WO2023053220A1 - 多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents

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WO2023053220A1
WO2023053220A1 PCT/JP2021/035693 JP2021035693W WO2023053220A1 WO 2023053220 A1 WO2023053220 A1 WO 2023053220A1 JP 2021035693 W JP2021035693 W JP 2021035693W WO 2023053220 A1 WO2023053220 A1 WO 2023053220A1
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WO
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container
somatic cells
cells
gene
compartment
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Application number
PCT/JP2021/035693
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English (en)
French (fr)
Inventor
正義 塚原
優子 山本
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公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団
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Publication date
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Priority to PCT/JP2022/035937 priority patent/WO2023054357A1/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/10—Apparatus for enzymology or microbiology rotatably mounted
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
    • G06F17/00—Digital computing or data processing equipment or methods, specially adapted for specific functions
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06N—COMPUTING ARRANGEMENTS BASED ON SPECIFIC COMPUTATIONAL MODELS
    • G06N7/00—Computing arrangements based on specific mathematical models
    • G06N7/02—Computing arrangements based on specific mathematical models using fuzzy logic
    • G06N7/04—Physical realisation

Definitions

  • This application relates to a method for producing pluripotent stem cells from somatic cells, especially blood cells.
  • iPS cells which are pluripotent stem cells manufactured by reprogramming somatic cells, can differentiate into various cells and are expected to be used in regenerative medicine, including transplantation. Methods for producing pluripotent stem cells using somatic cells of various origins are known.
  • pluripotent stem cells from blood lineage cells has the excellent advantage of being less invasive and less burdensome for patients. Methods of improving efficiency are desired.
  • blood cells can be cultured in suspension without adhering to the bottom surface of a plastic petri dish, and the cells can be easily handled in culture using an automated culture apparatus.
  • the purpose of the present application is to provide a method for producing pluripotent stem cells.
  • a method for producing pluripotent stem cells from somatic cells comprising: (1) Seeding somatic cells in a container having at least one compartment capable of consolidating two or more somatic cells (2) Contacting somatic cells with reprogramming factors (3) Somatic cells in contact with reprogramming factors with two or more of said somatic cells clustered within said compartment. [2]
  • the compartment has a low-cell-adhesive aggregation part capable of aggregating two or more somatic cells, The method according to [1] above, further comprising an aggregation step of gathering two or more somatic cells into the aggregation section.
  • the recess is composed of three or more inclined surfaces arranged adjacent to each other, and has a polygonal pyramid shape that tapers from the opening toward the bottom, The method according to [14] above, wherein the bottom portion constitutes the aggregated portion, and the side surface of the concave portion constitutes the guide portion. [16] The method according to [14] above, wherein the inclined surface is a substantially triangular plane. [17] The recess has a substantially conical shape that tapers from the opening toward the bottom, The method according to [12] above, wherein the bottom portion constitutes the aggregated portion, and the side surface of the recess constitutes the guide portion. [18] The method according to any one of [1] to [17], wherein the container has two or more compartments.
  • a container body capable of accommodating somatic cells inside; at least one compartment located inside the container body; with said compartment is a cell low-adhesion aggregation part capable of aggregating two or more somatic cells; and a guide portion that guides the somatic cells that have flowed into the container to the concentration portion.
  • said compartment is Having a recess including an opening opening to the inner surface of the container body and a bottom with low cell adhesion, The guide section
  • said compartment is Having a concave portion including an opening provided on the inner surface of the container body and a bottom portion with low cell adhesion,
  • the guide section The container according to [34], wherein the container is a projecting part arranged outside the recess, adjacent to the opening, further away from the circulation part than the opening, and projecting from the inner surface.
  • an initialization factor is included in the compartment.
  • the container according to any one of [33] to [38]; a seeding device for supplying and seeding somatic cells into the container; a collection device that discharges and collects the somatic cells that have come into contact with the reprogramming factor from the inside of the container to the outside of the container; A system comprising a control device that controls the sowing device and the recovery device.
  • a tilting device capable of tilting part or all of the container with respect to a reference plane to concentrate two or more of the somatic cells inside the container into the compartment. system.
  • the container has a flexible bottom surface;
  • the tilting device rotates and tilts the container around a rotation axis extending in a direction orthogonal to the reference plane, or presses a part of the bottom surface of the container to partially or entirely tilt the container.
  • a kit for producing pluripotent stem cells from somatic cells comprising: A kit comprising a cell-low-adhesion container having one or more compartments capable of aggregating two or more cells, and a reprogramming factor.
  • the present application provides an efficient method for producing pluripotent stem cells. Also provided are containers, systems, kits and programs for producing pluripotent stem cells.
  • Morphology of cells immediately after seeding on AggrewellTM plates Morphology of day 4 control cells (left panel) and cells seeded on AggrewellTM plates (right panel). Morphology of day 10 control cells (left panel) and cells seeded on AggrewellTM plates (right panel). Fluorescence image of cells seeded on AggrewellTM plates on day 10.
  • the upper left figure shows the fluorescence image of GFP.
  • the upper right figure shows an immunostaining image using the TRA-1-60 antibody.
  • the lower left figure shows an image obtained by merging a fluorescence image of GFP, an immunostaining image using the TRA-1-60 antibody, and a bright field image.
  • the lower right figure is an enlarged image of the lower left figure.
  • the upper left figure shows the fluorescence image of GFP.
  • the upper right figure shows an immunostaining image using the TRA-1-60 antibody.
  • the lower left figure shows a merged image of the fluorescence image of GFP and the immunostaining image using the TRA-1-60 antibody.
  • the lower right figure shows a bright-field image. Bright-field images of cell culture on day 9 24-well plate (control) (left panel) and cell culture on AggrewellTM plate (right panel). Relationship between the number of PBMC cells seeded per microwell and the number of viable cells on Day 14.
  • FIG. 4 is a schematic diagram illustrating an intensive process included in the manufacturing method of the first embodiment of the present disclosure
  • FIG. 5 is a schematic diagram for explaining an intensive step included in the manufacturing method of the second embodiment of the present disclosure
  • 1 is a schematic diagram showing a container according to a first embodiment of the present disclosure
  • FIG. Schematic diagram showing a container of a second embodiment of the present disclosure Schematic diagram showing a container according to a third embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing a container according to a ninth embodiment of the present disclosure
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing a container according to a tenth embodiment of the present disclosure
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing a container according to an eleventh embodiment of the present disclosure
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing a container according to a twelfth embodiment of the present disclosure
  • the present application provides a method for producing pluripotent stem cells from somatic cells, comprising: (1) Seeding somatic cells in a container having at least one compartment capable of consolidating two or more somatic cells (2) Contacting somatic cells with reprogramming factors (3) Somatic cells in contact with reprogramming factors with two or more of the somatic cells clustered within the compartment.
  • somatic cells are not particularly limited, and any somatic cells can be used.
  • keratinizing epithelial cells e.g., keratinizing epidermal cells
  • mucosal epithelial cells e.g., tongue epithelial cells
  • exocrine gland epithelial cells e.g., mammary gland cells
  • hormone-secreting cells e.g., adrenal medullary cells
  • cells for metabolism and storage e.g., hepatocytes
  • luminal epithelial cells that make up the interface e.g., type I alveolar cells
  • luminal epithelial cells of the inner chain duct e.g., vascular endothelial cells
  • transportation Ciliated cells with potential e.g.
  • airway epithelial cells extracellular matrix secreting cells (e.g. fibroblasts), contractile cells (e.g. smooth muscle cells), blood and immune system cells (e.g. peripheral blood mononuclear cells, cord blood, T lymphocytes), sensory cells (e.g. rod cells), autonomic nervous system neurons (e.g. cholinergic neurons), supporting cells of sensory and peripheral neurons (e.g. companion cells) , central nervous system neurons and glial cells (eg, astrocyte), pigment cells (eg, retinal pigment epithelial cells), and their progenitor cells (tissue progenitor cells).
  • extracellular matrix secreting cells e.g. fibroblasts
  • contractile cells e.g. smooth muscle cells
  • blood and immune system cells e.g. peripheral blood mononuclear cells, cord blood, T lymphocytes
  • sensory cells e.g. rod cells
  • autonomic nervous system neurons e.g. cholinergic neurons
  • supporting cells of sensory and peripheral neurons e.g
  • undifferentiated progenitor cells including somatic stem cells
  • terminally differentiated mature cells can be used as a source of somatic cells in Examples of undifferentiated progenitor cells.
  • tissue stem cells such as neural stem cells, hematopoietic progenitor cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • the somatic cells may be free-floating cells such as blood lineage cells (eg peripheral blood mononuclear cells, hematopoietic progenitor cells and CD34 positive cells).
  • the blood lineage cells are, for example, derived from peripheral blood or umbilical cord blood.
  • animals from which somatic cells are derived are not limited, for example, mammals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, cows, horses, pigs, sheep, monkeys, orangutans, chimpanzees, dogs, cats, birds, and humans. , preferably primates, more preferably humans.
  • pluripotent stem cells refers to a cell that has both the ability to differentiate into various cells and the ability to proliferate. Methods for reprogramming somatic cells to induce pluripotent stem cells by causing factors called reprogramming factors to act on somatic cells are known.
  • the medium can be prepared by appropriately adding necessary factors to the basal medium used for culturing animal cells.
  • basal media include IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, MEM Zinc Option medium, IMEM Zinc Option medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, DMEM/F12 medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, mixed medium thereof, and the like are included.
  • the basal medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum-free.
  • FBS fetal bovine serum
  • albumin, insulin, transferrin, selenium, KnockOut Serum Replacement (KSR) (serum replacement during ES cell culture) (Invitrogen), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acids, collagen May contain one or more serum replacements such as precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, Also contains one or more substances such as growth factors, small molecule compounds, antibiotics (e.g.
  • a commercially available medium may be used as the basal medium, for example, a medium such as StemSpan ACF (STEMCELL Technologies) or StemFit (registered trademark) AK03N medium (Ajinomoto Co., Inc.).
  • step (1) somatic cells are seeded in a container having at least one compartment capable of collecting two or more somatic cells.
  • Aggregation of somatic cells means that somatic cells are in contact with at least one other somatic cell and multiple somatic cells are clustered together. Compartments capable of aggregating two or more somatic cells are not particularly limited as long as they are capable of aggregating two or more somatic cells. It is a compartment that can be collected in a place. Specifically, the container has a compartment capable of aggregating two or more somatic cells by applying motions such as rotation, rocking, and vibration to the container, or has an inclined surface from the opening toward the bottom, and the inclined surface Examples include compartments in which the somatic cells described above can be collected at the bottom by their own weight. In a compartment having an inclined surface extending from the opening to the bottom, further motions such as rotation, rocking and shaking may be applied to the container.
  • the container has one or more compartments capable of aggregating two or more somatic cells.
  • the number of compartments contained in the container is not particularly limited as long as it is appropriately determined by those skilled in the art.
  • the container may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 compartments, and may have 1 to 100,000 or more compartments. .
  • the container is a 24-well plate with 1200 compartments in each well, the number of compartments is 28,800.
  • said container has two or more said compartments.
  • the compartment may have low cell adhesion.
  • Low-cell-adhesive compartments include compartments that have not been artificially treated (e.g., coating with extracellular matrix, etc.) for the purpose of improving cell adhesion in a commercially available cell culture vessel, or artificially Examples include, but are not limited to, compartments treated to inhibit adhesion (for example, coating treatment with polyhydroxyethylmethacrylic acid (poly-HEMA) or polymer of 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine (Lipidure)) not.
  • poly-HEMA polyhydroxyethylmethacrylic acid
  • Lipidure 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine
  • the cell density of the somatic cells seeded in step (1) may be determined as appropriate by those skilled in the art and is not particularly limited.
  • the cell density should be determined so as to obtain
  • the cell density can be 2-500 cells/compartment, 2-400 cells/compartment or 3-300 cells/compartment, for example It can be 3-150 cells/compartment, 5-100 cells/compartment, 5-50 cells/compartment.
  • the cell density can be determined according to the length of the linear portion where the somatic cells are aggregated. For example, if the linear portion is 10 cm in length, the cell density may be about 10 4 cells/compartment or greater, eg, about 10 4 to 10 6 cells/compartment.
  • step (2) somatic cells are contacted with reprogramming factors.
  • a reprogramming factor means a substance that is used alone or in combination with multiple factors to induce a differentiated state of a certain cell to a more undifferentiated state.
  • Reprogramming factors include factors essential for nuclear reprogramming and auxiliary factors (cofactors) that increase the efficiency of nuclear reprogramming.
  • Reprogramming factors can be, for example, genes (DNA, RNA), gene products (mRNA, miRNA, proteins, etc.), low-molecular-weight compounds, and combinations thereof.
  • Oct gene family genes When the reprogramming factor is a gene or its gene product, Oct gene family genes, Sox gene family genes, Klf gene family genes, Myc gene family genes, Lin gene family genes, and Nanog genes, and their At least one selected from the group consisting of gene products (WO2007/69666; Patent No. 5696282; Science, 2007, 318:1917-1920). Among these, at least one selected from the group consisting of Oct gene family genes, Sox gene family genes, Klf gene family genes, Myc gene family genes, and gene products of these genes is preferred. .
  • the Sox2 gene can be replaced with the Sox1 gene, Sox3 gene, Sox15 gene, Sox17 gene, or Sox18 gene.
  • the Klf4 gene can be replaced with the Klf1 gene, the Klf2 gene, or the Klf5 gene.
  • the c-Myc gene can be replaced with the T58A (active mutant) gene, the N-Myc gene, or the L-Myc gene.
  • Oct3/4 gene, Klf4 gene, c-Myc gene (2) Oct3/4 gene, Sox2 gene, Klf4 gene, c-Myc gene (3) Oct3/4 gene, Sox2 gene, Klf4 gene, c-Myc gene, Fbx15 gene, Nanog gene, Eras gene, ECAT15-2 gene, TclI gene, ⁇ -catenin (active mutant S33Y) (4) Oct3/4 gene, Sox2 gene, Klf4 gene, c-Myc gene, hTERT gene, SV40 Large Tantigen (hereinafter referred to as SV40LT) gene (5) Oct3/4 gene, Sox2 gene, Klf4 gene, c-Myc gene , hTERT gene, HPV16 E6 gene (6) Oct3/4 gene, Sox2 gene, Klf4 gene, c-Myc gene, hTERT gene, HPV16 E7 gene (7) Oct3/4 gene, Sox2 gene, Klf4 gene, c-Myc
  • Oct gene family member genes eg, Oct1A, Oct6, etc.
  • Sox2 gene or Sox1 gene, Sox3 gene, Sox15 gene, Sox17 gene, Sox18 gene
  • Sox gene family member genes for example, Sox7 gene
  • Lin28 gene other Lin gene family member genes (for example, the Lin28b gene) can also be used.
  • one or more reprogramming factors selected from the group consisting of Fbx15 gene, Eras gene, ECAT15-2 gene, Tcl1 gene, and ⁇ -catenin gene may be combined, and/or selected from the group consisting of ECAT1 gene, Esg1 gene, Dnmt3L gene, ECAT8 gene, Gdf3 gene, Mybl2 gene, ECAT15-1 gene, Fthl17 gene, Sall4 gene, Rex1 gene, UTF1 gene, Stella gene, Stat3 gene, and Grb2 gene
  • One or more initialization factors can also be combined. These combinations are specifically described in WO2007/69666.
  • Preferred reprogramming factors are selected from the group consisting of Oct3/4 gene, Sox2 gene, Klf4 gene, c-Myc gene (or L-Myc gene), Lin28 gene, Nanog gene, and gene products of these genes. At least one is exemplified. Preferably, a combination of two or more selected from the group consisting of Oct3/4 gene, Sox2 gene, Klf4 gene, c-Myc gene (or L-Myc gene), Lin28 gene, Nanog gene, their gene products, and more A combination of three or more is preferred.
  • combinations of reprogramming factors that are preferably introduced at least include (1) Oct3/4 gene or its gene product, Sox2 gene or its gene product, and Klf4 gene or its gene product, (2) Oct3 /4 gene or its gene product, Sox2 gene or its gene product, Klf4 gene or its gene product, and c-Myc gene or its gene product, (3) Oct3/4 gene or its gene product, Sox2 gene or its gene product , the Klf4 gene or its gene product, and the L-Myc gene or its gene product.
  • Oct3/4 gene or its gene product Sox2 gene or its gene product, and Klf4 gene or its gene product
  • Oct3/4 gene or its gene product, Sox2 gene or its gene product, Klf4 gene or its gene A combination of the product and the L-Myc gene or its gene product is preferred.
  • a combination of Oct3/4 gene, Sox2 gene and Klf4 gene, and a combination of Oct3/4 gene, Sox2 gene, Klf4 gene and L-Myc gene are more preferable.
  • the biological species from which the gene is derived is not particularly limited, and may be appropriately selected according to the origin of the cells to be reprogrammed. may be derived from mammals such as primates such as mice, rats, rabbits, pigs and monkeys, but is preferably derived from humans.
