CN116761882A

CN116761882A - 诱导性干细胞

Info

Publication number: CN116761882A
Application number: CN202180091820.4A
Authority: CN
Inventors: J·波罗; 刘晓东; 陈家斌
Original assignee: Monash University
Current assignee: Monash University
Priority date: 2020-11-24
Filing date: 2021-11-24
Publication date: 2023-09-15

Abstract

本发明涉及衍生自多层细胞结构或胚泡样结构的干细胞、包含这些干细胞的组合物以及获得这些干细胞的方法。

Description

诱导性干细胞

技术领域

本发明提供了产生各种诱导性干细胞的方法，以及这些干细胞本身。

相关申请

本申请要求澳大利亚临时申请AU 2020904340、AU 2021900686和AU 2021903429的优先权，所有这些临时申请的全部内容特此通过援引并入。

背景技术

哺乳动物胚胎发生从能够发育成桑椹胚的全能受精卵开始，随后形成胚泡。当胚胎植入时，胚泡内的上胚层(EPI)谱系的细胞将发育成胚体和羊膜，而滋养外胚层(TE)和原始内胚层(PE)的细胞将最终分别产生胎盘和卵黄囊。

当在体外分离和培养时，上胚层的细胞产生人胚胎干细胞(hESC)。替代性地，可通过转录因子介导的重编程将成体细胞重编程为人诱导性多能干细胞(hiPSC)。这些体外培养的多能细胞可分化成身体的所有细胞类型，因此，它们对于人‘迷你器官’或类器官模型的开发是关键的。此外，已使用hESC/hiPSC开发了许多体外模型以研究早期人类发育，包括微图案化的胚盘状结构、胚囊状结构和人类原肠胚。这一技术和医学革命对于疾病建模、药物筛选以及我们对几种疾病、胚胎和器官发育的分子机制的理解具有重大意义。

受精后约3.5天的小鼠胚胎形成包含以下三个谱系的胚泡：胚外滋养外胚层(TE)、PE和多能性EPI，可以从它们衍生出同源的离体干细胞。滋养层干(TS)细胞衍生自TE，胚外内胚层干(XEN)细胞衍生自PE，并且ES细胞衍生自EPI。值得注意的是，这些干细胞系中的每一种都是它们所代表的胚泡细胞谱系的有用模型。多年来，小鼠ES和TS细胞已成功用于模拟EPI或TE生物学，分别包括多能性维持和胎盘发育的机制。

鉴定可产生所需细胞形态的容易获得的干细胞来源对于治疗性治疗、组织工程和研究非常重要。

需要新的和/或改进的方法来生成人干细胞或显示出人干细胞特征的细胞。

说明书中对任何现有技术的援引并不是承认或暗示此现有技术形成任何管辖权的公知常识的一部分，或者可以合理地期望该现有技术被本领域的技术人员理解、认为是相关的和/或与其他现有技术组合。

发明内容

在第一方面，本发明提供了诱导的或体外衍生的人胚外内胚层干(XEN)细胞或XEN样细胞，其中该细胞表达SALL4、GATA4、SOX17、GATA6和SOX7中的一种或多种。任选地，XEN细胞或XEN样细胞表达PE谱系的一种或多种或所有标志物，如本文的表2中所定义。

在该方面，本发明提供了一种可在培养物中维持至少5代、至少10代或至少15代的时段的XEN或XEN样细胞群。通常，XEN或XEN样细胞以本文所述的方法维持。

在该方面，XEN或XEN样细胞产生自或分离自如本文所述的胚泡、或体外衍生的多层细胞结构或胚泡样结构。多层细胞结构或胚泡样结构(诸如类囊胚或iBlastoid)可通过本文所述的任何方法产生。

在该方面，本发明提供了一种产生人XEN或XEN样细胞的方法，该方法包括；

-在饲养层上在包含白血病抑制因子(LIF)、GSK-3抑制剂和激活素A的培养基存在下培养从多层细胞结构或胚泡样结构解离的单细胞，

由此产生人XEN或XEN样细胞。

在该方面，本发明提供了一种产生人XEN或XEN样细胞的方法，该方法包括：

-将如本文所述的胚泡或体外衍生的多层细胞结构或胚泡样结构解离成单细胞，

-在饲养层上在包含白血病抑制因子(LIF)、GSK-3抑制剂和激活素A的培养基存在下培养这些单细胞，

由此产生人XEN或XEN样细胞。

在该方面，饲养层可包含成纤维细胞或由其组成，例如经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞(iMEF)。

在该方面，将单细胞培养至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天的时段。单细胞可培养至少5代、至少10代、至少15代、至少20代、至少25代、至少30代、至少40代、至少50代或更多代。

在该方面，培养基可包含10ng/ml人白血病抑制因子、3μM CHIR99021和100ng/ml激活素A。

在该方面，本发明提供了一种培养或维持人XEN或XEN样细胞的方法，该方法包括：

-使存在于饲养层上的XEN或XEN样细胞解离；

-在包含白血病抑制因子(LIF)、GSK-3抑制剂、激活素A和ROCK抑制剂的培养基存在下将解离的细胞以1:4至1:10的分裂比接种到饲养层上，

由此培养或维持人XEN或XEN样细胞。

优选地，XEN或XEN样细胞每3、4、5或6天解离或传代一次。优选地，根据本发明第一方面的方法获得用于培养或维持的XEN样细胞。

XEN或XEN样细胞可通过培养根据本文所述的任何方法获得的任何体外衍生的多层细胞结构或胚泡样结构，并使XEN或XEN样细胞在包含白血病抑制因子(LIF)、GSK-3抑制剂和激活素A的培养基中增殖而生成。

在本发明的该方面的任何实施例中，解离XEN或XEN样细胞的步骤可包括使细胞与酶或酶组合物接触。可使用适于促进细胞脱离或使在聚集培养物中生长的细胞解离的包含蛋白水解酶和/或胶原溶解酶的任何酶或酶组合物。在任何实施例中，酶组合物可以是分散酶、胶原酶、EDTA、胰蛋白酶或

优选地，饲养层包含成纤维细胞或由其组成，例如经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞(iMEF)。

优选地，ROCK抑制剂以约10μM的浓度存在。通常，接种的细胞在包含ROCK抑制剂的培养基中培养1或2天，或直到接种的细胞附着到饲养层。附着后，可使用包含白血病抑制因子(LIF)、GSK-3抑制剂和激活素A(无ROCK抑制剂)的培养基并每隔一天替换一次。

在该方面，任何方法可进一步包括分离XEN或XEN样细胞的步骤。

因此，在该方面的进一步的实施例中，提供了一种通过本发明的第一方面的任何方法可获得的或获得的分离的XEN或XEN样细胞。

在该方面的任何方法中，该方法可进一步包括扩增XEN或XEN样细胞以增加群体中XEN或XEN样细胞的比例的步骤。扩增细胞的步骤可包括在如下所述的用于生成细胞群的条件下培养细胞足够的时间。

如本文所用，XEN样细胞可包括表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞。在该方面，本发明还提供了一种表现出通过本发明的第一方面的方法产生的XEN细胞的至少一种特征的细胞。

在进一步的实施例中，XEN或XEN样细胞或表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞当在传代培养物中维持时保持其未分化状态。

优选地，具有XEN细胞的至少一种特征的细胞在至少5、至少10、至少15、至少20、至少40或更多次细胞培养传代中保持XEN细胞的至少一种特征。

如本文所用，XEN细胞或XEN样细胞的特征将被理解为包括：

-扁平内胚层形态；

-标志物GATA6、GATA4、PDGFRa、NID2和BMP6中的一种或多种的表达，

-不存在多能性标志物诸如NANOG的表达；

-ECM诸如纤连蛋白和核纤层蛋白的分泌；

-基膜组分诸如LAMA1、COL4A1和FN1的产生；

-发育成内脏内胚层，例如，其特征在于AFP和HFN4a的表达失调以及GATA6、GATA4、PDGFRa、NID2和BMP6的表达下调。

在进一步的实施例中，表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞的特征在于不存在表征体细胞的标志物。在某些实施例中，表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞不表达以下标志物中的一种或多种：OCT4(也称为POU5F1)、NANOG、SOX2、KLF17、DPPA3和DNMT3L。

在任何实施例中，根据本发明的第一方面制备的XEN样细胞的特征在于如本文所述的XEN的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少五种特征。

在该方面，本发明还提供了一种包含通过本文所述的本发明的任何方法获得或可获得的XEN或XEN样细胞的细胞群。优选地，至少5％的细胞表现出XEN样细胞的至少一种特征，并且这些细胞通过如本文所述的方法产生。优选地，该群中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞表现出XEN细胞的至少一种特征，并且这些XEN样细胞通过本发明第一方面的方法获得或可获得。

在该方面，本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含：

-表现出XEN细胞的至少一种特征的XEN或XEN样细胞，其中该细胞根据本发明的第一方面的方法获得或可获得，以及

-药学上可接受的载剂或赋形剂。

在该方面，本发明还提供了一种组合物，该组合物包含顺势疗法剂或膳食补充剂，该顺势疗法剂或膳食补充剂包含：

-表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞或细胞群，其中该细胞根据本发明的第一方面的方法获得或可获得，以及

-药学上可接受的载剂或赋形剂。

在该方面，本发明进一步提供了一种组合物，该组合物包含顺势疗法剂或膳食补充剂，该顺势疗法剂或膳食补充剂衍生自：

-表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞或细胞群，其中该细胞根据本发明的第一方面的方法获得或可获得。

如本文所用，XEN样细胞和具有XEN细胞的至少一种特征的细胞也可称为iBlastoid(B)衍生的XEN(BXEN)细胞或iXEN细胞或体外衍生的XEN细胞。

本发明还提供了一种从根据本发明的第一方面的方法获得的表现出XEN或XEN样细胞的至少一种特征的细胞获得的类器官和/或从根据本发明的第二方面的方法制备的表现出XEN或XEN样细胞的至少一种特征的细胞获得的分化细胞。

在该方面，本发明还提供了一种从XEN或XEN样细胞或由XEN或XEN样细胞生成的分化细胞获得或衍生的嵌合器官或类器官，其中这些XEN或XEN样细胞根据本发明的第四方面的方法获得或可获得。

根据本发明的方法获得的XEN细胞、XEN样细胞、BXEN、iXEN或体外衍生的XEN细胞或它们的群体可整合到滋养层类器官中以形成复杂的胚外类器官系统(人工胎盘和卵黄囊)以支持体外胚胎生长。因此，本发明还提供了根据本发明的方法获得的XEN细胞、XEN样细胞、BXEN、iXEN或体外衍生的XEN细胞或它们的群体或类器官的用途，用于：

-形成胚外类器官；

-了解与胚外组织发育相关的疾病/功能障碍的模型；

-筛选用于改善胚外组织功能的药物和治疗剂；

-模型/研究胚胎模式、生殖细胞发育和/或胎儿造血干细胞形成。

在第二方面，本发明提供了一种细胞，该细胞表现出由如本文所述的体外衍生或生成的多层细胞结构或胚泡样结构(诸如类囊胚或iBlastoid)产生或分离的滋养层干细胞(TSC)的至少一种特征。多层细胞结构或胚泡样结构可通过本文所述的任何方法产生。

在该方面，本发明提供了一种产生人TSC的方法，该方法包括；

-在适于维持TSC的TSC培养基存在下，在包含一种或多种细胞外基质(ECM)蛋白的层上培养从多层细胞结构或胚泡样结构解离的单细胞，

由此产生人TSC。

-将如本文所述的多层细胞结构或胚泡样结构解离成单细胞，

-在适于维持TSC的TSC培养基存在下，在包含一种或多种细胞外基质(ECM)蛋白的层上培养这些单细胞，

由此产生人TSC。

在该方面，将单细胞培养至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天的时段。

在这方面，TSC培养基可包含生长因子(优选EGF)、ROCK抑制剂、HDAC抑制剂、TGF-β抑制剂和GSK-3抑制剂。优选地，该GSK-3抑制剂包括CHIR99021，该TGF-β抑制剂包括SB431542和A83-01，并且该HDAC抑制剂包括丙戊酸。

在特别优选的实施例中，TSC培养基是如Okae等人(2018)Cell Stem Cell[细胞干细胞],22:50-63所述的培养基，如本文进一步所述。

在该方面，本发明提供了一种培养或维持人TSC细胞的方法，该方法包括

-解离存在于包含一种或多种EXM蛋白的层上的TS细胞(TSC)；

-在适于维持TSC的TSC培养基存在下，将解离的细胞以1:4至1:10之间的分裂比接种到包含一种或多种细胞外基质(ECM)蛋白的层上，

由此培养或维持人TSC。

优选地，TSC细胞每3、4、5或6天解离或传代一次。优选地，根据本发明的第二方面的方法获得用于培养或维持的TSC。

在该方面的任何实施例中，包含一种或多种细胞外基质(ECM)蛋白的该层可包含胶原、纤连蛋白、基质胶、geltrex或核纤层蛋白的层或由其组成。优选地，该胶原可包含胶原IV或由其组成。

可通过培养根据本文所述的任何方法获得的任何体外衍生的多层细胞结构或胚泡样结构，并使TSC在TSC培养基中增殖来生成TSC。

在本发明的该方面的任何实施例中，解离TSC的步骤包括使细胞与酶或酶组合物接触。可使用适于促进细胞脱离或使在聚集培养物中生长的细胞解离的包含蛋白水解酶和/或胶原溶解酶的任何酶或酶组合物。在任何实施例中，酶组合物可以是分散酶、胶原酶、EDTA、胰蛋白酶或

在该方面，任何方法可进一步包括分离表现出TSC的至少一种特征的细胞的步骤。

因此，在该方面的进一步的实施例中，提供了一种可通过本文所述的本发明的第二方面的任何方法可获得或获得的分离的TSC。

在该方面，本发明还提供了一种通过本文所述的本发明的第二方面的任何方法产生的表现出TSC的至少一种特征的细胞。

在进一步的实施例中，表现出TSC的至少一种特征的细胞当在传代培养物中维持时保持其未分化状态。

优选地，具有TSC的至少一种特征的细胞在至少5、至少10、至少15、至少20、至少40或更多次细胞培养传代中保持TSC的至少一种特征。

在这方面，本发明还提供了一种分离的绒毛外滋养层(EVT)或合体滋养层(ST)，其衍生自或分化自根据本发明的第二方面的方法获得的表现出TSC的至少一种特征的细胞。

在该方面的任何方法中，该方法可进一步包括使表现出TSC的至少一种特征的细胞分化以生成表现出EVT或ST的至少一种特征的细胞的步骤。分化细胞的步骤可包括在生成具有如本文所述的EVT或ST的至少一种特征的细胞的条件下培养细胞足够的时间。

更进一步地，该方法可进一步包括使表现出TSC的至少一种特征的细胞分化成胎盘外细胞类型，以用于再生医学。

如本文所用，ST的特征包括以下中的一者或多者：SDC1+多核细胞，以及相对于TSC标志物CGA、CGB、PSG1、CSH1、HSD3B1、CYP19A1、SDC1和INHA中的一种或多种增加的表达。进一步的特征包括圆形多核形态。

如本文所用，EVT的特征包括以下中的一者或多者：相对于TSC标志物HLA-G、PRG2、PAPPA2、MMP2、ITGA5和ATGA1中的一种或多种增加的表达。进一步的特征包括细长纺锤体样形态。

在该方面的任何方法中，该方法可进一步包括扩增表现出TSC的至少一种特征的细胞以增加群体中表现出TSC的至少一种特征的细胞的比例的步骤。扩增细胞的步骤可包括在如下所述的用于生成细胞群的条件下培养细胞足够的时间。

在本文所述的任何方法中，该方法可进一步包括使表现出TSC的至少一种特征的细胞分化以生成表现出EVT或ST的至少一种特征的细胞的步骤。分化细胞的步骤可包括在生成具有如本文所述的EVT或ST的至少一种特征的细胞的条件下培养细胞足够的时间。

在该方面，本发明还提供了一种包含通过本文所述的本发明的任何方法获得或可获得的TSC的细胞群。优选地，至少5％的细胞表现出TSC的至少一种特征，并且这些细胞通过如本文所述的方法产生。优选地，该群中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞表现出TSC的至少一种特征，并且这些TSC通过如本文所述的本发明的第二方面的方法获得或可获得。

在该方面，本发明还提供了一种细胞群，其中至少5％的细胞是从通过如本文所述的方法产生的表现出TSC的至少一种特征的细胞分化的ST或EVT。优选地，该群中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞是通过使根据本发明获得的表现出TSC的至少一种特征的细胞分化而获得的ST或EVT。

在本发明的任何实施例中，TSC培养基包含ROCK抑制剂反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺(Y-27632)或其盐。

在进一步的实施例中，TSC培养基另外包含以下中的一者或多者：

-4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(SB 431542)或其盐；

-6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]烟腈(CHIR 99021)或其盐；和/或

-A83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺)或其盐。

在进一步的实施例中，TSC培养基还包含用于刺激Wnt的试剂和一种或多种TGFβ抑制剂。

在优选的实施例中，TSC培养物是如本文所述的ASECRiAV，并且包含：A83-01、SB431542、EGF、CHIR、ROCK抑制剂、抗坏血酸和丙戊酸。

如本文所用，TSC的特征将被理解为包括：

-未分化的双潜能状态以及分化成表现出绒毛外滋养层(EVT)或合体滋养层(ST)的一种或多种特征的细胞的能力；

-鹅卵石状集落外观；

-类似于胚泡衍生的TSC的甲基化模式，如通过亚硫酸氢盐测定或全基因组DNA甲基化谱分析技术确定的；

-TSC的一种或多种生物化学标志物的表达，如通过免疫组织化学和/或PCR测定确定的，优选地其中这些标志物选自由以下各项组成的组：CD249(氨肽酶A)、CD49f(iTGA6)；核GATA2/3、TFAP2C、P6和NR2F2；

-类似于胚泡衍生的TSC的染色质可及性水平，如使用ATAC-seq确定的；

-类似于胚泡衍生的TSC的组蛋白修饰图谱(例如，H3K4me3、H3K27ac基因修饰)；

-类似于胚泡衍生的TSC的蛋白质组或代谢物组图谱。

在进一步的实施例中，表现出TSC的至少一种特征的细胞的特征在于不存在表征体细胞的标志物。在某些实施例中，表现出TSC的至少一种特征的细胞不表达以下标志物中的一种或多种：OCT4(也称为POU5F1)、NANOG、SOX2、SALL2、OTX2、BANCR、KLF17、DPPA3、ARGFX和DNMT3L。

在任何实施例中，根据本发明制备的TSC的特征在于如本文所述的TSC的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少五种特征。

本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物包含：

-表现出TSC的至少一种特征的细胞，其中该细胞根据本发明的第二方面的方法获得或可获得，以及

-药学上可接受的赋形剂。

本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物包含：

-表现出ST或EVT的至少一种特征的细胞，其中该细胞通过使根据本发明的第二方面的方法获得或可获得的具有TSC的至少一种特征的细胞分化而获得或可获得，和

-药学上可接受的载剂或赋形剂。

本发明还提供了一种组合物，该组合物包含顺势疗法剂或膳食补充剂，该顺势疗法剂或膳食补充剂包含：

-表现出TSC的至少一种特征的细胞或细胞群，其中该细胞根据本发明的第二方面的方法获得或可获得，和/或

-表现出ST或EVT的至少一种特征的细胞或细胞群，其中该细胞通过使根据本发明的第二方面的方法获得或可获得的具有TSC的至少一种特征的细胞分化而获得或可获得，和/或

-衍生自表现出ST或EVT的至少一种特征的细胞或细胞群的类器官，其中该细胞通过使根据本发明的第二方面的方法获得或可获得的具有TSC的至少一种特征的细胞分化而获得或可获得；

和

-药学上可接受的载剂或赋形剂。

本发明进一步提供了一种组合物，该组合物包含顺势疗法剂或膳食补充剂，该顺势疗法剂或膳食补充剂衍生自：

-表现出TSC的至少一种特征的细胞或细胞群，其中该细胞根据本发明的第二方面的方法获得或可获得，和

-表现出ST或EVT的至少一种特征的细胞或细胞群，其中该细胞通过使根据本发明的第二方面的方法获得或可获得的具有TSC的至少一种特征的细胞分化而获得或可获得，和

-衍生自表现出ST或EVT的至少一种特征的细胞或细胞群的类器官，其中该细胞通过使根据本发明的第二方面的方法获得或可获得的具有TSC的至少一种特征的细胞分化而获得或可获得。

在本文所述的本发明的第二方面的任何方法中，该方法可进一步包括施用以下项：

-根据本发明的第二方面的方法制备的表现出TSC的至少一种特征的细胞，或

-细胞群，该细胞群包含根据本发明的第二方面的方法制备的表现出TSC的至少一种特征的细胞，或

-从根据本发明的第二方面的方法制备的表现出TSC的至少一种特征的细胞获得的分化细胞或分化细胞群，

至有需要的受试者的步骤。

在一些实施例中，提供了一种增强胎盘或胚泡的方法，该方法包括向胎盘或胚泡中引入：

-根据本发明的第二方面的方法生成的表现出TSC的至少一种特征的细胞；

-从根据本发明的第二方面的方法制备的表现出TSC的至少一种特征的细胞获得的分化细胞或分化细胞群。

本发明还提供了一种从根据本发明的第二方面的方法制备的表现出TSC的至少一种特征的细胞获得的类器官和/或从根据本发明的第二方面的方法制备的表现出TSC的至少一种特征的细胞获得的分化细胞(例如ST或EVT)。

在该方面，本发明还提供了一种从TSC或由TSC生成的分化细胞获得或衍生的嵌合器官或类器官，其中该TSC根据本发明的第四方面的方法获得或可获得。

在进一步的方面，提供了一种治疗和/或预防有需要的受试者中与滋养层的发育和/或活性相关的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的根据如本文所述的本发明的第二方面的方法制备的表现出TSC的至少一种特征的细胞或细胞群、从根据如本文所述的本发明的第二方面的方法制备的表现出TSC的至少一种特征的细胞获得的分化的ST或EVT、或根据本发明的药物产品，由此治疗和/或预防该受试者中与滋养层的发育和/或活性相关的障碍。

本发明还提供了根据本发明的第二方面的方法产生的表现出TSC的至少一种特征的细胞或包含细胞的细胞群在制备用于治疗胎盘疾病/障碍的药物中的用途。例如，可将本发明的重编程细胞引入(移植)到个体中以便改善胎盘的疾病或病症。替代性地，可使表现出TSC的至少一种特征的细胞在用于制备如本文所述的药物之前分化。

在本发明的第二方面的任何实施例中，该疾病选自由以下各项组成的组：复发性流产、先兆子痫、胎儿生长受限(FGR)、葡萄胎和绒毛膜癌。本发明的本方面还提供了一种鉴定能够调节滋养层发育和/或活性的试剂的方法，该方法包括：

-使根据本发明制备的分离的TSC或胎盘与候选试剂接触；

-将与该试剂接触后的分离的TSC或胎盘的发育和/或活性与没有该试剂的TSC或胎盘的发育和/或活性进行比较

其中相对于没有该试剂的TSC或胎盘的发育，该试剂对TSC或胎盘的发育和/或活性的作用高于预定水平指示该试剂调节滋养层发育和/或活性。

在进一步的实施例中，提供了一种用于获得由滋养层产生的化合物的方法，该方法包括培养根据本发明的第二方面的方法获得或可获得的包含TSC的至少一种特征的细胞或细胞群、或包含该细胞或细胞群的培养物，并从培养基中分离由这些细胞分泌的化合物，由此获得由滋养层产生的化合物。

进一步的实施例提供了一种用于获得由EVT或ST分泌的化合物或颗粒的方法，该方法包括培养通过使根据本发明的第二方面的方法获得或可获得的包含TSC的至少一种特征的细胞分化而获得的ST或EVT、或ST或EVT的群体，并从培养基中分离由这些细胞分泌的化合物或颗粒，由此获得由EVT或ST产生的化合物或颗粒。

该化合物可以是激素或生长因子。由该细胞分泌的颗粒可以是胞外囊泡，诸如外泌体。

进一步的实施例还涉及用于产生根据本发明的第二方面的方法获得或可获得的表现出如本文所披露的TSC的至少一种特征的细胞的试剂盒。该试剂盒可包括体细胞、重编程因子和如根据本发明的第二方面所披露的TSC培养基。优选地，该试剂盒可用于产生表现出TSC的至少一种特征的细胞。优选地，该试剂盒可与体细胞一起使用，该体细胞是成纤维细胞。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括用于根据如本文所披露的方法将体细胞重编程为表现出TSC的至少一种特征的细胞的说明书。优选地，本发明提供了在本文所述的本发明的方法中使用的情况下的试剂盒。

该试剂盒还可包括一种或多种适于使TSC向EVT或ST命运或其他非胎盘分化细胞类型分化的试剂。

如本文所用，TSC也可称为TSC样细胞、iBlastoid(B)衍生的TSC(BTSC)细胞或iTSC。

在第三方面，本发明提供了一种细胞，该细胞表现出由如本文所述的体外衍生或生成的多层细胞结构或胚泡样结构(诸如类囊胚或iBlastoid)产生或分离的原始态多能干细胞(nPSC)的至少一种特征。多层细胞结构或胚泡样结构可通过本文所述的任何方法产生。

在该方面，本发明提供了一种产生人nPSC的方法，该方法包括；

-在饲养层上在用于促进细胞达到原始态多能状态的培养基存在下培养从多层细胞结构或胚泡样结构解离的单细胞，

由此产生nPSC。

-将如本文所述的多层细胞结构或胚泡样结构解离成单细胞，

-在饲养层上在用于促进细胞达到原始态多能状态的培养基存在下培养这些单细胞，

由此产生nPSC。

在该方面，用于促进原始态多能状态的培养基包含MEK抑制剂、PKC抑制剂、GSK3抑制剂、STAT3激活剂和ROCK抑制剂。示例性MEK抑制剂、PKC抑制剂、GSK3抑制剂、STAT3激活剂和ROCK抑制剂在本文中描述。在一个实施例中，用于促进原始态多能状态的培养基是t2iLGoY培养基，例如如本文所定义。

在该方面，本发明提供了一种培养或维持人nPSC细胞的方法，该方法包括：

-使存在于饲养层上的nPSC解离；

-在用于促进细胞朝向原始态多能状态发展的培养基存在下将这些解离的细胞以1:10至1:20的分裂比接种到饲养层上，

由此培养或维持人nPSC。

优选地，nPSC每3、4、5或6天解离或传代一次。优选地，根据本发明的第三方面的方法获得用于培养或维持的nPSC。

可通过培养根据本文所述的任何方法获得的任何体外衍生的多层细胞结构或胚泡样结构，并使nPSC在nPSC培养基中增殖来生成nPSC。

在本发明的该方面的任何实施例中，解离nPSC的步骤包括使细胞与酶或酶组合物接触。可使用适于促进细胞脱离或使在聚集培养物中生长的细胞解离的包含蛋白水解酶和/或胶原溶解酶的任何酶或酶组合物。在任何实施例中，酶组合物可以是displase、胶原酶、EDTA、胰蛋白酶或

