JP5696282B2 - 人工多能性幹細胞樹立効率改善剤 - Google Patents
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Description
より詳細には、メシマコブの菌糸体由来物質を含有するiPS細胞の樹立効率改善剤、メシマコブの菌糸体由来物質を培地中に存在させるiPS細胞の樹立効率改善方法、 核初期化物質とメシマコブの菌糸体由来物質とを培地中に存在させるiPS細胞の製造方法、及びメシマコブ菌糸体の熱水抽出物を有効成分として含有するiPS細胞の生存増強剤に関するものである。
iPS細胞の樹立効率改善剤については、今まで幾つかの報告がなされているが(例えばNat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008)、Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))などを参照)、天然資源からiPS細胞の樹立効率改善効果を有する物質を見出したのは本発明が初めてである。
本発明は以上の知見に基づき完成するに至ったものである。
請求項1:下記の(1)、又は/及び(2)を含有することを特徴とする人工多能性幹細胞(以下iPS細胞)の樹立効率改善剤。
(1)メシマコブ(Phellinus linteus)菌糸体の熱水抽出物由来物質
(2)前記菌糸体のエタノール抽出物及びbFGF
請求項2:iPS細胞がヒト由来である請求項1記載のiPS細胞樹立効率改善剤。
請求項3:体細胞の核初期化工程において、下記の(1)、又は/及び(2)を培地中に存在させることを特徴とするiPS細胞の樹立効率改善方法。
(1)メシマコブ(Phellinus linteus)菌糸体の熱水抽出物由来物質
(2)前記菌糸体のエタノール抽出物及びbFGF
請求項4:体細胞がヒト由来である、請求項3記載の樹立効率改善方法。
請求項5:核初期化物質と、下記の(1)、又は/及び(2)を培地中に存在させることを特徴とするiPS細胞のiPS細胞の製造方法。
(1)メシマコブ(Phellinus linteus)菌糸体の熱水抽出物由来物質
(2)前記菌糸体のエタノール抽出物及びbFGF
請求項6:iPS細胞がヒト由来である請求項5記載のiPS細胞の製造方法。
請求項7:核初期化物質がOctファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー
ー、Mycファミリーメンバー、Linファミリーメンバー、及びNanog、又はそれらをコードする核酸から選択される少なくとも1つを含む請求項5、又は6記載のiPS細胞の製造方法。
請求項8:核初期化物質がOct3/4、 Klf4、 Sox2及びc-Myc、又はそれらをコードする核酸である請求項5、又は6記載の製造方法。
請求項9:核初期化物質がOct3/4、 Klf4、 Sox2及びL-Myc、又はそれらをコードする核酸である請求項5、又は6記載の製造方法。
請求項10:核初期化物質がOct3/4、 Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である請求項5、又は6記載の製造方法。
請求項11:メシマコブ菌糸体の熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とするiPS細胞の生存増強剤。
請求項12:フィーダー細胞非存在下での培養において用いられる請求項11記載のiPS細胞の生存増強剤。
請求項13:iPS細胞がヒト由来である請求項11、又は請求項12記載のiPS細胞の生存増強剤。
(2)メシマコブの菌糸体は、均一の培養基で工業的に安定して生産することができるので、本願発明に使用するメシマコブの菌糸体由来物質(メシマコブの菌糸体のエタノール抽出物、熱水抽出物等)も容易に、安定して得ることができる。
(3)メシマコブについては、近年抗腫瘍活性、抗アレルギー活性、抗酸化活性及びウイルスのワクチンに対するアジュバント作用など、人に対する有効性が報告されている。
又古くから伝承的に、メシマコブの煎じ液を疾病の予防及び改善を目的として飲用されていた経緯もあり、現在健康食品として、多量に販売されているものである。
したがって、従来の低分子化合物の樹立効率改善剤と比べて細胞へのダメージが少なく、より安全性の高い樹立効率改善剤であると期待される。
(イ)本願発明に用いたPhellinus linteus (メシマコブ)は、1998年10月に宮崎県西諸県郡須木村で、子実体を採取し、株式会社アイ・ビー・アイ応用キノコ研究所で菌糸体化した上でPL−08株として保存していたものを使用した。この菌株は、子実体を農林水産省林野庁総合研究所森林生物部森林微生物科 腐朽病害研究室の阿部恭久博士の鑑定により、メシマコブ子実体に特有の黄褐色の剛毛体を持つこと、及び担子胞子の形態、からメシマコブと同定されたものを用いた。
(a)メシマコブ菌糸体の乾燥粉末の取得
大型タンク(1000L)を用いて、炭素源としてグルコースを4.0%、天然物由来窒素源イーストエキス及びポリぺプトンを各0.3%、KH2PO4及びNa2HPO4を各0.05%を含み、初発培地pH5.5の液体培地に、メシマコブの菌糸体を接種し、強制的に0.22μmフィルターを通した無菌空気を培地内へ通気し、温度28℃で45日間培養した。
この培養液を遠心分離して得られた菌糸体を凍結乾燥してメシマコブの菌糸体の乾燥粉末(60メッシュパス)を得た。
メシマコブの菌糸体の乾燥粉末20gに、イオン交換水140mLを加え、105℃で60分、熱水抽出処理を行ない、遠心分離で不溶物を除去し、さらに段階的に熱水抽出液を吸引濾過(4μm濾紙、1μm濾紙)しメシマコブの菌糸体の熱水抽出物を得た。試験用サンプルの調製としては、固形分5%に調製し、0.45μmフィルター、0.2μmフィルターで濾過し、滅菌済みサンプル(PL−2C)とした(図1参照)。
前記(ロ)(a)のメシマコブの菌糸体の乾燥粉末50gに、エタノール1Lを加え、15℃下で攪拌抽出を24時間行った(抽出一回目)。20μm濾紙を用いた吸引濾過でメシマコブ菌糸体とエタノール抽出物に分け、再度、メシマコブ菌糸体にエタノールを加え15℃下で攪拌抽出を24時間行った(抽出二回目)。抽出終了後、段階的に20μm、8μm、2.5μm濾紙を用いて吸引濾過を行い、一回目と二回目のエタノール抽出物を混合し、エバポレーターにて濃縮(40℃以下)しエタノール抽出物を獲得した。