  • the cDNA sequence information of each of the above reprogramming factors can be obtained from publicly known databases. For example, reference may be made to the accession numbers in GenBank described in WO2007/069666. The Nanog gene is described under the name "ECAT4" in the publication.
  • the cDNA of each reprogramming factor can be easily obtained from cells of the organism from which the sequence is derived, using a known method such as PCR, based on the above cDNA sequence information or sequence information registered in a known database. It can be isolated.
  • sequences of the genes and gene products of the reprogramming factors do not necessarily have to be wild-type sequences, and may have any mutation as long as they can induce reprogramming.
  • one or a few (e.g., several, no more than 3, no more than 5, no more than 10, no more than 15, no more than 20, no more than 25) amino acids have been added, deleted, substituted, and/or inserted
  • a gene or mRNA encoding an amino acid sequence that can induce reprogramming can be used in the present application. The same applies to the protein encoded by the gene or mRNA.
  • polypeptides in which 1 to several residues (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15 or 20 residues) of amino acids are substituted, and genes or mRNAs encoding them can also be used.
  • Variants that may be used include, for example, fragments, analogs, derivatives, and fusion proteins with other polypeptides (eg, with the addition of heterologous signal peptides or antibody fragments) of the native protein.
  • it includes a sequence obtained by substituting, deleting, and/or adding one or more amino acids in the wild-type amino acid sequence, and has a biological activity equivalent to that of the wild-type protein (e.g., reprogramming-inducing activity ) are included.
  • a fragment of a wild-type protein it is usually 70% or more, preferably 80% or more, 85% or more, more preferably 90% or more, 95% of the wild-type polypeptide (mature form in the case of a secretory protein). % or more or 98% or more continuous area.
  • the number of amino acids to be modified is not particularly limited. 10% or less, 5% or less, or 3% or less, for example, 15 amino acids or less, preferably 10 amino acids or less, more preferably 8 amino acids or less, more preferably 5 amino acids or less, more preferably 3 amino acids or less.
  • amino acid substitution it is expected that protein activity can be maintained by substituting amino acids with similar side chain properties. Such substitutions are referred to herein as conservative substitutions. Conservative substitutions include, for example, basic amino acids (e.g. lysine, arginine, histidine), acidic amino acids (e.g. aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar amino acids (e.g.
  • glycine asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • non-polar amino acids e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • beta-branched amino acids e.g. threonine, valine, isoleucine
  • aromatic amino acids e.g. tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine. Examples include substitutions between amino acids within a group.
  • the modified protein shows high homology with the amino acid sequence of the wild-type protein.
  • High homology is, for example, an amino acid sequence having 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, or 96% or more identity.
  • Amino acid sequence identity can be determined using, for example, the BLASTP program (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). For example, a search can be performed using the default parameters on the BLAST web page of the NCBI (National Center for Biochnology Information) (Altschul S.F. et al., Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden, T.L.
  • blast2sequences program (Tatiana A et al., FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, 1999), which compares two sequences, can be used to generate a two-sequence alignment and determine sequence identity. Gaps are treated in the same way as mismatches, and identity values are calculated for the entire amino acid sequence of, for example, a native cytokine (the mature form after secretion). Specifically, the ratio of the number of matching amino acids to the total number of amino acids in the wild-type protein (mature form in the case of secretory proteins) is calculated.
  • a gene or mRNA can also introduce silent mutations so as not to change the encoded amino acid sequence.
  • AT(U) rich genes by replacing 5 or more consecutive A or T(U) bases with G or C without changing the encoded amino acid sequence, the gene can be stabilized. high expression can be obtained.
  • the reprogramming factor can be a small compound (such as VPA, CHIR99021, 616452, a combination of tranylcypromine, forskolin and DZNep) or miRNA used to induce dedifferentiation of differentiated cells.
  • the reprogramming factor is a low-molecular-weight compound, the reprogramming factor can be added to the medium (Science 09 Aug 2013: Vol. 341, Issue 6146, pp. 651-654).
  • reprogramming factors are contacted with somatic cells.
  • the somatic cell can be contacted with the reprogramming factor by introducing an expression vector encoding the reprogramming factor into the somatic cell by a method known per se.
  • the type of expression vector is not particularly limited, and known expression vectors can be used.
  • Expression vectors include, for example, episomal vectors, artificial chromosome vectors, plasmid vectors, virus vectors and the like.
  • An episomal vector is a vector that can replicate autonomously outside the chromosome. Specific means of using episomal vectors are disclosed in Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009).
  • an episomal vector can be used in which the loxP sequences are arranged in the same direction on the 5' and 3' sides of vector elements necessary for episomal vector replication. Since episomal vectors can autonomously replicate outside the chromosome, they can provide stable expression in host cells without being integrated into the genome, but once iPS cells are produced, the vectors are quickly removed. is desirable.
  • a vector element required for episomal vector replication is sandwiched between two loxP sequences, and Cre recombinase is allowed to act on the vector element to excise the vector element, thereby making it possible to lose the autonomous replication ability of the episomal vector. can be shed from iPS cells at an early stage.
  • Episomal vectors include, for example, vectors containing sequences necessary for autonomous replication derived from EBV, SV40, etc. as vector elements.
  • vector elements necessary for autonomous replication include replication origins and genes encoding proteins that bind to the replication origins to control replication. and EBNA-1 gene, and SV40 includes the replication origin ori and SV40LT gene.
  • artificial chromosome vectors examples include YAC (Yeast artificial chromosome) vectors, BAC (Bacterial artificial chromosome) vectors, PAC (P1-derived artificial chromosome) vectors, HAC (Human artificial chromosome) vectors, and the like.
  • the plasmid vector is not particularly limited as long as it is a plasmid vector that can be expressed in the somatic cells to be introduced.
  • somatic cells to be introduced are mammalian cells, commonly used animal cell expression plasmid vectors can be used.
  • Animal cell expression plasmid vectors include, for example, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo and the like.
  • Viral vectors include retrovirus (including lentivirus) vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, pox virus vectors, polio virus vectors, silvis virus vectors, rhabdovirus vectors, Examples include viral vectors, paramyxovirus vectors, orthomyxovirus vectors, and the like.
  • a viral vector means a vector that has a genomic nucleic acid derived from the virus and that can express a transgene by integrating it into the nucleic acid.
  • a Sendai virus vector can be suitably used as the virus vector.
  • Sendai virus belongs to the Paramyxoviridae (Paramyxoviridae; including genera such as Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, and Pnemovirus), one of the Mononegaviruses viruses, and has a single minus chain (encoding a viral protein
  • the genome contains the RNA of the antisense strand against the sense strand that is used as the genome.
  • the Sendai virus vector is a chromosomally non-integrating virus vector, and the vector is expressed in the cytoplasm. Therefore, since the transgene is not integrated into the chromosome of the host, the safety is high, and the vector can be removed from the transfected cells after the purpose is achieved.
  • Sendai virus vectors include viral cores, complexes of viral genomes and viral proteins, complexes composed of non-infectious viral particles, etc., which are loaded by introducing into cells. Included are complexes that are capable of expressing For example, a ribonucleoprotein (viral core portion, i.e., RNP) consisting of the Sendai virus genome and Sendai virus proteins (NP, P, and L proteins) bound thereto is introduced into cells to express transgenes in the cells. (WO 00/70055). Introduction into cells can be performed using general-purpose methods such as electroporation, lipofection, and microinjection. Therefore, such a ribonucleoprotein (RNP) is also included in the Sendai virus vector.
  • a ribonucleoprotein viral core portion, i.e., RNP
  • NP Sendai virus genome and Sendai virus proteins
  • Methods known per se for introducing expression vectors into somatic cells include infection methods for viral vectors (e.g., retroviral vector (Cell 2007 Nov 30;131(5):861-72, Sendai virus vector (Patent No. 5963309 No.)), and for plasmid vectors, the calcium phosphate method, lipofection method, retronectin method, or electroporation method (Nat Methods. 2011 May;8(5):409-12).
  • viral vectors e.g., retroviral vector (Cell 2007 Nov 30;131(5):861-72, Sendai virus vector (Patent No. 5963309 No.)
  • plasmid vectors the calcium phosphate method, lipofection method, retronectin method, or electroporation method (Nat Methods. 2011 May;8(5):409-12).
  • contacting the somatic cell with the reprogramming factor can be achieved by a gene transfer method using synthetic mRNA (e.g., calcium phosphate method, lipofection method (Cell Stem Cell. 2010 Nov 5; 7(5 ): 618-630) or electroporation method).
  • synthetic mRNA e.g., calcium phosphate method, lipofection method (Cell Stem Cell. 2010 Nov 5; 7(5 ): 618-630) or electroporation method.
  • the reprogramming factor is a protein
  • it is brought into contact with the somatic cells, for example, by direct injection of the protein (e.g., cell membrane permeable recombinant protein) (e.g., needle method, lipofection method, or electroporation method).
  • the protein e.g., cell membrane permeable recombinant protein
  • electroporation method e.g., needle method, lipofection method, or electroporation method.
  • Step (2) may be performed before step (1) or after step (1). In some embodiments, step (2) is performed after step (1). In another embodiment, step (2) is performed before step (1).
  • the method of the present application comprises the step of expanding somatic cells prior to step (2).
  • the culture conditions are not particularly limited, and may be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the somatic cells are peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • they may be cultured in a medium for CD34-positive cells to increase CD34-positive cells.
  • Known media for CD34-positive cells can be appropriately used, and examples thereof include media containing IL-6, SCF, TPO, Flt-3L, IL-3 and G-CSF.
  • the culture temperature is, but not limited to, about 30-40°C, for example about 37°C.
  • Cultivation is carried out in an atmosphere containing CO 2 , O 2 , N 2 with a CO 2 concentration of about 0.05-15%, preferably about 3-7%, more preferably about 4-6%, most preferably about 5%.
  • the O 2 concentration is about 0.05-100%, preferably 2-25%.
  • the N 2 concentration is about 0.05-100%, preferably 30-75%.
  • the period of expansion culture may be determined appropriately by a person skilled in the art and is not particularly limited, but it can be 1 to 20 days, 3 to 10 days, for example 4 to 7 days, while exchanging the medium as appropriate. Also, by using an automated culture device or the like, it is possible to perform continuous medium exchange (perfusion culture).
  • somatic cells can be cultured in suspension.
  • "suspension culture” means that cells are cultured in a state in which they do not adhere to a culture substrate.
  • those that have not been artificially treated for example, coating treatment with extracellular matrix etc.
  • an inhibitory treatment for example, a coating treatment with polyhydroxyethylmethacrylic acid (poly-HEMA) or a polymer of 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine (Lipidure)).
  • somatic cells for example, blood cells such as peripheral blood mononuclear cells, hematopoietic progenitor cells and CD34-positive cells
  • adhesion culture can also be used.
  • a commercially available product such as an adhesive cell culture plate 24F independent well type (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) may be used.
  • step (3) the somatic cells contacted with the reprogramming factor are cultured in a state in which two or more of the somatic cells are concentrated in the compartment. Said somatic cells may be cultured in suspension.
  • the step (3) is performed with two or more somatic cells concentrated in the compartment.
  • 2 to 500, 2 to 400, 3 to 300, 3 to 150, 5 to 100, or 5 to 50 somatic cells are aggregated at one point in the compartment. It is done in the The somatic cells may be aggregated by applying motions such as rotation, rocking, and vibration to the container, and the somatic cells may be aggregated at the bottom by using a compartment having an inclined surface from the opening toward the bottom. good.
  • the culture temperature is, but not limited to, about 30-40°C, for example about 37°C.
  • Cultivation is carried out in an atmosphere containing CO 2 , O 2 , N 2 with a CO 2 concentration of about 0.05-15%, preferably about 3-7%, more preferably about 4-6%, most preferably about 5%.
  • the O 2 concentration is about 0.05-100%, preferably 2-25%.
  • the N 2 concentration is about 0.05-100%, preferably 30-75%.
  • the period for culturing somatic cells is not particularly limited, and may be appropriately determined by a person skilled in the art based on the type of somatic cells, the type of reprogramming factors, the means of contacting reprogramming factors, etc., but is 3 to 30 days. , 5 to 20 days, 8 to 15 days, such as about 10 days.
  • the generation of pluripotent stem cells is e.g. It can be confirmed by the expression of pluripotent stem cell markers such as /4, Rexl and Nanog. The expression of pluripotent stem cell markers may be confirmed visually under a microscope by immunostaining, or may be confirmed using flow cytometry or FACS (fluorescence-activated cell sorting).
  • the produced pluripotent stem cells can be passaged every 3 to 30 days, every 4 to 20 days, every 5 to 10 days, for example, every 7 days.
  • the number of passages is not particularly limited, but for example, 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 10 or more, 20 or more, 30 or more, 40 or more, 50 or more. , 60 or more, 70 or more, 80 or more, 90 or more, or 100 or more.
  • Passage period is not particularly limited, 1 day or more, 10 days or more, 20 days or more, 30 days or more, 40 days or more, 50 days or more, 100 days or more, 200 days or more, 300 days or more, 400 days or more, 500 days or more It can be 1000 days or more, or 1000 days or more.
  • the vessel used for passage for example, the vessel for suspension culture described above can be used.
  • a closed-type automatic culture apparatus there is no concept of passage, and pluripotent stem cells can be propagated and differentiated by increasing the amount of medium and/or recirculating the medium.
  • the method of the present application further comprises an aggregation step in which the compartment has a cell-low-adhesion aggregation portion capable of aggregating two or more somatic cells, and aggregating the two or more somatic cells.
  • the aggregating step involves aggregating two or more somatic cells by rotating, rocking, or vibrating the container. If the method of the present application includes an aggregation step, step (3) is performed after the aggregation step has aggregated two or more somatic cells within the compartment. In other words, two or more somatic cells in contact with the reprogramming factor can be cultured in a more reliably aggregated state.
  • FIG. 10 and 11 An example of an aggregation process involving rotation with respect to the container will be described with reference to FIGS. 10 and 11.
  • FIG. The container 100 of FIGS. 10 and 11 is a substantially rectangular parallelepiped dish containing one compartment, and has a plurality of surfaces including a first surface 101 .
  • the first surface 101 has the largest area among the plurality of surfaces of the container 100 and faces the opening surface 102 .
  • the container 100 is rotated around a rotation axis L1 that is parallel to or crosses the first surface 101, so that the plurality of somatic cells housed in the container 100 are rotated. Somatic cells are aggregated.
  • the container 100 in FIG. 10 is configured to be rotatable around a rotation axis L1 parallel to the first surface 101.
  • a plurality of somatic cells accommodated in container 100 are concentrated in region 103 near rotation axis L1 of container 100 .
  • the rotating shaft L1 is not connected to the bearing mechanism at both shaft ends, but is connected to the bearing mechanism at one shaft end on the front side in FIG. If L1 can be rotated and also tilted in the elevation direction, the region 103 is arranged at the corner of the container 100 closest to the horizontal plane P.
  • the container 100 in FIG. 11 is configured to be rotatable around a rotation axis L1 that intersects the first surface 101.
  • a plurality of somatic cells housed in the container 100 are concentrated in a region 104 away from the axis of rotation L1 of the container 100 .
  • the region 104 is the side of the container 100 farthest from the rotation axis L1. placed on the edge.
  • a container 100 in FIG. 12 has a substantially rectangular plate shape and has a concave portion 110 .
  • the recess 110 has a substantially circular opening 111 that opens onto the one surface 105 of the container 100 .
  • the container 100 of FIGS. 10 and 11 may have recesses in the regions 103 and 104.
  • the concave portion has, for example, a low-cell-adhesive bottom portion, and is configured so that two or more somatic cells can be aggregated on this bottom portion. Further, a plurality of concave portions may be provided in the regions 103 and 104 according to the seeding amount of somatic cells, and in this case, the required amount of somatic cells can be collected efficiently.
  • the present application is a container body capable of accommodating somatic cells inside; at least one compartment disposed inside the container body; with said compartment is a cell low-adhesion aggregation part capable of aggregating two or more somatic cells; and a guide section for guiding the somatic cells that have flowed into the container to the concentration section.
  • a container body capable of accommodating somatic cells inside; at least one compartment disposed inside the container body; with said compartment is a cell low-adhesion aggregation part capable of aggregating two or more somatic cells; and a guide section for guiding the somatic cells that have flowed into the container to the concentration section.
  • the container of the present disclosure only needs to have at least one compartment, and may be plate-shaped, pack-shaped, or dish-shaped, for example.
  • the container of the present disclosure may further include a flow section that allows the inside of the container body and the outside of the container body to communicate with each other to enable the flow of somatic cells.
  • the guide part is not limited to having a pre-configured shape, and may be a path or means that allows somatic cells to be guided to the concentrated part by an external force.
  • FIGS. 13-23 An example of the container of the present disclosure is shown in FIGS. 13-23.
