CN102388130A

CN102388130A - 多能细胞的分化

Info

Publication number: CN102388130A
Application number: CN2010800161319A
Authority: CN
Inventors: D·拉杰什; R·利维斯
Original assignee: Fujifilm Cellular Dynamics Inc
Current assignee: Fuji film cell power company
Priority date: 2009-02-27
Filing date: 2010-03-01
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2030-03-01
Also published as: EP2401364B1; CA2753679A1; CN102388130B; KR101720961B1; US8372642B2; JP2015192681A; AU2010217739B2; US20130210141A1; JP2012519005A; CA2753679C; KR20110122858A; IL214818A0; AU2010217739A1; JP5816100B2; EP2401364A1; US10100282B2; US20100279403A1; IL214818A; WO2010099539A1

Abstract

本文提供了用于体外维持、扩增、培养多能细胞例如人类胚胎干细胞(hESC)或诱导的多能细胞(iPSC)和/或使其分化为造血前体细胞或内皮细胞的方法。多能细胞可以维持于并在确定条件下分化；因此，在一些实施方式中，多能细胞向造血前体细胞或内皮细胞的分化无需使用小鼠饲养细胞或血清。得到的造血前体细胞可以进一步分化为多种骨髓或淋巴谱系。

Description

多能细胞的分化

背景技术

本申请要求2009年2月27日递交的美国申请号61/156,304的优先权，其全部公开内容特别通过引用方式全文并入本文而无所放弃。

1.技术领域

本发明大体上涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及用于从胚胎干细胞产生造血祖细胞的方法和组合物。

2.相关领域的描述

由于造血干细胞和祖细胞的显著的医学潜在意义，已经进行了大量的工作以尝试改进从多能干细胞分化造血祖细胞的方法。在成人中，主要存在于骨髓中的少量的造血干细胞产生活跃分裂的造血(CD34+)祖细胞的异质群体，所述祖细胞分化为血液系统的所有细胞。然而，CD34+标志物是造血细胞的不精确的定义，因为其它细胞类型、尤其是内皮细胞(血管)也表达CD34。其它标志物，例如CD43标志物，也可用于辅助鉴定造血祖细胞(例如Kadaja-Saarepuu等人，2007；Vodyanik等人，2006)。在成人中，造血祖细胞增殖并分化，引起每天产生数千亿成熟的血细胞。造血祖细胞也存在于脐带血中。在体外，人类胚胎干细胞能够在培养物中无限增殖，因此，至少在理论上讲，能够提供用于替换衰退或缺损的人组织的细胞和组织。

使用饲养细胞系例如小鼠成纤维细胞培养人多能细胞具有发生预料不到的转化的风险，之前在共培养过程中与物种间暴露相关。由于培养人类多能干细胞的目标之一是产生能够最终移植进入人体的组织，所以十分理想的是：干细胞不暴露于另一物种的细胞或暴露于曾用于培养另一物种的细胞的培养基。因此，确定“允许人类多能干细胞分化为造血谱系而无任何种类的共培养步骤”的培养条件在持续开发用于从人类多能干细胞产生人类造血祖细胞的技术中是非常有意义的。

在分化培养基中使用血清也可能具有一定的缺点和局限性。例如，如Chadwick等人(2003)所示，血清是动物产品，就不同批次的血清成分而言，其具有不确定性(例如关于是否存在生长因子和/或其浓度是变化的)。这些不确定性也可以造成各个实验之间产生的造血细胞的比例的差异。另外，使用血清可能在临床发展中具有严重的规章制度问题，这进一步使其商业化复杂化。

目前显然需要使多能干细胞分化为造血祖细胞而不将细胞暴露于来自另一动物物种的物质的方法。由于与多能细胞的维持和分化相关的复杂性，目前尚不知道，相对于维持在小鼠饲养细胞上而言，在维持于多种确定培养基中之后，多种多能细胞将会如何针对随后暴露于生长因子作出应答。显然需要用于使多能细胞分化为造血前体细胞的改进的方法。

发明内容

本文提供了用于将已经在确定的条件下扩增和/或维持的多能细胞体外分化为造血前体细胞或内皮细胞的方法。这些方法通过提高可以在确定的条件下实施的方法而克服了现有技术中的局限。因此，这些方法可有利地用于产生，例如造血前体细胞(HPC)或进一步分化的骨髓或淋巴样谱系，它们可被施用至受试者(例如人类患者)，这降低了与使用暴露于动物产品例如小鼠成纤维细胞和/或血清的细胞相关的临床上的忧虑。

本发明的一个方面涉及使多能细胞分化为造血前体细胞或内皮细胞的方法，包括以下连续步骤：(a)在含有至少一种生长因子的第一确定培养基中培养或维持多个实质上未分化的多能细胞；(b)在基本上不含BMP4、VEGF、IL-3、Flt3配体和GMCSF的第二确定培养基中温育细胞；(c)在含有足以扩增多个细胞或促进其分化的量的BMP4和VEGF的第三确定培养基中培养细胞；和(d)在含有足以扩增多个细胞或促进其分化的量的(1)IL-3和Flt3配体或(2)VEGF、FGF-2或FGF-2模拟物和IGF的第四确定培养基中培养细胞；其中多个多能细胞分化为造血前体细胞或内皮细胞。在一些实施方式中，上述组合(1)可用于促进向造血前体细胞的分化。上述组合(2)可用于促进向内皮细胞或内皮祖细胞的分化。第二确定培养基可以不含或基本上不含FGF-2、IL6、SCF和/或TPO。第三确定培养基也可以包含FGF-2(例如，大约5-50ng/ml或大约10-25ng/ml)或FGF-2模拟物。如以下实施例中所示，在第三培养基中加入FGF-2能够增大多能细胞向造血前体细胞分化的效率。在一些实施方式中，第四确定培养基还包含GMCSF，或IL-6、SCF或TPO中的至少一项。在一些实施方式中，第四确定培养基包含足以促进细胞分化的量的(1)IL-3、Flt3配体和GMCSF；或(2)IL-3、Flt3配体、SCF、IL-6和TPO。第三确定培养基和/或第四确定培养基还可以包含BIT9500或血清替代物3(Serum Replacement 3)。该方法可以包括在含有BIT9500或血清替代物3的确定培养基中培养细胞。在步骤(b)之前，可以至少部分分离至少一些细胞或使其实质上个体化。可以使用酶例如胰蛋白酶使细胞实质上个体化。细胞可以在所述个体化之后与ROCK抑制剂和胰蛋白酶抑制剂(例如大豆胰蛋白酶抑制剂)接触。ROCK抑制剂可以选自HA-100、H-1152和Y-27632。多个多能细胞可以形成类胚体(EB)。可以使用大约200至大约1000个细胞/聚集体以形成至少一个所述EB。该方法可以包括在小于20％氧气的气压下或在大约5％氧气的气压下培养细胞。如以下实施例所示，在低氧条件例如大约5％氧气的空气中分化细胞能够增加细胞向例如造血和/或内皮前体细胞的分化。

在一些实施方式中，所述细胞可以至少一次部分或实质上再聚集。可以在第三确定培养基中培养之后并且在第四确定培养基中培养之前或之时使细胞再聚集。再聚集可以包括将所述细胞暴露于胰蛋白酶或TRYPLE。所述细胞可以在再聚集之后暴露于ROCK抑制剂，或者可以在再聚集之后在基本上不含ROCK抑制剂的培养基中培养所述细胞。该方法还可以包括在小于大约20％氧气的气压下培养细胞，其中大约200至大约1000个细胞/聚集体用于形成多个类胚体(EB)。第一确定培养基可以包括TeSR、mTeSR或mTeSR1。步骤(a)可以包括在基质包被的表面上培养细胞。基质可以包括层粘连蛋白、玻连蛋白、明胶、聚赖氨酸、血小板反应素(thrombospondin)或Matrigel^TM。第二确定培养基可以包括TeSR-GF或X-vivo15培养基。第二确定培养基还可以含有大约0.1ng/ml TGF-β和大约20ng/ml FGF-2。步骤(b)可以包括温育细胞大约12小时至大约3天的时间段。步骤(c)可以包括培养或分化细胞大约4天至大约8天的时间段。步骤(d)可以包括培养细胞至少大约4天，或大约4天至大约8天的时间段。多个多能细胞可以分化为多潜能(multipotent)造血细胞或骨髓祖细胞。在一些实施方式中，骨髓祖细胞共表达CD31、CD43和CD45。骨髓祖细胞可以是常见的骨髓祖细胞。第三确定培养基包含大约10-50ng/ml BMP4和大约10-50ng/ml VEGF。在一些实施方式中，第三确定培养基还包含10-50ng/mlFGF-2。第三确定培养基包含大约25ng/ml BMP4和大约25ng/mlVEGF。第四确定培养基可以包含大约5-25ng/ml IL-3和大约10-50ng/ml Flt3配体。第四确定培养基还可以包含大约5-25ng/ml GMCSF，或大约10-100ng/ml或大约10-50ng/ml TPO，大约10-100ng/ml SCF，大约5-25ng/ml IL-6，和大约5-25ng/ml IL-3。第四确定培养基可以包含大约10ng/ml IL-3，大约25ng/ml Flt3配体，和大约10ng/mlGMCSF。多个造血前体细胞可以表达选自包含CD43、CD34、CD31和CD45的列表的至少两种细胞标志物。多个造血前体细胞可以表达CD34、CD43、CD45和CD31。在一些实施方式中，造血前体细胞是共表达CD34、CD43、CD45和CD31的多潜能造血前体细胞。

一个或多个造血前体细胞可以分化为骨髓细胞或淋巴样细胞。骨髓细胞可以是巨噬细胞、肥大细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞或多形核粒细胞(例如，嗜曙红细胞、嗜碱细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞或巨噬细胞)。

在一些实施方式中，可以使用第五确定培养基以进一步促进细胞向特定细胞类型的分化，例如，多种培养基可用于促进造血前体细胞向更分化的细胞类型例如成红血球细胞、NK细胞或T细胞的分化。所述方法还可以包括在含有选自IL-3、IL-6、SCF、EPO和TPO的一种或多种生长因子的第五确定培养基中培养多个所述细胞，所述生长因子的量为足以促进多个细胞向成红血球细胞的分化。在含有选自IL-7、SCF和IL-2的一种或多种生长因子的第五确定培养基中培养多个细胞，所述生长因子的量为足以促进细胞向NK细胞的分化。所述方法还可以包括在含有Notch配体和选自IL-7、SCF和IL-2的一种或多种生长因子的第五确定培养基中培养多个所述细胞，所述生长因子的量为足以促进细胞向T细胞的分化。Notch配体可以是Fc嵌合的Notch DLL-1配体或由过表达Notch配体的基质细胞系产生的Notch配体。在一些实施方式中，可以使用胸腺肽例如胸腺素α、thymopenin或胸腺素B4来进一步促进细胞向T细胞的分化(例如，如Peng等人，2008所描述)。在一些实施方式中，多个所述细胞包括造血前体细胞。第三确定培养基可以包含选自SCF、IL-6、G-CSF、EPO、TPO、FGF2、IL-7、IL-11、IL-9、IL-13、IL-2或M-CSF的一种或多种生长因子，所述生长因子的量为足以促进细胞的扩增或细胞的进一步分化。第四确定培养基可以包含选自SCF、IL-6、G-CSF、EPO、TPO、FGF2、BMP4、VEGF、IL-7、IL-11、IL-9、IL-13、IL-2或M-CSF的一种或多种生长因子，所述生长因子的量为足以促进细胞扩增或细胞的进一步分化。在一些实施方式中，所述方法可以包括在包含选自SCF、IL-6、G-CSF、EPO、TPO、FGF2、IL-7、IL-11、IL-9、IL-13、IL-2或M-CSF的一种或多种生长因子的第五确定培养基中温育细胞，所述生长因子的量为足以促进细胞扩增或细胞的进一步分化。

所述多能细胞优选为哺乳动物多能细胞。在一些实施方式中，多能细胞是人类多能细胞，例如人类胚胎干细胞(hESC)或诱导的多能细胞(iPSC)。hESC细胞可以选自H1、H9、hES2、hES3、hES4、hES5、hES6、BG01、BG02、BG03、HSF1、HSF6、H1、H7、H9、H13B和H14的细胞。所述iPSC可以选自iPS6.1，iPS 6.6，iPS，iPS 5.6，iPS iPS5.12，iPS 5.2.15，iPS iPS 5.2.24，iPS 5.2.20，iPS 6.2.1，iPS-Bl-SONL，iPS-Bl-SOCK，iPS-TiPS 1EE，iPS-TiPS IB，iPS-KiPS-5和iPS 5/3-4.3。

本发明的另一个方面涉及通过本文描述的方法分化的造血前体细胞或衍生自根据本文描述的方法分化的单独的造血前体细胞。造血前体细胞可以表达CD34、CD43、CD45和CD31中的两项、三项或全部。本发明的另一个方面涉及衍生自根据本文描述的方法分化的造血前体细胞的骨髓细胞、骨髓祖细胞或常见的骨髓祖细胞。骨髓细胞可以选自单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱细胞、嗜曙红细胞、红细胞、巨核细胞/血小板和树突细胞。在一些实施方式中，骨髓细胞是红细胞。骨髓细胞、骨髓祖细胞或常见的骨髓祖细胞可以包含于药物制备物中。

本发明的另一个方面涉及衍生自根据本文描述的方法分化的造血前体细胞的淋巴样细胞。淋巴样细胞可以是T细胞、B细胞或自然杀伤细胞。淋巴样细胞可以包含于药物制备物中。

本发明的另一个方面涉及根据本文描述的方法分化的内皮细胞、内皮前体细胞或间充质细胞。预见到可以通过本文描述的方法产生多组内皮细胞。内皮细胞可以是特定的内皮细胞类型，例如：淋巴的或血管的(例如表达LYVE1或podoplanum)、动脉血管的(例如，表达Notch 1和Notch，Jagged 1和Jagged 2)、静脉血管的(例如，表达EphB4、Lefty1和Lefty 2)，或器官特异性内皮细胞(例如，心脏内的细胞、肾细胞、肺或血液中的细胞和血-脑屏障细胞)。在形态上讲，内皮细胞可以是连续的、有孔的或不连续的。

如本文使用的“使细胞个体化”是指使细胞分离或分开为较小组的细胞或单个细胞，例如，由于机械分离或暴露于蛋白水解酶例如胰蛋白酶或TrypLE^TM而造成的。在一些实施方式中，经过个体化的培养物仍然可以含有小的细胞簇，例如包含大约2-10个细胞簇。

如果某生长因子不存在于培养基中，或者该生长因子以不足以促进培养基中的细胞的任何实质性扩增和/或分化的量存在于培养基中，或者以低于可检测限值的浓度存在，则称该培养基“基本上不含”该生长因子。将认识到，基本上不含生长因子的培养基也可以含有在培养基中含有痕量的生长因子。

当用于权利要求和/或说明书中时，术语“抑制”、“减少”或“防止”或这些术语的任意变体包括任何可测定的降低或完全抑制以达到需要的结果。

当用于说明书和/或权利要求中时，术语“有效”意思是足以完成需要的、预期的或期望的结果。

当与术语“包含”一起用于权利要求和/或说明书中时，词语“一种(a)”或“一种(an)”意思是“一个”，但是也包括下列意思：“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”。

考虑到本说明书中讨论的任何实施方式可以根据本发明的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。

在本申请的通篇，术语“大约”用于表示这样的数值：该数值包括用于测定该数值的仪器、方法的内在差异，或存在于研究受试者之间的差异。

除非另有明确指明是仅指备选事项或者备选事项彼此互斥，否则权利要求中术语“或”用于指“和/或”，虽然本公开物支持仅指备选事项和“和/或”的定义。

如本说明书和权利要求中所使用，词语“comprising”(以及“包含”的任何形式，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及“具有”的任何形式，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及“包括”的任何形式，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及“含有”的任何形式，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括式的或开放式的，不排除另外的、未指明的元件或方法步骤。

本发明的其它目标、特征和优点将通过以下详细描述变得明显。然而，应该理解，虽然指明了本发明的具体实施方式，但是详细描述和具体实施例仅是通过例示的方式给出的，因为本发明精神和范围内的多种变化和修饰对于本领域技术人员而言将会通过该详细描述而变得明显。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分，包括它们是为了进一步说明本发明的一些方面。通过参考一个或多个这些附图并联合本文给出的具体实施方式的详细描述可以更好地理解本发明。

图1：传代数为50(A)和40(B)时，H1hESC的造血分化(对于8，12和16天的实验，n＝3)。

图2：暴露于确定的预条件化培养基改善造血分化。使用的是维持于确定条件并适应于使用mTESR在Matrigel包被的平板上的无饲养细胞生长的hESC和iPSC。

图3：类胚体(EB)大小与CD43表达相关。

图4：低氧促进造血分化。

图5：从多能细胞的单细胞悬浮液产生造血前体细胞的效率。

图6：EB分化和使用旋转瓶产生HPC和多种谱系特异性细胞类型的概览。

图7：在96孔中的hESC的EB分化。

图8：对衍生自iPSC的内皮细胞进行磁分选之前和之后的代表性的流式细胞术分析。

图9：在EB分化培养基中补充FGF-2引起hESC(H1)和多种iPSC细胞系中造血前体细胞(HPC)的产生的增加。

图10：在存在含有50ng/ml BMP4，50ng/ml VEGF和25ng/mlFGF-2的EB分化培养基的情况下，多种iPS细胞系的分化。

图11：显示了使用补充了生长因子的EB基础培养基进行的hESC(H1)和iPS(SONL)细胞系分化为造血前体细胞(HPC)。当含有IL-3和Flt-3的培养基中补充了SCF、IL-6和TPO时，观察到增加的分化。

图12：在(H1)和iPS(SONL)细胞系中，以修饰的EB2组合(D)观察到多能细胞向HPC的分化的效率的增加。显示了培养基中补充的生长因子。观察到在分化过程中，作为血清替代品，血清替代物3(SerumReplacer 3)(Sigma-Ald rich)优于BIT-9500(Stem Cell Technologies)。

图13：在含氧量正常(“N”)和低氧(“H”)条件下，从iPS细胞产生HPC。将未分化的细胞系维持在含氧量正常或低氧条件下，并在含氧量正常或低氧条件下进行分化。例如，“H-N”表示细胞维持在低氧条件下并且在含氧量正常条件下分化。

