包括T细胞标记如CD2、CD4和CD8；B细胞标记如CD 10、CD19和CD20；单核细胞标记CD 14；NK细胞标记CD2、CD 16和CD56或任何谱系特异性标记。阴性选择可以基于多种分子的细胞表面表达进行，所述多种分子为例如可以用于经由MACS或柱分离来分离其他细胞类型的抗体混合物(例如，CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123和CD235a)。
如本文使用的谱系阴性的(LIN-)是指缺少至少一种与谱系定向细胞相关的标记的细胞，所述标记为例如与T细胞(如CD2、3、4和8)、B细胞(如CD10、19和20)、髓样细胞(如CD14、15、16和33)、自然杀伤(″NK″)细胞(如CD2、16和56)、RBC(如血型糖蛋白A)、巨核细胞(CD41)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞相关的标记，或其他标记如CD38、CD71和HLA-DR。优选谱系特异性标记包括但不限于，CD2、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD33、CD38、HLA-DR和CD71中的至少一种。更优选地，LIN-将包括至少CD 14和CD 15。进一步纯化可以通过对例如c-kit+或Thy-1+进行阳性选择来实现。进一步富集可以通过本领域已知的方法，通过使用线粒体结合染料罗丹明123和针对罗丹明+细胞的选择来获得。高度富集的组合物可以通过选择性分离作为CD34+，优选CD34+LIN-，最优选CD34+Thy-1+LIN-的细胞获得。干细胞高度富集的群体和获取它们的方法是本领域技术人员熟知的，参见，例如，描述于PCT/US94/09760、PCT/US94/08574和PCT/US94/10501中的方法。
可以采用各种技术分离细胞，通过初始去除专用谱系的细胞进行。单克隆抗体对于鉴定与特定细胞谱系和/或分化阶段相关的标记特别有用。可以将抗体附连至固体支持物以允许粗分离。采用的分离技术应当将使收集部分的成活力的保留最大化。可以采用具有不同功效的各种技术来获取“相对粗”的分离物。此类分离物是这样的分离物，其中所存在的总细胞中的最多10％，通常不超过约5％，优选不超过约1％是仍然与待保留细胞群体在一起的不期望细胞。采用的具体技术将取决于分离效率、相关的细胞毒性、执行的容易性和速度，以及对先进设备和/或技术技能的需要。
造血祖细胞的选择不必单独地利用对细胞有特异性的标记来实现。通过使用阴性选择和阳性选择的组合，可以获得富集的细胞群体。
B.血细胞来源
造血干细胞(HSC)通常产生于骨髓中，但可被迫使进入血液，该过程被称为动员，在临床上用于收获外周血中的大量HSC。选定的一种动员剂是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
可以通过血液成分分离技术，在无扰状态，或在从外部施用造血生长因子如G-CSF后进行动员之后，收集在外周血中循环的CD34+造血干细胞或祖细胞。在动员之后收集的干细胞或祖细胞的数量大于在无扰状态下在血液成分分离之后获得的数量。在本发明的具体方面，细胞群体的来源是其细胞未经外部施用的因子动员的受试者，因为无需在体内富集造血干细胞或造血祖细胞。
用于本文描述的方法中的细胞群体可以是哺乳动物细胞，例如人细胞、非人灵长类动物细胞、啮齿类动物细胞(例如小鼠或大鼠细胞)、牛科动物细胞、羊科动物细胞、猪科动物细胞、马科动物细胞、羊细胞、犬科动物细胞，和猫科动物细胞，或其混合物。非人灵长类动物细胞包括猕猴细胞。细胞可以获自动物，例如人患者，或者它们可以来自细胞系。如果细胞是获自动物，则它们可以用作此类，例如，未分离的细胞(即，混合群体)；它们可能首先已经例如通过转化建立在培养物中；或者它们可能已经经受初步纯化方法。例如，细胞群体可以基于细胞表面标记的表达通过阳性或阴性选择进行操纵；在体外或在体内用一种或多种抗原进行刺激；在体外或在体内用一种或多种生物修饰剂进行处理；或这些中的任一种或全部的组合。
细胞群体包括外周血单核细胞(PBMC)、含有混合群体的全血或其级分、脾细胞、骨髓细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、通过白细胞分离术获得的细胞、活组织检查组织、淋巴结，例如从肿瘤引流的淋巴结。合适的供体包括经免疫的供体、非免疫的(首次接受试验的)供体、经处理的或未经处理的供体。“经处理的”供体是已经暴露于一种或多种生物修饰剂的供体。“未经处理的”供体是未暴露于一种或多种生物修饰剂的供体。
例如，可以如根据本领域已知的方法描述的那样获得外周血单核细胞(PBMC)。此类方法的实施例在Kim等人(1992)；Biswas等人(1990)；Biswas等人(1991)中有讨论。
从细胞群体获取造血前体细胞的方法也是本领域熟知的。可以使用各种细胞因子如hSCF、hFLT3和/或IL-3扩展造血前体细胞(Akkina等人，1996)，或者可以使用MACS或FACS富集CD34+细胞。如上所述，也可使用阴性选择技术来富集CD34+细胞。
也可以从受试者获取细胞样品，然后针对所需的细胞类型对它进行富集。例如，可以如本文描述的那样从血液分离PBMC和/或CD34+造血细胞。也可以使用多种技术从其他细胞分离细胞，例如，使用结合至所需细胞类型的细胞表面上的表位的抗体来分离和/或激活。可以使用的另一种方法包括：使用针对细胞表面标记的抗体进行阴性选择，以选择性富集特定细胞类型而不通过受体的介入激活细胞。
骨髓细胞可以获自髂嵴、股骨、胫骨、脊骨、肋骨或其他骨髓腔。可以从患者取出骨髓并通过多种分离和洗涤程序分离。用于分离骨髓细胞的示例性程序包括以下步骤：a)将骨髓悬浮液离心分离为3个级分，并收集中间级分，或血沉棕黄层；b)在分离流体，通常Ficoll(Pharmacia Fine Chemicals AB的商标)中再离心来自步骤a)的棕黄层级分1次，并收集含有骨髓细胞的中间级分；以及c)洗涤所收集的来自步骤b)的级分以回收可再输送的骨髓细胞。
IV.培养条件
人多潜能干细胞研究是在现代生物学中最具活力的领域之一。通常获取人iPS细胞如人ES细胞并在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的饲养层下进行培养。例如，人多潜能干细胞的治疗潜力在于为由单个细胞类型的丧失或非功能丧失引起的病症如帕金森氏症和糖尿病移植分化的细胞类型。然而，这些临床引用目前受到在体外获取和繁殖阶段期间的异种物质污染影响。如传统上使用的小鼠饲养物或条件培养基带有引入非人病原体的风险，其将消除在将来移植的可能性。因而，缩小研究模型与临床引用之间的差距需要设计和实施不含异种物质的工艺。不含异种物质(XF；或不含动物组分，ACF；或不含动物成分)的培养条件，如不含异种物质的培养基和不含异种物质的细胞外基质是开发需要在人中的植入的再生干细胞疗法的基本要素。另外，重编程效率可能会受到所使用的MEF饲养细胞或任何动物来源的产品的差异性影响。
为了提高外周血中的造血祖细胞的总重编程效率并降低所述差异性，可以提供用于扩展造血祖细胞的各种不含饲养物、不含异种物质或限定的培养条件、基质或培养基，以及重编程此类细胞的方法。
A.造血祖细胞扩展条件
本发明的扩展方法可以包括将基本上富集于造血祖细胞中并且基本上不含基质细胞的细胞群体接种到扩展容器中并且于一定体积的适宜培养基中，使得细胞密度为至少约5,000个细胞/mL培养基，优选7,000至约200,000个细胞/mL培养基，更优选约10,000至约150,000个细胞/mL培养基，并且是在约1％至20％，优选低于8％的初始氧浓度下接种的。在一个实施方案中，初始氧浓度范围为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％，或从其导出的任意范围。
在一方面，接种的细胞群体来源于成年骨髓并且具有约7,000个细胞/mL至约20,000个细胞/mL，优选约20,000个细胞/mL的细胞密度。在单独的方面，接种的细胞群体来源于动员的外周血并且具有约20,000个细胞/mL至约50,000个细胞/mL，优选50,000个细胞/mL的细胞密度。在另一方面，接种的细胞群体来源于未动员的外周血并且具有约7,000个细胞/mL至约50,000个细胞/mL，优选约20,000个细胞/mL的细胞密度。
在本发明方法中可以使用任何适宜的扩展容器、烧瓶或合适的管，如24孔板、12.5cm2T烧瓶或透气袋。此类培养容器可购自Falcon、Corning或Costar。如本文使用的“扩展容器”还意图包括任何用于扩展细胞的腔室或容器，不论所述用于扩展细胞的腔室或容器是独立式的，还是并入到扩展设备如本文描述的生物反应器中。在一个实施方案中，扩展容器是由凹面和剩余细胞支承表面朝向的平面形成的腔室的减小的体积空间。
多种培养基可以用于扩展造血祖细胞。示例性培养基包括Dulbecco′s MEM、IMDM以及可补充多种不同营养物、生长因子、细胞因子等的RPMI-1640。该培养基可以不含血清或补充有适量的血清如胎牛血清或自体血清。优选地，为了用于人治疗，该培养基不含血清或补充有自体血清。一种适宜的培养基是含有以下的培养基：IMDM、有效量的蛋白胨、蛋白酶抑制剂和垂体提取物中的至少一种，以及有效量的人血清白蛋白或血浆蛋白质级分、肝素、还原剂、胰岛素、转铁蛋白和乙醇胺中的至少一种。在进一步的实施方案中，适宜的扩展培养基含有至少IMDM和1-15％的胎牛血清。其他适宜的培养基配方是本领域技术人员熟知的，参见例如美国专利No.5,728,581。
不管在任何给定造血祖细胞扩展中使用何种特定培养基，所使用的培养基都优选补充有浓度为约0.1ng/mL至约500ng/mL，更通常为10ng/mL至100ng/mL的至少一种细胞因子。适宜的细胞因子包括但不限于：c-kit配体(KL)(也称为青灰因子(StI)、肥大细胞生长因子(MGF)，和干细胞因子(SCF))、IL-6、G-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-1α、IL-11MIP-1α、LIF、c-mpl配体/TPO，和flk2/flk3配体(Flt2L或Flt3L)。(Nicola等人，1979；Golde等人，1980；Lusis，1981；Abboud等人，1981；Okabe，1982；Fauser等人，1981)。特别地，该培养物将包括SCF、Flt3L和TPO中的至少一种。更特别地，该培养物将包括SCF、Flt3L和TPO。
在一个实施方案中，细胞因子包含在培养基中并且通过培养基灌注来加以补充。或者，当使用生物反应器系统时，细胞因子可以作为浓缩溶液经由单独的入口单独地添加，而无需培养基灌注。当不经灌注添加细胞因子时，该细胞因子通常将作为10×至100×溶液以等于生物反应器中的体积的1/10至1/100的量添加，新鲜细胞因子约每2至4天添加。进一步地，除了在灌注培养基中的细胞因子之外，还单独添加新鲜的浓缩细胞因子。
然后在适宜条件下培养细胞，以便该细胞使培养基条件化。当直到培养前几天之后才更换培养基，例如才开始灌注时，可以改善纯化造血祖细胞的扩展。
在某些方面，适宜条件包含在33℃至39℃，优选在约37℃下培养(初始氧浓度优选为4-8％，最优选为约5％)至少6天，优选约7至约10天，以允许自分泌因子从细胞释放，而没有释放足够多的废物产品以至于大幅度抑制造血祖细胞扩展。在该时间之后，氧浓度可以在剩余的培养期内分步或逐渐增加至约20％，培养期总共可为10-28天。可以让骨髓干细胞、动员的外周血细胞或未动员的外周血细胞生长约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天或从其导出的任意范围的时间。
在未经历培养基更换的初始培养期后，可以以允许造血祖细胞扩展的速率更换培养基。在没有使用可变容积的系统中，可以在第7天(对于动员的外周血干细胞而言)或第10天(对于骨髓细胞而言)更换培养基。在灌注系统中的新鲜培养基的更换可以例如是层流(laminar)。这种均匀的非扰动的流阻止“死空间”的形成，在所述死空间中细胞的碎片没有暴露于培养基中。可以以约0.10/天至0.50/天，或每天更换1/10体积至1/2体积的速率更换培养基。例如，灌注速率可以为约0.25/天至0.40/天。更优选地，对于骨髓干细胞，灌注可以在约第14天开始以0.27/天的速率进行，而对于动员或未动员的外周血细胞，灌注在约第10天时以0.25/天的速率开始并在约第12天时增加至0.40/天。
特别地，可以在整个扩展过程中保持细胞浓度为最佳。例如，与仅扩展～10-20倍的单核细胞(MNC)群体相比，祖细胞可扩展多达～1500倍。祖细胞具有大的增殖能力，因此，当在封闭系统中进行培养时，此种系统必须提供对于总细胞扩展足够的体积。然而，祖细胞还可以具有相对高的接种密度。最佳的接种密度和增殖条件可以通过让细胞在诸如美国专利No.5,728,581中描述的生物反应器的生物反应器中生长来实现。可以将细胞以合适的细胞密度接种在凹陷部分处，并在达到合适的细胞密度时添加额外的培养基。该装置的形状可以允许培养基体积增加至多达三倍而没有大幅度降低对细胞的氧转移效率。
B.在重编程期间和之后的培养条件
起始细胞(意思是，待重编程的扩展的造血祖细胞)和终末重编程细胞一般对培养基和培养条件具有不同的要求。为了实现此要求，同时还允许该细胞发生重编程，可能需要一种或多种转换培养条件。为了启动重编程过程，可以将扩展的造血祖细胞在接种后转染至少、约或最多0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天或9天，更特别地在接种后转染3天、4天、5或6天，并且在示例性实施方案中，在接种后转染6天。在替代实施方案中，扩展步骤可能并不总是必需的。例如，如果直接从未动员的外周血的纯化中获得足够的造血祖细胞，那么可以在不存在扩展步骤的情况下启动重编程。然而，当处理小体积，例如最多10ml体积的外周血时，可使用扩展步骤来增加造血祖细胞的数量并由此增大重编程效率。
转染后立即以及作为在转染后稳定细胞的方式，将细胞培养在如上所述的造血祖细胞扩展培养基，或包含一种或多种有利于重编程细胞的培养的细胞因子和信号抑制剂的培养基，或该两类条件的混合物(等量或以其他方式混合)中，所有这些培养基都最佳地为不含异种物质的培养基。不管使用何种培养基，该条件都可以实质上不含任何基质组分或它可以包含基质，该基质优选为不含异种物质的基质蛋白如纤连蛋白片段。此种培养条件可以处在转染后的至少、约，或最多前0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、24小时或从其导出的任意范围的时间段。然后，如果细胞尚未在基质上，则可以将细胞转换到基质中，并在如上所述的造血祖细胞扩展培养基或有利于细胞重编程的培养基或这两类条件的混合物(等量或以其他方式混合)中培养该细胞，所有这些培养基都最佳地为不含异种物质的培养基。不管使用何种培养基，都在一天或两天内逐渐转换细胞，将每种培养基更新成100％重编程培养基，此种重编程条件可以在转染稳定温育之后持续至少、约或最多1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天。