在该方面，任何方法可进一步包括分离表现出nPSC的至少一种特征的细胞的步骤。

因此，在该方面的进一步的实施例中，提供了一种通过如本文所述的本发明的第三方面的任何方法可获得或获得的分离的nPSC。

在该方面，本发明还提供了一种通过如本文所述的本发明的第三方面的方法产生的表现出nPSC的至少一种特征的细胞。

在进一步的实施例中，表现出nPSC的至少一种特征的细胞当在传代培养物中维持时保持其未分化状态。

如本文所用，“原始态多能状态”或“原始态多能表型”也可理解为是指包括圆形、圆顶形细胞的细胞形态或表型。原始态多能状态还可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23种或所有标志物的表达，这些标志物选自：KLF2、KLF4、TFCP2L1、TBX3、REX1、GBX2、STELLA(DPPA3)、KLF17、DPPA5、TFCP2L1、MAEL、UTF1、ZFP57、DNMT3L、FGF4、FOXR1、ARGFX、TRIM60、DDX43、BRDT、ALPPL2、KHDC3L、KHDC1L、PRAP1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、SOX2、E-钙粘蛋白、UTF-1、OCT4(POU5F1)、REX1和NANOG或如本文所述的原始态多能性的其他标志物，包括在表5中。任何这些形态学、表型或生物化学标志物在本文中均被称为nPSC的特征。

在进一步的实施例中，表现出nPSC的至少一种特征的细胞的特征在于不存在表征体细胞的标志物。在某些实施例中，表现出nPSC的至少一种特征的细胞不表达以下标志物中的一种或多种：ANPEP、TWIST2、ZIC2、SFRP2、KRT7、ITGA2。

优选地，具有nPSC的至少一种特征的细胞在至少5、至少10、至少15、至少20、至少40或更多次细胞培养传代中保持nPSC的至少一种特征。

在该方面的任何方法中，该方法可进一步包括扩增表现出nPSC的至少一种特征的细胞以增加群体中表现出nPSC的至少一种特征的细胞的比例的步骤。扩增细胞的步骤可包括在如下所述的用于生成细胞群的条件下培养细胞足够的时间。

在该方面，本发明还提供了一种包含通过本文所述的本发明的任何方法获得或可获得的nPSC的细胞群。优选地，至少5％的细胞表现出nPSC的至少一种特征，并且这些细胞通过如本文所述的方法产生。优选地，该群中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞表现出nPSC的至少一种特征，并且这些nPSC通过如本文所述的本发明的第三方面的方法获得或可获得。

在该方面的任何方法中，该方法进一步包括使通过本文所述的本发明的任何方法获得或可获得的nPSC分化的步骤。分化细胞的步骤可包括在生成具有分化细胞或不处于多能状态的细胞的至少一种特征的细胞的条件下培养nPSC足够的时间。

因此，在本发明的该第三方面的进一步的实施例中，提供了一种由通过本文所述的本发明的第三方面的任何方法获得或可获得的nPSC产生的分化细胞。在进一步的实施例中，提供了一种由通过本文所述的本发明的任何方法获得或可获得的nPSC产生的分离的分化细胞。此外，本发明提供了一种细胞群，该细胞群包含由通过本文所述的本发明的第三方面的任何方法获得或可获得的nPSC产生的分化细胞。

在进一步优选的实施例中，提供了一种细胞群，其中至少5％的细胞是分化细胞，并且这些分化细胞由通过如本文所述的本发明的第三方面的方法获得或可获得的nPSC产生。优选地，该群中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞是分化细胞，并且这些分化细胞由通过如本文所述的本发明的第三方面的方法获得或可获得的nPSC产生。

在本发明的第三方面的进一步的实施例中，还提供了一种衍生自nPSC/由nPSC生成的分化细胞群的细胞的类器官或其他组织化集合，其中该nPSC根据本发明的第三方面的方法获得或可获得。

在该方面，本发明还提供了一种从nPSC或由nPSC生成的分化细胞获得或衍生的嵌合器官或类器官，其中该nPSC根据本发明的第四方面的方法获得或可获得。

在进一步的实施例中，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含：

-表现出nPSC的至少一种特征的细胞，其中该细胞根据本发明的第三方面的方法获得或可获得，和

-药学上可接受的载剂或赋形剂。

-表现出nPSC的至少一种特征的细胞或细胞群，其中该细胞根据本发明的第三方面的方法获得或可获得

-根据本发明的第三方面的方法获得或可获得的分离的nPSC或nPSC群；

-衍生自根据本发明的第三方面的方法获得或可获得的一种或多种nPSC的分离的分化细胞或分化细胞群；或

-衍生自nPSC/由nPSC生成的分化细胞群的类器官，其中该nPSC根据本发明的第三方面的方法获得或可获得；

和药学上可接受的载剂或赋形剂。

此外，提供了一种治疗需要施用nPSC或细胞群的疾病或病症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用：

还提供了根据本发明的第三方面的方法获得或可获得的nPSC在制备用于治疗需要施用多能干细胞或由其衍生的分化细胞的疾病或病症的药物中的用途。

进一步的实施例涉及用于产生表现出根据如本文所披露的第三方面获得或可获得的nPSC的至少一种特征的细胞的试剂盒。在一些实施例中，该试剂盒包括体细胞、重编程因子和如本文所披露的用于促进原始态多能状态的培养基。优选地，该试剂盒可用于产生表现出nPSC的至少一种特征的细胞。优选地，该试剂盒可与体细胞一起使用，该体细胞是成纤维细胞。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括用于根据如本文所披露的本发明的第三方面的方法将体细胞重编程为表现出nPSC的至少一种特征的细胞的说明书。优选地，本发明提供了当用于本文所述的本发明的第三方面的方法中时的试剂盒。此外，该试剂盒可包括用于使根据本发明的第三方面的方法产生的nPSC分化的书面说明书和/或试剂。

如本文所用，nPSC也可称为nPSC样细胞、iBlastoid(B)衍生的nPSC(BnPSC或原始态BPSC)或inPSC。

在第四方面，本发明提供了一种细胞，该细胞表现出由如本文所述的体外衍生或生成的多层细胞结构或胚泡样结构(诸如类囊胚或iBlastoid)产生或分离的始发态(primed)多能干细胞(pPSC)的至少一种特征。多层细胞结构或胚泡样结构可通过本文所述的任何方法产生。

在该方面，本发明提供了一种产生人pPSC的方法，该方法包括；

-在玻连蛋白层上在用于促进细胞达到始发态多能状态的培养基存在下培养从多层细胞结构或胚泡样结构解离的单细胞，

由此产生pPSC。

-将如本文所述的多层细胞结构或胚泡样结构解离成单细胞，

-在用于促进细胞达到始发态多能状态的培养基存在下在包含一种或多种细胞外基质(ECM)蛋白的层上培养这些单细胞，

由此产生pPSC。

在该方面，包含一种或多种细胞外基质(ECM)蛋白的层包含玻连蛋白或包含基底膜提取物(BME)的培养基质，任选地基质胶或geltrex培养基质。

在该方面，用于促进始发态多能状态的培养基包括本文所述的任何培养基，包括在表1中。

在该方面，提供了一种培养或维持人pPSC细胞的方法，该方法包括

-使存在于ECM层上的pPSC解离；

-在用于促进细胞达到始发态多能状态的培养基存在下将这些解离的细胞以1:20至1:40的分裂比接种到包含一种或多种细胞外基质(ECM)蛋白的层上，

由此培养或维持人pPSC。

优选地，pPSC每3、4、5或6天解离或传代一次。优选地，根据本发明的第四方面的方法获得用于培养或维持的pPSC。

优选地，包含一种或多种细胞外基质(ECM)蛋白的该层包含玻连蛋白，或包含基底膜提取物(BME)、任选地基质胶或geltrex的培养基质。

可通过培养根据本文所述的任何方法获得的任何体外衍生的多层细胞结构或胚泡样结构，并使pPSC在pPSC培养基中增殖来生成pPSC。

在本发明的该方面的任何实施例中，解离pPSC的步骤包括使细胞与酶或酶组合物接触。可使用适于促进细胞脱离或使在聚集培养物中生长的细胞解离的包含蛋白水解酶和/或胶原溶解酶的任何酶或酶组合物。在任何实施例中，酶组合物可以是displase、胶原酶、EDTA、胰蛋白酶或

在该方面，任何方法可进一步包括分离表现出pPSC的至少一种特征的细胞的步骤。

因此，在该方面的进一步的实施例中，提供了一种通过本文所述的任何方法可获得或获得的分离的pPSC。

在该方面，本发明还提供了一种表现出通过如本文所述的方法产生的pPSC的至少一种特征的细胞。

在进一步的实施例中，表现出pPSC的至少一种特征的细胞当在传代培养物中维持时保持其未分化状态。

如本文所用，“始发态多能状态”或“始发态多能表型”通常是指以扁平细胞集落的存在为特征的细胞表型或形态。在某些实施例中，始发态多能状态是指表达植入后上胚层特异性转录因子的一种或多种mRNA的多能细胞。例如，始发态细胞可表达以下中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或全部：SFP、EOMES、BRACHYURY、OTX2、ZIC2、ZIC3、ZIC5、DNMT3B、KDR、CDH2、CER1、COL2A1、DAZL、TCF7L1、SOX11、SALL2、SOX2、NANOG、KLF4、EPCAM、PRDM14、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、E-钙粘蛋白、UTF-1、OCT4(POU5F1)和REX1或如本文所述的始发态多能状态的其他标志物，包括在表5中。任何这些形态学、表型或生物化学标志物在本文中均被称为pPSC的特征。

在进一步的实施例中，表现出pPSC的至少一种特征的细胞的特征在于不存在表征体细胞的标志物。在某些实施例中，表现出pPSC的至少一种特征的细胞不表达以下标志物中的一种或多种：ANPEP、TWIST2、KLF17、DNMT3L、KRT7、ITGA2

优选地，具有pPSC的至少一种特征的细胞在至少5、至少10、至少15、至少20、至少40或更多次细胞培养传代中保持pPSC的至少一种特征。

在该方面的任何方法中，该方法可进一步包括扩增表现出pPSC的至少一种特征的细胞以增加群体中表现出pPSC的至少一种特征的细胞的比例的步骤。扩增细胞的步骤可包括在如下所述的用于生成细胞群的条件下培养细胞足够的时间。

在该方面，本发明还提供了一种包含通过如本文所述的本发明的第四方面的任何方法获得或可获得的pPSC的细胞群。优选地，至少5％的细胞表现出pPSC的至少一种特征，并且这些细胞通过如本文所述的方法产生。优选地，该群中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞表现出pPSC的至少一种特征，并且这些pPSC通过如本文所述的本发明的第四方面的方法获得或可获得。

在该方面的任何方法中，该方法进一步包括使通过本文所述的本发明的第四方面的任何方法获得或可获得的pPSC分化的步骤。分化细胞的步骤可包括在生成具有分化细胞或不处于多能状态的细胞的至少一种特征的细胞的条件下培养pPSC足够的时间。

因此，进一步的实施例提供了一种由通过本文所述的本发明的方法的第四方面获得或可获得的pPSC产生的分化细胞。在进一步的实施例中，提供了一种由通过如本文所述的本发明的第四方面的方法获得或可获得的pPSC产生的分离的分化细胞。此外，还提供了一种细胞群，该细胞群包含由通过本文所述的本发明的第四方面的任何方法获得或可获得的pPSC产生的分化细胞。优选地，本发明提供了一种细胞群，其中至少5％的细胞是分化细胞，这些分化细胞由通过如本文所述的本发明的第四方面的方法获得或可获得的pPSC产生。优选地，该群中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞是分化细胞，并且这些分化细胞由通过如本文所述的本发明的第四方面的方法获得或可获得的pPSC产生。

在该方面，本发明还提供了一种衍生自pPSC/由pPSC生成的分化细胞群的细胞的类器官或其他组织化集合，其中该pPSC根据本发明的第四方面的方法获得或可获得。

此外，本发明还提供了一种从pPSC或由pPSC生成的分化细胞获得或衍生的嵌合器官或类器官，其中该pPSC根据本发明的第四方面的方法获得或可获得。

在本发明的第四方面的进一步的实施例中，还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含：

-表现出pPSC的至少一种特征的细胞，其中该细胞根据本发明的第四方面的方法获得或可获得，和

-药学上可接受的载剂或赋形剂。

-表现出pPSC的至少一种特征的细胞或细胞群，其中该细胞根据本发明的第四方面的方法获得或可获得；

-根据本发明的第四方面的方法获得或可获得的分离的pPSC或pPSC群；

-衍生自根据本发明的第四方面的方法获得或可获得的一种或多种pPSC的分离的分化细胞或分化细胞群；或

-衍生自pPSC/由pPSC生成的分化细胞群的类器官，其中该pPSC根据本发明的第四方面的方法获得或可获得；

和药学上可接受的载剂或赋形剂。

此外，本发明的本方面提供了一种治疗需要施用pPSC或细胞群的疾病或病症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用：

-衍生自pPSC群/由pPSC生成的分化细胞群的类器官，其中这些pPSC根据本发明的第四方面的方法获得或可获得；

本发明还提供了根据本发明的第四方面的方法获得或可获得的pPSC在制备用于治疗需要施用多能干细胞或由其衍生的分化细胞的疾病或病症的药物中的用途。

本发明还涉及用于产生表现出如本文所披露的pPSC的至少一种特征的细胞的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包含体细胞、重编程因子和如本文所披露的用于促进始发态多能状态的培养基。优选地，该试剂盒可用于产生表现出pPSC的至少一种特征的细胞。优选地，该试剂盒可与体细胞一起使用，该体细胞是成纤维细胞。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括用于根据如本文所披露的本发明的第四方面的方法将体细胞重编程为表现出pPSC的至少一种特征的细胞的说明书。优选地，本发明提供了当用于本文所述的本发明的第四方面的方法中时的试剂盒。此外，该试剂盒可包括用于使根据本发明的第四方面的方法产生的pPSC分化的书面说明书和/或试剂。

如本文所用，pPSC也可称为pPSC样细胞、iBlastoid(B)衍生的pPSC(BpPSC或始发态BPSC)或ipPSC。

在本文的任何方面，包括第一方面、第二方面、第三方面或第四方面中的任一方面，该方法进一步包括生成多层细胞结构或胚泡样结构(诸如类囊胚或iBlastoid)的步骤。

在本文的任何方面，包括第一方面、第二方面、第三方面或第四方面中的任一方面，生成多层细胞结构或胚泡样结构的方法包括如本文进一步描述的任何方法。

在本文的任何方面，包括第一方面、第二方面、第三方面或第四方面中的任一方面，衍生自、分离自或获自多细胞结构或胚泡样结构的细胞或细胞群能够自我更新。换句话讲，衍生自、分离自或获自多细胞结构或胚泡样结构的细胞或细胞群的特征在于它们可在培养物中维持。

如本文所用，除非上下文另有要求，否则术语“包含(comprise)”和该术语的变型诸如“包含(comprising/comprises/comprised)”不旨在排除另外的添加物、组分、整体或步骤。

本发明的其他方面和在前述段落中描述的方面的其他实施例将从通过实例并参考附图给出的以下描述中变得显而易见。

附图说明

图1.通过重编程生成人iBlastoid。a，重编程和iBlastoid衍生化实验设计。b，iBlastoid的相衬图像(n＝5)。比例尺，50μm。c，iBlastoid对于NANOG的相衬和免疫染色图像(n＝5)。比例尺，50μm。d-h，x轴和y轴直径、x/y纵横比、iBlastoid(n＝18)与人胚泡(Shahbazi,M.N.等人Nat.Cell Biol.[自然细胞生物学]18,700-708(2016)；Blakeley,P.等人Development[发育]142,3613(2015)；Petropoulos,S.等人Cell[细胞]165,1012-1026(2016)；Xiang,L.等人Nature[自然]577,537-542(2020)；Qin,H.等人Cell Rep.[细胞报道]14,2301-2312(2016)；Liu,L.等人Nat.Commun.[自然通讯]10,364(2019)；Durruthy-Durruthy,J.等人Dev.Cell[发育细胞]38,100-115(2016)；Fogarty,N.M.E.等人Nature[自然]550,67-73(2017))(n＝8)相比的投影面积的测量。i，iBlastoid的总细胞数估计(n＝14)。j，对于CDX2和NANOG染色的iBlastoid的3D和2D表示(n＝5)。比例尺，20μm。k-l，显示如箭头所示的囊胚腔样腔的iBlastoid的代表性DIC表示和CDX2、NANOG免疫染色(n＝5)。比例尺，10μm。m，iBlastoid对于GATA2、OCT4和SOX2的免疫染色(n＝3)。比例尺，20μm。n，对于GATA2、NANOG和SOX17染色的iBlastoid，其中ICM样区室-变焦显示SOX17阳性PE样细胞(n＝2)。o，对于CDX2、OCT4和GATA6染色的iBlastoid，其中ICM样区室-变焦显示CDX2低和GATA6阳性PE样细胞(n＝2)。n-o的比例尺＝10μm。p-q，对于F-肌动蛋白和NANOG染色的iBlastoid的代表性图像，其中EPI样和TE样细胞放大(q)突出它们的形态差异(n＝2)。r，(p)中基于F-肌动蛋白(浅蓝色)和NANOG(橙色)的iBlastoid的3D分割。p-r的比例尺＝10μm用于完整iBlastoid，2μm用于ICM缩放。s，F-肌动蛋白、OCT4和KRT8共染色，n＝2。

图2.iBlastoid的生成和表征。a，第21天重编程中间体的scRNA-seq分析显示存在EPI、TE和PE样群体。b，iBlastoid形成的时程相衬图像(n＝5)。比例尺，100μm。c，具有腔形成的iBlastoid的定量(n＝100)。比例尺，20μm。d，iBlastoid形成期间粘附于微孔边缘的难处理HDFa的代表性相衬图像，其在具有典型成纤维细胞形态的成纤维细胞培养基中增殖(n＝2)。比例尺，100μm。e，对于CDX2和NANOG染色的iBlastoid的3D和2D表示(n＝5)。比例尺，20μm。f，对于GATA2、NANOG和SOX17染色的iBlastoid(n＝2)。g，对于CDX2、OCT4和GATA6染色的iBlastoid(n＝2)。比例尺，对于f-g为20μm。h，第21天重编程细胞中不同现有细胞群的定量；n＝3。i，用于iBlastoid评分的评估标准。j，被包括用于评分评估的iBlastoid的相衬图像，n＝24。比例尺，100μm。k，根据(h)的(i)中iBlastoid的ICM和TE的平均等级，n＝24。

图3.iBlastoid的单细胞转录组谱分析。a，使用iBlastoid的scRNA-seq实验的实验设计。b，来自iBlastoid scRNA-seq文库的6858个细胞的EPI标志物(POU5F1和NANOG)、TE标志物(CDX2和GATA2)和PE标志物(SOX17和GATA6)的表达。c，iBlastoid scRNA-seq数据集的UMAP上的EPI、TE和EPI签名的每细胞表达评分。d，具有指定聚类名称的iBlastoid数据集的无监督聚类。e，显示iBlastoid EPI、TE和PE细胞以及来自胚泡的EPI、TE和PE细胞的整合数据集的UMAP投影(Blakeley和Petropoulos)。f，整合数据集的EPI、TE和PE签名的每细胞表达评分。g，具有指定聚类名称的整合数据集的无监督聚类。h，整合分析前每个整合聚类内具有相应原始细胞ID的iBlastoid和人胚泡数据集(Blakeley和Petropoulos)的细胞比例。i，iBlastoid EPI、TE和PE聚类与来自胚泡的注释EPI、TE和PE聚类的皮尔逊相关性分析(Blakeley和Petropoulos)。j、k，iBlastoid scRNA-seq TE聚类上限定的壁TE签名和极TE签名的每细胞表达评分。l，沿UMAP分量1的壁TE签名和极TE签名的分箱亚型评分。m，iBlastoid对于CCR7的免疫染色，n＝4。比例尺，20μm。n，iBlastoid上极TE和壁TE的CCR7荧光强度，n＝4。每个框内的线表示中值，并且晶须分别表示最大值和最小值。

图4.scRNA-seq管线和质量控制。a，scRNA-seq分析策略(详见方法)。b，iBlastoid的供体细胞分布的UMAP表示。c，iBlastoid scRNA-seq文库的细胞周期的UMAP表示。d，仙台-KLF4、仙台-KOS和仙台-MYC在iBlastoid中的表达。e，Petropoulos scRNA-seq文库(Petropoulos)的EPI标志物(POU5F1和NANOG)、TE标志物(CDX2和GATA2)和PE标志物(SOX17和GATA6)的表达。f、g，iBlastoid数据集的UMAP上非重编程签名的表达和IFI27表达。

图5.胚泡和iBlastoid上确定的E5-7 EPI、TE和PE签名评分。a，PetropoulosscRNA-seq数据集(Petropoulos)上E5、E6和E7发育日的确定的EPI、TE和PE签名。b，iBlastoid scRNA-seq数据集上E5、E6和E7发育日的确定的EPI、TE和PE签名。

图6.iBlastoid和胚泡数据集的scRNA-seq分析。a，来自每个供体的细胞在所有指定聚类中的比例。b，显示iBlastoid scRNA-seq数据集中每个指定聚类(每个聚类前10个基因)的基因表达谱的热图。c，显示整合数据集中iBlastoid和胚泡(Blakeley和Petropoulos)的细胞分布的UMAP投影。d，iBlastoid和E5-7胚泡(Blakeley和Petropoulos)的整合数据集的EPI标志物(POU5F1和NANOG)、TE标志物(CDX2和GATA2)和PE标志物(SOX17和GATA6)的表达。e，iBlastoid EPI、TE和PE聚类与来自胚泡(Blakeley和Petropoulos)的注释EPI、TE和PE聚类的皮尔逊相关性分析。

图7.使用iBlastoid模拟人体外植入。a，iBlastoid在附着第1、3和4.5天的代表性相衬图像(n＝5)。比例尺，100μm，b，GATA2、NANOG和SOX17共染色，n＝2。c，CDX2、OCT4和GATA6共染色，n＝2。d，F-肌动蛋白、OCT4和aPKC共染色，其中前羊膜样腔由箭头指示，n＝2。e，KRT7和NANOG共染色，n＝4。f，F-肌动蛋白和NANOG共染色，指示了上胚层样细胞和推定的ST以及EVT，n＝2。g，MMP2和hCG共染色，n＝2。比例尺，50μm；10μm用于放大。h，附着的iBlastoid中ST和EVT标志物的qRT-PCR分析，平均值±标准误差，n＝5。i，使用从附着的iBlastoid收集的条件培养基通过hCG ELISA检测到的hCG蛋白水平，平均值±标准误差，n＝4。

图8.附着的iBlastoid中的上胚层发育的评估。a，iBlastoid体外附着测定的实验设计示意图。b，在附着测定中直至第5天的iBlastoid中原始条纹标志物(TBXT、EOMES和MIXL1)的时程qRT-PCR分析。TBXT、EOMES和MIXL1的阳性对照使用先前公布的中胚层分化方案生成(Lam等人,2014,J.Am.Soc.Nephrol[美国肾脏学会期刊])(n＝6)。c，对于CDX2和NANOG染色的附着的iBlastoid(n＝5)。d，对于GATA2、OCT4和SOX2染色的附着的iBlastoid(n＝3)。e，对于NANOG和SOX17染色的附着的iBlastoid的放大视图(n＝2)。f，对于OCT4和GATA6染色的附着的iBlastoid的放大视图(n＝2)。c-f的比例尺，100μm。g，具有前羊膜腔的放大视图的用F-肌动蛋白、OCT4和aPKC染色的附着的iBlastoid的Z切片系列，n＝2。比例尺，20μm。h，iBlastoid、第1天附着的iBlastoid和第3天附着的iBlastoid对于F-肌动蛋白、OCT4和aPKC的免疫染色，n＝2。比例尺，20μm。前羊膜样腔的外观用箭头标记。i，iBlastoid和附着的iBlastoid对于KRT7和NANOG的免疫染色，n＝4。j，对于F-肌动蛋白和NANOG染色的附着的iBlastoid，n＝2。k，iBlastoid和附着的iBlastoid对于MMP2和hCG的免疫染色，n＝2。

图9.由iBlastoid衍生干细胞。a，用于衍生原始态bPSC、始发态bPSC和bTSC的实验设计。原始态bPSC(b、c)、始发态bPSC(d、e)和bTSC(f、g)的相衬和免疫染色分析。n＝2。所有比例尺，100μm。

图10.(a)具有GFP报道分子的原始态iPSC。比例尺：100μm。(b)：具有mCherry报道分子的iTSC。比例尺：100μm。(c)：原始态iPSC和iTSC的组装。比例尺：20μm。(d)：仅原始态iPSC的组装。比例尺：20μm。(e)：仅iTSC的组装。比例尺：20μm。(f)：使用多能性标志物OCT4和TSC标志物KRT7对原始态iPSC和iTSC、仅原始态iPSC和仅iTSC的组装结构进行免疫染色。比例尺：20μm。(g)：使用多能性标志物NANOG和TSC标志物CDX2对仅原始态iPSC的组装结构进行免疫染色。比例尺：20μm。

图11.衍生自iBlastoid的干细胞的表征。a，用于表征原始态bPSC、始发态bPSC和bTSC的实验设计的示意图。b，原始态bPSC对KLF17和NANOG、始发态bPSC对TRA160和NANOG以及bTSC对KRT7和GATA2的免疫染色，n＝2。c，原始态bPSC对原始态多能性标志物、始发态bPSC对始发态多能性标志物以及bTSC对TSC标志物的qRT-PCR分析，平均值±标准误差，n＝4。d、e，由#始发态bPSC和始发态bPSC衍生的EB，n＝2。#指示由原始态bPSC生成的始发态bPSC。f，来自#始发态bPSC和始发态bPSC的EB的评分卡测定分析，n＝2。g、h，#始发态bPSC和始发态bPSC分化成外胚层、内胚层和中胚层谱系，n＝2。i，bTSC分化的EVT对于HLA-G的免疫染色(n＝来自2个供体的2个实验重复)。j，bTSC分化的ST对于SDC1的免疫染色，n＝2。k，针对EVT标志物(ITGA1、ITGA5、FN1)的对bTSC分化的EVT的qRT-PCR分析，平均值±标准误差，n＝4。l，针对ST标志物(CSH1、SDC1、HSD3B1)的对bTSC分化的ST的qRT-PCR分析，平均值±标准误差，n＝4。m，bTSC分化的ST的融合指数，平均值±标准误差，n＝12，通过双尾未配对学生t检验的p值。n，使用从bTSC分化的ST收集的条件培养基通过hCG ELISA检测到的hCG蛋白水平，平均值±标准误差，n＝2-3。所有比例尺，100μm。

图12.当在其他培养条件下重编程时EPI、TE和PE样细胞的比例的评估。将D8重编程中间体转移到a)NACL培养基和b)PA培养基和c)t2iLGo培养基中，并在重编程的第21天评估EPI、TE和PE样细胞的比例。选择GATA3作为TE样细胞的标志物，GATA6作为PE样细胞的标志物并且KLF17作为EPI样细胞的标志物。比例尺，100μm。

