MX2014003874A - Composiciones y metodos para pruebas de toxigenicidad. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para probar agentes (por ejemplo, detección y análisis de neurotoxina de Clostridium botulinum (BoNT)). En particular, la presente invención se refiere al uso de células derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPS) para la detección y análisis de agentes.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA PRUEBAS DE TOXIGENICIDAD Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud provisional de E.U .A. No. 61 /540,693 , presentada el 29 de septiembre de 201 1 , la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y métodos para probar agentes (por ejemplo, detección y análisis de neurotoxina de Clostridium botulinum (BoNT). En particular, la presente invención se refiere al uso de células derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPS) para detección y análisis de agentes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las neurotoxinas botulínicas (BoNTs), sintetizadas por la bacteria Gram-positiva que vive en el suelo Clostridium botulinum, son las sustancias más tóxicas conocidas por la raza humana y son los agentes causantes de la enfermedad neuroparalítica botulismo (Johnson E (2005) en Topley and Wilson 's microbiology and microbial infections, ed S . P. Borriello, P . R. Murray, y G. Funke (Hodder Arnold, Londres, Reino Unido), páginas 1 035- 1 088). Siete serotipos inmunológicamente distintos de BoNTs designados A a G han sido descritos (Giménez DF & Giménez JA ( 1995) Int J Food Microbiol 27: 1 -9). Las BoNTs se sintetizan inicialmente como un polipéptido de cadena individual de alrededor de 150 kDa, pero el corte proteolítico después de la traducción produce cadenas pesada y ligera distintas (HC y LC) de - 100 kDa y -50 kDa enlazadas por un enlace de disulfuro. La HC se divide funcionalmente más en los sub-dominios HCc y HCN- El dominio HCc es responsable de reconocimiento y unión a receptores de superficie de células neuronales específicos llevando a endocitosis, mientras que el dominio HCN es responsable de la formación de canales en la membrana de vesículas endocíticas y translocación e internalización de la LC a través de la membrana endosómica (Montecucco et al. , (2004) Trends Microbiol 12: 442-446; Fischer A & Montal M (2007) J Biol Chem 282 :29604-2961 1 ; Fischer A, et al (2009) Proc Nati Acad Sci E. U.A. 106 : 1330- 1335). Durante la translocación, el enlace de disulfuro es cortado, y la LC es liberada en el citosol celular y redoblada al componente de enzima activa como una endopeptidasa dependiente de zinc (Fischer et al. , citado arriba; Fischer A & Montal M (2007) Proc Nati Acad Sci E. U.A. 104: 1 0447- 1 0452). La LC se dirige luego específicamente y corta una proteína SNA E intracelular en las vesículas presinápticas, lo cual lleva a inhibición de liberación de neurotransmisores. Cada serotipo de BoNT tiene un objetivo de corte distinto, con BoNT/A y E cortando SNAP-25 en sitios distintos, BoNT/B, D, F y G cortando VAMP/sinaptobrevina en sitios diferentes, y BoNT/C cortando tanto SNAP-25 como sintaxina (revisado en Montecucco C & S chiavo G ( 1994) Mol Microbiol 13: 1 -8).

El botulismo de origen natural es una enfermedad rara pero seria, con alrededor de 1 10 casos ocurriendo al año en los Estados Unidos y una tasa de mortalidad de -5- 10% (Johnson EA & Montecucco C (2008) en Handbook of Clinical Neurology, ed Andrew G. Engel (Elseviere, páginas 333 -368) . Debido a su extrema potencia (la dosis letal humana estimada de 1 ng/kg de peso corporal para BoNT/A (Bossi P, et al, (2006) Cell Mol Life Scie 63 :21 96-2212), la severidad de la enfermedad de botulismo y alto costo implicado en los casos de tratamiento, especialmente a gran escala, las BoNTs han sido clasificadas como un Agente Selecto categoría A y presentan una seria amenaza como un arma de bioterrorismo (Arnon S S, et al, (2001 ) JAMA 285 : 1 059- 1070).

BoNT/A y en un grado mucho menor BoNT/B también están siendo usadas como farmacéuticos únicos e importantes para tratar una variedad de trastornos neuromusculares y en cosmética. Las condiciones para las cuales la administración de fármacos y alimentos aprobó el uso de BoNTs incluyen tratamientos cosméticos y para aliviar temporalmente una variedad de trastornos de espasticidad muscular, hiperhidrosis y migrañas (Chaddock JA & Acharya KR (201 1 ) FEBS J 278 : 899-904) . Las aplicaciones cosméticas y clínicas de BoNTs se están incrementando, y se están desarrollando nuevas formulaciones de BoNTs para propósitos farmacéuticos que requieren de pruebas clínicas, determinación de potencia precisa y análisis de anticuerpos neutralizantes. Por ej emplo, las BoNTs se administran farmacéuticamente para el tratamiento de trastornos de dolor, fuerza muscular voluntaria, distonía focal, incluyendo distonía cervical y craneal y blefaroespasmo esencial benigno, espasmo hemifacial y espasticidad focal, trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis, y corrección cosmética de arrugas, blefaroespasmo, distonía oromandibular, tipo de apertura de la mandíbula, tipo de cierre de la mandíbula, bruxismo, síndrome de Meige, distonía lingual, apraxia del párpado, distonía cervical de apertura, antécolis, retrócolis, laterócolis, tortícolis, distonía faríngea, distonía laríngea, disfonía espasmódica/tipo aductor, disfonía espasmódica/tipo abductor, disnea espasmódica, distonía de extremidades, distonía de brazo, la distonía específica de tarea, calambre del escritor, calambres del músico, calambre del golfista, distonía de la pierna, aducción del muslo, flexión de la rodilla por abducción de muslo, extensión de la rodilla, flexión del tobillo, extensión de tobillo, equinovaro, distonía del pie por deformidad, dedo del pie estriado, flexión de los dedos, extensión del pie, distonía axial, síndrome de pisa, distonía por danza del vientre, distonía segmentaria, hemidistonía, distonía generalizada, distonía en Lubag, distonía en degeneración corticobasal, distonía en Lubag, distonía tardía, distonía en la ataxia espinocerebelosa, distonía en la enfermedad de Parkinson, distonía en la enfermedad de Huntington, distonía en la enfermedad de Hallervorden-Spatz, discinesias inducidas por dopa/distonía inducida por dopa, discinesias tardías/distonía tardía, discinesias/distonías paroxísticas, mioclono palatino inducido por acción kinesiogénica no kinesiogénica, mioquimia mioclonías, rigidez, calambres musculares benignos, barbilla temblorosa hereditaria, actividad paradójica de músculo de la mandíbula, espasmos hemimasticatorios, miopatía hipertrófica branquial, hipertrofia masetérica, hipertrofia tibial anterior, nistagmo, parálisis visual supranuclear oscilopsia, epilepsia, parcial continua, la planificación de operación de tortícolis espasmódica, parálisis de las cuerdas vocales abductoras, disfonía mutacional recalcitrante, disfunción del esfínter esofágico superior, granuloma de las cuerdas vocales, tartamudez, síndrome de Gilíes de la Tourette, mioclonías del oído medio, cierre de laringe protector, postlaringectomía, insuficiencia de voz, ptosis protectora, disfunción Odii de esfínter entropión, seudoacalasia, nonacalsia, trastornos motores esofágicos, vaginismo, temblor por inmovilización postoperatoria, disfunción de la vejiga, disinergia del esfínter detrusor, espasmo del esfínter de la vejiga, espasmo hemifacial, discinesias por renervacion, pies de craw por uso cosmético, frunciendo asimetrías faciales por ceño, hoyuelos mentoniano, síndrome de persona rígida, hiperplasia de próstata por tétanos, adiposidad, tratamiento infantil de estrabismo por parálisis cerebral, concomitante paralítico mixto, después de cirugía de desprendimiento de retina, después de cirugía de cataratas, en estrabismo miosítico por afaquia, estrabismo miopático, desviación disociada vertical, como complemento de la cirugía de estrabismo, esotropía, exotropía, acalasia, fisuras anales, hiperactividad de las glándulas exocrinas, síndrome de Frey, síndrome de lágrimas de cocodrilo, hiperhidrosis, rinorrea axilar palmar plantar, hipersalivación relativa en el accidente cerebrovascular, en mal de Parkinsosn, en esclerosis lateral amiotrófica, estados espásticos, en procesos autoinmunes de encefalitis y mielitis, esclerosis múltiple, mielitis transversa, síndrome de Devic, infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones parasitarias, infecciones por hongos, en infarto hemisférico por síndrome postapopléctico por paraparesia espástica hereditaria, infarto del tallo cerebral, infarto de médula espinal, en trauma del sistema nervioso central, lesiones hemisféricas, lesiones del tallo cerebral, lesión de médula espinal, en hemorragia del sistema nervioso central, hemorragia intracerebral, hemorragia subaracnoidea, hemorragia subdural, hemorragia intramedular, en neoplasias, tumores hemisféricos, tumores del tallo cerebral y tumores de médula espinal. Así, la detección cuantitativa y confiable de la actividad de BoNT en el ambiente, en alimentos, en preparaciones farmacéuticas, para detección de anticuerpos y en aplicaciones de investigación es crucial tanto en la prevención de botulismo, como para contra-terrorismo, así como en el desarrollo de fármacos nuevos y pruebas de productos para control y aseguramiento de seguridad y calidad en pacientes.

Se han publicado muchos métodos de detección de BoNT, y se pueden dividir en cuatro categorías generales (revisado en Cai et al. , (2007) Crit Rev Microbiol 33 : 109- 125) : 1 . Ensayos in vitro que detectan inmunológicamente la presencia de holotoxina pero no pueden distinguir entre estados activo o inactivo (ELISA) : 2. Ensayos de endopeptidasa que detectan la actividad enzimática de la toxina LC pero no distinguen entre holotoxina biológicamente activa y la LC únicamente; 3. Ensayos in vivo (bioensayo en ratón); y finalmente 4. Ensayos de estimulación in vivo tales como el ensayo de hemidiafragma, ensayos de inyección local y ensayos a base de células usando células primarias o inmortalizadas. Para poder detectar BoNTs completamente activas, un ensayo de detección debe medir todas las etapas del proceso de intoxicación (por ej emplo, unión HC a los receptores de superficie celular, endocitosis, formación de canales de vesículas, corte del enlace de disulfuro, transducción de la LC en el citosol celular y finalmente corte proteolítico de proteínas SNARE). Sólo el bioensayo de ratón y los ensayos de simulación in vivo miden todas estas etapas. El bioensayo de ratón incluye inyectar ratones ya sea intravenosamente o intraperitonealmente con diferentes diluciones de BoNT, y luego observar los ratones para síntomas de envenenamiento por botulismo (parálisis de extremidades, respiración dificultada, pelaje ondulado, etc.) (Hatheway CL ( 1988) en Laboratory diagnosis of infectious diseases: principies and practice. Eds Balows A, Hausler WH, Ohashi & Turano MA (Springr-Verlag, Nueva York), páginas 1 1 1 - 133 ; Schantz EJaK, D.A. ( 1 978) Journal of the Association of Official Analytical Chemist 61 :96-99) y finalmente muerte. Aunque la MBA es cuantitativa y puede monitorear todas las etapas de intoxicación, tiene un gran índice de error, no es estandarizada entre o dentro de laboratorios, requiere de un gran número de animales y de instalaciones y personal entrenado correspondientes. Los ensayos de hemidiafragma e inyección local reducen el sufrimiento de animales y algunos son suficientemente sensibles, pero todavía requieren grandes números de animales y personal especializado.

