KR101640694B1

KR101640694B1 - 독소생산능 시험용 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR101640694B1
Application number: KR1020147011026A
Authority: KR
Inventors: 에릭 아서 존슨; 사빈 펠렛; 레지나 클레어 메이어 화이트마시; 윌리암 하워드 텝
Original assignee: 셀스냅, 엘엘씨
Priority date: 2011-09-29
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2016-07-18
Also published as: EP2761065B1; RU2616281C2; SG11201401007SA; EP2761065A4; IL231768A0; PL2761065T3; CN103958747B; BR112014007717B1; HUE037509T2; LT2761065T; MX2014003874A; US9217172B2; WO2013049508A1; CA2850531C; KR20140086981A; CN103958747A; HK1199911A1; EP2761065A1; MX348188B; HRP20171937T1

Abstract

본 발명은 작용제 시험용 조성물 및 방법 (예컨대, 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 검출 및 분석)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 작용제 검출 및 분석을 위한 인간 유도성 만능 줄기 (hiPS) 유래 세포의 용도에 관한 것이다.

Description

독소생산능 시험용 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR TOXIGENICITY TESTING}

본 출원은 2011년 9월 29일 출원된 미국 가출원 번호 61/540,693을 우선권 주장하며, 상기 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 작용제 시험용 조성물 및 방법 (예컨대, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 신경독소 (BoNT) 검출 및 분석)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 작용제 검출 및 분석을 위한 인간 유도성 만능 줄기 (hiPS) 유래 세포의 용도에 관한 것이다.

토양에 사는 그람 양성 박테리움 클로스트리디움 보툴리눔에 의해 합성되는 보툴리눔 신경독소 (BoNT)는 인류에게 알려져 있는 독성 물질 중 가장 독성이 크고, 신경마비성 질환 보툴리눔독소증(botulism)의 병인이다 (문헌 [Johnson E (2005) in Topley and Wilson's microbiology and microbial infections, ed S. P. Borriello, P. R. Murray,and G.Funke (Hodder Arnold, London, United Kingdom), pp 1035-1088]). A부터 G까지로 지정된, BoNT의 면역학상 상이한 7가지의 혈청형이 기술된 바 있다 (문헌 [Gimenez DF & Gimenez JA (1995) Int J Food Microbiol 27:1-9]). BoNT는 초기에는 ~150 kDa의 단일 쇄 폴리펩티드로서 합성되지만, 번역 후 단백질분해성 절단을 통해 이황화 결합에 의해 연결된, ~100 kDa 및 ~50 kDa의 중쇄 및 경쇄 (HC 및 LC)가 생성된다. HC는 기능에 따라 HC_C 및 HC_N 서브-도메인으로 추가로 분류된다. HC_C 도메인은 특이적 뉴런 세포 표면 수용체를 인식하고 그에 결합함으로써 세포내이입을 유도하는 역할을 담당하는 반면, HC_N 도메인은 세포내이입된 소포체 막에서의 채널 형성 및 엔도솜 막을 가로지르는 LC의 전위 및 내재화를 담당한다 (문헌 [Montecucco et al., (2004) Trends Microbiol 12:442-446]; [Fischer A & Montal M (2007) J Biol Chem 282:29604-29611]; [Fischer A et al., (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106:1330-1335]). 전위 동안, 이황화 결합은 절단되고, LC는 세포 시토졸로 방출되고, 아연-의존성 엔도펩티다제로서 활성 효소 성분으로 리폴딩된다 (문헌 [Fischer et al., 상기 문헌 동일]; [Fischer A & Montal M (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104:10447-10452]). 이어서, LC는 시냅스전 소포체에서 세포내 SNARE 단백질을 특이적으로 표적화하고 절단하여, 신경전달물질의 방출 억제를 유도한다. 각 BoNT 혈청형은 상이한 절단 표적을 갖는데, BoNT/A 및 E는 상이한 별개의 부위에서 SNAP-25를 절단하고, BoNT/B, D, F, 및 G는 상이한 부위에서 VAMP/시냅토브레빈을 절단하고, BoNT/C는 SNAP-25 및 신탁신 둘 모두를 절단한다 (문헌 [Montecucco C & Schiavo G (1994) Mol Microbiol 13: 1-8]에서 검토됨).

천연적으로 발생된 보툴리눔독소증은 드물지만, 중증 질환이고, 미국에서는 매년 ~110건의 사례가 발생하며, 치사율은 ~5-10%이다 (문헌 [Johnson EA & Montecucco C (2008) in Handbook of Clinical Neurology, ed Andrew G. Engel (Elsevier, pp 333-368]). BoNT는 그의 효력이 극도로 크고 (BoNT/A의 인간 치사량 예측치는 체중 1 kg당 1 ng (문헌 [Bossi P, et al., (2006) Cell Mol Life Sci 63: 2196-2212])), 질환 보툴리눔독소증은 중증이며, 사례를 치료하는 데, 특히 대규모일 때, 많은 비용이 드는 바, BoNT는 카테고리 A 설렉트 에이전트(Select Agent)로서 분류되었으며, 이는 생물테러 무기로서 심각한 위협이 된다 (문헌 [Arnon SS, et al., (2001) JAMA 285: 1059-1070]).

BoNT/A, 및 그보다는 정도가 훨씬 더 작지만, BoNT/B 또한 다양한 신경근 장애를 치료하는 데 및 화장품에서 독특하고 중요한 제약으로서 사용되고 있다. 미 식품의약국(Food and Drug Administration)에 의해 BoNT 사용 승인을 받은 조건은 미용 치료, 및 다양한 근육 강직증 장애를 일시적으로 완화시키는 것을 포함한다 (문헌 [Chaddock JA & Acharya K (2011) FEBSJ 278:899-904]). BoNT의 미용학적 적용 및 임상 적용은 증가하고 있으며, 임상 시험, 정확한 효능 측정, 및 중화 항체 스크리닝이 필요한 제약용의 신규한 BoNT 제제가 개발되고 있다. 예를 들어, BoNT는 통증 장애, 수의근 근력, 국소성 근긴장 이상, 예를 들어 자궁경부, 두개 근긴장 이상, 및 양성 본태성 안검연축, 편측 얼굴 연축, 및 국소성 강직증, 위장관 장애, 다한증, 및 미용상 주름 보정, 안검연축, 경구 하악 근긴장 이상, 개구형, 폐구형, 이갈이, 메이지 증후군, 혀 근긴장 이상, 안검 행위상실증, 개자궁경부 근긴장 이상, 전굴, 목후굴, 측경, 사경, 인두 근긴장 이상, 후두 근긴장 이상, 연축성 발성 장애/내전형, 연축성 발성 장애/외전형, 연축성 호흡 곤란, 사지 근긴장 이상, 상지 근긴장 이상, 업무별 특수 근긴장 이상, 필기 경련, 음악가 경련, 골퍼 경련, 하지 근긴장 이상, 대퇴 내전, 대퇴 외전, 슬관절 굴곡, 슬관절 신전, 발목 굴곡, 발목 신전, 첨내번족, 족부 변형 근긴장 이상, 굽혀진 발가락, 발가락 굴곡, 발가락 신전, 축성 근긴장 이상, 피사 증후군, 벨리 댄서 근긴장 이상, 분절성 근긴장 이상, 반신성 근긴장 이상, 전신성 근긴장 이상, 루박병에서의 근긴장 이상, 피질기저 퇴행에서의 근긴장 이상, 루박병에서의 근긴장 이상, 지연성 근긴장 이상, 척수소뇌성 실조증에서의 근긴장 이상, 파킨슨병에서의 근긴장 이상, 헌팅톤병에서의 근긴장 이상, 할러포르텐-스파츠 병에서의 근긴장 이상, 도파-유도성 운동이상증/도파-유도성 근긴장 이상, 지연성 운동이상증/지연성 근긴장 이상, 발작성 운동이상증/근긴장 이상, 운동유발 비-운동유발 작용-유도성 구개 간대성 근경련증, 간대성 근경련증 근파동, 경축, 양성 근육 경련, 유전성 턱 진전병, 역설 턱 근육 활성, 반측저작 연축, 비대성 인두 근육병증, 교근 비대, 전경골 비대, 안진, 진동시 핵상 주시 마비, 지속성 부분적 간질, 연축성 사경 수술 계획, 외전근 성대 마비, 난치성 변성 장애, 상부 식도 괄약근 기능장애, 성대 주름 육아종, 간헐성 뚜렛 증후군(stuttering Gilles de la Tourette syndrome), 중이 간대성 근경련증, 보호 후두 폐쇄, 후두절제술후 발성 장애, 보호 안검하수증, 안검내반 오디 괄약근 기능장애, 가성이완불능증, 비이완불능증, 식도 운동 장애, 질경련, 수술 후 고정 떨림, 방광 기능장애, 배뇨근 괄약근 협동장애, 방광 괄약근 연축, 편측 얼굴 연축, 신경재분포 운동이상증, 미용 용도의 눈가 주름(claw's feet), 찌푸린 모양의 얼굴 비대칭, 턱끝 오목, 전신근 강직 증후군, 파상풍 전립선 비대증, 지방과다증, 유아성 뇌성마비 사시 치료, 혼합형 마비 수반 증상, 망막 박리 수술 후, 백내장 수술 후, 수정체결여증 근육염성 사시, 근육병증성 사시, 해리 수직 편위, 사시 수술에 대한 보조약으로서, 내사시, 외사시, 이완불능증, 항문 열창, 외분비샘 활동항진, 프라이 증후군(Frey syndrome), 악어 눈물 증후군, 다한증, 액와 손발바닥 비루, 뇌졸중에서의 상대적인 과다침분비, 파킨슨병에서, 근위축성 측삭 경화증에서, 강직성 병태, 뇌염 및 척수염 자가면역 과정에서, 다발성 경화증, 횡단 척수염, 데빅 증후군(Devic syndrome), 바이러스 감염, 박테리아 감염, 기생충 감염, 진균 감염, 유전성 강직성 반신마비 뇌졸중후 증후군 반구 경색증에서, 뇌간 경색증, 척수 경색증, 중추 신경계 외상에서, 반구 병변, 뇌간 병변, 척수 병변, 중추 신경계 출혈에서, 뇌내 출혈, 거미막하 출혈, 경막하 출혈, 척수내 출혈, 신생물에서, 반구 종양, 뇌간 종양, 및 척수 종양 치료를 위해 제약학상 투여된다. 따라서, 환경에서, 식품에서, 제약 제제에서, 항체 검출을 위해, 및 연구 적용에서 BoNT 활성의 정량적 및 신뢰성 있는 검출은 보툴리눔독소증 예방, 테러 방지 대책 뿐만 아니라, 신약 개발, 및 환자의 안전 및 질 관리 및 제품 보증 시험 둘 모두에 있어서 중요하다.

다수의 BoNT 검출 방법이 공개되어 있으며, 이는 하기와 같이 4가지 일반 카테고리로 분류될 수 있다 (문헌 [reviewed in Cai et al., (2007) Crit Rev Microbiol 33: 109-125]): 1. 홀로톡신의 존재 여부는 면역학적으로 검출하지만, 활성 또는 불활성 상태 사이를 구별하지는 못하는 시험관내 검정 (ELISA); 2. 독소 LC의 효소 활성은 검출하지만, 활성 홀로톡신과 오직 LC인 것만은 구별하지 못하는 엔도펩티다제 검정; 3. 생체내 검정 (마우스 생물검정); 및 마지막으로 4. 생체내 모의 검정, 예컨대 편측 횡경막 검정, 국소 주사 검정, 및 1차 또는 무한증식 세포를 사용하는 세포 기반 검정. 완전하게 활성인 BoNT를 검출하기 위해, 검출 검정은 중독 과정의 모든 단계 (예컨대, HC의 세포 표면 수용체에의 결합, 세포내이입, 소포체 채널 형성, 이황화 결합 절단, LC의 세포 시토졸 내로의 이동, 및 마지막으로 SNARE 단백질의 단백질분해성 절단)를 측정하여야 한다. 오직 마우스 생물검정 및 생체내 모의 검정만이 이들 단계 모두를 측정한다. 마우스 생물검정은 상이한 희석률의 BoNT 희석액을 정맥내로 또는 복강내로 마우스에 주사한 후, 보툴리눔독소증 중독의 증상 (사지 마비, 호흡 곤란, 털 세움 등) (문헌 [Hatheway CL (1988) in Laboratory diagnosis of infectious diseases : principles and practice, eds Balows A, Hausler WH, Ohashi M & Turano MA (Springer-Verlag, New York), pp 111-133]; [Schantz EJaK, D.A. (1978) Journal of the Association of Official Analytical Chemists 61 : 96-99]) 및 최종적으로는 사망에 대해 관찰하는 것을 포함한다. 비록 MBA는 정량적인 것이고, 중독의 모든 단계를 모니터링할 수는 있지만, 오류율이 높고, 실험실 사이에서, 또는 실험실 내에서 표준화되지 않으며, 다수의 동물, 및 상응하는 설비 및 숙련된 스텝을 필요로 한다. 편측 횡경막 및 국소 주사 검정은 동물의 고통을 감소시키고, 일부는 충분한 감도를 가지지만, 여전히 다수의 동물과 숙련된 스텝을 필요로 한다.