图13.第21天经由mRNA介导的重编程由人成纤维细胞生成的重编程细胞。a，在第21天由人成纤维细胞的4x OKSMNL mRNA转染生成的重编程细胞的OCT4、GATA6和CDX2的免疫染色分析。b，在第21天由人成纤维细胞的4x OKSMNL mRNA转染生成的重编程细胞的GATA2、NANOG和SOX17的免疫染色分析。c，在第21天由人成纤维细胞的6x OKSMNL mRNA转染生成的重编程细胞的OCT4、GATA6和CDX2的免疫染色分析。d，在第21天由人成纤维细胞的6xOKSMNL mRNA转染生成的重编程细胞的GATA2、NANOG和SOX17的免疫染色分析。

图14.第21天经由仙台病毒介导的重编程由人间充质干细胞(hMSC)生成的重编程细胞。a，在第21天由hMSC生成的重编程细胞的OCT4、GATA6和CDX2的免疫染色分析。b，第21天由hMSC生成的重编程细胞的GATA2、NANOG和SOX17的免疫染色分析。

图15.第18天和第21天经由仙台病毒介导的重编程由人外周血单核细胞(hPBMC)生成的重编程细胞。a，在第18天由hPBMC在StemPro34培养基中生成的重编程细胞的OCT4、GATA6和CDX2的免疫染色分析。b，在第21天由hPBMC在StemPro34培养基中生成的重编程细胞的OCT4、GATA6和CDX2的免疫染色分析。c，在第18天由hPBMC在补充有10％ FBS的StemPro34培养基中生成的重编程细胞的OCT4、GATA6和CDX2的免疫染色分析。d，在第18天由hPBMC在补充有10％ FBS的StemPro34培养基中生成的重编程细胞的GATA2、NANOG和SOX17的免疫染色分析。e，在第21天由hPBMC在补充有10％ FBS的StemPro34培养基中生成的重编程细胞的OCT4、GATA6和CDX2的免疫染色分析。f，在第21天由hPBMC在补充有10％FBS的StemPro34培养基中生成的重编程细胞的GATA2、NANOG和SOX17的免疫染色分析。

具体实施方式

现在将详细地参照本发明的某些实施例。虽然本发明将结合实施例来进行描述，但是应当理解的是，不意图将本发明限于那些实施例。相反，本发明旨在涵盖可以包括在如权利要求所限定的本发明范围内的所有替代性方案、修改方案以及等同方案。

本领域技术人员应认识到类似于或等同于本文所述的那些的可以在本发明的实践中使用的许多方法和材料。本发明绝不限于所述的方法和材料。应当理解，在本说明书中披露和限定的本发明扩展到从文本或附图中提及或显而易见的两个或更多个单独特征的所有替代性组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各种替代性方面。

为了解释本说明书，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。

诸位发明人已开发了一种新的培养方法，该方法源自人类体细胞(例如成纤维细胞)可直接被重编程为人多层细胞结构或胚泡样结构(在此也称为iBlastoid)的意外发现，其如实地在体外再现了人胚泡的形态、空间相互作用和分子组成。此外，根据诸位发明人的方法制备的iBlastoid可用于对早期人胚胎发育的许多方面进行建模，如通过使用人胚胎附着培养物的体外附着测定所证实的。

此外，诸位发明人已开发了在培养物中建立和维持自我更新细胞的方法，这些自我更新细胞表现出衍生自多层细胞结构或胚泡样结构的胚外内胚层干(XEN)细胞、滋养层干细胞(TSC)、原始态多能干细胞(nPSC)和始发态多能干细胞(pPSC)的一种或多种特征。

有利地，根据本发明的方法获得XEN细胞、TSC、nPSC和pPSC避免了与以其他方式从人胚胎衍生这些细胞类型相关的道德和伦理挑战。此外，与从重编程体细胞获得的其他干细胞不同，根据本发明的方法制备的干细胞在三维环境中发育，被正常人类发育中存在的细胞包围，并且处于正确的空间取向。因此，根据本发明的方法获得的干细胞比使用其他方法制备的其他重编程细胞更如实地与其天然存在的对应物保持一致。

如本文所用，XEN样细胞也可称为XEN细胞。XEN样和XEN细胞两者也可称为iBlastoid(B)衍生的XEN(BXEN)细胞或iXEN细胞。(BXEN)细胞或iXEN细胞为胚胎发育提供营养和支持，并且是胚胎模式、生殖细胞发育和胎儿造血干细胞形成所需的。因此，(BXEN)细胞或iXEN细胞及其衍生物可与滋养层类器官整合以形成复杂的胚外类器官系统(人工胎盘和卵黄囊)以支持体外胚胎生长。iXEN细胞可衍生自患有与PE发育和卵黄囊功能相关的遗传疾病的患者，并且其可充当用于疾病建模、药物筛选和潜在细胞疗法的模型。iXEN细胞可用于生成基于干细胞的人胚泡整合模型。此外，在理论上，XEN细胞产生胎儿造血干细胞的潜力可用于生成用于移植的造血细胞。

细胞

胚泡由以下三个细胞谱系组成：上胚层、滋养外胚层和原始内胚层。上胚层发育成大部分胚体、羊膜和卵黄囊的胚外中胚层；滋养外胚层最终产生胎盘；并且原始内胚层形成两个胚外内胚层谱系-卵黄囊的内脏内胚层和脏壁内胚层。胚外内胚层为胚胎提供营养支持，并且是若干诱导事件诸如内皮细胞和血岛的前轴模式化和形成所需的。

衍生自这三种细胞谱系的干细胞包括：衍生自上胚层的多能干细胞(原始态和始发态；nPSC和pPSC)、衍生自滋养外胚层的滋养层干细胞(TSC)和衍生自原始内胚层的胚外内胚层干细胞(XEN细胞)。这些细胞的常规来源是胚泡期胚胎，尽管本领域的研究人员已进行了各种尝试以将体细胞重编程为这些不同的干细胞系。本发明的方法使得能够从iBlastoid(如本文所述)衍生XEN细胞、TSC、nPSC和pPSC。迄今为止，还没有报道从胚泡衍生人XEN或XEN样细胞。

如本文所用，术语“干细胞”是指非终末分化的细胞，即，它能够分化成具有更特定的特化功能的其他细胞类型。该术语涵盖胚胎干细胞、胎儿干细胞、成体干细胞或定向/祖细胞。

如本文所用，术语XEN细胞或XEN样细胞是指胚外内胚层干细胞或具有其一种或多种特征的细胞。XEN细胞可用于研究胚外内胚层谱系细胞的信号传导途径，并代表体外模型以鉴定胚外内胚层的模式化活性，诸如参与心脏诱导的因子。

如本文所用，XEN细胞的特征将被理解为包括以下标志物中的一种或多种的表达：XEN标志物，诸如SALL4、GATA4、GATA6和SOX17。XEN细胞的特征还可包括如表2中所示的PE谱系的标志物中的一种或多种或所有的表达。

如本文所用，XEN细胞或XEN样细胞的特征将被理解为包括：

-扁平内胚层形态；

-标志物GATA6、GATA4、PDGFRa、NID2和BMP6中的一种或多种的表达，

-不存在多能性标志物诸如NANOG的表达；

-ECM诸如纤连蛋白和核纤层蛋白的分泌；

-基膜组分诸如LAMA1、COL4A1和FN1的产生；

衍生自初级胎盘组织或人胚泡的人滋养层干细胞(TSC)难以接近并且受到高度调节。因此，具有可衍生自成体细胞的稳定自我更新TSC系不仅提供了研究人滋养层发育的独特机会，而且提供了其与多能细胞的关系及其在体外环境中协调与早期人胚胎发生相关的事件的作用，其中可大规模应用现代生物化学和分子技术。TSC系也可用于疾病建模、药物筛选和再生医学。

根据本发明产生的细胞还可用于多种其他临床应用，包括用于生成滋养层类器官以研究异生物质、药物和病原体、蛋白质和激素的母婴传播。此外，衍生自初级胎盘组织或由相同健康个体或患者的体细胞重编程的人TSC/iTSC和iPSC可用于组装人胚泡样结构。这为大规模筛选研究提供了无限来源的合成人胚泡样类器官，包括用于治疗不育症和提高IVF的成功率。更进一步地，根据本发明产生的iTSC可用于再生医学。例如，胎盘细胞最近已显示在再生心脏组织中是有用的。本发明的iTSC可用于生成此类胎盘细胞，而不需要直接从胎盘获得细胞。

与其他公布的从人胎盘或人胚胎衍生人TSC的方法相比，本发明用于生成人iTSC的方法更容易获得、劳动力和成本更有效而没有伦理限制。该方法允许无限地供应等基因iTSC以用于使用由患者生成的疾病特异性iTSC进行的大规模筛选研究。

在本发明的任何方面，可通过分析细胞形态、基因表达谱、活性测定、蛋白质表达谱、表面标志物谱、分化能力或它们的组合来确定TSC特征。特征或标志物的实例包括本文所述的和技术人员已知的那些。

TSC的一种或多种特征可包括任何一种或多种滋养层标志物的上调和/或细胞形态的改变。通常，转换为TSC的细胞将显示TSC的1、2、3、4、5、6、7、8种或更多种特征。

如本文所用，表现出根据本发明制备的TSC的至少一种特征的细胞也可称为“诱导性滋养层干细胞”或iTSC。

在本发明的任何实施例中，作为TSC的特征的蛋白质标志物包括：核CD49f(iTGA6)、CD249(氨肽酶A)、核NR2F2、TFAP2C、核GATA2/3和P63。

在进一步的实施例中，表现出TSC的至少一种特征的细胞不表达以下标志物中的一种或多种：OCT4(POU5F1)、NANOG、SOX2、SALL2、OTX2、BANCR、KLF17、DPPA3和DNMT3L。

此外，具有TSC的至少一种特征的细胞具有分化成表现出EVT或ST的一种或多种特征的细胞的能力。技术人员将熟悉EVT或ST细胞的特征。例如，EVT细胞的特征在于细长纺锤体样形态并表达以下标志物基因：HLA-G、MMP2。ST细胞的特征在于圆形、多核形态并表达以下标志物基因：hCG和SDC1。此外，TSC通常形成大的鹅卵石状集落。

技术人员将已知可用于确定细胞是否具有TSC的一种或多种特征的其他标志物。合适标志物的实例披露于例如Okae等人,(2018)Cell Stem Cell[细胞干细胞]22:50-63，Deglincerti等人,(2016)Nature[自然],533:751-4，Shahbazi等人,(2016Nature CellBiology[自然细胞生物学]18:700-708以及Niakan&Eggan(2013)Dev Biol[发育生物学]375:54-64)中，其全部内容以其全文并入本文。

本发明的方法还涉及用于获得原始态和始发态多能干细胞(nPSC和pPSC)的方法。

如本文所用，术语“多能”或“多能性”是指具有产生可在适当条件下经历分化成共同展示与来自所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特征的细胞类型的后代的能力的细胞。多能干细胞可促成产前、产后或成年动物的许多或所有组织。本领域所接受的标准试验，诸如在8-12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可用于建立细胞群的多能性，然而各种多能干细胞特征的鉴定也可用于检测多能细胞。

如本文所用，“原始态多能状态”或“原始态多能表型”应理解为是指包括圆形、圆顶形细胞的细胞表型。如本文所用，原始态多能状态是指植入前胚胎的多能状态。

如本文所用，“始发态多能状态”或“始发态多能表型”通常是指特征在于存在具有清晰边界的扁平细胞集落的细胞表型。如本文所用，始发态多能性状态是指更接近地类似于植入后胚胎的上胚层的多能状态。

如本文所用，提及“多能状态”、“多能干细胞特征”或“多能细胞的一种或多种特征”是指将多能干细胞与其他细胞区分开的细胞的特征。产生可在适当条件下经历分化成共同展示与来自所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特征的细胞类型的后代的能力是多能干细胞特征。分子标志物的某些组合的表达或不表达也是多能干细胞特征。例如，人多能干细胞表达来自以下非限制性列表的标志物中的至少一种、两种或三种以及任选地全部：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、SO2、E-钙粘蛋白、UTF-1、OCT4(POU5F1)、REX1和NANOG。

与多能干细胞相关的细胞形态也是多能干细胞特征。多能细胞的特征通常在于自我更新能力、产生三个胚层的细胞类型的能力和多能标志物诸如OCT4(POU5F1)、NANOG和SOX2的表达。多能细胞通常生长为具有清晰边界的扁平集落(当处于始发态状态时)或圆顶形集落(当处于原始态状态时)。这可与体细胞的形态例如大而细长的成纤维细胞形成对比。既由原始态多能细胞也由始发态多能细胞表达的标志物包括：OCT4(POU5F1)、SOX2、NANOG、KLF4、EPCAM和PRDM14。

仅由原始态多能细胞表达或仅由始发态多能细胞表达的标志物在本文的表5中列出。

技术人员熟悉关于干细胞的术语“原始态”和“始发态”。这些术语在十多年前被确定，以便描述上胚层个体发育的早期和晚期，并描述ESC和EpiSC衍生物。如本文所用，原始态多能状态指更接近类似于植入前胚胎的多能状态。在一些情况下，术语“原始态状态”与术语“基态”可互换使用。原始态状态细胞是同质多能干细胞的稳定自我更新培养物，与体细胞相比，其基本上在表观遗传学上是重排的，并且具有植入前上胚层的发育同一性和功能能力。

在某些实施例中，原始态多能细胞可表达植入前上胚层特异性转录因子的mRNA和蛋白质。例如，原始态细胞可表达以下中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25种或全部：KLF2、KLF4、TFCP2L1、TBX3、REX1、GBX2、STELLA(DPPA3)、KLF17、DPPA3、DPPA5、TFCP2L1、MAEL、UTF1、ZFP57、DNMT3L、FGF4、FOXR1、ARGFX、TRIM60、DDX43、BRDT、ALPPL2、KHDC3L、KHDC1L和PRAP1。指示原始态多能状态的其他标志物示于表5中。

在某些实施例中，始发态多能细胞可表达植入后上胚层特异性转录因子的mRNA和蛋白质。例如，始发态细胞可表达以下中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或全部：SFP、EOMES、BRACHYURY、OTX2、ZIC2、ZIC3、ZIC5、DNMT3B、KDR、CDH2、CER1、COL2A1、DAZL、TCF7L1、SOX11、SALL2。指示始发态多能状态的其他标志物示于表5中。

自鉴定原始态和始发态多能状态以来，已开发了适于将多能细胞维持在任一状态的许多不同培养基。技术人员将熟悉此类培养基，其实例在本文中进一步提供。

此外，原始态细胞可通过其形态来表征。原始态表型的特征通常在于紧密堆积的圆形圆顶外观。细胞也可描述为形成致密的折射集落。根据本发明的一个优选实施例，在第二培养基中培养的细胞在转移到第三培养基中时没有发展出原始态细胞的典型形态。

如本文进一步描述的，根据本发明的方法获得的细胞可分化成特定的细胞类型，包括技术人员已知的任何体细胞。

如本文所用，“体细胞”是指终末分化细胞。术语“体细胞”是指形成生物体的身体的任何细胞，与种系细胞相反。在哺乳动物中，生殖细胞(也称为“配子”)是精子和卵子，它们在受精过程中融合以产生称为受精卵的细胞，整个哺乳动物胚胎从受精卵发育。哺乳动物体内的每个其他细胞类型-除了精子和卵子、制造它们的细胞(配子母细胞)和未分化的干细胞之外-是体细胞：内脏器官、皮肤、骨骼、血液和结缔组织都是由体细胞构成。

衍生自本发明的干细胞的体细胞也可用于衍生类器官。如本文所用，类器官是器官特异性细胞类型的集合，其以类似于体内的方式从干细胞或器官祖细胞发育、通过细胞分选和空间限制性谱系定型自组织，并表现出包括以下的特性：多种器官特异性细胞类型；能够再现器官的一些特定功能(例如收缩、神经活性、内分泌、过滤、排泄)；它的细胞被分组在一起并在空间上被组织，类似于器官。类器官可用作研究基本生物学过程的工具，包括各种疾病过程、药物筛选和对不同环境刺激的反应。

细胞培养

在本发明的第一方面和第三方面，细胞与饲养细胞接触培养。示例性饲养细胞包括但不限于成纤维细胞，例如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。在饲养细胞上培养细胞的方法是本领域已知的。

在本发明的一些方面，例如第二方面和第四方面，在不存在饲养细胞的情况下培养细胞。例如，细胞可例如经由分子系链直接附着到固体培养表面(例如，培养板)。诸位发明人已发现，与在饲养细胞上培养的其他方面相同处理的细胞的效率相比，当细胞直接附着到固体培养表面时，培养被诱导为多能性的细胞具有大得多的诱导多能性的效率(即，更大部分的细胞实现多能性)。示例性分子系链包括但不限于基质胶、细胞外基质(ECM)、ECM类似物、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白或胶原。然而，本领域技术人员将认识到，这是非限制性列表，并且其他分子也可用于将细胞附着到固体表面。用于将系链初步附着到固体表面的方法是本领域已知的。

如本文所用，“饲养细胞”或“饲养者”是描述一种类型的细胞与第二种类型的细胞共培养以提供第二种类型的细胞可在其中生长的环境的术语，因为饲养细胞提供用于支持第二种细胞类型的生长因子和营养物。饲养细胞任选地来自与它们所支持的细胞不同的物种。例如，某些类型的人细胞，包括干细胞，可由小鼠胚胎成纤维细胞或无限增殖化小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物支持。当与其他细胞共培养时，通常可通过辐照或用抗有丝分裂剂诸如丝裂霉素处理使饲养细胞失活，以防止它们生长超过它们所支持的细胞。饲养细胞可包括内皮细胞、基质细胞(例如上皮细胞或成纤维细胞)和白血病细胞。在不限制前述内容的情况下，一种特定的饲养细胞类型可以是人饲养细胞，诸如人皮肤成纤维细胞。另一种饲养细胞类型可以是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。通常，各种饲养细胞可部分用于维持多能性，指导向某一谱系的分化以及促进成熟为特化细胞类型，诸如效应细胞。

如本文所用，“解离的”细胞是指已从其他细胞或从表面(例如，培养板表面)基本上分离或纯化的细胞。例如，细胞可通过机械或酶促方法从动物或组织解离。替代性地，体外聚集的细胞可彼此解离，例如通过以酶促或机械方式解离成聚类、单细胞或单细胞和聚类的混合物的悬浮液。在另一个替代性实施例中，贴壁细胞从培养板或其他表面解离。因此，解离可涉及破坏细胞与细胞外基质(ECM)和底物(例如，培养物表面)的相互作用，或破坏细胞之间的ECM。

培养基-PSC

技术人员将熟悉用于以下的培养基组成和培养条件：

-促进细胞朝向去分化状态或多能状态重编程；

-促进原始态多能状态；和

-促进始发态多能状态。

在一个实施例中，用于促进原始态多能状态并根据本文所述的方法使用的培养基包含MEK抑制剂、PKC抑制剂、GSK3抑制剂、STAT3激活剂和ROCK抑制剂。

提及MEK抑制剂通常是指MEK抑制剂。MEK抑制剂可抑制蛋白激酶的MEK家族的任何成员，包括MEK1、MEK2和MEK5。合适的MEK抑制剂的实例是本领域已知的并且包括PD184352和PD98059、MEK1和MEK2的抑制剂U0126和SL327。特别地，已发现PD184352和PD0325901与其他已知的MEK抑制剂相比具有高度的特异性和效力。

蛋白激酶C(PKC)抑制剂的实例包(3-[1-[3-(二甲氨基)丙基]-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基]-4-(1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)(Gschwendt等人,1996FEBS Lett[欧洲生物化学联合会快报]392:77-80)。另一种优选的PKC抑制剂是Ro-31-8425。优选地，PKC抑制剂以0.01至10μM、0.1至5μM、优选地1至4μM的浓度存在于培养基中。

提及GSK3抑制是指一种或多种GSK3酶的抑制。GSK3酶家族是众所周知的并且已描述了许多变体。在某些实施例中，GSK3β被抑制。也可使用GSK3-α抑制剂。已知多种GSK3抑制剂，以举例的方式，抑制剂CHIR 98014、CHIR 99021、AR-AO144-18、TZD-8、SB21676763和SB415286。

抑制剂可由本领域技术人员通过常规手段或从常规来源提供或获得。抑制剂可以是小分子抑制剂或干扰RNA(RNAi)。技术人员还将熟悉用于鉴定激酶抑制剂的各种方法和测定。

STAT3激活剂的实例包括LIF，优选地hLIF。

MEK抑制剂、GSK3抑制剂和LIF的组合可称为2iL。

如本文所用，ROCK抑制剂是指Rho结合激酶的抑制剂。此类抑制剂的实例包括：((1R,4r)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己烷甲酰胺，艾博抗公司(Abcam))，也称为反式-N-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺；1-(5-异喹啉基)(磺酰基)高哌嗪(1-(5-异喹啉基磺酰基)高哌嗪)。典型地，ROCK抑制剂的量为约0.1至50μM，优选地约1至10μM。

表达或活性的“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”分别用于指使用体外和体内测定所述靶蛋白的表达或活性而鉴定的抑制、激活或调节分子，例如配体、激动剂、拮抗剂以及它们的同系物和模拟物。术语“调节剂”包括抑制剂和激活剂。抑制剂是例如抑制表达或结合，部分或完全阻断刺激或蛋白酶抑制剂活性，使所述靶蛋白的活性降低、被阻止、延迟激活、失活、脱敏或下调的试剂，例如拮抗剂。激活剂是例如诱导或激活所述靶蛋白的表达或结合、刺激、增加、打开、激活、促进、增强激活或蛋白酶抑制剂活性、使所述靶蛋白(或编码多核苷酸)的活性敏化或上调的试剂，例如激动剂。调节剂包括天然存在的和合成的配体、拮抗剂和激动剂(例如，起激动剂或拮抗剂作用的小化学分子、抗体等)。抑制剂和激活剂的此类测定包括例如将推定的调节剂化合物应用于表达所述靶蛋白的细胞，然后如上所述确定对所述靶蛋白活性的功能作用。将用潜在的激活剂、抑制剂或调节剂处理的包含所述靶蛋白的样品或测定与没有抑制剂、激活剂或调节剂的对照样品进行比较，以检查作用程度。将对照样品(未用调节剂处理)指定为100％的相对活性值。当相对于对照的活性值为约80％、任选50％或25％、10％、5％或1％时，实现对所述靶蛋白的抑制。当相对于对照的活性值为110％、任选150％、任选200％、300％、400％、500％或1000％-3000％或更高时，实现对所述靶蛋白的激活。

如本文所用，“抑制(inhibit)”、“防止(prevent)”或“减少(reduce)”或“抑制(inhibiting)”、“防止(preventing)”或“减少(reducing)”在本文中可互换使用。这些术语是指与未经处理的细胞(组织或受试者)相比，经处理的细胞(组织或受试者)中测量的参数(例如，活性、表达、线粒体呼吸、线粒体氧化、氧化磷酸化)的降低。也可在治疗前后对相同的细胞或组织或受试者进行比较。该降低足以是可检测的。在一些实施例中，与未处理的细胞相比，经处理的细胞的减少为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或被完全抑制。在一些实施例中，与未处理的细胞相比，在经处理的细胞中所测量的参数是不可检测的(即，被完全抑制)。

合适的培养基的实例总结于下表1中：

表1.可用于培养本发明的多能干细胞的细胞培养基。

如本文所用，hPGCLC诱导培养基是指人原始生殖细胞样细胞诱导培养基。

RSeT^TM培养基是用于在饲养细胞依赖性和低氧条件下维持原始态样hPSC的限定细胞培养基。RSeT^TM培养基含有预先筛选的优质组分并且不含bFGF或TGFβ。它与人胚胎干(ES)细胞和人诱导性多能干细胞(iPS)细胞相容。

在RSeT^TM培养基中培养的hPSC表现出原始态状态的特征，诸如具有折射边缘的紧密堆积的圆顶集落。与原始态样hPSC诸如KLF2、KLF4和TFCP2L1相关的关键转录物在RSeT^TM培养基中培养的hPSC中表现出增加的表达。RSeT^TMhPSC可通过在mTeSR^TM1中培养而转化回始发态状态，然后可使用标准技术分化。

示例性t2iLGoY培养基：

·补充有2mM L-谷氨酰胺(吉布可公司(Gibco))的DMEM/F-12(吉布可公司)和Neurobasal培养基(吉布可公司)的50:50混合物，

·0.1mM 2-巯基乙醇(吉布可公司)，

·0.5％ N2补充剂(吉布可公司)，

·1％ B27补充剂(吉布可公司)，

·1％ Pen-strep(吉布可公司)，

·10ng/ml人LIF(内部制造)，

·250μM L-抗坏血酸(西格玛公司(Sigma))，

·10μg/ml重组人胰岛素(西格玛公司)，

·1μM PD0325901(美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotec))，

·1μM CHIR99021(美天旎生物技术有限公司)，

·2.5μM(托克里斯公司(Tocris))，

·10μM Y-27632(艾博抗公司)。

培养基-TSC

适于支持TSC及其增殖的培养基优选是如Okae(2018)Cell Stem Cell[细胞干细胞]和WO 2016/143866中所述的培养基，其内容特此通过援引并入。

TSC的基础培养基组成可以是通常使用的任何基础培养基，包括DMEM、MEM、RPMI1640等。培养基中可适当地包含血清、生长因子、丙酮酸、氨基酸、抗生素等。

TSC培养物优选地包含至少一种生长因子和至少一种ROCK抑制剂。

如本文所用，生长因子可以是任何生长因子，但优选地选自表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转化生长因子(TGF)中的一种。生长因子的量可以是任何量，例如0.1至1000ng/ml，优选地10-100ng/ml。

在一些优选实施例中，TSC培养物是Okae等人中所述的ASECRiAV培养基，并且包含：A83-01、SB431542、EGF、CHIR、ROCK抑制剂、抗坏血酸和丙戊酸。

最优选地该TSC培养基包含：

-DMEM/F-12，

-补充有0.3％ BSA(西格玛公司)的GlutaMAX^TM(赛默飞世尔公司)，

-0.2％ FBS(赛默飞世尔公司)，

-1％ ITS-X补充剂(赛默飞世尔公司)，

-0.1mM 2-巯基乙醇(赛默飞世尔公司)，

-0.5％ Pen-Strep(赛默飞世尔公司)，

-1.5μg/ml L-抗坏血酸(西格玛公司)，

-5μM Y27632((1R,4r)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己烷甲酰胺，艾博抗公司)，

-2μM CHIR99021(6-((2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)烟腈，美天旎生物技术有限公司)，

-0.5μM A83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺，西格玛公司)，

-1μM SB431542(4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)

-50ng/ml EGF(派普泰克公司)和

-0.8mM丙戊酸(VPA，西格玛公司)。

培养基-XEN细胞

用于建立本发明的XEN或XEN样细胞的培养基包含白血病抑制因子(LIF)、GSK-3抑制剂、激活素A和ROCK抑制剂。

优选地，ROCK抑制剂以约10μM的浓度存在。通常，接种的细胞在包含ROCK抑制剂的培养基中培养1或2天，或直到接种的细胞附着到饲养层。附着后，可使用包含白血病抑制因子(LIF)、GSK-3抑制剂和激活素A(无ROCK抑制剂)的培养基并每隔一天替换一次。因此，用于维持本发明的XEN或XEN样细胞的培养基包含白血病抑制因子(LIF)、GSK-3抑制剂、激活素A，其中该培养基不含ROCK抑制剂。