  • 13 to 18 show an example of a plate-type container
  • FIGS. 19 to 21 show an example of a plate-type container
  • FIGS. 22 and 23 show an example of a pack-type container. ing.
  • the container 200 of FIGS. 13-17 is generally rectangular dish-shaped and includes at least one compartment 210 .
  • Section 210 has a consolidation portion 220 and a guide portion 230 .
  • the container 200 has a substantially rectangular opening surface 201 provided with an opening 203 and a substantially rectangular bottom portion 202 facing the opening surface 201 .
  • a collecting portion 220 and a guiding portion 230 are arranged on the bottom portion 202 .
  • the container in FIG. 13 includes one compartment 210.
  • the centralized portion 220 is arranged substantially in the center of the bottom portion 202 in the longitudinal direction of the container 200 (hereinafter referred to as the longitudinal direction), and is aligned in the lateral direction of the container 200 (hereinafter referred to as the lateral direction). extends in a substantially linear fashion.
  • the bottom 202 of the container 200 is composed of two inclined surfaces extending from each of the longitudinal ends toward the longitudinal center. The two slanted surfaces are slanted from the opening surface 201 toward the bottom portion 202 from each of the longitudinal ends toward the longitudinal center, forming a guide portion 230 .
  • the somatic cells that have flowed into the container 200 are collected linearly by a plurality of inclined planes each of which is a plane. It is preferable that the angle formed by each inclined surface constituting the guide part 230 and one surface of the container 200 (for example, the opening surface 201) is 15 to 60 degrees.
  • the container in FIG. 14 includes one compartment 210.
  • the aggregated portion 220 is arranged at one longitudinal end of the bottom portion 202 and extends substantially linearly in the lateral direction.
  • the bottom portion 202 of the container 200 is configured with one inclined surface extending from the other longitudinal end toward the one longitudinal end.
  • the inclined surface is inclined from the opening surface 201 toward the bottom portion 202 as it goes from the other end in the longitudinal direction to the one end in the longitudinal direction, and constitutes the guide portion 230 .
  • the somatic cells that have flowed into the container 200 are collected in a straight line by the sloped plane. It is preferable that the angle formed by the inclined surface forming the guide part 230 and one surface of the container 200 (for example, the opening surface 201) is 15 degrees to 60 degrees.
  • the container 200 of FIG. 15 is different from the container 200 of FIG. 14 in that the inclined surface forming the guide portion 230 is formed of a curved surface protruding from the opening surface 201 toward the bottom portion 202 .
  • the somatic cells that have flowed into the container 200 are aggregated in a curved shape by the curved inclined surface.
  • the container 200 in FIG. 16 includes one compartment 210.
  • the centralized portion 220 is arranged at one end of the bottom portion 202 in the longitudinal direction and substantially in the center in the lateral direction, and is provided in a dot shape.
  • the bottom portion 202 of the container 200 is composed of an inclined surface 231 extending from the other end in the longitudinal direction toward the concentrated portion 220 and a groove portion 232 arranged substantially in the center of the first inclined surface 231 in the lateral direction.
  • the inclined surface 231 and the groove portion 232 constitute the guide portion 230 .
  • the inclined surface 231 is inclined from the opening surface 201 toward the bottom portion 202 from the other end in the longitudinal direction toward one end in the longitudinal direction, and the opening surface 201 is inclined from each of both ends in the short direction toward the center in the short direction. from toward the bottom 202 .
  • the groove portion 232 opens to the inclined surface 231 and has a groove width (in other words, the dimensional groove width of the groove portion 232 in the lateral direction) that decreases from the other end in the longitudinal direction toward one end in the longitudinal direction.
  • the somatic cells that have flowed into the container 200 are collected at one point by a plurality of inclined planes each configured as a plane.
  • the groove portion 232 can also be omitted.
  • the container 200 of FIG. 17 includes two compartments 210 that are longitudinally adjacent to each other.
  • the aggregated portion 220 of each compartment 210 is arranged at the longitudinal end of the bottom portion 202 and extends substantially linearly in the lateral direction.
  • the bottom portion 202 of the container 200 has a first inclined surface 231 extending from approximately the center in the longitudinal direction toward one end in the longitudinal direction, and a second inclined surface 232 extending from approximately the center in the longitudinal direction toward the other end in the longitudinal direction. It is configured.
  • Each of the first inclined surface 231 and the second inclined surface 232 constitutes the guide portion 230 of each section 210 .
  • Each of the first inclined surface 231 and the second inclined surface 232 is inclined from the opening surface 201 toward the bottom portion 202 from the center in the longitudinal direction toward one end or the other end in the longitudinal direction.
  • the somatic cells that have flowed into the container 200 are guided to one of the two collecting portions 220 by the two flat inclined planes, and are linearly collected.
  • the angle formed by each of the first inclined surface 231 and the second inclined surface 232 and one surface of the container 200 is preferably 15 degrees to 60 degrees.
  • the container 200 in FIG. 18 includes one compartment 210.
  • a container 200 in FIG. 18 has a substantially circular dish shape and has a substantially circular opening surface 201 and a bottom portion 202 .
  • the concentrated portion 220 is arranged at the end of the bottom portion 202 that is radially farther from the center line L2 and extends in a circular line.
  • the bottom portion 202 of the container 200 has a substantially conical shape with the apex located on a center line L2 passing through the center of the container 200 and perpendicular to the opening surface 201 and the bottom portion 202.
  • the bottom portion 202 is composed of an inclined surface extending radially from the center line L2.
  • the inclined surface is inclined from the opening surface 201 toward the bottom portion 202 as the distance from the center line L2 increases, and constitutes the guide portion 230 .
  • the somatic cells that have flowed into the container 200 are aggregated in a circular line by the curved inclined surface.
  • the angle between each of the first inclined surface 231 and the second inclined surface 232 and one surface of the container 200 (for example, the bottom portion 202) is preferably 15 degrees to 60 degrees.
  • each container 13 to 18 show an example in which the bottom portion of each container is pre-molded with an inclination or slope.
  • You may provide an inclination or a gradient in the bottom face of .
  • a tilt mechanism controlled by MEMS is provided under the bottom surface of the container, and by activating the tilt mechanism, the bottom surface of the container can be tilted or sloped.
  • the container 300 of FIG. 19 includes nine compartments 302. Each compartment 302 has one recess 310 .
  • a container 300 in FIG. 19 has a substantially rectangular plate shape and has a substantially rectangular opening surface 301 provided with nine recesses 310 .
  • Each recess 310 has an opening 311 opening to the opening surface 301 and a bottom 312 facing the opening 311 .
  • Each recess 310 has a substantially truncated cone shape that tapers from the opening 311 toward the bottom 312 .
  • the somatic cells that have flowed into each concave portion 310 are collected at one point by the curved inclined surface.
  • the angle formed by the side surface of the concave portion 310 forming the guide portion 330 and the one surface of the container 200 (for example, the opening surface 301) is preferably 15 degrees to 60 degrees.
  • the concave portion 310 can adopt any configuration capable of aggregating two or more somatic cells that have flowed into the concave portion 310 .
  • the recess 310 may have a substantially truncated cone shape with a curved side surface 313 projecting toward the center of the recess 310 as shown in FIG. 20, or a substantially truncated pyramid shape as shown in FIG. It may be in shape.
  • the somatic cells that have flowed into each concave portion 310 are concentrated in one place by the curved inclined surfaces, as in FIG.
  • the somatic cells that have flowed into each concave portion 310 are collected in one place by an inclined surface configured by a polygonal (for example, substantially triangular) plane.
  • the opening surface does not need to have an opening on the entire surface, and the opening may be formed in a part of the wall surface. Further, the opening is opened and closed by a cap mechanism or the like. can be anything. Moreover, as long as the idea of the invention is the same, the opening surface does not necessarily face the bottom surface, and may be provided on the side surface of the container.
  • a container 400 of FIG. 22 includes a container body 410 capable of accommodating somatic cells therein, at least one compartment 420, and a circulation section 430 that allows circulation of somatic cells.
  • the container body 410 is in the form of a pack and has a compartment 420 arranged therein.
  • the flow section 430 communicates the inside of the container body 410 with the outside of the container body 410 .
  • the compartment 420 has a low-cell-adhesive aggregation section 440 capable of accommodating two or more somatic cells, and a guide section 450 that guides the gymnastic body that has flowed into the container 400 to the aggregation section 440 .
  • the compartment 420 has a recess 421 .
  • the recess 421 has an opening 422 that opens to the inner surface 411 of the container body 410 and a low cell adhesion bottom 423 facing the opening 422 .
  • the bottom portion 423 has an aggregate portion 440 arranged at one end in the longitudinal direction, and an inclined surface that slopes from the opening portion 422 toward the one end in the longitudinal direction from the other longitudinal end to the bottom portion 423 . This inclined surface constitutes the guide portion 450 .
  • the concave portion 421 can adopt any configuration that can collect two or more somatic cells that have flowed into the container main body 410 .
  • recess 310 shown in FIGS. 19-21 may be used as recess 421 .
  • the container 400 of FIG. 23 is different from the container 400 of FIG. 22 in that the converging portion 440 is composed of a concave portion 421 and the guide portion 450 is composed of a protruding portion protruding from the inner surface 411 of the container body 410.
  • the recess 421 has a low cell adhesion bottom 423 substantially parallel to the inner surface 411 of the container body 410 .
  • the protruding portion that constitutes the guide portion 450 is arranged adjacent to the opening portion 422 outside the recess portion 421 and further away from the flow portion 430 than the opening portion 422 is.
  • the guide part 450 is not limited to forming a part of the recess 421 .
  • the distribution unit 430 may be configured so as to be able to supply and discharge somatic cells and supply initialization factors. Further, the distribution unit 430 may be configured with a first distribution unit that supplies and discharges somatic cells and a second distribution unit that supplies initialization factors, or a first distribution unit that supplies somatic cells. , a second flow section for discharging somatic cells, and a third flow section for supplying the initialization factor.
  • the shape and configuration of the recess 421 of the container 400 is not limited to the shape illustrated in FIGS. .
  • the container of the present disclosure may contain an initialization factor within the compartment.
  • the reprogramming factors described above can be used, and can be, for example, the proteins, low-molecular-weight compounds, or miRNAs described above.
  • the amount of initialization factor contained in the partition may be appropriately determined by those skilled in the art, and is not particularly limited.
  • the present application is the container; a seeding device for supplying and seeding somatic cells into the container; a collection device that discharges and collects the somatic cells that have come into contact with the reprogramming factor from the inside of the container to the outside of the container; and a control device for controlling the sowing device and the collecting device.
  • This system allows the production of pluripotent stem cells from somatic cells.
  • the system 1 of the present disclosure includes a container 2, a control device 10, a sowing device 20, and a collection device 30, as shown in FIG.
  • the system 1 of FIG. 24 further includes, as an example, an initialization factor supply device 40, an inclination device 50, a vibration device 60, a rotation device 70, and a culture device 80.
  • the container 2 may be a container having one or more compartments with low cell adhesion.
  • the containers 100, 200, 300, 400 shown in FIGS. 10-23 can be used.
  • the control device 10 has, for example, a CPU that performs calculations, and a storage device that stores programs necessary for calculations and calculation results.
  • the control device 10 controls the initialization factor supplying device 40, the tilting device 50, the vibrating device 60, the rotating device 70, and the culturing device 80 in addition to the seeding device 20 and the collecting device 30. , producing pluripotent stem cells from somatic cells.
  • the control device 10 monitors the operation status of various devices electrically connected to the control device 10. For example, when using the container 100 shown in FIG. , a control signal relating to the tilt angle is transmitted to the tilt device 50 at .
  • the tilting device 50 Upon receiving the control signal from the control device 10, the tilting device 50 tilts the first surface 101 of the container 100 at the same tilt angle. As a result, it is possible to create in the container 100 a guiding situation equivalent to the guiding portion 230 of the container 200 in FIG.
  • the tilting device 50 preferably has a function of adjusting the tilting angle in multiple steps or steplessly. can be controlled. Further, when using the container 100 shown in FIG. 11, the control device 10 controls the rotation angle, rotation speed, rotation speed, It transmits control signals related to acceleration, angular velocity, torque, and the like.
  • the rotating device 70 concentrates the somatic cells in the container 100 in the region 104 by centrifugal force based on the rotation.
  • the aggregation status monitor device 90 monitors the aggregation status of the somatic cells in the container 100 and sends the result to the control device 10 as a monitor signal. Output.
  • the control device 10 can sequentially receive monitor signals from the aggregation status monitor device 90 and cause the container 100 to rotate optimally according to the aggregation status of somatic cells through inverter control. This enables production of pluripotent stem cells without applying unnecessary stress to somatic cells and pluripotent stem cells.
  • the control mechanism configured by combining the control device 10 and the tilting device 50 or the rotating device 70 can be effectively used even when the reprogramming factors are brought into contact with the somatic cells.
  • the seeding device 20 causes the somatic cells before contact with the reprogramming factor to flow into the container 2 and seed the somatic cells in the container 2 .
  • the seeding device 20 includes, as an example, a storage tank in which somatic cells before contact with the reprogramming factor are stored, and a driving device (for example, a pump) that delivers the somatic cells in the storage tank to the container 2. and
  • the collection device 30 discharges and collects the somatic cells that have come into contact with the reprogramming factor from the inside of the container 2 to the outside of the container 2 .
  • the collection device 30 includes, for example, a driving device that discharges the somatic cells that have come into contact with the reprogramming factor from the inside of the container 2 to the outside of the container 2, and a temporary storage of the somatic cells discharged by the driving device. It has a storage tank for The somatic cells stored in the storage tank are delivered to the culture device 80 by the driving device.
  • the initialization factor supply device 40 has, for example, a storage tank in which the initialization factor is stored, and a driving device that delivers the initialization factor in the storage tank to the container 2 .
  • the tilting device 50 tilts a part or all of the container 2 with respect to a reference plane (for example, a horizontal plane P shown in FIGS. 10 and 11) to move two or more somatic cells inside the container 2 into compartments of the container 2. It is configured so that it can be aggregated into For example, the tilting device 50 rotates and tilts the container 2 around a rotation axis L1 parallel to the reference plane as shown in FIG. 10, or if the container 2 has a flexible bottom surface, It is configured to deform a part of the bottom surface of the container 2 .
  • a reference plane for example, a horizontal plane P shown in FIGS. 10 and 11
  • the vibrating device 60 is configured to rock or vibrate the container 2 so that two or more somatic cells inside the container 2 can be concentrated in the compartment of the container 2 .
  • the rotating device 70 is configured to rotationally drive the container 2 around the rotation axis L1 and concentrate two or more of the somatic cells inside the container in the compartment by centrifugal force.
  • the culture device 80 cultures the somatic cells that have come into contact with the reprogramming factors recovered by the recovery device 30.
  • the aggregation status monitor device 90 has an optical member such as a CCD (charge-coupled device) provided, for example, on a portion of the rotation axis L1 or near the outer track of the container 2 .
  • the aggregation status monitor device 90 is configured to be able to monitor the aggregation status of somatic cells when the container 100 is made of an optically visible material.
  • the system 1 may include five driving devices that individually drive the seeding device 20, the recovery device 30, the initialization factor supply device 40, the tilting device 50, and the vibration device 60, or the seeding device 20 and the recovery device. 30, one to four driving devices for driving some or all of the initialization factor supply device 40, the tilting device 50 and the vibrating device 60 may be provided.
  • Systems in this application include, for example, automated systems for producing pluripotent stem cells from somatic cells.
  • a device for efficiently realizing the automation may be further provided.
  • pluripotent stem cells are produced according to GMP (Good Manufacturing Practice) standards
  • GMP Good Manufacturing Practice
  • the system of the present application may be configured to share some of the steps with another device, or may be configured to perform some of the steps by the operator of the system of the present application. You may The devices constituting the system of the present application do not all need to be installed in the same facility. may be connected to
  • the initialization factor supplying device 40, the tilting device 50, the vibrating device 60, the rotating device 70, the culturing device 80 and the aggregation status monitoring device 90 can be omitted. If the initialization factor supply device 40 is omitted, for example, the container 2 may be configured so that the compartments contain the initialization factor in advance. When the tilting device 50 and the vibrating device 60 are omitted, for example, containers 200, 300 and 400 shown in FIGS. 13 to 23 may be used.
  • kits for producing pluripotent stem cells from somatic cells, comprising: Provided is a kit comprising a cell-low-adhesion container having one or more compartments capable of consolidating two or more cells, and a reprogramming factor.
  • the initialization factor may be sealed in the container in advance, or may be sealed in a separate ampoule or the like.
  • the kit is provided with the former configuration, the user of the kit does not need to separately introduce a reprogramming factor after seeding the somatic cells, and simply seeding the somatic cells in the container can obtain the somatic cells. Since reprogramming becomes possible, it becomes possible to produce pluripotent stem cells more easily under sterile conditions.
  • Kits of the present application may also include buffers, media, instructions, and the like.
  • the present application also provides a program that causes a computer to execute the method for producing pluripotent stem cells from the somatic cells.