在使用所公开的方法将重编程因子导入细胞中并如上面所述的那样培养之后，可以将所得细胞转移到足以维持细胞的多潜能性的培养基如TeSR2中。此种条件可以优选地在重编程条件的后半部分期间通过在不去除培养基的情况下将TeSR2(或相似的多潜能细胞培养基)加入到重编程培养基中来逐渐获得，接着完全替换，使得细胞培养在100％多潜能细胞培养基中。包括逐渐转换期在内的细胞在多潜能细胞培养基中的培养可以在100％重编程条件之后持续至少、约或最多1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天。这种多潜能细胞培养条件可以包含细胞外基质，因为多潜能干细胞是粘附细胞。
已经使用在MEF饲养物上的传统含血清培养基。在某些方面，本发明消除了对血清或MEF饲养细胞的需要，并且提供了用于重编程细胞的限定工艺和条件。
在本发明中产生的诱导性多潜能干(iPS)细胞的培养可以使用开发用于培养灵长类动物多潜能干细胞，更具体地，胚胎干细胞的各种培养基和技术，如美国专利申请20070238170和美国专利申请20030211603中描述的。应理解，如技术人员将会知晓的用于培养和维持人多潜能干细胞的另外的方法可以与本发明一起使用。
优选可以不使用未限定的条件；例如，可以不在成纤维细胞饲养细胞或已暴露于成纤维细胞饲养细胞，尤其小鼠饲养细胞的培养基上培养重编程细胞。例如，可以使用限定的非饲养物依赖性培养系统如TeSR培养基，将多潜能细胞培养和维持在实质上未分化的状态(Ludwig等人，2006；Ludwig等人，2006)。可以使用非饲养物依赖性培养系统和培养基培养重编程细胞。这些设备允许重编程细胞在实质上未分化的状态上生长，而不需要小鼠成纤维细胞“饲养层”。如本文描述的，可以根据需要对这些方法做出各种修改以降低成本。
根据本发明某些方面的培养基可以使用用于培养动物细胞的培养基作为它的基础培养基来制备，所述的用于培养动物细胞的培养基为例如TeSR、BME、BGJb、CMRL 1066、Glasgow MEM、ImprovedMEM Zinc Option、IMDM、Medium 199、Eagle MEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI1640和Fischer′s培养基以及其任何组合中的任一种，但是该培养基并不特别局限于此，只要它可以用于培养动物细胞即可。特别地，该培养基可以是不含异种物质或化学限定的培养基。
根据本发明的培养基可以是含有血清的培养基或不含血清的培养基。不含血清的培养基是指不含未经加工或未经纯化的血清的培养基，并且因此可以包括含有纯化的血液来源的组分或动物组织来源的组分(如生长因子)的培养基。从阻止被异质的动物来源的组分污染的角度而言，血清可以来源于与一种(多种)干细胞的动物相同的动物。
根据本发明的培养基可以含有或可以不含任何血清替代品。血清替代品可以包括适当地含有以下物质的材料：白蛋白(如富含脂质的白蛋白、白蛋白代用品如重组白蛋白、植物淀粉、葡聚糖和蛋白水解物)、转铁蛋白(或其他铁转运体)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3′-硫醇甘油，或其等同物。血清替代品可以通过例如国际公开No.98/30679中公开的方法制备。或者，为了更方便，可以使用任何市售材料。市售材料包括敲除血清替代物(knockoutSerum Replacement)(KSR)、化学限定的浓缩脂质(Chemically-defined Lipid concentrated)(Gibco)，和Glutamax(Gibco)。
本发明的培养基还可以含有脂肪酸或脂质、氨基酸(如非必需氨基酸)、一种(多种)维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化物质、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂和无机盐。2-巯基乙醇的浓度可以为，例如，约0.05mM至1.0mM，更特别地为约0.1mM至0.5mM，但是该浓度并不特别局限于此，只要它适合于培养一种(多种)干细胞即可。
用于培养一个(多个)细胞的培养器皿可以包括，但不特别局限于：瓶、组织培养瓶、皿、皮氏培养皿、组织培养皿、多皿(multi dish)、微板、微孔板、多板(multi plate)、多孔板、微玻片、腔室玻片、管、盘、
Figure BDA00002587008000311
Chamber、培养袋，和转瓶，只要它能够培养其中的干细胞即可。可以在至少或约0.2ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml、10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml、550ml、600ml、800ml、1000ml、1500ml，或从其导出的任意范围的体积中培养细胞，这取决于培养需要。在某个实施方案中，培养器皿可以是生物反应器，该生物反应器可以指支持生物活性环境的任何装置或系统。生物反应器可以具有至少或约2升、4升、5升、6升、8升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、150升、200升、500升、1立方米、2立方米、4立方米、6立方米、8立方米、10立方米、15立方米，或从其导出的任意范围的体积。
培养器皿可以是细胞粘附性或非粘附性培养器皿，根据目的来选择。可以使用任何用于细胞粘附的底物例如细胞外基质(ECM)来包被细胞粘附性培养器皿以改善器皿表面对细胞的粘附。用于细胞粘附的底物可以是旨在附着细胞的任何材料。用于细胞粘附的底物包括胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白和纤连蛋白，以及它们的片段或混合物。
其他培养条件可以被适当地限定。例如，培养温度可以是约30℃至40℃，例如，至少或约31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃，但不特别限定于这些。CO2的浓度可以是约1％至10％，例如约2％至5％，或从其导出的任意范围的浓度。氧分压可以是至少、最多或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％，或从其导出的任意范围的氧分压。
本发明的方法也可用于诸如重编程细胞或干细胞的细胞的悬浮培养，包括在载体上的悬浮培养(Fernandes等人，2004)或凝胶/生物聚合物封装的悬浮培养(美国专利公开2007/0116680)。术语细胞的悬浮培养意指就培养器皿或培养基中的饲养细胞(如果使用的话)而言，在非粘附条件下培养细胞。细胞的悬浮培养包括细胞的解离培养和细胞的聚集体悬浮培养。术语细胞的解离培养意指培养悬浮的干细胞，干细胞的解离培养包括单一细胞或由多个细胞(例如，约2至400个细胞)组成的小细胞聚集体的解离培养。当前述解离培养继续进行时，培养的、解离的干细胞可以形成较大的细胞聚集体，此后可以进行聚集体悬浮培养。聚集体悬浮培养包括类胚体培养方法(参见Keller等人，1995)和SFEB方法(Watanabe等人，2005；国际公开No.2005/123902)。
C.基质组分
各种限定的基质组分可以用于重编程外周血细胞以用作用于粘附细胞培养的底物。例如，重组胶原蛋白IV、纤连蛋白，层粘连蛋白和玻连蛋白的组合可以用于包被培养表面，作为提供供多潜能细胞生长用的固体支持物，如Ludwig等人(2006a；2006b)中描述的，该文献通过引用完整地并入。
可以将基质组合物固定在表面上以提供细胞支持物。基质组合物可以包括一种或多种细胞外基质(ECM)蛋白和水性溶剂。术语“细胞外基质”是本领域中认可的。它的组分包括下列蛋白中的一种或多种：纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、肌腱蛋白、内功素、血小板反应蛋白、弹性蛋白、明胶、胶原蛋白、原纤蛋白、分区蛋白、锚定蛋白、软骨粘连蛋白、连接蛋白、骨涎蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白、外连蛋白(epinectin)、透明质粘连蛋白(hyaluronectin)、粗纤维调节素(undulin)、表皮整联配体蛋白(epiligrin)，以及缰蛋白。其他细胞外基质蛋白描述于Kleinman等人，(1993)中，该文献通过引用并入本文。意图术语“细胞外基质”包括可能在将来被发现的目前未知的细胞外基质，因为它的作为细胞外基质的表征可容易地被本领域技术人员确定。
在一些方面，基质组合物中的总蛋白浓度可以为约1ng/mL至约1mg/mL。在一些优选的实施方案中，基质组合物中的总蛋白浓度为约1μg/mL至约300μg/mL。在更优选的实施方案中，基质组合物中的总蛋白浓度为约5μg/mL至约200μg/mL。
细胞外基质(ECM)蛋白可以是天然来源的，并且可以从人或动物组织中纯化出来。或者，ECM蛋白可以是基因工程化重组蛋白或者在性质上是合成的。ECM蛋白可以是全蛋白或者原态或工程化的肽片段形式。可用于细胞培养基质中的ECM蛋白的实例包括层粘连蛋白、I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白。在一些实施方案中，基质组合物包括合成产生的纤连蛋白或重组纤连蛋白的肽片段。
在又一些进一步实施方案中，基质组合物包括至少纤连蛋白和玻连蛋白的混合物。
在一些其他实施方案中，基质组合物优选包括层粘连蛋白。
基质组合物优选包括单一类型的细胞外基质蛋白。在一些优选的实施方案中，基质组合物包括纤连蛋白，特别是用于与培养重编程细胞或造血祖细胞一起使用的纤连蛋白。例如，合适的基质组合物可以通过将人纤连蛋白如由Becton，Dickinson&Co.of Franklin Lakes，N.J.(BD)销售的人纤连蛋白(Cat#354008)在杜氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco′s phosphate buffered saline)(DPBS)中稀释至蛋白浓度为5μg/mL至约200μg/mL来制备。在特定实施例中，基质组合物包括纤连蛋白片段，如
Figure BDA00002587008000331
是～63kDa蛋白质(574个氨基酸)，其含有中央细胞结合结构域(III型重复，8、9、10)、高亲和性的肝素结合结构域II(III型重复，12、13、14)，以及在人纤连蛋白的选择性剪接IIICS区内的CS1位点。
在一些其他实施方案中，基质组合物优选包括层粘连蛋白。例如，合适的基质组合物可以通过将层粘连蛋白(Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)；Cat#L6274和L2020)在杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中稀释至蛋白质浓度为5μg/ml至约200μg/ml来制备。
在一些实施方案中，基质组合物不含异种物质，因为基质或它的组分蛋白仅来源于人。这可能是某些研究应用所需要的。例如在用于培养人细胞的不含异种物质的基质中，可以使用人来源的基质组分，其中任何非人动物组分可被排除。在某些方面，可以不将MatrigelTM作为用于重编程为人iPS细胞的底物。MatrigelTM是由小鼠肿瘤细胞分泌的胶质蛋白混合物，并且可商购自BD Biosciences(New Jersey，USA)。这种混合物与在许多组织中被发现的复杂的细胞外环境相似，并且经常被细胞生物学家用作细胞培养底物，但是它可能会引起不希望的异种抗原或污染物。
D.用于重编程的信号传导抑制剂
在本发明的某些方面，在至少一部分重编程过程中，可以在存在或不存在一种或多种信号传导抑制剂的情况下维持细胞，所述信号传导抑制剂抑制信号传导级联中所涉及的信号转导子，例如，在MEK抑制剂、GSK3抑制剂、TGF-β受体抑制剂，和/或肌球蛋白II ATP酶抑制剂，或这些相同通路内的其他信号转导子的抑制剂的存在下维持细胞。在某些方面，ROCK抑制剂如HA-100或H1152可用于促进重编程细胞和所得到的iPS细胞的克隆扩展。高浓度的FGF与特定重编程培养基如条件化的人ES细胞培养基或不含血清的N2B27培养基的组合也可用于增大重编程效率。在优选的方面，该培养基是限定培养基或不含异种物质的培养基。
在某些实施方案中，除了通过外源性游离遗传元件向细胞中导入重编程因子(例如2种、3种或更多种，如本文所描述)之外，用包含MEK抑制剂、TGF-β受体抑制剂、GSK3抑制剂、肌球蛋白IIATP酶抑制剂，和/或LIF的重编程培养基处理细胞，其优点在于，例如，改善重编程效率和动力学，并促进原代重编程培养物中iPS细胞的鉴定，从而保存iPS细胞的克隆形成能力(clonality)。
应理解，在这些方面和实施方案中，可以视需要用抑制相同信号传导通路(例如ERK1或ERK2级联)的信号传导组分的其他信号传导抑制剂替换MEK抑制剂。这可以包括抑制MAPK通路的上游刺激物，特别是通过FGF受体抑制MAPK通路的上游刺激物(Ying，2008)。同样，可以视需要将GSK3抑制剂替换为GSK3相关的信号传导通路如胰岛素合成和Wnt/β-连环蛋白信号传导的其他抑制剂；可以视需要将LIF替换为Stat3或gp130信号传导的其他激活子。
此种信号传导抑制剂，例如MEK抑制剂、GSK3抑制剂、TGF-β受体抑制剂可以以至少或约0.02μM、0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、100μM、150μM、200μM、500μM至约1000μM的有效浓度或从其导出的任意范围的有效浓度使用。
本领域技术人员可以通过常规方式或从常规来源提供或获得抑制剂(另参见WO2007113505)。
1.糖原合酶激酶3抑制剂