상기 검정에 관한 상기와 같이 명확하게 확인된 단점은 FDA 및 USDA를 포함하는 규제 기관으로부터의, 특이적이고, 감도를 가지며, 정량적인, MBA에 대한 대안을 제공하는 세포 기반 모델 개발에 관한 권고를 조장하였다 (문헌 [National Institute of Environmental Health Sciences, 2008]). 독성 시험을 위해 neuro-2a 및 PC-12를 포함하는, 다양한 연속 세포주가 사용되어 왔는데, 이는 MBA와 경쟁하기에는 감도가 충분하지 않다. 래트, 마우스, 또는 닭으로부터 유래된 1차 뉴런, 및 마우스 배아 줄기 세포로부터 유래된 뉴런은 감도가 유의적으로 더 크다 (문헌 [Hall YH, et al., (2004) J Immunol Methods 288: 55-60]; [Keller JE, Cai F & Neale EA (2004) Biochemistry 43: 526-532]; [Lalli G, et al., (1999) J Cell Sci 112 (Pt 16): 2715-2724]; [Neale et al., (1999) J Cell Biol 147: 1249-1260]; [Stahl AM, et al., (2007) J Biomol Screen 12: 370-377]). 기술된 독성 시험 및 항체 검출에 대하여 감도가 가장 큰 세포 유형은 1차 래트 척수 세포 (RSC) 검정 (문헌 [Pellett et al., (2007) FEBS Lett 581 : 4803-4808])으로, 이는 MBA보다 감도가 더 크고, 재현가능하며, 마우스 생물검정과 우수한 상관 관계가 있다 (문헌 [Pellett et al., (2010) J Pharmacol Toxicol Methods]). 추가로, 배아 줄기 세포로부터 유래된 뉴런 또한 감도가 큰 것으로 밝혀졌다 (문헌 [McNutt et al., (2011) Biochem Biophys Res Commun 405: 85-90; Pellett S, et al., (2011) Biochem Biophys Res Commun 404: 388-392]; [Kiris E, et al., (2011) Stem Cell Res]). 그러나, RSC 검정은 계속해서 새로운 세포 배치 제조를 필요로 하기 때문에, 세포 제조를 위해 여전히 일부 동물 및 숙련된 스텝 사용을 필요로 하고, 시험 표준화에 쉽게 적응하지 못한다.

발명의 개요

본 발명의 실시양태는 연구, 스크리닝, 임상 및 치료학적 적용에서 사용하기 위한 뉴런 세포 (예컨대, 인간 (예컨대, iPS 유래)의 것)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 BoNT, 및 BoNT에 대한 중화 항체를 검출 및 분석하는 데 사용된다. 예시적인 실시양태는 본원 하기에 기술된다. 추가의 실시양태는 본원에 기술되어 있고, 당업자의 지식 범위 내에 포함되어 있다.

예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 인간 유도성 만능 줄기 세포 (hiPS) 유래 뉴런 세포를, NT를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 b) NT를 생물학적 활성에 대하여 검정하는 단계를 포함하는, 클로스트리디움 종 (예컨대, 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT))을 활성에 대하여 검정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 클로스트리디움 종은 클로스트리디움 보툴리눔, 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum), 또는 클로스트리디움 바라티(Clostridium baratii)이다. 일부 실시양태에서, BoNT는 혈청형 A, B, C, D, E, F, 및 G를 포함하는, 7가지의 공지된 혈청형 모두, 및 각 혈청형 내의 공지된 서브타입을 포함한다. 일부 실시양태에서, NT는 재조합, 돌연변이체 또는 키메라 NT이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 활성은 SNAP-25, VAMP 또는 신탁신의 절단이다. 일부 실시양태에서, 검정은 정성적인 반면, 다른 것은 정량적이다. 일부 실시양태에서, NT는 정제된 것인 반면, 다른 것은 복합체, 용액 또는 매트릭스 형태이다. 일부 실시양태에서, NT는 재조합인 것이다. 일부 실시양태에서, NT는 치료 방식, 마커, 영상화제, 효소, 수용체, 항체, 또는 생체활성 화합물로부터 선택되는 또 다른 분자와 접합된다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 hPS 유래 뉴런 세포를 접촉시키기 전, NT를 시험 화합물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 시험 화합물은 NT의 항체 (예컨대, 중화 항체) 또는 소형 분자 억제제이다. 일부 실시양태에서, 중화 항체는 정제된 것이거나, 또는 혈청 또는 항독소 샘플 중에 존재한다.

본 발명은 a) 인간 유도성 만능 줄기 (hiPS) 유래 뉴런 세포를, a) NT; 및 b) 중화 항체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 b) NT를 생물학적 활성에 대하여 검정하는 단계를 포함하는, 클로스트리디움 종 신경독소 (예컨대, BoNT)를 활성에 대하여 검정하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 또한 생물학적 활성 BoNT를 포함하는 제제, 및 바람직하게, 생물학적 활성 BoNT를 포함하는 제약 제제 중 생물학적 활성 BoNT의 양을 측정하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 (a) hiPS 세포 유래 뉴런 세포를, 생물학적 활성 BoNT를 포함하는 제제의 샘플과 접촉시키는 단계; 및 (b) 샘플을 BoNT의 생물학적 활성에 대하여 검정함으로써 제제 중에 존재하는 생물학적 활성 BoNT의 양을 측정하는 단계를 포함한다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 활성에 대하여 BoNT를 검정하기 위한 인간 유도성 만능 줄기 (hiPS) 세포 유래 뉴런 세포의 용도를 제공한다.

추가의 실시양태는 본원에 기술된다.

도 1은 iPS 뉴런에서의 BoNT 수용체 발현을 보여주는 것이다. A. iPS 세포를 4, 7, 10, 14 및 21일 동안 성숙시키고, 웨스턴 블롯을 통해 BoNT 수용체의 발현 수준에 대하여 검정하였다. B. iPS 세포를 5, 10, 15 및 20일 동안 성숙시키고, 성인 인간 뇌 세포를 사용하여 정량적-PCR 검정을 수행하였다.
도 2는 상이한 7가지의 기판 (우측에 명시) 상에 플레이팅된 iPS 뉴런의 BoNT/A1 감도 비교를 보여주는 것이다.
도 3은 iPS 뉴런 및 RSC 세포의 BoNT/A1 감도를 보여주는 것이다.
도 4는 iPS 뉴런에서의 BoNT/A1 활성 검출의 시간 의존성을 보여주는 것이다.
도 5는 RSC 세포와의 비교로 나타낸, iPS 뉴런의 BoNT/A1 흡수 속도를 보여주는 것이다.
도 6은 뉴런에 의한 활성-의존성 BoNT/A1 흡수를 보여주는 것이다. A. iPS 뉴런 및 RSC 세포를 1, 5, 10 및 15분 동안 세포 자극 배지 중 55 U 또는 275 U의 BoNT/A1에 노출시킨 후, 독소를 제거하고, 24 h 동안 인큐베이션시켰다. B. iPS 뉴런을 1, 5 및 10 min 동안 뉴런 배지 및 세포 자극 배지, 두 배지 모두 중 55 U의 BoNT/A1에 노출시켰다. C. 뉴런을 5 min 동안 세포 자극 배지 중 1.7-55 U의 BoNT/A1에 노출시키고, 뉴런 배지로 2회에 걸쳐 세척하고, 24 h 동안 인큐베이션시켰다.
도 7은 iPS 뉴런에서의 항체 보호 검정에 관한 웨스턴 블롯 및 밀도 측정 데이터를 보여주는 것이다. A. iPS 뉴런을 24 h 동안 1.5 U의 독소 및 항체에 노출시켰다. B. iPS 뉴런을 5 min 동안 세포 자극 배지 중 55 U의 독소-항체 혼합물에 노출시키고, 혼합물을 제거하고, 세포를 2회에 걸쳐 세척하고, 24 h 동안 인큐베이션시켰다.
도 8은 BoNT/A 복합체 및 정제된 BoNT/A에 대한 iPS 뉴런의 감도를 보여주는 것이다. A. 정제된 BoNT/A1 및 BoNT/A1 복합체를 비교하는 SDS-PAGE 겔 (인비트로젠으로부터의 래더: 시블루^® 플러스2 프리-스테인드 스탠다드(SeeBlue^® Plus2 Pre-Stained Standard)). B. 48 h 독소 노출 후, BoNT/A1 정제된 독소 및 BoNT/A1 복합체에의 iPS 뉴런의 감도.
도 9는 iPS 뉴런 중 BoNT/B, C, 및 E 활성 검출을 보여주는 것이다. iPS 뉴런을 7일 동안 성숙시키고, RSC 세포를 48 h 동안 BoNT/B (A), /C (B), 및 /E (C)의 일련의 희석액에 동시에 노출시켰다.

정의

본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 다수의 용어 및 어구를 하기에서 정의한다:

본원에 사용된 "숙주 세포"라는 용어는 시험관내에 또는 생체내에 어디 위치하든 간에, 임의의 진핵 또는 원핵 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 식물 세포, 어류 세포, 및 곤충 세포)를 의미한다.

본원에 사용된 "세포 배양물"이라는 용어는 세포의 임의의 시험관내 배양물을 의미한다. 연속 세포주 (예컨대, 불멸의 표현형을 갖는 것), 1차 세포 배양물, 유한 세포주 (예컨대, 비형질전환된 세포), 및 난모세포 및 배아를 포함하는, 시험관내에서 유지되는 임의의 다른 세포가 본 용어에 포함된다.

본원에 사용된 "독성"이라는 용어는 독성물 투여 이전의 같은 세포 또는 조직과 비교하였을 때, 세포 또는 조직에 대해 미치는 임의의 유해한 또는 해로운 효과를 의미한다.

본원에 사용된 "제약 조성물"이라는 용어는 활성제와 담체, 불활성제 또는 활성제와의 조합물로서, 특히 조성물을 시험관내, 생체내, 또는 생체외 진단학적 또는 치료학적 용도에 적합하도록 만든 조합물을 의미한다.

본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"라는 용어는 표준 제약 담체, 예컨대 인산염 완충 염수 용액, 물, 에멀젼 (예컨대, 유/수 또는 수/유 에멀젼), 및 각종 유형의 습윤화제 중 임의의 것을 의미한다. 조성물은 또한 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 아주반트의 예가 존재한다 (예컨대, 문헌 [Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]] 참조).

본원에 사용된 "검출하다," "검출하는" 또는 "검출"이라는 용어는 검출가능한 방식으로 표지화된 조성물을 발견하거나, 또는 인식하는 일반적 행위, 또는 상기 조성물에 대한 구체적인 관찰을 기술하는 것일 수 있다.

본원에 사용된 "정제된" 또는 "정제하는"이라는 용어는 샘플로부터 성분 (예컨대, 오염 물질)을 제거하는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체는 비-이뮤노글로불린 단백질의 제거에 의해 정제되고; 또한, 표적 분자에 결합하지 않는 이뮤노글로불린의 제거에 의해 정제된다. 비-이뮤노글로불린 단백질의 제거 및/또는 표적 분자에 결합하지 않는 이뮤노글로불린의 제거를 통해 샘플 중 표적-반응성 이뮤노글로불린의 비율 (%)은 증가하게 된다. 또 다른 일례에서, 재조합 폴리펩티드는 박테리아 숙주 세포에서 발현되고, 폴리펩티드는 숙주 세포 단백질의 제거에 의해 정제되며; 이로써, 샘플 중의 재조합 폴리펩티드의 비율 (%)은 증가하게 된다.

본원에 사용된 "샘플"이라는 용어는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 한 의미에서는 임의의 공급원으로부터 수득된 표본 또는 배양물 뿐만 아니라, 생물학적 및 환경적 샘플을 포함하는 것으로 한다. 생물학적 샘플은 (인간을 포함하는) 동물로부터 수득될 수 있고, 유체, 고체, 조직 및 가스를 포함한다. 생물학적 샘플은 세포, 조직, 혈액 생성물, 예컨대 혈장, 혈청 등을 포함한다. 그러나, 상기 예들은 본 발명에 적용가능한 샘플 유형을 제한하는 것으로 해석되서는 안된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 또한 생물학적 활성 BoNT를 포함하는 제제, 예컨대 제약 또는 미용 목적으로 적용되는 BoNT 제제의 샘플일 수 있다. 또한, 본 개시내용의 한 측면에서, 샘플은 또한 BoNT를 포함할 것으로 의심되는 환경 샘플 또는 식품 샘플일 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 실시양태는 BoNT의 검출 및 분석을 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 시스템 및 검정은 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 검출을 위한 고감도의 재현가능한 플랫폼으로서 인간 iPS 유래 뉴런을 사용한다. 일부 실시양태에서, 뉴런은 GABA성, 도파민성, 및 글루타메이트성 뉴런으로 이루어진, 98% 순도의 범-뉴런 집단이고, 분화된 세포로서 생산되고 냉동 보존된다. 또 다른 측면에서, 뉴런은 GABA성, 도파민성, 및 글루타메이트성 뉴런으로 이루어진, 본질적으로 순수한 범-뉴런 집단이고, 분화된 세포로서 생산되고 냉동 보존되며, 여기서 세포는 뉴런 세포와 관련하여 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 96% 이상으로 순수하다. 본 발명의 실시양태 개발 과정 동안에 수행된 실험은 세포가 모든 BoNT 혈청에 의한 BoNT 중독을 위해 필요한 수용체 및 기질들 모두를 발현한다는 것을 입증하였다. BoNT 검출 검정은 iPS 유래 뉴런이 BoNT/A, B, C, 및 E, 및 중화 항체의 정량적 검출에 대하여 고도로 선택성이라는 것을 입증한다.