最优选地，XEN或XEN样培养基、或用于建立和/或维持XEN或XEN样细胞的培养基包含：

-DMEM/F-12(赛默飞世尔公司)和Neurobasal培养基(赛默飞世尔公司)的50:50混合物，

-2mM L-谷氨酰胺(赛默飞世尔公司)，

-0.1mM 2-巯基乙醇(赛默飞世尔公司)，

-0.5％ N2补充剂(赛默飞世尔公司)，

-1％ B27补充剂(赛默飞世尔公司)，

-1％青霉素-链霉素(赛默飞世尔公司)，

-10ng/ml人白血病抑制因子(LIF)，

-3μM CHIR99021(美天旎生物技术有限公司)和

-100ng/ml激活素A(派普泰克公司)，

-任选地与约10μM的如本文所述的ROCK抑制剂一起

本发明的方法可进一步包括分化步骤。例如，该方法可包括使表现出TSC的至少一种特征的细胞分化成表现出EVT或ST的至少一种特征的细胞。此外，该方法可包括使根据本发明制备的nPSC或pPSC分化，包括培养PSC以生成具有分化细胞或不处于多能状态的细胞的至少一种特征的细胞。如本文所用，术语“分化”是指在使祖细胞(例如双潜能或多能细胞)能够达到指定的、非多能或多能的特化细胞命运的条件下转化该细胞。此类方法通常包括增加与特化(分化)细胞相关的多种因子的水平。

根据具体的实施例，根据本发明制备的TSC细胞可用于分离谱系特异性细胞，例如ST和EVT。技术人员熟悉用于使根据本发明产生的TSC分化的标准方法。简言之，可如下使TSC分化成合体滋养层(ST)：通过使TSC经受MEFBAP处理(MEF条件培养基、BMP4、TGFβi、FGFRi，如Amita等人,2013PNAS[美国国家科学院院刊],110:E1212-1221中所述)。替代性地，将TSC暴露于毛喉素处理也可用于使TSC向ST命运分化。

用于分化的进一步方法披露于以下文献中：Kidder(2014)Methods Mol Biol[分子生物学方法],1150-201-12；Lei等人,(2017)Placenta[胎盘],28:14-12；以及Chen等人,(2013)Biochemical and Biophysical Research Communications[生物化学和生物物理研究通讯],431；179-202。该方法可包括在无GFG4和肝素的培养基中培养细胞。该方法还可涉及对包含分化因子的培养基中的细胞进行遗传修饰。

成功分化成ST可通过测量基础β-hCG(人绒毛膜促性腺激素)分泌以及人胎盘催乳素基因的表达来确定。替代性地，成功分化成ST可通过SDC1+多核细胞的存在来确定。成功分化成EVT命运可通过确定选自以下的一种或多种标志物的蛋白质表达来证实：HLA-G、PRG2和PAPP2。

类似地，用于使PSC分化的方法通常是本领域众所周知的。此类方法充分描述于例如Zhu等人,(2013)Development[发育],140:705-717；以及Bar和Benvenisty(2020)NatureReviews Molecular Biology[自然评论-分子细胞生物学],2020年11月5日。

PSC成功分化成终末分化细胞命运可通过确定分化细胞类型特征性的一种或多种标志物的蛋白质表达或形态特征来证实。体细胞特征性的形态和基因表达标志物是技术人员已知的。在某些实例中，当分化细胞是真皮成纤维细胞时，形态特征包括扁平形状，并且标志物包括：CD13(ANPEP)、CD44、TWIST1和ZEB1。

当分化细胞是角质形成细胞时，相关标志物包括角蛋白1、角蛋白14和外皮蛋白，并且细胞形态是鹅卵石外观。内皮细胞标志物包括CD31(Pe-CAM)、VE-钙粘蛋白和VEGFR2，并且细胞形态可以是毛细血管样结构。上皮细胞的标志物包括细胞角蛋白15(CK15)、细胞角蛋白3(CK3)、外皮蛋白和连接蛋白4。优选地，观察到的形态是鹅卵石外观。造血干细胞的标志物可包括CD45(泛造血标志物)、CD19/20(B细胞标志物)、CD14/15(髓系)、CD34(祖细胞/SC标志物)、CD90(SC)。间充质干细胞的标志物包括：CD13、CD29、CD90、CD105、CD10、CD45。

多层细胞结构或胚泡样结构

在任何方面，根据本发明的方法使用的体外衍生或体外生成的多层细胞结构或胚泡样结构包含内细胞层和外细胞层，该内细胞层包含表现出上胚层和/或原始内胚层谱系细胞的一种或多种特征的细胞，并且该外细胞层包含表现出滋养外胚层细胞的一种或多种特征的细胞。优选地，该特征可通过分析细胞形态、基因表达谱、活性测定、蛋白质表达谱、表面标志物谱、分化能力或它们的组合来确定。特征或标志物的实例包括本文所述的和技术人员已知的那些。

在任何方面，内细胞层进一步包含表现出PE的一种或多种特征的细胞聚类。优选地，表现出PE的一种或多种特征的细胞是或主要是表现出上胚层细胞的一种或多种特征的细胞的外周。

在任何方面，内细胞层是基本上表现为天然形成的内细胞团的内细胞团样组织。

在任何方面，外细胞层是基本上表现为天然形成的滋养外胚层的滋养外胚层样组织。

多层细胞结构或胚泡样结构也可称为人工胚泡，其包含围绕囊胚腔的滋养外胚层样组织和内细胞团样组织。

在任何方面，EPI细胞的特征是存在标志物NANOG、OCT4(也称为POU5F1)或SOX2中的任何一种或多种。在一个实施例中，多层细胞结构或胚泡样结构中的更多细胞表达OCT4而不是NANOG。

在任何方面，EPI细胞的特征是圆形柱状外观的形态。

在任何方面，TE细胞的特征是存在标志物CDX2和GATA2中的一种或多种。

在任何方面，TE细胞的特征是扁平或细长的上皮形态。

在任何方面，PE细胞的特征是存在标志物SOX17或GATA6。

表2：EPI、TE和PE转录签名

在任何方面，多层细胞结构或胚泡样结构可进一步包含邻近OCT4阳性细胞的GATA6阳性细胞(任选地具有低或弱CDX2染色)。

在任何方面，多层细胞结构或胚泡样结构在E5-7、优选地E6-7时表现出人胚泡的主要形态特征。人胚泡在E5-7和E6-7时的主要形态特征是技术人员已知的。这些特征可包括球形或主要为球形的层状细胞聚集体或结构，其包括至少两个径向定位的层，并包括内细胞层(如本文所定义)和具有透明带和称为囊胚腔的流体填充腔的外细胞层(如本文所定义)。胚泡具有约0.1-0.2mm的直径，并且通常包含约200-300个细胞。通常，表现出上胚层和/或原始内胚层谱系细胞的一种或多种特征的细胞存在于位于聚集体或结构内部的单个聚类中，而表现出滋养外胚层细胞的一种或多种特征的细胞存在于外部。

人胚泡的其他特性和特征描述于例如以下文献中：Blakeley,P.等人(2015)Development[发育]142,3613；Petropoulos,S.等人(2016)Cell[细胞]165,1012-1026；Shahbazi,M.N.等人(2016)Nat.Cell Biol.[自然细胞生物学]18,700-708；Xiang,L.等人(2020)Nature[自然]577,537-542；Qin,H.等人(2016)Cell Rep.[细胞报道]14,2301-2312；Liu,L.等人(2019)Nat.Commun.[自然通讯]10,364；Durruthy-Durruthy,J.等人(2016)Dev.Cell[发育细胞]38,100-115；Fogarty,N.M.E.等人(2017)Nature[自然]550,67-73。

此外，多层细胞结构或胚泡样结构还可包含表现出上胚层、原始内胚层和滋养外胚层细胞的一种或多种特征的细胞，其中这些细胞分别采用与在E5-7、优选地E6-7时人胚泡中的上胚层、原始内胚层和滋养外胚层细胞相同或相似的相对空间排列。如本文所用，关于人胚泡的“相同或相似的相对空间排列”应被理解为意指具有至少两个径向定位的层，并且包括内细胞层(如本文所定义)和外细胞层(如本文所定义)。可存在多于两个细胞层，但通常认为，表现出上胚层和/或原始内胚层谱系细胞的一种或多种特征的细胞存在于位于聚集体或结构内部的单个聚类中，而表现出滋养外胚层细胞的一种或多种特征的细胞存在于外部。换句话讲，该结构中细胞的外层通常是TE细胞(并表达TE标志物诸如CDX2和GATA2)，而指示上胚层的细胞(并表达标志物诸如NANOG和OXT4和SOX2)存在于该结构内的ICM样区室中。

在任何方面，多层细胞结构或胚泡样结构还包含无细胞腔或囊胚腔样腔。多层细胞结构或胚泡样结构可经历空化，由此允许形成囊胚腔。在形成囊胚腔样腔之后，内团样组织可将其自身定位在内腔的一部分中，而腔的其余部分填充有流体。

用于本发明的方法中的多层细胞结构或胚泡样结构与天然产生的人胚泡的区别通常在于本发明的结构不形成或包含透明带。

如本文所用，术语“透明带”是指围绕哺乳动物卵母细胞的质膜的糖蛋白层。卵母细胞受精后，透明带保持完整，因此天然存在的胚泡包含受精后长达约五天的透明带，此时胚泡进行所谓的“透明带孵化”，其中透明带作为植入的一部分退化和分解。

根据本发明使用的结构也可从天然存在的胚泡分化，包括从天然存在的胚泡获得的干细胞，因为该结构可包含具有在胚泡的细胞中没有发现的总体基因签名的细胞(其通常是混合的基因表达谱)，使得该细胞表达PE和TE、PE和EPI、TE和EPI、或PE、TE和EPI的组合的特征性基因。换句话讲，本发明的结构中的一些细胞可具有作为多于一种谱系特征性的混合转录签名。一个或多个单个细胞可具有多于一种谱系特征性的混合转录签名。与每个谱系相关的转录签名在本文中进一步描述，例如上文[0248]-[0252]和表2。

在任何方面，多层细胞结构或胚泡样结构具有x轴和y轴直径，x:y纵横比和/或投影面积，其大小与先前公布的受精后胚胎第5-7天(E5-7)人胚泡的测量值相当。例如，多层细胞结构或胚泡样结构的x轴和/或y轴直径为约100至约300μm。优选地，x/y轴比约为1。多层细胞结构或胚泡样结构的投射面积为约10,000至约40,000μm²，优选地约20,000至约40,000μm²。

如本文所用，与先前公布的人胚泡在E5-7时的测量值“相当的”x轴和y轴直径或x:y纵横比可包括在先前公布的测量值的约50％至200％之间、优选地为先前公布的测量值的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约1200％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％或至少约200％的x轴和y轴直径或x:y纵横比。

如本文所用，与先前公布的人胚泡在E5-7时的测量值“相当的”投影面积可包括在先前公布的人胚泡测量值的约50％至200％之间的投影面积。优选地，相当的投影面积包括范围为5,000至约40,000μm²的值的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约1200％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％或至少约200％的面积。换句话讲，相当的投影面积可以是在约5,000至约10,000μm²、约10,000至约40,000μm²、约40,000μm²至约60,000μm²、优选地约20,000至约40,000μm²之间的面积。

在本发明的上下文中，多层细胞结构或胚泡样结构是包含至少两个径向定位的层的层状细胞聚集体或结构。优选地，其为包含内细胞层(如本文所定义)和外细胞层(如本文所定义)的球形或主要为球形的细胞聚集体或结构。可存在多于两个细胞层，但通常认为，表现出上胚层和/或原始内胚层谱系细胞的一种或多种特征的细胞存在于位于聚集体或结构内部的单个聚类中，而表现出滋养外胚层细胞的一种或多种特征的细胞存在于外部。

在任何方面，多层细胞结构或胚泡样结构可包含约100-400个总细胞。

根据本发明的方法使用的多层细胞结构或胚泡样结构通常表现出模拟早期人胚胎发育的许多方面的特征。在某些实施例中，这些结构在可用于研究胚胎植入的体外附着测定中模拟人胚胎的特征。例如，当在IVC1培养基(如本文所定义)中培养1天且随后在IVC2培养基(如本文所定义)中培养第2天至第4.5天时，多层细胞结构或胚泡样结构可表现出以下中的一者或多者：

a)大小增加、变平并进展形成向外生长；

b)NANOG和OCT4/SOX2阳性细胞数量的增加；

c)CDX2和GATA2阳性细胞的扩散；

d)SOX17和GATA6阳性细胞定位于NANOG或OCT4阳性细胞的周边；

e)在外细胞层或表现出TE细胞的至少一种特征的细胞中表达角蛋白KRT7或其他滋养层标志物；

f)存在形态上类似合体滋养层(ST)和绒毛外滋养层(EVT)的细胞(例如分别为ST和EVT样细胞)，例如多核表型和纺锤体样形态；

g)存在表达hCG(示例性ST标志物)和MMP2(示例性EVT标志物)的细胞；和

h)存在表现出ST标志物CSH1和EVT标志物ITGA1上调的细胞。

应当理解，如本文所用的“增加”，无论是与大小的增加或对特定标志物呈阳性的细胞数量的增加有关，均指大于约5％的变化。在多层细胞或胚泡样结构的大小的上下文中，此类“增加”应理解为包括与在体外附着测定(如本文所述)中培养之前结构的大小相比大小增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％或更多。类似地，对特定标志物(诸如NANOG和OCT4/SOX2)呈阳性的细胞数量的“增加”可以是与在体外附着测定中培养之前结构中标志物阳性细胞的数量相比细胞数量增加至少％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％或更多

在优选的实施例中，根据本发明使用的体外衍生或生成的胚泡或类囊胚结构(即，多层细胞结构或胚泡样结构)具有以下特征中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种：

·球形或主要为球形的层状细胞聚集体或结构，其包含至少两个径向定位的层，并且包含内细胞层和不具有透明带的外层；

·该内细胞层包含表现出上胚层(EPI)细胞的一种或多种特征的细胞，该EPI细胞的特征是存在标志物NANOG、OCT4(也称为POU5F1)或SOX2中的任一种或多种和圆形柱状外观；

·该内细胞层还包含表现原始内胚层(PE)谱系的一种或多种特征的细胞聚类，其中表现出PE的一种或多种特征的该细胞是或主要是表现出上胚层细胞的一种或多种特征的细胞的外周；PE细胞的特征是存在标志物SOX17或GATA6。

·该外细胞层包含表现出滋养外胚层(TE)细胞的一种或多种特征的细胞，TE细胞的特征是存在CDX2和GATA2中的一种或多种标志物以及扁平或细长的上皮形态；

·直径约0.1-0.2mm；

·约100-400个细胞；

·其中多层细胞结构或胚泡样结构中的更多细胞表达OCT4而不是NANOG；

·GATA6阳性细胞(任选地具有低或弱CDX2染色)邻近OCT4阳性细胞；

·多层细胞结构或胚泡样结构的x轴和/或y轴直径为约100至约300μm；

·x/y轴比为约1；

·投影面积为约5,000至约10,000μm²、约10,000至约40,000μm²、约40,000μm²至约60,000μm²、优选地约20,000至约40,000μm²；

·任选地，流体填充腔，称为囊胚腔；和

·任选地其中表现出上胚层和/或原始内胚层谱系细胞的一种或多种特征的细胞存在于位于聚集体或结构内部的单个聚类中，而表现出滋养外胚层细胞的一种或多种特征的那些存在于外部。

用于生成多层细胞结构或胚泡样结构的方法

本发明的方法所需的多层细胞结构或胚泡样结构可通过本文所述的任何方法获得，诸如使用“聚集”方法从重编程中间体获得多层细胞结构或胚泡样结构，或通过组装人工衍生的多能干细胞和滋养层干细胞(iPSC和iTSC)。

应当理解，本发明的方法涉及从类似胚泡并且是人工衍生的结构中衍生和扩增细胞(XEN样细胞、TSC、pPSC和nPSC)的方法。换句话讲，本发明的方法通常排除了直接从人个体获得的胚泡的使用和操作。

在一个实施例中，一种产生多层细胞结构的方法包括：

a)获得表现出上胚层(EPI)、滋养外胚层(TE)和原始内胚层(PE)转录签名的重编程体细胞的细胞群；和

b)在允许聚集以获得多层细胞结构的条件下培养这些重编程体细胞；

由此产生多层细胞结构。

在一个实施例中，产生胚泡样结构的方法包括：

b)在允许聚集以获得胚泡样结构的条件下培养这些重编程体细胞；

由此产生胚泡样结构。

在任何方面，表现出上胚层(EPI)、滋养外胚层(TE)和/或原始内胚层(PE)谱系的转录签名的细胞群优选地表现出上胚层(EPI)、滋养外胚层(TE)和原始内胚层(PE)谱系中的每一种的转录签名。

获得表现出上胚层(EPI)、滋养外胚层(TE)和原始内胚层(PE)转录签名的重编程体细胞的细胞群优选地包括：

-增加体细胞群中一种或多种因子的蛋白质表达或量，其中这些因子用于将这些体细胞朝向去分化或多能状态重编程；和

-在允许这些细胞朝向去分化或多能状态重编程的条件下培养这些细胞足够的时间。

优选地，在允许这些细胞朝向去分化或多能状态重编程的条件下培养这些细胞足够的时间的步骤包括在用于维持培养中的体细胞的培养基中培养细胞。优选地，该步骤包括在不旨在用于促进多能性的培养基中培养细胞。

此外，在一个实施例中，一种产生胚泡样结构的方法依次包括以下步骤：

a)增加体细胞群中一种或多种因子的蛋白质表达或量，其中这些因子用于将这些体细胞朝向去分化或多能状态重编程；

b)在允许这些细胞朝向去分化或多能状态重编程的条件下培养这些细胞足够的时间；

c)在允许聚集的条件下，使这些细胞与包含WNT途径信号传导激活剂(任选地GSK-3抑制剂)、至少一种优选地两种TGF-β抑制剂、HDAC抑制剂、EGF和BMP4的培养基接触；

d)在允许细胞表现出如本文所述的胚泡样结构的至少一种特征的条件下在培养基中培养这些细胞足够的时间，

由此产生胚泡样结构。

优选地，步骤c)中的培养基进一步包含Rho激酶(ROCK)抑制剂。优选地，使细胞与包含ROCK抑制剂的培养基接触至少约6小时、至少约12小时或至少约24小时，然后使细胞随后与不含ROCK抑制剂的培养基接触。

应当理解，根据本发明的方法可使用任何将体细胞朝向去分化或多能状态重编程的方法。因此，本发明不受用于增加蛋白质表达或相关因子的量的特定方法或允许体细胞开始向可塑性或多能性重编程的培养条件的限制。此类方法是本领域已知的并且在本文中进一步描述。

在优选的实施例中，用于将体细胞朝向去分化或多能状态重编程的因子是转录因子。转录因子可以包含以下因子中的一种或多种，或由其组成或基本上由其组成：OCT4、SOX2、KLF4和MYC(OSKM)；SOX2、KLF4和OCT4(SKO)；OCT4、SOX2、KLF4和GLIS1(OSKG)；OCT4、SOX2、NANOG和LIN28(OSNL)；或OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、NANOG和LIN28(OKSMNL)。在特别优选的实施例中，转录因子包含因子OCT4、SOX2、KLF4和MYC(OSKM)中的所有四种或它们的变体。在另一个实施例中，转录因子包含SOX2、KLF4和OCT4(SKO)、由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，转录因子包含OCT4、SOX2、KLF4和GLIS1(OSKG)、由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，转录因子包含OCT4、SOX2、NANOG和LIN28(OSNL)、由其组成或基本上由其组成。在另一个实施例中，转录因子包含OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、NANOG和LIN28(OKSMNL)、由其组成或基本上由其组成。

因此，在任何方面，一种产生胚泡样结构的方法，该方法依次包括以下步骤：

a)增加体细胞群中以下转录因子组合中的一者或多者的蛋白质表达或量：OCT4、SOX2、KLF4和MYC(OSKM)，SOX2、KLF4和OCT4(SKO)，OCT4、SOX2、KLF4和GLIS1，或OCT4、SOX2、NANOG和LIN28(OSNL)，或本文所述转录因子的任何其他组合；

b)在允许细胞朝向多能状态重编程的条件下培养这些细胞足够的时间；

c)在允许聚集的条件下，使这些细胞与包含WNT激活剂、至少一种优选地两种TGF-β抑制剂、HDAC抑制剂、GSK-3抑制剂、EGF和BMP4的培养基接触；

由此产生胚泡样结构。

典型地，通过使该细胞与增加转录因子表达的试剂接触来增加如本文所述的转录因子的蛋白质表达或量。优选地，该试剂选自下组，该组由以下各项组成：核苷酸序列、蛋白质、适配体和小分子、核糖体、RNAi剂和肽-核酸(PNA)及其类似物或变体。在一些实施例中，该试剂是外源性的。本发明还考虑了转录激活系统(例如，用于基因激活系统诸如CRISPR/Cas9或TALEN中的gRNA)用于增加一种或多种转录因子的表达的用途。

通常，通过在细胞中引入至少一种包含编码转录因子或编码其功能片段的核苷酸序列的核酸(例如mRNA分子)来增加如本文所述的转录因子的蛋白质表达或量。可将该至少一种编码转录因子的核酸转染到体细胞群中多次，例如2、3、4、5或6次，例如每天分别持续2、3、4、5或6天。

在优选的实施例中，通过质粒将编码转录因子蛋白的核酸序列引入细胞。可使用编码一种或多种转录因子的一种或多种核酸。因此，显然，一种或多种质粒可用于增加所需的一种或多种转录因子的表达或量的目的。换句话讲，核酸序列可在单个质粒中或在单个质粒上，或在两个或多个质粒中提供给体细胞。

在任何实施例中，含有编码根据本发明使用的一种或多种转录因子的核酸的质粒可以是附加型质粒。

优选地，该核酸进一步包括异源启动子。优选地，该核酸是在载体中，诸如病毒载体或非病毒载体。优选地，该载体是包含不整合到宿主细胞基因组中的基因组的病毒载体。病毒载体可以是逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒或仙台病毒。

在某些实施例中，通过用一种或多种编码所述转录因子的载体转导或转染体细胞来增加体细胞中因子的蛋白质表达或量。载体可以是病毒载体，包括整合或非整合病毒载体。在进一步的实施例中，载体可以是附加型载体。

还应当理解，体细胞不需要在步骤c)中使细胞与培养基接触的步骤之前完成重编程为多能状态。换句话讲，细胞优选地处于中间状态，当其与培养基接触时从分化状态转变为多能状态。因此，在步骤b)结束时和在步骤c)中培养之前的细胞可被称为重编程中间体。

在某些实施例中，培养细胞以开始朝向去分化或多能状态重编程的时间段是在增加一种或多种因子的蛋白质表达或量之后至少1天，或从细胞与增加一种或多种因子的蛋白质表达或量的试剂接触时开始。该时间段可以是在增加该一种或多种因子的蛋白质表达或量后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天或更多天。在任何实施例中，用于培养细胞以开始朝向去分化或多能状态重编程的时间段可以是任何时间段，条件是其能够减少与体细胞相关的标志物和/或引起体细胞鉴定的减少或丧失并获得细胞可塑性。

在本发明的其他实施例中，上述方法包括在诱导EPI、TE和PE谱系转录签名上调的培养基中将细胞朝向去分化或多能状态培养。优选地，该培养基是成纤维细胞培养基，例如本文包括表1中定义的成纤维细胞培养基。

如本文所用，如上所述用于在允许聚集的条件下接触重编程中间体的培养基(即，包含WNT途径信号传导激活剂(优选GSK-3抑制剂)、至少一种优选地两种TGF-β抑制剂、HDAC抑制剂、EGF和BMP4的培养基)也可称为胚泡促进培养基或iBlastoid培养基。优选地，该胚泡促进培养基或iBlastoid培养基是如本文定义的任一种。在任何实施例中，细胞在步骤c)的培养基中培养至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约9天、至少约12天、至少约14天、至少约16天、至少约20天、至少约24天、或至少约28天或更多天。

在任何实施例中，在步骤c)中增加因子的蛋白质表达或量和使细胞与培养基接触之间的时间段可以是任何时间段，条件是其能够减少与体细胞相关的标志物。在进一步的实例中，在步骤c)中增加因子的蛋白质表达或量和使细胞与培养基接触之间的时间段可以是任何时间段，条件是其使细胞能够通过间充质进入上皮过渡状态。在进一步或替代性实施例中，该时间段可以是任何时间段，条件是其能够表达上胚层(EPI)、滋养外胚层(TE)和原始内胚层(PE)转录签名。

在任何方面，允许聚集的条件可包括在允许细胞三维聚集的任何培养板、培养容器或培养系统上培养。例如，细胞可以按等于或为约0.5至2×10⁵个细胞/孔、等于或为约0.6至2×10⁵个细胞/孔、等于或为约0.8至2×10⁵个细胞/孔、等于或为约1至2×10⁵个细胞/孔、等于或为约0.6×10⁵个细胞/孔、等于或为约0.8×10⁵个细胞/孔、等于或为约1×10⁵个细胞/孔、等于或为约1.2×10⁵个细胞/孔、等于或为约1.4×10⁵个细胞/孔、等于或为约1.6×10⁵个细胞/孔、等于或为约1.8×10⁵个细胞/孔、或等于或为约2×10⁵个细胞/孔的密度接种。在一个实施例中，该培养板或培养容器是本文所述的任一种。

体细胞可以是本文所述的任何细胞类型，包括患病细胞。体细胞可以是成体细胞或衍生自成体的显示成体或非胚胎细胞的一种或多种可检测的特征的细胞。患病细胞可以是显示疾病或病症(例如非整倍性、葡萄胎或科妮莉亚德兰格(Cornelia de Lange)综合征)的一种或多种可检测特征的细胞。此外，体细胞可已例如通过CRISPR技术(例如CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a、CRISPR-Cas13或相关的CRISPR/核酸酶系统)被基因编辑。

在优选的实施例中，体细胞是成纤维细胞(优选地真皮成纤维细胞)、角质形成细胞(优选地表皮角质形成细胞)、单核细胞或内皮细胞或间充质干细胞。优选地，用于本发明的方法中的体细胞仅包含成纤维细胞。替代性地，用于本发明的方法中的体细胞可以是外周血单核细胞(PBMC)，优选地人外周血单核细胞。替代性地，用于本发明的方法中的体细胞可以是间充质干细胞(MSC)，优选地人间充质干细胞。体细胞特征性的形态和基因表达标志物是技术人员已知的。因此，在进行本发明方法的过程期间测试和观察体细胞特征性标志物的减少将在技术人员的能力范围内。在某些实例中，当体细胞是真皮成纤维细胞时，形态特征包括扁平形状，并且标志物包括：CD13(ANPEP)、CD44、TWIST1和ZEB。

角质形成细胞标志物包括角蛋白1、角蛋白14和外皮蛋白，并且细胞形态为鹅卵石外观。内皮细胞标志物包括CD31(Pe-CAM)、VE-钙粘蛋白和VEGFR2，并且细胞形态可以是毛细血管样结构。上皮细胞的标志物包括细胞角蛋白15(CK15)、细胞角蛋白3(CK3)、外皮蛋白和连接蛋白4。优选地，观察到的形态是鹅卵石外观。造血干细胞的标志物可包括CD45(泛造血标志物)、CD19/20(B细胞标志物)、CD14/15(髓系)、CD34(祖细胞/SC标志物)、CD90(SC)。间充质干细胞的标志物包括：CD13、CD29、CD90、CD105、CD10、CD45。