糖原合酶激酶3(GSK-3)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其介导磷酸分子被添加至特定细胞底物中的某些丝氨酸和苏氨酸氨基酸上。GSK-3对这些其他蛋白的磷酸化通常会抑制靶蛋白(也称为“底物”)。如所提及的，已知GSK-3磷酸化糖原合酶并因此使其灭活。它还参与控制针对受损DNA的细胞反应和Wnt信号传导。GSK-3还在Hedgehog(Hh)通路中使Ci磷酸化，使它靶向于蛋白水解为无活性形式。除了糖原合酶之外，GSK-3还具有许多其他底物。然而，GSK-3在激酶中与众不同之处在于，它通常需要“引发激酶(primingkinase)”以首先使底物磷酸化。
GSK-3磷酸化的后果通常是抑制底物。例如，当GSK-3使它的另一底物，转录因子的NFAT家族，磷酸化时，这些转录因子不能转位至细胞核，并因此被抑制。除了它在Wnt信号传导通路中的重要作用(这对于在发育过程中建立组织式样是必需的)以外，GSK-3对于在诸如骨骼肌肥大的环境中被诱导的蛋白合成也是关键性的。它作为NFAT激酶的作用也使它成为分化和细胞增殖两者的关键调节器。
GSK3抑制可以指对一种或多种GSK3酶的抑制。GSK3酶家族是熟知的，并且许多变体已被描述(参见，例如，Schaffer等人，2003)。在具体实施方案中，GSK3-β被抑制。GSK3-α抑制剂也是适宜的，并且在某些方面，用于本发明的抑制剂抑制GSK3-α和GSK3-β二者。
GSK3的抑制剂可以包括结合GSK3的抗体、GSK3的显性阴性变体，以及靶向GSK3的siRNA和反义核酸。GSK3抑制剂的实例描述于Bennett等人(2002)和Ring等人(2003)。
GSK3抑制剂的具体实例包括但不限于：Kenpaullone、1-Azakenpaullone、CHIR99021、CHIR98014、AR-A014418(参见例如，Gould等人，2004)、CT 99021(参见例如，Wagman，2004)、CT20026(参见，Wagman，见上文)、SB415286、SB216763(参见例如，Martin等人，2005)、AR-A014418(参见例如，Noble等人，2005)、锂(参见例如，Gould等人，2003)、SB 415286(参见例如，Frame等人，2001)和TDZD-8(参见例如，Chin等人，2005)。可从Calbiochem获得的进一步示例性GSK3抑制剂(参见例如，Dalton等人，WO2008/094597，通过引用并入本文)，包括但不限于：BIO(2′Z，3′￡)-6-bromomdirubm-3′-肟(GSK3抑制剂IX)、BIO-丙酮肟(2′Z，3′E)-6-溴代靛玉红-3′-丙酮肟(GSK3抑制剂X)、(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺(GSK3-抑制剂XIII)、吡啶卡巴唑-环戊二烯基钌复合物(GSK3抑制剂XV)、TDZD-84-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮(GSK3β抑制剂I)、2-硫代(3-碘苄基)-5-(1-吡啶基)-[1，3，4]-噁二唑(GSK3β抑制剂II)、OTDZT 2，4-二苄基-5-氧代噻二唑烷-3-硫酮(GSK3β抑制剂III)、α-4-二溴乙酰苯(GSK3β抑制剂VII)、AR-AO 14418 N-(4-甲氧基苄基)-N′-(5-硝基-1，3-噻唑-2-基)脲(GSK-3β抑制剂VIII)、3-(1-(3-羟基丙基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2，5-二酮(GSK-3β抑制剂XI)、TWS1 19吡咯并嘧啶化合物(GSK3β抑制剂XII)、L803H-KEAPPAPPQSpP-NH2或其肉豆蔻酰化形式(GSK3β抑制剂XIII)、2-氯-1-(4，5-二溴-噻吩-2-基)-乙酮(GSK3β抑制剂VI)、AR-AO144-18、SB216763，和SB415286。
GSK3抑制剂可以激活例如Wnt/β-连环蛋白通路。许多β-连环蛋白下游基因共调节多潜能性基因网络。例如，GSK抑制剂激活cMyc表达并增强它的蛋白稳定性和转录活性。因此，在一些实施方案中，GSK3抑制剂可用于刺激细胞中的内源性Myc多肽的表达，由此消除诱导多潜能性对于Myc表达的需求。
另外，已经表征了GSK3-β的活性位点的结构，并鉴定了与特异性和非特异性抑制剂相互作用的关键残基(Bertrand等人，2003)。这种结构表征使得另外的GSK抑制剂能够容易鉴定。
本文使用的抑制剂优选对所要靶向的激酶有特异性。某些实施方案的抑制剂对GSK3-β和GSK3-α有特异性，基本上不抑制erk2，并且基本上不抑制cdc2。优选地，相对于小鼠erk2和/或人cdc2，所述抑制剂对于人GSK3具有至少100倍、更优选至少200倍、非常优选至少400倍的选择性，如通过IC50值的比率测得的；此处，所提及的GSK3 IC50值是指对于人GSK3-β和GSK3-α的平均值。已经使用对GSK3有特异性的CHIR99021获得了良好的结果。使用CHIR99021的适宜的浓度范围是0.01微摩尔至100微摩尔，优选0.1微摩尔至20微摩尔，更优选0.3微摩尔至10微摩尔。
2.MEK抑制剂
MEK抑制剂，包括有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶(MAPK/ERK激酶或MEK)或其相关信号传导通路如MAPK级联的抑制剂，可用于本发明的某些方面。有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶(sic)是使有丝分裂原激活的蛋白激酶磷酸化的激酶。它也被称为MAP2K。细胞外刺激物导致MAP激酶通过信号传导级联(“MAPK级联”)被激活，所述级联由以下组成：MAP激酶、MAP激酶激酶(MEK、MKK、MEKK或MAP2K)和MAP激酶激酶激酶(MKKK或MAP3K)。
本文中的MEK抑制剂一般是指MEK抑制剂。因此，MEK抑制剂是指蛋白激酶的MEK家族的成员的任何抑制剂，所述MEK家族的成员包括MEK1、MEK2和MEK5。还提及了MEK1、MEK2和MEK5抑制剂。适宜的MEK抑制剂的本领域已知的实例包括：MEK1抑制剂PD184352和PD98059、MEK1和MEK2的抑制剂U0126和SL327，以及如Davies等人(2000)中所讨论的那些。
特别地，已经发现PD184352和PD0325901与其他已知的MEK抑制剂相比具有高度的特异性和效价(Bain等人，2007)。其他MEK抑制剂和MEK抑制剂的类别描述于Zhang等人(2000)。
MEK的抑制剂可以包括：MEK的抗体、MEK的显性阴性变体，以及抑制MEK表达的siRNA和反义核酸。MEK抑制剂的具体实例包括但不限于：PD0325901(参见，例如，Rinehart等人，2004)、PD98059(可以获自例如Cell Signaling Technology)、U0126(可以获自例如Cell Signaling Technology)、SL327(可获自例如Sigma-Aldrich)、ARRY-162(可获自例如Array Biopharma)、PD184161(参见，例如，Klein等人，2006)、PD184352(CI-1040)(参见，例如，Mattingly等人，2006)、舒尼替尼(sunitinib)(参见，例如，Voss，等人，US2008004287，通过引用并入本文)、索拉非尼(sorafenib)(参见，Voss，见上文)、凡德他尼(Vandetanib)(参见，Voss见上文)、帕唑帕尼(pazopanib)(参见，例如，Voss见上文)、阿西替尼(Axitinib)(参见，Voss见上文)和PTK787(参见，Voss见上文)。
目前，有几种MEK抑制剂正处于临床试验评价中。CI-1040已在针对癌症的I期和II期临床试验中进行评价(参见，例如Rinehart等人，2004)。处于临床试验评价中的其他MEK抑制剂包括PD184352(参见，例如，English等人，2002)、BAY 43-9006(参见，例如，Chow等人，2001)、PD-325901(也称为PD0325901)、GSK1120212、ARRY-438162、RDEA1 19、AZD6244(也称为ARRY-142886或ARRY-886)、RO5126766、XL518和AZD8330(也称为ARRY-704)。
可以使用RNA介导的干扰(RNAi)方便地实现MEK的抑制。通常，将互补于全部或部分MEK基因的双链RNA分子导入多潜能细胞中，由此促进编码MEK的mRNA分子的特异性降解。这种转录后机制导致所靶向的MEK基因的表达减少或消除。使用RNAi实现MEK抑制的适宜技术和方案是已知的。
用于鉴定激酶抑制剂(包括GSK3抑制剂和MEK抑制剂)的许多测定法是已知的。例如，Davies等人(2000)描述了这样的激酶测定法：其中在存在肽底物和放射性标记的ATP的情况下温育激酶。激酶引起的底物磷酸化导致标记被掺入底物中。将等分的每种反应液固定于磷酸纤维素纸上并在磷酸中洗涤以除掉游离ATP。然后测量温育之后的底物活性并提供激酶活性的指示。使用此类测定法可以容易地确定在存在和不存在候选激酶抑制剂的情况下的相对激酶活性。Downey等人(1996)还描述了可用于鉴定激酶抑制剂的激酶活性测定法。
3.TGF-β受体抑制剂
TGF-β受体抑制剂可以包括一般性的TGF信号传导的任何抑制剂或对TGF-β受体(例如ALK5)有特异性的抑制剂，其可以包括：针对TGF-β受体(例如ALK5)的抗体、TGF-β受体(例如ALK5)的显性阴性变体，和抑制TGF-β受体(例如ALK5)的表达的siRNA和反义核酸。示例性TGFβ受体/ALK5抑制剂包括但不限于：SB431542(参见，例如，Inman等人，2002)、也被称为3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺的A-83-01(参见，例如，Tojo等人，2005，可从例如Toicris Bioscience购得)、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1，5-萘啶、Wnt3a/BIO(参见，例如，Dalton，等人，WO2008/094597，通过引用并入本文)、BMP4(参见，Dalton，见上文)、GW788388(-(4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑4-基]吡啶-2-基}-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺)(参见，例如，Gellibert等人，2006)、SMl6(参见，例如，Suzuki等人，2007)、IN-1130(3-((5-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(喹噁啉-6-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)苯甲酰胺)(参见，例如，Kim等人，2008)、GW6604(2-苯基-4-(3-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶)(参见，例如，de Gouville等人，2006)、SB-505124(2-(5-苯并[1，3]二噁唑-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐)(参见，例如，DaCosta等人，2004)和嘧啶衍生物(参见，例如，在Stiefl等人，WO2008/006583中列出的那些，其通过引用并入本文)。
进一步地，虽然“ALK5抑制剂”不意图包括非特异性激酶抑制剂，但是“ALK5抑制剂”应被理解为包括：除了抑制ALK5之外，还抑制ALK4和/或ALK7的抑制剂，例如SB-431542(参见，例如Inman等人，2002)。不希望限制本发明的范围，据信ALK5抑制剂会影响间充质至上皮的转化/转换(MET)过程。TGFβ/活化素通路是上皮至间充质转换(EMT)的驱动器。本发明人考虑到：抑制TGFβ/活化素通路可以促进MET(即重编程)过程。
据信抑制TGFβ/活化素通路将具有相似的效应。因此，TGFβ/活化素通路(例如，上游或下游)的任何抑制剂可与如本文描述的TGF-β/ALK5抑制剂联合使用或替代所述TGF-β/ALK5抑制剂。示例性TGFβ/活化素通路抑制剂包括但不限于：TGFβ受体抑制剂、SMAD 2/3磷酸化抑制剂、SMAD 2/3和SMAD 4相互作用的抑制剂，以及SMAD6和SMAD7的激活剂/激动剂。此外，本文描述的类别仅是为了组编目的，本领域技术人员将知晓化合物可以影响通路内的一个或多个点，因此，化合物可能按照不止一个所定义的类别来发挥作用。
TGFβ受体抑制剂可以包括：针对TGFβ受体的抗体、TGFβ受体的显性阴性变体，以及靶向TGFβ受体的siRNA或反义核酸。抑制剂的具体实例包括但不限于：SU5416、2-(5-苯并[1，3]二噁唑-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐(SB-505124)、乐德木单抗(lerdelimumb)(CAT-152)、美替木单抗(metelimumab)(CAT-192)、GC-1008、IDl 1、AP-12009、AP-11014、LY550410、LY580276、LY364947、LY2109761、SB-505124、SB-431542、SD-208、SM16、NPC-30345、Ki26894、SB-203580、SD-093、Gleevec、3，5，7，2’，4’-五羟基黄酮(Morin)、活化素-M108A、P144、可溶性的TBR2-Fc，以及靶向TGFβ受体的反义转染的肿瘤细胞(参见，例如Wrzesinski等人，2007；Kaminska等人，2005；和Chang等人，2007)。
4.ROCK抑制剂
多潜能干细胞，尤其是人ES细胞和iPS细胞，在细胞脱附和解离之后易于发生凋亡，这对于克隆分离或扩展和分化诱导具有重要意义。最近已发现一小类分子可增加解离的多潜能干细胞的克隆效率和存活，例如Rho相关激酶(ROCK)抑制剂，其为ROCK相关的信号传导通路的抑制剂，例如Rho特异性抑制剂、ROCK特异性抑制剂，或肌球蛋白II特异性抑制剂。在本发明的某些方面，ROCK抑制剂可用于多潜能干细胞的培养和传代和/或干细胞的分化。因此，ROCK抑制剂可存在于多潜能干细胞在其中生长、解离、形成聚集体或经历分化的任何细胞培养基中，例如粘附培养物或悬浮培养物。
