KR20230113768A - 유도 줄기 세포 - Google Patents

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KR20230113768A
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호세 폴로
샤오동 리우
지아 핑 탄
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모나쉬 유니버시티
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Abstract

본 발명은 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 유래된 줄기 세포, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 수득 방법에 관한 것이다.

Description

유도 줄기 세포
본 발명은 다양한 유도 줄기 세포의 생산 방법, 및 이러한 줄기 세포 자체를 제공한다.
관련 출원
본 출원은 호주 가출원 AU 2020904340, AU 2021900686 및 AU 2021903429로부터 우선권을 주장하며, 이들 가출원 모두의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
포유동물의 배아발생(embryogenesis)은 상실배로 발달할 수 있는 분화전능성(totipotent) 접합체(zygote)로 시작한 후에, 배반포(blastocyst)가 형성된다. 배아가 착상함에 따라, 배반포 내의 에피블라스트(Epiblast) (EPI) 계통(lineage)의 세포는 적절한 배아 및 양막으로 발달할 것이며, 한편 영양외배엽(trophectoderm) (TE) 및 원시 내배엽(primitive endoderm) (PE)의 세포는 결국 각각 태반 및 난황낭(yolk sac)을 초래할 것이다.
시험관내에서 단리되고 배양될 때, 에피블라스트의 세포는 인간 배아 줄기 세포(human embryonic stem cell) (hESC)를 초래한다. 대안적으로, 성체 세포는 전사 인자-매개 재프로그래밍에 의해 인간 유도 다능성 줄기 세포(human induced pluripotent stem cell) (hiPSC)로 재프로그래밍될 수 있다. 시험관내 배양된 이들 다능성 세포는 신체의 모든 세포 유형으로 분화될 수 있으며, 이와 같이, 이들 세포는 인간의 '미니 장기(mini organs)' 또는 오가노이드 모델(organoid model) 개발에 중추적인 역할을 해왔다. 게다가, hESC/hiPSC를 사용하여, 미세패턴화된(micropatterned) 배아 원반-유사 구조(embryonic disc-like structure), 배낭-유사 구조(embryonic sac-like structure), 및 인간 가스트룰로이드(gastruloid)를 포함한, 초기 인간 발달을 연구하기 위해 다수의 시험관내 모델이 개발되어 왔다. 이 기술적 및 의료 혁명은 질환 모델링, 약물 스크리닝, 및 여러 질환, 배아 및 장기 발달의 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해에 매우 중요하였다.
수정 후 ~3.5 d에 마우스 배아는 세 가지 계통: 배아외 영양외배엽(extraembryonic trophectoderm) (TE), PE 및 동족(cognate) 체외 줄기 세포가 유래될 수 있는 다능성 EPI를 포함하는 배반포를 형성한다. 영양막 줄기 세포(Trophoblast stem cell) (TS) 세포는 TE, PE로부터의 배아외 내배엽 줄기 (XEN) 세포 및 EPI로부터의 ES 세포로부터 유래된다. 특히, 이들 줄기 세포주 각각은 이들이 나타내는 배반포 세포 계통의 유용한 모델이다. 마우스 ES 및 TS 세포는 다능성 유지 및 태반 발달 각각의 메커니즘을 포함하여, EPI 또는 TE 생물학을 모델링하기 위해 다년간 성공적으로 사용되었다.
원하는 세포 형태를 초래할 수 있는 쉽게 이용가능한 줄기 세포 공급원의 확인은 치료적 치료, 조직 공학 및 연구에 중요하다.
인간 줄기 세포, 또는 인간 줄기 세포의 특성을 나타내는 세포를 생산하기 위한 신규 및/또는 개선된 방법이 필요하다.
본 명세서에서 임의의 선행 기술에 대한 언급은 이 선행 기술이 임의의 관할권에서 통상적인 일반 지식의 일부를 형성하거나 이 선행 기술이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되고, 관련 있는 것으로 간주되고/거나, 선행 기술의 다른 부분과 조합될 것으로 합리적으로 예상될 수 있다는 승인 또는 시사가 아니다.
제1 측면에서, 본 발명은 SALL4, GATA4, SOX17, GATA6 및 SOX7 중 하나 이상을 발현하는, 인간 유도 또는 시험관내-유래 배아외 내배엽 줄기 (XEN) 세포 또는 XEN-유사 세포를 제공한다. 임의로, XEN 세포 또는 XEN-유사 세포는 본원의 표 2에 정의된 바와 같이, PE 계통의 마커 중 하나 이상 또는 모두를 발현한다.
이 측면에서, 본 발명은 적어도 5회, 적어도 10회 또는 적어도 15회 계대의 기간 동안 배양 상태로 유지될 수 있는 XEN 또는 XEN-유사 세포의 집단(population)을 제공한다. 전형적으로, XEN 또는 XEN-유사 세포는 본원에 기재된 바와 같은 방법으로 유지된다.
이 측면에서, XEN 또는 XEN-유사 세포는 배반포로부터, 또는 본원에 기재된 바와 같은 시험관내-유래 다층(multi-layered) 세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 생산되거나 단리된다. 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조 (예컨대 블라스토이드(blastoid) 또는 아이블라스토이드(iblastoid))는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다.
이 측면에서, 본 발명은
- 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor) (LIF), GSK-3 억제제 및 액티빈 A를 포함하는 배양 배지의 존재 하에 피더(feeder) 층 상에서 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 해리된 단일 세포를 배양하는 단계
를 포함함으로써, 인간 XEN 또는 XEN-유사 세포를 생산하는, 인간 XEN 또는 XEN-유사 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
이 측면에서, 본 발명은
- 본원에 기재된 바와 같은 배반포 또는 시험관내-유래 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 단일 세포로 해리하는 단계,
- 이러한 단일 세포를 백혈병 억제 인자 (LIF), GSK-3 억제제 및 액티빈 A를 포함하는 배양 배지의 존재 하에 피더 층 상에서 배양하는 단계
를 포함함으로써, 인간 XEN 또는 XEN-유사 세포를 생산하는, 인간 XEN 또는 XEN-유사 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
이 측면에서, 피더 층은 섬유모세포(fibroblast) 세포, 예를 들어 방사선조사된 마우스 배아 섬유모세포(irradiated mouse embryonic fibroblast) (iMEF)를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
이 측면에서, 단일 세포는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일의 기간 동안 배양된다. 단일 세포는 적어도 5회, 적어도 10회, 적어도 15회, 적어도 20회, 적어도 25회, 적어도 30회, 적어도 40회, 적어도 50회 이상의 계대 동안 배양될 수 있다.
이 측면에서, 배양 배지는 10 ng/ml 인간 백혈병 억제 인자, 3 μM CHIR99021 및 100 ng/ml 액티빈 A를 포함할 수 있다.
이 측면에서, 본 발명은
- 피더 층에 존재하는 XEN 또는 XEN-유사 세포를 해리하는 단계;
- 해리된 세포를 백혈병 억제 인자 (LIF), GSK-3 억제제, 액티빈 A 및 ROCK 억제제를 포함하는 배양 배지의 존재 하에 1:4 내지 1:10의 분할 비율로 피더 층 상에 시딩(seeding)하는 단계
를 포함함으로써, 인간 XEN 또는 XEN-유사 세포를 배양하거나 유지하는, 인간 XEN 또는 XEN-유사 세포를 배양하거나 유지하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, XEN 또는 XEN-유사 세포는 3일, 4일, 5일 또는 6일마다 해리되거나 계대배양(passaging)된다. 바람직하게는, 배양하거나 유지하기 위한 XEN-유사 세포는 본 발명의 제1 측면의 방법에 따라 수득된다.
XEN 또는 XEN-유사 세포는 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 수득된 임의의 시험관내-유래 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 배양하고, XEN 또는 XEN-유사 세포가 백혈병 억제 인자 (LIF), GSK-3 억제제 및 액티빈 A를 포함하는 배양 배지에서 증식하도록 함으로써 생산될 수 있다.
본 발명의 이 측면의 임의의 실시양태에서, XEN 또는 XEN-유사 세포를 해리하는 단계는 세포를 효소 또는 효소 조성물과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 세포의 탈착을 촉진하거나 응집된 배양물에서 성장하는 세포를 해리시키기에 적합한 단백질분해 및/또는 콜라겐분해 효소를 포함하는 임의의 효소 또는 효소 조성물이 사용될 수 있다. 임의의 실시양태에서, 효소 조성물은 아쿠타제(Accutase)®, 트립엘이(TrypLE)®, 디스플라제(displase), 콜라게나제, EDTA, 트립신, 또는 아쿠맥스(Accumax)®일 수 있다.
바람직하게는, 피더 층은 섬유모세포 세포, 예를 들어 방사선조사된 마우스 배아 섬유모세포 (iMEF)를 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직하게는, ROCK 억제제는 약 10 μM의 농도로 존재한다. 전형적으로, 시딩된 세포는 1일 또는 2일 동안, 또는 시딩된 세포가 피더 층에 부착될 때까지 ROCK 억제제를 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 부착 후, 백혈병 억제 인자 (LIF), GSK-3 억제제 및 액티빈 A를 포함하는 배양 배지 (ROCK 억제제 없음)를 사용하고 격일로 교체할 수 있다.
이 측면에서, 임의의 방법은 XEN 또는 XEN-유사 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 이 측면의 추가 실시양태에서, 본 발명의 제1 측면의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 단리된 XEN 또는 XEN-유사 세포가 제공된다.
이 측면의 임의의 방법에서, 방법은 XEN 또는 XEN-유사 세포를 확대하여 집단내 XEN 또는 XEN-유사 세포의 비율을 증가시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 세포를 확대하는 단계는 하기에 기재된 바와 같이 세포 집단을 생산하기 위한 충분한 시간 동안 및 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, XEN-유사 세포는 XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 포함할 수 있다. 이 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 제1 측면의 방법에 의해 생산된 XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 제공한다.
추가 실시양태에서, XEN 또는 XEN-유사 세포, 또는 XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포는 계대배양에서 유지될 때 이의 미분화 상태를 유지한다.
바람직하게는, XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포는 적어도 5회, 적어도 10회, 적어도 15회, 적어도 20회, 적어도 40회 이상의 세포 배양 계대 동안 XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 유지한다.
본원에 사용된 바와 같이, XEN 세포 또는 XEN-유사 세포의 특징은 다음을 포함하는 것으로 이해될 것이다:
- 편평한 내배엽 형태;
- 마커 GATA6 GATA4, PDGFRa, NID2 및 BMP6 중 하나 이상의 발현,
- NANOG와 같은 다능성 마커의 발현 부재;
- 피브로넥틴 및 라민과 같은 ECM의 분비;
- LAMA1, COL4A1 및 FN1과 같은 기저막(basement membrane) 성분의 생산;
- 예를 들어, GATA6, GATA4, PDGFRa, NID2 및 BMP6의 발현이 하향 조절된 AFP 및 HFN4a의 조절되지 않은 발현을 특징으로 하는 내장 내배엽으로의 발달.
추가 실시양태에서, XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포는 체세포를 특징짓는 마커의 부재를 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포는 하기 마커 중 하나 이상을 발현하지 않는다: OCT4 (POU5F1로도 칭해짐), NANOG, SOX2, KLF17, DPPA3, 및 DNMT3L.
임의의 실시양태에서, 본 발명의 제1 측면에 따라 제조된 XEN-유사 세포는 본원에 기재된 바와 같은 XEN의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 특징을 특징으로 한다.
이 측면에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 XEN 또는 XEN-유사 세포를 포함하는 세포의 집단을 제공한다. 바람직하게는, 세포의 적어도 5%가 XEN-유사 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내고 이러한 세포는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내고 이러한 XEN-유사 세포들은 본 발명의 제1 측면의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있다.
이 측면에서, 본 발명은 또한
- 본 발명의 제1 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는, XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 XEN 또는 XEN-유사 세포, 및
- 제약상 허용되는 담체 또는 부형제(excipient)
를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
이 측면에서, 본 발명은 또한
- 본 발명의 제1 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는, XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포 또는 세포의 집단, 및
- 제약상 허용되는 담체 또는 부형제
를 포함하는 동종요법(homeopathic) 또는 식이 보충제(dietary supplement)를 포함하는 조성물을 제공한다.
이 측면에서, 본 발명은 추가로
- 본 발명의 제1 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는, XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포 또는 세포의 집단
으로부터 유래된 동종요법 또는 식이 보충제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 갖는 XEN-유사 세포 및 세포들은 또한 아이블라스토이드 (B)-유래 XEN (BXEN) 세포 또는 iXEN 세포 또는 시험관내-유래 XEN 세포로 지칭될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 제1 측면의 방법에 따라 수득된 XEN 또는 XEN-유사 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포로부터 수득된 오가노이드(organoid) 및/또는 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 제조된 XEN 또는 XEN-유사 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포로부터 수득된 분화된 세포를 제공한다.
이 측면에서, 본 발명은 또한 XEN 또는 XEN-유사 세포로부터 수득되거나 유래된 키메라 기관 또는 오가노이드 또는 XEN 또는 XEN-유사 세포로부터 생산된 분화된 세포를 제공하며, 여기서 XEN 또는 XEN-유사 세포는 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 수득된 XEN 세포, XEN-유사 세포, BXEN, iXEN 또는 시험관내-유래 XEN 세포, 또는 이의 집단은 영양막 오가노이드에 통합되어 정교한 배아외 오가노이드 시스템 (인공 태반 및 난황낭)을 형성하여 시험관내 배아 성장을 뒷받침할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한
- 배아외 오가노이드를 형성하기 위한;
- 배아외 조직의 발달과 연관된 질환/기능 장애를 이해하기 위한 모델을 위한;
- 배아외 조직의 기능을 개선하기 위한 약물 및 치료제의 스크리닝을 위한;
- 배아 패터닝(patterning), 생식 세포 발달 및/또는 태아 조혈 줄기 세포 형성을 모델로 하기 위한/연구하기 위한, 본 발명의 방법에 따라 수득된 XEN 세포, XEN-유사 세포, BXEN, iXEN 또는 시험관내-유래 XEN 세포, 또는 이의 집단 또는 오가노이드의 용도를 제공한다.
제2 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 시험관내-유래 또는 생산된 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조 (예컨대 블라스토이드 또는 아이블라스토이드)로부터 단리되거나 생산된 영양막 줄기 세포 (TSC)의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 제공한다. 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다.
이 측면에서, 본 발명은
- TSC를 유지하기에 적합한 TSC 배양 배지의 존재 하에 하나 이상의 세포외 기질 (ECM) 단백질을 포함하는 층 상에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 해리된 단일 세포를 배양하는 단계
를 포함함으로써, 인간 TSC를 생산하는, 인간 TSC를 생산하는 방법을 제공한다.
이 측면에서, 본 발명은
- 본원에 기재된 바와 같은 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 단일 세포로 해리하는 단계,
- 이러한 단일 세포를 TSC를 유지하기에 적합한 TSC 배양 배지의 존재 하에 하나 이상의 세포외 기질 (ECM) 단백질을 포함하는 층 상에서 배양하는 단계
를 포함함으로써, 인간 TSC를 생산하는, 인간 TSC를 생산하는 방법을 제공한다.
이 측면에서, 단일 세포는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일의 기간 동안 배양된다.
이 측면에서, TSC 배양 배지는 성장 인자, 바람직하게는 EGF, ROCK 억제제, HDAC 억제제, TGF-β 억제제 및 GSK-3 억제제를 포함할 수 있다. 바람직하게는 GSK-3 억제제는 CHIR99021을 포함하고, TGF-β 억제제는 SB431542 및 A83-01을 포함하고 HDAC 억제제는 발프로산을 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, TSC 배지는 본원에 추가로 기재된 바와 같이 문헌 [Okae et al. (2018) Cell Stem Cell, 22: 50-63]에 기재된 바와 같은 배지이다.
이 측면에서, 본 발명은
- 하나 이상의 EXM 단백질을 포함하는 층 상에 존재하는 TS 세포 (TSC)를 해리하는 단계;
- 해리된 세포를 TSC를 유지하기에 적합한 TSC 배양 배지의 존재 하에, 하나 이상의 세포외 기질 (ECM) 단백질을 포함하는 층 상에 1:4 내지 1:10의 분할 비율로 시딩하는 단계
를 포함함으로써, 인간 TSC를 배양하거나 유지하는, 인간 TSC 세포를 배양하거나 유지하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, TSC 세포는 3일, 4일, 5일 또는 6일마다 해리되거나 계대배양된다. 바람직하게는, 배양하거나 유지하기 위한 TSC는 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 수득된다.
이 측면의 임의의 실시양태에서, 하나 이상의 세포외 기질 (ECM) 단백질을 포함하는 층은 콜라겐, 피브로넥틴, 매트리겔, 겔트렉스 또는 라민의 층을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 콜라겐은 콜라겐 IV를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
TSC는 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 수득된 임의의 시험관내-유래 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 배양하고, TSC가 TSC 배양 배지에서 증식하도록 함으로써 생산될 수 있다.
본 발명의 이 측면의 임의의 실시양태에서, TSC를 해리하는 단계는 세포를 효소 또는 효소 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 세포의 탈착을 촉진하거나 응집된 배양물에서 성장하는 세포를 해리시키기에 적합한 단백질분해 및/또는 콜라겐분해 효소를 포함하는 임의의 효소 또는 효소 조성물이 사용될 수 있다. 임의의 실시양태에서, 효소 조성물은 아쿠타제®, 트립엘이®, 디스플라제, 콜라게나제, EDTA, 트립신, 또는 아쿠맥스®일 수 있다.
이 측면에서, 임의의 방법은 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 이 측면의 추가 실시양태에서, 본원에 기재된 본 발명의 제2 측면의 임의의 방법에 의해 수득될 수 있거나 수득된 단리된 TSC가 제공된다.
이 측면에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 본 발명의 제2 측면의 임의의 방법에 의해 생산된 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 제공한다.
추가 실시양태에서, TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포는 계대배양에서 유지될 때 이의 미분화 상태를 유지한다.
바람직하게는, TSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포는 적어도 5회, 적어도 10회, 적어도 15회, 적어도 20회, 적어도 40회 이상의 세포 배양 계대 동안 TSC의 적어도 하나의 특징을 유지한다.
이 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 수득된, TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포로부터 유래되거나 분화된 단리된 융모외 영양막(extravillous trophoblast) (EVT) 또는 합포체영양막(syncytiotrophoblast) (ST)을 제공한다.
이 측면의 임의의 방법에서, 방법은 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 분화시켜 EVT 또는 ST의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 세포를 분화시키는 단계는 본원에 기재된 바와 같은 EVT 또는 ST의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 생산시키기 위한 충분한 시간 동안 및 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
더 추가로, 방법은 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 재생 의약(regenerative medicine)에 사용하기 위해, 태반외 세포 유형으로 분화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, ST의 특징은 다음 중 하나 이상을 포함한다: SDC1+ 다핵 세포(multinucleated cell), 및 TSC에 비해 마커 CGA, CGB, PSG1, CSH1, HSD3B1, CYP19A1, SDC1 및 INHA 중 하나 이상의 증가된 발현. 추가 특징은 둥근, 다핵 형태를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, EVT의 특징은 다음 중 하나 이상을 포함한다: TSC에 비해 마커 HLA-G, PRG2, PAPPA2, MMP2, ITGA5 및 ATGA1 중 하나 이상의 증가된 발현. 추가 특징은 길쭉한(elongated) 스핀들(spindle)-유사 형태를 포함한다.
이 측면의 임의의 방법에서, 방법은 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 확대하여 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 집단내 세포의 비율을 증가시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 세포를 확대하는 단계는 하기에 기재된 바와 같이 세포 집단을 생산하기 위한 충분한 시간 동안 및 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
이 측면의 임의의 방법에서, 방법은 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 분화시켜 EVT 또는 ST의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 세포를 분화시키는 단계는 본원에 기재된 바와 같이 EVT 또는 ST의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 생산하기 위한 충분한 시간 동안 및 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
이 측면에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 TSC를 포함하는 세포의 집단을 제공한다. 바람직하게는, 세포의 적어도 5%가 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내고 이러한 세포는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 TSC 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내고 이러한 TSC는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 제2 측면의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있다.
이 측면에서, 본 발명은 또한 세포의 집단을 제공하며, 여기서 세포의 적어도 5%가 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포로부터 분화된 ST 또는 EVT이다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 본 발명에 따라 수득된 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 분화시킴으로써 수득된 ST 또는 EVT이다.
본 발명의 임의의 실시양태에서, TSC 배양 배지는 ROCK 억제제 트랜스-N-(4-피리딜)-4-(1-아미노에틸)-시클로헥산카르복스아미드 (Y-27632), 또는 이의 염을 포함한다.
추가 실시양태에서, TSC 배양 배지는 다음 중 하나 이상을 추가로 포함한다:
- 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리딜)-1H-이미다졸-2-일] 벤즈아미드 (SB 431542) 또는 이의 염;
- 6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸_2-일)-2-피리미디닐 아미노]에틸]아미노]미코티노니트릴 (CHIR 99021), 또는 이의 염; 및/또는
- A83-01 (3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카르보티오아미드), 또는 이의 염.
추가 실시양태에서, TSC 배지는 또한 Wnt 자극제 및 하나 이상의 TGFβ 억제제를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, TSC 배양물은 본원에 기재된 바와 같은 ASECRiAV이고, A83-01, SB431542, EGF, CHIR, ROCK 억제제, 아스코르브산 및 발프로산을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, TSC의 특성은 다음을 포함하는 것으로 이해될 것이다:
- 미분화, 이중전위 상태 및 융모외 영양막 (EVT) 또는 합포체영양막 (ST)의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포로 분화하는 능력;
- 자갈-형상의(cobblestone-shaped) 콜로니 외관;
- 비술파이트 검정(bisulfite assay) 또는 게놈-전체(genome-wide) DNA 메틸화 프로파일링 기술에 의해 결정된 바와 같은, 배반포-유래 TSC와 유사한 메틸화 패턴;
- 면역조직화학 및/또는 PCR 검정에 의해 결정된 바와 같은, TSC의 하나 이상의 생화학적 마커의 발현으로서, 바람직하게는 여기서 마커가 CD249 (아미노펩티다제 A), CD49f (iTGA6); 핵 GATA2/3, TFAP2C, P6 및 NR2F2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 발현;
- ATAC-seq를 사용하여 결정된 바와 같은 배반포-유래 TSC와 유사한 염색질 접근성의 수준;
- 배반포-유래 TSC와 유사한 히스톤 변형 프로파일 (예를 들어, H3K4me3, H3K27ac 유전자 변형);
- 배반포-유래 TSC와 유사한 프로테옴 또는 대사체 프로파일(metabolome profile).
추가 실시양태에서, TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포는 체세포를 특징짓는 마커의 부재를 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포는 하기 마커 중 하나 이상을 발현하지 않는다: OCT4 (POU5F1로도 칭해짐), NANOG, SOX2, SALL2, OTX2, BANCR, KLF17, DPPA3, ARGFX 및 DNMT3L.
임의의 실시양태에서, 본 발명에 따라 제조된 TSC는 본원에 기재된 바와 같은 TSC의 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 또는 적어도 다섯 가지 특징을 특징으로 한다.
본 발명은 또한
- 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는, TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포, 및
- 제약상 허용되는 부형제
를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한
- 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 TSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 분화함으로써 수득되거나 수득될 수 있는, ST 또는 EVT의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포, 및
- 제약상 허용되는 담체 또는 부형제
를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한
- 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는, TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포 또는 세포의 집단, 및/또는
- 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 TSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 분화함으로써 수득되거나 수득될 수 있는, ST 또는 EVT의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포 또는 세포의 집단, 및/또는
- ST 또는 EVT의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포 또는 세포의 집단으로부터 유래된 오가노이드로서, 여기서 세포가 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 TSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 분화함으로써 수득되거나 수득될 수 있는 오가노이드;
및
- 제약상 허용되는 담체 또는 부형제
를 포함하는 동종요법 또는 식이 보충제를 포함하는 조성물을 제공한다
본 발명은
- 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는, TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포 또는 세포의 집단, 및
- 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 TSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 분화함으로써 수득되거나 수득될 수 있는, ST 또는 EVT의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포 또는 세포의 집단, 및
- ST 또는 EVT의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포 또는 세포의 집단으로부터 유래된 오가노이드로서, 여기서 세포가 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 TSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 분화함으로써 수득되거나 수득될 수 있는 오가노이드
로부터 유래된 동종요법 또는 식이 보충제를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
본원에 기재된 본 발명의 제2 측면의 임의의 방법에서, 방법은
- 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 제조된 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포, 또는
- 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 제조된 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 포함하는 세포 집단, 또는
- 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 제조된 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포로부터 수득된, 분화된 세포 또는 분화된 세포의 집단을,
이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 태반 또는 배반포에
- 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 생산된 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포;
- 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 제조된 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 포함하는 세포 집단, 또는
- 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 제조된 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포로부터 수득된, 분화된 세포 또는 분화된 세포의 집단
을 도입하는 단계를 포함하는, 태반 또는 배반포를 증대시키는 방법이 제공된다.
본 발명은 또한 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 제조된 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포로부터 수득된 오가노이드 및/또는 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 제조된 TSC의 적어도 하나 이상의 특징을 나타내는 세포로부터 수득된 분화된 세포 (예를 들어, ST 또는 EVT)를 제공한다.
이 측면에서, 본 발명은 또한 TSC로부터 수득되거나 유래된 키메라 기관 또는 오가노이드 또는 TSC로부터 생산된 분화된 세포를 제공하며, 여기서 TSC는 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있다.
추가 측면에서, 영양막의 발생 및/또는 활성과 연관된 장애의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 제조된 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포 또는 세포의 집단, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 제조된 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포로부터 수득된 분화된 ST 또는 EVT, 또는 본 발명에 따른 제약 제품을 투여하는 단계를 포함함으로써, 상기 대상체에서 영양막의 발생 및/또는 활성과 연관된 장애를 치료 및/또는 예방하는, 상기 대상체에서 영양막의 발생 및/또는 활성과 연관된 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다.
본 발명은 또한 태반의 질환/장애의 치료를 의한 의약(medicament)의 제조에서의, TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는, 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 생산된 세포를 포함하는 세포 또는 세포의 집단의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 재프로그래밍된 세포는 태반의 질환 또는 병태(condition)를 개선하기 위해 개체에게 도입될 (이식될) 수 있다. 대안적으로, TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포는 본원에 기재된 바와 같은 의약의 제조에 사용하기 전에 분화될 수 있다.
본 발명의 제2 측면의 임의의 실시양태에서, 질환은 재발성 유산(recurrent miscarriage), 자간전증(preeclampsia), 태아 성장 제한(fetal growth restriction) (FGR), 포상 기태(hydratiform mole) 및 융모막암종(choriocarcinoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 본 측면은 또한
- 본 발명에 따라 제조된 단리된 TSC 또는 태반을 후보 작용제와 접촉시키는 단계;
- 상기 작용제와의 접촉 후 단리된 TSC 또는 태반의 발생 및/또는 활성을 작용제를 사용하지 않은 TSC 또는 태반의 발생 및/또는 활성과 비교하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 작용제를 사용하지 않은 TSC 또는 태반의 발생에 비해 미리 결정된 수준 초과의 TSC 또는 태반의 발생 및/또는 활성에 대한 상기 작용제의 효과가 작용제가 영양막 발생 및/또는 활성을 조절함을 나타내는 것인,
영양막 발생 및/또는 활성을 조절할 수 있는 작용제를 확인하는 방법을 제공한다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 제2의 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 TSC의 적어도 하나의 특징을 포함하는 세포 또는 세포의 집단, 또는 이를 포함하는 배양물을 배양하는 단계, 및 세포에 의해 분비된 화합물을 상기 배양 배지로부터 단리하여, 영양막에 의해 생산된 화합물을 수득하는 단계를 포함하는, 영양막에 의해 생산된 화합물을 수득하는 방법이 있다,
추가 실시양태는 ST 또는 EVT, 또는 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 TSC의 적어도 하나의 특징을 포함하는 세포를 분화함으로써 수득된 ST 또는 EVT의 집단을 배양하는 단계, 및 세포에 의해 분비된 화합물 또는 입자를 배양 배지로부터 단리하여, EVT 또는 ST에 의해 생산된 화합물 또는 입자를 수득하는 단계를 포함하는, EVT 또는 ST에 의해 분비된 화합물 또는 입자를 수득하는 방법을 제공한다.
화합물은 호르몬 또는 성장 인자일 수 있다. 세포에 의해 분비되는 입자는 엑소좀과 같은 세포외 소포일 수 있다.
추가 실시양태는 또한 본 발명의 제2 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 본원에 개시된 바와 같은 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 본 발명의 제2 측면에 따라 개시된 바와 같은 체세포, 재프로그래밍 인자, 및 TSC 배양 배지를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 키트는 섬유모세포인 체세포와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 바와 같은 방법에 따라 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포로 체세포를 재프로그래밍하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 방법에 사용될 때 키트를 제공한다.
키트는 또한 TSC를 EVT 또는 ST 운명(fate), 또는 다른 비-태반 분화된 세포 유형으로 분화시키는데 적합한 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, TSC는 TSC-유사 세포, 아이블라스토이드 (B)-유래 TSC (BTSC) 세포 또는 iTSC로도 지칭될 수 있다.
제3 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 시험관내-유래 또는 생산된 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조 (예컨대 블라스토이드 또는 아이블라스토이드)로부터 생산되거나 단리된 나이브 다능성 줄기 세포(nave pluripotent stem cell) (nPSC)의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 제공한다. 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다.
이 측면에서, 본 발명은
- 세포를 나이브 다능성 상태로 촉진하기 위한 배양 배지의 존재 하에 피더 층 상에서 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 해리된 단일 세포를 배양하는 단계
를 포함함으로써, nPSC를 생산하는, 인간 nPSC를 생산하는 방법을 제공한다.
이 측면에서, 본 발명은
- 본원에 기재된 바와 같은 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 단일 세포로 해리하는 단계,
- 이러한 단일 세포를 세포를 나이브 다능성 상태로 촉진하기 위한 배양 배지의 존재 하에 피더 층 상에서 배양하는 단계
를 포함함으로써, nPSC를 생산하는, 인간 nPSC를 생산하는 방법을 제공한다.
이 측면에서, 피더 층은 섬유모세포 세포, 예를 들어 방사선조사된 마우스 배아 섬유모세포 (iMEF)를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
이 측면에서, 단일 세포는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일의 기간 동안 배양된다.
이 측면에서, 나이브 다능성 상태를 촉진하기 위한 배양 배지는 MEK 억제제, PKC 억제제, GSK3 억제제, STAT3 활성화제 및 ROCK 억제제를 포함한다. 예시적인, MEK 억제제, PKC 억제제, GSK3 억제제, STAT3 활성화제 및 ROCK 억제제가 본원에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 나이브 다능성 상태를 촉진하기 위한 배양 배지는 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 t2iLGoY 배지이다.
이 측면에서, 본 발명은
- 피더 층 상에 존재하는 nPSC를 해리하는 단계;
- 해리된 세포를 세포를 나이브 다능성 상태로 촉진하기 위한 배양 배지의 존재 하에, 피더 층 상에 1:10 내지 1:20의 분할 비율로 시딩하는 단계
를 포함함으로써, 인간 nPSC를 배양하거나 유지하는, 인간 nPSC 세포를 배양하거나 유지하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, nPSC는 3일, 4일, 5일 또는 6일마다 해리되거나 계대배양된다. 바람직하게는, 배양하거나 유지하기 위한 nPSC는 본 발명의 제3 측면의 방법에 따라 수득된다.
바람직하게는, 피더 층은 섬유모세포, 예를 들어 방사선조사된 마우스 배아 섬유모세포 (iMEF)를 포함하거나 이로 이루어된다.
nPSC는 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 수득된 임의의 시험관내-유래 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 배양하고 nPSC가 nPSC 배양 배지에서 증식하도록 함으로써 생산될 수 있다.
본 발명의 이 측면의 임의의 실시양태에서, nPSC를 해리하는 단계는 세포를 효소 또는 효소 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 세포의 탈착을 촉진하거나 응집된 배양물에서 성장하는 세포를 해리시키기에 적합한 단백질분해 및/또는 콜라겐분해 효소를 포함하는 임의의 효소 또는 효소 조성물이 사용될 수 있다. 임의의 실시양태에서, 효소 조성물은 아쿠타제®, 트립엘이®, 디스플라제, 콜라게나제, EDTA, 트립신, 또는 아쿠맥스®일 수 있다.
이 측면에서, 임의의 방법은 nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 이 측면의 추가 실시양태에서, 본원에 기재된 본 발명의 제3 측면의 임의의 방법에 의해 수득될 수 있거나 수득된 단리된 nPSC가 제공된다.
이 측면에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 제3 측면의 방법에 의해 생산된 nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 제공한다.
추가 실시양태에서, nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포는 계대배양에서 유지될 때 이의 미분화 상태를 유지한다.
본원에 사용된 바와 같이, "나이브 다능성 상태" 또는 "나이브 다능성 표현형"은 또한 둥근, 돔-형상(round, dome-shaped)인 세포를 포함하는 세포 형태 또는 표현형을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다. 나이브 다능성 상태는 또한 KLF2, KLF4, TFCP2L1, TBX3, REX1, GBX2, STELLA (DPPA3), KLF17, DPPA5, TFCP2L1, MAEL, UTF1, ZFP57, DNMT3L, FGF4, FOXR1, ARGFX, TRIM60, DDX43, BRDT, ALPPL2, KHDC3L, KHDC1L, PRAP1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, SOX2, E-카드헤린(cadherin(, UTF-1, OCT4 (POU5F1), REX1, 및 NANOG로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23개 또는 모든 마커, 또는 표 5를 포함하여 본원에 기재된 바와 같은 나이브 다능성의 기타 마커의 발현을 또한 포함할 수 있다. 이들 형태학적, 표현형 또는 생화학적 마커 중 임의의 것은 본원에서 nPSC의 특징으로서 지칭된다.
추가 실시양태에서, nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포는 체세포를 특징짓는 마커의 부재를 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포는 하기 마커 중 하나 이상을 발현하지 않는다: ANPEP, TWIST2, ZIC2, SFRP2, KRT7, ITGA2.
바람직하게는, nPSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포는 적어도 5회, 적어도 10회, 적어도 15회, 적어도 20회, 적어도 40회 이상의 세포 배양 계대 동안 nPSC의 적어도 하나의 특징을 유지한다.
이 측면의 임의의 방법에서, 방법은 nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 확대시켜 nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 집단내 세포의 비율을 증가시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 세포를 확대시키는 단계는 하기에 기재된 바와 같이 세포의 집단을 생산하기 위한 충분한 시간 동안 및 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
이 측면에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 nPSC를 포함하는 세포의 집단을 제공한다. 바람직하게는, 세포의 적어도 5%가 nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내고 이러한 세포는 본원에 기재된 방법에 의해 생산된다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내며 이러한 nPSC는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 제3 측면의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있다.
이 측면의 임의의 방법에서, 방법은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 nPSC를 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 세포를 분화시키는 단계는 nPSC를 다능성 상태가 아닌 세포 또는 분화된 세포의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 생산하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 배양하는 것을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 이러한 제3 측면의 추가 실시양태에서, 본원에 기재된 본 발명의 제3 측면의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는, nPSC로부터 생산된 분화된 세포가 제공된다. 추가 실시양태에서, 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는, nPSC로부터 생산된, 단리된 분화된 세포가 제공된다. 추가로, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 제3 측면의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는, nPSC로부터 생산된 분화된 세포를 포함하는 세포의 집단을 제공한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 세포의 집단이 제공되며, 여기서 세포의 적어도 5%는 분화된 세포이고 이러한 분화된 세포는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 제3 측면의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 nPSC로부터 생산된다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 분화된 세포이고 이러한 분화된 세포는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 제3 측면의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 nPSC로부터 생산된다.
본 발명의 제3 측면의 추가 실시양태에서, nPSC/nPSC로부터 생산된 분화된 세포의 집단으로부터 유래된 세포의 오가노이드 또는 기타 조직화된 집합체(organised collection)가 또한 제공되며, 여기서 nPSC는 본 발명의 제3 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있다.
이 측면에서, 본 발명은 또한 nPSC 또는 nPSC로부터 생산된 분화된 세포로부터 수득되거나 유래된 키메라 기관 또는 오가노이드를 제공하며, 여기서 nPSC는 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있다.