替代性地，多层细胞结构或胚泡样结构可通过iPSC和iTSC、或iPSC和iTSC群的组装生成。例如，一种产生多层细胞结构的方法包括：

-在允许聚集以获得多层细胞结构的条件下培养iPSC和iTSC细胞；

由此产生多层细胞结构。

替代性地，存在一种产生体外衍生的胚泡样结构的方法，该方法包括：

-在允许聚集以获得胚泡样结构的条件下培养iPSC和iTSC细胞；

由此产生胚泡样结构。

用于生成iPSC和iTSC的方法是本领域已知的。用于生成iPSC的示例性方法描述于例如：Takahashi等人,(2007)Cell[细胞],131:861-872，WO 2017/219232，WO 2014/200114，WO 2014/065435，WO 2019/073055，Liu等人,(2017)Nat.Methods[自然方法],14:1055-1062；其全部内容特此通过援引以其全文并入。用于生成iTSC的示例性方法进一步描述于本文(实例11)和Liu等人,(2020)Nature[自然],586:101-107中，其内容也通过援引并入本文。

在一个实施例中，iPSC和iTSC可在本文所述的任何培养容器例如24孔AggreWell^TM400板中共培养。优选地，将细胞在用于促进细胞表现出如本文所述的胚泡样结构的至少一种特征的任何培养基(例如胚泡促进培养基或iBlastoid培养基)中培养。优选地，该培养基是如表4所示的iBlastoid培养基。

优选地，iPSC和iTSC以相应1:2.5的比率在同一孔中共培养，总数为1.2×10⁵个细胞/孔。

ROCKi优选地在共培养的第一天被包含在细胞培养物中以增强细胞存活，并且细胞在本文所述的任何培养容器(例如24孔AggreWell^TM400板)中培养3、4、5、6天，优选地6天。

在任何方面，多层细胞结构或胚泡样结构包含内细胞层和外细胞层，该内细胞层包含表现出上胚层和/或原始内胚层谱系细胞的一种或多种特征的细胞，该外细胞层包含表现出滋养外胚层细胞的一种或多种特征的细胞。优选地，该特征可通过分析细胞形态、基因表达谱、活性测定、蛋白质表达谱、表面标志物谱、分化能力或它们的组合来确定。特征或标志物的实例包括本文所述的和技术人员已知的那些。

在任何方面，EPI细胞的特征是圆形柱状外观的形态。

在任何方面，TE细胞的特征是扁平或细长的上皮形态。

在任何方面，PE细胞的特征是存在标志物SOX17或GATA6。

在任何方面，EPI、PE或TE谱系的标志物如Petropoulos等人,Cell[细胞]165,1012-1026(2016)中所述或如本文的表2中所示。

在任何方面，多层细胞结构或胚泡样结构在E5-7、优选地E6-7时表现出人胚泡的主要形态特征。此外，多层细胞结构或胚泡样结构还可包含表现出上胚层、原始内胚层和滋养外胚层细胞的一种或多种特征的细胞，其中这些细胞分别采用与在E5-7、优选地E6-7时人胚泡中的上胚层、原始内胚层和滋养外胚层细胞相同或相似的相对空间排列。

在任何方面，多层细胞结构或胚泡样结构还包含无细胞腔或囊胚腔样腔。

在任何方面，多层细胞结构或胚泡样结构包含至少约100至400个总细胞，或至少约300至约600个细胞。

在任何方面，当在IVC1培养基(如本文所定义)中培养1天且随后在IVC2培养基(如本文所定义)中培养第2天至第4.5天时，多层细胞结构或胚泡样结构可附着到表面(诸如玻璃表面)且表现出以下中的一者或多者：

i)大小增加、变平并进展形成向外生长；

j)NANOG和OCT4/SOX2阳性细胞数量的增加；

k)CDX2和GATA2阳性细胞的扩散；

l)SOX17和GATA6阳性细胞定位于NANOG或OCT4阳性细胞的周边；

m)在外细胞层或表现出TE细胞的至少一种特征的细胞中表达角蛋白KRT7或其他滋养层标志物；

n)存在形态上类似合体滋养层(ST)和绒毛外滋养层(EVT)的细胞(例如分别为ST和EVT样细胞)，例如多核表型和纺锤体样形态；

o)存在表达hCG(示例性ST标志物)和MMP2(示例性EVT标志物)的细胞；和

p)存在表现出ST标志物CSH1和EVT标志物ITGA1上调的细胞。

用于促进细胞表现出胚泡样结构的至少一种特征的培养基(例如胚泡促进培养基或iBlastoid培养基)可包含：

-用于激活WNT途径信号传导的试剂，任选地GSK-3抑制剂，

-至少一种优选地两种TGF-β抑制剂，

-HDAC抑制剂，

-EGF，和

-BMP4。

优选地，WNT激活剂、TGF-β抑制剂、HDAC抑制剂和GSK-3抑制剂可以是本领域已知的任一种，包括本文所述的任一种。

优选地，该培养基进一步包含：

-ITS-X；

-L-谷氨酰胺；

-N-乙酰-L-半胱氨酸；

-Β-雌二醇；

-孕酮；

-2-巯基乙醇；

-L-抗坏血酸；

-转铁蛋白(例如人)，

-胰岛素(例如人)，

-N2补充剂；和

-B27补充剂。

优选地，孕酮、转铁蛋白和胰岛素在本文所述的N2补充剂中提供，进一步包括腐胺和亚硒酸盐。

优选B27补充剂包含生物素、DLα生育酚乙酸酯、DLα生育酚、维生素A(乙酸盐)、BSA、过氧化氢酶、胰岛素(人)、超氧化物歧化酶、皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺HCL、谷胱甘肽、左旋肉碱HCL、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺2HCl、亚硒酸钠、T3(三碘-l-甲状腺原氨酸)。

该培养基进一步包含抗生素，例如青霉素-链霉素。

在一个实施例中，该培养基包含：

-如本文所定义的相应2:1:1比率的IVC1培养基、N2B27基础培养基和TSC基础培养基，

-WNT途径信号传导激活剂(任选地GSK-3抑制剂)，

-至少一种优选地两种TGF-β抑制剂，

-HDAC抑制剂，

-EGF，和

-BMP4。

在本文的任何方面，用于激活WNT途径信号传导的试剂可包括直接或间接激活WNT信号传导的任何小分子。在某些实施例中，用于激活WNT途径信号传导的试剂可以是GSK-3抑制剂。

优选地，TGF-β途径抑制剂选自SB431542和A83-01，组蛋白脱乙酰酶(HDAC)1抑制剂是VPA(丙戊酸)，GSK-3抑制剂是CHIR99021。

优选地，GSK-3抑制剂的浓度等于或为约2μM，TGF-β途径抑制剂的浓度等于或为约0.5μM或1μM，组蛋白脱乙酰酶(HDAC)1抑制剂的浓度等于或为约0.8mM，EGF的浓度等于或为约50ng/ml，并且BMP4的浓度等于或为约10ng/ml。

通常，该培养基进一步包含ROCK抑制剂。优选地，ROCK抑制剂是Y-27632。优选地，ROCK抑制剂的浓度为或约为10μM。

在任何方面，用于步骤c)中的培养基包含如表4中定义的成纤维细胞培养基、N2B27基础培养基、TSC基础培养基、IVC1培养基、IVC2培养基或人iBlastoid培养基或由其组成。

在任何方面，在本发明的任何方法的步骤c)中限定的培养基可以是本发明的任何培养基，包括但不限于如本文(包括在表4中)定义的人iBlastoid培养基。

在任何方面，体细胞具有疾病基因型。例如，体细胞可衍生自患有遗传疾病、优选地早期发育疾病的个体。早期发育疾病的实例是非整倍性、许多单基因疾病、葡萄胎和科妮莉亚德兰格综合征。

重编程细胞以生成多层细胞结构或胚泡样结构

用于将体细胞朝向多能状态重编程的各种方法是本领域已知的。体细胞的重编程通常涉及重编程因子(包括转录因子)的表达，随后在用于促进分化标志物丧失和可塑性标志物获得的特定条件下培养。

根据本发明的方法，体细胞朝向去分化或多能状态重编程，以便获得表现出EPI、TE或PE谱系的转录签名的细胞群，然后使其经受用于促进多层细胞结构或胚泡样结构形成的培养条件。因此，应当理解，细胞群在经受用于促进多层细胞结构或胚泡样结构形成的培养条件时包含重编程中间体。重编程中间体表现出EPI、TE和/或PE谱系的转录签名。优选地，中间体群体表现出EPI、TE和PE谱系中所有三种的转录签名。

在任何方面，表现出EPI、TE或PE谱系的转录签名的细胞群包含表达本文的表2中所列的标志物中的至少一种的细胞群。

优选地，EPI谱系的转录签名包括如本文的表2中所列的EPI谱系标志物中的至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70种或更多种或所有的表达。更优选地，TE谱系的转录签名包括如本文的表2中所列的TE谱系标志物中的至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70种或更多种或所有的表达。更优选地，PE谱系的转录签名包括如本文的表2中所列的PE谱系标志物中的至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70种或更多种或所有的表达。

在特别优选的实施例中，EPI谱系的转录签名包括以下标志物中的任何一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种或所有的表达：ARGFX、NANOG、GDF3、SUSD2、DPPA5、POU5F1、UTF1、TDGF1、PDLIM1和USP28；TE谱系的转录签名包括以下标志物中的任何一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种或所有的表达：KRT18、KRT8、NODAL、UPP1、TAGLN2、KRT19、SLC7A5、FAM101B、CDX2和GATA2；并且PE谱系的转录签名是以下标志物中的任何一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种或所有的表达：PALLD、FST、NOG、CLDN10、SERPINB6、MIAT、CHST2、VSNL1、MT1X、PDPN、SOX17和GATA6。

用于重编程体细胞的合适方法的实例在本领域中是丰富的，并且在WO 2009/101407、WO 2014/200030、WO 2015/056804、WO 2014/200114、WO 2014/065435、WO 2013/176233、WO 2012/060473、WO 2012/036299、WO 2011/158967、WO 2011/055851、WO 2011/037270、WO 2011/090221中举例说明，其内容特此通过援引并入。通常，此类方法包括增加起始细胞类型(或源细胞)中能够(或用于)将细胞朝向多能状态重编程的一种或多种因子或试剂的量。

在某些实施例中，用于重编程体细胞或能够重编程体细胞的因子或试剂是转录因子。替代性地，如本文进一步所述，这些因子或试剂间接增加细胞中一种或多种转录因子的水平。根据本发明的方法可用于重编程体细胞(例如成纤维细胞)的特别优选的转录因子及其核酸序列示于下表3中。根据本发明，应当理解，可使用表3中列出的转录因子中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或所有6种以便重编程体细胞。然而，应当理解，本发明不限于使用表3中列举的转录因子以便重编程体细胞。

本文所指的转录因子和其他蛋白质因子由HUGO基因命名委员会(HGNC)符号表示。表3提供了本文所述转录因子的示例性Ensembl基因ID和Uniprot ID。这些核苷酸序列源自Ensembl数据库(Flicek等人(2014).Nucleic Acids Research[核酸研究]第42卷,第D1期.第D749-D755页)版本83。还考虑用于本发明中的是本文提及的转录因子的任何变体、同源物、直系同源物或旁系同源物。

优选地，根据本发明的方法仅使单一细胞类型经受重编程。换句话讲，优选地，经受重编程的细胞群是同质或基本上同质的细胞群。例如，优选地，细胞群仅由或主要由成纤维细胞或角质形成细胞或本文所述的任何其他体细胞类型组成。因此，应当理解，当确定适于将体细胞朝向多能状态重编程的相关因子时，仅需要考虑一种起始细胞类型。

技术人员将理解，该信息可用于实施本发明的方法，例如，用于在体细胞中提供增加量的转录因子，或提供用于在体细胞中重组表达转录因子的核酸等。

表3：标识本文提及的转录因子的示例性核苷酸序列和氨基酸序列的登录号。

转录因子相关基因名称	Ensembl基因ID	Uniprot ID
			OCT4(也称为POU5F1)	ENSG00000204531	Q01860
SOX2	ENSG00000181449	P48431
			cMYC	ENSG00000136997	P01106
KLF4	ENSG00000136826	O43474
			LIN28	ENSG00000131914	Q9H9Z2
NANOG	ENSG00000111704	Q9H9S0

术语“变体”是指与全长多肽至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致的多肽。本发明考虑使用本文所述的转录因子的变体。变体可以是全长多肽的片段或天然存在的剪接变体。变体可以是与多肽片段至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的多肽，其中片段是至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，只要全长野生型多肽或其结构域具有感兴趣的功能活性，诸如促进体细胞类型转化为靶细胞类型的能力。在一些实施例中，该结构域的长度为至少100、200、300或400个氨基酸，从序列中的任何氨基酸位置开始并向着C-末端延伸。优选避免本领域已知的消除或实质性地降低蛋白质活性的变化。在一些实施例中，该变体缺少全长多肽的N-末端和/或C-末端部分，例如，缺少来自任一末端的多达10、20或50个氨基酸。在一些实施例中，该多肽具有成熟(全长)多肽的序列，其意指其中的一个或多个部分(诸如信号肽)在正常细胞内蛋白质水解加工期间(例如，在共翻译或翻译后加工期间)已经被去除的多肽。在其中不是通过从天然表达它的细胞中纯化蛋白质来产生蛋白质的一些实施例中，蛋白质是嵌合多肽，其意指它含有来自两个或更多个不同物种的部分。在其中不是通过从天然表达它的细胞中纯化蛋白质来产生蛋白质的一些实施例中，蛋白质是衍生物，其意指该蛋白质包含与该蛋白质无关的其他序列，只要这些序列基本上不降低该蛋白质的生物活性。本领域技术人员将意识到或将容易地能够使用本领域已知的测定来确定特定多肽变体、片段或衍生物是否是功能性的。例如，转录因子的变体将体细胞转化为靶细胞类型的能力可使用本文实例中披露的测定来评估。其他方便的测定包括测量激活报道构建体转录的能力，该报道构建体含有与编码可检测标志物诸如荧光素酶的核酸序列可操作地连接的转录因子结合位点。在本发明的某些实施例中，功能性变体或片段具有全长野生型多肽的活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。

关于增加用于将细胞朝向多能状态重编程的因子的量的术语“增加……的量”是指增加感兴趣的细胞(例如体细胞，诸如成纤维细胞)中的因子(例如转录因子)的量。在一些实施例中，当因子的量是相对于对照(例如，其中没有引入所述表达盒中任一个的成纤维细胞)的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多时，在感兴趣的细胞(例如，其中引入了指导编码一种或多种因子的多核苷酸的表达的表达盒的细胞)中因子的量“增加”。然而，考虑增加因子的量的任何方法，包括增加因子(或编码它的前mRNA或mRNA)的量、转录速率或效率、翻译、稳定性或活性的任何方法。此外，还考虑了转录表达的负调节因子的下调或干扰，增加了现有翻译(例如SINEUP)的效率。

如本文所用，术语“试剂”是指任何化合物或物质，诸如但不限于小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等。该试剂可以是增加包括如本文所述的转录因子在内的因子的量的任何化合物或物质。“试剂”可以是任何化学品、实体或部分，包括但不限于合成和天然存在的蛋白质和非蛋白质实体。在一些实施例中，试剂是核酸、核酸类似物、蛋白质、抗体、肽、适配体、核酸寡聚物、氨基酸或碳水化合物，包括但不限于蛋白质、寡核苷酸、核酶、DNA酶、糖蛋白、siRNA、脂蛋白、适配体和修饰，以及其组合等。在某些实施例中，试剂是具有化学部分的小分子。例如，化学部分包括未经取代或经取代的烷基、芳族或杂环基部分，包括大环内酯类、来普霉素(leptomycin)和相关的天然产物或其类似物。化合物可以已知具有所希望的活性和/或特性，或可以选自多样化合物的文库。

当与细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸相关使用时，术语“外源的”是指通过人工或自然手段引入该细胞或生物体的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸；或与细胞相关时，是指通过人工或自然手段分离并且随后引入其他细胞或生物体的细胞。外源核酸可以来自不同的生物体或细胞，或它可以是在该生物体或细胞内天然存在的核酸的一个或多个附加的拷贝。外源细胞可来自不同的生物体，或者它可来自相同的生物体。通过非限制性实例，外源核酸是处于与天然细胞不同的染色体位置的核酸，或以其他方式，侧翼为与自然中发现的不同的核酸序列。外源核酸也可以是染色体外的，诸如附加型载体。

合适的检测手段包括使用标记物，诸如放射性核苷酸、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、色原体、酶底物或辅因子、酶抑制剂、辅基配合物、自由基、颗粒、染料等。此类经标记的试剂可用于多种熟知的测定，诸如放射免疫测定、酶免疫测定(例如，ELISA)、荧光免疫测定等。参见例如美国专利号3,766,162；3,791,932；3,817,837；和4,233,402。

在测定系统中，本发明的方法可以通过任何可接受的小型化方法“小型化”，包括但不限于多孔板(诸如每板24、48、96或384个孔)、微芯片或载玻片。可以减小测定的尺寸以在微芯片支持物上进行，有利地涉及较少量的试剂和其他材料。

用于生成多层细胞结构或胚泡样结构的培养容器

形成胚泡样结构的多层细胞结构发生在允许聚集的合适容器、板、系统或器皿中。通常，培养发生在允许细胞三维聚集的任何培养板、培养容器或培养系统上。

合适的容器、板、系统或器皿优选地具有非粘附表面。非粘附表面是细胞置于其上的表面，并且其对细胞具有很小或没有粘附倾向。因此，细胞基本上不粘附到该表面。不希望受理论束缚，非粘附表面的使用为细胞提供驱动力以不粘附到表面，而是彼此粘附，从而形成用于本发明的细胞结构。

非粘附表面可通过用非粘附生物或人造材料涂覆材料来形成，或者非粘附表面可通过适当地使非粘附材料成型或通过本领域已知的其他方式来获得。在其上或其中可形成细胞聚集体的容器将由此将被称为支架。

具有非粘附表面的支架由例如环氧乙烷、环氧丙烷、聚乙二醇、(PEG)-(共)聚合物(例如PLL-g-(PEG))、聚(环氧乙烷)(PEO)(共)聚合物、琼脂糖水凝胶、低于其较低临界溶解温度(LCST)的温度响应材料(例如聚(N-异丙基丙烯酰胺))、疏水材料(例如烯烃聚合物)、细胞排斥性微米形貌和纳米形貌制成或涂覆有这些材料。

因此，根据本发明形成细胞聚集体优选地在非粘附支架中实现。非粘附支架具有至少一个基本上不允许细胞粘附的表面。优选地，这是形成聚集体的细胞置于其上或其中的那一侧。非粘附支架可以由非粘附材料形成，或者可由涂覆有非粘附材料的另一种材料形成。非粘附的培养皿或管可例如用作支架，但优选地，支架具有板状形状，诸如例如或多或少为六边形、五边形、正方形、矩形、三角形、椭圆形或圆形。

更优选地，支架包括至少一个合适的腔或通道。优选地，在支架上存在多个腔或通道。优选地，这些腔或通道比要形成的细胞聚集体的尺寸稍大。合适的腔和通道是小的，诸如例如直径为20-5000μm、更优选地100-1000μm，并且最优选的是直径为100-500μm、特别是约200μm的腔。合适的腔或通道可通过本领域已知的任何方式获得。直径被定义为在腔或通道的开口的圆周上的任何两个相对点之间的最长可能直线距离。通道或腔具有封闭的底部，并且至少腔或通道内部的表面包含非粘附材料。

优选地，腔具有长度和宽度具有近似相似数量级的形状。深度也具有大致相同的数量级。这种腔被称为微孔。对于本发明，优选的是，非粘附支架包括微孔。微孔优选地是腔，其长度至多是其宽度的约5倍，优选地3倍，更优选地近似等于其宽度，并且其深度不超过其宽度的10倍，优选地不超过其宽度的5倍，更优选地不超过其宽度的3倍。

微孔的长度被定义为微孔开口圆周上任意两个相对点之间的最长可能直线距离。因此，微孔的长度被认为是其直径，其优选地是例如20-5000μm，更优选地100-1000μm，并且最优选地100-500μm，特别是约200μm。微孔的宽度被定义为垂直于其长度的微孔开口圆周上任意两个相对点之间的最长直线距离。

微孔的各种横截面区域，其中那些垂直于和平行于支架表面，可以是任何形状，包括不规则形状，但优选地，微孔的可能横截面区域独立地是正方形或近似正方形、矩形或近似矩形、三角形或近似三角形、椭圆形或近似椭圆形或圆形或近似圆形。然而，优选的是，微孔是圆柱形的，并且在支架的表面中具有近似圆形的开口。合适的微孔例如存在于微孔板上，诸如本领域通常使用的。

在非粘附支架包括微孔的情况下，有利的是在单个支架上布置多个微孔。优选地，这些微孔以规则图案排列。这允许高通量制备大量类囊胚。

在一方面，培养容器是具有或约400μm或800μm或约400μm至800μm之间的倒锥形微孔的阵列的培养板。示例性培养板是AggreWell^TM板，例如AggreWell^TM400或800。在AggreWell板的每个孔中有许多微孔(例如，在24孔Aggrewell的每个孔中，有1200个微孔)。

通过将已知密度的单细胞的充分分散的悬浮液添加到板孔中并轻轻离心该板以迫使细胞均匀地进入微孔，可将细胞接种或添加到微孔中。

允许细胞三维聚集的条件包括以等于或为约0.5至2×10⁵个细胞/孔、等于或为约0.6至2×10⁵个细胞/孔、等于或为约0.8至2×10⁵个细胞/孔、等于或为约1至2×10⁵个细胞/孔、等于或为约0.6×10⁵个细胞/孔、等于或为约0.8×10⁵个细胞/孔、等于或为约1×10⁵个细胞/孔、等于或为约1.2×10⁵个细胞/孔、等于或为约1.4×10⁵个细胞/孔、等于或为约1.6×10⁵个细胞/孔、等于或为约1.8×10⁵个细胞/孔、或等于或为约2×10⁵个细胞/孔的密度接种细胞(例如，当将细胞接种在如本文所述的AggreWell板中时；接种可在每个微孔1-1000个细胞之间)。优选地，细胞在接种前是单细胞悬浮液。优选地，这些细胞是表现出上胚层(EPI)、滋养外胚层(TE)和原始内胚层(PE)转录签名的重编程体细胞的细胞群，或者在本文所述的方法的步骤c)和/或d)中的细胞。

用于由体细胞生成多层细胞结构或胚泡样结构的培养基和条件

本文提及的术语“细胞培养基”(在本文中也称为“培养基(culture medium或medium)”)是用于培养细胞的含有维持细胞活力和支持增殖的营养物的培养基。该细胞培养基可以含有以下任何一种(按适当的组合)：一种或多种盐、一种或多种缓冲液、氨基酸、葡萄糖或其他一种或多种糖、抗生素、血清或血清替代物以及诸如肽生长因子的其他组分。对于本领域技术人员来说，通常用于特定细胞类型的细胞培养基是已知的。本文描述了用于本发明方法中的示例性细胞培养基，包括表1中所示的那些。

如本文所述，根据本发明方法使用的体细胞不需要在步骤c)中与培养基接触的步骤之前完成重编程为多能状态。换句话讲，细胞优选地处于中间状态，当其与培养基接触时从分化状态转变为多能状态，从而能够聚集以获得胚泡样结构或多细胞结构。因此，如本文所述，在步骤b)结束时和在步骤c)中培养之前的细胞可被称为重编程中间体。

在某些实施例中，培养细胞以开始向多能状态重编程的时间段是在增加一种或多种因子的蛋白质表达或量之后至少1天，或从细胞与增加一种或多种因子的蛋白质表达或量的试剂接触时开始。该时间段可以是在增加该一种或多种因子的蛋白质表达或量后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天或更多天。在任何实施例中，用于培养细胞以开始向多能状态重编程的时间段可以是任何时间段，条件是其能够减少与体细胞相关的标志物。

在本发明的其他实施例中，上述方法包括在诱导EPI、TE和PE谱系转录签名上调的培养基中将细胞朝向多能状态培养。优选地，该培养基是成纤维细胞培养基，例如本文包括表1中定义的成纤维细胞培养基。

如本文所用，步骤c)中的培养基也可称为胚泡促进培养基或iBlastoid培养基。优选地，该胚泡促进培养基或iBlastoid培养基是如本文定义的任一种。在任何实施例中，细胞在步骤c)的培养基中培养至少约1、2、3、4、5或6天。

在任何实施例中，在步骤c)中增加用于将体细胞朝向多能状态重编程的因子的蛋白质表达或量和使细胞与培养基接触之间的时间段可以是任何时间段，条件是其能够减少与体细胞相关的标志物。在进一步的实例中，在步骤c)中增加因子的蛋白质表达或量和使细胞与培养基接触之间的时间段可以是任何时间段，条件是其使细胞能够通过间充质进入上皮过渡状态。在进一步或替代性实施例中，该时间段可以是任何时间段，条件是其能够表达上胚层(EPI)、滋养外胚层(TE)和原始内胚层(PE)转录签名。

在任何方面，一种用于促进细胞表现出胚泡样结构的至少一种特征的培养基，该培养基包含

-用于激活WNT途径信号传导的试剂(任选地GSK-3抑制剂)；

-至少一种，优选地2种，TGF-β抑制剂，

-HDAC抑制剂，

-生长因子(优选地EGF)，和

-BMP(优选地BMP4)。

在这方面，WNT激活剂、TGF-β抑制剂、HDAC抑制剂和GSK-3抑制剂可以是本领域已知的任一种，包括本文所述的任一种。

优选地，该培养基进一步包含：

-ITS-X；

-L-谷氨酰胺；

-N-乙酰-L-半胱氨酸；

-Β-雌二醇；

-孕酮；

-2-巯基乙醇；

-L-抗坏血酸；

-转铁蛋白(例如人)，

-胰岛素(例如人)，

-N2补充剂；和

-B27补充剂。

在任何实施例中，该培养基进一步包含抗生素，例如青霉素-链霉素。

在一个实施例中，该培养基包含：

-WNT途径信号传导激活剂(任选地GSK-3抑制剂)，

-至少一种，优选地2种，TGF-β抑制剂，

-HDAC抑制剂，

-GSK-3抑制剂，

-生长因子(优选地EGF)，和

-BMP(优选地BMP4)。

如本文所用，生长因子可以是任何生长因子，但优选地选自表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转化生长因子(TGF)中的一种。生长因子的量可以是任何量，例如0.1至1000g/ml，优选地10-100g/ml，优选地50ng/ml。

优选地，ROCK抑制剂是Y-27632。优选地，ROCK抑制剂的浓度为或约为10μM。

在另一方面，培养基包含如表4中定义的成纤维细胞培养基、N2B27基础培养基、TSC基础培养基、IVC1培养基、IVC2培养基或人iBlastoid培养基或由其组成。