ROCK信号传导通路可以包括Rho家族GTP酶；ROCK，Rho下游的主要效应子激酶；肌球蛋白II，ROCK下游的主导效应子(Harb等人，2008)；以及任何中间体、上游或下游信号处理器。ROCK可以使肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(MYPT1)磷酸化和失活，肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(MYPT1)是通过肌球蛋白调节轻链(MRLC)的去磷酸化来阴性地调节肌球蛋白功能的ROCK的主要下游靶标之一。
ROCK是丝氨酸/苏氨酸激酶，其充当Rho(其具有三种同种型-RhoA、RhoB和RhoC)的靶蛋白。这些激酶最初被当作RhoA诱导的应激纤维和局灶性粘连的形成的介导子。两种ROCK同种型-ROCK1(p160ROCK，也称为ROKβ)和ROCK2(ROKα)-由N-末端激酶结构域及接在其后的卷曲螺旋结构域(含有Rho结合结构域和pleckstrin(血小板-白细胞C激酶底物)同源性结构域(PH))组成。这两种ROCK都是介导RhoA对应激纤维形成、平滑肌收缩、细胞粘附、膜起皱和细胞运动的效应的细胞骨架调节器。ROCK可以通过靶向下游分子，如肌球蛋白II、肌球蛋白轻链(MLC)、MLC磷酸酶(MLCP)及磷酸酶和紧张素同源物(PTEN)而发挥它们的生物学活性。
ROCK抑制剂的非限制性实例包括：HA-100、Y-27632、H-1152、Fasudil(也称为HA1077)、Y-30141(描述于美国专利5,478,838)、Wf-536、HA-1077、羟基-HA-1077、GSK269962A、SB-772077-B、它们的衍生物，以及针对ROCK的反义核酸、RNA干扰诱导核酸(例如，siRNA)、竞争性肽、拮抗剂肽、抑制性抗体、抗体-ScFV片段、它们的显性阴性变体和表达载体。进一步地，由于已知其他小分子化合物为ROCK抑制剂，因此此类化合物或其衍生物也可用于实施方案中(例如，参考美国专利公开No.20050209261、20050192304、20040014755、20040002508、20040002507、20030125344和20030087919，以及国际专利公开No.2003/062227、2003/059913、2003/062225、2002/076976和2004/039796，其通过引用并入本文)。在本发明的某些方面，也可以使用该ROCK抑制剂中的一种或两种或更多种的组合。
在本发明的某些方面，Rho特异性抑制剂，例如肉毒梭菌(clostridium botulinum)C3胞外酶，和/或肌球蛋白(Myosin)II特异性抑制剂也可用作ROCK抑制剂。
E.低氧条件
可以在重编程之前的整个扩展阶段中使用低氧，以利于类似于祖细胞的状态的维持并有可能利于至少一部分重编程阶段。首先，当细胞扩展时，它们往往从较类似于祖细胞的状态逐渐偏离而变得更加分化(即，CD34表达水平随着时间的推移而降低)。低氧条件模拟造血祖细胞(HP)特有的微环境并且似乎减慢祖细胞的分化(Eliasson和Jonsson，2010)。本文中使用的低氧可以为约2％的水平或者可以在约1-7％的范围内。在进一步方面，也可以在重编程阶段中使用低O2以促进iPS形成(Yoshida等人，2009)。
V.游离遗传元件(Episomal genetic element)
在本发明的某些方面，从包含在一种或多种外源性游离遗传元件中的表达盒表达重编程因子(参见美国专利公开No.2010/0003757和美国专利申请No.61/258,120，其通过引用并入本文)。
已经使用用于异位表达重编程基因的逆转录病毒或慢病毒载体实现从人体细胞对多潜能干细胞的诱导。重组逆转录病毒如莫洛尼鼠白血病病毒具有以稳定方式整合到宿主基因组中的能力。它们含有逆转录酶，该酶允许整合到宿主基因组中。慢病毒是逆转录病毒的亚类。由于它们具有整合到非分裂细胞和分裂细胞的基因组中的能力，因此它们广泛地适合用作载体。当病毒进入细胞时，RNA形式的病毒基因组被逆转录以产生DNA，然后DNA通过病毒整合酶被插入基因组的随机位置。因此，目前的成功重编程技术依赖于基于整合的病毒途径。
然而，使用目前的技术，靶向整合仍然不是常规的(Bode等人，2000)，常规替代方式，即随机整合，可能会在诱导性多潜能干细胞中导致插入诱变，其具有不可预测的后果。由于相同的原因，转基因的表达不能被控制，因为它依赖于整合位点的染色质环境(Baer等人，2000)。只能在有利的基因座实现高水平表达，但是存在以下危险：整合到高表达位点中会干扰诱导性多潜能干细胞的极其重要的细胞功能。
此外，越来越多的证据表明存在针对外源DNA的细胞防御机制，该机制通过在伴随着DNA甲基化的过程中下调转基因而发挥作用(Bingham，1997，Garrick等人，1998)。此外，病毒组分可能与其他因子一起作用以转化细胞。伴随着从许多病毒基因的持续表达，至少部分病毒基因组在细胞中的持续存在可能会引起细胞转化。这些基因可能会干扰细胞的信号传导通路，导致所观察到的细胞的表型变化，产生转化的细胞，该转化的细胞显示出增加的细胞分裂，这对于病毒是有利的。
因此，在某些实施方案中，本发明开发了用于产生诱导性多潜能干细胞的新方法，所述诱导性多潜能干细胞实质上不含外源性遗传元件，如来自先前方法中所使用的逆转录病毒或慢病毒载体元件的外源性遗传元件。本发明中的这些方法利用染色体外复制载体，或能够游离复制的载体(参见美国专利申请No.12/478,154，通过引用并入本文)，联合在存在细胞信号传导抑制剂的情况下培养重编程细胞，从而实现最佳的重编程效率和动力学。
许多DNA病毒，如腺病毒、猴空泡病毒40(SV40)、牛乳头瘤病毒(BPV)，或含有出芽酵母ARS(自主复制序列)的质粒在哺乳动物细胞中在染色体外复制。这些游离质粒内在地不具有与整合载体相关的所有这些缺点(Bode等人，2001)。包括EB病毒(EBV)的基于嗜淋巴细胞性疱疹病毒的系统也可在染色体外复制并辅助递送重编程基因至体细胞。
例如，本发明中使用的基于游离型载体的途径提取用于成功复制和维持基于EBV元件的系统而不破坏系统在临床环境中的易处理性能所必需的稳健元件，如下文所详述。有用的EBV元件是OriP和EBNA-1，或它们的变体或功能等同物。这个系统的另外的优点是这些外源元件在被导入细胞之后将随着时间丧失，从而产生实质上不含这些元件的自我持续的iPS细胞。
A.游离型载体
这些重编程方法可以利用染色体外复制载体(即游离型载体)，该载体是能够游离地复制以使iPS细胞实质上不含外源载体或病毒元件的载体(参见，美国专利申请No.61/058,858，通过引用并入本文；Yu等人，2009)。许多DNA病毒，如腺病毒、猿猴空泡病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒(BPV)，或含有出芽酵母ARS(自主复制序列)的质粒在哺乳动物细胞中在染色体外或游离地复制。这些游离质粒内在地不具有与整合载体相关的所有那些缺点(Bode等人，2001)。例如，包括如上文定义的EB病毒(EBV)的基于嗜淋巴细胞性疱疹病毒的系统，或如上文定义的EB病毒(EBV)可以在染色体外复制并辅助递送重编程基因至体细胞。
例如，本发明中使用的基于质粒的方法可以提取用于成功复制和维持基于EBV元件的系统而不破坏系统在临床环境中的易处理性能所必需的稳健元件，如下文详细描述。必需的EBV元件是OriP和EBNA-1或它们的变体或功能等同物。这个系统的另一个优点是，这些外源元件在被导入细胞之后将随着时间丧失，从而产生实质上不含外源元件的自我持续的iPS细胞。
基于质粒或基于脂质体的染色体外载体，例如基于oriP的载体，和/或编码EBNA-1的衍生物的载体的使用，允许大的DNA片段被导入细胞并维持在染色体外，每个细胞周期复制一次，有效地在子代细胞中分配，并且基本上不引发免疫反应。特别地，EBNA-1，基于oriP的表达载体的复制所需的唯一病毒蛋白，不引发细胞免疫反应，因为它已形成用于绕过在I类MHC分子上呈递其抗原所需的加工的有效机制(Levitskaya等人，1997)。进一步地，在一些细胞系中，EBNA-1可以反式作用以增强所克隆的基因的表达，诱导所克隆的基因的表达多达100倍(Langle-Rouault等人，1998；Evans等人，1997)。最后，此类基于oriP的表达载体的制备是价廉的。
其他染色体外载体包括其他基于嗜淋巴细胞性疱疹病毒的载体。嗜淋巴细胞性疱疹病毒是在淋巴母细胞(例如，人B淋巴母细胞)中复制并在其一部分自然生命周期内变为质粒的疱疹病毒。单纯疱疹病毒(HSV)不是“嗜淋巴细胞性”疱疹病毒。示例性嗜淋巴细胞性疱疹病毒包括但不限于：EBV、卡波希氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、松鼠猴疱疹病毒(HS)和马立克氏病病毒(MDV)。还考虑到基于游离体的载体的其他来源，例如酵母ARS、腺病毒、SV40或BPV。
B.EB病毒
EB病毒(EBV)，也被称为人疱疹病毒4(HHV-4)，是疱疹家族(包括单纯疱疹病毒和巨细胞病毒)的病毒，是人类中最常见的病毒之一。EBV维持其基因组在染色体外并与宿主细胞机构合作进行有效复制和维持(Lindner和Sugden，2007)，从而仅依赖于针对其复制和其在细胞分裂过程中在细胞内的保留的两个本质特征(Yates等人1985；Yates等人1984)。一种通常被称为oriP的元件，以顺式存在并充当复制起始点。另一种因子EBNA-1通过结合至oriP内的序列而以反式发挥作用，从而促进质粒DNA的复制和维持。作为非限制性实例，本发明的某些方面提取这两个特征并在载体的环境下使用它们以运送重编程体细胞所需要的基因，从而相对于常规质粒促进这些基因的复制和持续表达。
C.复制起始点
在某些方面，可以使用EBV的复制起始点OriP。OriP是在DNA复制启动处或其附近的位点，通常由间隔约1千碱基对的两个顺式作用序列组成，所述的两个顺式作用序列被称为重复家族(FR)和二重对称(DS)。
FR由21个不完美拷贝的30bp重复序列组成，并含有20个高亲和性的EBNA-1结合位点。当FR与EBNA-1结合时，它既充当相距多达10kb的顺式启动子的转录增强子(Reisman和Sugden，1986；Yates，1988；Sugden和Warren，1989；Wysokenski和Yates，1989；Gahn和Sugden，1995；Kennedy和Sugden，2003；Altmann等人，2006)，并促成细胞核保持和含有FR的质粒的可靠维持(Langle-Rouault等人，1998；Kirchmaier和Sugden，1995；Wang等人，2006；Nanbo和Sugden，2007)。oriP质粒的有效分配也可能归因于FR。虽然病毒已经进化为维持FR中的20个EBNA-1结合位点，但是有效的质粒维持仅需要这些位点中的7个，并且可以被总共具有12个EBNA-1结合位点的3个拷贝的DS的聚合物重构(Wysokenski和Yates，1989)。
二重对称元件(DS)对于在存在EBNA-1的情况下启动DNA合成是足够的(Aiyar等人，1998；Yates等人，2000)，启动发生于DS处或其附近(Gahn和Schildkraut，1989；Niller等人，1995)。据认为，病毒DNA合成的终止发生于FR处，因为当FR被EBNA-1结合时，它起到复制叉屏障的作用，如通过2D凝胶电泳所观察到的(Gahn和Schildkraut，1989；Ermakova等人，1996；Wang等人，2006)。DS对DNA合成的启动经许可为每个细胞周期一次(Adams，1987；Yates和Guan，1991)，并且被细胞复制系统的组分调控(Chaudhuri等人，2001；Ritzi等人，2003；Dhar等人，2001；Schepers等人，2001；Zhou等人，2005；Julien等人，2004)。DS含有4个EBNA-1结合位点，虽然其亲和性比在FR中被发现的EBNA-1结合位点的亲和性低(Reisman等人，1985)。DS的拓扑学使得4个结合位点被布置成2对位点，每对之间有21bp的中心至中心的间隔，2个非配对内部结合位点之间有33bp的中心至中心的间隔(Baer等人，1984；Rawlins等人，1985)。
已经通过研究被称为Rep＊的EBV基因组的另一区域确认了DS内的元件的功能作用，Rep＊被鉴定为可无效率地替代DS的元件(Kirchmaier和Sugden，1998)。使Rep＊聚合8次产生在支持复制上与DS一样有效的元件(Wang等人，2006)。Rep＊的生化解剖鉴定出对于其复制功能具有关键意义的具有21bp的中心至中心间隔的一对EBNA-1结合位点(出处同上)。发现Rep＊的最小复制子是这对EBNA-1结合位点，因为即使将聚合物中所有的侧翼序列都替换为衍生自λ噬菌体的序列之后复制功能仍然得到保持。DS与Rep＊的对比已经揭示了共同的机理：这些复制子通过经由被EBNA-1弯曲和结合的一对适当间隔的位点募集细胞复制机构而支持DNA合成的启动。
存在其他的染色体外的得到许可的质粒，其在与EBV无关的哺乳动物细胞内复制并且在某些方面似乎与EBV的Raji株系内的启动区域相似。Hans Lipps及其同事已经开发并研究了含有“细胞核支架/基质附着区域”(S/MAR)和稳健转录单元的质粒(Piechaczek等人，1999；Jenke等人，2004)。它们的S/MAR源自人干扰素-β基因，富含A/T，并且通过其与细胞核基质的结合及其在低离子强度下或包埋在超螺旋DNA中时的优先解开而被操作地限定(Bode等人，1992)。这些质粒半保留地复制，结合ORC蛋白，并在整个它们的DNA中有效地随机地支持DNA合成的启动(Schaarschmidt等人，2004)。它们被有效地维持于增殖的仓鼠和人细胞中，无需药物选择，并且当被导入猪胚胎时，能够支持GFP在动物胎儿的多数组织中的表达(Manzini等人，2006)。
D.反式作用因子
反式作用因子的具体实例可以是EB细胞核抗原1(EBNA-1)，EB细胞核抗原1是DNA结合蛋白，该DNA结合蛋白与oriP的FR和DS或者Rep＊结合，从而在每次细胞分裂期间，独立于细胞染色体，但与其相协调地促进基于EBV的载体的复制和基于EBV的载体至子代细胞的可靠分配。