最終的なサンプル調製としては、エタノール抽出物(PL−EtOH):1.5gにエタノール10mLを加え溶解する。エタノールで十分に溶解させた溶液に0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水20mLを加え、さらに攪拌し、溶解させた溶液を試験サンプルとして−20℃以下で保存した(図2参照)。
本発明においてiPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物(例えば、マウスまたはヒト)由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞(例、角質化表皮細胞)、粘膜上皮細胞(例、舌表層の上皮細胞)、外分泌腺上皮細胞(例、乳腺細胞)、ホルモン分泌細胞(例、副腎髄質細胞)、代謝・貯蔵用の細胞(例、肝細胞)、境界面を構成する内腔上皮細胞(例、I型肺胞細胞)、内鎖管の内腔上皮細胞(例、血管内皮細胞)、運搬能をもつ繊毛のある細胞(例、気道上皮細胞)、細胞外マトリックス分泌用細胞(例、線維芽細胞)、収縮性細胞(例、平滑筋細胞)、血液と免疫系の細胞(例、Tリンパ球)、感覚に関する細胞(例、桿細胞)自律神経系ニューロン(例、コリン作動性ニューロン)、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞(例、随伴細胞)、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞(例、星状グリア細胞)、色素細胞(例、網膜色素上皮細胞)、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)が挙げられる。
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質(群)であれば、タンパク質またはそれをコードする核酸(ベクターに組み込まれた形態を含む)、あるいは低分子化合物等のいかなる物質であってもよい。核初期化物質がタンパク質またはそれをコードする核酸の場合、具体的には、たとえば、Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Mycファミリーメンバー、Linファミリーメンバー、及びNanogからなる群から選ばれる1種以上のタンパク質またはそれをコードする核酸を挙げることができる(WO2007/69666; Science, 2007, 318:1917-1920)。これらのファミリーメンバーおよびその組み合わせの具体例を以下に列挙する。なお、以下においてはタンパク質の名称のみ記載するが、これをコードする核酸も含まれる。
(b) Octファミリーメンバー及びSoxファミリーメンバーからなる2種の核初期化物質の組み合わせ;
(c) Octファミリーメンバー及びKlfファミリーメンバーからなる2種の核初期化物質の組合せ;
(d)Octファミリーメンバー及びNanogからなる2種の核初期化物質の組合せ;
(e) Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、及びSoxファミリーメンバーからなる3種の核初期化物質の組み合わせ;
(f) Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー及びMycファミリーメンバーからなる3種の核初期化物質の組合せ。
(g) Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー及びMycファミリーメンバーからなる4種の核初期化物質の組み合わせ;並びに
(h) Octファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Linファミリーメンバー、及びNanogからなる4種の核初期化物質の組み合わせ。
より具体的には、以下の組み合わせが例示されるが、これらに限定されない。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A(活性型変異体), N-Myc, L-Mycで置換可能である。)
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40 Large T antigen(以下、SV40LT)
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, Bmil
(以上、WO 2007/069666を参照(但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照)。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf2(またはKlf5), c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。)
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2(Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照)
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28(Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照)
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40LT(Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照)
(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28(Cell Research (2008) 600-603を参照)