Estas desventaj as claramente identificadas de estos ensayos han incitado una recomendación de agencias reguladoras incluyendo la FDA y USDA para desarrollar un modelo a base de células que proporcione una alternativa específica, sensible y cuantitativa a la MBA (National Institute of Environmental Health Sciences, 2008). Varias líneas de células continuas, incluyendo neuro-2a y PC- 12, han sido usadas para pruebas de toxicidad, pero no son lo suficientemente sensible como para competir con el MBA. Las neuronas primarias derivadas de rata, ratón o pollo, y neuronas derivadas de células madre embrionarias de ratón son significativamente más sensibles (Hall YH, et al (2004) J Immunol Methods 288 : 55-60; Keller JE, Cai F & Neale EA (2004) Biochemistry 43 : 526-532; Lalli G, et al ( 1999) J Cell Sci 1 12 (Pt 16) : 2715-2724; Neale et al., ( 1 999) J Cell Biol 147 : 1249- 1260; Stahl AM, et al (2007) J Biomol Screen 12 :370-377). El tipo de células más sensible para pruebas de toxicidad y detección de anticuerpos descrito es un ensayo de células de médula espinal de rata primaria (RSC) (Pellet et al ., (2007) FEBS Lett 581 : 4803 -4808), que es más sensible que el MBA, reproducible y se correlaciona bien con el bioensayo de ratón (Pellet et al. , (201 0) J Pharmacol Toxicol Methods). Además, neuronas derivadas de células madre embrionarias también han demostrado ser altamente sensibles (McNutt et al., (201 1 ) Biochem Biophys Res Commun 405 : 85-90; Pellett S, et al (201 1 ) Biochem Biophys Res Commun 404 : 388 -392; Kiris E, et al (20 1 1 ) Stem Cell Res) . Sin embargo, el ensayo RS C aún requiere el uso de alguno s animales y personal calificado para preparación de células, y no es fácilmente adaptable a estandarización de pruebas debido a la necesidad de preparar continuamente nuevos lotes de células .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y métodos para probar agentes (por ej emplo, detección y análisis de neurotoxina de Clostridium botulinum (BoNT)) . En particular, la presente invención se refiere al uso de células derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPS) para detección y análisis de agentes .

Las modalidades de la presente invención proporcionan células neuronales (por ej emplo, derivadas de humanos (por ej emplo, derivadas de iPS)) para usarse en aplicaciones de investigación, análisis, clínicas y terapéuticas. En algunas modalidades, lo s métodos se usan en la detección y análisis de BoNT y anticuerpos neutralizantes contra B oNT . Ej emplos de modalidades se describen en la presente y abaj o . Modalidades adicionales se describen aquí y están dentro del conocimiento de alguien de capacidad en la técnica.

Por ej emplo, en algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para ensayar una especie clostrial (por ej emplo, neurotoxina botulínica de Clostridium (BoNT)) para actividad, que comprende: a) poner en contacto una célula neuronal derivada de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPS) con una composición que comprenda una NT; y b) ensayar la NT para actividad biológica. En algunas modalidades, la especie clostrial es Clostridium botulinum, Clostridium butyricum o Clostridium haratii. En algunas modalidades, la BoNT abarca todos los siete serotipos conocidos incluyendo los serotipos A, B, C, D, E, F y G y subtipos conocidos dentro de cada serotipo. En algunas modalidades, la NT es una NT recombinante, muíante o quimérica. En algunas modalidades, la actividad biológica es corte de SNAP-25, VAMP o sintaxina. En algunas modalidades, el ensayo es cualitativo, mientras que en otras es cuantitativo. En algunas modalidades, la NT es purificada, mientras que en otras está en un complejo, una solución o una matriz. En algunas modalidades, la NT es recombinante. En algunas modalidades, la NT se conjuga con otra molécula seleccionada de modalidades terapéuticas, marcadores, agentes de formación de imágenes, enzimas, receptores, anticuerpos o compuestos bioactivos. En algunas modalidades, el método comprende además la etapa de poner en contacto la NT con un compuesto de prueba antes de poner en contacto las células neuronales derivadas de hPS . En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un anticuerpo (por ej emplo, un anticuerpo neutralizante) o inhibidor molecular pequeño de NT. En algunas modalidades, el anticuerpo neutralizante es purificado o está en una muestra de suero o antitoxinas.

La presente invención proporciona además un método para ensayar una neurotoxina de especie clostrial (por ej emplo, BoNT) para actividad, que comprende: a) poner en contacto una célula neuronal derivada de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPS) con una composición que comprende a) una NT; y b) un anticuerpo neutralizante; y b) ensayar la NT para actividad biológica.

La presente invención se refiere también a un método para determinar la cantidad de BoNT biológicamente activa en una preparación que comprende BoNT biológicamente activa y, de preferencia, una preparación farmacéutica que comprende BoNT biológicamente activa. En algunas modalidades, el método comprende las etapas de: a) poner en contacto una célula neuronal derivada de células hiPS con una muestra de una preparación que comprenda BoNT biológicamente activa; y b) determinar la cantidad de BoNT biológicamente activa presente en la preparación al ensayar la muestra para la actividad biológica de BoNT.

En modalidades adicionales, la presente invención proporciona el uso de una célula neuronal derivada de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPS) para ensayar una BoNT para actividad.

Modalidades adicionales se describen en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 A muestra la expresión del receptor de BoNT en neuronas iPS células iP S fueron maduradas durante 4, 7, 10, 14 y 21 días y ensayadas por medio de Western blot para niveles de expresión de receptores de BoNT. La figura I B muestra células iPS fueron maduradas durante 5, 10, 1 5 y 20 días y células de cerebro humanas adultas fueron usadas para llevar a cabo ensayos de PCR cuantitativa.

La figura 2 muestra una comparación de la sensibilidad de BoNT/A l de neuronas iPS colocadas en 7 sustratos diferentes (indicado a la derecha).

La figura 3 muestra la sensibilidad a BoNT/Al de neuronas iPS y células RSC.

La figura 4 muestra la dependencia de tiempo de la detección de la actividad de BoNT/A l en neuronas iPS.

La figura 5 muestra el índice de absorción de BoNT/A l de neuronas iPS en comparación con RSC.

Las figuras 6A - 6C muestran la absorción de BoNT/Al dependiente de actividad por neuronas. La figura 6A muestra neuronas iPS y células RSC fueron expuestas a 55 U o 275 U de BoNT/A l en medio de estimulación celular durante 1 , 5, 10 y 15 minutos, seguidas por la remoción de toxinas e incubación de 24 horas. La figura 6B muestra neuronas iPS fueron expuestas a 55 U de BoNT/A l en medios de estimulación tanto neuronal como celular durante 1 , 5 y 10 minutos. La figura 6C muestra las neuronas fueron expuestas a 1 .7 - 55 U de BoNT/Al durante 5 minutos en medio de estimulación celular, lavadas dos veces con medio neuronal e incubadas durante 24 horas.

Las figuras 7A - 7B muestran datos Western blot y densitometría de ensayo de protección de anticuerpos en neuronas iPS . La figura 7A muestra neuronas iPS fueron expuestas a 1 .5 U de toxina y anticuerpo durante 24 horas. La figura 7B muestra neuronas iPS fueron expuestas a 55 U de mezcla de toxina-anticuerpo en medio de estimulación de células durante 5 minutos, la mezcla se retiró, las células se lavaron dos veces y se incubaron durante 24 horas.

Las figuras 8A - 8B muestra la sensibilidad de neuronas iPS a complej o BoNT/A y BoNT/A purificada. La figura 8A muestra gel de SDS-PAGE que compara BoNT/Al purificada y complejo de BoNT/A l (escalera de Invitrogen: SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard). La figura 8B muestra sensibilidad de neuronas iPS a toxina purificada BoNT/A l y complejo BoNT/A l después de 48 horas de exposición a toxina.

Las figuras 9A - 9B muestran la detección de la actividad de BoNT/B, C y E en neuronas iPS. Las neuronas iPS maduraron durante 7 días y las células RSC fueron expuestas a diluciones en serie de BoNT/B (A)/C (B) y /E(C) durante 48 horas en paralelo.

DEFINICIONES Para facilitar un entendimiento de la presente invención, se definen a continuación un número de términos y frases : Según se usa en la presente, el término "célula anfitriona" se refiere a cualquier célula eucariótica o procariótica (por ejemplo, células de mamífero, células de ave, células de anfibio, células vegetales, células de pez y células de insecto" ubicada ya sea in vitro o in vivo.

Según se usa en la presente, el término "cultivo de células" se refiere a cualquier cultivo de células in vitro. Dentro de este término se incluyen las líneas de células continuas (por ej emplo, con un fenotipo inmortal), cultivos de células primarias, líneas de células finitas (por ej emplo, células no transformadas), y cualquier otra población celular mantenida in vitro, incluyendo oocitos y embriones.

Según se usa en la presente, el término "tóxico" se refiere a cualquier efecto dañino o perjudicial en una célula o tejido en comparación con la misma célula o tejido antes de la administración del tóxico.

Según se usa en la presente, el término "composición farmacéutica" se refiere a la combinación de un agente activo con un portador, inerte o activo, haciendo a la composición especialmente adecuada para uso de diagnóstico o terapéutico in vitro, in vivo o ex vivo.

Según se usa en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquiera de los portadores farmacéuticos estándares, tal como una solución salina de pH regulado con fosfato, agua, emulsiones (por ej emplo, tal como emulsiones de aceite/agua o agua/aceite), y varios tipos de agentes humectantes. Las composiciones también pueden incluir estabilizadores y conservadores. Para ejemplos de portadores, estabilizadores y adyuvantes. (Véase, por ejemplo, Martin, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 1 5a edición, Mack Publ. Co., Easton, PA [ 1975]).

Según se usa aquí, los términos "detectar", "detectando" o "detección" pueden describir ya sea el acto general de descubrir o discernir o la observación específica de una composición marcada en forma detectable.

Según se usa en la presente, el término "purificado" o "purificar" se refiere a la remoción de componentes (por ej emplo, contaminantes) de una muestra. Por ej emplo, los anticuerpos son purificados por remoción de proteínas no de inmunoglobulina contaminantes; también son purificados por la remoción de inmunoglobulina que no se une a la molécula obj etivo. La remoción de proteínas no de inmunoglobulina y/o la remoción de inmunoglobulinas que no se unen a la molécula objetivo se traduce en un incremento en el porcentaj e de inmunoglobulinas reactivas con objetivo en la muestra. En otro ejemplo, polipéptidos recombinantes son expresados en células anfitrionas bacterianas y los polipéptidos se purifican por la remoción de proteínas de células anfitrionas; el porcentaje de polipéptidos recombinantes se incrementa entonces en la muestra.

Según se usa aquí, el término "muestra" se usa en su sentido más amplio. En un sentido, intenta incluir un espécimen o cultivo obtenido de cualquier fuente, así como muestras biológicas y ambientales. Las muestras biológicas pueden obtenerse de animales (incluyendo humanos) y abarcan fluidos, sólidos, tejidos y gases. Las muestras biológicas incluyen células, tejidos, productos hemáticos tales como plasma, suero y similares. Tales ejemplos sin embargo no deben considerarse como limitativos de los tipos de muestra aplicables a la presente invención. En algunas modalidades, la muestra puede ser también una muestra de una preparación que comprenda BoNT biológicamente activa, tal como una preparación de BoNT que se aplicará para efectos farmacéuticos o cosméticos. Además, en un aspecto de la invención, la muestra también puede ser una muestra ambiental o una muestra de alimento que se sospeche comprenda BoNTs.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y métodos para probar agentes (por ejemplo, detección y análisis de neurotoxina de Clostridium botulinum (BoNT)) . En particular, la presente invención se refiere al uso de células derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPS) para detección y análisis de agentes.