인간 섬유모세포 세포는 간단하게는 침묵화된 유전자의 소규모 세트를 활성화시킴으로써 만능 줄기 세포로 재프로그래밍화될 수 있다는 것이 2007년 11월, 두 독립 군을 통해 최초로 밝혀졌다 (문헌 [Takahashi K, et al., (2007) Cell 131:861-872]; [Yu J, et al., (2007) Science 318: 1917-1920]). 이들 세포는 유도성 만능 줄기 세포로 명명되었으며, 이는 세포주와 유사하게 유지되고, 냉동 보존될 수 있다. 이러한 발견은 완전 기능성이고 분화된 인간 체세포와 유사하지만, 임의의 동물 사용을 필요로 하지 않는, 다수의 인간 iPS 유래 세포 모델 개발에 관한 기회를 열었다.

본원에 기술된 시스템 및 방법에서 사용하기 위한 iPS 세포를 선택할 때, 세포는 신뢰할 수 있고 재현가능하게 생산될 수 있으며, 분화된 세포의 순수한 집단을 상기 연구를 위해 충분한 양으로 생성하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 셀룰라 다이나믹스 인크.(Cellular Dynamics Inc.: 미국 위스콘신주 매디슨)로부터 이용가능하다.

본 발명의 실시양태 개발 과정 동안에 수행된 실험은 인간 iPS 유래 뉴런이 보툴리눔 신경독소, 중화 항체 및 억제제의 검출을 위한, 및 BoNT 세포 유입 및 수송 연구를 위한, 고감도의 선택적이며 종 특이적인 세포 모델이라는 것을 입증하였다. 이들 뉴런은 BoNT 효능 측정을 위해서 뿐만 아니라, 항체 검출, 억제제 스크리닝, 및 연구 적용을 위해서 MBA를 대체하는 데 적합하다.

I. 세포

본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 실시양태는 작용제, 예컨대 BoNT의 검출 및 분석에 사용하기 위한 만능 유래 줄기 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간의 것이다 (예컨대, 인간 유도성 만능 줄기 유래 세포 (hiPS) 유래 뉴런 세포 또는 인간 배아 줄기 세포). iPS 세포를 생성하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Yu et al., Science. 2009 May 8;324(5928):797-801]. Epub 2009, WO2011056971 및 WO2011025852 (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 일부 실시양태에서, iPS 세포는 적합한 방법 (예컨대, 미국 특허 출원 US2010/0279403 및 US2010/0216181 (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기술되어 있는 것)을 사용하여 뉴런으로 분화된다.

일부 실시양태에서, 뉴런은 GABA성, 도파민성, 및 글루타메이트성 뉴런으로 이루어진, 98% 순도의 범-뉴런 집단이고, 분화된 세포로서 생산되고 냉동 보존된다. 일부 실시양태에서, 비록 다른 공급원도 사용될 수는 있지만, 상업적으로 이용가능한 뉴런 유래 iPS 세포 (예컨대, 셀룰라 다이나믹스 인크. (미국 위스콘신주 매디슨) 또는 글로벌스템(GlobalStem: 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 이용가능한 것)가 사용된다. 일부 실시양태에서, 세포는 뉴런 hiPS 세포이다.

또 다른 측면에서, 세포는 GABA성, 도파민성, 및 글루타메이트성 뉴런으로 이루어진, 본질적으로 순수한 범-뉴런 집단이고, 분화된 세포로서 생산되고 냉동 보존되며, 여기서 세포는 뉴런 세포와 관련하여 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 96% 이상으로 순수한 것인 뉴런이다.

본 발명은 본원에 기술된 세포로 제한되지 않는다. 추가의 세포주 및 1차 세포 배양물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 콜린성 뉴런이 사용된다.

일부 실시양태에서, 적합한 세포주는 BoNT 중독에 필요하거나 충분한 수용체 및 물질을 발현한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 BoNT의 검출 및 분석을 수행하는 데 필요하거나 충분하거나 또는 유용한 성분과 함께, 본원에 기술된 세포주를 포함하는, 시스템 및 키트를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 키트는 세포 및 세포 배양물 시약 (예컨대, 플레이트, 완충제 등, 검정용 시약, 대조군 (양성 및 음성 BoNT 및/또는 억제제 대조군) 및 검정 수행 및 분석에 관한 지침서를 포함한다.

본 발명의 한 측면에서, hiPS 세포 유래 뉴런 세포는 상기 언급된 바와 같은 과정에 의해 생성된 hiPS 세포의 뉴런 세포로의 분화 및/또는 성숙에 의해 수득될 수 있거나, 또는 수득되어 왔다. 한 측면에서, 상기 뉴런 세포 분화는 약 37℃에서 및 약 5% CO₂ 하에 hiPS 세포의 배양에 의해 달성될 수 있다. 한 측면에서, 배양용 배지는 B27 및 글루타맥스로 보충된 뉴로베이잘(Neurobasal) 배지 (인비트로젠 인크.(Invitrogen, Inc: 미국))일 수 있다. 추가의 또 다른 측면에서, 세포는 폴리리신으로 코팅된 플레이트 상에서 배양되고, 추가의 또 다른 측면에서, 플레이트는 추가로 마트리겔 (BD 바이오사이언스(BD Bioscience: 미국))로 코팅된다. 한 측면에서, 96 웰 플레이트가 배양을 위해 사용되며, 여기서 세포는 웰당 약 40,000개의 세포인 밀도로 성장된다. 한 측면에서, 세포는 약 24시간 동안 시딩될 수 있다. 이후, 한 측면에서 세포는 약 2 내지 약 28일 동안, 한 측면에서 약 4 내지 약 14일 동안, 또는 한 측면에서 약 4 내지 약 7일 동안 성숙될 수 있다.

한 측면에서, 상기 hiPS 세포 유래 뉴런 세포는 본질적으로 하기 첨부된 실시예에 기술되어 있는 바와 같이, 분화 및 성숙 과정에 의해 수득된다.

본 발명의 실시양태는 또한 상기 언급된 분화 및 성숙 과정에 의해 수득된 hiPS 세포 유래 뉴런 세포에 관한 것이다.

한 측면에서, 상기 hiPS 세포 유래 뉴런 세포는 하기 마커: β3-튜불린, NeuN, vGAT, vGLUT2, NSE 뉴런-특이적 에놀라제) 또는 Tbr1 (T-도메인 전사 인자 1) 중 하나 이상의 존재, 및 한 측면에서, 그들 모두의 존재를 특징으로 한다. β3-튜불린 또는 NeuN의 경우, 본 발명의 hiPS 세포 유래 뉴런 세포의 배양물 중 양성 세포의 개수는 약 99%인 것으로 구상된다. vGAT 또는 vGLUT2의 경우, 한 측면에서, 배양물의 세포 중 적어도 일부는 상기 마커에 대하여 양성인 것으로 구상된다.

한 측면에서, 상기 hiPS 세포 유래 뉴런 세포는 하기 마커: GFAP, TH, NNE (비-뉴런 에놀라제), Tbr2 (T-도메인 전사 인자 2), 또는 NoGo a,C 중 하나 이상의 부재, 및 한 측면에서, 그들 모두의 부재를 특징으로 한다. GFAP의 경우, hiPS 세포 유래 뉴런 세포의 배양물 중 양성 세포의 개수는 유의적으로 낮고, 한 측면에서, 약 5% 미만, 또는 심지어는 약 1% 미만인 것으로 구상되고, 나머지 마커에 대해서는, 한 측면에서, 상기 세포의 개수는 존재하더라도 검출가능한 양 미만으로 존재하는 것으로 구상된다.

한 측면에서, 상기 언급된 마커의 존재 또는 부재, 또는 그의 양은 종래 면역학적 기법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 마커는 면역조직학적 염색 기법, 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정될 수 있거나, β3-튜불린 또는 NeuN에 관한 한, FACS 분석법에 의해 측정될 수 있다. 추가 검출 기법은 기술되어 있다 (예컨대, US2012/0178083, US2008/0280301, 문헌 [Englund 2005, J Neurosci 25: 247-251]; [Dupuis 2002, Neurobiology of Diseases 10: 358-365] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된다) 참조).

추가의 측면에서, hiPS 세포 유래 뉴런 세포는 하기 전기 생리학적 특성: 테트로도톡신 (TTX)에 의한 Na2+ 채널 억제, 테트라에틸암모늄에 의한 K+ 채널 억제, 니페디핀에 의한 L형 Ca2+ 채널 억제, ω-아가톡신 IVA에 의한 P/Q형 Ca2+ 채널 억제 또는 ω-코노톡신 GVIA에 의한 N형 Ca2+ 채널 억제 중 1개 이상, 및 한 측면에서, 그들 모두를 특징으로 한다. 상기 전기 생리학적 특성은 세포를 각 억제제로 처리하기 이전 및 이후에, 예컨대 패치-클램프 측정법을 포함하는, 표준 전기 생리학적 측정법에 의해 시험될 수 있다.

또 다른 측면에서, hiPS 세포 유래 뉴런 세포는 BoNT, 및 한 측면에서, BoNT/A에 대해 감도를 갖는 것을 특징으로 한다. 추가로, 한 측면에서, 세포는 또한 용량 의존성 방식으로 다른 신경독성 화합물에 대하여, 및 특히 하기 화합물: 스타우로스포린, ATP 경쟁 키나제 억제제, 클로르프로마진 또는 페노티아진 중 1개 이상, 또는 그들 모두에 대하여 감도를 가진다. 상기 언급된 화합물에 대한 감도는, 예컨대 세포 생존능 검정으로 측정될 수 있다.

한 측면에서, hiPS 세포 유래 뉴런 세포는 또한 신경돌기 성장과 관련하여 하기 화합물: 안티마이신 A, 미토마이신 C, MK571, PD98092 또는 스타우로스포린 중 1개 이상, 및 한 측면에서, 그들 모두에 대하여 감도를 가진다.

추가로, 한 측면에서, hiPS 세포 유래 뉴런 세포는 미토콘드리아 막 전위 손실과 관련하여 하기 화합물: 안티마이신 A 또는 발리노마이신 중 1개 이상, 및 한 측면에서, 그들 모두에 대하여 감도를 가진다.

II . 검정 및 용도

본 발명의 실시양태는 BoNT 검정용 조성물 및 방법을 제공한다. 검정은 연구, 임상, 진단 및 치료학적 적용에서의 용도를 발견해 낸다.

일부 실시양태에서, 검정은 만능 세포 (예컨대, hiPS 유래 뉴런 세포)를 사용한다. 인간 세포 사용은 종-특이적 모델의 이점을 제공한다. 추가로, 만능 세포 유래의 뉴런은 암 세포주 또는 변형된 세포주로부터 유래된 뉴런과는 반대로, 정상적이고 건강한 뉴런을 나타내며, 이는 체성 뉴런을 반영하지 않을 수 있다.

일부 실시양태에서, 검정은 BoNT의 효능을 스크리닝하기 위해 뉴런 세포, 예컨대 hiPS 유래 뉴런 세포를 이용한다. 다른 실시양태에서, 검정은 BoNT의 독성에 대해 스크리닝한다. 추가의 실시양태에서, 검정은 BoNT에 대한 중화 항체의 존재 또는 그의 특성에 대하여 또는 활성에 대하여 다른 생물약제를 스크리닝한다. 일부 실시양태에서, 검정은 정량적인 반면, 다른 경우에서 검정은 정성적이다.

일부 실시양태에서, 세포를 먼저 적합한 매트릭스 상에서 배양한다. 일부 실시양태에서, 뉴런을 성숙시키기 위해 세포를 배양한다. 본 발명의 실시양태에서 사용되는 만능 세포는 현 검정에서 사용되는 세포보다 성숙 속도가 더 빠르다는 이점을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이어서, 적합한 기간 동안 세포를 독소 (예컨대, BoNT)에 노출시킨다. 독소를 노출시킨 후, 적합한 방법을 사용하여 원하는 파라미터 (예컨대, EC50)를 계산한다. 본원에 기술된 검정은 정제된 BoNT, 및 복합체 형태의 BoNT (예컨대, 천연 환경 및 일부 제약 제제 중에서 발견되는 것과 같이, 다른 단백질과 복합체를 형성한 형태의 것), 둘 모두를 검출하는 데 적합하다. 본원에 기술된 검정은 임의의 개수의 BoNT 혈청형 (예컨대, BoNT/A, B, C, D, E, F 및 G), 또는 그의 변이체 또는 키메라를 검출하는 데 적합하다. 일부 실시양태에서, BoNT는 재조합적으로 발현된 것이다. 다른 실시양태에서, BoNT는 박테리아 세포로부터 정제된 것이다.

일부 실시양태에서, 항체 보호 검정은 중화 항체를 시험하기 위해 수행된다. 비록 BoNT가 다양한 병태에 대해 다수의 환자를 치료하는 데 있어 효과적으로 사용되기는 하지만 (문헌 [Dhaked et al., Indian J Med Res 132: 489-503] 참조), 일부는 중화 항체를 발생시킬 것이며, 이는 추가 치료의 성공을 방해할 것이다. 예를 들어, 자궁경부 근긴장 이상 치료에서, 치료받은 환자 중 ~5%에서는 추가 치료를 방해하는 중화 BoNT 항체가 발생될 것으로 추정된다 (문헌 [Kessler et al., (1999) J Neurol 246:265-274]). 현재, 고감도의 정량적 검정이 상업적으로 이용가능한 상태가 아니기 때문에, 환자는 그의 치료 과정 동안에 중화 항체의 발생에 대하여 모니터링되고 있지 않다 (문헌 [Sesardic et al., (2004) Mov Disord 19 Suppl 8: S85-91]). iPS 뉴런을 사용하는, 본원에서 제공하는 시험 플랫폼은 BoNT를 치료학상 또는 미용을 위해 반복하여 주사맞은 환자의 혈청 중 BoNT-중화 항체에 대한 감도가 좋은 정량적 검출을 제공한다. 중화 항체는 임의의 개수의 샘플 유형 (예컨대, 정제된 항체, 혈청, 항독소 등)에서 검출될 수 있다.