表4.可在本文所述的用于生成多层细胞结构或胚泡样结构(例如iBlastoid)的方法期间使用的细胞培养基

用于生成多层细胞结构或胚泡样结构的核酸和载体

核酸或包含如本文所述的核酸的载体可包含表3中提及的序列中的一者或多者。该核酸或载体可包含编码将体细胞朝向多能状态重编程的因子中的一种或多种的序列。

术语“表达”是指产生RNA和蛋白质以及(适当时)分泌蛋白质涉及的细胞过程，包括(在适用的情况下)但不限于例如转录、翻译、折叠、修饰和加工。

如本文中所使用的术语“分离的”或“部分纯化的”在核酸或多肽的情况下是指从至少一种其他组分(例如，核酸或多肽)中分离的核酸或多肽，其他组分与如在其天然来源中发现的核酸或多肽一起存在和/或当由细胞表达(或在分泌的多肽的情况下分泌)时与该核酸或多肽一起存在。化学合成的核酸或多肽或使用体外转录/翻译合成的核酸或多肽被认为是“分离的”。

术语“载体”是指载剂DNA分子，其中可插入DNA序列以引入宿主或体细胞中。优选的载体是那些能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的载体。能够指导与它们可操作地连接的基因表达的载体在本文中称为“表达载体”。因此，“表达载体”是一种特化载体，其含有在宿主细胞中表达感兴趣的基因所需的必需调节区。在一些实施例中，感兴趣的基因与载体中的另一序列可操作地连接。载体可以是病毒载体或非病毒载体。如果使用病毒载体，优选的是，该病毒载体是复制缺陷型的，其可以通过例如去除编码复制的所有病毒核酸来实现。复制缺陷型病毒载体将仍保留其感染特性，并以与复制型腺病毒载体相似的方式进入细胞，但一旦进入细胞，复制缺陷型病毒载体就不会繁殖或复制(reproduce或multiply)。载体还包括脂质体和纳米粒子以及将DNA分子递送至细胞的其他手段。

术语“可操作地连接”是指将编码序列表达所必需的调节序列置于DNA分子中相对于编码序列的适当位置处，以便影响该编码序列的表达。这种相同的定义有时适用于表达载体中编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的安排。术语“可操作地连接”包括在待表达的多核苷酸序列前面具有适当的起始信号(例如ATG)，并保持正确的阅读框以允许在表达控制序列的控制下表达该多核苷酸序列并且产生由该多核苷酸序列编码的所希望的多肽。

术语“病毒载体”是指使用病毒或病毒相关载体作为核酸构建体进入细胞的载体。可将构建体整合并包装到非复制缺陷型病毒基因组如腺病毒、腺相关病毒(AAV)或单纯疱疹病毒(HSV)或其他病毒中，包括逆转录病毒和慢病毒载体，用于感染或转导到细胞中。该载体可以被或可以不被掺入细胞的基因组中。如果希望的话，该构建体可以包含病毒序列以用于转染。可替代地，该构建体可以掺入能够发生附加型复制的载体(例如EPV和EBV载体)中。

如本文所用，术语“腺病毒”是指腺病毒科的病毒。腺病毒是中等大小(90-100nm)的无包膜(裸露)的二十面体病毒，其由核衣壳和双链线性DNA基因组构成。

如本文所用，术语“非整合型病毒载体”是指不整合到宿主基因组中的病毒载体；由该病毒载体递送的基因的表达是暂时的。由于几乎没有整合到宿主基因组中，非整合型病毒载体具有通过插入基因组中的随机点处而不产生DNA突变的优点。例如，非整合型病毒载体仍然是染色体外的，并且不会将其基因插入宿主基因组中，可能破坏内源基因的表达。非整合型病毒载体可包括但不限于以下：腺病毒、甲病毒(alphavirus)、小核糖核酸病毒和牛痘病毒。这些病毒载体是本文使用的术语“非整合型”病毒载体，尽管在某些罕见的情况下它们中的任何一种都可能将病毒核酸整合到宿主细胞的基因组中。关键的是，本文所述的方法中使用的病毒载体在所采用的条件下通常或作为其生命周期的主要部分，不将它们的核酸整合到宿主细胞的基因组中。

本文所述的载体可以使用科学文献中通常已知的方法来构建和工程化，以增加其在疗法中的使用安全性，包括选择和富集标志物，并且(如果希望的话)优化其上面含有的核苷酸序列的表达。这些载体应包括允许载体在体细胞类型中自我复制的结构组分。例如，已知的EB病毒(Epstein Barr)oriP/核抗原-1(EBNA-I)组合(参见，例如，S.E.和B.Sugden,The plasmid replicon of Epstein-Barr virus:mechanistic insights intoefficient,licensed,extrachromosomal replication in human cells[Eb病毒的质粒复制子:对人细胞中有效的得到许可的染色体外复制的机制见解],Plasmid[质粒]58:1(2007)，如在此阐述的，通过援引以其全文并入本文)足以支持载体自我复制，并且也可以采用已知在哺乳动物(特别是灵长类动物)细胞中起作用的其他组合。构建适用于本发明的表达载体的标准技术是本领域普通技术人员众所周知的，并且可见于出版物诸如SambrookJ等人,"Molecular cloning:a laboratory manual[分子克隆：实验室手册],"(第3版,Cold Spring harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.[冷泉港出版社，纽约冷泉港],2001)中，该文献通过援引并入本文，如同其全文被阐述一样。

在本发明的方法中，将编码转换所需的相关转录因子的遗传物质通过一种或多种重编程载体递送到体细胞中。每个转录因子可以作为多核苷酸转基因引入体细胞中，该多核苷酸转基因编码与异源启动子可操作地连接的转录因子，所述异源启动子可以驱动体细胞中多核苷酸的表达。

合适的重编程载体是本文所述的任一项，包括附加型载体，诸如质粒，其不编码足以产生感染性或复制感受态病毒的病毒基因组的全部或部分，尽管这些载体可含有从一种或多种病毒获得的结构元件。可将一种或多种重编程载体引入单个体细胞。可在单个重编程载体上提供一个或多个转基因。一种强的组成型转录启动子可以为多种转基因提供转录控制，其可以作为表达盒提供。载体上的单独表达盒可以在单独的强的组成型启动子的转录控制下，这些启动子可以是相同启动子的拷贝或可以是不同的启动子。本领域已知各种异源启动子，并且可以依赖于诸如转录因子的所希望表达水平的因素而使用。如下所例示的，使用在体细胞中具有不同强度的不同启动子来控制单独表达盒的转录可能是有利的。选择转录启动子的另一个考虑因素是一种或多种启动子沉默的速率。技术人员将理解，在一种或多种基因的产物完成或基本上完成其在重编程方法中的作用后，减少一种或多种转基因或转基因表达盒的表达可能是有利的。示例性启动子是人EF1α延伸因子启动子、CMV巨细胞病毒即时早期启动子和CAG鸡白蛋白启动子、以及来自其他物种的相应同源启动子。在人类体细胞中，EF1α和CMV都是强启动子，但是CMV启动子比EF1α启动子更有效地沉默，使得在前者控制下转基因的表达比在后者控制下转基因的表达更快地被关闭。这些转录因子可以按可被改变以调节重编程效率的相对比率在体细胞中表达。优选地，当在单个转录物上编码多个转基因时，在一个或多个转基因的远离转录启动子的上游提供内部核糖体进入位点。尽管因子的相对比率可以依赖于递送的因子而改变，但是掌握本披露的普通技术人员可以确定因子的最佳比率。

本领域技术人员将理解，通过单个载体而不是通过多个载体引入所有因子的效率是有利的，但是随着总载体大小增加，引入该载体变得越来越困难。技术人员还将理解，转录因子在载体上的位置可以影响其时间表达以及所得重编程效率。因此，申请人对载体组合采用各种因子组合。这里显示了几种此类组合以支持重编程。

在引入该一种或多种重编程载体之后，并且当体细胞被重编程时，这些载体可以在靶细胞中存留，同时引入的转基因被转录和翻译。在已经重编程为靶细胞类型的细胞中，转基因表达可以有利地被下调或关闭。该一种或多种重编程载体可以仍然是染色体外的。在极低效率下，该一种或多种载体可以整合到细胞的基因组中。以下实例旨在说明而决非限制本发明。

用于转化与本发明一起使用的细胞、组织或生物体的合适的核酸递送方法被认为实际上包括可以将核酸(例如，DNA)引入细胞、组织或生物体的任何方法，如本文所述或如本领域普通技术人员已知的(例如，Stadtfeld和Hochedlinger,Nature Methods[自然方法]6(5):329-330(2009)；Yusa等人,Nat.Methods[自然方法]6:363-369(2009)；Woltjen等人,Nature[自然]458,766-770(2009年4月9日))。此类方法包括但不限于直接递送DNA，诸如通过离体转染(Wilson等人,Science[科学],244:1344-1346,1989,Nabel和Baltimore,Nature[自然]326:711-713,1987)，任选地用基于脂质的转染试剂如Fugene6(罗氏公司(Roche))或Lipofectamine(英杰公司(Invitrogen))，通过注射(美国专利号5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，各自通过援引并入本文)，包括显微注射(Harland和Weintraub,J.Cell Biol.[细胞生物学杂志],101:1094-1099,1985；美国专利号5,789,215，通过援引并入本文)；通过电穿孔(美国专利号5,384,253，通过援引并入本文；Tur-Kaspa等人,Mol.Cell Biol.[分子与细胞生物学],6:716-718,1986；Potter等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],81:7161-7165,1984)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb,Virology[病毒学],52:456-467,1973；Chen和Okayama,Mol.Cell Biol.[分子与细胞生物学],7(8):2745-2752,1987；Rippe等人,Mol.Cell Biol.[分子与细胞生物学],10:689-695,1990)；通过使用DEAE-葡聚糖随后使用聚乙二醇(Gopal,Mol.Cell Biol.[分子与细胞生物学],5:1188-1190,1985)；通过直接音波荷载(Fechheimer等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],84:8463-8467,1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene,Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报],721:185-190,1982；Fraley等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],76:3348-3352,1979；Nicolau等人,Methods Enzymol.[酶学方法],149:157-176,1987；Wong等人,Gene[基因],10:87-94,1980；Kaneda等人,Science[科学],243:375-378,1989；Kato等人,J Biol.Chem.[生物化学杂志],266:3361-3364,1991)和受体介导的转染(Wu和Wu,Biochemistry[生物化学],27:887-892,1988；Wu和Wu,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],262:4429-4432,1987)；以及此类方法的任何组合，其中的每一个都通过援引并入本文。

先前已经描述了许多能够介导将相关分子引入细胞的多肽，并且这些多肽可以适用于本发明。参见，例如，Langel(2002)Cell Penetrating Peptides：Processes andApplications[细胞穿透肽：过程和应用],CRC Press,Pharmacology and ToxicologySeries[CRC出版社，药理学和毒理学系列]。增强跨膜转运的多肽序列的实例包括但不限于果蝇同源蛋白触角足转录蛋白(AntHD)(Joliot等人,New Biol.[新生物学]3:1121-34,1991；Joliot等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],88:1864-8,1991；LeRoux等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],90:9120-4,1993)、单纯疱疹病毒结构蛋白VP22(Elliott和O'Hare,Cell[细胞]88:223-33,1997)；HIV-1转录激活因子TAT蛋白(Green和Loewenstein,Cell[细胞]55:1179-1188,1988；Frankel和Pabo,Cell[细胞]55:1 289-1193,1988)；卡波西FGF信号序列(kFGF)；蛋白质转导结构域-4(PTD4)；穿膜肽、M918、转运素-10；核定位序列、PEP-I肽；两亲性肽(例如，MPG肽)；递送增强转运蛋白，诸如美国专利号6,730,293所述的(包括但不限于在30、40或50个氨基酸的连续集合中包含至少5-25个或更多个连续精氨酸或者5-25个或更多个精氨酸的肽序列；包括但不限于具有足够诸如至少5个胍基或脒基部分的肽)；和可商购获得的Penetratin^TM1肽，以及购自法国巴黎的戴托斯有限公司(Daitos S.A.,Paris,France)的平台的Diatos肽载体(“DPV”)。还参见WO/2005/084158和WO/2007/123667以及其中描述的其他转运蛋白。这些蛋白质不仅可以穿过质膜，而且其他蛋白质(诸如本文所述的转录因子)的附接足以刺激这些复合物的细胞摄取。

表5：仅在始发态或原始态多能状态下表达的标志物基因。

实例

实例1-伦理声明

该研究是在机构莫纳什大学人类研究伦理委员会批准下进行的(首先由MUHREC2020-22909-39935进行，随后由MUHREC 2020-27147-51995进行)。MUHREC 2020-22909-39935涵盖了涉及经历重编程的人成纤维细胞的功能和分子表征以及使用基于3D类器官的培养系统表征这些细胞的实验工作。MUHREC 2020-27147-51995涵盖了iBlastoid的生成、分子和功能表征

此外，由于目前没有使用人类囊胚模型的先例，除了寻求诸位发明人的机构人类研究伦理委员会的批准外，诸位发明人还根据已公布的建议进行了所有实验(Hyun等人Stem Cell Reports[干细胞报告]14,169-174(2020))，并且遵守在受精后长达14天培养人类胚胎和/或形成原条(PS)(以先发生者为准)的国际共识(Warnock,Ir.Nurs.News[护理新闻]5,7-8(1985))。

鉴于“14天规则”不容易应用于iBlastoid，考虑到起始材料不是来自胚胎来源，HDF衍生自成体组织，诸位发明人将重点放在培养iBlastoid所需的最短时间上，在这种情况下最多再培养5天(相当于～E11)，并在形态学上出现PS证据之前终止实验，以便很好地保持在国际指南范围内(Hyun和Warnock，同上)。

为了排除PS形成的分子证据，诸位发明人在5天胚胎附着培养期间进行了几种关键原条标志物的qRT-PCR 24小时时程(Xiang,L.等人Nature[自然]577,537-542(2020)；Takahashi,K.等人Nat.Commun.[自然通讯]5,3678(2014)；Tyser等人bioRxiv[生物档案](2020))，未观察到TBXT、EOMES或MIXL1的上调或指示原肠胚形成的任何形态变化(Tyser，同上；O’Rahilly,R.&Müller,F.Developmental stages in human embryos:revised andnew measurements.[人类胚胎的发育阶段：修订和新的测量]Cells Tissues Organs[细胞组织器官]192,73-84(2010)；Yamaguchi,Y.&Yamada,S.Cells Tissues Organs[细胞组织器官]205,314-319(2018))(图8b、图8a)。因此，在5天的iBlastoid附着培养中，EPI区室没有发展成PS的形成。然而，通过严格遵循上述参数，所有随后的人iBlastoid附着培养实验均在iBlastoid形成后总共进行4.5天(图8a)。

实例2-细胞培养基

成纤维细胞培养基：DMEM(赛默飞世尔公司)、10％胎牛血清(FBS，海克隆公司(Hyclone))、1％非必需氨基酸(赛默飞世尔公司)、1mM GlutaMAX(赛默飞世尔公司)、1％青霉素-链霉素(赛默飞世尔公司)、55μM 2-巯基乙醇(赛默飞世尔公司)和1mM丙酮酸钠(赛默飞世尔公司)。

N2B27基础培养基：DMEM/F-12(赛默飞世尔公司)和Neurobasal培养基(赛默飞世尔公司)的50:50混合物，补充有2mM L-谷氨酰胺(赛默飞世尔公司)、0.1mM 2-巯基乙醇(赛默飞世尔公司)、0.5％ N2补充剂(赛默飞世尔公司)、1％ B27补充剂(赛默飞世尔公司)、1％青霉素-链霉素(赛默飞世尔公司)。

TSC基础培养基：DMEM/F-12，补充有0.3％ BSA(西格玛公司)、0.2％ FBS(赛默飞世尔公司)、1％ ITS-X补充剂(赛默飞世尔公司)、0.1mM 2-巯基乙醇(赛默飞世尔公司)、0.5％青霉素-链霉素(赛默飞世尔公司)、1.5μg/ml L-抗坏血酸(西格玛公司)的GlutaMAX(赛默飞世尔公司)。

IVC1培养基：Advanced DMEM/F-12(赛默飞世尔公司)、1％ ITS-X补充剂(赛默飞世尔公司)、2mM L-谷氨酰胺(赛默飞世尔公司)、0.5％青霉素-链霉素(赛默飞世尔公司)、20％胎牛血清(FBS，海克隆公司)、25μM N-乙酰基-L-半胱氨酸(西格玛公司)、8nMβ-雌二醇(西格玛公司)和200ng/ml孕酮(西格玛公司)。IVC2培养基：Advanced DMEM/F-12(赛默飞世尔公司)、1％ ITS-X补充剂(赛默飞世尔公司)、2mM L-谷氨酰胺(赛默飞世尔公司)、0.5％青霉素-链霉素(赛默飞世尔公司)、30％敲除血清替代物(KSR，赛默飞世尔公司)、25μM N-乙酰基-L-半胱氨酸(西格玛公司)、8nMβ-雌二醇(西格玛公司)和200ng/ml孕酮(西格玛公司)。

人iBlastoid培养基：相应2:1:1的比率的IVC1培养基、N2B27基础培养基和TSC基础培养基，补充有2μM CHIR99021(美天旎生物技术有限公司)、0.5μM A83-01(西格玛公司)、1μM SB431542、0.8mM丙戊酸(VPA，西格玛公司)、50ng/ml EGF(派普泰克公司)和10ng/ml BMP4(美天旎生物技术有限公司)。

实例3-通过重编程生成iBlastoid

本研究中使用的所有细胞系均经过验证，支原体检测如报告摘要中所述。从赛默飞世尔公司(目录号C-013-5C，38F为批号1029000，55F为批号1528526，32F为批号1569390)获得来自三个不同女性供体的原代人成体真皮成纤维细胞(HDFa)，回收细胞并将其接种在补充有低血清生长补充剂(LSGS)(赛默飞世尔公司)的培养基106(赛默飞世尔公司)中用于扩增。

如前所述(Liu,X.等人Nat.Methods[自然方法]14,1055-1062(2017))进行人类体细胞重编程以获得d21重编程中间体。简言之，使用CytoTune-iPS 2.0仙台重编程试剂盒根据制造商的说明书(赛默飞世尔公司，批号2170052)进行人成纤维细胞的重编程。将原代HDFa以约5-10×10⁴个细胞的密度接种在成纤维细胞培养基中。如图1a所示，用FM中的仙台病毒以如下感染复数(MOI)转导细胞：KOS(KLF4-OCT4-SOX2)MOI＝5，c-MYC MOI＝5，KLF4MOI＝6。从转导后第1天开始每隔一天进行培养基替换，并且从第8天开始每天替换。在重编程的第21天，根据制造商的说明书，将细胞解离并以1.2×10⁵个细胞/孔的密度接种到在补充有10μM Y-27632(ROCK抑制剂，赛力克化学公司)的人iBlastoid培养基中的24孔Aggrewell板(干细胞技术公司)上。将细胞在培养箱中于37℃、5％ O2和5％ CO2下培养。24小时后，用不含ROCK抑制剂的新鲜人iBlastoid培养基补充细胞。在Aggrewell中形成iBlastoid的第6天，收集iBlastoid用于随后的分析或体内附着测定。用于生成iBlastoid的培养基的细节总结于以上实例2中。

诸位发明人如前所述(Liu,X.等人Nat.Methods[自然方法]14,1055-1062(2017))进行体细胞重编程，使用无整合的仙台病毒递送OCT4/POU5F1、KLF4、SOX2和c-MYC(OKSM)转录因子(TF)以获得第21天重编程中间体。替代性地，诸位发明人经由转录因子的mRNA转染进行体细胞重编程，如本文实例14中进一步所述。诸位发明人还证明，可使用如实例15和16中所述的类似方法对替代性体细胞进行重编程，从而建立重编程中间体可从各种体细胞获得，并用于本发明的方法中。

当将中间体转移到含有WNT激活剂、TGF-β抑制剂、HDAC抑制剂、EGF和BMP4的培养基中的AggreWell系统中时(参见方法)(图1a)，中间体开始形成聚集体，并且从第3天开始空化并逐渐扩大(图2b)。胚泡样结构在第5至6天变得明显(图1b)，并且NANOG结构的免疫荧光染色揭示了具有NANOG阳性细胞的内细胞团(ICM)样细胞区室，其中囊胚腔样腔被NANOG阴性细胞外层包围(图1c)。由于这些结构是通过体细胞重编程直接衍生的，因此它们被称为“人诱导性类囊胚”(iBlastoid)。此外，iBlastoid的x轴和y轴直径、x:y纵横比以及投影面积的测量揭示它们具有与先前公布的在受精后胚胎第5-7天(E5-7)人胚泡的测量值相当的大小(图1d-h)。此外，iBlastoid中的细胞数量的范围为100至400，其中中值为约280个细胞。尽管中值细胞数略大于在E5-7时人胚泡所报道的(近似平均值为240个细胞)，但它仍然在以前针对E5-7胚泡报道的范围内(图1i)。为了定量iBlastoid形成的效率，对100个随机结构计数，发现14％表现出典型的胚泡样形态，包括囊胚腔(图2c)。在AggreWell系统中形成iBlastoid期间，沿微孔边缘始终观察到不是iBlastoid一部分的粘附细胞聚类。假设这些是来自重编程培养物的难处理成纤维细胞(图2d)。为了验证这一点，分离那些细胞聚类并在成纤维细胞培养基中培养，导致具有典型成纤维细胞形态的细胞增殖(图2d)。这表明这些重编程难处理成纤维细胞不促成iBlastoid形成。使用IVF胚泡质量标准(良好＝1，一般＝2或差＝3)对iBlastoid进行评分(根据Istanbul consensus workshop on embryoassessment:proceedings of an expert meeting.[伊斯坦布尔胚胎评估共识研讨会：专家会议记录]Hum.Reprod.[人体生殖]26,1270-1283(2011)中描述的方法)，指出iBlastoid被评级为良好或一般，ICM平均评分为1.75并且TE平均评分为1.67(图2i-k)。

总之，这些数据证明，重编程中间体可用于直接生成结构类似于胚泡的称为“iBlastoid”的人胚泡样结构。

实例4-iBlastoid表征材料和方法

免疫荧光染色

将iBlastoid/细胞固定在4％多聚甲醛(PFA，西格玛公司)中，用DPBS(赛默飞世尔公司)中的0.5％ Triton X-100(西格玛公司)透化，并用封闭缓冲液(DPBS(赛默飞世尔公司)中的3％牛血清白蛋白(BSA)(西格玛公司)+0.1％吐温-20(西格玛公司))封闭。本研究中使用的所有抗体列于下表6中。

表6：用于表征iBlastoid的抗体

例如，所用的一抗：在封闭缓冲液中制备的兔抗NANOG多克隆(1:100，艾博抗公司)、小鼠抗CDX2 IgG1(1:50，艾博抗公司)。在4℃下在振荡器上进行一抗孵育过夜，随后用二抗(在封闭缓冲液中1:500)进行rtp孵育3小时。本研究中使用的二抗是用于NANOG的山羊抗兔IgG AF555(1:500，赛默飞世尔公司)或山羊抗兔IgG AF647(1:500，英杰公司)，用于CDX2的山羊抗小鼠IgG AF488(1:400，赛默飞世尔公司)或山羊抗小鼠IgG AF488(1:500，赛默飞世尔公司)。标记后，将iBlastoid/细胞用4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI，赛默飞世尔公司)以5μg/ml的浓度在封闭缓冲液中染色1小时。使用SP8倒置共焦显微镜(徕卡公司(Leica))或LSM780多光子共焦显微镜(蔡司公司(Zeiss))拍摄图像。

共焦成像和分析

使用SP8倒置共焦显微镜(徕卡公司)或具有水UV-VIS-IR Apochromat 40X1.2NA物镜和Confocor 3模块的高灵敏度雪崩光电二极管光检测器(蔡司公司)的激光扫描共焦(LSM 780显微镜，蔡司)对免疫染色的iBlastoid进行成像。使用Imaris 9.5软件(位平面公司(Bitplane AG))进行iBlastoid的3D显像。手动表面渲染模块用于细胞和iBlastoid分割。使用Adobe Photoshop或ImageJ处理并组装最终图像。

荧光激活细胞分选(FACS)

将iBlastoid用TrypLE Express(赛默飞世尔公司)解离，并将补充有2％ FBS(海克隆公司)和10μM Y-27632(赛力克化学公司)的DPBS(赛默飞世尔公司)用于样品的最终重悬。将解离的细胞以400×g沉淀5分钟，然后重悬于500μl的最终体积中，添加碘化丙啶(PI)(西格玛公司)至2μg/ml的浓度。在Influx仪器(BD生物科学公司(BD Biosciences))上用100μm喷嘴进行细胞分选。

定量RT-PCR

使用RNeasy微量提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen))或RNeasy小量提取试剂盒(凯杰公司)和QIAcube(凯杰公司)根据制造商的说明书从细胞中提取RNA。然后使用SuperScriptIII cDNA合成试剂盒(赛默飞世尔公司)或QuantiTect逆转录试剂盒(凯杰公司，目录号205311)进行逆转录，使用QuantiFast SYBR Green PCR试剂盒(凯杰公司)一式三份地建立实时PCR反应，然后在7500实时PCR系统(赛默飞世尔公司)上进行。本研究中使用的qRT-PCR引物示于下表7中。

表7：qRT-PCR引物

中胚层分化

通过修改先前公布的中胚层分化方案(Lam,A.Q.等人J.Am.Soc.Nephrol.[美国肾脏学会期刊]25,1211-1225(2014))获得原条标志物qRT-PCR的阳性对照。简言之，用由RPMI、GlutaMAX(赛默飞世尔公司)、1％ B27补充剂(赛默飞世尔公司)、1％青霉素-链霉素(赛默飞世尔公司)和5μM CHIR99021(美天旎生物技术有限公司)组成的培养基替换在E8培养基(赛默飞世尔公司)中以50％汇合度生长的人iPSC。48小时后，收集分化细胞用于qRT-PCR分析，其高表达原始条纹标志物TBXT、EOMES和MIXL1(图8b)。

hCG ELISA

iBlastoid的生成和体外附着测定如以下“体外附着测定”实例中所述进行。收集培养基中的iBlastoid(第6天)和附着的iBlastoid(第6+4.5天)两者并储存在-80℃。使用hCG ELISA试剂盒(亚诺法公司(Abnova)，ABNOKA4005)根据制造商的说明书测量培养基中的hCG水平。

iBlastoid的单细胞RNA-测序(scRNA-seq)