Las modalidades de la presente invención proporcionan sistemas y métodos para la detección y análisis de BoNT. En algunas modalidades, los sistemas y ensayos utilizan neuronas derivadas de iPS humana como una plataforma altamente sensible y reproducible para la detección de neurotoxina botulínica (BoNT). En algunas modalidades, las neuronas son una población pan-neuronal 98% pura de neuronas GABAérgicas, dopaminérgicas y glutamatérgicas, y se producen y criopreservan como células diferenciadas. En otro aspecto, las neuronas son una población pan-neuronal esencialmente pura de neuronas GABAérgicas, dopaminérgicas y glutamatérgicas y se producen y criopreservan como células diferenciadas, en donde las células son al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 96% puras con respecto a las células neuronales. Experimentos llevados a cabo durante el curso de desarrollo de modalidades de la presente invención demostraron que las células expresan todos los receptores y substratos necesarios para intoxicación por BoNT por todos los serotipos de BoNT. Ensayos de detección de BoNT demuestran que las neuronas derivadas de iPS son altamente sensibles a la detección cuantitativa de BoNT/A, B , C y E y anticuerpos neutralizantes.

En noviembre de 2007, dos grupos independientes demostraron por primera vez que células de fibroblastos humanos pueden ser reprogramadas a células madre pluripotentes simplemente al activar un pequeño conjunto de genes silenciados (Takahashi K, et al (2007) Cell 13 1 : 861 -872; Yu J, et al (2007) Science 3 1 8 : 191 7- 1920). Estas células fueron llamadas células madre pluripotentes inducidas y pueden ser mantenidas y criopreservadas en forma similar a líneas de células. Este descubrimiento abre la oportunidad para el desarrollo de un vasto número de modelos de células derivados de iPS humana que simulan células somáticas humanas diferenciadas completamente funcionales y no requieren ningún uso de animales.

Al seleccionar células iPS para usarse en los sistemas y métodos descritos aquí, se prefiere que las células puedan ser producidas de manera confiable y reproducible y generen poblaciones puras de células diferenciadas en cantidades suficientes para tales estudios. En algunas modalidades, estas células están disponibles de Cellular Dynamics Inc. (Madison, WI).

Experimentos llevados a cabo durante el curso del desarrollo de modalidades de la presente invención demostraron que neuronas derivadas de iPS humana son un modelo de célula altamente sensible, selectivo y específico de especie para la detección de las neurotoxinas botulínicas, anticuerpos neutralizantes e inhibidores, y para la entrada de células BoNT y estudios de tráfico. Estas neuronas son adecuadas para reemplazar el MBA para la determinación de la potencia de BoNT así como para la detección de anticuerpos, análisis de inhibidores y aplicaciones de investigación.

I. Células Según se describe aquí, las modalidades de la presente invención proporcionan células madre derivadas pluripotentes para usarse en la detección y análisis de agentes tales como BoNT. En algunas modalidades, las células son humanas (por ejemplo, células neuronales derivadas de células derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPS) o células madre embrionarias humanas). Métodos para generar células iPS se describen, por ejemplo, en Yu et al. , Science, 8 de mayo de 2009; 324(5928); 797-801 . Epub 2009, WO201 1056971 y WO201 1025852, cada uno de los cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, células iPS son diferenciadas en neuronas usando métodos adecuados (por ejemplo, aquellos descritos en las solicitudes de patente de E.U.A. US2010/0279403 y US2010/021 61 81 , cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad).

En algunas modalidades, las neuronas son una población pan-neuronal 98% pura de neuronas GABAérgicas, dopaminérgicas y glutamatérgicas y se producen y criopreservan como células diferenciadas. En algunas modalidades, células iPS derivadas neuronalmente disponibles comercialmente (por ej emplo, aquellas disponibles de Cellular Dynamics Inc. (Madison, WI) o GlobalStem, (Rockville, MD)) son utilizadas, aunque se pueden utilizar otras fuentes. En algunas modalidades, las células son células hiPS neuronales.

En otro aspecto, las células son las neuronas son una población pan-neuronal esencialmente pura de neuronas GABAérgicas, dopaminérgicas y glutamatérgicas y se producen y criopreservan como células diferenciadas, en donde las células son al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 96% puras con respecto a las células neuronales.

La presente invención no está limitada a las células descritas aquí. Líneas de células adicionales y cultivos de células primarias pueden ser utilizados. Por ej emplo, en algunas modalidades, se utilizan neuronas colinérgicas.

En algunas modalidades, líneas de células adecuadas expresan receptores y substratos necesarios o suficientes para intoxicación por BoNT.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona sistemas y kits que comprenden las líneas celulares descritas en la presente, junto con componentes necesarios, suficientes o útiles para llevar a cabo detección y análisis de BoNT. Por ej emplo, en algunas modalidades, los kits comprenden células y reactivos de cultivo de células (por ej emplo, placas, reguladores de pH, etc.), reactivos de ensayo, controles (controles de BoNT positivos y negativos y/o inhibidores) e instrucciones para llevar a cabo y analizar ensayos.

En un aspecto de la invención, la célula neuronal derivada de células hiPS se puede obtener o ha sido obtenida por diferenciación y/o maduración de una célula hiPS generada por un proceso como el mencionado arriba en una célula neuronal. Esta diferenciación de células neuronales, en un aspecto, se puede lograr por el cultivo de las células hiPS a aproximadamente 37°C y debajo de alrededor de 5% de C02. En un aspecto, el medio de cultivo puede ser medio Neurobasal suplementado con B27 y Glutamax (Invitrogen, Inc. , E.U.A.). En otro aspecto más, las células se cultivan en placas recubiertas con poli-lisina y, en otro aspecto más, las placas son además recubiertas con Matrigel (BD Bioscience, E.U.A.). En un aspecto, se usa una placa de 96 pocilios para cultivo en donde las células crecen a una densidad de aproximadamente 40,000 células por pocilio. En un aspecto, las células se dejan sembrar durante alrededor de 24 horas. Posteriormente, en un aspecto se dej a que las células maduren durante aproximadamente 2 a alrededor de 28 días, en un aspecto, alrededor de 4 a aproximadamente 14 o, en un aspecto, aproximadamente 4 a alrededor de 7 días.

En un aspecto, las células neuronales derivadas de células hiPS se obtienen por un proceso de diferenciación y maduración esencialmente como el descrito en los ej emplos acompañantes, abajo.

Modalidades de la presente invención también se refieren a una célula neuronal derivada de células hiPS obtenidas por el proceso de diferenciación y maduración mencionado arriba.

En un aspecto, esta célula neuronal derivada de células hiPS se caracteriza por la presencia de uno o más y, en un aspecto todos, de los siguientes marcadores: p3 -tubulina, NeuN, vGAT, vGLUT2, (NSE enolasa específica de neuronas) o Tbrl (factor 1 de transcripción de dominio T). Para p3 -tubulina o NeuN se contempla que el número de células positivas en un cultivo de la célula neuronal derivada de células hiPS de la invención sea de aproximadamente 99%. Para vGAT o vGLUT2 se contempla en un aspecto que al menos una porción de las células del cultivo sean positivas para dichos marcadores.

En un aspecto, la célula neuronal derivada de células hiPS se caracteriza por la ausencia de uno o más y, en un aspecto todos, de los siguientes marcadores. GFAP, TH, NNE (enolasa no neuronal), Tbr2 (factor 2 de transcripción de dominio T), o NoGo a, C. Para GFAP se contempla que el número de células positivas en un cultivo de la célula neuronal derivada de células hiPS sea significativamente bajo, y, en un aspecto, debaj o de alrededor de 5% o incluso debajo de alrededor de 1 %, para los marcadores restantes se contempla en un aspecto que estén, si lo están, presentes debajo de una cantidad detectable.

La presencia o ausencia o la cantidad de los marcadores mencionados arriba puede, en un aspecto, determinarse por técnicas inmunológicas convencionales. Por ejemplo, los marcadores pueden determinarse por técnicas de tinción inmunohistológica, análisis Western blot de lisados de células o, en cuanto a P 3-tubulina o NeuN tiene que ver por análisis FACS . Técnicas de detección adicionales se describen (véase, por ej emplo, US2012/01 78083 , US2008/0280301 , Englund 2005, J Neurosci 25 : 247-251 ; Dupuis 2002, Neurobiology of Diseases 1 0: 358-365; cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia) .

En un aspecto más, la célula neuronal derivada de células hiPS se caracteriza por al menos una y, en un aspecto todas, las siguientes propiedades electrofisiológicas : inhibición de canales Na2+ por tertrodotoxina (TTX), inhibición de canales K+ por tetraetilamonio, inhibición de canales Ca2+ tipo L por nifedipino, inhibición de canales Ca2+ tipo P/Q por w-agatoxina IVA o inhibición de canales de Ca2+ tipo N por w-conotoxina GVIA. Estas propiedades electrofisiológicas pueden probarse por mediciones electrofisiológicas estándares incluyendo, por ej emplo, mediciones de parche-pinza antes y después de tratamiento de las células con los inhibidores respectivos.

En otro aspecto, la célula neuronal derivada de células hiPS se caracteriza por sensibilidad a BoNT y, en un aspecto, BoNT/A. Además, las células, en un aspecto, también son sensibles a otros compuestos neurotóxicos de una manera dependiente de dosis y, en particular, a por lo menos uno o todos los siguientes compuestos: estaurosporina, inhibidor de cinasa competitiva ATP, cloropromazoina o fenotiazina. La sensibilidad hacia los compuestos mencionados arriba puede determinarse en, por ejemplo, ensayos de viabilidad celular.

En un aspecto las células neuronales derivadas de células hiPS también son sensibles con respecto a crecimiento de neuritas para por lo menos uno y, en un aspecto todos, de los siguientes compuestos : antimicina A, mitomicina C, MK571 , PD98092 o estaurosporina.

Además, en un aspecto las células neuronales derivadas de células hiPS son sensibles con respecto a pérdida de potencial de membrana mitocondrial a por lo menos uno o, en un aspecto, todos los siguientes compuestos : antimicina A o valinomicina.

II. Ensayos y usos Las modalidades de la presente invención proporcionan composiciones y métodos para ensayar BoNT. Los ensayos encuentran uso en aplicaciones de investigación, clínicas, de diagnóstico y terapéuticas.

En algunas modalidades, los ensayos utilizan células pluripotentes (por ej emplo, células neuronales derivadas de hiPS). El uso de células humanas proporciona la ventaj a de un modelo específico de especie. Además, neuronas derivadas de células pluripotentes son representativas de neuronas sanas y normales a diferencia de neuronas derivadas de líneas de células cancerosas o líneas de células modificadas, las cuales pueden no reflej ar las neuronas somáticas.

En algunas modalidades, los ensayos utilizan células neuronales, por ej emplo, células neuronales derivadas de hiPS para analizar la potencia de BoNT. En otras modalidades, los ensayos analizan la toxicidad de BoNT. En otras modalidades más, los ensayos analizan la presencia o propiedades de anticuerpos neutralizantes para BoNT u otros biofarmacéuticos para actividad. En algunas modalidades, los ensayos son cuantitativos, mientras que en otras son cualitativos.

En algunas modalidades, las células se cultivan primero en una matriz adecuada. En algunas modalidades, las células se cultivan para poder obtener maduración de neuronas. Las células pluripotentes usadas en modalidades de la presente invención proporcionan la ventaj a de maduración más rápida que células usadas en ensayos existentes. En algunas modalidades, las células son después expuestas a toxina (por ej emplo, BoNT durante un periodo de tiempo adecuado) . Después de la exposición a toxinas, parámetros deseados (por ejemplo, EC50) son calculados usando métodos adecuados. Los ensayos descritos aquí son adecuados para la detección tanto de BoNT purificada como BoNT en complejos (por ejemplo, complejada con otras proteínas como se encuentra en escenarios nativos y algunas preparaciones farmacéuticas). Los ensayos descritos en la presente son adecuados para la detección de cualquier número de serotipos de BoNT (por ejemplo, BoNT/A, B, C, D, E, F y G) o variantes o quimeras de los mismos. En algunas modalidades, BoNTs se expresan recombinantemente. En otras modalidades, se purifican de células bacterianas.