추가 실시양태에서,
- 본 발명의 제3 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는, nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포, 및
- 제약상 허용되는 담체 또는 부형제
를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
추가 실시양태에서,
- 본 발명의 제3 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는, nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포 또는 세포의 집단
- 본 발명의 제3 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 단리된 nPSC 또는 nPSC의 집단;
- 본 발명의 제3 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 하나 이상의 nPSC로부터 유래된, 단리된 분화된 세포, 또는 분화된 세포의 집단; 또는
- nPSC/nPSC로부터 생산된 분화된 세포의 집단으로부터 유래된 오가노이드로서, 여기서 nPSC가 본 발명의 제3 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는, 오가노이드;
및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제
를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
추가로, nPSC 또는 세포의 집단의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게
- 본 발명의 제3 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 단리된 nPSC 또는 nPSC의 집단;
- 본 발명의 제3 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 하나 이상의 nPSC로부터 유래된, 단리된 분화된 세포, 또는 분화된 세포의 집단; 또는
- nPSC/nPSC로부터 생산된 분화된 세포의 집단으로부터 유래된 오가노이드로서, 여기서 nPSC가 본 발명의 제3 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 오가노이드를 투여하는 단계
를 포함하는, nPSC 또는 세포의 집단의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 제공된다.
또한, 다능성 줄기 세포, 또는 이로부터 유래된 분화된 세포의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 본 발명의 제3 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 nPSC의 용도가 제공된다.
추가 실시양태는 본원에 개시된 바와 같은, 제3 측면에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하기 위한 키트에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 키트는 체세포, 재프로그래밍 인자, 및 본원에 개시된 바와 같은 나이브 다능성 상태를 촉진하기 위한 배양 배지를 포함한다. 바람직하게는, 키트는 nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 키트는 섬유모세포인 체세포와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제3 측면의 방법에 따라 nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포로 체세포를 재프로그래밍하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 제3 측면의 방법에 사용될 때 키트를 제공한다. 추가로, 키트는 본 발명의 제3 측면의 방법에 따라 생산된 nPSC를 분화하기 위한 서면 설명서 및/또는 시약을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, nPSC는 nPSC-유사 세포, 아이블라스토이드 (B)-유래 nPSC (BnPSC 또는 나이브 BPSC) 또는 inPSC로도 지칭될 수 있다.
제4 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 시험관내-유래 또는 생산된 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조 (예컨대 블라스토이드 또는 아이블라스토이드)로부터 생산되거나 단리된 프라이밍된 다능성 줄기 세포(primed pluripotent stem cell) (pPSC)의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 제공한다. 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다.
이 측면에서, 본 발명은
- 세포를 프라이밍된 다능성 상태로 촉진하기 위한 배양 배지의 존재 하에 비트로넥틴 층 상에서 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 해리된 단일 세포를 배양하는 단계
를 포함함으로써, pPSC를 생산하는, 인간 pPSC를 생산하는 방법을 제공한다.
이 측면에서, 본 발명은
- 본원에 기재된 바와 같은 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 단일 세포로 해리하는 단계,
- 이러한 단일 세포를 세포를 프라이밍된 다능성 상태로 촉진하기 위한 배양 배지의 존재 하에 하나 이상의 세포외 기질 (ECM) 층 단백질을 포함하는 층 상에서 배양하는 단계
를 포함함으로써, pPSC를 생산하는, 인간 pPSC를 생산하는 방법을 제공한다.
이 측면에서, 하나 이상의 세포외 기질 (ECM) 층 단백질을 포함하는 층은 비트로넥틴, 또는 기저막 추출물 (BME)을 포함하는 배양 기질, 임의로 매트리겔 또는 겔트렉스 배양 기질을 포함한다.
이 측면에서, 단일 세포는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일의 기간 동안 배양된다.
이 측면에서, 프라이밍된 다능성 상태를 촉진하기 위한 배양 배지는 표 1을 포함하여 본원에 기재된 임의의 배지를 포함한다.
이 측면에서, 본 발명은
- ECM 층 상에 존재하는 pPSC를 해리하는 단계;
- 해리된 세포를 세포를 프라이밍된 다능성 상태로 촉진하기 위한 배양 배지의 존재 하에, 하나 이상의 세포외 기질 (ECM) 층 단백질을 포함하는 층 상에 1:20 내지 1:40의 분할 비율로 시딩하는 단계
를 포함함으로써, 인간 pPSC를 배양하거나 유지하는, 인간 pPSC 세포를 배양하거나 유지하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, pPSC는 3일, 4일, 5일 또는 6일마다 해리되거나 계대배양된다. 바람직하게는, 배양하거나 유지하기 위한 pPSC는 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 수득된다.
바람직하게는, 하나 이상의 세포외 기질 (ECM) 단백질을 포함하는 층은 비트로넥틴, 또는 기저막 추출물 (BME)을 포함하는 배양 기질, 임의로 매트리겔 또는 겔트렉스를 포함한다.
pPSC는 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 수득된 임의의 시험관내-유래 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 배양하고 nPSC가 nPSC 배양 배지에서 증식하도록 함으로써 생산될 수 있다.
본 발명의 이 측면의 임의의 실시양태에서, pPSC를 해리하는 단계는 세포를 효소 또는 효소 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 세포의 탈착을 촉진하거나 응집된 배양물에서 성장하는 세포를 해리시키기에 적합한 단백질분해 및/또는 콜라겐분해 효소를 포함하는 임의의 효소 또는 효소 조성물이 사용될 수 있다. 임의의 실시양태에서, 효소 조성물은 아쿠타제®, 트립엘이®, 디스플라제, 콜라게나제, EDTA, 트립신, 또는 아쿠맥스®일 수 있다.
이 측면에서, 임의의 방법은 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 이 측면의 추가 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있거나 수득된 단리된 pPSC가 제공된다.
이 측면에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 제공한다.
추가 실시양태에서, pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포는 계대배양에서 유지될 때 이의 미분화 상태를 유지한다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이밍된 다능성 상태" 또는 "프라이밍된 다능성 표현형"은 전형적으로 편평 세포 콜로니(flat cell colony)의 존재를 특징으로 하는 세포 표현형 또는 형태를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 프라이밍된 다능성 상태는 착상 후(post-implantation) 에피블라스트(epiblast) 특이적 전사 인자의 하나 이상의 mRNA를 발현하는 다능성 세포를 지칭한다. 예를 들어, 프라이밍된 세포는 SFP, EOMES, BRACHYURY, OTX2, ZIC2, ZIC3, ZIC5, DNMT3B, KDR, CDH2, CER1, COL2A1, DAZL, TCF7L1, SOX11, SALL2, SOX2, NANOG, KLF4, EPCAM, PRDM14, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, E-카드헤린, UTF-1, OCT4 (POU5F1) 및 REX1 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 모두를 발현할 수 있거나, 또는 표 5를 포함하여 본원에 기재된 바와 같은 프라이밍된 다능성 상태의 기타 마커를 발현할 수 있다. 이들 형태학적, 표현형 또는 생화학적 마커 중 임의의 것은 본원에서 pPSC의 특징으로서 지칭된다.
추가 실시양태에서, pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포는 체세포를 특징짓는 마커의 부재를 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포는 하기 마커 중 하나 이상을 발현하지 않는다: ANPEP, TWIST2, KLF17, DNMT3L, KRT7, ITGA2.
바람직하게는, pPSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포는 적어도 5회, 적어도 10회, 적어도 15회, 적어도 20회, 적어도 40회 이상의 세포 배양 계대 동안 pPSC의 적어도 하나의 특징을 유지한다.
이 측면의 임의의 방법에서, 방법은 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 확대시켜 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 집단내 세포의 비율을 증가시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 세포를 확대시키는 단계는 하기에 기재된 바와 같이 세포의 집단을 생산하기 위한 충분한 시간 동안 및 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
이 측면에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 제4 측면의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 pPSC를 포함하는 세포의 집단을 제공한다. 바람직하게는, 세포의 적어도 5%가 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내고 이러한 세포는 본원에 기재된 방법에 의해 생산된다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내며 이러한 pPSC는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 제4 측면의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있다.
이 측면의 임의의 방법에서, 방법은 본원에 기재된 본 발명의 제4 측면의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 pPSC를 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 세포를 분화시키는 단계는 pPSC를 다능성 상태가 아닌 세포 또는 분화된 세포의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 생산하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 배양하는 것을 포함할 수 있다.
따라서, 추가 실시양태는 본원에 기재된 본 발명의 제4 측면의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는, pPSC로부터 생산된 분화된 세포를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 제4 측면의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는, pPSC로부터 생산된, 단리된 분화된 세포가 제공된다. 추가로, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 제4 측면의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는, pPSC로부터 생산된 분화된 세포를 포함하는 세포의 집단이 제공된다. 바람직하게는, 세포의 집단이 제공되며, 여기서 세포의 적어도 5%는 분화된 세포이고 이러한 분화된 세포는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 제4 측면의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 pPSC로부터 생산된다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 분화된 세포이고 이러한 분화된 세포는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 제4 측면의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 pPSC로부터 생산된다.
이 측면에서, 본 발명은 또한, pPSC/pPSC로부터 생산된 분화된 세포의 집단으로부터 유래된 세포의 오가노이드 또는 기타 조직화된 집합체를 제공하며, 여기서 pPSC는 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있다.
추가로, 본 발명은 또한 pPSC, 또는 pPSC로부터 생산된 분화된 세포로부터 수득되거나 유래된 키메라 기관 또는 오가노이드를 제공하며, 여기서 pPSC는 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있다.
본 발명의 제4 측면의 추가 실시양태에서, 또한
- 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는, pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포, 및
- 제약상 허용되는 담체 또는 부형제
를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
추가 실시양태에서,
- 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는, pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포 또는 세포의 집단;
- 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 단리된 pPSC, 또는 pPSC의 집단;
- 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 하나 이상의 pPSC로부터 유래된, 단리된 분화된 세포, 또는 분화된 세포의 집단; 또는
- pPSC/pPSC로부터 생산된 분화된 세포의 집단으로부터 유래된 오가노이드로서, 여기서 pPSC가 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는, 오가노이드;
및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제
를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
추가로, 본 발명의 본 측면은 pPSC, 또는 세포의 집단의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게
- 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 단리된 pPSC, 또는 pPSC의 집단;
- 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 하나 이상의 pPSC로부터 유래된, 단리된 분화된 세포, 또는 분화된 세포의 집단; 또는
- pPSC/pPSC로부터 생산된 분화된 세포의 집단으로부터 유래된 오가노이드로서, 여기서 pPSC가 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 오가노이드를 투여하는 단계
를 포함하는, nPSC 또는 세포의 집단의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 다능성 줄기 세포, 또는 이로부터 유래된 분화된 세포의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 pPSC의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하기 위한 키트에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 키트는 체세포, 재프로그래밍 인자, 및 본원에 개시된 바와 같은 프라이밍된 다능성 상태를 촉진하기 위한 배양 배지를 포함한다. 바람직하게는, 키트는 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 키트는 섬유모세포인 체세포와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포로 체세포를 재프로그래밍하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 제4 측면의 방법에 사용될 때 키트를 제공한다. 추가로, 키트는 본 발명의 제4 측면의 방법에 따라 생산된 pPSC를 분화하기 위한 서면 설명서 및/또는 시약을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, pPSC는 pPSC-유사 세포, 아이블라스토이드 (B)-유래 pPSC (BpPSC 또는 프라이밍된 BPSC) 또는 ipPSC로도 지칭될 수 있다.
제1, 제2, 제3 또는 제4 측면 중 임의의 측면을 포함한, 본원의 임의의 측면에서, 방법은 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조 (예컨대 블라스토이드 또는 아이블라스토이드)를 생산하는 단계를 추가로 포함한다.
제1, 제2, 제3 또는 제4 측면 중 임의의 측면을 포함한, 본원의 임의의 측면에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 생산하는 방법은 본원에 추가로 기재된 바와 같은 임의의 방법을 포함한다.
제1, 제2, 제3 또는 제4 측면 중 임의의 측면을 포함한, 본원의 임의의 측면에서, 다세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 유래되거나, 단리되거나, 수득된 세포 또는 세포의 집단은 자기-갱신할 수 있다. 환언하면, 다세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 유래되거나, 단리되거나, 수득된 세포 또는 세포의 집단은 이들이 배양 상태로 유지될 수 있는 것을 특징으로 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 요구되는 경우를 제외하고, 용어 "포함하다" 및 "포함하는", "포함한다" 및 "포함된"과 같은 상기 용어의 변형은 추가의 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다.
선행 단락에 기재된 본 발명의 추가 측면 및 상기 측면의 추가 실시양태는 예로서 그리고 첨부 도면을 참조하여 주어진, 하기 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1. 재프로그래밍에 의한 인간 아이블라스토이드의 생산. a, 재프로그래밍 및 아이블라스토이드 유도를 위한 실험 설계. b, 아이블라스토이드 (n=5)의 위상차(Phase-contrast) 이미지. 눈금 막대, 50 μm. c, NANOG (n=5)에 대한 아이블라스토이드의 위상차 및 면역염색 이미지. 눈금 막대, 50 μm. d-h, 인간 배반포와 비교한 아이블라스토이드 (n=18)의 x- 및 y-축 직경, x/y 종횡비, 투사 면적의 측정 (Shahbazi, M. N. et al. Nat. Cell Biol. 18, 700-708 (2016); Blakeley, P. et al. Development 142, 3613 (2015); Petropoulos, S. et al. Cell 165, 1012-1026 (2016); Xiang, L. et al. Nature 577, 537-542 (2020); Qin, H. et al. Cell Rep. 14, 2301-2312 (2016); Liu, L. et al. Nat. Commun. 10, 364 (2019); Durruthy-Durruthy, J. et al. Dev. Cell 38, 100-115 (2016); Fogarty, N. M. E. et al. Nature 550, 67-73 (2017)) (n=8). i, 아이블라스토이드 (n=14)의 총 세포 수 추정. j, CDX2 및 NANOG (n=5)에 대해 염색된 아이블라스토이드의 3D 및 2D 표시. 눈금 막대, 20 μm. k-l, 화살촉에 의해 표시된 바와 같은 포배강-유사 강(blastocoel-like cavity)을 예시하는, 아이블라스토이드 (n=5)의 대표적인 DIC 표시 및 CDX2, NANOG 면역염색. 눈금 막대, 10 μm. m, GATA2, OCT4 및 SOX2 (n=3)에 대한 아이블라스토이드의 면역염색. 눈금 막대, 20 μm. n, SOX17 양성 PE-유사 세포 (n=2)를 나타내는 ICM-유사 구획(compartment)-줌(zoom)으로 GATA2, NANOG 및 SOX17에 대해 염색된 아이블라스토이드. o, CDX2 낮음 및 GATA6 양성 PE-유사 세포 (n=2)를 나타내는 ICM-유사 구획-줌으로 CDX2, OCT4 및 GATA6에 대해 염색된 아이블라스토이드. n-o의 경우 눈금 막대 = 10 μm. p-q, (q) 형태학적 차이 (n=2)를 강조하는 EPI-유사 및 TE-유사 줌-인(zoom-in)으로 F-액틴 및 NANOG에 대해 염색된 아이블라스토이드의 대표 이미지. r, F-액틴 (담청색) 및 NANOG (주황색)를 기반으로 하는 (p)의 아이블라스토이드의 3D 세그먼트화(segmentation). p-r의 경우 눈금 막대 = 전체 아이블라스토이드의 경우 10 μm, ICM 줌의 경우 2 μm. s, F-액틴, OCT4 및 KRT8 공동-염색(co-staining), n=2.
도 2. 아이블라스토이드의 생산 및 특성화. a, EPI, TE, 및 PE-유사 집단의 존재를 나타내는 21일차 재프로그래밍 중간체의 scRNA-seq 분석. b, 아이블라스토이드 형성의 시간-경과 위상차 이미지 (n=5). 눈금 막대, 100 μm. c, 강 형성을 가진 아이블라스토이드의 정량화 (n=100). 눈금 막대, 20 μm. d, 고전적인 섬유모세포 형태 (n=2)를 갖는 섬유모세포 배지에서 전파된, 아이블라스토이드 형성 동안 마이크로웰 가장자리에 부착된 불응성 HDFa의 대표적인 위상차 이미지. 눈금 막대, 100 μm. e, CDX2 및 NANOG (n=5)에 대해 염색된 아이블라스토이드의 3D 및 2D 표시. 눈금 막대, 20 μm. f, GATA2, NANOG, 및 SOX17 (n=2)에 대해 염색된 아이블라스토이드. g, CDX2, OCT4, 및 GATA6 (n=2)에 대해 염색된 아이블라스토이드. 눈금 막대, f-g의 경우 20 μm. h, 21일차 재프로그래밍된 세포에서 상이한 기존 세포 집단의 정량화; n = 3. i, 아이블라스토이드의 득점에 사용되는 평가 기준. j, 득점 평가를 위해 포함된 아이블라스토이드의 위상차 이미지, n=24. 눈금 막대, 100 μm. k, (h)에 따른 (i)의 아이블라스토이드에 대한 ICM 및 TE의 평균 등급, n=24.
도 3. 아이블라스토이드의 단일 세포 전사체 프로파일링. a, 아이블라스토이드를 사용한 scRNA-seq 실험을 위한 실험 설계. b, 아이블라스토이드 scRNA-seq 라이브러리로부터의 6858 세포에 대한 EPI 마커 (POU5F1 및 NANOG), TE 마커 (CDX2 및 GATA2), 및 PE 마커 (SOX17 및 GATA6)의 발현. c, 아이블라스토이드 scRNA-seq 데이터세트의 UMAP에서 EPI, TE 및 EPI 시그니처에 대한 세포당 발현 점수. d, 클러스터 명칭이 배정된 아이블라스토이드 데이터세트의 감독되지 않은 클러스터링. e, 배반포 (블레이클리(Blakeley) 및 페트로포울로스(Petropoulos))로부터의 EPI, TE, 및 PE 세포와 함께 아이블라스토이드 EPI, TE, 및 PE 세포를 나타내는 통합 데이터세트의 UMAP 프로젝션. f, 통합 데이터세트의 EPI, TE, 및 PE 시그니처의 세포당 발현 점수. g, 클러스터 명칭이 배정된 통합 데이터세트의 감독되지 않은 클러스터링. h, 통합 분석 전에 각각의 원래 세포 ID를 가진 각각의 통합 클러스터 내의 아이블라스토이드 및 인간 배반포 데이터세트 (블레이클리 및 페트로포울로스)에 대한 세포의 비율. i, 배반포 (블레이클리 및 페트로포울로스)로부터의 주석이 달린 EPI, TE, 및 PE 클러스터와 아이블라스토이드 EPI, TE, 및 PE 클러스터의 피어슨(Pearson) 상관관계 분석. j, k, 아이블라스토이드 scRNA-seq TE 클러스터에서 정의된 벽재성(mural) 및 극성(polar) TE 시그니처의 세포당 발현 점수. l, UMAP 성분 1에 따른 벽재성 및 극성 TE 시그니처에 대한 비닝된(binned) 하위유형 점수. m, CCR7에 대한 아이블라스토이드의 면역염색, n=4. 눈금 막대, 20 μm. n, 아이블라스토이드에 대한 극성 및 벽재성 TE의 CCR7 형광 강도, n=4. 각각의 박스 안의 선은 중앙값을 나타내고 세선(whisker)은 각각 최대값 및 최소값을 나타낸다.
도 4. scRNA-seq 파이프라인 및 품질 제어. a, scRNA-seq 분석 전략 (세부 내용은 방법 참조). b, 아이블라스토이드에 대한 공여자 세포 분포의 UMAP 표시. c, 아이블라스토이드 scRNA-seq 라이브러리에 대한 세포 주기의 UMAP 표시. d, 아이블라스토이드에서 센다이(Sendai)-KLF4, 센다이-KOS 및 센다이-MYC의 표현. e, 페트로포울로스 scRNA-seq 라이브러리 (페트로포울로스)에 대한 EPI 마커 (POU5F1 및 NANOG), TE 마커 (CDX2 및GATA2), 및 PE 마커 (SOX17 및 GATA6)의 발현. f, g, 아이블라스토이드 데이터세트의 UMAP에 대한 비-재프로그래밍 시그니처 및 IFI27 발현의 표현.
도 5. 배반포 및 아이블라스토이드에 대한 정의된 E5-7 EPI, TE, 및 PE 시그니처의 득점. a, 페트로포울로스 scRNA-seq 데이터세트 (페트로포울로스)에서 E5, E6, 및 E7 발달일에 대한 정의된 EPI, TE, 및 PE 시그니처. b, 아이블라스토이드 scRNA-seq 데이터세트에서 E5, E6, 및 E7 발달일에 대해 정의된 EPI, TE, 및 PE 시그니처.
도 6. 아이블라스토이드 및 배반포 데이터세트의 scRNA-seq 분석. a, 배정된 모든 클러스터에서 각각의 공여자의 세포의 비율. b, 아이블라스토이드 scRNA-seq 데이터세트에서 각각의 배정된 클러스터 (각각 상위 10개 유전자)의 유전자 발현 프로파일을 나타내는 히트맵. c, 통합 데이터세트에서 아이블라스토이드 및 배반포 (블레이클리 및 페트로포울로스)의 세포 분포를 나타내는 UMAP 프로젝션. d, 아이블라스토이드 및 E5-7 배반포 (블레이클리 및 페트로포울로스)에 대한 EPI 마커 (POU5F1 및 NANOG), TE 마커 (CDX2 및 GATA2), 및 PE 마커 (SOX17 및 GATA6)의 발현. e, 배반포 (블레이클리 및 페트로포울로스)로부터의 주석이 달린 EPI, TE, 및 PE 클러스터와 아이블라스토이드 EPI, TE, 및 PE 클러스터의 피어슨 상관관계 분석.
도 7. 아이블라스토이드를 사용한 인간 시험관내 착상 모델링. a, 부착 1일, 3일 및 4.5일 (n=5)에서 아이블라스토이드의 대표적인 위상차 이미지. 눈금 막대, 100 μm, b, GATA2, NANOG, 및 SOX17 공동-염색, n=2. c, CDX2, OCT4, 및 GATA6 공동-염색, n=2. d, F-액틴, OCT4 및 aPKC 공동-염색, 양막 전구체-유사 강(pro-amniotic-like cavity)은 화살촉에 의해 표시됨, n=2. e, KRT7 및 NANOG 공동-염색, n=4. f, F-액틴 및 NANOG 공동-염색, 에피블라스트-유사 세포 및 추정 ST 및 EVT가 표시된다 (n=2). g, MMP2 및 hCG 공동-염색, n=2. 눈금 막대, 50 μm; 줌-인의 경우 10 μm. h, 부착된 아이블라스토이드에서 ST 및 EVT 마커의 qRT-PCR 분석, 평균 ± s.e.m, n=5. i, 부착된 아이블라스토이드로부터 수집된 컨디셔닝된 배지를 사용하여 hCG ELISA에 의해 검출된 hCG 단백질 수준, 평균 ± s.e.m, n=4.
도 8. 부착된 아이블라스토이드에서 에피블라스트 발달의 평가.. a, 아이블라스토이드 시험관내 부착 검정을 위한 실험 설계의 개략도. b, 첨부 검정에서 최대 5일 동안 아이블라스토이드에서 원시선(원시선) 마커 (TBXT, EOMES ,및 MIXL1)의 시간-경과 qRT-PCR 분석. TBXT, EOMES, 및 MIXL1에 대한 양성 대조군은 이전에 발표된 중배엽 분화 프로토콜 (Lam et al., 2014, J. Am. Soc. Nephrol) (n=6)을 사용하여 생산되었다 c, CDX2 및 NANOG (n=5)에 대해 염색된 부착된 아이블라스토이드. d, GATA2, OCT4, 및 SOX2 (n=3)에 대해 염색된 부착된 아이블라스토이드. e, NANOG, 및 SOX17 (n=2)에 대해 염색된 부착된 아이블라스토이드의 줌-인 뷰(view). f, OCT4, 및 GATA6 (n=2)에 대해 염색된 부착된 아이블라스토이드의 줌-인 뷰. c-f의 경우 눈금 막대, 100 μm. g, 양막 전구체강(pro-amniotic cavity)의 줌-인 뷰로 F-액틴, OCT4 및 aPKC로 염색된 부착된 아이블라스토이드의 Z-섹션 시리즈, n=2. 눈금 막대, 20μm. h, F-액틴, OCT4 및 aPKC에 대한 아이블라스토이드의 면역염색, 1일차 부착된 아이블라스토이드 및 3일차 부착된 아이블라스토이드, n=2. 눈금 막대, 20 μm. 양막 전구체-유사 강의 외관은 화살표로 표시된다. i, KRT7 및 NANOG에 대한 아이블라스토이드의 면역염색 및 부착된 아이블라스토이드, n=4. j, F-액틴 및 NANOG에 대해 염색된 부착된 아이블라스토이드, n=2,. k, MMP2 및 hCG에 대한 아이블라스토이드의 면역염색 및 부착된 아이블라스토이드, n=2.
도 9. 아이블라스토이드로부터 줄기 세포의 유도. a, 나이브 bPSC, 프라이밍된 bPSC 및 bTSC 유도를 위한 실험 설계. 나이브 bPSC (b,c), 프라이밍된 bPSC (d,e) 및 bTSC (f,g)의 위상차 및 면역염색 분석. n=2. 모든 눈금 막대, 100 μm.
도 10. (a) GFP 리포터를 가진 나이브 iPSC. 눈금 막대: 100 μm. (b): 엠체리(mCherry) 리포터를 가진 iTSC. 눈금 막대: 100 μm. (c): 나이브 iPSC 및 iTSC의 어셈블리. 눈금 막대: 20 μm. (d): 나이브 iPSC 단독의 어셈블리. 눈금 막대: 20 μm. (e): iTSC 단독의 어셈블리. 눈금 막대: 20 μm. (f): 다능성 마커 OCT4 및 TSC 마커 KRT7을 사용한, 나이브 iPSC 및 iTSC, 나이브 iPSC 단독 및 iTSC 단독 어셈블리된 구조의 면역염색. 눈금 막대: 20 μm. (g): 다능성 마커 NANOG 및 TSC 마커 CDX2를 사용한, 나이브 iPSC 단독 어셈블리된 구조의 면역염색. 눈금 막대: 20 μm.
도 11. 아이블라스토이드로부터 유래된 줄기 세포의 특성화. a, 나이브 bPSC, 프라이밍된 bPSC 및 bTSC의 특성화를 위한 실험 설계의 개략도. b, KLF17 및 NANOG에 대한 나이브 bPSC의 면역염색, TRA160 및 NANOG에 대한 프라이밍된 bPSC 및 KRT7 및 GATA2에 대한 bTSC, n=2. c, 나이브 다능성 마커에 대한 나이브 bPSC, 프라이밍된 다능성 마커에 대한 프라이밍된 bPSC 및 TSC 마커에 대한 bTSC의 qRT-PCR 분석, 평균 ± s.e.m, n=4. d,e, #프라이밍된 bPSC 및 프라이밍된 bPSC에서 유래된 EB, n=2. #은 나이브 bPSC로부터 생산된 프라이밍된 bPSC를 나타낸다. f, #프라이밍된 bPSC 및 프라이밍된 bPSC의 EB에 대한 스코어카드 검정(ScoreCard Assay) 분석, n=2. g,h, 외배엽, 내배엽 및 중배엽 계통으로 #프라이밍된 bPSC 및 프라이밍된 bPSC의 분화, n=2. i, HLA-G에 대한 bTSC-분화 EVT의 면역염색 (n=2 2명의 공여자로부터 실험 복제물). j, SDC1에 대한 bTSC-분화 ST의 면역염색, n=2. k, EVT 마커 (ITGA1, ITGA5, FN1)에 대한 bTSC-분화 EVT의 qRT-PCR 분석, 평균 ± s.e.m, n=4. l, ST 마커 (CSH1, SDC1, HSD3B1)에 대한 bTSC-분화 ST의 qRT-PCR 분석, 평균 ± s.e.m, n=4. m, bTSC-분화 ST의 융합 지수, 평균 ± s.e.m, n=12, 양측 독립표본 스튜던츠 t-검정(two-tailed unpaired Student's t-test)에 의한 p 값. n, bTSC-분화 ST로부터 수집된 컨디셔닝된 배지를 사용하여 hCG ELISA에 의해 검출된 hCG 단백질 수준, 평균 ± s.e.m, n=2-3. 모든 눈금 막대, 100 μm.
도 12. 다른 배양 조건에서 재프로그래밍할 때 EPI, TE, 및 PE-유사 세포의 비율 평가. D8 재프로그래밍 중간체를 a) NACL 배지 및 b) PA 배지 및 c) t2iLGo 배지로 이행하고(transitioned) 재프로그래밍 21일차에 EPI, TE, 및 PE-유사 세포의 비율을 평가하였다. GATA3는 TE-유사 세포의 경우 마커, PE-유사 세포의 경우 GATA6, EPI-유사 세포의 경우 KLF17로 선택되었다. 눈금 막대, 100 μm.
도 13. mRNA-매개 재프로그래밍을 통해 인간 섬유모세포로부터 생산된 21일차 재프로그래밍된 세포. a, 인간 섬유모세포의 4x OKSMNL mRNA 형질감염으로부터 생산된 21일차 재프로그래밍된 세포에서의 OCT4, GATA6 및 CDX2의 면역염색 분석. b, 인간 섬유모세포의 4x OKSMNL mRNA 형질감염으로부터 생산된 21일차 재프로그래밍된 세포에서의 GATA2, NANOG 및 SOX17의 면역염색 분석. c, 인간 섬유모세포의 6x OKSMNL mRNA 형질감염으로부터 생산된 21일차 재프로그래밍된 세포에서의 OCT4, GATA6 및 CDX2의 면역염색 분석. d, 인간 섬유모세포의 6x OKSMNL mRNA 형질감염으로부터 생산된 재프로그래밍된 21일차 재프로그래밍된 세포에서의 GATA2, NANOG 및 SOX17의 면역염색 분석.
도 14. 센다이 바이러스-매개 재프로그래밍을 통해 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)로부터 생산된 21일차 재프로그래밍된 세포. a, hMSC로부터 생산된 21일차 재프로그래밍된 세포에서 OCT4, GATA6 및 CDX2의 면역염색 분석. b, hMSC로부터 생산된 21일차 재프로그래밍된 세포에서 GATA2, NANOG 및 SOX17의 면역염색 분석.
도 15. 센다이 바이러스-매개 재프로그래밍을 통해 인간 말초 혈액 단핵 세포 (hPBMC)로부터 생산된 18일차 및 21일차 재프로그래밍된 세포. a, StemPro34 배지에서 hPBMC로부터 생산된 18일차 재프로그래밍된 세포에 대한 OCT4, GATA6 및 CDX2의 면역염색 분석. b, StemPro34 배지에서 hPBMC로부터 생산된 21일차 재프로그래밍된 세포에 대한 OCT4, GATA6 및 CDX2의 면역염색 분석. c, 10% FBS가 보충된 StemPro34 배지에서 hPBMC로부터 생산된 18일차 재프로그래밍된세포에서 OCT4, GATA6 및 CDX2의 면역염색 분석. d, 10% FBS가 보충된 StemPro34 배지에서 hPBMC로부터 생산된 18일차 재프로그래밍된 세포에서 GATA2, NANOG 및 SOX17의 면역염색 분석. e, 10% FBS가 보충된 StemPro34 배지에서 hPBMC로부터 생산된 21일차 재프로그래밍된 세포에 대한 OCT4, GATA6 및 CDX2의 면역염색 분석. f, 10% FBS가 보충된 StemPro34 배지에서 hPBMC로부터 생산된 21일차 재프로그래밍된 세포에서 GATA2, NANOG 및 SOX17의 면역염색 분석.
이제 본 발명의 특정 실시양태를 상세히 참조할 것이다. 본 발명이 실시양태와 관련하여 설명될 것이지만, 본 발명을 이러한 실시양태로 제한하려는 의도가 아니라는 것이 이해될 것이다. 반대로, 본 발명은 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 수정, 및 균등물을 포함하도록 의도된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 본원에에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 많은 방법 및 재료를 인식할 것이다. 본 발명은 기재된 방법 및 재료에 결코 제한되지 않는다. 본 명세서에 개시되고 정의된 본 발명은 본문 또는 도면으로부터 언급되거나 명백한 개별 특색들 중 둘 이상의 모든 대안적인 조합으로 확장된다는 것이 이해될 것이다. 이들 상이한 조합 모두는 본 발명의 다양한 대안적인 측면을 구성한다.
본 명세서를 해석할 목적으로, 단수로 사용된 용어는 또한 복수를 포함하며 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
본 발명자들은 인간 체세포 (예를 들어, 섬유모세포)가 시험관내에서 인간 배반포의 형태, 공간적 상호 작용, 및 분자 구성을 충실하게 반복되는 인간 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조 (여기서는 아이블라스토이드라고도 함)로 직접 재프로그래밍될 수 있다는 예상치 못한 발견으로부터 유래하는 신규한 배양 방법을 개발하였다. 게다가, 본 발명자들의 접근법에 따라 제조된 아이블라스토이드는 인간 배아 부착 배양을 사용하는 시험관내 부착 검정에 의해 검증된 바와 같이 초기 인간 배아 발달의 많은 측면을 모델링하는 데 사용될 수 있다.
추가로, 본 발명자들은 배아외 내배엽 줄기 (XEN) 세포, 영양막 줄기 세포 (TSC), 나이브 다능성 줄기 세포 (nPSC) 및 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 유래된 프라이밍된 다능성 줄기 세포 (pPSC) 중 하나 이상의 특징을 나타내는 자기-재생 세포를 배양 상태로 확립하고 유지하는 방법을 개발하였다.
유리하게는, 본 발명의 방법에 따라 XEN 세포, TSC, nPSC 및 pPSC를 수득하는 것은 달리 인간 배아로부터 이들 세포 유형을 유도하는 것과 연관된 도덕적 및 윤리적 도전을 피한다. 게다가, 재프로그래밍된 체세포로부터 수득된 다른 줄기 세포와 달리, 본 발명의 방법에 따라 제조된 줄기 세포는 정상적인 인간 발달에 존재하는 세포에 의해 둘러싸인 3차원적 맥락에서, 그리고 올바른 공간적 배향으로 발달한다. 결과적으로, 본 발명의 방법에 따라 수득된 줄기 세포는 다른 방법을 사용하여 제조된 다른 재프로그래밍된 세포보다 이의 자연 발생 대응물과 더 충실하게 정렬된다.
본원에 사용된 바와 같이, XEN-유사 세포는 또한 XEN 세포로 지칭될 수 있다. XEN-유사 및 XEN 세포는 둘 다 아이블라스토이드 (B)-유래 XEN (BXEN) 세포 또는 iXEN 세포 (BXEN) 세포 또는 iXEN 세포로도 지칭될 수 있으며 영양소를 제공하며 배아 발달을 뒷받침하며, 배아 패터닝, 생식 세포 발달 및 태아 조혈 줄기 세포 형성에 필요하다. 따라서, (BXEN) 세포 또는 iXEN 세포 및 이의 유도체는 영양막 오가노이드와 통합되어 정교한 배아외 오가노이드 시스템 (인공 태반 및 난황낭)을 형성하여 시험관내에서 배아 성장을 뒷받침할 수 있다. iXEN 세포는 PE 발달 및 난황낭 기능과 연관된 유전 질환을 가진 환자로부터 유래될 수 있으며, 이는 질환 모델링, 약물 스크리닝 및 잠재적인 세포 요법을 위한 모델로서 역할을 할 수 있다. iXEN 세포는 인간 배반포의 줄기 세포 기반 통합 모델을 생산하는 데 사용할 수 있다. 더욱이, XEN 세포가 태아 조혈 줄기 세포를 초래할 수 있는 가능성은 이론상 이식을 위한 조혈 세포 생산에 사용될 수 있다.