일부 실시양태에서, BoNT의 소형 분자 억제제는 (예컨대, 연구 또는 약물 스크리닝을 위해) 시험된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 먼저 세포를 BoNT에 노출시킨 후, 억제제를 그 둘 모두에 함께 노출시키거나, 세포를 먼저 억제제에 노출시킨 후 BoNT에 노출시킨다.

임의의 개수의 적합한 종점 측정법을 사용하여 BoNT 활성을 검정할 수 있다. 그 예로는 웨스턴 블롯, 신경전달물질 방출, ELISA (문헌 [Nuss JE, et al., (2010) J Biomol Screen 15:42-51]) 또는 세포내 발현 리포터, 예컨대 FRET 센서 (문헌 [Dong et al., (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:14701-14706])를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 검정은 제약으로서 또는 연구용으로 BoNT 또는 유도체를 제조하는 동안 품질 관리 시험에서, 진단 평가에서, 임상 치료의 최적화 및 투약에서, 및 치료 방식 선택에서의 용도를 발견해 낸다.

본원에 기술된 검정의 추가 적용은 억제제 검출, 및 진단, 임상, 스크리닝 및 연구 용도를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 a) hiPS 유래 뉴런 세포를, 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT)를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 b) BoNT를 생물학적 활성에 대하여 검정하는 단계를 포함하는, BoNT를 활성에 대하여 검정하는 방법을 제공한다.

상기 방법의 한 측면에서, 검정은 BoNT의 생물학적 활성의 존재 또는 부재를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 검정은 때때로 본원에서 정성적 검정으로 지칭될 수 있다. BoNT 생물학적 활성의 존재 또는 부재에 기초하여, 생물학적 활성 BoNT를 포함하거나 또는 포함할 것으로 의심되는 조성물 중 상기 생물학적 활성 BoNT의 존재 또는 부재를 결론지을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 추가로, 추가의 또 다른 측면에서, 검정은 생물학적 활성 BoNT를 포함하는 조성물 중 생물학적 활성 BoNT의 양을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 생물학적 활성 BoNT의 양은 조성물 중 상기 BoNT에 대하여 검정된 생물학적 활성의 양으로부터 도출될 수 있다는 이해할 것이다. 상기 검정 또한 때때로 본원에서 정량적 검정으로 지칭될 수 있다.

본 발명의 방법의 한 측면에서, BoNT는 클로스트리디움 신경독소에 대해 상이한 혈청형 군으로부터 선택되는 신경독소이고, 예컨대 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, 또는 BoNT/G로부터 선택된다. 추가로, 한 측면에서, 파상풍 독소 (TeNT)가 본 발명에 따른 방법에서 신경독소로서 사용될 수 있다.

박테리아 클로스트리디움 보툴리눔 및 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani)는 천연적으로 고도로 강력한 상기와 같은 신경독소, 예컨대 각각 보툴리눔 독소 (BoNT) 및 파상풍 독소 (TeNT)를 생산한다. 이들 신경독소는 뉴런 세포에 특이적으로 결합하여 신경전달물질 방출을 파괴시킨다. 각 독소는 대략 150 kDa의 불활성 단일 쇄 단백질로서 합성된다. 번역 후 프로세싱은 이황화 브릿지 형성, 및 박테리아 프로테아제(들)에 의한 제한된 단백질분해 (닉 형성(nicking))를 포함한다. 활성 이쇄(dichain) 신경독소는 이황화 결합으로 연결된, 대략 50 kDa의 N-말단 경쇄 및 대략 100 kDa의 중쇄, 이 2가지 쇄로 구성된다. 신경독소는 구조상 3가지 도메인, 예컨대 촉매성 경쇄, 전위 도메인 (N-말단 절반부) 및 수용체 결합 도메인 (C-말단 절반부)을 포함하는 중쇄로 구성된다 (예컨대, 문헌 [Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39]; [Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41]; [Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49] 참조). BoNT 폴리펩티드 및 TeNT 폴리펩티드의 구조는 상기 언급된 참고 문헌에 기술되어 있다.

BoNT 및 TeNT의 항원과 관련하여 상이한 7가지의 혈청형은 SNARE 단백질을 절단함으로써 시냅스 세포외유출을 차단하는 Zn⁺²-엔도프로테아제이다. 신경독소는 보툴리눔독소증 및 파상풍 장애에서 관찰되는 이완성 근육 마비를 야기한다 (문헌 [Fischer 2007, Proc Natl. Acad. Sci. USA 104, 10447] 참조).

추가의 또 다른 측면에서, 변형된 BoNT 또는 TeNT의 활성은 본 발명의 방법에 의해 검정될 수 있다. 상기 변형된 BoNT는 1개 이상의 치환, 부가 및/또는 결실을 BoNT 또는 TeNT의 아미노산 서열에 도입함으로써 상기 언급된 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, 또는 BoNT/G로부터, 또는 TeNT로부터 유도될 수 있다. 따라서, 상기 변형된 BoNT 또는 TeNT는 상기 언급된 BoNT 중 어느 하나 또는 TeNT의 아미노산 서열과 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본원에 사용된 "동일한"이라는 용어는 최고차로 매칭되도록 정렬된 두 아미노산 서열 사이의 동일한 아미노산 개수를 측정함으로써 특징이 규명되는 서열 동일성을 의미한다. 컴퓨터 프로그램으로 체계화되는 공개 기법 또는 방법, 예컨대 BLASTP 또는 FASTA를 사용함으로써 계산될 수 있다 (문헌 [Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403]). 한 측면에서, 동일성 (%) 값은 전체 아미노산 서열에 걸쳐 계산된다. 상이한 서열을 비교하기 위한 다양한 알고리즘에 기초한 일련의 프로그램은 숙련된 연구원에게 이용가능하다. 이와 관련하여, 니들만(Needleman) 및 운쉬(Wunsch), 또는 스미스(Smith) 및 워터만(Waterman)의 알고리즘이 특히 신뢰가능한 결과를 제공한다. 서열 정렬을 수행하기 위해, 프로그램 파일업(PileUp) (문헌 [Higgins 1989, CABIOS 5, 151]) 또는 프로그램 갭(Gap) 및 베스트핏(BestFit) (문헌 [Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443]; [Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482]) (이들은 GCG (제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group) 1991: 미국 위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575) 소프트웨어 패킷의 일부이다)이 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 언급된 서열 동일성 값 비율 (%)은 하기 설정: 갭 가중치: 50, 길이 가중치: 3, 평균 매칭수: 10.000 및 평균 미스매칭수: 0.000 (이는 달리 언급되지 않는 한, 서열 정렬을 위한 표준 설정값으로서 항상 사용되어야 한다)을 이용하여 전체 서열 영역에 걸쳐 프로그램 GAP를 이용함으로써 측정되는 것으로 한다.

한 측면에서, 각각의 상기 언급된 변형된 BoNT 또는 TeNT 폴리펩티드는 각각의 비변형된 폴리펩티드, 즉, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G 또는 TeNT의 생물학적 특성 중 하나 이상, 및 또 다른 측면에서, 그들 모두를 보유한다. 비록 프로세싱되지 않은 전구체도 일부 생물학적 기능을 발휘할 수 있거나, 또는 부분적으로 활성일 가능성도 있지만, 전체 생물학적 활성이 단백질분해성 활성화 이후에 유지되는 것으로 당업자는 이해할 것이다. 본원에 사용된 "생물학적 특성"은 (a) 수용체 결합, (b) 내재화, (c) 엔도솜 막을 가로지른 시토졸 내로의 전위, 및/또는 (d) 시냅스 소포체 막 융합에 관여하는 단백질의 단백질내 분해성 절단을 의미한다. 생물학적 활성을 평가하기 위한 생체내 검정으로는 마우스 LD50 검정을 포함하고, 생체외 마우스 편측 횡경막 검정은, 예컨대 드레시에르(Dressier) 등에 의해 기술된 바 있다 (문헌 [Dressier 2005, Mov Disord 20: 1617-1619], [Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637]). 생물학적 활성은 통상 마우스 유닛 (MU)으로 표시된다. 본원에 사용된 1 MU는 복강내 주사 후 명시된 마우스 집단 50%를 사멸시키는 신경독소 성분의 양, 즉, 마우스 i.p. LD50이다. 추가의 측면에서, 변형된 폴리펩티드는 개선 또는 변경된 생물학적 특성을 가질 수 있고, 예컨대 효소 인식에 대하여 개선된 절단 부위를 포함할 수 있거나, 또는 수용체 결합 또는 상기 언급된 임의의 다른 특성에 대해 개선될 수 있다.

한 측면에서, 변형된 BoNTs 또는 TeNT는 상기 언급된 생물학적 활성 중 하나 이상, 및 한 측면에서, 그들 모두에 대해 본원에 기술된 방법에 의해 검정될 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, 변형된 BoNT 또는 TeNT는, 예를 들어 BoNT 또는 BoNt/TeNT 하이브리드, 재표적화된 BoNT, 재표적화된 TeNT, 및 키메라 BoNT 또는 TeNT로부터 선택된다. 변형된 BoNT 및 TeNT가 기술되어 있다.

본 발명의 방법의 한 측면에서, 접촉 단계는 2가지 이상의 상이한 성분의 물리적 및/또는 화학적 상호작용이 이루어질 수 있도록 상기 두 성분이 물리적으로 근접하게 위치하도록 하는 것을 포함한다. 상기 언급된 방법에서, hiPS 유래 뉴런 세포는 생물학적 활성 BoNT를 포함하거나, 또는 포함할 것으로 의심되는 조성물과 접촉하게 된다. 접촉은 조성물 중에 포함된 생물학적 활성 BoNT가 hiPS 세포 유래 뉴런 세포 상에서 그의 생물학적 활성을 발휘할 수 있도록 하는 충분한 시간 동안 및 그러한 조건하에서 수행된다. 따라서, 한 측면에서, 접촉은 (a) 수용체 결합, (b) 내재화, (c) 엔도솜 막을 가로지른 시토졸 내로의 전위, 및/또는 (d) 시냅스 소포체 막 융합에 관여하는 단백질 또는 hiPS 세포 유래 뉴런 세포에서 상기 과정을 모사하는 기질의 단백질내 분해성 절단을 허용하여야 한다. 당업자는 주어진 hiPS 세포 유래 뉴런 세포 배양물에 대하여 어떤 조건이 적용되어야 하는지에 대해 잘 알고 있다. 한 측면에서, 접촉 단계는 본원에 기술된 방법에 의해 BoNT 활성에 대하여 검정하고자 하는 조성물 샘플을 배양 배지에 첨가함으로써 적합한 배양 조건하에 적합한 배양 배지 중 웰 플레이트 상에서 hiPS 세포 유래 뉴런 세포가 배양되는 세포 배양물 시스템에서 수행될 수 있다.

한 측면에서, 적합한 배양 조건으로는 약 37℃에서 약 5% CO₂하에 배양하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 배양용 배지는 B27 및 글루타맥스로 보충된 뉴로베이잘 배지 (인비트로젠 인크.: 미국)이다. 추가의 또 다른 측면에서, hiPS 세포 유래 뉴런 세포를 폴리리신 코팅된 플레이트 상에서 배양하고, 추가의 또 다른 측면에서, 추가로 마트리겔로 코팅된 플레이트 (BD 바이오사이언스: 미국)를 사용한다. 한 측면에서, 96 웰 플레이트가 배양을 위해 사용되며, 여기서 세포는 웰당 약 10,000 내지 약 100,000개의 세포, 추가의 측면에서, 약 20,000 내지 약 60,000개의 세포, 및 또 다른 측면에서, 약 40,000개의 세포인 밀도로 성장하게 된다. 한 측면에서, 세포는 약 24시간 동안 시딩시킬 수 있다. 한 측면에서, 이후 세포는 접촉 단계를 수행하기 전에 약 2 내지 약 28일 동안, 한 측면에서, 약 4 내지 약 14일 동안, 또는 한 측면에서, 약 4 내지 약 7일 동안 성숙될 수 있다.

또 다른 측면에서, 상기 접촉 단계는 하기 첨부된 실시예에 기술되어 있는 바와 같이 수행된다.

본 발명의 방법의 한 측면에서, 생물학적 활성 BoNT를 포함하는 조성물은 생물학적 활성 BoNT를 포함하는 것으로 알려진 조성물, 또는 생물학적 활성 BoNT를 포함할 것으로 의심되는 조성물이다. 조성물은 상기 생물학적 활성 BoNT 이외에 다른 성분, 예를 들어 적합한 용매 및/또는 안정화제, 예컨대 단백질 및, 한 측면에서, BoNT (HA70, HA17, HA33, 또는 NTNH (NBP))의 복합체 형성 단백질, 또는 다른 단백질 안정화제를 포함할 수 있다. 조성물은, 예컨대 본원 다른 곳에서도 언급되는 BoNT의 생물학적 활성들 중 임의의 것을 증진시킴으로써 BoNT의 생물학적 활성을 촉진시키는 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 조성물은 1개 초과의 BoNT를 포함할 수 있다.