En algunas modalidades, se llevan a cabo ensayos de protección de anticuerpos para probar anticuerpos neutralizantes. Aunque BoNTs se usan efectivamente en el tratamiento de un gran número de pacientes para varias condiciones (revisado en Dhaked et al. , Iridian J Med Res 1 32 :489-503 ), algunos desarrollarán anticuerpos neutralizantes, los cuales evitarán el éxito de tratamientos adicionales. Por ejemplo, se estima en el tratamiento de distonías cervicales que ~5 % de los pacientes tratados desarrollarán anticuerpos BoNT neutralizantes que impedirán tratamiento adicional (Kessler et al., ( 1999) J Neurol 246 : 265-274) . Actualmente, los pacientes no son monitoreados durante el curso de sus tratamientos para desarrollo de anticuerpos neutralizantes debido a que un ensayo altamente sensible y cuantitativo no está disponible comercialmente (Sesardic et al., (2004) Mov Disord 19 Suppl 8 : S85-91 ). La plataforma de prueba presentada aquí que usa neuronas iPS proporciona una detección sensible y cuantitativa de anticuerpos neutralizantes de BoNT en los sueros de pacientes quienes han recibido inyecciones terapéuticas o cosméticas repetidas de BoNT. Anticuerpos neutralizantes pueden detectarse en cualquier número de tipos de muestras (por ej emplo, anticuerpos purificados, suero, antitoxinas, etc.).

En algunas modalidades, inhibidores de molécula pequeña de BoNTs son probados (por ej emplo, para investigación o análisis de fármacos). Por ej emplo, en algunas modalidades, células son expuestas ya sea a la BoNT primero, luego al inhibidor, co-expuestas a ambos, o las células son expuestas al inhibidor primero, luego a BoNT.

Cualquier número de mediciones de punto final adecuadas pueden utilizarse para ensayar la actividad de BoNT. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a, Western blot, liberación de neurotransmisores, ELISA (Nuss JE, et al (2010) J Biomol Screen 1 5 :42-51 ) o reporteros expresados intracelularmente tales como, por ejemplo, sensores FRET (Dong et al, (2004) Proc Nati Acad Sci E. U.A. 101 : 14701 - 14706).

En algunas modalidades, los ensayos descritos en la presente encuentran uso en la prueba de controles de calidad durante la producción de BoNTs o derivados como farmacéuticos o para uso en investigación, en evaluación de diagnóstico, en la optimización y dosificación de tratamiento clínico y en la selección de modalidad terapéutica.

Aplicaciones adicionales de los ensayos descritos en la presente incluyen, pero no están limitadas a, detección de inhibidores y usos de diagnóstico, clínicos, análisis e investigación.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para ensayar una neurotoxina de Clostridium botulinum (B oNT) para actividad, que comprende : a) poner en contacto una célula neuronal derivada de hiP S con una composición que comprenda una BoNT; y b) ensayar la BoNT para actividad biológica.

En un aspecto de dicho método, el ensayo puede comprender determinar la presencia o ausencia de actividad biológica de BoNT. Este ensayo algunas veces puede ser denominado aquí un ensayo cualitativo . Se entenderá que con base en la presencia o ausencia de actividad biológica de BoNT, puede concluirse sobre la presencia o ausencia de BoNT biológicamente activa en una composición que comprenda o se sospeche comprenda la BoNT biológicamente activa. Además, en otro aspecto más, ensayar puede ab arcar determinar la cantidad de BoNT biológicamente activa en una composición que comprenda BoNT biológicamente activa. Se entenderá que la cantidad de BoNT biológicamente activa puede derivarse de la cantidad de actividad biológica ensayada para dicha BoNT en la composición. Este ensayo algunas veces puede ser dominado también un ensayo cuantitativo.

En un aspecto del método de la presente invención, la BoNT es una neurotoxina seleccionada de los diferentes grupos de serotipos para neurotoxinas clostridiales, por ej emplo, se selecciona de, por ejemplo, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C l , BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F o BoNT/G . Además, en un aspecto, puede usarse toxina de tétanos (TeNT) como una neurotoxina en los métodos de acuerdo con la presente invención.

Las bacterias Clostridium botulinum y Clostridium tetani producen naturalmente estas neurotoxinas altamente potentes, por ej emplo, toxinas botulínicas (BoNTs) y toxina de tétanos (TeNT), respectivamente. Estas neurotoxinas se unen específicamente a células neuronales e interrumpen la liberación de neurotransmisores. Cada toxina es sintetizada como una proteína unicatenaria inactiva de aproximadamente 1 50 kDa. El procesamiento post-traduccional incluye la formación de puentes de disulfuro y proteólisis limitada (formación en ella) por proteasas bacterianas. La neurotoxina de cadena doble activa consiste en dos cadenas, una cadena ligera N-terminal de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada de aproximadamente 100 kDa enlazada por un enlace de disulfuro. Las neurotoxinas consisten estructuralmente en tres dominios, por ejemplo, la cadena ligera catalítica, la cadena pesada que abarca el dominio de translocación (mitad N-terminal) y el dominio de unión a receptor (mitad C-terminal), véase, por ejemplo, Krieglstein 1990, Eur J Biochem 1 88 , 39; Krieglstein 1991 , Eur J Biochem 202, 41 ; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49. Las estructuras de los polipéptidos BoNT y polipéptido TeNT han sido descritas en las referencias mencionadas arriba.

Los siete serotipos antigénicamente distintos de BoNTs y TeNT son endoproteasas Zn2+ que bloquean exocitosis sináptica al cortar proteínas SNARE. Las neurotoxinas causan la parálisis muscular flácida vista en los trastornos de botulismo y tétanos, véase Fischer 2007, Proc Nati. Acad. Sci. E.U.A. 104, 1 0447.

En otro aspecto más, la actividad de una BoNT o TeNT modificada se puede ensayar en el método de la invención. Esta BoNT modificada puede derivarse de las BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C l , BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F o BoNT/G mencionadas arriba o a partir de TeNT al introducir al menos una sustitución, adición y/o supresión en la secuencia de aminoácidos de la BoNT o TeNT. Esta BoNT o TeNT modificada, entonces, puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las BoNTs o TeNT referidas arriba. El término "idénticas" según se usa en la presente se refiere a identidad de secuencia caracterizada al determinar el número de aminoácidos idénticos entre dos secuencias de aminoácidos en donde las secuencias se alinean de tal manera que la coincidencia de más alto orden sea obtenida. Puede calcularse usando técnicas o métodos publicados codificados en programas de computadora tales como, por ej emplo, BLASTP o FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215 , 403 ). Los valores de identidad porcentual son, en un aspecto, calculados sobre la secuencia de aminoácidos completa. Está disponible una serie de programas a base de una variedad de algoritmos para el experto en la técnica para la comparación de secuencias diferentes. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman dan resultados particularmente confiables. Para llevar a cabo las alineaciones de secuencia, el programa PileUp (Higgins 1989, CAB IOS 5, 1 51 ) o los programas Gap y BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48 ; 443 ; Smith 1981 , Adv Appl Math 2, 482), los cuales son partes del paquete de software GCG (Genetics Computer Group 1991 , 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, E.U.A. 5371 1 ) pueden ser usados. Los valores de identidad de secuencia descritos arriba en por ciento (%) se deben determinar, en otro aspecto de la invención, usando el programa GAP sobre la región de secuencia completa con los siguientes ajustes: ponderación de espacio: 50, ponderación de longitud: 3 , promedio de coincidencia: 10.000 y promedio de no coincidencia: 0.000, los cuales, a menos que se especifique lo contrario, siempre se usarán como ajustes estándares para alineaciones de secuencias.

En un aspecto, cada uno de los polipéptidos de BoNT o TeNT modificados mencionados arriba conserva una o más y, en otro aspecto, todas las propiedades biológicas del polipéptido no modificado respectivo, es decir, el BoNT/A, BoNT/B , BoNT/C l , BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G o TeNT. Aquellos de capacidad en la técnica apreciarán que actividad biológica completa se mantiene después de activación proteolítica, incluso a pesar de que sea concebible que el precursor no procesado pueda ej ercer ciertas funciones biológicas o ser parcialmente activo. "Propiedades biológicas" según se usa en la presente se refiere a (a) unión a receptor, (b) internalización, (c) translocación a través de la membrana endosómica en el citosol, y/o (d) corte endoproteolítico de proteínas implicadas en función a membrana de vesículas sinápticas. Ensayos in vivo para evaluar la actividad biológica incluyen el ensayo de LD50 de ratón y el ensayo de hemidiafragma de ratón ex vivo como el descrito por, por ej emplo, Dressler et al. (Dressler 2005 , Mov Disord 20 : 1617- 161 9, Keller 2006, Neuroscience 139 :629-637). La actividad biológica se expresa comúnmente en unidades de ratón (MU). Según se usa aquí, una MU es la cantidad de componente neurotóxico que mata 50% de una población de ratones específica después de inyección intraperitoneal, es decir, la LD50 i.p. de ratón. En un aspecto más, los polipéptidos modificados pueden tener propiedades biológicas mejoradas o alteradas, por ejemplo, pueden comprender sitios de corte que sean mejorados para reconocimiento de enzimas o pueden mejorarse para unión a receptor o cualquier otra propiedad especificada arriba.

En un aspecto, las BoNTs o TeNT modificadas pueden ensayarse para una o más y, en un aspecto, todas las actividades biológicas mencionadas arriba por el método descrito en la presente.

En un aspecto de la invención, una BoNT o TeNT modificada se selecciona de, por ejemplo, BoNT o híbridos BoNT/TeNT, BoNTs redirigidas, TeNT redirigida, y BoNTs o TeNT quiméricas. Se describen BoNTs y TeNT modificadas.

En un aspecto del método de la invención, poner en contacto comprende poner al menos dos componentes diferentes en proximidad física para permitir así la interacción física y/o química de dichos componentes. En el método mencionado arriba, la célula neuronal derivada de hiPS se pone en contacto con una composición que comprende o se sospecha comprende BoNT biológicamente activa. La puesta en contacto se lleva a cabo durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir que la BoNT biológicamente activa comprendida en la composición ej erza su actividad biológica en la célula neuronal derivada de células hiPS . En un aspecto, así, la puesta en contacto permitirá (a) unión a receptor, (b) internalización, (c) translocación a través de la membrana endosómica dentro del citosol, y/o (d) corte endoproteolítico de proteínas implicadas en fusión a membrana de vesícula sináptica o substratos que imiten dicho proceso en la célula neuronal derivada de células hiPS . La persona experta en la técnica está muy consiente de qué condiciones tienen que ser aplicadas para un cultivo dado de células neuronales derivadas de células hiPS . La puesta en contacto puede, en un aspecto, ser llevada a cabo en un sistema de cultivo de células en el que las células neuronales derivadas de células hiPS se cultiven en placas de pocilios en un medio de cultivo adecuado y bajo condiciones de cultivo adecuadas al añadir al medio de cultivo una muestra de la composición que será ensayada para actividad BoNT por los métodos descritos aquí.

En un aspecto, las condiciones de cultivo adecuadas comprenden cultivo a aproximadamente 37°C y bajo alrededor de 5% de C02. En un aspecto, el medio de cultivo es medio Neurobasal complementado con B27 y Glutamax (Invitrogen, Inc., E.U.A.). En otro aspecto más, las células neuronales derivadas de células hiPS se cultivan en placas recubiertas con poli-lisina y, en un aspecto más, se usan placas que además están recubiertas con Matrigel (BD Bioscience, E.U.A.). En un aspecto, una placa de 96 pocilios es usada para cultivo, en donde las células crecen a una densidad de aproximadamente 10,000 a alrededor de 1 00,000 células, en un aspecto alrededor de 20,000 a aproximadamente 60,000 células y en otro aspecto más aproximadamente 40,000 células por pocilio. En un aspecto, las células se dejan sembrar durante aproximadamente 24 horas. En un aspecto, posteriormente, las células se dejan madurar durante alrededor de 2 a aproximadamente 28 días, en un aspecto, aproximadamente 4 a alrededor de 14 o, en un aspecto, aproximadamente 4 a alrededor de 7 días antes de que se lleve a cabo la puesta en contacto.