세포
배반포는 세 가지 세포 계통으로 이루어진다: 에피블라스트, 영양외배엽, 및 원시 내배엽. 에피블라스트는 대부분의 고유 배아(embryo proper), 양막, 및 난황낭의 배아외 중배엽으로 발달하며; 영양외배엽은 궁극적으로 태반을 초래하며; 원시 내배엽은 두개의 배아외 내배엽 계통 - 난황낭의 내장 내배엽과 정수리 내배엽을 형성한다. 배아외 내배엽은 배아에 영양 뒷받침을 제공하고, 내피 세포 및 혈액 섬의 전방 패터닝 및 형성과 같은 여러 유도 사건(inductive event)에 필요하다.
이들 세 가지 세포 계통으로부터 유래된 줄기 세포는 다음을 포함한다: 에피블라스트로부터 유래된 다능성 줄기 세포 (나이브 및 프라이밍됨; nPSC 및 pPSC), 영양외배엽으로부터 유래된 영양막 줄기 세포 (TSC), 및 원시 내배엽으로부터 유래된, 배아외 내배엽 줄기 세포. 이들 세포의 통상적인 공급원은 배반포 단계 배아이긴 하지만, 체세포를 이들 상이한 줄기 세포주로 재프로그래밍하기 위해 현장의 연구자에 의해 다양한 시도가 이루어졌다. 본 발명의 방법은 아이블라스토이드 (본원에 기재된 바와 같이)로부터 XEN 세포, TSC, nPSC 및 pPSC의 유도를 가능하게 한다. 지금까지, 배반포로부터 인간 XEN 또는 XEN-유사 세포의 유도는 보고되지 않았다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "줄기 세포"는 말단 분화되지 않은 세포를 지칭하며, 즉 보다 특정한, 특수화된 기능을 갖는 다른 세포 유형으로 분화할 수 있다. 상기 용어는 배아 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 성체 줄기 세포 또는 수임(committed)/전구체 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 XEN 세포 또는 XEN-유사 세포는 배아외 내배엽 줄기 세포 또는 이의 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 지칭한다. XEN 세포는 배아외 내배엽 계통의 세포의 신호전달 경로를 조사하는 데 유용하며 심장 유도에 관여하는 인자와 같은 배아외 내배엽의 패턴화 활성을 확인하기 위한 시험관내 모델을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, XEN 세포의 특징은 마커 중 하나 이상의 발현을 포함하는 것으로 이해될 것이다: SALL4, GATA4, GATA6 및 SOX17과 같은 XEN 마커. XEN 세포의 특징은 또한 표 2에 제시된 바와 같은 PE 계통의 마커 중 하나 이상 또는 모두의 발현을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, XEN 세포 또는 XEN-유사 세포의 특징은 다음을 포함하는 것으로 이해될 것이다:
- 편평한 내배엽 형태;
- 마커 GATA6, GATA4, PDGFRa, NID2 및 BMP6 중 하나 이상의 발현,
- NANOG와 같은 다능성 마커의 발현 부재;
- 피브로넥틴 및 라민과 같은 ECM의 분비;
- LAMA1, COL4A1 및 FN1과 같은 기저막 성분의 생산;
- 예를 들어, GATA6, GATA4, PDGFRa, NID2 및 BMP6의 발현이 하향조절된 AFP 및 HFN4a의 조절되지 않은 발현을 특징으로 하는 내장 내배엽으로의 발달.
1차 태반 조직 또는 인간 배반포로부터 유래된 인간 영양막 줄기 세포 (TSC)는 접근하기 어렵고 고도로 조절된다. 따라서, 성체 세포로부터 유래할 수 있는 안정적인 자기-재생 TSC 주(line)를 갖는 것은 인간 영양막 발달을 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공할 뿐만 아니라, 다능성 세포와의 관계 및 현대 생화학 및 분자 기술이 대규모로 적용될 수 있는 시험관내 맥락에서 초기 인간 배아발생과 연관된 사건을 조정하는 역할을 제공한다. TSC 주는 질환 모델링, 약물 스크리닝 및 재생 의약에도 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 생산된 세포는 또한 생체이물, 약물 및 병원체, 단백질 및 호르몬의 모체-태아 전달을 조사하기 위한 영양막 오가노이드 생산을 포함하는 다양한 다른 임상 적용에서 유용성을 찾을 수 있다. 추가로, 동일한 건강한 개인 또는 환자의 체세포로부터 재프로그래밍되거나 1차 태반 조직으로부터 유래된 인간 TSC/iTSC 및 iPSC는 인간 배반포-유사 구조를 어셈블리하는 데 사용될 수 있다. 이것은 불임 치료 및 IVF 성공률 향상을 포함하여, 대규모 스크리닝 연구를 위한 합성 인간 배반포-유사 오가노이드의 무제한 공급원을 제공한다. 추가로, 본 발명에 따라 생산된 iTSC는 재생 의약에 사용될 수 있다. 예를 들어, 태반 세포는 최근 심장 조직 재생에 유용한 것으로 나타났다. 본 발명의 iTSC는 태반으로부터 직접 세포를 수득할 필요 없이, 이러한 태반 세포를 생산하는 데 사용할 수 있다.
인간 태반 또는 인간 배아로부터 인간 TSC를 유도하는 다른 공개된 방법과 비교하여, 인간 iTSC를 생산하기 위한 본 발명의 접근법은 어떤 윤리적 제한도 없이 더 접근 가능하고, 노동 및 비용 효율적이다. 이 접근법은 환자로부터 생산된 질환-특이적 iTSC를 사용하는 대규모 스크리닝 연구를 위한 동종동계(isogentic) iTSC의 무제한 공급을 허용한다.
본 발명의 임의의 측면에서, TSC 특징은 세포 형태, 유전자 발현 프로파일, 활성 검정, 단백질 발현 프로파일, 표면 마커 프로파일, 분화 능력 또는 이의 조합의 분석에 의해 결정될 수 있다. 특징 또는 마커의 예는 본원에 기재된 것들 및 통상의 기술자에게 공지된 것을 포함한다.
TSC의 하나 이상의 특징은 임의의 하나 이상의 영양막 마커의 상향 조절 및/또는 세포 형태의 변화를 포함할 수 있다. 전형적으로, TSC로 전환되는 세포는 TSC의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 이상의 특징을 표시한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포는 "유도된 영양막 줄기 세포" 또는 iTSC로도 지칭될 수 있다.
본 발명의 임의의 실시양태에서, TSC의 특징인 단백질 마커는 핵 CD49f (iTGA6), CD249 (아미노펩티다제 A) 및 핵 NR2F2, TFAP2C, 핵 GATA2/3 및 P63을 포함한다.
추가 실시양태에서, TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포는 하기 마커 중 하나 이상을 발현하지 않는다: OCT4 (POU5F1), NANOG, SOX2, SALL2, OTX2, BANCR, KLF17, DPPA3, 및 DNMT3L.
추가로, TSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포는 EVT 또는 ST의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포로 분화하는 능력을 갖는다. 통상의 기술자는 EVT 또는 ST 세포의 특징에 익숙할 것이다. 예를 들어, EVT 세포는 길쭉한 스핀들-유사 형태를 특징으로 하며 HLA-G, MMP2와 같은 마커 유전자를 발현한다. ST 세포는 둥근 다핵 형태를 특징으로 하며 hCG 및 SDC1과 같은 마커 유전자를 발현한다. 추가로, TSC는 전형적으로 큰 자갈-형상의 콜로니를 형성한다.
세포가 TSC의 하나 이상의 특징을 갖는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있는 추가 마커는 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 적합한 마커의 예는 예를 들어 문헌 [Okae et al., (2018) Cell Stem Cell 22: 50-63, Deglincerti et al., (2016) Nature, 533: 751-4, Shahbazi et al., (2016 Nature Cell Biology 18: 700-708] 및 [Niakan & Eggan (2013) Dev Biol 375: 54-64)]에 개시되어 있으며, 상기 문헌들의 전체 내용은 이의 전문이 본원에 포함된다.
본 발명의 방법은 또한 나이브 및 프라이머 다능성 줄기 세포 (nPSC 및 pPSC)를 수득하는 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다능성(pluripotent)" 또는 "다능성(pluripotency)"은, 적절한 조건 하에, 세 가지 배아층(germinal layer) (내배엽, 중배엽, 및 외배엽) 모두로부터의 세포 계통과 연관된 특징을 집합적으로 나타내는 세포 유형으로, 분화할 수 있는 자손을 초래하는 능력을 가진 세포를 지칭한다. 다능성 줄기 세포는 출생 전, 출생 후 또는 성체 동물의 많은 또는 모든 조직에 기여할 수 있다. 8-12주령 SCID 마우스에서 기형종(teratoma)을 형성하는 능력과 같이 관련 기술분야에서 허용되는 표준 시험을 사용하여 세포 집단의 다능성을 확립할 수 있으나, 다양한 다능성 줄기 세포 특성의 확인이 또한 다능성 세포를 검출하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "나이브 다능성 상태" 또는 "나이브 다능성 표현형"은 둥근 돔-형상인 세포를 포함하는 세포 표현형을 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 나이브 다능성 상태는 착상 전(pre-implantation) 배아와 더 밀접하게 비슷한 다능성 상태를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 "프라이밍된 다능성 상태" 또는 "프라이밍된 다능성 표현형"은 전형적으로 분명한 경계를 갖는 편평한 세포 콜로니의 존재를 특징으로 하는 세포 표현형을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 프라이밍된 다능성 상태는 착상 후 배아의 에피블라스트와 더 밀접하게 비슷한 다능성 상태를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "다능성 상태", "다능성 줄기 세포 특징" 또는 "다능성 세포의 하나 이상의 특징"에 대한 언급은 다능성 줄기 세포를 다른 세포와 구별하는 세포의 특징을 지칭한다. 적절한 조건 하에, 세 가지 배아층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽) 모두의 세포 계통과 연관된 특징을 집합적으로 나타내는 세포 유형으로, 분화할 수 있는 자손을 초래하는 능력은 다능성 줄기 세포의 특징이다. 분자 마커의 특정 조합의 발현 또는 비발현이 또한 다능성 줄기 세포 특징이다. 예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포는 하기 비제한적 목록의 마커 중 적어도 1, 2 또는 3개, 및 임의로 모두를 발현한다: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, SO2, E-카드헤린, UTF-1, OCT4 (POU5F1), REX1, 및 NANOG.
다능성 줄기 세포와 연관된 세포 형태는 또한 다능성 줄기 세포 특징이다. 다능성 세포는 전형적으로 자기-재생 능력, 세 가지 배엽층의 세포 유형을 초래하는 능력 및 OCT4 (POU5F1), NANOG 및 SOX2와 같은 다능성 마커의 발현을 특징으로 한다. 다능성 세포는 전형적으로 분명한 경계를 가진 편평한 (프라이밍 상태일 때) 또는 돔-형상인 (나이브 상태일 때) 콜로니에서 성장한다. 이것은 체세포, 예를 들어 크고 길쭉한 섬유모세포의 형태와 대조될 수 있다. 나이브 및 프라이밍된 다능성 세포 둘 다에 의해 발현되는 마커는: OCT4 (POU5F1), SOX2, NANOG, KLF4, EPCAM, 및 PRDM14를 포함한다.
나이브 다능성 세포에 의해서만 발현되거나 프라이밍된 다능성 세포에 의해서만 발현되는 마커는 본원의 표 5에 열거되어 있다.
통상의 기술자는 줄기 세포와 관련하여 용어 "나이브" 및 "프라이밍된"에 익숙할 것이다. 이들 용어는 에피블라스트 개체발생의 초기 및 후기 단계를 설명하고 ESC 및 EpiSC 유도체를 설명하기 위해 10년 초과 전에 확인되었다. 본원에 사용된 바와 같이, 나이브 다능성 상태는 착상 전 배아와 더 밀접하게 비슷한 다능성 상태를 지칭한다. 일부 상황에서, 용어 "나이브 상태"는 용어 "기저 상태(ground state)와 상호교환적으로 사용된다. 나이브 상태 세포는 체세포와 비교하여 실질적으로 후생유전학적으로 재설정되고 착상 전 에피블라스트의 발달적 정체성 및 기능적 능력을 갖는 균질한 다능성 줄기 세포의 안정적인 자기-재생 배양이다.
특정 실시양태에서, 나이브 다능성 세포는 착상 전 에피블라스트 특이적 전사 인자의 mRNA 및 단백질을 발현할 수 있다. 예를 들어, 나이브 세포는 KLF2, KLF4, TFCP2L1, TBX3, REX1, GBX2, STELLA (DPPA3), KLF17, DPPA3, DPPA5, TFCP2L1, MAEL, UTF1, ZFP57, DNMT3L, FGF4, FOXR1, ARGFX, TRIM60, DDX43, BRDT, ALPPL2, KHDC3L, KHDC1L 및 PRAP 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 모두를 발현할 수 있다. 나이브 다능성 상태를 나타내는 다른 마커는 표 5에 나와 있다.
특정 실시양태에서, 프라이밍된 다능성 세포는 착상 후 에피블라스트 특이적 전사 인자의 mRNA 및 단백질을 발현할 수 있다. 예를 들어, 프라이밍된 세포는 SFP, EOMES, BRACHYURY, OTX2, ZIC2, ZIC3, ZIC5, DNMT3B, KDR, CDH2, CER1, COL2A1, DAZL, TCF7L1, SOX11, SALL2 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 모두를 발현할 수 있다. 프라이밍된 다능성 상태를 나타내는 다른 마커는 표 5에 나와 있다.
나이브 및 프라이밍된 다능성 상태를 확인한 이후로, 두 상태 모두에서 다능성 세포를 유지하기에 적합한 다수의 상이한 배양 배지가 개발되었다. 통상의 기술자는 이러한 배지에 익숙할 것이며, 이의 예는 여기에 추가로 제공된다.
추가로, 나이브 세포는 그들의 형태에 의해 특징지어질 수 있다. 나이브 표현형은 전형적으로 빽빽하게-채워진, 둥근 돔의 외관을 특징으로 한다. 세포는 또한 조밀한(compact) 굴절성(refractile) 콜로니를 형성하는 것으로 기술될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에 따라서, 제2 배양 배지에서 배양되는 세포는 이들이 제3 배양 배지로 이행될 때 나이브 세포의 전형적인 형태가 발달하지 않았다.
본원에 추가로 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 수득된 세포는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 체세포를 포함한, 특이적 세포 유형으로 분화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "체세포"는 말단 분화된 세포를 지칭한다. 용어 "체세포"는 생식계열 세포와 대조적으로, 유기체의 신체를 형성하는 임의의 세포를 지칭한다. 포유동물에서, 생식계열 세포 ("생식자(gamete)"라고도 공지됨)는 수정 중에 융합되어 전체 포유동물 배아가 발달하는 접합체라고 칭해지는 세포를 생산하는 정자와 난자이다. 포유동물 신체의 다른 모든 세포 유형은 - 정자와 난자, 그것들이 만들어지는 세포 (생식모세포(gametocyte) 및 미분화 줄기 세포를 제외하고 - 체세포이다: 내부 기관, 피부, 뼈, 혈액, 및 결합 조직은 모두 체세포로 구성되어 있다.
본 발명의 줄기세포로부터 유래된 체세포는 또한 오가노이드를 유도하는데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 오가노이드는 줄기 세포 또는 기관 전구체로부터 발달하고, 생체내와 유사한 방식으로 세포 분류 및 공간적으로 제한된 계통 투입(lineage commitment)을 통해 자기-조직화되고, 다음을 포함한 특성을 나타내는 기관-특이적 세포 유형의 집합체이다: 다수 기관-특이적 세포 유형; 기관의 일부 특정 기능 (예를 들어, 수축, 신경 활동, 내분비 분비, 여과, 배설)을 반복할 수 있음; 이의 세포는 함께 그룹핑되고 기관과 유사하게 공간적으로 조직화됨. 오가노이드는 다양한 질환 프로세스, 약물 스크리닝, 및 상이한 환경 자극에 대한 반응을 포함한 기본적인 생물학적 프로세스를 연구하는 도구로서 사용될 수 있다.
세포의 배양
본 발명의 제1 및 제3 측면에서, 세포는 피더 세포(feeder cell)와 접촉하여 배양된다. 예시적인 피더 세포는 섬유모세포 세포, 예를 들어, 마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 피더 세포 상에서 세포를 배양하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명의 일부 측면, 예를 들어 제2 및 제4 측면에서, 세포는 피더 세포의 부재 하에 배양된다. 세포는 예를 들어 분자 테더(tether)를 통해 고체 배양 표면 (예를 들어, 배양 플레이트)에 직접 부착될 수 있다. 본 발명자들은 세포가 피더 세포 상에서 배양된 다른 방식으로 동일하게 처리된 세포의 효율에 비해 고체 배양 표면에 직접 부착될 때 다능성으로 유도된 세포를 배양하는 것이 다능성으로의 유도 효율이 훨씬 더 크다는 것을 발견하였다 (즉, 더 많은 부분의 세포가 다능성을 달성함). 예시적인 분자 테더는 마트리겔, 세포외 기질 (ECM), ECM 유사체, 라미닌, 피브로넥틴, 비크로넥틴 또는 콜라겐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 그러나 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이것이 비제한적인 목록이고 다른 분자를 사용하여 세포를 고체 표면에 부착할 수 있음을 인식할 것이다. 테더를 고체 표면에 초기 부착하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "피더 세포" 또는 "피더"는 피더 세포가 제2 세포 유형을 뒷받침하기 위한 성장 인자와 영양소를 제공함에 따라, 제2 유형의 세포가 성장할 수 있는 환경을 제공하기 위해 제2 유형의 세포와 공동-배양되는 한 유형의 세포를 기술하는 용어이다. 피더 세포는 임의로 그들이 뒷받침하는 세포와 상이한 종에서 유래한다. 예를 들어, 줄기 세포를 포함한 특정 유형의 인간 세포는 마우스 배아 섬유모세포, 또는 불멸화 마우스 배아 섬유모세포의 1차 배양에 의해 뒷받침될 수 있다. 피더 세포는 전형적으로 그들이 뒷받침하고 있는 세포보다 더 성장하지 못하도록 미토마이신과 같은 항유사분열제로 처리하거나 방사선조사에 의해 다른 세포와 공동-배양될 때 불활성화될 수 있다. 피더 세포는 내피 세포, 간질 세포(예를 들어, 상피 세포 또는 섬유모세포) 및 백혈병 세포를 포함할 수 있다. 전술한 내용을 제한하지 않으면서, 하나의 특정 피더 세포 유형은 인간 피부 섬유모세포와 같은 인간 피더일 수 있다. 또 다른 피더 세포 유형은 마우스 배아 섬유모세포 (MEF)일 수 있다. 일반적으로, 다양한 피더 세포를 부분적으로 사용하여 다능성을 유지하고, 특정 계통으로의 분화를 지시하고, 이펙터 세포와 같은 특수화된 세포 유형으로의 성숙을 촉진할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "해리된" 세포는 다른 세포로부터 또는 표면 (예를 들어, 배양 플레이트 표면)으로부터 실질적으로 분리되거나 정제된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 세포는 기계적 또는 효소적 방법에 의해 동물 또는 조직으로부터 해리될 수 있다. 대안적으로, 시험관내에서 응집하는 세포는 예컨대 클러스터 현탁액, 단일 세포 또는 단일 세포와 클러스터의 혼합물로 효소적으로 또는 기계적으로 해리함으로써 서로로부터 해리될 수 있다. 또 다른 대안적 실시양태에서, 부착 세포는 배양 플레이트 또는 다른 표면으로부터 해리된다. 따라서 해리는 세포외 기질 (ECM) 및 기질 (예를 들어, 배양 표면)과의 세포 상호작용을 차단하거나, 세포 사이의 ECM을 차단하는 것을 포함할 수 있다.
배양 배지 - PSC
통상의 기술자는 다음에 대한 배양 배지 조성 및 배양 조건에 익숙할 것이다:
- 탈분화 또는 다능성 상태로의 세포의 재프로그래밍 촉진;
- 나이브 다능성 상태 촉진; 및
- 프라이밍된 다능성 상태 촉진.
한 실시양태에서, 나이브 다능성 상태를 촉진하고 본원에 기재된 방법에 따라 사용하기 위한 배지는 MEK 억제제, PKC 억제제, GSK3 억제제, STAT3 활성화제 및 ROCK 억제제를 포함한다.
MEK 억제제에 대한 언급은 일반적으로 MEK 억제제를 지칭한다. MEK 억제제는 MEK1, MEK2 및 MEK5를 포함하는 단백질 키나제의 MEK 계열의 임의의 구성원을 억제할 수 있다. 적합한 MEK 억제제의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있고 PD184352 및 PD98059, MEK1 및 MEK2 U0126 및 SL327의 억제제를 포함한다. 특히, PD184352 및 PD0325901은 다른 공지된 MEK 억제제와 비교하여 높은 정도의 특이성 및 효능을 갖는 것으로 밝혀졌다.
단백질 키나제 C (PKC) 억제제의 예는 G6983 (3-[1-[3-(디메틸아미노)프로필]-5-메톡시-1H-인돌-3-일]-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 (Gschwendt et al., 1996 FEBS Lett 392:77-80)을 포함한다. 또 다른 바람직한 PKC 억제제는 Ro-31-8425이다. 바람직하게는 PKC 억제제는 0.01 내지 10 μM, 0.1 내지 5 μM, 바람직하게는 1 내지 4 μM의 농도로 배지에 존재한다.
GSK3 억제에 대한 언급은 하나 이상의 GSK3 효소의 억제를 지칭한다. GSK3 효소 계열은 널리 공지되어 있으며 다수의 변이체가 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, GSK3β는 억제된다. GSK3-α 억제제도 사용할 수 있다. 광범위한 GSK3 억제제가 공지되어 있으며, 예를 들어 억제제 CHIR 98014, CHIR 99021, AR-AO144-18, TZD-8, SB21676763 및 SB415286이다.
억제제는 통상적인 수단에 의해 또는 통상적인 공급원으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 제공되거나 수득될 수 있다. 억제제는 소분자 억제제 또는 간섭 RNA (RNAi)일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 키나제 억제제를 확인하기 위한 다양한 방법 및 검정에 익숙할 것이다.
STAT3 활성화제의 예는 LIF, 바람직하게는 hLIF를 포함한다.
MEK 억제제, GSK3 억제제 및 LIF의 조합은 2iL로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, ROCK 억제제는 Rho-결합 키나제의 억제제를 지칭한다. 이러한 억제제의 예는 트랜스-N-(4-(1-아미노에틸)-시클로헥산카르복스아미드로도 공지된, ((1R,4r)-4-((R)-1-아미노에틸)-N-(피리딘-4-일)시클로헥산 카르복스아미드, 압캠(Abcam)), 1-(5-이소퀴놀루닐) (술포닐) 호모피페라진 (1-(5-이소퀴놀리닐술포닐)호모피페라진을 포함한다. 전형적으로 ROCK 억제제의 양은 약 0.1 내지 50 μM, 바람직하게는 약 1 내지 10 μM이다.
발현 또는 활성의 "억제제", "활성화제" 및 "조정제"는 각각 기재된 표적 단백질의 발현 또는 활성에 대한 시험관내 및 생체내 검정을 사용하여 확인된 억제, 활성화, 또는 조정 분자, 예를 들어, 리간드, 작용제, 길항제, 및 이들의 동족체 및 모방체를 지칭하는 데 사용된다. 용어 "조정제"는 억제제 및 활성화제를 포함한다. 억제제는 예를 들어, 발현을 억제하거나 이에 결합하거나, 자극 또는 프로테아제 억제제 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 차단하고, 감소, 예방, 활성화 지연, 불활성화, 탈감작화 또는 기재된 표적 단백질, 예를 들어 길항제의 활성을 하향 조절하는 작용제이다. 활성화제는 예를 들어 기재된 표적 단백질의 발현을 유도 또는 활성화하거나 기재된 표적 단백질 (또는 코딩 폴리뉴클레오티드), 예를 들어 효능제를 예를 들어 결합, 자극, 증가, 개방, 활성화, 촉진, 활성화 또는 프로테아제 억제제 활성을 향상시키거나, 감작화하거나 상향 조절하는 작용제이다. 조정제는 자연 발생 및 합성 리간드, 길항제 및 효능제 (예를 들어, 작용제 또는 길항제로서 기능하는 작은 화학 분자, 항체 등)를 포함한다. 억제제 및 활성화제에 대한 이러한 검정은 예를 들어, 추정 조정제 화합물을 기재된 표적 단백질을 발현하는 세포에 적용한 다음에, 상기 기재된 바와 같이 기재된 표적 단백질 활성에 대한 기능적 효과를 결정하는 것을 포함한다. 잠재적인 활성화제, 억제제 또는 조정제로 처리된 기재된 표적 단백질을 포함하는 샘플 또는 검정을 억제제, 활성화제 또는 조절제가 없는 대조군 샘플과 비교하여 효과의 정도를 조사한다. 대조군 샘플 (조정제로 처리되지 않음)에는 100%의 상대 활성 값이 배정된다. 기재된 표적 단백질의 억제는 대조군에 대한 활성 값이 약 80%, 임의로 50% 또는 25, 10%, 5% 또는 1%일 때 달성된다. 기재된 표적 단백질의 활성화는 대조군에 대한 활성 값이 110%, 임의로 150%, 임의로 200, 300%, 400%, 500%, 또는 1000-3000% 또는 그 초과일 때 달성된다.
본원에 사용된 바와 같이, "억제하다", "방지하다" 또는 "감소하다", 또는 "억제하는", "방지하는" 또는 "감소시키는"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 처리되지 않은 세포 (조직 또는 대상)와 비교하여 처리된 세포 (조직 또는 대상)에서 측정된 파라미터 (예를 들어, 활성, 발현, 미토콘드리아 호흡, 미토콘드리아 산화, 산화적 인산화)의 감소를 나타낸다. 치료 전과 후 사이에 동일한 세포, 조직 또는 대상체를 또한 비교할 수 있다. 감소는 검출할 수 있을 정도로 충분하다. 일부 실시양태에서, 처리된 세포의 감소는 처리되지 않은 세포와 비교하여 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%이거나, 완전히 억제된다. 일부 실시양태에서, 측정된 파라미터는 처리되지 않은 세포와 비교하여 처리된 세포에서 검출가능하지 않다 (즉, 완전히 억제된다).
적합한 배양 배지의 예는 하기 표 1에 요약되어 있다:
본원에 사용된 바와 같이, hPGCLC 유도 배지는 인간 원시 생식 세포(primordial germ cell)-유사 세포 유도 배지를 지칭한다.
RSeT™ 배지는 피더 의존성 및 저산소 조건 하에 나이브-유사 hPSC의 유지에 사용되는 정의된 세포 배양 배지이다. RSeT™ 배지는 사전-스크리닝된 품질 성분을 포함하고 bFGF 또는 TGFβ를 함유하지 않는다. 이는 인간 배아 줄기 (ES) 세포 및 인간 유도 다능성 줄기 (iPS) 세포와 상용성이다.
RSeT™ 배지에서 배양된 hPSC는 굴절 가장자리가 있는 빽빽하게 채워진, 돔형 콜로니과 같은 나이브-유사 상태의 특색을 나타낸다. KLF2, KLF4, 및 TFCP2L1과 같은 나이브-유사 hPSC와 연관된 주요 전사체는 RSeT™ 배지에서 배양된 hPSC에서 발현 증가를 나타낸다. RSeT™ hPSC는 mTeSR™1에서 배양하여 프라이밍된 상태로 다시 전환시킬 수 있으며 이어서 표준 기술을 사용하여 분화시킬 수 있다.
예시적인 t2iLGoY 배지:
· 2 mM L-글루타민 (깁코(Gibco))이 보충된, DMEM/F-12 (깁코)와 뉴로베이살(Neurobasal) 배지 (깁코)의 50:50 혼합물,
· 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (깁코),
· 0.5% N2 보충제 (깁코),
· 1% B27 보충제 (깁코),
· 1% 펜-스트렙(Pen-strep) (깁코),
· 10 ng/ml 인간 LIF (사내 제조),
· 250 μM L-아스코르브산 (시그마(Sigma)),
· 10 μg/ml 재조합 인간 인슐린 (시그마),
· 1 μM PD0325901 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec)),
· 1 μM CHIR99021 (밀테니 바이오텍),
· 2.5 μM G6983 (토크리스(Tocris)),
· 10 μM Y-27632 (압캠).
배양 배지 - TSC
TSC 및 이의 증식을 뒷받침하는 데 적합한 배양 배지는 바람직하게는 문헌 [Okae (2018) Cell Stem Cell, 및 WO 2016/143866]에 기재된 바와 같은 배양 배지이며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
TSC의 기본 배지 조성은 DMEM, MEM, RPMI 1640 등을 포함하여 전형적으로 사용되는 임의의 기본 배지일 수 있다. 혈청, 성장 인자, 피루브산, 아미노산, 항생제 등이 배지에 적절하게 포함될 수 있다.
TSC 배양물은 바람직하게는 적어도 하나의 성장 인자 및 적어도 하나의 ROCK 억제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 성장 인자는 임의의 성장 인자일 수 있으나, 바람직하게는 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린, 형질전환 성장 인자 (TGF)로부터 선택된다. 성장 인자의 양은 임의의 양, 예를 들어 0.1 내지 1000 ng/ml, 바람직하게는 10-100 ng/ml일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, ROCK 억제제는 Rho-결합 키나제의 억제제를 지칭한다. 이러한 억제제의 예는 트랜스-N-(4-(1-아미노에틸)-시클로헥산카르복스아미드로도 공지된, ((1R,4r)-4-((R)-1-아미노에틸)-N-(피리딘-4-일)시클로헥산 카르복스아미드, 압캠), 1-(5-이소퀴놀루닐) (술포닐) 호모피페라진 (1-(5-이소퀴놀리닐술포닐)호모피페라진을 포함한다. 전형적으로 ROCK 억제제의 양은 약 0.1 내지 50 μM, 바람직하게는 약 1 내지 10 μM이다.
특정 바람직한 실시양태에서, TSC 배양물은 문헌 [Okae et al.]에 기재된 ASECRiAV 배지이고 A83-01, SB431542, EGF, CHIR, ROCK 억제제, 아스코르브산 및 발프로산을 포함한다.
가장 바람직하게는 TSC 배지는 다음을 포함한다:
- DMEM/F-12,
- 0.3% BSA (시그마)로 보충된 글루타맥스(GlutaMAX)™ (써모피셔(ThermoFisher),
- 0.2% FBS (써모피셔),
- 1% ITS-X 보충제 (써모피셔),
- 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (써모피셔),
- 0.5% 펜-스트렙 (써모피셔),
- 1.5 μg/ml L-아스코르브산 (시그마),
- 5 μM Y27632 ((1R,4r)-4-((R)-1-아미노에틸)-N-(피리딘-4-일)시클로헥산 카르복스아미드, 압캠),
- 2 μM CHIR99021 (6-((2-((4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일)아미노)에틸)아미노) 니코티노니트릴 밀테니 바이오텍),
- 0.5 μM A83-01 (3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카르보티오아미드, 시그마),
- 1 μM SB431542 (4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드)
- 50 ng/ml EGF (페프로텍(Peprotech)) 및
- 0.8 mM 발프로산 (VPA, 시그마).
배양 배지 - XEN 세포
본 발명의 XEN 또는 XEN-유사 세포의 확립에 유용한 배양 배지는 백혈병 억제 인자 (LIF), GSK-3 억제제, 액티빈 A 및 ROCK 억제제를 포함한다.
바람직하게는, ROCK 억제제는 약 10 μM의 농도로 존재한다. 전형적으로, 시딩된 세포는 1일 또는 2일 동안 또는 시딩된 세포가 피더 층에 부착될 때까지 ROCK 억제제를 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 부착 후, 백혈병 억제 인자 (LIF), GSK-3 억제제 및 액티빈 A (ROCK 억제제 없음)를 포함하는 배양 배지를 사용하고 격일로 교체할 수 있다. 따라서, 본 발명의 XEN 또는 XEN-유사 세포의 유지에 유용한 배양 배지는 백혈병 억제 인자 (LIF), GSK-3 억제제, 액티빈 A를 포함하며, 여기서 배양 배지는 ROCK 억제제를 함유하지 않는다.
가장 바람직하게는 XEN 또는 XEN-유사 배지, 또는 XEN 또는 XEN-유사 세포의 확립 및/또는 유지를 위한 배지는 다음을 포함한다:
- DMEM/F-12 (써모피셔)와 뉴로베이살 배지 (써모피셔)의 50:50 혼합물,
- 2 mM L-글루타민 (써모피셔),
- 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (써모피셔),
- 0.5% N2 보충제 (써모피셔),
- 1% B27 보충제 (써모피셔),
- 1% 페니실린-스트렙토마이신 (써모피셔),
- 10 ng/ml 인간 백혈병 억제 인자 (LIF),
- 3 μM CHIR99021 (밀테니 바이오텍) 및
- 100 ng/ml 액티빈 A (페프로텍),
- 임의로 약 10 μM에서 본원에 기재된 바와 같은 ROCK 억제제와 함께
본 발명의 방법은 분화 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 EVT 또는 ST의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포로 분화시키는 것을 포함할 수 있다. 추가로, 방법은 본 발명에 따라 제조된 nPSC 또는 pPSC를 분화시키는 것을 포함할 수 있으며, 이는 PSC를 배양하여 분화된 세포 또는 다능성 상태가 아닌 세포의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 생산하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분화시키는 것"은 세포가 다능성 또는 다능성이 아닌 지정된 특수화된 세포 운명에 도달할 수 있도록 하는 조건에서 전구체 세포 (예를 들어, 이중능 또는 다능성 세포)를 전환시키는 것을 지칭한다. 이러한 방법은 일반적으로 특수화된 (분화된) 세포와 연관된 다양한 인자의 수준을 증가시키는 것을 포함한다.
구체적 실시양태에 따르면, 본 발명에 따라 제조된 TSC 세포는 계통 특이적 세포, 예를 들어 ST 및 EVT를 단리하는 데 사용될 수 있다. 통상의 기술자는 본 발명에 따라 생산된 TSC를 분화하기 위한 표준 방법에 익숙할 것이다. 간단히 말해서, TSC는 TSC를 MEFBAP 처리 (MEF 컨디셔닝된 배지, BMP4, TGFβi, FGFRi, 문헌 [Amita et al., 2013 PNAS, 110: E1212-1221]에 기재된 바와 같음)에 적용함으로써 합포체영양막 (ST)으로 분화될 수 있다. 대안적으로, 포스콜린 처리에 대한 TSC의 노출은 또한 TSC를 ST 운명으로 분화하는 데 사용될 수 있다.
분화에 대한 추가 방법은 문헌 [Kidder (2014) Methods Mol Biol, 1150-201-12; Lei et al., (2017) Placenta, 28: 14-12]; 및 [Chen et al., (2013) Biochemical and Biophysical Research Communications, 431; 179-202]에 개시되어 있다. 방법은 GFG4 및 헤파린이 없는 배지에서 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 또한 분화 인자를 포함하는 배지에서 세포의 유전적 변형을 수반할 수 있다.
ST로의 성공적인 분화는 기저 β-hCG (인간 융모막 고나도트로핀) 분비뿐만 아니라 인간 태반 락토겐 유전자의 발현을 측정함으로써 결정될 수 있다. 대안적으로, ST로의 성공적인 분화는 SDC1+ 다핵 세포의 존재에 의해 결정될 수 있다. EVT 운명으로의 성공적인 분화는 HLA-G, PRG2 및 PAPP2로부터 선택된 하나 이상의 마커의 단백질 발현을 결정함으로써 확인할 수 있다.
유사하게, PSC의 분화 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Zhu et al., (2013) Development, 140: 705-717]; 및 [Bar and Benvenisty (2020) Nature Reviews Molecular Biology, 05 November 2020]에 잘 기재되어 있다.
최종적으로 분화된 세포 운명으로의 PSC의 성공적인 분화는 분화된 세포 유형의 특징인 하나 이상의 마커 또는 형태학적 특색의 단백질 발현을 결정함으로써 확인될 수 있다. 체세포의 특징적인 형태학적 및 유전자 발현 마커는 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 특정 예에서, 분화된 세포가 진피 섬유모세포인 경우, 형태학적 특징은 편평한 형상을을 포함하고 마커는 CD13 (ANPEP), CD44, TWIST1 및 ZEB1을 포함한다.