具体实施方式

本文提供了在体外使多能细胞例如人类胚胎干细胞(hESC)或诱导的多能细胞(iPSC)分化为造血前体细胞和/或内皮细胞的方法。多能细胞可以是维持的、扩增的、以及在确定条件下分化的；因此，无需使用小鼠饲养细胞或血清以使多能细胞分化为造血前体细胞和/或内皮细胞。得到的造血前体细胞可以进一步分化为多种骨髓谱系(例如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱细胞、嗜曙红细胞、红细胞、巨核细胞/血小板，或树突细胞)或淋巴谱系(例如T细胞、B细胞或自然杀伤细胞)。多能细胞可以在基本上未分化的状态下在确定条件(例如使用TeSR培养基)下扩增并维持，然后多能细胞分化。

具体地，本发明人发现某些生长因子对于维持在确定条件下的多能细胞的分化具有特别重要的意义。在一些实施方式中，多能细胞可以依次暴露于数种确定培养基中以促进分化为造血前体细胞。多能细胞在第一确定培养基(例如在TeSR培养基中)中培养并维持在基本上未分化的状态之后，细胞可以暴露于不含或基本上不含BMP4、VEGF、IL-3、Flt3配体或GMCSF的第二确定培养基中。然后细胞可以暴露于含有BMP4、VEGF、IL-3、Flt3配体和GMCSF的第三确定培养基中以促进造血分化；或者，细胞可以暴露于含有BMP4和VEGF以及任选含有FGF-2的第三确定培养基中；然后暴露于含有IL-3、Flt3配体和GMCSF的第四培养基中。本发明人发现：依次暴露于含有BMP4和VEGF的第三确定培养基、含有IL-3、Flt3配体和GMCSF的第四培养基可以令人惊奇地引起造血前体细胞的产量的明显增加。如以下实施例中所示，在第三确定培养基中加入FGF-2引起多能细胞向造血前体细胞的分化的令人惊奇的增加。还发现：低氧条件(例如暴露于5％O₂的气压)，细胞的至少部分再聚集(例如，使用胰蛋白酶或TrypLE^TM)，和/或形成聚集体(在形成类胚体时使用确定数目范围的细胞，例如大约200-1000个细胞/聚集体)也可用于进一步促进向造血前体细胞的分化。

I.胚胎干细胞的制备和维持

可以在造血分化之前使用多种方法培养多能细胞并维持在未分化的状态。在一些实施方式中，可以使用确定的、饲养细胞非依赖性培养系统例如TeSR培养基培养多能细胞并维持在基本上未分化的状态。或者，可以使用不确定的条件，例如，多能细胞可以培养于成纤维细胞饲养细胞或已经暴露于成纤维细胞饲养细胞的培养基中，以将干细胞维持在未分化状态。

可以使用饲养细胞非依赖性培养系统和培养基来培养和维持多能细胞，例如hESC或iPSC。这些方法允许人类胚胎干细胞保持基本上未分化的状态而无需小鼠成纤维细胞“饲养层”。如本文所描述，视需要可以对这些方法进行多种修改以降低成本等。

预见到：在本文描述的确定的条件下，实质上任何多能或人类胚胎干细胞系可以分化为造血祖细胞。例如，人类胚胎干细胞系H1，H9，hES2，hES3，hES4，hES5，hES6，BG01，BG02，BG03，HSF1，HSF6，H1，H7，H9，H13B和/或H14等可以通过本文描述的方法分化为造血前体细胞。预见到：那些随后变得可以获得的干细胞系也可通过本文描述的方法分化为造血前体细胞。虽然在一些实施方式中使用人类多能细胞可能是优选的，但是在一些情况下也可使用其它多能细胞，例如，哺乳动物、小鼠、灵长类等，用于造血分化。

除了人类胚胎干细胞之外，iPS细胞也可以通过本文描述的方法来培养和/或分化为造血前体细胞。iPS细胞是重编程的体细胞，其表现为像干细胞一样(Takahashi等人，2007；Takahashi等人，2007；Nakagawa等人，2007)。如本领域技术人员将认识到，术语“多能细胞”包括天然存在的细胞，或衍生自胚泡的细胞，以及经诱导去分化为干细胞或返回至干细胞样的状态的细胞(见，例如Nakagawa等人，2007；Yu等人，2007)。

A.TeSR培养基

TeSR培养基是确定培养基，其可用于培养未分化的人类胚胎干细胞。TeSR培养基包括TeSR1培养基和mTeSR培养基。TeSR包括bFGF、LiCl、γ-氨基丁酸(GABA)、哌啶酸和TGFβ，之前已经描述了使用TeSR的多种方法，例如在美国申请2006/0084168和Ludwig等人(2006a；2006b)中，二者通过引用方式全文并入本文。

TeSR培养基通常包括无机盐、痕量矿物质、能量底物、脂、氨基酸、维生素、生长因子和蛋白质以及其它成分。TeSR1培养基的完整配方显示于下表1中。

表1.TeSR1培养基的完整配方

以上配方中的某些成分也可以被替换，例如，以便促进TeSR为了科研的应用或为了节省资金。例如，可以使用培养基mTeSR1替换TeSR1，其与TeSR1的区别在于下列方面：牛血清白蛋白(BSA)可以替换人血清白蛋白，克隆的斑马鱼碱性成纤维细胞生长因子(zbFGF)可以替换bFGF。TeSR1描述于例如Ludwig等人(2006)，该文献通过引用方式全文并入本文。

“TeSR-GF”或“mTeSR-GF”是指不含bFGF和TGF-β的TeSR培养基。“EB基础培养基”是指含有下列的培养基：补充了大约20％BIT9500(Stem Cell Technologies)或血清替代物3(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、大约1％NEAA、大约1mM L-谷氨酰胺、大约0.1mM巯基乙醇、大约0.75％BSA和大约50ug/ml抗坏血酸的IMDM。如本文使用的术语“TeSR培养基”包括TeSR1培养基、TeSR2培养基或mTeSR培养基。TeSR2培养基基本上与TeSR1培养基相同，区别在于TeSR2培养基是人源化的。TeSR1培养基、TeSR2培养基或mTeSR培养基可用于本文描述的方法中。

1.在具有减少的生长因子含量的确定培养基中预条件化

在培养和/或维持多能细胞培养物之后(例如，在包括TeSR培养基和基质成分例如Matrigel^TM或纤连蛋白的二维培养系统中)并且在造血分化之前，有利地可以将多能细胞暴露于或培养于具有减少的、基本上消除了或不含生长因子的确定培养基中，在一些实施方式中，所述培养基中可以补充TGF-β和/或FGF-2。例如，可以使用具有实质上降低水平的生长因子的TeSR培养基(例如补充大约0.1ng/mL TGF-β和大约20ng/mL FGF-2，但是不含所有其它非胰岛素生长因子)来培养或“预条件化”细胞，然后暴露于另外的生长因子，例如，以促进分化为造血细胞。

该“预条件化”培养步骤可以包括：培养多能细胞大约12小时至大约7天或更长的时间段。在一些实施方式中，预条件化步骤可以包括培养细胞大约1天至大约7天，大约1天至大约3天，或大约1，2，3，4，5，6或7天，或其中的任何范围。如以下实施方式所示，大约1天至大约3天的预条件化培养可以足够显著改善后续的多能细胞的造血分化。

用于预条件化培养中的确定培养基可以包含FGF-2和/或TGF-β。通常，预条件化培养物中补充的FGF-2和/或TGF-β的量可以少于用于维持细胞为基本上未分化状态的确定培养基中的量。在一些实施方式中，在预条件化培养过程中可以在确定培养基中加入大约10pg/mL至大约5ng/mL，或大约0.05ng/mL至大约0.5ng/mL，或其中任意范围的TGF-β。在多个实施方式中，在预条件化培养过程中可以在确定培养基中加入大约1ng/mL至大约100ng/mL、大约5ng/mL至大约50ng/mL，或大约10ng/mL至大约25ng/mL，或大约20ng/mL的FGF-2。FGF-2可以是重组产生的人或斑马鱼FGF-2。

B.基质成分

有利地，可以在用于培养和维持多能细胞为实质上或基本上未分化状态的确定培养基中加入基质成分。当在合适的半固体基质中培养时，被称作集落形成细胞(CFC)的单个祖细胞能够增殖以形成不连续的细胞簇或集落。可以进行CFC测定：将细胞悬浮液置于半固体培养基中，例如补充了营养物和细胞因子的甲基纤维素或胶原，然后在例如大约37℃温育。

可以使用多种基质成分来培养和维持多能细胞，例如hESC或iPSC。例如，可以使用胶原IV、纤连蛋白、层粘连蛋白和玻连蛋白的组合来提供用于胚胎细胞培养和维持的固体支持物，如Ludwig等人(2006)所描述，该文献通过引用方式全文并入本文。

Matrigel^TM也可用于提供用于细胞培养和维持多能细胞的基底。Matrigel^TM是由小鼠肿瘤细胞分泌的凝胶状蛋白混合物，可以通过商业途径从BD Biosciences(New Jersey，USA)获得。该混合物类似于存在于很多组织中的复杂的细胞外环境，其被细胞生物学家用作基底以培养细胞。用于在含有Matrigel^TM的确定培养基中培养和维持人类胚胎干细胞的方法描述于例如Ludwig等人(2006)，可用于在造血分化之前培养多能细胞。认识到：本发明可以使用另外的用于培养和维持人胚胎干细胞的方法，如本领域技术人员所知晓。

II.ES细胞的接种和分化

在造血分化之前，多能细胞可以部分地、基本上、或完全分离或个体化。可以以单一集落或克隆组、以分离自培养的组织的细胞簇、或者以个体化的细胞来接种多能细胞以促进造血分化。可以使用机械或酶学方法，例如将包含多能细胞的组织暴露于胰蛋白酶或TrypLE^TM而使多能细胞个体化或分离为基本上单个细胞。可以使用蛋白水解酶将细胞从培养表面上分离下来，以及使细胞自身分离。可用于个体化ES细胞以进行分化的酶包括丝氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶，以及酶的混合物，例如存在于Accutase^TM中的那些。

可以以基本上的单个(或分散的)细胞向接种培养基中加入或接种多能细胞。在一些实施方式中，以大约0.5-3x 10⁶个细胞/毫升的密度将分散的ES细胞接种进入接种培养基中的表面，例如低附着表面(lowattachment surface)。在一些实施方式中，接种培养基是确定培养基。预想到可以使用基本上任意的与标准无菌细胞培养物相容的物质作为培养表面，虽然在一些实施方式中可以有利地使用低附着表面。接种培养基可以包含TeSR培养基或mTeSR培养基、基质成分和ROCK抑制剂。

可以在含有或不含ROCK抑制剂、蛋白酶抑制剂(例如胰蛋白酶抑制剂)和/或PKC抑制剂的接种培养基中培养多能细胞或将其暴露于所述培养基，并且可以在含有一种或多种生长因子的确定培养基中在低氧空气中培养细胞。在一些实施方式中，接种培养基中可以包含大豆胰蛋白酶抑制剂(例如大约0.25mg/mL-0.5mg/ml)。接种培养基和确定培养基各自可以不含或基本上不含饲养细胞。随后可以收获进一步分化的细胞。例如，可以在接种后培养大约8天至大约12天或更长的时间，或在接种后培养大约6天至大约9天产生造血前体细胞或CD34+细胞。

任选地，在形成类胚体(EB)的过程中，在含有ROCK抑制剂的培养基中可以包含聚乙烯醇(PVA)。本发明人发现：虽然PVA不是在含有ROCK抑制剂的培养基中形成EB必需的，但是，在形成EB过程中，可以在培养基(例如不含除了降低水平的TGF-β和FGF-2之外的生长因子的TeSR培养基)中包括PVA。可以使用TrypLE^TM或其它酶促消化来实质上个体化多能细胞或将其彼此分开，然后暴露于ROCK抑制剂和/或胰蛋白酶抑制剂(和/或，任选地，PVA)并形成EB。

III.多能细胞向造血前体细胞的分化

在部分地、基本上、或完全分离或个体化多能细胞之后，可以在确定培养基中进一步培养细胞以促进造血分化。已经发现：生长因子的特定组合能够实质上促进多能细胞分化为造血前体细胞和造血细胞谱系。进一步发现：生长因子的特定组合的顺序施用可用于进一步促进多能细胞的分化。在一些实施方式中，生长因子的特定组合对于多能细胞的造血分化具有关键意义。例如，本文中显示：BMP4，VEGF，Flt3配体，IL-3和GMCSF的组合可用于促进造血分化。在一些实施方式中，本发明人发现：将细胞培养物依次暴露于含有BMP4和VEGF(和任选地，FGF-2)的第一培养基和含有Flt3配体，IL-3和GMCSF的第二培养基能够令人惊奇地增加多能细胞向造血前体细胞和造血细胞的分化。例如，如以下实施例所示，这种依次暴露引起在确定条件下在相同的时间段内产生的造血前体细胞数目大约加倍。此外，在含有BMP4和VEGF的培养基中加入FGF-2(50ng/ml)引起从多能细胞产生造血前体细胞的效率至少加倍。

可以使用确定的或非确定的条件进行多能细胞向造血前体细胞的分化。一般地将认识到：在预期把得到的细胞施用至人类受试者的实施方式中，一般优选使用确定的条件。可以在确定的条件(例如使用TeSR培养基和基质成分例如Matrigel^TM)下从多能干细胞培养造血干细胞，可以从衍生自多能细胞的类胚体产生造血细胞。在其它实施方式中，可以与OP9细胞或小鼠胚胎成纤维细胞共培养多能细胞，并随后进行分化。

可以使多能细胞形成类胚体，作为分化过程的一部分。“类胚体(EB)”或生长中的细胞的簇的形成(为了诱导分化)一般包括人类多能干细胞体外聚集为EB，并允许人类多能干细胞自发和随机分化为代表内胚层、外胚层和中胚层来源的多种组织类型。因此，三维的EB可用于产生造血细胞和内皮细胞的一些级分(fraction)。

可以使用以下程序形成EB。可以通过使用胶原酶IV(1mg/ml)在大约37℃处理大约10分钟来收获汇合的适应于在Matrigel^TM包被的平板上以无饲养细胞方式生长的未分化的hESC或iPSC。可以在温育后洗涤孔使其不含胶原酶，可以通过在EB基础培养基中刮孔来形成EB。可以在次日将培养基更换为含有不同的生长因子配方的EB分化培养基。

为了促进EB的形成，可以将细胞转移至低附着平板，在含有补充了大约20％BIT9500(Stem Cell Technologies)或血清替代物3、大约1％NEAA、大约1mM L-谷氨酰胺、大约0.1mM巯基乙醇、大约0.75％BSA和大约50ug/ml抗坏血酸的IMDM的“EB基础培养基”中过夜温育。次日，可以从每个孔中收集细胞并离心。然后可以将细胞重悬于“EB分化培养基”中，其由补充了大约50ng/ml骨形态发生因子(BMP-4)、大约50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)、大约25ng/ml干细胞因子(SCF)、大约25ng/ml Flt-3配体(Flt-3L)、大约10ng/ml白介素-3(IL-3)、大约10ng/ml白介素-6(IL-6)、大约20ng/ml粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、大约20ng/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、大约0.2U/ml红细胞生成素(EPO)、大约25ng/ml血小板生成素(TPO)和大约25ng/mlFGF-2的EB基础培养基组成。可以每4天更换该培养基：通过将EB转移进入15-mL的管并使聚集体沉降大约5分钟来进行。在一些实施方式中，EB分化培养基可以含有大约BMP4(例如大约50ng/ml)，VEGF(例如大约50ng/ml)和任选地，FGF-2(例如大约25-75ng/ml或大约50ng/ml)。可以吸出上清液并替换为新鲜的分化培养基。或者，可以每2天向细胞半喂(half fed)以新鲜的培养基。可以在分化过程中的不同时间点收获细胞。

可以使用确定培养基从多能干细胞培养造血前体细胞。使用确定培养基将多能细胞分化为CD34+造血干细胞的方法描述于例如美国申请号61/015,813，通过引用方式全文并入本文而无放弃。预想到这些方法可用于本发明。

例如，可以使用确定培养基来诱导造血CD34+分化。确定培养基可以含有生长因子BMP-4，VEGF，Flt3配体，IL-3和/或GMCSF。可以将多能细胞培养于含有BMP4，VEGF和任选地FGF-2的第一确定培养基中，然后培养于含有“Flt3配体，IL-3和GMCSF”或“Flt3配体，IL-3，IL-6和TPO”的第二培养基中。第一和第二培养基也可以含有SCF，IL-6，G-CSF，EPO，FGF-2和/或TPO中的一项或多项。实质上的低氧条件(例如小于20％O₂)可以进一步促进造血或内皮分化。

可以通过机械或酶促方式(例如使用胰蛋白酶或TrypLE^TM)使细胞实质上个体化。也可以在培养基中包括ROCK抑制剂(例如H1152或Y-27632)。预想到这些方法可以自动化进行，例如使用自动器自动化。

虽然使用确定方法用于多能细胞向造血前体细胞的分化在一些情况下可能是优选的，但是在多个实施方式中也可使用非确定方式。一种用于从人类ESC分化造血干细胞的非确定方法包括在饲养细胞例如小鼠成纤维细胞(MEF)饲养层或小鼠基质细胞系OP9上培养ESC，其诱导向CD34+的有力分化。简而言之，可以在存在生长因子的情况下在MEF上培养ESC，MEF为细胞提供基底以及可能一些营养物。与确定的条件不同，使用OP9细胞一般无需另外的生长因子来诱导CD34+分化。这些过程发生的机理仍然未完全知晓。该方法也可与一些生长因子和血清联合使用(Wang，2007)。MEF经常用于培养和维持人类ESC。可以修改那些使用小鼠胚胎成纤维细胞上的培养物的方法(例如以下程序)以包括Knockout^TM血清替代物而非FBS。

可以使用以下的非确定程序来使多能细胞分化为造血细胞。可以将H1细胞常规地维持于MEF上，然后以1x10⁵个细胞/孔(1个孔是9.6cm²)转移至αMEM+20％确定的FBS+100ng/ml TPO中的几乎汇合的OP9基质细胞上。可以在第2天和第4天向细胞喂以新鲜培养基。在第7天，可以通过使用胶原酶IV将细胞按照1∶3分传到新鲜的OP9细胞上。可以在第8天和第10天向细胞喂以新鲜培养基。在第11天，可以使用胶原酶IV处理、然后以胰蛋白酶/EDTA处理将细胞按照1∶1分传到新鲜的OP9细胞上，以得到单一细胞，然后可以将培养基更换为αMEM+10％确定的FBS+100ng/ml TPO。从第14-16天起，可以通过每日加入另外的1ml此培养基来喂养细胞。在一些实施方式中，可以按照Gaur等人，2006的描述进行涉及OP9细胞的分化方法，该文献通过引用方式全文并入本文。