已经通过突变和缺失分析将EBNA-1的641种氨基酸(AA)归类为与其不同功能相关的结构域。在AA40-89和AA329-378之间的两个区域当被EBNA-1结合时，能够以顺式或反式连接2种DNA元件，因此被称为连接区1和2(LR1，LR2)(Middleton和Sugden，1992；Frappier和O′Dormell，1991；Su等人，1991；Mackey等人，1995)。将EBNA-1的这些结构域与GFP融合会使GFP归巢至有丝分裂的染色体(Marechal等人，1999；Kanda等人，2001)。LR1和LR2对于复制是功能上冗余的；任一个的缺失都会产生能够支持DNA复制的EBNA-1的衍生物(Mackey和Sugden，1999；Sears等人，2004)。LR1和LR2富含精氨酸和甘氨酸残基，并且类似于结合富含A/T的DNA的AT钩基序(AT-hook motif)(Aravind和Landsman，1998)，(Sears等人，2004)。EBNA-1的LR1和LR2的体外分析已经证明了它们与富含A/T的DNA结合的能力(Sears等人，2004)。当含有一个此种AT钩的LR1与EBNA-1的DNA结合和二聚化结构域融合时，发现它对于oriP质粒的DNA复制是足够的，虽然不如野生型EBNA-1效率高(出处同上)。
但是LR1和LR2确有不同。LR1的C末端的一半由除N末端的一半的重复Arg-Gly以外的氨基酸组成，并且被称为独特区域1(UR1)。UR1对于EBNA-1从含有FR的转染和整合报告子DNA有效激活转录是必需的(Wu等人，2002；Kennedy和Sugden，2003；Altmann等人，2006)。UR1对于被EBV感染的B细胞的有效转化也是必需的。当缺少这种结构域的EBNA-1衍生物替代完整病毒环境下的野生型蛋白时，这些衍生病毒具有0.1％的野生型病毒的转化能力(Altmann等人，2006)。
LR2不是EBNA-1对oirP复制的支持所需要的(Shire等人，1999；Mackey和Sugden，1999；Sears等人，2004)。另外，EBNA-1的N末端的一半可以被含有AT钩基序如HMGA1a的细胞蛋白替代，并且仍然保持复制功能(Hung等人，2001；Sears等人，2003；Altmann等人，2006)。这些发现表明：LR1和LR2的AT钩活性可能是人细胞中oriP的维持所需要的。
EBNA-1残基的第三结构域(AA91-328)由甘氨酸-甘氨酸-丙氨酸(GGA)重复序列组成，并与EBNA-1的通过抑制蛋白体降解和呈现而规避宿主免疫反应的能力有关(Levitskaya等人，1995；Levitskaya等人，1997)。已经发现这些重复序列在体外和体内抑制EBNA-1的翻译(Yin等人，2003)。然而，这个结构域的大部分的缺失对于EBNA-1在细胞培养中的功能无明显影响，这使得这个结构域的功能难以被阐释。
AA379-386编码细胞核定位信号(NLS)，其也与细胞核输入机构相关(Kim等人，1997；Fischer等人，1997)。由于它们的高度碱性含量，LR1和LR2的富含Arg-Gly的区域内的序列也可以作为NLS发挥作用。
最后，C末端(AA458-607)编码EBNA-1的重叠的DNA结合和二聚化结构域。已经通过X-射线晶体学解析与DNA结合的这些结构域的结构，发现该结构类似于乳头瘤病毒的E2蛋白的DNA结合结构域(Hegde等人，1992；Kim等人，2000；Bochkarev等人，1996)。
在本发明的具体实施方案中，重编程载体将含有oriP和编码有能力支持质粒复制及其在细胞分裂过程中的适当的维持的EBNA-1形式的简短序列。野生型EBNA-1的氨基末端1/3内的高度重复序列和被证明在多种细胞中具有毒性的25个氨基酸的区域的去除对于EBNA-1的与oriP相关的反式作用功能是可有可无的(Yates等人1985；Kennedy等人2003)。因此，在一个实施方案中，被称为ΔUR1的简短形式的EBNA-1可与oriP一起用于基于这个游离型载体的系统。
在某些方面，可用于本发明中的EBNA-1的衍生物是相对于对应的野生型多肽而言具有修饰的氨基酸序列的多肽。所述修饰包括在与EBNA-1中的LR1(约40至约89个的残基)的独特区域(约65至约89个的残基)对应的区域中删除、插入或替换至少一个氨基酸残基，并且可以包括在与EBNA-1的其他残基对应的区域中删除、插入和/或替换一个或多个氨基酸残基，所述的其他残基为例如约1位至约40个的残基、约90位至约328个的残基(“Gly-Gly-Ala”重复区域)、约329至约377个的残基(LR2)、约379至约386个的残基(NLS)、约451至约608个的残基(DNA结合和二聚化)，或约609至约641个的残基，只要得到的衍生物具有所需的性质，例如使含有对应于oriP的ori的DNA二聚化并与所述DNA结合，定位于细胞核，无毒性，并从染色体外激活转录但几乎不从整合的模板激活转录。
E.无残余特征
重要的是，基于oriP的游离型载体的复制和维持是不完美的，并且在其被导入细胞的前2周内从细胞迅速丧失(每次细胞分裂25％)；然而，它在保留质粒的那些细胞中丧失较慢(每次细胞分裂3％)(Leight和Sugden，2001；Nanbo和Sugden，2007)。一旦对具有质粒的细胞的选择性被去除，质粒将在每次细胞分裂中丧失，直至它们随着时间全部被消除，而没有在得到的子代细胞中留下其之前存在的痕迹。本发明的某些方面利用基于oriP的系统的这种无痕迹特征作为目前用于递送基因以产生iPS细胞的病毒相关性途径的替代。其他染色体外载体也将在宿主细胞复制和繁殖过程中丧失，并且也可用于本发明。在某些方面，可以使用用于除去外源游离型载体元件或选择实质上不含外源遗传元件的iPS细胞的方法。
VI.载体构建和递送
在某些实施方案中，重编程载体可以被构建为除了细胞中的如上所述的编码重编程因子的核酸序列之外，还包含另外的元件。以下公开了这些载体组分和递送方法的细节。
A.载体
本领域技术人员将完全具备通过标准重组技术(参见，例如Maniatis等人，1988及Ausubel等人，1994，二者通过引用并入本文)构建载体的能力。
载体还可以包含其他组分或功能，它们进一步调节基因递送和/或基因表达，或以其他方式为靶向的细胞提供有益特性。此类其他组分包括例如，影响与细胞的结合或影响靶向细胞的组分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组分)；影响细胞对载体核酸的摄取的组分；影响摄取之后多核苷酸在细胞内的定位的组分(例如介导细胞核定位的试剂)；以及影响多核苷酸表达的组分。
此类组分也可以包括标记，例如可检测标记和/或选择标记，其可用于检测或选择那些已被摄取并正表达被载体递送的核酸的细胞。此类组分可以作为载体的天然特征提供(例如使用某些病毒载体，其具有介导结合和摄取的组分或功能)，或者可以修饰载体以提供此类功能。大量的此类载体是本领域已知的，并且通常可获得。当载体被维持在宿主细胞中时，载体可以作为自主结构在有丝分裂过程中被细胞稳定复制，并入宿主细胞的基因组中，或维持在宿主细胞的细胞核或细胞质中。
B.调节元件
载体中包括的真核表达盒特别包含(以5′至3′的方向)：与蛋白编码序列可操作地连接的真核转录启动子、包括间插序列的剪接信号，以及转录终止/多腺苷化序列。
i.启动子/增强子
“启动子”是控制序列，其为核酸序列的区域，在该区域转录的启动和速率受到控制。它可以含有可与调节性蛋白和分子例如RNA聚合酶和其他转录因子结合的遗传元件，以启动核酸序列的特定转录。措辞“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在......控制下”和“在......转录控制下”意指启动子相对于核酸序列而言处于正确的功能位置和/或方向，以控制该序列的转录启动和/或表达。
适合用于本发明的编码EBNA 1的载体中的启动子是这样的启动子：其指导编码EBNA 1蛋白的表达盒的表达，以产生足够稳定水平的EBNA 1蛋白，以稳定维持含有EBV oriP的载体。启动子也用于有效表达编码重编程因子的表达盒。
启动子一般包含这样的序列：其作用是定位RNA合成的起始位点。这种序列的最有名的实例是TATA盒，但是在缺少TATA盒的一些启动子，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸基转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子中，覆盖起始位点本身的离散元件辅助固定启动位置。另外的启动子元件调节转录启动的频率。通常，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域，虽然许多启动子已被证明也含有位于起始位点下游的功能元件。为了使编码序列“在启动子的控制之下”，人们将转录阅读框的转录启动位点的5′端置于所选启动子的“下游”(即置于所选启动子的3′端)。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进所编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间隔经常是灵活可变的，所以，当元件被倒置或相对于彼此发生移动时，能够保持启动子的功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔可以增至相隔50bp，此后活性开始下降。取决于启动子，似乎单个元件可以合作地或独立地发挥激活转录的作用。启动子可以与“增强子”联用或者不与之联用，增强子是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列。
启动子可以是与核酸序列天然缔合的启动子，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5′非编码序列获得。此种启动子可以被称为“内源性的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然缔合、位于该序列的下游或上游的增强子。或者，通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子控制下将会产生某些益处，所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的启动子。重组或异源增强子是指在其天然环境中通常不与核酸序列结合的增强子。此类启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他病毒或原核或真核细胞中分离的启动子或增强子，以及不是“天然存在”的启动子或增强子，即，含有不同转录调节区的不同元件，和/或改变表达的突变的启动子或增强子。例如，在构建重组DNA时最常使用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。除了通过合成方式产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以使用包括PCRTM的重组克隆和/或核酸扩展技术，联合本文公开的组合物来产生序列(参见美国专利No.4,683,202和5,928,906，每篇均通过引用并入本文)。此外考虑到，也可以使用指导非细胞核细胞器如线粒体、叶绿体等内的序列转录和/或表达的控制序列。
自然，使用有效指导DNA区段在所选的用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物中的表达的启动子和/或增强子具有重要意义。分子生物学领域技术人员一般知晓用于蛋白表达的启动子、增强子和细胞类型组合的使用，(参见例如Sambrook等人1989，通过引用并入本文)。所使用的启动子可以是组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子和/或可用于在合适条件下指导所导入的DNA区段的高水平表达，如在大规模生产重组蛋白和/或肽中具有优势的启动子。启动子可以是异源的或内源的。
另外，任何启动子/增强子组合(按照例如真核启动子数据库EPDB，通过epd.isb-sib.ch/访问互联网)也可用于驱动表达。使用T3、T7或SP6细胞质表达系统是另一种可能的实施方案。如果提供合适的细菌聚合酶作为递送复合物的一部分或作为另外的遗传表达构建体，那么真核细胞可以支持从某些细菌启动子进行细胞质转录。
启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，如SV40早期或晚期启动子、细胞巨化病毒(CMV)即刻早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，如β肌动蛋白启动子(Ng，1989；Quitsche等人，1989)、GADPH启动子(Alexander等人，1988，Ercolani等人，1988)、金属硫蛋白启动子(Karin等人，1989；Richards等人，1984)；以及级联应答元件启动子，如环状AMP应答元件启动子(cre)、血清应答元件启动子(sre)、佛波酯启动子(TPA)和最小TATA盒附近的应答元件启动子(tre)。还可以使用人生长激素启动子序列(例如，描述于Genbank的人生长激素最小启动子，登记号X05244，核苷酸283-341)或小鼠乳腺肿瘤启动子(可以从ATCC获得，Cat.No.ATCC 45007)。具体实例可以是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。
ii.蛋白酶切割位点/自我切割肽和内部核糖体结合位点
在某些方面，根据本发明，编码标记或重编程蛋白的基因可以通过编码蛋白酶切割位点(即，包含蛋白酶识别位点的序列)的序列(可能存在多于一个序列)或至少一个自我切割肽而彼此连接。例如，包含至少两个重编程因子基因的多顺反子信息可以用在本发明的某些方面(参见美国系列号12/539,366，通过引用并入本文)。
根据本发明的某些实施方案，能够切割由连接构成多顺反子信息的基因的一个(多个)序列编码的切割位点的一种(多种)蛋白酶是由本发明的多核苷酸编码的。更特别地，编码该一种(多种)蛋白酶的一个(多个)基因是至少一个多顺反子信息的一部分。
适宜的蛋白酶切割位点和自我切割肽是技术人员已知的(参见，例如，Ryan等人，1997；Scymczak等人，2004)。蛋白酶切割位点的优选实例是马铃薯Y病毒组NIa蛋白酶(例如，烟草蚀纹病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒组HC蛋白酶、马铃薯Y病毒组P1(P35)蛋白酶、byovirus Nla蛋白酶、byovirus RNA-2-编码的蛋白酶、口蹄疫病毒属L蛋白酶、肠道病毒属2A蛋白酶、鼻病毒属2A蛋白酶、微小核醣核酸3C蛋白酶、豇豆花叶病毒组24K蛋白酶、线虫传多面体病毒属24K蛋白酶、RTSV(水稻东格鲁球状病毒)3C样蛋白酶、PY\IF(欧防风黄点病毒)3C-样蛋白酶、凝血酶、因子Xa和肠激酶的切割位点。由于其高切割严格性，可以使用TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶切割位点。