분화된 세포가 각질형성세포인 경우, 관련 마커는 케라틴1, 케라틴14 및 인볼루크린을 포함하고 세포 형태는 자갈 외관이다. 내피 세포 마커는 CD31 (Pe-CAM), VE-카드헤린 및 VEGFR2를 포함하고 세포 형태는 모세관-유사 구조일 수 있다. 상피 세포의 마커는 시토케라틴 15 (CK15), 시토케라틴 3 (CK3), 인볼루크린 및 코넥신 4를 포함한다. 바람직하게는 관찰된 형태는 자갈 외관이다. 조혈 줄기 세포의 마커는 CD45 (범 조혈 마커), CD19/20 (B-세포 마커), CD14/15 (골수(myeloid)), CD34 (전구체/SC 마커), CD90 (SC)을 포함할 수 있다. 중간엽 줄기 세포의 마커는 CD13, CD29, CD90, CD105, CD10, CD45를 포함한다.
다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조
임의의 측면에서, 본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 시험관내-유래 또는 시험관내-생산 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는, 내부 세포층 및 외부 세포층을 포함하고, 내부 세포층은 에피블라스트 및/또는 원시 내배엽 계통의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포를 포함하고, 외부 세포층은 영양외배엽의 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포를 포함한다. 바람직하게는 특징은 세포 형태, 유전자 발현 프로파일, 활성 검정, 단백질 발현 프로파일, 표면 마커 프로파일, 분화 능력 또는 이들의 조합의 분석에 의해 결정될 수 있다. 특징 또는 마커의 예는 본원에 기재된 것들 및 통상의 기술자에게 공지된 것들을 포함한다.
임의의 측면에서, 내부 세포층은 PE의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포의 클러스터를 추가로 포함한다. 바람직하게는 PE의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포는 에피블라스트의 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포 주변에 있거나 주로 주변에 있다.
임의의 측면에서, 내부 세포층은 본질적으로 자연적으로 형성된 내부 세포 덩어리(mass)처럼 거동하는 내부 세포 덩어리-유사 조직이다.
임의의 측면에서, 외부 세포층은 본질적으로 자연적으로 형성된 영양외배엽처럼 거동하는 영양외배엽-유사 조직이다.
다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 포배강을 둘러싸는 영양외배엽-유사 조직 및 내부 세포 덩어리-유사 조직을 포함하는 인공 배반포로도 지칭될 수 있다.
임의의 측면에서, EPI 세포의 특징은 마커 NANOG, OCT4 (POU5F1로도 알려짐) 또는 SOX2 중 임의의 하나 이상의 존재이다. 한 실시양태에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조에서 더 많은 세포가 NANOG보다 OCT4를 발현한다.
임의의 측면에서, EPI 세포의 특징은 둥근 원주 외관의 형태이다.
임의의 측면에서, TE 세포의 특징은 마커 CDX2 및 GATA2 중 하나 이상의 존재이다.
임의의 측면에서, TE 세포의 특징은 편평하거나 길쭉한 상피 형태이다.
임의의 측면에서, PE 세포의 특징은 마커 SOX17 또는 GATA6의 존재이다.
임의의 측면에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 OCT4 양성 세포에 이웃하는 GATA6 양성 세포 (임의로 낮거나 약한 CDX2 염색 포함)를 추가로 포함할 수 있다.
임의의 측면에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 E5-7, 바람직하게는 E6-7에서 인간 배반포의 주요 형태학적 특색을 나타낸다. E5-7, 및 E6-7에서 인간 배반포의 주요 형태학적 특징은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이러한 특색은 구형 또는 우세한 구형 층상 세포 응집체 또는 적어도 2개의 방사상으로 배치된 층을 포함하고 포배강이라고 불리는 투명대(zona pellucida) 및 유체-충전 강(fluid-filled cavity)을 가진 내부 세포층 (본원에 정의된 바와 같음) 및 외부 세포층 (본원에 정의된 바와 같음)을 포함하는 구조를 포함할 수 있다. 배반포는 직경이 대략 0.1-0.2 mm이고 전형적으로 약 200-300개의 세포를 포함한다. 일반적으로 에피블라스트 및/또는 원시 내배엽 계통의 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포는 응집체 또는 구조의 내부에 위치한 단일 클러스터에 존재하며, 한편 영양외배엽 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포는 외부에 존재한다.
인간 배반포의 추가 특징 및 특색은 예를 들어, 문헌 [Blakeley, P. et al. (2015) Development 142, 3613; Petropoulos, S. et al. (2016) Cell 165, 1012-1026; Shahbazi, M. N. et al. (2016) Nat. Cell Biol. 18, 700-708; Xiang, L. et al. (2020) Nature 577, 537-542; Qin, H. et al. (2016) Cell Rep. 14, 2301-2312; Liu, L. et al. (2019) Nat. Commun. 10, 364; Durruthy-Durruthy, J. et al. (2016) Dev. Cell 38, 100-115; Fogarty, N. M. E. et al. (2017) Nature 550, 67-73]에 기재되어 있다.
추가로, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 또한 에피블라스트, 원시 내배엽 및 영양외배엽의 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 이들 세포는 E5-7, 바람직하게는 E6-7의 인간 배반포에서 에피블라스트, 원시 내배엽 및 영양외배엽 세포 각각과 동일하거나 유사한 상대 공간 배열을 채택한다. 본원에 사용된 바와 같이, 인간 배반포에 대해 "동일하거나 유사한 상대 공간 배열"은 적어도 2개의 방사상으로 배치된 층을 갖고, 내부 세포층 (본원에 정의된 바와 같음) 및 외부 세포층 (본원에 정의된 바와 같음)을 포함하는 것을 의미하는 것으로 간주될 것이다. 2개 초과의 세포층이 있을 수 있으나, 일반적으로 에피블라스트 및/또는 원시 내배엽 계통의 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포는 응집체 또는 구조의 내부에 위치한 단일 클러스터에 존재하며, 한편 영양외배엽 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 것은 외부에 존재하는 것으로 간주된다. 환언하면, 구조에서 세포의 외부 층은 전형적으로 TE의 세포 (CDX2 및 GATA2와 같은 TE 마커를 발현함)이며, 한편 에피블라스트를 나타내는 세포 (그리고 NANOG 및 OXT4 및 SOX2와 같은 마커를 발현함)는 구조 내의 ICM-유사 구획에서 발견된다.
임의의 측면에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 또한 무세포 강 또는 배반포-유사 강을 포함한다. 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 공동현상(cavitation)을 겪어 포배강이 형성될 수 있다. 포배강-유사 강이 형성되면, 내부 덩어리-유사 조직이 내부 강(inner cavity)의 한 부분에 그 자체로 위치할 수 있고 나머지 강은 유체로 충전된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 일반적으로 본 발명의 구조가 투명대를 형성하거나 포함하지 않는다는 점에서 자연 발생 인간 배반포와 상이하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투명대"는 포유동물 난모세포의 원형질막을 둘러싸는 당단백질 층을 지칭한다. 난모세포의 수정 후, 투명대는 무손상 상태로 남아 있으므로, 자연 발생 배반포는 수정 후 최대 약 5일까지 투명대를 포함하며, 이때 배반포는 소위 "부화술(zona hatching)"을 수행하며 여기서 투명대는 착상의 부분으로서 퇴화 및 분해된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 구조는 또한, 구조가 배반포의 세포에서 발견되지 않는 전반적인 유전자 시그니처를 갖는 세포를 포함할 수 있다는 점 (이는 전형적으로 혼합된 유전자 발현 프로파일임)에서, 자연 발생 배반포로부터 수득된 줄기 세포를 포함한, 자연 발생 배반포와 구별될 수 있으며 따라서 세포가 PE 및 TE 둘 다, PE 및 EPI 둘 다, TE 및 EPI 둘 다, 또는 PE, TE 및 EPI의 조합의 특징인 유전자를 발현하도록 한다. 환언하면, 본 발명의 구조에서 일부 세포는 하나 초과의 계통의 특징인 혼합된 전사 시그니처를 가질 수 있다. 하나 이상의 개별 세포는 하나 초과의 계통의 특징인 혼합된 전사 시그니처를 가질 수 있다. 각각의 계통과 관련된 전사 시그니처는 예를 들어 상기 [0248]-[0252] 및 표 2에 더 설명되어 있다.
임의의 측면에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 수정 후 배아 5-7일차 (E5-7)에 인간 배반포의 이전에 공개된 측정치에 필적하는 크기의 x- 및 y-축 직경, x:y 종횡비 및/또는 투사 면적을 갖는다. 예를 들어, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조의 x- 및/또는 y-축 직경은 약 100 내지 약 300 μm이다. 바람직하게는 x/y 종횡비가 약 1이다. 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조의 투사 면적은 약 10,000 내지 약 40,000 μm2, 바람직하게는 약 20,000 내지 약 40,000 μm2이다.
본원에 사용된 바와 같이, E5-7에서 인간 배반포의 이전에 공개된 측정치와 "필적하는" x- 및 y-축 직경 또는 x:y 종횡비는 이전에 공개된 측정치의 약 50% 내지 200%, 바람직하게는 이전에 공개된 측정치의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 1200%, 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 170%, 적어도 약 180%, 적어도 약 190% 또는 적어도 약 200%의 x- 및 y-축 직경 또는 x:y 종횡비를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, E5-7에서 인간 배반포의 이전에 공개된 측정치와 "필적하는" 투사 면적은 인간 배반포에 대해 이전에 공개된 측정치의 약 50% 내지 200%인 투사 면적을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 필적하는 투사 면적은 5,000 내지 약 40,000 μm2 범위의 값의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 1200%, 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 170%, 적어도 약 180%, 적어도 약 190% 또는 적어도 약 200%인 면적을 포함한다. 환언하면, 유사한 투사 면적은 약 5,000 내지 약 10,000 μm2, 약 10,000 내지 약 40,000 μm2, 약 40,000 μm2 내지 약 60,000 μm2, 바람직하게는 약 20,000 내지 약 40,000 μm2인 면적일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 적어도 2개의 방사상으로 위치된 층을 포함하는 층상 세포 응집체 또는 구조이다. 바람직하게는, 이는 내부 세포층 (본원에 정의된 바와 같음) 및 외부 세포층 (본원에 정의된 바와 같음)을 포함하는 구형이거나 주로 구형인 세포 응집체 또는 구조이다. 2개 초과의 세포층이 있을 수 있지만 일반적으로 에피블라스트 및/또는 원시 내배엽 계통의 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포는 응집체 또는 구조의 내부에 위치한 단일 클러스터에 존재하며, 한편 영양외배엽 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 것은 외부에 존재하는 것으로 간주된다.
임의의 측면에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 약 100 내지 400개의 총 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 일반적으로 초기 인간 배아 발달의 많은 측면을 모방하는 특징을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 구조는 배아 이식을 연구하기 위해 이용될 수 있는 시험관내 부착 검정에서 인간 배아의 특징을 모방한다. 예를 들어, IVC1 배지 (본원에 정의된 바와 같음)에서 1일 동안 배양한 후 2일부터 4.5일차까지 IVC2 배지 (본원에 정의한 바와 같음)에서 배양한 경우, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 다음 중 하나 이상을 나타낼 수 있다:
a) 크기의 증가, 편평해지고 진행되어 결과물을 형성함;
b) NANOG 및 OCT4/SOX2 양성 세포 수의 증가;
c) CDX2 및 GATA2 양성 세포의 전개(spread);
d) SOX17 및 GATA6 양성 세포가 NANOG 또는 OCT4 양성 세포의 둘레에 국부화하며;
e) 외부 세포층 또는 TE 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포에서 케라틴 KRT7 또는 다른 영양막 마커의 발현;
f) 형태학적으로 합포체영양막 (ST) 및 융모외 세포영양막 (EVT)과 비슷한 세포 (예를 들어 각각 ST 및 EVT-유사 세포), 예를 들어 다핵성 표현형 및 스핀들-유사 형태의 존재;
g) hCG (예시적인 ST 마커) 및 MMP2 (예시적인 EVT 마커)를 발현하는 세포의 존재; 및
h) ST 마커 CSH1 및 EVT 마커 ITGA1의 상향조절을 나타내는 세포의 존재.
크기의 증가 또는 특정한 마커에 대해 양성인 세포 수의 증가와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 "증가"는 약 5% 초과의 변화를 의미하는 것으로 인식될 것이다. 이와 같이 "증가"는 다층 세포 또는 배반포-유사 구조의 크기와 관련하여, (본원에 기재된 바와 같은 시험관내-부착 검정에서 배양되기 전의 구조의 크기와 비교하여, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 250%, 적어도 300% 이상의 크기 증가를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 유사하게, 특정한 마커 (예컨대 NANOG 및 OCT4/SOX2)에 양성인 세포의 수의 "증가"는 시험관내-부착 검정에서 배양되기 전의 구조의 마커 양성 세포의 수와 비교하여, 적어도 %, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 250%, 적어도 300% 또는 그 초과인 세포 수의 증가일 수 있다
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 시험관내-유래 또는 생산된 배반포 또는 블라스토이드 구조 (즉, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조)는 하기 특징 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개를 가진다:
· 적어도 2개의 방사상으로 배치된 층을 포함하고 투명대가 없는 내부 세포층과 외부층을 포함하는 구형 또는 우세하게 구형인 층상 세포 응집체 또는 구조;
· 에피블라스트 (EPI) 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포를 포함하는 내부 세포층, EPI 세포의 특징은 마커 NANOG, OCT4 (POU5F1로도 알려짐) 또는 SOX2 중 임의의 하나 이상의 존재 및 둥근 원주 외관임;
· 또한 원시 내배엽 (PE) 계통의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포 클러스터를 포함하는 내부 세포층이으로서, 여기서 PE의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포는 에피블라스트의 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포 주변에 있거나 주로 주변에 있음; PE 세포의 특징은 마커 SOX17 또는 GATA6의 존재임;
· 영양외배엽 (TE) 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포를 포함하는 외부 세포층, TE 세포의 특성은 하나 이상의 마커 CDX2 및 GATA2의 존재 및 편평하거나 길쭉한 상피 형태;
· 대략 0.1-0.2 mm의 직경;
· 약 100-400개의 세포;
· 여기서 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조에서 더 많은 세포가 NANOG보다 OCT4를 발현함;
· OCT4 양성 세포에 이웃하는 GATA6 양성 세포 (임의로 낮거나 약한 CDX2 염색 포함);
· 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조의 x- 및/또는 y-축 직경은 약 100 내지 약 300 μm임;
· 약 1의 x/y 종횡비;
· 약 5,000 내지 약 10,000 μm2, 약 10,000 내지 약 40,000 μm2, 약 40,000 μm2 내지 약 60,000 μm2, 바람직하게는 약 20,000 내지 약 40,000 μm2의 투사 면적;
· 임의로, 포배강이라 불리는 유체-충전 강; 및
· 임의로 여기서 에피블라스트 및/또는 원시 내배엽 계통의 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포는 응집체 또는 구조의 내부에 위치한 단일 클러스터에 존재하며, 한편 영양외배엽의 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 것들은 외부에 존재함.
다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 생산하는 방법
본 발명의 방법에 필요한 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 재프로그래밍 중간체로부터 또는 인위적으로 유도된 다능성 및 영양막 줄기 세포 (iPSC 및 iTSC)의 어셈블리에 의한 다층 세포 구조 또는 배반포를 수득하기 위한 "응집" 방법의 사용과 같이, 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 방법은 배반포와 비슷하고 인위적으로 유도된 구조로부터 세포 (XEN-유사 세포, TSC, pPSC 및 nPSC)를 유도 및 확대하는 방법에 관한 것으로 이해될 것이다. 환언하면, 본 발명의 방법은 일반적으로 인간 개체로부터 직접 수득된 배반포의 사용 및 조작을 배제한다.
한 실시양태에서, 다층 세포 구조를 생산하는 방법은
a) 에피블라스트 (EPI), 영양외배엽 (TE) 및 원시 내배엽 (PE) 전사 시그니처를 나타내는 재프로그래밍된 체세포의 세포 집단을 수득하는 단계; 및
b) 다층 세포 구조를 수득하기 위해 응집을 허용하는 조건 하에 재프로그래밍된 체세포를 배양하는 단계
를 포함함으로써, 다층 세포 구조를 생산한다.
한 실시양태에서, 배반포-유사 구조를 생산하는 방법은
a) 에피블라스트 (EPI), 영양외배엽 (TE) 및 원시 내배엽 (PE) 전사 시그니처를 나타내는 재프로그래밍된 체세포의 세포 집단을 수득하는 단계; 및
b) 배반포-유사 구조를 수득하기 위해 응집을 허용하는 조건 하에 재프로그래밍된 체세포를 배양하는 단계
를 포함함으로써, 배반포-유사 구조를 생산한다.
임의의 측면에서, 에피블라스트 (EPI), 영양외배엽 (TE) 및/또는 원시 내배엽 (PE) 계통의 전사 시그니처를 나타내는 세포의 집단은 바람직하게는 에피블라스트 (EPI), 영양외배엽 (TE), 및 원시 내배엽 (PE) 계통 각각의 전사 시그니처를 나타낸다.
에피블라스트 (EPI), 영양외배엽 (TE), 및 원시 내배엽 (PE) 전사 시그니처를 나타내는 재프로그래밍된 체세포의 세포 집단을 수득하는 것은 바람직하게는
- 체세포의 집단에서 하나 이상의 인자의 단백질 발현 또는 양을 증가시키는 단계로서, 여기서 인자는 체세포를 탈분화 또는 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 것인 단계; 및
- 탈분화 또는 다능성 상태로의 세포의 재프로그래밍을 허용하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 세포를 배양하는 단계
를 포함한다.
바람직하게는, 탈분화 또는 다능성 상태로의 세포의 재프로그래밍을 허용하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 세포를 배양하는 단계는 체세포를 배양 상태로 유지하기 위한 배지에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 이 단계는 다능성을 촉진하기 위한 것이 아닌 배지에서 세포를 배양하는 것을 포함한다.
추가로, 한 실시양태에서, 배반포-유사 구조를 생산하는 방법은
a) 체세포의 집단에서 하나 이상의 인자의 단백질 발현 또는 양을 증가시키는 단계로서, 여기서 인자는 체세포를 탈분화 또는 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 것인 단계;
b) 탈분화 또는 다능성 상태로의 세포의 재프로그래밍을 허용하는 충분한 시간 및 조건 하에 충분한 시간 동안 세포를 배양하는 단계;
c) 응집을 허용하는 조건 하에 WNT 경로 신호전달의 활성화제 (임의로 GSK-3 억제제), 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 TGF-β 억제제, HDAC 억제제, EGF, 및 BMP4를 포함하는 배양 배지와 세포를 접촉시키는 단계;
d) 세포가 본원에 기재된 바와 같은 배반포-유사 구조의 적어도 하나의 특징을 나타내도록 하는 충분한 시간 동안 및 조건 하에 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 순서대로 포함함으로써, 배반포-유사 구조를 생산한다.
바람직하게는, 단계 c)의 배양 배지는 Rho-키나제 (ROCK) 억제제를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 세포는 ROCK 억제제가 없는 배양 배지와 후속적으로 접촉되기 전에 적어도 약 6시간, 적어도 약 12시간, 또는 적어도 약 24시간의 기간 동안 ROCK 억제제를 포함하는 배양 배지와 접촉된다.
체세포를 탈분화 또는 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 임의의 방법이 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 이와 같이, 본 발명은 관련 인자의 단백질 발현 또는 양을 증가시키기 위한 특정한 방법, 또는 체세포가 가소성(plasticity) 또는 다능성을 향한 재프로그래밍을 개시하도록 하는 배양 조건에 의해 제한되지 않는다. 이러한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원에 추가로 기재되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 체세포를 탈분화 또는 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 인자는 전사 인자이다. 전사 인자는 인자: OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC (OSKM); SOX2, KLF4 및 OCT4 (SKO); OCT4, SOX2, KLF4 및 GLIS1 (OSKG); OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28 (OSNL); 또는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, NANOG 및 LIN28 (OKSMNL) 중 하나 이상을 포함하거나 이로 이루어지거나 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 전사 인자는 인자 OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC (OSKM), 또는 이의 변이체 중 네 가지 모두를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 전사 인자는 SOX2, KLF4 및 OCT4 (SKO)를 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 전사 인자는 OCT4, SOX2, KLF4 및 GLIS1 (OSKG)를 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 전사 인자는 OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28 (OKSMNL)을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 전사 인자는 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, NANOG 및 LIN28 (OKSMNL)을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이로 이루어진다.
따라서, 임의의 측면에서, 배반포-유사 구조를 생산하는 방법은
a) 체세포의 집단에서 전사 인자 OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC (OSKM), SOX2, KLF4 및 OCT4 (SKO), OCT4, SOX2, KLF4 및 GLIS1, 또는 OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28 (OSNL), 또는 본원에 기재된 전사 인자의 임의의 다른 조합 중 하나 이상의 단백질 발현 또는 양을 증가시키는 단계;
b) 다능성 상태로의 세포의 재프로그래밍을 허용하는 충분한 시간 및 조건 하에 세포를 배양하는 단계;
c) 응집을 허용하는 조건 하에 WNT 활성화제, 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 TGF-β 억제제, HDAC 억제제, GSK-3 억제제, EGF, 및 BMP4를 포함하는 배양 배지와 세포를 접촉시키는 단계;
d) 세포가 본원에 기재된 바와 같은 배반포-유사 구조의 적어도 하나의 특징을 나타내도록 하는 충분한 시간 및 조건 하에 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계
를 순서대로 포함함으로써, 배반포-유사 구조를 생산한다.
전형적으로, 본원에 기재된 바와 같은 전시 인자의 단백질 발현 또는 양은 세포를 전사 인자의 발현을 증가시키는 작용제와 접촉시킴으로써 증가된다. 바람직하게는, 작용제는 뉴클레오티드 서열, 단백질, 앱타머(aptamer) 및 소분자, 리보솜, RNAi 작용제 및 펩티드-핵산 (PNA) 및 이의 유사체 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작용제는 외인성이다. 본 발명은 또한 하나 이상의 전사 인자의 발현을 증가시키기 위한 전사 활성화 시스템 (예를 들어, 유전자 조절 시스템 예컨대 CRISPR/Cas9 또는 TALEN에서 사용하기 위한 gRNA)의 사용을 고려한다.
전형적으로, 본원에 기재된 바와 같은 전사 인자의 단백질 발현 또는 양은 전사 인자를 코딩하거나 이의 기능적 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 (예를 들어, mRNA 분자)을 세포에 도입함으로써 증가된다. 전사 인자를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 체세포의 집단에 다수회, 예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 6회, 예를 들어 각각 매일 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일 동안 형질감염될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 전사 인자 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 플라스미드에 의해 세포에 도입된다. 하나 이상의 전사 인자를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 사용될 수 있다. 따라서, 필요한 하나 이상의 전사 인자의 발현 또는 양을 증가시킬 목적으로 하나 이상의 플라스미드가 사용될 수 있음은 명백하다. 환언하면, 핵산 서열은 단일 플라스미드 내에 또는 상에 있을 수 있거나, 2개 이상의 플라스미드로 체세포에 제공될 수 있다.
임의의 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 하나 이상의 전사 인자를 코딩하는 핵산을 함유하는 플라스미드는 에피솜 플라스미드(episomal plasmid)일 수 있다.
바람직하게는, 핵산은 이종 프로모터를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 핵산은 바이러스 벡터 또는 비-바이러스(non-viral) 벡터와 같은 벡터에 있다. 바람직하게는, 벡터는 숙주 세포 게놈 내로 통합되지 않는 게놈을 포함하는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 또는 센다이 바이러스(Sendai virus)일 수 있다.
특정 실시양태에서, 인자의 단백질 발현 또는 양은 상기 전사 인자를 코딩하는 하나 이상의 벡터로 체세포를 형질도입 또는 형질감염시킴으로써 체세포에서 증가된다. 벡터는 통합 또는 비통합 바이러스 벡터를 포함한, 바이러스 벡터일 수 있다. 추가 실시양태에서, 벡터는 에피솜 벡터일 수 있다.
또한, 체세포는 단계 c)에서 세포를 배양 배지와 접촉시키는 단계 전에 다능성 상태로의 재프로그래밍을 완료할 필요가 없음을 이해할 것이다. 환언하면, 세포는 배양 배지와 접촉할 때 분화된 상태에서 다능성 상태로 이행하는 중간 상태에 있는 것이 바람직하다. 따라서, b) 단계가 끝나고 c) 단계에서 배양하기 전의 세포를 재프로그래밍 중간체라고 할 수 있다.
특정 실시양태에서, 탈분화 또는 다능성 상태로의 재프로그래밍을 개시하기 위해 세포를 배양하는 기간은 하나 이상의 인자의 단백질 발현, 또는 양을 증가시킨 후 또는 세포가 하나 이상의 인자의 단백질 발현, 또는 양을 증가시키는 작용제와 접촉하는 경우로부터 시작하여 적어도 1일이다. 기간은 하나 이상의 인자의 단백질 발현, 또는 양을 증가시킨 후 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 또는 21일 또는 그 초과일 수 있다. 임의의 실시양태에서, 탈분화 또는 다능성 상태로의 재프로그래밍을 개시하기 위해 세포를 배양하는 기간은 체세포와 연관된 마커의 감소를 가능하게 하고/하거나 체세포 정체성 감소 또는 손실 및 세포 가소성의 획득을 유발한다면 임의의 기간일 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 방법은 EPI, TE, 및 PE 계통 전사 시그니처의 상향조절을 유도하는 배지에서 세포를 탈분화 또는 다능성 상태로 배양하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 배지는 섬유모세포 배지, 예를 들어 표 1을 포함하여 본원에 정의된 섬유모세포 배지이다.
본원에 사용된 바와 같이, 상기 기재된 바와 같이 응집을 허용하는 조건 하에 재프로그래밍 중간체를 접촉시키기 위한 배양 배지 (즉, WNT 경로 신호전달의 활성화제 (바람직하게는 GSK-3 억제제), 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 TGF-β 억제제, HDAC 억제제, EGF 및 BMP4를 포함하는 배지는, 또한 배반포 촉진 배지 또는 아이블라스토이드 배지로도 지칭될 수 있다. 바람직하게는, 배반포 촉진 배지 또는 아이블라스토이드 배지는 본원에 정의된 바와 같은 임의의 것이다. 임의의 실시양태에서, 세포는 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 9일, 적어도 약 12일,적어도 14일, 적어도 16일, 적어도 20일, 적어도 24일, 또는 적어도 28일 이상의 기간 동안 단계 c)의 배양 배지에서 배양된다.
임의의 실시양태에서, 단계 c)에서 인자의 단백질 발현 또는 양을 증가시키는 것과 세포를 배양 배지와 접촉시키는 것 사이의 기간은 그것이 체세포와 연관된 마커의 감소를 가능하게 한다면 임의의 기간일 수 있다. 추가 예에서, 인자의 단백질 발현 또는 양을 증가시키는 것과 단계 c)에서 세포를 배양 배지와 접촉시키는 것 사이의 기간은 그것이 세포가 중간엽을 통해 상피 전이 상태로 진행할 수 있도록 하는 한 임의의 기간일 수 있다. 추가 또는 대안적인 실시양태에서, 기간은 그것이 에피블라스트 (EPI), 영양외배엽 (TE) 및 원시 내배엽(PE) 전사 시그니처의 발현을 가능하게 한다면 임의의 기간일 수 있다.
임의의 측면에서, 응집을 허용하는 조건은 세포의 3차원 응집을 허용하는 임의의 배양 플레이트, 배양 용기 또는 배양 시스템 상에서의 배양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 웰당 0.5 내지 2 × 105개 또는 약 0.5 내지 2 × 105개 세포, 웰당 0.6 내지 2 × 105개 또는 약 0.6 내지 2 × 105개 세포, 웰당 0.8 내지 2 × 105개 또는 약 0.8 내지 2 × 105개 세포, 웰당 1 내지 2 × 105개 또는 약 1 내지 2 × 105개 세포, 웰당 0.6 × 105개 또는 약 0.6 × 105개 세포, 웰당 0.8 × 105개 또는 약 0.8 × 105개 세포, 웰당 1 × 105개 또는 약 1 × 105개 세포, 웰당 1.2 × 105개 또는 약 1.2 × 105개 세포, 웰당 1.4 × 105개 또는 약 1.4 × 105개 세포, 웰당 1.6 × 105개 또는 약 1.6 × 105개 세포, 웰당 1.8 × 105개 또는 약 1.8 × 105개 세포, 웰당 2 × 105개 또는 약 2 × 105개 세포의 밀도에서 시딩될 수 있다. 한 실시양태에서, 배양 플레이트 또는 배양 용기는 본원에 기재된 임의의 것이다.
체세포는 질환 세포를 포함하여 본원에 기재된 임의의 세포 유형일 수 있다. 체세포는 성체 세포 또는 성체 또는 비-배아 세포의 하나 이상의 검출가능한 특성을 나타내는 성체로부터 유래된 세포일 수 있다. 질환 세포는 질환 또는 병태, 예를 들어 이수성(aneuploidy), 포상기태(Hydatidiform mole) 또는 코르넬리아 데 랑게 증후군(Cornelia de Lange syndrome)의 하나 이상의 검출가능한 특징을 나타내는 세포일 수 있다. 또한, 체세포는 예를 들어 CRISPR 기술 (예를 들어 CRISPR-Cas9, -Cas12a, -Cas13 또는 관련 CRISPR/뉴클레아제 시스템)에 의해 유전자 편집되었을 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 체세포는 섬유모세포 (바람직하게는 진피 섬유모세포), 각질형성세포 (바람직하게는 표피 각질형성세포), 단핵구 또는 내피 세포 또는 중간엽 줄기 세포이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 체세포는 섬유모세포만을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 체세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 바람직하게는 인간일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 체세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC), 바람직하게는 인간일 수 있다. 체세포의 특징적인 형태학적 및 유전자 발현 마커는 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 결과적으로, 본 발명의 방법을 수행하는 동안 체세포의 특징적인 마커의 감소를 시험하고 관찰하는 것은 통상의 기술자의 범위 내에 있을 것이다. 특정 예에서, 체세포가 진피 섬유모세포인 경우, 형태학적 특징은 편평한 형상을 포함하고 마커는 CD13 (ANPEP), CD44, TWIST1 및 ZEB를 포함한다.
각질형성세포 마커는 케라틴1, 케라틴14 및 인볼루크린을 포함하고 세포 형태는 자갈 외관이다. 내피 세포 마커는 CD31 (Pe-CAM), VE-카드헤린 및 VEGFR2를 포함하고 세포 형태는 모세관-유사 구조일 수 있다. 상피 세포의 마커는 시토케라틴 15 (CK15), 시토케라틴 3 (CK3), 인볼루크린 및 코넥신 4를 포함한다. 바람직하게는 관찰된 형태는 자갈 외관이다. 조혈 줄기 세포의 마커는 CD45 (범 조혈 마커), CD19/20 (B-세포 마커), CD14/15 (골수), CD34 (전구체/SC 마커), CD90 (SC)을 포함할 수 있다. 중간엽 줄기 세포의 마커는 CD13, CD29, CD90, CD105, CD10, CD45를 포함한다.
다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 대안적으로 iPSC 및 iTSC의 어셈블리, 또는 iPSC 및 iTSC 집단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 다층 세포 구조의 생산 방법은
- 다층 세포 구조를 수득하기 위해 응집을 허용하는 조건 하에 iPSC 및 iTSC 세포를 배양하는
단계를 포함하으로써, 다층 세포 구조를 생산한다.
대안적으로,
- 배반포-유사 구조를 수득하기 위해 응집을 허용하는 조건 하에 iPSC 및 iTSC 세포를 배양하는 단계
를 포함함으로써, 배반포-유사 구조를 생산하는, 시험관내-유래 배반포-유사 구조를 생산하는 방법이 있다.
iPSC 및 iTSC를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. iPSC를 생산하는 예시적인 방법은 예를 들어 문헌 [Takahashi et al., (2007) Cell, 131: 861-872,, WO 2017/219232, WO 2014/200114, WO 2014/065435, WO 2019/073055, Liu et al., (2017) Nat. Methods, 14: 1055-1062]에 기재되어 있고; 상기 문헌의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. iTSC를 생산하는 예시적인 방법은 본 원에 (실시예 11) 및 문헌 [Liu et al., (2020) Nature, 586: 101-107]에 추가로 설명되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 또한 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, iPSC 및 iTSC는 본원에 기재된 임의의 배양 용기, 예를 들어 24-웰 어그레웰(Aggrewell)™400 플레이트에서 공동-배양될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 본원에 기재된 바와 같은 배반포-유사 구조의 적어도 하나의 특징을 나타내도록 세포를 촉진하기 위한 임의의 배양 배지 (예를 들어, 배반포 촉진 배지 또는 아이블라스토이드 배지)에서 배양된다. 바람직하게는, 배양 배지는 표 4에 나타낸 바와 같은 아이블라스토이드 배지이다.
바람직하게는, iPSC 및 iTSC는 동일한 웰에서 웰당 총 1.2 × 105개 세포로 각각 1:2.5 비율로 공동-배양된다.
ROCKi는 바람직하게는 세포 생존을 향상시키기 위해 공동-배양의 첫째 날에 세포 배양에 포함되며 세포는 예를 들어 본원에 기재된 임의의 배양 용기, 예를 들어, 24-웰 어그레웰™400 플레이트에서 3, 4, 5, 6일, 바람직하게는 6일 동안 배양된다.
임의의 측면에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 내부 세포층 및 외부 세포층을 포함하고, 내부 세포층은 에피블라스트 및/또는 원시 내배엽 계통의 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포를 포함하고, 외부 세포층은 영양외배엽 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포를 포함한다. 바람직하게는 특성은 세포 형태, 유전자 발현 프로파일, 활성 검정, 단백질 발현 프로파일, 표면 마커 프로파일, 분화 능력 또는 이들의 조합의 분석에 의해 결정될 수 있다. 특성 또는 마커의 예는 본원에 기재된 것들 및 통상의 기술자에게 공지된 것들을 포함한다.
임의의 측면에서, 내부 세포층은 PE의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포의 클러스터를 추가로 포함한다. 바람직하게는 PE의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포는 에피블라스트의 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포 주변에 있거나 주로 주변에 있다.
임의의 측면에서, EPI 세포의 특징은 마커 NANOG, OCT4 (POU5F1로도 알려짐) 또는 SOX2 중 임의의 하나 이상의 존재이다. 한 실시양태에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조에서 더 많은 세포가 NANOG보다 OCT4를 발현한다.
임의의 측면에서, EPI 세포의 특징은 둥근 원주 외관의 형태이다.
임의의 측면에서, TE 세포의 특징은 마커 CDX2 및 GATA2 중 하나 이상의 존재이다.
임의의 측면에서, TE 세포의 특징은 편평하거나 길쭉한 상피 형태이다.
임의의 측면에서, PE 세포의 특징은 마커 SOX17 또는 GATA6의 존재이다.
임의의 측면에서, EPI, PE 또는 TE 계통의 마커는 문헌 [Petropoulos et al., Cell 165, 1012-1026 (2016)]에 기재된 바와 같거나 본원의 표 2에 기재된 바와 같다.
임의의 측면에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 OCT4 양성 세포에 이웃하는 GATA6 양성 세포 (임의로 낮거나 약한 CDX2 염색 포함)를 추가로 포함할 수 있다.
임의의 측면에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 E5-7, 바람직하게는 E6-7에서 인간 배반포의 주요 형태학적 특징을 나타낸다. 추가로, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 또한 에피블라스트 세포, 원시 내배엽 및 영양외배엽 세포의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 세포는 E5-7, 바람직하게는 E6-7에서 인간 배반포에서, 각각 에피블라스트, 원시 내배엽 및 영양외배엽 세포와 동일하거나 유사한 상대 공간 배열을 채택한다.
임의의 측면에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 또한 무세포 강, 또는 포배강-유사 강을 포함한다.
임의의 측면에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 수정 후 배아 5-7일차 (E5-7)에 인간 배반포의 이전에 공개된 측정치에 필적하는 크기의 x- 및 y-축 직경, x:y 종횡비 및/또는 투사 면적을 갖는다. 예를 들어, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조의 x- 및/또는 y-축 직경은 약 100 내지 약 300 μm이다. 바람직하게는 x/y 종횡비가 약 1이다. 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조의 투사 면적은 약 10,000 내지 약 40,000 μm2, 바람직하게는 약 20,000 내지 약 40,000 μm2이다.