  • the method for producing pluripotent stem cells from somatic cells is implemented by the CPU of control device 10 executing a predetermined program in system 1 shown in FIG.
  • Non-transitory computer-readable media include, for example, magnetic recording media (eg, flexible discs, magnetic tapes, hard disk drives), magneto-optical recording media (eg, magneto-optical discs), CD-ROMs, CD-Rs, CD-Rs /W, including semiconductor memory (eg, mask ROM, PROM, flash ROM, RAM); Also, the program is supplied to the computer via a wired communication path such as an electric wire and an optical fiber or a wireless communication path, for example.
  • a wired communication path such as an electric wire and an optical fiber or a wireless communication path, for example.
  • the day when the somatic cells are contacted with the reprogramming factor (if the contact lasts for several days, the day when the contact is started) is Day0, and the number of days after that is DayX. . Therefore, for example, Day 2 is two days after the day when the reprogramming factor is brought into contact with the somatic cells.
  • SRV (trademark) iPSC-2 Vector is a stealth RNA vector with optimized gene expression levels to generate iPS cells from peripheral blood monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and CD34-positive cells.
  • Four human-derived reprogramming genes human KLF4 gene, human SOX2 gene, and human c-MYC gene, Aequorea victoria-derived EGFP gene, and Streptomyces alboniger-derived puromycin (Puro) resistance gene are carried.
  • Introduction of SRV (trademark) iPSC-2 Vector into cells can be confirmed by observing EGFP fluorescence with a fluorescence microscope.
  • the SRVTM iPSC-2 Vector is automatically cleared in response to the expression of miR-302, a microRNA specifically expressed in pluripotent stem cells.
  • SRV (trademark) iPSC-4 Vector may also be used.
  • the AggreWell (trademark) plate has 1200 microwells with a diameter of 400 ⁇ m in one well (see the right figure in Fig. 6). By seeding and culturing cells on an AggreWellTM plate, a large number of uniformly sized cell clusters can be produced.
  • Equipment Used Table 2 shows the details of the equipment used in this example.
  • Table 3 shows the details of the cells (PBMC, ZenBio) used in this example. Frozen PBMCs were thawed and used in this example.
  • Procedure A Expansion culture of CD34-positive cells To 2 mL of A1 StemSpan ACF, 2 ⁇ L of each of the cytokines adjusted to the following concentrations was added to prepare media for CD34-positive cells. 1 mL of PBS for moisturizing was added to the outer wells of the A2 24-well plate. A3 PBMCs were lightly thawed in a water bath at 37°C, and about 1 mL of medium for CD34 positive cells was added and dissolved completely. A4 was centrifuged at 1500 rpm for 5 min. The A5 supernatant was removed, the cell aggregates were loosened by tapping, and suspended in 1 mL of the medium for CD34-positive cells. The A6 cell suspension was seeded on a 24-well plate and statically cultured in a 37°C 5% CO2 incubator for 5 days.
  • B Production of iPS cells (adherent culture: control)
  • B1 5 mL of CD34-positive cell medium was prepared according to procedure A1.
  • the total amount of PBMCs after B2 culture was collected in a 1.5 mL tube and counted.
  • the cell suspension was transferred to a B8 15 mL tube, 1 mL of StemSpan ACF was added, and the mixture was centrifuged at 300 G, 5 min, 4°C. The B9 supernatant was removed and the cell clumps were loosened by tapping. B10 Steps B8, B9 were repeated. 400 ⁇ L of the CD34-positive cell medium and 1.8 ⁇ L of iMatrix were placed in a B11 24-well plate, and the plate was shaken for agitation. Cells were seeded (40 ⁇ L) so that B12 was 2 ⁇ 10 4 cells/well. The B13 plate was placed in a 37°C 5% CO2 incubator to initiate culture. On B14 Day2 and Day4, 400 ⁇ L each of AK03 medium was added. On B15 Day7 and Day9, the medium was replaced with 400 ⁇ L of AK03 medium. B16 Day10 was passed to a 6-well plate.
  • TRA-1-60 Immunostaining 2 ⁇ L of TRA-1-60 antibody was added to 100 ⁇ L of D1 FACS Buffer and mixed. The medium was removed with a micropipette, leaving a height of about 5 mm from the bottom of the well so as not to suck the D2 spheres. D3 1 mL of FACS Buffer was added little by little from the edge of the well. D4 FACS Buffer was removed by the method of procedure D2. D5 100 ⁇ L of TRA-1-60 antibody diluted in procedure D1 was added. It was protected from light with D6 aluminum foil and incubated at room temperature for 30 minutes.
  • D7 FACS Buffer 1 mL was added, and the medium was removed with a micropipette, leaving a medium height of about 5 mm from the bottom of the well.
  • D8 Procedure D7 was performed again. 300 ⁇ L of D9 FACS Buffer was added. Observed with a D10 Keyence fluorescence microscope.
  • TRA-1-60 a TRA-1-60-positive pluripotent stem cell marker
  • Example 1 Summary The results of Example 1 are shown in Table 6. As shown in Table 6, it was possible to efficiently obtain iPS cells by aggregating PBMCs in the initial stage of the reprogramming process. Number of seeded cells: 1.2 ⁇ 10 4 cells/well Reprogramming period: 9 days Reprogramming reagent: Tokiwa Bio Co., Ltd. SRV (trademark)-iPSC-2 vector
  • Example 2 The relationship between the size of the initially formed cell cluster (the number of constituent cells) and the reprogramming efficiency. The number of viable cells, the number of TRA-1-positive cells, and the TRA-1-positive rate on Day 14 relative to the number of PBMC cells (1 to 500 cells/microwell) obtained from the microwells were measured. The results are shown in Table 7 and Figures 7-9.
  • the total number of iPS cells was high when PBMC were aggregated at 300 cells/microwell. Efficiency was also seen when PBMC were agglutinated at 5-100 cells/microwell.

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Abstract

体細胞から多能性幹細胞を製造する方法であって、（１）2以上の体細胞を集約可能な区画を１以上有する容器に、体細胞を播種する工程、（２）体細胞に初期化因子を接触させる工程、及び（３）初期化因子と接触した体細胞を、前記区画内に２以上の前記体細胞が集約された状態で培養する工程を含む、前記方法を提供する。

Description

多能性幹細胞の製造方法
　本願は、体細胞、特に血球系細胞からの多能性幹細胞の製造方法に関する。
　体細胞を初期化して製造される多能性幹細胞であるiPS細胞は、様々な細胞に分化することができ、移植治療をはじめとする再生医療での利用が期待されている。様々な由来の体細胞を用いて多能性幹細胞を製造する方法が知られている。
　血球系細胞（具体的には末梢血単核球）からの多能性幹細胞製造は、侵襲性が低く患者の負担が小さいという優れた利点を有するが、初期化効率が非常に低いため、当該効率を改善する方法が切望されている。また、血球系細胞はプラスチックシャーレなどの底面に接着することなく、浮遊培養が可能であり、自動化培養装置などを用いる培養において、細胞の取扱いが容易であるという利点を合わせ持つ。
特開2018-23401 特開2016-135102 特開2021-035399 特開2020-036608 再表2018/143243 再表2017/110724
　本願は、多能性幹細胞の製造方法を提供することを目的とする。
　本願は、下記の実施形態を提供する。
［１］
　体細胞から多能性幹細胞を製造する方法であって、
（１）2以上の体細胞を集約可能な区画を１以上有する容器に、体細胞を播種する工程
（２）体細胞に初期化因子を接触させる工程
（３）初期化因子と接触した体細胞を、前記区画内に２以上の前記体細胞が集約された状態で培養する工程
を含む、前記方法。
［２］
　前記区画が、２以上の体細胞を集約可能な細胞低接着性の集約部を有し、
　２以上の体細胞を前記集約部へと集約する集約工程
をさらに含む、前記［１］に記載の方法。
［３］
　前記集約工程が、前記容器に対する回動、揺動及び震動の少なくともいずれかの動作を伴う、前記［２］に記載の方法。
［４］
　前記容器が、複数の面を有し、
　前記容器に対する回動の動作が、前記複数の面のうち最も面積の大きい第１面に平行又は交差する回転軸まわりに行われる、前記［３］に記載の方法。
［５］
　前記第１面に対する前記回転軸の角度が、直角である、前記［４］に記載の方法。
［６］
　２以上の体細胞が、前記容器の前記回転軸に対する径方向の中心よりも前記回転軸の近くの領域に集約される、前記［５］に記載の方法。
［７］
　２以上の体細胞が、前記容器の前記回転軸に対する径方向の中心よりも前記回転軸から離れた領域に集約される、前記［５］に記載の方法。
［８］
　前記区画が、
　前記容器の一面に設けられた開口部と、細胞低接着性の底部とを含む凹部を有し、
　前記凹部が、
　２以上の体細胞を集約可能な集約部と、
　前記容器の内部に流入した体細胞を前記集約部に案内する案内部と
を有する、前記［１］～［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］
　前記案内部が、前記容器の一面に対して傾斜する傾斜面である、前記［８］に記載の方法。
［１０］
　前記傾斜面と前記容器の一面とがなす角が、１５～６０度である、前記［９］に記載の方法。
［１１］
　前記傾斜面が、平面で構成されている、前記［９］又は[１０]に記載の方法。
［１２］
　前記傾斜面が、曲面で構成されている、前記［９］又は[１０]に記載の方法。
［１３］
　前記案内部が、２以上の前記傾斜面を有している、前記［９］～［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］
　前記傾斜面が、多角形状の平面で構成されている、前記［９］～［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］
　前記凹部が、互いに隣接して配置された３以上の前記傾斜面で構成され、前記開口部から前記底部に向かうに従って先細りとなる多角錐形状であり、
　前記底部が前記集約部を構成し、前記凹部の側面が前記案内部を構成する、前記［１４］に記載の方法。
［１６］
　前記傾斜面が、略三角形状の平面である、前記［１４］に記載の方法。
［１７］
　前記凹部が、前記開口部から前記底部に向かうに従って先細りとなる略円錐形状であり、
　前記底部が前記集約部を構成し、前記凹部の側面が前記案内部を構成する、前記［１２］に記載の方法。
［１８］
　前記容器が、２以上の前記区画を有する、前記［１］～［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］
　前記体細胞が浮遊性の体細胞である、前記［１］～［１８］のいずれか一項に記載の方法。
［２０］
　前記浮遊性の体細胞が血球系細胞である、前記［１９］に記載の方法。
［２１］
　前記血球系細胞が末梢血単核球である、前記［２０］に記載の方法。
［２２］
　前記血球系細胞が造血前駆細胞を含む、前記［２０］に記載の方法。
［２３］
　前記血球系細胞がCD34陽性細胞である、前記［２０］に記載の方法。
［２４］
　前記血球系細胞が末梢血又は臍帯血由来である、前記［２０］～［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］
　体細胞を３～１５０細胞／区画の細胞密度で播種する、前記［１］～［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］
　前記細胞密度が５～５０細胞／区画である、前記［２５］に記載の方法。
［２７］
　体細胞を初期化因子に接触させる前に、体細胞を拡大培養する工程を含む、前記［１］～［２６］のいずれか一項に記載の方法。
［２８］
　工程（２）において、センダイウイルスベクターを用いて体細胞に初期化因子を接触させる、前記［１］～［２７］のいずれか一項に記載の方法。
［２９］
　初期化因子がRNAである、前記［１］～［２８］のいずれか一項に記載の方法。
［３０］
　体細胞がヒト体細胞である、前記［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法。
［３１］
　前記工程（１）の後に、前記工程（２）が行われる、前記［１］～［３０］のいずれか一項に記載の方法。
［３２］
　前記工程（２）の後に、前記工程（１）が行われる、前記［１］～［３０］のいずれか一項に記載の方法。
［３３］
　2以上の体細胞を集約可能な前記区画を有する、前記［１］～［３２］のいずれか一項に記載の方法に用いる容器。
［３４］
　内部に体細胞を収容可能な容器本体と、
　前記容器本体の内部に配置された少なくとも１つの区画と、
を備え、
　前記区画が、
　２以上の体細胞を集約可能な細胞低接着性の集約部と、
　前記容器の内部に流入した体細胞を前記集約部に案内する案内部と
を有する、容器。
［３５］
　前記区画が、
　前記容器本体の内面に開口する開口部と、細胞低接着性の底部とを含む凹部を有し、
　前記案内部が、
　前記凹部の一部を構成し、前記容器本体の内面に対して傾斜する傾斜面である、前記［３４］に記載の容器。
［３６］
　前記区画が、
　前記容器本体の内面に設けられた開口部と、細胞低接着性の底部とを含む凹部を有し、
　前記案内部が、
　前記凹部の外部で前記開口部に隣接しかつ前記開口部よりも前記流通部から離れて配置され、前記内面から突出する突出部である、前記［３４］に記載の容器。
［３７］
　前記容器本体の内部と前記容器本体の外部とを連通し、体細胞の流通を可能とする流通部をさらに備える、前記［３３］～［３６］のいずれか一項に記載の容器。
［３８］
　前記区画内に初期化因子が含まれる、前記［３３］～［３７］のいずれか一項に記載の容器。
［３９］
　前記［３３］～［３８］のいずれか一項に記載の容器と、
　体細胞を前記容器の内部に供給して播種する播種装置と、
　初期化因子と接触した体細胞を前記容器の内部から前記容器の外部に排出して回収する回収装置と、
　前記播種装置及び前記回収装置を制御する制御装置と
を備える、システム。
［４０］
　前記容器の一部又は全部を基準面に対して傾斜させて、前記容器の内部の２以上の前記体細胞を前記区画に集約させることが可能な傾斜装置を備える、前記［３９］に記載のシステム。
［４１］
　前記容器が、可撓性の底面を有し、
　前記傾斜装置が、前記底面を変形させて前記基準面に対して傾斜させる、前記［４０］に記載のシステム。