IV.造血前体细胞分化为骨髓或淋巴谱系

本发明可以与多种方法一起使用以进一步使造血前体干细胞分化为细胞谱系，包括红细胞、粒细胞、巨噬细胞和巨核细胞。这些方法可以包括使用红系分化培养基(erythroid differentiation medium)、甲基纤维素和巨核细胞分化培养基。在一些实施方式中，造血祖细胞也可以分化为内皮细胞或用于产生血管。

这些细胞谱系可用于多种医学治疗和应用中。例如，红细胞谱系可用于产生血液以用于血液移植。在其它实施方式中，内皮细胞可用于产生新的血管，新的血管可用于治疗区域性贫血。或者，在一些实施方式中，可以施用根据本发明分化的造血细胞以治疗疾病，例如镰刀细胞贫血症(Hanna等人，2007)。

已经开发了体外检验系统来定量红细胞、粒细胞、单核细胞-巨噬细胞和巨核细胞骨髓细胞谱系的多潜能祖细胞和谱系限制性祖细胞。可以基于集落内的一种或多种类型的造血谱系细胞的形态学识别来分类和列举集落形成细胞(CFC)。可以通过光学显微镜或通过挑取单一集落、然后使用细胞化学和免疫细胞化学方法将细胞染色来进行原位的集落评价和列举。在CFC检验中已经使用了多种胶凝试剂，包括琼脂、琼脂糖、甲基纤维素、胶原和纤维蛋白块。

A.红系分化

造血祖细胞可以分化为红系细胞，使用例如红系分化培养基。红系分化培养基可以是无血清的或确定培养基，并且所述培养基可以含有SCF，EPO，TPO，胰岛素，地塞米松或氢化可的松和转铁蛋白(Slukvin等人，2007)。

可以使用以下程序使造血前体细胞分化为红系细胞。红系祖细胞可以这样产生：将衍生自IL-3，FLT-3，SCF和TPO的造血前体细胞置于含有氢化可的松(10-6M)、全转铁蛋白和EXCYTE的培养基中。如以下实施例所示，1x10⁶hESC能够产生2x10⁶个红系祖细胞。

B.甲基纤维素

可以使用甲基纤维素来诱导从造血祖细胞分化出红细胞、巨噬细胞和/或粒细胞。甲基纤维素是相对惰性的聚合物，其形成具有良好光学透明性的稳定凝胶。其通常以0.9％-1.2％的终浓度被用于培养基中，其中补充下列化合物，包括：胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、2-巯基乙醇、胰岛素、转铁蛋白和重组细胞因子或条件化培养基，作为集落刺激因子的来源。涉及使用甲基纤维素分化细胞的方法描述于例如Kaufman等人(2001)。

相对于其它类型的半固体基质，基于甲基纤维素的培养基允许红系谱系细胞更好地生长，从而允许在相同的培养物内检验红系、粒细胞、单核细胞和多潜能CFC。巨核细胞祖细胞适宜地培养于补充的基于胶原的培养基中，并使用免疫细胞化学染色法特异性鉴定。

C.巨核细胞分化

造血祖细胞可以进一步分化为巨核细胞。在体内，巨核细胞存在于血液骨髓中并通过多种过程或从前血小板(proplatelet)产生血小板，其形成于细胞上。人体内的巨核细胞仅代表一小部分的骨髓细胞，但其数目响应于一些疾病可以增加至多达10倍。在体内，巨核细胞通常分化自造血细胞，如下所述：原血细胞(hemacytoclast)分化巨核母细胞，然后巨核母细胞分化为前巨核细胞，然后前巨核细胞分化为巨核细胞。

可以使用多种培养基和方法使多能细胞或造血前体细胞分化为巨核细胞。例如在US 2007/0077654(其通过引用方式全文并入本文而无放弃)中描述的用于使多能细胞分化为巨核细胞的方法和培养基可用于本发明中。

在巨核细胞分化培养基中优选包含生长因子。例如，巨核细胞分化培养基可以含有下列生长因子中的1、2、3、4种或全部：FLT-3配体、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、白介素-3(IL-3)和白介素-6(IL-6)。在一些实施方式中，在巨核细胞分化培养基中可以仅包含SCF。在其它实施方式中，SCF可以与IL-3和/或IL-6中的一项或二者组合。在多个实施方式中，本发明的巨核细胞分化培养基中可以不含FLT-3配体和/或TPO。

可以通过以下程序使造血细胞分化为巨核细胞。可以通过将造血前体细胞置于含有100ng/ml TPO，SCF，FLT-3，20％BIT9500的培养基中来产生巨核细胞。如以下实施例所示，1x10⁶个hESC能够产生0.06x10⁶个巨核细胞。

巨核细胞分化培养基可用于诱导产生巨核细胞。已经描述了多种用于产生巨核细胞的产品和方法，并且可用于本发明中，例如在WO2006/050330中描述的那些。另外，Megacult^TM可以获自Stem CellTechnologies，并且可用于产生/分化巨核细胞。在多个实施方式中，可以在巨核细胞分化培养基中加入血小板生成素(TPO)、白介素3(IL-3)、白介素6(IL-6)和/或干细胞因子。用于细胞分化为巨核细胞的方法描述于例如Kaufman等人(2001)。

D.内皮细胞分化

造血细胞也可以分化为内皮细胞。例如可以使用以下的程序产生内皮细胞，以移植进入动物或人类受试者。可以将衍生自人类ES细胞的CD31+细胞培养于EGM^TM-2培养基(Lonza，Switzerland)或含有50ng/mL rhVEGF和5ng/mL rhFGF-2的分化培养基中7至10天。

为了内皮细胞的进一步扩增和分化，可以将分离的CD31+细胞培养于含有VEGF，FGF，EGF，IGF，抗坏血酸和FBS的内皮分化培养基(Lonza目录号CC3202)，或含有50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和FGF-2(例如50ng/ml斑马鱼FGF-2)的分化培养基中。可以将细胞培养2至3周。

可以使用以下程序来诱导内皮分化。为了内皮细胞的扩增和分化，可以将分离的CD34+细胞接种于EGM-2MV培养基(Cambrex)中的明胶包被的孔(1.5至2x10⁴细胞/cm²)中。也可以使用胶原I包被的孔(BDlabware)，虽然明胶通常比胶原I包被的孔便宜。可以在含有内皮生长因子、hVEGF₁₆₅(50ng/mL)和FGF-2(5ng/mL)的hESC分化培养基中培养CD34+细胞。在温育大约7-10天后，可以通过胰蛋白酶处理收获粘附细胞，并用于分析。

可以通过Matrigel塞成像来评价内皮细胞。例如，可以使用以下程序来使细胞成像：可以将衍生自hESC或iPSC的内皮细胞(EC)悬浮于Matrigel(例如大约1x10⁶细胞/毫升)，并皮下注射进入SCID Beige小鼠。然后可以在大约第14天静脉内注射入FITC葡聚糖，然后取出Matrigel塞。可以收集塞并使用荧光成像技术来成像，可以就是否存在新生血管来分析所述的塞。

E.肥大细胞的产生

造血前体细胞可以进一步分化为肥大细胞。多能细胞暴露于干细胞因子(SCF)，IL-6，IL-3，IL-4，IL-9和/或IL-10可以促进肥大细胞的分化。

在一些实施方式中，可以使用以下程序促进向肥大细胞的分化。可以通过将造血前体细胞置于含有100ng/ml TPO，SCF，FLT-3，20％BIT9500的“MK3”培养基中而使造血细胞首先分化为巨核细胞。随后可以通过在MK3扩增培养基、然后在含有50ng/ml SCF，50ng/ml IL-6的培养基中扩增前体来产生肥大细胞。

在多个实施方式中，也可以使用分化脐带血或外周血为肥大细胞的方法来促进巨核细胞的分化。例如，Schernthaner等人(2001)描述了在多个时间点使用SCF并结合IL-6或“IL-4，IL-6和IL-10”以使脐带血祖细胞分化为肥大细胞的方法。Lappalainen等人(2007)提供了通过使用加入了不同的时间段的SCF和其它细胞因子(IL-3，IL-6，IL-9和IL-4)培养细胞而使外周血分化为肥大细胞的方法。预想到这些方法任一项都可成功用于本发明。

F.巨噬细胞和树突细胞

造血前体细胞可以进一步分化为树突细胞。例如，可以将造血前体细胞置于含有200ng/ml GMCSF的培养基中8天。然后可以通过将细胞置于含有M-CSF(10ng/ml)和IL-1β(20ng/ml)的培养基中2周而使这些细胞进一步分化为巨噬细胞，或者通过将细胞置于“20ng/mlGMCSF，20ng/ml IL-4”而使其分化为树突细胞。如以下实施例所示，1x10⁶hESC能够产生大约0.2-2.5x 10⁶树突细胞和大约0.5-2.5x10⁶巨噬细胞。

V.多能细胞分化为内皮细胞

在本发明的多个实施方式中，多能细胞，例如iPSC或hESC，可以分化为内皮细胞。由于内皮细胞构成血管的一部分，所以这些细胞可以是特别有用的，例如用于筛选或测试化合物以测定该化合物对于血管或内皮细胞的效应、药理学或毒理学。内皮细胞也可用于评价或鉴定一项或多项以下性质：血管收缩或舒张、血压的控制、血液凝结(例如血栓形成或纤维蛋白溶解)、促进或减少动脉粥样硬化、血管发生、炎症和/或对屏障功能的效应(例如血脑屏障功能或化合物的转运)。内皮细胞也可用于筛选或鉴定可以促进或减少冠状动脉疾病、糖尿病、高血压或高胆固醇血症的化合物。

在一些实施方式中，可以在补充了TGF(例如大约0.1ng/ml)和FGF(例如20ng/ml)的确定培养基(例如，TeSR培养基)中预条件化多能细胞大约12-36小时或大约24小时。然后可以在汇合时收获细胞，例如使用TrypLE在大约37℃处理大约5分钟。可以将细胞收集于EB基础培养基(例如含有补充了下列物质的IMDM：大约20％BIT9500(Stem Cell Technologies)或血清替代物-3^TM、大约1％NEAA、大约1mM L-谷氨酰胺、大约0.1mM巯基乙醇、大约0.75％BSA、大约50ug/ml抗坏血酸和ROCK抑制剂，例如1μM H-1152)。然后可以将细胞培养于低附着培养表面或平板，生物反应器，或旋转瓶等。

培养大约12-24小时后，可以收集细胞并重悬于补充了BMP-4(例如50ng/ml)，VEGF(例如50ng/ml)和FGF-2(例如50ng/ml)的EB基础培养基中。可以在大约第4天将培养基至少部分更换为新鲜培养基。在EB分化的大约第7天，可以将细胞置于内皮分化培养基中，例如EGM-2MV，Lonza目录号CC3202。在一些实施方式中，内皮分化培养基包含VEGF，FGF，EGF，IGF，抗坏血酸和/或FBS中的至少1、2、3、4、5项或所有项。随后可以收集内皮细胞，例如在培养的第10天。可以使用例如MACS或FACS，使用一种或多种细胞标志物，例如CD31和/或CD105从细胞群体中实质上纯化内皮细胞的群体。如以下实施例所示，在本发明的一些实施方式中，可以成功地从iPSC或hESC产生内皮细胞。可用于鉴定或实质上纯化内皮细胞的细胞标志物包括CD31，CD105，CD144(VE-钙粘蛋白)，CD106，CD146和Z01(紧密连接蛋白)。

VI.低氧和分化

在一些实施方式中，可以使用实质上的低氧条件来促进多能细胞分化为造血祖细胞。如本领域技术人员将认识到，小于大约20.8％的空气氧含量将被认为是低氧的。培养物中的人类细胞可以在小于环境空气的氧含量的空气条件下生长。可以通过降低暴露于培养基的空气氧来实现这种相对的低氧。胚胎细胞在体内通常是在降低的氧条件下发育，一般是大约1％至大约6％的空气氧，二氧化碳为环境水平。不希望被理论所限，预想到低氧条件可以模拟某些胚胎发育条件的方面。如以下实施例所示，在一些实施方式中，可以使用低氧条件来促进多能细胞例如iPSC或hESC另外向更加分化的细胞类型例如造血前体细胞的分化。

以下低氧条件可用于促进多能细胞向造血祖细胞的分化。在一些实施方式中，小于大约20％、小于大约19％、小于大约18％、小于大约17％、小于大约16％、小于大约15％、小于大约14％、小于大约13％、小于大约12％、小于大约11％、小于大约10％、小于大约9％、小于大约8％、小于大约7％、小于大约6％、小于大约5％、大约5％、大约4％、大约3％、大约2％或大约1％的空气氧含量可用于促进向造血前体细胞的分化。在一些实施方式中，低氧空气含有大约5％的氧气。

VII.确定的培养基

如本文所述，一种或多种确定培养基可以有利地用于促进多能细胞向造血前体细胞的分化；特别地，动物产品例如血清和小鼠饲养层的消除能够降低与“细胞暴露于动物产品”相关的风险，并允许产生可以更安全地向人类受试者施用的细胞。由于传统的干细胞培养物的发展依赖于血清产品和小鼠饲养层，以使干细胞分化为多种细胞类型，所以这些传统程序具有有限的分化规模、增大的生物学差异性和潜在的污染，并且严重阻碍了ES细胞在移植治疗中的应用，要不然它们可能被证明是有用的。

特别地，本发明人发现：将多能细胞暴露于包含非常有限数目的同时或依次包含于培养基中的细胞因子(例如，BMP4，VEGF，FLT-3和IL-3，任选与GMCSF，IL-3.IL-6，TPO和/或FGF-2的组合)的确定培养基可用于促进向造血前体细胞的分化。令人惊奇地发现：虽然细胞培养基中的单独的BMP-4和单独的VEGF不促进造血分化，但是在细胞培养基加入BMP4和VEGF二者协同地促进——并且在一些实施方式中是必需的——前体细胞分化为造血细胞。在确定培养基中加入FGF-2与BMP4和VEGF能够促进多能细胞的分化；例如，如以下实验所示，在该培养基中加入FGF-2引起从多能细胞产生造血前体细胞(HPC)的效率至少加倍。

本发明人还发现：在一些实施方式中，在相同的时间段内，相对于将细胞同时暴露于所有下列细胞因子而言，将前体细胞依次暴露于第一组合“BMP4，VEGF和任选地，FGF-2”，然后暴露于“FLT-3，IL-3和GMCSF”或“FLT-3，IL-3，TPO，IL-3和IL-6”能够令人惊奇地进一步促进分化(例如向造血前体细胞的分化)。可以在暴露于“BMP4和VEGF”之后和暴露于“FLT-3和IL-3”之前使细胞再聚集，以促进或改进细胞向后续生长因子的暴露。不希望被任何理论所限，预想到该再聚集的步骤可以进一步促进细胞向造血前体细胞的分化。

培养基通常含有另外的营养物质、氨基酸、抗生素、缓冲剂等。在一些实施方式中，确定培养基含有下表1中所列的一种或多种成分。以下培养基可以含有大约25ng/ml Flt-3、大约10ng/ml IL-3和大约10ng/ml GMCSF。培养基可以含有一种或多种抗生素，虽然可以在不存在抗生素的情况下在细胞上进行分化的方法。如以下实施例所示，在IMDM培养基中加入血清替代物3能够进一步促进多能细胞的分化。

表2.IMDM确定培养基

20％BIT 9500或血清替代物3
	25-50ng/mL BMP4
25-50ng/mL VEGF
	5-25ng/ml FGF2
2mM L-谷氨酰胺
	0.1mM非必需氨基酸
450μM硫代甘油
	50μg/ml抗坏血酸
0.75％BSA

A.生长因子

多种生长因子可用于促进多能细胞向造血前体细胞的分化。在一些实施方式中，本发明的确定培养基可以含有1、2或更多种生长因子，例如“BMP-4和VEGF”或“BMP-4，VEGF，FLT-3，IL-3和GMCSF”。

可以包含于本发明的确定培养基中的生长因子包括但不限于：BMP-4，VEGF，bFGF，干细胞因子(SCF)，Flt3配体，白介素3(IL-3)，白介素6(IL-6)，白介素9(IL-9)，白介素11(IL-11)，胰岛素相关生长因子1(IGF1)，胰岛素相关生长因子2(IGF2)，红细胞生成素(EPO)，血小板生成素(TPO)，粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GMCSF或GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(GCSF或G-CSF)。本发明的确定培养基可以含有这些生长因子中的1、2、3或更多项；例如，可以在确定培养基中加入其它生长因子以增加增殖或调节细胞的分化状态。在一些实施方式中，确定培养基可以含有至少“BMP-4和VEGF，和任选地FGF-2”)或“FLT-3，IL-3和GMCSF”；在这些实施方式中，虽不必要，可以在确定培养基中加入一种或多种另外的生长因子。例如，可以在第二步分化过程中使用大约25ng/ml的TPO或SCF以替换GMCSF。可以使用多种数量的这些因子来刺激细胞应答(例如，描述于Yamamura等人，2008；Fadilah等人，2007；Bashey等人，2007中的量)。例如，可以加入大约1-50ng/mL，大约5-25ng/mL，或大约10ng/mL TPO来促进细胞扩增或细胞分化。在多个实施方式中，可以在确定培养基中加入浓度为大约5-100ng/mL、大约10-50ng/mL或大约25ng/mL的SCF。在多个实施方式中，可以在确定培养基中加入浓度为大约5-50ng/mL、大约5-25ng/mL或大约10ng/mL的IL-6。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)可用于从造血前体细胞产生粒细胞。

1.BMP-4

骨形态发生蛋白-4(BMP-4)是骨形态发生蛋白小组的成员，其是腹侧中胚层(ventral mesoderm)诱导子。BMP表达于成人骨髓(BM)中，并且对于骨的重塑和生长具有重要意义。在一些实施方式中，仅在培养的前2-3天需要加入BMP4，此后可以从系统中除掉它，对于分化没有有害影响。

BMP-4对于造血祖细胞的增殖和分化潜力的调节具有重要意义(Bhardwaj等人，2001；Bhatia等人，1999；Chadwick 2003)。另外，BMP-4能够调节人胎儿、新生儿和成人造血祖细胞中的早期造血细胞发育(Davidson and Zon，2000；Huber等人，1998；Marshall等人，2000)。例如，BMP-4能够调节来自成人和新生儿来源的高度纯化的原始的人造血细胞的增殖和分化(Bhatia等人，1999)，并且BMP-4能够促进人类胚胎干细胞中的造血分化(Chadwick，2003)。