임의의 측면에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 적어도 약 100 내지 400개의 총 세포, 또는 적어도 약 300 내지 약 600개의 세포를 포함한다.
임의의 측면에서, IVC1 배지 (본원에 정의된 바와 같음)에서 1일 동안 배양한 후 2일부터 4.5일차까지 IVC2 배지 (본원에 정의한 바와 같음)에서 배양한 경우, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조는 표면 (예컨대 유리 표면)에 부착할 수 있고 다음 중 하나 이상을 나타낼 수 있다:
i) 크기의 증가, 편평해지고 진행되어 결과물을 형성함;
j) NANOG 및 OCT4/SOX2 양성 세포 수의 증가;
k) CDX2 및 GATA2 양성 세포의 전개;
l) SOX17 및 GATA6 양성 세포가 NANOG 또는 OCT4 양성 세포의 둘레에 국부화하며;
m) 외부 세포층 또는 TE 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포에서 케라틴 KRT7 또는 다른 영양막 마커의 발현;
n) 형태학적으로 합포체영양막 (ST) 및 융모외 세포영양막 (EVT)과 비슷한 세포 (예를 들어 각각 ST 및 EVT-유사 세포), 예를 들어 다핵성 표현형 및 스핀들-유사 형태의 존재;
o) hCG (예시적인 ST 마커) 및 MMP2 (예시적인 EVT 마커)를 발현하는 세포의 존재; 및
p) ST 마커 CSH1 및 EVT 마커 ITGA1의 상향조절을 나타내는 세포의 존재.
배반포-유사 구조의 적어도 하나의 특성을 나타내도록 세포를 촉진하기 위한 배양 배지 (예를 들어, 배반포 촉진 배지 또는 아이블라스토이드 배지)는 다음을 포함할 수 있다:
- WNT 경로 신호전달의 활성화제, 임의로 GSK-3 억제제,
- 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 TGF-β 억제제,
- HDAC 억제제,
- EGF, 및
- BMP4.
바람직하게는, WNT 활성화제, TGF-β 억제제(들), HDAC 억제제 및 GSK-3 억제제는 본원에 기재된 임의의 것을 포함하여 관련 기술분야에 공지된 임의의 것일 수 있다.
바람직하게는, 배양 배지는 다음을 추가로 포함한다:
- ITS-X;
- L-글루타민;
- N-아세틸-L-시스테인;
- β-에스트라디올;
- 프로게스테론;
- 2-메르캅토에탄올;
- L-아스코르브산;
- 트랜스페린 (예를 들어 인간),
- 인슐린 (예를 들어 인간),
- N2 보충제; 및
- B27 보충제.
바람직하게는, 프로게스테론, 트랜스페린 및 인슐린은 퓨트레신 및 셀레나이트를 추가로 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 N2 보충제로 제공된다.
바람직하게는, B27 보충제는 비오틴, DL 알파 토코페롤 아세테이트, DL 알파 토코페롤, 비타민 A (아세테이트), BSA, 카탈라아제, 인슐린 (인간), 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제, 코르티코스테론, D-갈락토오스, 에탄올아민 HCL, 글루타티온, L-카르니틴 HCL, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 푸트레신 2HCl, 셀렌산나트륨, T3 (트리오도-l-티로닌)을 포함한다.
배양 배지는 항생제, 예를 들어 페니실린-스트렙토마이신을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 배양 배지는 다음을 포함한다:
- 각각 2:1:1 비율로 본원에 정의된 바와 같은 IVC1 배지, N2B27 기본 배지 및 TSC 기본 배지,
- WNT 경로 신호전달의 활성화제 (임의로 GSK-3 억제제),
- 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 TGF-β 억제제,
- HDAC 억제제,
- EGF, 및
- BMP4.
본원의 임의의 측면에서, WNT 경로 신호전달을 활성화하기 위한 작용제는 WNT 신호전달을 직접적으로 또는 간접적으로 활성화하는 임의의 소분자를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, WNT 경로 신호전달을 활성화하는 작용제는 GSK-3 억제제일 수 있다.
바람직하게는 TGF-β 경로 억제제는 SB431542 및 A83-01로부터 선택되고, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC)1 억제제는 VPA (발프로산)이고, GSK-3 억제제는 CHIR99021이다.
바람직하게는, GSK-3 억제제는 2 μM 또는 약 2 μM의 농도이고, TGF-β 경로 억제제는 0.5 μM 또는 1 μM, 또는 약 0.5 μM 또는 1 μM의 농도이고, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC)1 억제제는 0.8 mM 또는 약 0.8 mM의 농도이고, EGF는 50 ng/ml 또는 약 50 ng/ml의 농도이며, BMP4는 10 ng/ml 또는 약 10 ng/ml의 농도이다.
전형적으로, 배양 배지는 ROCK 억제제를 추가로 포함한다. 바람직하게는, ROCK 억제제는 Y-27632이다. 바람직하게는, ROCK 억제제는 10 μM 또는 약 10 μM의 농도이다.
임의의 측면에서, 단계 c)에서 사용하기 위한 배양 배지는 표 4에 정의된 바와 같은 섬유모세포 배지, N2B27 기본 배지, TSC 기본 배지, IVC1 배지, IVC2 배지 또는 인간 아이블라스토이드 배지를 포함하거나 이로 이루어된다
임의의 측면에서, 본 발명의 임의의 방법의 단계 c)에서 정의된 배양 배지는 표 4를 포함하여, 본원에 정의된 바와 같은 인간 아이블라스토이드 배지를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본 발명의 임의의 배양 배지일 수 있다.
임의의 측면에서, 체세포는 질환 유전자형을 갖는다. 예를 들어, 체세포는 유전 질환, 바람직하게는 초기 발달 질환을 가진 개체로부터 유래될 수 있다. 초기 발달 질환의 예는 이수성, 많은 단일유전자 장애(monogenic disorder), 포상기태, 및 코르넬리아 데 랑게 증후군이다.
다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 생산하기 위한 세포 재프로그래밍
체세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 체세포의 재프로그래밍은 전형적으로 재프로그래밍 인자 (전사 인자 포함)의 발현에 이어서, 분화 마커의 손실 및 가소성 마커의 획득을 촉진하기 위한 특정한 조건에서의 배양을 포함한다.
본 발명의 방법에 따라, 체세포는 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조의 형성을 촉진하기 위한 배양 조건에 적용되기 전에, EPI, TE 또는 PE 계통의 전사 시그니처를 나타내는 세포의 집단을 수득하기 위해, 탈분화 또는 다능성 상태로 재프로그래밍된다. 따라서, 세포 집단은 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조의 형성을 촉진하기 위한 배양 조건에 적용될 때 재프로그래밍 중간체를 포함하는 것으로 인식될 것이다. 재프로그래밍 중간체는 EPI, TE 및/또는 PE 계통의 전사 시그니처를 나타낸다. 바람직하게는 중간체의 집단은 EPI, TE, 및 PE 계통의 세 가지 모두의 전사 시그니처를 나타낸다.
임의의 측면에서, EPI, TE 또는 PE 계통의 전사 시그니처를 나타내는 세포의 집단은 본원의 표 2에 열거된 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포의 집단을 포함한다.
바람직하게는, EPI 계통의 전사 시그니처는 본원의 표 2에 열거된 바와 같은 EPI 계통의 마커 중 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70개 또는 그 초과 또는 모두의 발현을 포함한다. 보다 바람직하게는, TE 계통의 전사 시그니처는 본원의 표 2에 열거된 바와 같은 TE 계통의 마커 중 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70개 또는 그 초과 또는 모두의 발현을 포함한다. 보다 바람직하게는, PE 계통의 전사 시그니처는 본원의 표 2에 열거된 바와 같은 PE 계통의 마커 중 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70개 또는 그 초과 또는 모두의 발현을 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, EPI 계통의 전사 시그니처는 마커: ARGFX, NANOG, GDF3, SUSD2, DPPA5, POU5F1, UTF1, TDGF1, PDLIM1 및 USP28 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개, 또는 모두의 발현을 포함하며; TE 계통의 전사 시그니처는 마커: KRT18, KRT8, NODAL, UPP1, TAGLN2, KRT19, SLC7A5, FAM101B, CDX2, 및 GATA2 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개, 또는 모두의 발현을 포함하며; PE 계통의 전사 시그니처는 마커: PALLD, FST, NOG, CLDN10, SERPINB6, MIAT, CHST2, VSNL1, MT1X, PDPN, SOX17, 및 GATA6 중 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개, 또는 모든 마커의 발현이다.
체세포를 재프로그래밍하기 위한 적합한 방법의 예는 관련 기술분야에 충만하며, WO 2009/101407, WO 2014/200030, WO 2015/056804, WO 2014/200114, WO 2014/065435, WO 2013/176233, WO 2012/060473, WO 2012/036299, WO 2011/158967, WO 2011/055851, WO 2011/037270, WO 2011/090221에 예시되어 있으며, 이들의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 전형적으로, 이러한 방법은 출발 세포 유형 (또는 공급원 세포)에서 세포를 다능성 상태로 재프로그래밍할 수 있는 (또는 목적을 위해), 하나 이상의 인자 또는 작용제의 양을 증가시키는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 체세포를 재프로그래밍하기 위한 또는 체세포를 재프로그래밍할 수 있는 인자 또는 작용제는 전사 인자이다. 대안적으로, 인자 또는 작용제는 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 세포에서 하나 이상의 전사 인자의 수준을 간접적으로 증가시킨다. 본 발명의 방법에 따라 체세포 (예를 들어, 섬유모세포)를 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 특히 바람직한 전사 인자, 및 이의 핵산 서열을 하기 표 3에 나타냈다. 본 발명에 따라서, 표 3에 열거된 전사 인자 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 모두가 체세포를 재프로그래밍하기 위해 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 체세포를 재프로그래밍하기 위해 표 3에 언급된 전사 인자의 사용에 제한되지는 않는다는 것이 이해될 것이다.
본원에 언급되는 전사 인자 및 기타 단백질 인자는 HUGO 유전자 명명 위원회 (Gene Nomenclature Committee) (HGNC) 기호에 의해 언급된다. 표 3은 본원에 언급된 전사 인자에 대한 예시적인 앙상블 유전자(Ensemble Gene) ID 및 유니프롯(Uniprot) ID를 제공한다. 뉴클레오티드 서열은 앙상블 데이터베이스 (Flicek et al. (2014). Nucleic Acids Research Volume 42, Issue D1. Pp. D749-D755) 버전 83으로부터 유래된다. 또한, 본 발명에 사용하기 위해 고려되는 것은 본원에 언급된 전사 인자의 임의의 변이체, 상동체, 오르토로그 또는 파라로그이다.
바람직하게는, 단일 세포 유형만이 본 발명의 방법에 따라 재프로그래밍에 적용된다. 환언하면, 바람직하게는 재프로그래밍에 적용되는 세포의 집단은 동종 또는 실질적으로 동종인 세포의 집단이다. 예를 들어 바람직하게는, 세포의 집단은 섬유모세포, 각질형성세포, 또는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 체세포 유형으로만 구성되거나 주로 구성된다. 이와 같이, 체세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하기에 적합한 관련 인자를 결정할 때 단지 하나의 시작 세포 유형이 고려될 필요가 있음이 이해할 것이다.
통상의 기술자는 이 정보가 예를 들어 체세포에서 전사 인자의 증가된 양을 제공하거나, 체세포에서 전사 인자를 재조합적으로 발현하기 위한 핵산 등을 제공할 목적으로 본 발명의 방법을 수행하는 데 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
용어 "변이체"는 전장 폴리펩티드와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명은 본원에 기재된 전사 인자의 변이체의 사용을 고려한다. 변이체는 전장(full length) 폴리펩티드의 단편 또는 자연 발생 스플라이스 변이체일 수 있다. 변이체는 폴리펩티드의 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드일 수 있으며, 여기서 단편은 전장 야생형 폴리펩티드 또는 이의 도메인이 표적 세포 유형으로 체세포 유형의 전환을 촉진하는 능력과 같은 관심의 기능적 활성을 갖는 한 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%이다. 일부 실시양태에서, 도메인은 서열의 임의의 아미노산 위치에서 시작하여 C-말단을 향해 확장되는 길이가 적어도 100, 200, 300, 또는 400개 아미노산이다. 단백질의 활성을 제거하거나 실질적으로 감소시키는 관련 기술분야에 공지된 변형은 피하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 변이체에는 전장 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단 부분이 결여되어 있으며, 예를 들어 어느 한 말단으로부터 10, 20, 또는 50개 이하의 아미노산이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서 폴리펩티드는 성숙한 (전장) 폴리펩티드의 서열을 가지며, 이는 정상적인 세포내 단백질분해 처리 동안 (예를 들어, 공동-번역 또는 번역 후 처리) 신호 펩티드와 같은 하나 이상의 부분이 제거된 폴리펩티드를 의미한다. 단백질을 자연적으로 발현하는 세포로부터 정제하는 것에 의한 것이 아닌 단백질을 생산하는 일부 실시양태에서, 단백질은 키메라 폴리펩티드이며, 이는 그것이 2종 이상의 상이한 종으로부터의 부분을 함유함을 의미한다. 단백질을 자연 적으로 발현하는 세포로부터 정제하는 것에 의한 것이 아닌 단백질을 생산하는 일부 실시양태에서, 단백질은 유도체이며, 이는 단백질이 단백질과 관련이 없는 추가 서열을 포함하는 것을 의미하며, 이는 이러한 서열이 단백질의 생물학적 활성을 실질적으로 감소시키지 않는 한이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정한 폴리펩티드 변이체, 단편, 또는 유도체가 관련 기술분야에 공지된 검정을 사용하여 기능적인지 여부를 알고 있거나, 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 예를 들어, 체세포를 표적 세포 유형으로 전환시키는 전사 인자의 변이체의 능력은 실시예에서 본원에 개시된 바와 같은 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 다른 편리한 검정은 루시페라제와 같은 검출가능한 마커를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 전사 인자 결합 부위를 함유하는 리포터 구축물(construct)의 전사를 활성화하는 능력을 측정하는 것을 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 기능적 변이체 또는 단편은 전장 야생형 폴리펩티드의 활성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 초과를 갖는다.
세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 인자의 양을 증가시키는 것과 관련하여 용어 "의 양을 증가시키는"은 관심 세포 (예를 들어, 섬유모세포와 같은 체세포)에서 인자 (예를 들어, 전사 인자)의 수량을 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 인자의 양은 인자의 수량이 대조군 (예를 들어, 상기 발현 카세트 중 어느 것도 도입되지 않은 섬유모세포)에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 초과일 때 관심 세포 (예를 들어, 하나 이상의 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 발현 카세트가 도입된 세포)에서 "증가된다. 그러나, 인자 (또는 이를 코딩하는 프리(pre)-mRNA 또는 mRNA)의 전사, 번역, 안정성 또는 활성의 양, 속도 또는 효율을 증가시키는 임의의 방법을 포함한 인자의 양을 증가시키는 임의의 방법이 고려된다. 게다가, 전사 발현의 음성 조절인자의 하향-조절 또는 간섭, 기존 번역 (예를 들어, SINEUP)의 효율성 증가가 또한 고려된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "작용제"는 소분자, 핵산, 폴리펩티드, 펩티드, 약물, 이온 등과 같은, 그러나 이에 제한되지는 않는, 임의의 화합물 또는 물질을 의미한다. 작용제는 본원에 기재된 바와 같은 전사 인자를 포함하는 인자의 양을 증가시키는 임의의 화합물 또는 물질일 수 있다. "작용제"는 합성 및 자연-발생 단백질성 및 비단백질성 실체를 제한 없이 포함한, 임의의 화학물질, 실체 또는 모이어티일 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제는 핵산, 핵산 유사체, 단백질, 항체, 펩티드, 앱타머, 핵산의 올리고머, 아미노산, 또는 탄수화물, 예를 들어, 제한 없이 단백질, 올리고뉴클레오티드, 리보자임, DNA자임, 당단백질, siRNA, 지단백질, 앱타머, 및 이의 변형 및 조합 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 화학적 모이어티를 갖는 소분자이다. 예를 들어, 화학적 모이어티는 마크롤리드, 렙토마이신 및 관련 천연 생산물 또는 이의 유사체를 포함한 비치환 또는 치환된 알킬, 방향족, 또는 헤테로사이클릭 모이어티를 포함하였다. 화합물은 원하는 활성 및/또는 특성을 갖는 것으로 공지되어 있거나 다양한 화합물의 라이브러리로부터 선택될 수 있다.
세포 또는 유기체에서 단백질, 유전자, 핵산, 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때 용어 "외인성"은 인공적 또는 자연적 수단에 의해 세포 또는 유기체에 도입된 단백질, 유전자, 핵산, 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭하거나; 또는 세포와 관련하여, 단리되고 후속적으로 인위적 또는 자연적 수단에 의해 다른 세포 또는 유기체에 도입된 세포를 지칭한다. 외인성 핵산은 상이한 유기체 또는 세포로부터 유래하거나, 유기체 또는 세포 내에서 자연적으로 발생하는 핵산의 하나 이상의 추가 카피일 수 있다. 외인성 세포는 상이한 유기체의 것일 수 있거나, 이는 동일한 유기체의 것일 수 있다. 비제한적인 예로서, 외인성 핵산은 천연 세포의 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 있거나, 그렇지 않으면 자연에서 발견되는 것과 상이한 핵산 서열에 의해 플랭킹된 것이다. 외인성 핵산은 또한 에피솜 벡터와 같은 염색체외일 수 있다.
적합한 검출 수단은 표지, 예컨대 방사성뉴클레오티드, 효소, 조효소, 형광제, 화학발광제, 발색체, 효소 기질 또는 보조인자, 효소 억제제, 보결분자단 복합체, 자유 라디칼, 입자, 염료 등의 사용을 포함한다. 이러한 표지된 시약은 방사선면역검정, 효소 면역검정, 예를 들어 ELISA, 형광 면역검정 등과 같은 널리 공지된 다양한 검정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 3,766,162; 3,791,932; 3,817,837; 및 4,233,402를 참조한다.
본 개시내용의 방법은 플레이트, 마이크로칩 또는 슬라이드당 24, 48, 96 또는 384-웰과 같은 다중-웰 플레이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 허용 되는 소형화 방법을 통해 검정 시스템에서 "소형화"될 수 있다. 검정은 유리하게는 더 적은 양의 시약 및 기타 재료를 포함하는, 마이크로칩 지지체 상에서 수행할 크기가 줄어들 수 있다.
다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 생산하기 위한 배양 용기
배반포-유사 구조의 다층 세포 구조를 형성하는 것은 응집을 허용하는 적합한 용기, 플레이트, 시스템 또는 용기에서 발생한다. 전형적으로, 배양은 세포의 3차원 응집을 허용하는 임의의 배양 플레이트, 배양 용기 또는 배양 시스템 상에서 발생한다.
적합한 용기, 플레이트, 시스템 또는 용기는 바람직하게는 비부착성 표면을 갖는다. 비부착성 표면은 세포가 배치되고 세포에 대한 접착 경향이 거의 또는 전혀 없는 표면이다. 따라서, 세포는 본질적으로 이 표면에 부착되지는 않는다. 이론에 구애됨이 없이, 비부착성 표면의 사용은 세포가 표면에 접착되지 않고, 대신에 서로 부착하여, 본 발명에서 사용하기 위한 세포 구조를 형성하는 구동력을 제공한다.
비부착성 표면은 비부착성 생물학적 또는 인공 재료로 재료를 코팅함으로써 형성될 수 있거나, 비부착성 표면은 비부착성 재료를 적합하게 형상화하거나, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 수단에 의해 수득될 수 있다. 세포 응집체가 형성될 수 있는 용기를 이하 스캐폴드(scaffold)라고 한다.
비접착 표면을 가진 스캐폴드는 예를 들어 에틸렌 옥사이드, 프로필렌 옥사이드, 폴리에틸렌 글리콜, (PEG)-(공)중합체 (예를 들어 PLL-g-(PEG)), 폴리(에틸렌 옥사이드) (PEO) (공)중합체, 아가로스 히드로겔, 하한 임계 용액 온도(Lower Critical Solution Temperatures) (LCST) 미만의 온도-반응성 물질 (예를 들어 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)), 소수성 물질 (예를 들어 올레핀 중합체), 세포-기피 마이크로- 및 나노토포그래피(cell-repellent micro- and nanotopographies)로 제조되거나 이로 코팅된다.
따라서, 본 발명에 따른 세포 응집체를 형성하는 것은 바람직하게는 비접착 스캐폴드에서 달성된다. 비부착성 스캐폴드는 본질적으로 세포의 부착을 허용하지 않는 적어도 하나의 표면을 가지고 있다. 바람직하게는, 이는 응집체를 형성하는 세포가 위치하는 면이다. 비부착성 스캐폴드는 비부착성 재료로부터 형성되거나 비부착성 재료로 코팅된 또 다른 재료로부터 형성될 수 있다. 비부착성 페트리 접시 또는 튜브는 예를 들어 스캐폴드로서 사용될 수 있지만, 바람직하게는 스캐폴드는 예를 들어 판-유사 형상, 예컨대 예를 들어 다소 육각형, 오각형, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 타원형 또는 둥근 형상을 가지고 있다.
보다 바람직하게는, 스캐폴드는 적어도 하나의 적합한 공동 또는 채널을 포함한다. 바람직하게는, 스캐폴드에 다수의 공동 또는 채널이 존재한다. 이들 공동 또는 채널이 형성될 세포 집합체의 크기보다 다소 큰 것이 바람직하다. 적합한 공동 및 채널은 예를 들어 직경이 20-5000 μm, 보다 바람직하게는 100-1000 μm와 같이 작고, 가장 바람직하게는 100 - 500 μm, 특히 직경이 대략 200 μm인 공동이다. 적절한 공동 또는 채널은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 수득될 수 있다. 직경은 공동 또는 채널의 개구부의 원주에 있는 임의의 두 개의 반대 지점 사이의 가능한 가장 긴 직선 거리로 정의된다. 채널 또는 공동은 폐쇄된 바닥을 갖고, 적어도 공동 또는 채널 내부의 표면은 비부착성 재료를 포함한다.
바람직하게는, 공동은 길이와 너비가 대략 유사한 계산 차수인 형상을 갖는다. 깊이가, 또한 대략 동일한 계산 차수이다. 이러한 공동을 마이크로웰이라고 한다. 본 발명의 경우, 비부착성 스캐폴드가 마이크로웰을 포함하는 것이 바람직하다. 마이크로웰은 바람직하게는 길이가 이의 너비의 약 5배 이하, 바람직하게는 3배 이하 그리고 보다 바람직하게는 대략 동일하고, 깊이가 이의 너비의 10배 이하, 바람직하게는 5배 이하, 그리고 보다 바람직하게는 최대 3배인 공동이다.
마이크로웰의 길이는 마이크로웰의 개구부의 원주에서 임의의 마주보는 두 지점 사이의 가능한 가장 긴 직선 거리로 정의된다. 따라서, 마이크로웰의 길이는 바람직하게는 20-5000 μm, 보다 바람직하게는 100-1000 μm, 가장 바람직하게는 100 - 500 μm, 특히 대략 200 μm인 이의 직경으로 간주된다. 마이크로웰의 너비는 이의 길이에 수직인 마이크로웰 개구부의 원주에서 임의의 마주보는 두 지점 사이의 가장 긴 직선 거리로 정의된다.
스캐폴드의 표면에 수직하고 평행한 마이크로웰의 다양한 단면적은 불규칙한 형상을 포함하여 임의의 형상일 수 있지만, 바람직하게는 마이크로웰의 가능한 단면적은 독립적으로 정사각형 또는 대략 정사각형, 직사각형 또는 대략 직사각형, 삼각형 또는 대략 삼각형, 타원형 또는 대략 타원형 또는 둥근형 또는 대략 둥근형이다. 그러나, 마이크로웰이 원통형이고 스캐폴드 표면에 대략 둥근 개구부를 갖는 것이 바람직하다. 적합한 마이크로웰은 예를 들어 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 마이크로웰 플레이트에 존재하다.
비부착성 스캐폴드가 마이크로웰을 포함하는 경우, 단일 스캐폴드에 다수의 마이크로웰을 배열하는 것이 유리하다. 바람직하게는, 이들 마이크로웰은 규칙적인 패턴으로 배열된다. 이를 통해 많은 수의 블라스토이드를 높은 처리량으로 준비할 수 있다.
한 측면에서, 배양 용기는 400 μm 또는 800 μm의, 또는 약 400 μm 또는 800 μm 또는 약 400 μm 내지 800 μm의 역피라미드형 마이크로웰의 어레이를 갖는 배양 플레이트이다. 예시적인 배양 플레이트는 어그레웰™ 플레이트, 예를 들어 어그레웰™ 400 또는 800이다. 어그레웰 플레이트의 각각의 웰 내에는, 다수의 마이크로웰이 있다 (예를 들어, 각각의 웰에는 24-웰 어그레웰, 1200개의 마이크로웰이 있음).
공지된 밀도의 단일 세포의 잘 분산된 현탁액을 플레이트 웰에 첨가하고 플레이트를 부드럽게 원심분리하여 세포를 마이크로웰에 고르게 밀어넣음으로써 세포를 마이크로웰에 시딩하거나 첨가할 수 있다,
세포의 3차원 응집을 허용하는 조건은 예를 들어, 세포는 웰당 0.5 내지 2 × 105개 또는 약 0.5 내지 2 × 105개 세포, 웰당 0.6 내지 2 × 105개 또는 약 0.6 내지 2 × 105개 세포, 웰당 0.8 내지 2 × 105개 또는 약 0.8 내지 2 × 105개 세포, 웰당 1 내지 2 × 105개 또는 약 1 내지 2 × 105개 세포, 웰당 0.6 × 105개 또는 약 0.6 × 105개 세포, 웰당 0.8 × 105개 또는 약 0.8 × 105개 세포, 웰당 1 × 105개 또는 약 1 × 105개 세포, 웰당 1.2 × 105개 또는 약 1.2 × 105개 세포, 웰당 1.4 × 105개 또는 약 1.4 × 105개 세포, 웰당 1.6 × 105개 또는 약 1.6 × 105개 세포, 웰당 1.8 × 105개 또는 약 1.8 × 105개 세포, 웰당 2 × 105개 또는 약 2 × 105개 세포의 밀도로 세포를 시딩하는 것을 포함한다 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 어그레웰 플레이트에 세포를 시딩할 때; 시딩은 마이크로웰당 1-1000개 세포 사이일 수 있음). 바람직하게는 세포는 시딩 전 단일 세포 현탁액이다. 바람직하게는, 세포는 본원에 기재된 방법에서 단계 c) 및/또는 d)의 에피블라스트 (EPI), 영양외배엽 (TE), 및 원시 내배엽 (PE) 전사 시그니처를 나타내는 재프로그래밍된 체세포의 세포 집단 또는 세포이다.
체세포로부터 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 생산하기 위한 배양 배지 및 조건
본원에 언급된 바와 같은 용어 "세포 배양 배지" (본원에서 "배양 배지" 또는 "배지"라고도 함)는 세포 생존력을 유지하고 증식을 뒷받침하는 영양소를 함유하는 세포 배양을 위한 배지이다. 세포 배양 배지는 염(들), 완충체(들), 아미노산, 글루코스 또는 기타 당(들), 항생제, 혈청 또는 혈청 대체물, 및 펩티드 성장인자와 같은 기타 성분들 중 임의의 것을 적절한 조합으로 함유할 수 있다. 특정한 세포 유형에 통상적으로 사용되는 세포 배양 배지는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 예시적인 세포 배양 배지는 표 1에 나타낸 것들을 포함하여 본원에 기재되어 있다.
본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 체세포는 본원에 기재된 바와 같이 단계 c)에서 배양 배지와 접촉하는 단계 전에 다능성 상태로의 재프로그래밍을 완료할 필요가 없다. 환언하면, 세포는 배반포-유사 구조 또는 다세포 구조를 수득하기 위해 응집을 가능하게 하기 위해 배양 배지와 접촉할 때 분화된 상태에서 다능성 상태로 이행하는 중간 상태에 있는 것이 바람직하다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같이, b) 단계가 끝나고 c) 단계에서 배양하기 전의 세포를 재프로그래밍 중간체라고 할 수 있다.
특정 실시양태에서, 다능성 상태로의 재프로그래밍을 개시하기 위해 세포를 배양하는 기간은 하나 이상의 인자의 단백질 발현, 또는 양을 증가시킨 후 또는 세포가 하나 이상의 인자의 단백질 발현, 또는 양을 증가시키는 작용제와 접촉하는 경우로부터 시작하여 적어도 1일이다. 기간은 하나 이상의 인자의 단백질 발현, 또는 양을 증가시킨 후 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 또는 21일 또는 그 초과일 수 있다. 임의의 실시양태에서, 다능성 상태로의 재프로그래밍을 개시하기 위해 세포를 배양하는 기간은 체세포와 연관된 마커의 감소를 가능하게 한다면 임의의 기간일 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 상기 방법은 EPI, TE, 및 PE 계통 전사 시그니처의 상향조절을 유도하는 배지에서 세포를 다능성 상태로 배양하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 배지는 섬유모세포 배지, 예를 들어 표 1을 포함하는 본원에 정의된 섬유모세포 배지이다.
본원에 사용된 바와 같이, 단계 c)의 배양 배지는 또한 배반포 촉진 배지 또는 아이블라스토이드 배지로도 지칭될 수 있다. 바람직하게는, 배반포 촉진 배지 또는 아이블라스토이드 배지는 본원에서 정의된 바와 같은 임의의 배지이다. 임의의 실시양태에서, 세포는 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일의 기간 동안 단계 c)의 배양 배지에서 배양된다.
임의의 실시양태에서, 체세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 인자의 단백질 발현 또는 양을 증가시키는 것과 단계 c)에서 세포를 배양 배지와 접촉시키는 것 사이의 기간은 체세포와 연관된 마커의 감소를 가능하게 한다면 임의의 기간일 수 있다. 추가의 예에서, 인자의 단백질 발현 또는 양을 증가시키는 것과 단계 c)에서 세포를 배양 배지와 접촉시키는 것 사이의 기간은 그것이 세포가 중간엽을 통해 상피 전이 상태로 진행할 수 있도록 하는 한 임의의 기간일 수 있다. 추가 또는 대안적인 실시양태에서, 기간은 그것이 에피블라스트 (EPI), 영양외배엽 (TE) 및 원시 내배엽(PE) 전사 시그니처의 발현을 가능하게 한다면 임의의 기간일 수 있다.
임의의 측면에서, 세포가 배반포-유사 구조의 적어도 하나의 특징을 나타내도록 촉진하기 위한 배양 배지로서, 배양 배지는
- WNT 경로의 신호전달을 활성화하기 위한 작용제 (임의로 GSK-3 억제제);
- 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 TGF-β 억제제,
- HDAC 억제제,
- 성장 인자 (바람직하게는 EGF), 및
- BMP (바람직하게는 BMP4)
를 포함한다.
이 측면에서, WNT 활성화제, TGF-β 억제제(들), HDAC 억제제 및 GSK-3 억제제는 본원에 기재된 임의의 것을 포함하여 관련 기술분야에 공지된 임의의 것일 수 있다.
바람직하게는, 배양 배지는 다음을 추가로 포함한다:
- ITS-X;
- L-글루타민;
- N-아세틸-L-시스테인;
- β-에스트라디올;
- 프로게스테론;
- 2-메르캅토에탄올;
- L-아스코르브산;
- 트랜스페린 (예를 들어 인간),
- 인슐린 (예를 들어 인간),
- N2 보충제; 및
- B27 보충제.
바람직하게는, 프로게스테론, 트랜스페린 및 인슐린은 퓨트레신 및 셀레나이트를 추가로 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 N2 보충제로 제공된다.
바람직하게는, B27 보충제는 비오틴, DL 알파 토코페롤 아세테이트, DL 알파 토코페롤, 비타민 A (아세테이트), BSA, 카탈라아제, 인슐린 (인간), 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제, 코르티코스테론, D-갈락토오스, 에탄올아민 HCL, 글루타티온, L-카르니틴 HCL, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 푸트레신 2HCl, 셀렌산나트륨, T3 (트리오도-l-티로닌)을 포함한다.
임의의 실시양태에서, 배양 배지는 항생제, 예를 들어 페니실린-스트렙토마이신을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 배양 배지는 다음을 포함한다:
- 각각 2:1:1 비율로 본원에 정의된 바와 같은 IVC1 배지, N2B27 기본 배지 및 TSC 기본 배지,
- 활성화제 또는 WNT 경로 신호전달 (임의로 GSK-3 억제제),
- 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 TGF-β 억제제,
- HDAC 억제제,
- GSK-3 억제제,
- 성장 인자 (바람직하게는 EGF), 및
- BMP (바람직하게는 BMP4).
바람직하게는 TGF-β 경로 억제제는 SB431542 및 A83-01로부터 선택되고, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC)1 억제제는 VPA (발프로산)이고, GSK-3 억제제는 CHIR99021이다.
바람직하게는, GSK-3 억제제는 2 μM 또는 약 2 μM의 농도이고, TGF-β 경로 억제제는 0.5 μM 또는 1 μM, 또는 약 0.5 μM 또는 1 μM의 농도이고, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC)1 억제제는 0.8 mM 또는 약 0.8 mM의 농도이고, EGF는 50 ng/ml 또는 약 50 ng/ml의 농도이며, BMP4는 10 ng/ml 또는 약 10 ng/ml의 농도이다.
본원에 사용된 바와 같이, 성장 인자는 임의의 성장 인자일 수 있으나, 바람직하게는 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린, 형질전환 성장 인자 (TGF)로부터 선택된다. 성장 인자의 양은 임의의 양, 예를 들어 0.1 내지 1000 ng/ml, 바람직하게는 10-100 ng/ml, 바람직하게는 50 ng/ml일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, ROCK 억제제는 Rho-결합 키나제의 억제제를 지칭한다. 이러한 억제제의 예는 트랜스-N-(4-(1-아미노에틸)-시클로헥산카르복스아미드로도 공지된, ((1R,4r)-4-((R)-1-아미노에틸)-N-(피리딘-4-일)시클로헥산 카르복스아미드, 압캠), 1-(5-이소퀴놀루닐) (술포닐) 호모피페라진 (1-(5-이소퀴놀리닐술포닐)호모피페라진을 포함한다. 전형적으로 ROCK 억제제의 양은 약 0.1 내지 50 μM, 바람직하게는 약 1 내지 10 μM이다.
바람직하게는, ROCK 억제제는 Y-27632이다. 바람직하게는, ROCK 억제제는 10 μM, 또는 약 10 μM의 농도이다.
또 다른 측면에서, 배양 배지는 표 4에 정의된 바와 같은 섬유모세포 배지, N2B27 기본 배지, TSC 기본 배지, IVC1 배지, IVC2 배지 또는 인간 아이블라스토이드 배지를 포함하거나 이로 이루어된다.
임의의 측면에서, 본 발명의 임의의 방법의 단계 c)에서 정의된 배양 배지는 본 발명의 임의의 배양 배지일 수 있으며, 표 4를 포함하여, 본원에 정의된 바와 같은 인간 아이블라스토이드 배지를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 생산하기 위한 핵산 및 벡터
본원에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 핵산 또는 벡터는 표 3에 언급된 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 핵산 또는 벡터는 세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 인자 중 하나 이상을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
용어 "발현"은 해당되는 경우, 예를 들어, 전사, 번역, 접힘, 변형 및 처리를 포함하나 이에 제한되지는 않는, RNA 및 단백질 생산 및 적절한 경우 단백질 분비에 관련된 세포 프로세스를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단리된" 또는 "부분적으로 정제된"은, 핵산 또는 폴리펩티드의 경우에, 이의 천연 공급원에서 발견되는 바와 같은 핵산 또는 폴리펩티드와 함께 존재하고/하거나 세포에 의해 발현될 때 핵산 또는 폴리펩티드와 함께 존재할 것이거나, 분비된 폴리펩티드의 경우에 분비될 것인, 적어도 하나의 다른 성분 (예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드)으로부터 분리된 핵산 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 화학적으로 합성된 핵산 또는 폴리펩티드 또는 시험관내 전사/번역을 사용하여 합성된 것은 "단리된" 것으로 간주된다.