［４２］
　前記傾斜装置が、前記容器を前記基準面に直交する方向に延びる回転軸まわりに回転させて傾斜させるか、又は、前記容器の底面の一部を押圧することで前記容器の一部若しくは全部を前記基準面に対して傾斜させる、前記［４１］に記載のシステム。
［４３］
　前記容器を揺動又は振動させて、前記容器の内部の２以上の前記体細胞を前記区画に集約させることが可能な振動装置を備える、前記［３９］～［４２］のいずれか一項に記載のシステム。
［４４］
　前記容器を回転軸まわりに回転駆動させて、遠心力により前記容器の内部の２以上の前記体細胞を前記区画に集約させることが可能な回転装置を備える、前記［３９］～［４３］のいずれか一項に記載のシステム。
［４５］
　体細胞から多能性幹細胞を製造するためのキットであって、
　2以上の細胞を集約可能な区画を１以上有する細胞低接着性の容器、及び
　初期化因子を含む、キット。
［４６］
　前記［１］～［３２］のいずれか一項に記載の方法をコンピュータに実行させるプログラム。
　本願によって、効率の良い多能性幹細胞の製造方法が提供される。また、多能性幹細胞を製造するための容器、システム、キット及びプログラムが提供される。
Aggrewell(商標) plateに播種した直後の細胞の形態。 Day4のコントロールの細胞（左図）及びAggrewell(商標) plateに播種した細胞（右図）の形態。 Day10のコントロールの細胞（左図）及びAggrewell(商標) plateに播種した細胞（右図）の形態。 Day10のAggrewell(商標) plateに播種した細胞の蛍光画像。左上図は、GFPの蛍光画像を示す。右上図は、TRA-1-60抗体を用いた免疫染色像を示す。左下図は、GFPの蛍光画像、TRA-1-60抗体を用いた免疫染色像及び明視野画像をマージした画像を示す。右下図は、左下図を拡大した画像である。 Day11に継代を行い、Aggrewell(商標) plateに播種した細胞のDay16における形態及び蛍光画像。左上図は、GFPの蛍光画像を示す。右上図は、TRA-1-60抗体を用いた免疫染色像を示す。左下図は、GFPの蛍光画像及びTRA-1-60抗体を用いた免疫染色像をマージした画像を示す。右下図は、明視野画像を示す。 Day9の24ウェルプレート（コントロール）での細胞培養（左図）及びAggrewell(商標) plateでの細胞培養（右図）の明視野画像。 1マイクロウェル当たりに播種したPBMC細胞数とDay14の生細胞数との関係。 1マイクロウェル当たりに播種したPBMC細胞数とDay14のTRA-1陽性細胞数との関係。 1マイクロウェル当たりに播種したPBMC細胞数とDay14のTRA-1陽性率との関係。 本開示の第１の実施形態の製造方法に含まれる集約工程を説明する模式図。 本開示の第２の実施形態の製造方法に含まれる集約工程を説明する模式図。 本開示の第１の実施形態の容器を示す模式図。 本開示の第２の実施形態の容器を示す模式図。 本開示の第３の実施形態の容器を示す模式図。 本開示の第４の実施形態の容器を示す模式図。 本開示の第５の実施形態の容器を示す模式図。 本開示の第６の実施形態の容器を示す模式図。 本開示の第７の実施形態の容器を示す模式図。 本開示の第８の実施形態の容器を示す模式図。 本開示の第９の実施形態の容器を示す模式図。 本開示の第１０の実施形態の容器を示す模式図。 本開示の第１１の実施形態の容器を示す模式図。 本開示の第１２の実施形態の容器を示す模式図。 本開示の一実施形態のシステムを示すブロック図。
　本明細書及び特許請求の範囲においては、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値及び両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
［多能性幹細胞の製造方法］
　本願は、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法であって、
（１）2以上の体細胞を集約可能な区画を１以上有する容器に、体細胞を播種する工程
（２）体細胞に初期化因子を接触させる工程
（３）初期化因子と接触した体細胞を、前記区画内に２以上の前記体細胞が集約された状態で培養する工程
を含む、前記方法を提供する。
（体細胞）
　本開示において、体細胞としては、特に限定されず、任意の体細胞を利用できる。例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、末梢血単核球、臍帯血、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、及びそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本願における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血前駆細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。ある実施形態において、前記体細胞は、血球系細胞（例えば末梢血単核球、造血前駆細胞及びCD34陽性細胞）などの浮遊性の細胞であり得る。前記血球系細胞は、例えば末梢血又は臍帯血由来である。
　本願において、体細胞の由来となる動物に制限はなく、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、オランウータン、チンパンジー、イヌ、ネコ、トリ、ヒトなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトである。
（多能性幹細胞）
　本願において、「多能性幹細胞」とは、様々な細胞へと分化する分化能と、増殖能を併せ持つ細胞をいう。体細胞へ初期化因子と呼ばれる因子を作用させることで、体細胞を初期化して多能性幹細胞へと誘導する方法は公知である。
（培地）
　本願において、培地は動物細胞の培養に用いられる基礎培地に必要な因子を適宜添加して調製され得る。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、MEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、DMEM/F12培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、及びこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、又は無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン、マイトマイシン）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカイン及びこれらの同等物などの1つ以上の物質も含有し得る。基礎培地として市販の培地を使用してもよく、例えば、StemSpan ACF（STEMCELL Technologies）又はStemFit（登録商標）AK03N培地（味の素（株））などの培地を使用できる。
・工程（１）
　工程（１）において、2以上の体細胞を集約可能な区画を1以上有する容器に、体細胞を播種する。
（体細胞の集約）
　体細胞の「集約」とは、体細胞が少なくとも1つの他の体細胞に接触し、複数の体細胞が1か所に集まっている状態を意味する。2以上の体細胞を集約可能な区画は、2以上の体細胞を集約可能である限り特に限定されないが、例えば2以上の体細胞を物理的な力（自重によって生じる力を含む）によって1か所に集めることができる区画である。具体的には、容器に対して回転、揺動及び震動などの動作を与えることにより２以上の体細胞を集約可能な区画、又は開口部から底部に向かう傾斜面を有し、傾斜面により２以上の体細胞を例えばその自重により底部に集約可能な区画などが挙げられる。前記開口部から底部に向かう傾斜面を有する区画においては、さらに、容器に対して回転、揺動及び震動などの動作が与えられてもよい。
　本態様において、前記容器は、2以上の体細胞を集約可能な区画を1以上有する。容器に含まれる区画の数は、当業者が適宜定めれば良く特に限定されない。前記容器は、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の区画を有していてもよく、1～10万又はそれ以上の区画を有していてもよい。例えば、前記容器が各ウェルに1200個の区画を有する24ウェルプレートである場合、区画の数は28,800個である。ある実施形態において、前記容器は2以上の前記区画を有する。
　本態様において、前記区画は細胞低接着性であり得る。細胞低接着性の区画としては、市販の細胞培養容器において、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックスなどによるコーティング処理）されていない区画、又は人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）又は2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体（Lipidure）によるコーティング処理）がされている区画などが例示されるが、これらに限定されない。
　工程（１）で播種される前記体細胞の細胞密度は当業者が適宜定めれば良く特に限定されないが、例えば工程（３）においてほとんどすべての体細胞が少なくとも1つの他の体細胞に接触し得るように細胞密度を決定すればよい。工程（３）において体細胞が区画内の一点に集約される場合には、前記細胞密度は、2～500細胞／区画、2～400細胞／区画又は3～300細胞／区画であり得、例えば3～150細胞／区画、5～100細胞／区画、5～50細胞／区画であり得る。工程（３）において体細胞が線状に集約される場合には、前記細胞密度は体細胞が集約する線状部分の長さに応じて決定され得る。例えば線状部分の長さが10cmである場合、前記細胞密度は約104細胞／区画以上であり得、例えば約104～106細胞／区画であり得る。
・工程（２）
　工程（２）において、体細胞に初期化因子を接触させる。
（初期化因子）
　本願において初期化因子とは、単独で、又は複数の因子と共同して、ある細胞の分化状態をより未分化な状態に誘導するために用いられる物質を意味する。初期化因子には、核の初期化に必須の因子及び核初期化の効率を上昇させる補助的な因子（補助因子）が含まれる。初期化因子は、例えば遺伝子（DNA、RNA）、遺伝子産物（mRNA、miRNA、タンパク質など）、低分子化合物及びこれらの組合せであり得る。
　初期化因子が遺伝子又はその遺伝子産物の場合、Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｌｉｎ遺伝子ファミリーの遺伝子、及びＮａｎｏｇ遺伝子、並びに、それらの遺伝子産物からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる（国際公開第2007/69666号;特許第5696282号; Science, 2007, 318:1917-1920）。これらの中でも、好ましくは、Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子ファミリー遺伝子、及びＭｙｃ遺伝子ファミリーの遺伝子、及びこれらの遺伝子の遺伝子産物からなる群より選択される少なくとも１つが挙げられる。
　これらのファミリーの遺伝子及びその組み合わせの具体例を以下に列挙する。なお、以下においては遺伝子の名称のみを記載するが、その遺伝子産物を用いる場合も含まれる。
（ａ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる１種の初期化因子；
（ｂ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子及びＳｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる２種の初期化因子の組み合わせ；
（ｃ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子及びＫｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる２種の初期化因子の組み合わせ；
（ｄ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子及びＮａｎｏｇ遺伝子からなる２種の初期化因子の組み合わせ；
（ｅ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子、及びＫｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる３種の初期化因子の組み合わせ；
（ｆ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子及びＭｙｃ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる３種の初期化因子の組み合わせ；
（ｇ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子及びＭｙｃ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる４種の初期化因子の組み合わせ；並びに
（ｈ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｌｉｎ遺伝子ファミリーの遺伝子、及びＮａｎｏｇ遺伝子からなる４種の初期化因子の組み合わせ。
　より具体的には、以下の組み合わせが例示されるが、これらに限定されない。以下の組合せにおいて、Ｓｏｘ２遺伝子は、Ｓｏｘ１遺伝子、Ｓｏｘ３遺伝子、Ｓｏｘ１５遺伝子、Ｓｏｘ１７遺伝子、又はＳｏｘ１８遺伝子で置換可能である。Ｋｌｆ４遺伝子は、Ｋｌｆ１遺伝子、Ｋｌｆ２遺伝子、又はＫｌｆ５遺伝子で置換可能である。ｃ－Ｍｙｃ遺伝子は、Ｔ５８Ａ（活性型変異体）遺伝子、Ｎ－Ｍｙｃ遺伝子、又はＬ－Ｍｙｃ遺伝子で置換可能である。
（１）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子
（２）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子
（３）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、Ｆｂｘ１５遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｅｒａｓ遺伝子、ＥＣＡＴ１５－２遺伝子、ＴｃｌＩ遺伝子、β－ｃａｔｅｎｉｎ（活性型変異体Ｓ３３Ｙ）
（４）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０　Ｌａｒｇｅ　Ｔ　ａｎｔｉｇｅｎ（以下、ＳＶ４０ＬＴ）遺伝子
（５）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＨＰＶ１６　Ｅ６遺伝子
（６）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＨＰＶ１６　Ｅ７遺伝子
（７）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＨＰＶ６　Ｅ６遺伝子、ＨＰＶ１６　Ｅ７遺伝子
（８）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、Ｂｍｉｌ遺伝子
（上記（１）～（８）の組み合わせについては、国際公開第2007/069666号を参照（但し、上記（２）の組み合わせにおいて、Ｓｏｘ２遺伝子からＳｏｘ１８遺伝子への置換、Ｋｌｆ４遺伝子からＫｌｆ１遺伝子若しくはＫｌｆ５遺伝子への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）。「Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ２（又はＫｌｆ５）遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) も参照。「Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。）
（９）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子（Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）
（１０）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｌｉｎ２８遺伝子（Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照）
（１１）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｌｉｎ２８遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照）
（１２）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｌｉｎ２８遺伝子（Cell Research (2008) 600-603を参照）
（１３）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照）
（１４）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子（Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008))を参照）
（１５）Ｏｃｔ３／４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子（Nature 454:646-650 (2008)を参照）
（１６）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子（Nature, 451, 141-146 (2008), 国際公開第2008/118820号を参照）
（１７）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子（国際公開第2008/118820号を参照）
（１８）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｌｉｎ２８遺伝子（国際公開第2008/118820号を参照）
（１９）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、Ｅｓｒｒｂ遺伝子（Ｅｓｓｒｒｂ遺伝子はＥｓｒｒｇ遺伝子で置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照）
（２０）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｅｓｒｒｂ遺伝子（Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照）
（２１）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｌ－Ｍｙｃ遺伝子
（２２）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子
（２３）Ｏｃｔ３／４遺伝子
（２４）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｌｉｎ２８遺伝子、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子（Science, 324: 797-801 (2009)を参照）
　上記（１）～（２４）の組み合わせにおいて、Ｏｃｔ３／４遺伝子に代えて、他のＯｃｔ遺伝子ファミリーのメンバー遺伝子（例えばＯｃｔ１Ａ、Ｏｃｔ６など）を用いることもできる。Ｓｏｘ２遺伝子（又はＳｏｘ１遺伝子、Ｓｏｘ３遺伝子、Ｓｏｘ１５遺伝子、Ｓｏｘ１７遺伝子、Ｓｏｘ１８遺伝子）に代えて、他のＳｏｘ遺伝子ファミリーのメンバー遺伝子（例えばＳｏｘ７遺伝子など）を用いることもできる。Ｌｉｎ２８遺伝子に代えて、他のＬｉｎ遺伝子ファミリーのメンバー遺伝子（例えばＬｉｎ２８ｂ遺伝子など）を用いることもできる。
　上記（１）～（２４）の組み合わせには該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「初期化物質」の範疇に含まれ得る。初期化の対象となる体細胞が上記（１）～（２４）の組み合わせのいずれかにおける構成要素の一部を、初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「初期化因子」の範疇に含まれ得る。
　上記の初期化因子に加えて、Ｆｂｘ１５遺伝子、ＥＲａｓ遺伝子、ＥＣＡＴ１５－２遺伝子、Ｔｃｌ１遺伝子、及びβ－ｃａｔｅｎｉｎ遺伝子からなる群から選ばれる１種以上の初期化因子を組み合わせてもよく、及び／又はＥＣＡＴ１遺伝子、Ｅｓｇ１遺伝子、Ｄｎｍｔ３Ｌ遺伝子、ＥＣＡＴ８遺伝子、Ｇｄｆ３遺伝子、Ｍｙｂｌ２遺伝子、ＥＣＡＴ１５－１遺伝子、Ｆｔｈｌ１７遺伝子、Ｓａｌｌ４遺伝子、Ｒｅｘ１遺伝子、ＵＴＦ１遺伝子、Ｓｔｅｌｌａ遺伝子、Ｓｔａｔ３遺伝子、及びＧｒｂ２遺伝子からなる群から選ばれる１種以上の初期化因子を組み合わせることもできる。これらの組み合わせについては国際公開第2007/69666号に具体的に説明されている。