(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40LT(Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照)
(14) Oct3/4, Klf4(Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008))を参照)
(15) Oct3/4, c-Myc(Nature 454:646-650 (2008)を参照)
(16) Oct3/4, Sox2 (Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照)
(17) Oct3/4, Sox2, Nanog (WO2008/118820を参照)
(18) Oct3/4, Sox2, Lin28 (WO2008/118820を参照)
(19) Oct3/4, Sox2, c-Myc, Esrrb (ここで、EssrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(20) Oct3/4, Sox2, Esrrb (Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(21) Oct3/4, Klf4, L-Myc
(22) Oct3/4, Nanog
(23) Oct3/4
(24) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT(Science, 324: 797-801 (2009)を参照)
また、上記(1)-(24)には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記(1)-(24)のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「初期化物質」の範疇に含まれ得る。
これらの組み合わせの中で、Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc(またはL-Myc)、Lin28、及びNanogからなる群から選ばれる1種以上のタンパク質またはそれをコードする核酸から選択される少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上が、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。特に好ましいのは、(1)Oct3/4, Klf4, Sox2およびc-Myc、またはそれらをコードする核酸、(2)Oct3/4, Klf4, Sox2およびL-Myc、またはそれらをコードする核酸、あるいは(3)Oct3/4, Klf4およびSox2、またはそれらをコードする核酸である。
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
なお、核初期化物質の遺伝子名は、ヒト由来の遺伝子の場合、学術論文では全て大文字(例えば「OCT3/4」)で記載するが、本明細書においては最初の一文字のみ大文字であっても(例えば「Oct3/4」)、マウスのみならず、ヒトやその他の動物種の場合も含むものとする。
近年、マウスおよびヒトにおいて、核初期化物質(タンパク質)をポリアルギニンやTAT等のCPP(cell penetrating peptide)と共に導入してiPS細胞を樹立する方法が開発されており、これらの手法を用いることもできる(Cell Stem Cell, 4:381-(2009)、Cell Stem Cell,
doi: 10.1016/j.stem.2009.05.005-(2009))。
核初期化物質である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞(例、Plat-E細胞)や相補細胞株(例、293細胞)に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。例えば、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段が WO2007/69666、Cell, 126, 663-676 (2006) 及び Cell, 131, 861-872 (2007) に開示されており、ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合については、Science, 318, 1917-1920 (2007) に開示がある。また、アデノウイルスベクターを用いる場合については、Science, 322, 945-949 (2008) に記載されている。
さらにトランスポゾンを用いることもでき、例えばpiggy Bacトランスポゾンを用いた具体的手段は、Nature, 458:766-771(2009)および Nature, 458:771-776(2009)に記載されている。
本発明のメシマコブ菌糸体のエタノール抽出物及び/又は熱水抽出物に加え、公知の他のiPS細胞樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をさらに高めることが期待できる。そのようなiPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤[例えば、バルプロ酸(VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA(例、HDAC1 siRNA SmartpoolO (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等)等の核酸性発現阻害剤など]、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤(例えば5’-azacytidine)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤[例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA(例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等)等の核酸性発現阻害剤など]、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、p53阻害剤(例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling(例えばsoluble Wnt3a)(Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008))、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))等が挙げられるが、それらに限定されない。