En un aspecto más, la puesta en contacto se lleva a cabo como se describe en los ej emplos acompañantes, abajo.

En un aspecto del método de la presente invención, la composición que comprende BoNT biológicamente activa es una composición que se sabe comprende BoNT biológicamente activa o una composición que se sospecha comprende BoNT biológicamente activa. La composición puede comprender otros ingredientes además de la BoNT biológicamente activa tales como, por ej emplo, un solvente adecuado y/o agentes estabilizadores tales como proteínas y, en un aspecto, las proteínas complej adoras de las BoNTs (HA70, HA1 7, HA33 o NTNH (NBP)), u otros estabilizadores de proteínas. La composición también puede comprender además proteínas que faciliten la actividad biológica de la BoNT, por ej emplo, al incrementar cualquiera de las actividades biológicas de las BoNTs mencionadas en cualquier lado en la presente. En un aspecto más, la composición puede comprender más de una BoNT.

En un aspecto, la composición es un lisado celular de botulinum u otras células bacterianas o células no bacterianas que comprendan la BoNT biológicamente activa. En un aspecto, esta composición es también una preparación de BoNT obtenida a partir de tal lisado celular por purificación parcial, por ejemplo, un extracto crudo, o purificación de la BoNT, por ejemplo, una preparación de BoNT purificada. En otro aspecto, la composición es una composición artificial que comprende componentes mezclados. En un aspecto más, la composición es una preparación que se usará como composición farmacéutica como se define en cualquier lado en la presente.

En un aspecto del método de la presente invención, ensayar la BoNT para actividad biológica se lleva a cabo al determinar el corte endoproteolítico de proteínas implicadas en fusión a membrana de vesícula sináptica u otros substratos que sean cortados por la BoNT biológicamente activa, si están presentes, en la célula neuronal derivada de células hiPS.

En algunas modalidades, las proteínas implicadas en fusión a membrana de vesícula sináptica u otros substratos tienen un sito de corte por neurotoxinas reconocido por la BoNT o TeNT que será ensayada. Un sitio de corte por neurotoxinas según se usa en la presente se refiere a un sitio de corte que es reconocido y cortado por la proteasa endógena de un polipéptido de neurotoxina. Sitios de corte que son reconocidos por las proteasas de neurotoxinas se describen (véase, por ejemplo, EP 1 926 744 B l ; incorporada en la presente por referencia en su totalidad). En principio, un sitio de corte por neurotoxina puede ser un sitio de corte que se presente naturalmente en un substrato o que sea un sitio de corte diseñado artificialmente reconocido y cortado por la proteasa de polipéptido de neurotoxina.

Un sitio de corte por neurotoxina reconocido y cortado por la proteasa BoNT/A, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a corte por BoNT/A. En un aspecto, esa proteína es SNAP25A o B humana o un homólogo, parálogo u ortólogo de la misma de rata, ratón, bovino, Danio, Carassius, Xenopus, Torpedo, Strongylocentrotus, Loligo, Lymnaea o Aplysia. Los sitios de corte adecuados derivados de dic as proteínas se describen en EP 1 926744 Bl.

Un sitio de corte por neurotoxina reconocido y cortado por la proteasa BoNT/B, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a corte por BoNT/B. En un aspecto, esa proteína es VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina de humano o ratón,, VAMP-2 de bovino, VAMP-2 o VAMP-3 de rata, VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo, VAMP-1 de Torpedo, VAMP de Strongylocentrotus, sybA, synB, synC, synD, o syn de Drosophila, VAMP de Hirudo, VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus, VAMP-1 o VAMP-2 de Danio, VAMP de Loligo, VAMP de Lymnaea, VAMP de Aplysia o tipo Caenorhabditis SNB1 o cualquier ortólogo, parálogo u homólogo de los mismos. Los sitios de corte adecuados derivados de dichas proteínas se describen, por ejemplo, en EP 1 926744 Bl.

Un sitio de corte por neurotoxina reconocido y cortado por la proteasa BoNT/Cl, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a corte por BoNT/Cl. En un aspecto, esa proteína es Sintaxina 1A, Sintaxina IBl, Sintaxina 2-1, Sintaxina 2-2, Sintaxina 2-3, Sintaxina 3A o Sintaxina 1B2 de humano y ratón, Sintaxina 1A, Sintaxina IBl o Sintaxina 1B2 de bovino o rata, Sintaxina 2 de rata o Sintaxina 3 de rata, Sintaxina 1A, Sintaxina IBl, Sintaxina 1B2, Sintaxina 2, Sintaxina 3A, Sintaxina 3B o Sintaxina 3C de ratón, Sintaxina 1A o Sintaxina 2 de pollo; Sintaxina 1 A o Sintaxina I B de Xenopus, Sintaxina 1 A, Sintaxina I B o Sintaxina 3 de Danio, Sintaxina 1 A o Sintaxina I B de Torpedo, Sintaxina 1 A o Sintaxina I B de Strongylocentrotus, Sintaxina 1 A o Sintaxina I B de Drosophila, Sintaxina 1 A o Sintaxina I B de Hirudo, Sintaxina 1 A o Sintaxina I B de Loligo, Sintaxina 1 A o Sintaxina I B de Lymnaea o cualquier ortólogo, parálogo u homólogo de las mismas. Sitios de corte adecuados derivados de las proteínas se describen, por ej emplo, en EP 1 926 744 B l .

Un sitio de corte por neurotoxina reconocido y cortado por la proteasa BoNT/D, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible al corte por BoNT/D. En un aspecto, tal proteína es VAMP-1 , VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina de humano o ratón, VAMP-2 de bovino, VAMP-2 o VAMP-3 de rata, VAMP- 1 de pollo, VAMP-2 o VAMP-3 , VAMP- 1 de torpedo, VAMP de Strongylocentrotus, sybA, synB, synC, synD o syn de Drosophila, VAMP de Hirudo, VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus, VAMP- 1 o VAMP-2 de Danio, VAMP de Loligo, VAMP de Lymnaea, VAMP de Aplisia o tipo Caenorhabditis SNB 1 o cualquier ortólogo, parálogo u homólogo de las mismas. Los sitios de corte adecuados derivados de las proteínas se describen, por ejemplo, en EP 1 926 744 B l .

Un sitio de corte por neurotoxina reconocido y cortado por la proteasa BoNT/E, en un aspecto de la invención, se derivan de una proteína que es sensible al corte por BoNT/E. En un aspecto, tal proteína es, SNAP-25A o B humana o un homólogo, parálogo u ortólogo de la misma de rata, ratón, bovino, Danio, Carassius, Xenopus, Torpedo, Strongylocentrotus, Loligo, Lymnaea o Aplisia. Sitios de corte adecuados derivados de las proteínas se describen, por ej emplo, en EP 1 926 744 B l .

Un sitio de corte por neurotoxina reconocido y cortado por la proteasa BoNT/F, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a corte por BoNT/F. En un aspecto, dicha proteína es, VAMP- 1 , VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina de humano o ratón, VAMP-2 de bovino, VAMP-2 o VAMP-3 de rata, VAMP- 1 , VAMP-2 o VAMP-3 de pollo, VAMP- 1 de Torpedo, VAMP de Strongylocentrotus, sybA, synB, synC, synD o syn de Drosophila, VAMP de Hirudo, VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus, VAMP- 1 o VAMP-2 de Danio, VAMP de Loligo, VAMP de Lymnaea, VAMP de Aplisia o tipo Caenorhabditis SNB 1 o cualquier ortólogo, parálogo u homólogo de las mismas. Los sitios de corte adecuados derivados de las proteínas se describen, por ej emplo, en EP 1 926 744 B l .

Un sitio de corte por neurotoxina reconocido y cortado por la proteasa BoNT/G, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a corte por BoNT/G. En un aspecto, esa proteína es, VAMP- 1 , VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina de humano o ratón, VAMP-2 de bovino, VAMP-2 o VAMP-3 de rata, VAMP- 1 , VAMP-2 o VAMP-3 de pollo, VAMP- 1 de Torpedo, VAMP de Strongylocentrotus, sybA, synB, synC, synD o syn de Drosophila, VAMP de Hirudo, VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus, VAMP- 1 o VAMP-2 de Danio, VAMP de Loligo, VAMP de Lymnaea, VAMP de Aplisia o tipo Caenorhabditis SNB 1 o cualquier ortólogo, parálogo u homólogo de las mismas. Los sitios de corte adecuados derivados de las proteínas se describen, por ejemplo, en EP 1 926 744 B l .

Un sitio de corte por neurotoxina reconocido y cortado por la proteasa de TeNT, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a corte por TeNT. En un aspecto, tal proteína es VAMP- 1 , VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina de humano o ratón, VA P-2 de bovino, VAMP-2 o VAMP-3 de rata, VAMP- 1 , VAMP-2 o VAMP-3 de pollo, VAMP- 1 de Torpedo, VAMP de Strongylocentrotus, sybA, synB, synC, synD o syn de Drosophila, VAMP de Hirudo, VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus, VAMP- 1 o VAMP-2 de Danio, VAMP de Loligo, VAMP de Lymnaea, VAMP de Aplisia o tipo Caenorhabditis SNB l o cualquier ortólogo, parálogo u homólogo de las mismas. Los sitios de corte adecuados derivados de las proteínas se describen, por ej emplo, en EP 1 926 744 B l .

Un sitio de corte por neurotoxina reconocido y cortado por proteasas de BoNT, en otro aspecto de la invención, se deriva de los sitios de corte auto-catalíticos encontrados en las proteínas BoNT. En aspectos, un sitio de corte por neurotoxina que se usará de acuerdo con la presente invención y que se deriva del sitio de corte auto-catalítico de una BoNT o TeNT dada comprende al menos 6, al menos 8, al menos 10 o al menos 15 residuos consecutivos de incluyendo los residuos 250Tyr-251 Tyr de BoNT/A, los residuos 256Phe-257Phe de BoNT/B, los residuos 257Phe-258Tyr de BoNT/C l , los residuos 257Phe-258Phe de BoNT/D, los residuos 239Pro-240Leu de BoNT/E, los residuos 254Pro-255Leu de BoNT/F, los residuos 256Phe-257Phe de BoNT/G, los residuos 259Ile-260Tyr de TeNT, los residuos Phe266-Gly267 de BoNT/A, los residuos Phe272-Gly273 de BoNT/B, los residuos Phe273 -Gly274 de BoNT/C l , los residuos Phe273-Gly274 de BoNT/D, los residuos Phe255-Gly256 de BoNT/E, los residuos Phe270-Gly271 de BoNT/F, los residuos Phe272-Gly273 de BoNT/G o los residuos Phe275-Gly276 de TeNT. Los sitios de corte adecuados derivados de las proteínas se describen, por ej emplo en EP 1 926 744 B l .

En un aspecto de la presente invención, el corte de los sitios de corte por neurotoxina mencionados arriba para BoNTs y TeNT se puede ensayar al determinar uno o más productos de corte obtenidos por el corte de las proteínas mencionadas arriba. Productos derivados de las proteínas pueden determinarse por anticuerpos que se unan específicamente a dichos productos cortados pero no a las proteínas no cortadas. La unión de estos anticuerpos de unión específica a los productos puede determinarse por técnicas descritas en la presente o en cualquier lado. Por ej emplo, los anticuerpos de unión específica pueden ser enlazados covalente o no covalentemente a un marcador detectable. Este marcador detectable puede ser una porción detectable enlazada covalentemente al anticuerpo de unión específica o puede ser un agente de detección, tal como un anticuerpo de detección o aptámero que se una específicamente al anticuerpo de unión específica y permita la detección, por ej emplo, por medio de una porción detectable enlazada covalentemente al mismo. Varios tipos de estos inmunoensayos pueden usarse de esta manera para determinar los productos cortados y, de esta forma, para ensayar la actividad biológica de una BoNT o TeNT.