　好ましい初期化因子としては、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子（又はＬ－Ｍｙｃ遺伝子）、Ｌｉｎ２８遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、及びこれらの遺伝子の遺伝子産物からなる群から選択される少なくとも１つが例示される。好ましくは、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子（又はＬ－Ｍｙｃ遺伝子）、Ｌｉｎ２８遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、それらの遺伝子産物からなる群から選択される２つ以上の組み合わせ、より好ましくは３つ以上の組み合わせである。特にこのうち、少なくとも導入されることが好ましい初期化因子の組み合わせとしては、（１）Ｏｃｔ３／４遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子又はその遺伝子産物、及びＫｌｆ４遺伝子又はその遺伝子産物、（２）Ｏｃｔ３／４遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子又はその遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子又はその遺伝子産物、及びｃ－Ｍｙｃ遺伝子又はその遺伝子産物、（３）Ｏｃｔ３／４遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子又はその遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子又はその遺伝子産物、及びＬ－Ｍｙｃ遺伝子又はその遺伝子産物が挙げられる。中でも、Ｏｃｔ３／４遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子又はその遺伝子産物、及びＫｌｆ４遺伝子又はその遺伝子産物の組み合わせ、並びにＯｃｔ３／４遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子又はその遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子又はその遺伝子産物、及びＬ－Ｍｙｃ遺伝子又はその遺伝子産物の組み合せが好ましい。中でも、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、及びＫｌｆ４遺伝子の組み合わせ、並びにＯｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、及びＬ－Ｍｙｃ遺伝子の組み合わせがより好ましい。
　初期化因子が遺伝子又はその遺伝子産物の場合、かかる遺伝子が由来する生物種としては、特に制限はなく、初期化したい細胞の由来に合わせて適宜選択すればよく、ヒト由来であっても、その他の哺乳動物由来、例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等の霊長類由来であってもよいが、好ましくはヒト由来である。
　上記の各初期化因子のｃＤＮＡ配列情報は、公知のデータベースから得ることができる。例えば、国際公開第2007/069666号に記載のＧｅｎＢａｎｋにおけるアクセッション番号を参照してもよい。Ｎａｎｏｇ遺伝子は前記公報中では「ＥＣＡＴ４」との名称で記載されている。
　上記の各初期化因子のうち、特に好ましい４つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｌ－Ｍｙｃ遺伝子）のマウス及びヒトｃＤＮＡ配列情報を、以下に記載する。
遺伝子名　マウス　ヒト
Ｏｃｔ３／４　ＮＭ＿０１３６３３　ＮＭ＿００２７０１
Ｓｏｘ２　ＮＭ＿０１１４４３　ＮＭ＿００３１０６
Ｋｌｆ４　ＮＭ＿０１０６３７　ＮＭ＿００４２３５
Ｌ－Ｍｙｃ　ＮＭ＿００８５０６　ＮＭ＿００１０３３０８１
　上記各初期化因子のｃＤＮＡは、上記のｃＤＮＡ配列情報又は公知のデータベースに登録された配列情報に基づき、当該配列が由来する生物の細胞から、ＰＣＲ法等の公知の方法を用いて、容易に単離することができる。
　前記初期化因子の遺伝子及び遺伝子産物の配列は必ずしも野生型の配列でなくてもよく、初期化を誘導できる限り、いかなる変異を有していてもよい。例えば、１又は少数（例えば数個、３個以内、５個以内、１０個以内、１５個以内、２０個以内、２５個以内）のアミノ酸が付加、欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列をコードする遺伝子又はmRNAであって、初期化を誘導できる遺伝子又はmRNAは、本願において使用することができる。当該遺伝子又はmRNAにコードされるタンパク質も同様である。また生物学的活性（初期化の誘導能）を維持している限り、例えばＮ末端及び／又はＣ末端の１～数残基（例えば２、３、４、５、６、１０、１５又は２０残基）のアミノ酸が欠失又は付加されたポリペプチド、及び１～数残基（例えば２、３、４、５、６、１０、１５又は２０残基）のアミノ酸が置換されたポリペプチド、及びそれらをコードする遺伝子又はmRNAなども使用できる。使用し得るバリアントとしては、例えば天然のタンパク質の断片、アナログ、派生体、及び他のポリペプチドとの融合タンパク質（例えば異種シグナルペプチド又は抗体断片を付加したもの等）が含まれる。具体的には、野生型のアミノ酸配列の１又はそれ以上のアミノ酸を置換、欠失、及び／又は付加した配列を含み、野生型タンパク質と同等の生物学的活性（例えば初期化を誘導する活性）を有するポリペプチドが含まれる。野生型タンパク質の断片を用いる場合は、通常、野生型ポリペプチド（分泌タンパク質の場合は成熟型の形態）の70％以上、好ましくは80%以上、85%以上、より好ましくは90％以上、95％以上又は98％以上の連続領域を含む。
　改変されるアミノ酸数に特に制限はないが、例えば天然の成熟型ポリペプチドの全アミノ酸の30％以内、好ましくは25％以内、より好ましくは20％以内、より好ましくは15％以内、より好ましくは10％以内、5％以内、又は3％以内であり、例えば15アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは8アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、より好ましくは3アミノ酸以内である。アミノ酸を置換する場合は、側鎖の性質が似たアミノ酸に置換することによりタンパク質の活性を維持することが期待できる。このような置換は、本願において保存的置換という。保存的置換は、例えば塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸(例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族アミノ酸(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などの各グループ内のアミノ酸間の置換などが挙げられる。
　改変されたタンパク質は、野生型タンパク質のアミノ酸配列と高いホモロジーを示す。高いホモロジーとは、例えば70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、93%以上、95%以上、又は96%以上の同一性を有するアミノ酸配列である。アミノ酸配列の同一性は、例えばBLASTPプログラム（Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990）を用いて決定することができる。例えばNCBI（National Center for Biothchnology Information）のBLASTのウェブページにおいて、デフォルトのパラメータを用いて検索を行うことができる（Altschul S.F. et al., Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden, T.L. et al., Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul S.F. et al., Nucleic Acids Res.25:3389-3402, 1997; Zhang J. & Madden T.L., Genome Res. 7:649-656, 1997）。例えば２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana A et al., FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, 1999）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、例えば天然型サイトカイン（分泌後の成熟型の形態）のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。具体的には、野生型タンパク質(分泌タンパク質の場合は成熟型)の全アミノ酸数における一致するアミノ酸数の割合を計算する。
　また遺伝子又はmRNAは、コードされるアミノ酸配列を変えないようにサイレント変異を導入することができる。特にAT(U) richな遺伝子においては、5個以上の連続したA又はT(U)の塩基について、コードされるアミノ酸配列を変えないようにG又はCに置換することにより、安定して遺伝子の高発現を得ることができる。
　別の実施形態において、初期化因子は、分化した細胞の脱分化を誘導するために用いられる低分子化合物（例えば、VPA、CHIR99021、616452、tranylcypromine、forskolin及びDZNepの組合せなど）又はmiRNAであり得る。初期化因子が低分子化合物である場合、初期化因子は培地に添加され得る（Science 09 Aug 2013:Vol. 341, Issue 6146, pp. 651-654）。
（体細胞への初期化因子の接触）
　工程（２）において、初期化因子を、体細胞に接触させる。
　初期化因子が遺伝子である場合、初期化因子の体細胞への接触は、初期化因子をコードする発現ベクターを自体公知の方法により体細胞内に導入して行うことができる。発現ベクターの種類は、特に限定されず、公知の発現ベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、エピソーマルベクター、人工染色体ベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
　エピソーマルベクターは、染色体外で自律複製可能なベクターである。エピソーマルベクターを用いる具体的手段は、Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009) に開示されている。例えば、エピソーマルベクターの複製に必要なベクター要素の５’側及び３’側にｌｏｘＰ配列を同方向に配置したエピソーマルベクターを使用することができる。エピソーマルベクターは染色体外で自律複製可能なため、ゲノムに組み込まれなくとも宿主細胞内での安定な発現を提供し得るが、いったんｉＰＳ細胞が製造された後は、当該ベクターは速やかに除かれることが望ましい。エピソーマルベクターの複製に必要なベクター要素を２つのｌｏｘＰ配列で挟み、これにＣｒｅリコンビナーゼを作用させて当該ベクター要素を切り出すことにより、エピソーマルベクターの自律複製能を喪失させることができ、該ベクターを早期にｉＰＳ細胞から脱落させることが可能である。
　エピソーマルベクターとしては、例えば、ＥＢＶ、ＳＶ４０等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点、及び複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、ＥＢＶにあっては複製開始点ｏｒｉＰとＥＢＮＡ－１遺伝子、ＳＶ４０にあっては複製開始点ｏｒｉとＳＶ４０ＬＴ遺伝子が挙げられる。
　人工染色体ベクターとしては、ＹＡＣ（Yeast artificial chromosome）ベクター、ＢＡＣ（Bacterial artificial chromosome）ベクター、ＰＡＣ（P1-derived artificial chromosome）ベクター、ＨＡＣ（Human artificial chromosome）ベクター等が挙げられる。
　プラスミドベクターとしては、導入対象となる体細胞内で発現可能なプラスミドベクターであれば、特に限定されない。導入対象となる体細胞が哺乳動物である場合は、動物細胞発現用プラスミドベクターとして、一般的に用いられているものを用いることができる。動物細胞発現用プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が挙げられる。
　ウイルスベクターとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シルビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクター等が挙げられる。本明細書において、ウイルスベクターとは、当該ウイルスに由来するゲノム核酸を有し、該核酸に導入遺伝子を組み込むことにより、該遺伝子を発現させることができるベクターを意味する。
　ウイルスベクターとしては、センダイウイルスベクターを好適に用いることができる。センダイウイルスは、モノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルスの１つでパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ，Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ，Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ，及びＰｎｅｍｏｖｉｒｕｓ等の属を含む）に属し、一本のマイナス鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖に対するアンチセンス鎖）のＲＮＡをゲノムとして含んでいる。センダイウイルスベクターは、染色体非組み込み型ウイルスベクターであり、ベクターは細胞質中で発現される。よって、導入遺伝子が宿主の染色体に組み込まれないため、安全性が高く、目的達成後に導入細胞からベクターを除去することが可能である。
　センダイウイルスベクターには、感染性ウイルス粒子の他、ウイルスコア、ウイルスゲノムとウイルス蛋白質との複合体、又は非感染性ウイルス粒子などからなる複合体であって、細胞に導入することにより搭載する遺伝子を発現する能力を持つ複合体が含まれる。例えば、センダイウイルスゲノムとそれに結合するセンダイウイルス蛋白質（ＮＰ、Ｐ、及びＬ蛋白質）からなるリボヌクレオ蛋白質（ウイルスのコア部分、すなわちＲＮＰ）は、細胞に導入することにより該細胞内で導入遺伝子を発現することができる（国際公開第00/70055号）。細胞への導入は、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクションなどの汎用の方法を用いて行うことができる。したがって、このようなリボヌクレオ蛋白質（ＲＮＰ）も、センダイウイルスベクターに包含される。
　発現ベクターを体細胞内に導入する自体公知の方法としては、ウイルスベクターについては感染法（例えば、レトロウイルスベクター(Cell 2007 Nov 30;131(5):861-72、センダイウイルスベクター(特許第5963309号))、プラスミドベクターについては、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法又はエレクトロポレーション法(Nat Methods.2011 May;8(5):409-12)などが例示される。
　初期化因子がmRNA又はmiRNAである場合、初期化因子の体細胞への接触は、合成mRNAを用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法（Cell Stem Cell. 2010 Nov 5; 7(5): 618-630）又はエレクトロポレーション法）などが例示される。
　初期化因子がタンパク質である場合、例えばタンパク質（例えば、細胞膜透過型組換えタンパク質）の直接注入法（例えば、針を用いた方法、リポフェクション法、又はエレクトロポレーション法）により、体細胞と接触させてもよい（Cell Stem Cell, 4, 8 May 2009, 381-384）。
　工程（２）は工程（１）の前に行われてもよく、工程（１）の後に行われてもよい。ある実施形態において、工程（２）は工程（１）の後に行われる。別の実施形態において、工程（２）は工程（１）の前に行われる。
　ある実施形態において、本願の方法は、工程（２）の前に体細胞を拡大培養する工程を含む。培養条件は当業者が適宜定めれば良く、特に限定されない。例えば、前記体細胞が末梢血単核球（PBMC)である場合、CD34陽性細胞用培地中で培養してCD34陽性細胞を増やしてもよい。CD34陽性細胞用培地としては公知のものを適宜使用することができ、例えばIL-6、SCF、TPO、Flt-3L、IL-3及びG-CSFを含む培地が挙げられる。
　培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、例えば約37℃である。培養は、CO2、O2、N2含有の雰囲気下で行われ、CO2濃度は、約0.05～15％、好ましくは約3～7％、さらに好ましくは約4～6％、最も好ましくは約5％である。O2濃度は、約0.05～100％、好ましくは、2～25％である。N2濃度は、約0.05～100％、好ましくは、30～75％である。
　拡大培養の期間は当業者が適宜定めれば良く特に限定されないが、適宜培地を交換しつつ、1日～20日、3日～10日、例えば4～7日であり得る。また、自動化培養装置などを用いることで、連続的に培地交換（灌流培養）を行うことも出来る。
　拡大培養の工程において、前記体細胞は浮遊培養され得る。本願において、「浮遊培養」とは細胞が培養基材に接着しない状態で培養されることを意味する。特に限定はされないが、市販の細胞培養容器のうち、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックスなどによるコーティング処理）されていないもの、又は人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）又は2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体（Lipidure）によるコーティング処理）がされているものを使用して行うことができる。例えば、96ウェル低接着プレート（住友ベークライト（株））及び35ｍｍ低接着ディッシュ（住友ベークライト（株））などの市販品を使用してもよい。前記体細胞が浮遊性の体細胞（例えば、末梢血単核球、造血前駆細胞及びCD34陽性細胞などの血球系細胞）である場合、浮遊性の体細胞は培養容器に接着しないため、接着培養用の培養容器も使用できる。例えば、接着細胞培養プレート24F独立ウェルタイプ（住友ベークライト（株））などの市販品を使用してもよい。
・工程（３）
　工程（３）において、初期化因子と接触した体細胞を、前記区画内に２以上の前記体細胞が集約された状態で培養する。前記体細胞は浮遊培養され得る。
　工程（３）は、前記区画内に２以上の体細胞が集約された状態で行われる。例えば、工程（３）は、前記区画内の一点に2～500個、2～400個、3～300個、3～150個、5～100個、又は5～50個の体細胞が集約された状態で行われる。容器に対して回転、揺動及び震動などの動作を与えることにより体細胞を集約してもよく、開口部から底部に向かう傾斜面を有する区画を用いることにより体細胞を底部に集約してもよい。
　工程（３）において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、例えば約37℃である。培養は、CO2、O2、N2含有の雰囲気下で行われ、CO2濃度は、約0.05～15％、好ましくは約3～7％、さらに好ましくは約4～6％、最も好ましくは約5％である。O2濃度は、約0.05～100％、好ましくは、2～25％である。N2濃度は、約0.05～100％、好ましくは、30～75％である。
　工程（３）において、体細胞の培養期間は体細胞の種類や初期化因子の種類、初期化因子の接触手段等に基づき当業者が適宜定めれば良く特に限定されないが、3日～30日、5日～20日、8日～15日、例えば約10日であり得る。多能性幹細胞の生成は、例えばSSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-カドヘリン、UTF-1、Oct3/4、Rexl及びNanogなどの多能性幹細胞マーカーの発現にて確認することができる。多能性幹細胞マーカーの発現は、免疫染色により顕微鏡下において目視で確認してもよく、フローサイトメトリー又はFACS（fluorescence-activated cell sorting）を用いて確認してもよい。
　製造された多能性幹細胞は、3日～30日毎、4日～20日毎、5日～10日毎、例えば約7日毎に継代され得る。継代の回数は特に限定されないが、例えば1回以上、2回以上、3回以上、4回以上、5回以上、10回以上、20回以上、30回以上、40回以上、50回以上、60回以上、70回以上、80回以上、90回以上、又は100回以上であり得る。継代期間は特に限定されず、1日以上、10日以上、20日以上、30日以上、40日以上、50日以上、100日以上、200日以上、300日以上、400日以上、500日以上、又は1000日以上であり得る。継代に使用する容器としては、例えば上記の浮遊培養用の容器が使用できる。閉鎖型の自動培養装置を用いる場合は、継代という概念がなく、培地量を増やし、かつ／又は培地を還流させることにより、多能性幹細胞の増殖及び分化が可能となる。