示例性自我切割肽(也称为“顺式作用水解元件”，CHYSEL；参见deFelipe(2002))源自马铃薯Y病毒组和心病毒属2A肽。具体的自我切割肽可以选自衍生自FMDV(口蹄疫病毒)的2A肽、马鼻炎A病毒、Thosea asigna病毒和猪捷申病毒(porcine tescho virus)。
特定起始信号也可用于多顺反子信息中的编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将容易能够确定这一点并提供必要的信号。熟知的是，起始密码子必须与所需的编码序列的阅读框在同一框内，以确保整体插入序列的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可以通过引入合适的转录增强元件来增强表达效率。
在本发明的某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件产生多基因信息或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5′甲基化Cap依赖性翻译的核糖体扫描模式，并在内部位点处开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已经描述了来自微小核醣核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以连接至异源开放阅读框。多个开放阅读框可以一起被转录，每个开放阅读框之间均以IRES隔开，产生多顺反子信息。借助IRES元件，每个开放阅读框可靠近核糖体以进行有效翻译。使用用于转录单一信息的单个启动子/增强子可以有效表达多个基因(参见，例如美国专利No.5,925,565和5,935,819，均通过引用并入本文)。
iii.多克隆位点
载体可以包括多克隆位点(MCS)，其是含有多个限制性酶位点的核酸区域，所述多个限制性酶位点中的任一个均可用于根据标准重组技术来消化该载体(参见，例如Carbonelli等人，1999，Levenson等人，1998，和Cocea，1997，通过引用并入本文)。“限制性酶消化”是指用仅在核酸分子的特定位置处发挥作用的酶催化性切割核酸分子。这些限制性酶中的许多是可购得的。本领域技术人员普遍理解此类酶的使用。经常使用在MCS内切割的限制性酶将载体线性化或片段化，以使外源序列能被接合至载体。“接合”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述两个核酸片段可以是彼此连续的或不连续的。涉及限制性酶和接合反应的技术是重组技术领域技术人员熟知的。
iv.剪接位点
多数经转录的真核RNA分子将经历RNA剪接从而从初级转录物中去除内含子。含有基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保适当地加工转录物用于蛋白表达(参见，例如Chandler等人，1997，通过引用并入本文)。
v.终止信号
本发明的载体或构建体一般将包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由参与RNA聚合酶对RNA转录物的特异性终止的DNA序列构成。因此，在某些实施方案中考虑了结束RNA转录物的产生的终止信号。终止子可能是实现想要的信息水平所体内必需的。
在真核系统中，终止子区域还可以包含特定的DNA序列，其允许新转录物的位点特异性切割，以便暴露多腺苷化位点。这会向专职的内源聚合酶发出信号，使其将一串约200个残基A(多聚A)添加到转录物的3′端。经这种多聚A尾巴修饰的RNA分子似乎更加稳定并且更有效地被翻译。因此，在其他涉及真核细胞的实施方案中，优选终止子包含用于RNA切割的信号，更优选终止子信号促进信使的多聚腺苷化。终止子和/或多聚腺苷化位点元件可用于增强信使水平，并使从盒读入其他序列的读取最小化。
考虑用于本发明的终止子包括如本文描述的或本领域普通技术人员已知的任何已知的转录终止子，包括但不限于，例如，基因的终止序列，例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，例如SV40终止子。在某些实施方案中，终止信号可以是可转录或可翻译序列的缺乏，例如由于序列截短所造成的。
vi.多腺苷化信号
在表达时，尤其是真核表达时，人们通常会引入多腺苷化信号来进行转录物的适当的多腺苷化。据信，多腺苷化信号的性质对于本发明的成功实践不是关键性的，可以使用任何此类序列。优选的实施方案包括SV40多腺苷化信号或牛生长激素多腺苷化信号，所述信号是方便的并且已知它们在多种靶细胞中的作用是很好的。多腺苷化可以增强转录物的稳定性或者可以促进细胞质转运。
vii.复制起始点
为了在宿主细胞中繁殖载体，载体可以含有一个或多个复制起始位点(通常称为“ori”)，例如，与如上所述的EBV的oriP，或在分化重编程中具有相似或提高的功能的遗传工程化的oriP对应的核酸序列是特定的核酸序列，在该核酸序列处，复制被启动。或者，可以使用如上所述的其他染色体外复制性病毒的复制起始点或自主复制序列(ARS)。
viii.选择和可筛选标记
在本发明的某些实施方案中，可以通过在表达载体中引入标记而在体外或体内鉴定含有本发明核酸构建体的细胞。此类标记将赋予细胞可鉴定的变化，从而允许容易地鉴定含有表达载体的细胞。一般地，选择标记是赋予允许进行选择的性质的标记。阳性选择标记是这样的标记：它的存在允许针对其进行选择，而阴性选择标记是这样的标记：它的存在阻止针对其进行选择。阳性选择标记的实例是药物抗性标记。
通常，引入药物选择标记会辅助转化子的克隆和鉴定，例如，赋予对新霉素、嘌吟霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇抗性的基因是有用的选择标记。除了赋予允许基于条件的施用来区分转化子的表型的标记以外，也考虑到其他类型的标记，包括可筛选标记，例如GFP，其基础是显色反应。或者，可以使用可筛选的酶作为阴性选择标记，如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也将知晓如何使用免疫标记，可能要联合FACS分析。所用的标记不被认为是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时被表达即可。选择和可筛选标记的另外的实例是本领域技术人员熟知的。本发明的一个特征包括在分化重编程因子已经在那些细胞中执行所需的改变的分化状态之后使用选择和可筛选标记以选择不含载体的细胞。
C.载体递送
在本发明中，将重编程载体导入体细胞中可以使用任何合适的用于核酸递送以转化细胞的方法，如本文所描述或如本领域普通技术人员已知的。此类方法包括但不限于，DNA的直接递送，例如通过离体转染(Wilson等人，1989，Nabel等人，1989)，通过注射(美国专利No.5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，每篇均通过引用并入本文)，包括微注射(Harland和Weintraub，1985；美国专利No.5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利No.5,384,253，通过引用并入本文；Tur-Kaspa等人，1986；Potter等人，1984)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等人，1990)；通过使用DEAE-葡聚糖，接着使用聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接的声波载入(sonic loading)(Fechheimer等人，1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987；Wong等人，1980；Kaneda等人，1989；Kato等人，1991)和受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)；通过微粒轰击(PCT申请号WO 94/09699和95/06128；美国专利No.5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，每篇均通过引用并入本文)；通过用碳化硅纤维搅拌(Kaeppler等人，1990；美国专利No.5,302,523和5,464,765，每篇均通过引用并入本文)；通过农杆菌介导的转化(美国专利No.5,591,616和5,563,055，每篇均通过引用并入本文)；通过PEG介导的原生质体转化(Omirulleh等人，1993；美国专利No.4,684,611和4,952,500，每篇均通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等人，1985)，以及此类方法的任何组合。通过应用诸如此类的技术，可以稳定地或瞬间地转化一个(多个)细胞器、一个(多个)细胞、一个(多个)组织或一个(多个)生物体。
i.脂质体介导的转染
在本发明的某些实施方案中，核酸可以包埋在脂质复合物例如脂质体中。脂质体是囊泡结构，其特征在于磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有被水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。在形成封闭结构并将水和溶解的溶质包埋在脂质双层之间以前，脂质组分会经历自我重排(Ghosh和Bachhawat，1991)。还考虑到核酸与Lipofectamine(Gibco BRL)或Superfect(Qiagen)的复合。所使用的脂质体的量可以根据脂质体的性质以及所使用的细胞而变化，例如，可以考虑约5μg至约20μg载体DNA/1-10×106个细胞。
在体外进行脂质体介导的核酸递送和外源DNA的表达已经是非常成功的(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987)。也已经证明了脂质体介导的外源DNA在培养的鸡胚胎、HeLa和肝癌细胞中的递送和表达的可行性(Wong等人，1980)。
在本发明的某些实施方案中，脂质体可以与血凝病毒(HVJ)复合。已经证明这会促进与细胞膜的融合并促进脂质体包封的DNA进入细胞(Kaneda等人，1989)。在其他实施方案中，脂质体可以与细胞核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或与之结合使用(Kato等人，1991)。在又一些进一步实施方案中，脂质体可以与HVJ和HMG-1二者复合或与之结合使用。在其他实施方案中，递送媒介物可以包含配体和脂质体。
ii.电穿孔
在本发明的某些实施方案中，通过电穿孔法将核酸导入细胞。电穿孔涉及使细胞悬浮液和DNA暴露于高压放电。可以通过机械损伤使受体细胞变得更易于转化。同样，所使用的载体量可以根据所使用的细胞的性质而变化，例如，可有考虑约5μg至约20μg载体DNA/1-10x106个细胞。
使用电穿孔法转染真核细胞已经取得相当大的成功。已经用人κ-免疫球蛋白基因转染了小鼠前B淋巴细胞(Potter等人，1984)，也已经以这种方式用氯霉素乙酰转移酶基因转染大鼠肝细胞(TurKaspa等人，1986)。
iii.磷酸钙法
在本发明的其他实施方案中，使用磷酸钙沉淀法将核酸导入细胞中。已经使用这种技术用腺病毒5DNA转染人KB细胞(Graham和Van Der Eb，1973)。同样，用这种方式，已经用新霉素标记基因转染小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3和HeLa细胞(Chen和Okayama，1987)，并且用多种标记基因转染了大鼠肝细胞(Rippe等人，1990)。
iv.DEAE-葡聚糖
在另一个实施方案中，使用DEAE-葡聚糖，然后使用聚乙二醇将核酸递送到细胞中。用这种方式，已将报告分子质粒导入小鼠骨髓瘤和红白血病细胞(Gopal，1985)。
VII.重编程因子
iPS细胞的产生对于用于诱导的重编程因子是关键的。以下因子或其组合可用于本发明公开的方法中。在某些方面，编码Sox和Oct(特别是Oct3/4)的核酸将被引入到重编程载体中。例如，一个或多个重编程载体可以包含编码Sox2、Oct4、Nanog和任选的Lin28的表达盒，或编码Sox2、Oct4、Klf4以及任选的C-myc或L-myc的表达盒，或编码Sox2、Oct4和任选的Esrrb的表达盒，或编码Sox2、Oct4、Nanog、Lin28、Klf4、或C-myc或L-myc，以及任选的SV40大T抗原的表达盒。编码这些重编程因子的核酸可以包含在同一表达盒中、不同表达盒中、同一重编程载体中，或不同重编程载体中。
Oct4和Sox基因家族的某些成员(Sox1、Sox2、Sox3和Sox15)已经被鉴定为参与诱导过程的关键性转录调节子，它的缺乏会使诱导不能进行。然而，另外的基因，包括Klf家族的某些成员(Klf1、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族的某些成员(C-myc、L-myc和N-myc)、Nanog和Lin28已经被鉴定为增强诱导效率。
Oct4(Pou5f1)是八聚体(“Oct”)转录因子家族之一，并且在维持多潜能性方面起到关键作用。Oct4+细胞例如卵裂球和胚胎干细胞中Oct4的缺乏会导致自发的滋养层分化，Oct4的存在因而会产生胚胎干细胞的多潜能性和分化潜力。“Oct”家族中的各种其他基因，包括Oct4的近亲Oct1和Oct6，不能引发诱导，因此证明了Oct-4在诱导过程中的专有性。
与Oct4类似，Sox基因家族与维持多潜能性相关，但是它与多潜能和单潜能干细胞相关，而Oct4与此相反，Oct4专有性地在多潜能干细胞中表达。虽然Sox2是用于重编程诱导的最初基因，但是发现Sox家族中的其他基因也在诱导过程中起作用。Sox1以类似于Sox2的效率产生iPS细胞，并且基因Sox3、Sox15和Sox18也产生iPS细胞，但效率低。