确定培养基中加入的BMP-4的浓度可以是大约5-100ng/mL、大约20-100ng/mL、大约20-50ng/mL、大约10-30ng/mL、大约15-30ng/mL、大约20-30ng/mL或其中的任意范围。在一些实施方式中，确定培养基中加入的BMP-4的浓度可以是大约5，10，15，20，25，30，35，40，45或大约50ng/mL。

2.VEGF

血管内皮生长因子(VEGF)是重要的信号传导蛋白，其参与胚胎循环系统的形成和血管发生。VEGF能够影响多种细胞类型(包括血管内皮)和其它细胞类型(例如神经元、癌细胞、肾上皮细胞)。在体外，VEGF能够刺激内皮细胞有丝分裂发生和细胞迁移。还已经证明VEGF功能在多种疾病状态中具有重要意义，包括癌症、糖尿病、自身免疫疾病和眼睛血管疾病。

确定培养基中加入的VEGF的浓度可以是大约10-100ng/mL、大约20-100ng/mL、大约10-50ng/mL、大约15-30ng/mL、大约20-30ng/mL、大约20-50ng/mL或其中任意范围。在一些实施方式中，确定培养基中加入的VEGF的浓度可以是大约2.5，5，10，15，20，25，30，35，40，45或大约50ng/mL。

3.FGF-2

碱性成纤维细胞生长因子，也称作bFGF或FGF-2，是牵涉于多种生物学过程中的生长因子，包括肢体和神经系统发育，伤口愈合，和肿瘤生长。之前的研究已经表明bFGF不太可能影响造血细胞发育或生存(Ratajczak等人，1996.)，虽然bFGF已被用于支持人类胚胎干细胞的饲养细胞非依赖性生长(Ludwig等人，2006)。在一些实施方式中，bFGF不是诱导分化必需的；因此，在多个实施方式中，可以在本发明的培养基中加入或不加入它。

加入到确定培养基中的bFGF的浓度可以是大约5至大约100ng/mL，5至大约50ng/mL，大约5至大约25ng/mL，大约25至大约50ng/mL，或其中的任意范围。在一些实施方式中，加入到确定培养基中的bFGF的浓度是大约2.5，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70或大约75ng/mL。这些浓度对于用于将多能细胞维持在未分化或实质上未分化状态的培养基可能是特别有用的。在多个实施方式中，FG2(例如，大约100ng/ml)可用于维持多能细胞。为了促进造血分化，可以将细胞暴露于浓度为大约5-50ng/ml的FGF2。

本发明人发现：在多个实施方式中，可以在造血分化之前的“预条件化”培养期的确定培养基中加入较低浓度的bFGF。例如，可以在细胞分化为造血前体细胞之前的预条件化培养物的确定培养基中加入大约5ng/mL至大约50ng/mL，大约10ng/mL至大约30ng/mL，大约15ng/mL至大约25ng/mL，小于大约50ng/mL，小于大约40ng/mL，小于大约30ng/mL，或小于大约10，15，20，25或30ng/mL的bFGF。在一些实施方式中，在造血分化之前的多能细胞的预条件化培养物中，可以使用不含生长因子的、补充了bFGF(例如大约25-75ng/mL或大约50ng/ml)或FGF-2和0.1ng/mL TGF-β的TeSR培养基。在一些实施方式中，该预条件化步骤对于促进随后的造血分化是必不可少的。

在多能细胞经过预条件化之后(例如在不含生长因子的、补充了TGF-β和FGF-2的TeSR培养基中预条件化大约1天)之后，可以将细胞置于含有BMP4、VEGF和FGF-2(例如大约25-50ng/ml)的EB分化培养基中。如以下实施例所示，FGF-2的加入能够引起多能细胞例如hESC或iPSC向造血前体细胞的分化效率至少加倍。

设想到，在一些实施方式中，其它成纤维细胞生长因子例如酸性FGF(aFGF)，FGF4，FGF9，FGF17或FGF18可以替代bFGF或与bFGF一起加入，例如浓度为如上所述。或者，FGF-2模拟化合物可以替代FGF-2以产生实质上或基本上相同的效应。FGF-2模拟物包括FGF-2模拟肽、抗体和小分子。例如，合成的肽F2A4-K-NS模拟FGF-2的体外和体内效应(Lin等人，2006)，其可以在本发明的多个实施方式中替代FGF-2。

FG环(FGL)肽是可用于本发明的一些实施方式中的FGF-2模拟物的另一个实例。FGL是NCAM的第二F3模块的15个氨基酸的序列，其代表了NCAM与FGFR1的结合位点的一部分。已经证明FGL结合并激活FGFR1并刺激神经突的向外生长(Kiselyov等人，2003)。

BioSET F2A肽也可以替代FGF-2。BioSET F2A肽是天然人类FGF-2生长因子的合成模拟物。BioSET F2A肽和F2A4-KNS肽可以从FYI Tornier，Inc.或BioSurface Engineering Technologies，Inc.(″BioSET″)获得。设想到在本发明的多个实施方式中，FGF-2模拟化合物的组合也可以替代FGF-2。

4.IL-3

白介素-3(IL-3)是造血生长因子，其参与多潜能造血细胞的生存、增殖和分化。在5个哺乳动物物种(包括人类)中，已经分离了编码IL-3的基因并使其表达以产生成熟的重组蛋白。人类IL-3基因编码133个氨基酸的蛋白，其具有2个保守性半胱氨酸残基和2个潜在的N-连接的糖基化位点(Wagemaker等人，1990)。

在一些实施方式中，加入到本发明的培养基中的IL-3的浓度是2.5至大约50ng/mL，2.5至大约50ng/mL，大约5至大约50ng/mL，大约5至大约25ng/mL，大约5至大约15ng/mL，或其中的任意范围。在一些实施方式中，加入到确定培养基中的IL-3的浓度是大约2.5，5，10，15，20，25或大约30ng/mL。如以下实施例所示，Flt3配体和IL-3能够对多能细胞向造血前体细胞的分化显示出协同作用。在一些实施方式中，在多能细胞培养的大约前1-3周，在培养基中加入IL-3；或者在培养基中在大约第5天至大约第7天加入以促进多能细胞的分化，此后可以从系统中除掉它而对分化鲜有或基本上没有有害影响。

5.FLT3配体

Flt3配体，也称作FLT-3配体，是针对FLT3的内源配体。FLT3是由不成熟的造血祖细胞表达的受体酪氨酸激酶。针对FLT3的配体是跨膜或可溶性蛋白，其由多种细胞表达，包括造血和髓基质细胞；联同其它生长因子，Flt3配体能够刺激干细胞、骨髓和淋巴祖细胞、树突细胞和天然杀伤细胞的增殖和发育。受体的激活引起已知的参与不同的信号转导途径的多种重要接头蛋白的酪氨酸磷酸化，所述途径控制造血细胞的增殖、生存和其它过程。FLT3和影响FLT3的突变在病理疾病中也有重要意义，例如白血病的预后和治疗(Drexler等人，2004)。

在一些实施方式中，加入到本发明的培养基中的Flt3配体的浓度是5至大约100ng/mL，5至大约50ng/mL，大约10至大约30ng/mL，大约15至大约30ng/mL，大约20至大约30ng/mL，或其中的任意范围。在一些实施方式中，加入到确定培养基中的Flt3配体的浓度是大约2.5，5，10，15，20，25，30，35，40，45或大约50ng/mL。在一些实施方式中，在多能细胞培养的大约前1-3周，在培养基中加入Flt3配体；或者在培养基中在大约第5天至大约第7天加入以促进多能细胞的分化，此后可以从系统中除掉它而对分化鲜有或基本上没有有害影响。

6.粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，也缩写为GM-CSF或GMCSF，是由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的蛋白。GMCSF是能够作为白细胞生长因子发挥作用的细胞因子，并且GMCSF能够刺激干细胞以产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞和嗜碱细胞)和单核细胞。单核细胞能够脱离循环并成熟形成巨噬细胞。因此，GMCSF能够在免疫/炎症级联中发挥作用，通过该作用，少数巨噬细胞的激活能够迅速引起它们数目的增多，该过程对于对抗感染是至关重要的。在体内，GMCSF的活性形式通常以同二聚体的形式存在于细胞外。当在酵母细胞中表达时，GMCSF也被称作莫拉司亭或沙格司亭(Leukine)。在一些实施方式中，重组产生的生长因子可用于促进多能细胞的造血分化。

在一些实施方式中，加入到本发明的培养基中的GMCSF的浓度是大约2.5至大约100ng/mL，2.5至大约50ng/mL，大约5至大约50ng/mL，大约5至大约25ng/mL，大约5至大约15ng/mL，或其中的任意范围。在一些实施方式中，加入到确定培养基中的GMCSF的浓度是大约2.5，5，10，15，20，25或大约30ng/ml。在一些实施方式中，在多能细胞培养的大约前1-3周，在培养基中加入GMCSF配体；或者在培养基中在大约第5天至大约第7天加入以促进多能细胞的分化，此后可以从系统中除掉它而对分化鲜有或基本上没有有害影响。

7.干细胞因子

干细胞因子(SCF)是结合CD117(c-Kit)的细胞因子。SCF也被称作“KIT配体”、″c-kit配体″或“steel因子”。SCF以两种形式存在：细胞表面结合的SCF和可溶性(或游离)SCF。在体内，可溶性SCF通常是通过金属蛋白酶切割表面结合的SCF来产生的。SCF可能对于造血干细胞和其它造血前体细胞的生存、增殖和分化具有重要意义。在体内，SCF能够将BFU-E(爆式红系形成单位)细胞(其是红细胞系列中的最早的红细胞前体)改变为CFU-E(红系集落形成单位)。

在一些实施方式中，加入到本发明的培养基中的SCF的浓度是大约5至大约100ng/mL，5至大约50ng/mL，大约10至大约30ng/mL，大约15至大约30ng/mL，大约20至大约30ng/mL，或其中的任意范围。在一些实施方式中，加入到确定培养基中的SCF的浓度是大约2.5，5，10，15，20，25，30，35，40，45或大约50ng/mL。

8.IL-6

白介素-6(IL-6)是促炎性细胞因子。在体内，IL-6是由T细胞和巨噬细胞分泌的，并且刺激针对引起炎症的创伤或其它组织损伤的免疫应答。IL-6也可以在针对一些细菌的应答中发挥作用，在体内成骨细胞分泌IL-6以刺激破骨细胞形成。在人类中，很多血管的中膜中的平滑肌细胞能够产生IL-6作为促炎性细胞因子，并且IL-6是发烧的重要的体内介导子。

在一些实施方式中，加入到本发明的培养基中的IL-6的浓度是大约2.5至大约100ng/mL，2.5至大约50ng/mL，大约5至大约50ng/mL，大约5至大约25ng/mL，大约5至大约15ng/mL，或其中的任意范围。在一些实施方式中，加入到确定培养基中的IL-6的浓度是大约2.5，5，10，15，20，25或大约30ng/mL。

9.TPO

血小板生成素或TPO是一种糖蛋白激素，其主要在体内由肝和肾产生，并且在体内参与骨髓中的血小板生成。在一些实施方式中，加入到本发明的培养基中的TPO的浓度是大约2.5至大约100ng/mL，5至大约75ng/mL，大约10至大约50ng/mL，大约15至大约35ng/mL，25ng/ml，或其中的任意范围。在一些实施方式中，加入到确定培养基中的TPO的浓度是大约2.5，5，10，15，20，25，30，35，40，45或大约50ng/mL。

B.基质成分

培养基可以含有一种或多种基质成分，例如纤连蛋白或RGD肽。不希望被任意理论所限，基质成分可以提供用于胚胎干细胞生长的固体支持物。在一些实施方式中，基质成分可以应用至培养表面并与培养基接触，然后将细胞接种至培养基。例如，可以将细胞培养于确定培养基(例如TeSR培养基)中的包被了纤连蛋白或Matrigel^TM的平板上，然后将细胞机械分离为簇，或个体化细胞并诱导其分化为造血前体细胞。

可以使用多种基质成分来培养多能细胞，包括：胶原(例如胶原IV)、层粘连蛋白、玻连蛋白、Matrigel^TM、明胶、聚赖氨酸、血小板反应素(例如TSP-1，TSP-2，TSP-3，TSP-4和/或TSP-5)，和/或ProNectin-F^TM。在一些实施方式中，可以避免将之前使用TeSR培养的细胞与仅Matrigel^TM、胶原IV或层粘连蛋白一起使用，因为可能对细胞存活性造成不利影响；然而，这些成分可以有利地与其它基质成分组合。这些基质成分的组合可以提供用于促进细胞生长和细胞存活性的另外的益处。在一些实施方式中，可以使用1，2，3，4，5，6或更多种以上基质成分来培养细胞，例如，在造血分化之前。

1.RGD肽

RGD肽可用作确定培养基中的基质成分。RGD肽是粘附蛋白，其含有Arg-Gly-Asp(RGD)序列，并且一些RGD肽可以在细胞粘附、迁移和生长中发挥重要作用。不希望被任意理论所限，RGD肽可以为胚胎干细胞提供物理基底(类似于纤连蛋白)，以允许胚胎干细胞的分化和生长。在一些实施方式中，本发明中可以使用合成的RGD肽。

加入到确定培养基中的RGD肽的浓度可以是大约例如大约0.05-0.2mg/mL或大约0.1mg/mL。在一些实施方式中，可以使用ProNectin F来包被用于培养细胞的表面。ProNectin F(PnF)是商售的RGD肽，其通常含有13个位点的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)。

C.ROCK抑制剂和PKC抑制剂

在本发明的另一个方面，可以在ES细胞生长培养基中加入另外的培养基成分，例如减少细胞分离后的ES细胞调亡或促进细胞存活的分子(例如，在细胞群体分传或在形成EB之前)。可以使用确定培养基来接种、培养、维持或分化ES细胞，并且可以含有Rho-非依赖性激酶(ROCK)的抑制剂，和/或蛋白激酶C(PKC)的抑制剂。在一些实施方式中，ROCK抑制剂和/或PKC抑制剂可用于增强个体化之后的多能细胞的生存和分化效率。在一些实施方式中，可以在含有TeSR或mTeSR培养基和基质成分的接种培养基中加入ROCK抑制剂和/或PKC抑制剂。

在一些实施方式中，确定培养基可以含有一种或多种Rho-相关的激酶(ROCK)抑制剂，例如Y-27632或其衍生物。此外，在一些方面，确定培养基可以含有HA-100：

或其衍生物。

HA-100或Y-27632可以存在于ES细胞生长培养基中，例如，浓度为大约1-15μM，5-15μM，1-30μM，5-30μM，或大约5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30μM，或其中任何范围。在一些实施方式中，HA-100或Y-27632以大约10-20μM存在于ES细胞生长培养基中。

可以加入到根据本发明的ES细胞生长培养基中的其它ROCK抑制剂包括H-1152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]高哌嗪)。H-1152显示出比HA-100大约高10倍的效力。因此，H-1152可以以下列浓度存在于ES细胞生长培养基中：例如大约0.1-10μM，大约0.5-5μM，大约1-3μM，或大约0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，2，3，4或5μM或其中任意范围。在一些实施方式中，HA-100以大约1μM存在于ES细胞生长培养基中。H-1152允许非常有效地将个体化的人类ES细胞接种于96孔板中(类似于HA-100，但是浓度为1/10)。以细胞簇传代的个体化HES细胞则允许每个孔中更加均一的细胞密度，这是基于细胞的小分子筛选的严格先决条件。因此，H-1152可用于基于ES细胞的小分子筛选程序中，其中包括根据本发明的自动化细胞培养。之前已经描述了H-1152，见例如Ikenoya等人(2002)和Sasaki等人(2002)，通过引用方式全文并入本文。

可以加入到ES细胞生长培养基中的其它ROCK抑制剂包括Y-27632，N-(4-吡啶基)-N′-(2，4，6-三氯苯基)脲，3-(4-吡啶基)-1H-吲哚，甘氨酰-H1152((S)-(+)-2-甲基-4-甘氨酰-1-(4-甲基异喹啉基-5-磺酰基)高哌嗪)和/或HA1100(Hydroxyfausdil)。Y-27632((R)-(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺)可以从Sigma-Aldrich商购，并且已被描述(见，例如Maekawa等人，1999；Davies等人，2000)。

可用于促进细胞生存的示例性的ROCK抑制剂包括但不限于HA100，H1152，(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-1-(吡啶-4-基氨基羰基)环己烷二氢-氯化物一水合物(例如WO00078351，WO00057913)，咪唑并吡啶衍生物(例如US7348339)，取代的嘧啶和吡啶衍生物(例如US6943172)和取代的异喹啉磺酰基化合物(例如EP00187371)。

预想到PKC抑制剂可以与ROCK抑制剂联合或作为ROCK抑制剂的替代物。例如，PKC抑制剂可用于促进细胞生存，例如在多能细胞分离或个体化之后，在分化为造血前体细胞之前。可以使用的PKC抑制剂包括例如：V5肽(例如US7459424)、多粘菌素B、钙感光蛋白C、棕榈酰-DL-肉碱、硬脂酰肉碱、十六烷基磷酸胆碱、星状孢子素及其衍生物、桑吉瓦霉素；沙芬戈、D-红-鞘氨醇；氯化白屈菜赤碱、蜂毒肽；地喹氯铵；鞣花酸、HBDDE、1-O-十六烷基-2-O-甲基-外消旋-甘油、金丝桃素、K-252、NGIC-J、根皮素、四羟反式茋、柠檬酸他莫昔芬、取代的哌嗪和噻嗪(例如US6815450)。

D.其它成分

确定培养基还可以含有另外的成分，例如营养物、氨基酸、抗生素、缓冲剂等。在一些实施方式中，本发明的确定培养基可以含有非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、Pen-strep和硫代甘油。

BIT 9500(StemCell Technologies Inc.，Vancouver，Canada)也可以包含于本发明的确定培养基中，例如，其数量为大约10％至大约30％，或大约20％的量。BIT 9500含有处于Iscove’s MDM中的预测试批次的牛血清白蛋白、胰岛素和转铁蛋白(BIT)。BIT 9500含有50mg/mL牛血清白蛋白(以NaHCO₃缓冲)，50μg/mLrh胰岛素，1mg/mL人转铁蛋白(铁饱和的)。在一些实施方式中，在无需确定的培养基的实施方式中，KOSR可以替代BIT 9500。KOSR是可以商购的非确定培养基(例如购自Gibco/Invitrogen，目录号10828)，之前在WO98/30679中有描述。