En un aspecto, el corte de proteínas que tienen un sitio de corte con neurotoxina como las definidas en la presente puede determinarse por Western Blot. En otro aspecto, dicho corte puede determinarse por ELISA, RIA u otros formatos de ensayo inmunológico incluyendo aquellos mencionados en cualquier lado en la presente.

En otro aspecto, un substrato artificial puede usarse que comprenda un sitio de corte por neurotoxina como el especificado arriba y el cual después del corte en dicho sitio sea alterado en por lo menos una propiedad física y/o química. Por ej emplo, los substratos contemplados en tal aspecto pueden comprender una primera y una segunda porciones capaces de interactuar físicamente y/o químicamente unas con otras y ser separadas por un enlazador que tenga el sitio de corte por neurotoxina. Como resultado del corte del sitio de corte, la interacción antes mencionada entre las dos porciones será alterada. Las porciones adecuadas son, por ej emplo, fluoróforos donadores y receptores que exhiban transferencia de energía por resonancia en el estado no cortado, dicha transferencia de energía por resonancia siendo interrumpida después del corte. Como alternativa, un fluoróforo y un extintor puede aplicarse en donde el efecto de extinción del extintor se invierta después del corte. Los substratos de este tipo se describen, por ej emplo, en cualquiera de EP 1 438 586 B l , EP 2 208 067 A l , EP 1 543 329 A2, EP 1 869 459 B l , EP 2 293 064 B l , EP 1 920 248 B l , EP 2 264 458 A l , EP 2 332 959 A2, WO 201 1 /47241 , EP 1 901 069 B l , EP 2 293 064 B l , EP 1 807 698 B l o EP 2 107 1 12 B l ; cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.

En otro aspecto específico más del método de la invención, el ensayo se lleva a cabo al determinar la cantidad de SNAP-25 cortada presente en la célula neuronal derivada de células hiPS al determinar la cantidad de SNAP-25 cortada usando un primer anticuerpo y, en un aspecto, un anticuerpo monoclonal que se una específicamente a dicha SNAP-25 cortada. Más aún, la SNAP-25 total presente en las células, por ej emplo, SNAP-25 cortada y no cortada, se determina por un segundo anticuerpo, y, en un aspecto, un anticuerpo policlonal que se une a dicha SNAP-25 total. En un aspecto, la cantidad de primer anticuerpo unido y la cantidad de segundo anticuerpo unido puede determinarse por un agente de detección, en un aspecto, por uno o más anticuerpos de detección que permitan distinguir entre la cantidad de primer anticuerpo unido y la cantidad de segundo anticuerpo unido. Por ej emplo, un primer anticuerpo de detección acoplado a un primer marcador y la unión al primer anticuerpo y un segundo anticuerpo de detección acoplado a un segundo marcador y la unión al segundo anticuerpo unido pueden ser usados. La cantidad de primer anticuerpo unido y segundo anticuerpo unido y, de esta manera, la cantidad de SNAP-25 cortada y total se puede derivar subsecuentemente a partir de la cantidad de primero y segundo marcadores determinados. En un aspecto, un primer marcador contemplado en la presente puede ser una enzima tal como peroxidasa de rábano. En otro aspecto, un segundo marcador contemplado en la presente puede ser una enzima tal como una fosfatasa alcalina. Los marcadores pueden usarse para catalizar una conversión detectable de substratos no fluorescentes en productos fluorescentes.

En otro aspecto más del método de la invención, el ensayo se lleva a cabo al determinar liberación de neurotransmisores, por ej emplo, en el medio de cultivo. La cantidad de neurotransmisores liberados o no liberados puede determinarse por técnicas descritas en la presente o en cualquier lado.

Adecuadamente, los métodos contemplados por la presente invención se basan en recursos no animales, por ej emplo, las células neuronales derivadas de células hiPS, y, por lo tanto, se evitan pruebas con animales. Las células neuronales derivadas de células hiPS, no obstante, permiten probar todas las actividades biológicas de BoNTs requeridas, por ej emplo (a) unión a receptor, (b) internalización, (c) translocación a través de la membrana endosómica al citosol, y/o (d) corte endoproteolítico de proteínas implicadas en fusión a membrana de vesícula sináptica. En consecuencia, los métodos pueden usarse para medidas de control de seguridad o calidad así como para el desarrollo de BoNTs con propiedades biológicas modificadas que requieran normalmente, por ejemplo, enfoques de análisis en gran escala.

La presente invención se refiere también a un método para determinar la cantidad de BoNT biológicamente activa en una preparación que comprenda BoNT biológicamente activa, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una célula neuronal derivada de células hiPS con una muestra de dicha preparación; y (b) determinar la cantidad de BoNT biológicamente activa presente en la preparación al ensayar la muestra para la actividad biológica de BoNT.

La invención también se refiere al uso de la célula neuronal derivada de células hiPS para ensayar actividad de BoNT en una composición como se especifica en cualquier lado aquí.

En un aspecto, el ensayo abarca determinar la presencia o ausencia de actividad de BoNT y/o BoNT biológicamente activa. El ensayo cualitativo para BoNT biológicamente activa puede ser usado, por ej emplo, en aplicaciones que se enfoquen a la evaluación de riesgos para de esta manera prevenir cualquier daño causado por BoNTs, por ejemplo, como medida de control de seguridad durante el proceso de fabricación o durante las aplicaciones farmacéuticas o cosméticas de BoNTs o para prevenir conductas criminales con base en BoNTs, tales como bioterrorismo.

En otro aspecto, el ensayo abarca determinar la cantidad de actividad BoNT y/o BoNT biológicamente activa. El ensayo cuantitativo para BoNT biológicamente activa puede usarse durante el proceso para fabricación de BoNT o para ajustar una dosis adecuada de BoNT biológicamente activa para aplicaciones cosméticas o farmacéuticas. En consecuencia, este ensayo también puede ser útil como un medio para el control de calidad o para la formulación de productos farmacéuticos o cosméticos adecuados.

La invención se refiere también al uso de la célula neuronal derivada de células hiPS para determinar la cantidad de BoNT biológicamente activa en una preparación que comprenda la BoNT biológicamente activa como la especificada en cualquier lado en la presente.

Las referencias citadas en esta descripción arriba están incorporadas aquí a manera de referencia con respecto a su contenido de divulgación completo y el contenido de divulgación mencionado específicamente en esta descripción.

SECCIÓN EXPERIMENTAL Los siguientes ej emplos se proporcionan para poder demostrar e ilustrar más ciertas modalidades y aspectos preferidos de la presente invención y no se deben considerar como limitativos del alcance de la misma.

Ejemplo 1 A. Métodos Células neuronales : Las neuronas derivadas de iP S humana fueron suministradas congeladas por Cellular Dynamics Inc. (Madison, WI) . Las neuronas fueron descongeladas de acuerdo con las instrucciones de Cellular Dynamics, y las células vivas fueron contadas por ensayo de exclusión con Trypan Blue. Las células fueron sembradas a una densidad de 40,000 células por pocilio en cajas de 96 pocilios (TPP, MidSci) recubiertas con 0.01 % de poli-L-ornitina (SIGMA) y 8.3 µg/cm2 de Matrigel (BD Biosciences) a menos que se indique lo contrario, y se incubaron en medio neuronal (Neurobasal suplementado con B27 y Glutamax, todos de Invitrogen y suministrados por CDI) a 37°C, 5% de C02 para los tiempos de maduración indicados. Después de 24 horas de siembra, el medio se cambió completamente y la mitad del medio se reemplazó cada 2-3 días en adelante. Células de médula espinal de rata primaria (RSC) se prepararon como se describió previamente (Pellett et al. , 2007 y 2010), y se sembraron en placas de 96 pocilios recubiertas con Matrigel a una densidad de 75,000 células por pocilio.

Neurotoxina botulínica: Neurotoxina botulínica (BoNT) A, B, C y E pura ( 1 50 kDa) y complejo BoNT/A fueron preparados a partir de C. botulinum cepas Hall A hyper, Okra B, Brazil C y Beluga E como se describió previamente (Malizio et al., (2000) Methods Mol Biol 145 : 27-39; Prabakaran et al., (2001 ) Toxicon 39 : 1 51 5- 153 1 ), con lo cual se llevó a cabo la purificación de BoNT/C mediante el método de Malizio et al (2000) con la etapa adicional de adición de 0.2 mg/ml de ARN de levadura (SIGMA) al cultivo antes de precipitación con sulfato de amonio. Las toxinas se disolvieron en solución salina de pH regulado con fosfato, pH 7.4 y 40% de glicerol, y se almacenaron a -20°C hasta usar. La actividad de las preparaciones de BoNT/A, IB, /C, /E y complejo BoNT/A se determinó por el bioensayo de ratón (Hatheway CL ( 1988), citado arriba; Schantz EJ & autter DA ( 1978) J Assoc Off Anal Chem 61 : 96-99), y la toxicidad específica fue de 7 x 1 07 unidades LD50 de ratón/mg (BoNT/A l ), 7.7 x 107 unidades LD50/mg (complejo BoNT/A l ), 1 x 1 08 unidades LD50/mg (BoNT/B), 1 . 1 x 1 07 unidades LD50/mg (BoNT/C), y 7.6 x 107 unidades LD50/mg (BoNT/E).

Ensayos de toxicidad neuronal: Para todos los ensayos de toxicidad neuronal, neuronas iPS fueron expuestas a diluciones en serie de BoNT en 50 µ? de medio neuronal como se indica a menos que se indique lo contrario. Células de médula espinal de rata primarias fueron usadas como células de control en algunos ensayos como se indica en los resultados. Todas las muestras fueron probadas en un mínimo de triplicado, y un control negativo sin toxina siempre fue incluido . Después del tiempo de exposición especificado, la solución de toxinas fue retirada, y las células fueron lisadas en 50 µ? de 1 x de regulador de pH de muestra LDS (Invitrogen) . Los lisados de células fueron analizados por Western blot para SNAP-25, o corte de VAMP2 como se describió previamente (Pellett et al. , (2007), citado arriba; Pellett et al. , (2010), citado arriba). Las bandas cortadas y no cortadas fueron cuantificadas por densitometría usando un sistema Foto/Analyst FX y softwate TotalLab Quant (Fotodyne). Gráficas de datos se prepararon y EC50s se derivaron usando software PRISM.

Selección de matriz: Para seleccionar la matriz de superficie óptima, las neuronas fueron sembradas en siete matrices diferentes. Las matrices consistían en placas recubiertas con poli-D-lisina (BD biosciences) recubiertas con 1 .0 µg/cm2 ya sea de laminina (PDL laminina) u 8.3 g/cm2 de matrigel (PDL matrigel), placas recubiertas con 0.01 % de poli-L-ornitina seguidas por recubrimiento ya sea con 1 .0 µg/cm2 de laminina (PLO lamina) u 8.3 µg/cm de matrigel (PLO matrigel), placas recubiertas con PLO-laminina compradas de BD Biosciences (PLO-laminina (BD)), placas recubiertas con PDL de BD Biosciences (PDL (BD)), o 0.01 % de placas recubiertas con PLO (POLO (CDI)). Las neuronas se dejaron madurar durante 14 días, y la sensibilidad a BoNT/A se determinó al exponer neuronas a diluciones en serie de la toxina durante 48 horas. Algunas de las neuronas se mantuvieron durante 6 semanas y se probaron de nuevo como arriba.

Análisis de expresión de receptor: Para el análisis de expresión de receptor, neuronas iPS fueron puestas sobre placas de 24 pocilios a una densidad de 210,000 células/pocilio en un volumen de 0.75 mi. Las células de 3 pocilios, respectivamente, fueron cosechadas a 4, 7, 10, 14 y 21 días después de poner en placas en 75 µ? de 1 x de regulador de pH de muestra LDS (Invitrogen). Los lisados celulares fueron analizados por Western blot para la expresión de las isoformas SV2A, B y C, sinaptotagmina I y II, SNAP-25, VAMP usando un anticuerpo que reconoce VAMP 2 o un anticuerpo que reconoce VAMP isoformas 1 , 2 y 3 , y sintaxina. Se usó beta-actina como un control de carga, y células de médula espinal de rata primarias fueron usadas como un control positivo. El anticuerpo SV2C (Janz R & Sudhof TC ( 1999) Neuroscience 94: 1279- 1290) se proporcionó generosamente por Roger Janz. Todos los demás anticuerpos fueron de Synaptic Systems (Gottingen, Alemania). Todos los anticuerpos reconocen proteínas humanas.