한 측면에서, 조성물은 보툴리눔, 또는 생물학적 활성 BoNT를 포함하는 다른 박테리아 세포 또는 비-박테리아 세포의 세포 용해물이다. 한 측면에서, 상기 조성물은 또한, 예컨대 조 추출물과 같이, 부분 정제에 의해 상기 세포 용해물로부터 수득된 BoNT 제제, 또는 예컨대 정제된 BoNT 제제와 같이, BoNT의 정제에 의해 수득된 것이다. 또 다른 측면에서, 조성물은 혼합 성분을 포함하는 인공 조성물이다. 또 다른 측면에서, 조성물은 본원 다른 곳에서도 정의된 바와 같은 제약 조성물로서 사용하고자 하는 제제이다.

본 발명의 방법의 한 측면에서, BoNT를 생물학적 활성에 대하여 검정하는 단계는 hiPS 세포 유래 뉴런 세포 중, 시냅스 소포체 막 융합에 관여하는 단백질, 또는 존재할 경우, 생물학적 활성 BoNT에 의해 절단되는 다른 기질의 단백질내 분해성 절단을 측정함으로써 수행된다.

일부 실시양태에서, 시냅스 소포체 막 융합에 관여하는 단백질 또는 다른 기질은 검정하고자 하는 BoNT 또는 TeNT에 의해 인식되는 신경독소 절단 부위를 가진다. 본원에 사용된 신경독소 절단 부위란 신경독소 폴리펩티드의 내인성 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 절단 부위를 의미한다. 신경독소 프로테아제에 의해 인식되는 절단 부위는 기술되어 있다 (예컨대, EP 1 926 744 B1 (상기 특허는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다) 참조). 원칙적으로, 신경독소 절단 부위는 기질 중에 천연적으로 존재하거나, 또는 신경독소 폴리펩티드 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 인공적으로 디자인된 절단 부위인 절단 부위일 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, BoNT/A 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위는 BoNT/A에 의한 절단에 대해 감수성인 단백질로부터 유도된 것이다. 한 측면에서, 상기 단백질은 인간 SNAP25A 또는 B, 또는 래트, 마우스, 소, 다니오(Danio), 카라씨우스(Carassius), 제노푸스(Xenopus), 토르페도(Torpedo), 스트롱글리오센트로터스(Strongylocentrotus ), 롤리고(Loligo), 림나에아(Lymnaea) 또는 아플리시아(Aplysia)로부터 유래된, 그의 상동체, 파라로그 또는 오르토로그이다. 상기 단백질로부터 유도된 적합한 절단 부위는 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.

본 발명의 한 측면에서, BoNT/B 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위는 BoNT/B에 의한 절단에 대해 감수성인 단백질로부터 유도된 것이다. 한 측면에서, 상기 단백질은 인간 또는 마우스 VAMP-1, VAMP-2 및 VAMP-3/셀루브레빈, 소 VAMP-2, 래트 VAMP-2 또는 VAMP-3, 닭 VAMP-1, VAMP-2 또는 VAMP-3, 토르페도 VAMP-1, 스트롱글리오센트로터스 VAMP, 초파리 sybA, synB, synC, synD, 또는 syn, 히루도(Hirudo) VAMP, 제노푸스 VAMP-2 또는 VAMP-3, 다니오 VAMP-1 또는 VAMP-2, 롤리고 VAMP, 림나에아 VAMP, 아플리시아 VAMP 또는 카에노르하브디티스(Caenorhabditis) SNB1-유사, 또는 그의 임의의 오르토로그, 파라로그, 또는 상동체가다. 상기 단백질로부터 유도된 적합한 절단 부위는, 예를 들어 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.

본 발명의 한 측면에서, BoNT/C1 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위는 BoNT/C1에 의한 절단에 대해 감수성인 단백질로부터 유도된 것이다. 한 측면에서, 상기 단백질은 인간 및 마우스 신탁신 1A, 신탁신 1B1, 신탁신 2-1, 신탁신 2-2, 신탁신 2-3, 신탁신 3A 또는 신탁신 1B2, 소 또는 래트 신탁신 1A, 신탁신 1B1 또는 신탁신 1B2, 래트 신탁신 2 또는 래트 신탁신 3, 마우스 신탁신 1A, 신탁신 1B1, 신탁신 1B2, 신탁신 2, 신탁신 3A, 신탁신 3B 또는 신탁신 3C, 닭 신탁신 1A 또는 신탁신 2; 제노푸스 신탁신 1A 또는 신탁신 1B, 다니오 신탁신 1A, 신탁신 1B 또는 신탁신 3, 토르페도 신탁신 1A 또는 신탁신 1B, 스트롱글리오센트로터스 신탁신 1A 또는 신탁신 1B, 초파리 신탁신 1A 또는 신탁신 1B, 히루도 신탁신 1A 또는 신탁신 1B, 롤리고 신탁신 1A 또는 신탁신 1B, 림나에아 신탁신 1A 또는 신탁신 1B, 또는 그의 임의의 오르토로그, 파라로그, 또는 상동체가다. 상기 단백질로부터 유도된 적합한 절단 부위는, 예를 들어 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.

본 발명의 한 측면에서, BoNT/D 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위는 BoNT/D에 의한 절단에 대해 감수성인 단백질로부터 유도된 것이다. 한 측면에서, 상기 단백질은 인간 또는 마우스 VAMP-1, VAMP-2 및 VAMP-3/셀루브레빈, 소 VAMP-2, 래트 VAMP-2 또는 VAMP-3, 닭 VAMP-1, VAMP-2 또는 VAMP-3, 토르페도 VAMP-1, 스트롱글리오센트로터스 VAMP, 초파리 sybA, synB, synC, synD, 또는 syn, 히루도 VAMP, 제노푸스 VAMP-2 또는 VAMP-3, 다니오 VAMP-1 또는 VAMP-2, 롤리고 VAMP, 림나에아 VAMP, 아플리시아 VAMP 또는 카에노르하브디티스 SNB1-유사, 또는 그의 임의의 오르토로그, 파라로그, 또는 상동체가다. 상기 단백질로부터 유도된 적합한 절단 부위는, 예를 들어 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.

본 발명의 한 측면에서, BoNT/E 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위는 BoNT/E에 의한 절단에 대해 감수성인 단백질로부터 유도된 것이다. 한 측면에서, 상기 단백질은 인간 SNAP-25A 또는 B, 또는 래트, 마우스, 소, 다니오, 카라씨우스, 제노푸스, 토르페도, 스트롱글리오센트로터스, 롤리고, 림나에아 또는 아플리시아로부터 유래된 상동체, 파라로그 또는 오르토로그이다. 상기 단백질로부터 유도된 적합한 절단 부위는, 예를 들어 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.

본 발명의 한 측면에서, BoNT/F 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위는 BoNT/F에 의한 절단에 대해 감수성인 단백질로부터 유도된 것이다. 한 측면에서, 상기 단백질은 인간 또는 마우스 VAMP-1, VAMP-2 및 VAMP-3/셀루브레빈, 소 VAMP-2, 래트 VAMP-2 또는 VAMP-3, 닭 VAMP-1, VAMP-2 또는 VAMP-3, 토르페도 VAMP-1, 스트롱글리오센트로터스 VAMP, 초파리 sybA, synB, synC, synD, 또는 syn, 히루도 VAMP, 제노푸스 VAMP-2 또는 VAMP-3, 다니오 VAMP-1 또는 VAMP-2, 롤리고 VAMP, 림나에아 VAMP, 아플리시아 VAMP 또는 카에노르하브디티스 SNB1-유사, 또는 그의 임의의 오르토로그, 파라로그, 또는 상동체가다. 상기 단백질로부터 유도된 적합한 절단 부위는, 예를 들어 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.

본 발명의 한 측면에서, BoNT/G 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위는 BoNT/G에 의한 절단에 대해 감수성인 단백질로부터 유도된 것이다. 한 측면에서, 상기 단백질은 인간 또는 마우스 VAMP-1, VAMP-2 및 VAMP-3/셀루브레빈, 소 VAMP-2, 래트 VAMP-2 또는 VAMP-3, 닭 VAMP-1, VAMP-2 또는 VAMP-3, 토르페도 VAMP-1, 스트롱글리오센트로터스 VAMP, 초파리 sybA, synB, synC, synD, 또는 syn, 히루도 VAMP, 제노푸스 VAMP-2 또는 VAMP-3, 다니오 VAMP-1 또는 VAMP-2, 롤리고 VAMP, 림나에아 VAMP, 아플리시아 VAMP 또는 카에노르하브디티스 SNB1-유사, 또는 그의 임의의 오르토로그, 파라로그, 또는 상동체가다. 상기 단백질로부터 유도된 적합한 절단 부위는, 예를 들어 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.

본 발명의 한 측면에서, TeNT 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위는 TeNT에 의한 절단에 대해 감수성인 단백질로부터 유도된 것이다. 한 측면에서, 상기 단백질은 인간 또는 마우스 VAMP-1, VAMP-2 및 VAMP-3/셀루브레빈, 소 VAMP-2, 래트 VAMP-2 또는 VAMP-3, 닭 VAMP-1, VAMP-2 또는 VAMP-3, 토르페도 VAMP-1, 스트롱글리오센트로터스 VAMP, 초파리 sybA, synB, synC, synD, 또는 syn, 히루도 VAMP, 제노푸스 VAMP-2 또는 VAMP-3, 다니오 VAMP-1 또는 VAMP-2, 롤리고 VAMP, 림나에아 VAMP, 아플리시아 VAMP 또는 카에노르하브디티스 SNB1-유사, 또는 그의 임의의 오르토로그, 파라로그, 또는 상동체가다. 상기 단백질로부터 유도된 적합한 절단 부위는, 예를 들어 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, BoNT 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 신경독소 절단 부위는 BoNT 단백질에서 발견되는 자가촉매성 절단 부위로부터 유도된 것이다. 측면에서, 본 발명에 따라 사용되고 제공된 BoNT 또는 TeNT의 자가촉매성 절단 부위로부터 유도된 신경독소 절단 부위는 BoNT/A 잔기 250Tyr-251Tyr, BoNT/B 잔기 256Phe-257Phe, BoNT/C1 잔기 257Phe-258Tyr, BoNT/D 잔기 257Phe-258Phe, BoNT/E 잔기 239Pro-240Leu, BoNT/F 잔기 254Pro-255Leu, BoNT/G 잔기 256Phe-257Phe, TeNT 잔기 259Ile-260Tyr, BoNT/A 잔기 Phe266-Gly267, BoNT/B 잔기 Phe272-Gly273, BoNT/C1 잔기 Phe273-Gly274, BoNT/D 잔기 Phe273-Gly274, BoNT/E 잔기 Phe255-Gly256, BoNT/F 잔기 Phe270-Gly271, BoNT/G 잔기 Phe272-Gly273 또는 TeNT 잔기 Phe275-Gly276을 포함하는, 6개 이상, 8개 이상, 10개 이상 또는 15개 이상의 연속 잔기를 포함한다. 상기 단백질로부터 유도된 적합한 절단 부위는, 예를 들어 EP 1 926 744 B1에 개시되어 있다.

본 발명의 한 측면에서, BoNT 및 TeNT에 대한 상기 언급된 신경독소 절단 부위의 절단은 상기 언급된 단백질의 절단에 의해 수득되는 하나 이상 절단 생성물을 측정함으로써 검정될 수 있다. 상기 단백질로부터 유도된 생성물은 비절단된 단백질이 아닌, 상기 절단된 생성물에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 측정될 수 있다. 생성물에 특이적으로 결합하는 상기 항체의 결합은 본원 또는 다른 곳에 기술된 기법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적으로 결합하는 항체를 검출가능한 표지에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결시킬 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 특이적으로 결합하는 항체에 공유적으로 연결된 검출가능한 모이어티일 수 있거나, 또는 검출제, 예컨대 특이적으로 결합하는 항체에 결합하여, 예컨대 그에 공유적으로 연결된 검출가능한 모이어티를 통해 검출될 수 있도록 허용하는 검출 항체 또는 압타머일 수 있다. 다양한 유형의 상기 면역검정이 절단된 생성물을 측정하여 BoNT 또는 TeNT의 생물학적 활성을 검정하는 데 이러한 방식으로 사용될 수 있다.

한 측면에서, 본원에서 정의된 바와 같은 신경독소 절단 부위를 갖는 단백질의 절단은 웨스턴 블롯에 의해 측정될 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 절단은 ELISA, RIA, 또는 본원 또는 다른 곳에서 언급된 것을 포함하는, 다른 면역학적 검정 포맷에 의해 측정될 수 있다.

또 다른 측면에서, 상기 언급된 바와 같은 신경독소 절단 부위를 포함하고, 절단시 상기 부위에서 1개 이상의 물리적 및/또는 화학적 특성이 변경되는 인공 기질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 측면에서 구상되는 기질은 서로 물리적 및/또는 화학적으로 상호작용할 수 있고, 신경독소 절단 부위를 갖는 링커에 의해 이격될 수 있는 제1 및 제2 모이어티를 포함할 수 있다. 절단 부위의 절단 결과로서, 두 모이어티 사이의 상기 언급된 상호작용은 변경될 것이다. 적합한 모이어티는, 예컨대 비절단된 상태에서 공명 에너지 전달을 보이는 공여자 및 수용자 형광단으로서, 상기 공명 에너지 전달은 절단 이후에는 중단된다. 별법으로, 형광단 및 소광체는 절단 이후, 소광체의 소광 효과가 역전되는 경우에 적용될 수 있다. 상기 종류의 기질은, 예컨대 EP 1 438 586 B1, EP 2 208 067 A1, EP 1 543 329 A2, EP 1 869 459 B1, EP 2 293 064 B1, EP 1 920 248 B1, EP 2 264 458 A1, EP 2 332 959 A2, WO 2011/47241, EP 1 901 069 B1, EP 2 293 064 B1, EP 1 807 698 B1 또는 EP 2 107 112 B1 (상기 특허는 각각 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다) 중 하나에 기술되어 있다.