前記で核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
iPS細胞の樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が(a) タンパク質である場合、(b) 該タンパク質をコードする核酸である場合、あるいは(c) 低分子化合物である場合に応じて、核初期化物質についてそれぞれ上記したと同様の方法により、実施することができる。
iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子(例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanog又はOct3/4)の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び/又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性及び/又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo(β-ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする)遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF(Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006))、あるいはNanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF(Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007))等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。核初期化物質としてOct3/4、Klf4およびSox2の3因子を用いた場合、樹立クローン数は減少するものの生じるコロニーのほとんどがES細胞と比較して遜色のない高品質のiPS細胞であることから、レポーター細胞を用いなくとも効率よくiPS細胞を樹立することが可能である。
このようにして樹立されたiPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞で報告されている分化誘導法を利用して、iPS細胞から種々の細胞(例、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等)への分化を誘導することができる。したがって、患者本人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞(即ち、該患者が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞など)に分化させて該患者に移植するという、自家移植による幹細胞療法が可能となる。また、患者本人でなくても、HLAの型が同一である他人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導し、そこから所望の細胞へ分化させ、これを患者への移植に用いることもできる。さらに、iPS細胞から分化させた機能細胞(例、肝細胞)は、対応する既存の細胞株よりも実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、医薬候補化合物の薬効や毒性のin vitroスクリーニング等にも好適に用いることができる。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
ヒト歯髄幹細胞(J.Dent.Res., 87(7): 676-681 (2008))に対してCell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、レンチウイルスを用いて、マウスエコトロピックウイルスレセプターSlc7a1遺伝子を発現させた。このSlc7a1遺伝子発現歯髄幹細胞を1 x 105個/wellの割合で6ウェルプレート上に蒔き、翌日、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、ヒト由来のOCT3/4, KLF4, SOX2、およびc-MYCの4遺伝子をレトロウイルスで導入した。ウイルス感染から6日後に細胞を回収し、MSTO細胞上への蒔き直しを行った(3 x 104個/ウェル、6ウェルプレート)。翌日から以下の3種類の培地で培養を行った。
(a)霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF(WAKO)および50 U/mL ペニシリン、50μg/mL ストレプトマイシンを加えた培地
(b)上記(a)に、さらにPL-2Cを終濃度0.1%となるように添加した培地
(c)上記(a)に、さらにPL-EtOHを終濃度0.1%となるように添加した培地
2日に1回、上記の培地で培地交換を行いながら培養を続け、レトロウイルス感染後26日目に出現したトータルコロニーおよびヒトiPSコロニー(ES-likeコロニー)の数をカウントした。結果を図3に示す。図3に示されるように、PL-EtOHを培地に加えることにより、加えない場合に比べてiPSコロニーの樹立効率が3〜4倍上昇した。またPL-2Cを培地に加えた場合も、PL-EtOHほどではないが、加えない場合に比べてiPSコロニーの樹立効率の上昇が認められた。