용어 "벡터"는 숙주 또는 체세포로의 도입을 위해 DNA 서열이 삽입될 수 있는 운반체 DNA 분자를 지칭한다. 바람직한 벡터는 이들이 연결된 핵산의 자율 복제 및/또는 발현이 가능한 벡터이다. 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지향할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 따라서, "발현 벡터"는 숙주 세포에서 관심 유전자의 발현에 필요한 필수 조절 영역을 함유하는 특수화된 벡터이다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 벡터 내의 또 다른 서열에 작동가능하게 연결된다. 벡터는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터가 사용된다면, 바이러스 벡터는 복제 결함이 있는 것이 바람직하며, 이는 예를 들어 복제를 코딩하는 모든 바이러스 핵산을 제거함으로써 달성될 수 있다. 복제 결함 바이러스 벡터는 여전히 이의 감염 특성을 유지하고 복제 아데노바이러스 벡터와 유사한 방식으로 세포에 유입되나, 일단 세포에 유입되면 복제 결함 바이 러스 벡터는 번식하거나 증식하지 않는다. 벡터는 또한 리포솜 및 나노입자 및 DNA 분자를 세포에 전달하기 위한 기타 수단을 포함한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열이 코딩 서열의 발현에 영향을 미치도록 코딩 서열에 대해 적절한 위치에서 DNA 분자에 위치하는 것을 의미한다. 이와 동일한 정의가 때때로 발현 벡터에서 코딩 서열 및 전사 제어 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 및 종결 요소)의 배열에 적용된다. 용어 "작동적으로 연결된"은 발현될 폴리뉴클레오티드 서열 앞에 적절한 시작 신호 (예를 들어, ATG)를 갖고, 발현 제어 서열의 제어 하에 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 정확한 판독 프레임을 유지하고, 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 원하는 폴리펩티드를 제조하는 것을 포함한다.
용어 "바이러스 벡터"는 세포 내로 핵산 구축물의 운반체로서 바이러스, 또는 바이러스-연관 벡터의 사용을 지칭한다. 구축물은 감염 또는 세포로의 형질도입을 위해, 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터를 포함한, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 또는 단순 헤르페스 바이러스 (HSV) 또는 기타와 같은 복제되지 않는 결함이 있는 바이러스 게놈에 통합 및 패키징될 수 있다. 벡터는 세포의 게놈에 혼입되거나 혼입되지 않을 수 있다. 구축물은 원하는 경우 형질감염을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 구축물은 에피솜 복제가 가능한 벡터, 예를 들어 EPV 및 EBV 벡터에 혼입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아데노바이러스"는 아데노비리다 과의 바이러스를 지칭한다. 아데노바이러스는 뉴클레오캡시드와 이중-가닥 선형 DNA 게놈으로 구성된 중간 크기 (90-100 nm)의 외피가 없는 (네이키드) 정20면체 바이러스이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "비-통합 바이러스 벡터"는 숙주 게놈 내로 통합되지 않는 바이러스 벡터를 지칭하고; 바이러스 벡터에 의해 전달되는 유전자의 발현은 일시적이다. 숙주 게놈에 통합이 거의 내지 전혀 없기 때문에, 비-통합 바이러스 벡터는 게놈의 무작위 지점에 삽입함으로써 DNA 돌연변이를 생산하지 않는 이점이 있다. 예를 들어, 비-통합 바이러스 벡터는 염색체 외부에 남아 있고 그 유전자를 숙주 게놈에 삽입하지 않아, 잠재적으로 내인성 유전자의 발현을 방해한다. 비-통합 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 알파바이러스, 피코르나바 이러스 및 백시니아 바이러스를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 바이러스 벡터는 그들 중 임의의 것이 일부 드문 상황에서 바이러스 핵산을 숙주 세포의 게놈에 통합할 수 있는 가능성에도 불구하고, 용어가 본원에 사용된 바와 같이 "비-통합" 바이러스 벡터이다. 중요한 것은 본원에 기재된 방법에 사용된 바이러스 벡터가 대체로 또는 이용된 조건 하에 이의 수명 주기의 주요 부분으로서 그들의 핵산을 숙주 세포의 게놈에 통합하지 않는다는 것이다.
본원에 기재된 벡터는 요법에 사용하기 위한 이의 안전성을 증가시키고, 원하는 경우 선택 및 농축화 마커를 포함하고, 그에 함유된 뉴클레오티드 서열의 발현을 최적화하기 위해 과학 문헌에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 구축 및 조작될 수 있다. 벡터는 벡터가 체세포 유형에서 자기-복제할 수 있도록 하는 구조적 구성요소를 포함해야 한다. 예를 들어, 공지된 엡슈타인 바(Epstein Barr) oriP/핵 항원-1 (EBNA-I) 조합 (예를 들어, 그 전문이 제시된 것처럼 본원에 참조로 포함된 문헌 [Lindner, S.E. and B. Sugden, The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in 인간 cells, Plasmid 58:1 (2007)] 참조)은 벡터 자기-복제를 뒷받침하기에 충분하며 포유동물, 특히 영장류 세포에서 기능하는 것으로 공지된 다른 조합이 또한 이용될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 발현 벡터의 구축물을 위한 표준 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며 그 전문이 제시된 것처럼 본원에 참조로 포함된 간행물 예컨대 [Sambrook J, et al., "Molecular cloning: a laboratory manual," (3rd ed. Cold Spring harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 2001)]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 방법에서, 전환에 필요한 관련 전사 인자를 코딩하는 유전 물질은 하나 이상의 재프로그래밍 벡터를 통해 체세포 내로 전달된다. 각각의 전사 인자는 체세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 전사 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 트랜스진(transgene)으로서 체세포에 도입될 수 있다.
적합한 재프로그래밍 벡터는 플라스미드와 같은 에피솜 벡터를 포함하여 본원에 기재된 임의의 것으로, 이는 감염성 또는 복제-적격 바이러스를 초래하기에 충분한 바이러스 게놈의 전부 또는 일부를 코딩하지 않긴 하지만, 벡터는 하나 이상의 바이러스로부터 수득된 구조적 요소를 함유할 수 있다. 하나 또는 복수개의 재프로그래밍 벡터가 단일 체세포에 도입될 수 있다. 하나 이상의 트랜스진이 단일 재프로그래밍 벡터에 제공될 수 있다. 하나의 강력한 구성적 전사 프로모터는 발현 카세트로서 제공될 수 있는 복수개의 트랜스진에 대한 전사 제어를 제공할 수 있다. 벡터 상의 별도의 발현 카세트는 별도의 강력한 구성적 프로모터의 전사 제어 하에 있을 수 있으며, 이는 동일한 프로모터의 카피일 수 있거나 구별되는 프로모터일 수 있다. 다양한 이종 프로모터가 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 전사 인자의 원하는 발현 수준과 같은 인자에 따라 사용될 수 있다. 하기에 예시된 바 와 같이, v 세포에서 별개의 강도를 갖는 별개의 프로모터를 사용하여 별도의 발현 카세트의 전사를 제어하는 것이 유리할 수 있다. 전사 프로모터를 선택할 때 고려해야 할 또 다른 사항은 프로모터(들)가 침묵하는 속도이다. 통상의 기술자는 유전자(들)의 생산물이 재프로그래밍 방법에서 그 역할을 완료하거나 실질적으로 완료한 후 하나 이상의 트랜스진 또는 트랜스진 발현 카세트의 발현을 감소시키는 것이 유리할 수 있음을 인식할 것이다. 예시적인 프로모터는 인간 EF1α 신장 인자 프로모터, CMV 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터 및 CAG 닭 알부민 프로모터, 및 다른 종으로부터의 상응하는 상동 프로모터이다. 인간 체세포에서, EF1α와 CMV는 둘 다 강력한 프로모터이나, CMV 프로모터는 EF1α 프로모터보다 더 효율적으로 침묵화되어 전자의 제어 하에 있는 트랜스진의 발현이 후자의 제어 하에 있는 트랜스진의 발현보다 더 빨리 턴오프된다. 전사 인자는 재프로그래밍 효율을 조정하기 위해 변할 수 있는 상대적 비로 체세포에서 발현될 수 있다. 바람직하게는, 복수개의 트랜스진이 단일 전사체 상에 코딩되는 경우, 내부 리보솜 진입 부위는 전사 프로모터로부터 원위인 트랜스진(들)의 상류에 제공된다. 인자의 상대적 비가 전달된 인자에 따라 달라질 수 있긴 하지만, 본 개시내용을 소유한 통상의 기술자는 인자의 최적 비율을 결정할 수 있다.
통상의 기술자는 복수개의 벡터를 통하지 않고 단일 벡터를 통해 모든 인자를 도입하는 유리한 효율성이 있으나, 전체 벡터 크기가 증가함에 따라 벡터를 도입하는 것이 점점 더 어려워진다는 것을 인식할 것이다. 통상의 기술자는 또한 벡터 상의 전사 인자의 위치가 이의 시간적 발현, 및 생산된 재프로그래밍 효율에 영향을 미칠 수 있음을 또한 인식할 것이다. 이와 같이, 출원인은 벡터의 조합에 대해 인자의 다양한 조합을 이용하였다. 재프로그래밍을 뒷받침하기 위해 이러한 여러 조합이 여기에 표시된다.
재프로그래밍 벡터(들)의 도입 후 그리고 체세포가 재프로그래밍되는 동안, 도입된 트랜스진이 전사되고 번역되는 동안 벡터는 표적 세포에서 지속될 수 있다. 트랜스진 발현은 표적 세포 유형으로 재프로그래밍된 세포에서 유리하게 하향조절되거나 턴오프될 수 있다. 재프로그래밍 벡터(들)는 염색체외(extra-chromosomal)에 남을 수 있다. 극히 낮은 효율로, 벡터(들)는 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 하기 실시예는 예시를 위한 것이지만 본 발명을 제한하는 것은 결코 아니다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 세포, 조직 또는 유기체의 형질전환을 위한 핵산 전달에 적합한 방법은 핵산 (예를 들어, DNA)이 본원에 기재된 바와 같거나 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같은 세포, 조직 또는 유기체 내로 도입될 수 있는 거의 임의의 방법을 포함하는 것으로 여겨진다 (예를 들어, 문헌 [Stadtfeld and Hochedlinger, Nature Methods 6(5):329-330 (2009); Yusa et al., Nat. Methods 6:363-369 (2009); Woltjen, et al., Nature 458, 766-770 (9 Apr. 2009)]). 이들 방법은 생체외 형질감염과 같은 DNA의 직접 전달 (Wilson et al., Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel and Baltimore, Nature 326:711-713, 1987), 임의로 지질-기반 형질감염 시약 예컨대 퓨진(Fugene)6 (로슈(Roche)) 또는 리포펙타민 (인비트로겐 (인비트로겐))과 함께, 주사에 의해 (미국 특허 번호 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 및 5,580,859, 각각 본원에 참조로 포함됨), 미세주사 포함 (Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985; 미국 특허 번호 5,789,215, 본원에 참조로 포함됨); 전기천공법에 의해 (미국 특허 번호 5,384,253, 본원에 참조로 포함됨; Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984); 인산칼슘 침전에 의해 (Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990); DEAE-덱스트란에 이어서 폴리에틸렌 글리콜을 사용함으로써 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985); 직접 음파 로딩에 의해 (Fechheimer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987); 리포솜 매개 형질감염에 의해 (Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987; Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980; Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989; Kato et al., J Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991) 및 수용체-매개 형질감염 (Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987); 및 이러한 방법의 임의의 조합을 포함하나, 이제 제한되지는 않으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
세포 내로 회합된 분자의 도입을 매개할 수 있는 다수의 폴리펩티드가 이전에 기재되었으며 본 발명에 적합화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Langel (2002) Cell Penetrating Peptides: Processes and Applications, CRC Press, Pharmacology and Toxicology Series]을 참조한다. 막을 통한 수송을 향상시키는 폴리펩티드 서열의 예는 초파리 동종단백질 안테나피디아 전사 단백질 (AntHD) (Joliot et al., New Biol. 3: 1121-34, 1991; Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 1864-8, 1991; Le Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 9120-4, 1993), 단순 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22 (Elliott and O'Hare, Cell 88: 223-33, 1997); HIV-1 전사 활성화제 TAT 단백질 TAT (Green and Loewenstein, Cell 55: 1179-1188, 1988; Frankel and Pabo, Cell 55: 1 289-1193, 1988); 카포시 FGF 신호 서열 (kFGF); 단백질 형질도입 도메인-4 (PTD4); 페네트라틴(Penetratin), M918, 트랜스포르탄(Transportan)-10; 핵 국소화 서열, PEP-1 펩티드; 양친매성 펩티드 (예를 들어, MPG 펩티드); 미국 특허 번호 6,730,2933에 기재된 바와 같은 전달 증진 수송체 (30, 40, 또는 50개 아미노산의 인접 세트에서 적어도 5-25개 이상의 인접 아르기닌 또는 5-25개 이상의 아르기닌을 포함하는 펩티드 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않음); 충분한, 예를 들어, 적어도 5개의 구아니디노 또는 아미디노 모이어티를 갖는 펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않음); 및 상업적으로 입수가능한 페네트라틴(Penetratin)™ 1 펩티드, 및 프랑스 파리의 다이토스 에스. 아.(Daitos S.A.)로부터 입수가능한 벡토셀(Vectocell)®플랫폼의 다이아토스 펩티드 벡터(Diatos Peptide Vector) ("DPV")를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, WO/2005/084158 및 WO/2007/123667 및 본원에 기재된 추가 수송체를 참조한다. 이들 단백질은 원형질막을 통과할 수 있을 뿐만 아니라 본원에 기재된 전사 인자와 같은 다른 단백질의 부착은 이들 복합체의 세포 흡수를 자극하기에 충분하다.
실시예
실시예 1 - 윤리 선언문
이 연구는 인스티튜셔날 모나쉬 유니버서티(Institutional Monash University) 휴먼 리서치 윤리 위원회(Human Research Ethics Committee) (처음에는 MUHREC 2020-22909-39935에 의해 그리고 나중에는 MUHREC 2020-27147-51995에 의해)의 승인으로 수행되었다. MUHREC 2020-22909-39935는 재프로그래밍을 받는 인간 섬유모세포의 기능적 및 분자적 특성화와 관련된 실험 작업을 다루고 3D-오가노이드 기반 배양 시스템을 사용하여 이들 세포를 특성화하였다. MUHREC 2020-27147-51995는 아이블라스토이드의 생산, 분자 및 기능적 특성을 다루었다.
더욱이, 현재 인간 블라스토이드 모델로 작업한 선례가 없기 때문에, 본 발명자의 인스티튜셔널 휴먼 리서치 연구 윤리 위원회의 승인을 구하는 것 외에, 본 발명자들은 공개된 권장사항에 따라 모든 실험을 수행하였고 (Hyun et al. Stem Cell Reports 14, 169-174 (2020)), 뿐만 아니라 수정 후 최대 14일 및/또는 원시선 (PS) 형성 중 먼저 도래하는 인간 배아 배양에 대한 국제적 합의를 준수하였다 (Warnock, Ir. Nurs. News 5, 7-8 (1985)).
출발 물질이 배아 기원이 아니고, HDF가 성인 조직으로부터 유래되었다는 점을 고려하여 "14-일 규칙"을 아이블라스토이드에 적용하기가 쉽지 않다는 점을 고려하여, 본 발명자들은 필요한 최소 시간 동안 아이블라스토이드를 배양하는 데 초점을 맞추었으며, 이 경우에 최대 5일 추가 (~E11에 상당)이며, 국제 지침 내에 잘 유지되도록 PS의 형태학적 증거 전에 실험을 종료하였다 (Hyun and Warnock, 상기 문헌).
PS 형성의 분자적 증거를 배제하기 위해, 본 발명자들은 5일 배아 부착 배양 동안 몇 가지 주요 원시선 마커의 qRT-PCR 24시간 과정을 수행하였으며 (Xiang, L. et al. Nature 577, 537-542 (2020); Takahashi, K. et al.. Nat. Commun. 5, 3678 (2014); Tyser, et al. bioRxiv (2020)) TBXT, EOMES 또는 MIXL1 또는 창자 배형성(gastrulation)을 나타내는 임의의 형태학적 변화의 상향-조절을 관찰하지 않았다 (Tyser, Supra; O'Rahilly, R. & Mller, F. Developmental stages in human embryos: revised and new measurements. Cells Tissues Organs 192, 73-84 (2010); Yamaguchi, Y. & Yamada, S. Cells Tissues Organs 205, 314-319 (2018)) (도 8b, 도 8a). 따라서, 5일 간의 아이블라스토이드 부착 배양으로, EPI 구획은 PS의 형성으로 진행되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 상기 파라미터를 엄격하게 준수함으로써, 모든 후속 인간 아이블라스토이드 부착 배양 실험을 아이블라스토이드 형성 후 총 4.5일 동안 수행하였다 (도 8a).
실시예 2 - 세포 배양 배지
섬유모세포 배지: DMEM (써모피셔), 10% 태아 소 혈청 (FBS, 히클론(Hyclone)), 1% 비필수 아미노산 (써모피셔), 1 mM 글루타맥스 (써모피셔), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (써모피셔), 55 μM 2-메르캅토에탄올 (써모피셔) 및 1 mM 소듐 피루베이트 (써모피셔).
N2B27 기본 배지: 2 mM L-글루타민 (써모피셔)으로 보충된 DMEM/F-12 (써모피셔)와 뉴로베이살 배지 (써모피셔)의 50:50 혼합물, 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (써모피셔), 0.5% N2 보충제 (써모피셔), 1% B27 보충제 (써모피셔), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (써모피셔).
TSC 기본 배지: DMEM/F-12, 0.3% BSA (시그마)로 보충된 글루타맥스 (써모피셔), 0.2% FBS (써모피셔), 1% ITS-X 보충제 (써모피셔), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (써모피셔), 0.5% 페니실린-스트렙토마이신 (써모피셔), 1.5 μg/ml L-아스코르브산 (시그마).
IVC1 배지: 고급 DMEM/F-12 (써모피셔), 1% ITS-X 보충제 (써모피셔), 2 mM L-글루타민 (써모피셔), 0.5% 페니실린-스트렙토마이신 (써모피셔), 20% 태아 소 혈청 (FBS, 히클론), 25 μM N-아세틸-L-시스테인 (시그마), 8 nM β-에스트라디올 (시그마) 및 200 ng/ml 프로게스테론 (시그마). IVC2 배지: 고급 DMEM/F-12 (써모피셔), 1% ITS-X 보충제 (써모피셔), 2 mM L-글루타민 (써모피셔), 0.5% 페니실린-스트렙토마이신 (써모피셔), 30% 녹아웃 혈청 대체제 (KSR, 써모피셔), 25 μM N-아세틸-L-시스테인 (시그마), 8 nM β-에스트라디올 (시그마) 및 200 ng/ml 프로게스테론 (시그마).
인간 아이블라스토이드 배지: 2 μM CHIR99021 (밀테니 바이오텍)로 보충된 각각의 2:1:1 비율의 IVC1 배지, N2B27 기본 배지 및 TSC 기본 배지, 0.5 μM A83-01 (시그마), 1 μM SB431542, 0.8 mM 발프로산 (VPA, 시그마), 50 ng/ml EGF (페프로텍) 및 10 ng/ml BMP4 (밀테니 바이오텍).
실시예 3 - 재프로그래밍에 의한 아이블라스토이드 생산
이 연구에 사용된 모든 세포주는 인증되었으며, 보고 요약에 기재된 바와 같이 마이코플라스마 시험되었다. 3명의 상이한 여성 공여자로부터의 일차 인간 성인 진피 섬유모세포 (hDFa)를 써모피셔 (카탈로그 번호 C-013-5C 및 38F의 경우 로트# 1029000, 55F의 경우 로트# 1528526 및 32F의 경우 로트# 1569390)로부터 입수하였으며, 세포를 회수하고 확대를 위해 저혈청 성장 보충제 (LSGS) (써모피셔)로 보충된 배지 106 (써모피셔)에서 플레이팅하였다.
인간 체세포 재프로그래밍을 d21 재프로그래밍 중간체를 수득하기 위해 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Liu, X. et al. Nat. Methods 14, 1055-1062 (2017)). 간단히 말해서, 인간 섬유모세포의 재프로그래밍을 제조업체의 설명서 (써모피셔, lot#2170052)에 따라 시토튠(CytoTune)-iPS 2.0 센다이 재프로그래밍 키트를 사용하여 수행하였다. 일차 HDFa는 섬유모세포 배지에서 ~5-10×104 세포의 밀도로 시딩하였다. 도 1a에 도시된 바와 같이, KOS (KLF4 - OCT4 - SOX2) MOI=5, c-MYC MOI=5, KLF4 MOI=6과 같이 감염 다중도 (MOI)에서 FM의 센다이 바이러스로 세포를 형질도입하였다. 배지 교체는 형질도입 후 1일차부터 시작하여 격일로 그리고 8일차부터는 계속 매일 수행하였다. 재프로그래밍 21일차에, 세포를 해리하고 제조업체의 설명서에 따라 10 μM Y-27632 (ROCK 억제제, 셀렉켐)로 보충된 인간 아이블라스토이드 배지에서 24-웰 어그레웰 플레이트 (스템 셀 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies))에 웰당 1.2 × 105개 세포의 밀도로 시딩하였다. 세포는 37℃, 5% O2 및 5% CO2에서 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 후, ROCK 억제제가 없는 새로운 인간 아이블라스토이드 배지로 세포를 보충하였다. 어그레웰에서 아이블라스토이드 형성 6일차에, 아이블라스토이드를 후속 분석 또는 생체내 부착 검정을 위해 수집하였다. 아이블라스토이드의 생산에 사용된 배양 배지의 세부사항은 상기 실시예 2에 요약되어 있다.
본 발명자들은 21일차 재프로그래밍 중간체를 수득하기 위해 OCT4/POU5F1, KLF4, SOX2, 및 c-MYC (OKSM) 전사 인자 (TF)를 전달하는 무통합(integration-free) 센다이 바이러스를 사용하여, 이전에 기재된 바와 같이 (Liu, X. et al. Nat. Methods 14, 1055-1062 (2017)) 체세포 재프로그래밍을 수행하였다. 대안적으로, 본 발명자들은 실시예 14에서 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 전사 인자의 mRNA 형질감염을 통해 체세포 재프로그래밍을 수행하였다. 본 발명자들은 또한 실시예 15 및 16에 기재된 바와 같이, 유사한 접근법을 사용하여 대안적 체세포가 재프로그래밍될 수 있음을 입증하였고, 따라서 재프로그래밍 중간체를 다양한 체세포로부터 수득할 수 있고, 본 발명의 방법에 사용할 수 있음을 확립하였다.
WNT 활성화제, TGF-β 억제제, HDAC 억제제, EGF, 및 BMP4를 함유하는 배지에서 중간체를 어그레웰 시스템으로 옮겼을 때 (방법 참조) (도 1a), 중간체는 응집체를 형성하기 시작했고, 3일차로부터 공동화되어 점차 확대되었다 (도 2b). 배반포-유사 구조는 5일차 내지 6일차까지 분명해졌으며 (도 1b), NANOG에 대한 구조의 면역형광 염색은 NANOG-음성 세포의 외부 층에 의해 둘러싸인 포배강-유사 강과 함께, NANOG-양성 세포를 가진 내부 세포 덩어리 (ICM)-유사 세포 구획을 나타냈다 (도 1c). 이들 구조는 체세포의 재프로그래밍을 통해 직접 유래되었기 때문에, 이들은 "인간 유도 블라스토이드" (아이블라스토이드)라고 한다. 게다가, x- 및 y-축 직경, x:y 종횡비뿐만 아니라 아이블라스토이드의 투사 면적의 측정치가 수정 후 이들이 이전에 공개된 배아 5-7일차 (E5-7)의 인간 배반포 측정치에 필적하는 크기를 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 1d-h). 또한, 아이블라스토이드의 세포 수는 100 내지 400개 범위였으며, 중앙값은 대략 280개 세포였다. 중앙값 세포 수는 E5-7에서 인간 배반포에 대해 보고된 것 (대략 평균 240개 세포)보다 약간 더 크지만, 여전히 E5-7 배반포에 대해 이전에 보고된 범위 내에 있다 (도 1i). 아이블라스토이드 형성의 효율을 정량화하기 위해, 100개의 무작위 구조를 계수하였고 14%가 포배강 강(blastocoel cavity)을 포함한 전형적인 배반포-유사 형태를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 2c). 어그레웰 시스템에서 아이블라스토이드 형성 동안, 아이블라스토이드의 일부가 아닌 부착성 세포 클러스터가 마이크로웰의 가장자리를 따라 일관되게 관찰되었다. 이들이 재프로그래밍 배양으로부터의 불응성 섬유모세포라는 가설을 세웠다 (도 2d). 이를 검증하기 위해, 이러한 세포 클러스터를 단리하고 섬유모세포 배지에서 배양하여, 고전적인 섬유모세포 형태를 가진 세포의 전파를 초래하였다 (도 2d). 이것은 이들 재프로그래밍-불응성 섬유모세포가 아이블라스토이드 형성에 기여하지 않았음을 시사한다. IVF 배반포 품질 기준 (양호=1, 보통=2 또는 불량=3)을 사용한 아이블라스토이드의 득점 ([The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Hum. Reprod. 26, 1270-1283 (2011)]에 기재된 접근법에 따름)은, 아이블라스토이드가 ICM의 경우 평균 1.75점이고 TE의 경우 1.67점으로 양호 또는 보통으로 등급화됨을 나타냈다 (도 2i-k).
요약하면, 이들 데이터는 배반포와 구조적으로 유사한 '아이블라스토이드'로 명명된, 인간 배반포-유사 구조를 직접 생산하기 위해 재프로그래밍 중간체가 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 4 - 아이블라스토이드 특성화 재료 및 방법
면역형광 염색
아이블라스토이드/세포를 DPBS (써모피셔) 중 0.5% 트리톤(Triton) X-100 (시그마)으로 투과시킨 4% 파라포름알데히드 (PFA, 시그마)에 고정시켰고 DPBS (써모피셔) 중 차단 완충제 (3% 소 혈청 알부민 (BSA) (시그마) + 0.1% 트윈(Tween)-20 (시그마))로 차단시켰다. 이 연구에 사용된 모든 항체는 하기 표 6에 열거되어 있다.
예를 들어, 사용된 1차 항체: 차단 완충제 중에서 제조된, 토끼 항-NANOG 폴리클로날 (1:100, 압캠), 마우스 항-CDX2 IgG1 (1:50, 압캠). 1차 항체 인큐베이션을 진탕기에서 4℃에서 밤새 수행한 후 3시간 동안 2차 항체 (차단 완충제 중에서 1:500)와 함께 rtp 인큐베이션을 수행하였다. 본 연구에 사용된 2차 항체는 NANOG의 경우 염소 항-토끼 IgG AF555 (1:500, 써모피셔) 또는 염소 항-토끼 IgG AF647 (1:500, 인비트로겐(Invitrogen)), CDX2의 경우 염소 항-마우스 IgG AF488 (1:400, 써모피셔) 또는 염소 항-마우스 IgG AF488 (1:500, 써모피셔)이었다. 표지화 후, 아이블라스토이드/세포를 차단 완충제 중에서 5 μg/ml 농도의 4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디히드로클로라이드 (DAPI, 써모피셔)로 1시간 동안 염색하였다. SP8 도립 공초점 현미경 (레이카(Leica)) 또는 LSM780 다광자 공초점 현미경 (차이스(Zeiss))을 사용하여 이미지를 촬영하였다.
공초점 영상화 및 분석
면역염색된 아이블라스토이드를 워터 UV-VIS-IR 아포크로맷(Apochromat) 40X 1.2 NA 대물렌즈 및 콘포코르(Confocor) 3 모듈 (차이스)의 고감도 애벌랜치 포토다이오드(avalanche photodiode) 광 검출기가 장착된 SP8 도립 공초점 현미경 (레이카) 또는 레이저 주사 공초점 (LSM 780 현미경, 차이스)을 사용하여 영상화하였다. 아이블라스토이드의 3D 시각화는 이마리스(Imaris) 9.5 소프트웨어 (비트플란 아게(Bitplane AG))를 사용하여 수행하였다. 수동 표면 렌더링 모듈을 세포 및 아이블라스토이드 세그멘트화에 사용하였다. 최종 이미지를 어도비 포토샵(Adobe Photoshop) 또는 이미지(Image)J를 사용하여 처리 및 어셈블리하였다.
형광-활성화 세포 분류 (FACS)
아이블라스토이드를 트립엘이 익스프레스(TrypLE Express) (써모피셔), 및 2% FBS (히클론)으로 보충된 DPBS (써모피셔)로 해리하고, 10 μM Y-27632 (셀렉켐)를 샘플의 최종 재현탁에 사용하였다. 해리된 세포를 400× g에서 5분 동안 펠릿화한 다음에, 아이오딘화프로피듐 (PI) (시그마)을 2 μg/ml의 농도로 첨가하여 최종 부피 500 μl로 재현탁시켰다. 인플럭스(Influx) 기기 (BD 바이오사이언시즈(Biosciences)) 상에서 100 μm 노즐로 세포 분류를 수행하였다.
정량적 RT-PCR
RNeasy 마이크로 키트 (퀴아젠) 또는 RNeasy 미니 키트 (퀴아젠) 및 퀴아큐브(QIAcube) (퀴아젠)를 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 세포로부터 RNA를 추출하였다. 이어서 슈퍼스트립트(SuperScript) III cDNA 합성 키트 (써모피셔) 또는 콴티텍트(QuantiTect) 역전사 키트 (퀴아젠, 카탈로그 번호 205311)를 사용하여 역전사를 수행하고, 콴티패스트(QuantiFast) SYBR 그린(Green) PCR 키트 (퀴아젠)를 사용하여 실시간 PCR 반응을 삼중으로 설정한 다음에 7500 실시간 PCR 시스템 (써모피셔)에서 수행하였다. 본 연구에 사용된 qRT-PCR 프라이머는 하기 표 7에 나타냈다.
중배엽 분화
이전에 공개된 중배엽 분화 프로토콜 (Lam, A. Q. et al. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 1211-1225 (2014))을 변형하여 원시선 마커의 qRT-PCR에 대한 양성 대조군을 수득하였. 간단히 말해서, 50% 전면생장(confluency)에서 E8 배지 (써모피셔)에서 성장한 인간 iPSC를 RPMI, 글루타맥스 (써모피셔), 1% B27 보충제 (써모피셔), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (써모피셔) 및 5 μM CHIR99021 (밀테니 바이오텍)로 이루어진 배양 배지로 교체하였다. 48시간 후, qRT-PCR 분석을 위해 분화된 세포를 수집했는데, 원시선 마커 TBXT, EOMES 및 MIXL1이 높게 발현되었다 (도 8b).
hCG ELISA
아이블라스토이드의 생산 및 시험관내 부착 검정을 하기 '시험관내 부착 검정' 실시예에 기재된 바와 같이 수행하였다. 아이블라스토이드 (6일차) 및 부착된 아이블라스토이드 (6일차 + 4.5일차) 둘 다에 대해 배지를 수집하고 -80℃에서 보관하였다. hCG ELISA 키트 (앱노바(Abnova), ABNOKA4005)를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 배지 내 hCG 수준을 측정하였다.
아이블라스토이드의 단일 세포 RNA-시퀀싱 (scRNA-seq)
scRNA-seq 실험을 위해, 아이블라스토이드를 해리하여 상기 섹션에 기재된 바와 같이 FACS용 단일 세포 현탁액을 수득하였다. FACS에 적용된 세포를 scRNA-seq에 대해 PI-음성, 파편이 아닌 살아있는 단일 세포에 대해 분류하였다. 수집된 세포는 제조업체 설명서 "크로뮴 Next GEM Single Cell 3' Reagent Kit V3.3 User Guide"에 따라 크로뮴 컨트롤러(Chromium controller) (10x 제노믹스(10x Genomics))를 사용하여 단리, 캡슐화 및 구축하였다. 일루미나(Illumina) NovaSeq 6000 상에서 쌍형성-말단(paired-end) (R1 28bp 및 R2 87bp) 시퀀싱 전략을 사용하고 세포당 20,000개의 판독-쌍(read-pairs)을 목표로 시퀀싱을 수행하였다. 크로뮴 바코드를 역다중화(demultiplexing)에 사용하였고 FASTQ 파일을 셀레이전(Cellranger) 프로그램 (v3.1.0, http://software.10xgenomics.com/single-cell/overview/welcome)을 사용하여 mkfastq 파이프라인으로부터 생산하였다. 정렬 및 UMI 카운팅을 STAR 정렬기 (Dobin, A. et al. Bioinformatics 29, 15-21 (2013))를 활용하여 시퀀싱 판독을 맞춤형 버전(custom version)의 앙상블(Ensembl) GRCh37.87 참조 게놈에 매핑하는 셀레인저를 사용하여 수행하였으며, 이를 우리가 맞춤형 SENDAI KLF4, MYC 및 SEV (KOS) 벡터의 시퀀스에 의해 확대하였다. 이 단계는 9060개의 고유한 세포 바코드를 초래한다.
아이블라스토이드 scRNA-seq 세포 공여자 확인
모든 세포의 개별 공여자 정체성(identity)을 결정하기 위해, 베이즈 역다중화 도구 비레오(Bayesian demultiplexing tool Vireo) (v 0.3.2)를 사용하였다 (Huang, Genome Biol. 20, 273 (2019)). 간단히 말해서, 본 발명자들은 0.1의 최소 대립유전자 빈도 (인수(argument) minMAF 사용) 및 최소 고유 분자 식별자 (인수 minCOUNT 사용)를 갖는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)의 목록을 생산하기 위해 cellSNP (v 0.3.0)를 사용하여 단일-세포 데이터에서 발현된 대립유전자를 컴파일링하였다. 더욱이, cellSNP는 SNP를 호출하기 위해 인간 변이체의 참조 목록을 필요로 하고 본 발명자는 비레오의 저자가 제공한 1000 게놈 프로젝트로부터 SNP의 사전-컴파일링된 목록을 사용하였다 (https://sourceforge.net/projects/cellsnp/files/SNPlist/로부터 다운로드). 특히, 740만 SNP를 함유하는 마이너 대립유전자 빈도 > 0.05를 가진 hg19 게놈을 기반으로 하는 변이체의 목록을 사용하였다. 후속적으로, 비레오를 수행하여 세포를 두 개의 공여자 집단으로 분리하여 단일 세포 라이브러리를 역다중화하였다. 비레오는 두 공여자에 대해서만 세포를 구별할 수 있지만, 정확한 공여자 정체성 (32F 또는 38F)을 각각의 세포에 배정할 수는 없다.
아이블라스토이드 scRNA-seq 세포 호출, 품질 관리
품질 관리를 먼저 세포 수준에서 수행하였다. (i) 세포주 공여자 둘 다에 대한 증거 또는 둘 다 어느 것도 아닌 것에 대한 증거, (ii) 낮은 수의 발현된 유전자 [nGene], 또는 (iii) 높은 백분율의미토콘드리아 유전자 [pctMT]를 가진 세포를 폐기하였다. 컷오프 n유전자 < 1,300 pctMT > 15를 적용하여 세포를 폐기하였다. 다음으로, 유전자 수준에서 품질 관리를 수행하였다. 각각 적어도 1회 판독된 적어도 50개 세포에 존재하지 않는 경우 유전자를 필터링하였다. 모든 컷오프를 각각의 변수의 분포를 조사한 후에 결정하였다. 품질 관리 후, 6858개의 세포와 14224개의 유전자가 scRNA-seq를 위해 잔류한다.