（集約工程）
　ある実施形態において、本願の方法は、前記区画が、２以上の体細胞を集約可能な細胞低接着性の集約部を有し、２以上の体細胞を集約する集約工程をさらに含む。例えば、集約工程は、容器に対する回動、揺動及び震動の少なくともいずれかの動作を伴って、２以上の体細胞を集約する。本願の方法が集約工程を含む場合、工程（３）は、集約工程により区画内に２以上の体細胞が集約された後に行われる。つまり、初期化因子と接触した２以上の体細胞をより確実に集約させた状態で培養することができる。
　図１０及び図１１を参照して、容器に対する回動を伴う集約工程の一例を説明する。図１０及び図１１の容器１００は、１つの区画を含む略直方体形状の皿で、第１面１０１を含む複数の面を有している。第１面１０１は、容器１００の複数の面のうち、最も面積の大きい面であり、開口面１０２に対向している。容器１００の内部に複数の体細胞（図示せず）を収容した状態で、第１面１０１に平行又は交差する回転軸Ｌ１まわりに容器１００を回転させることで、容器１００に収容された複数の体細胞が集約される。
　図１０の容器１００は、第１面１０１に対して平行な回転軸Ｌ１まわりに回転可能に構成されている。容器１００に収容された複数の体細胞は、容器１００の回転軸Ｌ１の近くの領域１０３に集約される。例えば、容器１００が水平面Ｐに載置されているとすると、水平面Ｐよりも上側に位置するように容器１００を回動させた場合、領域１０３は、水平面Ｐに最も近い容器１００の辺縁に配置される。なお、回転軸Ｌ１が、両軸端が軸受け機構に接続されるのではなく、例えば図１０において手前側の片軸端で軸受け機構に接続し、なおかつ当該軸受け機構がボールジョイント仕様等により回転軸Ｌ１を回動させつつ仰角方向にも傾動可能な場合には、領域１０３は、水平面Ｐに最も近い容器１００の角部に配置される。
　図１１の容器１００は、第１面１０１に対して交差する回転軸Ｌ１まわりに回転可能に構成されている。容器１００に収容された複数の体細胞は、容器１００の回転軸Ｌ１から離れた領域１０４に集約される。例えば、容器１００が水平面Ｐに載置されているとすると、水平面Ｐに直交する回転軸Ｌ１まわりに容器１００を回動させた場合、領域１０４は、回転軸Ｌ１から最も離れた容器１００の辺縁に配置される。
　図１２を参照して、揺動又は振動を伴う集約工程の一例を説明する。図１２の容器１００は、略矩形板状で、凹部１１０を有している。凹部１１０は、容器１００の一面１０５に開口する略円形状の開口部１１１を有している。凹部１１０の内部に複数の体細胞を収容した状態で、図１２の矢印Ａ方向に容器１００を揺動又は振動させることで、凹部１１０内の複数の体細胞が集約される。
　図１０及び図１１の容器１００は、領域１０３、１０４に凹部を有していてもよい。凹部は、例えば、細胞低接着性の底部を有し、この底部に２以上の体細胞を集約可能に構成される。また、凹部は体細胞の播種量に応じて領域１０３、１０４内に複数設けられてもよく、この場合には必要量の体細胞を効率的に集約させることができる。
　本実施形態の集約工程に、後述する図１３～図２１の容器を用いることもできる。
　［容器］
　本願は、
　内部に体細胞を収容可能な容器本体と、
　前記容器本体の内部に設けられた配置された少なくとも１つの区画と、
を備え、
　前記区画が、
　２以上の体細胞を集約可能な細胞低接着性の集約部と、
　前記容器の内部に流入した体細胞を前記集約部に案内する案内部と
を有する、容器を提供する。このような容器を用いることで、容器を回動、揺動又は振動させることなく、２以上の体細胞を集約させることができる。
　本開示の容器は、少なくとも１つの区画を有していればよく、例えば、プレート型であってもよいし、パック型であってもよいし、皿型であってもよい。
　本開示の容器は、容器本体の内部と容器本体の外部とを連通し、体細胞の流通を可能とする流通部をさらに備えていてもよい。
　案内部は、予め形状として構成されたものに限らず、外力によって集約部への体細胞の案内が可能となる経路又は手段であってもよい。
　本開示の容器の一例を図１３～図２３に示す。図１３～図１８には、皿型の容器の一例を示し、図１９～図２１には、プレート型の容器の一例を示し、図２２及び図２３には、パック型の容器の一例を示している。
　図１３～図１７の容器２００は、略矩形の皿状で、少なくとも１つの区画２１０を含む。区画２１０は、集約部２２０と案内部２３０とを有している。容器２００は、開口部２０３が設けられた略矩形の開口面２０１と、開口面２０１に対向する略矩形の底部２０２とを有している。底部２０２には、集約部２２０及び案内部２３０が配置されている。
　図１３の容器は、１つの区画２１０を含んでいる。図１３の容器２００では、集約部２２０は、容器２００の長手方向（以下、長手方向という。）における底部２０２の略中央に配置され、容器２００の短手方向（以下、短手方向という。）に略線状に延びている。容器２００の底部２０２は、長手方向の両端の各々から長手方向の中央に向かって延びる２つの傾斜面で構成されている。２つの傾斜面は、長手方向の両端の各々から長手方向の中央に向かうに従って開口面２０１から底部２０２に向かって傾斜しており、案内部２３０を構成している。図１３の容器２００では、容器２００の内部に流入した体細胞は、平面でそれぞれ構成された複数の傾斜面により直線状に集約される。案内部２３０を構成する各傾斜面と容器２００の一面（例えば、開口面２０１）とが成す角は、１５度から６０度であるのが好ましい。
　図１４の容器は、１つの区画２１０を含んでいる。図１４の容器２００では、集約部２２０は、底部２０２の長手方向の一端に配置され、短手方向に略線状に延びている。容器２００の底部２０２は、長手方向の他端から長手方向の一端に向かって延びる１つの傾斜面で構成されている。傾斜面は、長手方向の他端から長手方向の一端に向かうに従って開口面２０１から底部２０２に向かって傾斜しており、案内部２３０を構成している。図１４の容器２００では、容器２００の内部に流入した体細胞は、平面で構成された傾斜面により直線状に集約される。案内部２３０を構成する傾斜面と容器２００の一面（例えば、開口面２０１）とが成す角は、１５度から６０度であるのが好ましい。
　図１５の容器２００は、案内部２３０を構成する傾斜面が、開口面２０１から底部２０２に向かう方向に突出する曲面で構成されている点で、図１４の容器２００と異なっている。図１５の容器２００では、容器２００の内部に流入した体細胞は、曲面で構成された傾斜面により曲線状に集約される。
　図１６の容器２００は、１つの区画２１０を含んでいる。図１６の容器２００では、集約部２２０は、底部２０２の長手方向の一端でかつ短手方向の略中央に配置され、点状に設けられている。容器２００の底部２０２は、長手方向の他端から集約部２２０に向かって延びる傾斜面２３１と、短手方向における第１傾斜面２３１の略中央に配置された溝部２３２とで構成されている。傾斜面２３１及び溝部２３２が、案内部２３０を構成している。傾斜面２３１は、長手方向の他端から長手方向の一端に向かうに従って開口面２０１から底部２０２に向かって傾斜すると共に、短手方向の両端の各々から短手方向の中央に向かうに従って開口面２０１から底部２０２に向かって傾斜している。溝部２３２は、傾斜面２３１に開口し、長手方向の他端から長手方向の一端に向かうに従って小さくなる溝幅（言い換えると、短手方向における溝部２３２の寸法溝幅）を有している。図１６の容器２００では、容器２００の内部に流入した体細胞は、平面でそれぞれ構成された複数の傾斜面により一点に集約される。溝部２３２は、省略することもできる。
　図１７の容器２００は、長手方向に隣接して配置された２つの区画２１０を含んでいる。図１７の容器２００では、各区画２１０の集約部２２０は、底部２０２の長手方向の端に配置され、短手方向に略線状に延びている。容器２００の底部２０２は、長手方向に略中央から長手方向の一端に向かって延びる第１傾斜面２３１と、長手方向の略中央から長手方向の他端に向かって延びる第２傾斜面２３２とで構成されている。第１傾斜面２３１及び第２傾斜面２３２の各々が、各区画２１０の案内部２３０を構成している。第１傾斜面２３１及び第２傾斜面２３２の各々は、長手方向の中央から長手方向の一端又は他端に向かうに従って開口面２０１から底部２０２に向かって傾斜している。図１７の容器２００では、容器２００の内部に流入した体細胞は、平面でそれぞれ構成された２つの傾斜面により２つの集約部２２０のいずれかに案内されて直線状に集約される。第１傾斜面２３１及び第２傾斜面２３２の各々と容器２００の一面（例えば、開口面２０１）とが成す角は、１５度から６０度であるのが好ましい。
　図１８の容器２００は、１つの区画２１０を含んでいる。図１８の容器２００は、略円形の皿状で、略円形の開口面２０１及び底部２０２を有している。集約部２２０は、中心線Ｌ２から径方向において遠い方の底部２０２の端に配置され、円形の線状に延びている。容器２００の底部２０２は、容器２００の中心を通り開口面２０１及び底部２０２に直交する中心線Ｌ２に頂点が配置された略円錐形状を有し、中心線Ｌ２から径方向に延びる傾斜面で構成されている。傾斜面は、中心線Ｌ２から離れるに従って開口面２０１から底部２０２に向かって傾斜しており、案内部２３０を構成している。図１８の容器２００では、容器２００の内部に流入した体細胞は、曲面で構成された傾斜面により円形の線状に集約される。第１傾斜面２３１及び第２傾斜面２３２の各々と容器２００の一面（例えば、底部２０２）とが成す角は、１５度から６０度であるのが好ましい。
　図１３～図１８については、予め各容器の底面部分に傾斜又は勾配がモールドされている例を掲載したが、容器の底面部分を例えばシリコン素材等の可撓性部材で形成することで、容器の底面に傾斜又は勾配を設けてもよい。この場合、例えば、容器の底面の下にＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ　Ｅｌｅｃｔｒｏ　Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）制御によるチルト機構を設け、当該チルト機構を発動させることで、容器の底面に傾斜又は勾配を生じさせることができる。また、別の態様として、可撓性部材で形成した底面の下側に、図１３～図１８に示す傾斜又は勾配に相当する面を有する部材を設けておき、当該部材を底面側から垂直上面方向に押し上げることで、各容器に所定の傾斜又は勾配を発現させるようにしてもよい。
　図１９の容器３００は、９つの区画３０２を含んでいる。各区画３０２は、１つの凹部３１０を有している。図１９の容器３００は、略矩形の板状で、９つの凹部３１０が設けられた略矩形の開口面３０１を有している。各凹部３１０は、開口面３０１に開口する開口部３１１と、開口部３１１に対向する底部３１２とを有している。各凹部３１０は、開口部３１１から底部３１２に向かうに従って先細りとなる略円錐台形状で、底部３１２が集約部３２０を構成し、開口部３１１及び底部３１２に接続された側面３１３が案内部３３０を構成している。図１９の容器２００では、各凹部３１０の内部に流入した体細胞は、曲面で構成された傾斜面により一箇所に集約される。案内部３３０を構成する凹部３１０の側面と容器２００の一面（例えば、開口面３０１）とが成す角は、１５度から６０度であるのが好ましい。
　凹部３１０は、凹部３１０の内部に流入した２以上の体細胞を集約可能な任意の構成を採用できる。例えば、凹部３１０は、図２０に示すように、凹部３１０の中心に向かって突出する湾曲形状の側面３１３を有する略円錐台形状であってもよいし、図２１に示すように、略角錐台形状であってもよい。図２０の凹部３１０では、各凹部３１０の内部に流入した体細胞は、図１９と同様に、曲面で構成された傾斜面により一箇所に集約される。図２１の凹部３１０では、各凹部３１０の内部に流入した体細胞は、多角形状（例えば、略三角形状）の平面で構成された傾斜面により一箇所に集約される。
　なお、図１０～図２１において、開口面は、一面全面に開口部を有する必要はなく、壁面の一部に開口が穿たれていてもよく、さらには、開口部はキャップ機構等で開閉するものであってもよい。また、発明の思想を同一にする限り、開口面は必ずしも底面に対向するものではなく、容器の側面に設けられていてもよい。
　図２２の容器４００は、内部に体細胞を収容可能な容器本体４１０と、少なくとも１つの区画４２０と、体細胞の流通を可能とする流通部４３０とを含む。容器本体４１０は、パック状で、内部に区画４２０が配置されている。流通部４３０は、容器本体４１０の内部と容器本体４１０の外部とを連通している。区画４２０は、２以上の体細胞を収容可能な細胞低接着性の集約部４４０と、容器４００の内部に流入した体操部を集約部４４０に案内する案内部４５０とを有している。図２２では、区画４２０は、凹部４２１を有している。凹部４２１は、容器本体４１０の内面４１１に開口する開口部４２２と、開口部４２２に対向する細胞低接着性の底部４２３とを有している。底部４２３は、長手方向の一端に配置された集約部４４０と、長手方向の他端から長手方向の一端に向かうに従って開口部４２２から底部４２３に向かって傾斜する傾斜面とを有している。この傾斜面が案内部４５０を構成している。凹部４２１は、容器本体４１０の内部に流入した２以上の体細胞を集約可能な任意の構成を採用できる。例えば、図１９～図２１に示す凹部３１０を凹部４２１として用いてもよい。
　図２３の容器４００は、集約部４４０が、凹部４２１で構成され、案内部４５０が、容器本体４１０の内面４１１から突出する突出部で構成されている点で、図２２の容器４００と異なっている。凹部４２１は、容器本体４１０の内面４１１に略平行な細胞低接着性の底部４２３を有している。案内部４５０を構成する突出部は、凹部４２１の外部で開口部４２２に隣接しかつ開口部４２２よりも流通部４３０から離れて配置されている。このように案内部４５０は、凹部４２１の一部を構成する場合に限らない。
　流通部４３０は、体細胞の供給及び排出と、初期化因子の供給の全てを行うことができるように構成してもよい。また、流通部４３０は、体細胞の供給及び排出を行う第１流通部と、初期化因子の供給を行う第２流通部とで構成してもよいし、体細胞の供給を行う第１流通部と、体細胞の排出を行う第２流通部と、初期化因子の供給を行う第３流通部とで構成してもよい。
　容器４００の凹部４２１の形状及び構成は、図２２及び図２３において図示する形状に限らず、例えば、図１２～図２１に例示する容器１００、２００、３００と同じ形状及び構成であってもよい。
　本開示の容器は、前記区画内に初期化因子を含み得る。初期化因子としては、上記の初期化因子が使用でき、例えば上記のタンパク質、低分子化合物又はmiRNAであり得る。前記区画内に含まれる初期化因子の量は当業者が適宜定めれば良く、特に限定されない。
［システム］
　本願は、
　前記容器と、
　体細胞を前記容器の内部に供給して播種する播種装置と、
　初期化因子と接触した体細胞を前記容器の内部から前記容器の外部に排出して回収する回収装置と、
　前記播種装置及び前記回収装置を制御する制御装置と
を備える、システムを提供する。このシステムにより、体細胞から多能性幹細胞を製造できる。
　本開示のシステム１は、図２４に示すように、容器２と、制御装置１０と、播種装置２０と、回収装置３０とを備える。図２４のシステム１は、一例として、初期化因子供給装置４０、傾斜装置５０、振動装置６０、回転装置７０及び培養装置８０をさらに備えている。
　容器２は、細胞低接着性の区画を１以上有する容器であればよい。例えば、図１０～図２３に示す容器１００、２００、３００、４００を用いることができる。
　制御装置１０は、例えば、演算を行うＣＰＵと、演算に必要なプログラム及び演算結果を記憶する記憶装置とを有している。本実施形態のシステム１では、制御装置１０は、播種装置２０及び回収装置３０に加え、初期化因子供給装置４０、傾斜装置５０、振動装置６０、回転装置７０、及び培養装置８０を制御して、体細胞から多能性幹細胞を製造する。制御装置１０は、当該制御装置１０に電気的に接続された各種装置の稼働状況をモニタリングし、例えば、容器２として図１０に示す容器１００を用いる場合、体細胞を播種した後の任意のタイミングで傾斜装置５０に対し傾斜角度に係る制御信号を送信する。傾斜装置５０は、制御装置１０からの制御信号を受信すると、容器１００の第１面１０１を同傾斜角度の通りに傾ける。これにより、容器１００内に、図１４における容器２００の案内部２３０と同等の案内的状況を作りだすことができる。傾斜装置５０は、多段階又は無段階で傾斜角度を調整できる機能を有することが望ましく、これにより、予め容器内に案内部が設けられている場合に比べて、より緻密に体細胞の集約状況の制御が可能となる。また、図１１に示す容器１００を用いる場合、制御装置１０は、体細胞を播種した後の任意のタイミングで、回転装置７０に対し容器１００の回転軸Ｌ１に対する回転角度、回転速度、回転数、加速度、角速度、トルク等に係る制御信号を送信する。回転装置７０は、制御装置１０からの制御信号を受信すると、容器１００内の体細胞を当該回転に基づく遠心力によって領域１０４に集約させる。この場合において、容器１００が光学的に可視できる素材によって形成される場合には、集約状況モニタ装置９０が、容器１００の体細胞の集約状況をモニタリングし、その結果をモニタ信号として制御装置１０に出力する。制御装置１０は、集約状況モニタ装置９０からのモニタ信号を制御装置１０が逐次受信し、インバータ制御により体細胞の集約状況に応じた最適な回転を容器１００に発生させることができる。これによって、体細胞及び多能性幹細胞に対して必要以上のストレスを与えることなく、多能性幹細胞の作製が可能となる。なお、上記の制御装置１０と傾斜装置５０又は回転装置７０との組み合わせにより構成される制御機構は、初期化因子を体細胞と接触させる場合においても、効果的に活用することができる。
　播種装置２０は、初期化因子と接触する前の体細胞を容器２の内部に流入させて、容器２に体細胞を播種する。本実施形態では、播種装置２０は、一例として、初期化因子と接触する前の体細胞が貯留された貯留槽と、貯留槽内の体細胞を容器２に送出する駆動装置（例えば、ポンプ）とを有している。
　回収装置３０は、初期化因子と接触した体細胞を容器２の内部から容器２外部に排出して回収する。本実施形態では、回収装置３０は、一例として、初期化因子と接触した体細胞を容器２の内部から容器２外部に排出する駆動装置と、駆動装置により排出された体細胞を一時的に貯留する貯留槽とを有している。貯留槽に貯留された体細胞は、駆動装置により培養装置８０に送出される。
　初期化因子供給装置４０は、例えば、初期化因子が貯留された貯留槽と、貯留槽内の初期化因子を容器２に送出する駆動装置とを有している。
　傾斜装置５０は、容器２の一部または全部を基準面（例えば、図１０及び図１１に示す水平面Ｐ）に対して傾斜させて、容器２の内部の２以上の体細胞を容器２の区画に集約させることができるように構成されている。例えば、傾斜装置５０は、図１０に示すように、容器２を基準面に対して平行な回転軸Ｌ１まわりに回転させて傾斜させるか、または、容器２が可撓性の底面を有する場合、容器２の底面の一部を変形させるように構成されている。
　振動装置６０は、容器２を揺動又は振動させて、容器２の内部の２以上の体細胞を容器２の区画に集約させることができるように構成されている。
　回転装置７０は、容器２を回転軸Ｌ１まわりに回転駆動させて、遠心力により前記容器の内部の２以上の前記体細胞を前記区画に集約させることができるように構成されている。
　培養装置８０は、回収装置３０で回収された初期化因子と接触した体細胞を培養する。
　集約状況モニタ装置９０は、例えば、回転軸Ｌ１の一部又は容器２の外周軌道近傍に設けられたＣＣＤ（電荷結合素子）等の光学部材を有している。集約状況モニタ装置９０は、容器１００が光学的に可視できる素材によって形成される場合に、体細胞の集約状況をモニタリング可能に構成されている。
　システム１は、播種装置２０、回収装置３０、初期化因子供給装置４０、傾斜装置５０及び振動装置６０の各々を個別に駆動させる５つの駆動装置を備えてもよいし、播種装置２０、回収装置３０、初期化因子供給装置４０、傾斜装置５０及び振動装置６０の複数又は全部を駆動させる１～４つの駆動装置を備えてもよい。
　本願におけるシステムは、例えば、体細胞から多能性幹細胞を製造するための自動化システムを含む。この場合、前述の各装置に加えて、当該自動化を効率よく実現するための装置をさらに備え得る。多能性幹細胞をＧＭＰ（Ｇｏｏｄ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）基準により製造する場合には、本願のシステムを構成する全ての装置が一体のシステムとして防塵処理等を施した同一筐体内に収められることが望ましい。しかし、この場合において、本願のシステムは、一部の工程を別の機器と分担して行うように構成してもよいし、一部の工程を本願のシステムの操作者自身が行うように構成してもよい。本願のシステムを構成する装置は、同一の施設内に全て設置される必要性はなく、例えば、制御装置１０のみが別の施設内に設置され、インターネット経由で播種装置等の各種装置と遠隔的に接続されるようにしてもよい。
　初期化因子供給装置４０、傾斜装置５０、振動装置６０、回転装置７０、培養装置８０及び集約状況モニタ装置９０は省略することもできる。初期化因子供給装置４０を省略する場合、例えば、区画に初期化因子が予め含まれるように容器２を構成すればよい。傾斜装置５０及び振動装置６０を省略する場合、例えば、図１３～図２３に示す容器２００、３００、４００を用いればよい。
［キット］
　本願はまた、体細胞から多能性幹細胞を製造するためのキットであって、
　2以上の細胞を集約可能な区画を１以上有する細胞低接着性の容器、及び