以上のように、メシマコブ菌糸体由来抽出物であるPL-EtOHおよびPL-2Cは、iPS細胞の樹立効率を向上させる効果のあることが明らかとなった。
bFGF存在下、非存在下でのPL-2C、PL-EtOHの効果を検討した。
実施例1と同じSlc7a1遺伝子発現歯髄幹細胞を、1 x 105個/wellの割合で6ウェルプレート上に蒔き、翌日、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、ヒト由来のOCT3/4, KLF4, SOX2、およびL-MYC1(以下単にL-MYCと称する)の4遺伝子をレトロウイルスで導入した。ウイルス感染から6日後に細胞を回収し、MSTO細胞上への蒔き直しを行った(3 x 104個/ウェル、6ウェルプレート)。
翌日から以下の表1の♯1〜14の各培養条件下(霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF(WAKO)および50 U/mL ペニシリン、50μg/mL ストレプトマイシンを加えた培地に対して、bFGF添加の有無、およびPL-2C、PL-EtOH添加の有無と濃度がそれぞれ異なる)で培養を行った。
bFGFを培地に添加しない系においては、PL-EtOH添加によるiPSコロニー樹立効率上昇効果は全く認められなかった。
一方、PL-2C添加の場合は、bFGFを培地に添加しない系であってもiPSコロニーの樹立効率上昇効果が認められ、PL-2Cが終濃度0.1%の場合はPL-2Cを加えない場合に比べてiPSコロニーの樹立効率が8倍上昇した。
bFGFを培地に添加した場合は、PL-EtOHを培地に加えることにより、加えない場合に比べてiPSコロニーの樹立効率が9〜10倍上昇した(PL-EtOHの終濃度0.1%の場合)。またPL-2Cを培地に加えた場合も、PL-EtOHほどではないが、加えない場合に比べてiPSコロニーの樹立効率が3〜4倍上昇した(PL-2Cの終濃度0.1%の場合)。
(1)メシマコブ菌糸体由来抽出物であるPL-EtOHおよびPL-2Cは、bFGF存在下でiPS細胞の樹立効率を向上させる効果のあることが明らかとなった。特にPL-EtOHのほうがその効果は顕著であった。
(2)PL-2Cは、bFGF非存在下でもiPS細胞の樹立効率を向上させる効果のあることが明らかとなった。PL-EtOHにはそのような効果が認められなかったことから、PL-2CにはbFGFそのもの、またはbFGFと同様の機能を有する因子が含まれている可能性が示唆された。
成人皮膚由来線維芽細胞(aHDF-Slc7a1)に対してOCT3/4, KLF4, SOX2、およびL-MYCの4遺伝子をレトロウイルスを用いて導入することにより樹立されたヒトiPS細胞(32R6、18継代目)(WO2009/057831)を、細胞解離剤であるAccutase(Invitrogen)を用いて剥離し、単一細胞化した。この細胞を、(1)マトリゲル(Becton, Dickinson and Company)、(2)CellStart (Invitrogen)、または(3)コラーゲンI(IWAKI)のいずれかをコートした6ウェルプレート上に、3.5 x 105個/ウェルの密度で蒔いた。各細胞を、以下の(a)または(b)の条件下で培養した。
(b)上記(a)に、さらにPL-2Cを終濃度0.1%となるように添加した培地
以上のようにPL-2Cは、フィーダー細胞の無い条件下で、ヒトiPS細胞の生存を増強させることが明らかとなった。
Claims (13)
- 下記の(1)、又は/及び(2)を含有することを特徴とする人工多能性幹細胞(以下iPS細胞)の樹立効率改善剤。
(1)メシマコブ(Phellinus linteus)菌糸体の熱水抽出物由来物質
(2)前記菌糸体のエタノール抽出物及びbFGF - iPS細胞がヒト由来である請求項1記載のiPS細胞樹立効率改善剤。
- 体細胞の核初期化工程において、下記の(1)、又は/及び(2)を培地中に存在させることを特徴とするiPS細胞の樹立効率改善方法。
(1)メシマコブ(Phellinus linteus)菌糸体の熱水抽出物由来物質
(2)前記菌糸体のエタノール抽出物及びbFGF - 体細胞がヒト由来である、請求項3記載の樹立効率改善方法。
- 核初期化物質と、下記の(1)、又は/及び(2)を培地中に存在させることを特徴とするiPS細胞のiPS細胞の製造方法。
(1)メシマコブ(Phellinus linteus)菌糸体の熱水抽出物由来物質
(2)前記菌糸体のエタノール抽出物及びbFGF - iPS細胞がヒト由来である請求項5記載のiPS細胞の製造方法。
- 核初期化物質がOctファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Mycファミリーメンバー、Linファミリーメンバー、及びNanog、又はそれらをコードする核酸から選択される少なくとも1つを含む請求項5、又は6記載のiPS細胞の製造方法。
- 核初期化物質がOct3/4、 Klf4、 Sox2及びc-Myc、又はそれらをコードする核酸である請求項5、又は6記載の製造方法。
- 核初期化物質がOct3/4、 Klf4、 Sox2及びL-Myc、又はそれらをコードする核酸である請求項5、又は6記載の製造方法。
- 核初期化物質がOct3/4、 Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である請求項5、又は6記載の製造方法。
- メシマコブ菌糸体の熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とするiPS細胞の生存増強剤。
- フィーダー細胞非存在下での培養において用いられる請求項11記載のiPS細胞の生存増強剤。
- iPS細胞がヒト由来である請求項11、又は請求項12記載のiPS細胞の生存増強剤。
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