본 발명의 방법의 또 다른 구체적인 측면에서, 검정 단계는 제1 항체, 및 한 측면에서, 절단된 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 사용하여 상기 절단된 SNAP-25의 양을 측정하여 hiPS 세포 유래 뉴런 세포 중에 존재하는 절단된 SNAP-25의 양을 측정함으로써 수행된다. 또한, 세포 중에 존재한 전체 SNAP-25, 예컨대 절단된 및 비절단된 SNAP-25는 제2 항체, 및 한 측면에서, 상기 전체 SNAP-25에 결합하는 폴리클로날 항체에 의해 측정된다. 한 측면에서, 결합된 제1 항체의 양 및 결합된 제2 항체의 양은 검출제에 의해, 한 측면에서, 결합된 제1 항체의 양 및 결합된 제2 항체의 양 사이를 구별할 수 있도록 허용하는 하나 이상 검출 항체에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 제1 표지에 커플링되어 있고, 제1 항체에 결합하는 제1 검출 항체 및 제2 표지에 커플링되어 있고, 제2 결합 항체 결합하는 제2 검출 항체가 사용될 수 있다. 따라서, 결합된 제1 및 결합된 제2 항체의 양, 및 따라서, 절단된 및 전체 SNAP-25의 양은 이어서, 제1 및 제2 표지 측정량으로부터 도출될 수 있다. 한 측면에서, 본원에서 구상되는 제1 표지는 효소, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제일 수 있다. 또 다른 측면에서, 본원에서 구상되는 제2 표지는 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제일 수 있다. 표지는 비-형광성 기질의 형광성 생성물로의 검출가능한 전환을 촉매화시키는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 방법의 추가의 또 다른 측면에서, 검정 단계는, 예컨대 배양 배지로의 신경전달물질 방출을 측정함으로써 수행된다. 방출된 또는 비-방출된 신경전달물질의 양은 본원 또는 다른 곳에서 기술된 기법에 의해 측정될 수 있다.

이롭게는, 본 발명에 의해 고려되는 방법은 비-동물 공급원, 예컨대 hiPS 세포 유래 뉴런 세포에 기초하며, 따라서, 동물 시험은 수행하지 않는다. 그럼에도 불구하고, hiPS 세포 유래 뉴런 세포는, 예컨대 (a) 수용체 결합, (b) 내재화, (c) 엔도솜 막을 가로질러 시토졸 내로의 전위, 및/또는 (d) 시냅스 소포체 막 융합에 관여하는 단백질의 단백질내 분해성 절단과 같은 BoNT의 모든 생물학적 활성에 대한 시험을 필요로 한다. 따라서, 본 방법은 안전성 또는 품질 관리 수단을 위해 뿐만 아니라, 보통 예컨대 대규모 스크리닝 접근법을 필요로 하는 변형된 생물학적 특성을 갖는 BoNT를 개발하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 (a) hiPS 세포 유래 뉴런 세포를, 생물학적 활성 BoNT를 포함하는 제제와 접촉시키는 단계, 및 (b) 샘플을 BoNT의 생물학적 활성에 대하여 검정함으로써 제제 중에 존재하는 생물학적 활성 BoNT의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 생물학적 활성 BoNT를 포함하는 제제 중 생물학적 활성 BoNT의 양을 측정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원 다른 곳에서 언급된 바와 같은 조성물 중에서 BoNT 활성을 검정하기 위한 hiPS 세포 유래 뉴런 세포의 용도에 관한 것이다.

한 측면에서, 검정 단계는 BoNT 활성 및/또는 생물학적 활성 BoNT의 존재 또는 부재를 측정하는 것을 포함한다. 생물학적 활성 BoNT에 대한 정성적 검정은, 예컨대 제조 과정 동안의 안전 관리 수단으로서, 또는 BoNT의 제약상 또는 미용학적으로 적용하는 동안, 또는 예컨대 생물테러와 같이, BoNT에 기반한 범죄 행위를 막기 위한 것과 같이, BoNT에 의해 발생되는 임의의 피해를 막기 위해 위험 평가를 목적하는 적용에서 사용될 수 있다.

또 다른 측면에서, 검정 단계는 BoNT 활성 및/또는 생물학적 활성 BoNT의 양을 측정하는 것을 포함한다. 생물학적 활성 BoNT에 대한 정량적 검정은 BoNT 제조 과정 동안, 미용학적 또는 제약상 적용을 위해 생물학적 활성 BoNT의 적절한 용량을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 상기 검정은 또한 적절한 제약품 또는 미용용품의 품질 관리를 위해, 또는 그를 제제화하는 데 필요한 수단으로서도 유용할 수 있다.

본 발명은 또한 본원 다른 곳에서 언급된 바와 같은 상기 생물학적 활성 BoNT를 포함하는 제제 중 생물학적 활성 BoNT의 양을 측정하기 위한 hiPS 세포 유래 뉴런 세포의 용도에 관한 것이다.

상기의 본 명세서에서 인용된 참고 문헌은 그의 개시내용 전문 및 본 명세서에서 구체적으로 언급된 개시 내용과 관련하여 본원에 참조로 포함된다.

실험부

하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 실시양태 및 측면을 입증하고, 추가로 설명하기 위해 제공되며, 그의 범주를 제한하는 것으로 해석되서는 안된다.

실시예 1

A. 방법

뉴런 세포: 인간 iPS 유래 뉴런은 셀룰라 다이나믹스 인크.(미국 위스콘신주 매디슨)로부터 냉동된 상태로 공급받았다. 셀룰라 다이나믹스 지침서에 따라 뉴런을 해동시키고, 트립판 블루(Trypan B1ue) 배제 검정에 의해 생(live) 세포를 계수하였다. 달리 명시되지 않는 한, 세포를 0.01% 폴리-L-오르니틴 (시그마(SIGMA)) 및 8.3 ㎍/㎠ 마트리겔 (BD 바이오사이언시즈(Biosciences))로 코팅된 96 웰 디쉬 (TPP, MidSci)에 웰당 40,000개의 세포인 밀도로 시딩하고, 37℃, 5% CO₂에서 명시된 성숙 시간 동안 뉴런 배지 (B27 및 글루타맥스로 보충된 뉴로베이잘, 이들 모두 인비트로젠으로부터의 것이며, CDI에 의해 공급받음) 중에서 인큐베이션시켰다. 시딩 후 24 h째, 배지를 완전하게 바꾸고, 이후 매 2-3일마다 배지의 절반을 교체하였다.

1차 래트 척수 (RSC) 세포를 앞서 기술된 바와 같이 제조하고 (문헌 [Pellett et al., 2007 and 2010]), 마트리겔 코팅된 96 웰 플레이트에 웰당 75,000개의 세포인 밀도로 시딩하였다.

보툴리눔 신경독소: 앞서 기술된 바와 같이 (문헌 [Malizio et al., (2000) Methods Mol Biol 145: 27-39]; [Prabakaran et al., (2001) Toxicon 39: 1515-1531]), 순수한 보툴리눔 신경독소 (BoNT) A, B, C 및 E (150 kDa) 및 BoNT/A 복합체를 C. 보툴리눔 균주 홀 A 하이퍼(Hall A hyper), 오크라 B(Okra B), 브라질 C(Brazil C), 및 벨루가 E(Beluga E)로부터 제조하고, 그를 통해, 황산암모늄 침전 전 배양물에 0.2 mg/ml의 효모 RNA (시그마)를 첨가하는 추가의 단계를 포함하는 말리지오(Malizio) 등 (2000년)의 방법에 의해 BoNT/C 정제를 수행하였다. 독소를 인산염 완충 염수 (pH 7.4) 및 40% 글리세롤에 용해시키고, 사용시까지 -20℃에서 보관하였다. BoNT/A, /B, /C, /E 및 BoNT/A-복합체 제제의 활성은 마우스 생물검정에 의해 측정하였고 (문헌 [Hatheway CL (1988), 상기 문헌 동일]; [Schantz EJ & Kautter DA (1978) J Assoc Off Anal Chem 61:96-99]), 특이적 독성은 7 x 10⁷ 마우스 LD₅₀ 유닛/mg (BoNT/A1), 7.7x10⁷ LD₅₀ 유닛/mg (BoNT/A1 복합체), 1 x 10⁸ LD₅₀ 유닛/mg (BoNT/B), 1.1 x 10⁷ LD₅₀ 유닛/mg (BoNT/C), 및 7.6 x 10⁷ LD₅₀ 유닛/mg (BoNT/E)이었다.

뉴런 독성 검정: 모든 뉴런 독성 검정을 위해, 달리 명시되지 않는 한, iPS 뉴런을 50 ㎕의 뉴런 배지 중 일련의 BoNT 농도에 대하여 노출시켰다. 1차 래트 척수 세포를 결과부에서 명시되는 바와 같은 일부 검정에서 대조군 세포로서 사용하였다. 샘플 모두를 최소 3중으로 시험하고, 독소를 포함하지 않는 음성 대조군 또한 항체 포함시켰다. 명시된 노출 시간이 경과한 후, 독소 용액을 제거하고, 세포를 50 ㎕의 1 x LDS 샘플 완충제 (인비트로젠) 중에서 용해시켰다. 앞서 기술된 바와 같이 (문헌 [Pellett et al., (2007), 상기 문헌 동일]; [Pellett et al., (2010), 상기 문헌 동일]), 세포 용해물을 SNAP-25, 또는 VAMP2 절단에 대하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 절단 및 비절단된 밴드는 포토/아날리스트 FX(Foto/ Analyst FX) 시스템 및 토탈랩 콴트(TotalLab Quant) 소프트웨어 (포토다인(Fotodyne))를 사용하여 밀도 측정법에 의해 정량화하였다. 데이터 플롯을 작성하고, PRISM 소프트웨어를 사용하여 EC₅₀을 도출하였다.

매트릭스 선택: 최적의 표면 매트릭스를 선택하기 위해 상이한 7가지의 매트릭스 상에 뉴런을 시딩하였다. 매트릭스는 1.0 ㎍/㎠의 라미닌 (PDL 라미닌) 또는 8.3 ㎍/㎠의 마트리겔 (PDL 마트리겔)로 코팅된, 폴리-D-리신 코팅된 플레이트 (BD 바이오사이언시즈), 0.01% 폴리-L-오르니틴으로 코팅된 후, 1.0 ㎍/㎠의 라미닌 (PLO 라미닌) 또는 8.3 ㎍/㎠의 마트리겔 (PLO 마트리겔)로 코팅된 플레이트, BD 바이오사이언시즈로부터 구입한 PLO-라미닌 코팅된 플레이트 (PLO-라미닌 (BD)), BD 바이오사이언시즈로부터의 PDL 코팅된 플레이트 (PDL (BD)), 또는 0.01% PLO 코팅된 플레이트 (PLO (CDI))로 구성되었다. 뉴런을 14일 동안 성숙시키고, 뉴런을 48 h 동안 일련의 독소 희석액에 노출시킴으로써 BoNT/A에 대한 감도를 측정하였다. 뉴런 중 일부를 6주 동안 유지시키고, 상기와 같이 다시 시험하였다.

수용체 발현 분석: 수용체 발현 분석을 위해, iPS 뉴런을 0.75 ml의 부피 중 210,000개의 세포/웰의 밀도로 24 웰 플레이트 상에 플레이팅하였다. 75 ㎕ 1 x LDS 샘플 완충제 (인비트로젠) 중에 플레이팅한 후, 4, 7, 10, 14, 및 21일째에 3개의 웰로부터 각각 세포를 수거하였다. 웨스턴 블롯에 의해 세포 용해물을 SV2A, B, 및 C 이소형, 시냅토타그민 I 및 II, SNAP-25, VAMP 2를 인식하는 항체, 또는 VAMP 1, 2, 및 3 이소형을 인식하는 항체를 사용하는 VAMP, 및 신탁신의 발현에 대하여 분석하였다. 베타-액틴을 로딩 대조군으로서 사용하고, 1차 래트 척수 세포를 양성 대조군으로서 사용하였다. SV2C 항체 (문헌 [Janz R & Sudhof TC (1999) Neuroscience 94: 1279-1290])는 로거 얀츠(Roger Janz)로부터 넉넉하게 제공받았다. 다른 모든 항체는 시냅틱 시스템즈(Synaptic Systems: 독일 괴팅겐)로부터 입수하였다. 모든 항체는 인간 단백질을 인식한다.