如上所述的BIT可以被替换为HIT；HIT包含BIT中的成分，只不过血清白蛋白是人的成分(例如人血清白蛋白)。例如，在特别关注可能的感染风险等的实施方式中，使用HIT可能是优选的。

血清替代物3(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)也可替代BIT 9500。血清替代物3仅含有人类蛋白(即，人血清白蛋白、人转铁蛋白、人重组胰岛素)。血清替代物3不含生长因子、类固醇激素、糖皮质激素、细胞粘附因子、可检测的Ig或有丝分裂原。如以下实施例所示，在一些实施方式中，加入血清替代物3可以进一步促进分化。

在多个实施方式中，确定培养基可以含有一种或多种维生素、矿物质、盐、脂、氨基酸或其它成分。例如，本发明的确定培养基可以含有一种或多种存在于TeSR培养基中的成分，例如，以包含于TeSR中的相同或相当的浓度存在。

VIII.细胞的分离

从胚胎干细胞制备了造血(例如CD34+，CD43+)前体细胞或内皮细胞(例如CD31+)之后，可能需要从细胞群体中实质上纯化或分离那些进一步或实质上分化的细胞(例如，造血前体细胞、内皮细胞等)的一个或多个亚群体。可以使用流式细胞术例如FACS的分离方法或磁激活的细胞分选从异质细胞群体分离造血细胞。

A.磁激活的细胞分选(MACS)

可以使用磁激活的细胞分选仪(MACS)从分化的hESC分离CD34+，CD43+，CD31+和/或CD45+细胞。MACS通常使用抗体，例如抗-CD34抗体，并联合磁珠以在柱上分离细胞。在一些实施方式中，相对于FACS，MACS对于细胞可能更加柔和，并且有利地影响细胞存活性和完整性，这可能是由于FACS涉及细胞的激光照射。

多种MACS产品是商业上可获得的，包括MACS MicroBeads^TM柱或AutoMACS^TM(Miltenyi Biotec，CA，USA)，可以根据生产商的说明书来使用。PBS/0.5％BSA(无EDTA)可用作细胞分离的缓冲液。在一些实验中，Dead Cell Removal Kit(Miltenyi Biotec)可用于在分离CD34+细胞之前除掉死细胞。如果必要，可重复使用MACS柱。

R.FA

荧光激活的细胞分选(FACS)也可用于分离CD34+细胞。FACS利用细胞显示出来的程度或荧光来分离细胞，例如，由于结合至包含荧光标签的抗-CD34抗体。通过这种方式，FACS可用于从异质细胞群体中分离造血CD34+细胞。

例如，以下程序可用于进行FACS以定量造血细胞。可以在含有1％FBS或0.5％BSA的PBS中制备细胞，并在4℃以单克隆抗体(mAb)的组合标记15-30分钟，所述单克隆抗体是例如CD31-PE(克隆WM-59)，CD34-APC(克隆581，8G12)，CD45-FITC(克隆HI30)(均来自BDPharMingen)和KDR-PE(克隆89106)(R&D system)。对于特定的抗体，可以使用1∶50的稀释；对于IgG对照，可以使用1∶200的稀释。可以通过FACSCalisbur^TM(Becton-Dickson，New Jersey，U.S.A)分析样品。

IX.生物反应器和自动器自动化

用于培养干细胞和/或从胚胎干细胞分化造血祖细胞的一个或多个步骤可以自动化。使用自动器或其它自动系统的自动化过程可以允许产生、培养和分化细胞的效率更高和更经济的方法。例如，可以使用磁性分离或FACS，在人类胚胎干细胞的培养、传代、培养基的添加、分化培养基的添加、分化培养基中的培养以及细胞类型的分离的一项或多项中使用自动器自动化。

根据本发明，也可以在本发明中使用生物反应器以培养、维持和/或分化细胞(例如人类胚胎干细胞、CD34+细胞、造血细胞等)。生物反应器提供了下列优点：允许“按比例放大”某过程以产生增多数量的细胞。本发明中可以使用多种生物反应器，包括批式生物反应器、补料分批生物反应器、连续生物反应器(例如，连续搅拌槽式反应器模式)，和/或恒化器。

例如，旋转瓶可用于按比例扩大用于维持和/或分化多能细胞的方法以允许产生数目增多的细胞。在一些实施方式中，以下程序可用于促进旋转瓶中EB的形成：可以使未分化的hESC和iPSC适应于在Matrigel包被的平板上的无饲养物生长，并在汇合时收获，例如使用TrypLE在大约37℃处理大约5分钟。可以将细胞收集于含有补充了下列物质的IMDM的EB基础培养基中：大约20％BIT9500(Stem Cell Technologies)或血清替代物-3(Sigma Aldrich)，大约1％NEAA，大约1mM L-谷氨酰胺，大约0.1mM巯基乙醇，大约0.75％BSA，大约50ug/ml抗坏血酸和大约1μM ROCK抑制剂(例如H-1152)。然后可以将细胞以大约0.5-2x10⁶个细胞/ml的密度置于旋转瓶(例如125ml Corning)中。可以将旋转瓶设定为30-40rpm，过夜，以促进EB形成。或者，可以将细胞置于低附着平板中在稳定条件下持续24小时。一般认识到：细胞密度和/或旋转瓶运动速度可以根据所使用的特定旋转瓶或生物反应器而变化。培养大约12-24小时后，可以将细胞置于含有细胞因子而不含ROCK抑制剂的EB分化培养基中，置于旋转瓶中的磁性搅拌平台上，例如以大约60RPM的速度旋转。可以将旋转瓶的侧盖松开以允许进行气体交换。可以将细胞置于补充了大约50ng/ml骨形态发生因子(BMP-4)，大约50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和大约25ng/ml斑马鱼FGF-2的EB基础培养基中。在分化的大约第4天，可以通过使旋转瓶保持静止来喂养细胞，从而悬浮的EB聚集体可以沉降至瓶底15-20分钟。然后可以吸出多余的培养基(例如，允许在125mL的旋转瓶中保留大约20mL)。然后可以轻轻地使细胞漩涡，并向细胞中加入含有大约50ng/ml骨形态发生因子(BMP-4)，大约50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和大约25ng/ml斑马鱼FGF-2的新鲜培养基。可以在整个造血分化过程中将旋转瓶设定为大约40-60rpm的速度，虽然预想到可以使用实质上更高或更低的旋转速度。在分化的大约第5-6天，按照上文所述吸掉多余的培养基，并将细胞置于补充了下列物质的EB基础培养基中：例如(1)大约25ng/ml Flt-3配体，大约10mg/ml IL-3和大约10ng/ml GMCSF；或(2)大约25ng/ml Flt-3配体，大约25ng/ml SCF，大约25ng/ml TPO，大约10ng/ml IL-3和大约10ng/ml IL-6。可以按照上文所述在大约第8和10天吸掉多余的培养基。可以在分化的大约第12天收获EB培养物。可以就表面标志物(例如CD34+，CD45+，CD43+，CD41+，CD235a+，CD31+)的表型表达来染色细胞，以定量群体中造血祖细胞的量。如以下实施例所示，这些方法可成功用于产生多种细胞谱系(例如红系、巨核细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、粒细胞)，可以使用iPS细胞或hESC获得相似的结果。

特别考虑到用于本发明的自动器自动化可以获自例如Tecan(CA，USA)。自动器可以包括液体操作工具，例如穿盖探针和即抛型尖头，以使样品间的滞留最小化。在多个实施方式中，可以在用于培养细胞的一个或多个生物反应器中使用自动器(例如在hESC的维持或生长过程中，hESC向造血细胞分化过程中，或造血细胞向后续谱系例如红细胞等分化过程中)。如以下实施例所示，可以使用Tecan Cellerity^TM系统(一种工业上相关的自动器平台)将用于维持和产生造血前体细胞的条件至少部分或完全自动化。Tecan Cellerity^TM装有Tecan液体操作自动器(Freedom EVO 200)，自动化的温育器(Storex500)，其具有温育500个Roboflasks^TM的能力，培养基贮存冰箱，Cedex细胞计数器，用于扩增和接种细胞悬浮液的旋转瓶，和用于操持平板的ROMA机器臂，和8通道的固定尖头移液管。一部分、基本上所有、或所有的EB分化程序可以自动化。例如，在分化的第12天，可以通过Tecan Cellerity系统收获细胞并人工洗涤以进行标志物的细胞表面染色。染色之后，可以使用连接至Accuri流式细胞仪的Hypercyt分析细胞。该过程可用于造血前体群体的高通量筛选。在一些实施方式中，可以在自动器上培养未分化的hESC或iPSC，例如使用Matrigel^TM包被的roboflask(Corning)，通过以上描述的方法进行。可以使用例如Tecan Cellerity^TM系统使EB的维持、接种、喂养和/或收获部分或完全自动化。该自动器具有包括旋转瓶的能力，或者可以使用生物反应器来产生大量的细胞。

在一些实施方式中，使本发明的方法微型化或“按比例缩小”可能是有用的。例如，当这些方法包括化合物的高通量筛选时，这些方法可能是特别有用的，例如可以促进细胞的去分化或向特定谱系的分化。高通量筛选也可用于评价候选物质的一个或多个性质(例如毒性、促进或减少分化的能力等)。方法的微型化可以包括使用低附着平板(例如96孔板)和/或在低氧条件下培养细胞(例如，小于大约25％O₂或大约5％O₂)。在一些实施方式中，可以使用以下方法：使用不含生长因子的补充了大约0.1ng/ml TGF和大约20ng/ml斑马鱼FGF的TeSR，将适应于在Matrigel包被的平板上的无饲养物生长的未分化的hESC或iPSC预条件化24小时。可以在汇合时收获细胞，例如使用TrypLE在大约37℃处理大约5分钟。可以将细胞收集于含有补充了下列物质的IMDM的EB基础培养基中：大约20％BIT9500或血清替代物-3，大约1％NEAA，大约1mM L-谷氨酰胺，大约0.1mM巯基乙醇，大约0.75％BSA，大约50ug/ml抗坏血酸和大约1μM ROCK抑制剂(例如H-1152)。为了启动EB的形成，可以将细胞以大约0.1x10⁶个细胞/孔的密度置于低附着的96孔平板中的含有ROCK抑制剂的EB基础培养基中。预想到可以改变所使用的细胞的精确浓度以达到相似的效果。也可以通过在低O₂条件下温育平板来促进EB的形成。在大约12-24小时后，可以将细胞置于含有大约50ng/ml骨形态发生因子(BMP-4)，大约50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和大约25ng/ml斑马鱼FGF-2的EB分化培养基中。每孔可以使用大约300μl培养基，例如使用96孔板。在分化的大约第3-4天，可以通过轻轻地除掉一半体积的多余培养基(例如100-150μl)并加入等体积的新鲜培养基来半喂细胞。在分化的大约第5-6天，可以按照上文所述吸掉多余的培养基，并将细胞置于补充了下列物质的EB基础培养基中：例如(1)大约25ng/ml Flt-3配体，大约10mg/ml IL-3和大约10ng/ml GMCSF；或(2)含有大约25ng/ml Flt-3配体，大约25ng/ml SCF，大约25ng/ml TPO，大约10ng/ml IL-3和大约10ng/ml IL-6的培养基。可以按照上文所述在分化的大约第8和10天以新鲜的培养基半喂分化中的EB培养物。可以在分化的大约第12天收获EB培养物。如以下实施例所示，这些方法可成功用于产生多种细胞谱系(例如红系、巨核细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、粒细胞)，可以使用iPS细胞或hESC获得相似的结果。

可以使用自动器自动化在单细胞测验中使用本发明的方法：通过在培养基中加入ROCK抑制剂HA100和/或H1152以诱导细胞，使单个细胞粘附至平板。在自动器上，向培养系统中加入小分子HA100或H1152或Y-27632能够极大地改善多能细胞(包括ES、hESC和iPS细胞)的存活性。在一些实施方式中，可以通过加入ROCK抑制剂或PKC抑制剂(尤其是在细胞被蛋白水解或机械分离为簇或个体化之后)改善TeSR培养基中多能细胞的存活。ROCK抑制剂能够促进个体化的hES细胞附着至表面并生长。多能细胞的维持或增殖过程以及分化为造血前体细胞或特定造血谱系的一些或全部过程可以自动化。部分或全部的自动化方法可以使用确定的条件。

X.试剂盒

本发明还涉及用于本发明中的试剂盒。例如，试剂盒可以包含处于一个或多个密封瓶中的本文描述的分化培养基。试剂盒可以包括细胞，例如多能干细胞、祖细胞、造血祖细胞或内皮祖细胞。

试剂盒还可以包含用于产生祖细胞例如造血祖细胞或内皮祖细胞的说明书。或者，所述说明书可以涉及产生造血细胞、内皮细胞、肥大细胞、树突细胞、巨核细胞、粒细胞、巨噬细胞或红细胞。

合适的试剂盒包括用于本发明的多种试剂，其处于合适的容器和包装材料中，包括管、瓶和收缩包装的和吹塑的包装。适合包含于本发明的试剂盒中的物质包括但不限于：一种或多种如本文描述的确定培养基，和一种或多种细胞，其中所述细胞是多能细胞或根据本发明的方法至少部分分化的多能细胞。在一些优选的实施方式中，本发明的试剂盒中包含多个多能细胞或至少部分分化的细胞。

XI.筛选测验

本发明涉及筛选测验，例如用于就促进多能干细胞向祖细胞分化的能力来鉴定候选物质的筛选测验。例如，造血细胞、造血前体细胞和/或内皮细胞可用于评价候选物质的药理学和/或毒理学性质。因此，使用通过本发明的方法分化的细胞的筛选方法可用于鉴定治疗化合物，所述治疗化合物可以缓解与影响所述细胞的疾病相关的一个或多个症状。在其它实施方式中，分化的细胞可用于鉴定导致细胞毒性的化合物。或者，筛选方法可以包括将细胞暴露于能够促进细胞的分化或去分化的候选物质。

如本文使用的术语“候选物质”是指促进多能干细胞向祖细胞的分化的任意物质。候选物质可以包括：天然存在的化合物的片段或一部分，或者可以仅是已知化合物的活性组合，不组合的话所述已知化合物则没有活性。在一个实施方式中，候选物质是小分子。在其它实施方式中，候选物质可以包括但不限于：有机小分子、肽或其片段、肽样分子、核酸、多肽、肽模拟物、碳水化合物、脂、蛋白、酶、盐、氨基酸、维生素、基质成分、抑制剂、抗生素、抗体、抗体片段、矿物质、脂或其它有机物(含碳的)或无机分子。

XII.药物制剂

通过本文描述的方法分化的细胞或衍生自通过本文描述的方法分化的细胞的细胞可以包含于药物制剂中并向受试者例如人类患者施用。在一些实施方式中，可以通过胃肠外或静脉内方式施用药物制剂。

本发明的药物组合物包含有效量的一种或多种造血、骨髓或红系细胞或溶解于或分散于药学上可接收的载体的另外的试剂。术语“药学上或药理学上可接收的”是指：当施用至动物例如人类(视情况)时，不产生不利的、过敏性或其它不需要的反应的分子实体和成分。根据本公开，含有至少一种造血、骨髓或红系细胞或另外的活性成分的药物组合物的制剂对于本领域技术人员将是已知的，如Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy，21st Ed.，University of the Sciences inPhiladelphia所例示，该文献通过引用方式并入本文。此外，对于向动物(例如人类)的施用，将理解：制剂应该满足FDA的生物标准机构所要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。一般地，将认识到，药物制剂将通常被配制为促进存在于该制剂中的造血、骨髓或红系细胞的存活性。例如，在一些实施方式中，组合物可以含有处于溶液中的红细胞以通过静脉内方式向人类患者施用。

本发明还涉及通过向受试者施用药学上有效量的通过本文公开的方法获得的祖细胞、造血细胞或内皮细胞来治疗疾病、病症或损伤的方法。根据本发明的这些成分的施用可以通过任何常规途径进行，只要通过该途径可以到达靶组织。这包括通过系统性或胃肠外方法施用，包括静脉内注射、脊柱内注射或大脑内、真皮内、皮下、肌内或腹膜内方法。取决于治疗剂的性质，也可以通过口、鼻、含服、直肠、阴道或表面方式施用。

可以通过本文公开的方法治疗的疾病或病症包括但不限于：血管疾病或病症，免疫疾病或病症，神经元疾病或病症，血液疾病或病症，或损伤。

XIII.实施例

包括了以下实施例以说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应该认识到，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在实施本发明中效果良好的技术，因此可以被认为是构成其实施的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容将认识到，可以不脱离本发明的精神和范围对所公开的具体实施方式作出多种改变并仍然获得相同或相似的结果。

实施例1

制备EB：通过使用胶原酶IV(1mg/ml)在37℃处理10分钟，在汇合时收取适应于在Matrigel^TM包被的平板上的无饲养物生长的未分化的hESC和iPSC。在温育之后，将胶原酶从孔中洗掉，通过刮取EB基础培养基中的孔而形成EB。次日，将培养基更换为含有不同细胞因子配方的EB分化培养基。

通过使用TrypLE^TM在37℃处理6分钟，在汇合时收取适应于在Matrigel^TM包被的平板上的无饲养物生长的未分化的hESC和iPSC。使用含有1μM ROCK抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的“EB基础培养基”中和孔中的TrypLE^TM。收集细胞并在含有1μM ROCK抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中洗涤细胞。对细胞进行计数以检查存活性，并铺板于低附着平板中的含有1μMROCK抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中。次日，将培养基更换为含有不同细胞因子配方的EB分化培养基。

EB形成和分化程序：为了促进使用以上的酶的EB的形成，将细胞转移至6孔低附着平板，在含有补充了下列物质的IMDM的“EB基础培养基”中过夜温育：20％BIT9500(Stem Cell Technologies)，1％NEAA，1mM L-谷氨酰胺，0.1mM巯基乙醇(均购自Invitrogen，Carlsbad，CA)，0.75％BSA，50ug/ml抗坏血酸。次日，从每个孔中收集细胞并离心。将细胞重悬于“EB分化培养基”，其由补充了下列生长因子和细胞因子的EB基础培养基构成：50ng/ml骨形态发生因子(BMP-4)，50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)，25ng/ml干细胞因子(SCF)；25ng/ml Flt-3配体(Flt-3L)，10ng/ml白介素-3(IL-3)，10ng/ml白介素-6(IL-6)，20ng/ml粒细胞集落刺激因子(G-CSF或GCSF)；20ng/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF或GMCSF)，0.2U/ml红细胞生成素(EPO)，25ng/ml血小板生成素(TPO)(均购自R&D Systems，Minneapolis，MN)和25ng/ml斑马鱼FGF-2。每4天更换培养基：将EB转移至15-mL的管中并使聚集体沉降5分钟。吸掉上清液并替换为新鲜的分化培养基。或者，每2天向细胞半喂以新鲜的培养基。在分化过程中的不同时间点收获细胞并通过流式细胞术测定表型，使用CFU检验法测定功能能力。