아이블라스토이드 scRNA-seq 분석
섹션의 나머지 부분에서의 분석을 R (v3.6)55와 쇠라(Seurat) (v3.1.5)를 사용하여 수행하였다 (Butler, et al. Nat. Biotechnol. 36, 411-420 (2018); Stuart, T. et al. Cell 177, 1888-1902.e21 (2019)). 생물정보학 플롯을 ggplot2 (v3.3.1)58, 및 p히트맵(pheatmap) (v1.0.12)을 가진 히트맵을 사용하여 생산하였다 (Kolde, R. & Vilo, J. F1000Research vol. 4 574 (2015)). 쇠라에서 SC트랜스폼(SCTransform) 함수 (Hafemeister, C. & Satija, R. Genome Biol. 20, 296 (2019))를 사용하여 데이터를 스케일링하고 정규화하였다. 원리 성분 분석 (PCA)에 이어서, 20차원을 사용하여 균일한 매니폴드 근사값 (UMAP)을 생산하였다 (Kolde, R. & Vilo, J. F1000Research vol. 4 574 (2015)). 감독되지 않은 클러스터링을 해상도가 0.2인 파인드클러스터스(FindClusters) 함수를 사용하여 수행하여, 7개의 개별 클러스터를 초래하였다. 윌콕슨 순위 합 검정(Wilcoxon rank sum test) 및 0.25 로그-배수(log-fold)의 최소 상향조절을 사용하여, 파인드올마커스(FindAllMarkers) 함수로 클러스터 (클러스터 마커) 사이에서 차별적으로 발현된 유전자를 확인하였다. 세포 유형 시그니처 (EPI, TE, PE, 비-재프로그래밍 (NR)의 평균 과발현을 각각 애드모듈스코어(AddModuleScore) 함수 및 문헌 [Petropoulos, S. et al. Cell 165, 1012-1026 (2016)] 및 [Liu et al (Nature 2020 Sep 16.doi: 10.1038/s41586-020-2734-6)]에 공개된 유전자 시그니처를 사용하여 계산하였다. 각각 표준 마커(canonical marker), 페트로포울로스 및 리우(Liu) 시그니처를 증거로 사용하여 세포 유형을 클러스터에 수동으로 배정하였다. 나머지 세포 집단을 "중간" (IM)으로 표지화하고 나열하였다 (Rossant, J. & Tam, P. P. L. Cell Stem Cell vol. 20 18-28 (2017); Harrison, et al. Science 356, (2017); Sozen, B. et al. Nat. Cell Biol. 20, 979-989 (2018)). 마지막으로, 스크랜(scran) 패키지로부터의 시클론 함수 (Scialdone, A. et al. Methods 85, 54?61 (2015))를 사용하여, 세포 주기 점수를 계산하고, 가장 높은 확률에 따라 세포 위상을 배정하였다.
통합 scRNA-seq 분석
문헌 [Petropoulos, S. et al. Cell 165, 1012-1026 (2016)] (페트로포울로스) 및 [Blakeley, P. et al. Development 142, 3613 (2015)] (블레이클리)로부터의 이전에 공개된 단일 세포 데이터를 여기에 게시된 아이블라스토이드 데이터와 통합하였다. 첫째, NR 클러스터로부터의 세포를 아이블라스토이드 데이터로부터의 이 통합과 관련이 없는 것으로서 제거한다. 페트로포울로스의 총 1529개 세포를 배반포 세포에 대해 여과하여, 배반포 이전 단계를 제거하고 1096개의 E5-E7 EPI, TE, 및 PE 세포를 남겼다. 페트로포울로스의 데이터와 블레이클리의 30개 세포를 SC트랜스폼을 사용하여 처리되었다. 두 데이터세트 모두를 SCT 검정으로부터 유래된 4000개의 앵커 유전자를 사용하여 통합 유전자 (FindIntegrationAnchors 및 IntegrateData)를 확인한 후 아이블라스토이드 데이터에 통합하였다. 통합 데이터 세트는 7861개의 세포, 23308개의 유전자, 및 4000개의 통합 유전자를 갖는다. PCA 및 UMAP (20차원)를 차원 축소에 사용하며 파인드클러스터를 클러스터 (해상도 0.2)를 확인하는 데 사용한다. 5개의 개별 클러스터에 대한 클러스터 정체성을 마커 및 시그니처 발현뿐만 아니라 증거로서 모든 세 데이터세트로부터 세포 정체성의 공동-국부화를 사용하여 수동으로 배정하였다. 전사체 상관관계는 a) 동일한 원래 세포 정체성 (아이블라스토이드의 경우 클러스터 id, 블레이클리의 경우 EPI, TE, PE, 페트로포울로스의 경우 E5-7 EPI, TE, PE), 또는 b) 동일한 세포 유형 (모든 EPI, TE, PE 세포의 및, 추가로, 아이블라스토이드의 경우 IM)의 모든 세포에 걸친 유전자 발현의 평균 값에 대한 피어슨 상관관계 및 통합 유전자 발현 값을 사용하여 계산하였다.
시험관내 부착 검정
아이블라스토이드의 생산은 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. 시험관내 부착 검정 (이는 배아 이식의 모델로서 자주 사용됨)은 이전에 공개된 프로토콜 (Shahbazi, et al. Nat. Cell Biol. 18, 700-708 (2016); Deglincerti, A. et al. Nature 533, 251-254 (2016))에 적응하여 수행하였다. 간단히 말해서, 유래된 아이블라스토이드를 광학-등급 조직 배양 플레이트 (에펜도르프)로 옮기고 37℃, 5% O2 및 5% CO2 인큐베이터에서 IVC1 배지에서 배양하였다. 부착 검정 2일차에, 배양 배지를 IVC2 배지로 교체하였다. 아이블라스토이드를 부착 검정에서 4.5일까지 배양하였고 분석을 위해 수집하였다. 시험관내 부착 검정에 사용된 배양 배지의 세부사항은 실시예 2에 요약되어 있다.
통계 및 재현성
이전 연구 (Liu et al (Nature 2020 Sep 16.doi: 10.1038/s41586-020-2734-6)로부터 수득된 21일차 섬유모세포 재프로그래밍 중간체 scRNA-seq 데이터를 4,761개의 세포로 도 2a에 대해 재분석하였다. 아이블라스토이드 scRNA-seq 데이터의 경우, n=2 생물학적 복제물로부터 수득된 총 6858개의 세포가 본 연구에 사용된 모든 분석에 포함되었다. 본 연구에 사용된 인간 배반포의 scRNA-seq 데이터 세트의 경우, 분석을 위해 총 1096개 세포를 페트로포울로스 데이터세트로부터 채택하였으며 블레이클리 데이터세트에서 총 30개의 세포를 채택하였다. 아이블라스토이드 및 인간 배반포 통합 데이터세트의 경우, 총 7861개의 세포를 분석에 사용였다. 도 1b의 경우, 2개의 독립적인 재프로그래밍 실험 (n=5 생물학적 복제물)의 3개의 상이한 공여자 섬유모세포로부터 생산되었으며 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다. 도 1c의 경우, 2개의 독립적인 재프로그래밍 실험 (n=5 생물학적 복제물)의 3개의 상이한 공여자로부터 아이블라스토이드 상에서 면역염색을 수행하며 유사한 결과를 수득하고 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다. 도 1e-h의 경우, 인간 배반포의 데이터는 8개의 간행물 (n=8)로부터 참조되었으며, 한편 아이블라스토이드에 대한 다양한 파라미터의 정량화는 각각 3개의 상이한 공여자로부터 수득된 18개의 독립적인 아이블라스토이드 (n=18 생물학적 복제물) 상에서 수행하였다. 도 1i의 경우, 3명의 상이한 공여자로부터 수득된 14개의 독립적인 아이블라스토이드 (n=14 생물학적 복제물) 상에서 세포 수 정량화를 수행하였다. 도 1j-1의 경우, 2개의 독립적인 재프로그래밍 실험 (n=5 생물학적 복제물)의 3개의 상이한 공여자로부터 아이블라스토이드 상에서 면역염색을 수행하며 유사한 결과를 수득하고 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다. 도 1m의 경우, 3개의 상이한 공여자 (n=3 생물학적 복제물)로부터 아이블라스토이드 상에서 면역염색을 수행하며 유사한 결과를 수득하고 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다. 도 1n-r의 경우, 2개의 상이한 공여자 (n=2 생물학적 복제물)로부터 아이블라스토이드 상에서 면역염색을 수행하며 유사한 결과를 수득하고 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다. 외부 TE-유사 세포를 가진 치밀한(dense) 케라틴 8 (KRT8) 필라멘트 네트워크가 배반포에서 전형적으로 관찰되는 것과 일치하는, 아이블라스토이드에서도 관찰되었다 (도 1s).
도 7a의 경우, 2개의 독립적인 재프로그래밍 실험 (n=5 생물학적 복제물)의 3개의 상이한 공여자 섬유모세포로부터 유래된 아이블라스토이드 상에서 시험관내 부착 검정을 수행하였으며 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다. 도 7b-c의 경우, 2개의 상이한 공여자 (n=2 생물학적 복제물)로부터 아이블라스토이드 상에서 면역염색을 수행하며 유사한 결과를 수득하고 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다. 도 7e의 경우, 2개의 독립적인 재프로그래밍 실험 (n=4 생물학적 복제물)의 2개의 상이한 공여자로부터의 아이블라스토이드 상에서 면역염색을 수행하며 유사한 결과를 수득하고 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다. 도 7f-g의 경우, 2개의 상이한 공여자 (n=2 생물학적 복제물)로부터의 아이블라스토이드 상에서 면역염색을 수행하고 유사한 결과를 수득하였으며 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다. 도 7h의 경우, CSH1 및 ITGA1의 배수 변화 발현을 기술적 복제물을 사용하여 n = 5 독립적인 실험에서 측정하였다. 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표시된다. 도 7i의 경우, hCG ELISA를 기술적 복제물을 사용하여 n=4 독립적인 실험에서 수행하였다. 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표시된다. 도 2b의 경우, 아이블라스토이드를 2개의 독립적인 재프로그래밍 실험 (n=5 생물학적 복제물)의 3개의 상이한 공여자 섬유모세포로부터 생산하였고 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다. 도 2c의 경우, 아이블라스토이드 효율성의 정량화를 수득한 100개의 독립적인 3D 구조 (n=100 생물학적 복제물)를 계수하여 수행하였다. 도 2d의 경우, 3명의 상이한 공여자로부터 n=3 생물학적 복제물을 사용하여 실험을 수행하고 유사한 결과를 수득하고 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다. 도 2e의 경우, 2개의 독립적인 재프로그래밍 실험 (n=5 생물학적 복제물)의 3개의 상이한 공여자로부터 아이블라스토이드 상에서 면역염색을 수행하고 유사한 결과를 수득하고 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다. 도 2f-g의 경우, 2개의 상이한 공여자 (n=2 생물학적 복제물)로부터 아이블라스토이드 상에서 면역염색을 수행하고 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다. 도 8ba의 경우, TBXT, EOMES, MIXL1의 배수 변화 발현을 기술적 복제물을 사용하여 2명의 공여자로부터 n=6 독립적인 실험에서 측정하였다. 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표시된다. 도 8c의 경우, 2개의 독립적인 재프로그래밍 실험 (n=5 생물학적 복제물)의 3개의 상이한 공여자로부터 아이블라스토이드 상에서 면역염색을 수행하고 유사한 결과를 수득하고 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다. 도 8d의 경우, 3개의 상이한 공여자 (n=3 생물학적 복제물)로부터 아이블라스토이드 상에 면역염색을 수행하고 유사한 결과를 수득하고 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다. 도 8e-f의 경우, 2개의 상이한 공여자 (n=2 생물학적 복제물)로부터 아이블라스토이드 상에 면역염색을 수행하고 유사한 결과를 수득하고 대표적인 이미지를 상기 도면에 도시하였다.
실시예 5 - 아이블라스토이드 특성화 결과
아이블라스토이드 내의 세포의 동일성 및 공간적 국부화를 추가로 확인하기 위해, 본 발명자들은 EPI 마커 NANOG 및 TE 마커 CDX2의 공동-면역염색을 수행하였다. 이어서 이들은 공초점 이미징 및 분석을 적용하여 아이블라스토이드의 3차원 (3D) 표시를 수득하였다. 결과는 NANOG 양성 세포가 ICM-유사 구획에만 독점적으로 위치하며, 한편 CDX2 양성 세포는 TE와 비슷한 외부 층에서 발견됨을 나타낸다(도 1j).
미분 간섭 대비(Differential Interference Contrast) (DIC) 및 형광 이미지의 3D 재구성 및 오버레이는 NANOG 양성 및 CDX2 양성 세포의 공간적 국부화를 확인해 주었을 뿐만 아니라, 배반포와 유사한 아이블라스토이드 구조에서 형성된 포배강-유사 강의 존재를 확인해 주었다 (Shahbazi, M. N. et al. Nat. Cell Biol. 18, 700-708 (2016), Deglincerti, A. et al. Nature 533, 251-254 (2016); Xiang, L. et al. Nature 577, 537-542 (2020) (도 1k, l). 중요하게도, 본 발명자들은 아이블라스토이드 생산의 다중 라운드에서 2개의 추가 섬유모세포 공여자로부터 생산된 아이블라스토이드로부터 이들 결과를 확인할 수 있었다 (도 2e).
아이블라스토이드의 EPI 및 TE-유사 세포를 추가로 특성화하기 위해, 본 발명자들은 아이블라스토이드에서 2개의 추가 EPI 마커 (OCT4 (POU5F1로도 칭해짐), 및 SOX2) 및 TE 마커 (GATA2)의 조합을 시험하였다. 인간 배반포 (Fogarty, N. M. E. et al. Nature 550, 67-73 (2017); Boroviak, T. et al. Development 145, (2018))에 대해 기재된 바와 같이, 외부 TE-유사 세포는 GATA2 양성이었으며 한편 OCT4 및 SOX2의 유의한 공동국부화가 ICM-유사 구획에서 발견되었다 (도 1m). 아이블라스토이드에서 PE-유사 세포의 존재를 평가하기 위해, 본 발명자들은 먼저 GATA2 (TE 마커) 및 NANOG (EPI 마커)와 함께 PE 마커인 SOX17의 면역염색을 수행하였다. ICM 유사 구획 내에서, 본 발명자들은 E6-7 배반포에 대해 이전에 보고된 것 (Xiang supra; Wamaitha, S. E. et al. Nat. Commun. 11, 764 (2020))과 유사하게, NANOG 양성 세포의 주변에서 SOX17 양성 세포를 확인하였다 (도 1n, 도 2f).
추가 검증을 위해, 본 발명자들은 CDX2(TE 마커) 및 OCT4(EPI 마커)와 함께 또 다른 PE 마커인 GATA6을 사용하여 추가 면역염색을 수행하였다. 그들은 CDX2 염색과 함께 GATA6의 공동-국부화에 의해 표시된 바와 같이 TE-유사 구획에서 "소금 및 후추" 패턴에 주목하였다 (도 1o, 도 2g). 처음에는 어리둥절하긴 했지만, 이 패턴은 이전에 보고되었으며, 여기서 GATA6는 E6-7 인간 배반포에서도 편재적으로 검출되었다 blastocysts (Deglincerti, Supra; Roode, M. et al. Human hypoblast formation is not dependent on FGF signalling. Dev. Biol. 361, 358-363 (2012); Kuijk, E. W. et al. The roles of FGF and MAP kinase signaling in the segregation of the epiblast and hypoblast cell lineages in bovine and human embryos. Development 139, 871-882 (2012)). 중요하게도, 면밀한 조사에서 본 발명자들은 ICM-유사 구획에서 OCT4 양성 세포에 이웃하는 GATA6 양성 세포 (낮거나 약한 CDX2 염색을 가짐)를 관찰하였는데, 이는 아이블라스토이드에서 GATA6 양성 PE-유사 세포의 존재 가능성을 시사한다 (도 1o).
인간 배반포에서, TE 및 EPI 계통의 세포는 세포 형태에 분명한 차이가 있는데, 여기서 TE 세포는 "고전적인" 길쭉한 상피 형태를 나타내며, 한편 EPI 세포는 ICM의 제약으로 인해 더 작고 압축된다 (Kovacic, B., Vlaisavljevic, V., Reljic, M. & Cizek-Sajko, M. Reprod. Biomed. Online 8, 687?694 (2004)). 아이블라스토이드에서 EPI-유사 및 TE-유사 세포의 세포 형태에 임의의 차이가 있는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 아이블라스토이드 상에서 세포막 마커 F-액틴 (팔로이딘으로도 칭해짐)을 활용하여 세포 구조를 시각화하였다 (도 1p-r). 결과는 조밀한 NANOG 양성 EPI-유사 세포가 보다 둥근 원주형 외관을 가졌고, 한편 포배강 강을 둘러싼 TE-유사 세포는 편평하여, 이 모델이 EPI 및 TE 세포의 세포 구조의 차이를 요약할 수 있음을 강조한다. (도 1q). 전체적으로, 이들 결과는 아이블라스토이드가 E6-7에서 인간 배반포의 주요 형태학적 특색을 표시하고, EPI, TE, 및 PE 세포의 주요 분자 및 공간적 측면을 모델링할 수도 있음을 나타낸다.
실시예 6 - 아이블라스토이드의 단일 세포 전사체 프로파일링
아이블라스토이드에서 세포의 전사 구성을 추가로 특성화하기 위해, 본 발명자들은 2개의 공여자로부터 생산된 아이블라스토이드를 사용하여 단일 세포 RNA 시퀀싱 (scRNA-seq)을 수행하였다 (도 3a). 품질 관리 및 엄격한 필터링 후, 6858개의 세포 (공여자 1로부터의 3249개 세포 및 공여자 2로부터의 3609개)가 유지되었고 하류 분석을 위해 총 14224개의 유전자가 검출되었다 (도 4a). scRNA-seq의 균일 매니폴드 근사 및 투사(Uniform Manifold Approximation and Projection) (UMAP) 분석은 공여자 또는 세포 주기 차이를 기반으로 하여 클러스터링 없이 세포가 고르게 분포되었음을 나타낸다 (도 4b, c). 센다이-KLF4 전사체를 검출할 수 있긴 하였지만, scRNA-seq 데이터에서 최소한의 센다이-KOS 및 센다이-MYC 발현이 있었는데 (도 4d), 이는 외인성 OCT4 및 SOX2가 발현되지 않았거나 매우 낮은 수준으로 발현되었음을 나타낸다.
UMAP 상에서 추정되는 EPI, TE, 및 PE 세포 클러스터를 확인하기 위해, 본 발명자들은 우리의 scRNA-seq 아이블라스토이드 데이터 세트에서 EPI 마커 (NANOG 및 OCT4/POU5F1), TE 마커 (CDX2 및 GATA2) 및 PE 마커 (SOX17 및 GATA6)의 발현을 조사하였다. 도 3b에 도시된 바와 같이, OCT4 및 NANOG-발현 세포는 UMAP 공간에서 별개의 영역을 차지한다. 이러한 주목에서, 더 많은 세포가 인간 배반포에서 관찰되는 특징인 NANOG (방법 참조)보다 내인성 OCT4를 발현한다 (도 4e). SOX17 및 GATA6-발현 세포는 또한 UMAP 상의 정의된 영역에서 발견되었으며, 한편 본 발명자들은 E5-7 인간 배반포로부터 생산된 scRNA-seq 데이터세트에서 유사하게 관찰되는 CDX2 및 GATA2의 보다 이질적인 발현을 발견하였다 (도 3b, 도 4e).
아이블라스토이드에서 세포 정체성 및 EPI, TE, 및 PE 계통의 존재를 추가로 확인하기 위해, 본 발명자들은 E5-7 인간 배반포의 이의 scRNA-seq를 사용하여, 상기 문헌 페트로폴로스에 정의된 일련의 EPI, TE, 및 PE 특이적 유전자 시그니처를 기반으로 하여 득점 시스템을 적용하였다 (도 3c). 이들 정의된 시그니처를 사용하여, 본 발명자는 아이블라스토이드 데이터세트의 UMAP 상에서 별개의 EPI, TE, 및 PE 세포 집단을 분석하였다. 아이블라스토이드 및 배반포 scRNA-seq 데이터 세트에서 E5, E6, 및 E7에 의해 분리된 정의된 EPI, TE, 및 PE 시그니처에 대한 추가 검사는 무시할 수 있는 차이를 나타낸다 (도 5a-b). 전체적으로, 결과는 아이블라스토이드에서 EPI, TE, 및 PE-유사 세포의 존재를 확인해 준다.
실시예 7 - 아이블라스토이드는 배반포와 전사적으로 유사함
아이블라스토이드 내의 세포의 정체성을 추가로 분석하기 위해, 본 발명자들은 감독되지 않은 클러스터링 분석을 수행하여, 7개의 세포 클러스터를 확인하였다 (도 3d). EPI, TE, 및 PE 유전자 시그니처를 기반으로 하여, 클러스터는 EPI 클러스터, TE 클러스터 또는 PE 클러스터로 배정되었다. 나머지 3개의 클러스터는 선험적으로 명확한 정체성을 갖지 않았고 중간 시그니처를 갖는 것으로 보인다 (클러스터 IM1-3) (도 6a-b, 도 3d). 흥미롭게도, 클러스터 IM1은 높은 수준의 CDX2뿐만 아니라 외인성 KLF4를 발현하며 (도 3b, 도 4d), 이는 이러한 세포가 TE-유사 세포가 되는 도중에 있음을 시사할 수 있다. 유사하게, EPSC로부터 생산된 마우스 블라스토이드는 scRNA-seq 전사체 프로파일링에 의해 밝혀진 바와 같이 중간 또는 정의되지 않은 시그니처를 가진 세포 클러스터를 가지고 있다. 본 발명자들은 또한 재프로그래밍되지 않은 불응성 섬유모세포 세포를 나타내는 세포의 클러스터를 관찰하였다 (도 4f, g). 이러한 주목에서, 이 작은 섬유모세포 클러스터는 하류 분석에서 제외되었다.
인간 배반포의 TE 세포는 배아 발생 동안 극성 및 벽재성 TE로 구체화된다. 아이블라스토이드에서 페트로포울로스 등이 정의한 극성 및 벽재성 TE 시그니처를 조사한 결과, 아이블라스토이드는 두 가지 별개의 TE 세포 집단을 가지고 있으며, 하나는 더 높은 극성 TE-관련 시그니처를 발현하고 또 다른 하나는 벽재성 TE 시그니처를 발현한다 (도 3 j,k,l). 극성 마커인 CCR713의 면역염색 분석은 또한 아이블라스토이드의 극성 측면에서 더 높은 발현을 시사하였다 (도 3m,n).
아이블라스토이드의 세포가 IVF 후 생산된 배반포의 세포와 얼마나 유사한지 결정하기 위해, 본 발명자들은 라너(Lanner) 및 니아칸(Niakan)의 그룹, (K. K. & Eggan, K. Dev. Biol. 375, 54-64 (2013))에 의해 이전에 보고된 인간 배반포로부터 수득된 2개의 추가 scRNA-seq 데이터세트와 아이블라스토이드 scRNA-seq를 통합하였다. 라너의 그룹으로부터의 데이터세트는 연화처리된(triturated) 세포에서 Smart-seq2를 사용하여 생산되었으며, E5-7에서 서브세트의 샘플은 면역수술을 통해 ICM 세포가 풍부하였다. 니아칸의 그룹의 데이터세트의 경우, 레이저 생검을 통한 미세조작을 사용하여 배반포로부터 ICM 및 극성 TE를 분리하고, 단리된 단일 세포로부터의 cDNA를 생산하고 시퀀싱하였다. UMAP 분석은 배반포와 아이블라스토이드의 세포 사이에 높은 일치성을 나타냈다 (도 3e, f, 도 6c, d). 중요하게는, EPI-아이블라스토이드 클러스터, TE-아이블라스토이드 클러스터, 및 PE-아이블라스토이드 클러스터의 세포가 배반포로부터의 이의 EPI, PE, 및 TE 대응물과 겹친다 (도 3e). 이들 세포 집단을 추가로 특성화하기 위해 감독되지 않은 클러스터링을 수행하여 (도 3g, h), 아이블라스토이드의 PE, EPI, 및 TE-유사 세포가 배반포로부터의 PE, EPI, 및 TE 세포와 동일한 클러스터를 공유함을 확인해 주었다. 이러한 주목에서, 본 발명자들은 또한 일부 배반포 TE 세포가 IM1-아이블라스토이드 클러스터의 세포와 함께 클러스터링됨을 관찰하였다 (도 3e). 더욱이, E5-7 배반포로부터의 주석이 달린 EPI, TE, 및 PE 세포와 아이블라스토이드 EPI, TE, 및 PE 클러스터의 상관관계 분석은 아이블라스토이드 클러스터와 배반포 대응물 사이에 높은 상관관계 (~0.9)를 나타냈다 (도 3i). 본 발명자들은 페트로포울로스 데이터세트에서 상이한 발달일 (E5, E6, 및 E7)에 배반포로부터의 EPI, TE, 및 PE 세포와 아이블라스토이드 세포 클러스터를 관련시켰고, E5-7 배반포 단계의 각각의 EPI/TE/PE 계통과 아이블라스토이드 클러스터의 상관관계를 관찰하였다 (도 6e). 계층적 클러스터링 분석은 아이블라스토이드 EPI 클러스터와 초기 배반포 EPI (E5 및 E6)의 더 양호한 상관관계를 시사하다. 전체적으로, 이 데이터는 아이블라스토이드의 세포가 E5-6에서 인간 배반포에 존재하는 세 가지 세포 계통의 전사적 구성을 충실히 재현한다는 것을 입증한다.
실시예 8- 아이블라스토이드는 시험관내 이식을 모델링할 수 있음
아이블라스토이드가 자궁이 없는 인간 배아 발달의 착상 주변 및 초기 착상 후 기간 동안 발생하는 형태학적 및 분자적 변화를 모델링하는 데 사용될 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 이전에 인간 배반포를 사용하여 공개된 인간 배아 부착 배양을 변형하여 시험관내 부착 검정을 수행하였다. 현재 인간 블라스토이드 모델로 작업한 선례가 없긴 하지만, 모든 실험은 공개된 권장사항에 따라 인스티튜셔널 휴먼 리서치 연구 윤리 위원회에 의해 승인받았을 뿐만 아니라, 수정 후 최대 14일 및/또는 원시선 (PS) 형성 중 먼저 도래하는 인간 배아 배양에 대한 국제적 합의를 준수하였다. 출발 섬유모세포가 성인 공여자로부터 유래되었다는 점을 고려하여 "14-일 규칙"을 아이블라스토이드에 적용할 수는 없다는 점을 고려하여, 본 발명자들은 가능한 최소 시간 동안 아이블라스토이드를 배양하는 데 초점을 맞추었으며, 이 경우에 최대 5일 추가 (~E11에 상당)이며, 국제 지침 내에 잘 유지되도록 PS의 형태학적 증거 전에 실험을 종료하였다. PS 형성의 분자적 증거를 배제하기 위해, 본 발명자들은 5일 배아 부착 배양 동안 몇 가지 주요 원시선 마커의 qRT-PCR 24시간 과정을 수행하였으며 TBXT, EOMES, 또는 MIXL1 또는 창자 배형성을 나타내는 임의의 형태학적 변화의 상향-조절을 관찰하지 않았다 (도 8b, 도 8a). 따라서, 5일 간의 아이블라스토이드 부착 배양으로, EPI 구획은 PS의 형성으로 진행되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 상기 파라미터를 엄격하게 준수함으로써, 본 발명자들은 모든 후속 인간 아이블라스토이드 부착 배양 실험을 아이블라스토이드 형성 후 총 4.5일 동안 수행하였다.
부착 배양 모델을 사용하여, 24시간 이내에 부착된 대부분의 아이블라스토이드 (>90%)는 인간 배반포에서 보고된 것과 유사하게 크기가 증가하고, 편평해지고 진행되어 결과물을 형성하였다 (도 7a). 부착 후, NANOG 및 OCT4/SOX2 양성 세포의 수가 증가하였는데, 이는 인간 배반포를 사용할 때 관찰된 것과 유사한, 아이블라스토이드 EPI의 확대를 나타낸다 (도 8c, d). 게다가, CDX2 및 GATA2 양성 세포는 또한 부착시 전개되며 (도 8c, d), 이는 부착된 아이블라스토이드의 TE 결과물을 나타냈다. 2명의 추가 공여자로부터 생산된 아이블라스토이드를 사용하여 유사한 결과를 수득하였다 (표시되지 않음). 다음으로, 본 발명자들은 부착 후 PE-유사 세포의 분포를 조사하였다. 이들 중 다수가 여전히 TE 마커 (GATA2 또는 CDX2)로 공동-염색되긴 하였지만, 본 발명자들은 일부 SOX17 및 GATA6 양성 세포가 NANOG 또는 OCT4 양성 EPI의 둘레에 국부화됨을 주목하였다 (도 7b,c, 도 8e,f).
시험관내 부착시, 인간 배반포의 EPI 세포가 분극화되어 양막강 전구체로 공지된 내강(lumen)을 형성하는 것으로 이전에 보고되었다. F-액틴, OCT4, 및 aPKC 면역염색은 방사상으로 조직화된 OCT4-양성 세포로 둘러싸여 있는 ~20-30% 부착된 아이블라스토이드의 EPI 구획내 중앙 루멘 (F-액틴 및 aPKC로 표시됨)을 나타냈다 (도 7d). 본 발명자들은 부착 3일차에 EPI-유사 세포의 분극화 및 양막 전구체-유사 강의 출현을 관찰하였다.
이어서, 본 발명자들은 부착시 TE-계통의 가능한 세포 운명 이행을 조사하였다. 놀랍게도, 그들은 부착 배양 전 아이블라스토이드에서 둔하고 제한된 KRT7 염색과 대조적으로, 부착된 아이블라스토이드에서 TE 세포의 고강도 및 필라멘트상 케라틴 KRT7 (범-영양막 마커) 염색을 발견하였다 (도 7e). 결과는 인간 배반포를 배양할 때 또한 보고된 영양막 계통으로의 TE 세포 상태 이행을 시사한다. 중요하게도, 본 발명자들은 부착된 아이블라스토이드에서 EPI-유사 구획을 둘러싸는 세포가 영양막 세포를 나타내는 EPI의 세포에 비해 더 큰 핵 부피를 가짐을 관찰하였다 (도 7f). 특히, 본 발명자들은 부착된 아이블라스토이드의 주변부에서 각각의 다핵 표현형 및 스핀들-유사 형태에 의해 입증된 바와 같이, 형태학적으로 합포체영양막 (ST) 및 융모외 세포영양막 (EVT)과 비슷한 일부 세포를 발견하였다 (도 7f).
ST 및 EVT-유사 세포의 존재를 추가로 검증하기 위해, 본 발명자들은 ST 마커로서 hCG, 및 EVT 마커로서 MMP2를 사용하여 면역염색을 수행하였다 (도 7g). 본 발명자들은 ST의 초기 발달을 반영하는 hCG에 대한 강력하고 광범위한 염색을 검출하였으며; 한편 MMP2는 착상 단계에서 나중에 발생하는 EVT와 일치하여 더 적은 수의 세포에서 검출되었다 (도 7g). 또한, qRT-PCR 분석은 부착된 ST 마커 CSH1 및 EVT 마커 ITGA117의 상향조절을 나타냈으며, 이는 아이블라스토이드 TE 세포가 ST 및 EVT 유사-상태로 분화할 수 있음을 나타낸다 (도 7h).
마지막으로, 본 발명자들은 부착된 아이블라스토이드로부터 수집된 컨디셔닝된 배지에 대해 hCG ELISA를 수행하였고, 부착 후 4.5일에 hCG의 양의 10배 증가를 검출하였다 (도 7i). 전체적으로, 결과는 아이블라스토이드가 배반포와 유사한 시험관내 이식을 모델링하는 데 사용될 수 있음을 나타내며, 이는 인간의 배아 발달의 착상 주변 및 초기 착상 후 후 단계를 분석할 수 있는 귀중한 모델 시스템이라는 사실을 강조한다.
실시예 9 - 아이블라스토이드-유래 세포주의 확립
인간 아이블라스토이드의 생산은 본원에 기재된 바와 같이 수행하였다. 형성 6일차에 수집된 아이블라스토이드는 나이브 블라스토이드 다능성 줄기 세포 (나이브 bPSC), 프라이밍된 블라스토이드 다능성 줄기 세포 (프라이밍된 bPSC), 블라스토이드 영양막 줄기 세포 (bTSC) 및 블라스토이드 배아외 내배엽 (bXEN)을 포함하는 아이블라스토이드 (B)-유래 세포주의 확립에 활용되었다 (도 9a). To derive these cell lines from 아이블라스토이드, the 아이블라스토이드 were dissociated into single cells using 트립엘이 express and seeded into respective culture conditions (도 9a). 아이블라스토이드로부터 이들 세포주를 유도하기 위해, 아이블라스토이드는 트립엘이 익스프레스를 사용하여 단일 세포로 해리하고 각각의 배양 조건에 시딩하였다 (도 9a). 간단히 말해서, 나이브 BPSC의 유도를 위해, 세포를 방사선조사된 마우스 배아 섬유모세포 (iMEF) 층 상의 t2iLGoY 배지 (Guo et al. 2016 Stem Cell Reports 6:437-46)에서 배양하고; 프라이밍된 bPSC의 유도를 위해, 세포를 비트로넥틴 상의 이센셜 8™ 배지 (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1517001#/A1517001)에서 배양하고; bTSC의 유도를 위해, 세포를 콜라겐 IV의 TSC 배지 (Okae et al. 2018)에서 배양하고; bXEN의 유도를 위해, 세포를 iMEF 층의 NACL 배지 (Linneberg-Agerholm et al. 2019, Development: 146)에서 배양하였다. 각각의 세포 유형을 나타내는 형태를 가진 세포는 5-10일 내에 관찰되었고 60-80%의 전면생장을 달성하면 계대배양할 준비가 되었다 (도 9b, d, f).
본 발명자들은 아이블라스토이드로부터 유래된 줄기 세포가 25 계대 초과 동안 배양 상태로 유지될 수 있음을 입증하였다.
나이브 bPS 세포는 전형적인 돔-형상의 형태, KLF17/NANOG에 대한 양성 염색을 나타내고 이들은 나이브 다능성-연관 마커 (DPPA3, KLF17, DNMT3L, DPPA5, SUSD2, KLF5)를 발현한다. 프라이밍된 bPS 세포는 편평한 상피 형태, TRA-160/NANOG에 대한 양성 염색을 나타내고 이들 세포는 프라이밍된 다능성-연관 마커 (ZIC2, ZIC3, NLGN4X, OTX2, CD24, SALL2)를 발현한다. bTS 세포는 예상되는 자갈-유사 형태를 나타내고 KRT7 (범-영양막 마커) 및 GATA2에 대해 양성일 뿐만 아니라 영양막 연관 유전자 예컨대 GATA2, GATA3, TFAP2C, KRT7, TP63, 및 TEAD4를 발현한다 (도 9b-g, 도 11 b,c). 중요하게도, 본 발명자들은 나이브 및 프라이밍된 bPS 세포가 삼계통 분화 잠재력을 갖는다는 것을 입증하였다 (도 11d-h). 게다가, 그들은 bTS 세포가 융모외 세포영양막 (EVT) 및 합포체영양막 (ST)을 초래하는 능력을 확인해 주었다 (도 11i-n). 전체적으로, 이들 결과는 아이블라스토이드가 배반포를 사용하여 유래된 주요 줄기 세포 유형을 초래하는 능력을 가지고 있음을 시사한다.
실시예 10 - 아이블라스토이드-유래 세포주의 유지
나이브 bPSC의 유지를 위해, 세포를 1:10-20의 분할 비율로 6일마다 일상적으로 계대배양하였다. 간단히 말해서, 나이브 bPSC를 실온에서 5분 동안 아쿠타제를 사용하여 해리하였다. 해리된 세포를 t2iLGoY 배지에서 iMEF (계대배양 1일 전 준비)의 층에 시딩하고 37℃, O2 및 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배지 교체를 매일 수행하였다.