실시간 qPCR에 의한 mRNA 분석을 위해, iPS 뉴런의 독립 배양물 3개를 각각 명시된 시간 동안 유지시켰다. 세포를 플레이트 상에서 직접 용해시키고, RN이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit) 및 RN아제-프리 DN아제 세트(RNase-Free DNase Set) (퀴아젠(Qiagen: 미국 캘리포니아주 발렌시아))를 사용하여 RNA를 정제하였다. 양성 대조군을 위해, 성인 인간 전체 뇌 RNA를 구입하였다 (애질런트 테크놀로지즈(Agilent Technologies: 미국 캘리포니아주 산타클라라)). 모든 샘플의 경우, 슈퍼스크립트 VILO cDNA 합성 키트(Superscript VILO cDNA Synthesis Kit) (라이프 테크놀로지즈(Life Technologies: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))를 이용하여 cDNA를 생성하였다. 택맨^® 유전자 발현 마스터 믹스(TaqMan^® Gene Expression Master Mix) 및 하기 택맨 인자 유전자 발현 검정: SNAP25 (Hs00938962_m1); STX1A (Hs00270282_m1); STX1B (Hs01041315_m1); VAMP1 (Hs00249911_m1); VAMP2 (Hs00360269_m1); VAMP3 (Hs00922166_m1); SV2A (Hs00372069_m1); SV2B (Hs00208178_m1); SV2C (Hs00392676_m1); SYT1 (Hs00194572_m1); SYT2 (Hs00980604_m1) 및 인간 GAPDH 내인성 컨트롤 프라이머 세트(Endogenous Control Primer Set) (이들 모두 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)로부터 입수)를 이용하여 라이트사이클러(LightCycler)^® 480 II (로슈(Roche: 스위스 바젤)) 상에서 실시간 qPCR 증폭을 수행하였다. 모든 샘플에 대하여 Abs 콴트(Quant)/2^nd 미분 분석을 수행하고, C_p 값을 내인성 GAPDH 발현에 대한 C_p로 정규화함으로써 상대적 변화 배수로 전환시켰다. 3개의 생물학적 복제물 내의 각 유전자에 대한 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 각 유전자에 대하여 기술상 4중으로 PCR 반응을 수행하였다.

활성-의존성 BoNT /A1 흡수 검정: BoNT/A1을 50 ㎕의 세포 자극 (B27 및 글루타맥스로 보충된, 2.2 mM CaCl 및 56 mM KCl을 함유하는, 인비트로젠 맞춤 뉴로베이잘 배지), 또는 뉴런 배지당 55 또는 275 U의 농도로 희석시키고, 4일 동안 성숙시킨 CDI iPS 뉴런 및 RSC 세포에 첨가하였다. 세포를 각각 1, 5, 10 및 15 min 동안 독소와 함께 인큐베이션시켰다. 음성 대조군의 경우, 독소 없이 각 배지를 세포에 첨가하였다. 독소를 제거하고, 세포를 즉시 200 ㎕의 뉴런 배지로 2회에 걸쳐 세척한 후, 200 ㎕의 새 뉴런 배지 중에서 24 h 동안 인큐베이션시켰다. 4개의 복제물 중에서 샘플을 수집하였다.

5 min 이내에 BoNT/A1의 활성-의존성 흡수가 이루어지도록 하는 데 필요한 최소 독소 농도를 측정하기 위해, 50 ㎕의 세포 자극 배지당 1.72 내지 55 U의 농도로 희석시켰다. 4일 동안 성숙된 iPS 뉴런을 5 min 동안 독소 희석액에 노출시킨 후, 독소를 제거하고, 뉴런 배지로 2회에 걸쳐 세척하고, 24 h 동안 뉴런 배지 중에서 인큐베이션시켰다. 희석액 모두를 4개의 복제물 중에서 시험하였다.

항체 보호 분석: 문헌 [Johnson et al., 1993]에 따라 BoNT/A1 특이적 항체를 제조하였다. 상이한 2가지 방법을 이용하여 중화 항체에 의한 iPS 뉴런에서의 BoNT/A1 활성 억제를 분석하였다. 첫번째 검정의 경우, 55 U의 BoNT/A1를 세포 자극 배지 중에서 일련으로 희석된 항체와 함께 조합하고, 37℃에서 1 h 동안 인큐베이션시켜 항체-독소 상호작용이 이루어지도록 하였다. 4일 동안 성숙된 iPS 뉴런을 5분 동안 독소-항체 혼합물에 노출시킨 후, 독소-항체 혼합물을 제거하고, 뉴런 배지로 2회에 걸친 세척 단계를 수행하고, 24 h 동안 뉴런 배지 중에서 인큐베이션시켰다. 두번째 검정의 경우, 1.5 U의 BoNT/A를 뉴런 배지 중 일련의 항체 희석액과 함께 조합하고, 37℃에서 1 h 동안 인큐베이션시켰다. iPS 뉴런을 24 h 동안 독소-항체 혼합물에 노출시켰다. 마우스 생물검정과의 비교는 167 ㎕의 부피 중 주변 온도에서 1.5 h 동안 5-10 U의 BoNT/A1와 함께 사전 인큐베이션된 일련의 항체 희석액을 사용하였다. 부피를 500 ㎕로 조정하고, 1개의 희석액당 4마리의 마우스에 주사하였다.

B. 결과

iPS 뉴런은 BoNT 중독에 중요한 수용체를 발현한다: 인간 iPS 유래 뉴런이 BoNT 활성을 검출하는 데 사용될 수 있는지 여부를 측정하기 위해, BoNT 세포 유입 및 촉매 활성에 필요한 수용체 및 표적 표적의 발현을 각각 웨스턴 블롯 및 정량적 PCR (qPCR)에 의해 분석하였다 (도 1). 웨스턴 블롯 결과, SV2A에 대한 신호, SV2B, 시냅토타그민 1, 신탁신, SNAP-25, VAMP2, 및 베타-액틴에 대한 약한 밴드를 얻었는데, 이 결과는 세포 플레이팅 후 21일간의 기간 동안 변함이 없었다 (도 1A). VAMP2는 VAMP2 특이적 항체로 검출된 반면, 3가지 VAMP 이소형 모두를 인식하는 항체는 어떤 신호도 나타내지 않았는데, 이는 VAMP2가 iPS 뉴런 중 우세한 VAMP 이소형이라는 것을 시사한다. 1차 래트 척수 세포 용해물을 항체 검출을 위한 양성 대조군으로서 사용하고, iPS 뉴런 대 RSC 세포의 상이한 밴드 강도는 항체에 의한 차별적 인식, 또는 상이한 발현 수준에 기인하는 것일 수 있다. qPCR에 의한 동일 단백질의 mRNA 수준에 대한 분석은 SV2B 및 C 이소형, 시냅토타그민 2, 및 VAMP1 및 3을 포함하는, 분석된 단백질 모두의 발현을 나타내는데 (도 2B), 이는 웨스턴 블롯에 의해서는 검출되지 않았다. 그러나, 상기 이소형의 mRNA 수준은 웨스턴 블롯에 의해 검출된 이소형 (SV2A, 시냅토타그민 1, 및 VAMP2)의 것보다 200배 이상 더 낮았다. 따라서, qPCR 데이터는 웨스턴 블롯 데이터를 뒷받침하며, iPS 뉴런이 상기 단백질 중 주로, 전뇌 뉴런을 나타내는 뉴런과 일치하는 SV2A, 시냅토타그민 1, 및 VAMP2 이소형을 발현한다는 것을 시사한다 (문헌 [Janz R & Sudhof TC (1999) Neuroscience 94: 1279-1290]). 모든 단백질의 발현 수준은 연구 전체 기간 동안에 걸쳐 변함이 없었고, 이는 세포가 플레이팅 후 4일째 완전하게 성숙되고, 21일 이상의 기간 동안 안정한 상태 그대로 유지되었다는 것을 시사한다.

표면 매트릭스는 BoNT /A1 검정에 있어 세포의 품질에 영향을 주지 않는다: 플레이팅 매트릭스가 BoNT에 대한 감도에 영향을 주는지 여부를 측정하기 위해, 상이한 7가지의 매트릭스 상에 플레이팅된 뉴런을 BoNT/A1 감도에 대하여 시험하였다. 뉴런은 모든 매트릭스 부착되고, 그 상에서 성숙되어 축삭 돌기 및 수상 돌기의 네트워크 형성은 증가하였다. 라미닌 또는 마트리겔을 포함하는 플레이트 상에서 성장된 세포와, 포함하지 않는 경우의 세포 사이에는 형태학상 유의적인 차이가 관찰되었다. PDL (BD 바이오사이언시즈) 라미닌 또는 마트리겔 플레이트 상, 또는 PLO (셀룰라 다이나믹스) 라미닌 또는 마트리겔 플레이트 상에서 성장시킨 세포는 대개 단층으로 성장하였지만, 긴 축삭 돌기가 응집체 그로부터 주로 플레이트의 주변 둘레로 연장되어 있는 일부 응집체를 형성하였다. 대조적으로, PLO 또는 PDL 플레이트 상에서 성장시킨 세포는 세포 네트워크 사이에 축삭 돌기 및 수상 돌기가 걸쳐 있는 세포의 단일 단층 상태 그대로 유지되었다. PLO 라미닌 (BD 바이오사이언시즈) 상에서 성장시킨 세포는 PLO 또는 PDL 플레이트 상에서 성장시킨 세포와 유사하였다.

14일 동안의 성숙 이후, 뉴런을 일련의 BoNT/A 희석액에 노출시키고, 세포 용해물을 웨스턴 블롯 분석한 결과, SNAP-25 절단은 시험된 모든 기질에 대해 거의 동일하게 나타났다 (도 2). 검출 한계는 0.05 마우스 LD₅₀ 유닛이었고, 절단은 1.75 내지 3.5 U에서 완료되었다. EC₅₀ 범위는 0.21 내지 0.31이었다.

상기 데이터는 세포가 상기 검정을 위해 시험된 표면 매트릭스 중 어느 것에나 플레이팅될 수 있다는 것을 시사한다. 하기의 모든 실험은 PLO-마트리겔 코팅된 플레이트 상에서 수행하였다. 세포 응집을 감소시키기 위하여, 표면적이 더욱 평평한 TPP 플레이트 (MidSci)를 사용하였다. 이를 통해 웰 주변 둘레의 응집은 제거되었다.

4-14일 동안의 세포 성숙 시간은 탁월하고 감도가 좋은 BoNT /A1 시험 플랫폼을 제공한다: 세포 성숙 시간이 iPS 뉴런의 BoNT 감도에 영향을 미치는지 여부를 측정하기 위해, 플레이팅 후 4 및 7일째 같은 독소 희석액을 사용하여 동시에 세포를 BoNT/A1 감도에 대하여 분석하였다. 현재 BoNT 검출에 대해 기술된 세포 중 가장 고감도인 1차 래트 척수 세포 (RSC 세포) (문헌 [Pellet et al., 2007, 상기 문헌 동일]; [Pellett et al., (2010) J Pharmacol Toxicol Methods])와 iPS 뉴런의 감도를 비교하기 위해 RSC 세포 또한 동시에 시험하였다. 결과 데이터를 통해 일관되게 EC₅₀은 ~0.3 U로, 4 또는 7일 동안 성숙된 세포의 감도에 있어 어떤 통계학상 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다 (도 3). 이는 상기 14일째 세포 (도 2) 및 RSC 세포에 대하여 관찰된 EC₅₀과 유사하다. iPS 뉴런에 대한 용량-반응 곡선은 RSC 세포에 대한 곡선보다 그 기울기가 유의적으로 더 급격하였고, 100% 절단은 1.75 U로 도달된 반면, RSC 세포에서는 사용된 독소 농도로는 100% 절단에 도달하지 못하였다. 이는 고순도의 iPS 뉴런에 기인하는 것일 수 있다. 따라서, 4-14일 동안 성숙된 세포가 BoNT/A1 검출 및 정량화를 위한 재현가능한 고감도 세포 기반 모델을 제공한다. 추가로, 상이한 4가지 iPS 세포 로트에 대한 시험은 BoNT/A1 감도에 있어 중요한 차이는 없는 것으로 나타났다.

iPS 뉴런 감도는 노출 시간이 길수록 증가한다: 세포를 일련의 BoNT/A1 희석액에 노출시키고, 독소 첨가 후, 6, 16, 24, 및 48 h째에 샘플을 수거함으로써 iPS 뉴런에서의 BoNT 검출의 시간 의존성을 조사하였다. 결과 데이터를 통해 일관되게, 48 h 노출시 감도는 가장 컸으며, 그 감도는 24 h 검정과 비교하여 ~3배 증가, 및 16 h 검정과 비교하여 ~6배 증가한 것으로 나타났다 (도 4). 6 h 독소 노출시, 감도는 ~130배 증가하였고, EC₅₀은 약 40 유닛이었다.

iPS 뉴런의 BoNT /A1 흡수 속도가 RSC 세포보다 빠르다: iPS 뉴런 및 RSC 세포를 동시에 82 U의 BoNT/A1에 노출시키고, 2, 4, 6, 8, 및 10 h째에 SNAP-25 절단을 평가함으로써 RSC 세포와 비교하여 iPS 뉴런으로의 BoNT/A1 흡수 속도를 조사하였다. 뉴런 활성에 기인하여 BoNT 흡수 속도가 더 빨라지는 것으로 보고되었는 바 (문헌 [Keller et al., (2004), 상기 문헌 동일]), 상이한 2가지 배지를 사용하여 활성-의존성 및 비의존성 독소 흡수 사이를 구별하였다. 제1 배지는 뉴런 배지 (NM)였고, 제2 배지는 뉴런 세포 활성을 화학적으로 자극시키기 위해 56 mM KCl 및 2.2 mM CaCl₂를 함유하는, 뉴런 배지의 변형된 버전인 세포 자극 배지 (CSM)였다.

iPS 뉴런을 통해 RSC 세포보다 유의적으로 더 먼저 및 더 완전하게 SNAP-25 절단이 이루어졌다. iPS 뉴런에서, 100%의 SNAP-25 절단은 8 h째에, 및 50%의 SNAP-25 절단은 ~4 h째에 이루어졌다 (도 5). 대조적으로, RSC 세포에서는 10 h 이후에 단 ~70-80%의 SNAP-25 절단에 도달하였고, ~50%의 SNAP-25 절단은 6 h째에 관찰되었다. 어느 세포 유형에서든 뉴런 배지와 세포 자극 배지 사이에는 어떤 차이도 관찰되지 않았으며, 이는 시간 프레임에서 시험된 뉴런 활성이 세포 내로의 BoNT 흡수에는 어떤 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다. 상기 데이터는 상기 검정을 통해 더욱 빠른 독소 흡수와 더욱 빠른 SNAP-25의 절단 사이를 구별하지는 못하지만, iPS 뉴런이 RSC 세포보다 BoNT/A에 대하여 감도가 유의적으로 더욱 크고, 더 빠른 속도로 독소를 흡수한다는 것을 시사한다.