Para el análisis de ARNm mediante qPCR en tiempo real, tres cultivos independientes de neuronas iPS fueron obtenidos durante los tiempos indicados, respectivamente. Las células fueron lisadas directamente en la placa y ARN se purificó usando el Rneasy Mini Kit y el Rnase-Free Dnase Set (Qiagen, Valencia, CA) . Para un control positivo, ARN de cerebro total adulto humano se compró (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Para todas las muestras, ADNc se generó usando el kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO (Life Technologies, Carlsbad, CA).

La amplificación por qPCR en tiempo real se llevó a cabo en el LightCycler® 480 II (Roche, Basilea, Suiza) usando el TaqMan® Gene Expression Master Mix y los siguientes ensayos de expresión de genes humanos TaqMan: SNAP25 (Hs00938962_ml); STX1A (Hs00270282_ml ); STX1B (Hs01041315_ml); VAMP1 (Hs0024991 l ml); VAMP2 (Hs00360269_ml); VAMP3 (Hs00922166_ml); SV2A (Hs00372069_ml); SV2B (Hs00208178_ml); SV2C (Hs00392676_ml); SYT1 (Hs00194572_ml); SYT2 (Hs00980604_ml) y el conjunto de cebadores de control endógenos de GAPDH humana (todos de Life Technologies). El análisis Quant/2° se llevó a cabo en todas las muestras y los valores Cp se convirtieron en cambio en veces relativo mediante normalización a la Cp para la expresión de GAPDH endógeno. Promedios y desviación estándar fueron calculados para cada gen dentro de las tres réplicas biológicas. Reacciones de PCR cuadruplicadas técnicas se llevaron a cabo para cada gen.

Ensayos de absorción de BoNT/Al dependiente de actividad: BoNT/Al se diluyó hasta una concentración de 55 ó 275 U por 50 µ? de estimulación celular (medio neurobasal personalizado de Invitrogen que contenía 2.2 mM de CaCl y 56 mM de KCl, complementado con B27 y glutamax) o medios neuronales y se añadieron a neuronas iPS de CDI maduradas durante 4 días células RSC. Las células fueron incubadas con toxina durante 1, 5, 10 y 15 minutos respectivamente. Para el control negativo, el medio respectivo sin toxina se añadió a las células. La toxina fue retirada y las células se lavaron inmediatamente dos veces con 200 µ? de medio neuronal seguido por incubación en 200 µ? de medio neuronal fresco durante 24 horas. Se tomaron muestras en réplicas de 4.

Para determinar la concentración de toxina requerida mínima para absorción dependiente de actividad de BoNT/Al dentro de 5 minutos, la toxina se diluyó a concentraciones de entre 1 .72 a 55 U por 50 µ? de medio de estimulación celular. Neuronas iPS maduradas cuatro días fueron expuestas a las diluciones de toxina durante 5 minutos, seguidas por remoción de toxina y dos lavados con medio neuronal e incubación en medio neuronal durante 24 horas. Todas las diluciones se probaron en réplicas de4.

Análisis de protección de anticuerpos : anticuerpos específicos para BoNT/Al fueron preparados de acuerdo con Johnson et al. , 1993. La inhibición de la actividad de BoNT/A l en neuronas iPS por anticuerpos neutralizantes se analizó usando dos métodos diferentes. Para el primer ensayo, 55 U de BoNT/A l se combinaron con anticuerpo diluido en serie en medio de estimulación celular y se incubaron durante 1 hora a 37°C para permitir la interacción a anticuerpo-toxina. Neuronas iPS maduradas 4 días fueron expuestas a la mezcla toxina-anticuerpo durante 5 minutos, seguidas por remoción de la mezcla a toxina-anticuerpo y dos etapas de lavado con medio neuronal e incubación en medio neuronal durante 24 horas. Para el segundo ensayo, 1 .5 U de BoNT/A se combinó con diluciones en serie de anticuerpo en medio neuronal y se incubó a 37°C durante 1 hora. Las neuronas iPS fueron expuestas a las mezclas toxina-anticuerpo durante 24 horas. La comparación con el bioensayo de ratón usó dilución en serie del anticuerpo pre-incubado con 5- 10 U de BoNT/Al durante 1 .5 horas a temperaturas ambiente en un volumen de 167 µ?. El volumen se ajustó a 500 microlitros y se inyectó en cuatro ratones por dilución.

B. Resultados Las neuronas iPS expresan receptores importantes para intoxicación por BoNT: Para poder determinar si las neuronas derivadas de iPS humana pueden usarse para detectar actividad de BoNT, la expresión de los receptores y obj etivos enzimáticos necesarios para la entrada de células BoNT y actividad catalítica se analizaron por Western blot y PCR cuantitativa (qPCR), respectivamente (figura 1A-1B). El Western blot dio como resultado señales para SV2A, una banda tenue para SV2B , sinaptotagmina 1 , sintaxina, SNAP-25, VAMP2 y beta-actina, que no cambió durante un periodo de tiempo de 21 días después de la colocación de células (figura 1 A) . Aunque VAMP2 se detectó con un anticuerpo específico para VAMP2, un anticuerpo que reconoce las tres isoformas de VAMP no dio como resultado ninguna señal, indicando que VAMP 2 es la isoforma de VAMP predominante en neuronas iPS . Lisado de células de médula espinal de rata primarias fue usado como un control positivo para detección de anticuerpos, y las diferentes intensidades en bandas de neuronas iPS versus células RSC puede deberse a reconocimiento diferencial por el anticuerpo o a niveles de expresión diferentes. Análisis de niveles de ARNm de las mismas proteínas por qPCR indicó la expresión de todas las proteínas analizadas (figura 2B) incluyendo SV2isoformas B y C, sinaptotagmina 2 y VAMP 1 y 3 , que no fueron detectadas por Western blot. Sin embargo, los niveles de ARNm de esas isoformas fueron al menos 200 veces más bajos que aquellos de las isoformas detectadas por Western blot (SV2A, sinaptotagmina 1 y VAMP2). Así, los datos de qPCR corroboran los datos de Western blot e indican que las neuronas iPS expresan principalmente las isoformas SV2A, sinaptotagmina 1 y VAMP 2 de estas proteínas, lo cual coincide con las neuronas que representan neuronas de prosencéfalo (Janz R & Sudhof TC ( 1999) Neuroscience 94 : 1279-1290). Los niveles de expresión de todas las proteínas no cambiaron a lo largo del periodo de estudio, indicando que las células son completamente maduradas 4 días después de la colocación y permanecen estables durante al menos 21 días.

La matriz de superficie no tiene influencia en la calidad de las células para el ensayo de BoNT/Al : Para determinar si la matriz de colocación tenía influencia en la sensibilidad a BoNT, las neuronas colocadas en siete matrices diferentes fueron probadas para sensibilidad a BoNT/A l . Las neuronas se fijaron y maduraron sobre todas las matrices, formando una red cada vez más alta de axones y dendritas. Diferencias morfológicas significativas fueron observadas entre las células cultivadas en placas con o sin laminina o matrigel. Las células cultivadas en laminina PDL (BD Biosciences) o placas de matrigel o en placas de laminina PLO (Cellular Dynamics) o matrigel crecieron principalmente en una monocapa pero formaron algunos agregados con axones largos extendiéndose desde ellas, principalmente alrededor del perímetro de las placas. En contraste, las células cultivadas en placas PLO o PDL permanecieron en una sola monocapa de células con axones y dendritas extendiéndose entre las redes de células. Las células cultivadas en laminina PLO (BD Biosciences) simularon células cultivadas en placas PLO o PDL.

Las neuronas fueron expuestas a diluciones en serie de BoNT/A después de 14 días de maduración, y análisis Western blot de lisados celulares indicó que el corte de SNAP-25 era casi idéntico para todos los substratos probados (figura 2). El límite de detección fue 0.05 unidades LD50 de ratón, y el corte se completó entre 1 .75 y 3.5 U. Las EC50s variaron de 0.21 a 0.31 .

Estos datos indican que las células pueden ser puestas en cualquiera de las matrices de superficie probadas para este ensayo. Todos los siguientes experimentos se llevaron a cabo en placas recubiertas con PLO-matrigel. Para reducir la agregación celular, se usaron placas TPP (MidSci), las cuales tienen un área superficial más plana. Esto elimina completamente la agregación alrededor del perímetro del pocilio.

Un tiempo de maduración celular de 4-14 días proporciona una excelente y sensible plataforma para pruebas de BoNT/Al : Para determinar si el tiempo de maduración celular afecta la sensibilidad a BoNT de neuronas iP S las células fueron analizadas para sensibilidad a BoNT/Al 4 y 7 días después de la colocación en paralelo usando las mismas diluciones de toxinas. Células de médula espinal de rata primarias (células RSC) también fueron probadas en paralelo, para comparar la sensibilidad de las neuronas iPS a células RSC, las cuales son actualmente las células más sensibles descritas para detección de BoNT (Pellet et al. , 2007, citado arriba; Pellett et al. , (201 0) J Pharmacol Toxicol Methods). Los datos resultantes no mostraron de manera consistente diferencias estadísticamente significativas en sensibilidad a las células maduradas durante 4 ó 7 días, con EC50s de ~ 0.3 U (figura 3 ). Esto es similar a la EC50 observada arriba para células del día 14 (figura 2) y para células RSC. La curva de respuesta a dosis para neuronas iPS fue significativamente más pronunciada que para células RSC, y 100% de corte se alcanzó con 1 .75 U, mientras que 1 00% de corte no se alcanzó en células RSC con las concentraciones de toxina usadas. Esto es probable debido a la alta pureza de las neuronas iPS . Así, las células maduradas 4- 14 días proporcionan un modelo a base de células reproducible y altamente sensible para la detección y cuantificación de BoNT/A l . Además, las pruebas de cuatro lotes de células iPS diferentes no indicaron una diferencia principal en la sensibilidad a BoNT/Al .

La sensibilidad de neuronas iPS se incrementa con tiempos de exposición más largos : La dependencia de tiempo de detección de BoNT en neuronas iPS se examinó al exponer las células a diluciones de BoNT/A l en serie y al cosechar muestras 6, 16, 24 y 48 horas después de la adición de toxinas. Los datos resultantes indicaron consistentemente que una exposición de 48 horas produjo sensibilidad más alta, con un incremento de ~3 veces en comparación con un ensayo de 24 horas y un incremento de ~ 6 veces en comparación con un ensayo de 16 horas (figura 4) . Una exposición a toxina de 6 horas dio como resultado una reducción de -1 30 veces en sensibilidad, con una EC50 de aproximadamente 40 unidades.

Las neuronas iPS tienen una velocidad de absorción de BoNT/Al más rápida que las células RSC : La velocidad de absorción de BoNT/A l en neuronas iPS en comparación con células RSC se examinó al exponer neuronas iPS y células RSC a 82 U de BoNT/A l en paralelo y evaluar el corte de SNAP-25 2, 4, 6, 8 y 10 horas después. Dos medios diferentes fueron usados para diferenciar entre absorción dependiente de actividad y absorción independiente de toxina, toda vez que la actividad neuronal se ha reportado que se traduce en una absorción más rápida de BoNTs (Keller et al. , (2004), citado arriba). El primer medio fue medio neuronal (NM), y el segundo fue medio de estimulación celular (CSM), el cual es una versión modificada del medio neuronal que contiene 56 mM de KCl y 2.2 mM de CaCl2 para estimular químicamente la actividad de células neruonales.