流式细胞术：从每个孔/条件收集细胞并以培养基洗涤一次。使用TrypLE^TM或0.5％胰蛋白酶在37℃的温育箱中消化细胞沉淀物5-10分钟，然后以培养基洗涤并通过70-μm的细胞染色器。将细胞重悬于含有PBS-FBS的FACS缓冲液中，计数以评估细胞存活性并以荧光团缀合的单克隆抗体染色：抗-人CD43(1G10)，抗-人CD31(WM-59)，抗-人CD41(HIP8)；抗-人CD45(HI30)和抗-人CD34(581，8G12)(BDBiosciences San Jose，CA)；抗-人llk-1(89106)，(购自R&D Systems，Minneapolis，MN)。使用7-氨基放线菌素D(7-AAD，BD Biosciences)排除死亡细胞。以FACSCalibur^TM或Accuri流式细胞仪和Cell Quest软件进行活细胞的分析。

克隆形成性造血祖细胞检验(CFU检验)：使用TryplE或0.5％胰蛋白酶/EDTA将EB分散为单细胞悬浮液。定量活细胞，铺板(50,000-300,000细胞/毫升)，并在用于造血CFC的湿室中测定，使用含有下列物质的人甲基纤维素完全培养基(R&D Systems，Minneapolis，MN)：干细胞因子(SCF)50ng/mL，红细胞生成素(EPO)3U/mL，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)10ng/mL，白介素-3(IL-3)10ng/mL。14天后，根据形态对集落进行评分，定量每10⁵个铺板细胞的集落。含血清的或无血清的MethoCult^TM培养基(Stem Cell Technologies)可用于产生集落。

细胞离心涂片：根据生产商的说明书，将细胞固定并以Wright-Giemsa试剂染色(Hema 3染色；Fisher Scientific，Hampton，NH)。

实施例2

被诱导形成簇(被称作类胚体，EB)的人胚胎干细胞(hESC)或iPSC的体外聚集体允许代表内胚层、中胚层和外胚层谱系的细胞的分化。可以通过加入外源生长因子对形成EB的这种随机过程进行引导以产生造血前体细胞类型。

本发明人使用一组5种必需生长因子建立了新的无饲养物的和无血清的确定的基于EB的造血分化程序，以在分化的第9-13天产生在细胞表面表达CD43+，CD34+，CD31+和CD45+的造血前体细胞。使用2种人类hESC和4种iPSC，产生前体细胞类型的效率是5％-8％。在分化过程中使用200-1000个细胞/聚集体、低氧和再聚集步骤而形成的EB有利于造血前体细胞类型的产生。

在存在5种细胞因子的情况下，该方法能够在培养的第16-24天后有效产生在细胞表面共表达CD31，CD43和CD45的骨髓祖细胞。或者，可以分离造血前体细胞，当置于富含针对每种特定细胞谱系的专门的细胞因子的培养基制剂中时，能够进一步分化为巨核细胞、红系和骨髓谱系(例如，未成熟至成熟的多形核粒细胞、巨噬细胞、树突细胞)。

胚胎干细胞

通过在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/Ham’s F-12培养基(F12)[补充了15％KO-血清替代物(Invitrogen)，1％非必需氨基酸(NEAA)，1mM L-谷氨酰胺(均购自Invitrogen，Carlsbad，CA)，0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma-Aldrich，St.Louis)]中与辐射的鼠胚胎成纤维细胞(MEF)共培养来维持未分化的人胚胎干细胞系(hESC)和诱导的多能干细胞系(iPSC)。对于hESC，培养基中补充4ng/ml斑马鱼碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；对于iPSC，培养基中补充100ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

生长于辐射的小鼠胚胎成纤维细胞或适应于在Matrigel^TM-包被的平板上的无饲养物生长[使用MEF条件化的培养基(MEF-CM)或mTeSR培养基维持]的未分化的hESC和iPSC用作EB分化程序的起始材料。

分化之前的预条件化细胞

在分化起始之前，使用mTeSR培养基维持于Matrigel包被的平板中的hESC和iPSC进行预条件化步骤。预条件化步骤为1-3天不等。

补充了0.1ng/ml TGF-β和20ng/ml FGF-2的X-vivo 15(Cambrex)，或补充了0.1ng/ml TGF-β和20ng/ml FGF-2的不含生长因子的mTeSR(“mTeSR-GF”)用于EB分化起始之前的预条件化步骤。

收获细胞以用于形成EB

方法1：通过使用胶原酶IV(1mg/ml)在37℃处理10分钟，在汇合时收取生长于MEF上的或适应于在Matrigel包被的平板上的无饲养物生长的未分化的hESC和iPSC。在温育之后，将胶原酶从孔中洗掉，通过刮取EB基础培养基中的孔而形成EB。次日，将培养基更换为含有不同细胞因子配方的EB分化培养基。

方法2：通过使用TrypLE^TM在37℃处理6分钟，在汇合时收取适应于在Matrigel^TM包被的平板上的无饲养物生长的未分化的hESC和iPSC。使用含有1μM ROCK抑制剂(H-1152)或10μM ROCK抑制剂(Y-27632)、大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中和孔中的TrypLE^TM。收集细胞并在含有1μM-10μM ROCK抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25-0.5mg/ml)的EB基础培养基中洗涤细胞。当使用胰蛋白酶来个体化细胞时，加入大豆胰蛋白酶抑制剂。在使用TrypLE来个体化细胞的情况下，可以不加大豆胰蛋白酶抑制剂。对细胞进行计数以检查存活性，并铺板于低附着平板中的含有1μM-10μM ROCK抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25-0.5mg/ml)的EB基础培养基中。次日，将培养基更换为含有不同细胞因子配方的EB分化培养基。

EB形成和分化程序

为了促进使用以上的酶的EB的形成，将细胞转移至6孔低附着平板，在含有补充了下列物质的IMDM的mTeSR培养基或EB基础培养基中过夜温育：20％BIT9500(Stem Cell Technologies)，1％NEAA，1mM L-谷氨酰胺，0.1mM巯基乙醇(均购自Invitrogen，Carlsbad，CA)，0.75％BSA，50ug/ml抗坏血酸。次日，从每个孔中收集细胞并离心。将细胞重悬于EB分化培养基，EB分化培养基由补充了下列生长因子和细胞因子的EB基础培养基构成：50ng/ml骨形态发生因子(BMP-4)，50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)，25ng/ml干细胞因子(SCF)；25ng/mlFlt-3配体(Flt-3L)，10ng/ml白介素-3(IL-3)，10ng/ml白介素-6(IL-6)，20ng/ml粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；20ng/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，0.2U/ml红细胞生成素(EPO)，25ng/ml血小板生成素(TPO)(均购自R&D Systems，Minneapolis，MN)和25ng/ml斑马鱼FGF-2。每4天更换培养基：将EB转移至15-mL的管中并使聚集体沉降5分钟。吸掉上清液并替换为新鲜的分化培养基。或者，每2天向细胞半喂以新鲜的培养基。在分化过程中的不同时间点收获细胞并通过流式细胞术测定表型，使用CFU检验法测定功能能力。

每4天更换培养基或每48小时更换一半培养基：将EB转移至15-mL的管中并使聚集体沉降5分钟。吸掉上清液并替换为新鲜的分化培养基。

结果

在分化16天之后，相对于从维持在辐射的小鼠胚胎成纤维细胞或适应于在Matrigel^TM-包被的平板上的无饲养物生长(使用MEF条件化培养基而非mTeSR来维持)的hESC和iPSC制备而来的EB，在mTESR培养基中从hESC制备而来的适应于mTeSR的EB显示出较低的造血前体频率(＜4％)。前者的条件产生10％-15％的造血前体细胞。不希望被任何理论所限，mTeSR培养基中的高水平的TGF-β可能对多数原始干细胞/祖细胞显示出优先的生长抑制效应。

观察到：细胞因子的存在对于驱动hESC和iPSC的无血清造血分化过程是必需的。最初的细胞因子制剂包括EB分化培养基中所列的11种细胞因子。在不存在血清和细胞因子的情况下，造血前体细胞的频率是0.5％-2％；在存在血清而没有细胞因子的情况下，该频率是2％-10％。在分化16天之后，在不存在血清和存在细胞因子的情况下，造血前体细胞的频率是10％-40％。向含有细胞因子的培养基中加入血清引起前体细胞的微小增多。因此，无血清的富含细胞因子的EB分化培养基能够从维持于Matrigel包被的平板(使用mTeSR培养基维持、使用MEF-CM预条件化)上的hESC和iPSC以及维持于辐射的小鼠胚胎成纤维细胞上的hESC和iPSC产生造血前体细胞。

在EB分化16-18天的末尾，细胞的主要表型是CD45+CD43+和CD31+细胞。CFU检验揭示：存在能够产生粒细胞(例如嗜曙红细胞、嗜碱细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞)的骨髓前体。

图1显示了第50次传代(A)和第40次传代(B)时的H1ESC的造血分化。两种hESC均维持于Matrigel^TM上，使用mTeSR传代10次。在造血分化起始之前使用MEF-CM将hESC预条件化3天。使用胶原酶收获细胞，使用无血清的富含细胞因子的培养基使EB分化。在不同的时间点，通过流式细胞术分析EB细胞，以确定是否存在造血前体细胞类型(CD43，CD34，CD45，CD31和CD41)。数值代表3个单独实验的平均值SEM。

在含有数量减少的FGF-2和TGF-β的确定培养基中预条件化细胞改善了造血分化。图2显示：使适应于在Matrigel^TM上的无饲养物生长(使用mTESR)的hESC和iPSC暴露于确定的预条件化培养基增多了随后的造血分化。更具体地，使用MEFCM，或补充了0.1ng/ml TGF-β和20ng/ml FGF-2的X-vivo 15，或补充了0.1ng/ml TGF-β和20ng/mlFGF-2的mTeSR(不含生长因子)，使适应于在Matrigel^TM包被的平板上的无饲养物生长的H1hESC预条件化3天。每天更换预条件化培养基，持续3天。使用胶原酶收获细胞，通过在EB基础培养基中刮取而形成EB。在EB基础培养基中铺板后24小时，将细胞转移至含有11种细胞因子的EB分化培养基中。在分化的第12天收获细胞，通过流式细胞术定量细胞的表型。

还观察到预条件化的时间框可以短至1天，并且仍然引起造血分化的改善。补充了低水平的TGF-β(0.1ng/ml)和FGF-2(20ng/ml)的不含生长因子的mTeSR(mTeSR-GF)是优选的预条件化培养基。预料到对于使用胰蛋白酶(例如TrypLE^TM)被个体化或分离为小簇的EB而言，也将观察到预条件化的有益效应。

实施例3

从hESC和iPSC的单细胞悬浮液产生造血前体。通过胰蛋白酶消化产生单细胞悬浮液或个体化的细胞。

用于从单一细胞产生EB的方法

在存在含有0.1ng/ml TGF-β和20ng/ml FGF-2的mTesR-GF的情况下，将使用mTESR维持的适应于在Matrigel上的无饲养物生长的hESC和iPSC预条件化3天。为了启动从单一细胞的分化，使用TrypLE^TM Select(Invitrogen)处理培养物6分钟，将细胞悬浮液收集于：(1)普通EB基础培养基；(2)含有PVA的EB基础培养基；(3)含有0.5％PVA和1μM H1152或10μM Y27632ROCK抑制剂的EB基础培养基；或(4)仅含有1uM H1152ROCK抑制剂的EB基础培养基。收集细胞，洗涤一次，并于37℃铺板于各个培养基制剂中的低附着平板上。在18-24小时后，在相差显微镜下检查EB的形成状态。

表3.使用ROCK抑制剂/PVA的EB形成

造血分化所需的细胞因子

细胞因子矩阵实验程序：在存在含有0.1ng/ml TGF-β和20ng/mlFGF-2的X-vivo-15的情况下，将使用mTESR维持的适应于在Matrigel上的无饲养物生长的hESC预条件化3天。通过使用TrypLE在37℃处理6分钟来收获细胞。使用含有1μM ROCK抑制剂(H-1152)、大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中和TrypLE^TM。将细胞在含有1μM ROCK抑制剂和大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中洗涤一次。将细胞铺板于低附着平板中的含有1μM ROCK抑制剂和大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中。次日，将培养基更换为含有不同细胞因子配方的EB分化培养基。

所用的细胞因子的浓度如下：25ng/ml BMP-4，25ng/ml VEGF，25ng/ml SCF，25ng/ml Flt-3L，10ng/ml IL-3，10ng/ml IL-6，20ng/mlG-CSF；20ng/ml GM-CSF，0.2U/ml EPO，10ng/ml TPO和10ng/ml斑马鱼FGF-2。

所用的细胞因子的组合列举于下面的表3。每2天向EB培养物半喂以新鲜的分化培养基。在分化的第8、12和17天收获EB培养物。通过将所有的细胞旋下来收获EB培养物，以TrypLE^TM或0.5％胰蛋白酶消化EB。通过流式细胞术分析祖细胞类型的表型，将细胞铺板于甲基纤维素培养基以用于CFU检验。“FLT3”是指Flt3配体。

表3

基于这些不同组合的结果显示于下表4中。如下所示，评价了在生长因子的这些不图组合中培养得到的细胞以确定多种细胞表面标志物的表达。

表4.结果

在EB细胞因子混合物中的11种细胞因子中，鉴定出一组5种细胞因子(BMP4，VEGF，IL-3，Flt-3，GMCSF)对于驱动无血清造血分化程序是特别有效的或必不可少的。在这5种细胞因子中，BMP-4和VEGF似乎在EB分化过程中的所有时间点都具有重要作用，而GMCSF和IL-3似乎在EB分化的较后期阶段发挥作用。

在造血分化的每个时间点的末尾时进行了集落形成检验。CFU检验揭示：在所有的时间点，5种细胞因子的组合产生的总集落数目与11种细胞因子的混合物所产生的集落数相当。在EB分化的第12天，11种细胞因子与5种细胞因子组合的GEMM集落的频率是相当的(3-5/10⁵个细胞)。使用含有5种细胞因子的EB分化培养基成功地从hESC和iPSC产生了造血前体细胞。

含有5种细胞因子的EB分化培养基足以从hESC和iPSC产生造血前体细胞。在存在含0.1ng/ml TGF-β及20ng/ml FGF-2的mTesR-GF或X-vivo 15的情况下，将使用mTESR维持的适应于在Matrigel^TM上的无饲养物生长的hESC和iPSC预条件化3天。

确定用于造血分化的细胞因子的浓度

实验程序：在存在含有0.1ng/ml TGF-β及20ng/ml FGF-2的mTeSR-GF的情况下，将使用mTESR维持的适应于在Matrigel上的无饲养物生长的hESC预条件化3天。通过使用TrypLE^TM在37℃处理6分钟来收获细胞。使用含有1μM ROCK抑制剂和大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中和TrypLE^TM。将细胞在含有1μMROCK抑制剂(H-1152)和大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中洗涤一次。将细胞铺板于低附着平板中的含有1μM ROCK抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中，细胞密度为1,000,000个细胞/ml。次日，将培养基更换为含有不同浓度的5种细胞因子的EB基础培养基。所用的细胞因子的浓度如下：BMP-4，VEGF，SCF，FLT-3配体为50-25ng/ml；IL-3，GM-CSF为10-20ng/ml。

每2天以新鲜的分化培养基半喂EB培养物。在分化的第9和12天收获EB培养物。通过将所有的细胞旋下来收获EB培养物，并以TrypLE^TM或0.5％胰蛋白酶消化EB。通过流式细胞术分析祖细胞类型的表型，并将细胞铺板于甲基纤维素培养基中以进行CFU检验。

结果(5种细胞因子剂量矩阵)

结果表明：驱动产生造血前体细胞的5种必需细胞因子的大约的最适剂量是25ng/ml的BMP4，VEGF和Flt-3配体，和10ng/ml IL-3和GMCSF。细胞因子的这种组合能够产生造血前体，在EB分化的第12天所述造血前体产生多潜能的GEMM集落(3-5/10⁵个细胞)。

EB培养物的再聚集增强造血发生

通过在分化程序中加入再聚集步骤进一步优化无血清的12天EB分化程序。

实验程序：在存在含有0.1ng/ml TGF及20ng/ml FGF-2的mTeSR-GF的情况下，将使用mTESR维持的适应于在Matrigel上的无饲养物生长的hESC预条件化2天。通过使用TrypLE在37℃处理6分钟来收获细胞。使用含有1μM ROCK抑制剂的EB基础培养基中和TrypLE^TM。将细胞在含有1μM ROCK抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中洗涤一次。将细胞铺板于低附着平板中的含有1μM ROCK抑制剂(H-1152)和大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中12-24小时。

次日，将培养基更换为含有25ng/ml的BMP-4和VEGF的EB基础培养基。使细胞在第一组细胞因子中分化4、5或6天。以这2种细胞因子首先处理之后，将EB培养物暴露于IL-3/GMCSF/FLT-3配体中4、5或6天。在第一组细胞因子转变为另一组的过程中，使用TrypLE^TM消化一组EB，并允许其在第二培养基中再聚集，而另一组细胞置于第二培养基中、不进行分离步骤。在整个分化过程中，每2天以新鲜的分化培养基半喂EB培养物。在EB分化的第9、10、11和14天收获EB培养物。在实验的末尾，通过将所有的细胞旋下来收获EB培养物，并以TrypLE^TM或0.5％胰蛋白酶消化EB。通过流式细胞术分析祖细胞类型的表型，并将细胞铺板于甲基纤维素中以进行CFU检验。

结果

EB培养物的部分再聚集增强了造血分化。在存在BMP4和VEGF下先培养4-5天之后加入IL-3/Flt3配体/GMCSF再培养7-8天，产生了最大数目的表达CD43+，CD34+，CD45+和CD31+的造血前体(＞10％)。