对于scRNA-seq实验，将iBlastoid解离以获得单细胞悬浮液用于FACS，如以上章节中所述。将经受FACS的细胞分选为PI阴性的非碎片活单细胞用于scRNA-seq。按照制造商的说明书“Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒V3.3用户指南”，使用Chromium控制器(10xGenomics)分离、封装和构建收集的细胞。在Illumina NovaSeq6000上使用配对末端(R128bp和R2 87bp)测序策略并针对每个细胞20,000个读对进行测序。Chromium条码用于解复用，并且使用Cellranger程序(v3.1.0，http://software.10xgenomics.com/single-cell/overview/welcome)从mkstaq管线生成FASTQ文件。使用Cellranger进行比对和UMI计数，Cellranger利用STAR比对器(Dobin,A.等人Bioinformatics[生物信息学]29,15-21(2013))将测序读段映射到Ensembl GRCh37.87参考基因组的定制版本，我们通过定制SENDAI KLF4、MYC和SEV(KOS)载体的序列对其进行扩增。该步骤产生9060个独特的细胞条形码。

iBlastoid scRNA-seq细胞供体鉴定

为了确定每个细胞的个体供体标识，采用Bayesian解复用工具Vireo(v 0.3.2)(Huang,Genome Biol.[基因组生物学]20,273(2019))。简言之，诸位发明人使用cellSNP(v0.3.0)在单细胞数据中汇编了所表达的等位基因，以生成最小等位基因频率(使用自变量minMAF)为0.1和最小独特分子标识符(使用自变量minCOUNT)为20的单核苷酸多态性(SNP)的列表。此外，cellSNP需要人变体的参考列表来调用SNP，并且诸位发明人使用来自由Vireo的作者提供的1000个基因组的项目的SNP的预编译列表(从https://sourceforge.net/projects/cellsnp/files/SNPlist/下载)。特别地，使用基于hg19基因组的具有>0.05的次要等位基因频率、含有7.4百万个SNP的变体列表。随后，通过将细胞分离成两个供体群体，进行Vireo以解复用单细胞文库。注意，Vireo仅能区分两个供体的细胞，但不能为每个细胞指定准确的供体标识(32F或38F)。

iBlastoid scRNA-seq细胞调用、质量控制

首先在细胞水平上进行质量控制。丢弃具有(i)两种细胞系供体或没有细胞系供体的证据，(ii)低数量的表达基因[nGene]，或(iii)高百分比线粒体基因[pctMT]的细胞。将截止值nGene<1,300、pctMT>15应用于丢弃细胞。接下来，在基因水平上进行质量控制。如果基因在至少50个细胞中不存在，则对其进行过滤，每个细胞具有至少1个读数。在研究每个变量的分布之后确定所有截止值。在质量控制后，保留6858个细胞和14224个基因用于scRNA-seq。

iBlastoid scRNA-seq分析

在该章节的其余部分中的分析使用具有Seurat(v3.1.5)的R(v3.6)55进行(Butler等人Nat.Biotechnol.[自然生物技术]36,411-420(2018)；Stuart,T.等人Cell[细胞]177,1888-1902.e21(2019))。使用ggplot2(v3.3.1)58和具有pheatmap的heatmap(v1.0.12)生成生物信息学绘图(Kolde,R.&Vilo,J.F1000Research[F1000研究]第4卷574(2015))。使用Seurat中的SCTransform函数(Hafemeister,C.&Satija,R.Genome Biol.[基因组生物学]20,296(2019))对数据进行缩放和标准化。在主成分分析(PCA)后，使用20个维度生成均匀流形近似(UMAP)。使用分辨率为0.2的FindClusters函数进行无监督聚类，得到7个单独的聚类。采用Wilcoxon秩和检验和0.25对数倍数的最小上调，用FindAllMarkers函数鉴定聚类(聚类标志物)之间差异表达的基因。用AddModuleScore函数以及分别由Petropoulos,S.等人Cell[细胞]165,1012-1026(2016)和Liu等人(Nature[自然]2020年9月16日.doi:10.1038/s41586-020-2734-6)公布的基因签名来计算细胞类型签名(EPI、TE、PE、非重编程(NR))的平均过表达。使用规范标志物、Petropoulos和Liu签名作为证据，将细胞类型手动分配到聚类中。将剩余的细胞群标记为“中间体”(IM)并计数(Rossant,J.&Tam,P.P.L.Cell Stem Cell[细胞干细胞]第20卷18-28(2017)；Harrison等人Science[科学]356,(2017)；Sozen,B.等人Nat.Cell Biol.[自然细胞生物学]20,979-989(2018))。最后，使用来自scran包的气旋函数(Scialdone,A.等人Methods[方法]85,54-61(2015))计算细胞周期评分，并根据最高概率分配细胞阶段。

整合scRNA-seq分析

将先前发布的来自Petropoulos,S.等人Cell[细胞]165,1012-1026(2016)(Petropoulos)和Blakeley,P.等人Development[发育]142,3613(2015)(Blakeley)的单细胞数据集与此处发布的iBlastoid数据整合。首先，从iBlastoid数据中移除NR聚类中与该整合无关的细胞。对Petropoulos的1529个细胞进行总胚泡细胞过滤，去除胚泡前阶段，留下1096个E5-E7 EPI、TE和PE细胞。使用SCTransform处理Petropoulos的数据和Blakeley的30个细胞。在使用衍生自SCT测定的4000个锚定基因鉴定整合基因(FindIntegrationAnchors和IntegrateData)后，将两个数据集整合到iBlastoid数据中。整合数据集具有7861个细胞、23308个基因和4000个整合基因。PCA和UMAP(20个维度)用于降维并且FindClusters用于鉴定聚类(分辨率0.2)。使用来自所有三个数据集的细胞标识的共定位作为证据，以及标志物和签名表达，手动分配5个单独聚类的聚类标识。使用整合的基因表达值和对所有细胞的基因表达平均值的皮尔逊相关性计算转录组相关性：a)相同的原始细胞标识(iBlastoid的聚类id，Blakeley的EPI、TE、PE，Petropoulos的E5-7 EPI、TE、PE)，或b)相同的细胞类型(所有EPI、TE、PE细胞的聚集体，以及另外iBlastoid的IM)。

体外附着测定

如以上实例3中所述进行iBlastoid的生成。体外附着测定(其通常用作胚胎植入的模型)通过适应先前公布的方案(Shahbazi等人Nat.Cell Biol.[自然细胞生物学]18,700-708(2016)；Deglincerti,A.等人Nature[自然]533,251-254(2016))进行。简言之，将衍生的iBlastoid转移到光学级组织培养板(Eppendorf)上，并在IVC1培养基中于37℃、5％O₂和5％CO₂培养箱中培养。在附着测定的第2天，将培养基替换为IVC2培养基。在附着试验中培养iBlastoid直至第4.5天并收集用于分析。体外附着测定中使用的培养基的细节总结于实例2中。

统计和再现性

对于图2a，用4,761个细胞重新分析从先前研究(Liu等人Nature[自然]2020年9月16日.doi:10.1038/s41586-020-2734-6)获得的第21天成纤维细胞重编程中间体scRNA-seq数据。对于iBlastoid scRNA-seq数据，从n＝2个生物学重复获得的总共6858个细胞包括在本研究中使用的所有分析中。对于本研究中使用的人胚泡的scRNA-seq数据集，总共1096个细胞改编自Petropoulos数据集并且总共30个细胞改编自Blakeley数据集用于分析。对于iBlastoid和人胚泡整合数据集，总共使用7861个细胞进行分析。对于图1b，从2个独立的重编程实验的3个不同的供体成纤维细胞生成iBlastoid(n＝5个生物学重复)，并且代表性图像示于图中。对于图1c，对来自2个独立重编程实验的3个不同供体的iBlastoid进行免疫染色(n＝5个生物学重复)，获得了相似的结果，并且代表性图像示于图中。对于图1e-h，从8个出版物(n＝8)中参考人胚泡的数据，同时对从3个不同供体获得的18个独立的iBlastoid进行iBlastoid的各种参数的定量(n＝18个生物学重复)。对于图1i，对从3个不同供体获得的14个独立的iBlastoid进行细胞数量定量(n＝14个生物学重复)。对于图1j-l，对来自2个独立的重编程实验的3个不同供体的iBlastoid进行免疫染色(n＝5个生物学重复)，获得了相似的结果并且代表性图像示于图中。对于图1m，对来自3个不同供体的iBlastoid进行免疫染色(n＝3个生物学重复)，获得了相似的结果，并且代表性图像示于图中。对于图1n-r，对来自2个不同供体的iBlastoid进行免疫染色(n＝2个生物学重复)，获得了相似的结果，并且代表性图像示于图中。在iBlastoid中也观察到具有外部TE样细胞的致密角蛋白8(KRT8)纤丝网络，这与在胚泡中典型地观察到的一致(图1s)。

对于图7a，使用衍生自2个独立的重编程实验的3个不同供体成纤维细胞的iBlastoid进行体外附着测定(n＝5个生物学重复)，并且代表性图像示于图中。对于图7b-c，对来自2个不同供体的iBlastoid进行免疫染色(n＝2个生物学重复)，获得了相似的结果，并且代表性图像示于图中。对于图7e，对来自2个独立重编程实验的2个不同供体的iBlastoid进行免疫染色(n＝4个生物学重复)，获得了相似的结果，并且代表性图像示于图中。对于图7f-g，对来自2个不同供体的iBlastoid进行免疫染色(n＝2个生物学重复)，获得了相似的结果，并且代表性图像示于图中。对于图7h，在具有技术重复的n＝5个独立实验中测量CSH1和ITGA1的倍数变化表达。数据表示为平均值±标准误差。对于图7i，hCG ELISA在具有技术重复的n＝4个独立实验中进行。数据表示为平均值±标准误差。对于图2b，从2个独立的重编程实验的三个不同的供体成纤维细胞生成iBlastoid(n＝5个生物学重复)，并且代表性图像示于图中。对于图2c，通过计数获得的100个独立的3D结构进行iBlastoid效率的定量(n＝100个生物学重复)。对于图2d，用来自3个不同供体的n＝3个生物学重复进行实验，获得了相似的结果，并且代表性图像示于图中。对于图2e，对来自2个独立重编程实验的3个不同供体的iBlastoid进行免疫染色(n＝5个生物学重复)，获得了相似的结果，并且代表性图像示于图中。对于图2f-g，对来自2个不同供体的iBlastoid进行免疫染色(n＝2个生物学重复)，获得了相似的结果，并且代表性图像示于图中。对于图8ba，在来自具有技术重复的2个供体的n＝6个独立实验中测量TBXT、EOMES、MIXL1的倍数变化表达。数据表示为平均值±标准误差。对于图8c，对来自2个独立重编程实验的3个不同供体的iBlastoid进行免疫染色(n＝5个生物学重复)，获得了相似的结果，并且代表性图像示于图中。对于图8d，对来自3个不同供体的iBlastoid进行免疫染色(n＝3个生物学重复)，获得了相似的结果，并且代表性图像示于图中。对于图8e-f，对来自2个不同供体的iBlastoid进行免疫染色(n＝2个生物学重复)，获得了相似的结果，并且代表性图像示于图中。

实例5-iBlastoid表征结果

为了进一步证实iBlastoid内细胞的标识和空间定位，诸位发明人进行了EPI标志物NANOG和TE标志物CDX2的共免疫染色。然后它们应用共焦成像和分析以获得iBlastoid的三维(3D)表示。结果表明NANOG阳性细胞仅位于ICM样区室中，而CDX2阳性细胞存在于类似TE的外层中(图1j)。

微分干涉对比的3D重建和叠加(DIC)证实了NANOG阳性细胞和CDX2阳性细胞的空间定位，以及证实了在类似于胚泡的iBlastoid结构中形成的囊胚腔样腔的存在(Shahbazi,M.N.等人Nat.Cell Biol.[自然细胞生物学]18,700-708(2016)，Deglincerti,A.等人Nature[自然]533,251-254(2016)；Xiang,L.等人Nature[自然]577,537-542(2020))(图1k、l)。重要的是，诸位发明人能够证实这些结果来自多轮iBlastoid生成中由两个附加的成纤维细胞供体生成的iBlastoid(图2e)。

为了进一步表征iBlastoid的EPI和TE样细胞，诸位发明人测试了iBlastoid中两种附加的EPI标志物(OCT4，也称为POU5F1和SOX2)和TE标志物(GATA2)的组合。如针对人胚泡所述(Fogarty,N.M.E.等人Nature[自然]550,67-73(2017)；Boroviak,T.等人Development[发育]145,(2018))，外部TE样细胞是GATA2阳性的，而在ICM样区室中发现OCT4和SOX2的显著共定位(图1m)。为了评价iBlastoid中PE样细胞的存在，诸位发明人首先对SOX17(PE标志物)以及GATA2(TE标志物)和NANOG(EPI标志物)进行免疫染色。在ICM样区室中，诸位发明人鉴定了NANOG阳性细胞外周的SOX17阳性细胞(图1n、图2f)，类似于先前报道的E6-7胚泡(Xiang同上；Wamaitha,S.E.等人Nat.Commun.[自然通讯]11,764(2020))。

为了进一步验证，诸位发明人使用另一种PE标志物GATA6与CDX2(TE标志物)和OCT4(EPI标志物)组合进行附加的免疫染色。他们注意到在TE样区室中的“椒盐”模式，如GATA6与CDX2染色的共定位所指示(图1o、图2g)。尽管最初令人迷惑，但这种模式以前已有报道，其中GATA6也在E6-7人胚泡中普遍检测到(Deglincerti，同上；Roode,M.等人Humanhypoblast formation is not dependent on FGF signalling.[人下胚层的形成不依赖于FGF信号传导]Dev.Biol.[发育生物学]361,358-363(2012)；Kuijk,E.W.等人The rolesof FGF and MAP kinase signaling in the segregation of the epiblast andhypoblast cell lineages in bovine and human embryos.[激酶信号传导在牛和人胚胎中的上胚层和下胚层细胞系的分离中的作用]Development[发育]139,871-882(2012))。重要的是，在更密切的检查中，诸位发明人观察到GATA6阳性细胞(具有低或弱的CDX2染色)邻近ICM样区室中的OCT4阳性细胞，提示iBlastoid中可能存在GATA6阳性PE样细胞(图1o)。

在人胚泡中，TE和EPI谱系的细胞在细胞形态上具有明显的差异，其中TE细胞显示“经典的”细长的上皮形态，而EPI细胞由于ICM的限制而较小且致密(Kovacic,B.,Vlaisavljevic,V.,Reljic,M.&Cizek-Sajko,M.Reprod.Biomed.Online[生殖生物医学在线]8,687-694(2004))。为了检查iBlastoid中EPI样和TE样细胞的细胞形态是否存在任何差异，诸位发明人利用iBlastoid上的细胞膜标志物F-肌动蛋白(也称为鬼笔环肽)来显现细胞构架(图1p-r)。结果表明致密的NANOG阳性EPI样细胞具有更圆的柱状外观，而围绕囊胚腔的TE样细胞是扁平的，这突出了该模型能够概括EPI和TE细胞的细胞构架的差异(图1q)。总之，这些结果表明iBlastoid在E6-7时显示出人胚泡的主要形态特征，并且还可模拟EPI、TE和PE细胞的关键分子和空间方面。

实例6-iBlastoid的单细胞转录组谱分析

为了进一步表征iBlastoid中细胞的转录组成，诸位发明人使用从两个供体生成的iBlastoid进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)(图3a)。在质量控制和严格过滤后，保留6858个细胞(来自供体1的3249个细胞和来自供体2的3609个细胞)，并且检测总共14224个基因用于下游分析(图4a)。scRNA-seq数据的均匀流形近似和投影(UMAP)分析表明，细胞基于供体或细胞周期差异均匀地分布而没有聚集(图4b、c)。尽管可检测到仙台-KLF4转录物，但在scRNA-seq数据中存在最小的仙台-KOS和仙台-MYC表达(图4d)，表明外源OCT4和SOX2不表达，或以非常低的水平表达。

为了鉴定UMAP上的推定的EPI、TE和PE细胞聚类，诸位发明人检查了我们的scRNA-seq iBlastoid数据集中EPI标志物(NANOG和OCT4/POU5F1)、TE标志物(CDX2和GATA2)和PE标志物(SOX17和GATA6)的表达。如图3b所示，表达OCT4和NANOG的细胞占据UMAP空间中的不同区域。在该注释中，更多的细胞表达内源性OCT4而不是NANOG(参见方法)，这是在人胚泡中观察到的特征(图4e)。表达SOX17和GATA6的细胞也在UMAP上的限定区域中发现，而诸位发明人发现CDX2和GATA2更异质的表达，这类似地在由E5-7人胚泡生成的scRNA-seq数据集中观察到(图3b、图4e)。

为了进一步证实iBlastoid中的细胞标识以及EPI、TE和PE谱系的存在，诸位发明人应用了基于Petropoulos(同上)中定义的一组EPI、TE和PE特异性基因签名的评分系统，使用它们的E5-7人胚泡的scRNA-seq(图3c)。使用这些定义的签名，诸位发明人在iBlastoid数据集的UMAP上分辨了不同的EPI、TE和PE细胞群。对iBlastoid和胚泡scRNA-seq数据集上由E5、E6和E7分隔的确定的EPI、TE和PE签名的进一步检查显示可忽略的差异(图5a-b)。总之，结果证实iBlastoid中存在EPI、TE和PE样细胞。

实例7-iBlastoid在转录上类似于胚泡

为了进一步分辨iBlastoid内细胞的标识，诸位发明人进行了无监督的聚类分析，鉴定了7个细胞聚类(图3d)。基于EPI、TE和PE基因签名，将聚类指定为：EPI聚类、TE聚类或PE聚类。三个剩余的聚类事先不具有清楚的标识，并且似乎具有中间签名(聚类IM1-3)(图6a-b、图3d)。有趣的是，聚类IM1表达高水平的CDX2以及外源KLF4(图3b、图4d)，这可能提示这些细胞正在变为TE样细胞。类似地，由EPSC生成的小鼠类囊胚具有中间的或不确定的签名的细胞聚类，如scRNA-seq转录组图谱分析所揭示的。诸位发明人还观察到代表非重编程难处理成纤维细胞的细胞聚类(图4f、g)。在该注释中，这种小成纤维细胞聚类被排除在下游分析之外。

人胚泡的TE细胞在胚胎发生期间特化为极TE和壁TE。对iBlastoid中由Petropoulos等人定义的极TE签名和壁TE签名的检查显示iBlastoid具有两种不同的TE细胞群，一种表达较高的极TE相关签名，另一种表达壁TE签名(图3j、k、l)。极标志物CCR713的免疫染色分析也提示在iBlastoid的极侧的更高表达(图3m、n)。

为了确定iBlastoid的细胞与IVF后生成的胚泡细胞的相似程度，诸位发明人将iBlastoid scRNA-seq与Lanner和Niakan,K.K.&Eggan,K.Dev.Biol.[发育生物学]375,54-64(2013)的小组先前报道的从人胚泡获得的两个附加scRNA-seq数据集整合。使用Smart-seq2在研磨细胞上生成来自Lanner小组的数据集，其中经由免疫手术富集E5-7时的样品子集的ICM细胞。对于来自Niakan小组的数据集，使用经由激光活组织检查的显微操作从胚泡分离ICM和极TE，并且生成来自分离的单细胞的cDNA并对其进行测序。UMAP分析揭示了胚泡细胞和iBlastoid之间的高度一致性(图3e、f、图6c、d)。重要的是，来自EPI-iBlastoid聚类、TE-iBlastoid聚类和PE-iBlastoid聚类的细胞与它们的来自胚泡的EPI、PE和TE对应物重叠(图3e)。为了进一步表征这些细胞群，进行无监督聚类(图3g、h)，证实来自iBlastoid的PE、EPI和TE样细胞与来自胚泡的PE、EPI和TE细胞共享相同的聚类。在该注释中，诸位发明人还观察到一些胚泡TE细胞与IM1-iBlastoid聚类的细胞聚类在一起(图3e)。此外，iBlastoid EPI、TE和PE聚类与来自E5-7胚泡的注释EPI、TE和PE细胞的相关性分析揭示iBlastoid聚类与它们的胚泡对应物之间的高度相关性(约0.9)(图3i)。诸位发明人将iBlastoid细胞聚类与来自Petropoulos数据集中来自不同发育日(E5、E6和E7)的胚泡的EPI、TE和PE细胞相关联，观察iBlastoid细胞聚类与E5-7胚泡阶段的相应EPI/TE/PE谱系的相关性(图6e)。分级聚类分析提示iBlastoid EPI聚类与早期胚泡EPI(E5和E6)的相关性更好。总之，该数据证明iBlastoid的细胞如实地再现了E5-6时人胚泡中存在的三种细胞谱系的转录组成。

实例8-iBlastoid可模拟体外植入

为了评价iBlastoid是否可用于模拟在不存在子宫的情况下在人胚胎发育的围植入期和植入后早期窗口期间发生的形态和分子变化，诸位发明人通过修饰先前使用人胚泡公布的人胚胎附着培养物进行了体外附着测定。尽管目前没有使用人类囊胚模型的先例，但所有实验均得到了机构人类研究伦理委员会根据公布建议的批准，并且遵守在受精后长达14天培养人类胚胎和/或形成原条(PS)(以先发生者为准)的国际共识。鉴于“14天规则”不适用于iBlastoid，考虑到起始成纤维细胞衍生自成年供体，诸位发明人将重点放在培养iBlastoid可能的最短时间上，在这种情况下最多再培养5天(相当于～E11)，并在形态学上出现PS证据之前终止实验，以便很好地保持在国际指南范围内。为了排除PS形成的分子证据，诸位发明人在5天胚胎附着培养期间进行了几个关键原条标志物的qRT-PCR 24小时时程，并且没有观察到TBXT、EOMES或MIXL1的上调或指示原肠胚形成的任何形态变化(图8b)。因此，在5天的iBlastoid附着培养中，EPI区室没有发展成PS的形成。然而，通过严格遵循上述参数，诸位发明人在iBlastoid形成后总共进行了4.5天的所有随后的人iBlastoid附着培养实验。

使用附着培养模型，大多数iBlastoid(>90％)在24小时内附着，大小增加、变平并进展形成向外生长，类似于在人胚泡中报道的(图7a)。附着后，NANOG和OCT4/SOX2阳性细胞的数量增加，表明iBlastoid EPI的扩增(图8c、d)，类似于当使用人胚泡时观察到的情况。此外，CDX2和GATA2阳性细胞也在附着时扩散(图8c、d)，这表明附着的iBlastoid的TE向外生长。使用由两个附加的供体生成的iBlastoid也获得了类似的结果(未示出)。接下来，诸位发明人检查了附着后PE样细胞的分布。尽管它们中的许多仍用TE标志物(GATA2或CDX2)共染色，但诸位发明人注意到一些SOX17和GATA6阳性细胞定位于NANOG或OCT4阳性EPI的周边(图7b、c、图8e、f)。

以前已报道了在体外附着后，人胚泡的EPI细胞极化并形成称为前羊膜腔的腔。F-肌动蛋白、OCT4和aPKC免疫染色表明EPI区室中约20％-30％附着的iBlastoid的中心腔(由F-肌动蛋白和aPKC标记)被放射状组织化的OCT4阳性细胞包围(图7d)。诸位发明人在附着的第3天观察到EPI样细胞的极化和前羊膜样腔的出现。

然后诸位发明人研究了TE-谱系在附着时可能的细胞命运转变。值得注意的是，他们发现附着的iBlastoid中TE细胞的高强度和丝状角蛋白KRT7(泛滋养层标志物)染色，与附着培养前iBlastoid中的暗淡且有限的KRT7染色相反(图7e)。结果提示TE细胞状态转变为滋养层谱系，这在培养人胚泡时也有报道。重要的是，诸位发明人观察到与EPI细胞相比，附着的iBlastoid中EPI样区室周围的细胞具有更大的核体积，这是滋养层细胞的指示(图7f)。值得注意的是，诸位发明人发现了一些在形态上类似合体滋养层(ST)和绒毛外滋养层(EVT)的细胞，如由在附着的iBlastoid的外周中的相应多核表型和纺锤体样形态所证明的(图7f)。

为了进一步验证ST和EVT样细胞的存在，诸位发明人使用hCG作为ST标志物并且MMP2作为EVT标志物进行免疫染色(图7g)。诸位发明人检测到hCG的强烈且广泛的染色，反映了ST的早期发展；然而，在较低数量的细胞中检测到MMP2，这与在植入阶段期间后期产生的EVT一致(图7g)。此外，qRT-PCR分析还揭示了ST标志物CSH1和EVT标志物ITGA117随附着而上调，表明iBlastoid TE细胞可分化成ST和EVT样状态(图7h)。

最后，诸位发明人对从附着的iBlastoid收集的条件培养基进行了hCG ELISA，并在附着后4.5天检测到hCG的量增加10倍(图7i)。总之，结果显示iBlastoid可用于模拟类似于胚泡的体外植入，这突出了这样的事实，即它是一种有价值的模型系统，能够分析人的胚胎发育的围植入期和植入后早期阶段。

实例9-iBlastoid衍生的细胞系的建立

如本文所述进行人iBlastoid的生成。将在形成的第6天收集的iBlastoid用于建立iBlastoid(B)衍生的细胞系，包括原始态类囊胚多能干细胞(原始态bPSC)、始发态类囊胚多能干细胞(始发态bPSC)、类囊胚滋养层干细胞(bTSC)和类囊胚胚外内胚层(bXENs)(图9a)。为了从iBlastoid衍生这些细胞系，使用TrypLE express将iBlastoid解离成单个细胞并接种到各自的培养条件中(图9a)。简言之，为了衍生原始态BPSC，将细胞在t2iLGoY培养基(Guo等人2016Stem Cell Reports[干细胞报告]6:437-46)中在经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞(iMEF)层上培养；为了衍生始发态bPSC，将细胞在Essential 8^TM培养基(https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1517001#/A1517001)中在玻连蛋白上培养；为了衍生bTSC，将细胞在TSC培养基(Okae等人2018)中在胶原IV上培养；并且为了衍生bXEN，将细胞在NACL培养基(Linneberg-Agerholm等人2019,Development[发育]:146)中在iMEF层上培养。在5-10天内观察到具有代表相应细胞类型的形态的细胞，并且一旦达到60％-80％的汇合度就准备传代(图9b、d、f)。

诸位发明人证明衍生自iBlastoid的干细胞可在培养物中维持超过25代。

原始态bPS细胞显示典型的圆顶形形态，对KLF17/NANOG染色呈阳性，并且它们表达原始态多能性相关标志物(DPPA3、KLF17、DNMT3L、DPPA5、SUSD2、KLF5)。始发态bPS细胞表现出扁平上皮形态，对TRA-160/NANOG染色呈阳性，并且这些细胞表达始发态多能性相关标志物(ZIC2、ZIC3、NLGN4X、OTX2、CD24、SALL2)。bTS细胞显示预期的鹅卵石样形态，并且对KRT7(泛滋养层标志物)和GATA2呈阳性以及表达滋养层相关基因诸如GATA2、GATA3、TFAP2C、KRT7、TP63和TEAD4(图9b-g，图11b、c)。重要的是，诸位发明人证明原始态和始发态bPS细胞具有三系分化潜能(图11d-h)。此外，他们证实了bTS细胞产生绒毛外滋养层(EVT)和合体滋养层(ST)的能力(图11i-n)。总之，这些结果提示iBlastoid具有产生使用胚泡衍生的主要干细胞类型的能力。

实例10-iBlastoid衍生细胞系的维持

为了维持原始态bPSC，以1:10-20的分裂比每6天常规传代细胞一次。简言之，使用Accutase在室温下将原始态bPSC解离5分钟。将解离的细胞接种到t2iLGoY培养基中的iMEF层(在传代前一天制备)上，并在37℃、O₂和5％ CO₂培养箱中培养。每天进行培养基替换。

为了维持始发态bPSC，以1:20-40的分裂比每6天常规传代细胞一次。简言之，在室温下使用0.5mM EDTA将始发态bPSC解离8分钟。将解离的细胞接种在Essential8^TM培养基中的5μg/ml玻连蛋白包被的板(在传代前于室温包被至少一小时)上，并在37℃、5％ O₂和5％CO₂培养箱中培养。在传代期间以10μM的浓度添加ROCKi以增强细胞附着和存活。每天进行培养基替换。