iPS 뉴런은 활성-의존성 검정에서 RSC 세포보다 더욱 빠르게 BoNT /A1을 흡수한다: iPS 뉴런이 활성-의존성 방식으로 BoNT를 흡수하는지 여부를 추가로 조사하기 위해, 4일 동안 성숙된 iPS 뉴런 및 RSC 세포를 각각 세포 자극 배지 중 55 및 275 U의 BoNT/A1에 노출시켰다. 세포를 1, 5, 10 또는 15 min 동안 독소에 노출시킨 후, 독소를 완전히 제거하고, 24 h 동안 뉴런 배지 중에서 인큐베이션시켜 SNAP-25 절단이 이루어지도록 하였다. 빠르면 55 U의 BoNT/A1에의 노출 후 1 min째부터 iPS 뉴런에서 유의적인 SNAP-25 절단이 관찰되었다 (도 6A). 5 min 후, 약 75%의 SNAP-25가 절단되었고, 더욱 장시간의 독소 노출과 어떤 유의적인 차이는 없었으며, 이는 5분 이내에 흡수가 완료된다는 것을 나타낸다. 275 U에 노출시켰을 때, 시험된 모든 노출 시간에 SNAP-25 절단이 완료되었다 (도 6A). 대조적으로, RSC 세포를 55 유닛의 BoNT/A1에 노출시켰을 때에는 최대 15 min의 노출 시간 이후에도 유의적인 SNAP-25 절단은 일어나지 않았고, 275 U에의 10 min 이상의 노출 이후에는 단지 약 30-40%의 SNAP-25만이 절단되었다 (도 6A). 이는 iPS 뉴런이 활성-의존성 방식으로 BoNT/A1을 흡수하고, 이러한 흡수는 RSC 세포보다 현저히 더욱 효율적으로 및 더 빠르게 이루어진다는 것을 시사한다.

iPS 뉴런에서의 빠른 흡수는 활성-의존성이라는 것을 확인하기 위해, 뉴런을 세포 자극 배지 또는 뉴런 배지 중 55 U의 BoNT/A에 1, 5, 또는 10 min 동안 노출시켰다. 세포 자극 배지로 처리된 세포에서 유의적으로 더 많은 SNAP-25 절단이 일어났으며, SNAP-25 절단의 50%는 1 min 후에 관찰되었고, 70% 절단은 5 min 후에 관찰되었다 (도 6B). 대조적으로, 뉴런 배지 중에서는 10분 후, 단지 약 20%의 SNAP-25가 절단되었다 (도 6B). 이는 BoNT/A1의 iPS 뉴런 내로의 빠른 흡수는 활성-의존성이라는 것을 시사한다.

iPS 뉴런에 의한 활성-의존성 BoNT/A1 흡수의 농도 의존성을 측정하기 위해서, 세포를 5 min 동안 세포 자극 배지 중 1.7-55 U의 BoNT/A1에 노출시켰다. 독소 제거 후, 세포를 24 h 동안 인큐베이션시켜 SNAP-25 절단이 이루어지도록 하였다. 독소 농도가 증가함에 따라, SNAP-25 절단의 농도 의존성 증가가 관찰되었으며, 약 30 U일 때, 50%의 SNAP-25 절단이 이루어졌다 (도 6C).

BoNT /A1 특이적 항체는 BoNT /A1에 의한 SNAP -25 절단으로부터 iPS 뉴런을 보호한다: 상이한 2가지 검정 포맷을 이용하여 항체 보호 검정에 의해 iPS BoNT 검정의 특이성을 확인하였다. 제1 검정에서, SNAP-25 절단이 거의 완전하게 일어나도록 하는 데 필요한 최소량 (1.5 유닛)의 독소를 이용하여 세포를 독소 항체 혼합물에 24 h 동안 노출시켰다. 제2 검정에서는, 세포를 세포 자극 배지 중 일련으로 희석된 항체 및 55 U BoNT/A의 혼합물에 5 min 동안 노출시킨 후, 독소를 제거하고, 24 h 동안 인큐베이션시켰다. 제1 검정 결과, 항체 검출에 있어 유의적으로 더욱 고감도인 결과를 얻었다. 뉴런은 0.0025 ㎕ 정도의 소량의 항체로도 SNAP-25 절단으로부터 완전하게 보호되었다. 0.000625 ㎕의 항체에 이르기까지 유의적인 부분적 보호가 관찰되었다 (도 7A). 0.5 U의 BoNT/A1 및 48 h 노출을 사용하여 항체를 RSC 세포에서 시험하였을 때, 앞서 동일한 보호 패턴이 관찰되었다. 마우스 생물검정에 의해 같은 항체 희석액을 시험한 결과, 이전 데이터로서 마우스 생물검정과 비교하여 세포 기반 검정은 ~10배 이상 더 큰 고감도 또한 보인 것으로 나타났다. RSC 검정은 중화 항체 검출에 있어서 마우스 생물검정보다 더욱 감도가 큰 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Pellett,S. 2007, 상기 문헌 동일]). 제2 (활성-의존성) 검정은 약 10배 정도 감도가 더 낮았으며, 전체 보호를 위해서는 50 ㎕당 0.016 ㎕의 항체를 필요로 하였고, 0.004 ㎕에서 부분 보호가 관찰되었다 (도 7B).

이를 통해 상기 검정의 특이성이 확인되었고, 이는 iPS 뉴런이 중화 항체 검출을 위한 탁월하고 고감도인 검정을 제공하며, 보다 소량의 독소에 장시간 동안 노출시키는 것이, 보다 다량의 독소와 보다 단시간의 노출 시간을 필요로 하는 활성-의존성 검정보다 감도가 더욱 크다는 것을 시사한다. 활성-의존성 검정은 일부 목적, 예컨대 세포독성일 수 있거나 또는 시간이 경과함에 따라 뉴런을 손상시킬 수 있는 용매 중에 용해시켜야 하는 화합물 또는 항독소를 스크리닝하는 데 유용하다.

천연 복합체 형태의 BoNT /A1 독소를 검출하는 것이 정제된 독소를 검출하는 것보다 감도가 더 크다: BoNT는 수개의 다른 단백질 (BoNT/A의 경우, 비독성 비헤마글루티닌 단백질 (NTNH) 및 헤마글루티닌 (HA) (문헌 [Johnson EA & Bradshaw M (2001) Toxicon 39: 1703-1722]에서 검토됨))과의 복합체로서 클로스트리디움에서 발현된다. 비독성 복합체 단백질이 위장관의 분해성 pH로부터 독소를 보호하는 것으로 여겨진다 (문헌 [Oguma et al., (2000) Microbial Foodborne Diseases : Mechanisms of Pathogenesis and Toxin Synthesis 273-293]). 비록 오직 정제된 BoNT만을 함유하는 보다 신규의 제제 (제오민(Xeomin)^® 제제)도 현재 FDA로부터 승인을 받은 상태이기는 하지만, BoNT/A에 대해 가장 일반적으로 사용되는 의료용 제제 (보톡스(BOTOX)^® 및 디스포트(Dysport)^® 제제)는 전체 독소 복합체로 구성된다. 그의 천연 복합체 형태의 BoNT/A1이 iPS 뉴런에서 순수한 BoNT/A1과 동일한 감도로 검출되는지 여부를 측정하기 위해, 세포를 동량의 BoNT/A1 복합체 또는 정제된 BoNT/A1에 동시에 노출시켰다. 밀도 측정법에 의해 측정된 바, 복합체는 약 24%의 BoNT/A1, 및 76%의 다른 비독성 관련 단백질로 구성되었다 (도 8A). 정제된 BoNT/A1 제제 및 BoNT/A1 복합체의 비(specific) 활성은 유사하였다 (7 x 10⁷ U/mg 및 7.3 x 10⁷ U/mg). 직접 비교에서, 완전한 SNAP-25 절단에 도달하기 위해서 복합체의 독소 성분은 유의적으로 더 소량이 요구되었다 (도 8B). 이러한 관찰 결과는 상기 복합체의 비독성 단백질이, 가능하게는 뉴런 배지 중에서의 보호 효과에 기인하여, 상기 검정에서 BoNT/1A의 활성을 증가시켰다는 것을 나타낸다.

iPS 뉴런은 BoNT 혈청형 B, C, 및 E 검출을 위한 고감도의 세포 모델이다: BoNT 수용체 분석을 통해 iPS 뉴런은 모든 BoNT 혈청형의 세포 유입에 필요한 수용체 및 SNARE 단백질을 발현하는 것으로 나타났다 (도 1). BoNT/A 및 /E는 SNAP-25를 절단하고, BoNT/B는 VAMP를 절단하고, BoNT/C는 SNAP-25 및 신탁신을 절단한다 (문헌 [Humeau et al., (2000) Biochimie 82: 427-446]). 상이한 혈청형에 대한 뉴런의 감도를 시험하기 위해, BoNT/B, C, 또는 E의 일련의 희석액을 48 h 동안 iPS 뉴런 또는 RSC 세포에 동시에 첨가하고, 세포 용해물을 웨스턴 블롯을 통해 그의 각 뉴런 기질 절단에 대하여 검정하였다. iPS 뉴런은 일관되게 RSC 세포와 동일하거나 또는 그보다 더 큰 감도로 모든 BoNT 혈청형을 검출하였다 (도 9). iPS 뉴런 및 RSC 세포에 대한 EC₅₀ 값은 BoNT/B의 경우, 15.71 U 및 29.22 U이고 (도 9A), BoNT/C의 경우, 0.4 U 및 0.36 U이고 (도 9B), 및 BoNT/E의 경우, iPS 뉴런에서 1.79 U였다 (도 9C). RSC 세포에서 BoNT/E에 대한 EC₅₀ 값은 PRISM 소프트웨어를 이용해서는 도출할 수 없었지만, iPS 뉴런의 것과 유사한 것으로 추정되었다 (도 9C).

상기 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허 출원 및 등록 번호는 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 비록 본 발명은 구체적인 실시양태와 관련하여 기술되기는 하였지만, 청구되는 본 발명은 상기 구체적인 실시양태로 과도하게 제한되지 않어야 한다는 것을 이해하여야 한다. 실제로, 본 발명의 기술된 조성물 및 방법의 다양한 수정 및 변형은 당업자에게 자명할 것이며, 하기 특허청구범위의 범주 내에 포함시키고자 한다.

Claims

a) 인간 유도성 만능 줄기 세포 (hiPS) 유래 뉴런 세포를, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 신경독소 (BoNT)를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 BoNT를 생물학적 활성에 대하여 검정하는 단계
를 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT)를 활성에 대하여 검정하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 BoNT가 상기 BoNT의 A, B, C, E 및 변형된 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형을 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 생물학적 활성이 SNAP-25 절단, VAMP2 절단 및 신경전달물질 방출로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 검정이 정성적인 방법.
제1항에 있어서, 상기 검정이 정량적인 방법.
제1항에 있어서, 상기 BoNT가 정제된 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 BoNT가 복합체 형태가 아닌 방법.
제1항에 있어서, 상기 BoNT가 복합체 형태인 방법.
제1항에 있어서, 상기 hiPS 유래 뉴런 세포를 접촉시키기 전에, 상기 BoNT를 BoNT에 대한 항체 또는 BoNT의 소형 분자 억제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
삭제
제9항에 있어서, 상기 BoNT에 대한 항체가 중화 항체인 방법.
제11항에 있어서, 상기 중화 항체가 정제된 항체, 혈청 및 항독소로 이루어진 군으로부터 선택되는 샘플 중에 존재하는 것인 방법.
a) 인간 유도성 만능 줄기 (hiPS) 세포 유래 뉴런 세포를, i) 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT); 및 ii) 중화 항체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 BoNT를 생물학적 활성에 대하여 검정하는 단계
를 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 (BoNT)를 활성에 대하여 검정하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 BoNT가 상기 BoNT의 A, B, C, E 및 변형된 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형을 갖는 것인 방법.
제13항에 있어서, 상기 생물학적 활성이 SNAP-25 절단, VAMP2 절단 및 신경전달물질 방출로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제13항에 있어서, 상기 검정이 정성적인 방법.
제13항에 있어서, 상기 검정이 정량적인 방법.
제13항에 있어서, 상기 BoNT가 정제된 것인 방법.
제13항에 있어서, 상기 BoNT가 복합체 형태가 아닌 방법.
제13항에 있어서, 상기 BoNT가 복합체 형태인 방법.
제13항에 있어서, 상기 중화 항체가 정제된 항체, 혈청 및 항독소로 이루어진 군으로부터 선택되는 샘플 중에 존재하는 것인 방법.
(a) 인간 유도성 만능 줄기 세포 (hiPS) 유래 뉴런 세포를, 생물학적 활성 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 신경독소 (BoNT)를 포함하는 제제의 샘플과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 샘플을 BoNT의 생물학적 활성에 대하여 검정함으로써 제제 중에 존재하는 생물학적 활성 BoNT의 양을 측정하는 단계
를 포함하는, 생물학적 활성 BoNT를 포함하는 제제 중 생물학적 활성 BoNT의 양을 측정하는 방법.
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