集落形成检验的结果类似于通过流式细胞术分析获得的数据。首先在存在BMP4和VEGF下培养EB培养物4-5天、然后加入IL-3/FLT3配体/GMCSF再培养7-8天显示出最多的集落形成单元。在再聚集步骤之后，总CFU值从＞100上升至高达250。携带集落的GEMM的频率从3-5/10⁵升高至15-20/10⁵个细胞。

实施例4

EB的大小能够影响造血分化

在存在含有0.1ng/ml TGF-β及20ng/ml FGF-2的mTeSR-GF的情况下，将使用mTESR维持的适应于在Matrigel上的无饲养物生长的hESC预条件化2天。通过使用TrypLE在37℃处理6分钟来收获细胞。使用含有10μM Y-27632ROCK抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中和TrypLE^TM。将细胞在含有1μMROCK抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中洗涤一次。

确定活细胞的计数，根据生产商的说明书，将所需数目的细胞置于AggreWell^TM平板的每个孔中：铺板1.2x10⁵个细胞以产生100个细胞的EB聚集体；铺板2.4x10⁵个细胞以产生200个细胞的EB聚集体；铺板6x 10⁵个细胞以产生500个细胞的EB聚集体；铺板1.2x10⁶个细胞以产生1000个细胞的EB聚集体；铺板2.4x10⁶个细胞以产生2000个细胞的EB聚集体；铺板3.6x10⁶个细胞以产生2000个细胞的EB聚集体；铺板4.8x10⁶个细胞以产生2000个细胞的EB聚集体。

将细胞铺板于AggreWell^TM(根据生产商的说明书)中的含有1μMROCK抑制剂(H-1152)，大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中18-24小时以允许形成EB。将细胞转移至低附着平板并照相以测定使用各种细胞数目形成的EB的大小。

在含有5种细胞因子(BMP4/VEGF/IL-3/FLT-3配体/GMCSF)的培养基中分化EB培养物。每2天以含有全部5种细胞因子的新鲜的分化培养基半喂EB培养物。在分化的第11天收获EB培养物。在实验的末尾，通过将所有的细胞旋下来收获EB培养物，并以TrypLE^TM或0.5％胰蛋白酶消化EB。通过流式细胞术定量CD43值。如图3所示，观察到EB大小与CD43表达之间的关联。

在AggreWell^TM平板(Stem cell technologies，根据生产商的说明书)中在EB基础培养基中培养18-24小时，形成了含有确定细胞数目的H1hESC聚集体。然后将细胞转移至低附着平板并使用显微镜上的刻度尺记录由不同细胞数目产生的EB大小(单位为μM)。在分化起始之前，定量构成EB的细胞数目和EB的聚集体大小。在存在BMP4/VEGF/IL-3/Flt-3配体/GMCSF的情况下使EB培养物分化11天。在实验的末尾，通过使用TrypLE^TM将EB个体化而收获EB培养物，通过流式细胞术定量CD43值。

结果

用于造血分化的最佳细胞数目是200-1000个细胞/聚集体，其为100-250μm。更多的细胞数目的聚集体(＞2000)(大于1000μm)不促进造血前体细胞的产生。

实施例5

低氧条件增强造血分化

在存在含有0.1ng/ml TGF-β及20ng/ml FGF-2的mTeSR-GF的情况下，将使用mTeSR维持的适应于在Matrigel上的无饲养物生长的H1hESC预条件化2天。通过使用TrypLE^TM收获细胞，并以1x10⁶细胞/ml的细胞密度铺板于低附着平板中的含有1μM ROCK抑制剂(H-1152)和大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中12-24小时。

在含有5种细胞因子(BMP4/VEGF/IL-3/FLT-3配体/GMCSF)的培养基中分化EB培养物。每2天以含有全部5种细胞因子的新鲜的分化培养基半喂EB培养物。在分化的第8、12和16天收获EB培养物而不进行再聚集步骤。在实验的末尾，通过将所有的细胞旋下来收获EB培养物，并以TrypLE^TM或0.5％胰蛋白酶消化EB。通过流式细胞术定量与造血发生相关的多种表面标志物的表型表达。

结果

与高氧条件相比，在低氧条件下，EB培养物产生较高百分率的表达CD43，CD31，CD45，CD34的细胞。在EB分化8天之后该效应更为显著。在两种条件下，细胞的总数目是相当的。

使用补充了0.1ng/ml TGF-β和20ng/ml FGF-2的mTeSR-GF将适应于在matrigel包被的平板上的无饲养物生长的H1hESC预条件化2天，在存在ROCK抑制剂的情况下使用TrypLE^TM收获细胞。将EB转移至低氧(5％O₂)和高氧(20％O₂)条件下的含有VEGF，BMP4，IL-3，GMCSF和Flt-3配体的EB分化培养基中。在分化的第8、11和16天收获细胞，通过流式细胞术定量细胞的表型。

产生造血前体的效率

在存在含有0.1ng/ml TGF及20ng/ml FGF-2的mTeSR-GF的情况下，将使用mTeSR^TM维持的适应于在Matrigel^TM上的无饲养物生长的H1hESC和iPSC预条件化2天。使用TrypLE^TM收获细胞。估计活细胞计数并将细胞以1x10⁶细胞/ml的密度铺板。

将细胞铺板于低附着平板中的含有1μM ROCK抑制剂(H-1152)和大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中24小时。通过两步分化过程诱导EB培养物分化。将培养物置于低氧条件下的含有BMP4和VEGF的培养基中4天。在分化的第5天使用TrypLE使EB培养物再聚集，并置于低氧条件下的含有(1)IL-3，Flt-3配体，GMCSF；(2)IL-3，Flt-3配体，SCF；或(3)IL-3，Flt-3配体，TPO的第二分化培养基中，再培养7天。每2天以新鲜的分化培养基半喂EB培养物。在分化的第12天收获EB培养物。在实验的末尾，通过将所有的细胞旋下来收获EB培养物，并以TrypLE^TM或0.5％胰蛋白酶消化EB。估计实验末尾的总的活细胞计数。通过流式细胞术定量与造血发生相关的多种表面标志物的表型表达。定量造血前体细胞(CD43+/CD34+)的百分比和绝对数目。由此，通过将最初的细胞计数除以分化实验末尾产生的造血前体的数目来确定产生造血前体细胞的效率。

结果：观察到使用两步EB分化程序从hESC和iPSC产生造血前体群体的效率是5％-8％。结果显示于图5。

实施例6

发现使用上述EB分化程序产生的造血前体细胞能够产生红系前体、巨核细胞、巨噬细胞、单核细胞和树突细胞。具体地，在存在含有0.1ng/ml TGF及20ng/ml FGF-2的mTeSR-GF的情况下，将使用mTESR维持的适应于在Matrigel上的无饲养物生长的H1hESC和iPSC预条件化2天。使用TrypLE收获细胞。对于所有的细胞系，估计活细胞计数。

将细胞以1x10⁶细胞/ml的细胞密度铺板于低附着平板中的含有1μM ROCK抑制剂(H-1152)和大豆胰蛋白酶抑制剂(0.25mg/ml)的EB基础培养基中24小时。通过两步分化过程诱导EB培养物分化。将培养物置于含有BMP4和VEGF的培养基中4天。在分化的第5天使用TrypLE使EB培养物再聚集，并置于含有(1)IL-3，Flt-3配体，GMCSF；(2)IL-3，Flt-3配体，SCF；或(3)IL-3，FLT-3，TPO的第二分化培养基中，再培养7天。每2天以新鲜的分化培养基半喂EB培养物。整个12天的分化都在低氧条件下进行。在分化的第12天收获EB培养物。在实验的末尾，通过将所有的细胞旋下来收获EB培养物，并以TrypLE^TM或0.5％胰蛋白酶消化EB。在实验末尾估计总的活细胞计数。1,000,000个hESC能够产生80,000个造血前体细胞。

将衍生自IL-3，FLT-3GMCSF组(1)的前体置于含有200ng/mlGMCSF的培养基中8天。这些细胞进一步分化为：(1)通过将细胞置于含有M-CSF(10ng/ml)和IL-1β(20ng/ml)的培养基中2周而分化为巨噬细胞；或(2)通过将细胞置于含有20ng/ml GMCSF和20ng/ml IL-4的培养基中而分化为树突细胞。1,000,000个hESC能够产生200,000个树突细胞。所有的谱系分化实验都在非低氧(～20％)浓度下进行。

通过将衍生自IL-3，Flt-3配体，SCF组(2)的前体细胞置于含有100ng/ml TPO，SCF，FLT-3，20％BIT9500的MK3培养基中来产生巨核细胞。通过在MK3扩增培养基中、随后在含有5ng/ml SCF，5ng/mlIL-6的培养基中扩增前体来产生肥大细胞。1,000,000个hESC能够产生60,000-1,200,000个巨核细胞。在非低氧(～20％)浓度下进行谱系分化实验。

通过将衍生自IL-3，FLT-3SCF TPO的前体置于含有氢化可的松(10-6M)、全转铁蛋白、ExCyte的培养基中而产生红系祖细胞。在正常氧(～20％氧)条件下进行谱系分化实验。人AB血清的补充和低氧条件增大了红系祖细胞的产率。这些方法用于将1,000,000个hESC扩增为培养物中大约100,000,000个成红血球细胞。

使用旋转瓶按比例扩大EB分化程序

在分化之前首先将细胞预条件化。使用补充了0.1ng/ml TGF和20ng/ml斑马鱼FGF的无生长因子的TeSR将适应于在Matrigel包被的平板上的无饲养物生长的未分化的hESC和iPSC分别预条件化24小时。

通过使用TrypLE^TM在37℃处理5分钟而在汇合时收获细胞。将细胞收集于含有补充了下列物质的IMDM的EB基础培养基中：20％BIT9500(Stem Cell Technologies)或血清替代物3(Sigma Aldrich)，1％NEAA，1mM L-谷氨酰胺，0.1mM巯基乙醇(均购自Invitrogen，Carlsbad，CA)，0.75％BSA，50ug/ml抗坏血酸和1μM ROCK抑制剂(H-1152)。

然后将细胞以500,000-2,000,000个细胞/ml的密度置于125mlCorning旋转瓶中。将旋转瓶设定为30-40rpm，过夜，以促进EB形成。或者，可以将细胞置于低附着corning瓶中在稳定条件下持续24小时(在低附着平板中)。在细胞培养的前12-24小时之后，观察到改善的细胞存活。12-24小时之后，将细胞置于含有细胞因子而不含ROCK抑制剂的EB分化培养基中，置于旋转瓶中的磁性搅拌平台上，以大约60RPM的速度旋转。当把旋转瓶维持于25-30RPM下12-24小时，产生EB，然后增加至40-60进行随后的分化。将旋转瓶的侧盖松开以允许进行气体交换。将细胞置于补充了50ng/ml骨形态发生因子(BMP-4)，50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和25ng/ml斑马鱼FGF-2的EB基础培养基中。

在分化的第4天，可以通过使细胞培养橱中的旋转瓶保持静止来喂养细胞，从而允许悬浮的EB聚集体沉降至瓶底15-20分钟。然后吸出多余的培养基(允许在125mL的旋转瓶中保留大约20mL)。然后轻轻地使细胞漩涡，并向细胞加入含有50ng/ml骨形态发生因子(BMP-4)，50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和25ng/ml斑马鱼FGF-2的新鲜培养基。在整个造血分化过程中将旋转瓶设定为60rpm的速度。

在分化的第5-6天，按照上文所述吸掉多余的培养基，并将细胞置于补充了下列物质的EB基础培养基中：例如(1)25ng/ml Flt-3配体，10mg/ml IL-3和10ng/ml GMCSF；或(2)25ng/ml Flt-3配体，25ng/mlSCF，25ng/ml TPO，10ng/ml IL-3和10ng/ml IL-6。按照上文所述在第8和10天吸掉多余的培养基。

在分化的大约第12天收获EB培养物。在分析的末尾定量总细胞数。就表面标志物(CD34+，CD45+，CD43+，CD41+，CD235a+，CD31+)的表型表达来染色细胞，以定量群体中造血祖细胞的量。表5总结了使用H1ES细胞以不同的细胞密度产生的旋转瓶数据。使用iPS细胞获得了类似的结果。图6中显示了在旋转瓶中进行的EB分化过程的示意图和所获得的结果。造血祖细胞能够产生属于不同谱系的多种细胞类型，包括成红血球细胞、巨核细胞、树突细胞、肥大细胞、粒细胞和巨噬细胞。

实施例7

使用96孔平板微型化EB分化

使用不含生长因子但补充了0.1ng/ml TGF和20ng/ml斑马鱼FGF的TeSR，将适应于在Matrigel包被的平板上的无饲养物生长的未分化的hESC或iPSC分别预条件化24小时。通过使用TrypLE在37℃处理5分钟而在汇合时收获细胞，将细胞收集于含有补充了下列物质的IMDM的EB基础培养基中：20％BIT9500(Stem Cell Technologies)或血清替代物-3(Sigma Aldrich)，1％NEAA，1mM L-谷氨酰胺，0.1mM巯基乙醇(均购自Invitrogen，Carlsbad，CA)，0.75％BSA，50μg/ml抗坏血酸和1μM ROCK抑制剂(例如H-1152)。

将细胞以0.1x10⁶个细胞/孔的密度置于低附着的96孔平板中的含有ROCK抑制剂的EB基础培养基中。通过在低氧(5％O₂)条件下温育铺板的细胞来促进EB的形成。在12-24小时后，将细胞置于含有50ng/ml骨形态发生因子(BMP-4)、50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和25ng/ml斑马鱼FGF-2的EB分化培养基中。96孔板的每孔使用大约300μl培养基。

在分化的第3-4天，通过轻轻地除掉一半体积的多余培养基(100-150μl)并向细胞加入等体积的含有50ng/ml骨形态发生因子(BMP-4)、50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和25ng/ml斑马鱼FGF-2的新鲜培养基来半喂细胞。

在分化的第5-6天，按照上文所述吸掉多余的培养基，并将细胞置于补充了下列物质的EB基础培养基中：(1)25ng/ml Flt-3配体，10mg/ml IL-3和10ng/ml GMCSF；或(2)含有25ng/ml Flt-3配体，25ng/ml SCF，25ng/ml TPO，10ng/ml IL-3和10ng/ml IL-6的培养基。按照上文所述在分化的第8和10天以新鲜的培养基半喂分化中的EB培养物。

在分化的第12天收获EB培养物。在分析的末尾定量总细胞数。就表面标志物(CD34+，CD45+，CD43+，CD41+，CD235a+，CD31+)的表型表达来染色细胞，以定量群体中造血祖细胞的量。使用H1ES细胞产生的数据总结于图7。使用iPS细胞获得了类似的结果。

如图7所示，将100,000个细胞铺板于低附着的96孔平板中。在低氧(5％O2)条件下在存在细胞因子BMP4/VEGF/FGF的情况下使细胞先分化4-5天，然后在低氧(5％O2)条件下在存在细胞因子SCF/FLt-3/TPO/IL-3/IL-6的情况下再分化7-8天。在分化12天后收获细胞，通过流式细胞术定量HPC。

实施例8

自动器上的自动化

使用Tecan Cellerity系统(一种工业上相关的自动器平台)维持和产生造血前体细胞的条件。基于实施例8中使用的程序，在分化的第12天通过Tecan Cellerity系统收获细胞并人工洗涤以进行标志物的细胞表面染色。染色之后，使用连接于Accuri流式细胞仪的Hypercyt分析细胞。

实施例9

从多能细胞产生内皮细胞

使用补充了0.1ng/ml TGF-β和20ng/ml斑马鱼FGF-2的无生长因子的TeSR将适应于在Matrigel包被的平板上的无饲养物生长的未分化的hESC和iPSC分别预条件化24小时。通过使用TrypLE在37℃处理5分钟而在汇合时收获细胞。将细胞收集于含有补充了下列物质的IMDM的EB基础培养基中：20％BIT9500(Stem Cell Technologies)或血清替代物-3(Sigma Aldrich)，1％NEAA，1mM L-谷氨酰胺，0.1mM巯基乙醇(均购自Invitrogen，Carlsbad，CA)，0.75％BSA，50μg/ml抗坏血酸和1μM ROCK抑制剂(H-1152)。将细胞以1-2x10⁶个细胞/ml的密度置于低附着平板中以促进EB的形成。

为了诱导EB的分化，使用以下程序。在12-24小时后，从平板中收集细胞，并以1000rpm离心5分钟使细胞旋下来。将细胞重悬于补充了50ng/ml骨形态发生因子(BMP-4)，50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)，和50ng/ml斑马鱼FGF-2的EB基础培养基中。

在EB分化的第4天，通过倾斜平板使细胞沉降。吸掉一半的上清液，并替换为分别含有50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和50ng/ml斑马鱼FGF-2的新鲜的分化培养基。

在EB分化的第7天，将EB培养物置于含有VEGF，FGF，EGF，IGF，抗坏血酸和FBS的内皮分化培养基(Lonza目录号CC3202，Basel，Switzerland)中；或含有50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)和50ng/ml斑马鱼FGF-2的新鲜分化培养基中。

在分化的第10天就内皮细胞的存在分析细胞。将细胞收集于锥形管中并离心。使用TrypLE^TM select或0.5％胰蛋白酶在37℃消化细胞沉淀物5分钟。将细胞重悬于含有PBS-FBS的FACS缓冲液中，计数细胞并确定存活状态。以荧光团缀合的单克隆抗体染色细胞：抗-人CD31(WM-59)和抗-人CD105。使用碘化丙啶(50μg/ml)排除死的细胞。在FACSCalibur^TM或Accuri^TM流式细胞仪上进行活细胞的分析。图8显示了在EB分化的第10天CD31+细胞的产生。

内皮细胞的纯化：将EB分散为单细胞悬浮液，并根据生产商的说明书，使用抗-CD31微珠(Milenyi目录号130-091-935)进行纯化。得到的群体经磁性分选后产生“CD31+CD105+”内皮细胞的纯化的群体。就乙酰化LDL的摄取、von Willebrand因子的表达测试内皮细胞，并进行matrigel管形成检验。matrigel管形成检验表明成功产生了衍生自iPSC的内皮细胞。

实施例10

在EB分化培养基中加入FGF-2能够增大造血前体细胞分化的效率

在以下条件下分别评价hESC和iPSC的分化。在补充了0.1ng/mlTGF-β和20ng/ml FGF-2而不含生长因子的TeSR中将细胞预条件化1天。在补充了1μM ROCK抑制剂的EB基础培养基(补充了20％BIT-9500，0.75％BSA，50μg/ml抗坏血酸，谷氨酰胺，NEAA和0.1mM硫代甘油的IMDM)中产生EB，细胞密度为1x10⁶个细胞/ml。