在胚胎干细胞中，Nanog以及Oct4和Sox2是促进多潜能性所需的。因此，当Yamanaka等人报道Nanog对于诱导不是必需的，但Thomson等人已报道可以使用Nanog作为因子之一来产生iPS细胞时，是令人惊讶的。
Lin28是一种在胚胎干细胞和胚胎癌细胞中表达、与分化和增殖相关的mRNA结合蛋白。Thomson等人证明它是产生iPS的一个因子，但是它不是必需的。
Klf基因家族的Klf4最初由Yamanaka等人鉴定，由Jaenisch等人确认为用于产生小鼠iPS细胞的因子，并且由Yamanaka等人证明为用于产生人iPS细胞的因子。然而，Thompson等人报道：Klf4对于人iPS细胞的产生不是必需的，事实上它未能产生人iPS细胞。发现Klf2和Klf4是能够产生iPS细胞的因子，相关的基因Klf 1和Klf5同样也是，但是效率低。
Myc基因家族是牵涉于癌症的原癌基因。Yamanaka等人和Jaenisch等人证明C-myc是牵涉于小鼠iPS细胞的产生的因子，Yamanaka等人证明它是牵涉于人iPS细胞的产生的因子。然而，Thomson等人和Yamanaka等人报道C-myc对于人iPS细胞的产生不是必需的。将“Myc”基因家族用于诱导iPS细胞，这会给iPS细胞最终作为临床治疗造成麻烦，因为25％的移植有C-myc诱导的iPS细胞的小鼠形成致命性畸胎瘤。N-myc和L-myc已经被鉴定为替代C-my以类似的效率进行诱导。
SV40大抗原可用于减少或防止当表达C-myc时可能发生的细胞毒性。
本发明中使用的重编程蛋白可以被具有约相同的重编程功能的蛋白同源物替代。编码这些同源物的核酸也可用于重编程。保守性氨基酸置换是优选的，即，例如，作为极性酸性氨基酸的天冬氨酸-谷氨酸；作为极性碱性氨基酸的赖氨酸/精氨酸/组氨酸；作为非极性或疏水性氨基酸的亮氨酸/异亮氨酸/甲硫氨酸/缬氨酸/丙氨酸/甘氨酸/脯氨酸；作为极性或不带电的亲水性氨基酸的丝氨酸/苏氨酸。保守性氨基酸置换还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理预期：将亮氨酸替换为异亮氨酸或缬氨酸、将天冬氨酸替换为谷氨酸、将苏氨酸替换为丝氨酸、或类似地将氨基酸替换为结构上相关的氨基酸将不会对得到的多肽的性质产生大的影响。可以通过测定多肽的比活性容易地确定氨基酸替换是否产生功能性多肽。
VIII.iPS细胞的选择和分化
在本发明的某些方面，在将重编程因子导入造血祖细胞中后，如上所述的那样培养细胞(任选地针对载体元件如阳性选择或可筛选标记的存在来进行选择，以富集转染的细胞)。重编程载体可以在这些细胞中表达重编程因子，并随着细胞分裂而复制和分割。或者，通过补充含有重编程蛋白的培养基，重编程蛋白可以进入这些细胞及其子代。这些重编程因子将重编程体细胞基因组以建立自我持续的多潜能状态，并且在去除针对载体的存在的阳性选择之后，随着时间的推移，外源遗传元件将逐渐丧失，而无需增加补充的重编程蛋白。
可以基于胚胎干细胞特性从源自这些外周血细胞的子代选择这些诱导性多潜能干细胞，因为预期它们与多潜能胚胎干细胞是基本上相同的。也可以使用另外的阴性选择步骤以加速或辅助选择实质上不含外源遗传元件的iPS细胞，这是通过测试重编程载体DNA的缺乏或使用选择标记如报告分子进行的。
A.针对胚胎干细胞特性的选择
先前的研究中成功产生的iPSC在以下方面与天然分离的多潜能干细胞(如小鼠和人胚胎干细胞，分别是mESC和hESC)是显著相似的，由此确认了iPSC相对于天然分离的多潜能干细胞的性质、真实性和多潜能性。因此，可以基于以下胚胎干细胞特性中的一种或多种来选择由本发明公开的方法产生的诱导性多潜能干细胞。
i.细胞生物学性质
形态学：iPSC在形态上类似于ESC。每个细胞可以具有圆形、双核仁或大核仁和贫乏的细胞质。iPSC的集落也可以与ESC的集落类似。人iPSC形成与hESC的集落类似的边界清晰、扁平、紧密堆积的集落，而小鼠iPSC形成与mESC的集落类似的集落，该集落不如hESC的集落扁平，比hESC的集落聚集度更高。
生长性质：倍增时间和有丝分裂活性是ESC的基石，因为干细胞作为其定义的一部分而必须自我更新。iPSC在有丝分裂活性、自我更新活性、增殖和分裂的速率方面可以与ESC相同。
干细胞标记：iPSC可以表达在ESC上表达的细胞表面抗原性标记。人iPSC表达对hESC有特异性的标记，包括但不限于SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E和Nanog。小鼠iPSC表达SSEA-1但不表达SSEA-3也不表达SSEA-4，这与mESC是类似的。
干细胞基因：iPSC可以表达在未分化的ESC中表达的基因，包括Oct4、Sox2、Nanog、GDF3、REX1、FGF4、ESG1、DPPA2、DPPA4和hTERT。
端粒酶活性：端粒酶是维持细胞分裂不受Hayflick极限(
Figure BDA00002587008000661
次细胞分裂)限制所必需的。hESC表达高端粒酶活性，以维持自我更新和增殖，iPSC也显示出高端粒酶活性并表达hTERT(人端粒酶逆转录酶)，其为端粒酶蛋白复合物中的必要组分。
多潜能性：iPSC将能够以类似于ESC的方式分化为完全分化的组织。
神经分化：iPSC可以分化为表达βIII-微管蛋白的神经元、酪氨酸羟化酶、AADC、DAT、ChAT、LMX1B和MAP2。儿茶酚胺相关的酶的存在可以指示iPSC类似于hESC，可以分化成为多巴胺能神经元。在分化之后，干细胞相关的基因将会被下调。
心脏分化：iPSC可以分化为心肌细胞，其自发开始跳动。心肌细胞表达cTnT、MEF2C、MYL2A、MYHCβ和NKX2.5。在分化之后，干细胞相关的基因将会被下调。
畸胎瘤形成：注射到免疫缺陷型小鼠中的iPSC可能在一定时间如9周之后自发形成畸胎瘤。畸胎瘤是含有源自三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层的组织的多谱系肿瘤；这与其他肿瘤不同，其他肿瘤通常仅是一种细胞类型。畸胎瘤形成是多潜能性的标志性测试。
拟胚体：培养中的hESC自发形成球状胚胎样结构，其被称为“拟胚体”，其由具有有丝分裂活性的分化中的hESC的核心和来自所有三个胚层的完全分化的细胞的外围组成。iPSC也可以形成拟胚体并具有外周分化的细胞。
胚泡注射：hESC天然地存在于胚泡的内细胞群(成胚区)内，且在成胚区中分化为胚胎；而胚泡的壳(滋养层)分化为胚胎外组织。中空的滋养层不能形成活胚胎，因此，成胚区中的胚胎干细胞必须分化并形成胚胎。通过微量吸液管将iPSC注射到滋养层中以产生被转移到雌性受体中的胚泡，这可能会导致产生嵌合的活小鼠幼崽：具有10％-90％的嵌合性并且遍布其身体掺入了iPSC衍生物的小鼠。
ii.表观遗传学的重编程
启动子去甲基化：甲基化是甲基被转移至DNA碱基，通常是甲基被转移至CpG位点(邻近的胞嘧啶/鸟嘌吟序列)中的胞嘧啶分子。基因的广泛甲基化会通过阻止表达蛋白的活性或募集干扰表达的酶来对表达产生干扰。因此，基因的甲基化会通过阻止转录而有效地使基因沉默。包括Oct4、Rex1和Nanog在内的多潜能性相关基因的启动子可能在iPSC中被去甲基化，显示出它们的启动子活性以及多潜能性相关基因在iPSC中的活性启动和表达。
组蛋白去甲基化：组蛋白是在结构上定位于DNA序列的紧凑蛋白，其可以通过多种染色质相关的修饰发挥其活性。与Oct/4、Sox2和Nanog相关的H3组蛋白可以被去甲基化以激活Oct4、Sox2和Nanog的表达。
B.针对无残余特征的选择
本发明中的重编程载体如基于oriP的载体可以在染色体外复制，并且在数代之后在宿主细胞中不再存在。然而，针对实质上不含外源载体元件的子代细胞的另外的选择步骤可以促进这个过程。例如，可以提取子代细胞样品以测试外源载体元件的存在或丧失，如本领域已知的(Leight和Sugden，2001)。
重编程载体可以进一步包含选择标记，更具体地，阴性选择标记，如编码胸苷激酶的基因，以选择实质上不含此种选择标记的子代细胞。人单纯疱疹病毒胸苷激酶1型基因(HSVtk)用作哺乳动物细胞中的条件致死标记。HSVtk编码的酶能够将某些核苷类似物(例如更昔洛韦，一种抗疱疹药物)磷酸化，由此将它们转化为有毒性的DNA复制抑制剂。替代或互补途径是测试外源遗传元件在子代细胞中的不存在，使用常规方法进行，例如RT-PCR、PCR、FISH(荧光原位杂交)、基因阵列，或杂交(例如Southern印迹)。
C.iPS细胞的分化
多种途径可以与本发明一起使用以使iPS细胞分化为细胞谱系，包括但不限于：造血细胞、单核细胞(例如心肌细胞)、神经元、成纤维细胞和表皮细胞，以及源自其中的组织或器官。iPS细胞的造血分化的示例性方法可以包括，例如，均通过引用完整地并入本文的美国申请No.61/088,054和No.61/156,304中公开的方法，或基于拟胚体(EB)的方法(Chadwick等人，2003；Ng等人，2005)。纤连蛋白分化方法也可用于血液谱系分化，如Wang等人，2007中所列举的。iPS细胞的心脏分化的示例性方法可以包括拟胚体(EB)方法(Zhang，等人，2009)、OP9基质细胞方法(Narazaki，等人，2008)，或生长因子/化学方法(参见美国专利公开No.20080038820、20080226558、20080254003和20090047739，都通过引用完整地并入本文)。
IX.实施例
包括了以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该认识到，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在实践本发明时效果良好的技术，因此可以被认为是构成本发明的实践的优选模式。但是，根据本公开，本领域技术人员应该认识到，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对所公开的具体实施方案作出许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果。
实施例1
从造血祖细胞产生iPS细胞
如图1所示，对来自患者的正常未动员的外周血进行加工以收集PBMC，并纯化以富集表达CD34的细胞。然后接种这些细胞以允许扩展，并在接种后约1周内进行转染。然后将这些细胞进行一天的转染后温育，此后是约1-2天的恢复期，并转换到100％重编程培养基中。随着粘附的细胞和松散的集落变得明显，将培养基逐渐转换到TESR2中以支持iPS细胞的形成。
在vacutainer中收集人全血(此处要包括的体积范围为1-50ml)。
从人全血中分离出PBMC并且要么冷冻，要么立即加工以分离CD34细胞。
将针对CD34的抗体施加到从外周血加工并且经手动或自动分离的PBMC中。
用流式细胞仪(Accuri；Ann Arbor，MI USA)测定纯度，以检测表达CD34和更一般的标记CD45的细胞百分比，从而检测所有造血祖细胞。所分离的级分的纯度对于CD34表达呈阳性的范围为20-96％。
要么冷冻针对CD34表达富集的细胞，要么立即将其与DNAseI(20U/ml)一起在37℃下温育10分钟。这个步骤确保除去当细胞在融化、纯化等促进的应力下裂解时释放的DNA，并限制细胞聚丛。旋转细胞，去除含有DNA酶的上清液。然后让细胞恢复过夜。
CD34表达细胞可使用富含细胞因子的培养基扩展。在这个实施例中发现，单独的富含细胞因子的培养基足以在至少3种独立的情况下扩展总细胞数量。
富含细胞因子的培养基：300ng/ml的以下每种物质：血小板生成素(TPO)、Flt3和干细胞因子(SCF)。100ng/ml的白细胞介素6(IL6)和10ng/ml的白细胞介素3(IL3)。基础培养基由牛血清白蛋白(BSA)、重组人胰岛素、铁饱和人转铁蛋白、2-巯基乙醇、Iscove′sMDM，和另外的补充物组成(在图2A-2C中指定为不含基质)。在优选的实施方案中，BSA可以完全省去。此外，在这种培养基中利用完全限定的组分。或者，可以利用补充有上面详述的浓度的不含动物成分的TPO、Flt3、SCF、IL6和IL3的StemSpan H3000(Stem CellTechnologies，目录号9850)。
CD34表达细胞可使用与纤连蛋白片段结合的富含细胞因子的 培养基扩展。在这个实施例中发现，CD34+细胞可以在纤连蛋白的重组人片段的存在下进一步扩展。所述纤连蛋白的重组人片段是574个氨基酸(63kDa)并且含有中央细胞结合结构域(III型重复，8、9、10)、高亲和性的肝素结合结构域II(III型重复，12、13、14)，以及在人纤连蛋白的选择性剪接IIICS区内的CS1位点(得自
Figure BDA00002587008000701
Takara)。将纤连蛋白片段与PBS以5ug/ml混合并置于未经处理的组织培养板(在图2A-2C中指定为Notch-)上。
CD34表达细胞可使用与纤连蛋白片段和固定化的工程化 Notch-1配体(Deltal ext-IgG ，DLL1)结合的富含细胞因子的培养基扩展.Delaney等人证明使用Notch-1配体从脐带血扩展出高于100倍的CD34+细胞(Delaney等人，2010)。在这个实施例中发现，来源于外周血的CD34+细胞也可以在Notch-1配体的存在下使用类似途径扩展。(在图2A-2C中指定为Notch+)。该配体是人肽，其代表在C-末端与免疫球蛋白G的Fc部分融合的重组δ样蛋白1(DLL1；aa1-545)的细胞外结构域。
CD34 + 细胞在不存在基质或Notch-1配体的情况下的扩展。基本上按6x103个细胞/孔(24孔板)或1x105个细胞/孔(6孔板)接种细胞，4天后进行喂养，并在扩展后第6天进行转染。图2A-2C示出随时间流逝的扩展倍数、总群体的生长速率，以及在该时间范围内的CD34表达的自然下降。
在扩展后第6天，从不含基质的条件收集细胞并用含有oriP-复制子的质粒组合转染细胞。从这些质粒表达的重编程因子可以包括以下的任何组合：Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、C-myc或L-myc、klf4，和SV40大T抗原(图3)。使用用于单比色皿转染的LonzaNucleofector装置或96孔穿梭形式转染2.5x104至1.5x106个细胞。下表1给出在使用编码eGFP的基于oriP的质粒对包括CD34+细胞在内的血液来源的造血祖细胞转染后的代表性结果。该表反映出使用增加数量的从外周血扩展的输入HP进行样品转染的结果。用缺少重编程因子的表达盒的对照质粒转染细胞。通过计算对于碘化丙啶(PI)染色不呈阳性的群体百分比来确定转染效率(GFP+％)。
表1-转染结果
Figure BDA00002587008000711