　初期化因子を含む、キットを提供する。この場合、キットの構成としては、初期化因子については、あらかじめ当該容器内に封入されていてもよいし、別のアンプル等に封入されていてもよい。特に前者の構成でキットが提供された場合、キット使用者は、体細胞を播種した後に別途、初期化因子を導入する必要がなく、容器内に体細胞を播種するだけで、当該体細胞の初期化が可能となるため、より簡便に無菌条件下での多野性幹細胞の作製が可能となる。
　本態様で用いられる容器及び初期化因子の例は、上述した通りである。本願のキットはまた、緩衝液、培地、取扱説明書などを含んでいてもよい。
［プログラム］
　本願はまた、前記体細胞から多能性幹細胞を製造する方法をコンピュータに実行させるプログラムを提供する。例えば、前記体細胞から多能性幹細胞を製造する方法は、図２４に示すシステム１において、制御装置１０のＣＰＵが所定のプログラムを実行することで実現される。
　プログラムは、様々なタイプの非一時的なコンピュータ可読媒体を用いて格納され、コンピュータに供給することができる。非一時的なコンピュータ可読媒体は、例えば、磁気記録媒体（例えば、フレキシブルディスク、磁気テープ、ハードディスクドライブ）、光磁気記録媒体（例えば、光磁気ディスク）、ＣＤ－ＲＯＭ、ＣＤ－Ｒ、ＣＤ－Ｒ／Ｗ、半導体メモリ（例えば、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、フラッシュＲＯＭ、ＲＡＭ）を含む。また、プログラムは、例えば、電線及び光ファイバ等の有線通信路又は無線通信路を介して、コンピュータに供給される。
　以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例では、体細胞に初期化因子を接触させた日（当該接触が数日間に及ぶ場合には、当該接触を開始した日）をDay0とし、以後の経過日数をDayXで表す。よって、例えば、体細胞に初期化因子を接触させた日から2日後は、Day2となる。
［実施例１］
1. 実施方法
1-1. 使用試薬
　本実施例で使用した試薬の詳細を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　SRV（商標） iPSC-2 Vectorは、末梢血単球、末梢血単核球、CD34陽性細胞からiPS細胞を作製するように遺伝子発現レベルを最適化したステルス型RNAベクターであり、ヒトOCT3/4遺伝子、ヒトKLF4遺伝子、ヒトSOX2遺伝子、ヒトc-MYC遺伝子の４つのヒト由来の初期化遺伝子とオワンクラゲ由来EGFP遺伝子、Streptomyces alboniger由来ピューロマイシン（Puro）耐性遺伝子を搭載している。細胞にSRV（商標） iPSC-2 Vectorが導入されていることは、蛍光顕微鏡によりEGFPの蛍光を観察することによって確認できる。SRV（商標） iPSC-2 Vectorは、多能性幹細胞に特異的に発現するマイクロRNAであるmiR-302の発現に応答して自動的に消去される。SRV（商標） iPSC-4 Vectorを用いることでも良い。
　AggreWell（商標）plateは、１つのウェルの中に1200個の400μm径のマイクロウェルを有している（図６右図参照）。細胞をAggreWell（商標）plateに播種して培養することにより、均一なサイズの細胞塊を大量に作成できる。
1-2. 使用機器
　本実施例で使用した機器の詳細を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
2. 由来細胞
　本実施例で使用した細胞（PBMC、ZenBio）の詳細を表３に示す。冷凍保存していたPBMCを解凍し、本実施例に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
3. 手順
A.　CD34陽性細胞の拡大培養
A1　StemSpan ACF 2mLに下記濃度に調整したサイトカインをそれぞれ2μLずつ添加し、CD34陽性細胞用培地を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 A2　24well plateの外側のウェルに、保湿のためのPBSを1mLずつ添加した。
A3　PBMCを37℃のウォーターバスで軽く解凍し、CD34陽性細胞用培地を1mL程度入れ完全に溶かした。
A4　1500rpm 5min遠心した。
A5　上清を除去し、タッピングで細胞塊をほぐしてから、CD34陽性細胞用培地1mLで懸濁した。
A6　細胞懸濁液を24well plateに播種し、37℃5%CO2インキュベーターで5日間静置培養した。
B.　iPS細胞の製造(接着培養：コントロール)
B1　手順A1に従って、CD34陽性細胞用培地を5mL作製した。
B2　培養後のPBMC全量を1.5mLチューブに回収し、セルカウントした。セルカウントの結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 B3　5×105細胞分(467μL)を分取し、300G, 5min, 4℃で遠心した。
B4　MOI=3となるよう、ベクター量を計算した。（TITER　4.3×107CIU/mL、150×104 / 4.3×107 = 34.88(μL)）
B5　ベクター34.88μLとCD34陽性細胞用培地965.12μLを混合し、合計1mLのベクター溶液を作製した。
B6　遠心後の細胞懸濁液から上清を除去し、タッピングにて細胞塊をほぐした後、ベクター溶液1mLで懸濁して、前記細胞に初期化因子と接触させた（＝Day0）。感染時の細胞密度は、0.5×106cells/mLであった。
B7　37℃5%CO2インキュベーターで2時間インキュベートした。30分おきに軽くチューブをタッピングした。
B8　15mLチューブに細胞懸濁液をうつし、1mLのStemSpan ACFを添加し、300G, 5min, 4℃で遠心した。
B9　上清を除去し、細胞塊をタッピングしてほぐした。
B10　手順B8、B9を繰り返した。
B11　24well plateにCD34陽性細胞用培地400μLとiMatrix 1.8μLを入れ、プレートを揺らして攪拌した。
B12　2×104cells/wellとなるように細胞を播種した(40μL)。
B13　プレートを37℃5%CO2インキュベーターに入れ、培養を開始した。
B14　Day2及びDay4に、それぞれ400μLずつAK03培地を添加した。
B15　Day7及びDay9にAK03培地400μLで培地交換した。
B16　Day10に6ウェルプレートへパスした。
C.　iPS細胞の製造(浮遊培養：AggreWell(商標) plate)
C1　マイクロウェル中の気泡を抜くためにAggreWell(商標) plateの1ウェルに2mLのAnti-Adherence Rinsing Solutionを添加し、2000G, 5minで遠心した。
C2　Rinsing Solutionをアスピレーターで除去し、2mLのStemSpanACFを添加後、アスピレーターで除去した。
C3　各ウェル内にCD34陽性細胞用培地を500μL添加し、インキュベーターに入れた。
C4　手順B10で得られた細胞懸濁液から、1.2×105細胞分を分取した。(240μL)
C5　ウェル内の培地量がTotal 1.5mLとなるよう、760μLのCD34陽性細胞用培地を細胞懸濁液に添加した。
C6　インキュベーターからAggreWell(商標) plateを取り出し、全量を播種した。
C7　数回ピペッティングし、ウェル内の細胞を均一にした。
C8　100G, 3minで遠心し、細胞をマイクロウェル内へと沈降させた。
C9　37℃5%CO2インキュベーターに入れた。
C10　Day2、Day4、Day7、及びDay9に培地交換をした。750μLの培地を除去し、750μLのAK03培地を添加する方法で実施した。
C11　Day10にTRA-1-60で免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察した（手法は手順Dで示す）。
C12　Day11にAggreWell(商標) plateへパスした。
D.　免疫染色(TRA-1-60)
D1　FACS Buffer 100μLにTRA-1-60抗体を2μL添加し、混合した。
D2　スフェアを吸い込まないよう、ウェルの底から5mm程度の高さ分の培地を残して、マイクロピペットで培地を除去した。
D3　1mLのFACS Bufferをウェルのフチから少しずつ添加した。
D4　手順D2の手法でFACS Bufferを除去した。
D5　手順D1で希釈したTRA-1-60抗体を100μL添加した。
D6　アルミホイルで遮光し、室温で30分間インキュベートした。
D7　FACS Bufferを1mL添加し、ウェルの底から5mm程度の高さ分の培地を残して、マイクロピペットで培地を除去した。
D8　手順D7を再度実施した。
D9　FACS Bufferを300μL添加した。
D10　キーエンス蛍光顕微鏡で観察した。
4. 結果
形態
　播種直後には、AggreWell(商標)のマイクロウェル底に集まった細胞群が確認できた（図１）。Day4には、AggreWell(商標) plateの各マイクロウェルの底部において、一部の細胞が凝集した塊が確認できた（図２右図）。Day10には、AggreWell(商標) plateのマイクロウェル内に丸いスフェアではないが、細胞が一つの塊となった細胞塊を形成している状態が多数確認できた（図３右図）。図３右図では、視野内の12個のマイクロウェルのうち12個すべてのマイクロウェルにおいて細胞塊が確認された。コントロールの接着培養においても多数のコロニーが確認できた（図６左図）。
TRA-1-60陽性細胞
　多能性幹細胞マーカーであるTRA-1-60の発現を、TRA-1-60抗体を用いた免疫染色により確認した。Day10には、形成したほぼすべての細胞塊でTRA-1-60陽性細胞が確認できた（図４右上図）。このことから、AggreWell(商標) plateを用いた浮遊状態でのiPS細胞の製造は可能であることが分かった。また、同一細胞塊中にGFP陽性のベクター残存細胞群も確認された（図４左上図）。これは、形質転換が進みiPS化した細胞と、形質転換途上の細胞がキメラ状態になった細胞塊である可能性が示唆された。この状態は１回継代した細胞塊でも維持されていた(図５)。
まとめ
　実施例１の結果を表６に示す。表６に示されているように、初期化工程の初期にPBMCを凝集させることで、iPS細胞を効率的に得ることが可能となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 播種細胞数：1.2×104 cells/well
Reprograming期間：9日間
Reprograming試薬：ときわバイオ社SRV（商標）-iPSC-2ベクター
［実施例２］
最初に形成させる細胞塊のサイズ（構成細胞数）と初期化効率との関係
　最初に形成させる細胞塊のサイズ（構成細胞数）と初期化効率との関係を調べるため、1マイクロウェル当たりに播種したPBMC細胞数（1～500cells/マイクロウェル）に対するDay14の生細胞数、TRA-1陽性細胞数及びTRA-1陽性率を測定した。結果を表７及び図７～９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　iPS細胞の総数が多いのは、300細胞/マイクロウェルでPBMCを凝集させた場合であった。また、効率が良いのは、5～100細胞/マイクロウェルでPBMCを凝集させた場合であった。

Claims (46)

  1. 　体細胞から多能性幹細胞を製造する方法であって、
    （１）2以上の体細胞を集約可能な区画を１以上有する容器に、体細胞を播種する工程
    （２）体細胞に初期化因子を接触させる工程
    （３）初期化因子と接触した体細胞を、前記区画内に２以上の前記体細胞が集約された状態で培養する工程
    を含む、前記方法。
  2. 　前記区画が、２以上の体細胞を集約可能な細胞低接着性の集約部を有し、
    　２以上の体細胞を前記集約部へと集約する集約工程
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記集約工程が、前記容器に対する回動、揺動及び震動の少なくともいずれかの動作を伴う、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記容器が、複数の面を有し、
    　前記容器に対する回動の動作が、前記複数の面のうち最も面積の大きい第１面に平行又は交差する回転軸まわりに行われる、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記第１面に対する前記回転軸の角度が、直角である、請求項４に記載の方法。
  6. 　２以上の体細胞が、前記容器の前記回転軸に対する径方向の中心よりも前記回転軸の近くの領域に集約される、請求項５に記載の方法。
  7. 　２以上の体細胞が、前記容器の前記回転軸に対する径方向の中心よりも前記回転軸から離れた領域に集約される、請求項５に記載の方法。
  8. 　前記区画が、
    　前記容器の一面に設けられた開口部と、細胞低接着性の底部とを含む凹部を有し、
    　前記凹部が、
    　２以上の体細胞を集約可能な集約部と、
    　前記容器の内部に流入した体細胞を前記集約部に案内する案内部と
    を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記案内部が、前記容器の一面に対して傾斜する傾斜面である、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記傾斜面と前記容器の一面とがなす角が、１５～６０度である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記傾斜面が、平面で構成されている、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 　前記傾斜面が、曲面で構成されている、請求項９又は１０に記載の方法。
  13. 　前記案内部が、２以上の前記傾斜面を有している、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　前記傾斜面が、多角形状の平面で構成されている、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　前記凹部が、互いに隣接して配置された３以上の前記傾斜面で構成され、前記開口部から前記底部に向かうに従って先細りとなる多角錐形状であり、
    　前記底部が前記集約部を構成し、前記凹部の側面が前記案内部を構成する、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記傾斜面が、略三角形状の平面である、請求項１４に記載の方法。
  17. 　前記凹部が、前記開口部から前記底部に向かうに従って先細りとなる略円錐形状であり、
    　前記底部が前記集約部を構成し、前記凹部の側面が前記案内部を構成する、請求項１２に記載の方法。
  18. 　前記容器が、２以上の前記区画を有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　前記体細胞が浮遊性の体細胞である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 　前記浮遊性の体細胞が血球系細胞である、請求項１９に記載の方法。
  21. 　前記血球系細胞が末梢血単核球である、請求項２０に記載の方法。
  22. 　前記血球系細胞が造血前駆細胞を含む、請求項２０に記載の方法。
  23. 　前記血球系細胞がCD34陽性細胞である、請求項２０に記載の方法。
  24. 　前記血球系細胞が末梢血又は臍帯血由来である、請求項２０～２３のいずれかに記載の方法。
  25. 　体細胞を３～１５０細胞／区画の細胞密度で播種する、請求項１～２４のいずれかに記載の方法。
  26. 　前記細胞密度が５～５０細胞／区画である、請求項２５に記載の方法。
  27. 　体細胞を初期化因子に接触させる前に、体細胞を拡大培養する工程を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 　工程（２）において、センダイウイルスベクターを用いて体細胞に初期化因子を接触させる、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 　初期化因子がRNAである、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 　体細胞がヒト体細胞である、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 　前記工程（１）の後に、前記工程（２）が行われる、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 　前記工程（２）の後に、前記工程（１）が行われる、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  33. 　2以上の体細胞を集約可能な前記区画を有する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法に用いる容器。
  34. 　内部に体細胞を収容可能な容器本体と、
    　前記容器本体の内部に配置された少なくとも１つの区画と、
    を備え、
    　前記区画が、
    　２以上の体細胞を集約可能な細胞低接着性の集約部と、
    　前記容器の内部に流入した体細胞を前記集約部に案内する案内部と
    を有する、容器。
  35. 　前記区画が、
    　前記容器本体の内面に開口する開口部と、細胞低接着性の底部とを含む凹部を有し、
    　前記案内部が、
    　前記凹部の一部を構成し、前記容器本体の内面に対して傾斜する傾斜面である、請求項３４に記載の容器。
  36. 　前記区画が、
    　前記容器本体の内面に設けられた開口部と、細胞低接着性の底部とを含む凹部を有し、
    　前記案内部が、
    　前記凹部の外部で前記開口部に隣接しかつ前記開口部よりも前記流通部から離れて配置され、前記内面から突出する突出部である、請求項３４に記載の容器。
  37. 　前記容器本体の内部と前記容器本体の外部とを連通し、体細胞の流通を可能とする流通部をさらに備える、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の容器。
  38. 　前記区画内に初期化因子が含まれる、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の容器。
  39. 　請求項３３～３８のいずれか一項に記載の容器と、
    　体細胞を前記容器の内部に供給して播種する播種装置と、
    　初期化因子と接触した体細胞を前記容器の内部から前記容器の外部に排出して回収する回収装置と、
    　前記播種装置及び前記回収装置を制御する制御装置と
    を備える、システム。
  40. 　前記容器の一部又は全部を基準面に対して傾斜させて、前記容器の内部の２以上の前記体細胞を前記区画に集約させることが可能な傾斜装置を備える、請求項３９に記載のシステム。
  41. 　前記容器が、可撓性の底面を有し、
    　前記傾斜装置が、前記底面を変形させて前記基準面に対して傾斜させる、請求項４０に記載のシステム。
  42. 　前記傾斜装置が、前記容器を前記基準面に直交する方向に延びる回転軸まわりに回転させて傾斜させるか、又は、前記容器の底面の一部を押圧することで前記容器の一部若しくは全部を前記基準面に対して傾斜させる、請求項４１に記載のシステム。
  43. 　前記容器を揺動又は振動させて、前記容器の内部の２以上の前記体細胞を前記区画に集約させることが可能な振動装置を備える、請求項３９～４２のいずれか一項に記載のシステム。
  44. 　前記容器を回転軸まわりに回転駆動させて、遠心力により前記容器の内部の２以上の前記体細胞を前記区画に集約させることが可能な回転装置を備える、請求項３９～４３のいずれか一項に記載のシステム。
  45. 　体細胞から多能性幹細胞を製造するためのキットであって、
    　2以上の細胞を集約可能な区画を１以上有する細胞低接着性の容器、及び
    　初期化因子を含む、キット。
  46. 　請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法をコンピュータに実行させるプログラム。
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YE HUAHU, WANG QIWEI: "Efficient Generation of Non-Integration and Feeder-Free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Cells by Sendai Virus", CELLULAR PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY, KARGER BASEL, CH, vol. 50, no. 4, 1 January 2018 (2018-01-01), CH , pages 1318 - 1331, XP093052870, ISSN: 1015-8987, DOI: 10.1159/000494589 *

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WO2023054357A1 (ja) 2023-04-06

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