12-24小时后，将细胞置于下列修改的EB分化培养基中的一种之中：(A)25ng/ml BMP4，25ng/ml VEGF，0ng/ml FGF-2；(B)25ng/mlBMP4，25ng/ml VEGF，10ng/ml FGF-2；(C)50ng/ml BMP4，50ng/mlVEGF，25ng/ml FGF-2。在整个分化过程中每4天半喂EB培养物。在分化的第4-5天使EB培养物部分再聚集。然后将EB培养物置于含有25ng/ml Flt-3配体，10ng/ml IL-3和10ng/ml GMCSF的培养基中。在整个分化过程中每4天半喂EB培养物。

在分化的第12天收获EB培养物，定量CD34，CD43，CD45，CD31，CD41和CD235a(Gly-a)的表达百分率。通过将EB分化第12天时的CD34+/CD43+双阳性细胞的绝对数目除以ES/iPS细胞的起始数目而确定HPC的产生效率。

结果：在EB1分化培养基中补充FGF-2使iPSC(iPS-SONL)的分化效率升高6％至12％，使hESC(H1ES细胞)的分化效率升高8％至21％。图9总结了在hESC(H1)和iPSC(SONL)细胞系中通过补充FGF而实现的效率的增加。图10显示了在修改的EB1分化培养基(含有50ng/ml BMP4，50ng/ml VEGF和25ng/ml FGF-2)中各种iPS细胞系的总体分化。

实施例11

在EB分化培养基中加入TPO，IL-6和IL-3

在补充了0.1ng/ml TGF-β和20ng/ml FGF-2而不含生长因子的TeSR中将hESC和iPSC分别预条件化1天。然后，通过在在补充了1μM ROCK抑制剂(H-1152)的EB基础培养基(补充了20％BIT-9500，0.75％BSA，50μg/ml抗坏血酸，谷氨酰胺，NEAA和0.1mM硫代甘油的IMDM)中培养细胞来产生EB，细胞密度为1-2x10⁶个细胞/ml。12-24小时后，将细胞置于补充了50ng/ml BMP4，50ng/ml VEGF，25ng/mlFGF-2的EB基础培养基中。在整个分化过程中每4天半喂EB培养物。在分化的第4-5天使EB培养物部分再聚集。

然后将EB培养物培养于第二EB培养基(“EB2”)中，其为补充了下列的EB基础培养基：(A)25ng/ml Flt-3配体，10ng/ml GMCSF，10ng/ml IL-3；(B)100ng/ml Flt-3配体，100ng/ml SCF，100ng/ml TPO，10ng/ml IL-3，10ng/ml IL-6；(C)50ng/ml Flt-3配体，50ng/ml SCF，50ng/ml TPO，10ng/ml IL-3，10ng/ml IL-6；或(D)25ng/ml Flt-3配体，25ng/ml SCF，25ng/ml TPO，10ng/ml IL-3，10ng/ml IL-6。

在整个分化过程中每4天半喂EB培养物，在分化的第12天收获EB培养物。定量表达CD34，CD43，CD45，CD31，CD41和CD235a(Gly-a)中的每一种细胞的百分率。通过将EB分化第12天时的CD34+/CD43+双阳性细胞的绝对数目除以ES/iPS细胞的起始数目而确定造血前体细胞(HPC)的产生效率。

结果：在EB2培养基中补充TPO、IL-6和SCF进一步使iPS-SONL的产生HPC的效率升高15％-55％，使H1ES细胞的产生效率升高21％-28％。如图11所示，使用以上修改的EB2培养基，观察到了hESC(H1)和iPS(SONL)细胞系向HPC分化的增加。图12显示了使用修改的EB2组合(D)，(H1)和iPS(SONL)细胞系的效率的增大。观察到在分化过程中，作为血清替代品，血清替代物3(Sigma)优于BIT-9500。

实施例12

分化培养基条件中的低氧和正常氧含量的评价

在存在5％O₂(低氧)和20％O₂(正常氧)的条件下将适应于在Matrigel包被的平板上的物饲养物生长(使用mTeSR)的未分化的hESC和iPSC维持至少5个传代。

在以下条件下评价EB的分化：

(A)在正常氧条件下维持未分化的细胞并且在正常氧条件下使EB分化12天(“N-N”)；

(B)在正常氧条件下维持未分化的细胞并且在低氧条件下使EB分化12天(“N-H”)；

(C)在低氧条件下维持未分化的细胞并且在正常氧条件下使EB分化12天(“H-N”)；

(D)在低氧条件下维持未分化的细胞并且在低氧条件下使EB分化12天(“H-H”)。

在补充了0.1ng/ml TGF-β和20ng/ml FGF-2而不含生长因子的TeSR中将细胞预条件化1天。12-24小时后，将细胞置于上述实施例中描述的修改的EB基础培养基中：含有50ng/ml BMP4，50ng/ml VEGF，25ng/ml FGF-2，细胞密度为1x10⁶个细胞/ml。在整个分化过程中每4天半喂EB培养物。在分化的第4-5天使EB培养物部分再聚集。然后在补充了25ng/ml Flt-3配体，25ng/ml SCF，25ng/ml TPO，10ng/mlIL-3，10ng/ml IL-6的EB基础培养基中进一步培养EB培养物。在整个分化过程中每4天半喂EB培养物。

在分化的第12天收获EB培养物，定量表达CD34，CD43，CD45，CD31，CD41和CD235a(Gly-a)中的每一种的细胞的百分率。通过将EB分化第12天时的CD34+/CD43+双阳性细胞的绝对数目除以ES/iPS细胞的起始数目而确定HPC的产生效率。

结果：图13显示了在正常氧和低氧条件下从iPS细胞产生HPC。在低氧以及正常氧条件下进行EB分化。当在低氧条件下进行EB分化时，观察到较高的HPC水平。在低氧条件下维持未分化的ES/iPS细胞未对分化过程带来任何显著益处。在正常氧条件下，表达血型糖蛋白A的细胞减少。

＊＊＊

根据本文公开内容，可以进行并实施本文公开和要求保护的所有的方法和组合物而无需过量实验。虽然已经通过优选实施方式描述了本发明的组合物和方法，但是，对本领域技术人员显而易见的是，可以不脱离本发明的概念、精神和范围而对本文描述的方法和组合物以及本文描述的方法的步骤以及步骤的顺序进行改变。更具体地，显而易见的是，化学和生理上相关某些试剂可以替换本文描述的试剂，但仍然实现相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有此类相似的替代物和修饰均被认为是在如随附的权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。

参考文献

通过引用方式将以下参考文献特别并入本文，如同它们提供示例性的程序或其它详细内容以补充本文所示那些内容的程度。

美国专利6,815,450

美国专利6,943,172

美国专利7,348,339

美国专利7,459,424

美国公开61/015,813

美国专利申请号2006/0084168

美国专利申请号2007/0077654

Bashey等人Transfusion，47(11)：2153-2160，2007.

Bhardwaj等人，Nat.Immunol.，2：172-180，2001.

Bhatia等人，J.Exp.Med.，189：1139-1148，1999.

Chadwick等人，Blood，102(3)：906-915，2003.

Davidson and Zon，Curr.Top Dev.Biol.，50：45-60，2000.

Davies等人，Structure，8(2)：185-195，2000.

Drexler等人，Growth Factors，22(2)：71-3，2004.

EP 00187371

Fadilah等人，Stem Cells Dev.，16(5)：849-856，2007.

Gaur等人，J.Thromb.Haemost.，4(2)：436-42，2006.

Hanna et al Science 318(5858)：1920-1923，2007.

Huber等人，Blood，92：4128-4137，1998.

Ikenoya，等人，J.Neurochem.，81：9，2002.

Kadaja-Saarepuu等人，2007

Kaufman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98：19，2001.

Kiselyov等人，Structure，11(6)：691-701，2003.

Lappalainen等人，Clin.Experim.Allergy，37：1404-1414，2007.

Lin等人，Int.J.Mol.Med.17：833-839，2006

Ludwig等人，Nature Biotech.，(2)：185-187，2006a.

Ludwig等人，Nature Methods，3(8)：637-646，2006b.

Maekawa等人，Science，285(5429)：895-8，1999.

Marshall等人，Blood，96：1591-1593，2000.

Nakagawa等人Nat.Biotechnol.，26(1)：101-106，2007.

PCT申请号WO 0005/7913

PCT申请号WO 0007/8351

PCT申请号WO 0098/30679

PCT申请号WO 2006/050330

Peng等人，Cell Biology International，32(10)：1265-1271，2008.

Ratajczak等人，Br.J.Haematol.，93(4)：772-782，1996.

Remington：The Science and Practice of Pharmacy，21st Ed.，University of the Sciences in Philadelphia

Sasaki等人；Pharmacol.Ther.，93：225，2002.

Schernthaner等人，Blood，98：3784-3792，2001.

Slukvin等人In：Directed Production of Specific Blood Lineagesfrom Human Embryonic Stem Cells，#33，ASCI/AAP Joint Meet.Posters，2007.

Takahashi等人，Cell，131(5)：861-872，2007.

Takahashi等人，Nat.Protoc.，2(12)：3081-3089，2007.

Vodyanik等人，Blood，108(6)：2095-105，2006.

Wagemaker等人，Biotherapy，2(4)：337-345，1990.

Wang等人，Nature Biotech.，25(3)：317-318，2007.

Yamamura等人，Stem Cells，26(2)：543-9，2008.

Yu等人Science，318(5858)：1917-1920，2007.

Claims

1.用于将多能细胞分化为造血前体细胞或内皮细胞的方法，包括以下连续步骤：

(a)在含有至少一种生长因子的第一确定培养基中培养或维持多个实质上未分化的多能细胞；

(b)在不含或基本上不含BMP4、VEGF、IL-3、Flt3配体和GMCSF的第二确定培养基中温育细胞；

(c)在含有足以扩增多个细胞或促进其分化的量的BMP4和VEGF的第三确定培养基中培养细胞；和

(d)在含有足以扩增多个细胞或促进其分化的量的(1)IL-3和Flt3配体或(2)VEGF、FGF-2或FGF-2模拟物和IGF的第四确定培养基中培养细胞；

其中多个多能细胞分化为造血前体细胞或内皮细胞。

2.权利要求1的方法，其中所述第三确定培养基还包含FGF-2或FGF-2模拟物。

3.权利要求1的方法，其中所述第四确定培养基包含IL-3、Flt3配体和GMCSF。

4.权利要求1的方法，其中所述第四确定培养基包含IL-3、Flt3配体和下列的至少一项：IL-6、SCF或TPO。

5.权利要求4的方法，其中所述第四确定培养基还包含IL-6、SCF和TPO。

6.权利要求5的方法，其中所述第四确定培养基还包含血清替代物3。

7.权利要求6的方法，其中所述多能细胞是iPSC。

8.权利要求1的方法，其中在步骤(b)之前，至少部分分离或实质上个体化至少一些细胞。

9.权利要求8的方法，其中使用酶使细胞实质上个体化。

10.权利要求9的方法，其中所述酶是胰蛋白酶。

11.权利要求10的方法，其中在所述个体化之后将细胞与ROCK抑制剂和胰蛋白酶抑制剂接触。

12.权利要求11的方法，其中所述ROCK抑制剂选自HA-100、H-1152和Y-27632。

13.权利要求11的方法，其中所述胰蛋白酶抑制剂是大豆胰蛋白酶抑制剂。

14.权利要求1的方法，其中多个多能细胞形成类胚体(EB)。

15.权利要求14的方法，其中使用大约200至大约1000个细胞/聚集体以形成至少一个所述EB。

16.权利要求1的方法，其中所述方法包括在小于20％氧气的气压下培养细胞。

17.权利要求16的方法，其中所述方法包括在大约5％氧气的气压下培养细胞。

18.权利要求1的方法，其中所述细胞至少一次部分或实质上再聚集。

19.权利要求18的方法，其中在第三确定培养基中培养之后并且在第四确定培养基中培养之前或之时使所述细胞再聚集。

20.权利要求18的方法，其中所述再聚集包括将所述细胞暴露于胰蛋白酶或TRYPLE。

21.权利要求18的方法，其中所述细胞在再聚集之后暴露于ROCK抑制剂。

22.权利要求18的方法，其中在再聚集之后在基本上不含ROCK抑制剂的培养基中培养所述细胞。

23.权利要求18的方法，其中该方法还包括在小于大约20％氧气的气压下培养细胞，并且其中大约200至大约1000个细胞/聚集体用于形成多个类胚体(EB)。

24.权利要求1的方法，其中所述第三确定培养基或第四确定培养基包含血清替代物3。

25.权利要求1的方法，其中所述第一确定培养基包括TeSR、mTeSR或mTeSR1。

26.权利要求25的方法，其中步骤(a)包括在基质包被的表面上培养细胞。

27.权利要求26的方法，其中基质包括层粘连蛋白、玻连蛋白、明胶、聚赖氨酸、血小板反应素或Matrigel^TM。

28.权利要求1的方法，其中所述第二确定培养基包括TeSR-GF或X-vivo15培养基。

29.权利要求28的方法，其中所述第二确定培养基还含有大约0.1ng/ml TGF-β和大约20ng/ml FGF-2。

30.权利要求1的方法，其中步骤(b)包括温育细胞大约12小时至大约3天的时间段。

31.权利要求1的方法，其中步骤(c)包括培养或分化细胞大约4天至大约8天的时间段。

32.权利要求1的方法，其中步骤(d)包括培养细胞至少4天的时间段。

33.权利要求32的方法，其中多个多能细胞分化为骨髓祖细胞。

34.权利要求33的方法，其中骨髓祖细胞共表达CD31、CD43和CD45。

35.权利要求1的方法，其中所述第三确定培养基包含大约10-50ng/ml BMP4和大约10-50ng/ml VEGF。

36.权利要求35的方法，其中所述第三确定培养基还包含大约10-50ng/ml FGF-2。

37.权利要求1的方法，其中所述第四确定培养基包含大约5-25ng/ml IL-3和大约10-50ng/ml Flt3配体。

38.权利要求37的方法，其中所述第四确定培养基还包含大约5-25ng/ml GMCSF。

39.权利要求37的方法，其中所述第四确定培养基还包含大约10-100ng/ml TPO，10-100ng/ml SCF，大约5-25ng/ml IL-6，和大约5-25ng/ml IL-3。

40.权利要求1的方法，其中多个造血前体细胞表达选自包含CD43、CD34、CD31和CD45的列表的至少两种细胞标志物。

41.权利要求40的方法，其中多个造血前体细胞表达CD34、CD43、CD45和CD31。

42.权利要求1的方法，其中一个或多个造血前体细胞分化为红系细胞、骨髓细胞或淋巴样细胞。

43.权利要求42的方法，其中一个或多个造血前体细胞分化为骨髓细胞，其中骨髓细胞选自巨噬细胞、肥大细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞和多形核粒细胞。

44.权利要求43的方法，其中一个或多个造血前体细胞分化为选自下列的粒细胞：嗜曙红细胞、嗜碱细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。

45.权利要求1的方法，其中所述方法包括在含有选自IL-3、IL-6、SCF、EPO和TPO的一种或多种生长因子的第五确定培养基中培养多个所述细胞，所述生长因子的量为足以促进多个细胞向成红血球细胞的分化。

46.权利要求1的方法，其中所述方法还包括在第五确定培养基中培养多个所述细胞，其中第五确定培养基含有选自SCF，IL-6，G-CSF，EPO，TPO，FGF2，IL-7，IL-11，IL-9，IL-13，IL-2或M-CSF的一种或多种生长因子，所述生长因子的量为足以促进所述细胞的扩增或进一步分化。

47.权利要求1的方法，其中在含有选自IL-7、SCF和IL-2的一种或多种生长因子的第五确定培养基中培养多个细胞，所述生长因子的量为足以促进细胞向NK细胞的分化。

48.权利要求43的方法，其中所述方法还包括在含有Fc嵌合NotchDLL-1配体和选自IL-7、SCF和IL-2的一种或多种生长因子的第五确定培养基中培养多个细胞，它们的量为足以促进细胞向T细胞的分化。

49.权利要求1的方法，其中所述多个细胞是哺乳动物多能细胞。

50.权利要求49的方法，其中所述哺乳动物多能细胞是人类多能细胞。

51.权利要求50的方法，其中所述人类多能细胞是人类胚胎干细胞(hESC)。

52.权利要求51的方法，其中所述hESC包括选自H1、H9、hES2、hES3、hES4、hES5、hES6、BG01、BG02、BG03、HSF1、HSF6、H1、H7、H9、H13B和H14的细胞。

53.权利要求50的方法，其中所述人类多能细胞是诱导的多能细胞(iPSC)。

54.权利要求53的方法，其中所述iPSC选自iPS6.1，iPS 6.6，iPS，iPS 5.6，iPS iPS 5.12，iPS 5.2.15，iPS iPS 5.2.24，iPS 5.2.20，iPS 6.2.1，iPS-Bl-SONL，iPS-Bl-SOCK，iPS-TiPS 1EE，iPS-TiPS IB，iPS-KiPS-5和iPS 5/3-4.3。

55.通过权利要求1的方法分化的或衍生自根据权利要求1的方法分化的单独的造血前体细胞的造血前体细胞。

56.权利要求55的造血前体细胞，其中所述造血前体细胞表达选自包含CD34、CD43、CD45和CD31的列表中的至少两种细胞标志物。

57.权利要求56的方法，其中所述造血前体细胞表达CD34、CD43、CD45和CD31。

58.衍生自根据权利要求1的方法分化的造血前体细胞的细胞，其中该细胞是骨髓细胞或常见的骨髓祖细胞。

59.权利要求58的方法，其中所述细胞选自单核细胞、巨噬细胞、、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱细胞、嗜曙红细胞、红细胞、巨核细胞、血小板和树突细胞。

60.权利要求59的方法，其中所述细胞是红细胞。

61.权利要求58的细胞，其中所述骨髓细胞包含于药物制剂中。

62.衍生自根据权利要求1的方法分化的造血前体细胞的淋巴样细胞。

63.权利要求62的淋巴样细胞，其中所述淋巴样细胞是T-细胞、B-细胞或自然杀伤细胞。

64.权利要求62的淋巴样细胞，其中所述淋巴样细胞包含于药物制剂中。

65.根据权利要求1的方法分化的内皮细胞。

66.权利要求65的内皮细胞，其中所述内皮细胞是淋巴内皮细胞、血管内皮细胞、动脉血管内皮细胞、静脉血管内皮细胞或器官特异性内皮细胞。