Las neuronas iPS dieron como resultado corte de SNAP-25 significativamente más prematuro y más completo que las células RSC . En neuronas iPS, 1 00% de corte de SNAP-25 se logró a 8 horas y 50% de corte de SNAP-25 a -4 horas (figura 5). Las células RSC, en contraste, alcanzaron sólo -70-80% de corte de SNAP-25 después de 10 horas, y -50% de corte de SNAP-25 se observó a 6 horas. No se observó diferencia entre medio de estimulación neuronal y de células para ningún tipo de célula, indicando que en el marco de tiempo probado la actividad neuronal no afecta la absorción de BoNT en las células. Estos datos indican que las neuronas iPS son significativamente más sensibles a BoNT/A que células RSC y absorben la toxina a una velocidad más rápida, aunque este ensayo no diferencia entre absorción de toxina más rápida y corte más rápido de SNAP-25.

Las neuronas iPS absorben BoNT/Al significativamente más rápido que células RSC en un ensayo dependiente de actividad: Para poder examinar más si las neuronas iPS absorben BoNT en una forma dependiente de actividad, neuronas iPS maduradas 4 días y células RSC fueron expuestas a 55 y 275 U de BoNT/Al en medio de estimulación celular, respectivamente. Las células fueron expuestas a toxina durante 1 , 5, 10 ó 1 5 minutos, seguidas por remoción de toxina completa e incubación en medio neuronal durante 24 horas para permitir el corte de SNAP-25. Un corte de SNAP-25 significativo se observó en neuronas iPS tan pronto como un minuto después de exposición con 55 U de BoNT/A l (figura 6A). Después de 5 minutos alrededor de 75% de SNAP-25 fue cortada, y no hubo cambio significativo con exposiciones a toxina más largas, indicando absorción completa a los 5 minutos. La exposición a 275 U se tradujo en corte de SNAP-25 completo a todos los tiempos de exposición probados (figura 6A). En contraste, la exposición de células RSC a 55 unidades de BoNT/A l no dio como resultado un corte de SNAP-25 significativo después de tiempos de exposición de hasta 1 5 minutos, y sólo aproximadamente 30-40%) de SNAP-25 fue cortada después de una exposición de al menos 10 minutos a 275 U (figura 6A). Esto indica que las neuronas iPS absorben BoNT/A l de una forma dependiente de actividad, y que esta absorción se presenta notoriamente de manera más eficiente y más rápido que en células RSC.

Para poder confirmar que la rápida absorción en neuronas iPS es dependiente de actividad, las neuronas fueron expuestas a 55 U de BoNT/A durante 1 , 5 ó 1 0 minutos en medio de estimulación celular o medio neuronal. Hubo significativamente más corte de SNAP-25 en las células tratadas con medio de estimulación celular, con 50%» de corte de SNAP-25 observada después de 1 minuto y 70% de corte después de 5 minutos (figura 6B). En medio neuronal, en contraste, sólo aproximadamente 20% de SNAP-25 se cortó después de 10 minutos (figura 6B). Esto indica que la rápida absorción de BoNT/A l en neuronas iPS depende de actividad.

Para poder determinar la dependencia de concentración de la absorción de BoNT/A l dependiente de actividad por neuronas iPS, las células fueron expuestas a 1 .7-55 U de BoNT/A l en medio de estimulación celular durante 5 minutos. Después de la remoción de toxinas, las células fueron incubadas durante 24 horas para permitir que se presentara el corte de SNAP-25. Un incremento dependiente de concentración en el corte de SNAP-25 se observó con una concentración de toxina cada vez más alta, con un corte de SNAP-25 de 50% presentándose con aproximadamente 30 U (figura 6C).

Anticuerpos específicos para BoNT/Al protegen a neuronas iPS del corte por SNAP-25 por BoNT/Al : La especificidad del ensayo de BoNT de iPS se confirmó por un ensayo de protección de anticuerpos usando dos formatos de ensayo diferentes. En el primer ensayo, las células fueron expuestas a las mezclas de toxinas y anticuerpos durante 24 horas, usando la cantidad mínima de toxinas requeridas para lograr corte de SNAP-25 casi completo ( 1 .5 unidades). En el segundo ensayo, las células fueron expuestas a mezclas de 55 U de BoNT/A y anticuerpo diluido en serie durante 5 minutos en medio de estimulación celular, seguidos por remoción de toxinas e incubación durante 24 horas. El primer ensayo produjo una sensibilidad significativamente más alta en detección de anticuerpos. Las neuronas fueron completamente protegidas del corte de SNAP-25 con tan poco como 0.0025 µ? de anticuerpo. Protección parcial significativa se observó hasta 0.00625 µ? de anticuerpo (figura 7A). El mismo patrón de protección se observó previamente cuando el anticuerpo se probó en células RSC usando 0.5 U de BoNT/A l y una exposición de 48 horas. La prueba de las mismas diluciones de anticuerpo por bioensayo de ratón indicó una sensibilidad al menos -10 veces más grande de los ensayos a base de células en comparación con el bioensayo de ratón como también habían indicado datos previos. El ensayo de RSC ha mostrado ser más sensible en la detección de anticuerpos neutralizantes que el bioensayo de ratón (Pellett, S . 2007, citado arriba). El segundo ensayo (dependiente de actividad) fue aproximadamente 10 veces menos sensible, requiriendo 0.016 µ? de anticuerpo por 50 µ? para protección completa, y se observó protección parcial con 0.004 µ? (figura 7B).

Esto confirma la especificidad de este ensayo e indica que las neuronas iPS proporcionan un ensayo excelente y altamente sensible para la detección de anticuerpos neutralizantes, y que una exposición más larga con menos toxina es menos sensible que un ensayo dependiente de actividad que requiere más toxina pero un tiempo de exposición más corto. El ensayo dependiente de actividad es útil para algunos propósitos, tal como el tamizado de compuestos o antitoxina que pudiera ser citotóxica o tuviera que ser disuelta en solventes que pudieran dañar neuronas con el tiempo.

La detección de toxina BoNT/Al en su complejo natural es más sensible que la detección de toxina purificada: BoNTs son expresadas en clostridios como un complej o con varias otras proteínas (proteína no hemaglutinina no tóxica (NTNH) y hemaglutininas (HA) en el caso de BoNT/A (revisado en Johnson EA & Bradhaw M (2001 ) Toxicon 39 : 1 703 - 1 722). Las proteínas complejas no tóxicas se cree que protegen a la toxina del pH degradante del tracto gastrointestinal (Ogurna et al. , (2000), Microbial Foodbo ne Diseases: Mechanisms of Pathogenesis and Toxin Synthesis 273-293 ). Las preparaciones médicas más comúnmente usadas del BoNT/A (preparaciones BOTOX® y Dysport®) consisten en el complejo de toxinas completo, aunque formulaciones más nuevas que contienen sólo la BoNT purificada (preparación Xeomin®) han sido ahora probadas por la FDA. Para poder determinar si BoNT/A l en su complej o natural se detecta con sensibilidad igual como BoNT/A l pura en neuronas iPS, las células fueron expuestas a cantidades iguales de complejo BoNT/A l o BoNT/Al purificado en paralelo. El complejo consiste en aproximadamente 24% de BoNT/A l y 76% de otras proteínas asociadas no tóxicas, según se determina por densitometría (figura 8A) . La preparación de BoNT/A l purificada y complejo de BoNT/A l tuvo actividades específicas similares (7x 1 07 U/mg y 7.3x 1 07 U/mg). En una comparación directa, significativamente menos del componente de toxina del complejo se requirió para alcanzar corte de SNAP-25 completo (figura 8B) . Este descubrimiento indica que las proteínas no tóxicas del complejo incrementan la actividad de BoNT/l A en este ensayo, posiblemente debido a un efecto protector en el medio neuronal.

Las neuronas iPS son un modelo celular altamente sensible para la detección de BoNT serotipos B, C y E : Los análisis de receptor de BoNT indicaron que las neuronas iPS expresan las proteínas SNARE y receptores requeridos para entrada celular de todos los serotipos de BoNT (figura 1 A- 1 B). BoNT/A y E Cortan SNAP-25, BoNT/B corta VAMP y BoNT/C corta SNAP-25 y sintaxina (Humeau et al, (2000) Biochimie 82 : 427-446) . Para probar la sensibilidades de neuronas a diferentes serotipos, diluciones en serie de BoNT/B, C o E fueron añadidas a neuronas iPS o células RSC durante 48 horas en paralelo, y lisados celulares fueron ensayados vía Western blot para el corte de su substrato neuronal respectivo. Las neuronas iPS detectaron de manera consistente todos los serotipos de BoNT con sensibilidad igual o mayor que las células RSC (figura 9). Los valors EC50 para neuronas iPS y células RSC fueron 15.71 U y 29.22 U para BoNT/B (figura 9A), 0.4 U y 0.36 U para BoNT/C (figura 9B) y 1 .79 U para BoNT/E en neuronas iPS (figura 9C). Un valor EC50 para BoNT/E en células RSC no pudo ser derivado con el software PRISM, pero se estima que es similar a aquél de las neuronas iPS (figura 9C).

Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y números de registro mencionados en la descripción anterior se incorporan en la presente por referencia en su totalidad. Aunque la invención ha sido descrita en relación con modalidades específicas, se debe entender que la invención reclamada no debe ser limitada indebidamente a tales modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones y variaciones de las composiciones y métodos descritos de la invención serán aparentes para aquellos de capacidad ordinaria en la técnica y se intenta que estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1 . Un método de ensayo de una neurotoxina de Clostridium botulinum (BoNT) para actividad, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto una célula neuronal derivada de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiP S) con una composición que comprende una BoNT; y b) ensayar la BoNT para actividad biológica.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la B oNT tiene un serotipo seleccionado del grupo que consiste en A, B, C , E y variantes de dichas BoNT modificadas.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la actividad biológica se selecciona del grupo que consi ste en corte de SNAP-25, corte de VAMP2 y liberación de neurotransmisores.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el ensayo es cualitativo .

5. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el ensayo es cuantitativo .

6. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la BoNT es purificada.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la BoNT no es purificada.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la BoNT está en un complej o.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende además la etapa de poner en contacto la BoNT con un compuesto de prueba antes de poner en contacto las células neuronales derivadas de hPS.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el compuesto de prueba es un anticuerpo.

1 1 . El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado porque el anticuerpo neutralizante se encuentra en una muestra seleccionada de entre el grupo que consiste en anticuerpos purificados, suero y antitoxinas.

13. Un método de ensayo de una neurotoxina de Clostridium botulinum (BoNT) para actividad, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto una célula neuronal derivada de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPS) con una composición que comprende i) una BoNT, y ii) un anticuerpo neutralizante; y b) ensayar la BoNT para actividad biológica.

14. El método de conformidad con la reivindicación 1 3 , caracterizado porque la BoNT tiene un serotipo seleccionado del grupo que consiste en A, B, C, E y variantes de dicha BoNT modificada.

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la actividad biológica se selecciona del grupo que consiste en corte de SNAP-25, corte de VAMP2 y liberación de neurotransmi sores.

16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el ensayo es cualitativo.

1 7. El método de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizado porque el ensayo es cuantitativo.

1 8. El método de conformidad con la reivindicación 1 3 , caracterizado porque la BoNT es purificada.

19. El método de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizado porque la BoNT no es purificada.

20. El método de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizado porque la BoNT está en un complejo.

21 . El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo neutralizante se encuentra en una muestra seleccionada del grupo que consiste en anticuerpos purificados, suero y antitoxinas.

22. Un método para determinar la cantidad de BoNT biológicamente activa en una preparación que comprende BoNT biológicamente activa, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) poner en contacto una célula neuronal derivada de células hiPS con una muestra de una preparación que comprende BoNT biológicamente activa; y (b) determinar la cantidad de BoNT biológicamente activa presente en la preparación mediante el ensayo de dicha muestra para la actividad biológica de BoNT.

23. El uso de una célula neuronal derivada de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPS) para el ensayo de un sustrato de BoNT para actividad.