然后将转染细胞重悬在相同的用于扩展的富含细胞因子的培养基中并温育过夜以恢复。第二日，旋转细胞，用富含细胞因子的培养基更新培养基，并制备受体板。
受体重编程板制备.在转染后24小时，将未经处理的6孔板用
Figure BDA00002587008000712
(10ug/孔)进行包被。
在转染后48小时，用PBS洗涤板，用2％BSA封闭，并再次洗涤。任选地，对于不含动物成分的培养条件，可以省去2％BSA封闭步骤。用重编程培养基(表2)定容转染的细胞，以便使用在3x104至3x105个细胞/孔的范围内的密度将2ml细胞接种于所制备的受体板上。
表2-重编程培养基
组分 供货商 最终浓度
StemSpan StemCellTechnologies
N-2补充物(100x) Invitrogen 1x
B-27补充物(50x) Invitrogen 1x
NEAA(100x) Invitrogen 1x
Glutamax(100x) Invitrogen 0.5x
β-巯基乙醇 Sigma 1.7μl
PD0325901 StemGent 0.5μM
CHIR99021 StemGent 3μM
A-83-01 StemGente 0.5μM
HA-100 StemGent 10μM
斑马鱼FGF 内部 100ng/ml
喂养重编程培养物。每隔一天喂养细胞。对于第1次喂养，向每个孔中添加2ml培养基，并且不移除培养基。对于随后的喂养，从每个孔中轻轻地移除2ml并用新鲜培养基替换。在铺板后24小时细胞开始粘附，并且在1周之前开始形成松散的集落。在约7-10天时将培养物转换到不含小分子的TESR2(Stem Cell Technologies)中。这代表逐渐变换，因为2ml先前的培养基仍然存在。如果已经形成充足的幼小集落，那么可以从孔中除去较多的培养基，以便存在的培养基大部分是新鲜的。在转染后约20天出现被非重编程的分化细胞包围的圆iPSC集落。围绕iPSC集落的细胞代表已粘附到基质上的血细胞或已开始分化的部分重编程细胞。利用小分子信号传导抑制剂时，实际的iPSC集落(Tra1-81阳性)经常嵌套在较松散的非iPSC区域内或在较分化的细胞下方。
实施例2
使用多顺反子重编程载体从造血祖细胞产生iPS细胞的优化
含有多顺反子信息的基于OriP的重编程质粒的示意图在图4中示出(组合集合1和组合集合2)。将来自PBMC的纯化细胞扩展3天或6天。用对照，表达GFP的基于oriP/EBNA1的质粒转染一系列输入细胞数量。如上所述的那样用重编程质粒转染来自供体GG的扩展3天或6天的PBMC。
通过计算采用流式细胞仪检测的表达GFP的活细胞的百分比来评估较低数量的来源于通过白细胞分离法收集的PBMC的富含CD34的细胞的转染效率。还通过确定转染后一天的台盼蓝阴性细胞数量除以输入细胞总数量的分数来确定成活力，当输入细胞在1x104至1x105的范围内时，该成活力约为30％(数据未示出)。当输入细胞数量在1x104至3x104范围内时，转染效率为30％，且当输入细胞数量在6x104至1x105个细胞范围内时，转染效率约为40％(图5A)。将来自PBMC的纯化细胞扩展3天或6天，并用对照，GFP表达质粒转染6x104至1x105个细胞。当对扩展3天的细胞进行转染时，转染效率是对CD34表达较高时的扩展6天的细胞的转染效率的两倍(图5B)。此外，第3天转染的细胞中超过90％的细胞共表达GFP和CD34，而第6天转染的群体中仅18％共表达二者标记(图5C)。然而，6天的扩展确实增加了用于转染的细胞总数量。这些结果支持这一观念，即，选择用于这个方案的条件相对于群体中其他细胞类型而言更有利于CD34表达细胞的转染。
含有人纤连蛋白(RetroNectin)或玻连蛋白的活性结构域的重组蛋白片段始终如一地支持iPSC形成，优于所测试的其他物质。当与StemSpan SFEM培养基、N2、B27及包括PD0325901、CHIR99021、A-83-01和HA-100在内的小分子的混合物联合使用时，RetroNectin包被的板上的集落形成效率显著提高(图5D)。示出6孔板中的单个孔，该孔含有对碱性磷酸酶活性染色呈阳性的集落(图5D，组i)。白色箭头强调了在组ii中放大的集落，该集落也对Tra1-81表达的染色呈阳性，组iii。
为了优化输入细胞数量，使用质粒集合2对一系列扩展6天的输入细胞数量(供体GG)执行重编程测试(图5E)。
L-myc可用来替代C-myc，具有潜在较高的重编程效率。如图5F所示，将从四个不同供体纯化出的CD34表达细胞扩展6天，并使用用于比较的表达C-myc(集合1)或L-myc(集合2)的质粒组合来进行转染，并比较由每种情况产生的iPSC的总数量。
为了在不需要B-27补充物中的动物组分的情况下获得不含异种物质的培养物，根据图6，证明了B-27补充物在重编程培养基中可以完全省去。
CD34表达量被证明与重编程效率相关联(图7A-7B)。从PBMC分离CD34表达细胞在该工艺中产生另外的步骤；因此，重要的是，使用本文详述的方法确定CD34表达与重编程效率之间是否确实存在关联性。下面的一组实验证实了这种关联性。首先，宿主细胞群体被视为在扩展第3天和第6天时不含使用靶向CD3、CD19和CD56(n＝9，数据未示出)的抗体通过流式细胞仪可检出的水平的T、B和NK细胞。其次，由45％CD3、10％CD19、20％CD56组成的CD34耗竭的细胞群体不能利用本文的不含饲养物的方案产生iPSC(图7A，ii)，因为针对CD34表达纯化的对应物确实是平行的(n＝3，FIG 7A，i)。第三，从另外的供体纯化CD34表达细胞，在与降低的CD34表达水平一致的不同扩展天数对该细胞进行转染，并重编程该细胞。重编程效率较低，因为对于所有四个供体而言CD34表达百分比都降低(图7B)。例如，当CD34表达水平低三分之一以上时，在扩展3天后转染时供体3096表现出超过90个iPSC/1x105个输入细胞的效率，而再扩展10天时表现出1个iPSC/1x105个输入细胞的效率。这个结果确证了本文先前的观察结果，即表明相对于CD34百分比较高时的扩展6天的转染效率而言在扩展3天时的转染效率较高的观察结果。总之，这些数据支持的观念是，在造血细胞群体内的CD34表达量与它们使用本文详述的不含饲养物的方法重编程能力相关联。
在标准或完全限定的条件下培养的CD34表达细胞的扩展倍数在图8A中详细示出。使用完全限定的重编程方法产生iPSC的能力将进一步使变异减至最小并且有利于临床级iPSC的生产。从多个供体纯化大量CD34表达细胞并进行混合，以确保多个测试所需的细胞数量。在扩展6天后，纯化细胞在完全限定的培养基中成功扩展113+/-11倍，相比之下，细胞在标准条件下成功扩展83+/-32倍。当乘以通过流式细胞仪检测的表达CD34的群体的百分比时，表达CD34的细胞的绝对数量在两个群体之间是类似的，尽管这两种条件之间存在30倍差异。例如，在标准条件下扩展的群体的42+/-13％表达CD34，而使用完全限定的条件时，26+/-16％表达CD34。图8B中的图片代表6孔板中的1个孔，该孔含有在利用完全限定的不含动物成分的试剂重编程针对CD34表达富集的扩展细胞后，对碱性磷酸酶染色呈阳性的集落。
使用本文详述的方法从26个供体繁殖多个iPS克隆，并选择一小组克隆用于进一步表征。该克隆显示出正常的核型，并在多个传代对一些克隆进行评估以证实它们随着时间的推移的遗传完整性。该克隆也表达如通过流式细胞仪测定的常见细胞表面标记Tra1-81和SSEA-4，以及指示多潜能性的内源基因，包括DNT3B、REX1、TERT、UTF1、Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、Klf4和C-myc。还证实了克隆不含完整的染色体外质粒DNA。oriP-转染的质粒的逐渐丧失通过收集在各个传代数的iPSC来证实，并通过PCR以1拷贝/细胞的检测限来筛选，该丧失在7至10个传代的平均范围内是可检测的。有趣地，当iPSC是利用EDTA而不是分散酶散开的时候，oriP的丧失在10以后的传代是明显的。此外，根据PCR分析，所测试的iPSC样品集合也不存在指示免疫球蛋白重链(IgH)基因或T细胞受体重排的基因片段的扩展。此种重排的不存在支持宿主细胞起源于造血祖细胞，以及该方案选择性地有利于从造血祖细胞而不是更分化的B或T细胞类型产生iPSC的这一说法。针对形成神经元的能力测试来自一个供体的数个iPSC克隆。此外，来自三个不同供体的五个iPS克隆在注射到免疫缺陷型(SCID)小鼠中后还形成畸胎瘤。有趣地，残余的转染DNA的存在似乎没有阻碍形成畸胎瘤的能力，因为来自两个供体的克隆没有丧失质粒DNA，直至分别在注射到小鼠中用于畸胎瘤研究后的第15传代和第18传代才丧失质粒DNA。
根据本公开，无需过量实验即可实现和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然已经针对优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对本领域技术人员明显的是，可以在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下对本文描述的方法、方法的步骤或步骤的次序进行改变。更具体地，明显的是，某些化学和生理学上均相关的试剂可以替换本文描述的试剂，同时仍然获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有此类相似的替换和修饰都被视为在如随附的权利要求限定的本发明的精神、范围和概念之内。
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Claims (20)

1.一种从造血祖细胞生产人iPS细胞的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含造血祖细胞的人外周血细胞的细胞群体；
b)在用于促进所述造血祖细胞扩展的扩展条件下培养所述群体；
c)将表达iPS重编程因子的外源性游离遗传元件或外源性RNA遗传元件导入所述扩展的造血祖细胞中；以及
d)将所述扩展的造血祖细胞在不含异种物质的培养物中进行培养，由此从所述造血祖细胞产生人iPS细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞群体是来自一个或多个其细胞没有用从外部施加的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)动员的受试者。
3.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述细胞群体包含在最多约10ml体积的血液样品中。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述扩展条件包含含有一种或多种细胞因子的扩展培养基，所述细胞因子包括干细胞因子(SCF)、Flt-3配体(Flt3L)、血小板生成素(TPO)、白细胞介素3(IL-3)，或白细胞介素6(IL-6)。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述扩展条件不包含Notch-1配体。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在步骤b)中的扩展条件包含限定的细胞外基质。
7.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中在步骤b)中的扩展条件不包含基质。
8.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在步骤b)中的条件或在步骤d)中的培养物具有最高7％的氧分压。
9.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述重编程因子为Sox、Oct、Nanog、Lin-28、Klf4、C-myc(或L-myc)、SV40大T抗原，或它们的组合。
10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述外源性游离遗传元件或外源性RNA遗传元件具有一个或多个多顺反子盒。
11.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述步骤c)在所述扩展步骤b)的约第3、4、5或6天进行。
12.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在所述步骤c)中所述扩展的造血祖细胞的起始数量为约104至约105个。
13.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在步骤d)中的培养物包含限定的细胞外基质。
14.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述限定的细胞外基质具有单一类型的细胞外基质肽。
15.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述限定的细胞外基质是人纤连蛋白片段。
16.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在所述步骤中的一个或多个中的培养基是化学限定的培养基。
17.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其进一步包括：e)针对iPS细胞进行选择。
18.一种从外周血样品生产人iPS细胞的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含造血祖细胞的外周血样品，其中所述外周血样品的体积最多为10ml；
b)将表达iPS重编程因子的外源性游离遗传元件或外源性RNA遗传元件导入所述造血祖细胞中；以及
c)将所述造血祖细胞在不含异种物质的培养物中进行培养，由此从所述外周血样品产生人iPS细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其进一步包括在所述步骤b)之前，在用于促进所述造血祖细胞扩展的扩展条件下培养所述造血祖细胞。
20.一种体外细胞培养组合物，其包含含有造血祖细胞和其子代细胞的人外周血细胞的细胞群体、不含异种物质的细胞外基质，和不含异种物质的培养基，其中所述造血祖细胞包含一种或多种表达重编程因子的外源性游离遗传元件或外源性RNA遗传元件。
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