为了维持bTSC，以1:4-1:10的分裂比每4-6天常规传代细胞一次。简言之，使用TrypLE express在37℃下将BTSC解离8-10分钟。将解离的细胞接种在TSC培养基中的5μg/ml胶原IV包被的板(在传代前于37℃包被至少一小时)上，并在37℃、20％ O₂和5％ CO₂培养箱中培养。每隔一天进行培养基替换。

为了维持bXEN，以1:4-1:10的分裂比每4-6天常规传代细胞一次。简言之，使用Accutase在室温下将bXEN解离3-5分钟。将解离的细胞接种到NACL培养基中的iMEF层(在传代前一天制备)上，并在37℃、5％ O₂和5％ CO₂培养箱中培养。在传代期间以10μM的浓度添加ROCKi以增强细胞附着和存活。每隔一天进行培养基替换。

实例11-用于生成iTSC的示例性方法

在从成纤维细胞重编程为iPSC期间，可在TSC培养基中捕获和稳定中间体，从而允许iTSC的产生。

原代成人真皮成纤维细胞(HDFa)获自生命技术公司(Life Technologies)。在补充有LSGS(吉布可公司)的培养基106(生命技术公司)中扩增HDFa用于核重编程实验。然后在含有DMEM(吉布可公司)、10％ FBS(海克隆公司)、1％非必需氨基酸(吉布可公司)、1mMGlutaMAX(吉布可公司)、1％ Pen-strep(吉布可公司)、0.1mM2-巯基乙醇(吉布可公司)和1mM丙酮酸钠(吉布可公司)的成纤维细胞培养基转导之前，将早期传代(<P6)的成纤维细胞以50,000-70,000个细胞/孔接种到6孔板中。

48小时后，将一个孔中的细胞用胰蛋白酶消化以计数，从而确定转导所需的病毒体积(MOI)。使用由四种转录因子OCT4、SOX2、cMYC、KLF4(OKSM)组成的CytoTune 2.0iPSC仙台重编程试剂盒(英杰公司)进行转导。24小时后，每隔一天去除病毒并替换培养基。

转导后7天，使用TrypLE Express(生命技术公司)收获细胞并将其重新接种到成纤维细胞培养基中的经辐照的MEF饲养层上。第二天，将培养基替换为1)iTSC培养基。

在TSC培养基中培养后，一旦iTSC变得融合且明显，将iTSC以1:2-1:4的比率每3-4天传代一次。对于最初的4代，使用TrpLE Express(生命技术公司)将iTSC传代到iMEF饲养者上，并在37℃、5％ O₂和5％ CO₂培养箱中培养。从第5代开始，将iTSC传代到用5μg/ml ColIV(西格玛公司)预包被(于37℃至少一小时)的组织培养烧瓶上并在37℃、20％ O₂和5％CO₂培养箱中培养。

实例12-在3D培养系统中共培养iPSC和iTSC

为了便于观察iPSC和iTSC之间的组装，首先分别经由GFP和mCherry空载体构建体的慢病毒转导生成具有GFP报道分子的iPSC系(iPSC-GFP)和具有mCherry报道分子的iTSC系(iTSC-mCherry)(图10a、b)。对于共培养实验，将解离的细胞在不同条件下置于iBlastoid培养基中的24孔AggreWell^TM400板上：(1)相应1:2.5比率的iPSC和iTSC，总数为1.2×10⁵个细胞/孔(图10c)；(2)仅iPSC，总数为1.2×10⁵个细胞/孔(图10d)；(3)仅iTSC，总数为1.2×10⁵个细胞/孔(图10e)。在共培养的第一天补充ROCKi以增强细胞存活，并将细胞在AggreWell系统中培养6天。收集在形成的第6天获得的3D结构用于下游分析(图10c-e)。

实例13-使用不同培养基生成重编程中间体

为了研究在重编程的第21天EPI、TE和PE样细胞的比例的改善，评估了已知调节早期胚胎和胚外谱系细胞命运的不同信号传导途径/培养条件。诸位发明人研究了各种培养基中的重编程，如本文的表4中所列的那些。特别地，据报道NACL培养基促进PE样细胞命运；PA培养基促进TE样细胞命运；并且t2iLGo培养基促进植入前EPI样细胞命运。基于第21天重编程细胞的免疫荧光分析(图12)，NACL培养基促进GATA6(PE)和KLF17(EPI)的表达；PA培养基促进GATA3(TE)、GATA6(PE)和KLF17(EPI)的上调，而t2iLGo培养基促进KLF17(EPI)的上调。在所测试的条件中，基于所评估的3个标志物，PA培养基在重编程第21天产生最高量的TE、PE和EPI样细胞。

实例14-经由OKSMNL-mRNA转染进行的人成纤维细胞的重编程

该方法中人成纤维细胞的重编程由OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、NANOG和LIN28(统称为OKSMNL)介导。对于经由mRNA方法的体细胞重编程，根据具有修改的StemRNA第3代重编程试剂盒(StemGent，目录号00-0076)的制造商说明书进行实验。为了进行重编程，将12孔板的每孔1-2×10⁴个人成纤维细胞接种在成纤维细胞培养基中。24小时后(第0天)，据制造商的说明书，用含有由Opti-MEM(吉布可公司)和RNAiMAX(英杰公司)生成的OSKMNL NM-RNA、EKB NM-RNA和NM-微RNA的NM-RNA重编程转染复合物转染细胞。18小时后，用新鲜的成纤维细胞培养基更新培养基，6小时后进行下一次转染。再重复转染过程3天(对于4x转染方案)或5天(对于6x转染方案)。将细胞在成纤维细胞培养基中培养至重编程的第21天并收集用于进一步分析。在这些实验中使用的培养基的进一步细节提供于实例2中。

在第21天，对细胞进行免疫染色以确定由4x OKSMNL和6x OKSMNL mRNA转染生成的OCT4、GATA6和CDX2(图13a和c)、GATA2、NANOG和SOX17(图13b和d)的表达。

结果证明，当使用替代性重编程方法时，重编程中间体可从人成纤维细胞获得，并且具有与如实例3中所述获得的那些相似的标志物OCT4、GATA6、CDX2、GATA2、NANOG和SOX17的基因表达谱。结果表明，使用替代性方法生成的重编程中间体也表现出上胚层(EPI)、滋养外胚层(TE)和/或原始内胚层(PE)转录签名，并表明iBlastoid可衍生自经由不同重编程方法，特别是驱动重编程转录因子表达的不同方法获得的重编程中间体。

实例15-经由仙台病毒介导的重编程对人间充质干细胞(hMSC)的重编程

使用CytoTune-iPS 2.0仙台重编程试剂盒根据制造商的说明书(赛默飞世尔公司，批号2170052)进行hMSC的重编程。将hMSC以约5-10×10⁴个细胞的密度接种在MSC培养基中。约36小时后，用FM中的仙台病毒以如下感染复数(MOI)转导细胞：KOS MOI＝5，c-MYCMOI＝5，KLF4 MOI＝6。从转导后第1天开始每隔一天进行培养基替换，并且从第8天开始每天替换。在重编程的第21天收集重编程的细胞用于进一步分析。在这些实验中使用的培养基的进一步细节提供于实例2中。

在第21天，将细胞免疫染色以确定OCT4、GATA6和CDX2(图14a)或GATA2、NANOG和SOX17(图14b)的表达。

结果证明，重编程中间体可从替代性体细胞获得，在这种情况下是hMSC，并且具有与如实例3中所述获得的那些相似的标志物OCT4、GATA6、CDX2、GATA2、NANOG和SOX17的基因表达谱。结果表明，使用替代性方法生成的重编程中间体也表现出上胚层(EPI)、滋养外胚层(TE)和/或原始内胚层(PE)转录签名，并表明iBlastoid可衍生自经由不同重编程方法，特别是驱动重编程转录因子表达的不同方法获得的重编程中间体。

实施例16-经由仙台病毒介导的重编程对人外周血单核细胞(hPBMC)的重编程。

使用CytoTune-iPS 2.0仙台重编程试剂盒根据制造商的说明书(赛默飞世尔公司，批号2170052)进行hPBMC的重编程。为了进行重编程，对2.5-5×10⁵个hPBMC进行计数并转移到12-mL圆底管中。通过将计算体积的仙台病毒以如下感染复数(MOI)添加到1mL PBMC培养基中来制备重编程混合物：KOS MOI＝5，c-MYC MOI＝5，KLF4MOI＝6。

在将重编程混合物转移到含有hPBMC的圆底管中之后，将细胞在室温下以1000xg离心30分钟。将另外1mL PBMC培养基添加到经离心的细胞上，并将内容物重悬并转移到12孔板的1个孔上以在37℃下孵育过夜(第0天)。在第二天(第1天)，用新鲜PBMC培养基替换培养基。在第3天，将细胞以1:3的比率在新鲜的PBMC培养基中铺板于基质胶包被的板上。在第4天和第6天，通过去除一半用过的培养基并用新鲜的StemPro34培养基(不含细胞因子的PBMC培养基)替换来进行培养基替换。在重编程的第8天，将细胞转移到StemPro34培养基或补充有10％ FBS的StemPro34培养基中，从该点开始每隔一天进行培养基替换。在第18天和第21天收集细胞用于进一步分析。在这些实验中使用的培养基的进一步细节提供于实例2中。

在第18天和第21天，将细胞免疫染色以确定OCT4、GATA6和CDX2(图15a-c)或GATA2、NANOG和SOX17(图15d-f)的表达。

结果证明，重编程中间体可从替代性体细胞获得，在这种情况下是人外周血单核细胞，并且具有与如实例3中所述获得的那些相似的标志物OCT4、GATA6、CDX2、GATA2、NANOG和SOX17的基因表达谱。结果表明，使用替代性方法生成的重编程中间体也表现出上胚层(EPI)、滋养外胚层(TE)和/或原始内胚层(PE)转录签名，并表明iBlastoid可衍生自经由不同重编程方法，特别是驱动重编程转录因子表达的不同方法获得的重编程中间体。

应当理解，在本说明书中披露和限定的本发明扩展到从文本或附图中提及或显而易见的两个或更多个单独特征的所有替代性组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各种替代性方面。

序列表

<110> 莫纳什大学（Monash Univeristy）

<120> 诱导性干细胞

<130> P23113633WP

<150> AU 2020904340

<151> 2020-11-24

<150> AU 2021900686

<151> 2021-03-10

<150> AU 2021903429

<151> 2021-10-26

<160> 12

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hGAPDH正向

<400> 1

ctgggctaca ctgagcacc 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hGAPDH反向

<400> 2

aagtggtcgt tgagggcaat g 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CSH1正向

<400> 3

catgactccc agacctcctt ct 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CSH1反向

<400> 4

atttctgttg cgtttcctcc at 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITGA1正向

<400> 5

gctcctcact gttgttctac g 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITGA1反向

<400> 6

cgggccgctg aaagtcatt 19

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TBXT正向

<400> 7

tatgagcctc gaatccacat agt 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TBXT反向

<400> 8

cctcgttctg ataagcagtc ac 22

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EOMES正向

<400> 9

gtgcccacgt ctacctgtg 19

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EOMES反向

<400> 10

cctgccctgt ttcgtaatga t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MIXL1正向

<400> 11

ggcgtcagag tgggaaatcc 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MIXL1反向

<400> 12

ggcaggcagt tcacatctac c 21

Claims

1.一种人诱导性胚外内胚层干(XEN)细胞或表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞，其中该细胞表达SALL4、GATA4、SOX17、GATA6和SOX7中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的细胞，其中该细胞从多层细胞结构或胚泡样结构产生或分离。

3.一种产生人XEN样细胞或表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞的方法，该方法包括：

由此产生人XEN样细胞。

4.一种产生人XEN样细胞或表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞的方法，该方法包括：

-将多层细胞结构或胚泡样结构解离成单细胞，

由此产生人XEN样细胞。

5.如权利要求3或4所述的方法，其中该饲养层包含成纤维细胞或由其组成，例如经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞(iMEF)。

6.如权利要求3或4所述的方法，其中该培养基包含10ng/ml人白血病抑制因子、3μMCHIR99021和100ng/ml激活素A。

7.一种培养或维持人XEN样细胞或表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞的方法，该方法包括：

-使存在于饲养层上的XEN样细胞或表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞解离，优选地其中这些细胞根据权利要求3或4所述的方法获得；

由此培养或维持人XEN样细胞或表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞。

8.如权利要求7所述的方法，其中这些XEN样细胞每3、4、5或6天解离或传代一次。

9.如权利要求7或8所述的方法，其中该ROCK抑制剂以约10μM的浓度存在。

10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，其中将这些接种的细胞在包含ROCK抑制剂的培养基中培养1或2天，或直到这些接种的细胞附着到该饲养层。

11.如权利要求3至10中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括扩增这些XEN样细胞以增加XEN样细胞的数量的步骤。

12.一种分离的XEN样细胞或表现出XEN细胞的至少一种特征的分离的细胞，其通过如权利要求3至11中任一项所述的方法可获得或获得。

13.一种细胞群，该细胞群包含如权利要求1、2或12中任一项所述的XEN样细胞或表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞，其中优选地，至少5％的细胞表现出XEN细胞的至少一种特征，更优选地，其中该群中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的这些细胞表现出XEN细胞的至少一种特征。

14.一种药物组合物，该药物组合物包含：

-如权利要求1、2或12中任一项所述的表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞，或如权利要求13所述的细胞群；

-药学上可接受的载剂或赋形剂。

15.一种组合物，该组合物包含顺势疗法剂或膳食补充剂，该顺势疗法剂或膳食补充剂包含：

-如权利要求1、2或12中任一项所述的表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞，或如权利要求12所述的细胞群；和

-药学上可接受的载剂或赋形剂。

16.一种组合物，该组合物包含顺势疗法剂或膳食补充剂，该顺势疗法剂或膳食补充剂衍生自：

-如权利要求1、2或12中任一项所述的表现出XEN细胞的至少一种特征的细胞，或如权利要求13所述的细胞群。

17.一种人诱导性滋养层干细胞(TSC)或表现出人TSC的至少一种特征的细胞，其从多层细胞结构或胚泡样结构产生或分离。

18.一种产生人TSC或表现出人TSC的至少一种特征的细胞的方法，该方法包括；

由此产生人TSC或表现出人TSC的至少一种特征的细胞。

19.一种产生人TSC或表现出人TSC的至少一种特征的细胞的方法，该方法包括；

-将如本文所述的多层细胞结构或胚泡样结构解离成单细胞，

由此产生人TSC或表现出人TSC的至少一种特征的细胞。

20.一种培养或维持人TSC细胞的方法，该方法包括

-使存在于包含一种或多种ECM蛋白的层上的人TS细胞(TSC)解离；

由此培养或维持人TSC。

21.如权利要求20所述的方法，其中这些TSC细胞每3、4、5或6天解离或传代一次。

22.如权利要求20或21所述的方法，其中包含一种或多种细胞外基质(ECM)蛋白的层能够包含胶原层或由其组成。

23.一种分离的人TSC或表现出人TSC的至少一种特征的细胞，其通过如权利要求18至22中任一项所述的方法可获得或获得。

24.如权利要求18至22中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括扩增表现出TSC的至少一种特征的这些细胞以增加表现出TSC的至少一种特征的细胞的数量的步骤。

25.如权利要求18至22中任一项所述的方法，该方法进一步包括使表现出TSC的至少一种特征的这些细胞分化以生成表现出EVT或ST的至少一种特征的细胞的步骤。

26.如权利要求18至22中任一项所述的方法，该方法进一步包括将表现出TSC的至少一种特征的细胞分化为胎盘外细胞类型，以用于再生医学。

27.一种分离的绒毛外滋养层(EVT)或合体滋养层(ST)、或包含EVT或ST的至少一种特征的细胞，其根据权利要求25或26中任一项获得。

28.一种细胞群，该细胞群包含如权利要求17所述的人TSC或具有人TSC或者EVT或ST的至少一种特征的细胞，其通过如权利要求18至26中任一项所述的方法获得或可获得，其中优选地，至少5％的细胞表现出TSC、EVT或ST的至少一种特征，更优选地，该群中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的这些细胞表现出TSC或者EVT或ST的至少一种特征。

29.如权利要求18至26中任一项所述的方法，其中该TSC培养基包含生长因子，优选地EGF，和ROCK抑制剂。

30.如权利要求29所述的方法，其中该TSC培养基包含该ROCK抑制剂反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺(Y-27632)或其盐。

31.如权利要求30所述的方法，其中该TSC培养基另外包含以下中的一者或多者：

-4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(SB431542)或其盐；

32.如权利要求29至31中任一项所述的方法，其中该TSC培养基还包含用于刺激Wnt的试剂和一种或多种TGFβ抑制剂。

33.如权利要求18至32中任一项所述的方法，其中该TSC培养基是如本文所述的ASECRiAV，并且包含：A83-01、SB431542、EGF、CHIR、ROCK抑制剂、抗坏血酸和丙戊酸。

34.如权利要求17所述的细胞或如权利要求18至33中任一项所述的方法，其中TSC的特征包括以下中的一者或多者，优选地全部：

-鹅卵石状集落外观；

-类似于胚泡衍生的TSC的蛋白质组或代谢物组图谱。

35.一种药物组合物，该药物组合物包含：

-如权利要求17或23所述的人TSC或表现出人TSC的至少一种特征的细胞、或如权利要求27所述的EVT或ST、或如权利要求28所述的细胞群，和

-药学上可接受的载剂或赋形剂。

36.一种组合物，该组合物包含顺势疗法剂或膳食补充剂，该顺势疗法剂或膳食补充剂包含：

-如权利要求17或23所述的人TSC或表现出人TSC的至少一种特征的细胞、或如权利要求27所述的EVT或ST、或如权利要求28所述的细胞群，和/或

-衍生自如权利要求17、23或27所述的细胞、或如权利要求28所述的细胞群的类器官；

和

-药学上可接受的载剂或赋形剂。

37.一种顺势疗法剂或膳食补充剂，该顺势疗法剂或膳食补充剂衍生自：

-衍生自如权利要求17、23或27所述的细胞、或如权利要求28所述的细胞群的类器官。

38.如权利要求18至33中任一项所述的方法，该方法进一步包括施用以下项：

至有需要的受试者的步骤。

39.一种增强胎盘或胚泡的方法，该方法包括向胎盘或胚泡中引入：

40.一种类器官，该类器官衍生自如权利要求17或23所述的人TSC细胞或表现出人TSC的至少一种特征的细胞、或如权利要求27所述的EVT或ST、或如权利要求28所述的细胞群。

41.一种治疗和/或预防有需要的受试者中与滋养层的发育和/或活性相关的障碍的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的以下项：

-如权利要求17或23所述的人TSC或表现出人TSC的至少一种特征的细胞、或如权利要求27所述的EVT或ST、或如权利要求28所述的细胞群，

-如权利要求35所述的药物组合物；或

-如权利要求36或37所述的组合物；

由此治疗和/或预防该受试者中与滋养层的发育和/或活性相关的障碍。

42.如权利要求17或23所述的人TSC或表现出人TSC的至少一种特征的细胞，或如权利要求27所述的EVT或ST，或如权利要求28所述的细胞群，和/或衍生自如权利要求17、23或27所述的细胞、或如权利要求28所述的细胞群的类器官在制备用于治疗胎盘疾病/障碍的药物中的用途。

43.一种表现出原始态多能干细胞(nPSC)的至少一种特征的细胞，该细胞从多层细胞结构或胚泡样结构产生或分离。

44.一种产生人nPSC或表现出人原始态多能干细胞(nPSC)的至少一种特征的细胞的方法，该方法包括：

由此产生nPSC或表现出人原始态多能干细胞(nPSC)的至少一种特征的细胞。

45.一种产生人nPSC或表现出人原始态多能干细胞(nPSC)的至少一种特征的细胞的方法，该方法包括；

-将如本文所述的多层细胞结构或胚泡样结构解离成单细胞，

46.如权利要求44或45所述的方法，其中该饲养层包含成纤维细胞或由其组成，例如经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞(iMEF)。

47.如权利要求44至46中任一项所述的方法，其中用于促进原始态多能状态的培养基包含MEK抑制剂、PKC抑制剂、GSK3抑制剂、STAT3激活剂和ROCK抑制剂。

48.如权利要求48所述的方法，其中用于促进原始态多能状态的培养基是t2iLGoY培养基。

49.一种培养或维持人nPSC细胞的方法，该方法包括：

-使存在于饲养层上的nPSC解离，其中该nPSC根据权利要求44至48中任一项所述的方法获得；

由此培养或维持人nPSC。

50.如权利要求49所述的方法，其中这些nPSC每3、4、5或6天解离或传代一次。

51.如权利要求44至50中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括扩增这些nPSC以增加nPSC的数量的步骤。

52.如权利要求44至51中任一项所述的方法，该方法进一步包括使该nPSC或该具有nPSC的至少一种特征的细胞分化的步骤，该步骤包括在用于生成具有分化细胞的至少一种特征的细胞或不处于多能状态的细胞的条件下培养这些nPSC足够的时间。

53.一种分离的nPSC或具有nPSC的至少一种特征的细胞，其通过如权利要求44至51中任一项所述的方法可获得或获得。

54.一种分化细胞，该分化细胞根据权利要求52所述的方法产生。

55.一种细胞群，该细胞群包含如权利要求43或权利要求53所述的nPSC，其中优选地，至少5％的细胞表现出nPSC的至少一种特征，更优选地，该群中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的这些细胞表现出nPSC的至少一种特征。

56.一种细胞群，该细胞群包含如权利要求54所述的分化细胞或由如权利要求43或53所述的nPSC产生，优选地其中至少5％的细胞是分化细胞，更优选地，该群中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的这些细胞是分化细胞。

57.一种细胞的类器官或其他组织化集合，其衍生自如权利要求54所述的nPSC群或如权利要求55所述的分化细胞。

58.一种药物组合物，该药物组合物包含：

-如权利要求43或53所述的nPSC细胞或如权利要求54所述的分化的nPSC；或

-如权利要求55或56所述的细胞群；或

-如权利要求57所述的类器官；

和

-药学上可接受的载剂或赋形剂。

59.一种治疗需要施用nPSC或细胞群的疾病或病症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用：

-如权利要求55或56所述的细胞群；

-如权利要求57所述的类器官；或

-如权利要求57所述的药物组合物。

60.如权利要求43或53所述的nPSC细胞或如权利要求54所述的分化的nPSC、或如权利要求55或56所述的细胞群、或如权利要求57所述的类器官在制备用于治疗需要施用多能干细胞或由其衍生的分化细胞的疾病或病症的药物中的用途。

61.一种人始发态多能干细胞(pPSC)或表现出pPSC的至少一种特征的细胞，其从多层细胞结构或胚泡样结构产生或分离。

62.一种产生人pPSC或表现出pPSC的至少一种特征的细胞的方法，该方法包括；

由此产生pPSC或表现出pPSC的至少一种特征的细胞。

63.一种产生人pPSC或表现出pPSC的至少一种特征的细胞的方法，该方法包括；

-将如本文所述的多层细胞结构或胚泡样结构解离成单细胞，

-在玻连蛋白层上在用于促进细胞达到始发态多能状态的培养基存在下培养这些单细胞，

由此产生pPSC或表现出pPSC的至少一种特征的细胞。

64.如权利要求61或62所述的方法，其中用于促进始发态多能状态的培养基是本文的表1中描述的培养基。

65.一种培养或维持人pPSC细胞或表现出pPSC的至少一种特征的细胞的方法，该方法包括：

-使存在于玻连蛋白层上的pPSC解离；

-在用于促进细胞达到始发态多能状态的培养基存在下将这些解离的细胞以1:20至1:40的分裂比接种到玻连蛋白层上，

由此培养或维持人pPSC。

66.如权利要求64所述的方法，其中这些pPSC每3、4、5或6天解离或传代一次。

67.一种分离的pPSC或表现出pPSC的至少一种特征的细胞，其通过如权利要求61至65中任一项所述的方法可获得或获得。

68.如权利要求61至66中任一项所述的方法，该方法进一步包括扩增表现出pPSC的至少一种特征的这些细胞以增加pPSC的数量的步骤。

69.如权利要求61至67中任一项所述的方法，该方法进一步包括使该nPSC或该具有nPSC的至少一种特征的细胞分化的步骤，该步骤包括在用于生成具有分化细胞的至少一种特征的细胞或不处于多能状态的细胞的条件下培养这些nPSC足够的时间。

70.一种分离的pPSC或具有pPSC的至少一种特征的细胞，其通过如权利要求61至67中任一项所述的方法可获得或获得。

71.一种分化细胞，该分化细胞根据如权利要求68所述的方法产生。

72.一种细胞群，该细胞群包含如权利要求60或69所述的pPSC或具有pPSC的至少一种特征的细胞，优选地其中，至少5％的细胞表现出pPSC的至少一种特征，更优选地，该群中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的这些细胞表现出pPSC的至少一种特征。

73.一种细胞群，该细胞群包含如权利要求70所述的分化细胞，优选地其中至少5％的细胞是由如权利要求70所述的分化细胞产生的分化细胞，更优选地，其中该群中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的这些细胞是分化细胞。

74.一种细胞的类器官或其他组织化集合，其衍生自如权利要求60或权利要求69所述的pPSC，或衍生自如权利要求71所述的pPSC群、或如权利要求70所述的分化细胞或如权利要求72所述的分化细胞群。

75.一种药物组合物，该药物组合物包含：

-具有如权利要求60或69所述的pPSC的至少一种特征的细胞；或如权利要求70所述的分化细胞；

-如权利要求71或72所述的细胞群；或

-如权利要求73所述的类器官；

和

-药学上可接受的载剂或赋形剂。

76.一种治疗需要施用pPSC或pPSC群的疾病或病症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用：

-如权利要求60、69或71所述的分离的pPSC或pPSC群；

-如权利要求70或72所述的分离的分化细胞或分化细胞群；或

-如权利要求73所述的类器官。

77.以下项：

-具有如权利要求60或69所述的pPSC的至少一种特征的细胞；

-如权利要求70所述的分化细胞；

-如权利要求71或72所述的细胞群；或

-如权利要求73所述的类器官；

在制备用于治疗需要施用pPSC或衍生自pPSC的细胞群的疾病或病症的药物中的用途。

78.如权利要求3、4、18、19、45、46、61或62中任一项所述的方法，其中将这些单细胞培养至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天的时段。

79.如权利要求3至11、18至22、45至52或61至65中任一项所述的方法，其中该细胞当在传代培养物中维持时保持其未分化状态，优选地，其中该细胞在至少5、至少10、至少15、至少20、至少40或更多次细胞培养传代中保持其特征。

80.如权利要求4、7、19、20、45、49、62或64中任一项所述的方法，其中解离这些细胞的步骤包括使这些细胞与酶或酶组合物接触，优选地其中该酶或酶组合物包含适合于促进细胞脱离或使在聚集培养物中生长的细胞解离的蛋白水解酶和/或胶原溶解酶。

81.如权利要求3至11、18至22、45至52或61至65中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括生成多层细胞结构或胚泡样结构的步骤。

82.如权利要求80所述的方法，其中该多层细胞结构或胚泡样结构通过使重编程中间体聚集的方法或组装iPSC和iTSC的方法获得。