프라이밍된 bPSC의 유지를 위해, 세포를 1:20-40의 분할 비율로 6일마다 일상적으로 계대배양하였다. 간단히 말해서, 프라이밍된 bPSC를 실온에서 8분 동안 0.5 mM EDTA를 사용하여 해리하였다. 해리된 세포를 이센셜 8™ 배지에서 5 μg/ml 비트로넥틴-코팅된 플레이트 (계대배양 전 실온에서 적어도 1시간 동안 코팅됨) 층에 시딩하고 37℃, O2 및 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. ROCKi를 세포 부착 및 생존을 향상시키기 위해 계대배양 동안 10 μM의 농도로 첨가하였다. 배지 교체를 매일 수행하였다.
bTSC의 유지를 위해, 세포를 1:4-1:10의 분할 비율로 4-6일마다 일상적으로 계대배양하였다. 간단히 말해서, BTSC는 37℃에서 8-10분 동안 트립엘이 익스프레스를 사용하여 해리하였다. 해리된 세포를 TSC 배지에서 5 μg/ml 콜라겐 IV-코팅된 플레이트 (계대배양 전 적어도 1시간 동안 코팅됨)에 시딩하고 37℃, O2 및 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배지 교체를 격일로 수행하였다.
bXEN의 유지를 위해, 세포를 1:4-1:10의 분할 비율로 4-6일마다 일상적으로 계대배양하였다. 간단히 말해서, bXEN은 아쿠타제를 사용하여 실온에서 3-5분 동안 해리하였다. 해리된 세포를 NACL 배지에서 iMEF (계대배양 1일 전 준비)의 층에 시딩하고 37℃, O2 및 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. ROCKi를 세포 부착 및 생존을 향상시키기 위해 계대배양 동안 10 μM의 농도로 첨가하였다. 배지 교체를 격일로 수행하였다.
실시예 11 - iTSC의 생산을 위한 예시적인 방법
섬유모세포에서 iPSC로 재프로그래밍하는 동안, TSC 배지에서 중간체를 포획하고 안정화하여, iTSC를 생산할 수 있다.
1차 성체 인간 진피 섬유모세포 (HDFa)를 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터 입수하였다. HDFa를 핵 리프로그래밍 실험을 위해 LSGS (깁코)로 보충된 배지 106에서 확대하였다. 이어서 초기 계대 (< P6) 섬유모세포 세포를 DMEM (깁코), 10% FBS (히클론), 1% 비필수 아미노산 (깁코), 1 mM 글루타맥스 (깁코), 1% 펜-스트렙 (깁코), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (깁코) and 1 mM 소듐 피루베이트 (깁코)를 함유하는 섬유모세포 배지에서 형질도입 전 웰당 50,000-70,000개 세포로 6-웰 플레이트에 시딩하였다.
48시간 후, 형질도입에 필요한 바이러스의 부피 (MOI)를 결정하기 위해 한 웰의 세포를 트립신처리하여 계수하였다. 4개의 전사 인자인 OCT4, SOX2, cMYC, KLF4로 이루어진 시토튠 2.0 iPSC 센다이 재프로그래밍 키트 (인비트로겐)를 사용하여 형질도입을 수행하였다. 24시간 후, 바이러스를 제거하고 배지를 격일로 교체하였다.
형질도입 7일 후, 트립엘이 익스프레스 (라이프 테크(Life tech))를 사용하여 세포를 수확하고 섬유모세포 배지에서 방사선조사된 MEF 피더의 층에 다시 시딩 한 다음에, 다음 날 배지를 1) iTSC 배지로 교체하였다.
TSC 배지에서 배양할 때, iTSC가 전면생장되고 명백해지면, iTSC를 1:2-1:4 비율로 3-4일마다 계대배양하였다. 초기 4회 계대의 경우, iTSC를 트립엘이 익스프레스 (라이프 테크)를 사용하여 iMEF 피더에 계대배양하고 37℃, 5% O2 및 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 계대 5부터 시작하여, iTSC를 5 μg/ml Col IV (시그마)로 사전 코팅된 조직 배양 플라스크에 계대배양하고 (37℃에서 적어도 1시간 동안)하고 37℃, 20% O2 및 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
실시예 12 - 3D 배양 시스템에서 iPSC 및 iTSC의 공동-배양
iPSC와 iTSC 사이의 어셈블리 관찰을 용이하게 하기 위해, GFP-리포터 (iPSC-GFP)를 포함하는 iPSC 주 및 엠체리-리포터 (iTSC-엠체리)를 포함하는 iTSC 주를 먼저 GFP 및 엠체리 빈(empty) 벡터 구축물의 렌티바이러스 형질도입을 통해 각각 생산하였다 (도 10a,b). 공동-배양 실험의 경우, 해리된 세포를 아이블라스토이드 배지의 24웰 어그레웰™400 플레이트에 상이한 조건으로 배치하였다. (1) 각각 1:2.5 비율의 iPSC 및 iTSC, 웰당 총 1.2 × 105 세포수 (도 10c); (2) 웰당 총 1.2 × 105 세포수를 가진 iPSC-단독 (도 10d); (3) 웰당 총 1.2 × 105 세포수를 가진 iTSC-단독 (도 10e). ROCKi를 세포 생존을 향상시키기 위해 공동-배양 첫날에 보충하였고 세포를 어그레웰 시스템에서 6일 동안 배양되었다. 형성 6일차에 수득된 3D 구조를 하류 분석을 위해 수집하였다 (도 10c-e).
실시예 13 - 재프로그래밍 중간체를 생산하기 위한 상이한 배지의 사용
재프로그래밍 21일차에 EPI, TE, 및 PE-유사 세포 비율의 개선을 탐구하기 위해, 초기 배아 및 배아외 계통 세포 운명을 조절하는 것으로 공지된 상이한 신호전달 경로/배양 조건을 평가하였다. 본 발명자들은 본원의 표 4에 열거된 바와 같은 다양한 배양 배지에서 재프로그래밍을 탐구하였다. 구체적으로, NACL 배지는 PE-유사 세포 운명을 촉진하고; PA 배지는 TE-유사 세포 운명을 촉진하고; t2iLGo 배지는 착상 전 EPI-유사 세포 운명을 촉진하는 것으로 보고되었다. 21일차 재프로그래밍된 세포의 면역형광 분석을 기반으로 하여 (도 12), NACL 배지는 GATA6 (PE) 및 KLF17 (EPI)의 발현을 촉진하고; PA 배지는 GATA3 (TE), GATA6 (PE) 및 KLF17 (EPI)의 상향 조절을 촉진하며, 한편 t2iLGo 배지는 KLF17 (EPI)의 상향조절을 촉진한다. 시험된 조건 중에서, PA 배지는 평가된 3개의 마커를 기반으로 하여 재프로그래밍 21일차에 가장 많은 양의 TE, PE 및 EPI-유사 세포를 초래하였다.
실시예 14 - OKSMNL-mRNA 형질감염을 통한 인간 섬유모세포의 재프로그래밍
이 접근법에서 인간 섬유모세포의 재프로그래밍은 집합적으로 OKSMNL로 공지된 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, NANOG 및 LIN28에 의해 매개된다. mRNA 접근법을 통한 체세포 재프로그래밍을 위해, 변형된 StemRNA 3세대 겐 재프로그래밍 키트(3rd Gen Reprogramming Kit) (스템겐트(StemGent), Cat# 00-0076)의 제조업체 지침에 따라 실험을 수행하였다. 재프로그래밍을 수행하기 위해, 12-웰 플레이트의 웰당 1-2x104개의 인간 섬유모세포를 섬유모세포 배지에 시딩하였다. 24시간 후 (0일차), 제조업체의 지침에 따라 Opti-MEM (깁코) 및 RNAiMAX (인비트로겐)로 생산된 OSKMNL NM-RNA, EKB NM-RNA 및 NM-마이크로RNA를 함유하는 NM-RNA 재프로그래밍 형질감염 복합체로 세포를 형질감염시켰다. 18시간 후 배지를 새로운 섬유모세포 배지로 교체하고 다음에 형질감염을 6시간 후에 수행하였다. 형질감염 과정을 또 다른 3일 (4x 형질감염 체제의 경우) 또는 5일 (6x 형질감염 체제의 경우) 동안 반복하였다. 세포를 재프로그래밍 21일차까지 섬유모세포 배지에서 배양하고 추가 분석을 위해 수집하였다. 이들 실험에 사용된 배지에 대한 추가 세부사항은 실시예 2에 제공되어 있다.
21일차에, 4 × OKSMNL 및 6 × OKSMNL mRNA 형질감염으로부터 생산된, OCT4, GATA6 및 CDX2 (도 13a 및 c), GATA2, NANOG 및 SOX17 (도 13b 및 d)의 발현을 결정하기 위해 세포를 면역염색하였다.
결과는 재프로그래밍 중간체가 대안적 재프로그래밍 방법론을 사용할 때 인간 섬유모세포로부터 수득될 수 있고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 수득된 것들과 유사한 마커 OCT4, GATA6, CDX2, GATA2, NANOG 및 SOX17의 유전자 발현 프로파일을 가짐을 입증한다. 결과는 대안적 방법론을 사용하여 생산된 재프로그래밍 중간체가 또한 에피블라스트 (EPI), 영양외배엽 (TE), 및/또는 원시 내배엽 (PE) 전사 시그니처를 나타냄을 나타내고 아이블라스토이드가 상이한 재프로그래밍 방법, 구체적으로 재프로그래밍 전사 인자의 발현을 유도하는 상이한 방법을 통해 수득된 재프로그래밍 중간체로부터 유래될 수 있음을 나타낸다.
실시예 15 - 센다이 바이러스-매개 재프로그래밍을 통한 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)의 재프로그래밍
제조업체의 설명서 (써모피셔, lot#2170052)에 따라 시토튠-iPS 2.0 센다이 재프로그래밍 키트를 사용하여 hMSC의 재프로그래밍을 수행하였다. hMSC는 MSC 배지에서 ~5-10×104개 세포의 밀도로 시딩하였다. ~36시간 후, KOS MOI=5, c-MYC MOI=5, KLF4 MOI=6과 같이 감염 다중도 (MOI)에서 FM의 센다이 바이러스로 세포를 형질도입하였다. 배지 교체를 형질도입 후 1일차부터 시작하여 격일로 그리고 8일차부터는 계속 매일 수행하였다. 추가 분석을 위해 재프로그래밍된 세포를 재프로그래밍 21일차에 수집하였다. 이들 실험에 사용된 배지에 대한 추가 세부사항은 실시예 2에 제공되어 있다.
21일차에, OCT4, GATA6 및 CDX2 (도 14a) 또는 GATA2, NANOG 및 SOX17 (도 14b)의 발현을 결정하기 위해 세포를 면역염색하였다.
결과는 재프로그래밍 중간체가 대안적 체세포, 이 경우에 hMSC로부터 수득될 수 있고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 수득된 것들과 유사한 마커 OCT4, GATA6, CDX2, GATA2, NANOG 및 SOX17의 유전자 발현 프로파일을 가짐을 입증한다. 결과는 대안적 방법론을 사용하여 생산된 재프로그래밍 중간체가 또한 에피블라스트 (EPI), 영양외배엽 (TE), 및/또는 원시 내배엽 (PE) 전사 시그니처를 나타냄을 나타내고 아이블라스토이드가 상이한 재프로그래밍 방법, 구체적으로 재프로그래밍 전사 인자의 발현을 유도하는 상이한 방법을 통해 수득된 재프로그래밍 중간체로부터 유래될 수 있음을 나타낸다.
실시예 16 - 센다이 바이러스-매개 재프로그래밍을 통한 인간 말초 혈액 단핵 세포 (hPBMC)의 재프로그래밍.
제조업체의 설명서 (써모피셔, lot#2170052)에 따라 시토튠-iPS 2.0 센다이 재프로그래밍 키트를 사용하여 hPBMC의 재프로그래밍을 수행하였다. 재프로그래밍을 수행하기 위해, 2.5-5×105개 hPBMC를 계수하고 12 mL 둥근 바닥 튜브로 옮겼다. 재프로그래밍 혼합물은 KOS MOI=5, c-MYC MOI=5, KLF4 MOI=6과 같이 감염 다중도 (MOI)에서 센다이 바이러스의 계산된 부피를 1 mL의 PBMC 배지에 첨가하여 제조하였다.
재프로그래밍 혼합물을 hPBMC-함유 둥근 바닥 튜브로 옮긴 후, 세포를 실온에서 30분 동안 1000xg에서 원심분리하였다. 추가 1 mL의 PBMC 배지를 원심분리된 세포에 첨가하고 내용물을 재현탁하고 37℃에서 밤새 배양하기 위해 12-웰 플레이트의 1개 웰로 옮겼다 (0일차). 다음날 (1일차), 배지를 새로운 PBMC 배지로 교체하였다. 3일차에 세포를 새로운 PBMC 배지에서 1:3 비율로 마트리겔(Matrigel)-코팅된 플레이트에 플레이팅하였다. 4일차 및 6일차에, 사용된 배지의 절반을 제거하고 새로운 StemPro34 배지 (시토카인이 없는 PBMC 배지)로 교체하여 배지 교체를 수행하였다. 재프로그래밍 8일차에, 세포를 StemPro34 배지 또는 10% FBS로 보충된 StemPro34 배지로 이행하고 이 시점부터 계속 격일로 배지 교체를 수행하였다. 추가 분석을 위해 18일차 및 21일차에 세포를 수집하였다. 이들 실험에 사용된 배지에 대한 추가 세부사항은 실시예 2에 제공되어 있다.
18일 및 21일에, OCT4, GATA6 및 CDX2 (도 15a-c) 또는 GATA2, NANOG 및 SOX17 (도 15d-f)의 발현을 결정하기 위해 세포를 면역염색하였다.
결과는 재프로그래밍 중간체가 대안적 체세포, 이 경우에 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 수득될 수 있고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 수득된 것들과 유사한 마커 OCT4, GATA6, CDX2, GATA2, NANOG 및 SOX17의 유전자 발현 프로파일을 가짐을 입증한다. 결과는 대안적 방법론을 사용하여 생산된 재프로그래밍 중간체가 또한 에피블라스트 (EPI), 영양외배엽 (TE), 및/또는 원시 내배엽 (PE) 전사 시그니처를 나타냄을 나타내고 아이블라스토이드가 상이한 재프로그래밍 방법, 구체적으로 재프로그래밍 전사 인자의 발현을 유도하는 상이한 방법을 통해 수득된 재프로그래밍 중간체로부터 유래될 수 있음을 나타낸다.
본 명세서에 개시되고 정의된 본 발명은 본문 또는 도면으로부터 언급되거나 명백한 개별 특색들 중 둘 이상의 모든 대안적인 조합으로 확장된다는 것을 이해할 것이다. 이들 상이한 조합 모두는 본 발명의 다양한 대안적 측면을 구성한다.
SEQUENCE LISTING <110> Monash Univeristy <120> Induced stem cells <130> 53152204SCH <150> AU 2020904340 <151> 2020-11-24 <150> AU 2021900686 <151> 2021-03-10 <150> AU 2021903429 <151> 2021-10-26 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAPDH Forward <400> 1 ctgggctaca ctgagcacc 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAPDH Reverse <400> 2 aagtggtcgt tgagggcaat g 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSH1 Forward <400> 3 catgactccc agacctcctt ct 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSH1 Reverse <400> 4 atttctgttg cgtttcctcc at 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA1 Forward <400> 5 gctcctcact gttgttctac g 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA1 Reverse <400> 6 cgggccgctg aaagtcatt 19 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBXT Forward <400> 7 tatgagcctc gaatccacat agt 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBXT Reverse <400> 8 cctcgttctg ataagcagtc ac 22 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EOMES Forward <400> 9 gtgcccacgt ctacctgtg 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EOMES Reverse <400> 10 cctgccctgt ttcgtaatga t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIXL1 Forward <400> 11 ggcgtcagag tgggaaatcc 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIXL1 Reverse <400> 12 ggcaggcagt tcacatctac c 21

Claims (81)

  1. SALL4, GATA4, SOX17, GATA6 및 SOX7 중 하나 이상을 발현하는, 인간 유도(human induced) 배아외 내배엽 줄기(extraembryonic endoderm stem) (XEN) 세포, 또는 XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포.
  2. 제1항에 있어서, 다층 세포 구조(multi-layered cellular structure) 또는 배반포-유사 구조(blastocyst-like structure)로부터 생산되거나 단리되는 세포.
  3. - 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor) (LIF), GSK-3 억제제 및 액티빈 A를 포함하는 배양 배지의 존재 하에 피더(feeder) 층 상에서 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 해리된 단일 세포를 배양하는 단계
    를 포함함으로써, 인간 XEN-유사 세포를 생산하는, 인간 XEN-유사 세포, 또는 XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는 방법.
  4. - 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 단일 세포로 해리하는 단계,
    - 이러한 단일 세포를 백혈병 억제 인자 (LIF), GSK-3 억제제 및 액티빈 A를 포함하는 배양 배지의 존재 하에 피더 층 상에서 배양하는, 단계를 포함함으로써, 인간 XEN-유사 세포를 생산하는, 인간 XEN-유사 세포, 또는 XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 피더 층이 섬유모세포(fibroblast) 세포, 예를 들어 방사선조사된 마우스 배아 섬유모세포(irradiated mouse embryonic fibroblast) (iMEF)를 포함하거나 이로 이루어진 방법.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 배양 배지가 10 ng/ml 인간 백혈병 억제 인자, 3 μM CHIR99021 및 100 ng/ml 액티빈 A를 포함하는 방법.
  7. - 피더 층에 존재하는 XEN-유사 세포, 또는 XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 해리하는 단계로서, 바람직하게는 여기서 세포가 제3항 또는 제4항의 방법에 따라 수득되는 단계;
    - 해리된 세포를 백혈병 억제 인자 (LIF), GSK-3 억제제, 액티빈 A 및 ROCK 억제제를 포함하는 배양 배지의 존재 하에 1:4 내지 1:10의 분할 비율로 피더 층 상에 시딩(seeding)하는 단계
    를 포함함으로써, 인간 XEN-유사 세포, 또는 XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 배양하거나 유지하는, 인간 XEN-유사 세포, 또는 XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 배양하거나 유지하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, XEN-유사 세포가 3일, 4일, 5일 또는 6일마다 해리되거나 계대배양(passaging)되는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, ROCK 억제제가 약 10 μM의 농도로 존재하는 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 시딩된 세포가 1일 또는 2일 동안, 또는 시딩된 세포가 피더 층에 부착될 때까지 ROCK 억제제를 포함하는 배양 배지에서 배양되는 방법.
  11. 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, XEN-유사 세포를 확대하여 XEN-유사 세포의 수를 증가시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있거나 수득된 XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 단리된 XEN-유사 세포 또는 단리된 세포.
  13. 제1항, 제2항 및 제12항 중 어느 한 항의 XEN-유사 세포, 또는 XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 포함하는 세포의 집단(population)으로서, 여기서 바람직하게는, 세포의 적어도 5%가 XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내고, 보다 바람직하게는, 여기서 집단내 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는, 세포의 집단.
  14. - XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 제1항, 제2항 및 제12항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제13항의 세포의 집단;
    - 제약상 허용되는 담체 또는 부형제(excipient)
    를 포함하는 제약 조성물.
  15. - XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 제1항, 제2항 및 제12항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제12항의 세포의 집단; 및
    - 제약상 허용되는 담체 또는 부형제
    를 포함하는, 동종요법(homeopathic) 또는 식이 보충제(dietary supplement)를 포함하는 조성물.
  16. - XEN 세포의 적어도 하나의 특징을 나타내는 제1항, 제2항 및 제12항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제13항의 세포의 집단
    으로부터 유래된, 동종요법 또는 식이 보충제를 포함하는 조성물.
  17. 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 생산되거나 단리된, 인간 유도 영양막 줄기 세포 (TSC), 또는 인간 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포.
  18. - TSC를 유지하기에 적합한 TSC 배양 배지의 존재 하에 하나 이상의 세포외 기질 (ECM) 단백질을 포함하는 층 상에서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 해리된 단일 세포를 배양하는 단계
    를 포함함으로써, 인간 TSC, 또는 인간 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는, 인간 TSC, 또는 인간 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는 방법.
  19. - 본원에 기재된 바와 같은 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 단일 세포로 해리하는 단계,
    - 이러한 단일 세포를 TSC를 유지하기에 적합한 TSC 배양 배지의 존재 하에 하나 이상의 세포외 기질 (ECM) 단백질을 포함하는 층 상에서 배양하는 단계
    를 포함함으로써, 인간 TSC, 또는 인간 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는, 인간 TSC, 또는 인간 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는 방법.
  20. - 하나 이상의 EXM 단백질을 포함하는 층 상에 존재하는 인간 TS 세포 (TSC)를 해리하는 단계;
    - 해리된 세포를 TSC를 유지하기에 적합한 TSC 배양 배지의 존재 하에, 하나 이상의 세포외 기질 (ECM) 단백질을 포함하는 층 상에 1:4 내지 1:10의 분할 비율로 시딩하는 단계
    를 포함함으로써, 인간 TSC를 배양하거나 유지하는, 인간 TSC 세포를 배양하거나 유지하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, TSC 세포가 3일, 4일, 5일 또는 6일마다 해리되거나 계대배양되는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 하나 이상의 세포외 기질 (ECM) 단백질을 포함하는 층이 콜라겐 층을 포함하거나 이로 이루어질 수 있는 방법.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있거나 수득된, 인간 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 단리된 인간 TSC 또는 세포.
  24. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 확대하여 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포의 수를 증가시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 분화시켜 EVT 또는 ST의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 재생 의약(regenerative medicine)에 사용하기 위해, 태반외 세포 유형으로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 따라 수득된, 단리된 융모외 영양막 (EVT) 또는 합포체영양막 (ST), 또는 EVT 또는 ST의 적어도 하나의 특징을 포함하는 세포.
  28. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는, 제17항의 인간 TSC, 또는 인간 TSC, 또는 EVT 또는 ST의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 포함하는 세포의 집단으로서, 여기서 바람직하게는, 세포의 적어도 5%가 TSC, EVT 또는 ST의 적어도 하나의 특징을 나타내고, 보다 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 TSC, 또는 EVT 또는 ST의 적어도 하나의 특징을 나타내는, 세포의 집단.
  29. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, TSC 배양 배지가 성장 인자, 바람직하게는 EGF, 및 ROCK 억제제를 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, TSC 배양 배지가 ROCK 억제제 트랜스-N-(4-피리딜)-4-(1-아미노에틸)-시클로헥산카르복스아미드 (Y-27632), 또는 이의 염을 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, TSC 배양 배지가 다음 중 하나 이상을 추가로 포함하는 방법:
    - 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리딜)-1H-이미다졸-2-일] 벤즈아미드 (SB 431542) 또는 이의 염;
    - 6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸_2-일)-2-피리미디닐 아미노]에틸]아미노]미코티노니트릴 (CHIR 99021), 또는 이의 염; 및/또는
    - A83-01 (3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카르보티오아미드), 또는 이의 염.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, TSC 배지가 또한 Wnt 자극제 및 하나 이상의 TGFβ 억제제를 포함하는 방법.
  33. 제18항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, TSC 배양 배지가 본원에 기재된 바와 같은 ASECRiAV이고, A83-01, SB431542, EGF, CHIR, ROCK 억제제, 아스코르브산 및 발프로산을 포함하는 방법.
  34. TSC의 특징이 다음 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 포함하는, 제17항의 세포, 또는 제18항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법:
    - 미분화, 이중전위 상태 및 융모외 영양막 (EVT) 또는 합포체영양막 (ST)의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포로 분화하는 능력;
    - 자갈-형상의 콜로니 외관(cobblestone-shaped colony appearance);
    - 비술파이트 검정(bisulfite assay) 또는 게놈-전체(genome-wide) DNA 메틸화 프로파일링 기술에 의해 결정된 바와 같은, 배반포-유래 TSC와 유사한 메틸화 패턴;
    - 면역조직화학 및/또는 PCR 검정에 의해 결정된 바와 같은, TSC의 하나 이상의 생화학적 마커의 발현으로서, 바람직하게는 여기서 마커가 CD249 (아미노펩티다제 A), CD49f (iTGA6); 핵 GATA2/3, TFAP2C, P6 및 NR2F2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 발현;
    - ATAC-seq를 사용하여 결정된 바와 같은 배반포-유래 TSC와 유사한 염색질 접근성의 수준;
    - 배반포-유래 TSC와 유사한 히스톤 변형 프로파일 (예를 들어, H3K4me3, H3K27ac 유전자 변형);
    - 배반포-유래 TSC와 유사한 프로테옴 또는 대사체 프로파일(metabolome profile).
  35. - 제17항 또는 제23항의 인간 TSC, 또는 인간 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포, 또는 제27항의 EVT 또는 ST, 또는 제28항의 세포의 집단, 및
    - 제약상 허용되는 담체 또는 부형제
    를 포함하는 제약 조성물.
  36. - 제17항 또는 제23항의 인간 TSC, 또는 인간 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포, 또는 제27항의 EVT 또는 ST, 또는 제28항의 세포의 집단, 및/또는
    - 제17항, 제23항 또는 제27항의 세포, 또는 제28항의 세포의 집단으로부터 유래된 오가노이드(organoid);
    및
    - 제약상 허용되는 담체 또는 부형제
    를 포함하는, 동종요법 또는 식이 보충제를 포함하는 조성물.
  37. - 제17항 또는 제23항의 인간 TSC, 또는 인간 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포, 또는 제27항의 EVT 또는 ST, 또는 제28항의 세포의 집단, 및/또는
    - 제17항, 제23항 또는 제27항의 세포, 또는 제28항의 세포의 집단으로부터 유래된 오가노이드
    로부터 유래된, 동종요법 또는 식이 보충제.
  38. 제18항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 제17항 또는 제23항의 인간 TSC, 또는 인간 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포, 또는 제27항의 EVT 또는 ST, 또는 제28항의 세포의 집단, 및/또는
    - 제17항, 제23항 또는 제27항의 세포, 또는 제28항의 세포의 집단으로부터 유래된 오가노이드
    를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  39. 태반 또는 배반포에
    - 제17항 또는 제23항의 인간 TSC, 또는 인간 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포, 또는 제27항의 EVT 또는 ST, 또는 제28항의 세포의 집단, 및/또는
    - 제17항, 제23항 또는 제27항의 세포, 또는 제28항의 세포의 집단으로부터 유래된 오가노이드
    를 도입하는 단계를 포함하는, 태반 또는 배반포를 증대시키는 방법.
  40. 제17항 또는 제23항의 세포 인간 TSC, 또는 인간 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포, 또는 제27항의 EVT 또는 ST, 또는 제28항의 세포의 집단으로부터 유래된 오가노이드.
  41. 영양막의 발생 및/또는 활성과 연관된 장애의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의
    - 제17항 또는 제23항의 인간 TSC, 또는 인간 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포, 또는 제27항의 EVT 또는 ST, 또는 제28항의 세포의 집단,
    - 제17항, 제23항 또는 제27항의 세포, 또는 제28항의 세포의 집단으로부터 유래된 오가노이드;
    - 제25항의 제약 조성물; 또는
    - 제36항 또는 제37항의 조성물
    을 투여하는 단계를 포함함으로써, 상기 대상체에서 영양막의 발생 및/또는 활성과 연관된 장애를 치료 및/또는 예방하는, 상기 대상체에서 영양막의 발생 및/또는 활성과 연관된 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법.
  42. 태반의 질환/장애의 치료를 의한 의약(medicament)의 제조에서의, 제17항 또는 제23항의 인간 TSC, 또는 인간 TSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포, 또는 제27항의 EVT 또는 ST, 또는 제28항의 세포의 집단, 및/또는 제17항, 제23항 또는 제27항의 세포, 또는 제28항의 세포의 집단으로부터 유래된 오가노이드의 용도.
  43. 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 생산되거나 단리된 나이브() 다능성 줄기 세포 (nPSC)의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포.
  44. - 세포를 나이브 다능성 상태로 촉진하기 위한 배양 배지의 존재 하에 피더 층 상에서 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 해리된 단일 세포를 배양하는 단계
    를 포함함으로써 nPSC 또는 인간 나이브 다능성 줄기 세포 (nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는, 인간 nPSC 또는 인간 나이브 다능성 줄기 세포 (nPSC)의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는 방법.
  45. - 본원에 기재된 바와 같은 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 단일 세포로 해리하는 단계,
    - 이러한 단일 세포를 세포를 나이브 다능성 상태로 촉진하기 위한 배양 배지의 존재 하에 피더 층 상에서 배양하는 단계
    를 포함함으로써, nPSC 또는 인간 나이브 다능성 줄기 세포 (nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는, 인간 nPSC 또는 인간 나이브 다능성 줄기 세포 (nPSC)의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 피더 층이 섬유모세포 세포, 예를 들어 방사선조사된 마우스 배아 섬유모세포 (iMEF)를 포함하거나 이로 이루어진 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 나이브 다능성 상태를 촉진하기 위한 배양 배지가 MEK 억제제, PKC 억제제, GSK3 억제제, STAT3 활성화제 및 ROCK 억제제를 포함하는 방법.
  48. 제48항에 있어서, 나이브 다능성 상태를 촉진하기 위한 배양 배지가 t2iLGoY 배지인 방법.
  49. - 피더 층 상에 존재하는 nPSC를 해리하는 단계로서, 여기서 nPSC가 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되는 단계;
    - 해리된 세포를 세포를 나이브 다능성 상태로 촉진하기 위한 배양 배지의 존재 하에, 피더 층 상에 1:10 내지 1:20의 분할 비율로 시딩하는 단계
    를 포함함으로써, 인간 PSC를 배양하거나 유지하는, 인간 PSC 세포를 배양하거나 유지하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, nPSC가 3일, 4일, 5일 또는 6일마다 해리되거나 계대배양되는 방법.
  51. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, nPSC를 확대하여 nPSC의 수를 증가시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  52. 제44항 내지 제51항에 있어서, nPSC, 또는 nPSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 다능성 상태가 아닌 세포 또는 분화된 세포의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 생산하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, nPSC, 또는 nPSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  53. 제44항 내지 제51항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있거나 수득된, 단리된 nPSC 또는 nPSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포.
  54. 제52항의 방법에 따라 생산된 분화된 세포.
  55. 제43항 또는 제53항의 nPSC를 포함하는 세포의 집단으로서, 여기서 바람직하게는, 세포의 적어도 5%가 nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내고, 보다 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 nPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포의 집단.
  56. 제54항의 분화된 세포 또는 제43항 또는 제53항의 nPSC로부터 생산된 분화된 세포를 포함하는 세포의 집단으로서, 바람직하게는 여기서 세포의 적어도 5%가 분화된 세포이며, 보다 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 분화된 세포인 세포의 집단 .
  57. 제54항의 nPSC의 집단으로부터 유래된 세포 또는 제55항의 분화된 세포의 오가노이드 또는 기타 조직화된 집합체(organised collection).
    [청구항 57]
    - 제43항 또는 제53항의 nPSC 세포 또는 제54항의 분화된 nPSC; 또는
    - 제55항 또는 제56항의 세포의 집단; 또는
    - 제57항의 오가노이드;
    및
    - 제약상 허용되는 담체 또는 부형제
    를 포함하는 제약 조성물.
  58. nPSC 또는 세포의 집단의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태(condition)의 치료를 필요로 하는 대상체에게
    - 제43항 또는 제53항의 nPSC 세포 또는 제54항의 분화된 nPSC; 또는
    - 제55항 또는 제56항의 세포의 집단; 또는
    - 제57항의 오가노이드; 또는
    - 제57항의 제약 조성물
    을 투여하는 단계를 포함하는, nPSC 또는 세포의 집단의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  59. 다능성 줄기 세포, 또는 이로부터 유래된 분화된 세포의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 제43항 또는 제53항의 nPSC 세포 또는 제54항의 분화된 nPSC, 또는 제55항 또는 제56항의 세포의 집단; 또는 제57항의 오가노이드의 용도.
  60. 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 생산되거나 단리된, 인간 프라이밍된(primed) 다능성 줄기 세포 (pPSC), 또는 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포.
  61. - 세포를 프라이밍된 다능성 상태로 촉진하기 위한 배양 배지의 존재 하에 비트로넥틴 층 상에서 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조로부터 해리된 단일 세포를 배양하는 단계
    를 포함함으로써, pPSC, 또는 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는, 인간 pPSC, 또는 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는 방법.
  62. - 본원에 기재된 바와 같은 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 단일 세포로 해리하는 단계,
    - 이러한 단일 세포를 세포를 프라이밍된 다능성 상태로 촉진하기 위한 배양 배지의 존재 하에 비트로넥틴 상에서 배양하는 단계
    를 포함함으로써, pPSC, 또는 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는, 인간 pPSC, 또는 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 생산하는 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 프라이밍된 다능성 상태를 촉진하기 위한 배양 배지가 본원의 표 1에 기재된 배지인 방법.
  64. - 비트로넥틴 층 상에 존재하는 pPSC를 해리하는 단계;
    - 해리된 세포를 세포를 프라이밍된 다능성 상태로 촉진하기 위한 배양 배지의 존재 하에, 비트로넥틴 상에 1:20 내지 1:40의 분할 비율로 시딩하는 단계
    를 포함함으로써, 인간 pPSC를 배양하거나 유지하는, 인간 pPSC 세포 또는 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 배양하거나 유지하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, pPSC가 3일, 4일, 5일 또는 6일마다 해리되거나 계대배양되는 방법.
  66. 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있거나 수득된, 단리된 pPSC, 또는 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포.
  67. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포를 확대하여 nPSC의 수를 증가시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  68. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, nPSC, 또는 nPSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 다능성 상태가 아닌 세포 또는 분화된 세포의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 생산하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, nPSC, 또는 nPSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  69. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있거나 수득된, 단리된 pPSC, 또는 pPSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포.
  70. 제68항의 방법에 따라 생산된 분화된 세포.
  71. 제60항, 또는 제69항의, pPSC, 또는 pPSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포를 포함하는 세포의 집단으로서, 바람직하게는 여기서, 세포의 적어도 5%가 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내고, 보다 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 pPSC의 적어도 하나의 특징을 나타내는 세포의 집단.
  72. 제70항의 분화된 세포를 포함하는 세포의 집단으로서, 바람직하게는 여기서 세포의 적어도 5%가 제70항의 분화된 세포로부터 생산된 분화된 세포이며, 보다 바람직하게는, 여기서 집단내 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 분화된 세포인 세포의 집단.
  73. 제60항 또는 제69항의 pPSC, 또는 제71항의 pPSC의 집단, 또는 제70항의 분화된 세포 또는 제72항의 분화된 세포의 집단으로부터 유래된 오가노이드 또는 기타 조직화된 세포 집합체.
  74. 제60항 또는 제69항의 pPSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포; 또는 제70항의 분화된 세포;
    - 제71항 또는 제72항의 세포의 집단; 또는
    - 제73항의 오가노이드;
    및
    - 제약상 허용되는 담체 또는 부형제
    를 포함하는 제약 조성물.
  75. pPSC, 또는 pPSC의 집단의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게
    - 제60항, 제69항 또는 제71항의 단리된 pPSC, 또는 pPSC의 집단;
    - 제70항 또는 제72항의, 단리된 분화된 세포, 또는 분화된 세포의 집단; 또는
    - 제73항의 오가노이드
    을 투여하는 단계를 포함하는, pPSC, 또는 pPSC의 집단의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  76. pPSC, 또는 pPSC로부터 유래된 세포의 집단의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 의약의 제조에서의,
    - 제60항 또는 제69항의 pPSC의 적어도 하나의 특징을 갖는 세포;
    - 제70항의 분화된 세포;
    - 제71항 또는 제72항의 세포의 집단; 또는
    - 제73항의 오가노이드
    의 용도.
  77. 제3항, 제4항, 제18항, 제19항, 제45항, 제46항, 제61항 및 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 세포가 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일의 기간 동안 배양되는 방법.
  78. 제3항 내지 제11항, 제18항 내지 제22항, 제45항 내지 제52항 및 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 계대배양에서 유지될 때 이의 미분화 상태를 유지하고, 바람직하게는, 여기서 세포가 적어도 5회, 적어도 10회, 적어도 15회, 적어도 20회, 적어도 40회 이상의 세포 배양 계대 동안 이의 특징을 유지하는 방법.
  79. 제4항, 제7항, 제19항, 제20항, 제45항, 제49항, 제62항 및 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 해리시키는 단계가 세포를 효소 또는 효소 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 바람직하게는 여기서 효소 또는 효소 조성물이 세포의 탈착을 촉진하거나 응집된 배양물에서 성장하는 세포를 해리시키기에 적합한 단백질분해 및/또는 콜라겐분해 효소를 포함하는 방법.
  80. 제3항 내지 제11항, 제18항 내지 제22항, 제45항 내지 제52항 및 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조를 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 다층 세포 구조 또는 배반포-유사 구조가 재프로그래밍 중간체를 응집시키는 방법 또는 iPSC와 iTSC를 어셈블리하는 방법에 의해 수득되는 방법.

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